1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE
van 11 juli 1991
inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven en de desbetreffende analyse-
methoden
(PB L 248 van 5.9.1991, blz. 1)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Verordening (EEG) nr. 3682/91 van de Commissie van 17 december
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Verordening (EEG) nr. 1429/92 van de Commissie van 26 mei 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Verordening (EEG) Nr. 1683/92 van de Commissie van 29 juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Verordening (EEG) nr. 1996/92 van de Commissie van 15 juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Verordening (EEG) nr. 3288/92 van de Commissie van 12 november
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Verordening (EEG) nr. 183/93 van de Commissie van 29 januari 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 826/93 van de Commissie van 6
april 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Verordening (EEG) nr. 620/93 van de Commissie van 17 maart 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Verordening (EG) nr. 177/94 van de Commissie van 28 januari 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Verordening (EG) nr. 2632/94 van de Commissie van 28 oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Verordening (EG) Nr. 656/95 van de Commissie van 28 maart 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Verordening (EG) nr. 2527/95 van de Commissie van 27 oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Verordening (EG) Nr. 2472/97 van de Commissie van 11 december 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Verordening (EG) nr. 282/98 van de Commissie van 3 februari 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Verordening (EG) nr. 2248/98 van de Commissie van 19 oktober 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Verordening (EG) nr. 379/1999 van de Commissie van 19 februari 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Verordening (EG) nr. 455/2001 van de Commissie van 6 maart 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Verordening (EG) nr. 2042/2001 van de Commissie van 18 oktober 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Verordening (EG) nr. 796/2002 van de Commissie van 6 mei 2002 L 128 8 15.5.2002
Gerectificeerd bij:
►C1Rectificatie PB L 176 van 20.7.1993, blz. 26 (183/93)
▼B
VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE
van 11 juli 1991
inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven
en de desbetreffende analysemethoden
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese EconomischeGemeenschap,
Gelet op Verordening nr. 136/66/EEG van de Raad van 22 september
1966 houdende de totstandbrenging van een gemeenschappelijke orde-
ning der markten in de sector oliën en vetten(
1), laatstelijk gewijzigd
bij Verordening (EEG) nr. 3577/90(2), en met name op artikel 35 bis,
Overwegende dat in de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG de
benamingen en definities zijn vastgesteld van olijfoliën en oliën uitafvallen van olijven die in elke Lid-Staat, in het kader van het handels-verkeer tussen de Lid-Staten onderling en in de handel met derde
landen, worden verkocht;
Overwegende dat, onverminderd andere bestaande bepalingen ter zake,
ter onderscheiding van de verschillende soorten olie, de fysisch-chemi-sche kenmerken van elke soort en de organoleptische kenmerken vanbij de eerste persing verkregen oliën dienen te worden bepaald, zodatzuiverheid en kwaliteit van de betrokken produkten kunnen wordengewaarborgd;
Overwegende dat het dienstig is om de aanwezigheid van de
kenmerken van de verschillende soorten olie in de gehele Gemeen-
schap op uniforme wijze te bepalen; dat daartoe communautairemethoden voor chemische analyse en organoleptische beoordelingdienen te worden vastgesteld; dat evenwel tijdens een overgangsperiodehet gebruik van andere in de Lid-Staten toegepaste analysemethoden
moet worden toegestaan, met dien verstande dat in geval van uiteenlo-
pende resultaten de uitkomsten van de communautaire methodedoorslaggevend zijn;
Overwegende dat als gevolg van de bepaling van de fysisch-chemische
kenmerken van de olijfoliën en de omschrijving van de analyseme-thoden de aanvullende aantekeningen van hoofdstuk 15 van degecombineerde nomenclatuur aanpassing behoeven;
Overwegende dat in het kader van de methode voor de beoordeling van
de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen oliën
„panels” van geselecteerde en getrainde proevers dienen te wordengevormd; dat derhalve de nodige tijd moet worden gelaten om eendergelijke structuur tot stand te brengen; dat, gezien de moeilijkhedendie sommige Lid-Staten zullen hebben om proefpanels te vormen, dient
te worden toegestaan dat op in andere Lid-Staten reeds bestaande
proefpanels een beroep wordt gedaan;
Overwegende dat met het oog op de correcte werking van de regeling
inzake de heffingen op de invoer van afvallen van olijven, eenuniforme methode voor de bepaling van het oliegehalte van dieprodukten dient te worden vastgesteld;
Overwegende dat het, om de handel niet te schaden, dienstig is een
beperkte periode vast te stellen waarbinnen vóór de inwerkingtreding
van deze verordening verpakte olie nog mag worden afgezet;
Overwegende dat Verordening (EEG) nr. 1058/77 van de
Commissie(
3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1858/
88(4), bijgevolg dient te worden ingetrokken;1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 2
(1) PB nr. 172 van 30. 9. 1966, blz. 3025/66.
(2) PB nr. L 353 van 17. 12. 1990, blz. 23.
(3) PB nr. L 128 van 24. 5. 1977, blz. 6.
(4) PB nr. L 166 van 1. 7. 1988, blz. 10.
▼B
Overwegende dat het Comité van beheer voor oliën en vetten geen
advies heeft uitgebracht binnen de door zijn voorzitter bepaaldetermijn.
HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:
Artikel 1
1. Als „bij de eerste persing verkregen olijfoliën” in de zin van punt
1, onder a), b) en c), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEGworden aangemerkt de oliën waarvan de respectieve kenmerken over-eenkomen met die welke in bijlage I, punten 1, 2 en 3, van
onderhavige verordening zijn vermeld.
2. Als „bij de eerste persing verkregen olijfolie voor verlichting” in
de zin van punt 1, onder d), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen
met die welke in bijlage I, punt 4, van de onderhavige verordening zijn
vermeld.
3. Als „geraffineerde olijfolie” in de zin van punt 2 van de bijlage
bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de
kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 5, van deonderhavige verordening zijn vermeld.
4. Als „olijfolie” in de zin van punt 3 van de bijlage bij Verordening
nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken over-
eenkomen met die welke in bijlage I, punt 6, van de onderhavigeverordening zijn vermeld.
5. Als „ruwe olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 4 van
de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie
waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt7, van de onderhavige verordening zijn vermeld.
6. Als „geraffineerde olie uit afvallen van olijven” in de zin van
punt 5 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aange-merkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke inbijlage I, punt 8, van de onderhavige verordening zijn vermeld.
7. Als olie uit afvallen van olijven in de zin van punt 6 van de
bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de oliewaarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt9, van de onderhavige verordening zijn vermeld.
8. Als „bij de eerste persing verkregen olijfoliën” in de zin van punt
1, onder a), b), c) of d), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG
worden voor de ►
M18verkoopseizoenen 1998/1999 tot en met 2002/
2003◄evenwel ook aangemerkt, de onverpakte oliën of de in onmid-
dellijke verpakkingen met een netto-inhoud van 100 kg of meerverpakte oliën, die geheel van oorsprong uit Marokko zijn, waarvande respectieve kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I,
punten 1, 2, 3 en 4, van onderhavige verordening zijn vermeld en
waarvan het gehalte aan linoleenzuur, in afwijking van het bepaaldein de leden 1 en 2, maximaal 1,0 % bedraagt.
Artikel 2
1. De in bijlage I vastgestelde kenmerken van de oliën worden aan
de hand van de volgende analysemethoden bepaald:
— voor de bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, uitgedrukt in
een percentage oliezuur, de in bijlage II beschreven methode;
— voor de bepaling van het peroxidegetal, de in bijlage III beschreven
methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan was, de in bijlage IV
beschreven methode;1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 3
▼M15
▼B
▼M19
▼B
— voor de bepaling van de sterolsamenstelling, de in bijlage V
beschreven methode;
— voor de bepaling van het erythrodiol- en uvaolgehalte, de in bijlage
VI beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan verzadigde vetzuren op de 2-
positie van de triglyceriden, de in bijlage VII beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan trilinoleïne, de in bijlage VIII
beschreven methode;
— voor de spectrofotometrische analyse, de in bijlage IX beschreven
methode;
— voor de bepaling van de vetzuursamenstelling, de in de bijlagen
X.A en X.B beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmid-
delen, de in bijlage XI beschreven methode;
— voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de
eerste persing verkregen olijfolie, de in bijlage XII beschrevenmethode, toegepast overeenkomstig het bepaalde in lid 2;
— voor het bewijs van raffinage, de in bijlage XIII beschreven
methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan stigmastadiënen, de in bijlage
XVII beschreven methode;
— voor de bepaling van de samenstelling van de triglyceriden met
ECN42, de in bijlage XVIII beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen, de in
bijlage XIX beschreven methode.
2. De verificatie van de organoleptische kenmerken van bij de eerste
persing verkregen olijfolie door de nationale autoriteiten of hun verte-
genwoordigers wordt uitgevoerd door een door de lidstaten erkendproeverspanel.
De organoleptische kenmerken van in de eerste alinea genoemde olie
zijn die van de voor de olijfolie opgegeven categorie wanneer eendoor de betrokken lidstaat erkend panel de indeling in die categoriebevestigt.
Wanneer het panel de indeling van de olie ten aanzien van de organo-
leptische kenmerken van de opgegeven categorie niet bevestigt, laten
de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers op verzoek van debelanghebbende twee tegenanalyses door andere proeverspanelsuitvoeren, waarvan minstens één door een panel dat is erkend door delidstaat van de betrokken producent. Er wordt aangenomen dat debetrokken kenmerken overeenstemmen met de opgegeven kenmerken
als de twee tegenanalyses de indeling bevestigen. Zo niet, komen de
kosten van de tegenanalyses, onverminderd andere sancties, voor reke-ning van de belanghebbende.
3. Monsters voor de controle van de kenmerken van de in lid 1
bedoelde olie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers
worden genomen volgens de internationale normen EN ISO 661 en EN
ISO 5555 met betrekking tot de voorbereiding van de monsters vooronderzoek en de monsterneming. In afwijking van punt 6.8 van normEN ISO 5555, worden echter voor partijen van dergelijke oliën inonmiddellijke verpakkingen, met een inhoud van maximaal 100 liter,monsters genomen volgens bijlage I bis.
Onverminderd de voorschriften van norm EN ISO 5555 en hoofdstuk 6
van norm EN 661, worden de monsters zo snel mogelijk tegen licht enhitte beschermd en:
— wat de periode oktober-mei betreft, uiterlijk op de tiende werkdag
na de dag waarop ze zijn genomen, of
— wat de periode juni-september betreft, uiterlijk op de vijfde
werkdag na de dag waarop ze zijn genomen,1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 4
▼M11
▼M13
▼M19
▼M17
▼M19
▼M19
voor analyse naar het laboratorium gezonden.
4. Voor de in lid 3 bedoelde verificatie worden de in de bijlagen II,
III, IX en XII bedoelde analyses en in voorkomend geval de door denationale wetgevingen voorgeschreven tegenexpertises uitgevoerd vóórde datum van minimale houdbaarheid. Indien het monster meer dan
vier maanden vóór de datum van minimale houdbaarheid wordt
genomen, moeten de analyses uiterlijk de vierde maand na de bemon-stering worden verricht. Voor de andere in de genoemde verordeningvermelde analyses is geen termijn van toepassing.
Als de resultaten van de analyses niet beantwoorden aan de kenmerken
van de aangegeven categorie olijfolie of olie uit afvallen van olijven,wordt de betrokkene hiervan uiterlijk één maand vóór het verstrijkenvan de in de eerste alinea bedoelde termijn in kennis gesteld, tenzij
het monster minder dan een maand vóór de datum van minimale houd-
baarheid is genomen.
5. Voor de bepaling van de kenmerken van olijfolie volgens de in
lid 1 aangegeven methoden worden de analyseresultaten rechtstreeks
vergeleken met de in deze verordening vastgestelde grenswaarden.
Artikel►M193◄
Wanneer wordt geconstateerd dat de organoleptische kenmerken van
een bepaalde olie verschillen van die welke deze olie op grond vanhaar benaming zou moeten hebben, past de betrokken Lid-Staat, onver-minderd de eventuele andere sancties, administratieve geldboetes toe,
waarvan de hoogte wordt bepaaldt op basis van de ernst van de gecon-
stateerde onregelmatigheid.
Voor de beoordeling van de onregelmatigheid wordt met name reke-
ning gehouden met de natuurlijke ontwikkeling van de kenmerken vanolie die onder normale omstandigheden is bewaard.
De Lid-Staten brengen de Commissie aan het begin van ieder halfjaar
op de hoogte van het aantal en de aard van de geconstateerde onregel-matigheden alsmede van de in het voorafgaande hafljaar toegepastesancties.
Artikel 4
1. Voor de beoordeling en controle van de organoleptische
kenmerken door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordiger
kunnen de lidstaten panels van proevers erkennen.
De erkenningsvoorwaarden worden door de lidstaten vastgesteld en wel
zodanig dat:
— aan de voorwaarden van punt 4 van bijlage XII wordt voldaan;
— de voorzitter van het panel wordt opgeleid door een daartoe door de
lidstaat erkende instelling en onder door de lidstaat goedgekeurde
voorwaarden;
— de geldigheid van de erkenning afhankelijk wordt gemaakt van de
resultaten van een jaarlijkse controle door de lidstaat.
Elke lidstaat stelt de Commissie in kennis van de lijst van erkende
panels en van de overeenkomstig dit lid genomen maatregelen.
2. Ingeval een Lid-Staat op zijn grondgebied moeilijk een panel van
proevers kan instellen, mag hij een beroep doen op een door een andereLid-Staat erkend panel.
3. Elke Lid-Staat stelt de lijst op van de door beroepsorganisaties of
sectorale organisaties overeenkomstig de in lid 1 vermelde voor-1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 5
▼M17
▼M19
▼M5
▼M19
▼M5
▼M5
waarden ingestelde panels van proevers en ziet toe op de naleving van
deze voorwaarden.
Artikel 6
1. Het oliegehalte van afvallen van olijven en van de andere bij de
winning van olijfolie verkregen afvallen (GN-codes 2306 90 11 en2306 90 19) wordt bepaald overeenkomstig de in bijlage XV opge-nomen methode.
2. Het in lid 1 bedoelde oliegehalte wordt uitgedrukt in gewichtsper-
centen berekend over de droge stof.
Artikel 7
Wat de aanwezigheid van andere ongewenste stoffen dan die bedoeld
in bijlage XI betreft, gelden de communautaire bepalingen.
Artikel 8
1. Elke Lid-Staat stelt de Commissie van de ter uitvoering van deze
verordening genomen maatregelen in kennis.
2. Elke Lid-Staat legt de Commissie aan het begin van elk halfjaar
een verzamelstaat met de analyseresultaten van de in het voorgaandehalfjaar uitgevoerde bepalingen over.
Deze resultaten worden volgens de procedure van artikel 39 van Veror-
dening nr. 136/66/EEG door het Comité van beheer voor oliën envetten onderzocht.
Artikel 9
Verordening (EEG) nr. 1058/77 wordt hierbij ingetrokken.
Artikel 10
1. Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op
die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese
Gemeenschappen .
De in bijlage XII beschreven methode wordt, behalve voor verrich-
tingen in het kader van de interventieregeling, met ingang van
►
M11 november 1992 ◄toegepast.
Deze methode geldt niet voor olijfolie van de eerste persing die vóór 1
november 1992 is verpakt.
2. Deze verordening is niet van toepassing op olijfoliën en oliën uit
afvallen van olijven die vóór de datum van inwerkingtreding van deze
verordening zijn verpakt en tot en met 31 oktober 1992 wordenverkocht.
Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks
toepasselijk in elke Lid-Staat.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 6
▼M19
▼B
▼M5
▼B
▼B
BIJLAGEN
Inhoudsopgave
Bijlage I: Kenmerken van olijfolie …
Bijage I bis: Bemonstering van partijen olijfolie en olie uit afvallen van
olijven in onmiddellijke verpakkingen van ten hoogste 100
liter …
Bijlage II: Bepaling van de zuurgraad …
Bijlage III: Bepaling van het peroxidegetal …
Bijlage IV: ►M6Bepaling van het gehalte aan was met behulp van
capillaire gaschromatografie ◄…
Bijlage V: Bepaling van de sterolsamenstelling en het sterolgehalte met
behulp van capillaire gaschromatografie …
Bijlage VI: Bepaling van het gehalte aan erythrodiol en uvaol …
Bijlage VII: Bepaling van vetzuren op de 2-positie in triglyceriden van
oliën en vetten …
Bijlage VIII: Bepaling van het gehalte aan trilinoleïne …
Bijlage IX: Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied …
Bijlage X.A: Gaschromatografische analyse van methylesters van vetzuren
…
Bijlage X.B: Bereiding van methylesters van vetzuren overeenkomstig
bijlage VI, punten I en II, van Verordening (EEG) nr. 72/77
of volgens de hieronder beschreven methode …
Bijlage XI: Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen
…
Bijlage XII: Organoleptische beoordeling van olijfolie van eerste persing
…
Bijlage XIII: ►M6Neutralisering en ontkleuring van olijfolie in het
laboratorium ◄…
Bijlage XV: Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven …
Bijlage XVI: Bepaling van het joodgetal …
Bijlage XVII: Methode voor de bepaling van de stigmastadiënen in plantaar-
dige oliën ...
Bijlage XVIII: Methode voor de bepalingen van de samenstelling van de
triglyceriden met ECN42 ...
Bijlage XIX: Methode voor de bepaling van het gehalte aan alifatische
alcoholen ...1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 7
▼M17
▼B
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
BIJLAGEI
KENMERKEN VAN OLIJFOLIE
CategorieZuurgraad
(%) (*)Peroxide
getal
mEq 02/
kg (*)Gehaloge-
neerde
oplosmid-
delen
mg/kg(*) (1)Was
mg/kg (**)Verzadigde
vetzuren in
2-positie-
triglyce-
riden
(%)Stigmasta-
diënen
mg/kg (2)Verschil
tussen
HPLC en
theoretische
berekening
van ECN42K232(*) K270(*)K270met
alumini-
umoxide (3)Delta-K (*)Organolepti-
sche beoor-
deling
Mediaan
voor de
gebreken
(Md) (*)Organolepti-
sche beoor-
deling
Mediaan
„fruitig”(Mf) (*)
1. Extra olijfolie
verkregen bij de eerste
persing≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Olijfolie verkregen bij
de eerste persing≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Courante olijfolie
verkregen bij de eerste
persing≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤6,0(4)—
4. Olijfolie verkregen bij
de eerste persing, voor
verlichting> 3,3 > 20 > 0,20 ≤300 (5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 > 0,25 ≤0,11 — Md > 6 —
5. Geraffineerde olijfolie ≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6. Olijfolie ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7. Ruwe olie uit afvallen
van olijven> 0,5 (**) — — >350(6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8. Geraffineerde olie uit
afvallen van olijven≤0,5 ≤5 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9. Olie uit afvallen van
olijven≤1,5 ≤15 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1) Maximumgehalte voor totale gehalogeneerde bestanddelen die zijn aangetoond met een elektronenvangstdetector.
Voor individueel aangetoonde bestanddelen is het toegestane maximum 0,10 mg/kg.
(2) Totaal van de isomeren dat (al dan niet) kan worden gescheiden over een capillaire kolom.
(3) Om na te gaan of geraffineerde olie aanwezig is, moet als K270hoger is dan de voor de betrokken categorie vastgestelde limiet K270worden bepaald over een kolom aluminiumoxide.
(4) Als de mediaan „fruitig” gelijk is aan 0, mag de mediaan van het gebrek niet hoger zijn dan 2,5.
(5) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als olijfolie voor verlichting aangemerkt, wanneer het totaalgehalte aan alifatische alco holen niet hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en
uvaol niet meer bedraagt dan 3,5 %.
(6) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als ruwe olie uit afvallen van olijven aangemerkt, wanneer het totaalgehalte aan alifatisch e alcoholen niet hoger is dan 350 mg/kg en wanneer het gehalte aan
erytrodiol en uvaol meer bedraagt dan 3,5 %.▼M191991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 8
CategorieZuurgraad
Totaal
transolie-
zuuriso-
meren
(%)Totaal
transli-
nolzuur-
en trans-linoleen-
zuuriso-
meren
(%)Choles-
terol
(%)Brassi-
casterol
(%)Campes-
terol
(%)Stigmas-
terol
(%)Bètasito-
sterol
(%) (
1)Delta-7-
Stigmas-
terol
(%)Totaal
sterolen
(mg/kg)Erythro-
diol plus
uvaol
(%) (**)Myristi-
nezuur
(%)Linoleen-
zuur
(%)Arachide-
zuur
(%)Eicosaan-
zuur
(%)Beheen-
zuur
(%)Lignoce-
rinezuur
(%)
1. Extra olijfolie
verkregen bij de
eerste persing≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Olijfolie
verkregen bij de
eerste persing≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Courante olijfolie
verkregen bij de
eerste persing≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
4. Olijfolie
verkregen bij de
eerste persing, voor
verlichting≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (2)
5. Geraffineerde
olijfolie≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Olijfolie ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
7. Ruwe olie uit
afvallen van olijven≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5(3)
8. Geraffineerde olie
uit afvallen van
olijven≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
9. olie uit afvallen
van olijven≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Totaal van Delta-5,23 stigmastadiënol + chlerosterol + bètasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-sigmastadiënol.
(2) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als olijfolie voor verlichting aangemerkt, wanneer het totaalgehalte aan alifatische alco holen niet hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte van erytrodiol en
uvaol niet meer bedraagt dan 3,5 %.
(3) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als ruwe olie uit afvallen van olijven aangemerkt, wanneer het totaalgehalte aan alifatisch e alcoholen niet hoger is dan 350 kg en wanneer het gehalte aan erytrodiol
en uvaol meer bedraagt dan 3,5 %.
Opmerkingen
a) De resultaten van de analyses moeten worden opgegeven met hetzelfde aantal decimale cijfers als in de normen voor elk kenmerk.
De laatste significante decimaal wordt naar boven afgerond als de volgende decimaal hoger is dan 4.
b) Om olie in een andere categorie in te delen of qua zuiverheid onvoldoende te verklaren, volstaat het dat een van de kenmerken niet aan de vastgestelde normen beantwoordt.
c) Aangezien de kenmerken met een asterisk (*) betrekking hebben op de kwaliteit van de olie, heeft dit als consequentie dat:
— voor bij de eerste persing verkregen olijfolie voor verlichting niet gelijktijdig aan alle normen (afgezien van K232) hoeft te worden voldaan;
— andere bij de eerste persing verkregen olijfolie die niet aan één van deze normen voldoet, wel wordt ingedeeld in een andere categorie, maar binnen de categorieën olijfolie verkregen bij de eerste persing blijft.
d) De kenmerken met een dubbele asterisk (**) houden in dat voor alle betrokken olie uit afvallen van olijven niet gelijktijdig aan alle normen hoeft te worden voldaan.▼M191991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 9
▼M17
BIJLAGEIbis
Bemonstering van partijen olijfolie en olie uit afvallen van olijven in onmid-
dellijke verpakkingen van ten hoogste 100 liter
Onderstaande bemonsteringsmethode is van toepassing op partijen olijfolie van
maximaal 125000 liter, in onmiddellijke verpakkingen van maximaal 100 liter.
Wanneer de betrokken partij groter is dan 125000 liter, wordt deze verdeeld in
bij benadering gelijke deelpartijen van minder dan 125000 liter. De methode
moet vervolgens worden toegepast op iedere aldus verkregen deelpartij.
1. Inhoud van een primair monster
Elk primair monster bestaat:
a) voor onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van 6 liter of meer, uit
de olie van één onmiddellijke verpakking verdeeld over ten minste 6 reci-
piënten van 1 liter waarvan:
— 1 recipiënt voor de in de bijlagen II, III, IX en XII bedoelde analyses,
— 1 recipiënt voor de overige analyses en— de resterende recipiënten voor eventuele tegenexpertises.
b) voor onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van 2 liter of meer,
maar minder dan 6 liter, uit de olie van 4 onmiddellijke verpakkingen,
waarvan:
— 1 onmiddellijke verpakking voor de in de bijlagen II, III, IX en XII
bedoelde analyses,
— een derde van een andere verpakking voor de overige analyses en— de resterende olie voor eventuele tegenexpertises.
c) voor onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van 0,75 liter of meer,
maar minder dan 2 liter, de olie van 6 onmiddellijke verpakkingen,
waarvan:
— 1 onmiddellijke verpakking voor de in de bijlagen II, III, IX en XII
bedoelde analyses,
— een andere verpakking voor de overige analyses en— de resterende olie voor eventuele tegenexpertises.
d) voor onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van minder dan 0,75
liter, uit de olie van het kleinste aantal verpakkingen dat in totaal meer
dan 4,5 liter bevat, verdeeld als volgt:
— de olie uit het kleinste aantal verpakkingen dat samen meer dan 0,75
liter bevat, is bestemd voor de in de bijlagen II, III, IX en XII
bedoelde analyses,
— dezelfde hoeveelheid is bestemd voor de andere analyses en— de rest wordt bewaard voor eventuele tegenexpertises.
2. Aantal primaire monsters
Het minimumaantal primaire monsters dat moet worden genomen, is afhan-
kelijk van de grootte van de partij en wordt bepaald volgens onderstaande
tabel.
Partijen kleiner dan (liter) Minimumaantal primaire monsters
7 500 2
25000 3
75000 4
125 000 5
De onmiddellijke verpakkingen van een primair monster moeten in de partij
naast elkaar liggen.
In geval van twijfel verhoogt de lidstaat het aantal te nemen primaire
monsters.
3. Analyses en resultaten
De olie moet tot op het tijdstip van de analyse zoveel mogelijk in het
oorspronkelijke recipiënt worden bewaard.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 10
▼M17
a) Ieder primair monster wordt, overeenkomstig punt 2.5 van norm EN ISO
5555, verdeeld in laboratoriummonsters, waarop de volgende analyses
worden uitgevoerd:
— bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, als bedoeld in artikel 2,
lid 1, eerste streepje;
— bepaling van het peroxidegetal, als bedoeld in artikel 2, lid 1, tweede
streepje;
— spectrofotometrische analyse, als bedoeld in artikel 2, lid 1, achtste
streepje;
— bepaling van de vetzuursamenstelling, als bedoeld in artikel 2, lid 1,
negende streepje.
b) Indien de resultaten van de onder a) bedoelde analyses voor ten minste
één van de primaire monsters uit eenzelfde partij niet allemaal overeen-
stemmen met de kenmerken van de aangegeven categorie olijfolie, wordt
de betrokken partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de
voorschriften beschouwd.
Indien alle resultaten van de onder a) bedoelde analyses voor elk van de
primaire monsters uit eenzelfde partij gelet op de herhaalbaarheid van de
betrokken methoden homogeen zijn en overeenstemmen met de
kenmerken van de aangegeven categorie olijfolie, wordt één van de
primaire monsters uit die partij onderworpen aan de overige analyses.
c) Indien één van de resultaten van de onder b), tweede alinea, bedoelde
analyses niet overeenstemt met de kenmerken van de aangegeven cate-
gorie olijfolie, wordt de betrokken partij in haar geheel als niet in
overeenstemming met de voorschriften beschouwd.
Indien alle resultaten van de onder b), tweede alinea, bedoelde analyses
overeenstemmen met de kenmerken van de aangegeven categorie olijfolie,
wordt de betrokken partij in haar geheel als in overeenstemming met de
voorschriften erkend.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 11
▼B
BIJLAGEII
BEPALING VAN DE ZUURGRAAD
1. DOEL
Bepaling van de vrije vetzuren in olijfolie. Het gehalte aan vrije vetzuren
wordt uitgedrukt in de volgens de klassieke methode berekende zuur-
graad.
1.1.Principe van de methode
Oplossing van het monster in een mengsel van oplosmiddelen, daarna
titrering van de aanwezige vrije vetzuren met behulp van een oplossing
van kaliumhydroxide in ethanol.
1.2.Reagentia
Alle reagentia moeten p.a. zijn en het gebruikte water dient gedistilleerd
water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.
1.2.1. Diëthylether: 95 % ethanol (v/v), mengsel 1: 1 (v/v) in volume.
Waarschuwing: Diëthylether is zeer ontvlambaar en kan explosieve
peroxiden vormen. Bij gebruik ervan dienen bijzondere
voorzorgen te worden genomen.
Neutraliseer, precies op het ogenblik van gebruik, met de kaliumhydro-
xide-oplossing (1.2.2), in aanwezigheid van 0,3 ml phenolphtaleïne-
oplossing (1.2.3) voor 100 ml mengsel.
Opmerking: Indien gebruik van diëthylether onmogelijk is, kan een
mengsel van uit ethanol en tolueen bestaande oplosmiddelen
worden gebruikt. Zonodig kan ethanol worden vervangen
door propanol-2.
1.2.2. Kaliumhydroxide, in ethanol getitreerde oplossing, c(KOH), ongeveer
0,1 mol/l of, indien nodig, c(KOH) ongeveer 0,5 mol/l.
De precieze concentratie van de oplossing van kaliumhydroxide in
ethanol dient bekend te zijn en onmiddellijk voor gebruik te worden
geverifieerd. Gebruik een oplossing die minstens vijf dagen voor gebruik
is bereid en is gedecanteerd in een donkerbruine, met een rubberen stop
gesloten fles. De oplossing dient kleurloos of strogeel te zijn.
Opmerking: Een stabiele, kleurloze kaliumhydroxideoplossing kan op de
volgende wijze worden bereid. 1000 ml ethanol op tempera-
tuur en gedurende één uur koken, met reflux, met 8 g
kaliumhydroxide en 0,5 g aluminiumsnippers. Onmiddellijk
distilleren. In het distillaat de benodigde hoeveelheid
kaliumhydroxide oplossen. Verschillende dagen laten rusten
en de heldere supernotans van het kaliumcarbonaatneerslag
decanteren.
De oplossing kan ook zonder distillatie op de volgende wijze
worden bereid. Aan 1 000 ml ethanol 4 ml aluminiumbuty-
laat toevoegen en het mengsel enkele dagen laten staan.
Het supernotans decanteren en de benodigde hoeveelheid
kaliumhydroxide erin oplossen. De oplossing is klaar voor
gebruik.
1.2.3. Phenolphtaleïne, oplossing van 10 g/l in 95-96 % ethanol (v/v) of alka-
lisch blauw (in geval van sterk gekleurde vetten), oplossing van 20 g/l
in 95-96 % ethanol (v/v).
1.3.Apparatuur
Gebruikelijk laboratoriummateriaal, en met name:
1.3.1. Analytische balans.
1.3.2. Kolf van 250 ml.
1.3.3. Buret van 10 ml, met een schaalindeling van 0,05 ml.
1.4.Werkwijze
1.4.1. Bereiding van het te analyseren monster
De bepaling wordt uitgevoerd op een gefiltreerd monster.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 12
▼B
Wanneer de som van vochtgehalte en gehalte aan onzuiverheden kleiner
is dan 1 %, wordt de bepaling uitgevoerd op het monster als zodanig.
1.4.2. Monsterneming
Houd bij het nemen van het monster rekening met het verwachte zuur-
getal volgens de gegevens van de volgende tabel.
Verwacht zuurgetalHoeveelheid af te wegen
monster
(g)Nauwkeurigheid van de
weging van het monster
(g)
< 1 20 0,05
1 tot 4 10 0,024 tot 15 2,5 0,01
15 tot 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Weeg het monster in de kolf (1.3.2).
1.4.3 Bepaling
Los het monster (1.4.2) op in 50 tot 150 ml van het mengsel diëthylether/
ethanol (1.2.1) dat tevoren is geneutraliseerd.
Titreer, al schuddend, met de oplossing 0,1 mol/l kaliumhydroxide (1.2.2)
(zie opmerking 3) tot omslag van de indicator (rose kleuring van de
phenophtaleïne die ten minste 10 seconden aanhoudt).
Opmerking1: De getitreerde kaliumhydroxideoplossing in ethanol (1.2.2)
kan worden vervangen door een oplossing in water van
kalium- of natriumhydroxide wanneer het erin gebrachte
volume water niet tot een fasescheiding leidt.
Opmerking2: Als de nodige hoeveelheid 0,1 mol/l kaliumhydroxideop-
lossing 10 ml overschrijdt, gebruik dan een oplossing van
0,5 mol/l.
Opmerking3: Als de oplossing troebel wordt tijdens de titrering, voeg
dan een hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen
(1.2.1) toe tot de oplossing helder wordt.
1.5Formulering in zuurgraad in percentage oliezuur
De zuurgraad, uitgedrukt in gewichtspercentage, is gelijk aan:
V/C1c/C1M
1000/C1100
m¼V/C1c/C1M
10/C1m
waarin:
V = het volume in ml van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxide-
oplossing;
c = de precieze concentratie, in mol/l van de gebruikte, getitreerde
kaliumhydroxideoplossing;
M = het molaire gewicht, in grammen per mol, van het zuur dat voor
de weergave van de resultaten is gekozen (= 282);
m = de hoeveelheid af te wegen monster in gram.
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde ►M6van twee
bepalingen ◄.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 13
▼B
BIJLAGEIII
BEPALING VAN HET PEROXIDEGETAL
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het peroxidegetal
van oliën en vetten.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor dierlijke en plantaardige oliën en vetten.
3. DEFINITIE
Het peroxidegetal is de hoeveelheid stoffen in het monster, uitgedrukt in
milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, die kaliumjodide oxideren
bij de beschreven werkomstandigheden.
4. PRINCIPE VAN DE METHODE
Het in een mengsel van azijnzuur en chloroform opgeloste vet wordt
behandeld met kaliumjodide en het vrijgemaakte jodide wordt getitreerd
met natriumthiosulfaatoplossing.
5. APPARATUUR
Alle gebruikte apparatuur dient vrij te zijn van reducerende of oxiderende
stoffen.
Opmerking: Geslepen oppervlakten niet invetten.
5.1. 3 ml glazen weegschuitje.5.2. Kolven met geslepen halzen en stoppen, van ongeveer 250 ml, vooraf
gedroogd en gevuld met een zuiver, droog inert gas (stikstof of, bij voor-
keur, koolstofdioxide).
5.3. Buret van 25 of 50 ml, met een schaalindeling van 0,1 ml.
6. REAGENTIA
6.1. Chloroform, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen
met een stroom zuiver, droog inert gas.
6.2. IJsazijn, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met
een stroom zuiver, droog gas.
6.3. Kaliumjodide, verzadigde oplossing in water, vlak vóór gebruik bereid, vrij
van jodium of jodaat.
6.4. Natriumthiosulfaat, 0,01 of 0,002 N nauwkeurig gestelde oplossing in
water, onmiddellijk vóór gebruik gesteld.
6.5. Zetmeeloplossing, 10 g/l oplossing in water, vers bereid uit natuurlijk
oplosbaar zetmeel.
7. MONSTER
Zorg ervoor dat het monster niet in de nabijheid van licht wordt genomen,
dat het in het donker wordt bewaard en vervolgens koud wordt opgeslagen
in volledig gevulde glazen recipiënten, hermetisch afgesloten met stoppen
van geslepen glas of kurk.
8. WERKWIJZE
De proef dient in diffuus daglicht of bij kunstlicht te worden uitgevoerd.
Weeg in een glazen weegschuitje (5.1), of bij gebrek daaraan in een kolf
(5.2), tot op 0,001 g nauwkeurig, een hoeveelheid van het monster volgens
de volgende tabel, afhankelijk van het verwachte peroxidegetal.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 14
▼B
Verwacht peroxidegetal
(meq O2/kg)Hoeveelheid van het monster
(g)
0 tot 12 5,0 tot 2,0
12 tot 20 2,0 tot 1,220 tot 30 1,2 tot 0,830 tot 50 0,8 tot 0,5
50 tot 90 0,5 tot 0,3
Ontstop een kolf (5.2) en breng er het glazen weegschuitje in dat het
monster bevat. Voeg 10 ml chloroform toe (6.1). Los het monster snel op
door roeren. Voeg 15 ml azijnzuur (6.2) toe, daarna 1 ml kaliumjodideop-
lossing (6.3). Sluit snel af met de stop, schud gedurende één minuut en laat
precies vijf minuten in het donker staan bij een temperatuur van 15 tot
25 ºC.
Voeg ongeveer 75 ml gedistilleerd water toe. Titreer, krachtig schuddend,
het vrijgekomen jodium met de natriumthiosulfaatoplossing (6.4) (0,002 N
oplossing voor verwachte waarden van minder dan 12 en 0,01 N oplossing
voor verwachte waarden boven 12), met gebruik van de zetmeeloplossing
(6.5) als indicator.
Voer twee bepalingen uit op hetzelfde proefmonster.
Voer terzelfder tijd een blanco bepaling uit. Indien het resultaat van de
blanco bepaling meer bedraagt dan 0,05 ml van de 0,01 N natriumthiosul-
faatoplossing (6.4), vervang dan de onzuivere reagentia.
9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het peroxidegetal, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per
kilogram, wordt weergegeven met de formule:
P:V:¼
V/C1T/C11000
m
waarin:
V = de gebruikte hoeveelheid gestelde natriumthiosulfaatoplossing (6.4)
in millimeter, gecorrigeerd om rekening te houden met de blanco
bepaling;
T = de precieze normaliteit van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing
(6.4);
m = het gewicht van het monster, in gram.
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee uitgevoerde
bepalingen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 15
▼M6
BIJLAGEIV
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN WAS MET BEHULP VAN
CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het
gehalte aan was van enkele oliën en vetten onder de beschreven
omstandigheden.
De methode kan vooral worden toegepast om geperste olijfolie te
onderscheiden van geëxtraheerde olijfolie (uit persafvallen van olijven).
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De olie of het vet, waaraan een geschikte interne standaard is toege-
voegd, wordt gefractioneerd met behulp van een gehydrateerde
kiezelgel-kolom. De met deze methode eerst geëlueerde fractie (met
een lagere polariteit dan de triglyceriden) wordt opgevangen en vervol-
gens direct geanalyseerd met capillaire gaschromatografie.
3. APPARATUUR
3.1. Erlenmeyer van 25 ml.
3.2. Glazen chromatografiekolom met een interne diameter van 15,0 mm en
een lengte van 30-40 cm.
3.3. Geschikte gaschromatograaf met een capillaire kolom, voorzien van een
on-column injectiesysteem bestaande uit:
3.3.1. Een gethermostateerde oven waarmee de kolommen op de gewenste
temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ±
1 ºC.
3.3.2. Een injector voor koude directe on-column injectie.3.3.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker/verzwakkereenheid.3.3.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker/
verzwakkereenheid (3.3.3) met een responstijd van niet meer dan één
seconde en met een variabele papiersnelheid.
3.3.5. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 10-15 m,
inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52 of SE-
54 vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30
µm.
3.4. Een on-column 10 µl injectiespuit met geharde naald.
4. REAGENTIA
4.1. Kiezelgel 70/230 mesh, Merck artikel 7754.
Zet de kiezelgel in een moffeloven gedurende 4 uur bij 500 ºC. Laat
afkoelen en voeg 2 % water toe. Schud krachtig om de massa te homo-
geniseren. Bewaar in het donker gedurende tenminste 12 uur alvorens
dit te gebruiken.
4.2. n-Hexaan, voor chromatografische doeleinden.4.3. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.4.4. n-Heptaan, voor chromatografische doeleinden.4.5. Standaardoplossing van lauryl-arachidaat, 0,1 % (m/v) oplossing in
hexaan (interne standaard).
4.6. Draaggas: waterstof, gaschromatografisch zuiver.4.7. Hulpgassen:
— waterstof, gaschromatografisch zuiver;
— lucht, gaschromatografisch zuiver.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 16
▼M6
5. WERKWIJZE
5.1. Scheiding van de wasfractie.
5.1.1. Bereiding van de chromatografiekolom.
Suspendeer 15 g 2 % gehydrateerde kiezelgel in n-hexaan watervrij en
breng dit in de kolom.
Laat uitzakken en vibreer de kolom met een elektrische vibrator om het
chromatografiebed meer homogeen te maken. Leid 30 ml n-hexaan
door om onzuiverheden te verwijderen.
5.1.2. Werkwijze met de chromatografiekolom.
Weeg nauwkeurig ongeveer 500 mg monster af in de de erlenmeyer van
25 ml, voeg een hoeveelheid interne standaard toe die overeenkomt met
het verwachte gehalte aan was. Bijvoorbeeld: voeg 0,1 mg lauryl-
arachidaat toe indien het gaat om olijfolie en 0,25-0,50 mg indien het
gaat om geëxtraheerde olijfolie.
Breng het aldus bereide monster over in de volgens 5.1.1 behandelde
chromatografiekolom, voeg dan achter elkaar 2 porties van elk 2 ml n-
hexaan toe.
Laat dit door de kolom lopen tot boven de absorbens een laag vloeistof
van 1 mm resteert. Voer dan de chromatografische elutie uit met 140
ml van een mengsel van n-hexaan/ethylether, 99:1, met een elutiesnel-
heid van ongeveer 15 druppels per 10 seconden (2,1 ml/minuut).
Damp de aldus verkregen fractie in een rotatievacuümverdamper in tot
bijna droog, verwijder de laatste 2 of 3 ml met een zachte stikstof-
stroom en neem het residu op in 10 ml n-heptaan.
5.2. Gaschromatografische analyse
5.2.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom.
5.2.1.1. Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt
aangesloten aan het on-column systeem en het uiteinde aan de detector.
Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografisch systeem
(lekken in de gasvoorziening, efficiëntie van de detector en de
recorder).
5.2.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij gecondi-
tioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet
de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een
temperatuur van ten minste 20 ºC boven de bij de analyse gebruikelijke
temperatuur (Opmerking). Houd deze temperatuur aan gedurende
tenminste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling
van de gassnelheid, ontsteking van de vlam, aansluiting van de elektro-
nische recorder, temperatuurregeling van de kolomruimte en de
detector, enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die
tenminste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basis-
lijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen.
Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de
kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoend uitge-
voerde conditionering van de kolom.
Opmerking: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten
minste 20 ºC lager zijn dan de maximumtemperatuur dievoor de gebruikte eluens is aangegeven.
5.2.2. Keuze van de werkomstandigheden.5.2.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende voor-
waarden dienen:
— kolomtemperatuur: start op 80 ºC, opwarmen met 30 ºC/minuut tot
120 ºC, daarna met 5 ºC/minuut tot 340 ºC;
— detectortemperatuur: 350 ºC;— lineaire snelheid van het draaggas: waterstof 20-35 cm/s;
— gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking;
— gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag;— papiersnelheid: 30 cm/uur;— injectiehoeveelheid: 0,5-1 µl oplossing.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 17
▼M6
Deze voorwaarden kunnen afhankelijk van de karakteristieken van de
kolom en van de gaschromatograaf worden gewijzigd zodanig dat chro-
matogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de retentietijd van de C32 interne standaard moet ongeveer 25 ± 2
minuten zijn;
— de meest representatieve piek van de was moet tussen 60 en 100 %
van de volle schaaluitslag zijn.
5.2.2.2. De piekintegratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een
juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen.
5.2.3. Uitvoering van de analyse
5.2.3.1. Zuig met de 10 µl injectiespuit 1 µl oplossing op. Trek de plunjer van
de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het
membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden,
verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald.
5.2.3.2. Neem het chromatogram op tot al de pieken van de was volledig zijn
geëlueerd.
De basislijn moet steeds aan de vereiste voorwaarden voldoen (5.2.1.2).
5.2.4. Identificatie van de pieken
Identificeer de verschillende pieken op basis van de retentietijden en
door vergelijking met wasmengsels met een bekende retentietijd, die
onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.
In figuur 1 wordt een chromatogram getoond van wassen in een koud
geperste olijfolie.
5.2.5. Kwantitatieve evaluatie5.2.5.1. Bereken met de integrator de piekoppervlakten van de interne standaard
en de C40-C46 alifatische esters.
5.2.5.2. Bereken de wasconcentratie van elke individuele ester in mg/kg vethou-
dend materiaal als volgt:
ester (mg/kg) =A
··ms·►M91 000◄
As·m
waarin:
Ax= piekoppervlak van de ester;
As= piekoppervlak van lauryl-arachidaat;
ms= massa van het toegevoegde lauryl-arachidaat, in milligram;
m = massa van het onderzochte monster, in gram.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Geef de gehaltes van de verschillende wassen en tevens het totaal op in
mg/kg vethoudend materiaal.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 18
▼M6
AANHANGSEL
Bepalingvandelineairesnelheid vanhetdraaggas
Injecteer 1-3 µl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden
werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door
de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek
(tm).
De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tm, waarbij
L de lengte van de kolom in centimeters en tm de gemeten tijd in seconden is.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 19
▼M61991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 20
▼B
BIJLAGEV
BEPALING VAN DE STEROLSAMENSTELLING EN HET STEROLGE-
HALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het indi-
viduele en totale sterolgehalte van vetstoffen.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De vetstof, waaraan α-cholestanol als interne standaard is toegevoegd,
wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het
onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met ethylether.
De sterolfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden met
behulp van basische kiezelgel dunne-laagchromatografie. De van de
dunne-laagplaat verzamelde sterolen worden omgezet in trimethylsilyle-
thers en via capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald.
3. APPARATUUR
3.1. Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.3.2. Scheitrechters van 500 ml.3.3. Kolven van 250 ml.3.4. Volledige uitrusting voor dunne-laagchromatografie met 20 × 20 cm
glasplaten.
3.5. Ultravioletlamp met een golflengte van 366 of 254 nm.3.6. Injectiespuiten van 100 µl en 500 µl.3.7. Filterkroes G 3 (poreusiteit 15—40 µm) met een diameter van ongeveer
2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te
filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.
3.8. Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21, waarmee deze
op de filterkroes kan worden aangesloten.
3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom,
voorzien van een splitsysteem bestaande uit:
3.10.1. Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste
temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van
± 1 ºC.
3.10.2. Een temperatuurgeregelde verdampingseenheid met een gepersilani-
seerd glazen verdampingselement.
3.10.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid,
3.10.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/
verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één
seconde en met een variabele papiersnelheid.
3.11. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van
20—30 m, inwendige diameter 0,25—0,32 mm, inwendig gecoat met
SE-52- of SE-54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen
0,10 en 0,30 µm.
3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 µl met een geharde naald.
4. REAGENTIA
4.1. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g
kaliumhydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling op in 200 ml
gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol. Bewaar de oplos-
sing in goed afgesloten flessen van donker glas.
4.2. Ethylether, p.a.4.3. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.
4.4. Glazen dunne-laagplaten gecoat met kiezelgel zonder fluorescentie-indi-
cator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel
te verkrijgen).1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 21
▼B
4.5. Kaliumhydroxideoplossing, 0,2 M in Methanol. Los 13 g kaliumhydro-
xide op in 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol aan tot 1 liter.
4.6. Benzeen, voor chromatografische doeleinden.
4.7. Aceton, voor chromatografische doeleinden.
4.8. Hexaan, voor chromatografische doeleinden.
4.9. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.
4.10. Chloroform, p.a.
4.11. Dunnelaagchromatografische referentieoplossing: cholesterol of fyto-
sterol,►M62%◄oplossing in chloroform.
4.12. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing
moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele drup-
pels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing.
4.13. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.
4.14. Hexamethyldisilazaan.
4.15. Trimethylchloorsilaan.
4.16. Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de sterolen. Direct
vóór gebruik te bereiden uit de zuivere sterolen of uit het mengsel van
sterolen verkregen uit de oliën die deze sterolen bevatten.
4.17. α-cholestanol, 0,2 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).
4.18. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.
4.19. Hulpgassen:
— waterstof, gaschromatografisch zuiver,
— lucht, gaschromatografisch zuiver.
5. WERKWIJZE
5.1. Bereiding van het onverzeepbare residu.
5.1.1. Breng in de kolf van 250 ml met behulp van de injectiespuit van 500 µl
een hoeveelheid 0,2 % α-cholestanoloplossing in chloroform (4.17) die
overeenkomt met ongeveer 10 % van de sterolfractie van het te onder-
zoeken monster. Bij voorbeeld: voeg voor 5 g monster 500 µl 0,2 % α-
cholestanoloplossing toe indien het gaat om olijfolie en 1 500 µl indien
het gaat om ►M6 ◄olie uit afvallen van olijven.
Damp met behulp van een stikstofstroom droog en weeg vervolgens in
dezelfde kolf nauwkeurig 5 g van het gedroogde gefiltreerde monster
af.
►M6Oliën◄die een aanmerkelijke hoeveelheid cholesterol
bevatten, kunnen een piek vertonen met dezelfde retentietijd als choles-
tanol. Is dit het geval dan moet de sterolfractie tevens zonder interne
standaard worden geanalyseerd ►M6of moet in plaats van cholestanol
betulinol worden gebruikt ◄.
5.1.2. Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig
de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken op een waterbad onder
voortdurend krachtig schudden tot de verzeping heeft plaatsgevonden
(de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg
dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler,
verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 ºC.
5.1.3. Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml schei-
trechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met
gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml
ethylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en laatuitzakken (zie opmerking 1).
Tap de waterige onderlaag af en vang deze op in een tweede schei-
trechter. Herhaal de extractie van de waterlaag twee keer op dezelfde
manier en gebruik hierbij telkens 60—70 ml ethylether.
Opmerking1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met
een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylal-
cohol toe te voegen.
5.1.4. Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens
50 ml gedistilleerd water tot het waswater neutraal reageert.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 22
▼B
Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer
over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf,
was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden ethylether.
5.1.5. Distilleer de ether tot op enkele ml af, droog door toepassing van een
kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in
een oven bij 100 ºC gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in
een exsiccator en weeg.
5.2. Scheiding van de sterolfractie.5.2.1. Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedu-
rende 10 seconden volledig in de 0,2 M ethanolische
kaliumhydroxideoplossing, laat de platen gedurende 2 uur in een zuur-
kast drogen en plaats ze ten slotte gedurende 1 uur in een stoof bij
100 ºC.
Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van
gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de op deze
manier bereide platen moeten binnen 2 weken worden gebruikt).
Opmerking2: Bij gebruik van basische-kiezelgelplaten voor de schei-
ding van de sterolfractie is de behandeling van het
onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig.
Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren
en andere) vastgehouden op de startlijn en is de sterol-
band duidelijk gescheiden van de band van de
alifatische- en triterpeenalcoholen.
5.2.2. Breng in de ontwikkeltank een mengsel van benzeen/aceton, 95: 5 (v/
v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Als alternatief kan een mengsel
van hexaan/ethylether, 65: 35 (v/v), worden gebruikt. Sluit de tank af
met een geschikt deksel en laat hem gedurende ongeveer een half uur
staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken
filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant
van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd
met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en
regelmatige elutie van de componenten.
Opmerking3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden
ververst om volkomen reproduceerbare elutie-condities
te verwezenlijken.
5.2.3. Bereid een ongeveer 5 % oplossing van het onverzeepbare residu
(5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulp van de 100 µl injec-
tiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische
plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk
moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens
2—3 µl aan van de sterol-referentieoplossing (4.11) zodat de sterolband
na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd.
5.2.4. Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De
omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 ºC en 20 ºC. Sluit de
tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront
tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen.
Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in
een hete luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuur-
kast te zetten.
5.2.5. Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneop-
lossing. De sterolband kan door bekijken onder ultraviolet licht
worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte ligt als de
vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen van de band aan
de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood.
5.2.6. Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied
af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filter-
kroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de
metalen spatel en filtreer onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de
afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes.
Was het residu in de filterkroes drie maal met ethylether (telkens onge-
veer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf. Damp het filtraat in
tot een volume van 4—5 ml, breng de resterende oplossing over in de
van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), damp droog door
voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele
druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende onge-
veer 10 minuten in een oven bij 105 ºC, laat afkoelen in een exsiccator
en weeg.
Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal is de sterolfractie.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 23
▼B
5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers.
5.3.1. Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige sterolfractie een hoeveel-
heid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/
hexamethydisilazaan/trimethylchloorsilaan 9: 3: 1 (v/v/v) (zie opmer-
king 4), waarbij voor elke mg sterol 50 µl wordt toegevoegd. Vermijd
hierbij bevochtiging (zie opmerking 5).
Opmerking4: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijg-
baar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar,
zoals bij voorbeeld bistrimethylsilyltrifluoaceetamide
+ 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden
verdund met een gelijk volume watervrije pyridine.
5.3.2. Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te
draaien) tot de sterolen volledig zijn opgelost. Laat ten minste 15
minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten.
De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse.
Opmerking5: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden
gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De
vorming van witte vlokken of de verschijning van een
roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van
vocht of van veroudering van het reagens. In deze
gevallen moet opnieuw worden begonnen.
5.4. Gaschromatografische analyse.5.4.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom.
5.4.1.1. Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt
aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector.
Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische
systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie
van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.).
5.4.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij gecondi-
tioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet
de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een
temperatuur van ten minste 20 ºC boven de bij de analyse gebruikelijke
temperatuur (zie opmerking 6). Houd deze temperatuur aan gedurende
ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling
van de gassnelheid en het splitsysteem, ontsteking van de vlam, aanslui-
ting van de elektronische recorder, regeling van de temperatuur van de
kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het signaal
met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruike-
lijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en
mag niet verlopen.
Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de
kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende
uitgevoerde conditionering van de kolom.
Opmerking6: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten
minste 20 ºC lager zijn dan de maximumtemperatuur
die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven.
5.4.2. Keuze van de werkomstandigheden.5.4.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden
dienen:
— kolomtemperatuur: 260 ºC ± 5 ºC;
— injectietemperatuur: 280 ºC;— detectortemperatuur: 290 ºC;
— lineaire snelheid van het draaggas: helium 20—35 cm/s, waterstof
30—50 cm/s;
— splitverhouding: van 1: 50 tot 1: 100;
— gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking;
— gevoeligheid van de recorder: 1—2 mV volle schaaluitslag;— papiersnelheid: 30—60 cm/uur;
— injectiehoeveelheid: 0,5—1 µl TMSE-oplossing.
Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de
kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chroma-
togrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de retentietijd van β-sitosterol moet ongeveer 20 ± 5 minuten zijn;1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 24
▼B
— de campesterolpiek moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie
(gemiddeld gehalte 3 %) 15 ± 5 % volle schaaluitslag, voor sojaolie
(gemiddelde gehalte 20 %) 80 ± 10 % volle schaaluitslag;
— alle aanwezige sterolpieken moeten gescheiden zijn. Daarnaast
moeten andere pieken voldoende gescheiden zijn, dat wil zeggen
dat het signaal tussen pieken volledig naar de basislijn moet terug-
keren. Onvolledige scheiding kan echter getolereerd worden mits de
piek met een relatieve retentietijd van 1,02 met behulp van een
loodlijn kan worden gekwantificeerd.
5.4.3. Bepaling.
5.4.3.1. Zuig in de 10 µl injectiespuit 1 µl hexaan, o,5 µl lucht en ten slotte
0,5—1,0 µl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit
dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de
injectie-eenheid en injecteer snel na 1—2 seconden, verwijder daarna
voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald.
5.4.3.2. Neem het chromatogram op tot alle aanwezige TMSE-sterolen volledig
zijn geëlueerd.
De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste kwalificaties (5.4.1.2).
5.4.4. Identificatie van de pieken.
Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door
een vergelijking met mengsels van TMSE-sterolen die onder dezelfde
omstandigheden zijn geanalyseerd.
De sterolen worden geëlueerd in de volgorde: cholesterol, brassicas-
terol, 24-methyleencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol,
∆7-campesterol, ∆5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sito-
stanol, ∆5-avanesterol, ∆5,24-stigmastadienol, ∆7-stigmastenol, ∆7-
avenasterol.
In tabel I worden de relatieve retentietijden ten oprichte van sitosterol
opgegeven voor SE 52- en SE 54-kolommen.
In de figuren 1 en 2 worden typische chromatogrammen getoond voor
enkele oliën.
5.4.5. Berekening.
5.4.5.1. Bereken met de integrator de oppervlakten van de α-cholestanol en de
sterolpieken. Houd geen rekening met pieken van stoffen die niet op de
lijst van tabel I voorkomen. De responsfactor van α-cholestanol wordt
op 1 gesteld.
5.4.5.2. Bereken de concentratie van elk individueel sterol in mg/100 g vethou-
dend materiaal als volgt:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
waarin:
Ax= piekoppervlak van sterol x, in integratoreenheden;
As= piekoppervlak van α-cholestanol, in integratoreenheden;
ms= hoeveelheid van het toegevoegde α-cholestanol, in milligram;
m = hoeveelheid van het onderzochte monster, in gram.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
6.1. Geef de gehaltes van de individuele sterolen op in mg/100 g vethou-
dend materiaal en hun som als „totaal sterolen”.
6.2. Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de
verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som
van de piekoppervlakken van de sterolen:
% van sterol x =Ax· 100
ΣA
waarin:
Ax= piekoppervlak van sterol x;
ΣA = som van de piekoppervlakken van alle sterolen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 25
▼B
AANHANGSEL
Bepaling vandelineairesnelheid vanhetdraaggas
Injecteer 1—3 µl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden
werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door
de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek
(tM).
De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij
L de lengte is van de kolom in centimeters en tMde gemeten tijd in seconden.
Tabel I
Relatieve retentietijden voor de sterolen
Pi-
ekIdentificatieRelatieve retentietijd
SE
54-kolomSE
52-kolom
1 cholesterol ∆5-cholesteen-3 β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5 α-cholestaan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-methyl- ∆5,22-cholestadieen-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-methyleen-cholesterol 24-methyleen- ∆5,24-cholestadieen-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-methyl- ∆5-cholesteen-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestaan-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24S]-24-ethyl- ∆5,22-cholestadieen-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-methyl- ∆7-cholesteen-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆5,23-cholestadieen-3 β-ol 0,95 0,95
10 chlerosterol [24S]-24-ethyl- ∆5,25-cholestadieen-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl- ∆5-cholesteen-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-ethyl-cholestaan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-ethylideen-5-cholesteen-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆5,24-stigmastadienol [24S,R]-24-ethyl- ∆5,24-cholestadieen-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl- ∆7,24-cholesteen-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-ethylideen- ∆7-cholesteen-3 β-ol 1,16 1,16
De capillaire gaschromatografische bepaling van erythrodiol en uvaol, welke
dezelfde sterolanalyse gebruikt, wordt momenteel door de NGD gepubliceerd.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 26
▼B
Figuur 1
Gaschromatogramvandesterolfractie ineenongeraffineerde olijfolie
1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 27
▼B
Figuur 2
Gaschromatogramvandesterolfractie ineengeraffineerde olijfolie
1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 28
▼B
BIJLAGEVI
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ERYTHRODIOL EN UVAOL
OPMERKING VOORAF
Erythrodiol (onder deze term verstaat men gewoonlijk het geheel van
diolen, erythrodiol en uvaol samen) is een bestanddeel van het onverzeep-
bare residu, en is kenmerkend voor bepaalde vetstoffen. De concentratie
ervan is beduidend hoger in olijfolie vervaardigd door extractie dan in de
andere soorten olie waarin het voorkomt (koudgeperste olijfolie, druive-
pittenolie), en daarom kan door bepaling ervan de aanwezigheid van
door extractie verkregen olijfolie worden aangetoond.
1. DOEL
De methode beschrijft de werkwijze voor de bepaling van erythrodiol in
vetstoffen.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De vetstof wordt verzeept met een ethanolische kaliumhydroxideoplos-
sing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met
diëthylether en wordt gezuiverd door passage over een kolom met alumi-
niumoxide.
Het onverzeepbare residu wordt gefractioneerd met behulp van kiezelgel
dunne-laagchromatografie en de band van de sterolfractie en die van de
erythrodiolfractie worden afgezonderd. De van de dunne-laagplaat verza-
melde sterolen en erythrodiol worden omgezet in trimethylsilylethers en
het mengsel wordt via gaschromatografie kwantitatief bepaald. Het resul-
taat wordt uitgedrukt als percentage van erythrodiol in de totale
hoeveelheid erythrodiol en sterolen.
3. APPARATUUR
3.1. Dezelfde apparatuur als die welke is beschreven in bijlage V (bepaling
van de sterolfractie).
4. REAGENTIA
4.1. Dezelfde reagentia als die welke zijn beschreven in bijlage V (bepaling
van de sterolfractie).
4.2. Referentieoplossing van erythrodiol 0,5 % in chloroform.
5. WERKWIJZE5.1.Bereiding van het onverzeepbare residu
Men gaat te werk zoals beschreven in paragraaf 5.1.2 van bijlage V.
5.2.Scheiding van de erythrodiol- en de sterolfractie.
5.2.1. Zie paragraaf 5.2.1 van methode C-51.5.2.2. Zie paragraaf 5.2.2 van vorengenoemde methode.
5.2.3. Bereid een 5 % oplossing van het onverzeepbare residu in chloroform.
Breng van deze oplossing met behulp van de 0,1 ml injectiespuit 0,3 ml
aan op ongeveer 1,5 cm van de benedenrand van de chromatografische
plaat in een vloeiende lijn die zo dun en uniform mogelijk moet zijn.
Breng aan één kant van de plaat tevens enkele microliter van de choles-
terol- en erythrodioloplossingen aan als referentie.
5.2.4. Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De
omgevingstemperatuur dient ongeveer 20 ºC te bedragen. Sluit de tank
onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot
ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de
plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete lucht-
stroom.
5.2.5. Besproei de plaat uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. Door
bekijken onder ultraviolet licht kunnen de sterolband en de erythrodio-
lband worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte liggen
als de referentievlek. Markeer met een punt iets buiten de zijkanten van
de fluorescentie.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 29
▼B
5.2.6. Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in de gemarkeerde gebieden
af. Breng het afgeschraapte materiaal in de afzuigkolf van 50 ml; voeg
15 ml hete chloroform toe, schud goed en filter op de filterkroes door
de kiezelgel op het filter te leggen. Was het residu driemaal met hete
chloroform (telkens ongeveer 10 ml), en vang het filtraat op in een glazen
kolf van 100 ml. Damp het filtraat in tot een volume van 4—5 ml, breng
de resterende oplossing over in de van tevoren getarreerde 10 ml konisch
afgeronde centrifugebuis, damp droog door voorzichtige verwarming in
een stikstofstroom, en weeg.
5.3.Bereiding van trimethylsilylethers
Ga te werk zoals is beschreven in punt 5.3 van bijlage V.
5.4.Gaschromatografische analyse
Ga te werk zoals beschreven in punt 5.4 van bijlage V. De werkwijze van
de gaschromatografische analyse moet zodanig zijn dat niet alleen aan de
eisen voor de bepaling van de sterolen wordt voldaan, maar dat ook een
scheiding van TMSE van het erythrodiol en van het uvaol wordt
verkregen.
Injecteer de monsteroplossing en laat het papier draaien totdat de aanwe-
zige sterolen, erythrodiol en uvaol zijn geëlueerd; identificeer vervolgens
de pieken (de retentietijden van erythrodiol en uvaol zijn circa 1,45,
respectievelijk 1,55 maal groter dan die van B-sitosterol) en bereken de
oppervlakten ervan zoals aangegeven voor de sterolen.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Erythrodiol, % =A1+A2
A1+A2+ΣA· 100
waarin:
A1= piekoppervlak van erythrodiol, in vierkante millimeter;
A2= piekoppervlak van uvaol, in vierkante millimeter;
ΣA = som van de piekoppervlakten van de aanwezige sterolen, in vier-
kante millimeter.
Het resultaat wordt uitgedrukt tot op éen cijfer achter de komma.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 30
▼B
BIJLAGEVII
BEPALING VAN VETZUREN OP DE 2-POSITIE IN TRIGLYCERIDEN
VAN OLIËN EN VETTEN
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van de samenstelling
van de vetzuurfractie van een olie of vet, veresterd op de 2-positie van
glycerol.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor oliën en vetten met een smeltpunt onder 45 ºC ten
gevolge van de specifieke kenmerken van de werking van pancreaslipase.
Ze geldt niet onvoorwaardelijk voor oliën en vetten die aanzienlijke
hoeveelheden bevatten van: vetzuren met 12 of minder koolstofatomen
(kokosnootolie en palmpitolie, botervet) of sterk onverzadigde vetzuren
(met meer dan vier dubbele bindingen) die 20 of meer koolstofatomen
bevatten (visolie en olie van zeedieren) of vetzuren die andere geoxyge-
neerde groepen dan de zuurgroep bevatten.
3. PRINCIPE
Mogelijke neutralisering van zure oliën en vetten in een oplosmiddel.
Zuivering door op een aluminiumoxidekolom te brengen. Gedeeltelijke
hydrolyse van triglyceriden met pancreaslipase gedurende een bepaalde
tijd. Afscheiding van de gevormde monogleriden door dunne-laagychro-
matografie en methanolyse van deze monoglyceriden. Analyse van deze
methylesters door gas/vloeistofchromatografie.
4. APPARATUUR
4.1. Rondbodemkolf van 100 ml.4.2. Rondbodemkolf van 25 ml, met geslepen stop.4.3. 1 m lange luchtcondensator voor kolf 4.2.4.4. Kolf van 250 ml.4.5. Bekerglas van 50 ml.4.6. Scheitrechter van 500 ml.4.7. Glazen chromatografiekolom over 13 mm invoerdiameter en 400 mm
lang, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan.
4.8. Centrifugebuis van 10 ml, met ingeslepen glazen stop.
4.9. Buret van 5 ml met schaalindeling van 0,05 ml.4.10. Hypodermische injectiespuit van 1 ml met dunne naald.4.11. Micro-injectiespuit waaruit druppels van 3—4 mµ/l komen.4.12. Uitstrijkapparaat voor dunne-laagchromatografie.4.13. Glazen platen voor dunne-laagchromatografie, 20 × 20 cm.4.14. Glazen ontwikkeltank voor dunne-laagchromatografie, met een deksel van
geslepen glas, geschikt voor platen van 20 × 20 cm.
4.15. Spray voor dunne-laagchromatografie.4.16. Oven afgesteld op 103 ± 2 ºC.
4.17. Thermostaat regelbaar tussen 30 en 45 ºC, tot op 0,5 ºC nauwkeurig.
4.18. Rotatie-vacuümverdamper.4.19. Vibrerend elektrisch schudapparaat, waarmee de centrifugebuis krachtig
kan worden geschud.
4.20. Ultravioletlamp voor onderzoek van de dunne-laagplaten.
Envoordecontrolevandelipaseactiviteit:
4.21. pH-meter.
4.22. Spiraalvormig roerstaafje.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 31
▼B
4.23. Buret van 5 ml.
4.24. Stopwatch.
Envoordeeventuele bereiding vanlipase:
4.25. Laboratoriumschudapparaat, geschikt voor de dispersie en menging van
heterogene materialen.
5. REAGENTIA
5.1. n-Hexaan of bij gebreke daarvan petroleumether (kookpunt 30—50 ºC),
chromatografische kwaliteit.
5.2. 2-Propanol of ethanol, 95 % (v/v), p.a.
5.3. 2-Propanol of ethanol, l/l oplossing in water.
5.4. Diëthylether, vrij van peroxiden.5.5. Aceton.5.6. Mierezuur, ten minste 98 % (m/m).
5.7. Ontwikkelvloeistof: mengsel van n-hexaan (5.1), diëthylether (5.4) en
mierezuur (5.6) in verhoudingen 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Geactiveerd aluminiumoxide voor chromatografische doeleinden, neutraal,
kwaliteit Brockmann I.
5.9. Siliciumdioxidepoeder met bindmiddel, geschikt voor dunne-laagchroma-
tografie.
5.10. Pancreaslipase van geschikte kwaliteit (zie de opmerkingen 1 en 2).5.11. Natriumhydroxide, 120 g/l oplossing in water.5.12. Zoutzuur 6 N oplossing in water.
5.13. Calciumchloride (CACl
2), 220 g/l oplossing in water.
5.14. Natriumcholaat, voor enzymatische doeleinden, 1 g/l oplossing in water.5.15. Bufferoplossing: 1 M oplossing in water van trishydroxymethylaminome-
thaan wordt op pH 8 gebracht door toevoeging van zoutzuur (5.12)
(potentiometrisch te controleren).
5.16. Phenolphtaleïne, 10 g/l oplossing in 95 % ethanol (v/v).
5.17. 2,7-dichloorfluoresceïne, 2 g/l oplossing in 95 % ethanol (v/v), licht alka-
lisch gemaakt door toevoeging van één druppel 1 N-
natriumhydroxideoplossing per 100 ml.
Envoordecontrolevandelipasewerking:
5.18. Geneutraliseerde olie.5.19. Natriumhydroxide, 0,1 N waterige oplossing.5.20. Natriumcholaat voor enzymatische doeleinden, 200 g/l oplossing in water.
5.21. Arabische gom, 100 g/l oplossing in water.
6. BEREIDING VAN HET MONSTER
Indien het monster een zuurgraad heeft van minder dan 3 %, bepaald
overeenkomstig bijlage II: direct zuiveren over aluminiumoxide overeen-
komstig punt 6.2.
Indien het monster een zuurgraad heeft van meer dan 3 %, bepaald over-
eenkomstig bijlage II: neutraliseren met alkali in aanwezigheid van een
oplosmiddel (6.1), dan brengen op aluminiumoxide (6.2).
6.1. Neutralisering met alkali in aanwezigheid van een oplosmiddel
Breng in een scheitrechter (4.6) ongeveer 10 g ruwe olie en voeg 100 ml
hexaan (5.1) toe, 50 ml 2-propanol (5.2), enkele druppels phenolphtaleïne-
oplossing (5.16) en een hoeveelheid van de natriumhydroxideoplossing
(5.11) die overeenkomt met de vrije zuurgraad van de olie plus 0,3 %
overmaat. Schud krachtig gedurende één minuut, voeg 50 ml gedistilleerd
water toe, schud opnieuw en laat bezinken.
Laat, na scheiding van de lagen, de onderste laag met de zepen weglopen.
Verwijder tevens mogelijke intermediaire lagen (slijmachtige en onopge-
loste stoffen). Was de hexaanoplossing van de geneutraliseerdeolie met1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 32
▼B
opeenvolgende porties van 25—30 ml van de 2-propanoloplossing (5.3)
tot de roze kleur van de phenolphtaleïne verdwijnt. Verwijder het meren-
deel van het hexaan door destillatie onder vacuüm in de
rotatievacuümverdamper (4.18), droog de olie bij 30—40 ºC onder
vacuüm met behulp van een stroom zuivere stikstof tot de hexaan volledig
is verwijderd.
6.2. Zuivering met aluminiumoxide.
Bereid een oplossing van 15 g geactivieerd aluminiumoxide (5.8) in 50 ml
hexaan (5.1) en giet het, al roerend, op de chromatografiekolom (4.7).
Laat het aluminiumoxide gelijkmatig bezinken en laat het niveau van het
oplosmiddel dalen tot 1—2 mm boven de absorbent. Giet zorgvuldig een
oplossing van 5 g olie in 25 ml hexaan (5.1) op de kolom, verzamel het
volledige effluent van de kolom in een rondbodemkolf (4.1).
7. KLAARMAKEN VAN DE CHROMATOGRAFISCHE PLATEN
Reinig de glazen platen (4.13) grondig met ethanol, petroleumether en
aceton ten einde alle vetsporen te verwijderen.
Plaats in een kolf (4.4) 30 g siliciumdioxidepoeder (5.9). Voeg 60 ml
gedistilleerd water toe. Plaats de stop erop en schud krachtig gedurende
één minuut. Breng de massa onmiddellijk over op het uitstrijkapparaat
(4.12) en bedek de zuivere platen met een 0,25 mm dikke laag.
Droog de platen gedurende 15 minuten aan de lucht en daarna gedurende
een uur in de oven (4.16) bij 103 ± 2 ºC. Koel de platen in een droogstoof
tot kamertemperatuur vóór gebruik.
Klaargemaakte platen zijn in de handel beschikbaar.
8. WERKWIJZE
8.1. Hydrolyse met pancreaslipase.
Weeg in de centrifugebuis (4.8) ongeveer 0,1 g van het bereide monster;
indien het monster een vloeibare olie is, ga dan direct te werk als hier-
onder vermeld; indien het een vast vet is dan moet het worden opgelost
in 0,2 ml hexaan (5.1) met zonodig voorzichtige verwarming.
Voeg 20 mg lipase (5.10) en 2 ml bufferoplossing (5.15) toe. Schud goed
maar zorgvuldig en voeg 0,5 ml natriumcholaatoplossing (5.14) toe en
0,2 ml calciumchlorideoplossing (5.13). Sluit de buis met de geslepen
stop, schud voorzichtig (vermijd natmaken van de stop) en plaats de buis
onmiddellijk in het thermostaatbad (4.17) dat op 40 ± 0,5 ºC wordt
gehouden en schud met de hand gedurende precies één minuut.
Haal de buis uit het thermostaatbad en schud krachtig door middel van het
elektrisch schudapparaat (4.19) gedurende precies twee minuten.
Koel onmiddellijk af onder stromend water; voeg 1 ml zoutzuur (5.12) en
1 ml diëthylether (5.4) toe. Plaats de stop erop en meng krachtig door
middel van het elektrisch schudapparaat. Laat staan en verwijder de orga-
nische laag met de injectiespuit (4.10), zonodig na centrifugering.
8.2. Scheiding van de monoglyceriden door dunne-laagchromatografie.
Breng het extract met de micro-injectiespuit (4.11) aan op de chromato-
grafische plaat, ongeveer 1,5 cm van de benedenrand in een dunne,
uniforme lijn, zo smal mogelijk. Plaats de plaat in de goed verzadigde
ontwikkeltank (4.14) en ontwikkel met de ontwikkelvloeistof (5.7) bij
ongeveer 20 ºC tot ongeveer 1 cm van de bovenrand van de plaat.
Droog de plaat aan de lucht bij de temperatuur van de vloeistoftank en
besproei ze met 2,7-dichloorfluoresceïne-oplossing (5.17). Markeer de
plaats (band) van de monoglyceriden (Rf ongeveer 0,035) onder UV-licht
(4.20).
8.3. Analyse van de monoglyceriden met gas/vloeistofchromatografie.
Verwijder de onder 8.2 verkregen band met een spatel (vermijd daarbij
meenemen van stoffen die op de basislijn zijn achtergebleven) en breng
deze over in de methyleringskolf (4.2).
Behandel het verkregen siliciumdioxide direct volgens de in bijlage X.B
vermelde methodes ten einde de monoglyceriden om te zetten in methy-
lesters en daarna de esters te onderzoeken met gaschromatografie zoals
beschreven in bijlage X.A.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 33
▼B
9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Bereken de samenstelling van de vetzuren op de 2-positie tot op één cijfer
achter de komma (zie opmerking 3).
10. OPMERKINGEN
Opmerking1: Controle van de activiteit van het lipase
Bereid een olie-emulsie door in een geschikte mixer een
mengsel te schudden van 165 ml van een oplossing van
arabische gom (5.21), 15 g ijsschilfers en 20 ml geneutrali-
seerde olie (5.18).
Breng 10 ml van deze emulsie in een bekerglas (4.5), voeg
hieraan 0,3 ml natriumcholaatoplossing (5.20) en 20 ml
gedistilleerd water toe.
Plaats het bekerglas in een waterbad, gethermostatiseerd op
37 ± 0,5 ºC (zie opmerking 4), en breng de elektroden van
een pH-meter (4.21) en een roerstaafje (4.22) in.
Voeg vervolgens door middel van een buret (4.23) druppel
voor druppel de natriumhydroxideoplossing (5.19) toe, tot
een pH van 8,5 is bereikt.
Voeg een voldoende hoeveelheid van een lipaseoplossing
in water (zie hieronder) toe. Zodra de pH-meter een pH
van 8,3 aangeeft, de stopwatch starten (4.24) en druppels-
gewijs de natriumhydroxideoplossing (5.19) toevoegen met
een zodanige snelheid dat de pH op 8,3 blijft. Noteer elke
minuut het verbruikte volume alkalioplossing.
Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij
op de x-as de tijd wordt aangegeven en op de y-as het
volume verbruikte alkalioplossing om de pH constant te
houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn.
De hierboven genoemde lipasesuspensie is een suspensie
van 1 per 1000 (m/m) in water. Voor elke test dient
voldoende van deze suspensie te worden gebruikt, zodat
ongeveer 1 ml van de alkalioplossing in vier tot vijf
minuten wordt verbruikt. Meestal is ongeveer 1—5 mg
van het poeder nodig. De lipase-eenheid wordt gedefineerd
als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 meq zuur vrij-
maakt. Dan wordt de activiteit A van het gebruikte poeder,
uitgedrukt in lipase-eenheden per milligram, berekend aan
de hand van de formule:
A¼V/C110
m
waarin:
V = het volume natriumhydroxideoplossing (5.19)
verbruikt per minuut (berekend uit de grafiek);
m = de hoeveelheid onderzochte lipase, in milligram, van
het poedermonster
Opmerking2: Bereiding van lipase
Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel
verkrijgbaar, maar kan ook in het laboratorium als volgt
worden bereid:
Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 ºC, verwijder al
het omgevende vet en bindweefsel en verklein het restant
in een kogelmolen met fijne messen tot een vloeibare pasta
is overgebleven. Meng deze pasta met het roerstaafje (4.25)
gedurende vier tot zes uur, samen met 2,5 liter watervrij
aceton, en centrifugeer. Extraheer het residu nog driemaal
met hetzelfde volume aceton, dan tweemaal met een l/l (v/
v) mengsel van aceton en diëthylether en ten slotte twee-
maal met diëthylether.
Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuüm; hierdoor
wordt een stabiel poeder verkregen dat in een koelkast
dient te worden opgeslagen.
Opmerking3: Het is in ieder geval aan te raden de samenstelling te
bepalen van het totaal aan vetzuren van hetzelfde monster,1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 34
▼B
aangezien de vergelijking met de samenstelling van de
zuren op de 2-positie nuttig is voor interpretatie van de
verkregen cijfers.
Opmerking4: De hydrolysetemperatuur is vastgesteld op 37 ºC omdat een
vloeibare olie wordt gebruikt. Ze wordt evenwel op 40 ºC
gebracht voor het monster om het onderzoek van vetten
met smeltpunten tot 45 ºC mogelijk te maken.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 35
▼B
BIJLAGEVIII
BEPALING VAN HET GEHALTE VAN TRILINOLEÏNE
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de scheiding en de kwantitatieve
bepaling van de triglyceridensamenstelling van plantaardige oliën, aan de
hand van hun molecuulgewicht, en het aantal dubbele bindingen, uitgedrukt
in hun equivalent koolstofgetal (zie opmerking 1).
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor alle plantaardige oliën die triglyceriden bevatten van
vetzuren met lange keten. De methode geldt in het bijzonder voor de
opsporing van de aanwezigheid van kleine hoeveelheden halfdrogendeoliën (rijk aan linolzuur) in plantaardige oliën die als overwegend onverza-
digd vetzuur oliezuur bevatten, zoals olijfolie.
3. PRINCIPE
Scheiding van triglyceriden, uitgedrukt in hun equivalent koolstofgetal met
hoge-drukvloeistofchromatografie (omgekeerde vaste polariteit) en interpre-
tatie van de chromatogrammen.
4. APPARATUUR
4.1. Hoge-drukvloeistofchromatograaf waarmee thermostatische controle van de
kolomtemperatuur mogelijk is.
4.2. Injectie-eenheid met een capaciteit van 10 mµ/l.4.3. Detector: differentiële refractometer. De gevoeligheid bij volledige schaa-
luitslag dient ten minste 10
−4-eenheid te zijn van de brekingsindex.
4.4. Kolom: buis van roestvrij staal, 250 mm lang en met een binnendiameter
van 4,5 mm, gepakt met siliciumdioxidedeeltjes van 5 µm diameter en
met 22—23 % koolstof in de vorm van octadecylsilaan (zie opmerking 2).
4.5. Recorder en/of integrator.
5. REAGENTIA
De reagentia dienen p.a. te zijn. Elutievloeistoffen dienen ontgast te zijn en
kunnen verschillende malen worden gerecycleerd zonder dat dit invloed
heeft op de scheidingen.
5.1. Chloroform.5.2. Aceton.5.3. Acetonitril.5.4. Elutievloeistof: acetonitril + aceton (verhoudingen moeten worden aange-
past om de gewenste scheiding te verkrijgen; begin met een 50: 50-
mengsel).
5.5. Oplosmiddel: aceton of 1: 1 acetonchloroformmengsel.5.6. Referentieglyceriden: in de handel verkrijgbare triglyceriden (tripalmpitaat,
triolaat, enz.) kunnen worden gebruikt en zo kunnen de retentietijden
worden uitgezet tegen.het equivalente koolstofgetal, of anders kan een met
sojaolie verkregen referentiechromatogram worden opgesteld (zie opmer-
king 3 en 4 en de figuren 1 en 2).
6. BEREIDING VAN MONSTERS
Een 5 % oplossing van de te analyseren monsters wordt bereid door het
afwegen van 0,5 ± 0,001 g van het monster in een kolf met een schaalin-
deling van 10 ml en het bijvullen tot 10 ml met het oplosmiddel (5.5).
7. WERKWIJZE
7.1. Installeer het chromatografiesysteem. Pomp de elutievloeistof (5.4) op in
een tempo van 1,5 ml/mm ten einde het volledige systeem te zuiveren.
Wacht tot een stabiele basislijn wordt verkregen.
Injecteer 10 µl van het volgens punt 6 bereide monster.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 36
▼B
8. BEREKENING EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Gebruik de methode met interne standaard, dat wil zeggen ga ervan uit dat
de som van de piekoppervlakken voor de verschillende triglyceriden gelijk
is aan 100 %. Bereken het relatieve percentage van elk triglyceride aan de
hand van de formule:
% triglyceride =piekoppervlak
som van de piekoppervlakken× 100
waarbij het resultaat met één cijfer achter de komma wordt opgegeven.
Opmerking1: De elutievolgorde kan worden bepaald door het berekenen
van de equivalente koostofgetallen, dikwijls gedefinieerd
met de vergelijking ECN = CN − 2n, waarin CN het kool-
stofgetal is en n het aantal dubbele bindingen; zij kan veel
preciezer worden berekend door rekening te houden met de
oorsprong van de dubbele binding. Indien no,n1en n1nde
aantallen dubbele bindingen zijn die respectievelijk worden
toegeschreven aan oliezuur, linolzuur en linoleenzuur, kan
het equivalent koolstofgetal worden berekend aan de hand
van de formule:
ECN = CN − dono−d1n1−d1nn1n,
waarin de coëfficiënten do,d1en d1nkunnen worden bere-
kend door middel van de referentieglyceriden. Onder de in
deze methode gespecificeerde voorwaarden zal de verkregen
vergelijking dicht liggen bij:
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 n1] − [2,17 n1n].
Opmerking2: Voorbeelden: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art. 50333,
Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art. 50377
of een soortgeijk produkt.
Opmerking3: Met verschillende referentieglyceriden kan ook de resolutie
ten opzichte van triolaat worden berekend
α=RT′
RT′oleaat
door gebruik van de gereduceerde retentietijd RT ′=R T−
RT oplosmiddel
De grafiek van log αtegen f (aantal dubbele bindingen)
maakt het mogelijk de retentiewaarden te bepalen voor alle
triglyceriden van vetzuren in de referentietriglyceriden (zie
figuur 2).
Opmerking4: De efficiëntie van de kolom moet zodanig zijn dat de piek
van LLL (trilinolaat) afkomstig van de triglyceriden duide-
lijk gescheiden is van de aangrenzende RT.
Opmerking5: Voor olijfolie voor verlichting verkregen bij de eerste
persing en voor ruwe oliën uit afvallen van olijven moet de
olie, om een goede scheiding tussen de trilinoleïnepieken en
de pieken daarnaast of de pieken van eventuele interfere-
rende stoffen te verkrijgen, vooraf worden gezuiverd
overeenkomstig de volgende methode.
Men absorbeert 200 µl olie, zonder verdunning, op een sili-
ciumdioxide-extractiekolom van het type SEP PAK silica
cartridge-waters part. nr. 51900.
De triglyceriden worden vervolgens in een tijdspanne van
ten hoogste 20 sec. geëlueerd met 20 ml watervrij hexaan
voor HPLC.
Het eluaat wordt gedroogd met een stikstofstroom en opge-
nomen in isopropanol of aceton (5 ml). 10-20 µl wordt
geïnjecteerd op een HPLC-kolom. Er moet worden geverifi-
eerd of de olie, qua vetzuren, binnen de voor de betrokken
analysemethode geldende fouttolerantie, dezelfde samenstel-
ling heeft vóór en na de zuivering.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 37
▼M11
▼B
Figuur 1
Chromatogram van een monster van sojaolie
P = palmitinezuur
L = linolzuurSt = stearinezuurLn = linoleenzuur
O = oliezuur1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 38
▼B
Figuur 2
Grafiek van log αtegen f (aantal dubbele bindingen)
La = laurinezuur
St = stearinezuurLn = linoleenzuurMy = myristinezuur
O = oliezuur
P = palmitinezuurL = linolzuur1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 39
▼B
BIJLAGEIX
SPECTROFOTOMETRISCH ONDERZOEK IN HET ULTRAVIOLETTE
GEBIED
Opmerking vooraf
Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied kan informatie
verschaffen over de kwaliteit van een vet, de toestand van bewaring en
veranderingen veroorzaakt door technologische processen.
De absorptie bij de in deze methode aangegeven golflengten wordt veroor-
zaakt door de aanwezigheid van dubbele en drievoudig onverzadigde
systemen. Deze absorpties worden uitgedrukt als de specifieke extincties
E1cm1%(de extinctie van een 1 % oplossing van het vet in het aangegeven
oplosmiddel, bij een optische weglengte van 1 cm), en worden volgens
afspraak als K, ook extinctiecoëfficiënt genoemd, opgegeven.
1. DOEL
Deze methode beschrijft de werkwijze voor de uitvoering van een spectro-
fotometrisch onderzoek van vetten in het ultraviolette gebied.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
Het te onderzoeken vet wordt opgelost in het vereiste oplosmiddel, vervol-
gens wordt de extinctie bepaald bij de opgegeven golflengten ten opzichte
van het zuivere oplosmiddel. De specifieke extincties worden uit de afle-
zingen van de spectrofotometer berekend.
3. APPARATUUR
3.1. Een spectrofotometer, geschikt voor metingen in het ultraviolette gebied
tussen 220 en 360 nm, instelbaar tot op de nm nauwkeurig.
3.2. Kwartscuvetten, met deksel, met een optische weglengte van 1 cm. Gevuld
met water of een ander geschikt oplosmiddel mogen de cuvetten onderling
geen verschillen vertonen groter dan 0,01 extinctie-eenheden.
3.3. Maatkolven van 25 ml.
3.4. Chromatografiekolom waarvan het bovenste gedeelte 270 mm lang is en
een doorsnede heeft van 35 mm en het onderste gedeelte 270 mm lang
met een doorsnede van 10 mm.
4. REAGENTIA
4.1. Iso-octaan (2,2,4-trimethylpentaan), voor spectrofotometrische doeleinden:
bij 220 nm moet dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie
hebben van ten minste 60 % en bij 250 nm van ten minste 95 %, of
— cyclohexaan, voor spectrofotometrische doeleinden: bij 220 nm moet
dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie hebben van ten
minste 40 % en bij 250 nm van ten minste 95 %.
4.2. Aluminiumhydroxide, voor kolomchromatografische doeleinden, voorbe-
handeld en gecontroleerd zoals omschreven in aanhangsel I.
4.3. Hexaan voor chromatografische doeleinden.
5. WERKWIJZE
5.1. Het te onderzoeken monster dient volledig homogeen te zijn en vrij van
onzuiverheden. Oliën die bij kamertemperatuur vloeibaar zijn, worden
over papier gefiltreerd bij een temperatuur van ongeveer 30 ºC, vetten
worden gehomogeniseerd en gefiltreerd bij een temperatuur die niet meer
dan 10 ºC boven het smeltpunt ligt.
5.2. Weeg nauwkeurig ongeveer 0,25 g van het voorbehandelde monster af in
een maatkolf van 25 ml, vul aan tot de streep met het aangegeven oplos-
middel en homogeniseer. De verkregen oplossing moet volmaakt helder1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 40
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
zijn. Indien opalescentie of troebeling optreedt dient direct over papier te
worden gefiltreerd.
5.3. Vul een cuvet met deze oplossing en meet de extincties ten opzichte van
het oplosmiddel bij geschikte golflengten tussen 232 en 276 nm.
De gemeten extinctiewaarden moeten tussen 0,1 en 0,8 liggen. Zo niet, dan
moeten de metingen worden herhaald bij een aangepaste inweeg van het
monster.
5.4. Indien een meting van de specifieke extinctie is vereist na het doorlopen
van de aluminiumoxidekolom, ga dan als volgt te werk. Breng in de chro-
matografiekolom 30 g aluminiumoxide in een hexaansuspensie. Verwijder,
nadat de suspensie is uitgezakt, zoveel van de overmaat hexaan dat boven
het aluminiumoxide nog ongeveer 1 cm hexaan staat. Los 10 g volgens
punt 5.1 gehomogeniseerd en gefiltreerd vet op in 100 ml hexaan en giet
de oplossing op de kolom. Verzamel het eluaat en verwijder het oplos-
middel onder vacuüm bij een temperatuur onder 25 ºC. Met het aldus
verkregen vet dient de bepaling onmiddellijk te worden voortgezet, zoals
omschreven in punt 5.2.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
6.1. Geef de specifieke extincties op, die bij de verschillende golflengten als
volgt worden berekend:
Kλ¼Eλ
c/C1s
waarin:
Kλ= specifieke extinctie bij golflengte λ,
Eλ= extinctie, gemeten bij golflengte λ;
c = gehalte van de oplossing, in g/100 ml;
s = optische weglengte, in centimeter.
De resultaten dienen te worden opgegeven met twee cijfers achter de
komma.
6.2. Het spectrofotometrisch onderzoek van olijfolie volgens de officiële bij de
EEG-Verordening voorgeschreven methode vereist de bepaling van de
specifieke extinctie in een iso-octaan oplossing bij golflengten van 232 en
270 nm en de bepaling van de grootheid ∆K volgens de formule:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
waarin:
Km= de specifieke extinctie bij golflengte m, de golflengte van het
absorptiemaximum bij ongeveer 270 nm.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 41
▼B
AANHANGSELI
Bereiding vandealuminiumoxidekolom enhettestenvandeactiviteit
A.1.1. Bereiding van de aluminiumoxidekolom
Breng in een hermetisch afsluitbare kolf een hoeveelheid aluminiumo-
xide, welke gedurende 3 uur in een oven bij een temperatuur van
380—400 ºC is gedroogd, voeg per 100 g aluminiumoxide 5 ml gedistil-
leerd water toe, sluit de kolf onmiddellijk, schud regelmatig en laat
vervolgens gedurende ten minste 12 uur staan alvorens dit te gebruiken.
A.1.2. Controle op de activiteit van het aluminiumoxide
Vul een chromatografiekolom met 30 g aluminiumoxide. Ga hierbij te
werk zoals omschreven in punt 5.4 en leid een mengsel door bestaande
uit:
— 95 % koudgeperste olijfolie van eerste persing met een specifieke
extinctie van minder dan 0,18 bij 268 nm,
— 5 % bij de raffinage met aarde behandelde aardnotenolie met een
specifieke extinctie van ten minste 4,0 bij 268 nm.
Indien de door de kolom gelopen vloeistof een specifieke extinctie van
ten minste 0,11 bij 268 nm heeft dan kan het aluminiumhydroxide
worden gebruikt, zo niet dan moet het percentage water worden opge-
voerd.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 42
▼B
AANHANGSELII
IJkingvandespectrofotometer
A.2. Het apparaat moet regelmatig (ten minste iedere 6 maanden) worden
gecontroleerd op een correcte golflengteaanwijzing en op de nauwkeurig-
heid van de respons.
A.2.1. De golflengte kan worden gecontroleerd met een kwiklamp of met
geschikte filters.
A.2.2. Ga, om de respons van de fotocel en de fotomultiplier te controleren, als
volgt te werk: weeg 0,2000 g kaliumchromaat, voor spectrofotometrische
doeleinden, af in een 1 000 ml maatkolf en los op in 0,05 M kaliumhy-
droxideoplossing en vul hiermee aan tot de streep. Pipetteer 25 ml van
deze oplossing in een 500 ml maatkolf en vul aan tot de streep met
dezelfe kaliumhydroxideoplossing.
Bepaal de extinctie van deze oplossing bij 275 nm, waarbij wordt
gemeten tegen de kaliumhydroxideoplossing. De met een 1 cm cuvet
gemeten extinctie moet 0,200 ± 0,005 bedragen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 43
▼B
BIJLAGEX.A
GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN METHYLESTERS VAN
VETZUREN
1. DOEL
Deze norm beschrijft de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatogra-
fische bepaling met gepakte of capillaire kolom van een mengsel van
methylesters van vetzuren, verkregen volgens bijlage X.B.
Deze norm kan niet worden toegepast op gepolymeriseerde vetzuren.
2. REAGENTIA
2.1.Draaggas
Inert gas (stikstof, helium, argon, waterstof, enz.), zeer goed gedroogd
en met een zuurstofgehalte kleiner dan 10 mg/kg.
Opmerking1: Waterstof, dat uitsluitend als draaggas wordt gebruikt bij
capillaire kolommen, kan de snelheid van de analyse
verdubbelen, maar is gevaarlijk. Veiligheidsvoorzie-
ningen zijn verkrijgbaar.
2.2.Hulpgassen
2.2.1. Waterstof (zuiverheid ten minste 99,9 %), vrij van organisch materiaal.2.2.2. Lucht of zuurstof, vrij van organisch materiaal.
2.3.Standaardmengsel
Een mengsel van methylesters van zuivere vetzuren of de methylesters
van een vetstof met bekende samenstelling, bij voorkeur met dezelfde
vetzuursamenstelling als het te analyseren monster.
Zorg ervoor oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren te voor-
komen.
3. APPARATUUR
De richtlijnen hebben betrekking op apparatuur die gewoonlijk wordt
gebruikt bij gas/vloeistofchromatografie met een gepakte en/of capil-
laire kolom en een vlamionisatiedetector. Elk apparaat waarmee de
efficiëntie en het scheidend vermogen zoals bepaald volgens en aange-
geven in punt 4.1.2 kunnen worden bereikt, is geschikt.
3.1.Gaschromatograaf
De gaschromatograaf dient te bestaan uit de volgende onderdelen:
3.1.1. Injectiestuk
a) voor een gepakte kolom moet een injectiestuk worden gebruikt dat
een zo klein mogelijke dode ruimte heeft (het injectiestuk moet
kunnen worden verwarmd tot een temperatuur die 20 tot 50 ºC hoger
is dan die van de kolom);
b) voor capillaire koloms dient een speciaal ontworpen injectiestuk te
worden gebruikt. Dit injectiestuk mag van het splittype zijn of van
het kolominjectortype.
Opmerking2: Indien geen vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen
aanwezig zijn, mag een beweegbare naaldinjector
worden gebruikt.
3.1.2. Oven
De oven moet de kolom tot ten minste 260 ºC kunnen verwarmen en de
gekozen temperatuur op 1 ºC nauwkeurig kunnen aanhouden voor eengepakte kolom en op 0,1 ºC voor een capillaire kolom. De laatstge-
noemde voorwaarde is van bijzonder belang wanneer een fused-silica
capillaire kolom wordt gebruikt.
Het verdient aanbeveling steeds temperatuur-geprogrammeerde gaschro-
matografie toe te passen, in het bijzonder voor vetzuren met minder dan
16 koolstofatomen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 44
▼B
3.1.3. Gepakte kolom
3.1.3.1. Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren
verbindingen (dat wil zeggen glas of roestvrij staal), van de volgende
afmetingen:
a) lengte: 1 tot 3 m. Er dient een relatief korte kolom te worden
gebruikt als vetzuren met lange ketens (meer dan 20 C-atomen)
aanwezig zijn. Voor de bepaling van C 4- en C 6-vetzuren wordt
een kolom van twee meter aanbevolen;
b) inwendige diameter: 2—4 mm.
Opmerking3: In een roestvrij stalen kolom kunnen meervoudig onver-
zadigde componenten met meer dan drie dubbele
bindingen zich ontleden.
Opmerking4: Er mag een systeem met dubbele gepakte kolommen
worden gebruikt.
3.1.3.2. Pakking
a)Drager: zuurgewassen, gesilaniseerde diatomeeënaarde of elke
andere geschikte inerte drager met een korrelgrootte tussen 125 en
200 µm (onderlinge verschillen niet groter dan 25 µm), afhankelijk
van de inwendige diameter en de lengte van de kolom.
b)Stationaire fase: type polyester van polaire vloeistof (bij voorbeeld
van diëthyleenglycolpolysuccinaat, butaandiolpolysuccinaat, ethy-
leenglycolpolyadipaat, enz.), cyaansiliconen of elke andere vloeistof
die de vereiste chromatografische scheiding mogelijk maakt (zie
punt 4). De stationaire fase moet ongeveer 5—20 % (m/m) van depakking uitmaken. Voor bepaalde scheidingen kunnen apolaire stati-
onaire fasen worden gebruikt.
3.1.3.3. Conditionering van de kolom
Maak, indien mogelijk, de kolom los van de detector en verwarm de
oven geleidelijk tot 185 ºC; laat bij deze temperatuur gedurende ten
minste 16 uur een stroom inert gas door de nieuwe kolom gaan met
een snelheid van 20—60 ml/min. en bij 195 ºC nog eens gedurende 2
uur.
3.1.4. Capillaire kolom3.1.4.1. Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren
verbindingen (gewoonlijk glas of fused silica). Inwendige diameter
0,2—0,8 mm. De binnenzijde dient een adequate behandeling te onder-
gaan (bij voorbeeld voorbehandeling van de oppervlakte, inactivering)
voordat ze met de stationaire fase wordt gecoat. In de meeste gevallen
is een kolom van 25 m voldoende.
3.1.4.2. Stationaire fase: gewoonlijk van het type polyglycol (poly(ethyleen-
glycol) 20000), polyester (butaandiolpolysuccinaat) of polair
polysiloxaan (cyaansiliconen). Er mogen kruiselings verbonden
kolommen worden gebruikt.
Opmerking5: Polaire polysiloxanen kunnen moeilijkheden geven bij
het identificeren en de scheiding van linoleenzuur en
vetzuren van C
20.
De coating moet dun zijn, dat wil zeggen 0,1—0,2 µm.
3.1.4.3. Montage en conditionering van de kolom
Neem de gebruikelijke voorzorgen voor het monteren van capillaire
kolommen, dat wil zeggen bevestiging van de kolom in de oven, keuze
en montage van verbindingsstukken (lekken), plaatsing van de uiteinden
van de kolom in de injector en de detector (beperking van dode
ruimten). Leid een stroom van draaggas onder druk door de kolom (bij
voorbeeld 0,3 bar (30 kPa) voor een kolom van 25 m lengte en een
inwendige diameter van 0,3 mm).
Conditioneer de kolom door de temperatuur in de oven geprogram-
meerd met 3 ºC/min. te verhogen van de omgevingstemperatuur tot
10 ºC onder de ontledingstemperatuur van de stationaire fase. Houd de
oven gedurende 1 uur op deze temperatuur, tot stabilisatie van de basis-
lijn. Verlaag de temperatuur tot 180 ºC en werk onder isotherme
omstandigheden.
Opmerking6: In de handel zijn geschikte, reeds geconditioneerde
kolommen verkrijgbaar.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 45
▼B
3.1.5. Detector
De detector moet bij voorkeur verwarmd kunnen worden tot een tempe-
ratuur die hoger is dan de kolomtemperatuur.
3.2.Injectiespuit
Injectiespuit van maximaal 10 µl, met schaalverdeling in 0,1 µl.
3.3Registratieapparatuur
Als de curve van de registratieapparatuur dient te worden gebruikt voor
de berekening van de samenstelling van het geanalyseerde mengsel, is
een elektronisch registratieapparaat met grote nauwkeurigheid vereist.
Dit apparaat moet compatibel zijn met de overige apparatuur en dient
de volgende kenmerken te hebben:
a) responstijd kleiner dan 1,5 sec., liefst kleiner dan 1 sec. (de respons-
tijd is de tijd die nodig is om de pen van het registratieapparaat van
0 tot 90 % te laten gaan bij een plotseling signaal van 100 %);
b) papierbreedte: minimaal 20 cm;
c) papiersnelheid: regelbaar van 0,4—2,5 cm/min.
3.4.Rekenapparatuur (optioneel)
Elektronische rekenapparatuur (bij voorbeeld een integrator) biedt de
mogelijkheid snelle en nauwkeurige berekeningen uit te voeren. De
integratie moet lineair zijn, een voldoende gevoeligheid hebben en de
correctie van het eventuele verloop van de basislijn moet toereikend
zijn.
4. WERKWIJZE
De in de punten 4.1 tot en met 4.3 beschreven handelingen betreffen
het gebruik van een vlamionisatiedetector.
Als alternatief mag een gaschromatograaf met een katharometer (reage-
rend op verschillen in warmtegeleiding) worden gebruikt. De
werkomstandigheden worden dan gewijzigd als beschreven in punt 6.
4.1.Werkomstandigheden
4.1.1. Bepaling van de optimale werkomstandigheden4.1.1.1. Gepakte kolom
Bij het vaststellen van de optimale werkomstandigheden moet rekening
worden gehouden met de volgende variabelen:
a) lengte en diameter van de kolom;
b) aard en hoeveelheid van de stationaire fase;
c) temperatuur van de kolom;
d) debiet van het draaggas;
e) gewenst scheidend vermogen;
f) de hoeveelheid van het monster, die zodanig moet worden gekozen
dat de detector en de elektrometer een lineaire respons geven;
g) duur van de analyse.
In het algemeen zullen bij de in de tabellen 1 en 2 vermelde waarden
de gewenste resultaten worden verkregen, dat wil zeggen ten minste
2 000 theoretische schotels voor methylstearaat bij een elutie binnen
ongeveer 15 min.
Als de apparatuur dit toelaat, dient het injectiestuk op een temperatuur
te worden gebracht van ongeveer 200 ºC en de detector op een tempe-
ratuur gelijk aan of hoger dan de kolomtemperatuur.
Het debiet van de waterstof naar de vlamionisatiedetector dient in het
algemeen, afhankelijk van de diameter van de kolom, 0,5 tot 1 maal
het debiet van het draaggas te zijn. Het debiet van de zuurstof is onge-
veer 5 tot 10 maal zo groot als die van de waterstof.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 46
▼B
Tabel1
Inwendige diameter van de kolom
(mm)Debiet van het draaggas (ml/min.)
2 15 tot 25
3 20 tot 40
4 40 tot 60
Tabel2
Concentratie van de stationaire fase
(% (m/m))Kolomtemperatuur (ºC)
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Capillaire kolom
De efficiëntie en permeabiliteit van capillaire kolommen brengen mee
dat de scheiding tussen de componenten en de duur van de analyse
sterk afhankelijk zijn van het debiet van het draaggas in de kolom.
Daarom moeten de werkomstandigheden worden geoptimaliseerd door
aanpassing van deze variabele (of eenvoudiger door beïnvioeding van
het drukverval van de kolom), naar gelang men de scheiding wenst te
verbeteren of een snelle analyse wenst.
4.1.2. Bepaling van het aantal theoretische schotels (efficiëntie)
en van het scheidend vermogen
(Zie figuur 1.)Voer de analyse uit met een mengsel van ongeveer gelijke hoeveel-
heden methylstearaat en- oleaat (bij voorbeeld methylesters van
cacaoboter).
Kies de kolomtemperatuur en het debiet van het draaggas zodanig dat
het maximum van de methylstearaatpiek ongeveer 15 minuten na de
oplosmiddelpiek wordt geregistreerd. Gebruik een hoeveelheid van het
mengsel van methylesters die groot genoeg is om een methylstearaat-
piek te krijgen die tot ongeveer driekwart van de hele schaal reikt.
Bereken het aantal theoretische schotels „n” (efficiëntie) met de
formule:
n¼16
dr1
wl/C20/C21
2
en het scheidend vermogen „R” met de formule:
R¼2∆
w1þw2
waarin:
dr1= de retentie-afstand, in millimeter, vanaf de start van het
chromatogram tot het maximum van de piek van methyl-
stearaat;
w1en w2= de basisbreedten, in millimeter, van de pieken voor
methylstearaat en -oleaat, gemeten tussen de snijpunten
van de raaklijnen aan de buigpunten met de basislijn;
∆ = de afstand, in millimeter, tussen de respectieve piekma-
xima van methylstearaat en -oleaat;
en de resolutiefactor „Ir” met de formule1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 47
▼M2
▼M2
a
b
waarin:
a = de hoogte van de laagste piek gemeten ten opzichte van de basis-
lijn;
b= de hoogte van het laagste punt van het dal tussen de twee
aangrenzende pieken, gemeten ten opzichte van de basislijn.
Figuur 1
Chromatogram voor bepaling van het aantal theoretische schotels (efficiëntie) en
het scheidend vermogen
De werkomstandigheden voor de analyse moeten zo worden gekozen
dat per meter kolom voor methylstearaat ten minste 2 000 theoretische
schotels en een scheidend vermogen van ten minste 1,25 worden
verkregen.
4.2.Analysemonster
Neem met de injectiespuit (3.2) 0,1 tot 2 µl van de oplossing van
methylesters die is bereid volgens bijlage X.B en injecteer die in de
kolom.
Bereid in het geval van esters die niet zijn opgelost, een oplossing van
ongeveer 100 mg/ml in heptaan voor chromatografische doeleinden en
injecteer 0,1 tot 1 µl.
Als de analyse betrekking heeft op componenten die slechts in spore-
hoeveelheden aanwezig zijn, mag het analysemonster (tot het
tienvoudige) worden vergroot.
4.3.Analyse
De meeste monsters kunnen bij de onder 4.1.1 beschreven werkomstan-
digheden worden geanalyseerd.
Er kan echter bij een lagere kolomtemperatuur worden gewerkt,
wanneer het een analyse betreft van vetzuren met minder dan 12 kool-1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 48
▼B
▼B
stofatomen, of bij een hogere temperatuur voor een analyse van
vetzuren met meer dan 20 koolstofatomen. Soms kan in beide gevallen
temperatuurprogrammering worden toegepast. Voorbeeld: injecteer,
indien het monster methylesters bevat van vetzuren met minder dan 12
koolstofatomen, het monster bij 100 ºC (of bij 50—60 ºC bij aanwezig-
heid van boterzuur) en programmeer dan direct naar de optimale
temperatuur met 4—8 ºC/minuut. In sommige gevallen mogen beide
werkwijzen worden gecombineerd.
Na de geprogrammeerde verwarming wordt de elutie isotherm voort-
gezet totdat alle componenten zijn geëlueerd. Als de gaschromatograaf
geen inrichting voor temperatuurprogrammering heeft, wordt aanbe-
volen bij twee verschillende temperaturen tussen 100 en 195 ºC te
analyseren.
Aanbevolen wordt zo nodig een analyse uit te voeren met twee statio-
naire fasen van verschillende polariteit om na te gaan dat er geen over
elkaar vallende pieken zijn, bij voorbeeld in het geval dat C18:3en C20:0of C18:3en geconjugeerd C18:2tegelijk voorkomen.
4.4.Referentiechromatogram en referentiegrafieken
Bepaal uit een analyse van het standaardmengsel (2.3) die onder
dezelfde omstandigheden wordt uitgevoerd als voor het onderzoek van
het monster, de retentietijden of retentieafstanden voor de samenstel-
lende vetzuren. Maak op semi-logaritmisch papier, voor een bepaalde
graad van onverzadigdheid, een grafiek door de logaritme van de reten-
tietijd of retentieafstand als functie van het aantal koolstofatomen uit te
zetten. Onder isotherme omstandigheden zullen voor esters met een
rechte keten en een bepaalde graad van onverzadigdheid de getekende
curven vrijwel evenwijdig lopende rechte lijnen zijn.
Het is noodzakelijk omstandigheden te vermijden die leiden tot over
elkaar vallende pieken, dat wil zeggen dat de resolutie onvoldoende is
om twee componenten te scheiden.
5. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN5.1.Kwalitatieve analyse
Identificeer de methylesterpieken van het analysemonster met behulp
van de volgens 4.4 gemaakte grafieken, zo nodig via interpolatie.
5.2.Kwantitatieve analyse
5.2.1. Bepaling van de samenstelling
Gebruik, behoudens uitzonderingen, de methode van de interne norma-
lisatie, dat wil zeggen ga er van uit dat alle componenten van het
monster op het chromatogram worden weergegeven, zodat het totaal
van de oppervlakken onder de pieken 100 % weergeeft van de bestand-
delen (totale elutie).
Als de apparatuur voorzien is van een integrator, gebruik dan de
hiermee verkregen getallen. Als dat niet het geval is, bepaal dan het
oppervlak onder elke piek door middel van driehoeksmeting, dat wil
zeggen door vermenigvuldiging van de piekhoogte met de piekbreedte
op halve hoogte, en houd, indien nodig, rekening met de verschillende
verzwakkerstanden tijdens het opnemen van het chromatogram.
5.2.2. Berekening
5.2.2.1. Algemeen te volgen methode
Bereken het gehalte van een bepaalde component i, uitgedrukt als een
massapercentage van de methylesters, door het percentage van het
oppervlak van de betrokken piek te bepalen ten opzichte van het totale
piekoppervlak, met de formule:
Ai
ΣA/C1100
waarin:
Ai= het oppervlak van de piek van component i;
ΣA = de som van de oppervlakken van alle pieken.
Geef het resultaat op met één decimaal.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 49
▼B
Opmerking7: In dit algemene geval wordt het resultaat van de bereke-
ning op grond van de relatieve oppervlakken geacht de
massapercentages weer te geven. Zie punt 5.2.2.2 voor
de gevallen waarin dit niet mag worden aangenomen.
5.2.2.2. Gebruik van correctiefactoren
In bepaalde gevallen, met name bij aanwezigheid van vetzuren met
minder dan 8 koolstofatomen of van zuren met secundaire groepen en
indien een katharometer wordt gebruikt of wanneer zeer nauwkeurige
analyses nodig zijn, moeten correctiefactoren worden gebruikt om de
percentages van de piekoppervlakken om te rekenen in massapercen-
tages van de componenten.
Bepaal de correctiefactoren met behulp van een chromatogram dat is
verkregen via de analyse van een standaardmengsel van methylesters
waarvan de samenstelling nauwkeurig bekend is en die is uitgevoerdonder dezelfde omstandigheden als voor het onderzoek van het monster.
Voor het standaardmengsel wordt het percentage (m/m) van component
i berekend met de formule:
mi/C1100
Σm
waarin:
mi= de massa van component i in het standaardmengsel;
Σm = de som van de massa's van de verschillende componenten van
het standaardmengsel.
Bereken uit het chromatogram van het standaardmengsel (4.4) het
percentage (oppervlak/oppervlak) van component i op de volgende
wijze:
Ai/C1100
ΣA
waarin:
Ai= het oppervlak van de piek van component i;
ΣA = de som van de oppervlakken van alle pieken.
De correctiefactor wordt nu berekend als volgt:
Ki¼mi/C1ΣA
Ai/C1Σm
Gewoonlijk worden de correctiefactoren uitgedrukt in relatieve factoren
ten opzichte van de correctiefactor van KC16; de relatieve correctiefac-
toren zijn:
K0
i¼Ki
KC16
In het monster wordt het gehalte van een component i, uitgedrukt als
massapercentage van de methylesters, berekend via:
K0
i/C1Ai
ΣK0
i/C1Ai/C0/C1 /C1100
Geef de resultaten op met één decimaal.
5.2.2.3. Gebruik van een interne standaard
In bepaalde gevallen (met name wanneer niet alle zuren worden
bepaald, zoals wanneer vetzuren met 4 en 6 koolstofatomen voorkomen
naast vetzuren met 18 en 19 koolstofatomen, of bij bepaling van de
absolute hoeveelheid van een vetzuur in een monster) moet een interne
standaard worden gebruikt. Daarvoor wordt vaak gebruik gemaakt van
C5,C15of C17. Dan moet de correctiefactor voor de interne standaard
worden bepaald.
Het percentage (m/m) van component i uitgedrukt in methylesters wordt
dan berekend met de formule:1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 50
▼B
ms/C1K0
i/C1Ai
m/C1K0
s/C1As/C1100
waarin:
Ai= het piekoppervlak van component i;
As= het piekoppervlak van de interne standaard;
K′i= de relatieve correctiefactor voor component i ten opzichte van
KC16;
K′s= de relatieve correctiefactor voor de interne standaard ten
opzichte van KC16;
m = de massa van het monster, in milligram;
ms= de massa van de interne standaard, in milligram.
Geef de resultaten op met één decimaal.
6. BIJZONDERE SITUATIE: BEPALING VAN DE TRANS-ISOMEREN
Het is mogelijk om het percentage trans-isomeren in vetzuren met een
aantal koolstofatomen tussen 10 en 24 te bepalen via scheiding van de
methylesters door gebruik van capillaire kolommen met een bepaalde
polariteit.
6.1. Fused-silica capillaire kolom met een lengte van 50 m, inwendige
diameter van 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met cyaanpropilsiliconen
in een dikte van 0,1-0,3 µm (type SP 2340, type SP 2380, CP Sil 88,
Silor 10 of equivalent).
6.2. De methylesters worden bereid volgens werkwijze B van bijlage X.B.
De vetstoffen met een zuurtegraad hoger dan 3 % moeten eerst worden
geneutraliseerd overeenkomstig punt 6.1 van bijlage VII.
6.3. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden
dienen:
— kolomtemperatuur geprogrammeerd van 150 ºC — 230 ºC (b.v.
165 ºC gedurende 15 minuten vervolgens oplopend met 5º per
minuut tot 200 ºC);
— temperatuur van het injectiestuk: 250 ºC als het splitsysteem wordt
gebruikt of bij het kolominjectortype dezelfde begintemperatuur als
de kolom;
— temperatuur van de detector: 260 ºC;— debiet van het draaggas (helium of waterstof): 1,2 ml per minuut.
Injecteer een zodanige hoeveelheid dat bij de toegepaste gevoeligheid
de hoogte van de piek voor methylester van arachidezuur niet lager is
dan 20 % van de volle schaaluitslag.
6.4. De verschillende methylesters worden geïdentificeerd op basis van de
retentietijden en door een vergelijking met standaardmengsels (zie
punt 2.3).
De esters van de trans-vetzuren worden geëlueerd voor de daarmee
corresponderende cis-isomeren. Fig. 2 geeft een voorbeeld van een
chromatogram.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 51
▼M2
▼M2
Figuur 2
Gaschromatogram van de bepaling van trans-isomeren van vetzuren, met
gebruikmaking van een capillaire kolom
6.5. De efficiëntie van de kolom, zoals bepaald overeenkomstig 4.1.2 moet
scheiding van een aantal kritische koppels geven, zoals b.v. het koppel
van de trans-iso-oliezuren en de piek van oliezuur, trans C 18: 1/cis C
18: 1, met een resolutiefactor van meer dan 2.
6.6. Het percentage van de afzonderlijke trans-vetzuren wordt berekend aan
de hand van de verhouding tussen het oppervlak van de betrokken piek
ten opzichte van het totale piekoppervlak.
De in aanmerking te nemen percentages zijn die van de volgende zuren:
— trans-octadeceenzuren (T 18: 1), in bijlage I van deze verordening
aangeduid als het totaal van de isomeren van trans-oliezuren;
— cis-trans- en trans-cis-octadecadieeenzuren [CT + TC) 18:2 ], in
bijlage I van deze verordening aangeduid als het totaal van de
isomeren van trans-linolzuren;
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis, trans-cis-cis-octadeca-
trieenzuren [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3], in bijlage I van
deze verordening aangeduid als het totaal van de isomeren van
trans-linoleenzuren.
Opmerking8: Gelet op de bijzondere kenmerken van deze methode,
moeten de resultaten worden opgetekend met twee deci-
malen.
►M27.◄BIJZONDERE SITUATIE — GEBRUIK VAN EEN KATHARO-
METER (REAGEREND OP VERSCHILLEN IN
WARMTEGELEIDING)
Voor de bepaling van de kwalitieve en kwantitatieve samenstelling van
een mengsel van methylesters van vetzuren mag ook een warmtegelei-
dingsdetector (katharometer) worden gebruikt.
De in de punten 3 en 5 vernielde aanwijzingen moeten dan worden
aangepast zoals vermeld in tabel 3.
Voor kwantitatieve analyse moeten de in punt 5.2.2.2 gedefinieerde
correctiefactoren worden gebruikt.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 52
▼B
▼B
Tabel3
Variabele Waarde/voorwaarde
Kolom Lengte: 2—4 m
Inwendige diameter: 4 mm
Drager Korrelgrootte tussen 160 en
200 µm
Bedekkingsgraad 15 % (m/m) — 25 % (m/m)
Draaggas Helium of, indien niet voor-
handen, waterstof met een zo laag
mogelijk zuurstofgehalte
Hulpgassen Geen
Temperatuur van het injectiestuk 40 tot 60 ºC boven de kolomtem-
peratuur
Kolomtemperatuur Tussen 180 en 200 ºC
Debiet van het draaggas Tussen 60 en 80 ml/minuut
Geïnjecteerde hoeveelheden Tussen 0,5 en 2 µl
►M28.◄VERSLAG
Vermeld in het verslag de resultaten en de methoden die zijn gebruikt
voor de bereiding van de methylesters en de gaschromatografische
analyse. Vermeld tevens details bij de uitvoering die niet in deze inter-
nationale norm zijn aangegeven of die als optioneel worden beschouwd,
en voorts bijzonderheden die waarschijnlijk van invloed zijn geweest op
de resultaten.
Geef in het verslag alle gegevens die nodig zijn voor de volledige iden-
tificatie van het monster.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 53
▼M19
BIJLAGEX.B
BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN VAN OLIJ-
FOLIE EN OLIE UIT AFVALLEN VAN OLIJVEN
Beide onderstaande methoden worden aanbevolen voor de bereiding van methy-
lesters van vetzuren van olijfolie en olie uit afvallen van olijven.
Methode A: Koude omestering door middel van een methanoloplossing van
kaliumhydroxide.
Methode B: Warme methylering door middel van een methanoloplossing van
natriummethylaas, gevolgd door een verestering in een zuur
milieu.
De keuze van de methode hangt af van de te bepalen analytische parameter en
de categorie van de olie, zoals hieronder vermeld:
a) Bepaling van het verschil tussen het werkelijke en het theoretische gehalte
aan triglyceriden volgens ECN42 ( ∆ECN42):
— Methode A wordt toegepast op monsters van alle categorieën olie, nadat
de olie is gezuiverd via een kolom van silicagel.
b) Bepaling van de vetzuursamenstelling:
— Methode A wordt direct toegepast op monsters van de hieronder
volgende categorieën olie:
— Olijfoliën van de eerste persing met een gehalte aan vrije vetzuren
van minder dan 3,3 %.
— Geraffineerde olijfolie.— Olijfolie (mengsel van olijfoliën van de eerste persing en geraffi-
neerde olijfolie).
— Geraffineerde olie uit afvallen van olijven.— Olie uit afvallen van olijven (mengsel van olijfoliën van de eerste
persing en geraffineerde olie uit afvallen van olijven).
— Methode B wordt direct toegepast op monsters van de hieronder volgende
categorieën olie:
— Olijfolie van de eerste persing met een gehalte aan vrije vetzuren van
meer dan 3,3 %.
— Ruwe olie uit afvallen van olijven.
c) Bepaling van de vetzuren van de trans-isomeren:
— Methode A wordt direct toegepast op monsters van de hieronder
volgende categorieën olie:
— Olijfoliën van de eerste persing met een gehalte aan vrije vetzuren
van minder dan 3,3 %.
— Geraffineerde olijfolie.— Olijfolie (mengsel van olijfoliën van de eerste persing en geraffi-
neerde olijfolie).
— Geraffineerde olie uit afvallen van olijven.
— Olie uit afvallen van olijven (mengsel van olijfoliën van de eerste
persing en geraffineerde olie uit afvallen van olijven).
— Methode A wordt toegepast op monsters van de volgende categorieën
olie, nadat de olie is gezuiverd via een kolom van silicagel:
— Olijfolie van de eerste persing met een gehalte aan vrije vetzuren van
meer dan 3,3 %.
— Ruwe olie uit afvallen van olijven.
ZUIVERING VAN OLIEMONSTERS
Indien nodig worden de monsters gezuiverd door deze door een kolom silicagel
te voeren; als oplosmiddel voor elutie wordt hexaan/diethyloxide (87:13 v/v)
gebruikt, zoals beschreven in de IUPAC 2.507-methode.
Het is ook mogelijk als alternatief extractie in de vaste fase toe te passen, onder
gebruikmaking van patronen silicagel. Plaats een patroon silicagel (1 g, 6 ml) in
een apparaat voor elutie onder vacuüm en was met 6 ml hexaan. Hef het
vacuüm op om te voorkomen dat de kolom uitdroogt. Breng vervolgens in de
kolom een oplossing van olie (ongeveer 0,12 g) in 0,5 ml hexaan en pas het
vacuüm weer toe, opdat de oplossing in het silicium binnendringt; elueer vervol-
gens met 10 ml hexaan/diethyloxide (87:12 v/v) onder vacuüm. Homogeniseer
het totaal van de eluaten en verdeel deze in twee gelijke volumes. Laat een
van de volumes tot uitdroging verdampen in een draaibaar verdamptoestel onder
verminderde druk en bij omgevingstemperatuur. Los het residu op in 1 ml1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 54
▼M19
heptaan. De verkregen oplossing is klaar voor de analyses van vetzuren door
CPG. Laat het tweede volume verdampen en los het residu op in 1 ml aceton
voor de analyse van de triglyceriden door HPCL, indien nodig.
METHODEN VOOR DE BEREIDING VAN DE METHYLESTERS VAN
VETZUREN
1.Methode A: Koude omestering door middel van een methanoloplos-
sing van kaliumhydroxide
1.1.Toepassing
Deze snelle methode wordt toegepast op olijfolie en olie uit afvallen
van olijven met een gehalte aan vrije vetzuren van minder dan 3,3 %.
De vrije vetzuren worden niet veresterd door het kaliumhydroxide. De
ethylesters van vetzuren transveresteren langzamer dan de glyceride-
esters en het is mogelijk dat zij slechts gedeeltelijk methyleren.
1.2.Principe
De methylesters worden gevormd door omestering in een methanolop-
lossing van kaliumhydroxide, als tussenfase voor de verzeping (punt 5
van de methode in ISO 5509:2000, punt 5 van de IUPAC 2.301-
methode).
1.3.Reagentia
Methanol met hoogstens 0,5 % (m/m) water.
Heptaan voor chromatografie.
Kaliumhydroxide, methanoloplossing van ca. 2 N: los 11,2 kaliumhy-
droxide op in 100 ml methanol.
1.4.Materiaal
Reageerbuisjes met schroefsluiting (capaciteit 5 ml), met een dop die
voorzien is van een PTFE-dichting.
Pipetten, met schaalverdeling of automatische, van 2 ml en 0,2 ml.
1.5.Werkwijze
Weeg ca. 0,1 g van het oliemonster af in een reageerbuisje van 5 ml
met schroefsluiting. Voeg 2 ml heptaan toe en schud. Voeg 0,2 ml van
de methanoloplossing van 2 N kaliumhydroxide toe, sluit met behulp
van de dop die van een PTFE-dichting is voorzien, sluit goed af en
schud krachtig gedurende 30 seconden. Laat rusten totdat het bovenste
deel van de oplossing helder wordt. Schenk de bovenste laag af; dat is
de laag waarin zich de methylesters bevinden. De heptaanoplossing is
gereed om in de chromatograaf ingebracht te worden. Het verdient
aanbeveling om de oplossing in de koelkast te laten tot het ogenblik
van de chromatografische analyse. Het is af te raden de oplossing
langer dan twaalf uur te bewaren.
2.Methode B: Warme methylering met behulp van een methanoloplos-
sing van natriummethylaat, gevolgd door een verestering in een zuur
milieu
2.1.Toepassing
Deze methode is van toepassing op olijfolie en olie uit afvallen van
olijven met een gehalte aan vrije vetzuren van meer dan 3,3 %.
2.2.Principe
Neutralisering van de vrije vetzuren en alkalische methanolisering van
glyceriden, gevolgd door verestering van de vetzuren in een zuur milieu
(punt 4.2 van de IUPAC 2.301-methode).
2.3.Reagentia
— Heptaan voor chromatografie.
— Methanol met hoogstens 0,05 % water (m/m).— Natriummethylaat, 0,2 N methanoloplossing: los 5 g natrium op in
1 000 ml methanol (kan worden bereid met behulp van handelsop-
lossingen).1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 55
▼M19
— Fenolftaleïne, 0,2 methanoloplossing.
— Zwavelzuur in de 1 N methanoloplossing: voeg 3 ml zwavelzuur
van 96 % toe aan 100 ml methanol.
— Verzadigde oplossing van natriumchloride in het water.
2.4.Materiaal
— Volumetrische kolf met een capaciteit van 50 ml, met platte bodem
en lange, nauwe geslepen hals.
— Terugstroomkoeler. Luchtkoeler (1 m lang) voorzien van een
geslepen dichting.
— Kookregelaar.
— Glazen trechter.
2.5.Werkwijze
Schenk ongeveer 0,25 g oliemonster in een volumetrische kolf van
50 ml met een geslepen hals. Voeg met behulp van de trechter 10 ml
van de 0,2 N methanoloplossing van natriummethylaat en de kookrege-
laar toe. Bevestig de terugstroomkoeler, schud en breng aan de kook.
De oplossing moet na ongeveer tien minuten helder worden. Na 15
minuten is de reactie praktisch voltooid. Neem de kolf van de warmte-
bron, wacht het einde van de terugstroom af, verwijder de koeler en
voeg twee druppels van de fenolftaleïneoplossing toe. Voeg enkele
ml 1 N zwavelzuur toe aan de methanoloplossing totdat deze kleurloos
wordt; voeg er daarna nog eens 1 ml aan toe. Sluit de koeler aan en
breng opnieuw aan de kook gedurende ongeveer 20 minuten. Neem de
kolf van de warmtebron en laat afkoelen onder een luchtstroom.
Verwijder de koeler, voeg 20 ml van de verzadigde natriumchlorideop-
lossing toe en schud. Voeg 5 ml heptaan toe, sluit de kolf en schud
krachtig gedurende 15 seconden.
Laat bezinken tot de volledige scheiding van de twee fasen. Voeg
opnieuw 20 ml van de verzadigde natriumchlorideoplossing toe, totdat
de waterige fase het onderste deel van de hals van de kolf bereikt. De
bovenste laag die zich in de hals van de kolf bevindt, is de laag die de
methylesters bevat. De verkregen oplossing is gereed om in de chroma-
tograaf te worden ingebracht.
Voorzorgsmaatregel: De methylering volgens methode B moet in een
geventileerde zuurkast worden uitgevoerd.
2.6.Alternatieven voor de methylering volgens methode B
2.6.1.MethodeC
2.6.1.1. Principe
De te analyseren vetstof wordt, bij 100 ºC, behandeld met een metha-
noloplossing van zoutzuur in een gesloten flesje.
2.6.1.2. Materiaal
— Flesje van dik glas met een inhoud van ca. 5 ml (hoogte 40 x 45 mm,
diameter 14 à 16 mm).
— Pipetten, met schaalverdeling, van 1 en 2 ml.
2.6.1.3. Reagentia
Oplossing van zoutzuur in 2 % methanol, bereid uit gasvormig zoutzuur
en watervrij methanol (opmerking 1).
Hexaan voor chromatografie
Opmerking1: Het is mogelijk handelsoplossingen van zoutzuur in
methanol te gebruiken. In het laboratorium kunnen
gemakkelijk kleine hoeveelheden gasvormig zoutzuur
worden bereid en wel door de handelsoplossing
(p = 1,18) te wijzigen, door de toevoeging van enkele
druppels geconcentreerd zwavelzuur. Aangezien
methanol zeer gemakkelijk zoutzuur opneemt, is het
goed bij de oplossing alle mogelijke voorzorgsmaatre-
gelen te treffen (bijvoorbeeld het gas inbrengen met
behulp van een kleine omgekeerde trechter, die juist
reikt tot het niveau van het methanol). Het is mogelijk
vooraf grote hoeveelheden methanoloplossingen van
zoutzuur te bereiden, die in het donker, in flessen met
een glazen stop, uitstekend bewaard kunnen worden. Dit1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 56
▼M19
reagens kan eveneens worden bereid door acetylchloride
op te lossen in het watervrije methanol.
2.6.1.4. Werkwijze
— Schenk in het glazen flesje 0,2 g van de vetstof die vooraf is
gedroogd aan natriumsulfaat en gefiltreerd en daarna 2 ml van de
methanoloplossing van zoutzuur. Sluit het flesje.
— Dompel het flesje gedurende 40 minuten onder bij 100 ºC.— Laat het flesje onder een luchtstroom afkoelen, open het en voeg
2 ml gedestilleerd water en 1 ml hexaan toe.
— Centrifugeer en extraheer de hexaanfase, gereed voor gebruik.
2.6.2.MethodeD
2.6.2.1. Principe
De geanalyseerde vetstof wordt onder terugstroming verhit met
methanol, hexaan en zwavelzuur. De verkregen methylesters worden
geëxtraheerd met petroleumether.
2.6.2.2. Materiaal
— Proefbuis met een capaciteit van ca. 20 ml met een terugstroom-
koeler (met behulp van lucht) van ca. 1 m lang, voorzien van een
geslepen dichting.
— Pipet, met schaalverdeling, van 5 ml.— Afschenktrechter van 50 ml.
— Reageerbuisjes van 10 ml en 25 ml.
— Proefbuis, met konische bodem, van 15 ml.
2.6.2.3. Reagentia
— Reagens voor methylering: watervrij methanol, hexaan en geconcen-
treerd zwavelzuur (p = 1,84 in de verhouding 75:25:1 (V/V/V).
— Petroleumether 40-60 ºC.
— Watervrij natriumsulfaat.
2.6.2.4. Werkwijze
Schenk 0,1 g olie in de buis van 20 ml en voeg 5 ml van het methyle-
ringsreagens toe.
Bevestig de terugstroomkoeler en verwarm gedurende 30 minuten tot
kookpunt in een waterbad (opmerking 2).
Breng het mengsel kwantitatief over naar een afschenktrechter van
50 ml met 10 ml gedestilleerd water en 10 ml petroleumether. Schud
krachtig en wacht totdat de scheiding van de fasen plaats heeft
gevonden. Scheid de waterachtige fase en was de geëtherde laag twee-
maal met 20 ml gedestilleerd water. Voeg in de trechter een kleine
hoeveelheid watervrij natriumsulfaat toe, schud, laat enkele minuten
rusten en filtreer, waarbij het filtraat in een buis van 15 ml met koni-
sche bodem wordt opgevangen.
Laat het oplosmiddel verdampen in een waterbad onder een stikstof-
stroom.
Opmerking2: Breng, om kookvertraging te voorkomen, een glazen
staafje in de buis en laat de temperatuur van het
waterbad niet boven 90 ºC stijgen.
3.Precisieparameters
De statistische evaluatie van de nauwkeurigheid van de methoden A en
B is gepubliceerd door de Internationale Olijfolieraad in zijn methode
COI/T.20/CO. nr. 24.
AANBEVELINGEN VOOR DE GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE
IN DE GASFASE VAN DE ESTERS VAN VETZUREN VAN OLIJFOLIE
EN OLIE UIT AFVALLEN VAN OLIJVEN
1.Werkwijze
De gaschromatografische analyse in de gasfase van oplossingen van
vetesters in hexaan wordt uitgevoerd overeenkomstig de norm ISO
5508, met behulp van een capillaire kolom (50 m lang x 0,25 of
0,32 mm binnenwerkse diameter), bedekt met cyanopropylsilicon, zoals
aangegeven voor de bepaling van vetzuren en trans-isomeren (COI/
T.20/Doc. nr. 17).1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 57
▼M19
Figuur 1 laat het typerende chromatografische profiel zien van een olie
uit afvallen van olijven die methyl- en ethylesters bevat van vetzuren en
trans-isomeren van methylesters.
2.Berekeningen
2.1. Om de vetzuursamenstelling en ∆ECN42 te berekenen, moet met de
volgende vetzuren rekening worden gehouden:
Myristinezuur (C14:0).
Palmitinezuur (C16:0). Som van de oppervlakken van de pieken die
overeenkomen met de methyl- en de ethylesters.
Palmitoleïnezuur (C16:1). Som van de oppervlakken van de pieken die
overeenkomen met de isomeren ω9enω7van het methylester, het
ethylester en de trans-isomeren van het methylester.
Heptadekaanzuur (C17:0).Heptadeceenzuur (C17:1).
Stearinezuur (C18:0).
Oleïnezuur (C18:1). Som van de oppervlakken van de pieken die over-
eenkomen met de isomeren ω9enω7van het methylester, het
ethylester en de trans-isomeren van het methylester.
Linolzuur (C18:2). Som van de oppervlakken van de pieken die over-
eenkomen met de methyl- en ethylesters en de trans-isomeren van het
methylester.
Arachidonzuur (C20:0).
Linoleenzuur (C18:3). Som van de oppervlakken van het methylester en
de trans-isomeren van het methylester.
Eïscoseneenzuur (C20:1)Beheenzuur (C22:0)
Lignocereenzuur (C24:0).
Voor de berekening van het totale oppervlak behoeft met squaleen geen
rekening te worden gehouden.
2.2. Voor de berekening van het percentage trans-C18:1 wordt de piek
gebruikt die met de methylesters van dit vetzuur overeenkomt. Voor
de som (trans-C18:2 + trans-C18:3) worden alle pieken die overeen-
komen met de trans-isomeren van deze twee vetzuren, bij elkaaropgeteld. Om het totale oppervlak te berekenen, wordt met alle pieken
die in punt 2.1 worden genoemd (zie COI/T.20/Doc. nr. 17) rekening
gehouden.
Voor het berekenen van het percentage van elk vetzuur wordt onder-
staande formule toegepast:% X = (oppervlak X × 100)/(totale
oppervlak)1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 58
▼M19
Figuur 1: Met behulp van de methode van koude methylering verkregen
chromatografisch profiel van een olie uit afvallen van olijven. De chro-
matografische pieken komen, tenzij anders aangegeven, overeen met de
methylesters.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 59
▼B
BIJLAGEXI
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN GEHALOGENEERDE OPLOS-
MIDDELEN
1. BEGINSEL
Gaschromatografische bepaling met behulp van de head-space techniek.
2. APPARATUUR
2.1. Gaschromatograaf, voorzien van een electron capture detector (ECD).
2.2. Instrumentatie voor head-space gaschromatografie.2.3. Glazen gaschromatografiekolom met een lengte van 2 m en een diameter
van 2 mm, stationaire fase.
OV101 10 % gelijkwaardig, op gecalcineerde, met zuur gewassen en gesi-
laniseerde diatomeeënaarde met korrelgrootte 80—100 Mesh.
2.4. Draaggas en hulpgas: stikstof voor gaschromatografie, geschikt voor elec-
tron capture detection.
2.5. Glazen flesjes van 10 tot 15 ml, bekleed met teflon en voorzien van een
stop van aluminium met een opening voor het inbrengen van een injectie-
spuitje.
2.6. Klemmen voor hermetische sluiting.2.7. Gasinjectiespuitje van 0,5 tot 2 ml.
3. REAGENTIA
Standaard: gehalogeneerde oplosmiddelen met een voor gaschromatografie
adequate zuiverheidsgraad.
4. WERKWIJZE
4.1. Weeg een nauwkeurig bepaalde hoeveelheid van ongeveer 3 g olie af in
een glazen flesje (dat achteraf niet meer mag worden gebruikt) en sluit
het flesje met de stop hermetisch af. Het flesje bij 70 ºC gedurende een
uur in eén thermostaat plaatsen. Neem uit de gasruimte met de injectiespuit
0,2 tot 0,5 ml op. Injecteer in de kolom van de als volgt ingestelde gaschro-
matograaf:
— temperatuur injector: 150 ºC;
— temperatuur kolom: 70—80 ºC;— temperatuur detector: 200—250 ºC.
Eventueel mag op andere temperaturen worden ingesteld, op voorwaarde
dat de resultaten gelijkwaardig zijn.
4.2. Referentieoplossingen. Maak standaardoplossingen aan met geraffineerde
olijfolie zonder sporen van oplosmiddelen en met verschillende concentra-
ties van gehalogeneerde oplosmiddelen tussen 0,05 en 1 ppm,
overeenkomstig het veronderstelde gehalte van het monster. Gebruikpentaan voor eventuele verdunning.
4.3. Kwantitatieve evaluatie. Bepaal de verhouding tussen de oppervlakten of de
hoogten van de pieken van het monster en de standaardoplossing waarvan
de concentratie verondersteld wordt het dichtst bij die van het monster te
liggen. Als de relatieve afwijking groter is dan 10 % moet de analyse
worden overgedaan door verrijking met een nieuwe standaardoplossing, en
dit totdat de concentratie niet meer dan 10 % afwijkt. Het gehalte wordt
bepaald op basis van een gemiddelde van elementaire injecties.
4.4. Weergave van de resultaten. De resultaten worden uitgedrukt in mg/kg
(ppm). De detectiegrens van de methode is 0,01 mg/kg.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 60
▼M19
BIJLAGEXII
ORGANOLEPTISCHE BEOORDELING VAN OLIJFOLIE VAN EERSTE
PERSING
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Hierbij worden de criteria vastgesteld voor de beoordeling van de organo-
leptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie in de zin
van punt 1 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG, en wordt de
methode voor de desbetreffende indeling van deze olie aangegeven.
Deze methode geldt slechts voor de indeling van olijfolie van eerste persing
uit een oogpunt van fruitigheid en van intensiteit van de gebreken, bepaald
door een overeenkomstig punt 4 samengesteld panel van geselecteerde en
getrainde proevers.
2. ALGEMEEN
Ten aanzien van de algemene basisterminologie, het proeflokaal, de alge-
mene methodiek en het proefglas is het aan te bevelen de voorschriftenvan de Internationale Olijfolieraad te volgen.
3. SPECIFIEKE TERMINOLOGIE3.1.Positieve kenmerken
Fruitig: het geheel van rechtstreeks of retronasaal waargenomen reukge-
waarwordingen, afhankelijk van de olijvensoort en kenmerkend voor de
van verse en gezonde, rijpe of onrijpe, vruchten vervaardigde olie.
Bitter: kenmerkende smaak van olijfolie die uit onrijpe of rijpende olijven
is verkregen.
Scherp: prikkelend gevoel in de mond, kenmerkend voor aan het begin van
het seizoen en hoofdzakelijk uit nog onrijpe olijven verkregen olie.
3.2.Negatieve kenmerken
Olijvengisting : flavour die kenmerkend is voor olie uit in hopen opgeslagen
olijven waarvan de anaerobe gisting ver gevorderd is.
Schimmel — vochtigheid : flavour die kenmerkend is voor olie uit olijven
waarop schimmels zijn gegroeid doordat de vruchten enkele dagen bij
vochtige omstandigheden zijn opgeslagen.
Droesem: flavour die kenmerkend is voor olie die in contact is gebleven
met het bezinksel in de tanks en bakken.
Wijnachtig — azijn : flavour die kenmerkend is voor sommige oliën die
doen denken aan wijn of azijn. Deze gewaarwording is hoofdzakelijk te
wijten aan de gisting van de olijven waardoor azijnzuur, ethylacetaat en
ethanol ontstaan.
Metaal: flavour die doet denken aan metaal. Zij is kenmerkend voor olie
die tijdens het malen, het mengen, het persen of de opslag lang in contact
is geweest met metalen oppervlakken.
Ranzig: flavour van oliën die oxidatie hebben ondergaan.
Gekooktofverbrand : flavour die kenmerkend is voor olie die wordt veroor-
zaakt door te sterke en/of te lange verhitting tijdens de productie en met
name bij het mengen van de massa olijvenvruchtvlees met ondeugdelijke
verhitting.
Hooi—hout : flavour die kenmerkend is voor oliën uit droge olijven.
Robuust: gewaarwording die kenmerkend is voor sommige oliën die bij het
proeven in de mond een gevoel van dichtheid en kleverigheid veroorzaken.
Smeermiddelen : flavour van olijfolie, die doet denken aan stookolie, vet of
minerale olie.
Vruchtwater : flavour die te wijten is aan langdurig contact met vrucht-
water.
Pekel: flavour van olie uit olijven die zijn bewaard in pekel.
Esparto: flavour die kenmerkend is voor olie die is verkregen uit olijven
die zijn geperst in nieuwe persmanden van esparto. De gewaarwording1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 61
▼M19
kan verschillen naargelang de persmanden van ongedroogd of gedroogd
esparto zijn gemaakt.
Grond: flavour van olie uit olijven waaraan grond of modder zat en die niet
zijn gewassen.
Wormstekig : flavour van olie uit olijven die zijn aangetast door larven van
de olijfvlieg (Bactrocera oleae).
Komkommer : flavour van olie die kenmerkend is voor te lange hermetische
bewaring, met name in blikken, en die wordt toegeschreven aan het
ontstaan van 2-6 nonadienal.
4. PANEL
Het panel wordt door de lidstaat aangewezen en bestaat uit een voorzitter
en acht tot twaalf proevers. Voor het verkoopseizoen 2001/2002 mag het
panel echter minder dan acht proevers tellen.
De voorzitter van het panel moet degelijk zijn opgeleid en een ervaren
expert voor de verschillende soorten olijfolie zijn. Hij is verantwoordelijk
voor het panel, voor de organisatie en het functioneren ervan en hij is
belast met de voorbereidingen, de codering van de monsters en de aanbie-
ding ervan aan de proevers, alsmede met het verzamelen en de statistische
verwerking van de gegevens.
De voorzitter van het panel selecteert de proevers en zorgt voor hun trai-
ning en de controle van hun werk zodat zij een hoog bekwaamheidsniveau
kunnen aanhouden.
De panelleden bij organoleptische tests van olijfolie moeten geselecteerd en
getraind zijn op grond van hun vermogen om soortgelijke monsters van
elkaar te onderscheiden, overeenkomstig de handleiding van de Internatio-
nale Olijfolieraad voor de selectie, de opleiding en de controle van
gekwalificeerde proevers van olijfolie van de eerste persing.
De panels moeten zich ertoe verbinden deel te nemen aan organoleptische
beoordelingen op nationaal, communautair of internationaal niveau voor de
periodieke controle en de harmonisering van de perceptiecriteria. Voorts
moeten zij de betrokken lidstaat jaarlijks in kennis stellen van alle gege-
vens over de samenstelling van het panel en het aantal beoordelingen die
zij als erkend panel hebben uitgevoerd.
5. PROCEDURE VOOR DE ORGANOLEPTISCHE BEOORDELING EN
DE INDELING
5.1.Gebruik van het beoordelingsformulier door het panellid
Het door het panellid te gebruiken beoordelingsformulier is opgenomen in
aanhangsel A.
Elke proever die deel uitmaakt van het panel, moet aan de in een proefglas
aangeboden olie ruiken en die vervolgens proeven(1) om de reuk, de
smaak, het mondgevoel en de kinestesische kenmerken te analyseren.
Vervolgens moet hij op het beoordelingsformulier de intensiteit vermelden
waarmee hij de negatieve en positieve kenmerken gewaarwordt.
Wanneer negatieve kenmerken worden waargenomen die niet op het formu-
lier voorkomen, moeten die worden aangegeven in de rubriek „Andere”
met de in punt 3.2 van deze bijlage omschreven termen die de gewaarwor-
ding het best weergeven.
5.2.Verwerking van de gegevens door de voorzitter van het panel
De voorzitter van het panel moet de door de panelleden ingevulde beoorde-
lingsformulieren inzamelen; hij moet de voor elk kenmerk vermelde
intensiteit controleren. Wanneer hij een anomalie constateert, vraagt hij
het betrokken panellid zijn beoordelingsformulier te herzien en eventueel
de test over te doen.
De voorzitter van het panel kan de door elk panellid vermelde gegevens
verwerken in een programma dat gebruikmaakt van de in aanhangsel B
beschreven methode voor de berekening van de statistische mediaan. De
gegevens van een monster moeten worden ingevoerd aan de hand van een1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 62
(1) Het panellid hoeft niet te proeven wanneer een uiterst onaangenaam kenmerk wordt
waargenomen; hij moet deze uitzonderlijke situatie in het beoordelingsformulier
vermelden.
▼M19
rooster met tien kolommen voor de tien kenmerken en met zoveel regels
als er panelleden zijn.
Wanneer in de rubriek „Andere” door minstens de helft van de panelleden
een negatief kenmerk is vermeld, moet de voorzitter van het panel voor dit
kenmerk de mediaan berekenen en de olie in de corresponderende categorie
indelen.
Wanneer tests worden verricht om na te gaan of de normen in acht zijn
genomen of in het kader van tegenexpertises, moet de voorzitter van het
panel driemaal een organoleptische beoordeling van de olie laten uitvoeren
met een tussenpoos van ten minste één dag na elke test; de mediaan van de
kenmerken wordt dan berekend op basis van de gegevens in de beoorde-
lingsformulieren van de drie tests.
5.3.Indeling van de oliën
De olie wordt ingedeeld bij één van de onderstaande categorieën naar
gelang van de mediaan voor de gebreken en de mediaan voor het kenmerk
fruitig. Onder mediaan voor de gebreken wordt verstaan de mediaan voor
het negatieve kenmerk dat is waargenomen met de grootste intensiteit. De
robuuste variatiecoëfficiënt voor dat gebrek mag niet hoger zijn dan 20 %.
a)Extra olijfolie van de eerste persing : de mediaan voor de gebreken is
gelijk aan 0 en de mediaan voor de fruitigheid is hoger dan 0.
b)Olijfolie van de eerste persing : de mediaan voor de gebreken is hoger
dan 0, maar niet hoger dan 2,5 en de mediaan voor de fruitigheid is
hoger dan 0.
c)Courante olijfolie van de eerste persing : de mediaan voor de gebreken
is hoger dan 2,5, maar niet hoger dan 6,0; of de mediaan voor de
gebreken is niet hoger dan 2,5 en de mediaan voor fruitigheid is gelijk
aan 0.
d)Olijfolie van de eerste persing voor verlichting : de mediaan voor de
gebreken is hoger dan 6,0.
Met ingang van 1 november 2003 worden de categorieën c) en d) echter
vervangen door de categorie:
c)Olijfolie voor verlichting : de mediaan voor de gebreken is hoger dan
2,5; of de mediaan voor de gebreken is niet hoger dan 2,5 en de
mediaan voor fruitigheid is gelijk aan 0.
5.4.Bijzondere gevallen
Wanneer de mediaan voor een ander positief kenmerk dan „fruitig” hoger
is dan 5,0, moet de voorzitter van het panel dit op het beoordelingsformu-
lier vermelden.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 63
▼M19
AANHANGSELA
1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 64
▼M19
AANHANGSELB
METHODE VOOR DE BEREKENING VAN DE MEDIAAN EN DE
BETROUWBAARHEIDSINTERVALLEN
Mediaan
De mediaan is het reële getal Xm gekenmerkt door het feit dat de kans (P) dat
de waarden van de verdeling (X) lager liggen dan dat getal (Xm), kleiner is dan
of gelijk is aan 0,5 en dat tegelijkertijd de kans (P) dat de waarden van de
verdeling (X) kleiner zijn dan of gelijk zijn aan Xm, groter is dan of gelijk is
aan 0,5. Volgens een andere definitie is de mediaan het 50e percentiel van een
naar opklimmende grootte gerangschikte reeks getallen. De mediaan is met
andere woorden de middelste waarde van een gerangschikte reeks oneven
getallen of het gemiddelde van de twee middelste waarden van een gerang-
schikte reeks even getallen.
Robuuste standaardafwijking
Om de variabiliteit rond de mediaan op betrouwbare wijze te kunnen schatten,
moet de robuuste standaardafwijking volgens het model van Stuart en Kendall
worden geschat. De asymptotische standaardafwijking S wordt bepaald door N
en IQR. N is het aantal waarnemingen en IQR de interkwartielafstand, d.w.z. de
robuuste schatting van de variabiliteit van de betrokken gegevens (de interkwar-
tielafstand omvat precies 50 % van de gevallen van ongeacht welke
waarschijnlijkheidsverdeling). De intervalafstand wordt berekend op basis van
de afstand tussen het 75e en 25e percentiel.
IQR = 75epercentiel — 25epercentiel
Het percentiel is de waarde Xpc gekenmerkt door het feit dat de kans (P) dat de
waarden van de verdeling lager liggen dan Xpc, kleiner is dan of gelijk is aan
een bepaald honderdste en dat tegelijkertijd de kans (P) dat de waarden van de
verdeling kleiner zijn dan of gelijk zijn aan Xpc, groter is dan of gelijk is aan
het genoemde honderdste. Het honderdste geeft het in aanmerking genomen
gedeelte van de verdeling weer. In het geval van de mediaan betreft het 50/100.
Het percentiel is met andere woorden de verdelingswaarde die overeenstemt met
een bepaald oppervlak dat wordt begrensd door de verdelings- of dichtheids-
kromme. Zo is het 25e percentiel de verdelingswaarde die overeenstemt met
een oppervlak van 0,25 of 25/100.
Robuuste variatiecoëfficiënt
RVC is een natuurlijk getal, d.w.z. zonder exponent, dat het percentage weer-
geeft van de variabiliteit van de onderzochte getallenreeks ten opzichte van de
waarde Me van de mediaan; daarom is deze coëfficiënt zeer nuttig bij het beoor-
delen van de betrouwbaarheid van de panelleden.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 65
▼M19
Betrouwbaarheidsinterval van 95 % voor de mediaan
Het betrouwbaarheidsinterval (B.I.) van 95 % (foutenmarge van de eerste soort
gelijk aan 0,05 of 5 %) is de marge waarbinnen de mediaan zou kunnen variëren
wanneer de test een oneindig aantal keren zou worden herhaald. In de praktijk
geeft dat interval de variabiliteit van de test aan in de vastgestelde omstandig-
heden wanneer de test een oneindig aantal keren zou worden herhaald. Het
interval draagt, evenals de RVC, bij tot de beoordeling van de betrouwbaarheid
van de test.
B.I. S sup. = Me + (c.S)B.I. S inf. = Me - (c.S)waarbij c, in het geval van het
betrouwbaarheidsinterval 0,95, 1,96 bedraagt.
De oliën worden ingedeeld door de waarden van de mediaan te vergelijken met
de in punt 5.3 van de bijlage vastgestelde referentie-intervallen. Met de
programmatuur kan de indeling visueel worden voorgesteld in de vorm van een
tabel met statistische gegevens of in de vorm van een grafiek.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 66
▼B
BIJLAGEXIII
NEUTRALISERING EN ONTKLEURING VAN OLijFOLIE IN HET
LABORATORIUM
1. NEUTRALISERING EN ONTKLEURING VAN OLIJFOLIE IN HET
LABORATORIUM
1.1.Neutralisering van de olijfolie
1.1.1. Apparatuur
— hoog bekerglas van 300 ml;
— laboratoriumcentrifuge met buisjes van 100 ml;— bekerglas van 250 ml;
— kolven van 100 ml;
— scheitrechter van 1 liter.
1.1.2. Reagentia
— natriumhydroxyde, oplossing van 12 % in water;
— fenolftaleïne, oplossing van 1 % in ethanol;
— hexaan, p.a.
— isopropylalcohol, p.a.
1.1.3. Werkwijze
a)Oliënmeteengehalte aanvrijevetzurenbeneden 30%,berekend als
oliezuur
Breng in een hoog bekerglas van 300 ml, 50 g ruwe olie en verwarm
in een waterbad tot 65 ºC. Voeg onder langzaam roeren een zodanige
hoeveelheid natriumhydroxydeoplossing (12 %) toe als overeenkomt
met het gehalte aan vrije vetzuren van de olie, met een overmaat van
5 %. Blijf gedurende 5 minuten roeren en houd de temperatuur op
65 ºC.
Breng alles over in centrifugebuisjes van 100 ml en centrifugeer de
zeeppasta af. Giet de geklaarde olie af in een bekerglas van 250 ml
en was met 50—60 ml kokend gedestilleerd water. Verwijder de
waterlaag met behulp van een hevel. Herhaal het wassen tot alle over-
blijvende sporen van zeep zijn verdwenen (tot de fenolftaleïne niet
meer rose kleurt). Centrifugeer de olie af om de kleine resten water
te verwijderen.
b)Olïen met een gehalte aan vrije vetzuren boven 30 %, berekend als
oliezuur
Breng in een scheitrechter van 1 liter 50 g ruwe olie, 200 ml hexaan,
100 ml isopropylalcohol en een zodanige hoeveelheid natriumhydro-
xydeoplossing (12 %) als overeenkomt met het gehalte aan vrije
vetzuren van de olie, met een overmaat van 0,3 %. Roer flink gedu-
rende een minuut, voeg 100 ml gedestilleerd water toe, roer nogmaals
en laat staan. Na scheiding van de lagen de zeephoudende onderlaag
lagen wegvloeien. Tussen de twee lagen (olie boven en waterige laag
onder) ontstaat vaak een tussenlaag, bestaande uit slijmige en niet
oplosbare stoffen, die eveneens moet worden verwijderd. Was vervol-
gens de hexaanoplossing van neutrale olie met porties van 50—60 ml
van een oplossing van een volumedeel isopropylalcohol in een
volumedeel gedestilleerd water tot de fenolftaleïne geen rose kleuring
meer geeft.
Verwijder vervolgens het hexaan volledig door destillatie onder
vacuüm (bij voorbeeld door middel van een roterende verdamper).
1.2.Ontkleuring van de geneutraliseerde olie
1.2.1. Apparatuur
— kolf van 250 ml met drie ingeslepen halzen voor het inbrengen van:
a) een thermometer ingedeeld in ºC en geschikt voor aflezingen tot
90 ºC;
b) een mechanische roerder met een toerental van 250—300 omw/
min en voorzien van een inrichting voor bedrijf onder vacuüm;1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 67
▼M6
▼B
▼B
c) een aansluiting voor de vacuümpomp;
— vacuümpomp, in staat een resterende druk te geven van 15—30 mbar,
en voorzien van een manometer.
1.2.2 Werkwijze
Weeg in de driehalskolf ca. 100 g van de geneutraliseerde olijfolie af.
Breng de thermometer en de roerder aan; sluit de vacuümpomp aan en
verwarm onder roeren tot 90 ºC, houd onder voortdurend roeren deze
temperatuur aan totdat de te analyseren olie volledig watervrij is (onge-
veer 30 minuten).
Zet de vacuümpomp af en voeg 2 tot 3 g geactiveerde bleekaarde toe.
Breng het vacuüm opnieuw tot stand tot een resterende druk van
15—30 mbar en roer steeds bij een temperauur van 90 ºC gedurende 30
minuten bij 250 omw/min.
Filtreer vervolgens warm in een oven met thermostaat (50—60 ºC).1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 68
▼M19
▼B
BIJLAGEXV
1. BEPALINGEN VAN HET OLIEGEHALTE VAN DE AFVALLEN VAN
OLIJVEN
1.1.Toestellen
Geschikt extractietoestel; inhoud van de kolf 200 à 250 ml.Bad met elektrische verwarming (zandbad, waterbad, enz.) op verwar-
mingsplaat.
Analystische balans.Droogoven, ingesteld op maximaal 80 ºC.Elektrische droogstoof, voorzien van een temperatuurregelaar en de moge-
lijkheid om lucht in te blazen of een gereduceerde druk te bewerkstelligen,
ingesteld op 103 ºC ± 2 ºC.
Machinale molen, die gemakkelijk kan worden gereinigd en waarmede men
in staat is te malen zonder dat het materiaal warm wordt en zonder dat het
vocht- en oliegehalte van het gemalen produkt verminderen.
Mortier en stamper van porselein, ijzer of brons of bij voorkeur geschikt
machinaal fijnmaaltoestel.
Extractiehuls en watten of filtreerpapier, vrij van in n-hexaan oplosbare
stoffen.
Exsiccator.Zeef met gaten 1 mm doorsnede.
Puimsteen in kleine korrels, vooraf gedroogd.
1.2.Reagentia
n-Hexaan technisch, waarvan het residu bij volledige verdamping minder
bedraagt dan 0,002 g/100 ml.
2. WERKWIJZE
2.1.Bereiding van het analysemonster
Maal het analysemonster indien nodig in het vooraf goed gereinigd maal-
toestel. Verwijder daartoe het eerste maalsel (ongeveer 1/20 deel van het
analysemonster) en maal de rest zodanig dat deeltjes worden verkregen
die volledig door de zeef gaan. Meng zorgvuldig en analyseer onmiddellijk.
2.2.Monsterweging
Weeg onmiddellijk na het malen tot op 0,01 g nauwkeurig ongeveer 10 g
van het analysemonster af.
2.3.Gereedmaken van de extractiehuls
Breng de proefeenheid in de huls en sluit deze met een watje af.Pak, indien filtreerpapier wordt gebruikt, de proefeenheid in dit papier.
2.4.Voordrogen
Plaats wanneer het monster zeer vochtig is (gehalte aan water en vluchtige
bestanddelen, vochtgehalte meer dan 10 %) de gevulde huls of het in
filtreerpapier verpakte monster enige tijd in de tot maximaal 80 ºC
verwarmde stoof om het vochtgehalte tot minder dan 10 % terug te
brengen.
2.5.Gereedmaken van de kolf
Weeg tot op 0,001 g nauwkeurig een kolf die 1 à 2 korrels puimsteen bevat
en die tevoren is gedroogd bij een temperatuur van 103 ± 2 ºC en gedu-
rende ten minste een uur in een exsiccator is afgekoeld.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 69
▼B
2.6.Eerste extractie
Plaats de huls of het in filtreerpapier verpakte monster in het extractietoe-
stel, giet in de kolf de benodigde hoeveelheid hexaan. Bevestig de kolf aan
het extractietoestel en plaats het geheel op het elektrische verwarmingsbad.
Verwarm zodanig dat de terugvloei ten minste 3 druppels/seconde bedraagt
(matig, niet heftig koken).
Extraheer gedurende 4 uur.Laat het geheel afkoelen.Neem de huls uit het extractietoestel en plaats haar in een luchtstroom ter
verwijdering van het grootste deel van het oplosmiddel waarmee de huls is
doordrenkt.
2.7.Tweede extractie
Ledig de huls in de mortier en maak het geheel zo fijn mogelijk. Breng het
mengsel weer kwantitatief in de huls en plaats de huls in het extractietoe-
stel en zet de extractie nog twee uur voort, met gebruikmaking van
dezelfde kolf die het eerste extract bevat. De in de extractiekolf verkregen
oplossing dient helder te zijn.
Filtreer indien dit niet het geval is de oplossing over een filtreerpapier. Was
de kolf en het filtreerpapier meerdere malen met hexaan uit.
Verzamel het filtraat en het voor het wassen gebruikt oplosmiddel in een
tweede kolf, die vooraf werd gedroogd en gewogen op 0,001 g nauwkeurig.
2.8.Verwijdering van het oplosmiddel en weging van het extract
Verwijder het grootste deel van het oplosmiddel uit de kolf door afdistil-
leren op een elektrisch verwarmingsbad.
Verwijder de laatste sporen oplosmiddel door verhitting van de kolf gedu-
rende 20 minuten bij een temperatuur van 103 ± 2 ºC.
Vergemakkelijk deze verwijdering, hetzij door van tijd tot tijd lucht of bij
voorkeur een inert gas in te blazen, hetzij door onder verminderde druk te
werken. Laat de kolf gedurende ten minste 1 uur in een exsiccator afkoelen
en weeg tot op 0,001 g nauwkeurig.
Verwarm opnieuw gedurende 10 minuten onder dezelfde omstandigheden,
laat afkoelen in een exsiccator en weeg.
Het verschil tussen deze beide wegingen mag niet groter zijn dan 0,010 g;
anders dient opnieuw steeds gedurende 10 minuten te worden verwarmd
gevolgd door afkoelen en wegen totdat het gewichtsverschil ten hoogste
0,010 g bedraagt.
Noteer het resultaat van de laatste weging van de kolf.Verricht twee bepalingen op hetzelfde analysemonster.
3. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN3.1.Berekeningswijze en formule
a) Bereken het oliegehalte in gewichtspercenten van het onbehandelde
produkt met de formule:
S=m
1×100
m0
waarin:
S = gehalte aan olie in massaprocenten van het onbehandelde
produkt;
m0= massa, in grammen van de proefeenheid;
m1= massa, in grammen van de olie die bij de laatste weging in de
kolf is gevonden.
Indien aan de eisen inzake de reproduceerbaarheid is voldaan, neemt
men als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen.
Druk de resultaten uit met één decimaal.
b) Op verzoek kan het oliegehalte worden uitgedrukt ten opzichte van de
droge stof en berekend met de formule:1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 70
▼B
olie in massaprocenten van de droge stof = S ×100
100 − U
waarin:
S = gehalte aan olie in massaprocenten van het onbehandelde produkt
(zie a);
U = vochtgehalte in %.
3.2.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door dezelfde
analist gelijktijdig en snel na elkaar worden verricht mag niet meer
bedragen dan 0,2 g voor het met behulp van hexaan verkregen extract uit
100 g monster.
Indien dit niet het geval is, moet de bepaling worden herhaald met twee
andere analysemonsters.
Neem, indien ditmaal het verschil nog groter is dan 0,2 g, als resultaat het
rekenkundig gemiddelde van de vier verrichte bepalingen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 71
▼B
BIJLAGEXVI
BEPALING VAN HET JOODGETAL
1. DOEL
Deze internationale norm beschrijft een methode voor de bepaling van het
joodgetal van dierlijke en plantaardige oliën en vetten, hierna te noemen
vetstoffen.
2 DEFINITIE
In het kader van deze internationale norm geldt de volgende definitie:
2.1. Joodgetal: de hoeveelheld jodium die door het analysemonster wordt opge-
nomen onder de omstandigheden die in deze internationale norm zijn
gespecificeerd.
Het joodgetal wordt uitgedrukt in grammen jodium per 100 g analysemon-
ster.
3. PRINCIPE
Een analyseportie wordt opgelost in een oplosmiddel, waarna Wijs-reagens
wordt toegevoegd. Na een bepaalde tijd worden een kaliumjodideoplossing
en water toegevoegd en vervolgens wordt het vrijgemaakte jodide geti-
treerd met natriumthiosulfaatoplossing.
4. REAGENTIA
Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn.
4.1. Water, dat voldoet aan de eisen van ISO 3896, kwaliteit 3.4.2. Kaliumjodideoplossing, 100 g/l, zonder vrij jodium of jodaat.4.3. Zetmeeloplossing
Meng 5 g oplosbaar zetmeel met 30 ml water, en voeg dit mengsel toe aan
1 000 ml kokend water; laat 3 minuten koken en laat afkoelen.
4.4. Volumetrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing
c(Na
2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l die niet ouder is dan 7 dagen.
4.5. Oplosmiddel, bereid door menging van gelijke volumes cyclohexaan en
azijnzuur.
4.6. Wijs-reagens met joodmonochloride in azijnzuur. Er dient in de handel
verkrijgbaar Wijs-reagens te worden gebruikt.
Opmerking: De reagens bevat 9 g ICl3+ 9 g I in azijnzuur.
5. APPARATUUR
Normale laboratoriumapparatuur en in het bijzonder:
5.1. Glazen weegschaaltjes die geschikt zijn voor de analyseportie en die in de
Erlenmeyers (5.2) kunnen worden gebracht.
5.2. Erlenmeyers van 500 ml, met ingeslepen glazen stop en volledig droog.
6. BEREIDING VAN HET ANALYSEMONSTER
Droog het gehomogeniseerde monster op natriumsulfaat en filtreer.
7. WERKWIJZE
7.1. Analyseportie
De analyseportie heeft, naar gelang van het verwachte joodgetal, de in tabel
1 vermelde grootte.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 72
▼B
Tabel1
Verwacht joodgetal Grootte analyseportie
Kleiner dan 5 3,00 g
5 t/m 20 1,00 g
21 t/m 50 0,40 g
51 t/m 100 0,20 g
101 t/m 150 0,13 g
151 t/m 200 0,10 g
Weeg de analyseportie in een glazen weegschaaltje (6.1) af op 0,1 mg
nauwkeurig.
7.2. Bepaling
Breng de analyseportie in een Erlenmeyer (5.2) van 500 ml. Voeg 20 ml
van het oplosmiddel (4.5) toe om de vetstof op te lossen. Voeg exact
25 ml van het Wijs-reagens (4.6) toe, sluit de kolf af, schud met een draai-
ende beweging en plaats de Erlenmeyer in het donker. Gebruik geen
mondpipet voor het Wijs-reagens.
Bereid op dezelfde wijze een blanco met het oplosmiddel en de reagens,
maar zonder de analyseportie.
Laat de Erlenmeyers voor monsters met een joodgetal van minder dan 150
gedurende 1 uur in het donker staan; laat de Erlenmeyers voor monsters
met een joodgetal boven 150 en voor gepolymeriseerde produkten of
produkten die in aanzienlijke mate zijn geoxideerd, gedurende 2 uur in het
donker staan.
Voeg na afloop van die periode 20 ml van de kaliumjodideoplossing (4.2)
en 150 ml water (4.1) toe in elk van de Erlenmeyers.
Titreer met de volumtrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing
(4.4) totdat de gele kleur als gevolg van het jodium vrijwel is verdwenen.
Voeg enkele druppels van de zetmeeloplossing (4.3) toe en ga verder met
het titreren totdat de blauwe kleur verdwijnt na heftig schudden.
Opmerking: Potentiometrische bepaling van het eindpunt is toegestaan.
7.3. Aantal bepalingen
Voer twee bepalingen uit op hetzelfde analysemonster.
8. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het joodgetal is
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
waarin:
c = de concentratie in mol per liter van de gebruikte volumetrische
gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing (4.4);
V1= het volume, in ml, van de volumetrische gestandaardiseerde
natriumthiosulfaatoplossing (4.4) dat is gebruikt voor de blanco;
V2= het volume, in ml, van de volumetrische gestandaardiseerde
natriumthiosulfaatoplossing (4.4) dat is gebruikt voor de bepaling;
m = de hoeveeldheid, in grammen, van de analyseportie (7.1).
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen,
voor zover aan de eis inzake herhaalbaarheid is voldaan.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 73
▼M11
BIJLAGEXVII
METHODE VOOR DE BEPALING VAN STIGMASTADIËNEN IN
PLANTAARDIGE OLIËN
1. DOEL
Bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën met lage concentraties
van deze koolwaterstoffen, met name in olijfolie verkregen bij de eerste
persing en olie uit afvallen van olijven.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm kan worden gebruikt voor alle plantaardige oliën, hoewel de
metingen alleen betrouwbaar zijn wanneer het gehalte aan deze koolwa-
terstoffen tussen 0,01 en 4,0 mg/kg ligt. De methode is vooral geschikt
om te bepalen of olijfolie verkregen bij de eerste persing, geraffineerde
plantaardige oliën (olijfolie, olie uit afvallen van olijven, zonnebloemolie,
palmolie, enz.) bevat, aangezien geraffineerde olie stigmastadiënen bevat
en olie verkregen bij de eerste persing niet.
3. PRINCIPE
Bereiding van het onverzeepbare residu. De steroïd-koolwaterstoffractie
wordt geïsoleerd met behulp van kolomchromatografie over silicagel en
geanalyseerd met behulp van capillaire gaschromatografie.
4. APPARATUUR
4.1. Kolven, 250 ml, met refluxkoeler.4.2. Scheitrechters, 500 ml.4.3. Rondbodemkolven, 100 ml.4.4. Rotatieverdamper.4.5. Glazen chromatografiekolom (inwendige diameter 1,5-2,0 cm en lengte
50 cm) met een teflon kraan en een pluk glaswol of een schijf gesinterd
glas op de bodem. Schenk voor de bereiding van de chromatografiekolom
een laag van ongeveer 5 cm hexaan in de kolom en voeg vervolgens in
porties een slurrie van silicagel in hexaan toe (15 g in 40 ml). Laat de
kolom eerst spontaan en vervolgens door licht te vibreren uitzakken.
Voeg watervrij natriumsulfaat toe totdat het vloeistofpeil ongeveer
0,5 cm is gestegen en elueer ten slotte de overmaat van hexaan.
4.6. Gaschromatograaf met vlamionisatiedetector, splitinjector of koude kolo-
minjector en een met een nauwkeurigheid van ± 1 ºC programmeerbare
oven.
4.7. Fused-silica capillaire kolom voor gaschromatografie (inwendige
diameter 0,25 of 0,32 mm, lengte 25 m), inwendig gecoat met een 5 %
fenylmethylsilicon-fase met een laagdikte van 0,25 µm.
NB1
Ook andere kolommen met een soortgelijke of lagere polariteit kunnen
worden gebruikt.
4.8. Integrerende recorder met een instelling voor dal/dal-integratie.4.9. Micro-injectiespuit voor gaschromatografie, 5-10 µl, met geharde naald.
4.10. Elektrische verwarmingsmantel of -plaat.
5. REAGENTIA
Alle reagentia moeten p.a. zijn, tenzij een andere specificatie wordt
gegeven. Het gebruikte water moet gedestilleerd zijn of minimaal
dezelfde zuiverheidsgraad hebben.
5.1. Hexaan of een mengsel van alkanen met een kooktraject van 65-70 ºC,
gedestilleerd met een fractioneerkolom.
NB2
Het oplosmiddel moet worden gedestilleerd om verontreinigingen te
verwijderen.
5.2. Ethanol, 96 % (v/v).1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 74
▼M11
5.3. Natriumsulfaat, watervrij.
5.4. Alcoholische kaliumhydroxideoplossing, 10 %: voeg 10 ml water toe aan
50 g kaliumhydroxide, roer en los vervolgens het mengsel op in ethanol
(aanvullen tot 500 ml).
NB3
Deze oplossing wordt na verloop van tijd bruin en moet dan ook elke dag
vers worden bereid en in een goed afgesloten fles van donker glas
worden bewaard.
5.5. Silicagel 60 voor kolomchromatografie, 70-230 mesh (Merck ref. nr.
7734 of soortgelijk).
NB4
Meestal kan silicagel zonder behandeling rechtstreeks uit de verpakking
worden gebruikt. Sommige partijen kunnen echter een lage activiteit
hebben, hetgeen leidt tot slechte chromatografische scheidingen. In dat
geval moet de silicagel als volgt worden behandeld: activeer de silicagel
door deze gedurende minimaal vier uur op 550 ºC te verhitten. Laat
daarna de silicagel in een exsiccator afkoelen en breng deze vervolgens
over in een gesloten fles. Voeg 2 % water toe en schud tot er geen
klonten meer zichtbaar zijn en het poeder vrij stroomt. Als een partij sili-
cagel chromatogrammen met overlappende pieken oplevert, moet de
silicagel op dezelfde manier worden behandeld. Het is ook mogelijk extra
zuivere silicagel 60 te gebruiken (Merck, ref. nr. 7754).
5.6. Voorraadoplossing (200 ppm) cholesta-3,5-dieen (Sigma, 99 % zuiver) in
hexaan (10 mg in 50 ml).
5.7. Standaardoplossing: 20 ppm cholesta-3,5-dieen in hexaan, verkregen door
verdunning van bovengenoemde oplossing.
NB5
Indien de oplossingen in de punten 5.6 en 5.7 bij minder dan 4 ºC worden
bewaard, blijven zij minimaal vier maanden goed.
5.8. Oplossing de n-nonacosaan in hexaan (ongeveer 100 ppm).
5.9. Draaggas voor chromatografie: helium of waterstof, zuiverheid
99,9990 %.
5.10. Hulpgassen voor de vlamionisatiedetector: waterstof, zuiverheid 99,9990,
en gezuiverde lucht.
6. WERKWIJZE
6.1.Bereiding van het onverzeepbare residu.
6.1.1. Weeg 20 ± 0,1 g olie af in een kolf van 250 ml (punt 4.1), voeg 1 ml
standaardoplossing cholesta-3,5-dieen (20 µg) en 75 ml alcoholische
kaliumhydroxideoplossing, 10 %, toe, bevestig de refluxkoeler en laat de
oplossing gedurende 30 minuten zachtjes koken. Stop met verwarmen en
laat de oplossing enigszins afkoelen (laat niet helemaal afkoelen, aange-
zien het monster dan gaat stollen). Voeg 100 ml water toe en breng de
oplossing met behulp van 100 ml hexaan over in een scheitrechter (punt
4.2). Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden en laat het
vervolgens uitzakken.
NB6
Voeg, indien een emulsie ontstaat die niet snel verdwijnt, kleine hoeveel-
heiden ethanol toe.
6.1.2. Breng de waterige onderlaag over in een tweede scheitrechter en extra-
heer opnieuw met 100 ml hexaan. Tap opnieuw de onderlaag af en was
de hexaanextracten (samengevoegd in een andere scheitrechter) drie keer
met telkens 100 ml van een ethanol/watermengsel (1 : 1) tot een neutrale
pH wordt bereikt.
6.1.3. Droog de hexaanoplossing over watervrij natriumsulfaat (50 g), was met
20 ml hexaan en damp de oplossing droog in een rotatieverdamper bij
30 ºC en lage druk.
6.2.Isolatie van de steroïd-koolwaterstoffractie.
6.2.1. Breng het residu op de fractioneerkolom met behulp van twee porties
hexaan van 1 ml. Laat het monster in de kolom zakken door het niveau
van de oplossing te laten dalen tot de bovenkant van de natriumsulfaat-
laag. Begin de elutie met hexaan met een stroomsnelheid van ongeveer1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 75
▼M11
1 ml/min. Gooi de eerste 25-30 ml eluaat weg en vang de volgende 40 ml
op. Breng deze fractie vervolgens over in een rondbodemkolf van 100 ml
(punt 4.3).
NB7
De eerste fractie bevat verzadigde koolwaterstoffen (zie figuur 1a) en de
tweede fractie de steroïd-koolwaterstoffen. Bij verdere elutie verschijnen
squaleen- en soortgelijke verbindingen. Om een goede scheiding tussen
de verzadigde en de steroïd-koolwaterstoffen te krijgen moeten de fractie-
volumes worden geoptimaliseerd. Hiertoe moet het volume van de eerste
fractie zodanig worden aangepast dat bij analyse van de tweede fractie de
pieken van de verzadigde koolwaterstoffen (zie figuur 1c) laag zijn. Als
deze pieken niet verschijnen, maar de piek van de standaard laag is, moet
het volume worden verlaagd. Een volledige scheiding tussen de compo-
nenten van de eerste en de tweede fractie is overigens niet nodig,
aangezien de pieken elkaar bij gaschromatografie niet overlappen als de
bij punt 6.3.1 vermelde werkomstandigheden worden gehanteerd.
Meestal hoeft het volume van de tweede fractie niet te worden geoptima-
liseerd, aangezien er een goede scheiding is met de verbindingen die later
elueren. Een grote piek bij een retentietijd van ongeveer 1,5 min. lager
dan de standaard, wordt echter veroorzaakt door squaleen en wijst op
een slechte scheiding.
6.2.2. Damp de tweede fractie bij 30 ºC en verlaagde druk in de rotatiever-
damper droog. Neem het residu onmiddellijk op in 0,2 ml hexaan en
bewaar de oplossing in de koelkast tot deze geanalyseerd wordt.
NB8
De residu's van de punten 6.1.3 en 6.2.2 mogen niet droog bij kamertem-
peratuur worden bewaard. Zodra ze worden verkregen, moet het
oplosmiddel worden toegevoegd en daarna moeten ze in de koelkastworden bewaard.
6.3.Gaschromatografie.
6.3.1. Werkomstandigheden voor splitinjector:
— Injectortemperatuur: 300 ºC.
— Detectortemperatuur: 320 ºC.
— Integrator/recorder: De piek-integratieparameters moeten zodanig
worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakten wordt
verkregen. Aanbevolen wordt de integrator in te stellen op dal/dal-
integratie.
— Gevoeligheid: ongeveer 16 keer de minimumverzwakking.— Geïnjecteerde hoeveelheid oplossing: 1 µl.
— Programmering oventemperatuur: eerst 235 ºC gedurende zes minuten
en daarna oplopend met 2 ºC/min. tot 285 ºC.
— Splitverhouding injector: 1 : 15.
— Draaggas: helium of waterstof bij een druk van ongeveer 120 kPa.
Deze omstandigheden kunnen afhankelijk van de kenmerken van de chro-
matograaf en de kolom zodanig worden aangepast dat chromatogrammen
worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen: de piek van de
interne standaard moet binnen ongeveer vijf minuten van de bij punt
6.3.2 vermelde retentietijd liggen; de hoogte van de piek van de interne
standaard moet minimaal 80 % van de volledige schaaluitslag zijn.
De gaschromatografieopstelling moet worden gecontroleerd door een
mengsel van de voorraadoplossing van cholesta-3,5-dieen (punt 5.6) en
de oplossing van n-nonacosaan (punt 5.8) te injecteren. De piek van
cholesta-3,5-dieen moet vóór die van n-nonacosaan verschijnen (figuur
1c); wanneer dit niet gebeurt, kan de temperatuur van de oven worden
verlaagd en/of kan de kolom worden vervangen door een kolom met een
lagere polariteit.
6.3.2. Identificatie van de pieken
De piek van de interne standaard verschijnt bij een retentietijd van onge-
veer 19 minuten en stigmasta-3,5-dieen bij een relatieve retentietijd van
ongeveer 1,29 (figuur 1b). Naast stigmasta-3,5-dieen worden kleine
hoeveelheden van een isomeer geëlueerd, die meestal geen aparte chro-
matografische piek opleveren. Als de kolom te polair is of een te hoge
resolutie heeft, kan de isomeer echter als een kleine piek vlak voor die
van stigmasta-3,5-dieen verschijnen (figuur 2). Om ervoor te zorgen dat
de stigmastadiënen als één piek worden geëlueerd, verdient het aanbeve-
ling de kolom te vervangen door een kolom met een lagere polariteit of
een grotere inwendige diameter.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 76
▼M11
NB9
Een referentie voor stigmastadiënen kan worden verkregen door de
analyse van een geraffineerde plantaardige olie met een kleinere monster-
hoeveelheid (1-2 g). Hierbij leveren stigmastadiënen een duidelijke en
gemakkelijk te identificeren piek op.
6.3.3. Kwantitatieve analyse
Het gehalte aan stigmastadiënen wordt berekend met de volgende
formule:
stigmastadiënen (mg/kg) =As/C2Mc
Ac/C2Mo.
Hierbij is: As= piekoppervlak stigmastadiënen (als de piek in twee
isomeren gesplitst is het totale oppervlak van de
twee pieken);
Ac= piekoppervlak interne standaard (cholestadieen);
Mc= toegevoegde hoeveelheid interne standaard in µg;
Mo= massa van het oliemonster in g.
Detectielimiet: ongeveer 0,01 mg/kg.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 77
▼M11
Figuur 1
Gaschromatogrammen van olijfoliemonsters over een fused-silica capil-
laire kolom (inwendige diameter 0,25 mm en lengte 25 m), gecoat met
5 % fenylmethylsilicon met een laagdikte van 0,25 µm.
a) Eerste fractie (30 ml) van een olijfolie van eerste persing met interne
standaard.
b) Tweede fractie (40 ml) van een olijfolie met 0,10 mg/kg stigmasta-
diënen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 78
▼M11
c) Tweede fractie (40 ml) met een kleine hoeveelheid van de eerste
fractie.
Figuur 2
Gaschromatogram van een monster van geraffineerde olijfolie over een
DB-5-kolom met het isomeer van stigmasta-3,5-dieen.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 79
▼M13
BIJLAGEXVIII
BEPALING VAN TRIACYLGLYCEROLEN MET ECN42 (VERSCHIL
TUSSEN HPLC-GEGEVENS EN THEORETISCH GEHALTE)
1.Doel
Bepaling van de samenstelling van triacylglycerolen (TAG's) in olij-
folie, uitgedrukt als het equivalent koolstofgetal, aan de hand van de
verschillen tussen de analyseresultaten verkregen met hogedrukvloei-
stofchromatografie (HPLC) en het theoretische gehalte berekend op
basis van de vetzuursamenstelling.
2.Toepassingsgebied
De norm geldt voor olijfolie. De methode geldt voor het detecteren van
de aanwezigheid van kleine hoeveelheden zaadolie (rijk aan linolzuur)
in elke klasse olijfolie.
3.Principe
Het gehalte aan triacylglycerolen met ECN42 bepaald door middel van
HPLC-analyse en het theoretische gehalte aan triacylglycerolen met
ECN42 (berekend op basis van de GLC-bepaling van de vetzuursamen-
stelling) stemmen voor zuivere olie binnen bepaalde grenzen overeen.
Een verschil groter dan de waarden vermeld in het voorschrift voor
elk soort olie wijst erop dat de olie zaadolie bevat.
4.Methode
De methode voor de berekening van het theoretische gehalte aan tria-
cylglycerolen met ECN42 en van het verschil tussen dit gehalte en het
resultaat van de HPLC-analyse bestaat in wezen uit het vergelijken van
de met andere methoden verkregen analysegegevens; we kunnen drie
fasen onderscheiden: bepaling van de vetzuursamenstelling door capil-
laire gaschromatografie, berekening van de theoretische samenstelling
van triacylglycerolen met ECN42, en bepaling van het gehalte aan tria-
cylglycerolen met ECN42 door HPLC-analyse.
4.1.Apparatuur
4.1.1. Rondbodemkolven 250 en 500 ml.4.1.2. Bekerglazen 100 ml.
4.1.3. Glazen chromatografiekolom, inwendige diameter 21 mm, lengte
450 mm, kraan, met taps slijpstuk (vrouwelijk) bovenaan.
4.1.4. Scheitrechters van 250 ml, met taps slijpstuk (mannelijk) onderaan
geschikt om boven aan de kolom te worden bevestigd.
4.1.5. Glazen staaf, lengte 600 mm.4.1.6. Glazen trechter, diameter 80 mm.4.1.7. Maatkolven van 50 ml.4.1.8. Maatkolven van 20 ml.4.1.9. Rotatievacuümverdamper.4.1.10. Hogedrukvloeistofchromatografie, met gethermostatiseerde kolomtem-
peratuur.
4.1.11. Injectietoestellen voor inspuiten van hoeveelheden van 10 µl.
4.1.12. Detector: differentiële refractometer. De gevoeligheid van de volle
uitslag dient ten minste 10
−4eenheden van de brekingsindex te
bedragen.
4.1.13. Kolom: roestvrijstalen buis, 250 mm (lengte) × 4,5 mm (inwendige
diameter), gepakt met silicadeeltjes met een diameter van 5 µm en met
22 tot 23 % koolstof in de vorm van octadecylsilaan (opmerking 2).
4.1.14. Recorder en/of integrator.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 80
▼M13
4.2.Reagentia
De reagentia dienen van pro-analysekwaliteit te zijn. Elutievloeistoffen
dienen te worden ontgast en kunnen verschillende keren worden herge-
bruikt zonder gevolgen voor de scheidingen.
4.2.1. Petroleumether, 40-60 ºC voor chromatografie.
4.2.2. Ethylether, vrij van perioxiden, zojuist gedistilleerd.
4.2.3. Elutievloeistof voor gaschromatografie: mengsel van petroleumether/
ethylether 87/13 (v/v).
4.2.4. Silicagel, korrelgrootte 70-230 mesh, type Merck 7734, op een stan-
daardwatergehalte van 5 % gebracht (m/m).
4.2.5. Glaswol.
4.2.6. Aceton.
4.2.7. Acetonitril.
4.2.8. HPLC-elutievloeistof: acetonitril + aceton (verhouding aan te passen
om de gewenste scheiding te krijgen; begin met een 50:50 mengsel).
4.2.9. Oplosmiddel: aceton.
4.2.10. Referentietriglyceriden: ofwel kunnen triglyceriden van handelskwaliteit
(tripalmitaat, trioleïne, enz.) worden gebruikt, waarvan de retentietijden
worden uitgezet volgens het equivalent koolstofgetal, ofwel kunnen
referentiechromatogrammen worden verkregen uitgaande van sojaolie,
een 30:70 mengsel sojaolie/olijflolie en pure olijfolie (zie opmerkingen
3 en 4 en figuren 1, 2, 3 en 4).
4.3.Monsterbereiding
Aangezien een aantal interfererende stoffen vals positieve resultaten
resultaten kunnen oproepen, moet het monster altijd worden gezuiverd
volgens IUPAC-methode 2.507 betreffende de bepaling van polaire
stoffen in geoxideerde oliën.
4.3.1. Bereiding van de chromatografiekolom
Vul de kolom (4.1.3) met circa 30 ml elutievloeistof (4.2.3); breng een
prop glaswol (4.2.5) in en druk deze met de glazen staaf (4.1.5) tot
onder in de kolom.
Bereid in een bekerglas van 100 ml een suspensie van 25 g silicagel
(4.2.4) in 80 ml van het elutiemengsel (4.2.3) en breng deze over in
de kolom met behulp van een glazen trechter (4.1.6).
Om er zeker van te zijn dat het silicagel volledig in de kolom wordt
overgebracht, het bekerglas met het elutiemengsel uitspoelen en de
wasporties ook in de kolom overbrengen.
De kraan aan de kolom openen en het oplosmiddel eruit laten stromen
tot de vloeistofspiegel van de elutievloeistof 1 cm boven het silicagel
staat.
4.3.2. Kolomchromatografie
Weeg op 0,001 g nauwkeurig 2,5 ± 0,1 g gefiltreerde, gehomogeni-
seerde en, indien nodig, gedroogde olie af in een maatkolf van 50 ml
(4.1.7). Los dit op in ongeveer 20 ml elutievloeistof (4.2.3). Indien
nodig, licht verwarmen om het oplossen te vergemakkelijken. Laat het
mengsel afkoelen tot omgevingstemperatuur en vul tot de maatstreep
aan met elutievloeistof.
Breng met een maatpipet 20 ml van de oplossing aan op de volgens
4.3.1 bereide kolom; open de kraan en laat het oplosmiddel uitstromen
tot het niveau van het silicagel.
De oplossing moet vervolgens worden geëludeerd met 150 ml elutie-
vloeistof (4.2.3), waarbij de stroomsnelheid moet worden afgeregeld
tot ongeveer 2 ml/min (zodat 150 ml in 60-70 minuten door de kolom
stroomt).
Vang het eluaat op in een kolf van 250 ml (4.1.1) die vooraf in de oven
is gekalibreerd en exact is gewogen. Verwijder het oplosmiddel bij lage
druk (Rotavapor) en weeg het residu; hiermee wordt de oplossing
bereid voor HPLC-analyse en voor de bereiding van de methylesters.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 81
▼M13
Voor de categorieën extra olijfolie van eerste persing, olijfolie van
eerste persing, geraffineerde olijfolie en olijfolie moet, nadat het
monster door de kolom gestroomd is, daarvan minimaal 90 % worden
teruggewonnen; voor olijfolie voor verlichting en olijfolie uit afvallen
van olijven geldt een terugwinningspercentage van minimaal 80.
4.4.HPLC-analyse
4.4.1. Monsterbereiding voor chromatografische analyse
Een 5 %-oplossing van het te analyseren monster wordt bereid door 0,5
± 0,001 g van het monster in een maatkolf van 10 ml af te wegen en
aan te lengen tot 10 ml met het oplosmiddel (4.2.9).
4.4.2. Werkwijze
Stel het chromatografiesysteem op. Pomp de elutievloeistof (4.2.8) op
met een snelheid van 1,5 ml/min teneinde het volledige systeem te
zuiveren. Wacht tot er een stabiele basislijn wordt verkregen. Injecteer
10µl van het volgens punt 4.3 bereide monster.
4.4.3. Berekening en uitdrukking van resultaten
Gebruik de methode met interne standaard, dat wil zeggen ga ervan uit
dat de som van de piekoppervlakken voor de TAG's met ECN42 t/m
ECN 52 gelijk is aan 100 %. Bereken het relatieve percentage van elk
triglyceride aan de hand van de formule:
% triglyceride = piekoppervlak × 100 / som van de piekoppervlakken.Het resultaat wordt opgegeven met minstens twee cijfers achter de
komma.
Opmerking 1: De elutievolgorde kan worden bepaald door het bere-
kenen van de equivalente koolstofgetallen, dikwijls gedefinieerd met
de vergelijking ECN = CN − 2n, waarin CN het koolstofgetal is en n
het aantal dubbele bindingen; zij kan preciezer worden berekend door
rekening te houden met de oorsprong van de dubbele binding. Als n
o,
nlen nlnde aantallen dubbele bindingen zijn die respectievelijk worden
toegeschreven aan oleïnezuur, linolzuur en linoleenzuur, kan het equi-
valent koolstofgetal worden berekend aan de hand van de formule:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln
waarin de coëfficiënten do,dlen dlnkunnen worden berekend door
middel van de referentietriglyceriden. Onder de in deze methode gespe-
cificeerde voorwaarden zal de verkregen vergelijking dicht liggen bij;
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Opmerkingen2: Voorbeelden: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 of een soortgelijk productOpmerking 3: Met verschillende referentietriglyceriden kan ook de
resolutie ten opzichte van trioleïne berekend worden:
α=R T
1/ RT trioleïne
door gebruik van de gereduceerde retentietijd RT1= RT − RT-oplos-
middel.
De grafiek van log αtegen f (aantal dubbele bindingen) maakt het
mogelijk de retentiewaarden te bepalen voor alle triglyceriden van
vetzuren in de referentietriglyceriden (zie figuur 2).
Opmerking4: De efficiëntie van de kolom dient zodanig te zijn dat de
trioleïnepiek duidelijk gescheiden is van de pieken van triglyceriden
met een aangrenzende RT. De elutie wordt uitgevoerd tot de piek van
ECN52.
Opmerking 5: Om een chromatogram te krijgen dat een juiste meting
van de oppervlakken van alle belangrijke pieken mogelijk maakt, moet
de tweede piek die overeenkomt met ECN50 een intensiteit (hoogte)
hebben van 50 % van de volle uitslag.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 82
▼M13
4.5.Berekening van de samenstelling van de triacylglycerolen
4.5.1. Bepaling van de vetzuursamenstelling
De vetzuursamenstelling wordt bepaald met de EEG-gaschromatografi-
sche methode vermeld in bijlage X.A van Verordening (EEG) nr. 2568/
91 met behulp van een capillaire kolom. De bereiding van methylesters
wordt uitgevoerd volgens bijlage X.B (oplossing van natriummethylaat
in alcohol).
4.5.2. Vetzuren gebruikt bij de berekening
Glyceriden zijn gegroepeerd volgens hun equivalent koolstofgetal
(ECN), rekening houdend met de volgende equivalenties tussen ECN
en vetzuren. Er werden alleen vetzuren met 16 en 18 koolstofatomen
in aanmerking genomen, aangezien alleen deze van belang zijn voor
olijfolie.
Vetzuur (VZ) AfkortingMolecuulge-
wicht (MG)ECN
Palmitinezuur P 256,4 16
Palmitoleïnezuur Po 254,4 14Stearinezuur S 284,5 18Oleïnezuur O 282,5 16Linolzuzuur L 280,4 14Linoleenzuur Ln 278,4 12
4.5.3. Omrekening van oppervlak % in aantal mol voor alle
vetzuren
aantal mol P ¼
opp :%P
MG Paantal mol S ¼opp :%S
MG Saantal mol Po ¼opp :%P o
MG Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
aantal mol O ¼
opp :%O
MG Oaantal mol L ¼opp :%L
MG Laantal mol Ln ¼opp :%L n
MG Ln
4.5.4. Normalisering van vetzuren tot 100 %
mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼aantal mol P /C3100
aantal mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼
aantal mol S /C3100
aantal mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼aantal mol Po /C3100
aantal mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼aantal mol O /C3100
aantal mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼aantal mol L /C3100
aantal mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼aantal mol Ln /C3100
aantal mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Het resultaat geeft het vetzuurpercentage in mol % in de globale (1,2,3-
)positie van de TAG's.
Vervolgens wordt de som van de verzadigde vetzuren (VVZ) P en S en
de onverzadigde vetzuren (OVZ) Po, O, L en Ln berekend:
mol % VVZ = mol % P + mol % S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)mol % OVZ = 100 − mol % VVZ1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 83
▼M13
4.5.5. Berekening van de vetzuursamenstelling in 2- en 1,3-posi-
ties van TAG's
De vetzuren zijn als volgt over de drie groepen verdeeld: twee identieke
voor 1- en 3-posities en één voor de 2-positie, met verschillende coëffi-
ciënten voor de verzadigde (P en S) en de onverzadigde zuren (Po, O, L
en Ln).
4.5.5.1.
Verzadigde vetzuren op de 2-positie [P(2) en S(2)]
mol % P(2) = mol % P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)mol % S(2) = mol % S (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2. Onverzadigde vetzuren op de 2-positie [Po(2), O(2), L(2) en Ln(2)]:
mol % Po 2 ðÞ ¼mol % Po 1 ;2;3 ðÞ
mol % OVZ/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)mol % O 2 ðÞ ¼
mol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol % OVZ/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ðÞ
mol % L 2 ðÞ ¼mol % L 1 ;2;3 ðÞ
mol % OVZ/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ðÞ
mol % Ln 2 ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
mol % OVZ/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol % S 2 ðÞ ðÞ
4.5.5.3. Vetzuren in 1,3-posities [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) en
Ln(1,3)]:
mol % P1 ;3¼mol % P1 ;2;3/C0mol % P 2 ðÞ
2þmol % P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)mol % S 1 ;3ðÞ ¼
mol % S 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % S 2 ðÞ
2þmol % S 1 ;2;3 ðÞ
mol % Po 1 ;3ðÞ ¼mol % Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % Po 2 ðÞ
2þmol % Po 1 ;2;3 ðÞ
mol % O 1 ;3ðÞ ¼mol % O 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % O 2 ðÞ
2þmol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol % L 1 ;3ðÞ ¼mol % L 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % L 2 ðÞ
2þmol % L 1 ;2;3 ðÞ
mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol % Ln 2 ðÞ
2þmol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Berekening van triacylglycerolen
4.5.6.1. TAG's met één vetzuur (AAA, hier LLL, PoPoPo)
mol % AAA ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3mol% A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAG's met twee vetzuren (AAB, hier PoPoL, PoLL)
mol % AAB ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
mol % ABA ¼
mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % B 2 ðÞ/C3mol % A 1 ;3ðÞ
100001991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 84
▼M13
4.5.6.3. TAG's met drie vetzuren (ABC, hier OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn)
mol % ABC ¼mol % A 1 ;3ðÞ /C3 mol % B 2 ðÞ/C3mol % C 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) mol % BCA ¼
mol % B 1 ;3ðÞ /C3 mol % C 2 ðÞ/C3mol % A 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
mol % CAB ¼mol % C 1 ;3ðÞ /C3 mol % A 2 ðÞ/C3mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
4.5.6.4. Triacylglyceriden met ECN42
De volgende triglyceriden met ECN42 worden berekend volgens verge-
lijking 7, 8 en 9 in volgorde van verwachte elutie in HPLC (normaal
slechts drie pieken).
LLLPoLL en de positie-isomeer LPoLOLLn en de positie-isomeren OLnL en LnOLPoPoL en de positie-isomeer PoLPoPoOLn en de positie-isomeren OPoLn en OLnPoPLLn en de positie-isomeren LLnP en LnPLPoPoPoSLnLn en de positie-isomeer LnSLnPPoLn en de positie-isomeren PLnPo en PoPLnDe som van de negen triacylglycerolen, inclusief de positie-isomeren,
geeft de triacylglyceriden met ECN42. Het resultaat moet worden opge-
geven met minstens twee cijfers achter de komma.
5.Beoordeling van het resultaat
Het berekende theoretische gehalte en het gehalte bepaald met HPLC-
analyse worden vergeleken. Als het verschil tussen de HPLC-gegevens
en de theoretische gegevens groter is dan de waarden die voor de
betrokken categorie olie in de verordening zijn vermeld, dan bevat het
monster zaadolie.
Opmerking: De resultaten worden opgegeven met één cijfer achter de
komma.
6.Voorbeeld(De nummers verwijzen naar de secties in de tekst van de
methode)
4.5.1. Berekening van mol % vetzuren uit GLC-gegevens
(oppervlak %)
De volgende gegevens voor de vetzuursamenstelling worden verkregen
door middel van GLC:
VZ
MGP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
opp. % 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Omrekening van oppervlak % in aantal mol voor alle
vetzuren
aantal mol P ¼10
256 ;4¼0;03900 mol P Zie formule (1)
aantal mol S ¼3
284 ;5¼0;01054 mol S Zie formule (1)1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 85
▼M13
aantal mol Po ¼1
254 ;4¼0;00393 mol Po Zie formule (1)
aantal mol O ¼75
282 ;5¼0;26549 mol O Zie formule (1)
aantal mol L ¼10
280 ;4¼0;03566 mol L Zie formule (1)
aantal mol Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 mol Ln Zie formule (1)
Totaal = 0,35822 moles TG
4.5.4. Normalisering van de vetzuren tot 100 %
mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 mol P /C3100
0;35822 mol¼10;888 % Zie formule (2)
mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 mol S /C3100
0;35822 mol¼2;944 % Zie formule (2)
mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 mol Po /C3100
0;35822 mol¼1;097 % Zie formule (2)
mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 mol O /C3100
0;35822 mol¼74;113 % Zie formule (2)
mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 mol L /C3100
0;35822 mol¼9;956 % Zie formule (2)
mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 mol Ln /C3100
0;35822 mol¼1;003% Zie formule (2)
Totaal mol % = 100,0 %
Som van de verzadigde en onverzadigde vetzuren in 1,2,3-posities van
TAG's:
mol % VVZ = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Zie formule (3)
mol % OVZ = 100,000 % — 13,831 % = 86,169 % Zie formule (3)
4.5.5. Berekening van de vetzuursamenstelling in 2- en 1,3-posi-
ties van de TAG's
4.5.5.1. Verzadigde vetzuren op de 2-positie [P(2) en S(2)]
mol % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 mol % Zie formule (4)
mol % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 mol % Zie formule (4)
4.5.5.2. Onverzadigde vetzuren in 1,3-posities [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) en
Ln(1,3)]
mol % Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 mol % Zie formule
(5)
mol % O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 mol % Zie formule
(5)
mol % L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 mol % Zie formule
(5)
mol % Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 mol % Zie formule
(5)1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 86
▼M13
4.5.5.3. Vetzuren in 1,3-posities [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) en
Ln(1,3)]
mol % P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 mol % Zie formule (6)
mol % S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 mol % Zie formule (6)
mol % Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 mol % Zie formule (6)
mol % O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 mol % Zie formule (6)
mol % L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 mol % Zie formule (6)
mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 mol % Zie formule (6)
4.5.6. Berekening van triacylglycerolen
Uit de berekende vetzuursamenstelling in sn-2- en sn-1,3-posities (zie
boven)
VZ in 1,3-pos. 2-pos.
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Som 100,0 % 100,0 %
worden de volgende triacylglycerolen berekend:
LLL
PoPoPo
PoLL met 1 positie-isomeer
SLnLn met 1 positie-isomeer
PoPoL met 1 positie-isomeer
PPoLn met 2 positie-isomeren
OLLn met 2 positie-isomeren
PLLn met 2 positie-isomeren
PoOLn met 2 positie-isomeren
4.5.6.1. TAG's met één vetzuur (LLL, PoPoPo) Zie formule (7)
mol % LLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 mol LLL
mol % PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TAG's met drie verschillende vetzuren (PoLL, SLnLn, PoPoL)
Zie formule (8)
mol % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,021411991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 87
▼M13
mol % LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000 = 0,01070
0,03211 mol PoLL
mol % SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00093
mol % LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000= 0,00002
0,00095 mol SLnLn
mol % PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
mol % PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
0,00354 mol PoPoL
4.5.6.3. TAG's met drie verschillende vetzuren (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Zie formule (9)
mol % PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
mol % LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
mol % PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
mol % OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
mol % LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
mol % LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
0,43671 mol OLLn
mol % PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
mol % LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00111
mol % LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,03400
0,06911 mol PLLn
mol % PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000= 0,01605
mol % LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
mol % OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42= 0,69540 mol TAG's1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 88
▼M14
Figuur 1:Grafiekvanlog αtegenf(aantaldubbelebindingen)
La = laurinezuur, My = myristinezuur; P = palmitinezuur; St = stearine-
zuur, O = oliezuur; L = linolzuur, Ln = linoleenzuur.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 89
▼M14
Figuur 2:Sojaolie
Figuur 3:Sojaolie/olijfolie 30/70
1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 90
▼M14
Figuur 4:Olijfolie
1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 91
▼M19
BIJLAGEXIX
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ALIFATISCHE ALCOHOLEN
MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
In deze methode wordt een werkwijze beschreven om op eenvoudige
wijze het totale gehalte aan alifatische alcoholen in vetten te bepalen.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De vetten, waaraan 1-eicosanol als interne standaard is toegevoegd,
worden verzeept met behulp van een oplossing van kaliumhydroxide
in ethanol. Vervolgens worden de onverzeepbare bestanddelen geëxtra-
heerd met ethylether. De alcoholfractie wordt van het onverzeepbare
extract gescheiden door middel van dunnelaagchromatografie met een
basische silicagel als stationaire fase. De alcoholen in de silicagel
worden omgezet in trimethylsilylethers en geanalyseerd door middel
van gaschromatografie in een capillaire kolom.
3. APPARATUUR
3.1. Erlenmeyer van 250 ml met een refluxkoeler met geslepen uiteinde.
3.2. Scheitrechter van 500 ml.3.3. Erlenmeyers van 250 ml.
3.4. Volledige uitrusting voor dunnelaagchromatografie, met glasplaten van
20 × 20 cm.
3.5. Ultraviolette lamp, met een golflengte van 366 of 254 nm.
3.6. Micropipetten van 100 en 500 µl.
3.7. Filterkroes G 3 (porositeit 15 tot 40 µm) met een diameter van onge-
veer 2 cm en een hoogte van 5 cm, geschikt om onder vacuüm te
filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.
3.8. Afzuigkolf van 50 ml voorzien van een slijpstuk 12/21 waarmee deze
op de filterkroes kan worden aangesloten (3.7).
3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.
3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom,
voorzien van een splitsysteem, bestaande uit:
3.10.1. Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste
temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van
± 1 ºC.
3.10.2. Een temperatuurregelbare injector met een gepersilaniseerd glazen
verdampingselement.
3.10.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid.3.10.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/
verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één
seconde en met een variabele papiersnelheid.
3.11. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m,
inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52- of SE-
54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 µm.
3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 µl met een geharde naald.
3.13. Precisiebalans met een gevoeligheid van 1 mg (af te lezen tot op
0,1 mg).
4. REAGENTIA
4.1. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 N in ethanol. Los 130 g kalium-
hydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling op in 200 ml
gedistilleerd water en vul aan tot 1 l met ethanol. Bewaar de oplossing
in goed afgesloten flessen van donker glas.
4.2. Diëthylether, p.a.
4.3. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 92
▼M19
4.4. Glazen dunnelaagplaten gecoat met kiezelgel, zonder fluorescentie-indi-
cator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel
te verkrijgen).
4.5. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 0,2 N in ethanol. Los 13 g
kaliumhydroxide op in 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol
aan tot 1 l.
4.6. Benzeen, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.7. Aceton, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).4.8. Hexaan, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.9. Ethylether, voor chromatografische doeleinden (5.2.2).
4.10. Chloroform, p.a.
4.11. Dunnelaagchromatografische referentieoplossing. Een 5 %-oplossing
van een mengsel van C20-C28-alcoholen in chloroform.
4.12. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing
moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele drup-
pels 2 N alcoholische kaliumhydroxideoplossing.
4.13. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.4.14. Hexamethyldisilazaan.
4.15. Trimethylchloorsilaan.
4.16. Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de C20-C28 alifa-
tische alcoholen. Direct vóór gebruik te bereiden uit een mengsel van
de zuivere alcoholen.
4.17. 1-eicosanol, 0,1 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).
4.18. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.4.19. Hulpgassen: stikstof, gaschromatografisch zuiver.
5. WERKWIJZE5.1.Bereiding van het onverzeepbare residu
5.1.1. Breng in de kolf van 250 ml met behulp van de injectiespuit van 500 µl
een hoeveelheid 0,1 % l-eicosanoloplossing in chloroform (4.17) die
overeenkomt met ongeveer 10 % van het gehalte aan alifatische alco-
holen in het in bewerking te nemen monster. Bijvoorbeeld: voeg voor
5 g monster 250 µl 0,1 % 1-eicosanoloplossing toe indien het gaat om
olijfolie en 1 500 µl indien het gaat om olie uit afvallen van olijven.
Damp het chloroform in een stikstofstroom in tot droog en weeg in
dezelfde kolf nauwkeurig ongeveer 5 g af van het gedroogde gefil-
treerde monster.
5.1.2. Voeg 50 ml 2 N ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig
de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken op een waterbad onder
voortdurend krachtig schudden totdat de verzeping heeft plaatsge-
vonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20
minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van
de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer
30 ºC.
5.1.3. Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml schei-
trechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met
gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml
diëthylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en
laat uitzakken (zie opmerking 1).
Tap de waterige onderlaag af in een tweede scheitrechter. Herhaal de
extractie van de waterlaag twee keer op dezelfde manier en gebruik
hierbij telkens 60-70 ml ethylether.
Opmerking1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met
een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylal-
cohol toe te voegen.
5.1.4. Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens
50 ml gedistilleerd water totdat het waswater neutraal reageert.
Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer
over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf,1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 93
▼M19
was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden diëthylether. Er
mag ook gebruik worden gemaakt van 1-eneicosanol.
5.1.5. Distilleer de ether tot op enkele ml af, droog door toepassing van een
kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in
een oven bij 100 ºC gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in
een exsiccator en weeg.
5.2.Scheiding van de alcoholfractie
5.2.1. Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedu-
rende 10 seconden volledig in de 0,2 N ethanolische
kaliumhydroxideoplossing (4.5), laat de platen gedurende twee uur in
een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende één uur in een
stoof bij 100 ºC.
Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van
gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de op deze
manier bereide platen moeten binnen twee weken worden gebruikt).
Opmerking2: Bij gebruik van basischekiezelgelplaten voor de schei-
ding van de alcoholfractie is de behandeling van het
onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig.
Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren
en andere) vastgehouden op de startlijn en is de band
van de alifatische- en terpeenalcoholen duidelijk van de
sterolband gescheiden.
5.2.2. Breng in de ontwikkeltank een mengsel van hexaan/ethylether, 65:35
(v/v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm(*).
Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende onge-
veer een half uur staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden
bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen
tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de beno-
digde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een
meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten.
Opmerking3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden
ververst om volkomen reproduceerbare elutiecondities te
verwezenlijken.
5.2.3. Bereid een ongeveer 5 %-oplossing van het onverzeepbare residu
(5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulp van de 100 µl injec-
tiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische
plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk
moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens
2-3µl aan van de alcoholreferentieoplossing (4.11) zodat de alcohol-
band na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd.
5.2.4. Plaats de plaat in de volgens punt 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank.
De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 ºC en 20 ºC. Sluit
de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren totdat het vloei-
stoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen.
Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof in een hetelucht-
stroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te drogen,
verdampen.
5.2.5. Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneop-
lossing. De alifatische alcoholenband kan door bekijken onder
ultraviolet licht worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde
hoogte ligt als de vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen
van deze band en van de band direct hierboven, die correspondeert met
de triterpeenalcoholen, aan de zijkanten van de fluorescentie met een
zwart potlood.
Opmerking4: Het voorschrift om zowel de alifatische alcoholenband
als de triterpeenalcoholband samen verder te verwerken,
houdt verband met het feit dat aanzienlijke hoeveelheden
alifatische alcoholen bij deze methode in de triterpeenal-
coholband terechtkomen.
5.2.6. Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied
af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filter-
kroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 94
(*) In het bijzonder in deze gevallen dient een eluentmengsel benzeen/aceton 95:5 (v/v) te
worden gebruikt om een goede scheiding in banden te verkrijgen.
▼M19
metalen spatel en filtreer onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de
afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes.
Was het residu in de filterkroes driemaal met ethylether (telkens onge-
veer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf. Damp het filtraat in
tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de
van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), damp droog door
voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele
druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende onge-
veer tien minuten in een oven bij 105 ºC, laat afkoelen in een
exsiccator en weeg.
Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal is de alcoholfractie.
5.3.Bereiding van de trimethylsilylethers
5.3.1. Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige alcoholfractie een hoeveel-
heid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/
hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan 9:3:1 (v/v/v) (zie opmerking
5), waarbij voor elke mg alcohol 50 µl wordt toegevoegd. Vermijd
hierbij bevochtiging (zie opmerking 6).
Opmerking5: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijg-
baar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar,
zoals bijvoorbeeld
bistrimethylsilyltrifluoraceetamide + 1 % trimethyl-
chloorsilaan, hetgeen moet worden verdund met een
gelijk volume watervrije pyridine.
Opmerking6: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden
gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De
vorming van witte vlokken of de verschijning van een
roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van
vocht of van veroudering van het reagens. In deze
gevallen moet opnieuw worden begonnen.
5.3.2. Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te
draaien) totdat de alcoholfractie volledig is opgelost. Laat ten minste
15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten.
De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse.
5.4.Gaschromatografische analyse
5.4.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom
5.4.1.1. Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt
aangesloten aan het splitsysteem met injector en het uiteinde aan de
detector. Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografi-
sche systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie,
efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.).
5.4.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij gecondi-
tioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet
de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een
temperatuur van ten minste 20 ºC boven de bij de analyse gebruikelijke
temperatuur (zie opmerking 7). Houd deze temperatuur aan gedurende
ten minste twee uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik
(regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, onsteking van de
vlam, aansluiting van de elektronische recorder, temperatuurregeling
van de kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het
signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan
gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige
piek en mag niet verlopen. Een rechtlijnig negatief verloop vormt een
indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop
wijst op een onvoldoende uitgevoerde conditionering van de kolom.
Opmerking7: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten
minste 20 ºC lager zijn dan de maximumtemperatuur
die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven.
5.4.2. Keuze van de werkomstandigheden
5.4.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden
dienen:
— kolomtemperatuur: acht minuten isotherm op 180 ºC, opwarmen
met 5 ºC per minuut tot 260 ºC, gedurende vijf minuten handhaven,
afkoelen tot 160 ºC en deze temperatuur vijf minuten handhaven;
— injectietemperatuur: 280 ºC;1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 95
▼M19
— detectortemperatuur: 290 ºC;
— lineaire snelheid van het draaggas: helium 20-35 cm/s, waterstof 30-
50 cm/s;
— splitverhouding: van 1:50 tot 1:100;— gevoeligheid: vier tot 16 keer de minimumverzwakking;— gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag;— papiersnelheid: 30-60 cm/uur;— injectiehoeveelheid: 0,5-1 µl TMSE-oplossing.
Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de
kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chroma-
togrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de retentietijd van de C
26-alcohol moet ongeveer 18 ± vijf minuten
zijn;
— de piek van de C22-alcohol moet de volgende grootte hebben: voor
olijfolie 80 ± 20 % volle schaaluitslag en voor zaadoliën 40 ± 0 %
volle schaaluitslag.
5.4.2.2. Voer, om de hierboven genoemde vereisten te controleren, een aantal
injecties uit van oplossingen van TMSE-alcoholen en pas de omstandig-
heden zodanig aan dat de beste resultaten worden verkregen.
5.4.2.3. De piek-integratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een
juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen.
5.4.3. Bepaling
5.4.3.1. Zuig in de 10 µl-injectiespuit 1 µl hexaan, 0,5 µl lucht en ten slotte 0,5-
1,0µl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de
naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injectie-
eenheid en injecteer snel na één tot twee seconden, verwijder daarna
voorzichtig na ongeveer vijf seconden de naald.
5.4.3.2. Neem het chromatogram op totdat alle aanwezige TMSE-alcoholen
volledig zijn geëlueerd. De basislijn moet blijven voldoen aan de
vereiste specificaties (5.4.1.2).
5.4.4. Identificatie van de pieken
Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door
vergelijking met mengsels van TMSE-alcoholen die onder dezelfde
omstandigheden zijn geanalyseerd.
In figuur 1 wordt een chromatogram getoond van de alcoholfractie van
een eerste persing olijfolie.
5.4.5. Berekening
5.4.5.1. Bereken met de integrator de piekoppervlakten van 1-eicosanol en de
C22-C28alifatische alcoholen.
5.4.5.2. Bereken het gehalte aan elke individuele alifatische alcohol in mg/
1 000 g vethoudend materiaal als volgt:
waarbij:
Ax= piekoppervlak van alcohol x;
As= piekoppervlak van 1-eicosanol;
ms= gewicht van het toegevoegde 1-eicosanol, in mg;
m = gewicht van het monster voor de bepaling, in g.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Geef de gehaltes van de individuele alifatische alcoholen op in mg/
1 000 g vethoudend materiaal en hun som als „totaal alifatische alco-
holen”.1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 96
▼M19
AANHANGSEL
Bepalingvandelineairesnelheid vanhetdraaggas
Injecteer 1-3 µl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden
werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door
de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek
(tM).
De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij
L de lengte is van de kolom in centimeters en tM de gemeten tijd in seconden.
Grafiek 1 — Chromatogram van de alcoholfractie van olie van de eerste persing
1 = eicosanol
2 = decosanol
3 = tricosanol4 = tetracosanol
5 = pentacosanol
6 = hexacosanol7 = heptacosanol8 = octacosanol1991R2568 — NL — 22.05.2002 — 019.001 — 97