1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
veevoeders
(72/199/EEG)
(PB L 123 van 29.5.1972, blz. 6)
Gerectificeerd bij:
►C1Rectificatie PB L 320 van 27.11.1980, blz. 43 (72/199/EEG)
▼B
DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analyseme-
thoden voor de officiële controle van veevoeders
(72/199/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethodenvoor de officiële controle van veevoeders(
1), inzonderheid op artikel 2,
Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële
controle van veevoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de op
grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van veevoeders gestelde eisen is voldaan,geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende dat bij richtlijnen nr. 71/250/EEG en nr. 71/393/EEG van
de Commissie van 15 juni 1971 (
2) onderscheidenlijk 18 november
1971 (3) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden
isvas tgelegd; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamhedensindsdien hebben gemaakt het nuttig is een derde serie methoden uitte vaardigen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voorveevoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoedersten aanzien van hun gehalte aan zetmeel, ruw eiwit,
ruw eiwit oplosbaar in pepsine en zoutzuur, en aan vrij en totaalgossypol, alsmede ten aanzien van de pepsineactiviteit, geschiedenvolgensde in de bijlage I bij deze richtlijn oms chreven methoden.
De algemene bepalingen welke vermeld staan in het deel 1 van de
bijlage (inleiding) van de eerste richtlijn nr. 71/250/EEG van de
Commissie van 15 juni 1971, houdende vaststelling van de gemeen-schappelijke methoden van onderzoek voor de officiële controle vanveevoeders, zijn toepasselijk op de methoden beschreven in de bijlageI van deze richtlijn.
Artikel 2
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoederstot ops poring en identificatie van antibiotica van degroep tetracyclinen zowel alsten aanzien van het gehalte in veevoedersaan chloortetracycline, oxytetracicline, tetracycline, oleandomycine,tylosine en virginiamycine geschieden volgens de in bijlage II bij dezerichtlijn omschreven methoden.
De algemene bepalingen van deel 1 (inleiding) van de bijlage van de
eerste richtlijn nr. 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971zijn, met uitzondering van het deel betreffende de voorbereiding vanhet analysemonster, op de methoden beschreven in bijlage II aan dezerichtlijn toepasselijk.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(3) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.
▼B
Artikel 3
De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 juli 1973 de noodzakelijke wettelijke
of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om zich te voegen
naar deze richtlijn. Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan in
kennis.
Artikel 4
Deze richtlijn isgericht tot de Lid-Staten.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 3
▼B
BIJLAGE I
1.BEPALING VAN ZETMEEL
Polarimetrische methode
1.Doel en toepassingsgebied
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
zetmeel en afbraakprodukten van zetmeel met een hoog moleculair gewicht
in veevoeders, met uitzondering van die welke bietensnijdsels, bietenpulp,
gedroogd bieteloof of gedroogde bietekoppen, aardappelpulp, gedroogde
gist, inulinehoudende stoffen (bij voorbeeld topinamboersnijdsels en -meel)
of kanen bevatten.
2.Principe
De bepaling bestaat uit twee onderdelen. Het eerste onderdeel omvat de
behandeling van het monster met warm verdund zoutzuur. Na klaren en
filtreren wordt de optische draaiing van de oplossing polarometrisch gemeten.
Het tweede onderdeel omvat de extractie van het monster met ethanol 40 %.
Na aanzuren van het filtraat met zoutzuur, klaren en filtreren wordt de opti-
sche draaiing gemeten onder dezelfde omstandigheden als bij het eerste
onderdeel.
Het verschil tussen de beide metingen, vermenigvuldigd met een bekende
factor, geeft het zetmeelgehalte van het monster.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 25 % in gewicht, d = 1,126.3.2 Zoutzuur 11,28 g/l.
De sterkte moet worden gecontroleerd door titratie met natronloog 0,1 N
t.o.v. de indicator methylrood 1 g/l in ethanol 94 % (v/v). 10 ml
= 30,94 ml NaOH 0,1 N.
3.3 Carrez-I-oplossing: los op in water 21,9 g zinkacetaat Zn (CH
3COO)2·
2H2O en 3 g ijsazijn. Vul aan met water tot 100 ml.
3.4 Carrez-II-oplossing: los op in water 10,6 g kaliumhexacyanoferraat (II),
K4[Fe (CN)6]·3 H2O· Vul aan met water tot 100 ml.
3.5 Ethanol 40 % (v/v), d: 0,948 bij 20 ºC.
4.Apparatuur
4.1 Conische kolf van 250 ml met normaalslijpstuk en terugvloeikoeler.4.2 Polarimeter of saccharimeter.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van het monster
Maak het monster zodanig fijn dat het geheel een zeef met ronde mazen
van 0,5 mm diameter passeert.
5.2Bepaling van de totale optische draaiing (P of S) (zie opmerking 7.1)
Breng 2,5 g van het gemalen monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen,
in een maatkolf van 100 ml. Voeg toe 25 ml zoutzuur (3.2), schud de
kolf om, totdat de stof goed gesuspendeerd is en voeg nogmaals 25 ml
zoutzuur (3.2) toe. Plaatsde kolf in een bad met kokend water en s chud
gedurende de eerste 3 minuten krachtig en regelmatig om, ten einde
klontvorming te vermijden. De hoeveelheid water in het bad moet groot
genoeg zijn om aan de kook te blijven wanneer de kolf erin wordt
geplaatst. De kolf mag tijdens het omschudden niet uit het water worden
gehaald. Neem na precies15 minuten de kolf uit het bad, voeg er 30 ml
koud water aan toe en laat onmiddellijk afkoelen tot 20 ºC.
Voeg toe 5 ml Carrez-I-oplossing (3.3) en schud gedurende één minuut
om. Voeg vervolgens toe 5 ml Carrez-II-oplossing (3.4) en schud
nogmaalsgedurende één minuut om. Vul aan met water tot de s treep,
meng en filtreer. Indien het filtraat niet volledig helder is(wat zelden1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 4
▼B
voorkomt), herhaal dan de analyse met grotere hoeveelheden Carrez-I en
II-oplossingen, bij voorbeeld 10 ml.
Meet vervolgens de optische draaiing van de oplossing in een buis van
200 mm met behulp van de polarimeter of de saccharimeter.
5.3Bepaling van de optische draaiing (P ′of S ′) van de in 40 % ethanol
oplosbare stoffen
Weeg af 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng deze in
een maatkolf van 100 ml. Voeg toe ca. 80 ml ethanol (3.5) (zie opmer-
king 7.2) en laat de kolf gedurende 1 h staan bij kamertemperatuur;
schud de oplossing gedurende die tijd 6 maal krachtig, zodat de stof
goed met het ethanol wordt vermengd. Vul vervolgensaan met ethanol
(3.5) tot de streep, meng en filtreer.
Pipeteer 50 ml van het filtraat (= 2,5 g monster) in een conische kolf van
250 ml, voeg toe 2,1 ml zoutzuur (3.1) en zwenk krachtig om. Verbind
de conische kolf met een terugvloeikoeler en plaats de kolf in een bad
met kokend water. Neem na precies15 minuten de conis che kolf uit het
bad, breng de inhoud ervan met een kleine hoeveelheid koud water over
in een maatkolf van 100 ml en laat afkoelen tot 20 ºC.
Klaar vervolgens met de Carrez-oplossingen I (3.3) en II (3.4), vul aan
met water tot de streep, meng, filtreer en meet de optische draaiing als
aangegeven onder 5.2, tweede en derde alinea.
6.Berekening van de resultaten
Bereken het gehalte aan zetmeel, uitgedrukt in percenten van het monster, als
volgt:
6.1Metingen met de polarimeter
percent zetmeel ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
waarin:
P = totale optische draaiing in booggraden
P′ = optische draaiing in booggraden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen
α½/C13820º
D = specifiek draaiend vermogen van zuiver zetmeel. De
waarden die conventioneel D voor deze factor worden
gebruikt zijn de volgende:
+ 185,9º: rijstezetmeel,
+ 185,4º: aardappelzetmeel,+ 184,6º: maïszetmeel,
+ 182,7º: tarwezetmeel+ 181,5º: gerstezetmeel+ 181,3º: haverzetmeel
+ 184,0º: andere zetmeelsoorten alsmede zetmeelmengsels in
mengvoeders.
6.2Metingen m.b.v. de saccharimeter
percent zetmeel ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N /C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = totale optische draaiing in saccharimetrische graden.
S′= optische draaiing in saccharimetrische graden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen.
N = gewicht in g van de hoeveelheid saccharose, die in 100 ml
water bij een laagdikte van 200 mm een optische draaiing van
100 saccharimetrische graden geeft.
Dit gewicht varieert naargelang van het type saccharimeter:16,29 g voor Franse saccharimeters
26,00 g voor Duitse saccharimeters1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 5
▼C1
▼B
▼B
20,00 g voor gemengde saccharimeters
α½/C13820º
D= specifiek draaiend vermogen van zuiver zetmeel (zie 6.1).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
0,4 % absoluut bij gehalten van minder dan 40 % zetmeel;
1 % relatief bij gehalten van 40 % zetmeel of meer.
7.Opmerkingen
7.1 Indien het monster meer dan 6 % carbonaten bevat, berekend als
calciumcarbonaat, moeten deze worden ontleed vóór de bepaling van de
totale optische draaiing door een behandeling met precies de daarvoor
benodigde hoeveelheid verdund zwavelzuur.
7.2 Produkten met een hoog gehalte aan lactose, zoals weipoeder, onder-
melkpoeder, enzovoort worden, na het toevoegen van de 80 ml ethanol
(3.5) alsvolgt behandeld:
Verbind de kolf met een terugvloeikoeler en plaatsde kolf gedurende 30
minuten in een waterbad van 50 ºC. Laat vervolgensafkoelen en handel
verder alsbes chreven onder 5.3.
2.BEPALING VAN RUW EIWIT
1.Doel en toepasbaarheid
Het voorschrift beschrijft de methode om op conventionele wijze het gehalte
aan ruw eiwit in veevoeders vast te stellen door bepaling van het gehalte aan
stikstof volgens Kjeldahl.
2.Beginsel
Het monster wordt langs natte weg gedestrueerd. De zure oplossing wordt
met natronloog alkalisch gemaakt. De vrijgekomen ammoniak wordt door
destilleren uitgedreven en opgevangen in een bekende hoeveelheid zwavel-
zuur, waarvan de overmaat met natronloog wordt getitreerd.
3.Reagentia
3.1 Kaliumsulfaat p.a.
3.2 Katalysator: koper (II) oxide p.a., CuO, of gekristalliseerd kopersulfaat
p.a., CuSO4.5 H2O, of kwik, of kwik (II) oxide p.a., HgO.
3.3 Zink p.a., in korrelvorm.3.4 Zwavelzuur p.a., d = 1,84.
3.5 Zwavelzuur 0,1 N.
3.6 Zwavelzuur 0,5 N.3.7 Methylrood: 3 g/l in ethanol van 95—96 % (v/v).3.8 Natronloog 400 g/l.3.9 Natronloog 0,1 N.3.10 Natronloog 0,25 N.3.11 Verzadigde natriumsulfide-oplossing p.a.
3.12 Natriumthiosulfaatoplossing 80 g/l, Na
2S2O3.5 H2O p.a.
3.13 Puimsteenkorrels, met zoutzuur gewassen en gegloeid.
4.Apparatuur
Destructie- en destillatieapparaat volgens Kjeldahl (zie opmerking 7.1).
5.Uitvoering
5.1Destructie
Weeg af 1 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng dit in de
kolf van het destructieapparaat. Voeg hieraan toe 10 g kaliumsulfaat1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 6
▼B
(3.1), de benodigde hoeveelheid katalysator (3.2) (0,3 à 0,4 g koper (II)
oxide of 0,9 à 1,2 g kopersulfaat of een druppel kwik of 0,6 à 0,7 g kwik
(II) oxide), 25 ml zwavelzuur (3.4) en enkele puimsteenkorrels (3.13).
Meng de inhoud van de kolf. Verhit de kolf eerst zacht en zwenk van
tijd tot tijd om tot de massa verkoold is en het schuim verdwenen; verhit
vervolgenskrachtiger tot de vloeis tof regelmatig kookt. Zorg ervoor dat
de wand niet oververhit raakt en dat geen organische stof aan de wand
gaat vastzitten. Houd de vloeistof nog een uur aan de kook nadat deze
helder en kleurloosisgeworden (of lichtgroen bij aanwezigheid van een
koperkatalysator). Laat vervolgens afkoelen.
5.2Destillatie
Voeg onder omzwenken voorzichtig 250 tot 350 ml water toe, waarbij de
sulfaten volledig dienen op te lossen. Laat afkoelen. Voeg vervolgens
enkele zinkkorrels(3.3) toe.
Breng in de opvangkolf van het destillatieapparaat afhankelijk van het te
verwachten stikstofgehalte precies 25 ml zwavelzuur 0,1 N (3.5) of 0,5 N
(3.6) (zie opmerking 7.2), alsmede enkele druppels methylrood (3.7).
Verbind de kolf met het destillatieapparaat en zorg ervoor dat het
uiteinde van de koelbuis zich ten minste 1 cm onder het vloeistofopper-
vlak in de opvangkolf bevindt. Laat langzaam via de druppeltrechter (zie
opmerking 7.3) in de kolf lopen 100 ml natronloog 40 % (3.8).
Voeg bij gebruik van een kwikkatalysator bovendien toe in de kolf hetzij
10 ml natriumsulfide-oplossing (3.11), hetzij 25 ml natriumthiosulfaatop-
lossing (3.12).
Verhit de kolf zodanig dat in 30 minuten 150 ml vloeistof overdestilleert.
Controleer na 30 minuten met behulp van lakmoespapier of het dan over-
komende destillaat neutraal is. Destilleer bij een alkalische reactie verder
tot het destillaat neutraal reageert op lakmoespapier. Zwenk tijdens de
destillatie van tijd tot tijd de inhoud van de opvangkolf om en let op de
kleur ervan. Voeg, in geval van een kleuromslag naar geel, onmiddellijk
een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid zwavelzuur 0,1 N (3,5) of 0,5 N
(3.6) toe.
5.3Titratie
Titreer de overmaatzwavelzuur in de opvangkolf met natronloog 0,1 N
(3.9) of 0,25 N (3.10), afhankelijk van de normaliteit van het gebruikte
zwavelzuur tot een kleuromslag naar lichtgeel.
5.4Controle van de methode
Verricht een blancobepaling (destillatie en titratie) zonder analysemate-
riaal om na te gaan of de reagentia stikstofvrij zijn. Voer, om de
nauwkeurigheid van de methode te toetsen, de analyse (destructie, destil-
latie en titratie) uit op 1,5 à 2,0 g aceetanilide p.a. (smp. 114 ºC; % N:
10,36) in aanwezigheid van 1 g stikstofvrije saccharose. 1 g aceetanilide
verbruikt 14,80 ml zwavelzuur 0,5 N.
6.Berekening van de resultaten
Bereken de hoeveelheid verbruikt zwavelzuur. 1 ml zwavelzuur 0,1 N komt
overeen met 1,4 mg stikstof. Vermenigvuldig de hoeveelheid stikstof met de
factor 6,25. Druk het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan:
0,2 % absoluut bij gehalten van minder dan 20 % ruw eiwit;
1,0 % relatief bij gehalten van 20 tot 40 %;
0,4 absoluut bij gehalten van meer dan 40 %.
7.Opmerkingen
7.1 Apparatuur waarbij het nodig ishet des truaat over te brengen in een
destillatiekolf mag eveneens gebruikt worden. Bij het overbrengen
mogen geen verliezen optreden.
7.2 Voor stikstofarme veevoeders kan de in de opvangkolf te brengen
hoeveelheid van 25 ml zwavelzuur 0,1 N eventueel worden terugge-
bracht tot 10 of 15 ml en met water worden aangevuld tot 25 ml.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 7
▼B
7.3 Indien de destillatiekolf niet voorzien is van een druppeltrechter moet de
natronloog worden toegevoegd onmiddellijk voordat de kolf met de
koeler wordt verbonden; laat hierbij de vloeistof langzaam langs de
wand van de kolf toevloeien ten einde menging met de zure oplossing
zoveel mogelijk te voorkomen.
3.BEPALING VAN RUW EIWIT, OPLOSBAAR IN PEPSINE EN ZOUT-
ZUUR
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
ruw eiwit, oplosbaar in pepsine en zoutzuur onder vastgestelde omstandig-
heden. Deze methode is toepasselijk voor alle veevoerders.
2.Beginsel
Het monster wordt gedurende 48 h bij 40 ºC behandeld met een oplossing
van pepsine in zoutzuur. De suspensie wordt gefiltreerd en het gehalte aan
stikstof van het filtraat wordt bepaald volgens de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur d = 1,125.
3.2 Zoutzuur 0,075 N.
3.3 Pepsine 2,0 E/mg. Deze activiteit is gedefinieerd in de methode van deel
4 van deze bijlage en dient volgensdeze methode gecontroleerd te
worden.
3.4 Pepsine-oplossing, ca. 0,2 g/l in zoutzuur (3.2), vers bereid, activiteit
400 E/l.
3.5 Antischuimemulsie (bijvoorbeeld siliconen).
3.6 Alle reagentia genoemd onder punt 3 van de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad of broedstoof, ingesteld op 40 ºC ± 1 ºC.
4.2 Destructie- en destillatieapparatuur volgens Kjeldahl.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.2)
Weeg af 2 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng dit in
een maatkolf van 500 ml. Voeg hieraan toe 450 ml pepsine-oplossing
(3.4), die van te voren op 40 ºC isgebracht.
Schud de inhoud opdat klontvorming vermeden wordt. Controleer of de
pH van de suspensie minder bedraagt dan 1,7. Breng de kolf in het
waterbad of de broedstoof (4.1) en laat gedurende 48 h staan. Zwenk de
inhoud om na 8, 24 en 32 h. Voeg na 48 h toe 15 ml zoutzuur (3.1), laat
afkoelen tot 20 ºC, vul aan met water tot de streep, meng en filtreer.
5.2Destructie
Breng 250 ml van het filtraat over in de kolf van het destructieapparaat
(4.2). Voeg toe de voor de destructie benodigde reagentia zoals is aange-
geven in de methode voor de bepaling van ruw eiwit onder punt 5.1,
tweede zin.
Meng de inhoud van de kolf en verhit tot koken. Voeg bij schuimvor-
ming enkele druppels antischuimemulsie (3.5) toe. Laat flink doorkoken
tot het water bijna volledig verdampt is. Verwijder vervolgens voor-
zichtig de laatste resten water door minder intensief te verhitten. Laat
nog gedurende 1 h doorkoken nadat de oplossing helder en kleurloos is
geworden (of lichtgroen bij aanwezigheid van een koperkatalysator).
Laat vervolgensafkoelen.
5.3Destillatie en titratie
Handel zoalsbes chreven in de punten 5.2 en 5.3 van de methode voor de
bepaling van ruw eiwit.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 8
▼B
5.4Blancobepaling
Verricht een blancobepaling onder toepassing van de beschreven werk-
wijze, echter zonder analysemateriaal.
6.Berekening van de resultaten
Verminder het volume aan zwavelzuur, verbruikt bij de analyse van het
monster, met het volume aan zwavelzuur, verbruikt bij de analyse van de
blanco. 1 ml zwavelzuur 0,1 N komt overeen met 1,4 mg stikstof.
Vermenigvuldig de verkregen hoeveelheid stikstof met de factor 6,25. Druk
het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan
— 0,4 % absoluut bij gehalten van minder dan 20 %;
— 2 % relatief bij gehalten van 20 tot 40 %;— 0,8 % absoluut bij gehalten van meer dan 40 %.
7.Opmerkingen
7.1 De verkregen waarden staan niet in direct verband met de verteerbaar-
heidin vivo.
7.2 Produkten met een vetgehalte van meer dan 10 % moeten eerst worden
ontvet door extractie met petroleumether (kp. 40—60 ºC).
4.BEPALING VAN DE PEPSINE-ACTIVITEIT
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de controle van de activiteit van
de pepsine, die wordt gebruikt voor de bepaling van ruw eiwit, oplosbaar in
pepsine en zoutzuur.
2.Beginsel
Hemoglobine wordt onder vastgestelde omstandigheden behandeld met
pepsine en verdund zoutzuur. Het niet gehydrolyseerde gedeelte van de
eiwitten wordt met trichloorazijnzuur geprecipiteerd. Aan het filtraat wordt
natronloog en het reagensvolgensFolin-Ciocalteu toegevoegd. De extinctie
van deze oplossing wordt gemeten bij 750 nm en de hiermee corresponde-
rende hoeveelheid tyrosine wordt afgelezen van een ijkgrafiek.
Definitie: De pepsine-eenheid (E) wordt gedefinieerd als die hoeveelheid
enzym, die onder de omstandigheden van de methode zoveel hydroxyarylver-
bindingen vrijmaakt, dat na kleuring met het Folin-Ciocalteu-reagenseen
extinctie verkregen wordt, die overeenkomt met die van 1 µmol tyrosine
onder dezelfde omstandigheden.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 0,2 N.
3.2 Zoutzuur 0,06 N.3.3 Zoutzuur 0,025 N.3.4 Trichloorazijnzuuroplossing 50 g/l.3.5 Natronloog 0,5 N.3.6 ReagensvolgensFolin-Ciocalteu: breng 100 g natriumwolframaat,
Na
2WO4.2 H2O, 25 g natriummolybdaat, Na2MoO4.2 H2O en 700 ml
water in een rondbodemkolf van 2 l met ingeslepen stop. Voeg toe
50 ml fosforzuur (d = 1,71) en 100 ml geconcentreerd zoutzuur (d
= 1,19). Verbind de kolf met een terugvloeikoeler, verhit de oplossing
tot koken en houd deze gedurende 10 h zachtjesaan de kook. Laat
afkoelen, verwijder de terugvloeikoeler en voeg toe 175 g lithiumsulfaat,
Li2SO4.2 H2O,50 ml water en 1 ml broom. Laat gedurende 15 minuten
koken, om de overmaat broom te verwijderen.
Laat afkoelen, breng de oplossing over in een maatkolf van 1 l, vul aan
met water tot de streep, meng en filtreer. De oplossing mag geen groene
kleur vertonen. Verdun vóór gebruik 1 volumedeel reagensmet 2
volumedelen water.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 9
▼B
3.7 Hemoglobine-oplossing: weeg af een hoeveelheid (ca. 2 g) hemoglobine,
protease-substraat volgens Anson, die overeenkomt met 354 mg stik-
stof (1) en breng deze in een kolf van 200 ml met ingeslepen stop. Voeg
enkele ml zoutzuur (3.2) toe, sluit de kolf aan op de vacuumpomp en
schud tot de hemoglobine volledig opgelost is. Hef het vacuum op en
voeg onder omzwenken zoveel zoutzuur (3.2) toe alsnodig isom de
hoeveelheid zoutzuur aan te vullen tot 100 ml. Vóór gebruik vers
bereiden.
3.8 Standaardtyrosine-oplossing: los op 181,2 mg tyrosine in zoutzuur (3.1)
en vul aan met hetzelfde zuur tot 1 l (stamoplossing). Verdun 20,0 ml
van deze oplossing met zoutzuur (3.1) tot 100 ml. 1 ml van deze oplos-
sing bevat 0,2 µmol tyrosine.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad met ultrathermostaat, ingesteld op 25 ºC ± 0,1 ºC.
4.2 Spectrofotometer.
4.3 Chronometer, nauwkeurigheid: 1 sec.
4.4 pH-meter
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.1)
Los150 mg peps ine op in 100 ml zoutzuur (3.2). Pipeteer 2 ml van de
oplossing in een maatkolf van 50 ml en vul aan met zoutzuur (3.3) tot de
streep. De met de pH-meter gemeten pH moet 1,6 ± 0,1 bedragen. Plaats
de kolf in het waterbad (4.1).
5.2Hydrolyse
Pipeteer 5,0 ml hemoglobineoplossing (3.7) in een reageerbuis en breng
in het waterbad (4.1) op een temperatuur van 25 ºC. Voeg daarna toe
1,0 ml van de in punt 5.1 verkregen pepsine-oplossing en meng door
ongeveer 10 maal op en neer bewegen met een glasstaaf, die aan het
uiteinde isafgeplat.
Plaatsde buisgedurende precies10 minuten in het waterbad (4.1) van
25 ºC, gerekend vanaf de toevoeging van de pepsine-oplossing (tijd en
temperatuur moeten nauwkeurig worden aangehouden). Voeg vervolgens
toe 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van tevoren op een
temperatuur van 25 ºC isgebracht, meng en filtreer door een droog filter.
5.3Ontwikkeling van de kleur en meting van de extinctie
Pipeteer 5,0 ml van het filtraat in een conische kolf van 50 ml, voeg toe
10,0 ml natronloog (3.5) en onder voortdurend omzwenken 3,0 ml
verdund reagensvolgensFolin-Ciocalteu (3.6). Meet na 5 à 10 minuten
de extinctie van de oplossing tegen water in cuvetten van 1 cm, met
behulp van de spectrofotometer bij 750 nm.
5.4Blancobepaling
Verricht bij iedere bepaling een blancoproef zoalshieronder bes chreven.
Pipeteer 5,0 ml hemoglobine-oplossing (3.7) in een reageerbuis, verwarm
dit in het waterbad (4.1) op 25 ºC. Voeg dan hieraan toe 10,0 ml
trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van te voren op een temperatuur
van 25 ºC isgebracht, meng en voeg vervolgens1,0 ml van de in punt
5.1 verkregen pepsine-oplossing toe. Meng met behulp van de glasstaaf
en plaatsde reageerbuisgedurende precies10 minuten in het waterbad
(4.1) bij 25 ºC. Meng en filtreer door een droogfilter. Handel verder
zoalsbes chreven onder punt 5.3.
5.5IJkgrafiek
Breng in conische kolven van 50 ml hoeveelheden van 1,0; 2,0; 3,0; 4,0
en 5,0 ml standaardtyrosine-oplossing (3.8), overeenkomend met respec-
tievelijk 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 en 1,0 µmol tyrosine. Voeg aan de reeks nog
een kolf toe zonder tyrosine. Breng met zoutzuur (3.1) op een volume
van 5,0 ml. Voeg toe 10,0 ml natronloog (3.5), alsmede onder voortdu-1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 10
(1) Bepaal het gehalte aan stikstof volgens een semi-microkjeldahlmethode (theoretisch
gehalte: 17,7 % N).
▼B
rend omzwenken 3,0 ml verdund reagensvolgensFolin-Ciocalteu (3.6).
Bepaal de extinctie zoalsaangegeven in de laats te zin van punt 5.3. Stel
de ijkgrafiek op door de extinctiesuit te zetten tegen de toegevoegde
hoeveelheden tyrosine.
6.Berekening van de resultaten
Leesuit de ijkgrafiek af de hoeveelheid tyros ine in µmol, die overeenkomt
met de extiactie van de gekleurde oplossing, gecorrigeerd met de blanco.
De pepsine-activiteit in µmol tyrosine per mg en per minuut, bij 25 ºC, wordt
berekend uit de volgende formule:
Eenheden per mg E =mgðÞ ¼0;32/C1a
g
waarin:
a = hoeveelheid tyrosine in µmol, afgelezen uit de ijkgrafiek,
g = gewicht in mg van de hoeveelheid pepsine, toegevoegd onder 5.2
7.Opmerkingen
7.1 De op te lossen hoeveelheid pepsine moet zodanig worden gekozen, dat
bij de uiteindelijke fotometrische meting een extinctie wordt verkregen
van 0,35 ± 0,035.
7.2 2 E/mg, bepaald volgensdeze methode, komen overeen met 3,64 milli-
eenheden Anson/mg (µmol tyrosine/mg · min bij 35,5 ºC) of met 36 400
handelseenheden/g (µmol tyrosine/g · 10 minuten bij 35,5 ºC).
5.BEPALING VAN VRIJ EN TOTAAL GOSSYPOL
1.Doel en toepassingsgebied
Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
vrij gossypol, totaal gossypol en aan gossypol chemisch nauw verwante
stoffen in katoenzaad, katoenzaadmeel en -koeken en in mengvoeders die
katoenzaadprodukten bevatten.
De ondergrensvan de bepaalbaarheid bij de methode bedraagt 20 ppm.
2.Beginsel
Gossypol wordt geëxtraheerd in aanwezigheid van 3-amino-1-propanol, hetzij
met een mengsel van isopropanol en hexaan voor het bepalen van vrij
gossypol, hetzij met dimethylformamide voor het bepalen van totaal
gossypol.
Het gossypol wordt met behulp van aniline omgezet in gossypoldianiline,
waarvan de extinctie gemeten wordt bij 440 nm.
3.Reagentia
3.1 Isopropanol-hexaanmengsel: Meng 60 volumedelen isopropanol p.a. met
40 volumedelen n-hexaan.
3.2 Oplosmiddel A: Breng in een maatkolf van 1 l ongeveer 500 ml isopro-
panol-hexaanmengsel (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml ijsazijn en
50 ml water. Vul aan tot 1 l met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Dit
reagensiseen week houdbaar.
3.3 Oplosmiddel B: Pipeteer in een maatkolf van 100 ml 2 ml 3-amino-1-
propanol en 10 ml ijsazijn. Koel af tot kamertemperatuur en vul aan tot
100 ml met N,N-dimethylformamide. Dit reagensiseen week houdbaar.
3.4 Aniline p.a.: Wanneer de extinctie van een blancobepaling meer
bedraagt dan 0,022 , moet de aniline worden afgedestilleerd over
zinkpoeder, waarbij 10 % voorloop en 10 % naloop worden verwijderd.
Dit reagens is enige maanden houdbaar in een gesloten bruine fles,
bewaard in een koelkast.
3.5 Gossypolstandaardoplossing A: Breng in een maatkolf van 250 ml
27,9 mg gossypolacetaat, los op in oplosmiddel A (3.2), en vul hiermee
aan tot de streep. Pipeteer 50 ml van deze oplossing in een maatkolf van
250 ml en vul aan tot 250 ml met oplosmiddel A (3.2). 1 ml van deze
oplossing bevat 0,02 mg gossypol. Laat de oplossing vóór het gebruik 1 h
staan bij kamertemperatuur.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 11
▼B
3.6 Gossypolstandaardoplossing B: Breng in een maatkolf van 50 ml 27,9 mg
gossypolacetaat, los op in oplosmiddel B (3.3) en vul hiermee aan tot de
streep. 1 ml van deze oplossing bevat 0,5 mg gossypol.
De gossypolstandaardoplossingen zijn — in het donker bewaard — gedu-
rende 24 h houdbaar.
4.Apparatuur
4.1 Roteerapparaat met ongeveer 35 omwentelingen per minuut.4.2 Spectrofotometer.
5.Uitvoering
5.1Af te wegen hoeveelheid analysemateriaal
De af te wegen hoeveelheid analysemateriaal hangt af van het te
verwachten gehalte aan gossypol. Het verdient de voorkeur te werken
met een kleine hoeveelheid analysemateriaal en met een relatief groot
aliquoot deel van het filtraat, om een voldoende hoeveelheid gossypol
te verkrijgen voor een nauwkeurige fotometrische meting.
Voor het bepalen van vrij gossypol in katoenzaad, katoenzaadmeel en -
koeken mag het gewicht van het analysemateriaal niet meer bedragen
dan 1 g; van mengvoederskan tot 5 g worden afgewogen. In het alge-
meen kan een aliquoot deel van 10 ml van het filtraat worden
afgepipeteerd; het moet 50 à 100 µg gossypol bevatten.
Voor het bepalen van totaal gossypol kan de af te wegen hoeveelheid
analysemateriaal variëren van 0,5 tot 5 g, opdat in een aliquoot deel
van 2 ml van het filtraat 40 tot 200 µg gossypol aanwezig is.
De analyse moet worden uitgevoerd bij een omgevingstemperatuur van
nabij 20 ºC.
5.2Bepaling van vrij gossypol
Breng het afgewogen analysemateriaal in een kolf van 250 ml met slijp-
stuk en waarvan de bodem bedekt is met glaskralen. Pipeteer hierbij
50 ml oplosmiddel A (3.2), sluit de kolf en laat gedurende 1 h roteren.
Filtreer door een droogfilter en vang het filtraat op in een kleine kolf met
slijpstuk. Bedek tijdens het filtreren de trechter met een horlogeglas.
Pipeteer gelijke aliquote delen van het filtraat, die 50 tot 100 µg gossypol
bevatten, in twee maatkolven van 25 ml (A en B). Breng eventueel het
volume op 10 ml met oplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van maatkolf
(A) aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing
dient als referentieoplossing voor het monster.
Pipeteer vervolgensin twee andere maatkolven van 25 ml (C en D) 10 ml
oplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van kolf (C) aan tot 25 ml met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing dient als referentieop-
lossing voor de blanco.
Voeg aan de maatkolven (D) en (B) resp. 2 ml aniline (3.4) toe.
Verwarm gedurende 30 min. op een kokend waterbad voor het ontwik-
kelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot de
streep met isopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h
staan.
Meet met behulp van de spectrofotometer de extinctie van de blanco-
oplossing (D) bij 440 nm in een glascuvet van 1 cm t.o.v. de referentie-
oplossing (C). Meet vervolgens de extinctie van de monsteroplossing (B)
t.o.v. de referentie-oplossing (A).
Verminder de extinctie van de monsteroplossing met die van de blanco-
oplossing (= gecorrigeerde extinctie). Bereken uit de aldus verkregen
waarde het gehalte aan vrij gossypol als beschreven onder 6.
5.3Bepaling van totaal gossypol
Breng een hoeveelheid analysemateriaal, die 1 à 5 mg gossypol bevat, in
een maatkolf van 50 ml en voeg toe 10 ml oplosmiddel B (3.3). Bereid
terzelfder tijd een blanco-oplossing, door 10 ml oplosmiddel B (3.3) in
een tweede maatkolf van 50 ml te brengen.
Verwarm beide kolven gedurende 30 minuten op een kokend waterbad.
Koel af tot kamertemperatuur, vul beide kolven aan tot de streep met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en meng. Laat na gedurende 10 à 15
minuten staan en filtreer dan af in kolfjes met ingeslepen stop.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 12
▼B
Pipeteer 2 ml van het filtraat van het monster in resp. twee maatkolven
van 25 ml en 2 ml van het filtraat van de blanco in resp. twee andere
maatkolven van 25 ml. Vul van elke serie één maatkolf aan tot 25 ml
met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossingen dienen als refe-
rentieoplossingen.
Voeg vervolgens2 ml aniline (3.4) toe aan de beide overige maatkolven.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad voor het
ontwikkelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot
25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h
staan.
Meet de extincties als beschreven onder 5.2 voor vrij gossypol. Bereken
uit de verkregen waarde het gehalte aan totaal gossypol als beschreven
onder 6.
6.Berekening van de resultaten
De berekening van de resultaten kan geschieden hetzij op basis van de speci-
fieke extinctie (6.1), dan wel m.b.v. een ijkgrafiek (6.2).
6.1Opbasis van de sp ecifieke extinctie
Onder de beschreven omstandigheden bedragen de specifieke extincties
voor:
vrij gossypol: E1%
1c m ¼625
totaal gossypol: E1%
1c m ¼600
Het gehalte aan vrij of totaal gossypol in het monster wordt verkregen
uit de onderstaande formule:
percentage gossypol ¼E/C11250
E1%
1c m/C1g/C1v
waarin:
E = gecorrigeerde extinctie, alsbepaald onder 5.2
g = gewicht van het analysemateriaal in grammen
v = aliquoot deel van het filtraat in ml.
6.2Met behulpvan een ijkgrafiek
6.2.1Vrij gossypol
Neem twee series van telkens 5 maatkolven van 25 ml. Pipeteer in
beide series resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en 10,0 ml gossypol-
standaardoplossing A (3.5). Verdun met oplosmiddel A (3.2) tot
10 ml. Voeg aan elke serie nog een maatkolf van 25 ml toe, die
slechts 10 ml oplosmiddel A (3.2) bevat (blancoproef). Vul de
kolven van de eerste serie, met inbegrip van de blancoproef, aan
tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentieserie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie,
inclusief de blancoproef. Verwarm gedurende 30 minuten op een
kokend waterbad voor het ontwikkelen van de kleuring. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h staan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extinctieste s tellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.2.2Totaal gossypol
Neem zes maatkolven van 50 ml. Breng in de eerste 10 ml oplos-
middel B (3.3) en in de andere resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en
10,0 ml gossypolstandaardoplossing B (3.6). Verdun de inhoud van
elke kolf tot 10 ml met oplossmiddel B (3.3). Verwarm gedurende
30 minuten op een kokend waterbad. Koel af tot kamertempera-
tuur, vul aan tot 50 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en
meng.
Pipeteer van deze oplossingen telkens 2,0 ml in resp. twee series
van zes maatkolven van 25 ml. Vul de kolven van de eerste serie1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 13
▼B
aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentie-
serie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h staan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extinctieste s tellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
— 15 % relatief bij gehalten van minder dan 500 ppm gossypol;
— niet meer dan 75 ppm absoluut bij gehalten van 500 tot 750 ppm;— 10 % relatief bij gehalten van meer dan 750 ppm gossypol.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 14
▼B
BIJLAGE II
1.OPSPORING EN IDENTIFICATIE VAN ANTIBIOTICA VAN DE
GROEP TETRACYCLINEN
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de opsporing en de identificatie van antibiotica van
de groep tetracyclinen in voedermiddelen die ten minste 0,1 ppm bevatten, inconcentraten en voormengsels.
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een mengsel van methanol en zoutzuur.
Het extract wordt aan stijgende papierchromatografie onderworpen in verge-
lijking met standaard oplossingen. De antibiotica worden opgespoord en
geïdentificeerd door hun Rf waarden te vergelijken met deze van een stan-
daard, hetzij door fluorescentie in UV-licht (bij sterke dosis aan antibiotica),
hetzij via bioautografie op agarvoedingsbodem geënt met B. cereus .
3.Reagentia en voedingsbodem
3.1Buffer, pH 3,5
Citroenzuur met een mol water p.a. 10,256 g
Dinatriumfosfaat Na
2HPO4·2 H2O p.a. 7,45 g
Aceton p.a. 300 ml
Gedestilleerd water tot 1000 ml
3.2Fosfaatbuffer, pH 5,5
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 130,86 g
Dinatriumfosfaat Na2HPO4·2H2O p.a. 6,947 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
3.3 Loopmiddel I: Mengsel nitromethaan chemisch zuiver/chloroform
chemisch zuiver/ α/dichloorhydrine: 20/10/1,5 in vol.,
versbereid.
3.4 Loopmiddel II: Mengsel nitromethaan chemisch zuiver/chloroform
chemisch zuiver/ α-picoline 20/10/3 in vol., vers
bereid.
3.5 Mengsel methanol chemisch zuiver/zoutzuur (d: 1,19): 98/2 in vol.3.6 Zoutzuur 0,1 N
3.7 Ammonia d: 0,91.
3.8 Standaard: chloortetracycline, oxytetracycline, tetracycline waarvan de
activiteit alshydrochloride uitgedrukt is .
3.9Mikro-organisme: B. cereus ATCC 11.778
Voor het bewaren van de stam, de bereiding van de entsuspensie en
voor het enten van de voedingsbodem, zijn de voorschriften 3.1 en 3.2
van de methode voor de bepaling van chloortetracycline, oxytetracy-
cline en tetracycline door middel van agardiffusie, die deel uitmaken
van deel 2 van deze bijlage, toe te passen.
3.10Voedingsbodem (
1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 15
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
Agar-agar 20 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
Op pH 5,8 brengen vlak voor gebruik.
3.11 Oplossing van 0,1 % 2,3,5-triphényltétrazoliumchloride (g/v) en 5 %
glucose (g/v).
4.Apparatuur
4.1 Toestel voor stigfende papierchromatografie (papierhoogte: 25 cm).
Papier Schleicher en Schüll 2040 b of 2043 b, of gelijkwaardig.
4.2 Centrifuge.
4.3 Broedstoof geregeld bij 30 ºC.4.4 UV lamp voor fluorescentie detectie.
4.5 Glasplaten van 20 × 30 cm geschikt voor het vormen van platte dozen
voor bioautografie.
5.Standaardoplossingen
5.1Stamoplossingen:
Uitgaande van de standaard (3.8) worden met zoutzuur (3.6) oplossingen
bereid waarvan de concentratie respectievelijk, overeenstemt met 500 µg
chloortetracycline-HCl, oxytetracycline-HCl en tetracycline-HCl per ml.
5.2Standaardoplossingen voor detectie in UV licht
De oplossingen (5.1) worden met fosfaatbuffer (3.2) verdund om oplos-
singen te bekomen waarvan de concentratie overeenstemt met 100 µg
chloortetracycline-HCl, oxytetracycline-HCl en tetracycline-HCl per ml.
5.3Standaardoplossingen voor detectie langs bioautografie
De oplossingen (5.1) worden met fosfaatbuffer (3.2) verdund om oplos-
singen te bekomen waarvan de concentratie overeenstemt met 5 µg
chloortetracycline-HCl, oxytetracycline-HCl en tetracycline-HCl per ml.
6.Extractie
Voor verwachte gehalten aan antibioticum beneden 10 ppm kan men een deel
van het homogeen monster nemen of de fijnste zeeffractie, aangezien de anti-
biotica zich bij voorkeur in deze fractie bevinden.
Het monsterdeel wordt in suspensie gebracht in het mengsel (3.5) en gecen-
trifugeerd. De bovenstaande vloeistof wordt als zodanig gebruikt of zo nodig
verdund met het mengsel (3.5) tot antibioticum concentraties van ca. 100 µg
(6.1) en 5 µg (6.2) per ml.
7.Aantonen en identificatie
7.1Chromatografie
Het papier wordt in de bufferoplossing, pH 3,5 (3.1) gedompeld, daarna
wordt de overmaat vocht verwijderd door het tussen twee droge stukken
filtreerpapier te leggen. Vervolgensworden 0,01 ml van de standaardop-
lossingen (5.2 en 5.3) alsook van het extract (6.1 en 6.2) op het papier
gebracht. De juiste vochtigheidsgraad van het papier is belangrijk voor
het verkrijgen van een goede scheiding, desnoods lichtjes drogen.
Ontwikkelen via stijgende chromatografie. Het loopmiddel I (3.3) wordt
voor de detectie via bioautografie gebruikt en het loopmiddel II (3.4)
voor de detectie onder UV licht. De chromatografie wordt afgebroken
zodra het loopmiddel een hoogte van 15 tot 20 cm heeft bereikt (onge-
veer 1 h 30) nadien het papier drogen.
7.2Detectie onder UV licht
Bij gehalten aan antibioticum boven 1 µg/cm
2ziet men na behandeling
met ammoniadampen (3.7) onder de UV-lamp (4.4) geel-goude fluores-
cerende vlekken.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 16
▼B
7.3Detectie via bioautografie
De voedingsbodem (3.10) geënt met B. cereus (3.9) wordt op platen
(4.5) gebracht en het papier op de voedingsbodem uitgestrekt. Na 5
minuten contact het papier afnemen en op een andere plaatsleggen van
de voedingsbodem, waar het zal blijven tijdens een nacht broeden bij
30 ºC in de broedstoof. Het ontstaan van klare remmingszones in de troe-
bele voedingsbodem wijzen op de aanwezigheid van antibiotica van
tetracyclinegroep. Om het chromatogram te fixeren wordt het papier na
broeden besproeid met oplossing (3.11).
7.4Identificatie
Hier volgen de relatieve Rf waarden van de antibiotica van de tetracy-
cline groep. Deze waarden kunnen lichtjesafwijken volgensde
kwaliteit van het papier en zijn vochtgehalte.
Chloortetracycline (CTC) 0,60
Tetracycline (TC) 0,40Oxytetracycline (OTC) 0,204-epi-CTC 0,15
4-epi-TC 0,13
4-epi-OTC 0,10
De verbindingen „epi” hebben geringere antibiotische werking dan de
normale verbindingen.
2.BEPALING VAN CHLOORTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE
EN VAN TETRACYCLINE
A. DOOR MIDDEL VAN AGARDIFFUSIE METHODE
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van chloortetracycline
(CTC), oxytetracycline (OTC) en van tetracycline (TC) in voedermiddelen,
concentraten en voormengsels. De ondergrens van de bepaalbaarheid ligt bij
5 ppm. De gehalten beneden 5 ppm kunnen geschat worden door interpoleren
op de ijklijn.
2.Principe
Voorgehalten beneden of gelijk aan 50 ppm wordt geëxtraheerd met verdund
formamide. Voor gehalten boven 50 ppm extraheert men voor de bepaling
van CTC met een mengsel van aceton, water en zoutzuur en voor de bepaling
van OTC en van TC met een mengsel van aceton en zoutzuur.
De extracten worden verdund en de antibiotische werking bepaald door
meting van de diffusiezones van CTC, OTC of van TC in een met B. cereus
geënte agar-voedingsbodem. De diffusie wordt zichtbaar gemaakt door het
ontstaan van remmingszones in aanwezigheid van het micro-organisme. De
diameter van deze zonesisrechtevenredig met de logaritme van de concen-
tratie van het antibioticum.
3.Micro-organisme: B. cereus ATCC nr. 11.778
3.1Bewaren van de stam
B. cereus enten in een proefbuisje met schuingestolde agar-voedings-
bodem (4.1) zonder methyleenblauw en boorzuur . Een nacht bij ca.
30 ºC bebroeden. Deze cultuur in ijskast bewaren en alle 14 dagen op
dezelfde wijze overenten.
3.2Bereiding van de entsuspensie
Een cultuur op schuingestolde agar bereid, beschreven in (3.1) wordt
direct na het bebroeden, in 2 tot 3 ml steriele fysiologische zoutoplossing
(4.5) opgenomen. Met deze suspensie een Roux-fles bevattende 300 ml
gestolde voedingsbodem (4.1) zonder methyleenblauw en boorzuur en
met een concentratie aan agar van 3 tot 4 % beënten, 3 tot 5 dagen bij
28-30 ºC bebroeden, na microscopische controle van sporulatie de
cultuur opnemen in 15 ml ethanol (4.6) en homogeniseren. Deze
suspensie kan, mits in ijskast bewaard, gedurende 5 maanden gebruikt
worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) nagaan hoeveel van
deze suspensie aan het medium moet worden toegevoegd om voor de
toegepaste concentraties aan antibioticum zo groot mogelijke maar nog1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 17
▼B
scherpe remmingszones te verkrijgen. Deze hoeveelheid is gewoonlijk
van 0,2 tot 0,3 ml/1 000 ml. Het enten van de voedingsbodem vindt bij
50-60 ºC plaats.
4.Voedingsbodems en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de bepalingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 gVleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van type) 10 tot 20 gTween 80 1 ml
Fosfaatbuffer, pH 5,5 (4.2) 10 ml
Boorzuuroplossing 5 % (g/v) 15 mlOplossing 0,5 % methyleenblauw in ethanol 4 ml
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
Op pH 5,8 brengen, vlak voor gebruik
4.2Fosfaatbuffer pH 5,5
Monokaliumfosfaat KH
2PO4p.a. 130,86 g
Dinatriumfosfaat Na2HPO4·2H2O p.a. 6,947 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3 Fosfaatbuffer pH 5,5, verdund tot 1/10.
4.4Fosfaatbuffer pH 8
Monikaliumfosfaat KH2PO4p.a. 1,407 g
Dinatriumfosfaat Na2HPO4·2 H2O p.a. 57,539 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.5 Steriele fysiologische zoutoplossing
4.6 Ethanol 20 % (V/V).4.7 Zoutzuur 0,1 N.
4.8 Formamide 70 % (V/V) versbereid en tot pH 4,5 brengen met zwavel-
zuur ca. 2 N.
4.9 Mengsel aceton chemisch zuiver water/zoutzuur (d: 1,19): 65/33/2
(vol).
4.10 Mengsel methanol chemisch zuiver/zoutzuur (d: 1,19): 98/2 (vol).4.11 Standaard: CTC, OTC, TC waarvan de activiteit alshydrochloride
uitgedrukt is.
5.Standaardoplossingen
5.1Chloortetracycline
Uitgaande van de standaard (4.11) wordt met zoutzuur (4.7) een stamop-
lossing bereid waarvan de concentratie overeenstemt met 500 µg
chloortetracycline-HCl per ml. Deze oplossing kan, mits in ijskast
bewaard, een week gebruikt worden.
Uitgaande van deze oplossing, wordt door verdunnen met de fosfaat-
buffer pH 5,5, verdund tot 1/10 (4.3) waaraan 0,01 % amidozwart (
2)i s
toegevoegd, een werkstandaardoplossing S8bereid waarvan de concen-
tratie overeenstemt met 0,2 µg chloortetracycline-HCl per ml.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 18
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
(2) Amidozwart dient om de remmingszones van de standaardoplossingen te kenmerken
(blauwe ringen).
▼B
Vervolgensworden, door 1 + 1 verdunnen met de buffer (4.3) de
volgende concentratiesbereid:
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2Oxytetracycline
Zoals beschreven onder 5.1 wordt uitgaande van een stamoplossing
waarvan de concentratie overeenstemt met 400 µg oxytetracycline-HCl
per ml, een standaardmerkoplossing S8van 1,6 µg oxytetracycline-HCl
per ml bereid, alsook de volgende concentraties:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.3Tetracycline
Zoals beschreven onder 5.1 wordt, uitgaande van een stamoplossing
waarvan de concentratie overeenstemt met 500 µg tetracycline-HCl per
ml, een standaardmerkoplossing S8van 1,0 µg tetracycline-HCl per ml
bereid, alsook de volgende concentraties:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Extractie
6.1Gehalten beneden of gelijk aan 50 ppm
De afgewogen hoeveelheid van het monster wordt behandeld met forma-
mide (4.8) volgensde aanduidingen van hiernavolgende tabel en 30
minuten geschud. Daarna onmiddellijk verdunnen met de fosfaatbuffer
(4.3) volgensbes chreven in de tabel tot de proefconcentratie U8, bij
deze oplossing moet de concentratie aan formamide beneden 40 % zijn.
Centrifugeren of bezinken laten tot een heldere oplossing.
Vervolgensworden, door 1 + 1 verdunnen met fos faatbuffer (4.3) de
concentratiesU4,U2en U1bereid.
Antibioticum CTC OTC TC
Verwacht gehalte
in ppm 10 50 10 50 10 50
Afgewogen
hoeveelheid in g 10 10 24 9,6 20 10
ml formamide
(4.8) 100 100 80 100 80 100
ml fosfaatbuffer
(4.3)verd.
1: 5
(a)verd.
1: 25
(b)70 200 120verd.
1: 5
(a)
Conc. U8in µg/
ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) 20 ml extract afmeten en tot 100 ml met buffer aanvullen in een maatkolf.
(b) 4 ml extract afmeten en tot 100 ml met buffer aanvullen in een maatkolf.
6.2Gehalten boven 50 ppm
6.2.1Chloortetracycline
Een afgewogen hoeveelheid van 2 tot 10 g naargelang het
verwacht gehalte of de fabrikatiewaarborg aan antibioticum, wordt
met 20 maal zijn volumemengsel (4.9) 30 minuten geschud.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 19
▼B
Tijdensde extractie wordt nagegaan of de pH waarde onder 3 blijft
zo niet op pH 3 brengen (met azijnzuur 10 % bij minerale meng-
sels). Een aliquot van het extract wordt met fosfaatbuffer pH 8
(4.4) in aanwezigheid van bromocresolgroen (omslag van geel
naar blauw) op pH 5,5 gebracht. Verdunnen tot de concentratie
U8(zie 6.1) met fosfaatbuffer, pH 5,5 verdund tot 1/10 (4.3).
Vervolgensworden, door 1 + 1 verdunnen met de fos faatbuffer
(4.3) de concentratiesU4,U2en U, bereid.
6.2.2Oxytetracycline en tetracycline
Hetzelfde als beschreven onder 6.2.1, maar het mengsel (4.9)
wordt door het mengsel (4.10) vervangen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) wordt met de entsuspensie (3.2) bij 50 — 60 ºC
geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in schalen met de vier standaardconcentra-
tiesS8,S4,S2,S1en de vier monsterconcentraties U8,U4,U2,U1. Iedere
schaal moet beslist alle vier concentraties van zowel standaard als
monster bevatten. Te dien einde schalen kiezen met zodanige afmetingen
dat in elk ten minste 8 gaatjes van 10 à 13 mm diameter kunnen worden
aangelegd. De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem (7.1) wordt
berekend zodat een overal even dikke laag van 2 mm dikte verkregen
wordt. Bij voorkeur dienen alss chalen te worden gebruikt, vlakke glazen
platen met een volledig vlakke ring van aluminium of kunststof van
200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjes, afhankelijk van hun diameter, worden met een pipet,
nauwkeurig afgemeten hoeveelheden van het antibioticumextract
gebracht die tussen 0,10 en 0,15 ml liggen. Voor ieder monster worden
ten minste 4 diffusiebepalingen gedaan met iedere concentratie, zodanig
dat iedere bepaling neerkomt op het meten van 32 remzones.
7.3Bebroeden
De schalen worden gedurende ca. 18 uur bij 28 — 30 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diametersvan de remzonesworden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, de loga-
ritmen van de concentratiestegen de remzonediameters .
Voor de standaard en monsteroplossingen worden nu lijnen getrokken; bij
afwezigheid van storingen zijn deze recht en evenwijdig.
De logaritme van de relatieve activiteit wordt volgensde volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8/C10;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
B. DOOR TURBIDIMETRIE
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van chloortetracycline
(CTC), oxytetracycline (OTC) en van tetracycline (TC) bij concentraties
boven 1 g/kg, voor zover geen bestanddelen storen of een troebel filtraat
veroorzaken. Deze methode is sneller dan de agardiffusie methode.
PrincipeHet monster wordt geëxtraheerd met een mengsel van aceton, water en zout-
zuur voor de bepaling van CTC en met een mengsel van methanol en
zoutzuur voor de bepaling van OTC en TC. De extracten worden verdund1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 20
▼B
en de antibiotische werking bepaald door het meten van de lichttransmissie
van een voedingsbodem geënt met Staphylococcus aureus in aanwezigheid
van het antibioticum. De lichttransmissie is functie van de antibioticum
concentratie.
3.Micro-organisme: Staphylococcus aureus K 141 (1)
3.1Bewaren van de stam
S. aureus enten in een proefbuisje met schuingestolde agra-voedings-
bodem (4.1) waaraan 1,5 tot 3,5 % agar wordt toegevoegd (afhankelijk
van type). Een nacht bij ca. 37 ºC bebroeden. Deze cultuur in ijskast
bewaren en alle 4 weken op dezelfde wijze overenten. Gelijktijdig
worden subculturen aangelegd voor het laboratoriumgebruik.
3.2Bereiding van de entsuspensie
24 uur voor de bepaling wordt een proefbuisje met schuingestolde agar-
voedingsbodem met een subcultuur geënt en een nacht bij 37 ºC bebroed.
De totale cultuur van dit buisje wordt in suspensie gebracht in ca. 2 ml
voedingsbodem voor de bepaling (4.1) en daarna aseptisch in ca. 100 ml
voedingsbodem voor de bepaling (4.1) overbrengen. In een waterbad bij
37 ºC broeden tot de groei van de stam haar logaritmische fase bereikt (1
u 30 tot 2 uur).
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de bepaling (2)
Pepton 5 g
Gistextract 1,5 g
Vleesextract 1,5 g
Natriumchloride 3,5 gGlucose 1,0 g
Monokaliumfosfaat KH
2PO4p.a. 1,32 g
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 3,68 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
pH na sterilisatie 6,8 tot 7,0
4.2Fosfaatbuffer, pH 4,5
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 13,6 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
4.3 Zoutzuur 0,1 N.
4.4 Mengsel aceton chemisch zuiver water/zoutzuur (d: 1,19): 65/33/2 (vol.).4.5 Mengsel methanol chemisch zuiver zoutzuur (d: 1,19): 98/2 (vol.).4.6 Oplossing van 10 % ongeveer (g/v) formaldehyde.4.7 Standaard: CTC, OTC, TC waarvan de activiteit alshydrochloride uitge-
drukt is.
5.Standaardoplossing
Uitgaande van de standaard (4.7), wordt met zoutzuur (4.3) een stamoplos-
sing bereid waarvan de concentratie overeenstemt met 400 tot 500 µg CTC
— HCl, OTC — HCl of TC — HCl per ml. Deze oplossing kan een week
in de ijskast bewaard worden.
6.Extractie
6.1Chloortetracycline
Een afgewogen hoeveelheid van 1 tot 2 g in een maatkolf van 200 of
250 ml wordt met ca. 100 ml mengsel (4.4) 30 minuten geschud. Tot1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 21
(1) De stam, door LUFA te Kiel geïsoleerd, groeit sneller dan S. aureus ATGG 6538 P .
(2) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
de maatstreep aanvullen met fosfaatbuffer pH 4,5 (4.2), mengen en laten
bezinken.
6.2Oxytetracycline en tetracycline
Een afgewogen hoeveelheid van 1 tot 2 g in een maatkolf van 200 of
250 ml wordt met ca. 100 ml mengsel (4.5) 30 minuten geschud. Tot
de maatstreep aanvullen met fosfaatbuffer pH 4,5 (4.2), mengen en laten
bezinken.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Bereiding van standaard en extractverdunningen
Uitgaande van standaardoplossing (5) en van de extractoplossing (6)
worden met fosfaatbuffer pH 4,5 (4.2) een reeks verdunningen bereid.
Voor elke bepaling met behulp van elke verdunning een ijklijn trekken
die ten minste het interpoleren van twee waarden van het extract toelaat.
De verdunningen kiezen naargelang de omstandigheden van de stam-
groei, deze kunnen verschillen van het ene laboratorium tot het andere.
Gewoonlijk werkt men alsvolgt:
7.1.1Chloortetracycline
De standaardoplossing (5) wordt met fosfaatbuffer (4.2) verdund
om een werkstandaardoplossing te bekomen waarvan de concen-
tratie overeenstemt met 0,2 µg CTC — HCl per ml. Vervolgens
worden met fosfaatbuffer (4.2) 6 verdunningen in buisjes bestemd
voor de bepaling, met een herhaling voor elke verdunning alsvolgt
bereid.
ml werkstandaardop-
lossingml fosfaatbuffer (4.2)CTC-HCl concentratie
(µg/ml)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Het extract (6.1) wordt met fosfaatbuffer (4.2) tot een verwachte
concentratie aan CTC — HCl van 0,12 µg/ml verdund. In twee
buisjes wordt 1 ml van deze oplossing gebracht en 0,75 ml
(= 0,09 µg) in twee andere buisjes, deze twee laatste buisjes
worden met fosfaatbuffer (4.2) tot 1 ml aangevuld.
7.1.2Oxytetracycline en tetracycline
De standaardoplossing (5) wordt met fosfaatbuffer (4.2) verdund
om een standaardwerkoplossing te bekomen waarvan de concen-
tratie overeenstemt met 0,6 µg OTC — HCl of TC — HCl per
ml. Vervolgensworden 7 verdunningen in buis jesvoor de bepaling
met een herhaling voor elke verdunning, met fosfaatbuffer (4.2) als
volgt bereid:
ml werkstandaardop-
lossingml fosfaatbuffer (4.2)Concentratie van
OTC-HCl of TC-HCl
µg/ml)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,12
Het extract (6.2) wordt met fosfaatbuffer (4.2) tot een verwachte
concentratie aan OTC — HCl of TC — HCl van 0,48 µg/ml
verdund. In twee buisjes wordt 1 ml van deze oplossing gebracht1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 22
▼B
en 0,5 ml (= 0,24 µg) in twee andere buisjes, deze twee laatste
buisjes worden met fosfaatbuffer (4.2) tot 1 ml aangevuld.
7.2Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem voor de bepaling (4.1) wordt met de entsuspensie
(3.2) zodanig geënt tot een lichttransmissie van 85 % met een fotometer
bij 590 nm in een cuvet van 5 cm dikte of 92 % in een cuvet van 2 cm
dikte het toestel zijnde ingesteld op 100 % transmissie met de niet geënte
voedingsbodem (4.1).
7.3Het enten
In elk buisje (7.1.1 of 7.1.2) wordt 9 ml geënte voedingsbodem (7.2)
gebracht. De buisjes worden op propere wijze gevuld, maar niet noodza-
kelijk aseptisch.
7.4Bebroeden
Het bebroeden moet beslist plaatsvinden in een waterbad met door bewe-
ging van het water overal gelijke temperatuur van 37 ºC ± 0,1 ºC, zolang
dat de helling van de transmissiecurven precieze metingen toelaat
(gewoonlijk 2 u 30 tot 3 uur). Daarna wordt de groei gestopt door 1 ml
formaldehyde oplossing (4.6) snel in elke buis te spuiten.
7.5Meting van de groei
De transmissies worden met een fotometer bij 590 nm gemeten, het
toestel ingesteld op 100 % transmissie met de helderste standaardoplos-
sing (met het hoogste gehalte aan antibioticum). Daar er maar weinig
verschil van turbiditeit tussen de verschillende buisjes bestaat, is het aan
te bevelen cuvetten van ten minste 2 cm en bij voorkeur van 5 cm te
gebruiken.
8.Berekening van de resultaten
De ijklijn wordt grafisch op millimeterpapier getrokken waarbij de fotometri-
sche transmissies tegen de concentraties aan antibioticum. Op de ijklijn
worden de transmissies voortkomend van het extract geïnterpoleerd en het
gehalte aan antibioticum van het monster berekend.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
3.BEPALING VAN OLEANDOMYCINE
— door middel van de agardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van oleandomycine in
voedermiddelen, voormengsels en concentraten, ook in aanwezigheid van
tetracyclinen. De ondergrensvan de bepaalbaarheid ligt bij 0,5 ppm.
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een oplossing van tris (hydroxymethyl)
aminomethaan in methanol. Na centrifugeren wordt het extract verdund en de
antibiotische werking ervan gemeten via de diffusie van het oleandomycine
in een met B. cereus geënte voedingsbodem. De diffusie wordt zichtbaar
door de vorming van remzonesin aanwezigheid van het micro-organis me.
De diameter van deze remzonesisrechtevenredig met de logaritme van de
antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: B. cereus K 250 TR (1) (tetracyclinenresistent)
3.1Bewaren van de stam
B. cereus wordt geënt in een buisje met schuingestolde agarvoedings-
bodem (4.1), waaraan per 5 ml 100 µg oxytetracycline istoegevoegd.
Na een nacht bebroeden bij ca. 30 ºC wordt deze cultuur in de ijskast
bewaard en alle vier weken op dezelfde wijze overgeënt.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 23
(1) Door LUFA te Kiel geïsoleerde stam.
▼B
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestelde
agar bereid en daarna in 3 ml fysiologische zoutoplossing (4.3) opge-
nomen. Met deze suspensie wordt een Roux-fles beënt, die 300 ml
gestolde voedingsbodem (4.1) met een agar-agarconcentratie van 3—
4 % bevat. Na een incubatietijd van 3 — 5 dagen bij 28 — 30 ºC wordt
sporevorming microscopisch gecontroleerd, waarna de sporen in 15 ml
aethanol (4.4) worden opgenomen. Deze suspensie wordt gehomogeni-
seerd en kan ten minste 5 maanden in de ijskast bewaard worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.2) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan het medium moet worden toege-
voegd om bij de toegepaste concentraties oleandomycine zo groot
mogelijke, maar nog scherpe remzones te verkrijgen. In het algemeen
zal dit 0,1 — 0,2 ml/1 000 ml zijn. Het enten van de voedingsbodem
vindt bij 60 ºC plaats.
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor het bewaren van de stam (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 gGistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
Op pH 6,5 brengen, vlak voor gebruik
4.2Voedingsbodem voor de metingen (
2)
Voedingsbodem (4.1), echter ingesteld op pH 8,8.
4.3 Steriele physiologische zoutoplossing.
4.4 Aethanol 20 % (v/v).
4.5 Methanol, chemisch zuiver.4.6 Tris (hydroxymethyl) aminomethaanoplossing, p.a. 0,5 % (g/v).
4.7Extractievloeistof
Methanol, chemisch zuiver 50 ml
Gedestilleerd water 50 mlTris(hydroxymethyl)
aminomethaan p.a.0,5 g
4.8 Standaard: oleandomycine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossing
Een hoeveelheid standaard (4.8) wordt in 5 ml methanol (4.5) opgelost,
waarna met oplossing (4.6) verdund wordt tot een oleandomycineconcentratie
van 100 µg/ml.
Door verder verdunnen van deze stamoplossing met mengsel (4.6) werd een
werkstandaardoplossing S
8van 0,1 µg oleandomyoine per ml bereid. Daarna
werden de volgende concentraties door successieve verdunningen (1 + 1) met
oplossing (4.6) bereid:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 24
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft kan gebruikt worden.
(2) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft kan gebruikt worden.
▼B
S10,0125 µg/ml
6.Extractie
Rekening houdend met het „verwachte gehalte” aan oleandomycine in het
monster, wordt een hoeveelheid tussen de 2 en 10 g ervan afgewogen. Na
toevoegen van 100 ml oplossing (4.7) wordt 30 minuten geschud. Na centri-
fugeren wordt een aliquot deel van de bovenstaande vloeistof met oplossing
(4.6) verdund tot een verwachte concentratie aan oleandomycine van 0,1 µg/
ml (= U8). Vervolgensworden de concentratiesU4,U2en U1door verder
verdunnen (1 + 1) met oplossing (4.6) bereid.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.2) wordt met de entsuspensie (3.2) bij 60 ºC geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri)schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentratiesen de vier mons terconcentraties(S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten.
De plaatdiameter moet voldoende zijn om in de agarlaag ten minste acht
gaatjesvan 10 à 13 mm te kunnen maken. De hoeveelheid te gebruiken
voedingsbodem per plaat dient zo berekend te worden dat een overal
even dikke laag van 2 mm dikte verkregen wordt. Bij voorkeur dienen
alss chalen te worden gebruikt vlakke glazen platen met een volledig
vlakke ring van aluminium of kunststof van 200 mm diameter en 20 mm
hoogte.
In de gaatjesworden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt.
Voor ieder monster worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan
met iedere concentratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het
meten van 32 remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden ca. 18 h bij 28 — 30 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diametersvan de remzonesworden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentratiestegen de remzonediameters . Indien er bij de
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgensde volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
4.BEPALING VAN TYLOSINE
— door middel van agardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van tylosine in voeder-
middelen, voormengsels en concentraten. De ondergrens van de
bepaalbaarheid ligt bij 2 ppm.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 25
▼B
2.Principe
Het monster wordt behandeld met een tot 80 ºC verwarmd fosfaatbuffer pH
8, waarna methanol geëxtraheerd wordt. Na centrifugeren wordt het extract
verdund en de antibiotische werking ervan gemeten via de diffusie van het
tylosine in een met Sarcina lutea geëente agarvoedingsbodem. De diffusie
wordt zichtbaar gemaakt door de vorming van remzonesin aanwezigheid
van het micro-organisme. De diameter van deze remzones is rechtevenredig
met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Sarcina lutea ATCC nr. 9341
3.1Bewaren van de stam
Sarcina lutea wordt geënt in een buisje met schuingestolde agar-
voedingsbodem (4.1), echter op pH 7,0 gebracht. Na een nacht
bebroeden bij ca. 35 ºC wordt deze cultuur in de ijskast bewaard en
alle veertien dagen op dezelfde wijze overgeënt.
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestolde
agar bereid. Direct na het bebroeden wordt deze cultuur in 2 tot 3 ml
fysiologische zoutoplossing (4.4) opgenomen. Met deze suspensie wordt
een Roux-fles met 250 ml gestolde voedingsbodem (4.1), echter op pH
7,0 gebracht beënt en 24 uur bij 35 ºC bebroed. Vervolgenswordt de
cultuur opgenomen in 25 ml fysiologische zoutoplossing (4.4). Deze
suspensie wordt gehomogeniseerd en verdund tot een lichttransmissie
van ca. 75 % bij 650 nm verkregen wordt. Deze suspensie kan, mits in
de ijskast bewaard, gedurende een week gebruikt worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan het medium moet worden toege-
voegd om voor de toegepaste concentraties tylosine zo groot mogelijke,
maar nog scherpe remmingszones te verkrijgen. Het enten van de
voedingsbodem vindt bij 48-50 ºC plaats.
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de metingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 gGistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
Voor het bewaren van de vlam en het bereiden van de entsuspensie op
pH 7,0 brengen en voor de bepaling op pH 8,0 brengen.
4.2Fosfaatbuffer pH 8
Monokaliumfosfaat KH
2PO4p.a. 0,523 g
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 16,730 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3Fosfaatbuffer pH 7
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 5,5 g
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 13,6 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.4 Steriele fysiologische zoutoplossing.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 26
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
4.5 Methanol, chemisch zuiver.
4.6 Methanol 40 % (v/v).
4.6 Mengsel van fosfaatbuffer (4.2)/methanol, chemisch zuiver: 60/40 (vol.).
4.8 Standaard: tylosine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Na drogen van de standaard (4.8) (3 uur 60 ºC bij 5 mm kwik) wordt 10-
50 mg afgewogen en in een maarkolf opgelost in 5 ml methanol (4.5) waarna
aangevuld wordt met fosfaatbuffer pH 7 (4.3). Met deze buffer wordt verder
verdund tot een tylosine-basisconcentratie van 1000 µg/ml is verkregen.
Uitgaande van deze stamoplossing wordt een werkstandaardoplossing S8bereid door verdunnen met mengsel (4.7) tot een concentratie van 2 µg tylo-sinebase per ml is verkregen.
Door verdere verdunning (1 + 1) met mengsel (4.7) worden de volgende
concentratiesbereid:
S
41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extractie
Van de te onderzoeken concentraten wordt 10 g afgewogen, van voormeng-
sels en voeders 20 g. Van fosfaatbuffer pH 8 (4.2) wordt 60 ml tot 80 ºC
verwarmd en bij de afgewogen monsterhoeveelheid gevoegd, waarna geho-mogeniseerd wordt gedurende 2 minuten (huishoudmixer, Ultra-Turrax, enz.).
Na 10 minuten staan worden 40 ml methanol (4.5) toegevoegd en wordt nog
eens5 minuten gehomogenis eerd. Na centrifugeren wordt een aliquot deel
van de bovenstaande vloeistof met mengsel (4.7) verdund tot een verwachte
concentratie aan tylosine van 2 µg/ml (= U
8). Vervolgensworden de concen-
tratiesU4,U2en U1door verder verdunnen (1 + 1) met oplossing (4.7) bereid.
Bij gehalten beneden 10 ppm wordt het extract bij 35 ºC in een rotatiever-
damper drooggedampt en in 40 % methanol (4.6) opgenomen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) op pH 8,0 gebracht wordt met de entsuspensie
(3.2) bij 48-50 ºC geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri) schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentratiesen de vier mons terconcentraties(S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten. De plaatdiameter moet voldoende
zijn om in de agarlaag ten minste acht gaatjes van 10 à 13 mm te kunnen
maken De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem per plaat dient zo
berekend te worden dat een overal even dikke laag van 2 mm dikte
verkregen wordt. Bij voorkeur dienen alss chalen te worden gebruikt
vlakke glazen platen met een volledig vlakke ring van aluminium of
kunststof van 200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjesworden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt. Voor ieder monster
worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan met iedere concen-
tratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het meten van 32
remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden gedurende een nacht bij 35-37 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diametersvan de remzonesworden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentratiestegen de remzonediameters . Indien er bij de1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 27
▼B
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgensde volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
5.DOSAGE VAN VIRGINIAMYCINE
— Door middel van lagardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van virginiamycine in
voedermiddelen, voormengsels en concentraten. De ondergrens van de
bepaalbaarheid ligt bij 2 ppm.
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een oplossing van Tween 80 in
methanol. Na centrifugeren of filtreren, wordt het extract verdund en de anti-
biotische werking ervan gemeten via de diffusie van het virginiamycine in
een met Sarcina lutea geënte agarvoedingsbodem. De diffusie wordt zicht-
baar door de vorming van remzonesin aanwezigheid van het micro-
organisme. De diameter van deze remzones is rechtevenredig met de loga-
ritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Sarcina lutea ATCC nr. 9341
3.1Bewaren van de stam
Sarcina lutea wordt geënt in een buisje met schuingestolde agarvoedings-
bodem (4.1). Na een nacht bebroeden bij ca. 35 ºC wordt deze cultuur in
de ijskast bewaard en alle 14 dagen op dezelfde wijze overgeënt.
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestolde
agar bereid, en direct daarna in 3 ml fysiologische zoutoplossing (4.3)
opgenomen. Met deze suspensie wordt een Roux-fles beënt, die 250 ml
gestolde voedingsbodem (4.1) bevat. Na 24 uur bebroeden bij 35 ºC
wordt de cultuur opgenomen in 25 ml fysiologische zoutoplossing (4.3).
Deze suspensie wordt gehomogeniseerd en verdund tot een lichttrans-
missie van ca. 75 % die bij 650 nm verkregen wordt. Deze suspensie
kan, mits in de ijskast bewaard, gedurende een week gebruikt worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan het medium moet worden toege-
voegd om voor de toegepaste concentraties virginiamycine zo groot
mogelijke, maar nog scherpe remzones te verkrijgen. Het enten van de
voedingsbodem vindt bij 48-50 ºC plaats.
4.Voedingsbodems en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de metingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 28
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samentelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
Op pH 6,5 brengen, vlak vóór gebruik
4.2Fosfaatbuffer pH 6
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 8,0 g
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 2,0 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3 Steriele fysiologische zoutoplossing.
4.4 Methanol, chemisch zuiver.
4.5 Mengsel van fosfaatbuffer (4.2)/methanol chemisch zuiver: 80/20 (vol.).4.6 Methanolische oplossing van 0,5 % (g/v) Tween 80.
4.7 Standaard: Virginiamycine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Een hoeveelheid standaard (4.7) wordt in zoveel methanol opgelost, dat een
concentratie van 800 µg virginiamycine per ml wordt verkregen. Door verder
verdunnen van deze stamoplossing met mengsel (4.5) wordt een werkstan-
daardoplossing S
8van 1 µg virginiamycine per ml bereid. Vervolgens
worden, door 1 + 1 verdunnen met mengsel (4.5) de volgende concentraties
bereid:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Extractie
6.1Produkten met een virginiamycinegehalte beneden of gelijk aan 50 ppm
Na afwegen van 10 à 20 g van het monster worden 100 ml oplossing
(4.6) toegevoegd en 30 minuten geschud. Na filtreren of centrifugeren
worden 20 ml van de heldere vloeistof in een rotatieverdamper droogge-
dampt. Het residu wordt in 20 ml of meer van het mengsel (4.5)
opgelost, zodanig dat een verwachte concentratie aan virginiamycinevan 1 µg/ml wordt verkregen (= U
8). Door verder verdunnen (1 + 1)
met mengsel (4.5) worden de concentraties U4,U2en U1bereid.
6.2Produkten met een virginiamycinegehalte boven 50 ppm
Na afwegen van 1 à 10 g monster worden 100 ml van oplossing (4.6)
toegevoegd en 30 minuten geschud. Na filtreren of centrifugeren wordt
met mengsel (4.5) verdund tot een verwachte concentratie aan virginia-
mycine van 1 µg/ml (= U8). Vervolgensworden alsin (6.1) de
concentratiesU4,U2en U1bereid.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) wordt met de entsuspensie (3.2) bij 48 — 50 ºC
geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri)schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentratiesen de vier mons terconcentraties(S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten. De plaatdiameter moet voldoende
zijn om in de agarlaag ten minste acht gaatjes van 10 à 13 mm te kunnen
maken. De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem per plaat dient zo
berekend te worden dat een overal even dikke laag van 2 mm dikte
verkregen wordt. Bij voorkeur dienen alss chalen te worden gebruikt1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 29
▼B
vlakke glazen platen met een volledig vlakke ring van aluminium of
kunststof van 200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjesworden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt.
Voor ieder monster worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan
met iedere concentratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het
meten van 32 remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden gedurende ca. 18 h bij 28 — 30 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diametersvan de remzonesworden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentratiestegen de remzonediameters . Indien er bij de
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgensde volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.1972L0199 — NL — 05.05.1972 — 000.001 — 30