1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE
van 11 juli 1991
inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven en de desbetreffende analyse-
methoden
(PB L 248 van 5.9.1991, blz. 1)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Verordening (EEG) nr. 3682/91 van de Commissie van 17 december
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Verordening (EEG) nr. 1429/92 van de Commissie van 26 mei 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Verordening (EEG) Nr. 1683/92 van de Commissie van 29 juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Verordening (EEG) nr. 1996/92 van de Commissie van 15 juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Verordening (EEG) nr. 3288/92 van de Commissie van 12 november
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Verordening (EEG) nr. 183/93 van de Commissie van 29 januari 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 826/93 van de Commissie van 6
april 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Verordening (EEG) nr. 620/93 van de Commissie van 17 maart 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Verordening (EG) nr. 177/94 van de Commissie van 28 januari 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Verordening (EG) nr. 2632/94 van de Commissie van 28 oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Verordening (EG) Nr. 656/95 van de Commissie van 28 maart 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Verordening (EG) nr. 2527/95 van de Commissie van 27 oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
Gerectificeerd bij:
►C1Rectificatie PB L 176 van 20.7.1993, blz. 26 (183/93)
▼B
VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE
van 11 juli 1991
inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven
en de desbetreffende analysemethoden
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese EconomischeGemeenschap,
Gelet opVerordening nr. 136/66/EEG van de Raad van 22 sep tember
1966 houdende de totstandbrenging van een gemeenschappelijke orde-
ning der markten in de sector oliën en vetten(
1), laatstelijk gewijzigd
bij Verordening (EEG) nr. 3577/90(2), en met name opartikel 35 bis,
Overwegende dat in de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG de
benamingen en definities zijn vastgesteld van olijfoliën en oliën uitafvallen van olijven die in elke Lid-Staat, in het kader van het handels-verkeer tussen de Lid-Staten onderling en in de handel met derde
landen, worden verkocht;
Overwegende dat, onverminderd andere bestaande bepalingen ter zake,
ter onderscheiding van de verschillende soorten olie, de fysisch-chemi-sche kenmerken van elke soort en de organoleptische kenmerken vanbij de eerste persing verkregen oliën dienen te worden bepaald, zodatzuiverheid en kwaliteit van de betrokken produkten kunnen wordengewaarborgd;
Overwegende dat het dienstig is om de aanwezigheid van de
kenmerken van de verschillende soorten olie in de gehele Gemeen-
schapopuniforme wijze te bep alen; dat daartoe communautairemethoden voor chemische analyse en organoleptische beoordelingdienen te worden vastgesteld; dat evenwel tijdens een overgangsperiodehet gebruik van andere in de Lid-Staten toegepaste analysemethoden
moet worden toegestaan, met dien verstande dat in geval van uiteenlo-
pende resultaten de uitkomsten van de communautaire methodedoorslaggevend zijn;
Overwegende dat als gevolg van de bepaling van de fysisch-chemische
kenmerken van de olijfoliën en de omschrijving van de analyseme-thoden de aanvullende aantekeningen van hoofdstuk 15 van degecombineerde nomenclatuur aanpassing behoeven;
Overwegende dat in het kader van de methode voor de beoordeling van
de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen oliën
„panels” van geselecteerde en getrainde proevers dienen te wordengevormd; dat derhalve de nodige tijd moet worden gelaten om eendergelijke structuur tot stand te brengen; dat, gezien de moeilijkhedendie sommige Lid-Staten zullen hebben om proefpanels te vormen, dient
te worden toegestaan dat opin andere Lid-Staten reeds bestaande
proefpanels een beroep wordt gedaan;
Overwegende dat met het oog opde correcte werking van de regeling
inzake de heffingen opde invoer van afvallen van olijven, eenuniforme methode voor de bepaling van het oliegehalte van dieprodukten dient te worden vastgesteld;
Overwegende dat het, om de handel niet te schaden, dienstig is een
beperkte periode vast te stellen waarbinnen vóór de inwerkingtreding
van deze verordening verpakte olie nog mag worden afgezet;
Overwegende dat Verordening (EEG) nr. 1058/77 van de
Commissie(
3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1858/
88(4), bijgevolg dient te worden ingetrokken;1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 2
(1) PB nr. 172 van 30. 9. 1966, blz. 3025/66.
(2) PB nr. L 353 van 17. 12. 1990, blz. 23.
(3) PB nr. L 128 van 24. 5. 1977, blz. 6.
(4) PB nr. L 166 van 1. 7. 1988, blz. 10.
▼B
Overwegende dat het Comité van beheer voor oliën en vetten geen
advies heeft uitgebracht binnen de door zijn voorzitter bepaaldetermijn.
HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:
Artikel 1
1. Als „bij de eerste persing verkregen olijfoliën” in de zin van punt
1, onder a), b) en c), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEGworden aangemerkt de oliën waarvan de respectieve kenmerken over-eenkomen met die welke in bijlage I, punten 1, 2 en 3, vanonderhavige verordening zijn vermeld.
2. Als „bij de eerste persing verkregen olijfolie voor verlichting” in
de zin van punt 1, onder d), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomenmet die welke in bijlage I, punt 4, van de onderhavige verordening zijnvermeld.
3. Als „geraffineerde olijfolie” in de zin van punt 2 van de bijlage
bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan dekenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 5, van deonderhavige verordening zijn vermeld.
4. Als „olijfolie” in de zin van punt 3 van de bijlage bij Verordening
nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken over-eenkomen met die welke in bijlage I, punt 6, van de onderhavigeverordening zijn vermeld.
5. Als „ruwe olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 4 van
de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de oliewaarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt7, van de onderhavige verordening zijn vermeld.
6. Als „geraffineerde olie uit afvallen van olijven” in de zin van
punt 5 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aange-merkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke inbijlage I, punt 8, van de onderhavige verordening zijn vermeld.
7. Als olie uit afvallen van olijven in de zin van punt 6 van de
bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de oliewaarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt9, van de onderhavige verordening zijn vermeld.
Artikel 2
1. De in bijlage I vastgestelde kenmerken van de oliën worden aan
de hand van de volgende analysemethoden bepaald:
— voor de bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, uitgedrukt in
een percentage oliezuur, de in bijlage II beschreven methode;
— voor de bepaling van het peroxidegetal, de in bijlage III beschreven
methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen, de in
bijlage IV beschreven methode;
— voor de bepaling van de sterolsamenstelling, de in bijlage V
beschreven methode;
— voor de bepaling van het erythrodiol- en uvaolgehalte, de in bijlage
VI beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan verzadigde vetzuren op de 2-
positie van de triglyceriden, de in bijlage VII beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan trilinoleïne, de in bijlage VIII
beschreven methode;
— voor de spectrofotometrische analyse, de in bijlage IX beschreven
methode;
— voor de bepaling van de vetzuursamenstelling, de in de bijlagen
X.A en X.B beschreven methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmid-
delen, de in bijlage XI beschreven methode;1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 3
▼B
— voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de
eerste persing verkregen olijfolie, de in bijlage XII beschrevenmethode, toegepast overeenkomstig het bepaalde in lid 2;
— voor het bewijs van raffinage, de in bijlage XIII beschreven
methode;
— voor de bepaling van het gehalte aan stigmastadiënen, de in bijlage
XVII beschreven methode.
2.►
M3De analist, die zelf deskundig is ophet gebied van senso-
risch onderzoek of door deskundigen wordt bijgestaan, ◄de
organoleptische kenmerken volgens de procedure die in het in bijlageXII bedoelde beoordelingsformulier is beschreven. Indien de bij deanalyse geconstateerde organoleptische kenmerken verschillen van diewelke het produkt op grond van zijn benaming dient te hebben, laatde analist het monster overeenkomstig bijlage XII door een proefpanel
onderzoeken.
De tweede analyse wordt door het proefpanel overeenkomstig de in
bijlage XII genoemde voorschriften uitgevoerd.
Ingeval de organoleptische kenmerken in het kader van de toepassing
van de interventieregeling moeten worden beoordeeld, verricht hetproefpanel deze beoordeling overeenkomstig bijlage XII.
Artikel 3
Tot en met ►
M628 februari 1993 ◄mogen de Lid-Staten, onver-
minderd de invoering van de in artikel 2 bedoelde analysemethoden,andere beproefde en wetenschappelijk verantwoorde methodentoepassen, op voorwaarde dat daardoor het vrije verkeer van produktendie opgrondslag van de communautaire methoden als in overeenstem-ming met de voorschriften zijn erkend, niet wordt belemmerd. De
betrokken Lid-Staten delen bedoelde andere methoden, alvorens deze
toe te passen, aan de Commissie mede.
Ingeval de uitslag van een van deze andere methoden van die van de
gemeenschappelijke methode afwijkt, geldt de met de gemeenschappe-
lijke methode verkregen uitslag.
Artikel 3bis
In geval van verschil van mening over de organoleptische kenmerken
van bij een handelstransactie betrokken olie kunnen de betrokkenpartijen zich tot een door hen gekozen erkend panel van proeverswenden.
Artikel 3ter
Wanneer wordt geconstateerd dat de organoleptische kenmerken van
een bepaalde olie verschillen van die welke deze olie op grond vanhaar benaming zou moeten hebben, past de betrokken Lid-Staat, onver-
minderd de eventuele andere sancties, administratieve geldboetes toe,
waarvan de hoogte wordt bepaaldt op basis van de ernst van de gecon-stateerde onregelmatigheid.
Voor de beoordeling van de onregelmatigheid wordt met name reke-
ning gehouden met de natuurlijke ontwikkeling van de kenmerken van
olie die onder normale omstandigheden is bewaard.
De Lid-Staten brengen de Commissie aan het begin van ieder halfjaar
opde hoogte van het aantal en de aard van de geconstateerde onregel-matigheden alsmede van de in het voorafgaande hafljaar toegepaste
sancties.
Artikel 4
1. Voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken vormen
de Lid-Staten „panels” van proevers, die belast worden met de officiële1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 4
▼M11
▼B
▼M5
▼M5
controle van die kenmerken, en die moeten voldoen aan de volgende
voorwaarden:
— bestaan uit volgens de in bijlage XII beschreven methode geselec-
teerde en geoefende proevers;
— beschikken over de installaties en het materiaal dat nodig is voor
een organoleptische beoordeling volgens de bovengenoemde
methode;
— de in de bedoelde methode omschreven specifieke terminologie
voor het sensorisch onderzoek van olijfolie, profieltabel en beoorde-lingstabel gebruiken;
— zich ertoe verbinden de opcommunautair of internationaal vlak
toegepaste organoleptische beoordelingen uit te voeren bij perio-dieke controles en bijeenkomsten voor het harmoniseren van desensorische criteria;
— zich ertoe verbinden jaarlijks aan de Commissie alle inlichtingen te
doen toekomen over wijzigingen in de samenstelling van het panelen het aantal beoordelingen dat door het erkende panel is uitge-voerd.
Iedere Lid-Staat erkent de opzijn grondgebied gevormde p anels die
aan deze voorwaarden voldoen. Hij wijst de panels aan die met deherzieningsanalyses worden belast.
Panels die door de Lid-Staten vóór 1 november 1992 zijn ingesteld
volgens de regels van de in bijlage XII beschreven methode, wordenbeschouwd als erkend in de zin van dit artikel.
Iedere Lid-Staat doet zowel aan de Commissie als aan de andere Lid-
Staten de lijst van de erkende panels toekomen.
2. Ingeval een Lid-Staat opzijn grondgebied moeilijk een p anel van
proevers kan instellen, mag hij een beroep doen op een door een andere
Lid-Staat erkend panel.
3. Elke Lid-Staat stelt de lijst opvan de door beroep sorganisaties of
sectorale organisaties overeenkomstig de in lid 1 vermelde voor-
waarden ingestelde panels van proevers en ziet toe op de naleving vandeze voorwaarden.
Artikel 5
De aanvullende aantekeningen 2, 3 en 4 van hoofdstuk 15 van de
gecombineerde nomenclatuur in bijlage I bij Verordening (EEG) nr.2658/87 van de Raad(
1)worden vervangen door de aanvullende aante-
keningen in bijlage XIV bij de onderhavige verordening.
Artikel 6
1. Het oliegehalte van afvallen van olijven en van de andere bij de
winning van olijfolie verkregen afvallen (GN-codes 2306 90 11 en2306 90 19) wordt bepaald overeenkomstig de in bijlage XV opge-nomen methode.
2. Het in lid 1 bedoelde oliegehalte wordt uitgedrukt in gewichtsper-
centen berekend over de droge stof.
Artikel 7
Wat de aanwezigheid van andere ongewenste stoffen dan die bedoeld
in bijlage XI betreft, gelden de communautaire bepalingen.
Artikel 8
1. Elke Lid-Staat stelt de Commissie van de ter uitvoering van deze
verordening genomen maatregelen in kennis.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 5
(1) PB nr. L 256 van 7. 9. 1987, blz. 1.▼M6
▼B
▼B
2. Elke Lid-Staat legt de Commissie aan het begin van elk halfjaar
een verzamelstaat met de analyseresultaten van de in het voorgaandehalfjaar uitgevoerde bepalingen over.
Deze resultaten worden volgens de procedure van artikel 39 van Veror-
dening nr. 136/66/EEG door het Comité van beheer voor oliën envetten onderzocht.
Artikel 9
Verordening (EEG) nr. 1058/77 wordt hierbij ingetrokken.
Artikel 10
1. Deze verordening treedt in werking opde derde dag volgende op
die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese
Gemeenschappen .
De in bijlage XII beschreven methode wordt, behalve voor verrich-
tingen in het kader van de interventieregeling, met ingang van►
M11 november 1992 ◄toegepast.
Deze methode geldt niet voor olijfolie van de eerste persing die vóór 1
november 1992 is verpakt.
2. Deze verordening is niet van toepassing op olijfoliën en oliën uit
afvallen van olijven die vóór de datum van inwerkingtreding van dezeverordening zijn verpakt en tot en met 31 oktober 1992 wordenverkocht.
Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks
toepasselijk in elke Lid-Staat.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 6
▼M5
▼B
▼B
BIJLAGEN
Inhoudsopgave
Bijlage I: Kenmerken van olijfolie …
Bijlage II: Bepaling van de zuurgraad …
Bijlage III: Bepaling van het peroxidegetal …Bijlage IV: ►
M6Bepaling van het gehalte aan was met behulp van capil-
laire gaschromatografie ◄…
Bijlage V: Bepaling van de sterolsamenstelling en het sterolgehalte met
behulpvan cap illaire gaschromatografie …
Bijlage VI: Bepaling van het gehalte aan erythrodiol en uvaol …Bijlage VII: Bepaling van vetzuren op de 2-positie in triglyceriden van
oliën en vetten …
Bijlage VIII: Bepaling van het gehalte aan trilinoleïne …Bijlage IX: Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied …
Bijlage X.A: Gaschromatografische analyse van methylesters van vetzuren
…
Bijlage X.B: Bereiding van methylesters van vetzuren overeenkomstig
bijlage VI, punten I en II, van Verordening (EEG) nr. 72/77
of volgens de hieronder beschreven methode …
Bijlage XI: Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen
…
Bijlage XII: Organoleptische beoordeling van olijfolie van eerste persing …
Bijlage XIII: ►
M6Neutralisering en ontkleuring van olijfolie in het
laboratorium ◄…
Bijlage XIV: Aanvullende aantekeningen 2, 3 en 4 bij hoofdstuk 15 van de
gecombineerde nomenclatuur …
Bijlage XV: Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven …
Bijlage XVI: Bepaling van het joodgetal …
Bijlage XVII: Methode voor de bepaling van de stigmastadiënen in plantaar-
dige oliën ...1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 7
▼M11
BIJLAGEI
KENMERKEN VAN OLIJFOLIE
Categorie ZuurgraadPeroxide-
getal
meq O2/kgGehaloge-
neerde
oplosmid-
delen mg/
kg (1)Was mg/
kgVerza-
digde
vetzuren
2-positie
triglyce-
riden %Stigmasta-
diënen (2)
mg/kgErythro-
diol +
uvaol %Trilino-
leïne %Choles-
terol %Brassicas-
terol %Campes-
terol %Stigmas-
terol %Betasito-
sterol
%(3)Delta-7-
stigma
stenol %Totaal
sterolen
mg/kg
1. Extra olijfolie
verkregen bij de
eerste persing M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1000
2. Olijfolie
verkregen bij de
eerste persing M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1000
3. Courante olijfolie
verkregen bij de
eerste persing M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1000
4. Olijfolie voor
verlichting
verkregen bij de
eerste persing m 3,3 m 20 m 0,20 M 350 M 1,3 M 0,50 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1000
5. Geraffineerde olij-
folie M 0,5 M 5 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1000
6. Olijfolie M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1000
7. Olie uit afvallen
van olijven m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,7 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500
8. Geraffineerde olie
uit afvallen van
olijven M 0,5 M 5 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1800▼M111991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 8
Categorie ZuurgraadPeroxide-
getal
meq O2/kgGehaloge-
neerde
oplosmid-
delen mg/
kg (1)Was mg/
kgVerza-
digde
vetzuren
2-positie
triglyce-
riden %Stigmasta-
diënen (2)
mg/kgErythro-
diol +
uvaol %Trilino-
leïne %Choles-
terol %Brassicas-
terol %Campes-
terol %Stigmas-
terol %Betasito-
sterol
%(3)Delta-7-
stigma
stenol %Totaal
sterolen
mg/kg
9. Olie uit afvallen
van olijven M 1,5 M 15 M 0,20 >350 M 2,0 >4,5 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 <Campes-
terolm 93,0 M 0,5 m 1600
M = maximum, m = minimum.
(1) Totaal maximumgehalte voor bestanddelen die zijn aangetoond met een elektronenvangstdetector. Voor individueel aangetoonde bestanddelen is he t toegestane maximum 0,10 mg/kg.
(2) Totaal van de isomeren dat (al dan niet) kan worden gescheiden over een capillaire kolom.
(3) Delta-5,23-stigmastadiënol + chlerosterol + sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadiënol.
Opmerking
Wanneer de olijfolie niet aan een van de vereiste kenmerken voldoet, wordt deze olie ingedeeld in een lagere categorie.▼M111991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 9
CategorieZuurgraad
Totaal
transolie-
zuuriso-
merenTotaal
translinol-
zuur- en
translino-
leenzuuriso-
merenK232K270K270met
aluminium-
oxydeDelta-K Cijfer panelMristine-
zuur %Linoleen-
zuur %Arachide-
zuur %Eicosaan-
zuur %Beheen(Do-
cosaan-
)zuur %Lignocari-
nezuur %
1. Extra olijfolie
verkregen bij de
eerste persing M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,50 M 0,20 M 0,10 M 0,01 m 6,5
2. Olijfolie verkregen
bij de eerste persing M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 5,5
3. Courante olijfolie
verkregen bij de
eerste persing M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 3,5
4. Olijfolie voor
verlichting verkregen
bij de eerste persing M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,10 M 0,10 M 3,70 M 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Geraffineerde olij-
folie M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —
6. Olijfolie M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Olie uit afvallen van
olijven M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,20 M 0,10 —————
8. Geraffineerde olie uit
afvallen van olijven M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Olie uit afvallen van
olijven M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
M = maximum; m = minimum.
Opmerking
Voor de vaststelling van de zuiverheid, moet, als K270hoger is dan de limiet, K270na behandeling van de olie voor de betrokken categorie over een kolom geactiveerd aluminiumoxide opnieuw worden bepaald.▼M111991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 10
▼B
BIJLAGEII
BEPALING VAN DE ZUURGRAAD
1. DOEL
Bepaling van de vrije vetzuren in olijfolie. Het gehalte aan vrije vetzuren
wordt uitgedrukt in de volgens de klassieke methode berekende zuur-
graad.
1.1.Principe van de methode
Oplossing van het monster in een mengsel van oplosmiddelen, daarna
titrering van de aanwezige vrije vetzuren met behulpvan een op lossing
van kaliumhydroxide in ethanol.
1.2.Reagentia
Alle reagentia moeten p.a. zijn en het gebruikte water dient gedistilleerd
water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.
1.2.1. Diëthylether: 95 % ethanol (v/v), mengsel 1: 1 (v/v) in volume.
Waarschuwing: Diëthylether is zeer ontvlambaar en kan explosieve
peroxiden vormen. Bij gebruik ervan dienen bijzondere
voorzorgen te worden genomen.
Neutraliseer, precies op het ogenblik van gebruik, met de kaliumhydro-
xide-oplossing (1.2.2), in aanwezigheid van 0,3 ml phenolphtaleïne-
oplossing (1.2.3) voor 100 ml mengsel.
Opmerking: Indien gebruik van diëthylether onmogelijk is, kan een
mengsel van uit ethanol en tolueen bestaande oplosmiddelen
worden gebruikt. Zonodig kan ethanol worden vervangen
door propanol-2.
1.2.2. Kaliumhydroxide, in ethanol getitreerde oplossing, c(KOH), ongeveer
0,1 mol/l of, indien nodig, c(KOH) ongeveer 0,5 mol/l.
De precieze concentratie van de oplossing van kaliumhydroxide in
ethanol dient bekend te zijn en onmiddellijk voor gebruik te worden
geverifieerd. Gebruik een oplossing die minstens vijf dagen voor gebruik
is bereid en is gedecanteerd in een donkerbruine, met een rubberen stop
gesloten fles. De oplossing dient kleurloos of strogeel te zijn.
Opmerking: Een stabiele, kleurloze kaliumhydroxideoplossing kan op de
volgende wijze worden bereid. 1000 ml ethanol optemp era-
tuur en gedurende één uur koken, met reflux, met 8 g
kaliumhydroxide en 0,5 g aluminiumsnippers. Onmiddellijk
distilleren. In het distillaat de benodigde hoeveelheid
kaliumhydroxide oplossen. Verschillende dagen laten rusten
en de heldere supernotans van het kaliumcarbonaatneerslag
decanteren.
De oplossing kan ook zonder distillatie op de volgende wijze
worden bereid. Aan 1 000 ml ethanol 4 ml aluminiumbuty-
laat toevoegen en het mengsel enkele dagen laten staan.
Het supernotans decanteren en de benodigde hoeveelheid
kaliumhydroxide erin oplossen. De oplossing is klaar voor
gebruik.
1.2.3. Phenolphtaleïne, oplossing van 10 g/l in 95-96 % ethanol (v/v) of alka-
lisch blauw (in geval van sterk gekleurde vetten), oplossing van 20 g/l
in 95-96 % ethanol (v/v).
1.3.Apparatuur
Gebruikelijk laboratoriummateriaal, en met name:
1.3.1. Analytische balans.
1.3.2. Kolf van 250 ml.
1.3.3. Buret van 10 ml, met een schaalindeling van 0,05 ml.
1.4.Werkwijze
1.4.1. Bereiding van het te analyseren monster
De bepaling wordt uitgevoerd op een gefiltreerd monster.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 11
▼B
Wanneer de som van vochtgehalte en gehalte aan onzuiverheden kleiner
is dan 1 %, wordt de bepaling uitgevoerd op het monster als zodanig.
1.4.2. Monsterneming
Houd bij het nemen van het monster rekening met het verwachte zuur-
getal volgens de gegevens van de volgende tabel.
Verwacht zuurgetalHoeveelheid af te wegen
monster
(g)Nauwkeurigheid van de
weging van het monster
(g)
< 1 20 0,05
1 tot 4 10 0,024 tot 15 2,5 0,01
15 tot 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Weeg het monster in de kolf (1.3.2).
1.4.3 Bepaling
Los het monster (1.4.2) opin 50 tot 150 ml van het mengsel diëthylether/
ethanol (1.2.1) dat tevoren is geneutraliseerd.
Titreer, al schuddend, met de oplossing 0,1 mol/l kaliumhydroxide (1.2.2)
(zie opmerking 3) tot omslag van de indicator (rose kleuring van de
phenophtaleïne die ten minste 10 seconden aanhoudt).
Opmerking1: De getitreerde kaliumhydroxideoplossing in ethanol (1.2.2)
kan worden vervangen door een oplossing in water van
kalium- of natriumhydroxide wanneer het erin gebrachte
volume water niet tot een fasescheiding leidt.
Opmerking2: Als de nodige hoeveelheid 0,1 mol/l kaliumhydroxideop-
lossing 10 ml overschrijdt, gebruik dan een oplossing van
0,5 mol/l.
Opmerking3: Als de oplossing troebel wordt tijdens de titrering, voeg
dan een hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen
(1.2.1) toe tot de oplossing helder wordt.
1.5Formulering in zuurgraad in percentage oliezuur
De zuurgraad, uitgedrukt in gewichtspercentage, is gelijk aan:
V/C1c/C1M
1000/C1100
m¼V/C1c/C1M
10/C1m
waarin:
V = het volume in ml van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxide-
oplossing;
c = de precieze concentratie, in mol/l van de gebruikte, getitreerde
kaliumhydroxideoplossing;
M = het molaire gewicht, in grammen per mol, van het zuur dat voor
de weergave van de resultaten is gekozen (= 282);
m = de hoeveelheid af te wegen monster in gram.
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde ►M6van twee
bepalingen ◄.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 12
▼B
BIJLAGEIII
BEPALING VAN HET PEROXIDEGETAL
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het peroxidegetal
van oliën en vetten.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor dierlijke en plantaardige oliën en vetten.
3. DEFINITIE
Het peroxidegetal is de hoeveelheid stoffen in het monster, uitgedrukt in
milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, die kaliumjodide oxideren
bij de beschreven werkomstandigheden.
4. PRINCIPE VAN DE METHODE
Het in een mengsel van azijnzuur en chloroform opgeloste vet wordt
behandeld met kaliumjodide en het vrijgemaakte jodide wordt getitreerd
met natriumthiosulfaatoplossing.
5. APPARATUUR
Alle gebruikte apparatuur dient vrij te zijn van reducerende of oxiderende
stoffen.
Opmerking: Geslepen oppervlakten niet invetten.
5.1. 3 ml glazen weegschuitje.5.2. Kolven met geslepen halzen en stoppen, van ongeveer 250 ml, vooraf
gedroogd en gevuld met een zuiver, droog inert gas (stikstof of, bij voor-
keur, koolstofdioxide).
5.3. Buret van 25 of 50 ml, met een schaalindeling van 0,1 ml.
6. REAGENTIA
6.1. Chloroform, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen
met een stroom zuiver, droog inert gas.
6.2. IJsazijn, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met
een stroom zuiver, droog gas.
6.3. Kaliumjodide, verzadigde oplossing in water, vlak vóór gebruik bereid, vrij
van jodium of jodaat.
6.4. Natriumthiosulfaat, 0,01 of 0,002 N nauwkeurig gestelde oplossing in
water, onmiddellijk vóór gebruik gesteld.
6.5. Zetmeeloplossing, 10 g/l oplossing in water, vers bereid uit natuurlijk
oplosbaar zetmeel.
7. MONSTER
Zorg ervoor dat het monster niet in de nabijheid van licht wordt genomen,
dat het in het donker wordt bewaard en vervolgens koud wordt opgeslagen
in volledig gevulde glazen recipiënten, hermetisch afgesloten met stoppen
van geslepen glas of kurk.
8. WERKWIJZE
De proef dient in diffuus daglicht of bij kunstlicht te worden uitgevoerd.
Weeg in een glazen weegschuitje (5.1), of bij gebrek daaraan in een kolf
(5.2), tot op0,001 g nauwkeurig, een hoeveelheid van het monster volgens
de volgende tabel, afhankelijk van het verwachte peroxidegetal.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 13
▼B
Verwacht peroxidegetal
(meq O2/kg)Hoeveelheid van het monster
(g)
0 tot 12 5,0 tot 2,0
12 tot 20 2,0 tot 1,220 tot 30 1,2 tot 0,830 tot 50 0,8 tot 0,5
50 tot 90 0,5 tot 0,3
Ontstopeen kolf (5.2) en breng er het glazen weegschuitje in dat het
monster bevat. Voeg 10 ml chloroform toe (6.1). Los het monster snel op
door roeren. Voeg 15 ml azijnzuur (6.2) toe, daarna 1 ml kaliumjodideop-
lossing (6.3). Sluit snel af met de stop, schud gedurende één minuut en laat
precies vijf minuten in het donker staan bij een temperatuur van 15 tot
25 ºC.
Voeg ongeveer 75 ml gedistilleerd water toe. Titreer, krachtig schuddend,
het vrijgekomen jodium met de natriumthiosulfaatoplossing (6.4) (0,002 N
oplossing voor verwachte waarden van minder dan 12 en 0,01 N oplossing
voor verwachte waarden boven 12), met gebruik van de zetmeeloplossing
(6.5) als indicator.
Voer twee bepalingen uit op hetzelfde proefmonster.
Voer terzelfder tijd een blanco bepaling uit. Indien het resultaat van de
blanco bepaling meer bedraagt dan 0,05 ml van de 0,01 N natriumthiosul-
faatoplossing (6.4), vervang dan de onzuivere reagentia.
9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het peroxidegetal, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per
kilogram, wordt weergegeven met de formule:
P:V:¼
V/C1T/C11000
m
waarin:
V = de gebruikte hoeveelheid gestelde natriumthiosulfaatoplossing (6.4)
in millimeter, gecorrigeerd om rekening te houden met de blanco
bepaling;
T = de precieze normaliteit van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing
(6.4);
m = het gewicht van het monster, in gram.
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee uitgevoerde
bepalingen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 14
▼M6
BIJLAGEIV
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN WAS MET BEHULP VAN
CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het
gehalte aan was van enkele oliën en vetten onder de beschreven
omstandigheden.
De methode kan vooral worden toegepast om geperste olijfolie te
onderscheiden van geëxtraheerde olijfolie (uit persafvallen van olijven).
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De olie of het vet, waaraan een geschikte interne standaard is toege-
voegd, wordt gefractioneerd met behulpvan een gehydrateerde
kiezelgel-kolom. De met deze methode eerst geëlueerde fractie (met
een lagere polariteit dan de triglyceriden) wordt opgevangen en vervol-
gens direct geanalyseerd met capillaire gaschromatografie.
3. APPARATUUR
3.1. Erlenmeyer van 25 ml.
3.2. Glazen chromatografiekolom met een interne diameter van 15,0 mm en
een lengte van 30-40 cm.
3.3. Geschikte gaschromatograaf met een capillaire kolom, voorzien van een
on-column injectiesysteem bestaande uit:
3.3.1. Een gethermostateerde oven waarmee de kolommen opde gewenste
temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ±
1 ºC.
3.3.2. Een injector voor koude directe on-column injectie.3.3.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker/verzwakkereenheid.3.3.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker/
verzwakkereenheid (3.3.3) met een responstijd van niet meer dan één
seconde en met een variabele papiersnelheid.
3.3.5. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 10-15 m,
inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52 of SE-
54 vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30
µm.
3.4. Een on-column 10 µl injectiespuit met geharde naald.
4. REAGENTIA
4.1. Kiezelgel 70/230 mesh, Merck artikel 7754.
Zet de kiezelgel in een moffeloven gedurende 4 uur bij 500 ºC. Laat
afkoelen en voeg 2 % water toe. Schud krachtig om de massa te homo-
geniseren. Bewaar in het donker gedurende tenminste 12 uur alvorens
dit te gebruiken.
4.2. n-Hexaan, voor chromatografische doeleinden.4.3. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.4.4. n-Heptaan, voor chromatografische doeleinden.4.5. Standaardoplossing van lauryl-arachidaat, 0,1 % (m/v) oplossing in
hexaan (interne standaard).
4.6. Draaggas: waterstof, gaschromatografisch zuiver.4.7. Hulpgassen:
— waterstof, gaschromatografisch zuiver;
— lucht, gaschromatografisch zuiver.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 15
▼M6
5. WERKWIJZE
5.1. Scheiding van de wasfractie.
5.1.1. Bereiding van de chromatografiekolom.
Suspendeer 15 g 2 % gehydrateerde kiezelgel in n-hexaan watervrij en
breng dit in de kolom.
Laat uitzakken en vibreer de kolom met een elektrische vibrator om het
chromatografiebed meer homogeen te maken. Leid 30 ml n-hexaan
door om onzuiverheden te verwijderen.
5.1.2. Werkwijze met de chromatografiekolom.
Weeg nauwkeurig ongeveer 500 mg monster af in de de erlenmeyer van
25 ml, voeg een hoeveelheid interne standaard toe die overeenkomt met
het verwachte gehalte aan was. Bijvoorbeeld: voeg 0,1 mg lauryl-
arachidaat toe indien het gaat om olijfolie en 0,25-0,50 mg indien het
gaat om geëxtraheerde olijfolie.
Breng het aldus bereide monster over in de volgens 5.1.1 behandelde
chromatografiekolom, voeg dan achter elkaar 2 porties van elk 2 ml n-
hexaan toe.
Laat dit door de kolom lopen tot boven de absorbens een laag vloeistof
van 1 mm resteert. Voer dan de chromatografische elutie uit met 140
ml van een mengsel van n-hexaan/ethylether, 99:1, met een elutiesnel-
heid van ongeveer 15 druppels per 10 seconden (2,1 ml/minuut).
Dampde aldus verkregen fractie in een rotatievacuümverdamp er in tot
bijna droog, verwijder de laatste 2 of 3 ml met een zachte stikstof-
stroom en neem het residu opin 10 ml n-hep taan.
5.2. Gaschromatografische analyse
5.2.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom.
5.2.1.1. Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt
aangesloten aan het on-column systeem en het uiteinde aan de detector.
Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografisch systeem
(lekken in de gasvoorziening, efficiëntie van de detector en de
recorder).
5.2.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij gecondi-
tioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet
de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een
temperatuur van ten minste 20 ºC boven de bij de analyse gebruikelijke
temperatuur (Opmerking). Houd deze temperatuur aan gedurende
tenminste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling
van de gassnelheid, ontsteking van de vlam, aansluiting van de elektro-
nische recorder, temperatuurregeling van de kolomruimte en de
detector, enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die
tenminste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basis-
lijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen.
Een rechtlijnig negatief verloopvormt een indicatie voor lekkage bij de
kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoend uitge-
voerde conditionering van de kolom.
Opmerking: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten
minste 20 ºC lager zijn dan de maximumtemperatuur dievoor de gebruikte eluens is aangegeven.
5.2.2. Keuze van de werkomstandigheden.5.2.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende voor-
waarden dienen:
— kolomtemperatuur: start op 80 ºC, opwarmen met 30 ºC/minuut tot
120 ºC, daarna met 5 ºC/minuut tot 340 ºC;
— detectortemperatuur: 350 ºC;— lineaire snelheid van het draaggas: waterstof 20-35 cm/s;
— gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking;
— gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag;— papiersnelheid: 30 cm/uur;— injectiehoeveelheid: 0,5-1 µl oplossing.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 16
▼M6
Deze voorwaarden kunnen afhankelijk van de karakteristieken van de
kolom en van de gaschromatograaf worden gewijzigd zodanig dat chro-
matogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de retentietijd van de C32 interne standaard moet ongeveer 25 ± 2
minuten zijn;
— de meest representatieve piek van de was moet tussen 60 en 100 %
van de volle schaaluitslag zijn.
5.2.2.2. De piekintegratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een
juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen.
5.2.3. Uitvoering van de analyse
5.2.3.1. Zuig met de 10 µl injectiespuit 1 µl oplossing op. Trek de plunjer van
de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het
membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden,
verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald.
5.2.3.2. Neem het chromatogram optot al de p ieken van de was volledig zijn
geëlueerd.
De basislijn moet steeds aan de vereiste voorwaarden voldoen (5.2.1.2).
5.2.4. Identificatie van de pieken
Identificeer de verschillende pieken op basis van de retentietijden en
door vergelijking met wasmengsels met een bekende retentietijd, die
onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.
In figuur 1 wordt een chromatogram getoond van wassen in een koud
geperste olijfolie.
5.2.5. Kwantitatieve evaluatie5.2.5.1. Bereken met de integrator de piekoppervlakten van de interne standaard
en de C40-C46 alifatische esters.
5.2.5.2. Bereken de wasconcentratie van elke individuele ester in mg/kg vethou-
dend materiaal als volgt:
ester (mg/kg) =A
··ms·►M91 000◄
As·m
waarin:
Ax= piekoppervlak van de ester;
As= piekoppervlak van lauryl-arachidaat;
ms= massa van het toegevoegde lauryl-arachidaat, in milligram;
m = massa van het onderzochte monster, in gram.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Geef de gehaltes van de verschillende wassen en tevens het totaal opin
mg/kg vethoudend materiaal.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 17
▼M6
AANHANGSEL
Bepalingvandelineairesnelheid vanhetdraaggas
Injecteer 1-3 µl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden
werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door
de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek
(tm).
De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tm, waarbij
L de lengte van de kolom in centimeters en tm de gemeten tijd in seconden is.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 18
▼M61991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 19
▼B
BIJLAGEV
BEPALING VAN DE STEROLSAMENSTELLING EN HET STEROLGE-
HALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL
Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het indi-
viduele en totale sterolgehalte van vetstoffen.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De vetstof, waaraan α-cholestanol als interne standaard is toegevoegd,
wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het
onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met ethylether.
De sterolfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden met
behulpvan basische kiezelgel dunne-laagchromatografie. De van de
dunne-laagplaat verzamelde sterolen worden omgezet in trimethylsilyle-
thers en via capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald.
3. APPARATUUR
3.1. Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.3.2. Scheitrechters van 500 ml.3.3. Kolven van 250 ml.3.4. Volledige uitrusting voor dunne-laagchromatografie met 20 × 20 cm
glasplaten.
3.5. Ultravioletlampmet een golflengte van 366 of 254 nm.3.6. Injectiespuiten van 100 µl en 500 µl.3.7. Filterkroes G 3 (poreusiteit 15—40 µm) met een diameter van ongeveer
2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te
filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.
3.8. Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21, waarmee deze
opde filterkroes kan worden aangesloten.
3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom,
voorzien van een splitsysteem bestaande uit:
3.10.1. Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen opde gewenste
temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van
± 1 ºC.
3.10.2. Een temperatuurgeregelde verdampingseenheid met een gepersilani-
seerd glazen verdampingselement.
3.10.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid,
3.10.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/
verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één
seconde en met een variabele papiersnelheid.
3.11. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van
20—30 m, inwendige diameter 0,25—0,32 mm, inwendig gecoat met
SE-52- of SE-54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen
0,10 en 0,30 µm.
3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 µl met een geharde naald.
4. REAGENTIA
4.1. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g
kaliumhydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling opin 200 ml
gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol. Bewaar de oplos-
sing in goed afgesloten flessen van donker glas.
4.2. Ethylether, p.a.4.3. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.
4.4. Glazen dunne-laagplaten gecoat met kiezelgel zonder fluorescentie-indi-
cator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel
te verkrijgen).1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 20
▼B
4.5. Kaliumhydroxideoplossing, 0,2 M in Methanol. Los 13 g kaliumhydro-
xide opin 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol aan tot 1 liter.
4.6. Benzeen, voor chromatografische doeleinden.
4.7. Aceton, voor chromatografische doeleinden.
4.8. Hexaan, voor chromatografische doeleinden.
4.9. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.
4.10. Chloroform, p.a.
4.11. Dunnelaagchromatografische referentieoplossing: cholesterol of fyto-
sterol,►M62%◄oplossing in chloroform.
4.12. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing
moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele drup-
pels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing.
4.13. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.
4.14. Hexamethyldisilazaan.
4.15. Trimethylchloorsilaan.
4.16. Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de sterolen. Direct
vóór gebruik te bereiden uit de zuivere sterolen of uit het mengsel van
sterolen verkregen uit de oliën die deze sterolen bevatten.
4.17. α-cholestanol, 0,2 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).
4.18. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.
4.19. Hulpgassen:
— waterstof, gaschromatografisch zuiver,
— lucht, gaschromatografisch zuiver.
5. WERKWIJZE
5.1. Bereiding van het onverzeepbare residu.
5.1.1. Breng in de kolf van 250 ml met behulpvan de injectiesp uit van 500 µl
een hoeveelheid 0,2 % α-cholestanoloplossing in chloroform (4.17) die
overeenkomt met ongeveer 10 % van de sterolfractie van het te onder-
zoeken monster. Bij voorbeeld: voeg voor 5 g monster 500 µl 0,2 % α-
cholestanoloplossing toe indien het gaat om olijfolie en 1 500 µl indien
het gaat om ►M6 ◄olie uit afvallen van olijven.
Dampmet behulpvan een stikstofstroom droog en weeg vervolgens in
dezelfde kolf nauwkeurig 5 g van het gedroogde gefiltreerde monster
af.
►M6Oliën◄die een aanmerkelijke hoeveelheid cholesterol
bevatten, kunnen een piek vertonen met dezelfde retentietijd als choles-
tanol. Is dit het geval dan moet de sterolfractie tevens zonder interne
standaard worden geanalyseerd ►M6of moet in plaats van cholestanol
betulinol worden gebruikt ◄.
5.1.2. Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig
de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken opeen waterbad onder
voortdurend krachtig schudden tot de verzeping heeft plaatsgevonden
(de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg
dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler,
verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 ºC.
5.1.3. Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml schei-
trechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met
gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml
ethylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en laatuitzakken (zie opmerking 1).
Tapde waterige onderlaag af en vang deze opin een tweede schei-
trechter. Herhaal de extractie van de waterlaag twee keer opdezelfde
manier en gebruik hierbij telkens 60—70 ml ethylether.
Opmerking1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met
een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylal-
cohol toe te voegen.
5.1.4. Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens
50 ml gedistilleerd water tot het waswater neutraal reageert.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 21
▼B
Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer
over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf,
was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden ethylether.
5.1.5. Distilleer de ether tot openkele ml af, droog door toep assing van een
kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in
een oven bij 100 ºC gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in
een exsiccator en weeg.
5.2. Scheiding van de sterolfractie.5.2.1. Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedu-
rende 10 seconden volledig in de 0,2 M ethanolische
kaliumhydroxideoplossing, laat de platen gedurende 2 uur in een zuur-
kast drogen en plaats ze ten slotte gedurende 1 uur in een stoof bij
100 ºC.
Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van
gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de opdeze
manier bereide platen moeten binnen 2 weken worden gebruikt).
Opmerking2: Bij gebruik van basische-kiezelgelplaten voor de schei-
ding van de sterolfractie is de behandeling van het
onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig.
Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren
en andere) vastgehouden opde startlijn en is de sterol-
band duidelijk gescheiden van de band van de
alifatische- en triterpeenalcoholen.
5.2.2. Breng in de ontwikkeltank een mengsel van benzeen/aceton, 95: 5 (v/
v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Als alternatief kan een mengsel
van hexaan/ethylether, 65: 35 (v/v), worden gebruikt. Sluit de tank af
met een geschikt deksel en laat hem gedurende ongeveer een half uur
staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken
filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant
van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd
met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en
regelmatige elutie van de componenten.
Opmerking3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden
ververst om volkomen reproduceerbare elutie-condities
te verwezenlijken.
5.2.3. Bereid een ongeveer 5 % oplossing van het onverzeepbare residu
(5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulpvan de 100 µl injec-
tiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische
plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk
moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens
2—3 µl aan van de sterol-referentieoplossing (4.11) zodat de sterolband
na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd.
5.2.4. Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De
omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 ºC en 20 ºC. Sluit de
tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront
tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen.
Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in
een hete luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuur-
kast te zetten.
5.2.5. Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneop-
lossing. De sterolband kan door bekijken onder ultraviolet licht
worden geïdentificeerd aangezien deze opdezelfde hoogte ligt als de
vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen van de band aan
de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood.
5.2.6. Schraapmet een metalen sp atel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied
af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filter-
kroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de
metalen spatel en filtreer onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de
afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes.
Was het residu in de filterkroes drie maal met ethylether (telkens onge-
veer 10 ml), vang het filtraat opin dezelfde kolf. Damphet filtraat in
tot een volume van 4—5 ml, breng de resterende oplossing over in de
van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), dampdroog door
voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele
druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende onge-
veer 10 minuten in een oven bij 105 ºC, laat afkoelen in een exsiccator
en weeg.
Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal is de sterolfractie.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 22
▼B
5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers.
5.3.1. Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige sterolfractie een hoeveel-
heid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/
hexamethydisilazaan/trimethylchloorsilaan 9: 3: 1 (v/v/v) (zie opmer-
king 4), waarbij voor elke mg sterol 50 µl wordt toegevoegd. Vermijd
hierbij bevochtiging (zie opmerking 5).
Opmerking4: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijg-
baar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar,
zoals bij voorbeeld bistrimethylsilyltrifluoaceetamide
+ 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden
verdund met een gelijk volume watervrije pyridine.
5.3.2. Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te
draaien) tot de sterolen volledig zijn opgelost. Laat ten minste 15
minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten.
De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse.
Opmerking5: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden
gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De
vorming van witte vlokken of de verschijning van een
roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van
vocht of van veroudering van het reagens. In deze
gevallen moet opnieuw worden begonnen.
5.4. Gaschromatografische analyse.5.4.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom.
5.4.1.1. Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt
aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector.
Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische
systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie
van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.).
5.4.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij gecondi-
tioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet
de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een
temperatuur van ten minste 20 ºC boven de bij de analyse gebruikelijke
temperatuur (zie opmerking 6). Houd deze temperatuur aan gedurende
ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling
van de gassnelheid en het splitsysteem, ontsteking van de vlam, aanslui-
ting van de elektronische recorder, regeling van de temperatuur van de
kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het signaal
met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruike-
lijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en
mag niet verlopen.
Een rechtlijnig negatief verloopvormt een indicatie voor lekkage bij de
kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende
uitgevoerde conditionering van de kolom.
Opmerking6: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten
minste 20 ºC lager zijn dan de maximumtemperatuur
die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven.
5.4.2. Keuze van de werkomstandigheden.5.4.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden
dienen:
— kolomtemperatuur: 260 ºC ± 5 ºC;
— injectietemperatuur: 280 ºC;— detectortemperatuur: 290 ºC;
— lineaire snelheid van het draaggas: helium 20—35 cm/s, waterstof
30—50 cm/s;
— splitverhouding: van 1: 50 tot 1: 100;
— gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking;
— gevoeligheid van de recorder: 1—2 mV volle schaaluitslag;— papiersnelheid: 30—60 cm/uur;
— injectiehoeveelheid: 0,5—1 µl TMSE-oplossing.
Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de
kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chroma-
togrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de retentietijd van β-sitosterol moet ongeveer 20 ± 5 minuten zijn;1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 23
▼B
— de campesterolpiek moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie
(gemiddeld gehalte 3 %) 15 ± 5 % volle schaaluitslag, voor sojaolie
(gemiddelde gehalte 20 %) 80 ± 10 % volle schaaluitslag;
— alle aanwezige sterolpieken moeten gescheiden zijn. Daarnaast
moeten andere pieken voldoende gescheiden zijn, dat wil zeggen
dat het signaal tussen pieken volledig naar de basislijn moet terug-
keren. Onvolledige scheiding kan echter getolereerd worden mits de
piek met een relatieve retentietijd van 1,02 met behulp van een
loodlijn kan worden gekwantificeerd.
5.4.3. Bepaling.
5.4.3.1. Zuig in de 10 µl injectiespuit 1 µl hexaan, o,5 µl lucht en ten slotte
0,5—1,0 µl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit
dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de
injectie-eenheid en injecteer snel na 1—2 seconden, verwijder daarna
voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald.
5.4.3.2. Neem het chromatogram optot alle aanwezige TMSE-sterolen volledig
zijn geëlueerd.
De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste kwalificaties (5.4.1.2).
5.4.4. Identificatie van de pieken.
Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door
een vergelijking met mengsels van TMSE-sterolen die onder dezelfde
omstandigheden zijn geanalyseerd.
De sterolen worden geëlueerd in de volgorde: cholesterol, brassicas-
terol, 24-methyleencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol,
∆7-campesterol, ∆5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sito-
stanol, ∆5-avanesterol, ∆5,24-stigmastadienol, ∆7-stigmastenol, ∆7-
avenasterol.
In tabel I worden de relatieve retentietijden ten oprichte van sitosterol
opgegeven voor SE 52- en SE 54-kolommen.
In de figuren 1 en 2 worden typische chromatogrammen getoond voor
enkele oliën.
5.4.5. Berekening.
5.4.5.1. Bereken met de integrator de oppervlakten van de α-cholestanol en de
sterolpieken. Houd geen rekening met pieken van stoffen die niet op de
lijst van tabel I voorkomen. De responsfactor van α-cholestanol wordt
op1 gesteld.
5.4.5.2. Bereken de concentratie van elk individueel sterol in mg/100 g vethou-
dend materiaal als volgt:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
waarin:
Ax= piekoppervlak van sterol x, in integratoreenheden;
As= piekoppervlak van α-cholestanol, in integratoreenheden;
ms= hoeveelheid van het toegevoegde α-cholestanol, in milligram;
m = hoeveelheid van het onderzochte monster, in gram.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
6.1. Geef de gehaltes van de individuele sterolen opin mg/100 g vethou-
dend materiaal en hun som als „totaal sterolen”.
6.2. Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de
verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som
van de piekoppervlakken van de sterolen:
% van sterol x =Ax· 100
ΣA
waarin:
Ax= piekoppervlak van sterol x;
ΣA = som van de piekoppervlakken van alle sterolen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 24
▼B
AANHANGSEL
Bepaling vandelineairesnelheid vanhetdraaggas
Injecteer 1—3 µl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden
werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door
de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek
(tM).
De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij
L de lengte is van de kolom in centimeters en tMde gemeten tijd in seconden.
Tabel I
Relatieve retentietijden voor de sterolen
Pi-
ekIdentificatieRelatieve retentietijd
SE
54-kolomSE
52-kolom
1 cholesterol ∆5-cholesteen-3 β-ol 0,67 0,63
2 cholestanol 5 α-cholestaan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-methyl- ∆5,22-cholestadieen-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-methyleen-cholesterol 24-methyleen- ∆5,24-cholestadieen-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-methyl- ∆5-cholesteen-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestaan-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24S]-24-ethyl- ∆5,22-cholestadieen-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-methyl- ∆7-cholesteen-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl- ∆5,23-cholestadieen-3 β-ol 0,95 0,95
10 chlerosterol [24S]-24-ethyl- ∆5,25-cholestadieen-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl- ∆5-cholesteen-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-ethyl-cholestaan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-ethylideen-5-cholesteen-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆5,24-stigmastadienol [24S,R]-24-ethyl- ∆5,24-cholestadieen-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl- ∆7,24-cholesteen-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-ethylideen- ∆7-cholesteen-3 β-ol 1,16 1,16
De capillaire gaschromatografische bepaling van erythrodiol en uvaol, welke
dezelfde sterolanalyse gebruikt, wordt momenteel door de NGD gepubliceerd.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 25
▼B
Figuur 1
Gaschromatogramvandesterolfractie ineenongeraffineerde olijfolie
1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 26
▼B
Figuur 2
Gaschromatogramvandesterolfractie ineengeraffineerde olijfolie
1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 27
▼B
BIJLAGEVI
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ERYTHRODIOL EN UVAOL
OPMERKING VOORAF
Erythrodiol (onder deze term verstaat men gewoonlijk het geheel van
diolen, erythrodiol en uvaol samen) is een bestanddeel van het onverzeep-
bare residu, en is kenmerkend voor bepaalde vetstoffen. De concentratie
ervan is beduidend hoger in olijfolie vervaardigd door extractie dan in de
andere soorten olie waarin het voorkomt (koudgeperste olijfolie, druive-
pittenolie), en daarom kan door bepaling ervan de aanwezigheid van
door extractie verkregen olijfolie worden aangetoond.
1. DOEL
De methode beschrijft de werkwijze voor de bepaling van erythrodiol in
vetstoffen.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De vetstof wordt verzeept met een ethanolische kaliumhydroxideoplos-
sing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met
diëthylether en wordt gezuiverd door passage over een kolom met alumi-
niumoxide.
Het onverzeepbare residu wordt gefractioneerd met behulp van kiezelgel
dunne-laagchromatografie en de band van de sterolfractie en die van de
erythrodiolfractie worden afgezonderd. De van de dunne-laagplaat verza-
melde sterolen en erythrodiol worden omgezet in trimethylsilylethers en
het mengsel wordt via gaschromatografie kwantitatief bepaald. Het resul-
taat wordt uitgedrukt als percentage van erythrodiol in de totale
hoeveelheid erythrodiol en sterolen.
3. APPARATUUR
3.1. Dezelfde apparatuur als die welke is beschreven in bijlage V (bepaling
van de sterolfractie).
4. REAGENTIA
4.1. Dezelfde reagentia als die welke zijn beschreven in bijlage V (bepaling
van de sterolfractie).
4.2. Referentieoplossing van erythrodiol 0,5 % in chloroform.
5. WERKWIJZE5.1.Bereiding van het onverzeepbare residu
Men gaat te werk zoals beschreven in paragraaf 5.1.2 van bijlage V.
5.2.Scheiding van de erythrodiol- en de sterolfractie.
5.2.1. Zie paragraaf 5.2.1 van methode C-51.5.2.2. Zie paragraaf 5.2.2 van vorengenoemde methode.
5.2.3. Bereid een 5 % oplossing van het onverzeepbare residu in chloroform.
Breng van deze oplossing met behulp van de 0,1 ml injectiespuit 0,3 ml
aan opongeveer 1,5 cm van de benedenrand van de chromatografische
plaat in een vloeiende lijn die zo dun en uniform mogelijk moet zijn.
Breng aan één kant van de plaat tevens enkele microliter van de choles-
terol- en erythrodioloplossingen aan als referentie.
5.2.4. Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De
omgevingstemperatuur dient ongeveer 20 ºC te bedragen. Sluit de tank
onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot
ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de
plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete lucht-
stroom.
5.2.5. Besproei de plaat uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. Door
bekijken onder ultraviolet licht kunnen de sterolband en de erythrodio-
lband worden geïdentificeerd aangezien deze opdezelfde hoogte liggen
als de referentievlek. Markeer met een punt iets buiten de zijkanten van
de fluorescentie.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 28
▼B
5.2.6. Schraapmet een metalen sp atel de kiezelgel in de gemarkeerde gebieden
af. Breng het afgeschraapte materiaal in de afzuigkolf van 50 ml; voeg
15 ml hete chloroform toe, schud goed en filter opde filterkroes door
de kiezelgel ophet filter te leggen. Was het residu driemaal met hete
chloroform (telkens ongeveer 10 ml), en vang het filtraat opin een glazen
kolf van 100 ml. Damphet filtraat in tot een volume van 4—5 ml, breng
de resterende oplossing over in de van tevoren getarreerde 10 ml konisch
afgeronde centrifugebuis, dampdroog door voorzichtige verwarming in
een stikstofstroom, en weeg.
5.3.Bereiding van trimethylsilylethers
Ga te werk zoals is beschreven in punt 5.3 van bijlage V.
5.4.Gaschromatografische analyse
Ga te werk zoals beschreven in punt 5.4 van bijlage V. De werkwijze van
de gaschromatografische analyse moet zodanig zijn dat niet alleen aan de
eisen voor de bepaling van de sterolen wordt voldaan, maar dat ook een
scheiding van TMSE van het erythrodiol en van het uvaol wordt
verkregen.
Injecteer de monsteroplossing en laat het papier draaien totdat de aanwe-
zige sterolen, erythrodiol en uvaol zijn geëlueerd; identificeer vervolgens
de pieken (de retentietijden van erythrodiol en uvaol zijn circa 1,45,
respectievelijk 1,55 maal groter dan die van B-sitosterol) en bereken de
oppervlakten ervan zoals aangegeven voor de sterolen.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Erythrodiol, % =A1+A2
A1+A2+ΣA· 100
waarin:
A1= piekoppervlak van erythrodiol, in vierkante millimeter;
A2= piekoppervlak van uvaol, in vierkante millimeter;
ΣA = som van de piekoppervlakten van de aanwezige sterolen, in vier-
kante millimeter.
Het resultaat wordt uitgedrukt tot opéen cijfer achter de komma.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 29
▼B
BIJLAGEVII
BEPALING VAN VETZUREN OP DE 2-POSITIE IN TRIGLYCERIDEN
VAN OLIËN EN VETTEN
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van de samenstelling
van de vetzuurfractie van een olie of vet, veresterd opde 2-p ositie van
glycerol.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor oliën en vetten met een smeltpunt onder 45 ºC ten
gevolge van de specifieke kenmerken van de werking van pancreaslipase.
Ze geldt niet onvoorwaardelijk voor oliën en vetten die aanzienlijke
hoeveelheden bevatten van: vetzuren met 12 of minder koolstofatomen
(kokosnootolie en palmpitolie, botervet) of sterk onverzadigde vetzuren
(met meer dan vier dubbele bindingen) die 20 of meer koolstofatomen
bevatten (visolie en olie van zeedieren) of vetzuren die andere geoxyge-
neerde groepen dan de zuurgroep bevatten.
3. PRINCIPE
Mogelijke neutralisering van zure oliën en vetten in een oplosmiddel.
Zuivering door opeen aluminiumoxidekolom te brengen. Gedeeltelijke
hydrolyse van triglyceriden met pancreaslipase gedurende een bepaalde
tijd. Afscheiding van de gevormde monogleriden door dunne-laagychro-
matografie en methanolyse van deze monoglyceriden. Analyse van deze
methylesters door gas/vloeistofchromatografie.
4. APPARATUUR
4.1. Rondbodemkolf van 100 ml.4.2. Rondbodemkolf van 25 ml, met geslepen stop.4.3. 1 m lange luchtcondensator voor kolf 4.2.4.4. Kolf van 250 ml.4.5. Bekerglas van 50 ml.4.6. Scheitrechter van 500 ml.4.7. Glazen chromatografiekolom over 13 mm invoerdiameter en 400 mm
lang, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan.
4.8. Centrifugebuis van 10 ml, met ingeslepen glazen stop.
4.9. Buret van 5 ml met schaalindeling van 0,05 ml.4.10. Hypodermische injectiespuit van 1 ml met dunne naald.4.11. Micro-injectiespuit waaruit druppels van 3—4 mµ/l komen.4.12. Uitstrijkapparaat voor dunne-laagchromatografie.4.13. Glazen platen voor dunne-laagchromatografie, 20 × 20 cm.4.14. Glazen ontwikkeltank voor dunne-laagchromatografie, met een deksel van
geslepen glas, geschikt voor platen van 20 × 20 cm.
4.15. Spray voor dunne-laagchromatografie.4.16. Oven afgesteld op103 ± 2 ºC.
4.17. Thermostaat regelbaar tussen 30 en 45 ºC, tot op0,5 ºC nauwkeurig.
4.18. Rotatie-vacuümverdamper.4.19. Vibrerend elektrisch schudapparaat, waarmee de centrifugebuis krachtig
kan worden geschud.
4.20. Ultravioletlampvoor onderzoek van de dunne-laagp laten.
Envoordecontrolevandelipaseactiviteit:
4.21. pH-meter.
4.22. Spiraalvormig roerstaafje.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 30
▼B
4.23. Buret van 5 ml.
4.24. Stopwatch.
Envoordeeventuele bereiding vanlipase:
4.25. Laboratoriumschudapparaat, geschikt voor de dispersie en menging van
heterogene materialen.
5. REAGENTIA
5.1. n-Hexaan of bij gebreke daarvan petroleumether (kookpunt 30—50 ºC),
chromatografische kwaliteit.
5.2. 2-Propanol of ethanol, 95 % (v/v), p.a.
5.3. 2-Propanol of ethanol, l/l oplossing in water.
5.4. Diëthylether, vrij van peroxiden.5.5. Aceton.5.6. Mierezuur, ten minste 98 % (m/m).
5.7. Ontwikkelvloeistof: mengsel van n-hexaan (5.1), diëthylether (5.4) en
mierezuur (5.6) in verhoudingen 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Geactiveerd aluminiumoxide voor chromatografische doeleinden, neutraal,
kwaliteit Brockmann I.
5.9. Siliciumdioxidepoeder met bindmiddel, geschikt voor dunne-laagchroma-
tografie.
5.10. Pancreaslipase van geschikte kwaliteit (zie de opmerkingen 1 en 2).5.11. Natriumhydroxide, 120 g/l oplossing in water.5.12. Zoutzuur 6 N oplossing in water.
5.13. Calciumchloride (CACl
2), 220 g/l oplossing in water.
5.14. Natriumcholaat, voor enzymatische doeleinden, 1 g/l oplossing in water.5.15. Bufferoplossing: 1 M oplossing in water van trishydroxymethylaminome-
thaan wordt opp H 8 gebracht door toevoeging van zoutzuur (5.12)
(potentiometrisch te controleren).
5.16. Phenolphtaleïne, 10 g/l oplossing in 95 % ethanol (v/v).
5.17. 2,7-dichloorfluoresceïne, 2 g/l oplossing in 95 % ethanol (v/v), licht alka-
lisch gemaakt door toevoeging van één druppel 1 N-
natriumhydroxideoplossing per 100 ml.
Envoordecontrolevandelipasewerking:
5.18. Geneutraliseerde olie.5.19. Natriumhydroxide, 0,1 N waterige oplossing.5.20. Natriumcholaat voor enzymatische doeleinden, 200 g/l oplossing in water.
5.21. Arabische gom, 100 g/l oplossing in water.
6. BEREIDING VAN HET MONSTER
Indien het monster een zuurgraad heeft van minder dan 3 %, bepaald
overeenkomstig bijlage II: direct zuiveren over aluminiumoxide overeen-
komstig punt 6.2.
Indien het monster een zuurgraad heeft van meer dan 3 %, bepaald over-
eenkomstig bijlage II: neutraliseren met alkali in aanwezigheid van een
oplosmiddel (6.1), dan brengen op aluminiumoxide (6.2).
6.1. Neutralisering met alkali in aanwezigheid van een oplosmiddel
Breng in een scheitrechter (4.6) ongeveer 10 g ruwe olie en voeg 100 ml
hexaan (5.1) toe, 50 ml 2-propanol (5.2), enkele druppels phenolphtaleïne-
oplossing (5.16) en een hoeveelheid van de natriumhydroxideoplossing
(5.11) die overeenkomt met de vrije zuurgraad van de olie plus 0,3 %
overmaat. Schud krachtig gedurende één minuut, voeg 50 ml gedistilleerd
water toe, schud opnieuw en laat bezinken.
Laat, na scheiding van de lagen, de onderste laag met de zepen weglopen.
Verwijder tevens mogelijke intermediaire lagen (slijmachtige en onopge-
loste stoffen). Was de hexaanoplossing van de geneutraliseerdeolie met1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 31
▼B
opeenvolgende porties van 25—30 ml van de 2-propanoloplossing (5.3)
tot de roze kleur van de phenolphtaleïne verdwijnt. Verwijder het meren-
deel van het hexaan door destillatie onder vacuüm in de
rotatievacuümverdamper (4.18), droog de olie bij 30—40 ºC onder
vacuüm met behulpvan een stroom zuivere stikstof tot de hexaan volledig
is verwijderd.
6.2. Zuivering met aluminiumoxide.
Bereid een oplossing van 15 g geactivieerd aluminiumoxide (5.8) in 50 ml
hexaan (5.1) en giet het, al roerend, opde chromatografiekolom (4.7).
Laat het aluminiumoxide gelijkmatig bezinken en laat het niveau van het
oplosmiddel dalen tot 1—2 mm boven de absorbent. Giet zorgvuldig een
oplossing van 5 g olie in 25 ml hexaan (5.1) op de kolom, verzamel het
volledige effluent van de kolom in een rondbodemkolf (4.1).
7. KLAARMAKEN VAN DE CHROMATOGRAFISCHE PLATEN
Reinig de glazen platen (4.13) grondig met ethanol, petroleumether en
aceton ten einde alle vetsporen te verwijderen.
Plaats in een kolf (4.4) 30 g siliciumdioxidepoeder (5.9). Voeg 60 ml
gedistilleerd water toe. Plaats de stoperopen schud krachtig gedurende
één minuut. Breng de massa onmiddellijk over op het uitstrijkapparaat
(4.12) en bedek de zuivere platen met een 0,25 mm dikke laag.
Droog de platen gedurende 15 minuten aan de lucht en daarna gedurende
een uur in de oven (4.16) bij 103 ± 2 ºC. Koel de platen in een droogstoof
tot kamertemperatuur vóór gebruik.
Klaargemaakte platen zijn in de handel beschikbaar.
8. WERKWIJZE
8.1. Hydrolyse met pancreaslipase.
Weeg in de centrifugebuis (4.8) ongeveer 0,1 g van het bereide monster;
indien het monster een vloeibare olie is, ga dan direct te werk als hier-
onder vermeld; indien het een vast vet is dan moet het worden opgelost
in 0,2 ml hexaan (5.1) met zonodig voorzichtige verwarming.
Voeg 20 mg lipase (5.10) en 2 ml bufferoplossing (5.15) toe. Schud goed
maar zorgvuldig en voeg 0,5 ml natriumcholaatoplossing (5.14) toe en
0,2 ml calciumchlorideoplossing (5.13). Sluit de buis met de geslepen
stop, schud voorzichtig (vermijd natmaken van de stop) en plaats de buis
onmiddellijk in het thermostaatbad (4.17) dat op40 ± 0,5 ºC wordt
gehouden en schud met de hand gedurende precies één minuut.
Haal de buis uit het thermostaatbad en schud krachtig door middel van het
elektrisch schudapparaat (4.19) gedurende precies twee minuten.
Koel onmiddellijk af onder stromend water; voeg 1 ml zoutzuur (5.12) en
1 ml diëthylether (5.4) toe. Plaats de stoperopen meng krachtig door
middel van het elektrisch schudapparaat. Laat staan en verwijder de orga-
nische laag met de injectiespuit (4.10), zonodig na centrifugering.
8.2. Scheiding van de monoglyceriden door dunne-laagchromatografie.
Breng het extract met de micro-injectiespuit (4.11) aan op de chromato-
grafische plaat, ongeveer 1,5 cm van de benedenrand in een dunne,
uniforme lijn, zo smal mogelijk. Plaats de plaat in de goed verzadigde
ontwikkeltank (4.14) en ontwikkel met de ontwikkelvloeistof (5.7) bij
ongeveer 20 ºC tot ongeveer 1 cm van de bovenrand van de plaat.
Droog de plaat aan de lucht bij de temperatuur van de vloeistoftank en
besproei ze met 2,7-dichloorfluoresceïne-oplossing (5.17). Markeer de
plaats (band) van de monoglyceriden (Rf ongeveer 0,035) onder UV-licht
(4.20).
8.3. Analyse van de monoglyceriden met gas/vloeistofchromatografie.
Verwijder de onder 8.2 verkregen band met een spatel (vermijd daarbij
meenemen van stoffen die opde basislijn zijn achtergebleven) en breng
deze over in de methyleringskolf (4.2).
Behandel het verkregen siliciumdioxide direct volgens de in bijlage X.B
vermelde methodes ten einde de monoglyceriden om te zetten in methy-
lesters en daarna de esters te onderzoeken met gaschromatografie zoals
beschreven in bijlage X.A.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 32
▼B
9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Bereken de samenstelling van de vetzuren opde 2-p ositie tot opéén cijfer
achter de komma (zie opmerking 3).
10. OPMERKINGEN
Opmerking1: Controle van de activiteit van het lipase
Bereid een olie-emulsie door in een geschikte mixer een
mengsel te schudden van 165 ml van een oplossing van
arabische gom (5.21), 15 g ijsschilfers en 20 ml geneutrali-
seerde olie (5.18).
Breng 10 ml van deze emulsie in een bekerglas (4.5), voeg
hieraan 0,3 ml natriumcholaatoplossing (5.20) en 20 ml
gedistilleerd water toe.
Plaats het bekerglas in een waterbad, gethermostatiseerd op
37 ± 0,5 ºC (zie opmerking 4), en breng de elektroden van
een pH-meter (4.21) en een roerstaafje (4.22) in.
Voeg vervolgens door middel van een buret (4.23) druppel
voor druppel de natriumhydroxideoplossing (5.19) toe, tot
een pH van 8,5 is bereikt.
Voeg een voldoende hoeveelheid van een lipaseoplossing
in water (zie hieronder) toe. Zodra de pH-meter een pH
van 8,3 aangeeft, de stopwatch starten (4.24) en druppels-
gewijs de natriumhydroxideoplossing (5.19) toevoegen met
een zodanige snelheid dat de pH op 8,3 blijft. Noteer elke
minuut het verbruikte volume alkalioplossing.
Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij
opde x-as de tijd wordt aangegeven en opde y-as het
volume verbruikte alkalioplossing om de pH constant te
houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn.
De hierboven genoemde lipasesuspensie is een suspensie
van 1 per 1000 (m/m) in water. Voor elke test dient
voldoende van deze suspensie te worden gebruikt, zodat
ongeveer 1 ml van de alkalioplossing in vier tot vijf
minuten wordt verbruikt. Meestal is ongeveer 1—5 mg
van het poeder nodig. De lipase-eenheid wordt gedefineerd
als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 meq zuur vrij-
maakt. Dan wordt de activiteit A van het gebruikte poeder,
uitgedrukt in lipase-eenheden per milligram, berekend aan
de hand van de formule:
A¼V/C110
m
waarin:
V = het volume natriumhydroxideoplossing (5.19)
verbruikt per minuut (berekend uit de grafiek);
m = de hoeveelheid onderzochte lipase, in milligram, van
het poedermonster
Opmerking2: Bereiding van lipase
Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel
verkrijgbaar, maar kan ook in het laboratorium als volgt
worden bereid:
Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 ºC, verwijder al
het omgevende vet en bindweefsel en verklein het restant
in een kogelmolen met fijne messen tot een vloeibare pasta
is overgebleven. Meng deze pasta met het roerstaafje (4.25)
gedurende vier tot zes uur, samen met 2,5 liter watervrij
aceton, en centrifugeer. Extraheer het residu nog driemaal
met hetzelfde volume aceton, dan tweemaal met een l/l (v/
v) mengsel van aceton en diëthylether en ten slotte twee-
maal met diëthylether.
Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuüm; hierdoor
wordt een stabiel poeder verkregen dat in een koelkast
dient te worden opgeslagen.
Opmerking3: Het is in ieder geval aan te raden de samenstelling te
bepalen van het totaal aan vetzuren van hetzelfde monster,1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 33
▼B
aangezien de vergelijking met de samenstelling van de
zuren op de 2-positie nuttig is voor interpretatie van de
verkregen cijfers.
Opmerking4: De hydrolysetemperatuur is vastgesteld op 37 ºC omdat een
vloeibare olie wordt gebruikt. Ze wordt evenwel op40 ºC
gebracht voor het monster om het onderzoek van vetten
met smeltpunten tot 45 ºC mogelijk te maken.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 34
▼B
BIJLAGEVIII
BEPALING VAN HET GEHALTE VAN TRILINOLEÏNE
1. DOEL
Deze norm beschrijft een methode voor de scheiding en de kwantitatieve
bepaling van de triglyceridensamenstelling van plantaardige oliën, aan de
hand van hun molecuulgewicht, en het aantal dubbele bindingen, uitgedrukt
in hun equivalent koolstofgetal (zie opmerking 1).
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm geldt voor alle plantaardige oliën die triglyceriden bevatten van
vetzuren met lange keten. De methode geldt in het bijzonder voor de
opsporing van de aanwezigheid van kleine hoeveelheden halfdrogendeoliën (rijk aan linolzuur) in plantaardige oliën die als overwegend onverza-
digd vetzuur oliezuur bevatten, zoals olijfolie.
3. PRINCIPE
Scheiding van triglyceriden, uitgedrukt in hun equivalent koolstofgetal met
hoge-drukvloeistofchromatografie (omgekeerde vaste polariteit) en interpre-
tatie van de chromatogrammen.
4. APPARATUUR
4.1. Hoge-drukvloeistofchromatograaf waarmee thermostatische controle van de
kolomtemperatuur mogelijk is.
4.2. Injectie-eenheid met een capaciteit van 10 mµ/l.4.3. Detector: differentiële refractometer. De gevoeligheid bij volledige schaa-
luitslag dient ten minste 10
−4-eenheid te zijn van de brekingsindex.
4.4. Kolom: buis van roestvrij staal, 250 mm lang en met een binnendiameter
van 4,5 mm, gepakt met siliciumdioxidedeeltjes van 5 µm diameter en
met 22—23 % koolstof in de vorm van octadecylsilaan (zie opmerking 2).
4.5. Recorder en/of integrator.
5. REAGENTIA
De reagentia dienen p.a. te zijn. Elutievloeistoffen dienen ontgast te zijn en
kunnen verschillende malen worden gerecycleerd zonder dat dit invloed
heeft opde scheidingen.
5.1. Chloroform.5.2. Aceton.5.3. Acetonitril.5.4. Elutievloeistof: acetonitril + aceton (verhoudingen moeten worden aange-
past om de gewenste scheiding te verkrijgen; begin met een 50: 50-
mengsel).
5.5. Oplosmiddel: aceton of 1: 1 acetonchloroformmengsel.5.6. Referentieglyceriden: in de handel verkrijgbare triglyceriden (tripalmpitaat,
triolaat, enz.) kunnen worden gebruikt en zo kunnen de retentietijden
worden uitgezet tegen.het equivalente koolstofgetal, of anders kan een met
sojaolie verkregen referentiechromatogram worden opgesteld (zie opmer-
king 3 en 4 en de figuren 1 en 2).
6. BEREIDING VAN MONSTERS
Een 5 % oplossing van de te analyseren monsters wordt bereid door het
afwegen van 0,5 ± 0,001 g van het monster in een kolf met een schaalin-
deling van 10 ml en het bijvullen tot 10 ml met het oplosmiddel (5.5).
7. WERKWIJZE
7.1. Installeer het chromatografiesysteem. Pompde elutievloeistof (5.4) opin
een tempo van 1,5 ml/mm ten einde het volledige systeem te zuiveren.
Wacht tot een stabiele basislijn wordt verkregen.
Injecteer 10 µl van het volgens punt 6 bereide monster.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 35
▼B
8. BEREKENING EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Gebruik de methode met interne standaard, dat wil zeggen ga ervan uit dat
de som van de piekoppervlakken voor de verschillende triglyceriden gelijk
is aan 100 %. Bereken het relatieve percentage van elk triglyceride aan de
hand van de formule:
% triglyceride =piekoppervlak
som van de piekoppervlakken× 100
waarbij het resultaat met één cijfer achter de komma wordt opgegeven.
Opmerking1: De elutievolgorde kan worden bepaald door het berekenen
van de equivalente koostofgetallen, dikwijls gedefinieerd
met de vergelijking ECN = CN − 2n, waarin CN het kool-
stofgetal is en n het aantal dubbele bindingen; zij kan veel
preciezer worden berekend door rekening te houden met de
oorsprong van de dubbele binding. Indien no,n1en n1nde
aantallen dubbele bindingen zijn die respectievelijk worden
toegeschreven aan oliezuur, linolzuur en linoleenzuur, kan
het equivalent koolstofgetal worden berekend aan de hand
van de formule:
ECN = CN − dono−d1n1−d1nn1n,
waarin de coëfficiënten do,d1en d1nkunnen worden bere-
kend door middel van de referentieglyceriden. Onder de in
deze methode gespecificeerde voorwaarden zal de verkregen
vergelijking dicht liggen bij:
ECN = CN − [2,60 no] − [2,35 n1] − [2,17 n1n].
Opmerking2: Voorbeelden: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art. 50333,
Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art. 50377
of een soortgeijk produkt.
Opmerking3: Met verschillende referentieglyceriden kan ook de resolutie
ten opzichte van triolaat worden berekend
α=RT′
RT′oleaat
door gebruik van de gereduceerde retentietijd RT ′=R T−
RT oplosmiddel
De grafiek van log αtegen f (aantal dubbele bindingen)
maakt het mogelijk de retentiewaarden te bepalen voor alle
triglyceriden van vetzuren in de referentietriglyceriden (zie
figuur 2).
Opmerking4: De efficiëntie van de kolom moet zodanig zijn dat de piek
van LLL (trilinolaat) afkomstig van de triglyceriden duide-
lijk gescheiden is van de aangrenzende RT.
Opmerking5: Voor olijfolie voor verlichting verkregen bij de eerste
persing en voor ruwe oliën uit afvallen van olijven moet de
olie, om een goede scheiding tussen de trilinoleïnepieken en
de pieken daarnaast of de pieken van eventuele interfere-
rende stoffen te verkrijgen, vooraf worden gezuiverd
overeenkomstig de volgende methode.
Men absorbeert 200 µl olie, zonder verdunning, opeen sili-
ciumdioxide-extractiekolom van het type SEP PAK silica
cartridge-waters part. nr. 51900.
De triglyceriden worden vervolgens in een tijdspanne van
ten hoogste 20 sec. geëlueerd met 20 ml watervrij hexaan
voor HPLC.
Het eluaat wordt gedroogd met een stikstofstroom en opge-
nomen in isopropanol of aceton (5 ml). 10-20 µl wordt
geïnjecteerd opeen HPLC-kolom. Er moet worden geverifi-
eerd of de olie, qua vetzuren, binnen de voor de betrokken
analysemethode geldende fouttolerantie, dezelfde samenstel-
ling heeft vóór en na de zuivering.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 36
▼M11
▼B
Figuur 1
Chromatogram van een monster van sojaolie
P = palmitinezuur
L = linolzuurSt = stearinezuurLn = linoleenzuur
O = oliezuur1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 37
▼B
Figuur 2
Grafiek van log αtegen f (aantal dubbele bindingen)
La = laurinezuur
St = stearinezuurLn = linoleenzuurMy = myristinezuur
O = oliezuur
P = palmitinezuurL = linolzuur1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 38
▼B
BIJLAGEIX
SPECTROFOTOMETRISCH ONDERZOEK IN HET ULTRAVIOLETTE
GEBIED
Opmerking vooraf
Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied kan informatie
verschaffen over de kwaliteit van een vet, de toestand van bewaring en
veranderingen veroorzaakt door technologische processen.
De absorptie bij de in deze methode aangegeven golflengten wordt veroor-
zaakt door de aanwezigheid van dubbele en drievoudig onverzadigde
systemen. Deze absorpties worden uitgedrukt als de specifieke extincties
E1cm1%(de extinctie van een 1 % oplossing van het vet in het aangegeven
oplosmiddel, bij een optische weglengte van 1 cm), en worden volgens
afspraak als K, ook extinctiecoëfficiënt genoemd, opgegeven.
1. DOEL
Deze methode beschrijft de werkwijze voor de uitvoering van een spectro-
fotometrisch onderzoek van vetten in het ultraviolette gebied.
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
Het te onderzoeken vet wordt opgelost in het vereiste oplosmiddel, vervol-
gens wordt de extinctie bepaald bij de opgegeven golflengten ten opzichte
van het zuivere oplosmiddel. De specifieke extincties worden uit de afle-
zingen van de spectrofotometer berekend.
3. APPARATUUR
3.1. Een spectrofotometer, geschikt voor metingen in het ultraviolette gebied
tussen 220 en 360 nm, instelbaar tot opde nm nauwkeurig.
3.2. Kwartscuvetten, met deksel, met een optische weglengte van 1 cm. Gevuld
met water of een ander geschikt oplosmiddel mogen de cuvetten onderling
geen verschillen vertonen groter dan 0,01 extinctie-eenheden.
3.3. Maatkolven van 25 ml.
3.4. Chromatografiekolom waarvan het bovenste gedeelte 270 mm lang is en
een doorsnede heeft van 35 mm en het onderste gedeelte 270 mm lang
met een doorsnede van 10 mm.
4. REAGENTIA
4.1. Iso-octaan (2,2,4-trimethylpentaan), voor spectrofotometrische doeleinden:
bij 220 nm moet dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie
hebben van ten minste 60 % en bij 250 nm van ten minste 95 %, of
— cyclohexaan, voor spectrofotometrische doeleinden: bij 220 nm moet
dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie hebben van ten
minste 40 % en bij 250 nm van ten minste 95 %.
4.2. Aluminiumhydroxide, voor kolomchromatografische doeleinden, voorbe-
handeld en gecontroleerd zoals omschreven in aanhangsel I.
4.3. Hexaan voor chromatografische doeleinden.
5. WERKWIJZE
5.1. Het te onderzoeken monster dient volledig homogeen te zijn en vrij van
onzuiverheden. Oliën die bij kamertemperatuur vloeibaar zijn, worden
over papier gefiltreerd bij een temperatuur van ongeveer 30 ºC, vetten
worden gehomogeniseerd en gefiltreerd bij een temperatuur die niet meer
dan 10 ºC boven het smeltpunt ligt.
5.2. Weeg nauwkeurig ongeveer 0,25 g van het voorbehandelde monster af in
een maatkolf van 25 ml, vul aan tot de streepmet het aangegeven op los-
middel en homogeniseer. De verkregen oplossing moet volmaakt helder1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 39
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
zijn. Indien opalescentie of troebeling optreedt dient direct over papier te
worden gefiltreerd.
5.3. Vul een cuvet met deze oplossing en meet de extincties ten opzichte van
het oplosmiddel bij geschikte golflengten tussen 232 en 276 nm.
De gemeten extinctiewaarden moeten tussen 0,1 en 0,8 liggen. Zo niet, dan
moeten de metingen worden herhaald bij een aangepaste inweeg van het
monster.
5.4. Indien een meting van de specifieke extinctie is vereist na het doorlopen
van de aluminiumoxidekolom, ga dan als volgt te werk. Breng in de chro-
matografiekolom 30 g aluminiumoxide in een hexaansuspensie. Verwijder,
nadat de suspensie is uitgezakt, zoveel van de overmaat hexaan dat boven
het aluminiumoxide nog ongeveer 1 cm hexaan staat. Los 10 g volgens
punt 5.1 gehomogeniseerd en gefiltreerd vet op in 100 ml hexaan en giet
de oplossing op de kolom. Verzamel het eluaat en verwijder het oplos-
middel onder vacuüm bij een temperatuur onder 25 ºC. Met het aldus
verkregen vet dient de bepaling onmiddellijk te worden voortgezet, zoals
omschreven in punt 5.2.
6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
6.1. Geef de specifieke extincties op, die bij de verschillende golflengten als
volgt worden berekend:
Kλ¼Eλ
c/C1s
waarin:
Kλ= specifieke extinctie bij golflengte λ,
Eλ= extinctie, gemeten bij golflengte λ;
c = gehalte van de oplossing, in g/100 ml;
s = optische weglengte, in centimeter.
De resultaten dienen te worden opgegeven met twee cijfers achter de
komma.
6.2. Het spectrofotometrisch onderzoek van olijfolie volgens de officiële bij de
EEG-Verordening voorgeschreven methode vereist de bepaling van de
specifieke extinctie in een iso-octaan oplossing bij golflengten van 232 en
270 nm en de bepaling van de grootheid ∆K volgens de formule:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
waarin:
Km= de specifieke extinctie bij golflengte m, de golflengte van het
absorptiemaximum bij ongeveer 270 nm.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 40
▼B
AANHANGSELI
Bereiding vandealuminiumoxidekolom enhettestenvandeactiviteit
A.1.1. Bereiding van de aluminiumoxidekolom
Breng in een hermetisch afsluitbare kolf een hoeveelheid aluminiumo-
xide, welke gedurende 3 uur in een oven bij een temperatuur van
380—400 ºC is gedroogd, voeg per 100 g aluminiumoxide 5 ml gedistil-
leerd water toe, sluit de kolf onmiddellijk, schud regelmatig en laat
vervolgens gedurende ten minste 12 uur staan alvorens dit te gebruiken.
A.1.2. Controle opde activiteit van het aluminiumoxide
Vul een chromatografiekolom met 30 g aluminiumoxide. Ga hierbij te
werk zoals omschreven in punt 5.4 en leid een mengsel door bestaande
uit:
— 95 % koudgeperste olijfolie van eerste persing met een specifieke
extinctie van minder dan 0,18 bij 268 nm,
— 5 % bij de raffinage met aarde behandelde aardnotenolie met een
specifieke extinctie van ten minste 4,0 bij 268 nm.
Indien de door de kolom gelopen vloeistof een specifieke extinctie van
ten minste 0,11 bij 268 nm heeft dan kan het aluminiumhydroxide
worden gebruikt, zo niet dan moet het percentage water worden opge-
voerd.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 41
▼B
AANHANGSELII
IJkingvandespectrofotometer
A.2. Het apparaat moet regelmatig (ten minste iedere 6 maanden) worden
gecontroleerd opeen correcte golflengteaanwijzing en opde nauwkeurig-
heid van de respons.
A.2.1. De golflengte kan worden gecontroleerd met een kwiklampof met
geschikte filters.
A.2.2. Ga, om de respons van de fotocel en de fotomultiplier te controleren, als
volgt te werk: weeg 0,2000 g kaliumchromaat, voor spectrofotometrische
doeleinden, af in een 1 000 ml maatkolf en los opin 0,05 M kaliumhy-
droxideoplossing en vul hiermee aan tot de streep. Pipetteer 25 ml van
deze oplossing in een 500 ml maatkolf en vul aan tot de streep met
dezelfe kaliumhydroxideoplossing.
Bepaal de extinctie van deze oplossing bij 275 nm, waarbij wordt
gemeten tegen de kaliumhydroxideoplossing. De met een 1 cm cuvet
gemeten extinctie moet 0,200 ± 0,005 bedragen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 42
▼B
BIJLAGEX.A
GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN METHYLESTERS VAN
VETZUREN
1. DOEL
Deze norm beschrijft de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatogra-
fische bepaling met gepakte of capillaire kolom van een mengsel van
methylesters van vetzuren, verkregen volgens bijlage X.B.
Deze norm kan niet worden toegepast op gepolymeriseerde vetzuren.
2. REAGENTIA
2.1.Draaggas
Inert gas (stikstof, helium, argon, waterstof, enz.), zeer goed gedroogd
en met een zuurstofgehalte kleiner dan 10 mg/kg.
Opmerking1: Waterstof, dat uitsluitend als draaggas wordt gebruikt bij
capillaire kolommen, kan de snelheid van de analyse
verdubbelen, maar is gevaarlijk. Veiligheidsvoorzie-
ningen zijn verkrijgbaar.
2.2.Hulpgassen
2.2.1. Waterstof (zuiverheid ten minste 99,9 %), vrij van organisch materiaal.2.2.2. Lucht of zuurstof, vrij van organisch materiaal.
2.3.Standaardmengsel
Een mengsel van methylesters van zuivere vetzuren of de methylesters
van een vetstof met bekende samenstelling, bij voorkeur met dezelfde
vetzuursamenstelling als het te analyseren monster.
Zorg ervoor oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren te voor-
komen.
3. APPARATUUR
De richtlijnen hebben betrekking op apparatuur die gewoonlijk wordt
gebruikt bij gas/vloeistofchromatografie met een gepakte en/of capil-
laire kolom en een vlamionisatiedetector. Elk apparaat waarmee de
efficiëntie en het scheidend vermogen zoals bepaald volgens en aange-
geven in punt 4.1.2 kunnen worden bereikt, is geschikt.
3.1.Gaschromatograaf
De gaschromatograaf dient te bestaan uit de volgende onderdelen:
3.1.1. Injectiestuk
a) voor een gepakte kolom moet een injectiestuk worden gebruikt dat
een zo klein mogelijke dode ruimte heeft (het injectiestuk moet
kunnen worden verwarmd tot een temperatuur die 20 tot 50 ºC hoger
is dan die van de kolom);
b) voor capillaire koloms dient een speciaal ontworpen injectiestuk te
worden gebruikt. Dit injectiestuk mag van het splittype zijn of van
het kolominjectortype.
Opmerking2: Indien geen vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen
aanwezig zijn, mag een beweegbare naaldinjector
worden gebruikt.
3.1.2. Oven
De oven moet de kolom tot ten minste 260 ºC kunnen verwarmen en de
gekozen temperatuur op 1 ºC nauwkeurig kunnen aanhouden voor eengepakte kolom en op 0,1 ºC voor een capillaire kolom. De laatstge-
noemde voorwaarde is van bijzonder belang wanneer een fused-silica
capillaire kolom wordt gebruikt.
Het verdient aanbeveling steeds temperatuur-geprogrammeerde gaschro-
matografie toe te passen, in het bijzonder voor vetzuren met minder dan
16 koolstofatomen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 43
▼B
3.1.3. Gepakte kolom
3.1.3.1. Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren
verbindingen (dat wil zeggen glas of roestvrij staal), van de volgende
afmetingen:
a) lengte: 1 tot 3 m. Er dient een relatief korte kolom te worden
gebruikt als vetzuren met lange ketens (meer dan 20 C-atomen)
aanwezig zijn. Voor de bepaling van C 4- en C 6-vetzuren wordt
een kolom van twee meter aanbevolen;
b) inwendige diameter: 2—4 mm.
Opmerking3: In een roestvrij stalen kolom kunnen meervoudig onver-
zadigde componenten met meer dan drie dubbele
bindingen zich ontleden.
Opmerking4: Er mag een systeem met dubbele gepakte kolommen
worden gebruikt.
3.1.3.2. Pakking
a)Drager: zuurgewassen, gesilaniseerde diatomeeënaarde of elke
andere geschikte inerte drager met een korrelgrootte tussen 125 en
200 µm (onderlinge verschillen niet groter dan 25 µm), afhankelijk
van de inwendige diameter en de lengte van de kolom.
b)Stationaire fase: type polyester van polaire vloeistof (bij voorbeeld
van diëthyleenglycolpolysuccinaat, butaandiolpolysuccinaat, ethy-
leenglycolpolyadipaat, enz.), cyaansiliconen of elke andere vloeistof
die de vereiste chromatografische scheiding mogelijk maakt (zie
punt 4). De stationaire fase moet ongeveer 5—20 % (m/m) van depakking uitmaken. Voor bepaalde scheidingen kunnen apolaire stati-
onaire fasen worden gebruikt.
3.1.3.3. Conditionering van de kolom
Maak, indien mogelijk, de kolom los van de detector en verwarm de
oven geleidelijk tot 185 ºC; laat bij deze temperatuur gedurende ten
minste 16 uur een stroom inert gas door de nieuwe kolom gaan met
een snelheid van 20—60 ml/min. en bij 195 ºC nog eens gedurende 2
uur.
3.1.4. Capillaire kolom3.1.4.1. Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren
verbindingen (gewoonlijk glas of fused silica). Inwendige diameter
0,2—0,8 mm. De binnenzijde dient een adequate behandeling te onder-
gaan (bij voorbeeld voorbehandeling van de oppervlakte, inactivering)
voordat ze met de stationaire fase wordt gecoat. In de meeste gevallen
is een kolom van 25 m voldoende.
3.1.4.2. Stationaire fase: gewoonlijk van het type polyglycol (poly(ethyleen-
glycol) 20000), polyester (butaandiolpolysuccinaat) of polair
polysiloxaan (cyaansiliconen). Er mogen kruiselings verbonden
kolommen worden gebruikt.
Opmerking5: Polaire polysiloxanen kunnen moeilijkheden geven bij
het identificeren en de scheiding van linoleenzuur en
vetzuren van C
20.
De coating moet dun zijn, dat wil zeggen 0,1—0,2 µm.
3.1.4.3. Montage en conditionering van de kolom
Neem de gebruikelijke voorzorgen voor het monteren van capillaire
kolommen, dat wil zeggen bevestiging van de kolom in de oven, keuze
en montage van verbindingsstukken (lekken), plaatsing van de uiteinden
van de kolom in de injector en de detector (beperking van dode
ruimten). Leid een stroom van draaggas onder druk door de kolom (bij
voorbeeld 0,3 bar (30 kPa) voor een kolom van 25 m lengte en een
inwendige diameter van 0,3 mm).
Conditioneer de kolom door de temperatuur in de oven geprogram-
meerd met 3 ºC/min. te verhogen van de omgevingstemperatuur tot
10 ºC onder de ontledingstemperatuur van de stationaire fase. Houd de
oven gedurende 1 uur opdeze temp eratuur, tot stabilisatie van de basis-
lijn. Verlaag de temperatuur tot 180 ºC en werk onder isotherme
omstandigheden.
Opmerking6: In de handel zijn geschikte, reeds geconditioneerde
kolommen verkrijgbaar.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 44
▼B
3.1.5. Detector
De detector moet bij voorkeur verwarmd kunnen worden tot een tempe-
ratuur die hoger is dan de kolomtemperatuur.
3.2.Injectiespuit
Injectiespuit van maximaal 10 µl, met schaalverdeling in 0,1 µl.
3.3Registratieapparatuur
Als de curve van de registratieapparatuur dient te worden gebruikt voor
de berekening van de samenstelling van het geanalyseerde mengsel, is
een elektronisch registratieapparaat met grote nauwkeurigheid vereist.
Dit apparaat moet compatibel zijn met de overige apparatuur en dient
de volgende kenmerken te hebben:
a) responstijd kleiner dan 1,5 sec., liefst kleiner dan 1 sec. (de respons-
tijd is de tijd die nodig is om de pen van het registratieapparaat van
0 tot 90 % te laten gaan bij een plotseling signaal van 100 %);
b) papierbreedte: minimaal 20 cm;
c) papiersnelheid: regelbaar van 0,4—2,5 cm/min.
3.4.Rekenapparatuur (optioneel)
Elektronische rekenapparatuur (bij voorbeeld een integrator) biedt de
mogelijkheid snelle en nauwkeurige berekeningen uit te voeren. De
integratie moet lineair zijn, een voldoende gevoeligheid hebben en de
correctie van het eventuele verloopvan de basislijn moet toereikend
zijn.
4. WERKWIJZE
De in de punten 4.1 tot en met 4.3 beschreven handelingen betreffen
het gebruik van een vlamionisatiedetector.
Als alternatief mag een gaschromatograaf met een katharometer (reage-
rend opverschillen in warmtegeleiding) worden gebruikt. De
werkomstandigheden worden dan gewijzigd als beschreven in punt 6.
4.1.Werkomstandigheden
4.1.1. Bepaling van de optimale werkomstandigheden4.1.1.1. Gepakte kolom
Bij het vaststellen van de optimale werkomstandigheden moet rekening
worden gehouden met de volgende variabelen:
a) lengte en diameter van de kolom;
b) aard en hoeveelheid van de stationaire fase;
c) temperatuur van de kolom;
d) debiet van het draaggas;
e) gewenst scheidend vermogen;
f) de hoeveelheid van het monster, die zodanig moet worden gekozen
dat de detector en de elektrometer een lineaire respons geven;
g) duur van de analyse.
In het algemeen zullen bij de in de tabellen 1 en 2 vermelde waarden
de gewenste resultaten worden verkregen, dat wil zeggen ten minste
2 000 theoretische schotels voor methylstearaat bij een elutie binnen
ongeveer 15 min.
Als de apparatuur dit toelaat, dient het injectiestuk op een temperatuur
te worden gebracht van ongeveer 200 ºC en de detector opeen temp e-
ratuur gelijk aan of hoger dan de kolomtemperatuur.
Het debiet van de waterstof naar de vlamionisatiedetector dient in het
algemeen, afhankelijk van de diameter van de kolom, 0,5 tot 1 maal
het debiet van het draaggas te zijn. Het debiet van de zuurstof is onge-
veer 5 tot 10 maal zo groot als die van de waterstof.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 45
▼B
Tabel1
Inwendige diameter van de kolom
(mm)Debiet van het draaggas (ml/min.)
2 15 tot 25
3 20 tot 40
4 40 tot 60
Tabel2
Concentratie van de stationaire fase
(% (m/m))Kolomtemperatuur (ºC)
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Capillaire kolom
De efficiëntie en permeabiliteit van capillaire kolommen brengen mee
dat de scheiding tussen de componenten en de duur van de analyse
sterk afhankelijk zijn van het debiet van het draaggas in de kolom.
Daarom moeten de werkomstandigheden worden geoptimaliseerd door
aanpassing van deze variabele (of eenvoudiger door beïnvioeding van
het drukverval van de kolom), naar gelang men de scheiding wenst te
verbeteren of een snelle analyse wenst.
4.1.2. Bepaling van het aantal theoretische schotels (efficiëntie)
en van het scheidend vermogen
(Zie figuur 1.)Voer de analyse uit met een mengsel van ongeveer gelijke hoeveel-
heden methylstearaat en- oleaat (bij voorbeeld methylesters van
cacaoboter).
Kies de kolomtemperatuur en het debiet van het draaggas zodanig dat
het maximum van de methylstearaatpiek ongeveer 15 minuten na de
oplosmiddelpiek wordt geregistreerd. Gebruik een hoeveelheid van het
mengsel van methylesters die groot genoeg is om een methylstearaat-
piek te krijgen die tot ongeveer driekwart van de hele schaal reikt.
Bereken het aantal theoretische schotels „n” (efficiëntie) met de
formule:
n¼16
dr1
wl/C20/C21
2
en het scheidend vermogen „R” met de formule:
R¼2∆
w1þw2
waarin:
dr1= de retentie-afstand, in millimeter, vanaf de start van het
chromatogram tot het maximum van de piek van methyl-
stearaat;
w1en w2= de basisbreedten, in millimeter, van de pieken voor
methylstearaat en -oleaat, gemeten tussen de snijpunten
van de raaklijnen aan de buigpunten met de basislijn;
∆ = de afstand, in millimeter, tussen de respectieve piekma-
xima van methylstearaat en -oleaat;
en de resolutiefactor „Ir” met de formule1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 46
▼M2
▼M2
a
b
waarin:
a = de hoogte van de laagste piek gemeten ten opzichte van de basis-
lijn;
b = de hoogte van het laagste punt van het dal tussen de twee
aangrenzende pieken, gemeten ten opzichte van de basislijn.
Figuur 1
Chromatogram voor bepaling van het aantal theoretische schotels (efficiëntie) en
het scheidend vermogen
De werkomstandigheden voor de analyse moeten zo worden gekozen
dat per meter kolom voor methylstearaat ten minste 2 000 theoretische
schotels en een scheidend vermogen van ten minste 1,25 worden
verkregen.
4.2.Analysemonster
Neem met de injectiespuit (3.2) 0,1 tot 2 µl van de oplossing van
methylesters die is bereid volgens bijlage X.B en injecteer die in de
kolom.
Bereid in het geval van esters die niet zijn opgelost, een oplossing van
ongeveer 100 mg/ml in heptaan voor chromatografische doeleinden en
injecteer 0,1 tot 1 µl.
Als de analyse betrekking heeft op componenten die slechts in spore-
hoeveelheden aanwezig zijn, mag het analysemonster (tot het
tienvoudige) worden vergroot.
4.3.Analyse
De meeste monsters kunnen bij de onder 4.1.1 beschreven werkomstan-
digheden worden geanalyseerd.
Er kan echter bij een lagere kolomtemperatuur worden gewerkt,
wanneer het een analyse betreft van vetzuren met minder dan 12 kool-1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 47
▼B
▼B
stofatomen, of bij een hogere temperatuur voor een analyse van
vetzuren met meer dan 20 koolstofatomen. Soms kan in beide gevallen
temperatuurprogrammering worden toegepast. Voorbeeld: injecteer,
indien het monster methylesters bevat van vetzuren met minder dan 12
koolstofatomen, het monster bij 100 ºC (of bij 50—60 ºC bij aanwezig-
heid van boterzuur) en programmeer dan direct naar de optimale
temperatuur met 4—8 ºC/minuut. In sommige gevallen mogen beide
werkwijzen worden gecombineerd.
Na de geprogrammeerde verwarming wordt de elutie isotherm voort-
gezet totdat alle componenten zijn geëlueerd. Als de gaschromatograaf
geen inrichting voor temperatuurprogrammering heeft, wordt aanbe-
volen bij twee verschillende temperaturen tussen 100 en 195 ºC te
analyseren.
Aanbevolen wordt zo nodig een analyse uit te voeren met twee statio-
naire fasen van verschillende polariteit om na te gaan dat er geen over
elkaar vallende pieken zijn, bij voorbeeld in het geval dat C18:3en C20:0of C18:3en geconjugeerd C18:2tegelijk voorkomen.
4.4.Referentiechromatogram en referentiegrafieken
Bepaal uit een analyse van het standaardmengsel (2.3) die onder
dezelfde omstandigheden wordt uitgevoerd als voor het onderzoek van
het monster, de retentietijden of retentieafstanden voor de samenstel-
lende vetzuren. Maak op semi-logaritmisch papier, voor een bepaalde
graad van onverzadigdheid, een grafiek door de logaritme van de reten-
tietijd of retentieafstand als functie van het aantal koolstofatomen uit te
zetten. Onder isotherme omstandigheden zullen voor esters met een
rechte keten en een bepaalde graad van onverzadigdheid de getekende
curven vrijwel evenwijdig lopende rechte lijnen zijn.
Het is noodzakelijk omstandigheden te vermijden die leiden tot over
elkaar vallende pieken, dat wil zeggen dat de resolutie onvoldoende is
om twee componenten te scheiden.
5. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN5.1.Kwalitatieve analyse
Identificeer de methylesterpieken van het analysemonster met behulp
van de volgens 4.4 gemaakte grafieken, zo nodig via interpolatie.
5.2.Kwantitatieve analyse
5.2.1. Bepaling van de samenstelling
Gebruik, behoudens uitzonderingen, de methode van de interne norma-
lisatie, dat wil zeggen ga er van uit dat alle componenten van het
monster ophet chromatogram worden weergegeven, zodat het totaal
van de oppervlakken onder de pieken 100 % weergeeft van de bestand-
delen (totale elutie).
Als de apparatuur voorzien is van een integrator, gebruik dan de
hiermee verkregen getallen. Als dat niet het geval is, bepaal dan het
oppervlak onder elke piek door middel van driehoeksmeting, dat wil
zeggen door vermenigvuldiging van de piekhoogte met de piekbreedte
ophalve hoogte, en houd, indien nodig, rekening met de verschillende
verzwakkerstanden tijdens het opnemen van het chromatogram.
5.2.2. Berekening
5.2.2.1. Algemeen te volgen methode
Bereken het gehalte van een bepaalde component i, uitgedrukt als een
massapercentage van de methylesters, door het percentage van het
oppervlak van de betrokken piek te bepalen ten opzichte van het totale
piekoppervlak, met de formule:
Ai
ΣA/C1100
waarin:
Ai= het oppervlak van de piek van component i;
ΣA = de som van de oppervlakken van alle pieken.
Geef het resultaat opmet één decimaal.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 48
▼B
Opmerking7: In dit algemene geval wordt het resultaat van de bereke-
ning op grond van de relatieve oppervlakken geacht de
massapercentages weer te geven. Zie punt 5.2.2.2 voor
de gevallen waarin dit niet mag worden aangenomen.
5.2.2.2. Gebruik van correctiefactoren
In bepaalde gevallen, met name bij aanwezigheid van vetzuren met
minder dan 8 koolstofatomen of van zuren met secundaire groepen en
indien een katharometer wordt gebruikt of wanneer zeer nauwkeurige
analyses nodig zijn, moeten correctiefactoren worden gebruikt om de
percentages van de piekoppervlakken om te rekenen in massapercen-
tages van de componenten.
Bepaal de correctiefactoren met behulp van een chromatogram dat is
verkregen via de analyse van een standaardmengsel van methylesters
waarvan de samenstelling nauwkeurig bekend is en die is uitgevoerdonder dezelfde omstandigheden als voor het onderzoek van het monster.
Voor het standaardmengsel wordt het percentage (m/m) van component
i berekend met de formule:
mi/C1100
Σm
waarin:
mi= de massa van component i in het standaardmengsel;
Σm = de som van de massa's van de verschillende componenten van
het standaardmengsel.
Bereken uit het chromatogram van het standaardmengsel (4.4) het
percentage (oppervlak/oppervlak) van component i op de volgende
wijze:
Ai/C1100
ΣA
waarin:
Ai= het oppervlak van de piek van component i;
ΣA = de som van de oppervlakken van alle pieken.
De correctiefactor wordt nu berekend als volgt:
Ki¼mi/C1ΣA
Ai/C1Σm
Gewoonlijk worden de correctiefactoren uitgedrukt in relatieve factoren
ten opzichte van de correctiefactor van KC16; de relatieve correctiefac-
toren zijn:
K0
i¼Ki
KC16
In het monster wordt het gehalte van een component i, uitgedrukt als
massapercentage van de methylesters, berekend via:
K0
i/C1Ai
ΣK0
i/C1Ai/C0/C1 /C1100
Geef de resultaten opmet één decimaal.
5.2.2.3. Gebruik van een interne standaard
In bepaalde gevallen (met name wanneer niet alle zuren worden
bepaald, zoals wanneer vetzuren met 4 en 6 koolstofatomen voorkomen
naast vetzuren met 18 en 19 koolstofatomen, of bij bepaling van de
absolute hoeveelheid van een vetzuur in een monster) moet een interne
standaard worden gebruikt. Daarvoor wordt vaak gebruik gemaakt van
C5,C15of C17. Dan moet de correctiefactor voor de interne standaard
worden bepaald.
Het percentage (m/m) van component i uitgedrukt in methylesters wordt
dan berekend met de formule:1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 49
▼B
ms/C1K0
i/C1Ai
m/C1K0
s/C1As/C1100
waarin:
Ai= het piekoppervlak van component i;
As= het piekoppervlak van de interne standaard;
K′i= de relatieve correctiefactor voor component i ten opzichte van
KC16;
K′s= de relatieve correctiefactor voor de interne standaard ten
opzichte van KC16;
m = de massa van het monster, in milligram;
ms= de massa van de interne standaard, in milligram.
Geef de resultaten opmet één decimaal.
6. BIJZONDERE SITUATIE: BEPALING VAN DE TRANS-ISOMEREN
Het is mogelijk om het percentage trans-isomeren in vetzuren met een
aantal koolstofatomen tussen 10 en 24 te bepalen via scheiding van de
methylesters door gebruik van capillaire kolommen met een bepaalde
polariteit.
6.1. Fused-silica capillaire kolom met een lengte van 50 m, inwendige
diameter van 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met cyaanpropilsiliconen
in een dikte van 0,1-0,3 µm (type SP 2340, type SP 2380, CP Sil 88,
Silor 10 of equivalent).
6.2. De methylesters worden bereid volgens werkwijze B van bijlage X.B.
De vetstoffen met een zuurtegraad hoger dan 3 % moeten eerst worden
geneutraliseerd overeenkomstig punt 6.1 van bijlage VII.
6.3. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden
dienen:
— kolomtemperatuur geprogrammeerd van 150 ºC — 230 ºC (b.v.
165 ºC gedurende 15 minuten vervolgens oplopend met 5º per
minuut tot 200 ºC);
— temperatuur van het injectiestuk: 250 ºC als het splitsysteem wordt
gebruikt of bij het kolominjectortype dezelfde begintemperatuur als
de kolom;
— temperatuur van de detector: 260 ºC;— debiet van het draaggas (helium of waterstof): 1,2 ml per minuut.
Injecteer een zodanige hoeveelheid dat bij de toegepaste gevoeligheid
de hoogte van de piek voor methylester van arachidezuur niet lager is
dan 20 % van de volle schaaluitslag.
6.4. De verschillende methylesters worden geïdentificeerd opbasis van de
retentietijden en door een vergelijking met standaardmengsels (zie
punt 2.3).
De esters van de trans-vetzuren worden geëlueerd voor de daarmee
corresponderende cis-isomeren. Fig. 2 geeft een voorbeeld van een
chromatogram.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 50
▼M2
▼M2
Figuur 2
Gaschromatogram van de bepaling van trans-isomeren van vetzuren, met
gebruikmaking van een capillaire kolom
6.5. De efficiëntie van de kolom, zoals bepaald overeenkomstig 4.1.2 moet
scheiding van een aantal kritische koppels geven, zoals b.v. het koppel
van de trans-iso-oliezuren en de piek van oliezuur, trans C 18: 1/cis C
18: 1, met een resolutiefactor van meer dan 2.
6.6. Het percentage van de afzonderlijke trans-vetzuren wordt berekend aan
de hand van de verhouding tussen het oppervlak van de betrokken piek
ten opzichte van het totale piekoppervlak.
De in aanmerking te nemen percentages zijn die van de volgende zuren:
— trans-octadeceenzuren (T 18: 1), in bijlage I van deze verordening
aangeduid als het totaal van de isomeren van trans-oliezuren;
— cis-trans- en trans-cis-octadecadieeenzuren [CT + TC) 18:2 ], in
bijlage I van deze verordening aangeduid als het totaal van de
isomeren van trans-linolzuren;
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis, trans-cis-cis-octadeca-
trieenzuren [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3], in bijlage I van
deze verordening aangeduid als het totaal van de isomeren van
trans-linoleenzuren.
Opmerking8: Gelet opde bijzondere kenmerken van deze methode,
moeten de resultaten worden opgetekend met twee deci-
malen.
►M27.◄BIJZONDERE SITUATIE — GEBRUIK VAN EEN KATHARO-
METER (REAGEREND OP VERSCHILLEN IN
WARMTEGELEIDING)
Voor de bepaling van de kwalitieve en kwantitatieve samenstelling van
een mengsel van methylesters van vetzuren mag ook een warmtegelei-
dingsdetector (katharometer) worden gebruikt.
De in de punten 3 en 5 vernielde aanwijzingen moeten dan worden
aangepast zoals vermeld in tabel 3.
Voor kwantitatieve analyse moeten de in punt 5.2.2.2 gedefinieerde
correctiefactoren worden gebruikt.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 51
▼B
▼B
Tabel3
Variabele Waarde/voorwaarde
Kolom Lengte: 2—4 m
Inwendige diameter: 4 mm
Drager Korrelgrootte tussen 160 en
200 µm
Bedekkingsgraad 15 % (m/m) — 25 % (m/m)
Draaggas Helium of, indien niet voor-
handen, waterstof met een zo laag
mogelijk zuurstofgehalte
Hulpgassen Geen
Temperatuur van het injectiestuk 40 tot 60 ºC boven de kolomtem-
peratuur
Kolomtemperatuur Tussen 180 en 200 ºC
Debiet van het draaggas Tussen 60 en 80 ml/minuut
Geïnjecteerde hoeveelheden Tussen 0,5 en 2 µl
►M28.◄VERSLAG
Vermeld in het verslag de resultaten en de methoden die zijn gebruikt
voor de bereiding van de methylesters en de gaschromatografische
analyse. Vermeld tevens details bij de uitvoering die niet in deze inter-
nationale norm zijn aangegeven of die als optioneel worden beschouwd,
en voorts bijzonderheden die waarschijnlijk van invloed zijn geweest op
de resultaten.
Geef in het verslag alle gegevens die nodig zijn voor de volledige iden-
tificatie van het monster.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 52
▼B
BIJLAGEX.B
BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN OVEREEN-
KOMSTIG BIJLAGE VI, PUNTEN I EN II, VAN VERORDENING
(EEG) Nr. 72/77 OF VOLGENS DE HIERONDER BESCHREVEN
METHODE
OPMERKING VOORAF
De te volgen werkwijze moet worden gekozen opgrond van de zuursamen-
stelling en de zuurtegraad van de te onderzoeken vetstof en van de uit te
voeren gaschromatografie.
Voor
— vetstoffen met vetzuren met minder dan 12 koolstofatomen kunnen
uitsluitend de werkwijzen met een gesloten buisje of met dimethylsul-
faat worden gebruikt;
— vetstoffen met een zuurtegraad hoger dan 3 % kunnen uitsluitend de
werkwijzen worden gebruikt met methanol-zoutzuur of dimethylsulfaat;
— gaschromatografische bepalingen van transisomeren kunnen uitsluitend
de werkwijzen worden gebruikt met natriummethoxide of dimethylsul-
faat;
— de bereiding van methylesters van kleine hoeveelheden vetstoffen voor
scheidingen door dunne-laagchromatografie mag alleen de werkwijze
met methanol-hexaan-zwavelzuur worden gebruikt.
Er behoeft geen rekening te worden gehouden met onverzeepte bestand-
delen, voor zover het gehalte daaraan niet meer bedraagt dan 3 %, anders
moeten de methylesters worden bereid uit de vetzuren.
1. ONDERWERP
Deze norm beschrijft de vijf werkwijzen voor de bereiding van methyles-
ters van vetstoffen:
a) met natriummethoxide,
b) met natriummethoxide in een gesloten buisje,
c) met methanol-zoutzuur in een gesloten buisje,
d) met dimethylsulfaat,
e) met methanol-hexaan-zwavelzuur.
Werkwijze A
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De te onderzoeken vetstof wordt verwarmd onder reflux met methylalcohol
en natriummethoxide. De methylesters worden geëxtraheerd met ethylal-
cohol.
3. APPARATUUR
3.1. Rondbodemkolf van 100 ml voorzien van een refluxkoeler, met aan de
bovenkant een buis met daarin een mengsel van CaO en NaOH en slijp-
stukken.
3.2. Maatcilinders van 50 ml.
3.3. Maatpipetten van 5 ml, met schaalindeling in 0,1 ml.
3.4. Scheitrechters van 250 ml.3.5. Rondbodemkolf van 200 ml.
4. REAGENTIA
4.1. Watervrij methanol.
4.2. Natriummethoxide, oplossing van ongeveer 1 % in methanol. De oplossing
wordt bereid door 0,34 g metallisch natrium opte lossen in 100 ml water-
vrij methanol.
4.3. Ethylether.4.4. Natriumchloride, 10 % oplossing.4.5. Petroleumether, kooktraject 40—60 ºC.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 53
▼B
5. WERKWIJZE
5.1. Breng 2 g vetstof die tevoren is gedroogd over natriumsulfaat en die is
gefiltreerd, in de rondbodemkolf van 100 ml. Voeg 35 ml methanol toe,
bevestig de koeler en laat enkele minuten koken onder reflux.
5.2. Onderbreek het verhitten, maak de koeler los en voeg snel 3,5 ml natrium-
methoxideoplossing toe; bevestig de refluxkoeler opnieuw en laat minstens
3 uren koken onder reflux. De methylering is compleet, wanneer alle
vetstof is opgelost en het reactiemengsel bij omgevingstemperatuur
volstrekt helder is.
5.3. Laat afkoelen en giet het reactiemengsel in een scheitrechter van 250 ml,
voeg 35—40 ml ethylether, 100 ml water en 5—6 ml 10 % natriumchlori-
deoplossing toe. Schud en laat de fasen scheiden; de waterige laag wordt
overgebracht in een tweede scheitrechter en opnieuw geëxtraheerd met
25 ml ethylether.
Aan de verzamelde etherextracten wordt 50 ml petroleumether, kooktraject
40—60 ºC, toegevoegd: hierdoor scheidt het water zich af, waarna het
wordt verwijderd.
Was de etherextracten driemaal met 10—15 ml water; droog over watervrij
natriumsulfaat en filtreer door een vouwfilter en vang het filtraat opin de
rondbodemkolf van 200 ml.
Distilleer het oplosmiddel en verdrijf dit volledig met behulp van een
waterbad door een stroom van zuivere stikstof over het vloeistofoppervlak
te leiden.
Werkwijze B
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De te onderzoeken vetstof wordt behandeld met natriummethoxide in een
methanoloplossing, in een gesloten buisje, bij 85—90 ºC.
3. APPARATUUR
3.1. Dikwandige glazen ampul van ongeveer 5 ml (hoogte 40 tot 45 mm,
diameter 14 tot 16 mm).
3.2. Maatpipet van 1 ml, met schaalindeling in 0,1 ml.
4. REAGENTIA
4.1. Natriummethoxide, oplossing van ongeveer 1,5 % in methanol. De oplos-
sing wordt bereid door 0,50 g metallisch natrium opte lossen in 100 ml
watervrij methanol.
5. WERKWIJZE
5.1. Breng in de glazen ampul 2 g vetstof die tevoren is gedroogd over natrium-
sulfaat en die is gefiltreerd. Voeg 0,3 g (ongeveer 0,4 ml) van de oplossing
van natriummethoxide toe en smelt de ampul dicht.
5.2. Leg de ampul gedurende twee uur in een waterbad bij 85—90 ºC en schud
van tijd tot tijd; de verestering is volledig als de inhoud van de ampul na
bezinking van de glycerine en van het residu van de reagentia helder is.
5.3. Koel af tot omgevingstemperatuur. Open de ampul op het tijdstip dat de
methylesters worden gebruikt. De methylesters behoeven niet verder te
worden behandeld vóór ze in de gaschromatograaf worden gebracht.
Werkwijze C
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De te onderzoeken vetstof wordt behandeld met methanol-zoutzuur, in een
gesloten ampul bij 100 ºC.
3. APPARATUUR
3.1. Dikwandige glazen ampul van ongeveer 5 ml (hoogte 40 tot 45 mm,
diameter 14 tot 16 mm).
3.2. Geijkte pipetten van 1 en 2 ml.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 54
▼B
4. REAGENTIA
4.1. Zoutzuur-methanoloplossing van 2 %. De oplossing wordt bereid met
gasvormig zoutzuur en watervrij methanol (zie opmerking 1, werkwijze E).
4.2. Hexaan voor gaschromatografie.
5. WERKWIJZE
5.1. Breng 2 g vetstof dat tevoren is gedroogd over natriumsulfaat en dat is
gefiltreerd, alsmede 2 ml van de zoutzuur-methanoloplossing in de glazen
ampul. Smelt de ampul dicht.
5.2. Leg de ampul 40 minuten in een waterbad bij 100 ºC.
5.3. Koel de ampul af onder stromend water, open hem, en voeg 2 ml gedistil-
leerd water en 1 ml hexaan toe. Centrifugeer en neem de hexaanfase, die
klaar is voor gebruik.
Werkwijze D
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De te onderzoeken vetstof wordt verzeept met een methanolische kalium-
hydroxideoplossing en vervolgens behandeld met dimethylsulfaat. Na
toevoeging van zoutzuur volgt spontane afscheiding van de gevormde
methylesthers. Door vervolgens te behandelen met aluminiumoxide,
worden methylesters van hoge zuiverheid verkregen.
3. APPARATUUR
3.1. Dikwandige glazen centrifugebuis van ongeveer 20 ml, met slijpstuk (10/
19) en veiligheidsklemmen.
3.2. Refluxkoelers met 5 bollen en slijpstuk (10/19).
3.3. Glazen filters G 2 met een diameter van ongeveer 20 mm.
3.4. Glazen, konisch afgeronde centrifugebuisjes van ongeveer 10 ml.
3.5. Injectiespuiten van 1 en 5 ml.
4. REAGENTIA
4.1. Kaliumhydroxide, oplossing van 10 % in methylalcohol, voor gaschromato-
grafische doeleiden.
4.2. Broomkresolgroen-indicator: oplossing van 0,05 % in methylalcohol.
4.3. Dimethylsulfaat (dichtheid 1,335 bij 15 ºC).
4.4. Geconcentreerd zoutzuur, dichtheid 1,19 verdund 1: 1 met methylalcohol
voor gaschromatografische doeleinden.
4.5. Aluminiumoxide, gestandaardiseerd volgens Brockmann, voor adsorptie-
chromatografie.
5. WERKWIJZE
5.1. Breng in het reageerbuisje van 20 ml 2 g (ongeveer 2,2 ml) vetstof die
tevoren is gedroogd over natriumsulfaat en die is gefiltreerd; voeg 5 ml
van de kaliumhydroxideoplossing en enkele kooksteentjes toe. Bevestig de
refluxkoeler en verhit langzaam gedurende 5 minuten onder schudden: de
verzeping is volledig, wanneer de oplossing helder is. Koel vervolgens af
onder stromend water en verwijder de refluxkoeler.
5.2. Voeg 2 druppels van de indicator toe en breng, met de injectiespuit, lang-
zaam 1 ml dimethylsulfaat in de reageerbuis. Sluit de reageerbuis
hermetisch en schud 2 à 3 minuten, en dompel de onderkant van de
reageerbuis frequent in een kokend-waterbad: de reactie is voltooid
wanneer de indicator van blauw omslaat in geel. Koel de reageerbuis
vervolgens af onder stromend water, open de buis en voeg 5 ml toe van
de methanolische zoutzuuroplossing.
5.3. Plaats de reageerbuis, na enkele seconden schudden, in een schuine stand
en tik vervolgens zachtjes opde buis, waardoor bevorderd wordt dat de
methylesters in de vorm van een olieachtige massa aan de oppervlakte
komen (zie opmerking A).
Zuig de methylesters af met de injectiespuit en breng ze in een konisch
afgeronde centrifugebuis; voeg een hoeveelheid aluminiumoxide toe van1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 55
▼B
ongeveer één vierde van het volume van de methylesters; schud en filtreer
door een vouwfilter.
OpmerkingA: Als er geen spontane afscheiding is van de methylesters,
5 ml water in de centrifugebuis toevoegen en schudden.
Werkwijze E
2. PRINCIPE VAN DE METHODE
De te onderzoeken vetstof wordt onder reflux verhit met methanol-hexaan-
zwafelzuur. De methylesters worden geëxtraheerd met petroleumether.
3. APPARATUUR
3.1. Buis van ongeveer 20 ml, voorzien van luchtrefluxkoeler, met een lengte
van ongeveer 1 m, en slijpstukken.
3.2. Geijkte pipet van 5 ml.3.3. Scheitrechter van 50 ml.
3.4. Maatcilinders van 10 en 25 ml.
3.5. Konisch afgeronde buis van 15 ml.
4. REAGENTIA
4.1. Reagens voor methylering: watervrij methanol-hexaan-geconcentreerd
zwavelzuur (dichtheid 1,84) in de verhouding 75:25:1 (v/v/v).
4.2. Petroleumether, kooktraject 40—60 ºC.
4.3. Watervrij natriumsulfaat.
5. WERKWIJZE
5.1. Breng de stof die afkomstig is van de plaat in de buis van 20 ml en voeg
5 ml methyleringsreagens toe.
5.2. Bevestig de refluxkoeler en verhit gedurende 30 minuten in een kokend-
waterbad (zie opmerking 2).
5.3. Breng het mengsel kwantitatief over in een scheitrechter van 50 ml, met
10 ml gedistilleerd water en 10 ml petroleumether. Schud krachtig, laat de
fasen scheiden, tapde waterige laag af en was de etherlaag tweemaal met
20 ml gedistilleerd water. Voeg in de scheitrechter een kleine hoeveelheid
watervrij natriumsulfaat toe, schuld, laat enkele minuten rusten en filtreer;
vang het filtraat opin een konisch afgeronde buis van 15 ml.
Verdrijf het oplosmiddel met behulp van een kokend-waterbad door een
stikstofstroom over het vloeistofoppervlak te leiden.
Opmerking1: Kleine hoeveelheden gasvormig zoutzuur kunnen gemakke-
lijk worden bereid in het laboratorium door eenvoudig aan
de commerciële oplossing (p = 1,84) geconcentreerd zwavel-
zuur (p = 1,18) toe te druppelen. Het vrijgemaakte gas kan
eenvoudig worden gedroogd door het door geconcentreerd
zwavelzuur te leiden. Aangezien zoutzuur zeer gemakkelijk
worden geabsorbeerd door methanol, wordt geadviseerd de
gebruikelijke voorzorgen in acht te nemen bij het oplossen;
bij voorbeeld: leid het gas via een omgekeerde trechter
waarvan de rand net de oppervlakte van de vloeistof raakt.
Grote hoeveelheden methanolische zoutzuuroplossingen
kunnen van tevoren worden gemaakt, aangezien deze oplos-
sing uitstekend kan worden bewaard in flessen met glazen
stoppen, die in het donker worden opgeslagen.
Opmerking2: Plaats, om kookvertraging te voorkomen, een glazen staafje
in het buisje en laat de temperatuur van het kokend-
waterbad niet boven 90 ºC stijgen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 56
▼B
BIJLAGEXI
BEPALING VAN HET GEHALTE AAN GEHALOGENEERDE OPLOS-
MIDDELEN
1. BEGINSEL
Gaschromatografische bepaling met behulp van de head-space techniek.
2. APPARATUUR
2.1. Gaschromatograaf, voorzien van een electron capture detector (ECD).
2.2. Instrumentatie voor head-space gaschromatografie.2.3. Glazen gaschromatografiekolom met een lengte van 2 m en een diameter
van 2 mm, stationaire fase.
OV101 10 % gelijkwaardig, opgecalcineerde, met zuur gewassen en gesi-
laniseerde diatomeeënaarde met korrelgrootte 80—100 Mesh.
2.4. Draaggas en hulpgas: stikstof voor gaschromatografie, geschikt voor elec-
tron capture detection.
2.5. Glazen flesjes van 10 tot 15 ml, bekleed met teflon en voorzien van een
stopvan aluminium met een op ening voor het inbrengen van een injectie-
spuitje.
2.6. Klemmen voor hermetische sluiting.2.7. Gasinjectiespuitje van 0,5 tot 2 ml.
3. REAGENTIA
Standaard: gehalogeneerde oplosmiddelen met een voor gaschromatografie
adequate zuiverheidsgraad.
4. WERKWIJZE
4.1. Weeg een nauwkeurig bepaalde hoeveelheid van ongeveer 3 g olie af in
een glazen flesje (dat achteraf niet meer mag worden gebruikt) en sluit
het flesje met de stophermetisch af. Het flesje bij 70 ºC gedurende een
uur in eén thermostaat plaatsen. Neem uit de gasruimte met de injectiespuit
0,2 tot 0,5 ml op. Injecteer in de kolom van de als volgt ingestelde gaschro-
matograaf:
— temperatuur injector: 150 ºC;
— temperatuur kolom: 70—80 ºC;— temperatuur detector: 200—250 ºC.
Eventueel mag opandere temp eraturen worden ingesteld, opvoorwaarde
dat de resultaten gelijkwaardig zijn.
4.2. Referentieoplossingen. Maak standaardoplossingen aan met geraffineerde
olijfolie zonder sporen van oplosmiddelen en met verschillende concentra-
ties van gehalogeneerde oplosmiddelen tussen 0,05 en 1 ppm,
overeenkomstig het veronderstelde gehalte van het monster. Gebruikpentaan voor eventuele verdunning.
4.3. Kwantitatieve evaluatie. Bepaal de verhouding tussen de oppervlakten of de
hoogten van de pieken van het monster en de standaardoplossing waarvan
de concentratie verondersteld wordt het dichtst bij die van het monster te
liggen. Als de relatieve afwijking groter is dan 10 % moet de analyse
worden overgedaan door verrijking met een nieuwe standaardoplossing, en
dit totdat de concentratie niet meer dan 10 % afwijkt. Het gehalte wordt
bepaald op basis van een gemiddelde van elementaire injecties.
4.4. Weergave van de resultaten. De resultaten worden uitgedrukt in mg/kg
(ppm). De detectiegrens van de methode is 0,01 mg/kg.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 57
▼B
BIJLAGEXII
ORGANOLEPTISCHE BEOORDELING VAN OLIJFOLIE VAN EERSTE
PERSING
1. DOEL
Deze methode beschrijft de criteria voor de beoordeling van de
kenmerken van olijfolie van eerste persing en de daarbij te volgen metho-
diek.
2. TOEPASSINGSGEBIED
De beschreven methode geldt slechts voor organoleptische beoordeling en
indeling van olijfolie van eerste persing voor rechtstreekse consumptie.
De methode houdt slechts in dat de olijfolie van eerste persing op grond
van de beoordeling van een geselecteerd panel wordt ingedeeld volgenseen numerieke waardeschaal die in verband wordt gebracht met de waar-
neming van de stimuli die uitgaan van de flavour van de betrokken olie.
3. BASISTERMINOLOGIE SENSORISCHE ONDERZOEKEN
Zie verderopin deze bijlage het hoofdstuk „Sensorisch onderzoek: basis-
terminologie”.
4. SPECIFIEKE TERMINOLOGIE VOOR OLIJFOLIE
4.1. Aangename gewaarwording, opgewekt door de karakteristieke kwaliteits-
kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie:
Fruitigheid: flavour die doet denken aan de geur en de smaak van de
gezonde en verse vrucht die in het optimale rijpheidsstadium is geoogst;
Overrijpe olijven: flavour van olijfolie uit rijpe vruchten, over het alge-
meen met een vervaagde geur en een zoete smaak;
Onrijpeolijven: flavour van olijfolie uit onrijpe vruchten.
4.2. Gewaarwording die in meerdere of mindere mate aangenaam is naar
gelang van de intensiteit van de waarneming, en die niet als gebrek
moet worden aangemerkt maar die wel de harmonie van de fruitigheid
beïnvloedt:
Appel:flavour van olijfolie die aan die vrucht doet denken;
Zacht:aangename smaak van de olie, niet uitgesproken zoet, maar
waarbij bitterheid, adstringentie en scherpte niet domineren;
Gras:kenmerkende flavour van sommige soorten olijfolie die doet
denken aan die van vers gemaaid gras;
Groenebladeren(bitter): flavour van olijfolie uit te onrijpe olijven of uit
een olijvenmassa die is verkregen door het vermalen van olijven waarbij
ook bladeren en takjes zaten;
Bitter:kenmerkende smaak van olijfolie die is vervaardigd uit onrijpe of
rijpende olijven. Deze smaak is meer of minder aangenaam naargelang
van de intensiteit;
Wrang:kenmerkende gewaarwording bij bepaalde soorten olijfolie die bij
het proeven een kinetesische adstringentiereactie veroorzaken;
Scherp:branderige smaakgewaarwording die kenmerkend is voor aan het
begin van het verkoopseizoen, vooral uit onrijpe olijven geproduceerde
olie. Zij wordt veroorzaakt door de werking van fenolen opde overal in
de mondholte verspreid liggende uiteinden van de drielingszenuw;
Amandel: deze flavour kan voorkomen optwee verschillende manieren:
de ene is typisch voor de verse amandel, de andere voor de gedroogde
amandel van gezonde kwaliteit, en kan worden verward met een begin
van ranzigheid. Er wordt een specifieke nasmaak waargenomen wanneer
de olie in contact blijft met de tong en het gehemelte. Deze flavour komt
voor bij zachte olijfolie waarvan de geur vervaagd is;
Vlak of vervaagd: flavour van olijfolie waarvan de organoleptische
kenmerken zeer zwak zijn als gevolg van het verlies van de aromatisch
bestanddelen;
Hooi:kenmerkende flavour die doet denken aan die van min of meer
gedroogd gras.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 58
▼M3
▼M3
4.3. Gewaarwording die steeds onaangenaam is, zelfs bij nauwelijks waar-
neembare intensiteit, en die als organoleptisch gebrek moet worden
aangemerkt:
Esparto: kenmerkende flavour van olijven die zijn geperst in nieuwe
persmanden van esparto. De flavour kan verschillen naar gelang de pers-
manden uit ongedroogd of gedroogd esparto zijn gemaakt;
Grond:kenmerkende flavour van olie uit olijven waaraan grond of
modder zat en die niet zijn gewassen. In sommige gevallen kan tegelijk
een schimmelflavour voorkomen;
Oud:kenmerkende flavour van olie die te lang in recipiënten in opslag-
plaatsen is gebleven. Deze flavour kan ook voorkomen bij olie die al te
lang in de verpakking zit;
Wormstekig: kenmerkende flavour van olie uit olijven die sterk te lijden
hebben gehad onder larven van de olijfvlieg (Dacus Oleae);
Metaal:flavour die doet denken aan metaal. Kenmerkend voor olie die
tijdens het malen, het mengen, het persen of de opslag, op onjuiste wijze,
lang in contact geweest met levensmiddelen of met metalen opper-
vlakken;
Schimmel, vochtigheid: kenmerkende flavour van olijfolie uit olijven
waaropschimmels zijn gegroeid doordat de vruchten enkele dagen bij
vochtige omstandigheden in hopen zijn blijven liggen;
Ranzig:kenmerkende flavour van alle oliën en vetten waarbij zich auto-
oxidatie heeft voorgedaan als gevolg van langdurige blootstelling aan de
lucht. Deze flavour is onaangenaam en definitief;
Olijvengisting: kenmerkende flavour van olie uit tijdens opslag in hopen
sterk gegiste olijven;
Pekel:flavour van olie uit olijven die zijn bewaard in pekel;
Afvallen van olijven: kenmerkende flavour die doet denken aan de
flavour van afvallen (schroot) van koudgeperste olijven;
Zeepsmaak: flavour waarbij een geur en smaak wordt waargenomen die
doet denken aan groene zeep;
Vruchtwaterflavour: kenmerkende flavour als gevolg van slecht decan-
teren en langdurig contact met vruchtwater;
Wijnachtig-azijn: Kenmerkende flavour van sommige oliën die doet
denken aan wijn of azijn. Deze flavour is hoofdzakelijk te wijten aan de
vorming van azijnzuur, ethylacetaat en ethanol in grotere hoeveelheden
dan normaal is in het aroma van olijfolie;
Komkommer: flavour die ontstaat bij zeer lange hermetische bewaring
met name in blikken, en die wordt toegeschreven aan het onstaan van 2-
6 nonadienal;
Gekookt of verbrand: kenmerkende flavour van olie die wordt veroor-
zaakt door te sterke en/of te lange verwarming tijdens de produktie en
met name bij het mengen van de massa olijvenvruchtvlees onder verwar-
ming daarvan, als een en ander niet goed gebeurt;
Droesem: kenmerkende flavour van olie die is gerecupereerd uit droesem
in tanks en bakken;
Manden: kenmerkende flavour van olie uit olijven die zijn geperst in
manden die vuil zijn van gegiste residuen;
Smeermiddelen: geur van olijfolie uit een fabriek waarin bij de machines
residuen van petroleum, vet of minerale olie niet goed zijn verwijderd;
Robuust: kenmerkende perceptie van sommige soorten olijfolie, die bij
het proeven in de mond een gevoel van dichtheid en kleverigheid veroor-
zaken.
5. PROEFGLAS VOOR OLIJFOLIE
Zie verderopin deze bijlage het hoofdstuk „Proefglas voor olijfolie”.
6. TESTRUIMTE
Zie verderopin deze bijlage het hoofdstuk „Aanwijzingen voor de inrich-
ting van een lokaal voor sensorisch onderzoek”.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 59
▼B
▼B
7. BENODIGDHEDEN
In iedere cabine dient binnen handbereik van het pannellid alles aanwezig
te zijn wat nodig is om hem in staat te stellen zijn taak goed te vervullen,
dat wil zeggen:
— Glazen (genormaliseerd) met de monsters en voorzien van een code in
twee willekeurige cijfers of in een cijfer en een letter. De codes
dienen onuitwisbaar en reukloos te zijn en moeten met potlood
worden aangebracht.
— Horlogeglaasjes met dezelfde codes, waarmee de glazen kunnen
worden afgedekt.
— Beoordelingsformulier (zie figuur 2) met de aanwijzingen voor het
gebruik.
— Potlood of balpen.— Bordjes met schijfjes appel.— Een glas water opomgevingstemp eratuur.
8. METHODIEK
In dit punt wordt aangegeven wat de panelleden reeds dienen te weten
vóór het sensorisch onderzoek van olijfolie van eerste persing en wordt
verder gestreefd naar normalisatie van de werkwijze van de panelleden,
die zowel kennis moeten nemen van de aanbevelingen van algemene
aard als van de specifieke aanbevelingen voor het proeven van olijfolie.
8.1.Taak van de organisator
De organisator van het panel dient een voldoende gevormd persoon te
zijn die tevens een kenner en deskundige is inzake alle soorten olijfolie
waarmee hij bij zijn werk te maken heeft. Hij is de spil van het panel
en verantwoordelijk voor de organisatie en het functioneren daarvan. Hij
dient de panelleden tijdig genoeg bijeen te roepen en moet alle onzeker-
heid over de tests wegnemen, maar dient zich daarbij te onthouden van
suggesties over de monsters.
Hij is verantwoordelijk voor de inventarisatie van de benodigheden, voor
de netheid daarvan, voor de voorbereiding en codering van de monsters,
en voor de aanbieding daarvan aan de panelleden in de adequate volg-
orde; ook is hij verantwoordelijk voor het verzamelen en voor de
statistische verwerking van de gegevens, opdat met de minste inspanning
de beste resultaten worden bereikt.
Het werk van de organisator vergt sensorische bekwaamheid, nauwgezet-
heid bij de voorbereiding en de uitvoering van de tests, alsmede
organisatievermogen en geduld voor de planning en de uitvoering van
de tests. De organisator heeft voorts tot taak de leden van het panel te
stimuleren door belangstelling, nieuwsgierigheid en de wedijver te bevor-
deren. Hij moet vermijden dat zijn standpunt bekend is en beletten dat de
criteria van mogelijke leiders worden opgedrongen aan de andere panel-
leden. Voorts dient hij te zorgen voor training en selectie van de
panelleden en voor de controle om ervoor te zorgen dat zij van voldoende
niveau blijven.
8.2.Uitvoering van de test
8.2.1. Grootte van het monster
Ieder glas moet 15 ml olijfolie bevatten.
8.2.2. Temperatuur van het monster
De te proeven olijfoliemonsters moeten in de glazen op een temperatuur
van 28 ºC ± 2 ºC worden gehouden. Deze temperatuur is gekozen, omdat
het, binnen het normale temperauurbereik waarbij olijfolie als toeberei-
dingsmiddel wordt gebruikt, de temperatuur is waarbij de
organoleptische verschillen het gemakkelijkst worden waargenomen. Een
andere reden voor de keuze van deze temperatuur is dat er bij erg lage
temperaturen een geringe vervluchtiging van de aromatische compo-
nenten is, terwijl erg hoge leiden tot een vervluchtiging van
componenten die eigen zijn aan verhitte olie.
8.2.3. Tijdstipvan de tests
De morgenuren zijn het meest geschikt voor het proeven van de olijfolie.
Het is bewezen dat er in de loop van de dag optimale perioden zijn voor
het waarnemen van smaak en geur.
Juist vóór de maaltijden neemt de gevoeligheid voor geur en smaak toe,
terwijl juist daarna die gevoeligheid afneemt.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 60
▼B
Dit criterium mag echter niet worden doorgedreven, tot het punt waarop
honger de panelleden afleidt en hun onderscheidingsvermogen, en met
name hun criteria inzake preferentie en acceptatie, aantast.
9. PANELLEDEN (PROEVERS)
De panelleden bij organoleptische tests van olijfolie voor consumptie
moeten getraind zijn en gekozen worden opgrond van hun vermogen
om gelijkaardige monsters van elkaar te onderscheiden; niet vergeten
mag worden dat de precisie door training wordt verbeterd (zie punt 9.5).
Voor iedere test zijn acht à twaalf panelleden nodig, maar het is
verstandig om enkele panelleden in reserve te houden in verband met
eventuele absenties.
9.1.Algemene gedragsregels voor kandidaten en panelleden
De kandidaten en de panelleden dienen zich aan de volgende aanbeve-
lingen te houden.
Wanneer een panellid door de organisator wordt opgeroepen om deel te
nemen aan een organoleptische test, moet hij ervoor zorgen dat hij op
de aangegeven tijdstippen kan meewerken en dient hij de volgende regels
in acht te nemen:
9.1.1. Uiterlijk vanaf 30 minuten vóór het tijdstipdat voor de test is vastgesteld,
niet roken.
9.1.2. Geen parfum, cosmetica of zeep gebruiken waarvan de geur bij de test
nog waarneembaar zou kunnen zijn. De handen moeten worden gewassen
met ongeparfumeerde of nauwelijks geparfumeerde zeep, vervolgens zo
vaak als nodig is worden afgespoeld en gedroogd om iedere geur van de
zeepte doen verdwijnen.
9.1.3. Ten minste het laatste uur voor de test niets eten.9.1.4. Als het panellid zich fysiek niet goed voelt, met name op het punt van
geur- of smaakwaarneming, of bij psychologische omstandigheden die
concentratie onmogelijk maken, dient hij de organisator in te lichten,
opdat deze hem niet laat deelnemen of de nodige beslissingen neemt
rekening houdende met het feit dat de beoordeling van dat panellid zal
kunnen afwijken van de gemiddelde waarde van de rest van het panel.
9.1.5. Als het panellid aan bovengenoemde regels voldoet, dient hij zich zo
ordelijk en stil mogelijk in de hem toegewezen cabine te installeren.
9.1.6. Nadat het panellid in de cabine heeft plaatsgenomen, dient hij na te gaan
of alle benodigdheden goed gerangschikt en in orde zijn en of de code-
ring opelk glas in overeenstemming is met de codering ophet
horlogeglaasje waarmee dat glas is afgedekt.
9.1.7. Het panellid dient de aanwijzingen op het beoordelingsformulier
aandachtig te lezen en pas met de test van het monster te beginnen
wanneer hij absoluut geen twijfel meer heeft over zijn taak en de wijze
waaropdie moet worden uitgevoerd. Bij twijfel dient het p anellid zich
te wenden tot de organisator en de moeilijkheden met hem persoonlijk
te bespreken.
9.1.8. Het panellid neemt het glas, met daarop nog het horlogeglaasje, vervol-
gens houdt hij het iets schuin en maakt een draaiende beweging met hetglas zodat een zo groot mogelijk gedeelte van de binnenkant bevochtigd
wordt. Vervolgens neemt hij het horlogeglaasje van het glas en moet hij
de geur van het monster een aantal malen zacht, langzaam en intens
opsnuiven totdat hij een oordeel heeft over het betrokken monster. Dit
ruiken dient niet langer te duren dan 30 seconden. Als het panellid in
die periode niet tot een conclusie is gekomen, moet hij even onderbreken
alvorens opnieuw te beginnen. Zodra de geurtest is beëindigd, wordt de
flavour (het totaal van de gewaarwordingen ophet gebied van geur,
smaak en mondgevoel) beoordeeld. Daartoe wordt een slokje, ongeveer
3 ml, olijfolie genomen. Het is van zeer groot belang dat de olijfolie
door de hele mondholte wordt verspreid, dat wil zeggen vanaf de voor-
kant van de mond en de tong, via de zijkanten en het achterste gedeelte
van de tong tot het gehemelte; zoals bekend worden de vier elementaire
smaken (zoet, zout, zuur en bitter) immers met een verschillende intensi-
teit waargenomen naar gelang van de verschillende zones van de tong en
van het gehemelte.
Er dient met nadruk opte worden gewezen dat het noodzakelijk is dat
voldoende olijfolie zeer langzaam over het achterste gedeelte van de
tong tot het gehemelte en de keel wordt verspreid, waarbij de aandacht
moet worden geconcentreerd opde volgorde waarin bitterheid en scherp te1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 61
▼B
worden waargenomen; als deze methode niet wordt gevolgd kunnen bij
bepaalde soorten olijfolie deze twee stimuli onopgemerkt blijven of kan
de bitterheid worden gemaskeerd door de scherpte.
Door korte opeenvolgende inademingen via de mond kan er niet alleen
voor worden gezorgd dat het monster zich in de hele mondholte
verspreid, maar dat retronasaal de vluchtige aromatische componenten
worden waargenomen.
Er moet ook rekening worden gehouden met het mondgevoel. Fluïditeit,
kleverigheid en prikkeling of branderigheid moeten worden genoteerd,
zodra ze worden opgemerkt, met vermelding van de intensiteit als dat
bij de test wordt gevraagd.
9.1.9. De organoleptische beoordeling van olijfolie van eerste persing moet
worden uitgevoerd met één enkel monster per testronde, ten einde het
contrast-effect te vermijden dat bij onmiddellijk proeven van andere
monsters zou kunnen ontstaan.
Aangezien bij opeenvolgende tests vermoeidheid of verlies van waarne-
mingsscherpte optreedt, moet een produkt worden gebruikt waarmee de
resten van olijfolie van de juist verrichte test uit de mond kunnen worden
verwijderd.
Aanbevolen wordt om een stukje appel van ongeveer 15 g te gebruiken
dat na kauwen in de spuwbak kan worden gegooid. Vervolgens dient de
mond te worden gespoeld met een beetje water op omgevingstempera-
tuur. Minstens 15 minuten wachten voor de volgende test.
9.2.Voorselectie van de kandidaten
De organisator dient via persoonlijke gesprekken een voorselectie uit te
voeren om de persoonlijkheid en andere omstandigheden van de kandi-
daten te kennen. De fysiologische en psychologische voorwaarden
waaraan de kandidaten moeten voldoen zijn niet erg scherp, aangezien
in principe iedere normale persoon dit soort proeven kan uitvoeren. Leef-
tijd, geslacht, bepaalde gewoonten (roken), enz., worden van minder
belang geacht dan andere aspecten, zoals de gezondheid, de persoonlijke
interesse en het feit of iemand tijd heeft voor dit werk.
Tijdens het gesprek dient de organisator de kandidaat uit te leggen wat
van hem wordt gevraagd en hem te zeggen hoeveel tijd dat ongeveer
van hem zal vergen. Vervolgens dient de organisator aan de kandidaat
gegevens te vragen om zijn belangstelling en betrokkenheid te beoordelen
en tevens hoeveel tijd hij werkelijk beschikbaar zou kunnen zijn voor dit
werk. De onderstaande vragenlijst kan daarbij een leidraad zijn.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 62
▼B
(1)
Aan de hand van de via een dergelijke vragenlijst verzamelde gegevens
maakt de organisator van het panel de preselectie. Kandidaten die weinig
belangstelling tonen, weinig tijd beschikbaar hebben of die niet in staat
zijn hun gedachten te preciseren, worden afgewezen.
9.3.Bepaling van de „gemiddelde drempelwaarde” van de groep voor
„karakteristieke kenmerken”
Kies zorgvuldig vier soorten olijfolie en wel zo dat deze soorten respec-
tievelijk typerend zijn voor de kenmerken: olijvengisting, wijnachtig,
ranzig en bitter.
Neem een deel van elk van deze oliën en bereid monsters van verschill-
dende concentraties (factor 2) door opeenvolgende verdunningen met een
passende draagstof, totdat in de laatste twee of drie oplossingen geen
verschil meer kan worden onderkend met het glas dat alleen de draagstof
bevat. Een laatste paar moet bestaan uit glazen met uitsluitend de draag-
stof.
De serie moet tot een totaal van acht worden gecompleteerd met glazen
met hogere concentraties.
Bereid voldoende monsters van de verschillende concentraties om elk van
de kandidaten een complete serie voor ieder kenmerk te kunnenaanbieden.
Om de „gemiddelde drempelwaarde” van de kandidaten voor elk
kenmerk te bepalen, moet ieder van hen tegelijk een glas met 15 ml van
een van de bereide concentraties en een glas met alleen 15 ml van de
„draagstof” worden aangeboden. Na testen moet de kandidaat aangeven
of de inhoud van de glazen identiek is of verschilt.
Dezelfde test moet worden herhaald voor de overige concentraties van het
bestudeerde kenmerk.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 63
(1) Geef Uw oordeel over het belang van organoleptische beoordeling van voedingsmid-
delen of zo U wilt, olijfolie.
▼B
Noteer het aantal correcte antwoorden van alle panelleden per concen-
tratie en reken dit getal om in een percentage van het aantal uitgevoerde
tests.
Zet, in oplopende volgorde, op de x-as de geteste concentraties uit en op
de y-as voor elke concentratie het percentage van de juiste waarne-
mingen.
Figuur 1 geeft een illustratie van het voorgaande.De drempelwaarde wordt afgelezen op de x-as door vanaf de curve het
punt van de y-as te extrapoleren dat overeenkomt met 75 % juiste
antwoorden.
Deze „drempel”-concentratie die kan verschillen voor iedere olijfolie,
aangezien die waarde afhankelijk is van de intensiteit van het betrokken
kenmerk, moet gelijkwaardig zijn voor de verschillende groepen kandi-
daten voor verschillende panels; deze waarde staat los van gewoonten of
tendentieuze preferenties. Deze waarde is derhalve een referentiepunt dat
iedere normale groepmensen gemeen heeft en kan dienen voor het
homogeniseren van de verschillende panels, doch uitsluitend wat betreft
de gevoeligheid inzake geur en smaak.
Nadat zo de „drempelwaarde” van de groep is bepaald, moet als volgt te
werk worden gegaan:
Bereid, in afnemende en oplopende concentraties, een serie monsters
zodat de „drempelconcentratie” ligt op niveau 10 van de schaal. Het is
duidelijk dat de elfde en twaalfde concentratie sterker verdund zullen
zijn en dat het bijgevolg moeilijker is om de olijfolie en het gekozen
kenmerk waar te nemen.
Uitgaande van het monster met concentratie C
10kunnen de overige
monsters worden bereid aan de hand van de volgende formule:
C10·aN, waarin „a” een constante is, namelijk de verdunningsfactor gelijk
aan 1,5, en „N” de exponent, die gaat van 9 tot − 2.
Voorbeeld: ervan uitgaande dat de voor ranzige olijfolie waargenomen
drempelwaarde gelijk is aan 0,32; dan is C10gelijk aan 0,32 en, aangezien
„a” gelijk is aan 1,5, wordt een serie monsters verkregen met de volgende
concentraties:
Monster 1 2 3456789 1 0 1 1 1 2
Concentratie 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Als dezelfde werkwijze wordt gevolgd voor de drie andere kenmerken,
zullen, uitgaande van de respectieve drempelwaarden die eveneens zijn
bepaald op de hierboven aangegeven wijze, waardeschalen worden
verkregen die voor alle laboratoria voor elke stimulus overeenkomstige
intensiteiten voor het aroma zullen omvatten, ook al waren de waarneem-
bare gebreken van de olijfolie van verschillende intensiteit.
9.4.Selectie van de panelleden op grond van „intensiteitsindeling”
De selectie dient te gebeuren uit een aantal kandidaten dat twee- of drie-
maal groter is dan nodig voor de vorming van het panel, ten einde de
mensen met de grootste waarnemingsscherpte en een groter onderschei-
dingsvermogen te kunnen kiezen. Aanbevolen wordt om de selectie
steeds uit te voeren met het produkt dat later in de tests moet worden
beoordeeld (daarom dient in dit geval steeds olijfolie te worden gebruikt).1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 64
▼B
Figuur 1
Bij de keuze van de selectieprocedure mag, los van de doeltreffendheid
ervan, niet uit het oog worden verloren dat deze zo voordelig mogelijk
moet zijn wat betreft de hoeveelheid olie, het aantal monsters en de tijd
die nodig is voor selectie van panelleden. De efficiency van een selectie-
procedure hangt samen met het optimale niveau van de volgende drie
variabelen: a) de „kosten”, bepaald door het aantal tests; b) het aantal
potentieel valabele kandidaten dat als gevolg van toeval wordt uitgescha-
keld bij de selectie en c) het aantal onbekwame kandidaten dat als gevolg
van toeval toch wordt geaccepteerd.
De gekozen selectieprocedure is onder de titel „The intensity rating test”
(tests voor intensiteitsindeling) beschreven in de normen van de ASTM
(American Society for Testing and Materials), STP (Special Technical
Publication), nr. 440, blz. 53. De procedure is gewijzigd op de volgende
vier punten:
1. vermindering van het aantal monsters in de serie;
2. uitbreiding van het aantal stimuli, om het aantal beoordelingen van
geur en smaak waaropde selectie wordt gebaseerd te verhogen en
aan te passen aan de meest voorkomende waarneembare gebreken
van olijfolie;
3. wijziging van de verhoudingen tussen de concentraties in de serie;4. statistische verwerking van de resultaten.
Benodigdheden
— flessen of kolven van 1 500 ml;
— donker gekleurde proefglazen;
— maatcilinders van 10, 15, 1 000 en 1500 ml.
Benodigde produkten
— Merck-paraffine (referentie 7.160, DAB 8, USP XX) of een reukloze
en smaakloze olieachtige draagstof (olijfolie of andere gelijkaardige
olie, recent geraffineerd);1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 65
▼B
— olijfolie, respectievelijk met de kenmerken olijvengisting, wijnachtig,
ranzig en bitter.
9.4.1. Werkwijze
Na bereiding van de verdunningen wordt, eerst met 25 kandidaten,
volgens de hierna beschreven methode voor iedere stimulus, begonnen
met de selectie:
1. Maak series klaar van 12 gecodeerde proefglazen (één serie per kandi-
daat). Schenk in de glazen 15 ml van elk van de verschillende
concentraties bereid volgens de fomule C10·an.
2. Nadat de glazen zijn gevuld en afgedekt met het horlogeglaasje,
moeten zij minstens één uur bij een temperatuur van 20—22 ºC in de
testruimte staan voordat met de tests wordt begonnen, ten einde ervoor
te zorgen dat de temperatuur van de glazen gelijk is aan de omge-
vingstemperatuur.
3. De organisator plaatst de 12 glazen van iedere serie in aflopende volg-
orde van concentratie, te beginnen met de sterkste concentratie aan de
linkerkant.
Daarna wordt iedere kandidaat verzocht de test afzonderlijk af te leggen
opgrond van de volgende aanwijzingen.
9.4.2. Aanwijzingen voor de kandidaat
De 12 in een rij vóór de kandidaat opgestelde glazen bevatten naar gelang
van het geval verdunningen van de stimuli olijvengisting, wijnachtig,
ranzig of bitter. De glazen onderscheiden zich van elkaar door de intensi-
teit van de geur, met dien verstande dat het glas met de meest intense
geur links staat; de geurintensiteit van de overige glazen vermindert naar
mate zij meer naar rechts staan. Het laatste glas aan de rechterkant kan zo
weinig geur hebben dat het wellicht onmogelijk is om die geur waar te
nemen.
Ga als volgt te werk: maak U vertrouwd met de geuren van de glazen van
deze serie. Begin daartoe met het ruiken vanaf het glas dat rechts staat
(nr. 12) en probeer de intensiteit van de geuren te onthouden. Zorg er
echter voor U niet te vermoeien.
Verlaat het lokaal zodra U denkt dat U gewend bent aan de geuren van
de serie glazen.
Ondertussen kiest de organisator een glas uit de serie en plaatst dit ter
hoogte van het meest rechtse glas (nr. 12) en zet de overige glazen
dichter bij elkaar om de lege ruimte opte vullen die is ontstaan door
het weggenomen glas. Ga daarna het lokaal weer binnen voor het vervolg
van de test.
De uit te voeren opdracht is de volgende:Het door de organisator gekozen glas moet opde juiste p laats in de serie
worden teruggeplaatst. Daartoe mag U zoveel maal als nodig is ruiken en
vergelijken met de overige glazen; bij het terugplaatsen van het glas mag
niet worden vergeten, dat de geur intenser moet zijn dan die van het glas
dat onmiddellijk rechts en minder intens dan het glas dat onmiddellijk
links van het teruggeplaatste glas staat. De test moet worden herhaald
met nog drie glazen.
Om de test en het verzamelen van de antwoorden te vergemakkelijken,
moeten aan iedere kandidaat niet alleen bovenvermelde aanwijzingen
worden gegeven, maar ook nog het volgende formulier:
9.4.3. Verzameling van de resultaten
Om de gegevens van elke kandidaat gemakkelijker te kunnen ordenen,
moet de organisator ze als volgt noteren:1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 66
▼B
9.4.4. Statistische beoordeling
Voor deze selectie moeten alle kandidaten dezelfde glazen weer ophun
juiste plaats zetten. Volgens statistische berekeningen betreft het in de
aangegeven volgorde de glazen met de nummers:
Olijvengisting
(O)Wijnachtig (W) Ranzig (R) Bitter (B)
Glas nr. Glas nr. Glas nr. Glas nr.
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Het nummer van het glas in de serie mag niet worden veranderd, aange-
zien bij de statistische berekeningen voor deze test rekening is gehouden
met de waarschijnlijkheid dat de betrokken glazen bij toeval weer opde
juiste plaats worden teruggezet.
Om te voorkomen dat kandidaten elkaar inlichten, moet de organisator
1. Communicatie tussen de kandidaten beletten. Voor iedere kandidaat
verschillende codes gebruiken.
2. Voorkomen dat de kandidaten weten opwelke p laats de weggenomen
glazen stonden.
3. Hoewel aan alle kandidaten dezelfde glazen moeten worden aange-
boden, die eerder zijn genoemd, moet de volgorde waarin dit gebeurt
voor iedere kandidaat verschillen.
Iedere kandidaat wordt vervolgens beoordeeld opde volgende manier:Duid de twaalf glazen met de twaalf concentraties van een stimulus „i” (i
= één van de vier stimuli: olijvengisting, wijnachtig, ranzig en bitter) in
aflopende volgorde van intensiteit van het betrokken stimulus, aan met
e
i
1,ei
2,…ei
12.
Duid het te beoordelen glas aan met ei
ken de plaats waarop de kandidaat
het glas in de serie heeft teruggezet met K ′. De waarden voor K en K ′
zijn dus hele getallen van 1 tot en met 12, respectievelijk corresponde-
rend met de echte plaats van het glas en de plaats die de kandidaat het
glas heeft toegewezen.
Duid een vooraf vastgestelde waarde, in dit geval 3, aan met T (maximaal
toegestane afwijking) zodat, als (K ′−K) > T, de kandidaat automatisch
uitgeschakeld is(1).
Als daarentegen (K ′−K)≤T, is de kandidaat in principe niet uitgescha-
keld en kan hij dus verdergaan met de test aangezien hij in staat is
gebleken de te beoordelen stimulus opde juiste p laats terug te zetten of
althans op een plaats in de onmiddellijke nabijheid van de juiste plaats.
In dat geval zijn de punten die aan een kandidaat worden toegekend,
wanneer hij een bepaalde stimulus (concentratie) juist beoordeelt, gelijk
aan het kwadraat van het verschil tussen het nummer van de juiste plaats
van het glas in de serie en het nummer van de plaats waarop het glas
door de kandidaat is teruggezet, bij voorbeeld:
St(O)=( K′−K)2
waarin: St= stimulus.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 67
(1) De organisator dient de kandidaat er met nadruk opte wijzen dat hij verstandig te werk
dient te gaan, dat wil zeggen zonder dat de waarnemingsscherpte vermindert als gevolg
van vermoeidheid bij het waarnemen van geuren.
▼B
Aangezien de test door iedere kandidaat moet worden uitgevoerd voor
vier concentraties van iedere stimulus, wordt de beoordeling voor die
stimulus (bij voorbeeld):
ZO=S thO+S tjO+S tlO+S tmO
Ter verduidelijking onderstaande voorbeelden:
Voorbeeld nr. 1:
Laten we veronderstellen dat de antwoorden die kandidaat A heeft
gegeven voor de vier concentraties van de stimulus (i) die uit de serie
zijn genomen, de volgende zijn:
Juiste plaats van het
glas in de serie (K)Plaats waarophet
glas door de kandi-
daat is teruggezet
(K′)Verschil ten opzichte van de
juiste plaats (K ′−K )
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Deze kandidaat is uitgeschakeld, aangezien T groter is dan 3.
Voorbeeld nr. 2:
Laten we veronderstellen dat een kandidaat de vier concentraties van een
stimulus als volgt terugzet:
Juiste plaats van het
glas in de serie (K)Plaats waarophet
glas door de kandi-
daat is teruggezet
(K′)Verschil ten opzichte van de
juiste plaats (K ′−K )
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Deze kandidaat is niet uitgeschakeld, aangezien de beoordeling die hij
voor de test met deze stimulus krijgt, de volgende is:
Zi=02+02+32+( −1 )2=1 0
Het cijfer van de kandidaat voor selectie als panellid op grond van zijn
antwoorden voor de vier betrokken stimuli, wordt als volgt bepaald:
SthO+S tjO+S tlO+S tmO=ZO
SthW+S tjW+S tlW+S tmW=ZW
SthR+S tjR+S tlR+S tmR=ZR
SthB+S tjB+S tlB+S tmB=ZB
Zdef = ZO+…+ZB
waarin:
O = olijvengisting;
W = wijnachtig;R = ranzig;B = bitter.
Nu moet worden bepaald tot welk maximum voor Z een kandidaat kan
worden geacht qua perceptie, geur, geheugen en intensiteitsindeling van
goed niveau te zijn om een passend antwoord te kunnen geven voor de
vier betrokken stimuli. Het is duidelijk dat Z nooit negatief is en dat Z
= 0 betekent dat de kandidaat alle 16 intensiteiten die hem zijn aange-
boden (4 voor iedere stimulus) heeft herkend en correct heeft1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 68
▼B
gekwantificeerd. Andere waarden voor Z dan 0 wijzen eropdat de kandi-
daat de zones waarbinnen de intensiteit zich situeerde, heeft herkend,
maar dat hij niet in staat is geweest de stimulus exact te situeren omdat
hij geen goed onderscheidingsvermogen heeft voor het intensiteitsgamma
waarmee hij is geconfronteerd voor één of meer van de betrokken stimuli.
Daarom moet de kritische waarde (Zk) zo worden vastgesteld dat de
waarschijnlijkheid dat een kandidaat die alle glazen willekeurig binnen
de herkende zones zet een eindcijfer Z heeft dat lager is dan Zkklein
genoeg ( α)is; deze waarde αkan vooraf worden bepaald. Anders gezegd:
er moet voor worden gezorgd dat de waarschijnlijkheid dat via deze
selectie een panellid wordt geselecteerd dat de intensiteiten van de bij
de selectie gebruikte stimuli niet voldoende kan onderscheiden, kleiner
is dan α.
Zodra de waarde van α(in dit geval 0,05) is vastgesteld, is Zkafhankelijk
van de waarschijnlijkheidsverdeling van de variabele Z, en die is ophaar
beurt afhankelijk van de waarschijnlijkheidsverdeling van de Stvaria-
belen (K ′).
Na uitvoering van de statistische berekeningen bedraagt de waarde voor
Zk34.
Zodra voor alle kandidaten het Z-cijfer is bepaald, moeten diegenen met
meer dan 34 punten worden afgewezen.
Als voorbeeld de beoordelingen van twee kandidaten A en B:
Stimulus Kandidaat A Kandidaat B
Olijvengisting ZO=1 0 ZO=1 2
Wijnachtig ZW=1 0 ZW=1 0
Ranzig ZR=1 0 ZR=1 5
Bitter ZB=4 ZB=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Aangezien de Z-cijfers voor de twee betrokken kandidaten respectievelijk
34 en 38 zijn, wordt kandidaat A geaccepteerd, terwijl kandidaat B wordt
afgewezen. Nadat alle kandidaten met een beoordeling hoger dan 34 zijn
afgewezen, worden de overige ingedeeld opgrond van hun Z-cijfer totdat
het gewenste panel van twaalf is gevormd.
9.5.Training
Training is hoofdzakelijk bedoeld om:
a) de panelleden vertrouwd te maken met de vele varianten die in olij-
folie van eerste persing voorkomen op het gebied van geur, smaak en
mondgevoel;
b) de panelleden vertrouwd te maken met de organoleptische methode;
c) de individuele capaciteit in het herkennen, identificeren en kwantifi-
ceren van de stimuli te vergroten, en
d) de waarnemingsscherpte en het geheugen wat betreft de verschillende
beoordeelde stimuli te verbeteren, om tot een consistente beoordeling
te komen.
De training bestaat gewoonlijk uit een reeks bijeenkomsten, afhankelijk
van de mogelijkheden van de groepen de studie, waarin, na individuele
beoordeling van de olijfolie, de panelleden gezamenlijk met de organi-
sator de moeilijkheden bespreken en de gebruikte omschrijvingen
becommentariëren met het oog opeenheid in de beoordeling en de
opinies.
Het niveau dat is bereikt na een aantal bijeenkomsten wordt beoordeeld
opgrond van de toeneming van het p ercentage juiste antwoorden
wanneer discriminatietests worden gebruikt, of door analyse van de vari-
antie in de gemiddelde individuele beoordelingen van het panel, wanneer
indelingstests worden gebruikt.
Het praktische nut van deze training is uitvoerig besproken, maar
momenteel is het standpunt dat training zeer doeltreffend is en zelfs abso-
luut noodzakelijk om exacte en nauwkeurige sensorische informatie te
verzamelen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 69
▼B
9.6.Controlepanels
Ervaren panels voeren regelmatig organoleptische tests uit die een grote
inspanning vergen. In veel gevallen zijn belangrijke technologische en
commerciële besluiten afhankelijk van hun oordeel. Daarom moet, na de
selectietraining, het niveau van de panelleden worden gecontroleerd om
er voor te zorgen dat hun beoordelingen precies blijven.
Het is duidelijk dat, nadat de panels zijn gevormd en de routinetests
hebben afgelegd, hun niveau met regelmatige tussenpozen moet worden
gecontroleerd.
10. PROCEDURE VOOR DE ORGANOLEPTISCHE BEOORDELING
VAN OLIJFOLIE VAN EERSTE PERSING
Wanneer aan de hierboven vermelde normen is voldaan, alle benodigd-
heden beschikbaar zijn en het panel is geselecteerd, ruikt en proeft(1)
het panellid het monster in het proefglas. Hij analyseert de geur, smaak,
het mondgevoel en de kinestesische percepties met gebruikmaking van
het in figuur 2 vermelde beoordelingsformulier waarophij aangeeft of
de kenmerken voorkomen en hoe hij de intensiteit daarvan beoordeelt.
Vervolgens moet de kwaliteit worden beoordeeld.
10.1.Gebruik van het beoordelingsformulier in figuur 2 (beschrijving van
de flavour en beoordeling van de kwaliteit)
Aan de linkerkant van het formulier zijn een aantal gewaarwordingen
vermeld die het meest voorkomen bij olijfolie en waarmee de flavour
daarvan beschreven wordt. Als andere stimuli worden waargenomen die
niet overeenkomen met de vermelde omschrijvingen, dient het panellid
die stimuli te vermelden in de rubriek „andere” en die stimuli zo nauw-
keurig mogelijk te omschrijven.
De stimuli moeten worden beoordeeld volgens hun intensiteit door in het
betrokken vakje een plusteken (+) te plaatsen volgens onderstaande waar-
deschaal:
1 = nauwelijks waarneembaar
3 = licht3 = gemiddeld
4 = sterk
5 = zeer sterk
Aan de rechterkant van het beoordelingsformulier is een schaal van 1 tot
en met 9 vermeld (9 voor een buitengewone en goede kwaliteit en 1 voor
de slechtste kwaliteit) waarin het panellid een algemeen oordeel moet
geven over de olijfolie. Dit oordeel moet corresponderen met de kwali-
teiten en gebreken die reeds aan de linkerkant van het
beoordelingsformulier zijn opgegeven.
De eerste kolom (gebreken) van de beoordelingstabel omvat vijf
rubrieken: de indeling van de olijfolie moet allereerst gebeuren opgrond
van de onberispelijkheid of het voorkomen van flavourgebreken, en op de
ernst of intensiteit van de gebreken; aangezien de waardeschaal 9 niveaus
omvat, moet echter ook rekening worden gehouden met nuances of
aspecten die zijn vermeld in de tweede kolom „kenmerken” en die mede-
bepalend zijn voor de uiteindelijke beoordeling.
10.2.Eindbeoordeling
De verantwoordelijke voor het panel dient de beoordelingen van elk van
de panelleden te verzamelen en vervolgens na te gaan of de kenmerken
en intensiteiten die zijn aangegeven in de „profieltabel” redelijk corres-
ponderen met de beoordeling van de olijfolie in de „beoordelingstabel”.
Bij een aanzienlijk verschil dient hij het panellid te verzoeken zijn beoor-
delingsformulier te herzien.
Indien nodig dient het panellid de test te herhalen.
Vervolgens moet de organisator de beoordelingen van de groepin een
tabel verwerken, het rekenkundig gemiddelde en de standaard-fout (van
het gemiddelde) hieruit volgend berekenen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 70
(1) Het panellid hoeft niet te proeven wanneer een uiterst onaangenaam kenmerk wordt
waargenomen; hij moet deze uitzonderlijke situatie ophet beoordelingsformulier
vermelden.
▼B
Indien de standaard-fout groter is dan de methode-fout, dient hij de test
door de gehele groepte laten herhalen.
Enkel in geval van een herzieningsanalyse dient de groepde testen te
herhalen tot er drie waarderingen per monster verkregen worden. De
eindbeoordeling is het resultaat van het gemiddelde van de drie verkregen
beoordelingen, met één decimaal cijfer.
Als het cijfer voor de gemiddelde intensiteit van het kenmerk bitter en/of
scherphoger is dan 2,5 moet de olijfolie met die kwalificatie worden
beoordeeld en moet worden aangetekend dat de olijfolie bitter en/of
scherpis.
Weergave van de beoordeling: de persoon die de leiding heeft van het
panel, bepaalt, op basis van het gemiddelde van de beoordelingen en de
in bijlage I vastgestelde limieten, in welke categorie het monster wordt
ingedeeld. Te dien einde past hij een tolerantie toe:
— van + 1,5 in het verkoopseizoen 1992/1993,
— van + 1 met ingang van het verkoopseizoen 1993/1994,
indien het gemiddelde beoordelingscijfer 5 of meer is.
Voor oliën waarvoor met interventies samenhangende transacties plaats-
vinden, is evenwel geen tolerantie van toepassing.
Het statistisch verschil wat de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid
van de methode betreft, tussen het resultaat van de analyse en de limiet
volgens de voorschriften is in de in de vorige alinea's bedoelde tolerantie
meegerekend.
Ingeval de olie in de voornoemde verkoopseizoenen zonder toepassing
van de vastgestelde tolerantie wordt ingedeeld, mag opde onmiddellijke
verpakking van het produkt het minimale organoleptische beoordelings-
cijfer worden aangegeven dat voor de hele houdbaarheidsperiode juist is.
De persoon die de leiding van het panel heeft, vermeldt in het analysever-
slag alleen de categorie waarin het monster is ingedeeld. Bij het
onderzoek door de analist overeenkomstig artikel 2, lid 2, eerste alinea,
wordt voor de bepaling van de categorie dezelfde procedure toegepast.
Opmerking: De monsters moeten in gesloten recipiënten in de koelkast
worden bewaard totdat zij worden geanalyseerd en moeten
in de koelkast worden teruggeplaatst totdat de drie beoorde-
lingen zijn uitgevoerd.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 71
▼M12
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Figuur 2
Olijfolie van eerste persing
SENSORISCH ONDERZOEK: BASISTERMINOLOGIE
1. DOEL
Deze norm betreft een aantal algemene termen die worden gebruikt bij
sensorisch onderzoek en de definitie daarvan.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 72
▼B
▼B
2. WOORDENLIJST
2.1.Algemene termen
Sensorischonderzoek (zelfstandig naamwoord):
Zintuiglijk onderzoek van de organoleptische kenmerken van een
produkt.
Perceptie (zelfstandig naamwoord):
Sensorische bewustwording van extreme objecten of gebeurtenissen.Organoleptisch (bijvoeglijk naamwoord) (kenmerk of eigenschap):
Iedere eigenschapvan een p rodukt die kan worden waargenomen met de
zintuigen.
Deskundige (zelfstandig naamwoord):
(Ten aanzien van het onderzoek van de organoleptische kenmerken)Proever die gespecialiseerd is in sensorisch onderzoek van een bepaald
produkt en basiskennis heeft over de vervaardiging van dat produkt en
de voorkeur van de markt.
Proever/panellid (zelfstandig naamwoord):
Geselecteerde en getrainde scherpzinnige en gevoelige persoon die de
organoleptische kenmerken van een voedingsmiddel beoordeelt op grond
van zintuigelijke waarneming.
Panel(zelfstandig naamwoord):
Groep speciaal geselecteerde en getrainde proevers die onder gecontro-
leerde omstandigheden bijeenkomen voor sensorisch onderzoek van het
produkt.
Gewaarwording (zelfstandig naamwoord):
Subjectief verschijnsel ten gevolge van prikkeling van een zintuig. Dit
verschijnsel kan subjectief worden onderscheiden en objectief worden
vastgesteld via het betrokken zintuig, volgens de aard of de kwaliteit
van de stimulus en de intensiteit daarvan.
Gevoeligheid (zelfstandig naamwoord):
Vermogen van de zintuigen om een stimulus van geringe intensiteit of
om kleine verschillen tussen stimuli kwalitatief en kwantitatief waar te
nemen.
Proeven(zelfstandig naamwoord):
Handeling die erin bestaat de organoleptische kenmerken van een
voedingsmiddel waar te nemen, te analyseren en te beoordelen en meer
in het bijzonder de geur, de smaak, het mondgevoel en de kinestesische
kenmerken.
Acceptatie (zelfstandig naamwoord):
Handeling die erin bestaat dat een individu of een populatie een produkt
aanvaardt.
Harmonie (zelfstandig naamwoord):
Hoedanigheid van een produkt dat een algemene aangename gewaarwor-
ding veroorzaakt. Die gewaarwording is toe te schrijven aan de adequate
verhouding van de componenten van het produkt, zoals smaak, geur,
mondgevoel, alsmede kinestesische stimuli, die worden waargenomen.
Aanvaardbaarheid (zelfstandig naamwoord):
Hoedanigheid van een produkt dat op grond van zijn organoleptische
kenmerken wordt aanvaard door een individu of een populatie.
Discriminatie (zelfstandig naamwoord):
Het onderscheiden van twee of meer stimuli opgrond van kwaliteit en/of
kwantiteit.
Compensatie (zelfstandig naamwoord):
Het resultaat van interactie van een combinatie van stimuli met het
gevolg dat ieder van de stimuli minder intens wordt waargenomen dan
bij afzonderlijke waarneming.
Aspect(zelfstandignaamwoord):1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 73
▼B
De organoleptische kenmerken die worden waargenomen met het
gezichtsvermogen: grootte, vorm, kleur, structuur, troebelheid, helderheid,
vloeibaarheid, schuim en borreling. Deze term verdient de voorkeur
boven „uiterlijk”.
Kenmerk (zelfstandig naamwoord):
Waarneembare kenmerkende eigenschap.
2.2.Fysiologische termen
Stimulus (zelfstandig naamwoord):
Fysisch of chemisch agens dat de specifieke respons van de externe of
interne receptoren van de zintuigen veroorzaakt (meervoud: stimuli of
stimulus).
Smaak(zelfstandig naamwoord) (smaakzintuig):
Zintuig waarvan de receptoren zich bevinden in de mond, met name op
de tong, en die worden geactiveerd door verschillende componenten in
oplossing.
Smaak-(bijvoeglijk naamwoord):
De eigenschapvan een p rodukt waardoor het smaakzintuig wordt gesti-
muleerd en waarnemingen worden veroorzaakt die corresponderen met
een van de vier elementaire smaken: zoet, zout, zuur en bitter.
Receptor (zelfstandig naamwoord):
Gespecialiseerde structuur van een prikkelgevoelig zintuig dat een
stimulus kan ontvangen en die kan omzetten in een zenuwprikkel.
Opmerking: De receptoren worden ingedeeld volgens het type energie
van de stimulus (licht, warmte, geluid, enz.).
Reukzin(zelfstandig naamwoord):
Functie van het reukzintuig bestaande in het waarnemen en onder-
scheiden van de moleculen die dit zintuig rechtstreeks of onrechtstreeks,
in gasvorm via de neus bereiken.
Intensiteit (zelfstandig naamwoord):
Gradatie van energie die kan worden gemeten met een kwantitatieve
schaal van waarden hoger dan de drempelwaarde.
Aanpassing (zelfstandig naamwoord):
Tijdelijke wijziging in de gevoeligheid voor de waarneming van stimuli
die het gevolg is van voortdurende en herhaalde blootstelling aan
dezelfde of soortgelijke stimuli.
Inhibitie (zelfstandig naamwoord):
Ontbreken van respons van een zintuig of een deel van dat zintuig,
ondanks een stimulus met een hogere intensiteit dan de drempelwaarde.
Respons(zelfstandig naamwoord):
Reactie van de zintuigcellen opeen of meer stimuli voor een bep aald
zintuig.
Corps(zelfstandig naamwoord):
Gevoel in de mond waarbij een zekere dichtheid, viscositeit, consistentie
of compactheid van een voedingsmiddel wordt waargenomen.
Welriekendheid (zelfstandig naamwoord):
Frisse, zachte en aangename geur.
Ruiken(werkwoord):
Het waarnemen van een geur.
Objectief (bijvoeglijk naamwoord):
a) Aanduiding van een reële en verifieerbare beschrijving van het object
waarbij de menselijke factoren (zoals bij voorbeeld voorkeur,
gewoonte, affectiviteit) tot het minimum worden beperkt.
b) Aanduiding van de techniek waarbij, door gebruikmaking van sensori-
sche of instrumentele methoden, persoonlijke vergissingen tot een
minimum kunnen worden beperkt.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 74
▼B
Opmerking: Afgeraden wordt om de term „instrumenteel” als synoniem
te gebruiken.
Subjectief (bijvoeglijk naamwoord):
Aanduiding van een waarneming die samenhangt met de gedachte of de
gevoelens van een individu en niet alleen wordt bepaald door de stimulus.
Kinestesie:
De waarnemingen die het gevolg zijn van de druk die opeen monster
wordt uitgeoefend via een beweging (bij voorbeeld het drukken met de
vingers opkaas).
Drempel (zelfstandig naamwoord):
Absolutedrempel
Kleinste hoeveelheid van een stimulus die nodig is
— voor het onstaan van een gewaarwording (detecteerbaarheidsdrempel),
of
— voor het herkennen van de gewaarwording (identificatiedrempel).
VerschildrempelKleinste hoeveelheid van een stimulus die nodig is om een verschil in
waargenomen intensiteit te veroorzaken.
Einddrempel:Hoeveelheid van een stimulus waarboven geen verschil in de intensiteit
van de gewaarwording meer wordt waargenomen.
Voorkeurdrempel:Kleinste hoeveelheid van een stimulus of kritische supraliminaire waarde
van deze stimulus waarbij een voorkeur of afwijzing ontstaat ten opzichte
van een blank stimulus, bij voorbeeld bij de keuze tussen een sucroseop-
lossing en water.
Opmerking: Absolute voorkeurdrempel en verschildrempel mogen niet
met elkaar worden verward.
Infraliminair (bijvoeglijk naamwoord):
Kwalificatie van een stimulus beneden de absolute drempel.
Supraliminair (bijvoeglijk naamwoord):
Kwalificatie van een stimulus boven de absolute drempel.Vermoeidheidvandezintuigen:Vorm van aanpassing van de zintuigen bestaande in een vermindering
van de gevoeligheid.
Compensatie (zelfstandig naamwoord):
Het resultaat van interactie van een combinatie van stimuli met het
gevolg dat ieder van de stimuli minder intens wordt waargenomen dan
bij afzonderlijke waarneming.
Synergetisch (bijvoeglijk naamwoord):
Effect waardoor de intensiteit van de organoleptische kenmerken van
gecombineerde stoffen groter is dan simpele optelling van de intensiteiten
van elk van de individuele stoffen laat verwachten.
Contrasteffect:
Toeneming van de respons op de verschillen tussen twee gelijktijdige of
opeenvolgende stimuli.
Tegengestelde van het convergentie-effect.
Convergentie-effect:
Vermindering van de respons op de verschillen tussen twee gelijktijdige
of opeenvolgende stimuli.
Tegengestelde van het contrast-effect.
2.3.Termen in verband met organoleptische kenmerken
Zuur(bijvoeglijk naamwoord):1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 75
▼B
a) Kwalificatie van de elementaire smaak die wordt veroorzaakt door
waterige oplossingen van de meeste zuren (bij voorbeeld citroenzuur,
melkzuur en wijnsteenzuur).
b) Kwalificatie van de eigenschapvan zuivere of gemengde stoffen die
bij het proeven deze smaak veroorzaakt.
Het met dit bijvoeglijke naamwoord corresponderende zelfstandige naam-
woord is zuurheid.
Wrang(bijvoeglijk naamwoord):
Kwalificatie van de geur-/smaakgewaarwording bij overheersen van zuren
die over het algemeen afkomstig zijn van gisting; tevens kwalificatie van
de voedingsmiddelen die deze gewaarwording veroorzaken. Een aantal
factoren die bijdragen tot deze gewaarwording houden verband met het
gistingsproces, bij voorbeeld azijnzuur- of melkzuurgisting, vaneen
voedingsmiddel.
Bitter(bijvoeglijk naamwoord):
a) Kwalificatie van de elementaire smaak die wordt veroorzaakt door
waterachtige oplossingen van verschillende stoffen zoals kinine,
cafeïne en bepaalde heterosiden.
b) Kwalificatie van de eigenschapvan zuivere of gemengde stoffen die
bij het proeven deze smaak veroorzaakt.
Het met dit bijvoeglijke naamwoord corresponderende zelfstandige naam-
woord is bitterheid.
Zout(bijvoeglijk naamwoord):
a) Kenmerkende gewaarwording die met het smaakzintuig wordt waarge-
nomen; het meest typische voorbeeld is de gewaarwording die wordt
veroorzaakt door een oplossing van natriumchloride.
b) Kwalificatie van de eigenschapvan zuivere of gemengde stoffen die
bij het proeven deze smaak veroorzaakt.
Het met dit bijvoeglijke naamwoord corresponderende zelfstandige naam-
woord is zoutheid.
Zoet(bijvoeglijk naamwoord):
a) Kwalificatie van de elementaire smaak die wordt veroorzaakt door
waterige oplossingen van verschillende stoffen zoals saccharose.
b) Kwalificatie van de eigenschapvan zuivere of gemengde stoffen die
bij het proeven deze smaak veroorzaakt.
Het met dit bijvoeglijke naamwoord corresponderende zelfstandige naam-
woord is zoetheid.
Wrang(bijvoeglijk naamwoord):
a) Kwalificatie van de complexe gewaarwording die in de mond wordt
veroorzaakt door een waterige oplossing van produkten zoals bepaalde
tanninen (bij voorbeeld tanninen van de kakivrucht en van de sleep-
ruim).
b) Kwalificatie van de eigenschapvan zuivere of gemengde stoffen die
deze gewaarwording veroorzaken.
Het met dit bijvoeglijke naamwoord corresponderende zelfstandige naam-
woord is wrangheid.
Flavour(zelfstandig naamwoord):
Onder flavour wordt verstaan het totaal van de percepties veroorzaakt
door geur-, smaak- en taststimuli alsmede kinestesische stimuli, en op
grond waarvan een individu een voedingsmiddel kan identificeren en in
gradaties een oordeel over aangenaamheid of onaangenaamheid van dat
produkt kan geven.
Smaak(zelfstandig naamwoord):
a) Gewaarwordingen die door de smaakpapillen worden waargenomen,
wanneer deze worden geprikkeld door bepaalde oplosbare stoffen.
b) Kwaliteit van de specifieke gewaarwording die wordt veroorzaakt
door deze stoffen.
Elementaire smaak (zelfstandig naamwoord):
Elk van de vier erkende smaken: zoet, zout, zuur, bitter.
Geur(zelfstandig naamwoord):1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 76
▼B
a) Het totaal van de gewaarwordingen die door de reukzin worden waar-
genomen bij inademing van bepaalde vluchtige stoffen.
b) Kwaliteit van de specifieke gewaarwording die wordt veroorzaakt
door elk van die stoffen.
Aroma(zelfstandig naamwoord):
a) Aangename gewaarwordingen die door de reukzin indirect worden
waargenomen bij het proeven van een voedingsmiddel.
b) In de parfumsector en in het gewone taalgebruik wordt deze term ook
gebruikt voor dezelfde gewaarwordingen die rechtstreeks via de neus
worden waargenomen.
Nasmaak (zelfstandig naamwoord):
De gewaarwordingen die worden waargenomen nadat de stimulus niet
meer in de mond is en die verschillen van de eerder waargenomen
gewaarwordingen.
Aromatisch (bijvoeglijk naamwoord):
a) Kwalificatie van de eigenschapvan zuivere of gemengde stoffen die
bij het proeven de gewaarwordingen veroorzaakt die worden aange-
duid met „aroma”.
b) Kwalificatie van produkten die bij onderzoek door rechtstreekse geuri-
nademing via de neus een gewaarwording van welriekendheid en
frisheid veroorzaken.
Textuur(zelfstandig naamwoord):
De kenmerken van een voedingsmiddel in vaste of reologische staat die
de mechanische receptoren bij het proeven kunnen prikkelen, en met
name die in de mond.
Opmerking: Deze term is uitsluitend van toepassing op de objectieve
eigenschappen en niet op de gewaarwordingen die worden
aangeduid met algemene termen zoals consistentie, vezelig-
heid, smeuïgheid, enz.
Proeven(werkwoord):
Actie met de bedoeling om een voedingsmiddel in de mond in contact te
brengen met alle gevoelige zones met de bedoeling om de gewaarwor-
dingen die het veroorzaakt waar te nemen.
Opmerking: De basisterminologie kan worden aangevuld door raadple-
ging van ISO-norm 5492, deel I tot en met V, en andere
werken zoals „Les cahiers techniques du Centre National de
Coordination des Études et Recherches sur la Nutrition et
l'Alimentation” van J.L. Magnin, enz.
PROEFGLAS VOOR OLIJFOLIE
1. DOEL
Deze norm beschrijft de kenmerken van het glas voor de organoleptische
beoordeling van olijfolie voor consumptie (geur, smaak, flavour).
Ook wordt een beschrijving gegeven van een verwarmingsapparaat voor
het verkrijgen en handhaven van de adequate temperatuur voor deze
beoordeling.
2. BESCHRIJVING VAN HET GLAS
De schets in figuur 1 geeft de optimale kenmerken aan die als volgt
kunnen worden gespecificeerd:
a) Maximale stabiliteit om omvallen van het glas en morsen van de olij-
folie te voorkomen.
b) Een bodemvorm die gemakkelijk past in de uitsparingen van het
verwarmingsapparaat, zodat de bodem van het glas gelijkmatig kan
worden verwarmd.
c) Toegebogen randen aan de mondopening van het glas, waardoor de
concentratie van de geuren wordt bevorderd en de identificatie van
de olijfolie wordt vergemakkelijkt.
d) Donkergekleurd glas, zodat het panellid de kleur van de olijfolie niet
kan waarnemen, waardoor vooroordelen worden voorkomen die de
objectiviteit van de beoordeling kunnen aantasten.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 77
▼B
2.1.Afmetingen
Het glas is getekend in figuur 1 en de afmetingen zijn:
— totaal volume: …............................... 130 ml ± 10 ml,
— totale hoogte: …............................... 60 mm ± 1 mm,— diameter van de mondopening: ….............. 50 mm ± 1 mm,— grootste diameter: …........................... 70 mm ± 1 mm,— diameter van de bodem: …..................... 35 mm ± 1 mm,— dikte van de zijkant van het glas: … ............ 1,5mm±0,2mm,
— dikte van de bodem van het glas: …............ 5 mm ± 1 mm.
Bij ieder glas hoort een horlogeglaasje waarvan de diameter bijna 10 mm
groter is dan die van de mondopening van het glas. Het horlogeglaasje
dient als deksel om het verlies van aroma en vervuiling met stof tegen
te gaan.
2.2.Vervaardiging van het proefglas
Het proefglas moet worden vervaardigd uit resistent, donker glas zodat de
kleur van de inhoud niet kan worden waargenomen; voorts dient dat glas
vrij te zijn van krassen of bellen.
De rand moet regelmatig en glad zijn, en voorzien van een boord.
Het glas moet gehard zijn, zodat het bestand is tegen de temperatuurwis-
selingen bij de tests.
2.3.Aanwijzingen voor het gebruik
De glazen moeten worden gereinigd met reukloze zeepof een reukloos
wasmiddel en moeten vervolgens zolang worden gespoeld tot de zeep of
het wasmiddel volledig is verdwenen. Vervolgens wordt een laatste spoe-
ling uitgevoerd met gedistilleerd water en daarna moeten de glazen, na
uitlekken, worden gedroogd in een stoof.
Er mogen geen geconcentreerde zuren en ook geen mengsels met
chroomzuur worden gebruikt.
De glazen moeten in de stoof worden bewaard totdat zij worden gebruikt
of anders in een kast waar ze worden gevrijwaard van vreemde geuren.
Vóór het gebruik moet worden nagegaan dat de glazen vrij zijn van
vreemde geuren. Bij de voorbereiding van de test moet ervoor worden
gezorgd dat de code van ieder glas wordt genoteerd en tevens welke olij-
folie het bevat. De relatie tussen de code en de olijfolie mag alleen
bekend zijn aan de organisator van de test.
3. APPARAAT VOOR HET VERWARMEN VAN DE MONSTERS
De monsters moeten organoleptisch worden beoordeeld op een bepaalde
temperatuur, die voor olijfolie 28 ± 2 ºC bedraagt. Daartoe moet in iederecabine binnen het bereik van het panellid een verwarmingsapparaat (zie
figuur 2) worden geplaatst. Dit apparaat bestaat uit een aluminiumblok
in een gethermostateerd waterbad, zodat de temperatuur constant kan
worden gehouden. In dit blok zijn een aantal uitsparingen waarin de
bodems van de glazen passen. Het verschil in temperatuur tussen het
verwarmingsapparaat en de olijfolie in de glazen die in de uitsparingen
van de verschillende blokken staan mag niet meer bedragen dan ± 2 ºC.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 78
▼B
Figuur 1 — proefglas
Afmetingen (in mm)1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 79
▼B
Figuur 2 — Apparaat voor verwarming van de monsters (Afmetingen
in millimeter)
AANWIJZINGEN VOOR DE INRICHTING VAN EEN LOKAAL VOOR
SENSORISCH ONDERZOEK
1. INLEIDING
Het inrichten van een lokaal voor sensorisch onderzoek is bedoeld om
ervoor te zorgen dat het panel dat deelneemt aan de sensorische tests
zijn werk kan uitvoeren in een geschikte, comfortabele, gestandaardi-
seerde omgeving die het werk vergemakkelijkt en die ertoe bijdraagt dat
de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten wordt verbe-
terd.
2. DOEL
Deze norm preciseert de belangrijkste eisen waaraan moet worden
voldaan bij de inrichting van een testruimte.
3. ALGEMENE VOORWAARDEN
De testruimte dient, ongeacht de afmetingen (3.1), te beantwoorden aan
de volgenden voorwaarden:1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 80
▼B
Het lokaal dient aangenaam te zijn en adequaat verlicht (3.2), maar
neutraal qua stijl. Daartoe wordt voor de wanden een ontspannende,
effen, lichte kleur aanbevolen zodat een ontspannen atmosfeer wordt
gecreëerd(1).
Het lokaal moet gemakkelijk schoongemaakt kunnen worden en dient
geen hinder te ondervinden van geluidsbronnen; geluidsisolatie verdient
dan ook de voorkeur. Ook moet het lokaal vrij worden gehouden van
vreemde geuren en daartoe dient het zo mogelijk te worden voorzien
van een effciënte ventilatie. Als de schommelingen in de omgevingstem-
peratuur dat noodzakelijk maken, dient de testruimte te worden voorzien
van airconditioningsapparatuur om de temperatuur op 20—22 ºC te
houden.
3.1.Afmetingen
De afmetingen van het lokaal zijn vaak afhankelijk van de mogelijkheden
van de laboratoria of bedrijven. In het algemeen dient voldoende ruimte
aanwezig te zijn voor de inrichting van ongeveer 10 cabines, en van een
ruimte voor de voorbereiding van de monsters.
Het is echter duidelijk dat hoe meer ruimte beschikbaar is hoe beter het
is, want dan kunnen vertrekken worden ingericht bij voorbeeld voor reini-
ging van het materiaal, het opbergen van bereidingen en bijeenkomsten
van „open panels”.
3.2.Verlichting
De algemene verlichting, ongeacht of het daglicht of lampen (bij voor-
beeld buislampen van het type „daglicht”) betreft, moet uniform,
regelbaar en diffuus zijn.
3.3.Temperatuur en hygrometrische toestand
De temperatuur en de hygrometrische toestand in het lokaal dienen steeds
aangenaam te zijn. Afgezien van bijzondere omstandigheden wordt een
temperatuur van 20—22 ºC en een relatieve vochtigheid van 60—70 %
aanbevolen.
4. BESCHRIJVING VAN DE CABINES4.1.Algemene kenmerken
De cabines voor sensorisch onderzoek moeten naast elkaar in het lokaal
worden opgesteld. De cabines dienen identiek te zijn, met scheidings-
wanden die voldoende hoog en breed zijn zodat de zittende panelleden
elkaar niet zien.
De cabines mogen worden vervaardigd uit alle geschikt materiaal dat
gemakkelijk kan worden schoongemaakt en onderhouden (bij voorbeeld:hout, gecoat multiplex, laminaten, enz.). Als verf wordt gebruikt, dient
die na het drogen reukloos te zijn.
De stoelen in de cabines moeten comfortabel zijn en ophoogte instelbaar.
Iedere cabine moet ook voorzien zijn van individuele verlichting,
waarvan de richting en de intensiteit kan worden geregeld.
Het is ten zeerste aanbevolen de cabines te voorzien van een knop
waarmee aan de buitenzijde van de cabine een licht kan worden aange-
stoken met behulp waarvan het panellid, zonder de andere panelleden te
storen, de hem bedienende persoon kan laten weten dat hij klaar is met de
test, de volgende monsters wenst, een van de benodigdheden mist, een
onregelmatigheid heeft opgemerkt, inlichtingen wenst, enz.
4.2.Afmetingen
De cabines moeten voldoende ruim en comfortabel zijn.
In het algemeen dienen zij de volgende afmetingen te hebben:
— breedte:
0,75 m (zonder gootsteen),
0,85 m (met gootsteen);1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 81
(1) De kleur van de ruimte en de verlichting kunnen van invloed zijn opde resultaten van
de sensorische test.
▼B
— diepte:
0,50 m (tafel),
0,20 m (oversteek van de scheidingswand);
— hoogte van de scheidingswanden: tenminste 0,60 m vanaf de tafel;
— hoogte van de tafel: 0,75 m.
4.3.Inrichting van de proefcabine
De oppervlakte van de tafel dient gemakkelijk schoongemaakt te kunnen
worden.
Een gedeelte van de tafel moet worden gebruikt voor een gootsteen met
stromend drinkwater. Als dit niet mogelijk is, mag deze ruimte worden
gebruikt om een kom, een spuugbak of iets dergelijks neer te zetten.
Wanneer de monsters tijdens de test opeen constante temp eratuur boven
of beneden de omgevingstemperatuur moeten worden gehouden, is het
aan te bevelen dat daartoe voor adequate apparatuur wordt gezorgd
(waterbad, verwarmingsplaat, enz.).
Ook kan opeen hoogte van ongeveer 1,10 m boven de grond een
legplankje worden aangebracht voor de verschillende benodigdheden
(glazen, enz.).
Het is aan te bevelen om, als de plaatsing van de cabines in de testruimte
dit toelaat, een voorziening in de cabine aan te brengen om het aanbieden
van de monsters te vergemakkelijken. Deze voorziening kan bestaan in
een schuivend doorgeefluikje (figuur 1), een draaiplateau (figuur 2)
vooral voor hoge bekers of glazen, of een horizontale draaiende kap
wanneer de monsters niet erg hoog zijn (figuur 3). Er moet eenvoudigweg
voor worden gezorgd dat de opening groot genoeg is om de plateaus en
glazen met de monsters te kunnen doorgeven.
5. ANDERE LOKALEN
Als voldoende ruimte beschikbaar is, dient te worden gezorgd voor aparte
lokalen voor de voorbereiding van de monsters (keukenwerkzaamheden
of andere werkzaamheden), het bewaren van glazen of andere benodigd-
heden, en besprekingen voor of na de tests. In dat geval dienen die
lokalen schoon te worden gehouden; in geen geval mogen geuren, geluid
of gesprekken uit die lokalen het werk van de panelleden in de testruimte
storen.
In figuur 4 is een schets opgenomen van een proeflokaal en andere
lokalen.
Opmerking: De beschreven situatie is het ideaal. Als niet kan worden
beschikt over een lokaal dat uitsluitend wordt gebruikt voor
de sensorische beoordeling, kunnen de tests worden uitge-
voerd in een lokaal dat voldoet aan de
minimumvoorwaarden (licht, temperatuur, geluid, geur)
door zodanige verplaatsbare scharnierende cabines te
plaatsen dat de panelleden in ieder geval van elkaar
gescheiden zijn.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 82
▼B
INRICHTING PROEFCABINE
Figuur 1
1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 83
▼B
DRAAIPLATEAU VOOR AANBIEDING VAN DE MONSTERS
Figuur 2
1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 84
▼B
DRAAIKAP
Figuur 3
1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 85
▼B
LOKAAL VOOR SENSORISCH ONDERZOEK
Figuur 4 — Voorbeeld
1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 86
▼B
BIJLAGEXIII
NEUTRALISERING EN ONTKLEURING VAN OLijFOLIE IN HET
LABORATORIUM
1. NEUTRALISERING EN ONTKLEURING VAN OLIJFOLIE IN HET
LABORATORIUM
1.1.Neutralisering van de olijfolie
1.1.1. Apparatuur
— hoog bekerglas van 300 ml;
— laboratoriumcentrifuge met buisjes van 100 ml;— bekerglas van 250 ml;
— kolven van 100 ml;
— scheitrechter van 1 liter.
1.1.2. Reagentia
— natriumhydroxyde, oplossing van 12 % in water;
— fenolftaleïne, oplossing van 1 % in ethanol;
— hexaan, p.a.
— isopropylalcohol, p.a.
1.1.3. Werkwijze
a)Oliënmeteengehalte aanvrijevetzurenbeneden 30%,berekend als
oliezuur
Breng in een hoog bekerglas van 300 ml, 50 g ruwe olie en verwarm
in een waterbad tot 65 ºC. Voeg onder langzaam roeren een zodanige
hoeveelheid natriumhydroxydeoplossing (12 %) toe als overeenkomt
met het gehalte aan vrije vetzuren van de olie, met een overmaat van
5 %. Blijf gedurende 5 minuten roeren en houd de temperatuur op
65 ºC.
Breng alles over in centrifugebuisjes van 100 ml en centrifugeer de
zeeppasta af. Giet de geklaarde olie af in een bekerglas van 250 ml
en was met 50—60 ml kokend gedestilleerd water. Verwijder de
waterlaag met behulpvan een hevel. Herhaal het wassen tot alle over-
blijvende sporen van zeep zijn verdwenen (tot de fenolftaleïne niet
meer rose kleurt). Centrifugeer de olie af om de kleine resten water
te verwijderen.
b)Olïen met een gehalte aan vrije vetzuren boven 30 %, berekend als
oliezuur
Breng in een scheitrechter van 1 liter 50 g ruwe olie, 200 ml hexaan,
100 ml isopropylalcohol en een zodanige hoeveelheid natriumhydro-
xydeoplossing (12 %) als overeenkomt met het gehalte aan vrije
vetzuren van de olie, met een overmaat van 0,3 %. Roer flink gedu-
rende een minuut, voeg 100 ml gedestilleerd water toe, roer nogmaals
en laat staan. Na scheiding van de lagen de zeephoudende onderlaag
lagen wegvloeien. Tussen de twee lagen (olie boven en waterige laag
onder) ontstaat vaak een tussenlaag, bestaande uit slijmige en niet
oplosbare stoffen, die eveneens moet worden verwijderd. Was vervol-
gens de hexaanoplossing van neutrale olie met porties van 50—60 ml
van een oplossing van een volumedeel isopropylalcohol in een
volumedeel gedestilleerd water tot de fenolftaleïne geen rose kleuring
meer geeft.
Verwijder vervolgens het hexaan volledig door destillatie onder
vacuüm (bij voorbeeld door middel van een roterende verdamper).
1.2.Ontkleuring van de geneutraliseerde olie
1.2.1. Apparatuur
— kolf van 250 ml met drie ingeslepen halzen voor het inbrengen van:
a) een thermometer ingedeeld in ºC en geschikt voor aflezingen tot
90 ºC;
b) een mechanische roerder met een toerental van 250—300 omw/
min en voorzien van een inrichting voor bedrijf onder vacuüm;1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 87
▼M6
▼B
▼B
c) een aansluiting voor de vacuümpomp;
— vacuümpomp, in staat een resterende druk te geven van 15—30 mbar,
en voorzien van een manometer.
1.2.2 Werkwijze
Weeg in de driehalskolf ca. 100 g van de geneutraliseerde olijfolie af.
Breng de thermometer en de roerder aan; sluit de vacuümpomp aan en
verwarm onder roeren tot 90 ºC, houd onder voortdurend roeren deze
temperatuur aan totdat de te analyseren olie volledig watervrij is (onge-
veer 30 minuten).
Zet de vacuümpomp af en voeg 2 tot 3 g geactiveerde bleekaarde toe.
Breng het vacuüm opnieuw tot stand tot een resterende druk van
15—30 mbar en roer steeds bij een temperauur van 90 ºC gedurende 30
minuten bij 250 omw/min.
Filtreer vervolgens warm in een oven met thermostaat (50—60 ºC).1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 88
▼M6
BIJLAGEXIV
AANVULLENDE AANTEKENINGEN 2, 3 EN 4 VAN HOOFDSTUK 15
VAN DE GECOMBINEERDE NOMENCLATUUR
2. A. Als olijfolie in de zin van de posten 1509 en 1510 wordt enkel aange-
merkt olie die uitsluitend afkomstig is van de behandeling van olijven
en die wat het gehalte aan vetzuren en sterolen volgens de analysegege-
vens betreft de volgende kenmerken heeft:
Tabel I: Vetzuurgehalte in gewichtsprocent van het
totale gehalte aan vetzurenTabel II: Sterolgehalte in gewichtsprocent van het
totale gehalte aan sterolen
Myristinezuur M 0,1 Cholesterol M 0,5
Linoleenzuur M 0,9 Brassicasterol M 0,2
Arachidezuur M 0,7 Campesterol M 4,0
Eicosaanzuur M 0,5 Stigmasterol (1) < Campesterol
Beheenzuur M 0,3 Betasitosterol (2) m 93,0
Lignocerinezuur M 0,5 Delta-7-stigmastzerol M 0,5
m = minimum
M = maximum
(1) Deze voorwaarde geldt niet voor lampolie (onderverdeling 1509 10 10) en voor ruwe olie (onderverde-
ling 151000 10).
(2) Delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + betasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-
stigmastadienol.
Tot olijfolie in de zin van de posten 1509 en 1510 worden niet gerekend
chemisch gewijzigde olijfolie (met name opnieuw veresterde olijfolie) en
mengsels van olijfolie met olie van een andere soort. De aanwezigheid
van opnieuw veresterde olijfolie of olie van een andere soort wordt vast-
gesteld met behulpvan de in de bijlagen V, VII, X A en X B van
Verordening (EEG) nr. 2568/91 beschreven methoden.
B. Als olijfolie in de zin van onderverdeling 150910worden enkel aange-
merkt de in de hiernavolgende punten I en II gedefinieerde oliën uit
olijven die zijn verkregen langs zuiver mechanische weg of via andere
natuurkundige procédés onder omstandigheden, met name thermische,
waardoor de kwaliteit van de olie niet wordt aangetast, en die geen
andere behandeling hebben ondergaan dan wassen, decanteren, centrifu-
geren en filtreren, met uitsluiting van oliën die uit olijven zijn verkregen
met gebruikmaking van oplosmiddelen (post 1510).
I. Als „olijfolie voor verlichting verkregen bij de eerste persing (lamp-
olie)” in de zin van onderverdeling 15091010 wordt, ongeacht het
zuurgehalte, aangemerkt olijfolie met de volgende kenmerken:
a) gehalte aan ►M9was◄, ten hoogste ►M9350◄mg/kg;
b) gehalte aan erythrodiol + uvaol, ten hoogste 4,5 %;
c) gehalte aan verzadigde vetzuren opde 2-p ositie van de triglyce-
riden, ten hoogste 1,3 %;
d) som van de trans-isomeren van oliezuur ten hoogste 0,10 % en
som van de trans-isomeren van linolzuur + linoleenzuur ten
hoogste 0,10 %;
e) en/of een of meer van de volgende kenmerken:
1) peroxidegetal, meer dan 20 meq actieve zuurstof/kg;
2) totaalgehalte aan vluchtige gehalogeneerde oplosmiddelen,
meer dan 0,2 mg/kg of in ieder geval meer dan 0,1 mg/kg
voor een ervan;
3) een extinctie-coëfficiënt K270hoger dan 0,25 en, na behandeling
van de olie over een kolom geactiveerd aluminiumoxide, niet
hoger dan 0,11; oliën met een gehalte aan vrije vetzuren, bere-
kend als oliezuur, hoger dan 3,3 g/100 g mogen na behandeling
over een kolom geactiveerd aluminiumoxide volgens de
methode in bijlage IX van Verordening (EEG) nr. 2568/91 een
extinctie-coëfficiënt K270hebben hoger dan 0,10; in dat geval
moeten de oliën, na neutralisering en ontkleuring in het labora-
torium, de volgende kenmerken hebben:
— extinctie-coëfficiënt K270niet hoger dan 1,20,1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 89
▼M6
— variatie van de extinctie-coëfficiënt (Delta K) in de nabij-
heid van 270 nm hoger dan 0,01 en niet hoger dan 0,16,
d.w.z.:
Delta K = Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
Km= de extinctie-coëfficiënt bij de golf-
lengte van het maximum van de
absorptiecurve in de nabijheid van
270 nm,
Km−4en Km+4= de extinctie-coëfficiënten bij de
golflengten die 4 nm lager, respec-
tievelijk 4 nm hoger zijn dan die bij
Km;
4) organoleptische kenmerken waarbij onvolkomenheden waar-
neembaar zijn met een intensiteit die de
aanvaardbaarheidsgrens overschrijdt en een door het proefpanel
volgens de methode in bijlage XII van Verordening (EEG) nr.
2568/91, vastgesteld beoordelingscijfer beneden 3,5.
II. Als „andere olijfolie verkregen bij de eerste persing” in de zin van
onderverdeling 1509 1090 wordt aangemerkt olijfolie met de
volgende kenmerken:
a) zuurtegraad, berekend als oliezuur, ten hoogste 3,3 g/100 g;
b) peroxidegetal, ten hoogste 20 meq actieve zuurstof/kg;
c) gehalte aan ►M9was◄, ten hoogste ►M9250◄mg/kg;
d) totaalgehalte aan vluchtige gehalogeneerde oplosmiddelen, ten
hoogste 0,2 mg/kg en in ieder geval ten hoogste 0,1 mg/kg voor
ieder ervan;
e) extinctie-coëfficiënt K270, niet hoger dan 0,25 en, na behandeling
van de olie over een kolom geactiveerd aluminiumoxide, ten
hoogste 0,10;
f) variatie van de extinctie-coëfficiënt (Delta K) in de nabijheid van
270 nm, ten hoogste 0,01;
g) organoleptische kenmerken waarbij onvolkomenheden waarneem-
baar zijn met een intensiteit die de aanvaardbaarheidsgrens niet
overschrijdt en een door het proefpanel, volgens de methode in
bijlage XII van Verordening (EEG) nr. 2568/91, vastgesteld beoor-
delingscijfer van minstens 3,5;
h) gehalte aan erythrodiol + uvaol, ten hoogste 4,5 %;
i) gehalte aan verzadigde vetzuren opde 2-p ositie van de triglyce-
riden, ten hoogste 1,3 %;
j) som van de trans-isomeren van oliezuur ten hoogste 0,03 % en
som van de trans-isomeren van linolzuur + linoleenzuur ten
hoogste 0,03 %.
C. Als olijfolie in de zin van onderverdeling1509 9000wordt aangemerkt
olijfolie die is verkregen door behandeling van olie van de onderverde-
lingen 15091010 en/of 15091090, ook indien versneden met olijfolie
verkregen bij de eerste persing, en die de volgende kenmerken heeft:
a) zuurtegraad, berekend als oliezuur, ten hoogste 3,3 g/100 g;
b) gehalte aan ►M9was◄, ten hoogste 350 mg/kg;
c) extinctie-coëfficiënt K270ten hoogste 1,20;
d) variatie van de extinctie-coëfficiënt ( ∆K) in de nabijheid van 270 nm
niet hoger dan 0,16;
e) gehalte aan erythrodiol + uvaol, ten hoogste 4,5 %;
f) gehalte aan verzadigde vetzuren opde 2-p ositie van de triglyceriden,
ten hoogste 1,5 %;
g) som van de trans-isomeren van oliezuur ten hoogste 0,20 % en som
van de trans-isomeren van linolzuur + linoleenzuur ten hoogste 0,30 %.
D. Als ruwe oliën in de zin van onderverdeling 1510 0010 worden met
name aangemerkt de oliën uit afvallen van olijven met de volgende
kenmerken:
a) zuurtegraad, berekend als oliezuur, gelijk aan of hoger dan 2 g/100 g;
b) gehalte aan erythrodiol + uvaol, gelijk aan of hoger dan 12 %;1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 90
▼M9
▼M6
▼M6
c) gehalte aan verzadigde vetzuren opde 2-p ositie van de triglyceriden,
ten hoogste 1,8 %;
d) som van de trans-isomeren van oliezuur ten hoogste 0,20 % en som
van de trans-isomeren van linolzuur + linoleenzuur ten hoogste 0,10 %.
E. Als oliën van onderverdeling 1510 0090 worden aangemerkt zowel de
oliën die zijn verkregen door behandeling van de oliën van onderverde-
ling 1510 0010, ook indien versneden met olijfolie verkregen bij de
eerste persing, als de oliën die niet de kenmerken hebben als bedoeld in
de aanvullende aantekeningen 2.B, 2.C en 2.D, opvoorwaarde dat het
gehalte aan verzadigde vetzuren opde 2-p ositie van de triglyceriden ten
hoogste 2 % bedraagt en de som van de trans-isomeren van oliezuur niet
hoger is dan 0,40 % en die van de trans-isomeren van linolzuur + trans-
linoleenzuur niet hoger dan 0,35 %.
3. Tot de onderverdelingen 1522 0031 en 15220039 behoren niet:
a) afvallen, afkomstig van de bewerking van vetstoffen, die olie bevatten
waarvan het joodgetal, bepaald volgens de in bijlage XVI van Verorde-
ning (EEG) nr. 2568/91 vastgestelde methode, kleiner is dan 70 of groterdan 100;
b) afvallen, afkomstig van de bewerking van vetstoffen, die olie bevatten
met een joodgetal tussen 70 en 100, maar waarbij het oppervlak van de
piek die overeenkomt met de retentietijd van betasitosterol(
1), bepaald
volgens de methode in bijlage V van Verordening (EEG) nr. 2568/91,
minder bedraagt dan 93 % van het totale oppervlak van de sterolpieken.
4. Voor de vaststelling van de kenmerken van bovengenoemde produkten
worden de analysemethoden gebruikt die zijn beschreven in de bijlagen bij
Verordening (EEG) nr. 2568/91.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 91
(1) Delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol ►C1+ betasistosterol ◄+ sitostanol +
delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol.
▼B
BIJLAGEXV
1. BEPALINGEN VAN HET OLIEGEHALTE VAN DE AFVALLEN VAN
OLIJVEN
1.1.Toestellen
Geschikt extractietoestel; inhoud van de kolf 200 à 250 ml.Bad met elektrische verwarming (zandbad, waterbad, enz.) opverwar-
mingsplaat.
Analystische balans.Droogoven, ingesteld opmaximaal 80 ºC.Elektrische droogstoof, voorzien van een temperatuurregelaar en de moge-
lijkheid om lucht in te blazen of een gereduceerde druk te bewerkstelligen,
ingesteld op103 ºC ± 2 ºC.
Machinale molen, die gemakkelijk kan worden gereinigd en waarmede men
in staat is te malen zonder dat het materiaal warm wordt en zonder dat het
vocht- en oliegehalte van het gemalen produkt verminderen.
Mortier en stamper van porselein, ijzer of brons of bij voorkeur geschikt
machinaal fijnmaaltoestel.
Extractiehuls en watten of filtreerpapier, vrij van in n-hexaan oplosbare
stoffen.
Exsiccator.Zeef met gaten 1 mm doorsnede.
Puimsteen in kleine korrels, vooraf gedroogd.
1.2.Reagentia
n-Hexaan technisch, waarvan het residu bij volledige verdamping minder
bedraagt dan 0,002 g/100 ml.
2. WERKWIJZE
2.1.Bereiding van het analysemonster
Maal het analysemonster indien nodig in het vooraf goed gereinigd maal-
toestel. Verwijder daartoe het eerste maalsel (ongeveer 1/20 deel van het
analysemonster) en maal de rest zodanig dat deeltjes worden verkregen
die volledig door de zeef gaan. Meng zorgvuldig en analyseer onmiddellijk.
2.2.Monsterweging
Weeg onmiddellijk na het malen tot op0,01 g nauwkeurig ongeveer 10 g
van het analysemonster af.
2.3.Gereedmaken van de extractiehuls
Breng de proefeenheid in de huls en sluit deze met een watje af.Pak, indien filtreerpapier wordt gebruikt, de proefeenheid in dit papier.
2.4.Voordrogen
Plaats wanneer het monster zeer vochtig is (gehalte aan water en vluchtige
bestanddelen, vochtgehalte meer dan 10 %) de gevulde huls of het in
filtreerpapier verpakte monster enige tijd in de tot maximaal 80 ºC
verwarmde stoof om het vochtgehalte tot minder dan 10 % terug te
brengen.
2.5.Gereedmaken van de kolf
Weeg tot op0,001 g nauwkeurig een kolf die 1 à 2 korrels p uimsteen bevat
en die tevoren is gedroogd bij een temperatuur van 103 ± 2 ºC en gedu-
rende ten minste een uur in een exsiccator is afgekoeld.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 92
▼B
2.6.Eerste extractie
Plaats de huls of het in filtreerpapier verpakte monster in het extractietoe-
stel, giet in de kolf de benodigde hoeveelheid hexaan. Bevestig de kolf aan
het extractietoestel en plaats het geheel op het elektrische verwarmingsbad.
Verwarm zodanig dat de terugvloei ten minste 3 druppels/seconde bedraagt
(matig, niet heftig koken).
Extraheer gedurende 4 uur.Laat het geheel afkoelen.Neem de huls uit het extractietoestel en plaats haar in een luchtstroom ter
verwijdering van het grootste deel van het oplosmiddel waarmee de huls is
doordrenkt.
2.7.Tweede extractie
Ledig de huls in de mortier en maak het geheel zo fijn mogelijk. Breng het
mengsel weer kwantitatief in de huls en plaats de huls in het extractietoe-
stel en zet de extractie nog twee uur voort, met gebruikmaking van
dezelfde kolf die het eerste extract bevat. De in de extractiekolf verkregen
oplossing dient helder te zijn.
Filtreer indien dit niet het geval is de oplossing over een filtreerpapier. Was
de kolf en het filtreerpapier meerdere malen met hexaan uit.
Verzamel het filtraat en het voor het wassen gebruikt oplosmiddel in een
tweede kolf, die vooraf werd gedroogd en gewogen op0,001 g nauwkeurig.
2.8.Verwijdering van het oplosmiddel en weging van het extract
Verwijder het grootste deel van het oplosmiddel uit de kolf door afdistil-
leren opeen elektrisch verwarmingsbad.
Verwijder de laatste sporen oplosmiddel door verhitting van de kolf gedu-
rende 20 minuten bij een temperatuur van 103 ± 2 ºC.
Vergemakkelijk deze verwijdering, hetzij door van tijd tot tijd lucht of bij
voorkeur een inert gas in te blazen, hetzij door onder verminderde druk te
werken. Laat de kolf gedurende ten minste 1 uur in een exsiccator afkoelen
en weeg tot op0,001 g nauwkeurig.
Verwarm opnieuw gedurende 10 minuten onder dezelfde omstandigheden,
laat afkoelen in een exsiccator en weeg.
Het verschil tussen deze beide wegingen mag niet groter zijn dan 0,010 g;
anders dient opnieuw steeds gedurende 10 minuten te worden verwarmd
gevolgd door afkoelen en wegen totdat het gewichtsverschil ten hoogste
0,010 g bedraagt.
Noteer het resultaat van de laatste weging van de kolf.Verricht twee bepalingen op hetzelfde analysemonster.
3. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN3.1.Berekeningswijze en formule
a) Bereken het oliegehalte in gewichtspercenten van het onbehandelde
produkt met de formule:
S=m
1×100
m0
waarin:
S = gehalte aan olie in massaprocenten van het onbehandelde
produkt;
m0= massa, in grammen van de proefeenheid;
m1= massa, in grammen van de olie die bij de laatste weging in de
kolf is gevonden.
Indien aan de eisen inzake de reproduceerbaarheid is voldaan, neemt
men als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen.
Druk de resultaten uit met één decimaal.
b) Opverzoek kan het oliegehalte worden uitgedrukt ten op zichte van de
droge stof en berekend met de formule:1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 93
▼B
olie in massaprocenten van de droge stof = S ×100
100 − U
waarin:
S = gehalte aan olie in massaprocenten van het onbehandelde produkt
(zie a);
U = vochtgehalte in %.
3.2.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door dezelfde
analist gelijktijdig en snel na elkaar worden verricht mag niet meer
bedragen dan 0,2 g voor het met behulpvan hexaan verkregen extract uit
100 g monster.
Indien dit niet het geval is, moet de bepaling worden herhaald met twee
andere analysemonsters.
Neem, indien ditmaal het verschil nog groter is dan 0,2 g, als resultaat het
rekenkundig gemiddelde van de vier verrichte bepalingen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 94
▼B
BIJLAGEXVI
BEPALING VAN HET JOODGETAL
1. DOEL
Deze internationale norm beschrijft een methode voor de bepaling van het
joodgetal van dierlijke en plantaardige oliën en vetten, hierna te noemen
vetstoffen.
2 DEFINITIE
In het kader van deze internationale norm geldt de volgende definitie:
2.1. Joodgetal: de hoeveelheld jodium die door het analysemonster wordt opge-
nomen onder de omstandigheden die in deze internationale norm zijn
gespecificeerd.
Het joodgetal wordt uitgedrukt in grammen jodium per 100 g analysemon-
ster.
3. PRINCIPE
Een analyseportie wordt opgelost in een oplosmiddel, waarna Wijs-reagens
wordt toegevoegd. Na een bepaalde tijd worden een kaliumjodideoplossing
en water toegevoegd en vervolgens wordt het vrijgemaakte jodide geti-
treerd met natriumthiosulfaatoplossing.
4. REAGENTIA
Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn.
4.1. Water, dat voldoet aan de eisen van ISO 3896, kwaliteit 3.4.2. Kaliumjodideoplossing, 100 g/l, zonder vrij jodium of jodaat.4.3. Zetmeeloplossing
Meng 5 g oplosbaar zetmeel met 30 ml water, en voeg dit mengsel toe aan
1 000 ml kokend water; laat 3 minuten koken en laat afkoelen.
4.4. Volumetrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing
c(Na
2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l die niet ouder is dan 7 dagen.
4.5. Oplosmiddel, bereid door menging van gelijke volumes cyclohexaan en
azijnzuur.
4.6. Wijs-reagens met joodmonochloride in azijnzuur. Er dient in de handel
verkrijgbaar Wijs-reagens te worden gebruikt.
Opmerking: De reagens bevat 9 g ICl3+ 9 g I in azijnzuur.
5. APPARATUUR
Normale laboratoriumapparatuur en in het bijzonder:
5.1. Glazen weegschaaltjes die geschikt zijn voor de analyseportie en die in de
Erlenmeyers (5.2) kunnen worden gebracht.
5.2. Erlenmeyers van 500 ml, met ingeslepen glazen stop en volledig droog.
6. BEREIDING VAN HET ANALYSEMONSTER
Droog het gehomogeniseerde monster opnatriumsulfaat en filtreer.
7. WERKWIJZE
7.1. Analyseportie
De analyseportie heeft, naar gelang van het verwachte joodgetal, de in tabel
1 vermelde grootte.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 95
▼B
Tabel1
Verwacht joodgetal Grootte analyseportie
Kleiner dan 5 3,00 g
5 t/m 20 1,00 g
21 t/m 50 0,40 g
51 t/m 100 0,20 g
101 t/m 150 0,13 g
151 t/m 200 0,10 g
Weeg de analyseportie in een glazen weegschaaltje (6.1) af op 0,1 mg
nauwkeurig.
7.2. Bepaling
Breng de analyseportie in een Erlenmeyer (5.2) van 500 ml. Voeg 20 ml
van het oplosmiddel (4.5) toe om de vetstof op te lossen. Voeg exact
25 ml van het Wijs-reagens (4.6) toe, sluit de kolf af, schud met een draai-
ende beweging en plaats de Erlenmeyer in het donker. Gebruik geen
mondpipet voor het Wijs-reagens.
Bereid opdezelfde wijze een blanco met het op losmiddel en de reagens,
maar zonder de analyseportie.
Laat de Erlenmeyers voor monsters met een joodgetal van minder dan 150
gedurende 1 uur in het donker staan; laat de Erlenmeyers voor monsters
met een joodgetal boven 150 en voor gepolymeriseerde produkten of
produkten die in aanzienlijke mate zijn geoxideerd, gedurende 2 uur in het
donker staan.
Voeg na afloop van die periode 20 ml van de kaliumjodideoplossing (4.2)
en 150 ml water (4.1) toe in elk van de Erlenmeyers.
Titreer met de volumtrische gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing
(4.4) totdat de gele kleur als gevolg van het jodium vrijwel is verdwenen.
Voeg enkele druppels van de zetmeeloplossing (4.3) toe en ga verder met
het titreren totdat de blauwe kleur verdwijnt na heftig schudden.
Opmerking: Potentiometrische bepaling van het eindpunt is toegestaan.
7.3. Aantal bepalingen
Voer twee bepalingen uit op hetzelfde analysemonster.
8. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN
Het joodgetal is
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
waarin:
c = de concentratie in mol per liter van de gebruikte volumetrische
gestandaardiseerde natriumthiosulfaatoplossing (4.4);
V1= het volume, in ml, van de volumetrische gestandaardiseerde
natriumthiosulfaatoplossing (4.4) dat is gebruikt voor de blanco;
V2= het volume, in ml, van de volumetrische gestandaardiseerde
natriumthiosulfaatoplossing (4.4) dat is gebruikt voor de bepaling;
m = de hoeveeldheid, in grammen, van de analyseportie (7.1).
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen,
voor zover aan de eis inzake herhaalbaarheid is voldaan.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 96
▼M11
BIJLAGEXVII
METHODE VOOR DE BEPALING VAN STIGMASTADIËNEN IN
PLANTAARDIGE OLIËN
1. DOEL
Bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën met lage concentraties
van deze koolwaterstoffen, met name in olijfolie verkregen bij de eerste
persing en olie uit afvallen van olijven.
2. TOEPASSINGSGEBIED
Deze norm kan worden gebruikt voor alle plantaardige oliën, hoewel de
metingen alleen betrouwbaar zijn wanneer het gehalte aan deze koolwa-
terstoffen tussen 0,01 en 4,0 mg/kg ligt. De methode is vooral geschikt
om te bepalen of olijfolie verkregen bij de eerste persing, geraffineerde
plantaardige oliën (olijfolie, olie uit afvallen van olijven, zonnebloemolie,
palmolie, enz.) bevat, aangezien geraffineerde olie stigmastadiënen bevat
en olie verkregen bij de eerste persing niet.
3. PRINCIPE
Bereiding van het onverzeepbare residu. De steroïd-koolwaterstoffractie
wordt geïsoleerd met behulpvan kolomchromatografie over silicagel en
geanalyseerd met behulpvan cap illaire gaschromatografie.
4. APPARATUUR
4.1. Kolven, 250 ml, met refluxkoeler.4.2. Scheitrechters, 500 ml.4.3. Rondbodemkolven, 100 ml.4.4. Rotatieverdamper.4.5. Glazen chromatografiekolom (inwendige diameter 1,5-2,0 cm en lengte
50 cm) met een teflon kraan en een pluk glaswol of een schijf gesinterd
glas opde bodem. Schenk voor de bereiding van de chromatografiekolom
een laag van ongeveer 5 cm hexaan in de kolom en voeg vervolgens in
porties een slurrie van silicagel in hexaan toe (15 g in 40 ml). Laat de
kolom eerst spontaan en vervolgens door licht te vibreren uitzakken.
Voeg watervrij natriumsulfaat toe totdat het vloeistofpeil ongeveer
0,5 cm is gestegen en elueer ten slotte de overmaat van hexaan.
4.6. Gaschromatograaf met vlamionisatiedetector, splitinjector of koude kolo-
minjector en een met een nauwkeurigheid van ± 1 ºC programmeerbare
oven.
4.7. Fused-silica capillaire kolom voor gaschromatografie (inwendige
diameter 0,25 of 0,32 mm, lengte 25 m), inwendig gecoat met een 5 %
fenylmethylsilicon-fase met een laagdikte van 0,25 µm.
NB1
Ook andere kolommen met een soortgelijke of lagere polariteit kunnen
worden gebruikt.
4.8. Integrerende recorder met een instelling voor dal/dal-integratie.4.9. Micro-injectiespuit voor gaschromatografie, 5-10 µl, met geharde naald.
4.10. Elektrische verwarmingsmantel of -plaat.
5. REAGENTIA
Alle reagentia moeten p.a. zijn, tenzij een andere specificatie wordt
gegeven. Het gebruikte water moet gedestilleerd zijn of minimaal
dezelfde zuiverheidsgraad hebben.
5.1. Hexaan of een mengsel van alkanen met een kooktraject van 65-70 ºC,
gedestilleerd met een fractioneerkolom.
NB2
Het oplosmiddel moet worden gedestilleerd om verontreinigingen te
verwijderen.
5.2. Ethanol, 96 % (v/v).1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 97
▼M11
5.3. Natriumsulfaat, watervrij.
5.4. Alcoholische kaliumhydroxideoplossing, 10 %: voeg 10 ml water toe aan
50 g kaliumhydroxide, roer en los vervolgens het mengsel opin ethanol
(aanvullen tot 500 ml).
NB3
Deze oplossing wordt na verloop van tijd bruin en moet dan ook elke dag
vers worden bereid en in een goed afgesloten fles van donker glas
worden bewaard.
5.5. Silicagel 60 voor kolomchromatografie, 70-230 mesh (Merck ref. nr.
7734 of soortgelijk).
NB4
Meestal kan silicagel zonder behandeling rechtstreeks uit de verpakking
worden gebruikt. Sommige partijen kunnen echter een lage activiteit
hebben, hetgeen leidt tot slechte chromatografische scheidingen. In dat
geval moet de silicagel als volgt worden behandeld: activeer de silicagel
door deze gedurende minimaal vier uur op550 ºC te verhitten. Laat
daarna de silicagel in een exsiccator afkoelen en breng deze vervolgens
over in een gesloten fles. Voeg 2 % water toe en schud tot er geen
klonten meer zichtbaar zijn en het poeder vrij stroomt. Als een partij sili-
cagel chromatogrammen met overlappende pieken oplevert, moet de
silicagel opdezelfde manier worden behandeld. Het is ook mogelijk extra
zuivere silicagel 60 te gebruiken (Merck, ref. nr. 7754).
5.6. Voorraadoplossing (200 ppm) cholesta-3,5-dieen (Sigma, 99 % zuiver) in
hexaan (10 mg in 50 ml).
5.7. Standaardoplossing: 20 ppm cholesta-3,5-dieen in hexaan, verkregen door
verdunning van bovengenoemde oplossing.
NB5
Indien de oplossingen in de punten 5.6 en 5.7 bij minder dan 4 ºC worden
bewaard, blijven zij minimaal vier maanden goed.
5.8. Oplossing de n-nonacosaan in hexaan (ongeveer 100 ppm).
5.9. Draaggas voor chromatografie: helium of waterstof, zuiverheid
99,9990 %.
5.10. Hulpgassen voor de vlamionisatiedetector: waterstof, zuiverheid 99,9990,
en gezuiverde lucht.
6. WERKWIJZE
6.1.Bereiding van het onverzeepbare residu.
6.1.1. Weeg 20 ± 0,1 g olie af in een kolf van 250 ml (punt 4.1), voeg 1 ml
standaardoplossing cholesta-3,5-dieen (20 µg) en 75 ml alcoholische
kaliumhydroxideoplossing, 10 %, toe, bevestig de refluxkoeler en laat de
oplossing gedurende 30 minuten zachtjes koken. Stop met verwarmen en
laat de oplossing enigszins afkoelen (laat niet helemaal afkoelen, aange-
zien het monster dan gaat stollen). Voeg 100 ml water toe en breng de
oplossing met behulp van 100 ml hexaan over in een scheitrechter (punt
4.2). Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden en laat het
vervolgens uitzakken.
NB6
Voeg, indien een emulsie ontstaat die niet snel verdwijnt, kleine hoeveel-
heiden ethanol toe.
6.1.2. Breng de waterige onderlaag over in een tweede scheitrechter en extra-
heer opnieuw met 100 ml hexaan. Tap opnieuw de onderlaag af en was
de hexaanextracten (samengevoegd in een andere scheitrechter) drie keer
met telkens 100 ml van een ethanol/watermengsel (1 : 1) tot een neutrale
pH wordt bereikt.
6.1.3. Droog de hexaanoplossing over watervrij natriumsulfaat (50 g), was met
20 ml hexaan en damp de oplossing droog in een rotatieverdamper bij
30 ºC en lage druk.
6.2.Isolatie van de steroïd-koolwaterstoffractie.
6.2.1. Breng het residu opde fractioneerkolom met behulpvan twee p orties
hexaan van 1 ml. Laat het monster in de kolom zakken door het niveau
van de oplossing te laten dalen tot de bovenkant van de natriumsulfaat-
laag. Begin de elutie met hexaan met een stroomsnelheid van ongeveer1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 98
▼M11
1 ml/min. Gooi de eerste 25-30 ml eluaat weg en vang de volgende 40 ml
op. Breng deze fractie vervolgens over in een rondbodemkolf van 100 ml
(punt 4.3).
NB7
De eerste fractie bevat verzadigde koolwaterstoffen (zie figuur 1a) en de
tweede fractie de steroïd-koolwaterstoffen. Bij verdere elutie verschijnen
squaleen- en soortgelijke verbindingen. Om een goede scheiding tussen
de verzadigde en de steroïd-koolwaterstoffen te krijgen moeten de fractie-
volumes worden geoptimaliseerd. Hiertoe moet het volume van de eerste
fractie zodanig worden aangepast dat bij analyse van de tweede fractie de
pieken van de verzadigde koolwaterstoffen (zie figuur 1c) laag zijn. Als
deze pieken niet verschijnen, maar de piek van de standaard laag is, moet
het volume worden verlaagd. Een volledige scheiding tussen de compo-
nenten van de eerste en de tweede fractie is overigens niet nodig,
aangezien de pieken elkaar bij gaschromatografie niet overlappen als de
bij punt 6.3.1 vermelde werkomstandigheden worden gehanteerd.
Meestal hoeft het volume van de tweede fractie niet te worden geoptima-
liseerd, aangezien er een goede scheiding is met de verbindingen die later
elueren. Een grote piek bij een retentietijd van ongeveer 1,5 min. lager
dan de standaard, wordt echter veroorzaakt door squaleen en wijst op
een slechte scheiding.
6.2.2. Dampde tweede fractie bij 30 ºC en verlaagde druk in de rotatiever-
damper droog. Neem het residu onmiddellijk op in 0,2 ml hexaan en
bewaar de oplossing in de koelkast tot deze geanalyseerd wordt.
NB8
De residu's van de punten 6.1.3 en 6.2.2 mogen niet droog bij kamertem-
peratuur worden bewaard. Zodra ze worden verkregen, moet het
oplosmiddel worden toegevoegd en daarna moeten ze in de koelkastworden bewaard.
6.3.Gaschromatografie.
6.3.1. Werkomstandigheden voor splitinjector:
— Injectortemperatuur: 300 ºC.
— Detectortemperatuur: 320 ºC.
— Integrator/recorder: De piek-integratieparameters moeten zodanig
worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakten wordt
verkregen. Aanbevolen wordt de integrator in te stellen opdal/dal-
integratie.
— Gevoeligheid: ongeveer 16 keer de minimumverzwakking.— Geïnjecteerde hoeveelheid oplossing: 1 µl.
— Programmering oventemperatuur: eerst 235 ºC gedurende zes minuten
en daarna oplopend met 2 ºC/min. tot 285 ºC.
— Splitverhouding injector: 1 : 15.
— Draaggas: helium of waterstof bij een druk van ongeveer 120 kPa.
Deze omstandigheden kunnen afhankelijk van de kenmerken van de chro-
matograaf en de kolom zodanig worden aangepast dat chromatogrammen
worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen: de piek van de
interne standaard moet binnen ongeveer vijf minuten van de bij punt
6.3.2 vermelde retentietijd liggen; de hoogte van de piek van de interne
standaard moet minimaal 80 % van de volledige schaaluitslag zijn.
De gaschromatografieopstelling moet worden gecontroleerd door een
mengsel van de voorraadoplossing van cholesta-3,5-dieen (punt 5.6) en
de oplossing van n-nonacosaan (punt 5.8) te injecteren. De piek van
cholesta-3,5-dieen moet vóór die van n-nonacosaan verschijnen (figuur
1c); wanneer dit niet gebeurt, kan de temperatuur van de oven worden
verlaagd en/of kan de kolom worden vervangen door een kolom met een
lagere polariteit.
6.3.2. Identificatie van de pieken
De piek van de interne standaard verschijnt bij een retentietijd van onge-
veer 19 minuten en stigmasta-3,5-dieen bij een relatieve retentietijd van
ongeveer 1,29 (figuur 1b). Naast stigmasta-3,5-dieen worden kleine
hoeveelheden van een isomeer geëlueerd, die meestal geen aparte chro-
matografische piek opleveren. Als de kolom te polair is of een te hoge
resolutie heeft, kan de isomeer echter als een kleine piek vlak voor die
van stigmasta-3,5-dieen verschijnen (figuur 2). Om ervoor te zorgen dat
de stigmastadiënen als één piek worden geëlueerd, verdient het aanbeve-
ling de kolom te vervangen door een kolom met een lagere polariteit of
een grotere inwendige diameter.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 99
▼M11
NB9
Een referentie voor stigmastadiënen kan worden verkregen door de
analyse van een geraffineerde plantaardige olie met een kleinere monster-
hoeveelheid (1-2 g). Hierbij leveren stigmastadiënen een duidelijke en
gemakkelijk te identificeren piek op.
6.3.3. Kwantitatieve analyse
Het gehalte aan stigmastadiënen wordt berekend met de volgende
formule:
stigmastadiënen (mg/kg) =As/C2Mc
Ac/C2Mo.
Hierbij is: As= piekoppervlak stigmastadiënen (als de piek in twee
isomeren gesplitst is het totale oppervlak van de
twee pieken);
Ac= piekoppervlak interne standaard (cholestadieen);
Mc= toegevoegde hoeveelheid interne standaard in µg;
Mo= massa van het oliemonster in g.
Detectielimiet: ongeveer 0,01 mg/kg.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 100
▼M11
Figuur 1
Gaschromatogrammen van olijfoliemonsters over een fused-silica capil-
laire kolom (inwendige diameter 0,25 mm en lengte 25 m), gecoat met
5 % fenylmethylsilicon met een laagdikte van 0,25 µm.
a) Eerste fractie (30 ml) van een olijfolie van eerste persing met interne
standaard.
b) Tweede fractie (40 ml) van een olijfolie met 0,10 mg/kg stigmasta-
diënen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 101
▼M11
c) Tweede fractie (40 ml) met een kleine hoeveelheid van de eerste
fractie.
Figuur 2
Gaschromatogram van een monster van geraffineerde olijfolie over een
DB-5-kolom met het isomeer van stigmasta-3,5-dieen.1991R2568 — NL — 31.10.1995 — 013.001 — 102