1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B ZEVENDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 1 maart 1976
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
diervoeders
(76/372/EEG)
(PB L 102 van 15.4.1976, blz. 8)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Richtlijn 81/680/EEG van de Commissie van 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Richtlijn 92/95/EEG van de Commissie van 9 november 1992 L 327 54 13.11.1992
►M3Richtlijn 94/14/EG van de Commissie van 29 maart 1994 L 94 30 13.4.1994
▼B
ZEVENDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 1 maart 1976
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden
voor de officiële controle van diervoeders
(76/372/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet opde richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden
voor de officiële controle van veevoeders(1), laatstelijk gewijzigd bij
de Toetredingsakte(2), inzonderheid opartikel 2,
Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële
controle van diervoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de opgrond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van diervoeders gestelde eisen is voldaan,
geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende dat bij de E.E.G.-Richtlijnen 71/250, 71/393, 72/199, 73/
46, 74/203 en 75/84 van de Commissie van 15 juni 1971(
3), 18
november 1971(4), 27 april 1972(5), 5 december 1972(6), 25 maart
1974(7) en 20 december 1974(8) reeds een zeker aantal gemeenschap-
pelijke analysemethoden is vastgesteld; dat het gezien de vorderingen
welke de werkzaamheden sindsdien hebben gemaakt, dienstig is een
zevende reeks methoden vast te stellen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voordiervoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van diervoeders ten aanzien van hun gehalte aan aflatoxine B1geschieden volgens de in de bijlage bij deze richtlijn omschreven
methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten doen uiterlijk op1 oktober 1976 de nodige wettelijke of
bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden, die nodig zijn om aandeze richtlijn te voldoen en stellen de Commissie daarvan onverwijld inkennis.
Artikel 3
Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 73 van 27. 3. 1972, blz. 14.
(3) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(4) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.
(5) PB nr. L 123 van 29. 5. 1972, blz. 6.
(6) PB nr. L 83 van 30. 3. 1973, blz. 21.
(7) PB nr. L 108 van 22. 4. 1974, blz. 7.
(8) PB nr. L 32 van 5. 2. 1975, blz. 26.▼M1
▼B
▼B
BIJLAGE
BEPALING VAN AFLATOXINE B1
A. METHODE DOOR MIDDEL VAN EENDIMENSIONALE UNNELAAG-
CHROMATOGRAFIE
1. Doel en toepassingsgebied
Met behulpvan deze methode is het mogelijk het gehalte aan afla-
toxine B1te bepalen in enkelvoudige diervoeders en grondstoffen.
Deze methode is niet bruikbaar in aanwezigheid van citruspulp.
De ondergrens van de bepaling ligt bij 0,01 mg/kg (10 ppb).
Indien de aanwezigheid van bepaalde stoffen de bepaling stoort,
moet de analyse opnieuw worden verricht, maar dan volgens
methode B (hogedrukvloeistofchromatografie).
2. Principe
Het monster wordt onderworpen aan een extractie met chloroform.
Het extract wordt gefiltreerd en een evenmatig deel wordt door
middel van chromatografie opeen kolom van silicagel gezuiverd.
Het eluaat wordt ingedampt en het residu wordt in een bepaalde
hoeveelheid chloroform of benzeen-acetonitrilmengsel opgelost.
Een evenmatig deel van deze oplossing wordt aan dunnelaagchro-
matografie onderworpen. De hoeveelheid aflatoxine B1wordt
onder UV-licht of visueel of fluorodensitometrisch bepaald doorvergelijking met bekende hoeveelheden aflatoxine-B
1-standaard.
De identiteit van de uit het diervoeder geëxtraheerde aflatoxine B1moet met behulpvan de aangegeven methode worden bevestigd.
3. Reagentia
Noot:Alle reagentia dienen, voor zover niet anders vermeld, van
analytisch zuivere kwaliteit te zijn.
3.1. Aceton
3.2. Chloroform, gestabiliseerd met 0,5 — 1,0 % ethanol 96 % (v/v).
3.3. n-Hexaan
3.4. Methanol3.5. Diëthylether, vrij van water en peroxyden.3.6. Mengsel van benzeen en acetonitril 98/2 (v/v).3.7. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4) 97/3 (v/v).3.8. Silicagel voor kolomchromatografie, korrelgrootte 0,05 — 0,20 mm.3.9. Watten, hydrofiel en met chloroform ontvet, of glaswol.3.10. Natriumsulfaat, vrij van water, korrels.3.11. Inert gas, b.v. stikstof.3.12. Zoutzuur, 1 N.3.13. Zwavelzuur 50 % (v/v).3.14. Diatomeeënaarde (Hyflosupercel), met zuur gewassen.3.15. Silicagel G-HR of gelijkwaardig voor dunnelaagchromatografie.3.16. Standaardoplossing, bevattende ongeveer 0,1 µg aflatoxine B
1per
ml in chloroform (3.2) of in het mengsel van benzeen en acetonitril
(3.6), bereid en gecontroleerd zoals aangegeven onder punt 7.
3.17. Kwalitatieve standaardoplossing, bevattende ongeveer 0,1 µg afla-
toxine B1en B2per ml in chloroform (3.2) of in het mengsel van
benzeen en acetonitril (3.6). Deze concentraties zijn als richtsnoer
gegeven. Zij moeten zodanig worden gekozen, dat voor beide afla-
toxinen dezelfde fluorescentie-intensiteit wordt verkregen.
3.18. Loopvloeistoffen:1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 3
▼M2
▼B
▼B
3.18.1. Mengsel van chloroform (3.2) en aceton (3.1): 9/1 (v/v), onverza-
digde ontwikkelbak;
3.18.2. Mengsel van diëthylether (3.5), methanol (3.4) en water: 96/3/1 (v/
v/v), onverzadigde ontwikkelbak;
3.18.3. Mengsel van diëthylether (3.5), methanol (3.4) en water: 94/4,5/1,5
(v/v/v), verzadigde ontwikkelbak;
3.18.4. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4): 94/6 (v/v), verza-
digde ontwikkelbak;
3.18.5. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4): 97/3 (v/v), verza-
digde ontwikkelbak.
4. Apparatuur
4.1. Meng- en maalapparaat.4.2. Schudmachine of magnetische roerder.4.3. Vouwfilters, Schleicher & Schül nr. 588, of gelijkwaardig, diameter
24 cm.
4.4. Chromatografiekolommen, van glas (binnendiameter 22 mm, lengte
300 mm), met teflonkraan en reservoir van 250 ml.
4.5. Rotatievacuümverdamper met rondbodemkolf van 500 ml.4.6. Konische kolven van 500 ml met ingeslepen stop.4.7. Uitrusting voor dunnelaagchromatografie.4.8. Glazen platen voor dunnelaagchromatografie van 200 × 200 mm,
als volgt gemaakt (de aangegeven hoeveelheden zijn voldoende
voor vijf platen): Breng 30 g silicagel G-HR (3.15) in een konische
kolf. Voeg 60 ml water toe en schud gedurende één minuut. Breng
de suspensie in een uniforme laag van 0,25 mm dikte op de platen
aan. Laat de platen drogen aan de lucht en bewaar'ze daarna in de
exsiccator over silicagel. Activeer ze vóór gebruik, door deze gedu-
rende één uur in de droogstoof bij 110 ºC te plaatsen.
Er kan gebruik gemaakt worden van kant-en-klaar-platen indien
daarbij een zelfde resultaat wordt verkregen als bij de platen die
opde hierboven beschreven wijze zijn gemaakt.
4.9. Lampvoor langgolvig Ultraviolet licht 360 nm. De stralingsintensi-
teit moet voldoende zijn en een aflatoxine-B
1-vlek van 1,0 ng op
een plaat voor dunnelaagchromatografie op een afstand van 10 cm
van de lampnog duidelijk zichtbaar te maken.
4.10. Reageerbuisjes van 10 ml, met maatverdeling, voorzien van poly-
ethyleen stop.
4.11. UV-spectrofotometer.4.12. Fluorodensitometer (facultatief).
5. Uitvoering
5.1. Voorbereiding van het monster (zie opmerkingen in deel C, punt 1)
Maal het monster zodanig dat het door een zeef met mazen van
1 mm (overeenkomstig ISO-aanbeveling R 565) gaat.
5.2. Extractie
Breng van het gemalen en gehomogeniseerde monster 50,0 g over
in een konische kolf van 500 ml (4.6) en voeg 25 g diatomeeë-
naarde (3.14), 25 ml water en 250 ml chloroform (3.2) toe. Sluit
de kolf af en schud, resp. roer daarna gedurende 30 minuten met
behulpvan de schudmachine of de roerder (4.2). Filtreer vervolgens
door een vouwfilter (4.3), verwijder de eerste 10 ml van het filtraat
en vang de volgende 50 ml op.
5.3. Kolomzuivering
Breng onder in de chromatografiekolom (4.4) een prop watten of
glaswol (3.9) aan, vul de kolom tot ongeveer 2/3 met chloroform
(3.2), voeg daarna 5 g natriumsulfaat (3.10) toe, waarbij erop
moet worden gelet dat het bovenoppervlak van de natriumsulfaat-
laag een vlakke basis vormt. Voeg 10 g silicagel (3.8) in kleine
porties toe. Roer na iedere toevoeging voorzichtig om, om lucht-
bellen te verwijderen. Laat de silicagel 15 minuten inklinken en1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 4
▼B
voeg vervolgens voorzichtig 15 g natriumsulfaat (3.10) toe. Laat
daarna de vloeistof aflopen tot juist boven de natriumsulfaatlaag.
Meng de 50 ml van het onder 5.2 verkregen filtraat met 100 ml n-
hexaan (3.3). Breng het mengsel kwantitatief opde kolom en laat
de vloeistof doorlopen tot juist boven de natriumsulfaatlaag.
Verwijder de doorgelopen vloeistof. Voeg daarna 100 ml diëthyle-
ther (3.5) toe en laat de vloeistof weer doorlopen tot boven de
natriumsulfaatlaag. De doorloopsnelheid moet 8 tot 12 ml/minuut
bedragen. Zorg ervoor dat de kolom niet droogloopt. Verwijder de
doorgelopen vloeistof. Elueer vervolgens met 150 ml van het
mengsel van chloroform en methanol (3.7) en vang daarbij het
gehele eluaat op. Damp het eluaat in de rotatievacuümverdamper
(4.5) onder een inerte gasstroom (3.11) en bij een temperatuur van
hoogstens 50 ºC tot bijna geheel droog in. Breng het residu kwanti-
tatief met chloroform (3.2) of het mengsel van benzeen en
acetonitril (3.6) over in een reageerbuisje van 10,0 ml (4.10).
Concentreer de oplossing onder een inerte gasstroom (3.11) en
breng vervolgens met chloroform (3.2) of het mengsel van benzeen
en acetonitril (3.6) het volume op2,0 ml.
5.4. Dunnelaagchromatografie
Breng opeen p laat voor dunnelaagchromatografie (4.8) op2 cm
van de onderrand naast elkaar oponderlinge afstanden van 2 cm
de volgende hoeveelheden standaardoplossing en extract punt-
vormig op:
— 10, 15, 20, 30 en 40 µl aflatoxine-B1-standaardoplossing (3.16);
— 10 µl van het onder 5.3 verkregen extract en 20 µl standaardop-
lossing (3.16) opéén standp unt.
— 10 en 20 µl van het onder 5.3 verkregen extract.
Ontwikkel het chromatogram in het donker met een van de loop-
vloeistoffen (3.18).
Breng met het oog ophet kiezen van een geschikte loop vloeistof
vooraf 25 µl van de kwalitatieve standaardoplossing (3.17) op een
van de platen op en ga na of na de ontwikkeling een volledige
scheiding van aflatoxine B1en B2is bereikt.
Laat de loopvloeistoffen in het donker verdampen en bekijk daarna
de plaat onder UV-licht op een afstand van 10 cm van de lamp
(4.9). De aflatoxine B1-vlekken fluoresceren blauw.
5.5. Kwantitatieve bepaling
Voer de bepaling ofwel visueel ofwel fluorodensitometrisch uit.
5.5.1. Visuele bepaling
Bepaal de hoeveelheid aflatoxine B1in het extract door de intensi-
teit van de fluorescentie van de vlek van het extract met een van de
vlekken van de standaardoplossing te vergelijken. Interpoleer
indien nodig. De fluorescentie van de vlek verkregen door het
over elkaar aanbrengen van extract en standaardoplossing moet
sterker zijn dan die van 10 µl van het extract en er mag slechts
één vlek zichtbaar zijn. Verdun, indien de fluorescentie-intensiteit
van 10 µl extract sterker is dan die van 40 µl standaardoplossing,
het extract 10 of 100 maal met chloroform (3.2) of het mengsel
van benzeen en acetonitril (3.6) alvorens het extract aan een nieuwe
dunnelaagchromatographische scheiding te onderwerpen.
5.5.2. Bepaling door fluorodensitometrie
Meet de fluorescentie-intensiteit van de aflatoxine-B1-vlekken met
behulpvan een fluorodensitometer bij een golflengte van 365 nm
voor de extinctie en bij een golflengte van 443 nm voor de emissie.
Bepaal de hoeveelheid aflatoxine B1in de extractvlekken door de
fluorescentie-intensiteiten van de vlekken van het extract en van
de standaardoplossing onderling te vergelijken.
5.6. Bevestiging van de identiteit van aflatoxine B1
Bevestig de identiteit van aflatoxine B1in het extract, door middel
van de hierna beschreven technieken:
5.6.1. Behandeling met zwavelzuur
Verstuif zwavelzuur (3.13) over het overeenkomstig 5.4 verkregen
chromatogram. De fluorescentie van de aflatoxine-B1-vlek onder
UV-licht moet zijn veranderd van blauw naar geel.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 5
▼B
5.6.2. Tweedimensionale chromatografie met vorming van
aflatoxine B1-hemiacetaal (aflatoxine B2a)
Noot:De hierna beschreven verrichtingen moeten worden uitge-
voerd als aangegeven in figuur 3.
5.6.2.1. Opbrengen van de oplossingen
Trek opeen p laat (4.8) twee lijnen evenwijdig aan twee aanlig-
gende zijden (opeen afstand van 6 cm van deze zijden) die de
migratie van de loopvloeistoffen moeten afbakenen. Breng met
behulp van capillaire pipetten of microspuitjes op een plaat de hier-
onder aangegeven oplossingen op:
—in punt A: een hoeveelheid gezuiverd extract van het monster
dat onder 5.3 is verkregen en dat ongeveer 2,5 nanogram afla-
toxine B1bevat;
—in de punten B en C: 25 µl van de standaardoplossing (3.16).
5.6.2.2. Ontwikkeling
Ontwikkel het chromatogram in richting I met behulpvan de loop -
vloeistof (3.18.1) (laag van 1 cm in een onverzadigde
ontwikkelbak) in het donker totdat het vloeistoffront de grenslijn
bereikt. Neem de plaat uit de ontwikkelbak en laat deze 5 minuten
in het donker en bij omgevingstemperatuur drogen. Verstuif vervol-gens zoutzuur (3.12) opeen strook van 2,5 cm breed waarin de
punten A en B zijn gelegen (in fig. 3 met arcering aangegeven)
totdat deze donker wordt en bescherm de rest van de plaat met
een glasplaat. Laat gedurende 10 minuten in het donker reageren
en droog met een luchtstroom bij omgevingstemperatuur.
Ontwikkel vervolgens het chromatogram in richting II met behulp
van de loopvloeistof (3.18.1) (laag van 1 cm in een onverzadigde
ontwikkelbak) eveneens in het donker, totdat het front van de loop-
vloeistof de grenslijn bereikt. Neem de plaat uit de ontwikkelbak en
laat deze bij omgevingstemperatuur drogen.
5.6.2.3. Beoordelen van het chromatogram
Bekijk het chromatogram onder UV-licht (4.9) en ga de hierna
aangegeven bijzonderheden of kenmerken na:
a) Een blauwe fluorescerende aflatoxine-B
1-vlek wordt zichtbaar,
afkomstig van de in punt C opgebrachte standaardoplossing
(migratie in richting I).
b) Een blauwe fluorescerende vlek van aflatoxine B1(welke niet
met het zoutzuur heeft gereageerd) wordt zichtbaar alsmede
een intensere blauwe fluorescerende vlek van aflatoxine B1-
hemiacetaal, beide afkomstig van de in punt B opgebrachte
standaardoplossing (migratie in richting II).
c) Vlekken zoals die welke onder b) zijn aangegeven, afkomstig
van het in punt A opgebrachte extract van het monster worden
zichtbaar. De plaats van deze vlekken wordt bepaald door de
migratieafstand van aflatoxine B1van punt A af in richting I
(dezelfde afstand als die welke door de in punt C opgebrachte
standaardoplossing is afgelegd) en door de migratie-afstanden
die in richting II zijn afgelegd door aflatoxine B1(welke niet
met het zoutzuur heeft gereageerd) en door aflatoxine B1-hemi-
acetaal (zelfde afstanden als die welke door de in punt B
opgebrachte standaardoplossing zijn afgelegd). De fluores-
centie-intensiteiten van de hemiacetaalvlekken afkomstig van
het extract en van de in punt B opgebrachte standaardoplossing
moeten redelijk overeenstemmen.
6. Berekening van de resultaten
6.1. Visuele meting
Het gehalte aan aflatoxine B1van het monster in µg/kg (ppb) wordt
berekend met behulpvan de volgende formule:
S/C1Y/C1V
W/C1X1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 6
▼B
waarin:
Y en X = volumina in microliter uitgedrukt van de aflatoxine-B1-
standaardoplossing (3.16), resp. van het extract
waarvan de fluorescentie-intensiteiten gelijk zijn;
S = concentratie in microgram aflatoxine B1per ml in de
standaardoplossing (3.16);
V = eindvolume van het extract in microliter, met inachtne-
ming van een eventueel gemaakte verdunning;
W = massa van het monster in gram, overeenkomend met de
voor de kolomzuivering gebruikte hoeveelheid extract.
6.2. Het meten door middel van fluorodensitometrie
Het gehalte aan aflatoxine B1van het monster in µg/kg (ppb) wordt
berekend met behulpvan de volgende formule:
S/C1V
W/C1Y
waarin:
Y = volume van het op de plaat opgebrachte extract in microliter
(10 of 20 µl);
S = het aantal nanogram aflatoxine B1in de extractvlek (reke-
ning houdend met het volume Y) afgeleid uit de metingen;
V = eindvolume van het extract in microliter, met inachtneming
van een eventueel gemaakte verdunning;
W = massa van het monster in gram, overeenkomend met de
voor de kolomzuivering gebruikte hoeveelheid extract.
7. Bereiding en controle van de standaardoplossing (3.16)
7.1. Bepaling van de aflatoxine-B1-concentratie
Bereid een aflatoxine-B1-standaardoplossing in chloroform (3.2) of
in het mengsel van benzeen en acetonitril (3.6) met een concen-
tratie van 8 tot 10 µg per ml. Meet het absorptiespectrum tussen
330 en 370 nm met een spectrofotometer (4.11).
Bepaal de optische dichtheid (A) bij 363 nm wanneer chloroform
als oplosmiddel is gebruikt en bij 348 nm wanneer het mengsel
benzeen-acetonitril als oplosmiddel is gebruikt.
Bereken de aflatoxine-B1-concentratie in microgram per ml oplos-
sing met behulpvan de volgende formules:
312/C1A/C11000
20600voor de oplossing in chloroform
312/C1A/C11000
19800voor de oplossing in het mengsel van benzeen en
acetonitril.
Voer de, voor het bereiden van een standaard-werkoplossing met
een aflatoxine-B1-concentratie van ongeveer 0,1 µg per ml, noodza-
kelijke verdunningen uit onder het uitsluiten van daglicht. Deze
oplossing blijft twee weken stabiel indien zij in de koelkast wordt
bewaard bij 4 ºC.
7.2. Controle op de chromatografische zuiverheid
Breng opeen p laat voor dunnelaagchromatografie (4.8) 5 µl opvan
de standaardoplossing, die 8 tot 10 µg aflatoxine B1per ml bevat
(zie 7.1). Ontwikkel het chromatogram volgens 5.4. Onder UV-licht
mag slechts één vlek zichtbaar zijn; er mag geen fluorescentie
worden waargenomen daar waar de stof oorspronkelijk werd opge-
bracht.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 7
▼B
8. Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee door dezelfde analist aan
hetzelfde monster uitgevoerde parallelle bepalingen zou niet meer
mogen bedragen dan:
25 % van de hoogste waarde bij aflatoxine-B1-gehalten van 10 tot
en met 20 µg/kg,
5 µg in absolute waarde bij gehalten van 20 tot en met 50 µg/kg,10 % van de hoogste waarde bij gehalten van meer dan 50 µg/kg.
9. Reproduceerbaarheid
Zie opmerkingen in deel C, punt 2,
B. BEPALING VAN AFLATOXINE B
1MET HOGEDRUKVLOEISTOF-
CHROMATOGRAFIE
1. Doel en toepassingsgebied
Met behulpvan deze methode is het mogelijk het gehalte aan afla-
toxine B1te bepalen in diervoeders, inclusief die welke citruspulp
bevatten. De onderste bepalingsgrens is 0,001 mg/kg (1 ppb).
2. Principe
Het monster wordt met chloroform geëxtraheerd. Het extract wordt
gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wordt achtereenvolgens
met een Florisil-patroon en een C18-patroon gezuiverd. De uiteinde-
lijke scheiding en bepaling worden uitgevoerd met
hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met een reversed phase
C18-kolom, gevolgd door derivatisering met jodium en fluorescen-
tiedetectie.
N.B.:Mycotoxinen zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen
dienen in een zuurkast te worden uitgevoerd. Speciale voorzorgs-
maatregelen dienen te worden genomen wanneer aflatoxinen in
vaste vorm zijn, vanwege hun elektrostatische karakter waardoor
zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden.
3. Reagentia
3.1. Chloroform, gestabiliseerd met 0,5 tot 1,0 % (m/m) ethanol. Zie
opmerking 10.2.
3.2. Methanol, HPLC-kwaliteit voor bereiding van 3.6.3.3. Aceton.3.4. Acetonitril, HPLC-kwaliteit.3.5. Elutiemiddelen
Bereid deze één dag voor gebruik, of verwijder de lucht er ultra-
soon uit.
3.5.1. Mengsel van aceton (3.3) en water, 98 + 2 (v+v).3.5.2. Mengsel van water en methanol (3.2), 80 + 20 (v+v).3.5.3. Mengsel van water en aceton (3.3), 85 + 15 (v+v).3.6. Mobiele fase voor HPLC
Mengselvanwater, methanol (3.2)enacetonitril (3.4),130+70+40
(v+v+v).
N.B.:Zonoig wordt de samenstelling van de mobiele fase aange-
past aan het gebruikte type HPLC-kolom.
3.7. Verzadigde oplossing van jodium in water. Voeg 2 g jodium toe
aan 400 ml water. Meng gedurende ten minste 90 minuten en
filtreer door een membraanfilter (4.15). Scherm deze oplossing af
tegen licht om ontleding te voorkomen.
3.8. Celite 545, met zuur gewassen, of gelijkwaardig materiaal.
3.9. Florisil-patroon (Waters SEP-PAK), of gelijkwaardig materiaal.3.10. C
18-patroon (Waters SEP-PAK), of gelijkwaardig materiaal.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 8
▼M2
▼M2
3.11. Inert gas, bij voorbeeld stikstof.
3.12. Aflatoxine B1, standaardoplossing in chloroform, concentratie 10 µg/
ml. Controleer de concentratie van de oplossing als volgt: neem het
absorptiespectrum van de oplossing op tussen 330 en 370 nm met
een spectrofotometer (4.23). Meet de absorptie (A) bij het
maximum dicht bij 363 nm. Bereken de concentratie aflatoxine B1in microgram per milliliter oplossing met de formule:
Concentratie èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.12.1. Aflatoxine B1, voorraadstandaardoplossing in chloroform
Breng 2,5 ml standaardoplossing (3.12) kwantitatief over in een
maatkolf van 50 ml en vul aan tot de maatstreepmet chloroform
(3.1). Bewaar deze oplossing goed afgesloten, in aluminiumfolie
gewikkeld en opeen koele (4 ºC) en donkere p laats.
3.13. Aflatoxine B1, ijkoplossingen voor HPLC
N.B.:Gebruik voor de bereiding van deze oplossingen met zuur
gewassen glaswerk (zie bij 4, Apparatuur).
3.13.1. IJkoplossing, 4 ng/ml
Laat de maatkolf met de voorraadstandaardoplossing (3.12.1) in
enkele uren in aluminiumfolie tot kamertemperatuur opwarmen.
Breng 400 µl van de voorraadstandaardoplossing (200 ng aflatoxine
B1) over in een maatkolf van 50 ml en dampdit droog met een
stroom inert gas (3.11).
Los het verkregen residu opin ongeveer 20 ml water/aceton (3.5.3),
vul de oplossing aan tot de maatstreep met het water/aceton-
mengsel en meng goed.
3.13.2. IJkoplossing, 3 ng/ml
Breng 7,5 ml van de ijkoplossing van 4 ng/ml (3.13.1) kwantitatief
over in een maatkolf van 10 ml, vul aan tot de maatstreepmet
water/aceton (3.5.3) en meng goed.
3.13.3. IJkoplossing, 2 ng/ml, tevens referentiestandaard
Breng 25 ml van de ijkoplossing van 4 ng/ml (3.13.1) kwantitatief
over in een maatkolf van 50 ml, vul aan tot de maatstreepmet het
water/aceton-mengsel (3.5.3) en meng goed.
Deze oplossing wordt ook gebruikt voor herhaalde injectie tijdens
HPLC-bepalingen (5.5) en wordt hierna aangeduid als referentie-
standaard.
3.13.4. IJkoplossing, 1 ng/ml
Breng 2,5 ml van de ijkoplossing van 4 ng/ml (3.13.1) kwantitatief
over in een maatkolf van 10 ml, vul aan tot de maatstreepmet het
water/aceton-mengsel (3.5.3) en meng goed.
3.14. Ampul welke een mengsel van aflatoxinen B1,B2,G1en G2in
concentraties van respectievelijk circa 1, 0,5, 1 en 0,5 µg/ml in
1 ml chloroform bevat.
3.14.1. Testoplossing voor HPLC
Breng de inhoud van de ampul (3.14) over in een glazen buis met
glazen stopof in een flesje met schroefdop . Breng 40 µl van deze
oplossing over in een glazen buis met glazen stop (4.22) (met zuur
gewassen). Dampde chloroform droog met een stikstofstroom en
los het residu opin 10 ml water/aceton-mengsel (3.5.3).
3.15. Reagentia voor bevestigingstest (6).3.15.1. Verzadigde oplossing van natriumchloride in water.
3.15.2. Natriumsulfaat, watervrij, in korrels.
4. Apparatuur
Opgelet: Het gebruik van niet met zuur gewassen glaswerk voor
oplossingen van aflatoxine in water kan leiden tot verlies van afla-
toxine. Bijzondere aandacht dient te worden besteed aan nieuw
glaswerk en wegwerpglaswerk, zoals flesjes voor monsterwisselaars
en pasteurpipetten. Glaswerk dat met oplossingen van aflatoxine in1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 9
▼M2
aanraking komt, moet daarom enkele uren in verdund zuur (bij
voorbeeld zwavelzuur, 2 mol/l) worden gelegd en daarna ter
verwijdering van zuurresten grondig met gedestilleerd water
worden gespoeld (bij voorbeeld drie maal, controleren met pH-
papier). In de praktijk is deze behandeling nodig voor de rondbo-
demkolf (4.4), de maatkolven en maatcilinders, de voor
ijkoplossingen en extracten gebruikte flesjes en buizen (vooral
voor flesjes voor monsterwisselaars) en de pasteurpipetten voor
zover deze worden gebruikt voor het overbrengen van ijkoplos-
singen of extracten.
4.1. Maal- en mengtoestel.
4.2. Zeef met openingen van 1,0 mm (ISO R 565).4.3. Schudmachine.4.4. Rotatievacuümverdamper, voorzien van een rondbodemkolf van
150-250 ml.
4.5. Hogedrukvloeistofchromatograaf; injector met injectielus geschikt
voor injectie van 250 µl. Zie de instructies van de fabrikant voor
de gedeeltelijke of volledige vulling van de injectielus.
4.6. Analytische HPLC-kolom: C
18-vulling van 3 µm of 5 µm deeltjes.
4.7. Pulsvrije pomp voor de toevoer van het jodiumreagens na de
kolom.
4.8. T-stuk zonder dood volume (Valco), roestvrij staal (1/16 ″
× 0,75 mm).
4.9. Spiraalvormig reactiekanaal; teflon of roestvrij staal. In combinatie
met 5 µm of 3 µm HPLC-kolommen komen afmetingen van
3 000 × 0,5 mm tot 5 000 × 0,5 mm in aanmerking.
4.10. Gethermostateerd waterbad, ingesteld op60 ºC, waarmee een
temperatuurregeling van beter dan 0,1 ºC mogelijk is.
4.11. Fluorescentiedetector met excitatie- en emissiegolflengten van
respectievelijk 365 nm en 435 nm (voor een filterinstrument: emis-
siegolflengte > 400 nm). Detectie van ten minste 0,05 ng aflatoxine
B1moet mogelijk zijn. Het kan nodig zijn enige tegendruk toe te
passen (bij voorbeeld in de vorm van een restrictor of een spiraal
van teflon of roestvrij staal aan de uitgang van de detector), om
luchtbellen in de doorstroomcel tegen te gaan.
4.12. Recorder.
4.13. Elektronische integrator (facultatief).
4.14. Vouwfilters, doorsnede 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 of gelijk-
waardig.
4.15. Membraanfilter met poriegrootte van 0,45 µm, Millipore H.A.W.P.
04700 of gelijkwaardig.
4.16. Erlenmeyerkolf van 500 ml met glazen stop.4.17. Glazen kolom (inwendige doorsnede ongeveer 1 cm, lengte onge-
veer 30 cm) voorzien van een Luer-uiteinde.
4.18. Luer nylon kraan, chloroformbestendig (bij voorbeeld Bio-rad
7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 of gelijkwaardig).
4.19. Chemisch inerte injectiespuit, 10 ml, met Luer-verbinding.4.20. Injectiespuit, geschikt voor HPLC-injectie van 250 µl (zie 4.5).4.21. Microspuit van 100 µl voor de bereiding van de ijkoplossingen
(nauwkeurigheid binnen 2 %, te controleren door wegen).
4.22. Glazen buizen, geijkt op10 ml, met glazen stop .4.23. Spectrofotometer, geschikt voor UV-meting.4.24. Apparatuur voor bevestigingstest (6)4.24.1. Scheitrechter van 100 ml, met teflonkraan met zuur gespoeld.4.24.2. Verwarmingsblok, 40-50 ºC.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 10
▼M2
5. Werkwijze
5.1. Monsterbereiding
Maal het monster zo fijn dat het door de zeef (4.2) gaat.
5.2. Testmonster
Weeg 50,0 g van het bereide monster af in de erlenmeyer (4.16).
5.3. Extractie
Voeg aan het testmonster (5.2) 25 g Celite (3.8), 250 ml chloro-
form (3.1) en 25 ml water toe. Sluit de erlenmeyer af en schud 30
minuten opde schudmachine (4.3). Filtreer het mengsel door een
vouwfilter (4.14) en vang 50 ml van het filtraat op. Neem, indien
nodig, een hoeveelheid van het filtraat en verdun dit tot 50 ml
met chloroform, zodanig dat de concentratie aan aflatoxine B1niet
hoger is dan 4 ng/ml.
5.4. Opzuivering (de opzuivering dient zonder noemenswaardige onder-
brekingen te worden uitgevoerd).
Opgelet:
— Zorg dat in de onderzoekruimte geen daglicht wordt toegelaten.
Dit kan worden bereikt door een van de volgende maatregelen:
1. UV-absorberende folie opde ramen, in combinatie met
gedempt licht (geen direct zonlicht);
2. gordijnen of jaloezieën in combinatie met kunstlicht (TL-
buizen zijn aanvaardbaar).
— Aflatoxine-bevattende oplossingen moeten zoveel mogelijk
beschermd worden tegen licht (donker bewaren, aluminiumfolie
gebruiken).
5.4.1. Zuivering met Florisil-SEP-PAK
5.4.1.1. Voorbereiding patroon en koppeling aan kolom
Sluit aan het korte uiteinde van een Florisil-patroon (3.9) een kraan
aan (zie figuur 1). Spoel de patroon en verwijder de lucht eruit door
van 10 ml chloroform (3.1) met een injectiespuit (4.19) 8 ml snel
via de kraan door de patroon te leiden. Verbind het lange uiteinde
van de patroon met een glazen kolom (4.17) en leid de overblij-
vende 2 ml chloroform door de patroon in de kolom. Sluit de
kraan en verwijder de injectiespuit.
5.4.1.2. Zuivering
Breng het bij 5.3 verzamelde filtraat in de kolom en laat het filtraat
met behulp van de zwaartekracht door de patroon elueren. Spoel
met 5 ml chloroform (3.1) en vervolgens met 20 ml methanol
(3.2). Verwerpde eluaten. Voorkomen moet worden dat de p atroon
bij deze handelingen droog komt te staan. Elueer het aflatoxine B1met 40 ml aceton/water (3.5.1) en vang het gehele eluaat opin derondbodemkolf van de rotatievacuümverdamper (4.4). Damp het
eluaat in aan de rotatievacuümverdamper bij 40-50 ºC tot geen
aceton meer wordt afgedestilleerd. ( N.B.:Opdit p unt blijft er
ongeveer 0,5 ml vloeistof in de kolf over; proefondervindelijk is
gebleken dat verder indampen geen kwaad kan en dat wanneer er
0,5 ml vloeistof over is, er geen noemenswaardige hoeveelheid
aceton meer is; acetonresten kunnen leiden tot een verlies aan afla-
toxine B
1in de C18-patroon.) Voeg aan het residu 1 ml methanol
(3.2) toe, zwenk de kolf rond zodat opde wand van de kolf aanwe-
zige aflatoxine B1wordt opgelost, voeg 4 ml water toe en meng.
Koppel de patroon af en verwijder deze. Spoel de glazen kolom
met water en bewaar deze voor de C18-zuivering.
5.4.2. Zuivering met C18-SEP-PAK
5.4.2.1. Voorbereiding patroon en koppeling aan kolom
Sluit aan het korte uiteinde van een C18-patroon (3.10) een kraan
(4.18) aan (zie figuur 1). Spoel de patroon en verwijder eventuele
lucht door met een spuit (4.19) 10 ml methanol (3.2) snel via dekraan door de patroon te leiden (luchtbellen in de patroon zijn
zichtbaar als lichtvlekjes tegen een grijze achtergrond). Neem
10 ml water en leid 8 ml door de patroon (bij de overgang van
methanol naar water oppassen voor de vorming van luchtbellen).
Verbind het lange uiteinde van de patroon met een glazen kolom
(4.17) en leid de overblijvende 2 ml water door de patroon in de
kolom. Sluit de kraan en verwijder de spuit.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 11
▼M2
5.4.2.2. Zuivering
Breng het bij 5.4.1.2 verzamelde extract kwantitatief over in de
kolom (4.17), spoel de kolf tweemaal met 5 ml water/methanol-
mengsel (3.5.2) en laat de vloeistof door middel van de zwaarte-kracht door de patroon elueren. Voorkomen moet worden dat de
patroon bij deze handelingen droog komt te staan. (Indien zich in
de vernauwing van de patroon luchtbellen vormen, wordt de door-
stroming gestopt en wordt zachtjes tegen de bovenzijde van de
kolom getikt, zodat de bellen verdwijnen, waarna de doorstroming
wordt hervat.) Elueer met 25 ml water/methanol-mengsel (3.5.2).
Verwerpde eluaten. Elueer het aflatoxine B
1met 50 ml water/
aceton-mengsel (3.5.3) en vang het gehele eluaat opin een maat-
kolf van 50 ml. Vul aan tot de maatstreepmet water en meng: de
verkregen monsteroplossing wordt gebruikt voor de chromatografie
(5.5).
Opgelet: Filtreren van het uiteindelijke extract voor de HPLC-stap
is meestal niet nodig. Wordt filtreren wel nodig geacht,
dan dienen geen cellulosefilters te worden gebruikt, daar
deze tot een verlies aan aflatoxine B1kunnen leiden.
Teflon filters (4.15) zijn wel bruikbaar.
5.5. Hogedrukvloeistofchromatografie
(Zie figuur 2 voor de opstelling van de apparatuur.) De instru-
menten moeten de gelegenheid hebben om optemp eratuur te
komen en stabiel te worden.
Opmerking 1:
De voor de HPLC-mobiele fase en het reagens na de kolom
vermelde stroomsnelheden zijn slechts indicatief. Zo nodig worden
deze aan de aard en de afmetingen van de HPLC-kolom aangepast.
Opmerking 2:
De piekuitslagen van aflatoxinen zijn afhankelijk van de tempera-
tuur en daarom moet voor eventueel verloopworden
gecompenseerd (zie figuur 3). Door injectie van een vaste hoeveel-
heid referentiestandaard aflatoxine B1(3.13.3) met regelmatige
tussenpozen (elke derde injectie) kunnen de piekuitslagen voor
aflatoxine B1tussen deze referentiestandaarden aan de hand van
de gemiddelde uitslag worden gecorrigeerd, mits het verschil tussen
de uitslagen van opeenvolgende referentiestandaarden klein is
(< 10 %). Daarom moeten injecties zonder onderbrekingen plaats-
hebben. Indien een onderbreking nodig is, dienen de laatste
injectie voor de onderbreking en de eerste na de onderbreking
injecties van de referentiestandaard (3.13.3) te zijn. Aangezien de
ijklijn recht is en door de oorsprong gaat, worden de hoeveelheden
aflatoxine B1in het monster rechtstreeks aan de hand van de naast-
liggende referentiestandaarden bepaald.
5.5.1. Instelling van de HPLC-pomp
Stel de HPLC-pomp (4.5) zo in dat voor een HPLC-kolom van 5 µm
respectievelijk 3 µm (4.6) de stroomsnelheid van de mobiele fase
(3.6) 0,5 respectievelijk 0,3 ml/min. bedraagt.
5.5.2. Instelling van de pomp na de kolom
Stel de pomp (4.7) zo in dat de jodiumoplossing (3.7) een stroom-
snelheid van 0,2-0,4 ml/min. heeft. Als vuistregel dienen bij
stroomsnelheden van de mobiele fase van 0,5 respectievelijk
0,3 ml/min. stroomsnelheden na de kolom van ongeveer 0,4 respec-
tievelijk 0,2 ml/min. te worden gekozen.
5.5.3. Fluorescentiedetector
Stel de fluorescentiedetector (4.11) in opeen excitatiegolflengte
van 365 nm en een emissiegolflengte van 435 nm (filterinstrument:
> 400 nm). Stel de verzwakker van de detector zo in dat voor 1 ng
aflatoxine B1de recorder ongeveer 80 % van de volledige uitslag
geeft.
5.5.4. Injector
Injecteer van alle oplossingen hoeveelheden van 250 µl volgens de
aanwijzingen van de fabrikant van de injector.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 12
▼M2
5.5.5. Controle opde chromatografische scheiding
Injecteer de testoplossing voor HPLC (3.14.1). De dalen dienen een
afstand tot de basislijn te hebben van minder dan 5 % van de som
van de hoogten van de aangrenzende pieken.
5.5.6. Controle opde stabiliteit van het systeem
Injecteer voorafgaande aan een reeks analyses herhaaldelijk de
referentiestandaard (3.13.3) totdat stabiele piekuitslagen worden
verkregen. ( N.B.:De piekuitslagen voor aflatoxine B1van twee
opeenvolgende injecties mogen niet meer dan 6 % van elkaar
verschillen.) Controleer onmiddellijk daarna de lineariteit (5.5.7).
5.5.7. Controle opde lineariteit
Injecteer de ijkoplossingen van aflatoxine B1(3.13.1 tot en met
3.13.4). Als derde injectie wordt telkens de referentiestandaard
(3.13.3) gebruikt ter correctie van het verloop in piekrespons.
(N.B.:De piekuitslagen van de referentiestandaard mogen niet
meer dan 10 % verschil geven in 90 minuten.) Corrigeer voor
verloopmet de formule bij p unt 7. De ijklijn moet recht zijn en
door de oorsprong lopen, binnen tweemaal de standaardfout voor
de geschatte Y-waarde. De gevonden waarden mogen niet meer
dan 3 % van de nominale waarden afwijken. Als aan deze eisen is
voldaan, wordt dadelijk verdergegaan. Zo niet, dan worden eerst de
oorzaken van de problemen opgespoord en verholpen.
5.5.8. Injectie van de monsterextracten
Injecteer de gezuiverde monsterextracten (5.4.2.2). Injecteer na
twee monsterextracten telkens weer de referentiestandaard
(3.13.3), dus: referentiestandaard, extract, extract, referentiestan-
daard, extract, extract, referentiestandaard, enzovoort.
6. Bevestigingstest
6.1. Verdere behandeling van het extract (5.4.2.2)
Voeg aan het bij 5.4.2.2 verkregen extract 5 ml natriumchlorideop-
lossing (3.15.1) toe. Extraheer het mengsel in een scheitrechter
(4.24.1) driemaal telkens een minuut met 2 ml chloroform (3.1).
Giet de verzamelde chloroformextracten over ongeveer 1 g
natriumsulfaat (3.15.2) in een reageerbuis van 10 ml. Hiervoor kan
een trechtertje (doorsnede 4 cm) met een propje watten in de
vernauwing worden gebruikt, waaropzich ongeveer 1 g natriumsul-
faat (3.15.2) bevindt.
Was het natriumsulfaat met een paar ml chloroform en vang dit op
in dezelfde reageerbuis. Damphet chloroformextract droog in
dezelfde reageerbuis met behulpvan het verwarmingsblok (4.24.2)
en los het residu weer opin 1 ml chloroform.
6.2. Bereiding van het derivaat en dunnelaagchromatografie
Zie Richtlijn 76/372/EEG van de Raad van 1 maart 1976, bijlage,
methode A, onder 5.6.2.
7. Berekening van de resultaten
Bereken het in het monster aanwezige gehalte aan aflatoxine B1in
µg/kg met behulpvan de formule:
gehalte aan aflatoxine B 1in èmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
waarin:
m = hoeveelheid aflatoxine B1in ng volgens de B1-piek
van het monster, die als volgt wordt berekend:
m¼P monsterðÞ
Ps t1ðÞ þPs t2ðÞ/C22rs tðÞ
P(monster) = piekoppervlak voor aflatoxine P1in het monster1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 13
▼M2
P(st1) = piekoppervlak voor aflatoxine B1in voorafgaande
referentiestandaard (3.13.3)
P(st2) = piekoppervlak voor aflatoxine B1in eerstvolgende
referentiestandaard (3.13.3)
r(st) = ingespoten hoeveelheid aflatoxine B1in de referen-
tiestandaard (3.13.3) in ng
Vm= volume van het ingespoten monsterextract in ml
Vext= eindvolume van het monsterextract in ml, rekening
houdend met eventuele verdunning (zie 5.3)
M = massa van het monster in gV
f= volume van het in de Florisil-patroon overgebrachte
filtraat (5.4.1.2) in ml
Vc= volume van de voor de monsterextractie gebruikte
chloroform in ml
Indien het protocol van de hier beschreven methode wordt gevolgd,
kan de formule als volgt worden vereenvoudigd:
gehalte aan aflatoxine B1in µg/kg = 20 × m
7.1. De resultaten kunnen ook worden berekend door middel van
metingen van de piekhoogten.
8. Herhaalbaarheid
Zie bij 10.1 (opmerkingen).
9. Reproduceerbaarheid
Zie bij 10.1.
10. Opmerkingen
10.1. Precisie
Een internationaal uitgevoerd ringonderzoek(1) opdiervoeders
leverde voor de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid de in
tabel 1 weergegeven resultaten. Onder herhaalbaarheid (r) wordt
hier verstaan de grootste verhouding die met een waarschijnlijkheid
van 95 % bij vergelijking van twee uitkomsten van hetzelfde
monster in hetzelfde laboratorium onder overeenkomstige omstan-
digheden niet significant is. Het begriprep roduceerbaarheid (R) is
overeenkomstig gedefinieerd voor de vergelijking van twee labora-
toria volgens ISO 3534-1977, 2.35(2) en Beschikking nr. 610/89/
EEG van de Commissie van 14 november 1989(3). In tabel 1 zijn
r en R ook vermeld als variatiecoëfficiënten.
Tabel 1
Herhaalbaarheid (r) en reproduceerbaarheid (R), uitgedrukt als
verhoudingen en overeenkomstige variatiecoëfficiënten
(15 laboratoria)
Gehalte r R CVr(*) CVR(*)
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = variatiecoëfficiënt.
10.2. Stabilisatie van chloroform (3.1)
De adsorptie-eigenschappen van de Florisil-patroon kunnen zich
wijzigen, als de chloroform gestabiliseerd wordt met andere
middelen dan ethanol. Dit moet geverifieerd worden volgens 10.3,
indien de aangeduide chloroform niet beschikbaar is.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 14
(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3) PB nr. L 351 van 2. 12. 1989, blz. 39.
▼M2
10.3. Nauwkeurigheid
De juiste uitvoering van de methode wordt gecontroleerd door
herhalingsbepalingen op gecertificeerde referentiematerialen. Indien
die niet beschikbaar zijn, dient de methode gecontroleerd te worden
met terugvindingsproeven aan blanco-monsters met toevoeging. Het
gemiddelde terugvindingspercentage moet meer dan 80 % en
minder dan 110% van de werkelijke waarde zijn.
Figuur 1: Combinatie van kolom en patroon1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 15
▼M2
Figuur 2: Stroomschema van het LC-systeem met derivatisering
met jodium na de kolom
Figuur 3: Compensatie voor verloop in piekuitslag voor aflatoxine
B1door regelmatige injectie van referentiestandaard (3.13.3)
C. OPMERKINGEN IN VERBAND MET DE METHODEN A EN B
1.Ontvetten
Monsters met een vetgehalte van meer dan 5 % moeten met petroleumether
(kookpunt 40-60 ºC) worden ontvet nadat zij op de in punt 5.1 aangegeven
wijze zijn bereid. In dergelijke gevallen moeten de analyseresultaten worden
uitgedrukt opbasis van het gewicht van het niet-ontvette monster.
2.Reproduceerbaarheid van de resultaten voor methode A
De reproduceerbaarheid van de resultaten, zijnde de variatie tussen de resul-
taten van twee of meer laboratoria ophetzelfde monster, werd vastgesteld op :
± 50 % van gemiddelde waarde in aflatoxine B1bij gemiddelde waarden van
10 tot en met 20µg/kg;
± 10 µg/kg van de gemiddelde waarde bij gemiddelde waarden hoger dan 20
en tot en met 50 µg/kg;
± 20 % van de gemiddelde waarde bij gemiddelde waarden van meer dan
50 µg/kg.1976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 16
▼M3
▼B
BIJLAGE
Figuur 1
Figuur 21976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 17
▼B
Figuur 31976L0372 — NL — 03.05.1994 — 003.001 — 18