1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
veevoeders
(72/199/EEG)
(PB L 123 van 29.5.1972, blz. 6)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1 Richtlijn 81/680/EEG van de Commissie van 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie van 20 december 1983 L 15 28 18.1.1984
Gerectificeerd bij:
►C1 Rectificatie PB L 320 van 27.11.1980, blz. 43 (72/199/EEG)
▼B
DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analyseme-
thoden voor de officiële controle van veevoeders
(72/199/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethodenvoor de officiële controle van veevoeders (
1), inzonderheid op artikel 2,
Overwegende datbovenbedoelde richt lijn bepaaltdatde officiële
controle van veevoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de op
grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van veevoeders gestelde eisen is voldaan,geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende datbij richt lijnen nr. 71/250/EEG en nr. 71/393/EEG van
de Commissie van 15 juni 1971 (
2) onderscheidenlijk 18 november
1971 (3) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden
is vastgelegd; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamhedensindsdien hebben gemaakt het nuttig is een derde serie methoden uitte vaardigen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor
veevoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders ten aanzien van hun gehalte aan zetmeel, ruw eiwit,
ruw eiwit oplosbaar in pepsine en zoutzuur, en aan vrij en totaalgossypol, alsmede ten aanzien van de pepsineactiviteit, geschiedenvolgens de in de bijlage I bij deze richtlijn omschreven methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders tot opsporing en identificatie van antibiotica van degroep tetracyclinen zowel als ten aanzien van het gehalte in veevoedersaan chloortetracycline, oxytetracicline, tetracycline, oleandomycine,tylosine en virginiamycine geschieden volgens de in bijlage II bij dezerichtlijn omschreven methoden.
Artikel 3
De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 juli 1973 de noodzakelijke wettelijke
of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om zich te voegennaar deze richtlijn. Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan inkennis.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(3) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 3
▼B
BIJLAGE I
1.BEPALING VAN ZETMEEL
Polarimetrische methode
1.Doel en toepassingsgebied
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
zetmeel en afbraakprodukten van zetmeel met een hoog moleculair gewicht
in veevoeders, met uitzondering van die welke bietensnijdsels, bietenpulp,
gedroogd bieteloof of gedroogde bietekoppen, aardappelpulp, gedroogde
gist, inulinehoudende stoffen (bij voorbeeld topinamboersnijdsels en -meel)
of kanen bevatten.
2.Principe
De bepaling bestaat uit twee onderdelen. Het eerste onderdeel omvat de
behandeling van het monster met warm verdund zoutzuur. Na klaren en
filtreren wordt de optische draaiing van de oplossing polarometrisch gemeten.
Het tweede onderdeel omvat de extractie van het monster met ethanol 40 %.
Na aanzuren van het filtraat met zoutzuur, klaren en filtreren wordt de opti-
sche draaiing gemeten onder dezelfde omstandigheden als bij het eerste
onderdeel.
Het verschil tussen de beide metingen, vermenigvuldigd met een bekende
factor, geeft het zetmeelgehalte van het monster.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 25 % in gewicht, d = 1,126.3.2 Zoutzuur 11,28 g/l.
De sterkte moet worden gecontroleerd door titratie met natronloog 0,1 N
t.o.v. de indicator methylrood 1 g/l in ethanol 94 % (v/v). 10 ml
= 30,94 ml NaOH 0,1 N.
3.3 Carrez-I-oplossing: los op in water 21,9 g zinkacetaat Zn (CH
3COO)2·
2H2O en 3 g ijsazijn. Vul aan met water tot 100 ml.
3.4 Carrez-II-oplossing: los op in water 10,6 g kaliumhexacyanoferraat (II),
K4[Fe (CN)6]·3 H2O· Vul aan met water tot 100 ml.
3.5 Ethanol 40 % (v/v), d: 0,948 bij 20 ºC.
4.Apparatuur
4.1 Conische kolf van 250 ml met normaalslijpstuk en terugvloeikoeler.4.2 Polarimeter of saccharimeter.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van het monster
Maak hetmonst er zodanig fijn dathetgeheel een zeef metronde mazen
van 0,5 mm diameter passeert.
5.2Bepaling van de totale optische draaiing (P of S) (zie opmerking 7.1)
Breng 2,5 g van het gemalen monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen,
in een maatkolf van 100 ml. Voeg toe 25 ml zoutzuur (3.2), schud de
kolf om, totdat de stof goed gesuspendeerd is en voeg nogmaals 25 ml
zoutzuur (3.2) toe. Plaats de kolf in een bad met kokend water en schud
gedurende de eerste 3 minuten krachtig en regelmatig om, ten einde
klontvorming te vermijden. De hoeveelheid water in het bad moet groot
genoeg zijn om aan de kook te blijven wanneer de kolf erin wordt
geplaatst. De kolf mag tijdens het omschudden niet uit het water worden
gehaald. Neem na precies 15 minuten de kolf uit het bad, voeg er 30 ml
koud water aan toe en laat onmiddellijk afkoelen tot 20 ºC.
Voeg toe 5 ml Carrez-I-oplossing (3.3) en schud gedurende één minuut
om. Voeg vervolgens toe 5 ml Carrez-II-oplossing (3.4) en schud
nogmaals gedurende één minuut om. Vul aan met water tot de streep,
meng en filtreer. Indien het filtraat niet volledig helder is (wat zelden1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 4
▼B
voorkomt), herhaal dan de analyse met grotere hoeveelheden Carrez-I en
II-oplossingen, bij voorbeeld 10 ml.
Meetvervolgens de opt ische draaiing van de oplossing in een buis van
200 mm met behulp van de polarimeter of de saccharimeter.
5.3Bepaling van de optische draaiing (P ′of S ′) van de in 40 % ethanol
oplosbare stoffen
Weeg af 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng deze in
een maatkolf van 100 ml. Voeg toe ca. 80 ml ethanol (3.5) (zie opmer-
king 7.2) en laat de kolf gedurende 1 h staan bij kamertemperatuur;
schud de oplossing gedurende die tijd 6 maal krachtig, zodat de stof
goed met het ethanol wordt vermengd. Vul vervolgens aan met ethanol
(3.5) tot de streep, meng en filtreer.
Pipeteer 50 ml van het filtraat (= 2,5 g monster) in een conische kolf van
250 ml, voeg toe 2,1 ml zoutzuur (3.1) en zwenk krachtig om. Verbind
de conische kolf met een terugvloeikoeler en plaats de kolf in een bad
met kokend water. Neem na precies 15 minuten de conische kolf uit het
bad, breng de inhoud ervan meteen kleine hoeveelheid koud wat er over
in een maatkolf van 100 ml en laat afkoelen tot 20 ºC.
Klaar vervolgens metde Carrez-oplossingen I (3.3) en II (3.4), vul aan
met water tot de streep, meng, filtreer en meet de optische draaiing als
aangegeven onder 5.2, tweede en derde alinea.
6.Berekening van de resultaten
Bereken het gehalte aan zetmeel, uitgedrukt in percenten van het monster, als
volgt:
6.1Metingen met de polarimeter
percentzet meel ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
waarin:
P = totale optische draaiing in booggraden
P′ = optische draaiing in booggraden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen
α½/C13820º
D = specifiek draaiend vermogen van zuiver zetmeel. De
waarden die conventioneel D voor deze factor worden
gebruiktzijn de volgende:
+ 185,9º: rijstezetmeel,
+ 185,4º: aardappelzetmeel,+ 184,6º: maïszetmeel,
+ 182,7º: tarwezetmeel+ 181,5º: gerstezetmeel+ 181,3º: haverzetmeel
+ 184,0º: andere zetmeelsoorten alsmede zetmeelmengsels in
mengvoeders.
6.2Metingen m.b.v. de saccharimeter
percentzet meel ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = totale optische draaiing in saccharimetrische graden.
S′ = optische draaiing in saccharimetrische graden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen.
N = gewichtin g van de hoeveelheid saccharose, die in 100 ml
water bij een laagdikte van 200 mm een optische draaiing van
100 saccharimetrische graden geeft.
Dit gewicht varieert naargelang van het type saccharimeter:16,29 g voor Franse saccharimeters
26,00 g voor Duitse saccharimeters1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 5
▼C1
▼B
▼B
20,00 g voor gemengde saccharimeters
α½/C13820º
D= specifiek draaiend vermogen van zuiver zetmeel (zie 6.1).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
0,4 % absoluut bij gehalten van minder dan 40 % zetmeel;
1 % relatief bij gehalten van 40 % zetmeel of meer.
7.Opmerkingen
7.1 Indien het monster meer dan 6 % carbonaten bevat, berekend als
calciumcarbonaat, moeten deze worden ontleed vóór de bepaling van de
totale optische draaiing door een behandeling met precies de daarvoor
benodigde hoeveelheid verdund zwavelzuur.
7.2 Produkten met een hoog gehalte aan lactose, zoals weipoeder, onder-
melkpoeder, enzovoort worden, na het toevoegen van de 80 ml ethanol
(3.5) als volgtbehandeld:
Verbind de kolf met een terugvloeikoeler en plaats de kolf gedurende 30
minuten in een waterbad van 50 ºC. Laat vervolgens afkoelen en handel
verder als beschreven onder 5.3.
2.BEPALING VAN RUW EIWIT
1.Doel en toepasbaarheid
Het voorschrift beschrijft de methode om op conventionele wijze het gehalte
aan ruw eiwit in veevoeders vast te stellen door bepaling van het gehalte aan
stikstof volgens Kjeldahl.
2.Beginsel
Het monster wordt langs natte weg gedestrueerd. De zure oplossing wordt
met natronloog alkalisch gemaakt. De vrijgekomen ammoniak wordt door
destilleren uitgedreven en opgevangen in een bekende hoeveelheid zwavel-
zuur, waarvan de overmaat met natronloog wordt getitreerd.
3.Reagentia
3.1 Kaliumsulfaatp.a.
3.2 Katalysator: koper (II) oxide p.a., CuO, of gekristalliseerd kopersulfaat
p.a., CuSO4.5 H2O, of kwik, of kwik (II) oxide p.a., HgO.
3.3 Zink p.a., in korrelvorm.3.4 Zwavelzuur p.a., d = 1,84.
3.5 Zwavelzuur 0,1 N.
3.6 Zwavelzuur 0,5 N.3.7 Methylrood: 3 g/l in ethanol van 95—96 % (v/v).3.8 Natronloog 400 g/l.3.9 Natronloog 0,1 N.3.10 Natronloog 0,25 N.3.11 Verzadigde natriumsulfide-oplossing p.a.
3.12 Natriumthiosulfaatoplossing 80 g/l, Na
2S2O3.5 H2O p.a.
3.13 Puimsteenkorrels, met zoutzuur gewassen en gegloeid.
4.Apparatuur
Destructie- en destillatieapparaat volgens Kjeldahl (zie opmerking 7.1).
5.Uitvoering
5.1Destructie
Weeg af 1 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng dit in de
kolf van het destructieapparaat. Voeg hieraan toe 10 g kaliumsulfaat1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 6
▼B
(3.1), de benodigde hoeveelheid katalysator (3.2) (0,3 à 0,4 g koper (II)
oxide of 0,9 à 1,2 g kopersulfaatof een druppel kwik of 0,6 à 0,7 g kwik
(II) oxide), 25 ml zwavelzuur (3.4) en enkele puimsteenkorrels (3.13).
Meng de inhoud van de kolf. Verhitde kolf eerstzachten zwenk van
tijd tot tijd om tot de massa verkoold is en het schuim verdwenen; verhit
vervolgens krachtiger tot de vloeistof regelmatig kookt. Zorg ervoor dat
de wand nietoververhitraakten datgeen organische st of aan de wand
gaat vastzitten. Houd de vloeistof nog een uur aan de kook nadat deze
helder en kleurloos is geworden (of lichtgroen bij aanwezigheid van een
koperkatalysator). Laat vervolgens afkoelen.
5.2Destillatie
Voeg onder omzwenken voorzichtig 250 tot 350 ml water toe, waarbij de
sulfaten volledig dienen op te lossen. Laat afkoelen. Voeg vervolgens
enkele zinkkorrels (3.3) toe.
Breng in de opvangkolf van het destillatieapparaat afhankelijk van het te
verwachten stikstofgehalte precies 25 ml zwavelzuur 0,1 N (3.5) of 0,5 N
(3.6) (zie opmerking 7.2), alsmede enkele druppels methylrood (3.7).
Verbind de kolf met het destillatieapparaat en zorg ervoor dat het
uiteinde van de koelbuis zich ten minste 1 cm onder het vloeistofopper-
vlak in de opvangkolf bevindt. Laat langzaam via de druppeltrechter (zie
opmerking 7.3) in de kolf lopen 100 ml natronloog 40 % (3.8).
Voeg bij gebruik van een kwikkatalysator bovendien toe in de kolf hetzij
10 ml natriumsulfide-oplossing (3.11), hetzij 25 ml natriumthiosulfaatop-
lossing (3.12).
Verhit de kolf zodanig dat in 30 minuten 150 ml vloeistof overdestilleert.
Controleer na 30 minuten met behulp van lakmoespapier of het dan over-
komende destillaat neutraal is. Destilleer bij een alkalische reactie verder
tot het destillaat neutraal reageert op lakmoespapier. Zwenk tijdens de
destillatie van tijd tot tijd de inhoud van de opvangkolf om en let op de
kleur ervan. Voeg, in geval van een kleuromslag naar geel, onmiddellijk
een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid zwavelzuur 0,1 N (3,5) of 0,5 N
(3.6) toe.
5.3Titratie
Titreer de overmaatzwavelzuur in de opvangkolf met natronloog 0,1 N
(3.9) of 0,25 N (3.10), afhankelijk van de normaliteit van het gebruikte
zwavelzuur tot een kleuromslag naar lichtgeel.
5.4Controle van de methode
Verricht een blancobepaling (destillatie en titratie) zonder analysemate-
riaal om na te gaan of de reagentia stikstofvrij zijn. Voer, om de
nauwkeurigheid van de methode te toetsen, de analyse (destructie, destil-
latie en titratie) uit op 1,5 à 2,0 g aceetanilide p.a. (smp. 114 ºC; % N:
10,36) in aanwezigheid van 1 g stikstofvrije saccharose. 1 g aceetanilide
verbruikt14,80 ml zwavelzuur 0,5 N.
6.Berekening van de resultaten
Bereken de hoeveelheid verbruiktzwavelzuur. 1 ml zwavelzuur 0,1 N komt
overeen met 1,4 mg stikstof. Vermenigvuldig de hoeveelheid stikstof met de
factor 6,25. Druk het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan:
0,2 % absoluut bij gehalten van minder dan 20 % ruw eiwit;
1,0 % relatief bij gehalten van 20 tot 40 %;
0,4 absoluutbij gehalt en van meer dan 40 %.
7.Opmerkingen
7.1 Apparatuur waarbij het nodig is het destruaat over te brengen in een
destillatiekolf mag eveneens gebruikt worden. Bij het overbrengen
mogen geen verliezen optreden.
7.2 Voor stikstofarme veevoeders kan de in de opvangkolf te brengen
hoeveelheid van 25 ml zwavelzuur 0,1 N eventueel worden terugge-
bracht tot 10 of 15 ml en met water worden aangevuld tot 25 ml.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 7
▼B
7.3 Indien de destillatiekolf niet voorzien is van een druppeltrechter moet de
natronloog worden toegevoegd onmiddellijk voordat de kolf met de
koeler wordtverbonden; laathierbij de vloeist of langzaam langs de
wand van de kolf toevloeien ten einde menging met de zure oplossing
zoveel mogelijk te voorkomen.
3.BEPALING VAN RUW EIWIT, OPLOSBAAR IN PEPSINE EN ZOUT-
ZUUR
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
ruw eiwit, oplosbaar in pepsine en zoutzuur onder vastgestelde omstandig-
heden. Deze methode is toepasselijk voor alle veevoerders.
2.Beginsel
Hetmonst er wordtgedurende 48 h bij 40 ºC behandeld meteen oplossing
van pepsine in zoutzuur. De suspensie wordt gefiltreerd en het gehalte aan
stikstof van het filtraat wordt bepaald volgens de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur d = 1,125.
3.2 Zoutzuur 0,075 N.
3.3 Pepsine 2,0 E/mg. Deze activiteit is gedefinieerd in de methode van deel
4 van deze bijlage en dient volgens deze methode gecontroleerd te
worden.
3.4 Pepsine-oplossing, ca. 0,2 g/l in zoutzuur (3.2), vers bereid, activiteit
400 E/l.
3.5 Antischuimemulsie (bijvoorbeeld siliconen).
3.6 Alle reagentia genoemd onder punt 3 van de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad of broedstoof, ingesteld op 40 ºC ± 1 ºC.
4.2 Destructie- en destillatieapparatuur volgens Kjeldahl.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.2)
Weeg af 2 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng dit in
een maatkolf van 500 ml. Voeg hieraan toe 450 ml pepsine-oplossing
(3.4), die van te voren op 40 ºC is gebracht.
Schud de inhoud opdat klontvorming vermeden wordt. Controleer of de
pH van de suspensie minder bedraagtdan 1,7. Breng de kolf in het
waterbad of de broedstoof (4.1) en laat gedurende 48 h staan. Zwenk de
inhoud om na 8, 24 en 32 h. Voeg na 48 h toe 15 ml zoutzuur (3.1), laat
afkoelen tot 20 ºC, vul aan met water tot de streep, meng en filtreer.
5.2Destructie
Breng 250 ml van het filtraat over in de kolf van het destructieapparaat
(4.2). Voeg toe de voor de destructie benodigde reagentia zoals is aange-
geven in de methode voor de bepaling van ruw eiwit onder punt 5.1,
tweede zin.
Meng de inhoud van de kolf en verhitt otkoken. Voeg bij schuimvor-
ming enkele druppels antischuimemulsie (3.5) toe. Laat flink doorkoken
tot het water bijna volledig verdampt is. Verwijder vervolgens voor-
zichtig de laatste resten water door minder intensief te verhitten. Laat
nog gedurende 1 h doorkoken nadatde oplossing helder en kleurloos is
geworden (of lichtgroen bij aanwezigheid van een koperkatalysator).
Laatvervolgens afkoelen.
5.3Destillatie en titratie
Handel zoals beschreven in de punten 5.2 en 5.3 van de methode voor de
bepaling van ruw eiwit.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 8
▼B
5.4Blancobepaling
Verrichteen blancobepaling onder t oepassing van de beschreven werk-
wijze, echter zonder analysemateriaal.
6.Berekening van de resultaten
Verminder hetvolume aan zwavelzuur, verbruiktbij de analyse van het
monster, met het volume aan zwavelzuur, verbruikt bij de analyse van de
blanco. 1 ml zwavelzuur 0,1 N komt overeen met 1,4 mg stikstof.
Vermenigvuldig de verkregen hoeveelheid stikstof met de factor 6,25. Druk
het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan
— 0,4 % absoluutbij gehalt en van minder dan 20 %;
— 2 % relatief bij gehalten van 20 tot 40 %;— 0,8 % absoluutbij gehalt en van meer dan 40 %.
7.Opmerkingen
7.1 De verkregen waarden st aan nietin directverband metde vert eerbaar-
heidin vivo .
7.2 Produkten met een vetgehalte van meer dan 10 % moeten eerst worden
ontvet door extractie met petroleumether (kp. 40—60 ºC).
4.BEPALING VAN DE PEPSINE-ACTIVITEIT
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de controle van de activiteit van
de pepsine, die wordtgebruiktvoor de bepaling van ruw eiwit , oplosbaar in
pepsine en zoutzuur.
2.Beginsel
Hemoglobine wordt onder vastgestelde omstandigheden behandeld met
pepsine en verdund zoutzuur. Het niet gehydrolyseerde gedeelte van de
eiwitten wordt met trichloorazijnzuur geprecipiteerd. Aan het filtraat wordt
natronloog en het reagens volgens Folin-Ciocalteu toegevoegd. De extinctie
van deze oplossing wordtgemet en bij 750 nm en de hiermee corresponde-
rende hoeveelheid tyrosine wordt afgelezen van een ijkgrafiek.
Definitie: De pepsine-eenheid (E) wordtgedefinieerd als die hoeveelheid
enzym, die onder de omstandigheden van de methode zoveel hydroxyarylver-
bindingen vrijmaakt , datna kleuring methetFolin-Ciocalt eu-reagens een
extinctie verkregen wordt, die overeenkomt met die van 1 µmol tyrosine
onder dezelfde omstandigheden.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 0,2 N.
3.2 Zoutzuur 0,06 N.3.3 Zoutzuur 0,025 N.3.4 Trichloorazijnzuuroplossing 50 g/l.3.5 Natronloog 0,5 N.3.6 Reagens volgens Folin-Ciocalteu: breng 100 g natriumwolframaat,
Na
2WO4.2 H2O, 25 g natriummolybdaat, Na2MoO4.2 H2O en 700 ml
water in een rondbodemkolf van 2 l met ingeslepen stop. Voeg toe
50 ml fosforzuur (d = 1,71) en 100 ml geconcentreerd zoutzuur (d
= 1,19). Verbind de kolf meteen t erugvloeikoeler, verhitde oplossing
tot koken en houd deze gedurende 10 h zachtjes aan de kook. Laat
afkoelen, verwijder de terugvloeikoeler en voeg toe 175 g lithiumsulfaat,
Li2SO4.2 H2O,50 ml water en 1 ml broom. Laat gedurende 15 minuten
koken, om de overmaatbroom t e verwijderen.
Laatafkoelen, breng de oplossing over in een maat kolf van 1 l, vul aan
met water tot de streep, meng en filtreer. De oplossing mag geen groene
kleur vertonen. Verdun vóór gebruik 1 volumedeel reagens met 2
volumedelen water.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 9
▼B
3.7 Hemoglobine-oplossing: weeg af een hoeveelheid (ca. 2 g) hemoglobine,
protease-substraat volgens Anson, die overeenkomt met 354 mg stik-
stof (1) en breng deze in een kolf van 200 ml metingeslepen st op. Voeg
enkele ml zoutzuur (3.2) toe, sluit de kolf aan op de vacuumpomp en
schud tot de hemoglobine volledig opgelost is. Hef het vacuum op en
voeg onder omzwenken zoveel zoutzuur (3.2) toe als nodig is om de
hoeveelheid zoutzuur aan te vullen tot 100 ml. Vóór gebruik vers
bereiden.
3.8 Standaardtyrosine-oplossing: los op 181,2 mg tyrosine in zoutzuur (3.1)
en vul aan met hetzelfde zuur tot 1 l (stamoplossing). Verdun 20,0 ml
van deze oplossing met zoutzuur (3.1) tot 100 ml. 1 ml van deze oplos-
sing bevat0,2 µmol t yrosine.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad met ultrathermostaat, ingesteld op 25 ºC ± 0,1 ºC.
4.2 Spectrofotometer.
4.3 Chronometer, nauwkeurigheid: 1 sec.
4.4 pH-meter
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.1)
Los 150 mg pepsine op in 100 ml zoutzuur (3.2). Pipeteer 2 ml van de
oplossing in een maatkolf van 50 ml en vul aan met zoutzuur (3.3) tot de
streep. De met de pH-meter gemeten pH moet 1,6 ± 0,1 bedragen. Plaats
de kolf in hetwat erbad (4.1).
5.2Hydrolyse
Pipeteer 5,0 ml hemoglobineoplossing (3.7) in een reageerbuis en breng
in het waterbad (4.1) op een temperatuur van 25 ºC. Voeg daarna toe
1,0 ml van de in punt5.1 verkregen pepsine-oplossing en meng door
ongeveer 10 maal op en neer bewegen meteen glasst aaf, die aan het
uiteinde is afgeplat.
Plaats de buis gedurende precies 10 minuten in het waterbad (4.1) van
25 ºC, gerekend vanaf de toevoeging van de pepsine-oplossing (tijd en
temperatuur moeten nauwkeurig worden aangehouden). Voeg vervolgens
toe 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van tevoren op een
temperatuur van 25 ºC is gebracht, meng en filtreer door een droog filter.
5.3Ontwikkeling van de kleur en meting van de extinctie
Pipeteer 5,0 ml van het filtraat in een conische kolf van 50 ml, voeg toe
10,0 ml natronloog (3.5) en onder voortdurend omzwenken 3,0 ml
verdund reagens volgens Folin-Ciocalteu (3.6). Meet na 5 à 10 minuten
de extinctie van de oplossing tegen water in cuvetten van 1 cm, met
behulp van de spectrofotometer bij 750 nm.
5.4Blancobepaling
Verrichtbij iedere bepaling een blancoproef zoals hieronder beschreven.
Pipeteer 5,0 ml hemoglobine-oplossing (3.7) in een reageerbuis, verwarm
dit in het waterbad (4.1) op 25 ºC. Voeg dan hieraan toe 10,0 ml
trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van te voren op een temperatuur
van 25 ºC is gebracht, meng en voeg vervolgens 1,0 ml van de in punt
5.1 verkregen pepsine-oplossing toe. Meng met behulp van de glasstaaf
en plaats de reageerbuis gedurende precies 10 minuten in het waterbad
(4.1) bij 25 ºC. Meng en filtreer door een droogfilter. Handel verder
zoals beschreven onder punt5.3.
5.5IJkgrafiek
Breng in conische kolven van 50 ml hoeveelheden van 1,0; 2,0; 3,0; 4,0
en 5,0 ml standaardtyrosine-oplossing (3.8), overeenkomend met respec-
tievelijk 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 en 1,0 µmol tyrosine. Voeg aan de reeks nog
een kolf toe zonder tyrosine. Breng met zoutzuur (3.1) op een volume
van 5,0 ml. Voeg toe 10,0 ml natronloog (3.5), alsmede onder voortdu-1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 10
(1) Bepaal het gehalte aan stikstof volgens een semi-microkjeldahlmethode (theoretisch
gehalte: 17,7 % N).
▼B
rend omzwenken 3,0 ml verdund reagens volgens Folin-Ciocalteu (3.6).
Bepaal de extinctie zoals aangegeven in de laatste zin van punt 5.3. Stel
de ijkgrafiek op door de extincties uit te zetten tegen de toegevoegde
hoeveelheden tyrosine.
6.Berekening van de resultaten
Lees uitde ijkgrafiek af de hoeveelheid t yrosine in µmol, die overeenkomt
met de extiactie van de gekleurde oplossing, gecorrigeerd met de blanco.
De pepsine-activiteit in µmol tyrosine per mg en per minuut, bij 25 ºC, wordt
berekend uitde volgende formule:
Eenheden per mg E =mgðÞ ¼0;32/C1a
g
waarin:
a = hoeveelheid tyrosine in µmol, afgelezen uit de ijkgrafiek,
g = gewichtin mg van de hoeveelheid pepsine, t oegevoegd onder 5.2
7.Opmerkingen
7.1 De op te lossen hoeveelheid pepsine moet zodanig worden gekozen, dat
bij de uiteindelijke fotometrische meting een extinctie wordt verkregen
van 0,35 ± 0,035.
7.2 2 E/mg, bepaald volgens deze methode, komen overeen met 3,64 milli-
eenheden Anson/mg (µmol tyrosine/mg · min bij 35,5 ºC) of met 36 400
handelseenheden/g (µmol tyrosine/g · 10 minuten bij 35,5 ºC).
5.BEPALING VAN VRIJ EN TOTAAL GOSSYPOL
1.Doel en toepassingsgebied
Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
vrij gossypol, totaal gossypol en aan gossypol chemisch nauw verwante
stoffen in katoenzaad, katoenzaadmeel en -koeken en in mengvoeders die
katoenzaadprodukten bevatten.
De ondergrens van de bepaalbaarheid bij de methode bedraagt 20 ppm.
2.Beginsel
Gossypol wordt geëxtraheerd in aanwezigheid van 3-amino-1-propanol, hetzij
meteen mengsel van isopropanol en hexaan voor hetbepalen van vrij
gossypol, hetzij met dimethylformamide voor het bepalen van totaal
gossypol.
Hetgossypol wordtmetbehulp van aniline omgezetin gossypoldianiline,
waarvan de extinctie gemeten wordt bij 440 nm.
3.Reagentia
3.1 Isopropanol-hexaanmengsel: Meng 60 volumedelen isopropanol p.a. met
40 volumedelen n-hexaan.
3.2 Oplosmiddel A: Breng in een maatkolf van 1 l ongeveer 500 ml isopro-
panol-hexaanmengsel (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml ijsazijn en
50 ml water. Vul aan tot 1 l met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Dit
reagens is een week houdbaar.
3.3 Oplosmiddel B: Pipeteer in een maatkolf van 100 ml 2 ml 3-amino-1-
propanol en 10 ml ijsazijn. Koel af tot kamertemperatuur en vul aan tot
100 ml metN,N-dimet hylformamide. Ditreagens is een week houdbaar.
3.4 Aniline p.a.: Wanneer de extinctie van een blancobepaling meer
bedraagt dan 0,022 , moetde aniline worden afgedest illeerd over
zinkpoeder, waarbij 10 % voorloop en 10 % naloop worden verwijderd.
Ditreagens is enige maanden houdbaar in een geslot en bruine fles,
bewaard in een koelkast.
3.5 Gossypolstandaardoplossing A: Breng in een maatkolf van 250 ml
27,9 mg gossypolacetaat, los op in oplosmiddel A (3.2), en vul hiermee
aan tot de streep. Pipeteer 50 ml van deze oplossing in een maatkolf van
250 ml en vul aan tot 250 ml met oplosmiddel A (3.2). 1 ml van deze
oplossing bevat0,02 mg gossypol. Laatde oplossing vóór hetgebruik 1 h
staan bij kamertemperatuur.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 11
▼B
3.6 Gossypolstandaardoplossing B: Breng in een maatkolf van 50 ml 27,9 mg
gossypolacetaat, los op in oplosmiddel B (3.3) en vul hiermee aan tot de
streep. 1 ml van deze oplossing bevat 0,5 mg gossypol.
De gossypolstandaardoplossingen zijn — in het donker bewaard — gedu-
rende 24 h houdbaar.
4.Apparatuur
4.1 Roteerapparaat met ongeveer 35 omwentelingen per minuut.4.2 Spectrofotometer.
5.Uitvoering
5.1Af te wegen hoeveelheid analysemateriaal
De af te wegen hoeveelheid analysemateriaal hangt af van het te
verwachten gehalte aan gossypol. Het verdient de voorkeur te werken
meteen kleine hoeveelheid analysemat eriaal en meteen relat ief groot
aliquoot deel van het filtraat, om een voldoende hoeveelheid gossypol
te verkrijgen voor een nauwkeurige fotometrische meting.
Voor het bepalen van vrij gossypol in katoenzaad, katoenzaadmeel en -
koeken mag hetgewichtvan hetanalysemat eriaal nietmeer bedragen
dan 1 g; van mengvoeders kan tot 5 g worden afgewogen. In het alge-
meen kan een aliquootdeel van 10 ml van hetfilt raatworden
afgepipeteerd; het moet 50 à 100 µg gossypol bevatten.
Voor het bepalen van totaal gossypol kan de af te wegen hoeveelheid
analysemateriaal variëren van 0,5 tot 5 g, opdat in een aliquoot deel
van 2 ml van het filtraat 40 tot 200 µg gossypol aanwezig is.
De analyse moet worden uitgevoerd bij een omgevingstemperatuur van
nabij 20 ºC.
5.2Bepaling van vrij gossypol
Breng hetafgewogen analysemat eriaal in een kolf van 250 ml metslijp-
stuk en waarvan de bodem bedekt is met glaskralen. Pipeteer hierbij
50 ml oplosmiddel A (3.2), sluitde kolf en laatgedurende 1 h rot eren.
Filtreer door een droogfilter en vang het filtraat op in een kleine kolf met
slijpstuk. Bedek tijdens het filtreren de trechter met een horlogeglas.
Pipeteer gelijke aliquote delen van het filtraat, die 50 tot 100 µg gossypol
bevatten, in twee maatkolven van 25 ml (A en B). Breng eventueel het
volume op 10 ml metoplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van maat kolf
(A) aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing
dient als referentieoplossing voor het monster.
Pipeteer vervolgens in twee andere maatkolven van 25 ml (C en D) 10 ml
oplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van kolf (C) aan tot 25 ml met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing dientals referent ieop-
lossing voor de blanco.
Voeg aan de maatkolven (D) en (B) resp. 2 ml aniline (3.4) toe.
Verwarm gedurende 30 min. op een kokend waterbad voor het ontwik-
kelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot de
streep met isopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h
staan.
Meet met behulp van de spectrofotometer de extinctie van de blanco-
oplossing (D) bij 440 nm in een glascuvet van 1 cm t.o.v. de referentie-
oplossing (C). Meet vervolgens de extinctie van de monsteroplossing (B)
t.o.v. de referentie-oplossing (A).
Verminder de extinctie van de monsteroplossing met die van de blanco-
oplossing (= gecorrigeerde extinctie). Bereken uit de aldus verkregen
waarde hetgehalt e aan vrij gossypol als beschreven onder 6.
5.3Bepaling van totaal gossypol
Breng een hoeveelheid analysemateriaal, die 1 à 5 mg gossypol bevat, in
een maatkolf van 50 ml en voeg toe 10 ml oplosmiddel B (3.3). Bereid
terzelfder tijd een blanco-oplossing, door 10 ml oplosmiddel B (3.3) in
een tweede maatkolf van 50 ml te brengen.
Verwarm beide kolven gedurende 30 minuten op een kokend waterbad.
Koel af tot kamertemperatuur, vul beide kolven aan tot de streep met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en meng. Laatna gedurende 10 à 15
minuten staan en filtreer dan af in kolfjes met ingeslepen stop.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 12
▼B
Pipeteer 2 ml van het filtraat van het monster in resp. twee maatkolven
van 25 ml en 2 ml van het filtraat van de blanco in resp. twee andere
maatkolven van 25 ml. Vul van elke serie één maatkolf aan tot 25 ml
metisopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossingen dienen als refe-
rentieoplossingen.
Voeg vervolgens 2 ml aniline (3.4) toe aan de beide overige maatkolven.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad voor het
ontwikkelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot
25 ml metisopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laatgedurende 1 h
staan.
Meet de extincties als beschreven onder 5.2 voor vrij gossypol. Bereken
uit de verkregen waarde het gehalte aan totaal gossypol als beschreven
onder 6.
6.Berekening van de resultaten
De berekening van de resultaten kan geschieden hetzij op basis van de speci-
fieke extinctie (6.1), dan wel m.b.v. een ijkgrafiek (6.2).
6.1Op basis van de specifieke extinctie
Onder de beschreven omstandigheden bedragen de specifieke extincties
voor:
vrij gossypol: E1%
1c m¼625
totaal gossypol: E1%
1c m¼600
Het gehalte aan vrij of totaal gossypol in het monster wordt verkregen
uitde onderst aande formule:
percentage gossypol ¼E/C11250
E1%
1c m/C1g/C1v
waarin:
E = gecorrigeerde extinctie, als bepaald onder 5.2
g = gewichtvan hetanalysemat eriaal in grammen
v = aliquootdeel van hetfilt raatin ml.
6.2Met behulp van een ijkgrafiek
6.2.1Vrij gossypol
Neem twee series van telkens 5 maatkolven van 25 ml. Pipeteer in
beide series resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en 10,0 ml gossypol-
standaardoplossing A (3.5). Verdun met oplosmiddel A (3.2) tot
10 ml. Voeg aan elke serie nog een maatkolf van 25 ml toe, die
slechts 10 ml oplosmiddel A (3.2) bevat (blancoproef). Vul de
kolven van de eerste serie, met inbegrip van de blancoproef, aan
tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentieserie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie,
inclusief de blancoproef. Verwarm gedurende 30 minuten op een
kokend waterbad voor het ontwikkelen van de kleuring. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laatgedurende 1 h st aan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extincties te stellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.2.2Totaal gossypol
Neem zes maatkolven van 50 ml. Breng in de eerste 10 ml oplos-
middel B (3.3) en in de andere resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en
10,0 ml gossypolstandaardoplossing B (3.6). Verdun de inhoud van
elke kolf tot 10 ml met oplossmiddel B (3.3). Verwarm gedurende
30 minuten op een kokend waterbad. Koel af tot kamertempera-
tuur, vul aan tot 50 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en
meng.
Pipeteer van deze oplossingen telkens 2,0 ml in resp. twee series
van zes maatkolven van 25 ml. Vul de kolven van de eerste serie1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 13
▼B
aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentie-
serie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laatgedurende 1 h st aan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extincties te stellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
— 15 % relatief bij gehalten van minder dan 500 ppm gossypol;
— niet meer dan 75 ppm absoluut bij gehalten van 500 tot 750 ppm;— 10 % relatief bij gehalten van meer dan 750 ppm gossypol.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 14
▼B
BIJLAGE II
1.OPSPORING EN IDENTIFICATIE VAN ANTIBIOTICA VAN DE
GROEP TETRACYCLINEN
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de opsporing en de identificatie van antibiotica van
de groep tetracyclinen in voedermiddelen die ten minste 0,1 ppm bevatten, inconcentraten en voormengsels.
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een mengsel van methanol en zoutzuur.
Het extract wordt aan stijgende papierchromatografie onderworpen in verge-
lijking met standaard oplossingen. De antibiotica worden opgespoord en
geïdentificeerd door hun Rf waarden te vergelijken met deze van een stan-
daard, hetzij door fluorescentie in UV-licht (bij sterke dosis aan antibiotica),
hetzij via bioautografie op agarvoedingsbodem geënt met B. cereus .
3.Reagentia en voedingsbodem
3.1Buffer, pH 3,5
Citroenzuur met een mol water p.a. 10,256 g
Dinatriumfosfaat Na
2HPO4·2 H2O p.a. 7,45 g
Aceton p.a. 300 ml
Gedestilleerd water tot 1000 ml
3.2Fosfaatbuffer, pH 5,5
MonokaliumfosfaatKH2PO4p.a. 130,86 g
Dinatriumfosfaat Na2HPO4·2H2O p.a. 6,947 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
3.3 Loopmiddel I: Mengsel nitromethaan chemisch zuiver/chloroform
chemisch zuiver/ α/dichloorhydrine: 20/10/1,5 in vol.,
vers bereid.
3.4 Loopmiddel II: Mengsel nitromethaan chemisch zuiver/chloroform
chemisch zuiver/ α-picoline 20/10/3 in vol., vers
bereid.
3.5 Mengsel methanol chemisch zuiver/zoutzuur (d: 1,19): 98/2 in vol.3.6 Zoutzuur 0,1 N
3.7 Ammonia d: 0,91.
3.8 Standaard: chloortetracycline, oxytetracycline, tetracycline waarvan de
activiteit als hydrochloride uitgedrukt is.
3.9Mikro-organisme: B. cereus ATCC 11.778
Voor het bewaren van de stam, de bereiding van de entsuspensie en
voor het enten van de voedingsbodem, zijn de voorschriften 3.1 en 3.2
van de methode voor de bepaling van chloortetracycline, oxytetracy-
cline en tetracycline door middel van agardiffusie, die deel uitmaken
van deel 2 van deze bijlage, toe te passen.
3.10Voedingsbodem (
1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 15
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
Agar-agar 20 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
Op pH 5,8 brengen vlak voor gebruik.
3.11 Oplossing van 0,1 % 2,3,5-triphényltétrazoliumchloride (g/v) en 5 %
glucose (g/v).
4.Apparatuur
4.1 Toestel voor stigfende papierchromatografie (papierhoogte: 25 cm).
Papier Schleicher en Schüll 2040 b of 2043 b, of gelijkwaardig.
4.2 Centrifuge.
4.3 Broedstoof geregeld bij 30 ºC.4.4 UV lamp voor fluorescentie detectie.
4.5 Glasplaten van 20 × 30 cm geschikt voor het vormen van platte dozen
voor bioautografie.
5.Standaardoplossingen
5.1Stamoplossingen:
Uitgaande van de standaard (3.8) worden met zoutzuur (3.6) oplossingen
bereid waarvan de concentratie respectievelijk, overeenstemt met 500 µg
chloortetracycline-HCl, oxytetracycline-HCl en tetracycline-HCl per ml.
5.2Standaardoplossingen voor detectie in UV licht
De oplossingen (5.1) worden metfosfaat buffer (3.2) verdund om oplos-
singen te bekomen waarvan de concentratie overeenstemt met 100 µg
chloortetracycline-HCl, oxytetracycline-HCl en tetracycline-HCl per ml.
5.3Standaardoplossingen voor detectie langs bioautografie
De oplossingen (5.1) worden metfosfaat buffer (3.2) verdund om oplos-
singen te bekomen waarvan de concentratie overeenstemt met 5 µg
chloortetracycline-HCl, oxytetracycline-HCl en tetracycline-HCl per ml.
6.Extractie
Voor verwachte gehalten aan antibioticum beneden 10 ppm kan men een deel
van het homogeen monster nemen of de fijnste zeeffractie, aangezien de anti-
biotica zich bij voorkeur in deze fractie bevinden.
Hetmonst erdeel wordtin suspensie gebrachtin hetmengsel (3.5) en gecen-
trifugeerd. De bovenstaande vloeistof wordt als zodanig gebruikt of zo nodig
verdund met het mengsel (3.5) tot antibioticum concentraties van ca. 100 µg
(6.1) en 5 µg (6.2) per ml.
7.Aantonen en identificatie
7.1Chromatografie
Hetpapier wordtin de bufferoplossing, pH 3,5 (3.1) gedompeld, daarna
wordt de overmaat vocht verwijderd door het tussen twee droge stukken
filtreerpapier te leggen. Vervolgensworden 0,01 ml van de standaardop-
lossingen (5.2 en 5.3) alsook van hetext ract(6.1 en 6.2) op hetpapier
gebracht. De juiste vochtigheidsgraad van het papier is belangrijk voor
hetverkrijgen van een goede scheiding, desnoods licht jes drogen.
Ontwikkelen via stijgende chromatografie. Het loopmiddel I (3.3) wordt
voor de detectie via bioautografie gebruikt en het loopmiddel II (3.4)
voor de detectie onder UV licht. De chromatografie wordt afgebroken
zodra het loopmiddel een hoogte van 15 tot 20 cm heeft bereikt (onge-
veer 1 h 30) nadien hetpapier drogen.
7.2Detectie onder UV licht
Bij gehalten aan antibioticum boven 1 µg/cm
2zietmen na behandeling
metammoniadampen (3.7) onder de UV-lamp (4.4) geel-goude fluores-
cerende vlekken.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 16
▼B
7.3Detectie via bioautografie
De voedingsbodem (3.10) geëntmet B. cereus (3.9) wordtop plat en
(4.5) gebracht en het papier op de voedingsbodem uitgestrekt. Na 5
minuten contact het papier afnemen en op een andere plaats leggen van
de voedingsbodem, waar hetzal blijven t ijdens een nachtbroeden bij
30 ºC in de broedstoof. Het ontstaan van klare remmingszones in de troe-
bele voedingsbodem wijzen op de aanwezigheid van antibiotica van
tetracyclinegroep. Om het chromatogram te fixeren wordt het papier na
broeden besproeid metoplossing (3.11).
7.4Identificatie
Hier volgen de relatieve Rf waarden van de antibiotica van de tetracy-
cline groep. Deze waarden kunnen lichtjes afwijken volgens de
kwaliteit van het papier en zijn vochtgehalte.
Chloortetracycline (CTC) 0,60
Tetracycline (TC) 0,40Oxytetracycline (OTC) 0,204-epi-CTC 0,15
4-epi-TC 0,13
4-epi-OTC 0,10
De verbindingen „epi” hebben geringere antibiotische werking dan de
normale verbindingen.
2.BEPALING VAN CHLOORTETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE
EN VAN TETRACYCLINE
A. DOOR MIDDEL VAN AGARDIFFUSIE METHODE
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van chloortetracycline
(CTC), oxytetracycline (OTC) en van tetracycline (TC) in voedermiddelen,
concentraten en voormengsels. De ondergrens van de bepaalbaarheid ligt bij
5 ppm. De gehalten beneden 5 ppm kunnen geschat worden door interpoleren
op de ijklijn.
2.Principe
Voorgehalten beneden of gelijk aan 50 ppm wordt geëxtraheerd met verdund
formamide. Voor gehalten boven 50 ppm extraheert men voor de bepaling
van CTC met een mengsel van aceton, water en zoutzuur en voor de bepaling
van OTC en van TC met een mengsel van aceton en zoutzuur.
De extracten worden verdund en de antibiotische werking bepaald door
meting van de diffusiezones van CTC, OTC of van TC in een met B. cereus
geënte agar-voedingsbodem. De diffusie wordt zichtbaar gemaakt door het
ontstaan van remmingszones in aanwezigheid van het micro-organisme. De
diameter van deze zones is rechtevenredig met de logaritme van de concen-
tratie van het antibioticum.
3.Micro-organisme: B. cereus ATCC nr. 11.778
3.1Bewaren van de stam
B. cereus enten in een proefbuisje met schuingestolde agar-voedings-
bodem (4.1) zonder methyleenblauw en boorzuur . Een nachtbij ca.
30 ºC bebroeden. Deze cultuur in ijskast bewaren en alle 14 dagen op
dezelfde wijze overenten.
3.2Bereiding van de entsuspensie
Een cultuur op schuingestolde agar bereid, beschreven in (3.1) wordt
direct na het bebroeden, in 2 tot 3 ml steriele fysiologische zoutoplossing
(4.5) opgenomen. Met deze suspensie een Roux-fles bevattende 300 ml
gestolde voedingsbodem (4.1) zonder methyleenblauw en boorzuur en
met een concentratie aan agar van 3 tot 4 % beënten, 3 tot 5 dagen bij
28-30 ºC bebroeden, na microscopische controle van sporulatie de
cultuur opnemen in 15 ml ethanol (4.6) en homogeniseren. Deze
suspensie kan, mits in ijskast bewaard, gedurende 5 maanden gebruikt
worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) nagaan hoeveel van
deze suspensie aan hetmedium moetworden t oegevoegd om voor de
toegepaste concentraties aan antibioticum zo groot mogelijke maar nog1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 17
▼B
scherpe remmingszones te verkrijgen. Deze hoeveelheid is gewoonlijk
van 0,2 tot 0,3 ml/1 000 ml. Het enten van de voedingsbodem vindt bij
50-60 ºC plaats.
4.Voedingsbodems en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de bepalingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 gVleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van type) 10 tot 20 gTween 80 1 ml
Fosfaatbuffer, pH 5,5 (4.2) 10 ml
Boorzuuroplossing 5 % (g/v) 15 mlOplossing 0,5 % methyleenblauw in ethanol 4 ml
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
Op pH 5,8 brengen, vlak voor gebruik
4.2Fosfaatbuffer pH 5,5
MonokaliumfosfaatKH
2PO4p.a. 130,86 g
Dinatriumfosfaat Na2HPO4·2H2O p.a. 6,947 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3 Fosfaatbuffer pH 5,5, verdund tot 1/10.
4.4Fosfaatbuffer pH 8
MonikaliumfosfaatKH2PO4p.a. 1,407 g
Dinatriumfosfaat Na2HPO4·2 H2O p.a. 57,539 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.5 Steriele fysiologische zoutoplossing
4.6 Ethanol 20 % (V/V).4.7 Zoutzuur 0,1 N.
4.8 Formamide 70 % (V/V) vers bereid en tot pH 4,5 brengen met zwavel-
zuur ca. 2 N.
4.9 Mengsel aceton chemisch zuiver water/zoutzuur (d: 1,19): 65/33/2
(vol).
4.10 Mengsel methanol chemisch zuiver/zoutzuur (d: 1,19): 98/2 (vol).4.11 Standaard: CTC, OTC, TC waarvan de activiteit als hydrochloride
uitgedrukt is.
5.Standaardoplossingen
5.1Chloortetracycline
Uitgaande van de standaard (4.11) wordt met zoutzuur (4.7) een stamop-
lossing bereid waarvan de concentratie overeenstemt met 500 µg
chloortetracycline-HCl per ml. Deze oplossing kan, mits in ijskast
bewaard, een week gebruiktworden.
Uitgaande van deze oplossing, wordt door verdunnen met de fosfaat-
buffer pH 5,5, verdund tot 1/10 (4.3) waaraan 0,01 % amidozwart (
2)i s
toegevoegd, een werkstandaardoplossing S8bereid waarvan de concen-
tratie overeenstemt met 0,2 µg chloortetracycline-HCl per ml.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 18
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
(2) Amidozwart dient om de remmingszones van de standaardoplossingen te kenmerken
(blauwe ringen).
▼B
Vervolgens worden, door 1 + 1 verdunnen metde buffer (4.3) de
volgende concentraties bereid:
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2Oxytetracycline
Zoals beschreven onder 5.1 wordt uitgaande van een stamoplossing
waarvan de concentratie overeenstemt met 400 µg oxytetracycline-HCl
per ml, een standaardmerkoplossing S8van 1,6 µg oxytetracycline-HCl
per ml bereid, alsook de volgende concentraties:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.3Tetracycline
Zoals beschreven onder 5.1 wordt, uitgaande van een stamoplossing
waarvan de concentratie overeenstemt met 500 µg tetracycline-HCl per
ml, een standaardmerkoplossing S8van 1,0 µg tetracycline-HCl per ml
bereid, alsook de volgende concentraties:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Extractie
6.1Gehalten beneden of gelijk aan 50 ppm
De afgewogen hoeveelheid van hetmonst er wordtbehandeld metforma-
mide (4.8) volgens de aanduidingen van hiernavolgende tabel en 30
minuten geschud. Daarna onmiddellijk verdunnen met de fosfaatbuffer
(4.3) volgens beschreven in de tabel tot de proefconcentratie U8, bij
deze oplossing moet de concentratie aan formamide beneden 40 % zijn.
Centrifugeren of bezinken laten tot een heldere oplossing.
Vervolgens worden, door 1 + 1 verdunnen metfosfaat buffer (4.3) de
concentraties U4,U2en U1bereid.
Antibioticum CTC OTC TC
Verwachtgehalt e
in ppm 10 50 10 50 10 50
Afgewogen
hoeveelheid in g 10 10 24 9,6 20 10
ml formamide
(4.8) 100 100 80 100 80 100
ml fosfaatbuffer
(4.3)verd.
1: 5
(a)verd.
1: 25
(b) 70 200 120verd.
1: 5
(a)
Conc. U8in µg/
ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) 20 ml extract afmeten en tot 100 ml met buffer aanvullen in een maatkolf.
(b) 4 ml extract afmeten en tot 100 ml met buffer aanvullen in een maatkolf.
6.2Gehalten boven 50 ppm
6.2.1Chloortetracycline
Een afgewogen hoeveelheid van 2 tot 10 g naargelang het
verwacht gehalte of de fabrikatiewaarborg aan antibioticum, wordt
met20 maal zijn volumemengsel (4.9) 30 minut en geschud.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 19
▼B
Tijdens de extractie wordt nagegaan of de pH waarde onder 3 blijft
zo nietop pH 3 brengen (metazijnzuur 10 % bij minerale meng-
sels). Een aliquot van het extract wordt met fosfaatbuffer pH 8
(4.4) in aanwezigheid van bromocresolgroen (omslag van geel
naar blauw) op pH 5,5 gebracht. Verdunnen tot de concentratie
U8(zie 6.1) met fosfaatbuffer, pH 5,5 verdund tot 1/10 (4.3).
Vervolgens worden, door 1 + 1 verdunnen metde fosfaat buffer
(4.3) de concentraties U4,U2en U, bereid.
6.2.2Oxytetracycline en tetracycline
Hetzelfde als beschreven onder 6.2.1, maar het mengsel (4.9)
wordtdoor hetmengsel (4.10) vervangen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) wordtmetde ent suspensie (3.2) bij 50 — 60 ºC
geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in schalen met de vier standaardconcentra-
ties S8,S4,S2,S1en de vier monsterconcentraties U8,U4,U2,U1. Iedere
schaal moet beslist alle vier concentraties van zowel standaard als
monster bevatten. Te dien einde schalen kiezen met zodanige afmetingen
dat in elk ten minste 8 gaatjes van 10 à 13 mm diameter kunnen worden
aangelegd. De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem (7.1) wordt
berekend zodateen overal even dikke laag van 2 mm dikt e verkregen
wordt. Bij voorkeur dienen als schalen te worden gebruikt, vlakke glazen
platen met een volledig vlakke ring van aluminium of kunststof van
200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjes, afhankelijk van hun diameter, worden met een pipet,
nauwkeurig afgemeten hoeveelheden van het antibioticumextract
gebracht die tussen 0,10 en 0,15 ml liggen. Voor ieder monster worden
ten minste 4 diffusiebepalingen gedaan met iedere concentratie, zodanig
datiedere bepaling neerkomtop hetmet en van 32 remzones.
7.3Bebroeden
De schalen worden gedurende ca. 18 uur bij 28 — 30 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diameters van de remzones worden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, de loga-
ritmen van de concentraties tegen de remzonediameters.
Voor de standaard en monsteroplossingen worden nu lijnen getrokken; bij
afwezigheid van storingen zijn deze recht en evenwijdig.
De logaritme van de relatieve activiteit wordt volgens de volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8/C10;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
B. DOOR TURBIDIMETRIE
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van chloortetracycline
(CTC), oxytetracycline (OTC) en van tetracycline (TC) bij concentraties
boven 1 g/kg, voor zover geen bestanddelen storen of een troebel filtraat
veroorzaken. Deze methode is sneller dan de agardiffusie methode.
PrincipeHet monster wordt geëxtraheerd met een mengsel van aceton, water en zout-
zuur voor de bepaling van CTC en meteen mengsel van met hanol en
zoutzuur voor de bepaling van OTC en TC. De extracten worden verdund1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 20
▼B
en de antibiotische werking bepaald door het meten van de lichttransmissie
van een voedingsbodem geëntmetSt aphylococcus aureus in aanwezigheid
van het antibioticum. De lichttransmissie is functie van de antibioticum
concentratie.
3.Micro-organisme: Staphylococcus aureus K 141 (1)
3.1Bewaren van de stam
S. aureus enten in een proefbuisje met schuingestolde agra-voedings-
bodem (4.1) waaraan 1,5 tot 3,5 % agar wordt toegevoegd (afhankelijk
van type). Een nacht bij ca. 37 ºC bebroeden. Deze cultuur in ijskast
bewaren en alle 4 weken op dezelfde wijze overenten. Gelijktijdig
worden subculturen aangelegd voor het laboratoriumgebruik.
3.2Bereiding van de entsuspensie
24 uur voor de bepaling wordteen proefbuisje metschuingest olde agar-
voedingsbodem meteen subcult uur geënten een nachtbij 37 ºC bebroed.
De totale cultuur van dit buisje wordt in suspensie gebracht in ca. 2 ml
voedingsbodem voor de bepaling (4.1) en daarna aseptisch in ca. 100 ml
voedingsbodem voor de bepaling (4.1) overbrengen. In een waterbad bij
37 ºC broeden tot de groei van de stam haar logaritmische fase bereikt (1
u 30 tot 2 uur).
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de bepaling (2)
Pepton 5 g
Gistextract 1,5 g
Vleesextract 1,5 g
Natriumchloride 3,5 gGlucose 1,0 g
MonokaliumfosfaatKH
2PO4p.a. 1,32 g
DikaliumfosfaatK2HPO4p.a. 3,68 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
pH na sterilisatie 6,8 tot 7,0
4.2Fosfaatbuffer, pH 4,5
MonokaliumfosfaatKH2PO4p.a. 13,6 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
4.3 Zoutzuur 0,1 N.
4.4 Mengsel aceton chemisch zuiver water/zoutzuur (d: 1,19): 65/33/2 (vol.).4.5 Mengsel methanol chemisch zuiver zoutzuur (d: 1,19): 98/2 (vol.).4.6 Oplossing van 10 % ongeveer (g/v) formaldehyde.4.7 Standaard: CTC, OTC, TC waarvan de activiteit als hydrochloride uitge-
druktis.
5.Standaardoplossing
Uitgaande van de standaard (4.7), wordt met zoutzuur (4.3) een stamoplos-
sing bereid waarvan de concentratie overeenstemt met 400 tot 500 µg CTC
— HCl, OTC — HCl of TC — HCl per ml. Deze oplossing kan een week
in de ijskastbewaard worden.
6.Extractie
6.1Chloortetracycline
Een afgewogen hoeveelheid van 1 tot 2 g in een maatkolf van 200 of
250 ml wordtmetca. 100 ml mengsel (4.4) 30 minut en geschud. Tot1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 21
(1) De stam, door LUFA te Kiel geïsoleerd, groeit sneller dan S. aureus ATGG 6538 P .
(2) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
de maatstreep aanvullen met fosfaatbuffer pH 4,5 (4.2), mengen en laten
bezinken.
6.2Oxytetracycline en tetracycline
Een afgewogen hoeveelheid van 1 tot 2 g in een maatkolf van 200 of
250 ml wordtmetca. 100 ml mengsel (4.5) 30 minut en geschud. Tot
de maatstreep aanvullen met fosfaatbuffer pH 4,5 (4.2), mengen en laten
bezinken.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Bereiding van standaard en extractverdunningen
Uitgaande van standaardoplossing (5) en van de extractoplossing (6)
worden metfosfaat buffer pH 4,5 (4.2) een reeks verdunningen bereid.
Voor elke bepaling metbehulp van elke verdunning een ijklijn t rekken
die ten minste het interpoleren van twee waarden van het extract toelaat.
De verdunningen kiezen naargelang de omstandigheden van de stam-
groei, deze kunnen verschillen van het ene laboratorium tot het andere.
Gewoonlijk werktmen als volgt :
7.1.1Chloortetracycline
De standaardoplossing (5) wordt met fosfaatbuffer (4.2) verdund
om een werkstandaardoplossing te bekomen waarvan de concen-
tratie overeenstemt met 0,2 µg CTC — HCl per ml. Vervolgens
worden met fosfaatbuffer (4.2) 6 verdunningen in buisjes bestemd
voor de bepaling, meteen herhaling voor elke verdunning als volgt
bereid.
ml werkstandaardop-
lossingml fosfaatbuffer (4.2)CTC-HCl concentratie
(µg/ml)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Het extract (6.1) wordt met fosfaatbuffer (4.2) tot een verwachte
concentratie aan CTC — HCl van 0,12 µg/ml verdund. In twee
buisjes wordt1 ml van deze oplossing gebrachten 0,75 ml
(= 0,09 µg) in twee andere buisjes, deze twee laatste buisjes
worden met fosfaatbuffer (4.2) tot 1 ml aangevuld.
7.1.2Oxytetracycline en tetracycline
De standaardoplossing (5) wordt met fosfaatbuffer (4.2) verdund
om een standaardwerkoplossing te bekomen waarvan de concen-
tratie overeenstemt met 0,6 µg OTC — HCl of TC — HCl per
ml. Vervolgens worden 7 verdunningen in buisjes voor de bepaling
meteen herhaling voor elke verdunning, metfosfaat buffer (4.2) als
volgtbereid:
ml werkstandaardop-
lossingml fosfaatbuffer (4.2)Concentratie van
OTC-HCl of TC-HCl
µg/ml)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,12
Het extract (6.2) wordt met fosfaatbuffer (4.2) tot een verwachte
concentratie aan OTC — HCl of TC — HCl van 0,48 µg/ml
verdund. In twee buisjes wordt 1 ml van deze oplossing gebracht1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 22
▼B
en 0,5 ml (= 0,24 µg) in twee andere buisjes, deze twee laatste
buisjes worden met fosfaatbuffer (4.2) tot 1 ml aangevuld.
7.2Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem voor de bepaling (4.1) wordtmetde ent suspensie
(3.2) zodanig geënt tot een lichttransmissie van 85 % met een fotometer
bij 590 nm in een cuvetvan 5 cm dikt e of 92 % in een cuvetvan 2 cm
dikte het toestel zijnde ingesteld op 100 % transmissie met de niet geënte
voedingsbodem (4.1).
7.3Het enten
In elk buisje (7.1.1 of 7.1.2) wordt9 ml geënt e voedingsbodem (7.2)
gebracht. De buisjes worden op propere wijze gevuld, maar niet noodza-
kelijk aseptisch.
7.4Bebroeden
Het bebroeden moet beslist plaatsvinden in een waterbad met door bewe-
ging van het water overal gelijke temperatuur van 37 ºC ± 0,1 ºC, zolang
dat de helling van de transmissiecurven precieze metingen toelaat
(gewoonlijk 2 u 30 tot 3 uur). Daarna wordt de groei gestopt door 1 ml
formaldehyde oplossing (4.6) snel in elke buis te spuiten.
7.5Meting van de groei
De transmissies worden met een fotometer bij 590 nm gemeten, het
toestel ingesteld op 100 % transmissie met de helderste standaardoplos-
sing (met het hoogste gehalte aan antibioticum). Daar er maar weinig
verschil van turbiditeit tussen de verschillende buisjes bestaat, is het aan
te bevelen cuvetten van ten minste 2 cm en bij voorkeur van 5 cm te
gebruiken.
8.Berekening van de resultaten
De ijklijn wordt grafisch op millimeterpapier getrokken waarbij de fotometri-
sche transmissies tegen de concentraties aan antibioticum. Op de ijklijn
worden de transmissies voortkomend van het extract geïnterpoleerd en het
gehalte aan antibioticum van het monster berekend.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
3.BEPALING VAN OLEANDOMYCINE
— door middel van de agardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van oleandomycine in
voedermiddelen, voormengsels en concentraten, ook in aanwezigheid van
tetracyclinen. De ondergrens van de bepaalbaarheid ligt bij 0,5 ppm.
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een oplossing van tris (hydroxymethyl)
aminomethaan in methanol. Na centrifugeren wordt het extract verdund en de
antibiotische werking ervan gemeten via de diffusie van het oleandomycine
in een met B. cereus geënte voedingsbodem. De diffusie wordt zichtbaar
door de vorming van remzones in aanwezigheid van hetmicro-organisme.
De diameter van deze remzones is rechtevenredig met de logaritme van de
antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: B. cereus K 250 TR (1) (tetracyclinenresistent)
3.1Bewaren van de stam
B. cereus wordtgeëntin een buisje metschuingest olde agarvoedings-
bodem (4.1), waaraan per 5 ml 100 µg oxytetracycline is toegevoegd.
Na een nachtbebroeden bij ca. 30 ºC wordtdeze cult uur in de ijskast
bewaard en alle vier weken op dezelfde wijze overgeënt.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 23
(1) Door LUFA te Kiel geïsoleerde stam.
▼B
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestelde
agar bereid en daarna in 3 ml fysiologische zoutoplossing (4.3) opge-
nomen. Metdeze suspensie wordteen Roux-fles beënt , die 300 ml
gestolde voedingsbodem (4.1) met een agar-agarconcentratie van 3—
4 % bevat. Na een incubatietijd van 3 — 5 dagen bij 28 — 30 ºC wordt
sporevorming microscopisch gecontroleerd, waarna de sporen in 15 ml
aethanol (4.4) worden opgenomen. Deze suspensie wordt gehomogeni-
seerd en kan ten minste 5 maanden in de ijskast bewaard worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.2) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan hetmedium moetworden t oege-
voegd om bij de toegepaste concentraties oleandomycine zo groot
mogelijke, maar nog scherpe remzones te verkrijgen. In het algemeen
zal dit0,1 — 0,2 ml/1 000 ml zijn. Hetent en van de voedingsbodem
vindtbij 60 ºC plaat s.
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor het bewaren van de stam (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 gGistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
Op pH 6,5 brengen, vlak voor gebruik
4.2Voedingsbodem voor de metingen (
2)
Voedingsbodem (4.1), echter ingesteld op pH 8,8.
4.3 Steriele physiologische zoutoplossing.
4.4 Aethanol 20 % (v/v).
4.5 Methanol, chemisch zuiver.4.6 Tris (hydroxymethyl) aminomethaanoplossing, p.a. 0,5 % (g/v).
4.7Extractievloeistof
Methanol, chemisch zuiver 50 ml
Gedestilleerd water 50 mlTris (hydroxymethyl)
aminomethaan p.a.0,5 g
4.8 Standaard: oleandomycine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossing
Een hoeveelheid standaard (4.8) wordt in 5 ml methanol (4.5) opgelost,
waarna met oplossing (4.6) verdund wordt tot een oleandomycineconcentratie
van 100 µg/ml.
Door verder verdunnen van deze stamoplossing met mengsel (4.6) werd een
werkstandaardoplossing S
8van 0,1 µg oleandomyoine per ml bereid. Daarna
werden de volgende concentraties door successieve verdunningen (1 + 1) met
oplossing (4.6) bereid:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 24
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft kan gebruikt worden.
(2) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft kan gebruikt worden.
▼B
S10,0125 µg/ml
6.Extractie
Rekening houdend met het „verwachte gehalte” aan oleandomycine in het
monster, wordt een hoeveelheid tussen de 2 en 10 g ervan afgewogen. Na
toevoegen van 100 ml oplossing (4.7) wordt 30 minuten geschud. Na centri-
fugeren wordt een aliquot deel van de bovenstaande vloeistof met oplossing
(4.6) verdund tot een verwachte concentratie aan oleandomycine van 0,1 µg/
ml (= U8). Vervolgens worden de concentraties U4,U2en U1door verder
verdunnen (1 + 1) metoplossing (4.6) bereid.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.2) wordt met de entsuspensie (3.2) bij 60 ºC geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri)schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentraties en de vier monsterconcentraties (S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten.
De plaatdiameter moet voldoende zijn om in de agarlaag ten minste acht
gaatjes van 10 à 13 mm te kunnen maken. De hoeveelheid te gebruiken
voedingsbodem per plaatdientzo berekend t e worden dateen overal
even dikke laag van 2 mm dikte verkregen wordt. Bij voorkeur dienen
als schalen te worden gebruikt vlakke glazen platen met een volledig
vlakke ring van aluminium of kunststof van 200 mm diameter en 20 mm
hoogte.
In de gaatjes worden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt.
Voor ieder monster worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan
met iedere concentratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het
meten van 32 remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden ca. 18 h bij 28 — 30 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diameters van de remzones worden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentraties tegen de remzonediameters. Indien er bij de
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgens de volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
4.BEPALING VAN TYLOSINE
— door middel van agardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van tylosine in voeder-
middelen, voormengsels en concentraten. De ondergrens van de
bepaalbaarheid ligtbij 2 ppm.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 25
▼B
2.Principe
Het monster wordt behandeld met een tot 80 ºC verwarmd fosfaatbuffer pH
8, waarna methanol geëxtraheerd wordt. Na centrifugeren wordt het extract
verdund en de antibiotische werking ervan gemeten via de diffusie van het
tylosine in een met Sarcina lutea geëente agarvoedingsbodem. De diffusie
wordtzicht baar gemaaktdoor de vorming van remzones in aanwezigheid
van het micro-organisme. De diameter van deze remzones is rechtevenredig
met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Sarcina lutea ATCC nr. 9341
3.1Bewaren van de stam
Sarcina lutea wordtgeëntin een buisje metschuingest olde agar-
voedingsbodem (4.1), echter op pH 7,0 gebracht. Na een nacht
bebroeden bij ca. 35 ºC wordtdeze cult uur in de ijskastbewaard en
alle veertien dagen op dezelfde wijze overgeënt.
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestolde
agar bereid. Direct na het bebroeden wordt deze cultuur in 2 tot 3 ml
fysiologische zoutoplossing (4.4) opgenomen. Met deze suspensie wordt
een Roux-fles met 250 ml gestolde voedingsbodem (4.1), echter op pH
7,0 gebrachtbeënten 24 uur bij 35 ºC bebroed. Vervolgens wordtde
cultuur opgenomen in 25 ml fysiologische zoutoplossing (4.4). Deze
suspensie wordt gehomogeniseerd en verdund tot een lichttransmissie
van ca. 75 % bij 650 nm verkregen wordt. Deze suspensie kan, mits in
de ijskastbewaard, gedurende een week gebruiktworden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan hetmedium moetworden t oege-
voegd om voor de toegepaste concentraties tylosine zo groot mogelijke,
maar nog scherpe remmingszones te verkrijgen. Het enten van de
voedingsbodem vindtbij 48-50 ºC plaat s.
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de metingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 g
Vleesextract 1,5 gGistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
Voor hetbewaren van de vlam en hetbereiden van de ent suspensie op
pH 7,0 brengen en voor de bepaling op pH 8,0 brengen.
4.2Fosfaatbuffer pH 8
MonokaliumfosfaatKH
2PO4p.a. 0,523 g
DikaliumfosfaatK2HPO4p.a. 16,730 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3Fosfaatbuffer pH 7
MonokaliumfosfaatKH2PO4p.a. 5,5 g
DikaliumfosfaatK2HPO4p.a. 13,6 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.4 Steriele fysiologische zoutoplossing.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 26
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.
▼B
4.5 Methanol, chemisch zuiver.
4.6 Methanol 40 % (v/v).
4.6 Mengsel van fosfaatbuffer (4.2)/methanol, chemisch zuiver: 60/40 (vol.).
4.8 Standaard: tylosine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Na drogen van de standaard (4.8) (3 uur 60 ºC bij 5 mm kwik) wordt 10-
50 mg afgewogen en in een maarkolf opgelostin 5 ml met hanol (4.5) waarna
aangevuld wordtmetfosfaat buffer pH 7 (4.3). Metdeze buffer wordtverder
verdund tot een tylosine-basisconcentratie van 1000 µg/ml is verkregen.
Uitgaande van deze stamoplossing wordt een werkstandaardoplossing S8bereid door verdunnen met mengsel (4.7) tot een concentratie van 2 µg tylo-sinebase per ml is verkregen.
Door verdere verdunning (1 + 1) metmengsel (4.7) worden de volgende
concentraties bereid:
S
41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extractie
Van de te onderzoeken concentraten wordt 10 g afgewogen, van voormeng-
sels en voeders 20 g. Van fosfaatbuffer pH 8 (4.2) wordt 60 ml tot 80 ºC
verwarmd en bij de afgewogen monsterhoeveelheid gevoegd, waarna geho-mogeniseerd wordt gedurende 2 minuten (huishoudmixer, Ultra-Turrax, enz.).
Na 10 minuten staan worden 40 ml methanol (4.5) toegevoegd en wordt nog
eens 5 minuten gehomogeniseerd. Na centrifugeren wordt een aliquot deel
van de bovenstaande vloeistof met mengsel (4.7) verdund tot een verwachte
concentratie aan tylosine van 2 µg/ml (= U
8). Vervolgens worden de concen-
traties U4,U2en U1door verder verdunnen (1 + 1) metoplossing (4.7) bereid.
Bij gehalten beneden 10 ppm wordt het extract bij 35 ºC in een rotatiever-
damper drooggedampten in 40 % met hanol (4.6) opgenomen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) op pH 8,0 gebrachtwordtmetde ent suspensie
(3.2) bij 48-50 ºC geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri) schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentraties en de vier monsterconcentraties (S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten. De plaatdiameter moet voldoende
zijn om in de agarlaag ten minste acht gaatjes van 10 à 13 mm te kunnen
maken De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem per plaat dient zo
berekend te worden dat een overal even dikke laag van 2 mm dikte
verkregen wordt. Bij voorkeur dienen als schalen te worden gebruikt
vlakke glazen platen met een volledig vlakke ring van aluminium of
kunststof van 200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjes worden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt. Voor ieder monster
worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan met iedere concen-
tratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het meten van 32
remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden gedurende een nacht bij 35-37 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diameters van de remzones worden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentraties tegen de remzonediameters. Indien er bij de1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 27
▼B
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgens de volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
5.BEPALING VAN VIRGINIAMYCINE
— door middel van agardiffusie —
1.Doel en toepassingsgebied
Metdeze met hode kan virginiamycine in diervoeders en in voormengsels
worden bepaald. De ondergrens van de bepaling ligtbij 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een methanolische oplossing van Tween
80. Het extract wordt gedecanteerd of gecentrifugeerd en verdund. De anti-
biotische activiteit van het extract wordt bepaald door meting van de
diffusie van virginiamycine op een agarvoedingsbodem die is geëntmet
Micrococcus luteus . De diffusie wordtzicht baar door de vorming van zones
waarin de groei van hetmicro-organisme is geremd. De doorsnede van dezeremmingszones wordt binnen het gebruikte concentratiegebied verondersteld
recht evenredig te zijn met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Bewaren van de stam
Buizen metschuingest olde voedingsbodem (4.1) worden geëntmet
Micrococcus luteus en 24 uur bij 30 ºC geïncubeerd. De kweek wordt
in de koelkastbij 4 ºC bewaard. Elke t wee weken wordtopnieuw over-
geënt.
3.2.Bereiding van de bacteriesuspensie (
a)
De cultuur van een vers bereid agarbuisje (3.1) wordt gesuspendeerd in
2 à 3 ml natriumchlorideoplossing (4.3). 250 ml voedingsbodem (4.1) in
een Rouxfles wordtmetdeze suspensie geënten 18 t ot20 uur bij 30 ºC
geïncubeerd. Neem de cultuur op in 25 ml natriumchlorideoplossing
(4.3) en meng. Verdun de suspensie 1 op 10 metnat riumchlorideoplos-
sing (4.3). De lichttransmissie van de suspensie, gemeten bij 650 nm in
een cel van 1 cm tegen natriumchlorideoplossing (4.3), moet ongeveer
75 % bedragen. Deze suspensie kan ongeveer één week bij 4 ºC worden
bewaard.
4.Voedingsbodems en reagentia
4.1.Voedingsbodem (b)
Vleespepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Gistextract 3,0 g
Vleesextract 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 10,0 tot 20,0 g
Water 1 000 ml1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 28
(1) 1 mg virginiamycine komtovereen met1 000 UK-eenheden.
(a) Andere methoden mogen ook worden gebruikt, mits vaststaat dat die dezelfde bacterie-
suspensies opleveren.
(b) In de handel verkrijgbare voedingsbodems van vergelijkbare samenstelling, die
dezelfde resultaten geven, kunnen ook worden gebruikt.▼M2
▼M2
pH 6,5 (na sterilisatie)
4.2.Fosfaatbuffer pH 6
Dikaliumwaterstoffosfaat, K2HPO42,0 g
Kaliumdiwaterstoffosfaat, KH2PO48,0 g
Water 1 000 ml
4.3. Natriumchlorideoplossing 0,8 % (m/v): los 8 g natriumchloride op in
water en verdun tot 1 000 ml; steriliseer.
4.4. Methanol.
4.5. Mengsel van fosfaatbuffer en methanol: meng fosfaatbuffer (4.2) en
methanol (4.4) in de verhouding 80: 20 (v/v).
4.6. Methanolische oplossing van Tween 80, 0,5 % (m/v): los 5 g Tween 80
in methanol (4.4) op en verdun met methanol tot 1 000 ml.
4.7. Standaard: virginiamycine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Los een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid standaard (4.7) in methanol
(4.4) op en verdun met methanol tot een voorraadoplossing van 1 000 µg
virginiamycine per ml.
In een gesloten kolf bij 4 ºC is deze oplossing vijf dagen stabiel.
Bereid, uitgaande van deze voorraadoplossing, door steeds met mengsel (4.5)
te verdunnen, de volgende oplossingen:
S81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Bereiding van het extract en de meetoplossingen
6.1.Extractie
6.1.1.Produkten met een virginiamycinegehalte tot 100 mg/kg
Weeg 50,0 g monster af, voeg 200 ml van oplossing (4.6) toe en
schud 30 minuten. Laat het mengsel uitzakken of centrifugeer het,
neem 20 ml van de bovenstaande vloeistof en damp deze in een
rotatieverdamper bij een temperatuur van maximaal 40 ºC tot
ongeveer 5 ml in. Verdun hetresidu metmengsel (4.5) t oteen
aangenomen virginiamycinegehalte van 1 µg/ml (= U8).
6.1.2.Produkten met een virginiamycinegehalte hoger dan 100 mg/kg
Weeg ten hoogste 10,0 g monster af, zodat de afgewogen
hoeveelheid 1 tot 50 mg virginiamycine bevat, voeg 100 ml
oplossing (4.6) toe en schud 30 minuten. Laat het mengsel
uitzakken of centrifugeer het en verdun de bovenstaande vloeistof
vervolgens metmengsel (4.5) t oteen aangenomen virginiamyci-
negehalte van 1 µg/ml (= U8).
6.2.Meetoplossingen
Bereid, uitgaande van oplossing U8, oplossingen U4(aangenomen
gehalte: 0,5 µg/ml), U2(verondersteld gehalte: 0,25 µg/ml) en U1(veron-
dersteld gehalte 0,125 µg/ml) door steeds 1 op 1 met mengsel (4.5) te
verdunnen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1.Enten van de voedingsbodem
Entde voedingsbodem voor de bepaling (4.1) bij ongeveer 50 ºC metde
bacteriesuspensie (3.2). In voorafgaande proeven op platen met
voedingsbodem (4.1) wordtde hoeveelheid bact eriesuspensie bepaald
die bij de verschillende concentraties virginiamycine tot de grootste en
duidelijkste remmingszones leidt.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 29
▼M2
7.2.Bereiden van de platen
De agardiffusie vindt plaats op platen met de vier standaardoplossingen
(S8,S4,S2en S1) en de vier meetoplossingen (U8,U4,U2en U1). Op elke
plaat moeten alle vier concentraties van standaard en van extract worden
opgebracht. Daarom moeten de afmetingen van de platen zo worden
gekozen dat op de agarvoedingsbodem plaats is voor ten minste acht
gaatjes van 10 tot 13 mm doorsnede, waarvan de middelpunten niet
minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. Voor de bepaling kunnen
vlakke glazen platen worden gebruikt, waarop aluminium- of plastic-
ringen van 200 mm doorsnede en 20 mm hoogte worden gelegd.
Gietop de plat en een hoeveelheid voedingsbodem (4.1), geëntals
aangegeven bij punt 7.1, zodat een laag van ongeveer 2 mm dik ontstaat
(60 ml voor een plaatmeteen doorsnede van 200 mm). Laatde
voedingsbodem in horizontale stand stollen, pons er de gaatjes in en
breng er exact afgemeten hoeveelheden standaard en extract in (0,10
tot 0,15 ml per gaatje, afhankelijk van de doorsnede). Breng iedere
concentratie ten minste in viervoud aan, zodat iedere bepaling als grond-
slag voor de berekening 32 remmingszones heeft.
7.3.Incuberen
Incubeer de platen 16 tot 18 uur bij 30 ºC ± 2 ºC.
8.Meting en berekening
Meetde doorsnede van de remmingszones t otop 0,1 mm nauwkeurig. Zet
voor elke concentratie de gemiddelde waarden op half-logaritmisch papier
uit, zodat de logaritme van de concentraties tegen de doorsnede van de
remmingszones komt te staan. Trek de best passende lijnen, zowel voor de
standaard als voor het extract, en ga daarbij bij voorbeeld als volgt te werk:
Bepaal het meest passende punt voor de laagste standaardwaarde (SL)
volgens de formule:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Bepaal het meest passende punt voor de hoogste standaardwaarde (SH)
volgens de formule:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Bepaal op dezelfde wijze de meest passende punten voor de laagste extract-
waarde (UL) en de hoogste extractwaarde (UH) door in bovenstaande
formules s1,s2,s4en s8door u1,u2,u4en u8te vervangen.
Vul de waarden SL en SH in dezelfde grafiek in. Door deze twee punten te
verbinden, krijgt men de meest passende rechte voor de standaardoplossing.
Op dezelfde wijze verkrijgtmen metUL en UH de meestpassende recht e
voor het extract.
Wanneer er geen enkele storing is, moeten de rechten evenwijdig zijn. In de
praktijk kunnen de rechten als evenwijdig worden beschouwd wanneer (SH
— SL) en (UH — UL) nietmeer dan 10 % van hun gemiddelde afwijken.
Als de rechten niet evenwijdig zijn, kan men hetzij u1en s1, hetzij u8en s8uitsluiten. De waarden SL, SH, UL en UH waarmee men dan de meest
passende rechten kan trekken, worden dan berekend volgens de volgende
formules:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6of5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6of5s2þ2s4/C0s2
6
en analoge formules voor UL en UH. Nu moetwel aan bovengenoemde eis
van evenwijdigheid zijn voldaan. Wanneer het resultaat uit drie concentraties
is berekend, moetditop hetanalysecert ificaatvermeld worden.
Wanneer de rechten als evenwijdig beschouwd kunnen worden, wordt de
logaritme van de relatieve activiteit (log A) berekend volgens één van de
volgende formules, afhankelijk van hetbereiken van evenwijdigheid met4
of 3 concentraties:
Voor 4 concentraties:1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 30
▼M2
(c) Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Voor 3 concentraties:
(d) Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
of
(d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Activiteit van het monsterextract = activiteit van de bijbehorende standaard ×
A:
(U8=S8×A )
Blijkt de relatieve activiteit buiten het gebied 0,5 tot 2,0 te liggen, dan moet
de bepaling worden herhaald met geschikte aanpassingen aan de extractcon-
centraties of, indien zulks onmogelijk is, aan de standaardoplossingen. Indien
de relatieve activiteit niet in dit vereiste gebied kan worden gebracht, moet
hetresult aatals een benadering worden beschouwd en als zodanig op het
analysecertificaat worden vermeld.
Wanneer de rechten niet als evenwijdig beschouwd kunnen worden, moet de
bepaling worden herhaald. Wanneer dan nog steeds geen evenwijdige rechten
zijn verkregen, moetde bepaling als nietbevredigend worden beschouwd.
Geef de uitkomst weer in milligram virginiamycine per kilogram voeder.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen aan hetzelfde monster
uitgevoerd door dezelfde analist mag niet groter zijn dan:
— 2 mg/kg in absolute waarde bij virginiamycinegehalten tot 10 mg/kg;
— 20 % van de hoogste waarde bij gehalten van 10 tot 25 mg/kg;— 5 mg/kg in absolute waarde bij gehalten van 25 tot 50 mg/kg;— 10 % van de hoogste waarde bij gehalten van meer dan 50 mg/kg.1972L0199 — NL — 20.12.1983 — 002.001 — 31