Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en versch ĳnt buiten de verantwoordel ĳkheid van de instellingen  
►B VERORDENING (EG) Nr. 440/2008 VAN DE COMMISSIE  
van 30 mei 2008  
houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het 
Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en 
beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)  
(Voor de EER relevante tekst)  
(PB L 142 van 31.5.2008, blz. 1)  
Gewĳzigd bĳ: 
Publicatieblad  
nr. blz.  datum  
►M1 Verordening (EG) nr. 761/2009 van de Commissie van 23 juli 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Verordening (EU) nr. 1152/2010 van de Commissie van 8 december 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Verordening (EU) nr. 640/2012 van de Commissie van 6 juli 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Verordening (EU) nr. 260/2014 van de Commissie van 24 januari 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Verordening (EU) nr. 900/2014 van de Commissie van 15 juli 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1
VERORDENING (EG) Nr. 440/2008 VAN DE COMMISSIE  
van 30 mei 2008  
houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening 
(EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen 
ten aanzien van chemische stoffen (REACH)
 
(Voor de EER relevante tekst)  
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,  
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,  
Gelet op Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement 
en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verorde ­
ning (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (
 1 ), en met name op artikel 13, lid 3,  
Overwegende hetgeen volgt:  
(1) Krachtens Verordening (EG) nr. 1907/2006 dienen op com ­
munautair niveau testmethoden te worden vastgesteld voor de beproeving van stoffen indien een dergelijke beproeving vereist is om informatie over de intrinsieke eigenschappen van die stof ­
fen te verkrijgen.
 
(2) In bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad van 27 juni 
1967 betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuurs ­
rechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen (
 2 ) zijn methoden vastgesteld 
voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen en preparaten. Bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG is bij Richtlijn 2006/121/EG van het Europees Parlement en de Raad met ingang van 1 juni 2008 geschrapt.
 
(3) De in bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG vervatte testmethoden 
dienen in deze verordening te worden geïntegreerd.  
(4) Deze verordening sluit het gebruik van andere testmethoden niet 
uit, op voorwaarde dat het gebruik daarvan in overeenstemming is met artikel 13, lid 3, van Verordening (EG) nr. 1907/2006.  ▼
B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1; gerectificeerd in PB L 136 van 29.5.2007, 
blz. 3. 
( 2 ) PB 196 van 16.8.1967, blz. 1. Richtlijn laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 
2006/121/EG van het Europees Parlement en de Raad (PB L 396 van 30.12.2006, blz. 849; gerectificeerd in PB L 136 van 29.5.2007, blz. 281) — verwijzing aan te passen na publicatie van de 30e AVT.
 (5) Bij de opzet van de testmethoden dient terdege rekening te wor ­
den gehouden met de beginselen van vervanging, vermindering en verfijning van het gebruik van dieren in procedures, met name wanneer passende gevalideerde methoden ter vervanging, vermin ­
dering of verfijning van dierproeven beschikbaar worden.
 
(6) De bepalingen van deze verordening zijn in overeenstemming 
met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,
 
HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:  
Artikel 1  
De in het kader van Verordening (EG) nr. 1907/2006 toe te passen 
testmethoden zijn opgenomen in de bijlage van deze verordening.  
Artikel 2  
De Commissie herbeziet indien nodig de in deze verordening vervatte 
testmethoden met het oog op de vervanging, de vermindering of de verfijning van proeven op gewervelde dieren.
 
Artikel 3  
Alle verwijzingen naar bijlage V van Richtlijn 67/548/EEG worden 
gelezen als verwijzingen naar deze verordening.  
Artikel 4  
Deze verordening treedt in werking op de dag volgende op die van haar 
bekendmaking in het  Publicatieblad van de Europese Unie . 
Zij is van toepassing met ingang van 1 juni 2008.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
BIJLAGE  
DEEL A: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE FYSISCH- 
CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN  
INHOUD 
A.1. SMELT-/VRIESTEMPERATUUR 
A.2. KOOKTEMPERATUUR 
A.3. RELATIEVE DICHTHEID A.4. DAMPSPANNING A.5. OPPERVLAKTESPANNING 
A.6. OPLOSBAARHEID IN WATER 
A.8. VERDELINGSCOËFFICIËNT A.9. VLAMPUNT 
A.10. ONTVLAMBAARHEID (VASTE STOFFEN) 
A.11. ONTVLAMBAARHEID (GASSEN) A.12. ONTVLAMBAARHEID (CONTACT MET WATER) 
A.13. PYROFORE EIGENSCHAPPEN VAN VASTE STOFFEN EN 
VLOEISTOFFEN 
A.14. EXPLOSIEGEVAAR 
A.15. ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR (VLOEISTOFFEN 
EN GASSEN) 
A.16. RELATIEVE ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR VAN 
VASTE STOFFEN 
A.17. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VASTE STOFFEN) A.18. AANTALGEMIDDELD MOLECUULGEWICHT EN MOLE ­
CUULGEWICHTSVERDELING VAN POLYMEREN 
A.19. GEHALTE VAN POLYMEREN AAN LAAGMOLECULAIRE 
BESTANDDELEN 
A.20. OPLOS/EXTRACTIEGEDRAG VAN POLYMEREN IN WA ­
TER 
A.21. OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VLOEISTOFFEN) 
A.22. NAAR LENGTE GEWOGEN MEETKUNDIG GEMIDDELDE 
VAN DE DIAMETER VAN VEZELS
 
▼M4 
A.23. 1-OCTANOL/WATER-VERDELINGSCOËFFICIËNT: 
LANGZAAM-ROERENMETHODE  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. SMELT-/VRIESTEMPERATUUR  
1. METHODE  
De meeste van de beschreven methoden berusten op de testricht ­
lijnen van de OESO (1). De fundamentele principes worden bespro ­
ken in de referenties (2) en (3).  
1.1. INLEIDING  
De hier beschreven methoden en toestellen dienen te worden toege ­
past voor de bepaling van de smelttemperatuur van stoffen, ongeacht 
de mate van zuiverheid ervan.  
De keuze van de methode hangt af van de aard van de te onder ­
zoeken stof. De beperkende factor zal dan ook worden bepaald door 
de vraag of de stof al dan niet gemakkelijk, moeilijk of helemaal niet kan worden verpulverd.
 
Voor sommige stoffen is de bepaling van de vries- of stoltempera ­
tuur zinvoller; ook de normen voor deze bepaling werden in de methode opgenomen.
 
Indien, als gevolg van de specifieke eigenschappen van de stof, geen 
van de bovenstaande parameters eenvoudig kan worden gemeten, 
kan een vloeipunt geschikt zijn.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Onder smelttemperatuur wordt verstaan de temperatuur, waarbij de 
faseovergang van vaste naar vloeibare toestand optreedt bij normale 
atmosferische druk; deze temperatuur komt in het ideale geval over ­
een met de vriestemperatuur.  
Aangezien de faseovergang bij veel stoffen over een temperatuurbe ­
reik plaatsvindt, wordt deze vaak omschreven als het smelttraject.  
Smelttemperatuur en -traject worden steeds uitgedrukt in K.  
t = T - 273,15  
t: Celsius-temperatuur, graden Celsius (  o C) 
T: thermodynamische temperatuur, Kelvin (K)  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats 
bedoeld om van tijd tot tijd de werking van de methode te contro ­
leren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mo ­
gelijk te maken.  
In de referenties worden enige ijkstoffen genoemd (4).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN  
De temperatuur (het temperatuurbereik), waarbij fase-overgang van 
vaste naar vloeibare of van vloeibare naar vaste toestand plaatsvindt, wordt bepaald. In de praktijk betekent dit dat een monster van de te 
onderzoeken stof bij atmosferische druk wordt verwarmd/gekoeld en 
dat de temperatuur in het begin- en het eindstadium van het smelt- /vriesproces wordt bepaald. Vijf onderzoekmethoden worden be ­
schreven, namelijk: de capillaire methode, de methode met de ver ­
hitte plaat, de methode voor bepaling van de vriestemperatuur, ther ­
mische-analysemethoden, alsmede de bepaling van het vloeipunt (zo ­
als ontwikkeld voor minerale oliën).
 
In sommige gevallen kan het gemakkelijker zijn de vriestemperatuur 
te bepalen in plaats van de smelttemperatuur.  
1.4.1.  Capillaire methode  
1.4.1.1.  Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een 
vloeistofbad  
Een kleine hoeveelheid van de verpulverde stof wordt in een capillair 
gebracht en stevig aangedrukt. Het buisje wordt samen met een 
thermometer verwarmd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de tempe ­
ratuurstijging tijdens het eigenlijke smeltproces minder dan circa 1 K/min bedraagt. De temperatuur in het begin- en eindstadium van 
het smeltproces wordt bepaald.
 
1.4.1.2.  Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een 
metalen blok  
Als omschreven in 1.4.1.1, met dit verschil dat het capillair en de 
thermometer in een verwarmd metalen blok zijn aangebracht en door 
openingen in het blok kunnen worden waargenomen.  
1.4.1.3.  Fotoceldetectie  
Het monster in het capillair wordt automatisch verhit in een metalen 
cilinder. Een lichtbundel wordt, via openingen in de cilinder, door de 
stof heen op een nauwkeurig geijkte fotocel gericht. De optische eigenschappen van de meeste stoffen veranderen van ondoorschij ­
nend naar doorschijnend bij het smelten. Zodra de lichtintensiteit die 
de fotocel bereikt toeneemt, zendt deze een stopsignaal naar de 
digitale meter die de temperatuur afleest van een thermometer met platinaweerstand in de verwarmingskamer. Deze methode leent zich niet voor toepassing op sommige sterk gekleurde stoffen.
 
1.4.2.  Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit opper ­
vlak (hot stage)  
1.4.2.1.  De verhitte staaf volgens Kofler  
De verhitte staaf volgens Kofler bestaat uit twee stukken metaal die 
een verschillend warmtegeleidingsvermogen bezitten en elektrisch 
worden verwarmd. De staaf is zo ontworpen dat de temperatuur nagenoeg lineair langs de lengte ervan varieert. De temperatuur van de verhitte staaf kan variëren van 283 K tot 573 K; de tempe ­
ratuur wordt met een voor elke staaf afzonderlijk geijkt ruitertje (met 
wijzer) afgelezen. Om een smelttemperatuur te bepalen, wordt de stof in een dunne laag direct op het oppervlak van de verhitte staaf gebracht. Binnen enkele seconden ontstaat er een scherpe scheidings ­
lijn tussen de vloeibare en de vaste fase. De wijzer wordt ingesteld 
op de scheidingslijn, waarna de temperatuur kan worden afgelezen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Smeltpuntmicroscoop  
Er bestaan verschillende verhitte platen voor microscopische smelt ­
temperatuurbepaling waarbij met zeer kleine hoeveelheden materiaal kan worden gewerkt. Bij de meeste verhitte platen wordt de tempe ­
ratuur gemeten met een gevoelig thermokoppel, maar bij sommige 
met een kwikthermometer. Een toestel voor microscopische bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een verhitte plaat bestaat meestal uit een verwarmingskamer met een metalen plaat waarop het 
monster op een voorwerpglaasje wordt geplaatst, in het midden van 
de metalen plaat is een opening aangebracht zodat deze het licht van de microscoop doorlaat. Tijdens het gebruik wordt, om lucht uit de 
verwarmingskamer te weren, deze met een glazen plaat afgesloten.
 
De verwarming van het monster wordt ingesteld met een regelweer ­
stand. Voor zeer nauwkeurige metingen bij optisch anisotrope stoffen kan gebruik worden gemaakt van gepolariseerd licht.
 
1.4.2.3.  De meniscusmethode  
Deze methode wordt speciaal toegepast voor polyamiden.  
Bepaling van de temperatuur, waarbij de verplaatsing van een me ­
niscus van siliconenolie die tussen een verhit oppervlak (hot stage) 
en een dekglas, geplaatst op het te onderzoeken polyamidemonster, is ingesloten, visueel wordt waargenomen.
 
1.4.3.  Methode voor de bepaling van de vriestemperatuur  
Het monster wordt in een speciaal proefbuisje in een toestel geplaatst 
voor de bepaling van de vriestemperatuur. Tijdens de afkoeling 
wordt het monster voortdurend zachtjes geroerd en de temperatuur wordt regelmatig afgelezen en geregistreerd. Zodra de temperatuur gedurende enkele aflezingen constant blijft, wordt deze temperatuur 
(na correctie voor afwijking van de thermometer) geregistreerd als de 
vriestemperatuur.
 
Onderkoeling moet worden voorkomen door een evenwicht te bewa ­
ren tussen de vaste en de vloeibare fase.  
1.4.4.  Thermische analyse  
1.4.4.1.  Differentiële thermische analyse (DTA)  
Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd 
tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de 
temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde 
temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme (smelten) of 
exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn van de temperatuur ­
registratie.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Differentiële scanningcalorimetrie (DSC)  
Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van 
de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de tem ­
peratuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde tempe ­
ratuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie 
die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endo ­
therme (smelten) of exotherme (bevriezen) afwijking van de basislijn 
van de warmtestroomregistratie.
 
1.4.5.  Vloeipunt  
Deze methode werd ontwikkeld voor minerale oliën en is bruikbaar 
voor olieachtige stoffen met lage smelttemperaturen.  
Na voorafgaande verwarming wordt het monster afgekoeld met een 
specifieke snelheid en telkens, iedere 3 K, onderzocht op vloeika ­
rakteristieken. De laagste temperatuur waarbij nog beweging van de vloeistof wordt gezien, wordt genoteerd als het vloeipunt.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende metho ­
den voor de bepaling van smelttemperaturen/smelttrajecten staat ver ­
meld in de tabel.  
TABEL: TOEPASBAARHEID VAN DE METHODEN  
A. Capillaire methode  
Meetmethode Stoffen die 
kunnen 
verpulveren Stoffen die niet 
vlot verpulveren Temperatuurbereik Geschatte 
nauwkeurigheid (  1 ) Bestaande 
norm 
Smelttemperatuur ­
toestellen met vloeistofbad Ja Enkele 273 tot 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Smelttemperatuur ­
toestellen met me ­
talen blok Ja Enkele 293 tot > 573 
K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Fotoceldetectie Ja Verscheidene 
met toepassing 
van hulpappa ­
ratuur 253 tot 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een verhit oppervlak (hot stage) en methode voor 
de bepaling van de vriestemperatuur  
Meetmethode Stoffen die 
kunnen 
verpulveren Stoffen die niet 
vlot verpulveren Temperatuurbe ­
reik Geschatte 
nauwkeurigheid (  1 ) Bestaande norm  
Verhitte staaf vol ­
gens Kofler Ja Neen 283 tot > 
573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
345176 
Smeltpuntmicro ­
scoop Ja Enkele 273 tot > 
573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Meniscusmethode Neen Specifiek 
voor poly ­
amiden 293 tot > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Vriestemperatuur ­
methode Ja Ja 223 tot 573 K ± 0,5 K zoals BS 4695  
( 1 ) Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.  
C. Thermische analyse  
Meetmethode Stoffen die 
kunnen 
verpulveren Stoffen die niet 
vlot verpulveren Temperatuurbe ­
reik Geschatte 
nauwkeurigheid (  1 ) Bestaande norm  
Differentiële ther ­
mische analyse Ja Ja 173 tot 
1 273 K tot 600 K 
± 0,5 K tot 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 537-76 
Differentiële scan ­
ningcalorimetrie Ja Ja 173 tot 
1 273 K tot 600 K 
± 0,5 K tot 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.  
D. Vloeipunt  
Meetmethode Stoffen die 
kunnen 
verpulveren Stoffen die niet 
vlot verpulveren Temperatuurbe ­
reik Geschatte 
nauwkeurigheid (  1 ) Bestaande norm  
Vloeipunt Voor minerale 
oliën en olie ­
achtige 
stoffen Voor minerale 
oliën en 
olieachtige 
stoffen 223 tot 
323 K. ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Afhankelijk van het type instrument en de graad van zuiverheid van de stof.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN  
De aan te houden werkwijzen van bijna alle testmethoden staan 
beschreven in internationale en nationale normen (zie aanhangsel 1).  
1.6.1.  Methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van een capillair  
Bij een trage temperatuurstijging zullen verpulverde stoffen door ­
gaans volgens de in figuur 1 weergegeven stadia verlopen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figuur 1
  
Tijdens de smelttemperatuurbepaling wordt de temperatuur in het 
begin- en eindstadium van het smeltproces geregistreerd.  
1.6.1.1.  Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een 
vloeistofbad  
In figuur 2 is een genormaliseerd glazen apparaat voor smelttempe ­
ratuurbepaling (JIS K 0064) afgebeeld. Alle specificaties zijn opge ­
geven in mm.  
Figuur 2
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Badvloeistof  
Er moet een geschikte badvloeistof bepaald worden. De keuze van 
de vloeistof is afhankelijk van de smelttemperatuur van de te onder ­
zoeken stof, bijvoorbeeld vloeibare paraffine voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 473 K, siliconenolie voor stoffen met een smelttemperatuur van maximaal 573 K.
 
Voor stoffen met een smelttemperatuur hoger dan 523 K kan een 
mengsel, bestaande uit drie delen zwavelzuur en twee delen kaliums ­
ulfaat (naar massa), worden gebruikt. Passende voorzorgsmaatregelen 
dienen te worden genomen wanneer een dergelijk mengsel wordt 
gebruikt.  
Thermometer  
Er mag alleen gebruik worden gemaakt van thermometers die aan de 
eisen in de volgende of daarmee overeenkomende normen voldoen:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Werkwijze  
De droge stof wordt verpulverd in een mortier en in een aan één 
uiteinde dichtgesmolten capillair gebracht en wel zo dat het niveau 
van de vulling, nadat de stof stevig is aangedrukt, circa 3 mm be ­
draagt. Teneinde een gelijkvormig aangedrukt monster te verkrijgen, laat men het capillair vanaf een hoogte van circa 700 mm door een 
glazen buis verticaal op een horlogeglas vallen.
 
Het gevulde capillaire buisje wordt in een bad geplaatst en wel zo 
dat het midden van de kwikbol van de thermometer het capillair ter 
hoogte van het monster aanraakt. Doorgaans wordt het capillair in 
het toestel gebracht bij ongeveer 10 K beneden de smelttemperatuur.  
De badvloeistof wordt zodanig verwarmd dat de temperatuurstijging 
circa 3 K/min bedraagt. De vloeistof moet worden geroerd. Bij on ­
geveer 10 K beneden de verwachte smelttemperatuur wordt de snel ­
heid van de temperatuurstijging ingesteld op ten hoogste 1 K/min.  
Berekening  
De smelttemperatuur wordt als volgt berekend:  
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E )n 
waarin:  
T = de gecorrigeerde smelttemperatuur, uitgedrukt in K  
T D = de van thermometer D afgelezen temperatuur, in K  
T E = de van thermometer E afgelezen temperatuur, in K  
n = het aantal schaalverdelingen van het kwikdraad op het uit ­
stekende gedeelte van thermometer D.  
1.6.1.2.  Toestellen ter bepaling van de smelttemperatuur met behulp van een 
metalen blok  
Apparatuur  
De apparatuur bestaat uit:  
— een cilindervormig metalen blok, waarvan het bovenste gedeelte 
hol is en een kamer vormt (zie figuur 3);  
— een metalen stop met twee of meer openingen waarlangs buisjes 
in het metalen blok kunnen worden gebracht;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— een verwarmingssysteem voor het metalen blok, bijvoorbeeld een 
in het blok ingesloten elektrische weerstand;  
— een regelbare weerstand voor de stroomtoevoer, indien van elek ­
trische verwarming gebruik wordt gemaakt;  
— in de zijwanden van de kamer, in rechte hoeken ten opzichte van 
elkaar, vier vensters van hittebestendig glas; voor één van deze 
vensters is een oculair aangebracht, waardoor het capillair kan 
worden waargenomen, de overige drie vensters worden gebruikt voor de verlichting van de kamer en inhoud daarvan;
 
— een aan één uiteinde gesloten capillair van hittebestendig glas 
(zie 1.6.1.1).  
Thermometer  
Zie de in 1.6.1.1 genoemde normen. Thermo-elektrische meetinstru ­
menten van vergelijkbare nauwkeurigheid kunnen ook worden ge ­
bruikt.  
Figuur 3
  
1.6.1.3.  Fotoceldetectie  
Apparatuur en werkwijze:  
Het apparaat bestaat uit een metalen kamer met een geautomatiseerd 
verwarmingssysteem. Drie capillairen worden overeenkomstig 
1.6.1.1 gevuld en in de oven geplaatst.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Er zijn verscheidene lineaire temperatuurstijgingen beschikbaar voor 
het ijken van het apparaat; de gewenste temperatuurstijging wordt 
elektrisch ingesteld met een van tevoren gekozen constante snelheid en heeft een lineair verloop. Recorders geven de werkelijke oven ­
temperatuur en de temperatuur van de stof in het capillair aan.
 
1.6.2.  Verwarmde oppervlakken (hot stages)  
1.6.2.1.  De verhitte staaf volgens Kofier  
Zie aanhangsel.  
1.6.2.2.  Smeltpuntmicroscoop  
Zie aanhangsel.  
1.6.2.3.  Meniscusmethode (polyamiden)  
Zie aanhangsel.  
De opwarmsnelheid bij temperaturen in de buurt van de smelttem ­
peratuur moet minder zijn dan 1 K/min.  
1.6.3.  Methoden voor de vriestemperatuurbepaling  
Zie aanhangsel.  
1.6.4.  Thermische analyse  
1.6.4.1.  Differentiële thermische analyse  
Zie aanhangsel.  
1.6.4.2.  Differentiële scanningcalorimetrie  
Zie aanhangsel.  
1.6.5.  Bepaling van het vloeipunt  
Zie aanhangsel.  
2. GEGEVENS  
Soms is een thermometercorrectie noodzakelijk.  
3. RAPPORTAGE  
In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens 
worden opgenomen:  
— de gebruikte methode;  
— de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrij ­
ving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voor ­
afgaande zuivering;  
— een schatting van de nauwkeurigheid.  
Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de ge ­
schatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabellen) vallen, wordt gerap ­
porteerd als smelttemperatuur,  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Als het temperatuurverschil tussen het beginpunt en het eindpunt van 
het smelten binnen de nauwkeurigheidsgrenzen van de methode valt, 
wordt de temperatuur van het eindstadium genomen als de smelttem ­
peratuur; zo niet, dan moeten beide temperaturen worden gerappor ­
teerd.  
Als ontleding of sublimatie van de onderzochte stof optreedt voordat 
de smelttemperatuur is bereikt, dient de temperatuur waarbij dit ef ­
fect optreedt, te worden gerapporteerd.  
Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, 
dienen te worden gerapporteerd.
 
4. LITERATUUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102 — Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter VII.  
(4) IUPAC, Physicochemical Measurements: Catalogue of Refe ­
rence Materials from National Laboratories, Pure and Applied Chemistry, 1976, Vol. 48, 505-515.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Aanhangsel  
Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld 
worden geraadpleegd.  
1. Capillaire methoden  
1.1. Smelttemperatuurtoestellen met een vloeistofbad 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the mel ­
ting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of mel ­
ting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products  
1.2. Smelttemperatuurtoestellen met een metalen blok 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of „melting point”  
2. Hete oppervlakken  
2.1. Verwarmde staaf volgens Kofler 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Smeltpuntmicroscoop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen  
2.3. Meniscusmethode (polyamiden) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of „melting point”  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion ma ­
terials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Determination 
du „point de fusion”. Méthode du mé ­
nisque.  
3. Methoden voor vriestemperatuurbepaling  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for determination of melting 
point of petroleum wax (cooling curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Thermische analyse  
4.1. Differentiële thermische analyse 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by me ­
thods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Differentiële scanningcalorimetrie 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by me ­
thods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Bepaling van het vloeipunt  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monster ­
neming en ontleding van aardoliepro ­
dukten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. KOOKTEMPERATUUR  
1. METHODE  
De meeste van de beschreven methoden berusten op de testrichtlijn 
van de OESO (1). De fundamentele principes worden besproken in 
de referenties (2) en (3).  
1.1. INLEIDING  
De hier beschreven methoden en toestellen kunnen worden toegepast 
op vloeistoffen en op bij lage temperatuur smeltende stoffen, welke beneden de kooktemperatuur geen chemische reactie ondergaan (bij ­
voorbeeld: auto-oxidatie, omlegging, ontleding, enz.). De methoden 
zijn van toepassing op zuivere en onzuivere vloeistoffen.
 
De meeste aandacht wordt gegeven aan de fotoceldetectiemethode en 
thermische analysemethode, omdat hiermee zowel smelt- als kook ­
temperaturen kunnen worden bepaald. Bovendien kunnen deze me ­
tingen worden geautomatiseerd.  
Het voordeel van de dynamische methode is, dat deze ook kan 
worden toegepast voor de bepaling van de dampspanning en dat 
het niet nodig is de kooktemperatuur te corrigeren tot normale druk (101,325 kPa) omdat de normale druk tijdens de meting kan worden ingesteld met behulp van een manostaat.
 
Opmerkingen:  
De invloed van verontreinigingen op de bepaling van de kooktem ­
peratuur is sterk afhankelijk van de aard van de verontreiniging. Indien in het monster vluchtige verontreinigingen aanwezig zijn, die de resultaten zouden kunnen beïnvloeden, kan de stof worden 
gezuiverd.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De normale kooktemperatuur wordt gedefinieerd als de temperatuur 
waarbij de dampdruk van een vloeistof gelijk is aan 101,325 kPa.  
Als de kooktemperatuur niet wordt gemeten bij normale atmosferi ­
sche druk, kan de temperatuurafhankelijkheid van de dampdruk wor ­
den beschreven met de vergelijking van Clausius-Clapeyron:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3RT þ constante  
p = de dampspanning van de stof in pascal (Pa)  
ΔH v = de verdampingswarmte in J mol  -1 
R = de universele molaire gasconstante = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = de thermodynamische temperatuur in K.  
Bij vermelding van de kooktemperatuur moet de druk tijdens de 
meting worden opgegeven.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Herleidingen  
Druk (eenheid: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(„bar” is nog toegestaan, doch het gebruik hiervan 
wordt niet aanbevolen).  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(de eenheden mm Hg en Torr zijn niet meer toe ­
gestaan).  
1 atm = standaardatmosfeer = 101 325 Pa 
(de eenheid „atm” is niet toegestaan).  
Temperatuur (eenheid: K)  
t = T - 273,15  
t: Celsiustemperatuur, graden Celsius (  o C) 
T: thermodynamische temperatuur, kelvin (K)  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste 
plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijking met de resultaten van andere metho ­
den mogelijk te maken.
 
Een aantal ijkstoffen is te vinden in de methoden die zijn opgenomen 
in het aanhangsel.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN  
Vijf methoden voor de bepaling van de kooktemperatuur (of kook ­
traject) berusten op de meting van de kooktemperatuur, twee andere 
op thermische analyse.  
1.4.1.  Bepaling met behulp van een ebullioscoop  
De ebullioscoop is oorspronkelijk ontwikkeld voor de bepaling van 
het molecuulgewicht via de kooktemperatuurverhoging, doch leent 
zich ook voor nauwkeurige metingen van de kooktemperatuur. Een zeer eenvoudig toestel is beschreven in ASTM D 1120-72 (zie aan ­
hangsel). De vloeistof wordt in dit toestel onder evenwichtscondities 
bij atmosferische druk verwarmd totdat zij kookt.
 
1.4.2.  Dynamische methode  
Bij deze methode meet men de condensatietemperatuur van de damp 
met behulp van een geschikte thermometer in de reflux tijdens het koken. De druk kan bij deze methode worden gevarieerd.
 
1.4.3.  Destillatiemethode voor kooktemperatuur  
Bij deze methode destilleert men de vloeistof en meet men de con ­
densatietemperatuur van de damp, alsmede de hoeveelheid destillaat.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Methode volgens Siwoloboff  
Bij deze methode verwarmt men het monster in een monsterbuisje, 
dat in een verwarmd vloeistofbad wordt gehouden. Een dichtgesmol ­
ten capillair met een luchtbel onderin wordt in het monsterbuisje 
gebracht.  
1.4.5.  Fotoceldetectie  
Naar het beginsel volgens Siwoloboff worden de opstijgende bellen 
automatisch gemeten met een fotocel.  
1.4.6.  Differentiële thermische analyse  
Met deze techniek wordt het verschil in temperatuur geregistreerd 
tussen de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de temperatuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde 
temperatuurprogramma worden blootgesteld. Als het monster een 
faseovergang doormaakt met verandering van enthalpie, zal deze verandering aangetoond worden door een endotherme afwijking (ko ­
ken) van de basislijn van de temperatuurregistratie.
 
1.4.7.  Differentiële scanningcalorimetrie  
Deze techniek registreert het verschil tussen de energieopname van 
de te onderzoeken stof en een referentiestof als functie van de tem ­
peratuur, wanneer beide stoffen aan hetzelfde gecontroleerde tempe ­
ratuurprogramma worden onderworpen. Deze energie is de energie die nodig is om dezelfde temperatuur voor beide stoffen te bereiken. Als het monster een faseovergang doormaakt met verandering van 
enthalpie zal deze verandering aangetoond worden door een endo ­
therme afwijking (koken) van de basislijn van de warmtestroomregis ­
tratie.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de verschillende metho ­
den voor de bepaling van de kooktemperatuur/kooktraject staan ver ­
meld in tabel 1.  
Tabel 1  
Vergelijking van de methoden  
Meetmethode Geschatte nauwkeurigheid Bestaande norm  
Ebullioscoop ± 1,4 K (tot 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (tot 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dynamische methode ± 0,5 K (tot 600 K) (  2 ) 
Destillatiemethode (kooktraject) ± 0,5 K (tot 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Volgens Siwoloboff ± 2 K (tot 600 K) (  2 ) 
Fotoceldetectie ± 0,3 K (bij 373 K) (  2 ) 
Differentiële thermische analyse ± 0,5 K (tot 600 K) 
± 2,0 K (tot 1 273 K) ASTM E 537-76 
Differentiële scanningcalorimetrie ± 0,5 K (tot 600 K) 
± 2,0 K (tot 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Deze nauwkeurigheid geldt alleen voor eenvoudige toestellen zoals bijvoorbeeld beschreven in ASTM D 1120-72; de 
nauwkeurigheid kan worden verbeterd met meer verfijnde versies van de ebullioscoop. 
( 2 ) Deze nauwkeurigheid geldt alleen voor zuivere stoffen. Het gebruik in andere omstandigheden moet verantwoord 
worden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN  
De werkwijzen van een aantal testmethoden zijn beschreven in inter ­
nationale en nationale normen (zie aanhangsel).  
1.6.1.  Ebullioscoop  
Zie aanhangsel.  
1.6.2.  Dynamische methode  
Zie testmethode A.4 voor de bepaling van de dampspanning.  
De waargenomen kooktemperatuur bij een druk van 101,325 kPa 
wordt geregistreerd.  
1.6.3.  Destillatiemethode (kooktraject)  
Zie aanhangsel.  
1.6.4.  Methode volgens Siwoloboff  
Het monster wordt verwarmd in een smelttemperatuurtoestel in een 
monsterbuisje met een diameter van ongeveer 5 mm (figuur 1).  
In figuur 1 staat een standaardapparaat voor de bepaling van de 
smelt- en kooktemperatuur (JIS K 0064) afgebeeld (glas, alle afme ­
tingen in mm).  
Figuur 1
  
Een capillair (kookcapillair) dat op ongeveer 1 cm boven het onder ­
eind is dichtgesmolten, wordt in het monsterbuisje gebracht. Het 
monsterbuisje wordt met de te onderzoeken stof gevuld, totdat het dichtgesmolten deel van het capillair zich onder het vloeistofopper ­
vlak bevindt. Het monsterbuisje met het kookcapillair wordt met een 
elastiekje aan de thermometer bevestigd of met een zijstuk vastgezet 
(zie figuur 2).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figuur 2  
Beginsel volgens Siwoloboff  Figuur 3  
Gewijzigd beginsel
  
De badvloeistof wordt gekozen aan de hand van de kooktempera ­
tuur. Bij temperaturen tot 573 K kan siliconenolie worden gebruikt. Vloeibare paraffine mag slechts worden gebruikt bij temperaturen tot 473 K. De verwarming van het vloeistofbad moet zo geregeld zijn, 
dat de temperatuur aanvankelijk 3 K/min stijgt. Het vloeistofbad 
moet worden geroerd. Bij ongeveer 10 K beneden de verwachte kooktemperatuur moet de verwarming zo worden ingesteld dat de temperatuur met minder dan 1 K/min stijgt. Zodra de kooktempera ­
tuur wordt bereikt, beginnen er snel belletjes uit het kookcapillair te 
komen.
 
De kooktemperatuur wordt bereikt wanneer, bij tijdelijke afkoeling, 
de bellenvorming stopt en de vloeistof plotseling in het capillair omhoog komt. De bijbehorende stand van de thermometer is de 
kooktemperatuur van de te onderzoeken stof.
 
Bij het gewijzigd beginsel (figuur 3) wordt de kooktemperatuur be ­
paald in een smelttemperatuurcapillair. Deze wordt uitgetrokken tot een fijne punt van ongeveer 2 cm lengte, waarin een geringe hoe ­
veelheid van het monster wordt opgezogen. Het open einde van de 
fijne punt wordt dicht gesmolten, zodat er zich onderin een kleine 
luchtbel bevindt (a). Bij verwarming in het smelttemperatuur toestel (b) zet de luchtbel uit. De kooktemperatuur komt overeen met de temperatuur waarbij de prop van de te onderzoeken stof op het 
niveau van het vloeistofoppervlak komt (c).
 
1.6.5.  Fotoceldetectie  
Het monster wordt verwarmd in een capillair in een verwarmd me ­
taalblok.  
Via geschikte openingen in het blok wordt een lichtbundel door de 
stof heen op een zorgvuldig geijkte fotocel gericht.  
Terwijl de temperatuur van het monster oploopt, komen er lucht ­
bellen uit het kookcapillair. Wanneer de kooktemperatuur wordt be ­
reikt, neemt het aantal bellen flink toe. Hierbij verandert de intensi ­
teit van het licht dat op de cel valt, waardoor het apparaat wordt stilgezet dat de temperatuur afleest van een thermometer met platina weerstand die in het blok is gemonteerd.
 
Deze methode is bijzonder nuttig omdat hiermee ook bepalingen 
mogelijk zijn beneden kamertemperatuur tot 253,15 K (– 20  o C) 
zonder enige veranderingen in de apparatuur. Het instrument moet 
alleen in een koelbad worden geplaatst.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Thermische analyse  
1.6.6.1.  Differentiële thermische analyse  
Zie aanhangsel.  
1.6.6.2.  Differentiële scanningcalorimetrie  
Zie aanhangsel.  
2. GEGEVENS  
Bij kleine afwijkingen van de normale druk (max. ± 5 kPa) worden 
de kooktemperaturen genormaliseerd tot Tn met behulp van de vol ­
gende numerieke vergelijking van Sidney Young:  
T n = T + (f  T x Δ p) 
waarin:  
Δ p = (101,325 - p), [let op het teken]  
p = barometerstand in kPa,  
f T = tempo waarin de kooktemperatuur verandert met de druk in 
K/kPa,  
T = gemeten kooktemperatuur in K,  
T n = kooktemperatuur gecorrigeerd tot normale druk in K.  
De temperatuurcorrectiefactoren f  T en de vergelijkingen voor de be ­
nadering daarvan zijn opgenomen in de internationale en nationale 
normen die hierboven voor een groot aantal stoffen zijn genoemd.  
Zo worden bijvoorbeeld in de methode DIN 53171 de volgende (bij 
benadering) correcties vermeld voor oplosmiddelen in verf (zie tabel 2).  
Tabel 2:  
Temperatuurcorrectiefactoren f  T 
Temperatuur T (K) Correctiefactor f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RAPPORTAGE  
In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens 
worden opgenomen:  
— de gebruikte methode;  
— een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (be ­
schrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voor ­
afgaande zuivering;  
— een schatting van de nauwkeurigheid.  
Het gemiddelde van ten minste twee metingen die binnen de ge ­
schatte nauwkeurigheidsgrenzen (zie tabel 1) vallen, wordt genoteerd 
als kooktemperatuur.  
De gemeten kooktemperaturen en hun gemiddelde moeten worden 
opgegeven, alsmede de druk(ken), waarbij de metingen zijn uitge ­
voerd, in kPa. De druk dient bij voorkeur dicht bij de normale atmosferische druk te liggen.
 
Alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.
 
4. LITERATUUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103 — Decision of the 
Council C(81)30 Final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Burterworths, London, 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol.I, Part I, Chapter VIII.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Aanhangsel  
Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld 
worden geraadpleegd:  
1. Ebullioscoop  
ASTM D 1120-72 Standard Test Method for Boiling Point 
of Engine Anti-freezes  
2. Destillatieprocess (kooktraject)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Disrillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Differentiële thermische analyse en differentiële scanningcalori ­
metrie  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. RELATIEVE DICHTHEID  
1. METHODE  
De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO 
(1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).  
1.1. INLEIDING  
De hieronder beschreven methoden voor het bepalen van de relatieve 
dichtheid zijn van toepassing op vaste stoffen en op vloeistoffen, 
ongeacht de zuiverheid van deze stoffen. De verschillende methoden zijn vermeld in tabel 1.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De relatieve dichtheid, D20/4, van vaste stoffen of vloeistoffen is de 
verhouding tussen de massa van een volume te onderzoeken stof bij 
20 o C en de massa van hetzelfde volume water bij 4  o C. De relatieve 
dichtheid heeft geen dimensie.  
De dichtheid, p, van een stof is het quotiënt van de massa m en het 
volume v van deze stof.  
De dichtheid, p, wordt uitgedrukt in kg/m  3 (SI-eenheden).  
1.3. REFERENTIESTOFFEN (1) (3)  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren en om vergelijkingen met resultaten van andere methodes mogelijk 
te maken.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN  
Er worden vier soorten methoden gebruikt.  
1.4.1.  Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht  
1.4.1.1.  Areometer  (hydrometer voor vloeistoffen)  
Voldoende nauwkeurige en snelle dichtheidsbepalingen kunnen wor ­
den uitgevoerd met drijvende areometers; het gedeelte van de areo ­
meter dat in de vloeistof zakt, is bepalend voor de dichtheid van de 
vloeistof en kan van een schaalverdeling worden afgelezen.  
1.4.1.2.  Hydrostatische balans  (voor vloeistoffen en vaste stoffen)  
Het gewichtsverschil van een monster, gemeten in lucht en in een 
geschikte vloeistof (bijvoorbeeld water), kan worden gebruikt om de dichtheid ervan te bepalen.
 
Voor vaste stoffen geldt de gemeten dichtheid slechts voor het be ­
wuste monster. Voor het bepalen van de dichtheid van vloeistoffen 
wordt een voorwerp met volume v eerst in lucht en vervolgens in de testvloeistof gewogen.
 
1.4.1.3.  Methode met ondergedompeld voorwerp  (voor vloeistoffen) (4)  
Bij deze methode wordt de dichtheid van een vloeistof bepaald aan 
de hand van het verschil tussen de resultaten van een weging van de 
vloeistof voor en na het onderdompelen van een voorwerp met be ­
kend volume in de te onderzoeken vloeistof.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Methoden met de pyknometer  
Voor vaste stoffen en vloeistoffen kunnen pyknometers van uiteen ­
lopende vorm en met bekend volume worden gebruikt. De dichtheid wordt berekend uit het verschil in gewicht tussen de volle en de lege 
pyknometer en het bekende volume daarvan.
 
1.4.3.  Vergelijkingspyknometer met lucht  (voor vaste stoffen)  
De dichtheid van een vaste stof in willekeurige vorm kan bij kamer ­
temperatuur worden gemeten met behulp van een gasvergelijkings ­
pyknometer. Het volume van een stof wordt in lucht of in een inert 
gas gemeten in een cilinder waarvan het variabele volume gekali ­
breerd is. Voor de berekening van de dichtheid wordt na meting van het volume een massameting verricht.
 
1.4.4.  Oscillerende dichtheidsmeter  (5) (6) (7)  
De dichtheid van een vloeistof kan worden gemeten met behulp van 
een oscillerende dichtheidsmeter. Een mechanische oscillator in de 
vorm van een U-buis wordt in trilling gebracht bij de resonantiefre ­
quentie van de oscillator die afhankelijk is van zijn massa. Bij het inbrengen van een monster verandert de resonantiefrequentie van de 
oscillator. Het apparaat moet worden geijkt met twee vloeistoffen 
van bekende dichtheid. Deze ijkstoffen moeten bij voorkeur zo wor ­
den gekozen dat de dichtheden ervan zich aan de uiteinden van het meetbereik bevinden.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De toepasbaarheid van de verschillende methoden voor bepaling van 
de relatieve dichtheid staat vermeld in de tabel.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN  
Normen, die als voorbeeld kunnen worden geraadpleegd voor aan ­
vullende technische gegevens, zijn bijgevoegd in het aanhangsel.  
De proeven moeten worden uitgevoerd bij 20  o C en ten minste in 
tweevoud.  
2. GEGEVENS  
Zie normen.  
3. RAPPORTAGE  
In het eindverslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens 
worden opgenomen:  
— de gebruikte methode;  
— een nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (be ­
schrijving en verontreinigingen) en, indien van toepassing, voor ­
afgaande zuivering.  
De relatieve dichtheid  D 20 
4 dient te worden gerapporteerd zoals ge ­
definieerd onder 1.2, alsmede de fysische toestand van de onder ­
zochte stof.  
Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot 
verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, 
dienen te worden gerapporteerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabel  
Toepasbaarheid van de methoden  
Meetmethode Dichtheid Maximale 
dynamische 
viscositeit Bestaande norm 
Vaste stof Vloeistof  
1.4.1.1. Areometer Ja 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Hydrostatische balans 
a) vaste stof Ja ISO 1183 (A) 
b) vloeistof Ja 5 Pa S ISO 901 en 758 
1.4.1.3. Methode met onder ­
gedompeld voorwerp Ja 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Pyknometer ISO 3507 
a) vaste stof Ja ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
b) vloeistof Ja 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Vergelijkingspyknometer 
met lucht Ja DIN 55990 deel 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Oscillerende dichtheids ­
meter Ja 5 Pa s
 
4. LITERATUUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of organic chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Intersci ­
ence Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realisation of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.
 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugei zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm; 1979, Vol. 11, 427- 
430. 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Pro ­
dukten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische 
Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.  
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brau ­
ereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Aanhangsel  
Voor aanvullende technische gegevens kunnen de volgende normen als voorbeeld 
worden geraadpleegd:  
1. Methoden gebaseerd op de opwaartse kracht  
1.1. Areometer 
DIN 12790, ISO 387 Areometer; algemene aanwijzingen 
DIN 12791 Deel I: Dichtheidsareometers: constructie, 
instelling en gebruik 
Deel II: Dichtheidsareometers: genormali ­
seerde maten, benaming 
Deel III: Gebruik en test 
ISO 649-2 Laboratoriumglaswerk: Dichtheidsareome ­
ters voor algemeen gebruik 
NF T 20-050 Chemische producten voor industrieel ge ­
bruik — Bepaling van dichtheid van vloeistoffen — Areometermethode 
DIN 12793 Laboratoriumglaswerk: areometers voor 
bepaling van het meetbereik
 
1.2. Hydrostatische balans  
Voor vaste stoffen  
ISO 1183 Methode A: Methoden voor het bepalen 
van de dichtheid en relatieve dichtheid 
van kunststoffen met uitzondering van 
schuimplastics 
NF T 20-049 Chemische producten voor industrieel ge ­
bruik — Bepaling van dichtheid van vaste 
stoffen uitgezonderd poeders en schuim ­
producten — Hydrostatische balans ­
methode 
ASTM D 792 Soortelijk gewicht en dichtheid van kunst ­
stoffen door verplaatsing 
DIN 53479 Proeven voor kunststoffen en elastome ­
ren: bepaling van de dichtheid  
Voor vloeistoffen  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Proeven voor minerale oliën en verwante 
materialen: bepaling van de dichtheid 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 en ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Dichtheid, soortelijk gewicht of API-ge ­
wicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieproducten met de areometer ­
methode 
BS 4714 Dichtheid, soortelijk gewicht of API-ge ­
wicht van ruwe aardolie en vloeibare aardolieproducten met de areometer ­
methode
 
1.3. Methode met ondergedompeld voorwerp 
DIN 53217 Proeven voor verf, vernis en soortgelijke 
producten; dichtheidsbepaling met de me ­
thode met ondergedompeld voorwerp  
2. Pyknometermethoden  
2.1. Voor vloeistoffen 
ISO 3507 Pyknometers 
ISO 758 Vloeibare chemische producten; bepaling 
van de dichtheid bij 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pyknometer (voor niet-vluch ­
tige vloeistoffen die niet al te visceus zijn) 
DIN 12798 Lipkin pyknometer (voor vloeistoffen met 
een kinematische viscositeit van minder dan 100.10
 -6 m 2 s -1 bij 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pyknometer (voor vloeistoffen 
zoals in DIN 12798) 
DIN 12801 Reischauer pyknometer (voor vloeistoffen 
met een kinematische viscositeit van min ­
der dan 100.10  -6 m 2 s -1 bij 20  o C, vooral 
ook toepasbaar op koolwaterstoffen en oplossingen in water, alsmede op vloei ­
stoffen met een hogere dampdruk, onge ­
veer 1 bar bij 90
 o C) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pyknometer (voor alle soorten 
visceuze vloeistoffen met een niet al te hoge dampdruk, in het bijzonder voor verven, vernissen en bitumen) 
DIN 12807 Bingham pyknometer (voor vloeistoffen 
zoals in DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pyknometer (in het bijzonder 
voor mengsels van ethanol en water) 
DIN 12809 Pyknometer met ingeslepen thermometer 
en capillaire zijbuis (voor vloeistoffen 
die niet al te visceus zijn) 
DIN 53217 Proeven voor verven, vernissen en soort ­
gelijke producten; bepaling van de dicht ­
heid met behulp van een pyknometer 
DIN 51757 Punt 7: Proeven voor minerale oliën en 
verwante materialen; bepaling van de dichtheid 
ASTM D 297 Hoofdstuk 15: Rubberproducten — che ­
mische analyse 
ASTM D 2111 Methode C: Organische halogeenverbin ­
dingen 
BS 4699 Methode voor het bepalen van soortelijk 
gewicht en dichtheid van aardolieproduc ­
ten (met behulp van een bicapillaire 
pyknometer met schaalverdeling) 
BS 5903 Methode voor het bepalen van de rela ­
tieve dichtheid en dichtheid van aardolie ­
producten met behulp van een pyknome ­
ter met capillaire stop 
NF T 20-053 Chemische producten voor industrieel ge ­
bruik — Bepaling van dichtheid van vaste 
stoffen in poeders en vloeistoffen — 
Pyknometermethode
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Voor vaste stoffen 
ISO 1183 Methode B: Methode voor het bepalen 
van de dichtheid en relatieve dichtheid van kunststoffen, met uitzondering van 
schuimplastics 
NF T 20-053 Chemische producten voor industrieel ge ­
bruik — Bepaling van dichtheid van vaste stoffen in poeder en vloeistoffen — Pyknometermethode 
DIN 19683 Bepaling van de bodemdichtheid
 
3. Vergelijkingspyknometer met lucht  
DIN 55990 Deel 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ahnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. DAMPSPANNING  
1. METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan OESO TG 104 (2004).  
1.1. INLEIDING  
Deze herziene versie van methode A.4 (1) bevat een aanvullende 
meetmethode, Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie, ontwik ­
keld voor stoffen met zeer lage spanningen (tot 10  –10 Pa). Gezien de 
behoefte aan meetmethoden, met name voor het bepalen van de dampspanning van stoffen met lage dampspanning, zijn de overige meetmethoden van deze methode herzien met betrekking tot andere 
toepassingsbereiken.
 
Bij thermodynamisch evenwicht is de dampspanning van een zuivere 
stof alleen een functie van de temperatuur. De fundamentele princi ­
pes worden besproken in de referenties (2) en (3).  
Er bestaat geen meetmethode die voor alle mogelijke waarden van de 
dampspanning, van minder dan 10  –10 tot 10  5 Pa, van toepassing is. 
Deze methode omvat acht meetmethoden voor de dampspanning, die toepasbaar zijn voor verschillende dampspanningsbereiken. Tabel 1 
biedt een vergelijking van de toepasbaarheid en het meetbereik van 
de verschillende methoden. De meetmethoden kunnen alleen worden toegepast voor verbindingen die niet ontleden onder de testomstan ­
digheden. In gevallen waarin de experimentele methoden om tech ­
nische redenen niet kunnen worden toegepast kan de dampspanning 
ook worden geschat. Een aanbevolen schattingsmethode wordt be ­
schreven in het aanhangsel.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De dampspanning van een stof wordt gedefinieerd als de verzadi ­
gingsdruk boven een vaste stof of vloeistof.  
Voor de druk dient de SI-eenheid, de pascal (Pa), te worden ge ­
bruikt. Andere eenheden die in het verleden zijn gebruikt worden hieronder weergegeven, samen met hun herleidingsfactoren: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10
 2 Pa 
1 atmosfeer = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
De SI-eenheid van temperatuur is de kelvin (K). De formule voor het 
herleiden van graden Celsius naar Kelvin is:  
T = t + 273,15  
Hierin is T de Kelvintemperatuur ofwel de thermodynamische tem ­
peratuur en t de Celsiustemperatuur.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabel 1  
Meetmethode Vaste stoffen Vloeistoffen Geschatte her ­
haalbaarheid Geschatte repro ­
duceerbaarheid Aanbevolen bereik  
Dynamische 
methode Laag 
smeltpunt Ja tot 25 % 
1-5 % tot 25 % 
1-5 % 10 3 Pa tot 
2x10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa tot 
10 5 Pa 
Statische methode Ja Ja 5-10 % 5-10 % 10 Pa – 10  5 Pa 
10 –2 Pa tot 
10 5 Pa (  1 ) 
Isoteniscoop ­
methode Ja Ja 5-10 % 5-10 % 10  2 Pa tot 10  5 Pa 
Effusiemethode: 
dampspannings ­
balans Ja Ja 5-20 % tot 50 % 10  –3 tot– 1 Pa 
Effusiemethode: 
Knudsencel Ja Ja 10-30 % — 10  –10 tot 1 P 
Effusiemethode: 
isotherme thermo ­
gravimetrie Ja Ja 5-30 % tot 50 % 10  –10 tot 1 Pa 
Gasverzadigings ­
methode Ja Ja 10-30 % tot 50 % 10  –10 tot 10  3 Pa 
Draaienderotor ­
methode Ja Ja 10-20 % — 10  –4 tot 0,5 Pa  
( 1 ) Bij gebruik van een capacitieve manometer.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TEST  
Over het algemeen wordt de dampspanning bepaald bij verschillende 
temperaturen. Binnen een beperkt temperatuurbereik is de logaritme 
van de dampspanning van een zuivere stof omgekeerd evenredig met 
de thermodynamische temperatuur, volgens de vereenvoudigde ver ­
gelijking van Clausius-Clapeyron:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constante  
waarin:  
p = de dampspanning van de stof in pascal (Pa)  
ΔHv = de verdampingswarmte in J mol  –1 
R = de universele molaire gasconstante, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = de thermodynamische temperatuur in K  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. REFERENTIESTOFFEN  
Het is niet nodig om referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn 
in de eerste plaats bedoeld om van tijd tot tijd de werking van een methode te controleren en om vergelijkingen tussen resultaten van 
verschillende methoden mogelijk te maken.
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.5.1.  Dynamische methode (methode van Cottrell)  
1.5.1.1.  Principe  
De dampspanning wordt bepaald door het meten van de kooktem ­
peratuur van een stof bij verschillende ingestelde waarden van de druk tussen ongeveer 10
 3 Pa en 10  5 Pa. Deze methode wordt ook 
aanbevolen voor het bepalen van de kooktemperatuur. Voor dat doel 
is de methode bruikbaar tot 600 K. De kooktemperatuur van vloei ­
stoffen op een diepte van 3 tot 4 centimeter is ongeveer 0,1 °C hoger dan aan de oppervlakte, vanwege de hydrostatische druk van de 
vloeistofkolom. In de methode van Cottrell (4) wordt de thermometer 
in de damp boven de oppervlakte van de vloeistof geplaatst en wordt de kokende vloeistof voortdurend over de kwikbol van de thermo ­
meter geleid. De kwikbol wordt bedekt door een dunne vloeistoflaag 
die in evenwicht is met de damp bij atmosferische druk. Zo geeft de 
thermometer de echte kooktemperatuur aan, zonder meetfouten door oververhitting of hydrostatische druk. De oorspronkelijk door Cot ­
trell gebruikte pomp is weergegeven in figuur 1. Buis A bevat de 
kokende vloeistof. Een platina draad B, die in de bodem is beves ­
tigd, bevordert gelijkmatig koken. De zijbuis C leidt naar een con ­
densor en de mantel D zorgt ervoor dat het koude condensaat niet bij de thermometer E kan komen. Als de vloeistof in A kookt, worden 
de in de trechter opgevangen bellen en vloeistof via de twee armen 
van de pomp F over de kwikbol van de thermometer geleid.  
Figuur 1
 Figuur 2
  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrell-pomp (4)  
A: Thermokoppel  
B: Vacuümbuffervolume  
C: Precisiemanometer  
D: Vacuüm  
E: Meetpunt  
F: Verwarmingselement (ca. 150 W)  
1.5.1.2.  Apparatuur  
In figuur 2 is een zeer nauwkeurig meetapparaat weergegeven, dat 
werkt volgens het Cottrell-principe. Het bestaat uit een buis met een kookgedeelte aan de benedenzijde, een koeler in het midden, en een uitgang en een flens aan de bovenzijde. De Cottrell-pomp wordt in 
het kookgedeelte geplaatst, dat wordt verwarmd door middel van een 
elektrisch verwarmingspatroon. De temperatuur wordt gemeten via een mantelthermokoppel of een weerstandsthermometer die bij de 
flens aan de bovenzijde naar binnen steekt. De uitgang wordt ver ­
bonden aan het drukregelingssysteem, dat bestaat uit een vacuüm ­
pomp, een buffervolume, een manostaat voor het inlaten van stikstof om de druk te regelen, en een manometer.
 
1.5.1.3.  Werkwijze  
De stof wordt in het kookgedeelte gebracht. Indien vaste stoffen niet 
als poeder beschikbaar zijn, kunnen er problemen ontstaan, maar deze kunnen soms worden opgelost door de koelwatermantel te ver ­
warmen. De apparatuur wordt bij de flens afgesloten en de stof 
wordt ontgast.
 
Vervolgens wordt de laagst gewenste druk ingesteld en wordt het 
verwarmingssysteem aangezet. Tegelijkertijd wordt de temperatuur ­
voeler verbonden met een recorder.  
Het evenwicht is bereikt, wanneer bij een constante druk een con ­
stante kooktemperatuur kan worden afgelezen. Wees voorzichtig om „stoten” tijdens het koken te voorkomen. Voorts moet volledige 
condensatie plaatsvinden op de koeler. Bij het bepalen van de damp ­
spanning van bij lage temperatuur smeltende stoffen moet men voor ­
komen dat de condensor verstopt raakt.
 
Nadat dit evenwichtspunt is geregistreerd, wordt een hogere druk 
ingesteld. Dit proces wordt herhaald totdat een druk van 10  5 Pa is 
bereikt (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal). Ter controle moeten de evenwichtspunten nogmaals worden bepaald bij afnemende druk.
 
1.5.2.  Statische methode  
1.5.2.1.  Principe  
In de statische methode (5) wordt de dampspanning bij thermodyna ­
misch evenwicht bepaald bij een ingestelde temperatuur. Deze me ­
thode is geschikt voor stoffen en vloeistoffen die uit meerdere com ­
ponenten bestaan en vaste stoffen in het bereik van 10  –1 tot 10  5 Pa 
en eveneens, mits behoedzaam uitgevoerd, in het bereik van 1 tot 
10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Apparatuur  
De opstelling bestaat uit een thermostatisch bad (met een nauwkeu ­
righeid van ± 0,2 K), een vat voor het monster dat verbonden is aan de vacuümleiding, een manometer en een drukregelingssysteem. De 
monsterruimte (figuur 3a) is verbonden aan de vacuümleiding via 
een kraan en een hulpmanometer (een U-buis met een geschikte manometervloeistof) die dient voor de nulpuntsinstelling. Afhanke ­
lijk van het drukbereik en het chemisch gedrag van de teststof zijn 
kwik, siliconenoliën en ftalaten geschikte manometervloeistoffen. 
Het gebruik van kwik dient echter om milieuredenen waar mogelijk te worden vermeden. De teststof mag niet merkbaar oplossen in of 
reageren met de vloeistof in de U-buis (figuur 3b). Voor de mano ­
meter kan kwik worden gebruikt in het bereik van normale drukken tot 10
 2 Pa; siliconenvloeistoffen en ftalaten zijn geschikt voor druk ­
ken van 10 tot 10  2 Pa. Er bestaan ook andere drukmeters die ge ­
bruikt kunnen worden tot 10  2 Pa, en verwarmbare membraancapaci ­
teitmanometers kunnen zelfs worden gebruikt bij drukken beneden 10
 –1 Pa. De temperatuur wordt aan de buitenkant van de monster ­
ruimte of in het vat zelf gemeten.  
1.5.2.3.  Werkwijze  
Vul bij gebruikmaking van de in figuur 3a beschreven opstelling de 
U-buis met de gewenste vloeistof, die moet zijn ontgast bij hogere temperatuur voordat tot aflezen wordt overgegaan. De teststof wordt in de opstelling gebracht en bij lagere temperatuur ontgast. In het 
geval van een meercomponentensysteem moet de temperatuur laag 
genoeg zijn om te verzekeren dat de samenstelling van het materiaal niet verandert. Een evenwichtstoestand kan sneller worden bereikt 
door te roeren. Het monster kan onderkoeld worden met vloeibare 
stikstof of droog ijs, waarbij condensatie van lucht of pompvloeistof moet worden vermeden. Met de kraan boven de monsterruimte in geopende stand wordt vervolgens de ingesloten lucht gedurende een 
aantal minuten uit de apparatuur gepompt. Zo nodig moet de ont ­
gassing verschillende keren herhaald worden.  
Figuur 3a
 Figuur 3b
  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Als het monster verhit wordt met de kraan gesloten, stijgt de damp ­
spanning. Dit verandert het evenwicht van de vloeistof in de U-buis. 
Om hiervoor te compenseren, wordt stikstof of lucht via de kraan in het toestel binnengelaten tot de vloeistof in de drukmeter weer bij nul staat. De hiervoor vereiste druk kan afgelezen worden bij kamer ­
temperatuur op een manometer of op een instrument met hogere 
precisie. Deze druk komt overeen met de dampspanning van de stof bij die meettemperatuur. Bij gebruikmaking van de in figuur 3b weergegeven opstelling wordt de dampspanning direct afgelezen.
 
De dampspanning wordt bepaald met voldoende kleine temperatuur ­
intervallen (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal) tot aan de ge ­
wenste maximumtemperatuur.  
Ter controle moeten de metingen bij lage temperaturen herhaald 
worden. Als de waarden die verkregen worden bij de herhaalde metingen niet overeenkomen met de grafiek die is verkregen bij 
stijgende temperatuur, kan dit te wijten zijn aan een van de volgende 
situaties:
 
i) Het monster bevat nog altijd lucht (bijvoorbeeld stoffen met hoge 
viscositeit) of bij lage temperatuur kokende stoffen die vrijkomt/ ­
vrijkomen bij verwarming;  
ii) De stof ondergaat een chemische reactie in het onderzochte tem ­
peratuurbereik (bijvoorbeeld afbraak, polymerisatie).  
1.5.3.  Isoteniscoopmethode  
1.5.3.1.  Principe  
De isoteniscoop (6) is gebaseerd op het principe van de statische 
methode. Bij deze methode wordt een monster in een bol gebracht 
die op constante temperatuur wordt gehouden en die wordt verbon ­
den met een manometer en een vacuümpomp. Verontreinigingen die vluchtiger zijn dan de te onderzoeken stof worden verwijderd door te ontgassen bij gereduceerde druk. De dampspanning van het monster 
bij de ingestelde temperatuur wordt in evenwicht gebracht met een 
bekende druk van een inert gas. De isoteniscoop is ontwikkeld om de dampspanning van bepaalde vloeibare koolwaterstoffen te meten, maar is eveneens geschikt voor onderzoek van vaste stoffen. Over 
het algemeen is de methode niet geschikt voor meercomponenten ­
systemen. Bij monsters die niet-vluchtige verontreinigingen bevatten vertonen de resultaten slechts geringe meetfouten. Het aanbevolen meetbereik is 10
 2 tot 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Apparatuur  
Een voorbeeld van een meetinstrument is afgebeeld in figuur 4. Zie 
ASTM D 2879-86 (6) voor een volledige beschrijving.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Werkwijze  
Voor vloeistoffen dient de stof zelf als vulvloeistof in de hulp ­
manometer. Een hoeveelheid vloeistof die voldoende is voor het vullen van de bol en de korte arm van de manometer, wordt in 
de isoteniscoop gebracht. De isoteniscoop wordt met het va ­
cuümsysteem verbonden, leeggepompt en daarna gevuld met stik ­
stof. Het leegmaken en doorspoelen van het systeem wordt tweemaal herhaald om de resterende zuurstof te verwijderen. 
De gevulde isoteniscoop wordt horizontaal gehouden zodat het 
monster zich in een dunne laag verspreidt over de monsterbol en de manometer. De druk in het systeem wordt gereduceerd tot 
133 Pa en het monster wordt zachtjes verwarmd tot het juist 
kookt (verwijdering van opgeloste gassen). De isoteniscoop wordt dan zo gedraaid dat het monster terugloopt naar de bol en het de korte arm van de manometer vult. De druk wordt op 
133 Pa gehouden. De uitgetrokken punt van de monsterbol 
wordt verwarmd met een kleine vlam, totdat de damp die uit het monster vrijkomt voldoende expandeert om een deel van het monster uit het bovenste gedeelte van de bol en de manometer ­
arm te verplaatsen naar het manometergedeelte van de isoteni ­
scoop en zo een met damp gevulde, stikstofvrije ruimte te creë ­
ren. Vervolgens wordt de isoteniscoop in een thermostatisch bad geplaatst, en de druk van de stikstof aangepast tot deze druk 
gelijk is aan de druk van het monster. Bij het evenwichtspunt is 
de dampspanning van de stikstof gelijk aan de dampspanning van de stof.
 
Figuur 4
  
Voor vaste stoffen worden manometervloeistoffen zoals silico ­
nenoliën of ftalaten gebruikt, afhankelijk van het druk- en 
temperatuurbereik. De ontgaste manometervloeistof wordt in 
de ronding van de lange arm van de isoteniscoop gebracht. Daarna wordt de te onderzoeken vaste stof in de bol gebracht en bij hogere temperatuur ontgast. Vervolgens wordt de isote ­
niscoop gekanteld zodat de manometervloeistof in de U-buis 
kan stromen.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Effusiemethode: dampspanningsbalans  (7) 
1.5.4.1.  Principe  
Een monster van een teststof wordt verwarmd in een kleine oven en 
in een vacuüm stolp gebracht. De oven wordt afgesloten met een 
deksel met kleine openingen van bekende diameter. De damp van de 
stof die door een van de openingen ontsnapt, wordt naar de balans ­
schaal van een zeer gevoelige balans geleid, die ook is omgeven door een vacuüm stolp. In sommige ontwerpen wordt de balans ­
schaal omgeven door een koelpot voor warmteafvoer naar buiten 
door middel van thermische geleiding en wordt deze door straling gekoeld zodat de ontsnappende damp erop condenseert. De impuls 
van de dampstroom werkt als kracht op de balansschaal. De damp ­
spanning kan op twee manieren worden afgeleid: rechtstreeks uit de kracht op de balansschaal en tevens uit de verdampingssnelheid met behulp van de Hertz-Knudsen-vergelijking (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
waarin:  
G = verdampingssnelheid (kg s  –1 m –2 ) 
M = molaire massa (g mol  –1 ) 
T = temperatuur (K)  
R = universele gasconstante (J mol  –1 K –1 ) 
p = dampspanning (Pa)  
Het aanbevolen meetbereik is 10  –3 tot 1 Pa.  
1.5.4.2.  Apparatuur  
Het algemene principe van de opstelling is weergegeven in figuur 5.  
Figuur 5
  
A: Grondplaat F: Koelpot en koelstaaf 
B: Instrument met bewegende spiraal G: Verdampingsoven 
C: Stolp H: Dewarvat met vloeibare stikstof D: Balans met balansschaal I: Temperatuurmeting van het monster 
E: Vacuüm meetinstrument J: Teststof
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Effusiemethode: Knudsencel  
1.5.5.1.  Principe  
Deze methode berust op de schatting van de massa van de hoe ­
veelheid teststof die per tijdseenheid in de vorm van damp door een gekalibreerde micro-opening uit een Knudsencel (8) stroomt, in ultravacuüm toestand. De uitgestroomde dampmassa kan verkre ­
gen worden door bepaling van de afname van de massa van de cel of 
door condensatie van de damp bij lage temperatuur en bepaling van de hoeveelheid verdampte stof met behulp van chromatografie. De dampspanning wordt berekend door toepassing van de Hertz-Knud ­
sen-vergelijking (zie paragraaf 1.5.4.1) met correctiefactoren die af ­
hankelijk zijn van de parameters van de apparatuur (9). Het aanbe ­
volen meetbereik is 10
 –10 tot 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Apparatuur  
Het algemene principe van de opstelling is weergegeven in figuur 6.  
Figuur 6
  
1: Verbinding naar vacuüm 7: Deksel met schroefdraad 
2: Uitsparingen voor platina weerstandsther ­
mometer of temperatuurmeting en -rege ­
ling 8: Vleugelmoeren 
3: Deksel voor vacuümva 9: Bouten 
4: O-ring 10: Roestvrijstalen uitstroomcel 
5: Aluminium vacuümvat 11: Verwarmingspatroon 6: Onderdeel voor het plaatsen en verwijde ­
ren van de cellen
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie  
1.5.6.1.  Principe  
Deze methode berust op bepaling van de verhoogde verdampings ­
snelheden voor de teststof bij hogere temperaturen en omgevings ­
druk door middel van thermogravimetrie (10)(15)(16)(17)(18) (19) ­
(20). De verdampingssnelheden v  T worden verkregen door de geko ­
zen verbinding bloot te stellen aan een atmosfeer van langzaam stromend inert gas en bij bekende isotherme temperaturen T in Kel ­
vin de gewichtsafname gedurende geschikte tijdsperioden te meten. 
De dampspanningen p
 T worden berekend uit de v  T -waarden met 
behulp van het lineaire verband tussen de logaritme van de damp ­
spanning en de logaritme van de verdampingssnelheid. Indien nodig 
kan worden geëxtrapoleerd tot temperaturen van 20 en 25 °C door log p
 T uit te zetten tegen 1/T. Deze methode is geschikt voor stoffen 
met dampspanningen tot 10  –10 Pa (10  –12 mbar) en met een zuiver ­
heid die zo dicht mogelijk de 100 % benadert, teneinde een ver ­
keerde interpretatie van de gemeten gewichtsafname te vermijden.  
1.5.6.2.  Apparatuur  
Het algemene principe van de proefopstelling is weergegeven in 
figuur 7.  
Figuur 7
  
De verdampte teststofmoleculen worden meegevoerd in een stroom van 
droog stikstofgas. Deze strijkt langs het dragerplaatje, dat aan een mi ­
crobalans in een thermostatisch geregelde ruimte hangt. Na het verlaten van deze ruimte wordt de gasstroom gezuiverd door een sorptiemiddel.
 
1.5.6.3.  Werkwijze  
De teststof wordt als homogene laag op het oppervlak van een geruwd 
glasplaatje aangebracht. Bij vaste stoffen wordt het plaatje gelijkmatig bevochtigd met een oplossing van de stof in een geschikt oplosmiddel en in een inerte atmosfeer gedroogd. Voor de meting wordt het drager ­
plaatje in een thermogravimetrisch analyseapparaat gehangen, waarna 
continu de gewichtsafname als functie van de tijd wordt gemeten.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
De verdampingssnelheid v  T bij een bepaalde temperatuur wordt be ­
rekend uit de gewichtsafname Δm van het dragerplaatje met behulp 
van de vergelijking  
v T ¼ Δm 
F Ö t Ä 
gcm  –2 h –1 Ö 
waarin F staat voor de oppervlakte van de teststoflaag, gewoonlijk de 
oppervlakte van het dragerplaatje, en t de tijd is waarin de massa met Δm afneemt.
 
De dampspanning p  T wordt berekend op basis van het verband met 
de verdampingssnelheid v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
waarin C en D constanten zijn die specifiek zijn voor de gebruikte 
proefopstelling en die afhangen van de diameter van de meet ­
ruimte en de stroomsnelheid van het stikstofgas. Deze constanten 
moeten eenmalig worden bepaald door een reeks verbindingen met bekende dampspanningen te meten en log p
 T uit te zetten tegen 
log v  T (11)(21)(22).  
Het verband tussen de dampspanning p  T en de kelvintemperatuur T 
wordt gegeven door  
Log p  T = A + B 1/T  
waarin A en B constanten zijn die worden verkregen door log p  T uit 
te zetten tegen 1/T. Met behulp van deze vergelijking kan door 
extrapolatie de dampspanning voor iedere andere temperatuur wor ­
den verkregen.  
1.5.7.  Gasverzadigingsmethode  (23)  
1.5.7.1.  Principe  
Inert gas wordt bij kamertemperatuur en met een bekende stroom ­
snelheid door of over een monster van de teststof geleid. De stroom ­
snelheid moet laag genoeg zijn om de noodzakelijke verzadiging in de gasfase te verzekeren. De getransporteerde stof wordt opgevan ­
gen, over het algemeen met behulp van een sorptiemiddel, en aan 
kwantitatieve analyse onderworpen. Als een alternatief voor damp ­
vallen met daarop volgende analyse kunnen in serie gezette analyti ­
sche technieken zoals chromatografie worden gebruikt om de hoe ­
veelheid getransporteerde stof te meten. De dampspanning wordt 
berekend met de aanname dat wordt voldaan aan de ideale gaswet en dat de totale druk van een gasmengsel gelijk is aan de som van de drukken van de componenten van het gasmengsel. De partiële druk 
van de teststof, met andere woorden de dampspanning, wordt bere ­
kend uit het bekende totale gasvolume en het gewicht van het ge ­
transporteerde materiaal.
 
De gasverzadigingsmethode is geschikt voor vaste en vloeibare stof ­
fen en kan worden gebruikt voor dampspanningen tot 10  –10 Pa (10)­
(11)(12)(13)(14). De methode is het betrouwbaarst voor dampspan ­
ningen beneden 10  3 Pa. Boven 10  3 Pa levert de methode over het 
algemeen een te hoge waarde voor de dampspanning op, waarschijn ­
lijk als gevolg van aerosolvorming. Aangezien de metingen van de 
dampspanningen bij kamertemperatuur worden uitgevoerd hoeven de data niet te worden geëxtrapoleerd vanaf hoge temperaturen en wordt extrapolatie vanaf hoge temperaturen, dikwijls aanleiding tot ernstige 
meetfouten, vermeden.
 
1.5.7.2.  Apparatuur  
De methode vereist het gebruik van een thermostatisch geregeld vat. 
In de opzet in figuur 8 is een vat weergegeven met drie houders voor vaste monsters en drie houders voor vloeibare monsters, zodat zowel voor een vast als voor een vloeibaar monster een analyse in drievoud 
kan worden uitgevoerd. De temperatuur wordt constant gehouden 
± 0,5 °C of beter.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figuur 8
  
Als dragergas wordt over het algemeen stikstof gebruikt, maar in een 
enkel geval kan een ander gas nodig zijn (24). Het dragergas moet 
droog zijn. De gasstroom wordt in 6 stromen gesplitst, geregeld met naaldventielen (opening ongeveer 0,79 mm), en stroomt het vat in 
door koperen buizen met een binnendiameter van 3,8 mm. Als zich 
een temperatuurevenwicht heeft ingesteld stroomt het gas door het monster en de sorptieval, waarna het het vat verlaat.
 
Vaste monsters worden geladen in glazen buisjes met een binnen ­
diameter van 5 mm, met propjes glaswol aan weerszijden (zie figuur 9). In figuur 10 is een houder voor vloeibare monsters weergegeven 
en een sorptiesysteem. De best reproduceerbare methode om de 
dampspanning van vloeistoffen te meten is door de vloeistof aan te brengen op glasparels of op een inert sorptiemiddel als silica, en hiermee de houder te beladen. Als alternatief kan men het drager ­
gas door een grof glasfrit leiden en het door een kolom van vloeibare 
teststof laten borrelen.  
Figuur 9
 Figuur 10
  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Het sorptiesysteem bevat een voor- en een nafilter. Bij heel lage 
dampspanningen worden slechts kleine hoeveelheden stof door het 
sorptiemiddel opgevangen en kan adsorptie aan de glaswol en de glazen buizen tussen monster en sorptiemiddel een aanzienlijk pro ­
bleem vormen.
 
Met vast CO  2 gekoelde dampvallen vormen een andere efficiënte 
manier om het verdampte materiaal te verzamelen. Ze geven geen tegendruk op de verzadigingskolom en bovendien laat het opgevan ­
gen materiaal zich gemakkelijk kwantitatief analyseren.
 
1.5.7.3.  Werkwijze  
De stroomsnelheid van het uitstromende dragergas wordt gemeten bij 
kamertemperatuur. De stroomsnelheid wordt gedurende het experi ­
ment regelmatig gecontroleerd om zeker te zijn van de nauwkeurig ­
heid van de waarde voor het totale volume van het dragergas. Con ­
tinue controle met een massastroommeter verdient de voorkeur. Ver ­
zadiging van de gasfase kan aanzienlijke contacttijden vergen en dus vrij lage gasstroomsnelheden (25).
 
Aan het einde van het experiment worden het voor- en het nafilter 
van het sorptiesysteem apart geanalyseerd. De verbinding op elk filter wordt gedesorbeerd door toevoeging van een oplosmiddel. 
De resulterende oplossingen worden aan kwantitatieve analyse on ­
derworpen om de massa te bepalen die van elk filter is gedesorbeerd. De keuze van de analysemethode (alsmede de keuzen van het sorp ­
tiemiddel en het desorberende oplosmiddel) hangt af van de aard van 
de teststof. De desorptie-efficiëntie wordt bepaald door een bekende 
hoeveelheid van de monsterstof op het sorptiemiddel aan te brengen, desorptie uit te voeren en te analyseren hoeveel is teruggewonnen. Het is van belang dat de desorptie-efficiëntie wordt gecontroleerd op 
of nabij de monsterconcentratie onder testomstandigheden.
 
Om er zeker van te zijn dat het dragergas verzadigd is met de teststof 
worden drie verschillende gasstroomsnelheden gebruikt. Als de be ­
rekende dampspanning niet verandert afhankelijk van de stroomsnel ­
heid wordt aangenomen dat het gas is verzadigd.  
De dampspanning wordt berekend met behulp van de vergelijking:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
waarin:  
p = dampspanning (Pa)  
W = massa van de verdampte teststof (g)  
V = volume verzadigd gas (m  3 ) 
R = universele molaire gasconstante (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatuur (K)  
M = molaire massa van de teststof (g mol  –1 ). 
De gemeten volumes moeten worden gecorrigeerd voor druk- en 
temperatuurverschillen tussen de stroomsnelheidsmeter en de ver ­
zadigingskolom.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Draaienderotormethode  
1.5.8.1.  Principe  
Bij deze methode wordt gebruikgemaakt van een draaienderotorvis ­
cositeitsmeter, met als meetelement een kleine stalen kogel die 
zweeft in een magnetisch veld en die aan het draaien wordt gebracht 
door rotatie van de velden (26)(27)(28). De draaisnelheid kan wor ­
den bepaald met meetspoelen. Als de kogel een bepaalde draaisnel ­
heid (gewoonlijk ongeveer 400 toeren per seconde) heeft bereikt, 
wordt de energietoevoer gestopt waardoor een vertraging van de 
draaisnelheid optreedt, die het gevolg is van de gaswrijving. De afname van de rotatiesnelheid wordt gemeten als functie van de tijd. 
De dampspanning wordt afgeleid uit de drukafhankelijke snelheids ­
afname van de stalen kogel. Het aanbevolen meetbereik is 10
 –4 tot 
0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Apparatuur  
Een schematische tekening van de proefopstelling is afgebeeld in 
figuur 11. De meetkop wordt geplaatst in een van thermostaatrege ­
ling voorziene ruimte (geregeld op 0,1 °C). De monsterhouder wordt 
in een aparte van een thermostaatregeling voorziene ruimte (even ­
eens geregeld op 0,1 °C) gebracht. Om condensatie te voorkomen, worden alle andere onderdelen van de opstelling op een hogere 
temperatuur gehouden. Het hele toestel wordt verbonden aan een 
hoogvacuümsysteem.
 
Figuur 11
  
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
In elk van de voorafgaande methoden moet de dampspanning ten 
minste bij twee temperaturen worden bepaald. Bepaling van de dampspanning bij drie of meer temperaturen in het bereik van 0 tot 50 °C verdient de voorkeur, aangezien men dan kan controleren 
of de dampspanningskromme lineair is. Bij de effusiemethode 
(Knudsencel en isotherme thermogravimetrie) en de gasverzadigings ­
methode, wordt een temperatuurbereik voor de meting van 120 tot 
150 °C aanbevolen in plaats van 0 tot 50 °C.
 
2.2. TESTVERSLAG  
In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
— de gebruikte methode;  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrij ­
ving en verontreinigingen) en indien van toepassing, voor ­
afgaande zuivering;  
— het vereiste minimumaantal van twee waarden voor de damp ­
spanning en de bijbehorende temperaturen — bij voorkeur drie 
of meer — in het bereik van 0 tot 50 °C (of 120 tot 150 °C);  
— ten minste één van de temperaturen dient 25 °C of lager te zijn, 
indien technisch mogelijk volgens de gekozen methode;  
— alle ruwe gegevens;  
— grafiek van log p tegen 1/T;  
— geschatte waarde van de dampspanning bij 20 of 25 °C.  
Indien een verandering (faseovergang, ontleding) wordt waargeno ­
men, dienen de volgende gegevens te worden opgenomen:  
— aard van de verandering;  
— temperatuur waarbij de verandering optreedt bij atmosferische 
druk;  
— dampspanning bij 10 °C respectievelijk 20 °C beneden de over ­
gangstemperatuur en bij 10 °C respectievelijk 20 °C boven deze 
temperatuur (tenzij het een overgang is van vaste fase naar gas ­
fase).  
Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot 
verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd.
 
3. LITERATUUR  
(1) Publicatieblad van de Europese Unie  L 383 A, 26-47 (1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., en Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.
 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa — Static 
method.  
(6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.
 
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000)  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22-28  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-di ­
oxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122.  
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147.  
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection II. Application to Formulated Products; Pesticide Sci ­
ence 5 (1974) 393-400.  
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relations ­
hip between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide 
Science 13 (1982) 161-168.
 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used 
in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20.  
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 
150 °C.  
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002)  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Re ­
gister, Washington DC  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., en Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., en Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. 
Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Aanhangsel  
Schattingsmethode  
INLEIDING  
De berekende waarden van de dampspanning kunnen als volgt worden gebruikt:  
— om te bepalen welke van de experimentele methoden geschikt is;  
— om een schatting of grenswaarde te verkrijgen, ingeval de experimentele 
methode om technische redenen niet toegepast kan worden.  
SCHATTINGSMETHODE  
De dampspanning van vloeistoffen en vaste stoffen kan worden geschat met 
behulp van de gewijzigde Correlatie van Watson (a). Het enige benodigde ge ­
geven is de normale kooktemperatuur. De methode is toepasbaar in het drukbe ­
reik van 10  5 tot 10  –5 Pa. 
Uitgebreide informatie over deze methode wordt gegeven in het „Handbook of 
Chemical Property Estimation Methods” (b). Zie ook OECD Environmental Mo ­
nograph No.67 (c).  
BEREKENINGSMETHODE  
De dampspanning wordt als volgt berekend:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – Í 
3 – 2  T 
T b Î 
m 
T 
T b – 2m Í 
3 – 2  T 
T b Î 
m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 6 6 6 4 3 
7 7 7 7 7 5
 
waarin:  
T = betreffende temperatuur  
T b = normaal kookpunt  
P vp = dampspanning bij temperatuur T  
ΔH vb = verdampingswarmte  
ΔZ b = compressibiliteitscoëfficiënt (geschat op 0,97)  
m = empirische factor afhankelijk van de fysische toestand bij de betref ­
fende temperatuur  
Voorts:  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
waarin K  F een empirische factor is waarin de polariteit van de stof tot uitdruk ­
king komt. K  F -waarden voor verscheidene typen verbindingen worden opgesomd 
in referentie (b).  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Dikwijls zijn gegevens beschikbaar waarin een kookpunt bij verlaagde druk 
wordt gegeven. In dergelijke gevallen wordt de dampspanning als volgt bere ­
kend:  
lnP vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m – 1 
ln T 
T 1 " #  
waarin T  1 staat voor het kookpunt bij de verlaagde druk P  1 . 
VERSLAG  
Bij gebruik van de schattingsmethode dient de berekening uitvoerig in het ver ­
slag te worden gedocumenteerd.  
LITERATUUR  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. OPPERVLAKTESPANNING  
1. METHODE  
De beschreven methoden berusten op de testrichtlijn van de OESO 
(1). De fundamentele principes worden besproken in referentie (2).  
1.1. INLEIDING  
De hier beschreven methoden zijn geschikt voor de bepaling van de 
oppervlaktespanning van waterige oplossingen.  
Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te 
beschikken over gegevens inzake de oplosbaarheid in water, de 
structuur, de hydrolyseerbaarheid en de kritische concentraties voor 
de vorming van micellen.  
De hieronder beschreven methoden zijn geschikt voor de meeste 
chemische stoffen, ongeacht de zuiverheid ervan.  
Bepaling van de oppervlaktespanning met behulp van de ringspan ­
ningsmeter is alleen mogelijk voor waterige oplossingen met een dynamische viscositeit van minder dan ongeveer 200 mPa s.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De vrije-oppervlakte-enthalpie per oppervlakte-eenheid heet de op ­
pervlaktespanning.  
De oppervlaktespanning wordt uitgedrukt in  
N/m (SI-eenheid) of in m  
N/m (SI-subeenheid).  
1 N/m = 10  3 dyne/cm  
1 mN/m = 1 dyne/cm in het verouderde cgs-systeem.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren 
en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk 
te maken.
 
Een aantal referentiestoffen met zeer uiteenlopende oppervlaktespan ­
ningen staan vermeld in referenties (1) en (3).  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN  
De methoden berusten op de meting van de maximale kracht die 
verticaal moet worden uitgeoefend op een beugel of een ring die het oppervlak van de te onderzoeken vloeistof in een meetbak raakt, om deze beugel of ring van dit oppervlak te scheiden, of op een plaat 
waarvan een rand het oppervlak raakt, om de vloeistoflaag die zich 
heeft gevormd op te trekken.
 
Stoffen die oplosbaar zijn in water met een concentratie van ten 
minste 1 mg/l worden getest in waterige oplossingen bij één con ­
centratie.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Deze methoden zijn nauwkeuriger dan waarschijnlijk voor milieu ­
beoordelingsdoeleinden noodzakelijk is.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN  
De stof wordt opgelost in gedestilleerd water. De concentratie van 
deze oplossing moet 90 % van die van een verzadigde oplossing in water bedragen. Indien deze concentratie de 1 g/l overschrijdt, wordt 
een oplossing van 1 g/l gebruikt voor de bepaling. Stoffen met een 
oplosbaarheid in water van minder dan 1 mg/l hoeven niet te worden onderzocht.
 
1.6.1.  Plaatmethode  
Zie ISO 304 en NF T 73-060 („Surface Active Agents — Determi ­
nation of Surface Tension by Drawing up Liquid Films”).  
1.6.2.  Beugelmethode  
Zie ISO 304 en NF T 73-060 („Surface Active Agents — Determi ­
nation of Surface Tension by Drawing up Liquid Films”).  
1.6.3.  Ringmethode  
Zie ISO 304 en NF T 73-060 („Surface Active Agents — Determi ­
nation of Surface Tension by Drawing up Liquid Films”).  
1.6.4.  Geharmoniseerde ringmethode (OESO)  
1.6.4.1.  Apparatuur  
In de handel verkrijgbare spanningsmeters kunnen voor deze metin ­
gen worden gebruikt. Zij bestaan uit:  
— draaitafeltje;  
— systeem voor het meten van de kracht;  
— meetlichaam (ring);  
— meetvat.  
1.6.4.1.1. D r a a i t a f e l t j e  
Het draaitafeltje wordt gebruikt als draagvlak voor het meetvat met 
temperatuurregeling, waarin de te onderzoeken stof zich bevindt. Tezamen met het systeem voor het meten van de kracht is het draai ­
tafeltje aan een rek gemonteerd.
 
1.6.4.1.2. S y s t e e m v o o r h e t m e t e n v a n d e k r a c h t  
Het systeem voor het meten van de kracht (zie figuur) bevindt zich 
boven het draaitafeltje. De fout bij het meten van de kracht mag niet 
meer bedragen dan ± 10  -6 N, hetgeen overeenkomt met een foutgrens 
van ± 0,1 mg in een massameting. De meetschaal van de in de handel verkrijgbare tensiometers is meestal geijkt in mN/m zodat 
de oppervlaktespanning met een nauwkeurigheid van 0,1 mN/m 
rechtstreeks in mN/m kan worden afgelezen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M e e t l i c h a a m ( r i n g )  
De ring bestaat meestal uit een draad van platina-iridium met een 
dikte van ongeveer 0,4 mm en een gemiddelde omtrek van 60 mm. 
De ring wordt horizontaal opgehangen aan een metalen stift en een ophangsysteem om de verbinding met het krachtmeetsysteem tot stand te brengen (zie figuur).
 
Figuur  
Meetlichaam  
(alle maten in mm)
  
1.6.4.1.4. M e e t v a t  
Voor de te onderzoeken oplossing wordt een glazen meetvat met 
temperatuurregeling gebruikt. Het meetvat dient zo te zijn ontworpen dat tijdens de meting de temperatuur van de testvloeistof en de gasfase daarboven constant is en dat het monster niet kan verdam ­
pen. Ronde glazen bekers met een inwendige doorsnede van ten 
minste 45 mm zijn aanvaardbaar.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Voorbereiding van het apparaat  
1.6.4.2.1. S c h o o n m a k e n  
Glazen vaten dienen zorgvuldig te worden schoongemaakt. Zo nodig 
moeten zij worden gespoeld met heet chroomzuur en vervolgens met stroperig fosforzuur (83 tot 98 gewichtsprocent H
 3 PO 4 ), dan grondig 
gespoeld met leidingwater, uitgewassen met tweemaal gedestilleerd 
water tot een neutrale pH, en vervolgens gedroogd of omgespoeld 
met een gedeelte van de te onderzoeken vloeistof.  
De ring wordt eerst zorgvuldig in water gespoeld ten einde water ­
oplosbare stoffen te verwijderen, daarna kort in chroomzuur gedom ­
peld, in tweemaal gedestilleerd water gewassen tot een neutrale pH is 
bereikt en ten slotte kort verhit boven een methanolvlam.  
NB: 
Verontreinigende stoffen zoals siliconen die niet in chroomzuur of 
fosforzuur oplossen, dienen met een geschikt organisch oplosmiddel 
te worden verwijderd.  
1.6.4.2.2. I J k i n g v a n h e t a p p a r a a t  
Bij de validering van het apparaat wordt het nulpunt gecontroleerd 
en zodanig ingesteld dat met de uitslag van de wijzer een nauwkeu ­
rige bepaling in mN/m mogelijk is.  
Opstellen:  
Het apparaat wordt, bijvoorbeeld met behulp van een waterpas aan 
de onderzijde van de tensiometer, horizontaal opgesteld; hiertoe 
wordt gebruik gemaakt van de schroeven aan de onderzijde van 
het apparaat.  
Instelling van het nulpunt:  
Na het aanbrengen van de ring aan het apparaat en alvorens deze in 
de vloeistof te dompelen wordt de wijzer van de tensiometer op nul 
gezet en wordt nagegaan of de ring evenwijdig aan het vloeistof ­
oppervlak loopt. Hierbij kan het vloeistofoppervlak als spiegel wor ­
den gebruikt.  
IJking:  
Het ijken kan op twee manieren geschieden:  
a) Met behulp van een massa; hierbij worden ruiters met een be ­
kende massa van 0,1 tot 1,0 g op de ring aangebracht; de ijkfac ­
tor Ф a , waarmee alle afgelezen waarden moeten worden ver ­
menigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende ver ­
gelijking (1):  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
waarin:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = massa van de ruiter (g)  
g = versnelling door de zwaartekracht (981 cm s  -2 op zee­
niveau)  
b = gemiddelde omtrek van de ring (in cm)  
σ a = uitslag van de tensiometer na het plaatsen van de ruiter op 
de ring (mN/m).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Met behulp van water; hierbij wordt gebruik gemaakt van zuiver 
water met een oppervlaktespanning van bijvoorbeeld 72,3 mN/m 
bij 23  o C; deze procedure verloopt weliswaar vlotter dan die met 
de ruiters, maar houdt steeds het gevaar in dat de oppervlakte ­
spanning van het water onjuist is door de aanwezigheid van 
sporen oppervlakteactieve stoffen.  
De ijkfactor, Ф b , waarmee alle meetresultaten moeten worden 
vermenigvuldigd, wordt bepaald met behulp van de volgende vergelijking (2):
 
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
waarin:  
σ o = literatuurwaarde voor de oppervlaktespanning van water 
(mN/m),  
σ g = gemeten waarde voor de oppervlaktespanning van het wa ­
ter (mN/m) beide bij dezelfde temperatuur.  
1.6.4.3.  Bereiding van de monsters  
De te onderzoeken stoffen worden tot de gewenste concentraties in 
water opgelost; er mogen geen onoplosbare stoffen in het water 
voorkomen.  
De oplossing moet op constante temperatuur worden gehouden 
(± 0,5  o C). Aangezien de oppervlaktespanning van een oplossing 
in het meetvat met de tijd verandert, moeten er op verschillende 
tijdstippen metingen worden verricht en moet van de resultaten een 
kromme worden uitgezet waaruit het verloop van de oppervlakte ­
spanning als functie van de tijd blijkt. Zodra geen verdere wijzigin ­
gen meer worden waargenomen, is er een evenwichtstoestand be ­
reikt.  
Stof en gasvormige verontreinigingen beïnvloeden het resultaat van 
de meting. De meting dient derhalve te worden verricht onder een scherm.
 
1.6.5.  Testomstandigheden  
De metingen dienen plaats te vinden bij ongeveer 20  o C en de 
temperatuur dient op ± 0,5  o C na constant te zijn.  
1.6.6.  Uitvoering van de proef  
De te meten oplossingen dienen in het zorgvuldig schoongemaakte 
meervat te worden overgebracht waarbij schuimvorming wordt ver ­
meden; vervolgens wordt het meetvat op de tafel van het testapparaat 
geplaatst. Het tafelblad met het meetvat wordt omhoog gebracht tot de ring is gedompeld onder het oppervlak van de te onderzoeken oplossing. Vervolgens laat men het tafelblad geleidelijk en regelma ­
tig (met een snelheid van ongeveer 0,5 cm/min) zakken om de ring 
van het oppervlak vrij te maken, tot de maximale kracht is bereikt. De vloeistoflaag die aan de ring hangt, mag de ring niet loslaten. Na de meting wordt de ring weer onder het oppervlak gedompeld en 
wordt de meting herhaald tot een constante waarde voor de opper ­
vlaktespanning is bereikt. Bij iedere bepaling dient de tijd, die ver ­
lopen is sinds het overbrengen van de vloeistof naar het meetvat, te worden genoteerd. De meter wordt afgelezen op het moment van de 
maximale kracht die vereist is om de ring van het oppervlak van de 
vloeistof los te trekken.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. GEGEVENS  
Ter berekening van de oppervlaktespanning wordt de van het appa ­
raat afgelezen waarde in mN/m eerst vermenigvuldigd met de ijk ­
factor Ф a of Ф b (afhankelijk van de toegepaste ijkprocedure). Dit 
leidt tot een waarde die slechts bij benadering juist is en daarom nog 
verder moet worden gecorrigeerd.  
Harkins en Jordan (4) hebben langs empirische weg correctiefactoren 
bepaald voor oppervlaktespanningen die met de ringmethode zijn gemeten; deze correctiefactoren zijn afhankelijk van de afmetingen 
van de ring, de dichtheid van de vloeistof en de oppervlaktespan ­
ning.
 
Het is tamelijk omslachtig om de correctiefactor voor iedere meting 
afzonderlijk met behulp van de tabellen van Harkins en Jordan te 
bepalen voor de berekening van de oppervlaktespanning; daarom kan 
voor waterige oplossingen gebruik worden gemaakt van een vereen ­
voudigde procedure waarbij de gecorrigeerde waarden voor de op ­
pervlaktespanning rechtstreeks uit de volgende tabel worden afgele ­
zen (tussenliggende waarden worden via interpolatie verkregen).  
Tabel  
Correctie van de gemeten oppervlaktespanning  
Uitsluitend voor waterige oplossingen, p ≈ 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring) 
r = 0,185 mm (straal van de draad van de ring)  
Gemeten waarde Gecorrigeerde waarde (mN/m) 
(IJking met massa (zie 1.6.4.2.2 (a)) IJking met water (zie 1.6.4.2.2 (b))  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Gemeten waarde Gecorrigeerde waarde (mN/m) 
(IJking met massa (zie 1.6.4.2.2 (a)) IJking met water (zie 1.6.4.2.2 (b))  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 —
 
Deze tabel werd opgesteld aan de hand van de correctie volgens 
Harkins en Jordan en overeenkomstig de DIN-normen (DIN 53914) voor water en waterige oplossingen (met een dichtheid van p = 1 g/cm
 3 ) en voor in de handel verkrijgbare ringen met afmetingen 
R = 9,55 mm (gemiddelde straal van de ring) en r = 0,185 mm 
(straal van de draad van de ring). De tabel geeft de gecorrigeerde waarden voor oppervlaktespanningsmetingen die werden uitgevoerd na ijking met massa of met water.
 
Volgens een alternatieve methode zonder voorafgaande ijking kan de 
oppervlaktespanning als volgt worden berekend:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
waarin:  
F = de kracht die op de dynamometer wordt afgelezen bij het 
breken van de film  
R = de straal van de ring  
f = de correctiefactor (1).  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFENEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— gebruikte testmethode;  
— gebruikt type water of oplossing;  
— nauwkeurige specificatie van de stoffen (beschrijving en veront ­
reinigingen);  
— meetresultaten: afgelezen oppervlaktespanning waarbij zowel de 
afzonderlijke resultaten als het rekenkundig gemiddelde daarvan moet worden vermeld, alsmede het gecorrigeerde gemiddelde 
(waarbij rekening is gehouden met de correctiefactór voor het 
apparaat en de correctietabel);
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— concentratie van de oplossing;  
— temperatuur bij de meting;  
— ouderdom van de gebruikte oplossing, en met name de tijd tussen 
de bereiding en de meting van de oplossing;  
— beschrijving van de tijdafhankelijkheid van de oppervlaktespan ­
ning, na het overbrengen van de oplossing in het meetvat;  
— alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten, en met name gegevens met betrekking 
tot verontreinigingen en de fysische toestand van de stof.  
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Met het oog op het feit dat gedestilleerd water een oppervlaktespan ­
ning heeft van 72,75 mN/m bij 20  o C, dienen stoffen met een opper ­
vlaktespanning van minder dan 60 mN/m, zoals gemeten met deze methode, beschouwd te worden als oppervlakteactieve stoffen.
 
4. LITERATUUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115 — Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ. New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.
 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, Vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. OPLOSBAARHEID IN WATER  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 105 (1995) van de OESO 
(TG 105). Deze testmethode is een herziene versie van de oorspronkelijke TG 105, die in 1981 is vastgesteld. Er zijn geen inhoudelijke verschillen 
tussen de huidige versie en die uit 1981. De wijzigingen betreffen voor ­
namelijk de vorm. De herziening is uitgevoerd op basis van EU-testmethode „Oplosbaarheid in water” (
 1 ). 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
2. De oplosbaarheid in water van een stof kan aanzienlijk worden beïnvloed 
door de aanwezigheid van verontreinigingen. Deze testmethode betreft de 
bepaling van de oplosbaarheid in water van niet-vluchtige, chemisch zuivere 
stoffen die stabiel zijn in water. Alvorens de oplosbaarheid in water te bepalen, is het nuttig om van tevoren te beschikken over gegevens inzake de te onderzoeken stof, zoals de structuurformule, de dampspanning, de 
dissociatieconstante en de hydrolyse (als functie van de pH).
 
3. In deze testmethode worden twee methoden beschreven: de kolomelutie ­
methode en de methode met de kolf, die respectievelijk van toepassing zijn op stoffen waarvan de oplosbaarheid minder of meer bedraagt dan 
10
 –2 g/l. Tevens wordt een eenvoudige inleidende test beschreven. Daarmee 
kan worden bepaald wat bij benadering de juiste hoeveelheid van het mon ­
ster is om in de uiteindelijke test te gebruiken, alsmede hoeveel tijd er nodig is om de verzadigingswaarde te bereiken.
 
DEFINITIES EN EENHEDEN  
4. De oplosbaarheid van een stof in water is de massaconcentratie van de stof 
in een verzadigde oplossing in water bij een gegeven temperatuur.  
5. De oplosbaarheid in water wordt uitgedrukt als de massa van opgeloste stof 
per volume van de oplossing. De SI-eenheid is kg/m  3 (g/l kan ook worden 
gebruikt).  
REFERENTIESTOFFEN  
6. Het is niet nodig om bij het onderzoeken van een stof referentiestoffen te 
gebruiken.  
BESCHRIJVING VAN DE METHODEN  
Testomstandigheden  
7. De test wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 20 ± 0,5 °C. De gekozen tempe ­
ratuur moet in alle betrokken delen van de apparatuur constant worden 
gehouden.  
Inleidende test  
8. In een maatcilinder van 10 ml, voorzien van een glazen stop, worden staps ­
gewijs toenemende volumes water op kamertemperatuur toegevoegd aan ongeveer 0,1 g monster (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt). Nadat 
een hoeveelheid water is toegevoegd, wordt het mengsel telkens gedurende 
10 minuten geschud en vervolgens visueel onderzocht op eventuele onopge ­
loste delen van het monster. Als het monster of delen ervan onopgelost zijn nadat nog 10 ml water is toegevoegd, wordt het experiment herhaald in een 
maatcilinder van 100 ml. De benaderde waarde van de oplosbaarheid is 
hieronder in tabel 1 vermeld onder de hoeveelheid water waarin het monster
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
geheel wordt opgelost. Bij een lagere waarde van de oplosbaarheid kan het 
lang duren om een teststof op te lossen en moet minimaal 24 uur in acht 
worden genomen. Als de teststof na 24 uur nog steeds niet is opgelost, moet langer (maximaal 96 uur) worden gewacht of moet worden geprobeerd de stof verder te verdunnen om te bepalen of de kolomelutiemehode dan wel de 
methode met de kolf moet worden gebruikt.
 
Tabel 1  
ml water voor 0,1 g opge ­
loste stof 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
benaderde waarde van de op ­
losbaarheid in g/l > 1 000 1 000 tot 
en met 
200 200 tot 
en met 
100 100 tot 
en met 
50 50 tot en 
met 10 10 tot en 
met 1 < 1 
Kolomelutiemethode  
Principe  
9. Deze methode is gebaseerd op de elutie van de te onderzoeken stof met 
water uit een microkolom welke is gevuld met een inert dragermateriaal dat van tevoren is gedekt met een overmaat aan de te onderzoeken stof (2). De 
oplosbaarheid in water is gelijk aan de massaconcentratie van het eluaat 
wanneer deze een plateau bereikt als functie van de tijd
 
Apparatuur  
10. De apparatuur bestaat uit een microkolom (figuur 1) die op constante tem ­
peratuur wordt gehouden. Deze wordt aangesloten op een recirculatiepomp 
(figuur 2) of op een voorraadfles (figuur 3). De microkolom bevat een inerte drager die op zijn plaats wordt gehouden door een kleine prop glaswol, waarmee ook deeltjes worden weggefilterd. Bruikbare materialen voor de 
drager zijn bijvoorbeeld glasparels, diatomeeënaarde of andere inerte mate ­
rialen.
 
11. De microkolom in figuur 1 is geschikt voor de opstelling met recirculatie ­
pomp. Zij is aan de bovenzijde voorzien van een hoofdruimte voor vijf 
kolomvolumina (die aan het begin van het experiment worden afgevoerd) en voor het volume van vijf monsters (die tijdens het experiment worden genomen om te worden geanalyseerd). Eventueel kunnen de afmetingen 
worden verminderd indien tijdens het experiment water aan het systeem 
kan worden toegevoegd ter vervanging van de eerste vijf kolomvolumina welke met verontreinigingen worden afgevoerd. De kolom is door middel van slangen, gemaakt van een inert materiaal, verbonden met de circulatie ­
pomp, die een opbrengst van ongeveer 25 ml/h moet kunnen leveren. Als 
recirculatiepomp kan bijvoorbeeld een peristaltische pomp of een mem ­
braanpomp worden gebruikt. Er moet op worden toegezien dat geen ver ­
ontreiniging en/of adsorptie plaatsvindt met het materiaal van de slangen.
 
12. In figuur 3 is een schema van een opstelling met een voorraadfles afgebeeld. 
In deze opstelling is de microkolom voorzien van een eenwegkraan. De kolom en de voorraadfles zijn verbonden door middel van een glazen slijp ­
stuk en slangen, gemaakt van een inert materiaal. Het debiet door de voor ­
raadfles moet ongeveer 25 ml/h bedragen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figuur 1
  
Afmetingen in mm  
A. Aansluiting voor glazen slijpstuk  
B. Hoofdruimte  
C. Inwendig 5  
D. Uitwendig 19  
E. Prop glaswol  
F. Kraan  
Figuur 2
  
A. Evenwicht met atmosferische druk  
B. Stromingsmeter  
C. Microkolom  
D. Circulatiepomp met thermostaatregeling  
E. Recirculatiepomp  
F. Tweewegkraan voor bemonstering  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figuur 3
  
A. Voorraadfles (bijvoorbeeld een kolf van 2,5 liter)  
B. Kolom  
C. Fractieverzamelaar  
D. Thermostaat  
E. Teflonslang  
F. Glazen slijpstuk  
G. Waterleiding (tussen thermostaat en kolom, inwendige diameter onge ­
veer 8 mm)  
13. Ongeveer 600 mg dragermateriaal wordt overgebracht in een rondbodemkolf 
van 50 ml. Een geschikte hoeveelheid van de teststof wordt opgelost in een 
vluchtig en analytisch zuiver oplosmiddel en de juiste hoeveelheid van deze oplossing wordt bij het dragermateriaal gevoegd. Het oplosmiddel wordt, bijvoorbeeld met behulp van een roterende verdamper, volledig verdampt. 
Bij onvolledige verwijdering van het oplosmiddel kan het dragermateriaal, 
ten gevolge van verdelingseffecten aan het oppervlak, tijdens de elutiefase niet worden verzadigd met water. Het beladen dragermateriaal wordt gedu ­
rende twee uur bevochtigd in ongeveer 5 ml water en de suspensie wordt in 
de microkolom gebracht. Als alternatief kan men ook het droge, beladen 
dragermateriaal direct in de met water gevulde microkolom brengen, en daarna twee uur wachten totdat een evenwichtstoestand is ontstaan.
 
14. Het laden van het dragermateriaal kan aanleiding geven tot problemen en 
daarmee tot onjuiste resultaten, bijvoorbeeld als de teststof wordt afgezet als 
olie. Deze problemen moeten worden onderzocht en de bijzonderheden 
moeten worden gerapporteerd.  
Werkwijze met circulatiepomp  
15. De stroming door de kolom wordt op gang gebracht. Een debiet van on ­
geveer 25 ml/h (dit komt overeen met ongeveer 10 kolomvolumina/uur voor 
de beschreven kolom) wordt aanbevolen. Ten minste de eerste vijf kolom ­
volumina worden afgevoerd om wateroplosbare verontreinigingen te verwij ­
deren. De apparatuur blijft in werking totdat een evenwichtstoestand is 
bereikt; hiervoor geldt dat de concentraties in vijf opeenvolgende monsters 
niet meer dan ± 30 % mogen verschillen op aselecte wijze. Tussen de tijd ­
stippen, waarop deze monsters worden genomen, moeten ten minste tien kolomvolumina passeren. Afhankelijk van de toegepaste analysemethode 
kan het de voorkeur genieten een concentratie/tijdcurve op te stellen om 
aan te tonen dat het evenwicht is bereikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Werkwijze met voorraadfles  
16. Er wordt een aantal opeenvolgende monsters van het eluaat genomen voor 
analyse volgens de gekozen methode. In het middengebied van het eluaat, wanneer de concentraties constant zijn binnen ± 30 % in ten minste vijf 
opeenvolgende fracties, worden de fracties gebruikt om de oplosbaarheid te 
bepalen.
 
17. Als eluens wordt bij voorkeur dubbel gedestilleerd water gebruikt. Gedeï ­
oniseerd water met een soortelijke weerstand van meer dan 10 megohm/cm en een totaal gehalte aan organische koolstof van minder dan 0,01 % kan 
ook worden gebruikt.
 
18. Bij beide werkwijzen wordt een tweede reeks metingen verricht waarbij het 
debiet de helft is van de aanvankelijke waarde. Als de resultaten van beide series metingen overeenstemmen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de gemeten oplosbaarheid bij het laagste debiet hoger blijkt, dan moet het 
halveren van het debiet worden voortgezet, totdat twee opeenvolgende series 
metingen dezelfde oplosbaarheid geven.
 
19. Bij beide werkwijzen moeten de fracties aan de hand van het Tyndall-effect 
worden gecontroleerd op aanwezigheid van deeltjes in colloïdale toestand. De aanwezigheid van deeltjes maakt de test ongeldig, zodat de test moet 
worden herhaald nadat de filterwerking van de kolom is verbeterd.
 
20. De pH van elk monster moet worden gemeten, bij voorkeur met behulp van 
speciaal indicatorpapier.  
Methode met de kolf  
Principe  
21. De teststof (vaste stoffen moeten worden fijngemaakt) wordt opgelost in 
water bij een temperatuur die iets hoger is dan de testtemperatuur. Zodra 
verzadiging is bereikt, wordt het mengsel afgekoeld en op de testtempera ­
tuur gehouden. Als alternatief, en op voorwaarde dat men er, via geschikte monsternamen, zeker van is dat het verzadigingsevenwicht is bereikt, kan de 
meting rechtstreeks bij de testtemperatuur worden uitgevoerd. Vervolgens 
wordt de massaconcentratie van de teststof in de waterige oplossing, welke geen onopgeloste deeltjes mag bevatten, bepaald aan de hand van een geschikte analysemethode (3).
 
Apparatuur  
22. Het volgende materiaal is nodig:  
— gangbaar laboratoriumglaswerk en -apparatuur;  
— een apparaat om de oplossingen in beweging te brengen bij constante 
temperatuur;  
— zo nodig voor emulsies een centrifuge (bij voorkeur met thermostaat), en  
— analyseapparatuur.  
Werkwijze  
23. Aan de hand van de inleidende test wordt bepaald hoeveel van de teststof 
nodig is om de gewenste hoeveelheid water te verzadigen. In drie van een glazen stop voorziene glazen vaten (bijvoorbeeld centrifugebuizen, kolven) wordt telkens ongeveer vijfmaal die hoeveelheid materiaal afgewogen. De 
op grond van de analysemethode en het oplosbaarheidsbereik vastgestelde 
hoeveelheid water wordt in elk vat gegoten. De vaten worden goed afge ­
sloten en vervolgens bij 30 °C geschud. Hiervoor moet een schud- of roer ­
machine worden gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden 
gewerkt, bijvoorbeeld een magneetroerder in een waterbak met thermostaat ­
regeling. Na één dag wordt 24 uur gewacht totdat in één van de vaten onder af en toe roeren bij de testtemperatuur een evenwichtstoestand is ontstaan. Vervolgens wordt de inhoud van het vat gecentrifugeerd bij de testtempe ­
ratuur, waarna de concentratie van de teststof in de heldere waterige oplos ­
sing volgens een geschikte analysemethode wordt bepaald. De beide andere
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
kolven ondergaan dezelfde behandeling nadat respectievelijk twee en drie 
dagen bij 30 °C is gewacht totdat een evenwichtstoestand is ontstaan. Als de 
gemeten concentraties in ten minste de twee laatstgenoemde vaten onderling niet meer dan 15 % verschillen, worden de testresultaten geaccepteerd. Als de resultaten van de vaten 1, 2 en 3 toenemende waarden geven, moet de 
hele test worden herhaald, waarbij langer wordt gewacht tot een evenwichts ­
toestand is ontstaan.
 
24. De test kan ook worden uitgevoerd zonder voorverwarming bij 30 °C. Om 
de snelheid te kunnen schatten waarmee het verzadigingsevenwicht zich instelt, worden monsters genomen totdat blijkt dat verder roeren geen in ­
vloed meer heeft op de gemeten concentraties.
 
25. De pH van elk monster moet worden gemeten, bij voorkeur met behulp van 
speciaal indicatorpapier.  
Analytische bepalingen  
26. Bij voorkeur wordt een methode toegepast waarmee verschillende stoffen 
kunnen worden onderscheiden, aangezien kleine hoeveelheden opgeloste 
verontreinigingen kunnen leiden tot grote fouten in de gemeten oplosbaar ­
heid. Voorbeelden van zulke methoden zijn: gas- of vloeistofchromatografie, titratie, fotometrie, voltametrie.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
Kolomelutiemethode  
27. Voor elke serie metingen moeten het gemiddelde en de standaardafwijking 
worden berekend van ten minste vijf opeenvolgende monsters, die op het 
verzadigingsniveau zijn genomen. De gemiddelde waarden uit twee tests 
met verschillend debiet mogen onderling niet meer dan 30 % verschillen.  
Methode met de kolf  
28. Het gemiddelde van de aparte resultaten voor de drie kolven, die onderling 
niet meer dan 15 % mogen verschillen, wordt berekend.  
Testverslag  
Kolomelutiemethode  
29. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
— de resultaten van de inleidende test;  
— de chemische identiteit en verontreinigingen en indien van toepassing, 
de voorafgaande zuivering;  
— de concentraties, debieten en pH-waarden voor elk monster;  
— het gemiddelde en de standaardafwijking van ten minste vijf monsters 
uit elke serie die op het verzadigingsniveau zijn genomen;  
— het gemiddelde van ten minste twee opeenvolgende series;  
— de temperatuur van het water tijdens het verzadigingsproces;  
— de analysemethode;  
— de aard van het dragermateriaal;  
— het laden van het dragermateriaal;  
— het gebruikte oplosmiddel;  
— elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test;  
— alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie 
van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigin ­
gen en de fysische toestand van de teststof.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Methode met de kolf  
30. In het verslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
— de resultaten van de inleidende test;  
— de chemische identiteit en verontreinigingen en indien van toepassing, 
de voorafgaande zuivering;  
— de afzonderlijke analysen en het gemiddelde, indien meer dan één 
waarde werd bepaald, voor iedere kolf;  
— de pH van elk monster;  
— het gemiddelde van de waarden voor de verschillende kolven die onder ­
ling overeenstemden;  
— de testtemperatuur;  
— de analysemethode;  
— elke gebleken chemische instabiliteit van de stof tijdens de test;  
— alle gegevens en opmerkingen, die van belang zijn voor de interpretatie 
van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigin ­
gen en de fysische toestand van de teststof.  
LITERATUUR:  
(1) Richtlijn 92/69/EEG van de Commissie van 31 juli 1992 houdende zeven ­
tiende aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en 
bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het ken ­
merken van gevaarlijke stoffen (PB L 383 van 29.12.1992, blz. 113).
 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.
 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. VERDELINGSCOËFFICIËNT  
1. METHODE  
De „schudfles”-methode berust op de testrichtlijn van de OESO (1).  
1.1. INLEIDING  
Voor het uitvoeren van deze test is het nuttig om van tevoren te 
beschikken over gegevens inzake de structuurformule, dissociatie ­
constante, oplosbaarheid in water, hydrolyse, oplosbaarheid in  n-oc­
tanol en oppervlaktespanning van de stof.  
Metingen van ioniseerbare stoffen dienen alleen te worden uit ­
gevoerd met de niet-geïoniseerde vorm van de stof (vrij zuur of 
vrije base) verkregen met behulp van een geschikte buffer met een pH van minstens één pH-eenheid onder (vrij zuur) of boven (vrije base) de pK.
 
Deze testmethode omvat twee verschillende procedures: de schud ­
flesmethode en de hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De eer ­
ste methode is toepasbaar wanneer de log P  ow -waarde (zie verder 
voor definities) in het bereik van - 2 tot 4 valt, de tweede methode in 
het bereik van 0 tot 6. Alvorens een van beide experimentele pro ­
cedures uit te voeren, dient eerst een voorlopige schatting van de verdelingscoëfficiënt te worden gemaakt.
 
De schudflesmethode is alleen van toepassing op chemisch zuivere 
stoffen die oplosbaar zijn in water en  n-octanol. De methode is niet 
van toepassing op oppervlakteactieve stoffen (waarvoor een bere ­
kende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaar ­
heid in  n-octanol en water, moet worden gerapporteerd).  
De HPLC-methode is niet toepasbaar op sterke zuren en basen, 
metaalcomplexen en oppervlakte-actieve stoffen die met het eluent kunnen reageren. Voor deze stoffen dient een berekende waarde of een raming, gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n -octanol 
en water, te worden gerapporteerd.
 
De HPLC-methode is minder gevoelig voor de aanwezigheid van 
verontreinigingen in de teststof dan de schudflesmethode. Des ­
ondanks kunnen verontreinigingen soms de interpretatie van de re ­
sultaten bemoeilijken omdat moeilijk kan worden bepaald welke piek 
bij welke stof hoort. Voor mengsels die een band zonder resolutie geven, moeten de boven- en ondergrens van log P worden gerap ­
porteerd.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De verdelingscoëfficiënt (P) is gedefinieerd als de verhouding van de 
concentraties in evenwichtstoestand (C  j ) van een opgeloste stof in 
een twee-fasensysteem bestaande uit twee niet-mengbare oplosmid ­
delen. Voor  n-octanol en water:  
p ow ¼ c nÄoctanol  
c water 
De verdelingscoëfficiënt (P) is daarom het quotiënt van twee con ­
centraties; gewoonlijk wordt deze waarde opgegeven als een loga ­
ritme met grondtal tien (log P).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Schudflesmethode  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de werking van de methode te controleren 
en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mogelijk 
te maken.
 
HPLC-methode  
Om de gemeten HPLC-gegevens van een stof te kunnen correleren 
met de P-waarde, moet een ijklijn worden gemaakt van log P tegen 
de chromatografische gegevens, met behulp van minstens 6 referen ­
tiepunten. De gebruiker dient de geschikte referentiestoffen te kiezen. Zo mogelijk dient de P
 ow -waarde van minstens één referentiestof 
boven, en die van minstens één referentiestof onder de P  ow van de 
teststof te liggen. Voor log P-waarden kleiner dan 4 kan bij de ijking 
worden uitgegaan van met de schudflesmethode verkregen gegevens. Voor log P-waarden groter dan 4 kan de ijking worden uitgevoerd met behulp van gevalideerde waarden uit de literatuur, op voor ­
waarde dat deze overeenkomen met de berekende waarden. Voor 
een grotere nauwkeurigheid verdient het de voorkeur om referentie ­
stoffen te kiezen die qua structuur verwant zijn aan de te onder ­
zoeken stof.
 
Er zijn uitgebreide lijsten beschikbaar met log P  ow -waarden voor 
verschillende categorieën chemicaliën (2)(3). Als er geen gegevens 
over de verdelingscoëffici ēnt van structureel verwante stoffen be ­
schikbaar zijn, mag een meer algemene ijking worden toegepast met andere ijkstoffen.
 
In aanhangsel 2 wordt een lijst van aanbevolen ijkstoffen en hun 
P ow -waarden gegeven.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Schudflesmethode  
Om een verdelingscoëfficiënt te kunnen bepalen, moet een even ­
wichtstoestand zijn bereikt tussen alle componenten van het systeem; 
de concentraties van de opgeloste stoffen moeten vervolgens in beide 
fasen worden bepaald. Uit de literatuur blijkt dat er voor dit pro ­
bleem, dat wil zeggen het grondig mengen van beide fasen gevolgd door fasescheiding ten einde de evenwichtsconcentraties van de te 
onderzoeken stof te bepalen, verschillende technische oplossingen 
bestaan.
 
1.4.2.  HPLC-methode  
HPLC wordt uitgevoerd met analytische kolommen, gepakt met een 
in de handel verkrijgbare vaste fase, bestaande uit chemisch aan silica gebonden lange koolwaterstofketens (bijvoorbeeld C
 8 , C  18 ). 
Chemische stoffen die in deze kolommen geïnjecteerd worden, be ­
wegen met verschillende snelheden door deze kolommen, wat een 
gevolg is van het verschil in verdeling tussen de mobiele fase en de stationaire koolwaterstoffase. Mengsels van stoffen worden geëlueerd in volgorde van waterafstotendheid, wateroplosbare stoffen het eerst 
en olieoplosbare stoffen het laatst, afhankelijk van hun 
koolwaterstof/water-verdelingscoëfficiënt. Op deze wijze kan de ver ­
houding tussen de retentietijd in de (omgekeerde fase) kolom en de  
n-octanol/water-verdelingscoëfficiënt worden bepaald. De verdelings ­
coëfficiënt wordt afgeleid uit de capaciteitsfactor k, met de volgende 
formule:
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t R Ä t o 
t o 
waarin t  R = retentietijd van de te onderzoeken stof, en t  0 = gemid­
delde tijd die een molecuul van het oplosmiddel nodig heeft om de 
kolom te passeren (dode tijd).  
Kwantitatieve analysemethoden zijn niet vereist, alleen de elutietijd 
moet worden bepaald.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
1.5.1.  Herhaalbaarheid  
Schudflesmethode  
Om de nauwkeurigheid van de verdelingscoëfficiënt te garanderen 
moeten duplo-metingen worden verricht onder drie uiteenlopende testomstandigheden; hierbij kan zowel de hoeveelheid stof als de 
verhouding van de hoeveelheden oplosmiddel worden gevarieerd. 
De gevonden waarden van de verdelingscoëfficiënt moeten, uit ­
gedrukt in gewone logaritmen, binnen een interval van ± 0,3 log- eenheden vallen.
 
HPLC-methode  
Om de betrouwbaarheid van de meting te vergroten moeten duplo- 
metingen worden verricht. De log P-waarden, afgeleid uit de indivi ­
duele metingen, moeten binnen een bereik van ± 0,1 log-eenheid 
liggen.  
1.5.2.  Gevoeligheid  
Schudflesmethode  
Het meetbereik van de methode wordt bepaald door de detectiegrens 
van de analysemethode. Deze moet voldoende laag zijn om log P  ow - 
waarden in het bereik van – 2 tot 4 te kunnen bepalen (onder speciale voorwaarden kan dit bereik uitgebreid worden tot een log 
P
 ow van 5), wanneer de concentratie van de opgeloste stof in geen 
van beide fasen hoger is dan 0,01 mol per liter.  
HPLC-methode  
Met de HPLC-methode kunnen verdelingscoëfficiënten worden be ­
paald in het log P  ow -bereik van 0 tot 6.  
Normaal gezien kan de verdelingscoëfficiënt van een mengsel wor ­
den geschat tot op ± 1 log-eenheid van de schudfleswaarde. Voor ­
beelden van correlaties kunnen worden teruggevonden in de litera ­
tuur (4, 5, 6, 7, 8). Grotere nauwkeurigheid kan meestal worden 
bereikt met behulp van correlatiekrommen gebaseerd op referentie ­
mengsels met verwante structuur (9).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Specificiteit  
Schudflesmethode  
De verdelingswet van Nernst geldt alleen voor verdunde oplossingen 
bij constante temperatuur, druk en pH. De wet geldt bovendien voor een zuivere stof die wordt verdeeld tussen twee zuivere oplosmid ­
delen. Indien in één of beide fasen tegelijkertijd verschillende opge ­
loste stoffen voorkomen, dan kan dit van invloed zijn op de resul ­
taten.
 
Dissociatie of associatie van de opgeloste moleculen leidt tot afwij ­
kingen van de verdelingswet van Nernst. Dergelijke afwijkingen 
blijken uit de concentratieafhankelijkheid van de verdelingscoëffi ­
ciënt.  
Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden mag 
deze test niet zonder correcties worden toegepast op ioniseerbare stoffen. Voor dergelijke stoffen dient het gebruik van bufferoplos ­
singen in plaats van water te worden overwogen; de pH van de 
buffer dient ten minste 1 pH-eenheid te verschillen van de pKa van de stof en men dient rekening te houden met het belang van deze pH met betrekking tot het milieu.
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiënt  
De verdelingscoëfficiënt wordt bij voorkeur geschat aan de hand van 
een berekeningsmethode (zie aanhangsel 1) of, indien van toepas ­
sing, op basis van de oplosbaarheidsverhouding van de te onder ­
zoeken stof in de zuivere oplosmiddelen (10).  
1.6.2.  Schudflesmethode  
1.6.2.1.  Voorbereiding  
n-Octanol: de verdelingscoëfficiënt moet worden bepaald met analy ­
tisch zuiver oplosmiddel.  
Water: er moet gebruik worden gemaakt van gedestilleerd of dubbel 
gedestilleerd water uit apparatuur van glas of kwarts. Voor ioniseer ­
bare verbindingen dienen zo nodig bufferoplossingen in plaats van water te worden gebruikt.
 
Opmerking:  
Er mag geen gebruik worden gemaakt van water dat rechtstreeks uit 
een ionenwisselaar komt.  
1.6.2.1.1. V o o r v e r z a d i g i n g v a n d e o p l o s m i d d e l e n  
Alvorens een verdelingscoëfficiënt te bepalen, worden de fasen van 
het oplosmiddelsysteem onderling verzadigd door uitschudden bij de 
temperatuur van het experiment. Hiertoe is het handig om gedurende 
24 uur twee grote voorraadflessen met analytisch zeer zuiver  n-oc­
tanol, respectievelijk water, waaraan voldoende water respectievelijk  
n-octanol is toegevoegd, mechanisch te schudden en daarna te laten 
staan totdat de fasen zich afscheiden en een verzadigingstoestand is 
ontstaan.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. V o o r b e r e i d i n g v a n d e t e s t  
Het twee-fasensysteem moet het testvat bijna vullen. Aldus wordt 
vervluchtiging van de vloeistof voorkomen. De volumeverhouding 
en de benodigde hoeveelheid van de te onderzoeken stof worden bepaald door:
 
— de inleidende bepaling van de verdelingscoëfficiënt (zie 1.6.1);  
— de minimale hoeveelheid van de te onderzoeken stof vereist voor 
de analyse;  
— de beperking van de maximale concentratie in beide fasen tot 
0,01 mol/l.  
Er worden drie tests uitgevoerd: in de eerste test wordt gewerkt 
met de berekende volumeverhouding  n-octanol/water; in de 
tweede test wordt deze verhouding gedeeld door twee, in de 
derde test wordt deze verhouding vermenigvuldigd met twee (bijvoorbeeld 1:1, 1:2, 2:1).
 
1.6.2.1.3. D e t e o n d e r z o e k e n s t o f  
Er wordt een voorraadoplossing bereid uit  n-octanol voorverzadigd 
met water. De concentratie van deze voorraadoplossing moet nauw ­
keurig worden bepaald voor gebruik bij de bepaling van de ver ­
delingscoëfficiënt. Deze oplossing moet onder stabiele omstandighe ­
den bewaard worden.  
1.6.2.2.  Testomstandigheden  
De testtemperatuur moet constant (± 1  o C) worden gehouden binnen 
een bereik van 20-25  o C. 
1.6.2.3.  Meetprocedure  
1.6.2.3.1. I n s t e l l i n g v a n h e t v e r d e l i n g s e v e n w i c h t  
Voor de verschillende testomstandigheden moeten steeds twee test ­
vaten worden gevuld met de vereiste, nauwkeurig bekende hoeveel ­
heden van beide oplosmiddelen en de gewenste hoeveelheid voor ­
raadoplossing.  
Het volume van de  n-octanol-fasen moet worden gemeten. De test ­
vaten moeten in een schudmachine worden geplaatst of met de hand worden geschud. Aanbevolen wordt om, bij gebruik van een cen ­
trifugebuis, deze snel 180
 o te draaien om de transversale as, zodat de 
ingesloten lucht door de beide fasen omhoog beweegt. De ervaring 
heeft geleerd dat 50 van dergelijke bewegingen gewoonlijk vol ­
doende zijn om het verdelingsevenwicht te bereiken. Om zeker te zijn wordt aangeraden om 100 bewegingen uit te voeren in 
5 minuten.
 
1.6.2.3.2. S c h e i d i n g v a n d e f a s e n  
Indien noodzakelijk, moet het mengsel worden gecentrifugeerd om 
de fasen te scheiden. Dit moet worden gedaan in een laboratorium ­
centrifuge bij kamertemperatuur; indien een centrifuge zonder tem ­
peratuurregeling wordt gebruikt, moeten de centrifugebuizen ten minste gedurende één uur op de testtemperatuur worden gehouden, 
zodat de evenwichtstoestand zich kan instellen voordat de analyse 
wordt uitgevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analyse  
Voor bepaling van de verdelingscoëfficiënt moet de concentratie van 
de te onderzoeken stof in beide fasen worden bepaald. Dit kan worden gedaan door onder de verschillende testomstandigheden uit 
alle buizen een monster van iedere fase te nemen en dit volgens de 
gekozen procedure te analyseren. De totale hoeveelheid van de te onderzoeken stof in beide fasen wordt berekend en vergeleken met de oorspronkelijke hoeveelheid toegevoegde stof.
 
Van de waterfase moet een monster worden genomen volgens een 
procedure waardoor zo min mogelijk sporen n-octanol worden mee ­
genomen: voor de bemonstering van de waterfase kan een glazen injectiespuit met verwisselbare naald worden gebruikt. De injectie ­
spuit moet van tevoren gedeeltelijk worden gevuld met lucht. De 
lucht moet zachtjes worden uitgedreven terwijl de naald door de  n- 
octanol-fase wordt gestoken. De benodigde hoeveelheid van de wa ­
terfase wordt in de injectiespuit gezogen. De spuit wordt snel uit de oplossing gehaald, waarna de naald wordt losgemaakt. De inhoud 
van de injectiespuit kan nu worden gebruikt als monster van de 
waterfase. De concentratie in de twee afzonderlijke fasen dient bij voorkeur te worden bepaald met behulp van een analysemethode waarmee verschillende stoffen kunnen worden onderscheiden. Enkele 
voorbeelden van geschikte analysenmethoden zijn:
 
— fotometrische methoden;  
— gaschromatografie;  
— hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).  
1.6.3.  HPLC-methode  
1.6.3.1.  Voorbereiding  
Apparatuur  
Benodigd is een vloeistofchromatograaf, uitgerust met een niet-pul ­
serende pomp en een geschikte detectie-in-richting. Het gebruik van een injectieventiel met injectielussen wordt aangeraden. Aangezien 
de aanwezigheid van polaire groepen in de stationaire fase het juiste 
gedrag van de HPLC-kolom ernstig kan beïnvloeden, dient deze een zo klein mogelijk percentage polaire groepen te bevatten (11). Men kan gebruik maken van in de handel verkrijgbare, met microdeeltjes 
gevulde, omgekeerde fasepakkingen of van voorgepakte kolommen. 
Tussen het injectiesysteem en de analytische kolom kan een voor ­
kolom worden geïnstalleerd.
 
Mobiele fase  
Methanol en water, beide van HPLC-kwaliteit, worden gebruikt als 
elutiemiddel, dat voor gebruik wordt ontgast. Isokratische elutie dient 
te worden toegepast. Men moet methanol/water-verhoudingen met minimaal 25 % watergehalte gebruiken, normaliter neemt men een 3:1 (v/v) methanol/watermengsel om verbindingen met een log P van 
6 binnen het uur te elueren, bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut. 
Voor verbindingen met een hoge log P kan het noodzakelijk zijn om de elutietijd te verkorten (evenals voor de referentiestoffen) door de polariteit van de mobiele fase of de kolomlengte te verminderen.
 
Stoffen met een zeer lage oplosbaarheid in n-octanol geven met de 
HPLC-methode veelal abnormaal lage log P  ow -waarden; de pieken 
van dergelijke stoffen vallen soms samen met het oplosmiddelfront. 
Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat het verdelingsproces te traag verloopt om het evenwicht te bereiken binnen de tijdsduur die normaal voor een HPLC-scheiding nodig is. Het kan dan nuttig zijn 
om de stroomsnelheid en/of de methanol/water-verhouding te ver ­
lagen ten einde een betrouwbare waarde te verkrijgen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Test- en referentiestoffen moeten in voldoende concentratie oplos ­
baar zijn in de mobiele fase om detectie mogelijk te maken. Alleen 
in uitzonderingsgevallen mogen additieven in het methanol/water- mengsel worden gebruikt, daar toevoegingen de eigenschappen van de kolom veranderen. Voor chromatogrammen met additieven is het 
verplicht een aparte kolom van hetzelfde type te gebruiken. Als 
methanol/water niet voldoet, mogen andere organisch-oplosmiddel/ ­
water-mengsels worden gebruikt, bijvoorbeeld ethanol/water of acetonitril/water.
 
De pH van het eluent is kritisch voor ioniseerbare stoffen. Hij moet 
in het juiste pH-bereik van de kolom liggen, gewoonlijk tussen 2 en 8. Bufferen wordt aangeraden. Voorzichtigheid dient in acht te wor ­
den genomen om neerslag van zout en achteruitgang van de kolom 
te voorkomen, hetgeen optreedt met sommige organische fase/buffer- mengsels. HPLC-metingen met stationaire fasen op basis van silica 
boven pH 8 worden afgeraden omdat het gebruik van een alkalische 
mobiele fase kan leiden rot een snelle achteruitgang van de kolom ­
eigenschappen.
 
Opgeloste stoffen  
De referentiestoffen dienen zo zuiver mogelijk te zijn. Verbindingen 
voor test- of ijkdoeleinden worden, indien mogelijk, opgelost in de 
mobiele fase.  
Testomstandigheden  
De temperatuur gedurende de metingen mag niet meer variëren dan 
± 2 K.  
1.6.3.2.  Meting  
Berekening van de dode tijd t  0 
De dode tijd t  0 kan bepaald worden met of wel een homologe serie 
(bijvoorbeeld n-alkylmethylketonen) of wel organische stoffen die 
niet worden tegengehouden (bijvoorbeeld thioureum of formamide). Ter berekening van de dode tijd t
 0 met een homologe serie moet een 
set van ten minste 7 stoffen uit dezelfde serie worden geïnjecteerd en 
moeten de respectieve retentietijden worden bepaald. De ruwe reten ­
tietijden t  r(nc + 1)  worden uitgezet als functie van t  r(nc) , en het snijpunt 
a en de helling b van de regressievergelijking:  
t r(nc + 1)  = a + bt  r (nc) 
worden bepaald (n  c = aantal koolstofatomen). De dode tijd t  0 wordt 
dan gegeven door:  
t 0 = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
IJklijn  
De volgende stap bestaat uit het construeren van een correlatiek ­
romme van log k-waarden tegen log P voor geschikte referentiestof ­
fen. In de praktijk wordt een set van 5 tot 10 standaard-referentie ­
stoffen, met een log P-waarde rond het te verwachten bereik, tege ­
lijkertijd geïnjecteerd en worden de retentietijden bepaald, bij voor ­
keur met een recorder/integrator die is verbonden met het detectie ­
systeem. De corresponderende logaritmen van de capaciteitsfactoren, log k, worden berekend en uitgezet als functie van log P, bepaald 
met de schudflesmethode. De ijking wordt uitgevoerd met regelma ­
tige tussenpozen, minstens eenmaal per dag, zodat rekening kan worden gehouden met mogelijke veranderingen in het gedrag van de kolom.
 
Bepaling van de capaciteitsfactor van de te onderzoeken stof  
De teststof wordt in een zo klein mogelijke hoeveelheid van de 
mobiele fase geïnjecteerd. De retentietijd wordt bepaald (in duplo), om zo de capaciteitsfactor k te kunnen berekenen. Uit de correlatie ­
grafiek van de ijkstoffen kan de verdelingscoëfficiënt van de teststof 
worden geïnterpoleerd. Voor zeer lage en zeer hoge verdelingscoëf ­
ficiënten is extrapolatie noodzakelijk. In deze gevallen dient men extra aandacht te besteden aan de betrouwbaarheidsgrenzen van de regressielijn.
 
2. GEGEVENS  
Schudflesmethode  
De betrouwbaarheid van de gevonden waarden voor P kan worden 
onderzocht door de gemiddelden van de duplo-bepalingen te ver ­
gelijken met het totale gemiddelde.  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrij ­
ving en verontreinigingen);  
— indien de methoden niet toepasbaar zijn (bijvoorbeeld oppervlak ­
teactieve stoffen), dient een berekende waarde of een schatting gebaseerd op de individuele oplosbaarheid in n-octanol en water 
te worden opgegeven;
 
— alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot 
verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof.
 
Voor de schudflesmethode:  
— het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;  
— testtemperatuur;  
— gegevens over de analytische procedures voor bepaling van de 
concentraties;  
— tijd en snelheid van centrifugeren, indien van toepassing;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— de gemeten concentraties in beide fasen voor elke bepaling (dit 
betekent dat in totaal 12 concentraties worden vermeld);  
— het gewicht van de onderzochte stof, het volume van elke fase in 
elk testvat en de berekende totale hoeveelheid van de onder ­
zochte stof in elke fase bij evenwicht;  
— de berekende waarden van de verdelingscoëfficiënt (P) en het 
gemiddelde voor iedere groep testomstandigheden, evenals het gemiddelde van alle metingen; indien er aanwijzingen zijn dat de verdelingscoëfficiënt afhankelijk is van de concentratie, dient 
dit te worden vermeld in het testrapport;
 
— de standaardafwijking van de afzonderlijke P-waarden ten op ­
zichte van het gemiddelde;  
— de logaritme (grondtal 10) van de P-waarde gemiddeld over alle 
metingen;  
— de theoretisch berekende waarde van P  ow , wanneer deze is be ­
paald of wanneer de gemeten waarde groter is dan 10  4 ; 
— pH van het gebruikte water en van de waterfase tijdens het 
experiment;  
— indien bufferoplossingen worden gebruikt, de redenen voor het 
gebruik van bufferoplossingen in plaats van water, samenstelling, 
concentratie en pH van de bufferoplossingen, pH van de waterige 
fase vóór en na het experiment.  
Voor de HPLC-methode:  
— het resultaat van de inleidende schatting, indien van toepassing;  
— test- en referentiestoffen, en de zuiverheid;  
— testtemperatuur;  
— de pH waarbij de bepaling wordt uitgevoerd;  
— details van de analytische en de voorkolom, de mobiele fase en 
de detectiemethode;  
— retentiegegevens en log P-waarden uit de literatuur voor de bij de 
ijking gebruikte referentiestoffen;  
— details van de gevonden regressielijn (log k tegen log P);  
— gemiddelde retentiegegevens en de geïnterpoleerde log P-waarde 
voor de teststof;  
— beschrijving van de apparatuur en de werkomstandigheden;  
— elutieprofielen;  
— de hoeveelheden test- en referentiestoffen die in de kolom zijn 
gebracht;  
— dode tijd en hoe hij gemeten werd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. LITERATUUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107 — Decision of the 
Council C(81) 30 Final.  
(2) C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) 
— Available from Pomona College Medicina! Chemistry Pro ­
ject, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.  
(4) L. Renberg, G. Sundström en K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 
1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt en R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219.  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky en A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.  
(9) S. Fujisawa en E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umspraxis (edited by E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart (1958), Band I/1, 223-339.  
(11) R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem., 1979, vol. 
14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Partition coefficients and their 
uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 (AFNOR) (Sept. 1985). Chemical products for 
industrial use — Determination of partition coefficient — 
Flask shaking method.  
(15) CV. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 
459. 
(16) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 
525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani en 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson en G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1 113.  
(19) D.S. Brown en E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J.K. Seydel en K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologi ­
sche Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Am ­
sterdam, 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.j. Noulton, C.T. Murphy en P.J. Taylor, j. 
Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Aanhangsel 1  
Berekenings-/schattingsmethoden  
INLEIDING  
Een algemene inleiding tot berekeningsmethoden, gegevens en voorbeelden wor ­
den gegeven in het „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (a).  
Berekende waarden voor P  ow kunnen worden gebruikt:  
— om te beslissen welke van de experimentele methoden het meest geschikt is 
(schudflesbereik: log P  ow : – 2 tot 4, HPLC-bereik: log P  ow : 0 tot 6);  
— om de geschikte testvoorwaarden te kunnen kiezen (bijvoorbeeld referentie ­
stoffen voor de HPLC-methode, n-octanol/water-volumeverhoudingen voor de schudflesmethode);
 
— ter controle voor het laboratorium zelf van eventuele fouten in het experi ­
ment;  
— om een P  ow -schatting te leveren in die gevallen waar de experimentele me ­
thoden om technische redenen niet kunnen worden toegepast.  
SCHATTINGSMETHODE  
Inleidende schatting van de verdelingscoëfficiënt  
De waarde van de verdelingscoëfficiënt kan geschat worden met behulp van de 
oplosbaarheid van de teststof in zuivere oplosmiddelen. Hiervoor geldt:  
P geschat ¼ c nÄoktanol  verzadigd 
c water verzadigd  
BEREKENINGSMETHODEN  
Principe van de berekeningsmethoden  
Alle berekeningsmethoden zijn gebaseerd op de formele fragmentatie van het 
molecuul in geschikte substructuren, waarvoor betrouwbare log P  ow -fragment ­
constanten bekend zijn. De log P  ow van het volledige molecuul wordt dan bere ­
kend als de som van de afzonderlijke waarden van de overeenkomstige frag ­
menten, plus de som van de correctietermen voor intramoleculaire wisselwerkin ­
gen. 
Lijsten van fragmentconstanten en correctietermen zijn te vinden in de literatuur 
(b)(c)(d)(e). Sommige hiervan worden regelmatig bijgewerkt (b).  
Kwaliteitscriteria  
Over het algemeen vermindert de betrouwbaarheid van een berekeningsmethode 
met het toenemen van de complexiteit van de onderzochte stof. Voor eenvoudige 
moleculen met laag molecuulgewicht en slechts één of twee functionele groepen kan een afwijking van 0,1 tot 0,3 log P
 ow -eenheden worden verwacht tussen de 
resultaten van de verschillende fragmentatiemethoden en de gemeten waarde. 
Voor meer complexe moleculen kan de fout groter zijn. Dit is afhankelijk van 
de betrouwbaarheid en beschikbaarheid van fragmentconstanten, alsmede van het vermogen om intramoleculaire wisselwerkingen (bijvoorbeeld waterstofbruggen) te herkennen en het juiste gebruik van de correctietermen (minder problematisch 
met de computersoftware CLOGP-3) (b). In geval van ioniserende verbindingen 
is het belangrijk de lading of de mate van ionisatie juist in te schatten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Berekeningsprocedures  
Hansch π-methode  
De oorspronkelijke hydrofobesubstitutieconstante π, geïntroduceerd door Fujita et 
al. (f), wordt gedefinieerd als:  
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH)  
waarin P  ow (PhX) de verdelingscoëfficiënt van een aromatisch derivaat is, en P  ow 
(PhH) die van de oorspronkelijke verbinding,  
(bijvoorbeeld π CI = log P  ow (C 6 H 5 C1) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
Volgens zijn definitie is de Л-methode voornamelijk toepasbaar op aromatische 
substitutie. De Л-waarden van een groot aantal substitutiegroepen zijn in tabellen 
terug te vinden (b)(c)(d). Deze worden gebruikt voor de berekening van log P  ow 
van aromatische moleculen of substructuren.  
Rekker-Methode  
Volgens Rekker (g) wordt de log P  ow -waarde als volgt berekend:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j ðwisselwerkingstermen Þ 
waarin f  i de moleculaire fragmentconstante voorstelt en a  i de frequentie van het 
voorkomen ervan in het onderzochte molecuul. De correctietermen kunnen wor ­
den uitgedrukt als een integraal veelvoud van eén enkele constante c  m (de zo­
genaamde „magische” constante). De fragmentconstanten f  i en c  m werden be ­
paald uit een lijst van 1 054 experimentele P  ow waarden (825 stoffen) met behulp 
van meervoudige regressieanalyse (c)(h). De bepaling van de interactietermen 
wordt uitgevoerd volgens vaste regels beschreven in de literatuur (e)(h)(i).  
Hansch-Leo-methode  
Volgens Hansch en Leo (c) wordt de log P  ow -waarde berekend uit:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
waarin f  i de moleculaire fragmentconstante voorstelt, F  j de correctietermen en a  i 
en b  j het overeenkomstige aantal keren dat ze voorkomen. Afgeleid uit experi ­
mentele P  ow -waarden werd door „trial and error” een lijst gemaakt van atoom- en 
groepsfragmentwaarden evenals een lijst van correctietermen F  j (de zogenaamde 
„factoren”). De correctietermen zijn geclassificeerd in verschillende categorieën 
(a)(c). Omdat het vrij ingewikkeld en tijdrovend is rekening te houden met alle 
regels en correctietermen, werden softwarepakketten ontwikkeld (b).  
Gecombineerde methode  
De berekening van log P  ow van complexe moleculen kan aanzienlijk verbeterd 
worden, indien het molecuul wordt opgesplitst in grotere substructuren waarvoor 
betrouwbare log P  ow -waarden beschikbaar zijn, hetzij uit tabellen (b)(c) of uit 
eigen metingen. Zulke fragmenten (bijvoorbeeld heterocyclische structuren, an ­
trachinon, azobenzeen) kunnen dan worden gecombineerd met de Л-waarden 
volgens Hansch of met de fragmentconstanten volgens Rekker of Leo.  
Opmerkingen  
i) De berekeningsmethoden kunnen slechts worden toegepast op gedeeltelijk of 
volledig geïoniseerde stoffen wanneer de mogelijkheid bestaat om de nodige 
correctiefactoren in de berekening te verwerken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Als het bestaan van intramoleculaire waterstofbruggen kan worden aange ­
nomen, moeten de overeenkomstige correctietermen (ongeveer + 0,6 
tot + 1,0 log P  ow -eenheden) bij het resultaat worden opgeteld (a). Aanwij ­
zingen voor de aanwezigheid van waterstofbruggen kunnen worden verkre ­
gen uit ruimtelijke modellen of spectroscopische gegevens over het molecuul.  
iii) Als verschillende tautomere vormen mogelijk zijn, dient de meest waar ­
schijnlijke vorm gebruikt te worden voor de berekening.  
iv) De herzieningen van lijsten met fragmentconstanten dienen zorgvuldig ge ­
volgd te worden.  
Rapport  
Bij het gebruik van berekenings-/schattingsmethoden dient het testrapport zo 
mogelijk de volgende gegevens te bevatten:  
— beschrijving van de stof (mengsel, verontreinigingen, enz.);  
— aanwijzingen over mogelijke intramoleculaire waterstofbruggen, dissociatie, 
lading en alle andere ongewone effecten (bijvoorbeeld tautomerie);  
— beschrijving van de berekeningsmethode;  
— identificatie of leverancier van de database;  
— bijzonderheden in de keuze van de fragmenten;  
— uitgebreide documentatie van de berekening.  
LITERATUUR  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl en D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project. Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch en A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch en D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker en H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther., 1979, 
vol. 14, 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa en C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.  
(h) C.V. Eadsforth en P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, 225.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Aanhangsel 2  
Aanbevolen referentiestoffen voor de HPLC-methode  
Nr. Referentiestof log P  ow pKa 
1 2-Butanon 0,3 
2 4-Acetylpyridine 0,5 3 Aniline 0,9 4 Aceetanilide 1,0 5 Benzylalcohol 1,1 6 p -Methoxyfenol 1,3 pKa = 10,26 
7 Fenoxyazijnzuur 1,4 pKa = 3,12 
8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 
9 2,4-Dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Benzonitril 1,6 11 Fenylacetonitril 1,6 12 4-Methylbenzylalcohol 1,6 13 Acetofenon 1,7 14 2-Nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 15 3-Nitrobenzoëzuur 1,8 pKa = 3,47 16 4-Chlooraniline 1,8 pKa = 4,15 17 Nirrobenzeen 1,9 
18 Cinnamylalcohol 1,9 
19 Benzoëzuur 1,9 pKa = 4,19 20 p -Kresol 1,9 pKa = 10,17 
21 Kaneelzuur 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisool 2,1 23 Methylbenzoaat 2,1 24 Benzeen 2,1 25 3-Methylbenzoëzuur 2,4 pKa = 4,27 26 4-Chloorfenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trichloorethyleen 2,4 
28 Atrazine 2,6 
29 Ethylbenzoaat 2,6 30 2,6-Dichloorbenzonitril 2,6 31 3-Chloorbenzoëzuur 2,7 pKa = 3,82 32 Tolueen 2,7 33 1-Naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Dichlooraniline 2,8 35 Chloorbenzeen 2,8 36 Allylfenylether 2,9 37 Broombenzeen 3,0
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nr. Referentiestof log P  ow pKa 
38 Ethylbenzeen 3,2 
39 Benzofenon 3,2 
40 p -Fenylfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 Thymol 3,3 
42 1,4-Dichloorbenzeen 3,4 
43 Difenylamine 3,4 pKa = 0,79 44 Naftaleen 3,6 45 Fenylbenzoaat 3,6 46 Isopropylbenzeen 3,7 47 2,4,6-Trichloorfenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenyl 4,0 49 Benzylbenzoaat 4,0 50 2,4-Dinitro-6-sec-butylfenol 4,1 51 1,2,4-Trichloorbenzeen 4,2 
52 Dodecaancarbonzuur 4,2 
53 Difenylether 4,2 54 n -Burylbenzeen 4,5 
55 Fenanthreen 4,5 56 Fluorantheen 4,7 57 Dibenzyl 4,8 58 2,6-Difenylpyridine 4,9 59 Trifenylamine 5,7 60 DDT 6,2 
Andere referentiestoffen met lage log P
 ow 
1 Nicotinezuur - 0,07  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. VLAMPUNT  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Alvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriën ­
terende gegevens inzake de brandbaarheid van de stof. De testpro ­
cedure is van toepassing op vloeistoffen waarvan de dampen door een ontstekingsbron tot ontbranding kunnen worden gebracht. De hier beschreven testmethoden zijn alleen betrouwbaar indien de ge ­
meten waarde van het vlampunt binnen een bereik ligt zoals in de 
afzonderlijke methoden is aangegeven.
 
Bij het selecteren van de te gebruiken methode dient rekening te 
worden gehouden met mogelijke chemische reacties tussen de test ­
stof en het monstervat.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Het vlampunt is de laagste temperatuur, gecorrigeerd tot een druk 
van 101,325 kPa, waarbij een vloeistof onder de beschreven omstan ­
digheden zodanig verdampt, dat in het testvat een brandbaar mengsel 
van lucht en damp wordt gevormd.  
Eenheden:  o C 
t = T - 273,15  
(t in  o C en T in K).  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Referentiestoffen zijn in de eerste 
plaats bedoeld om regelmatig de werking van de methode te contro ­
leren en om vergelijkingen met resultaten van andere methoden mo ­
gelijk te maken.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De stof wordt in een testvat gebracht en verwarmd of gekoeld tot de 
testtemperatuur volgens de procedure beschreven bij de afzonderlijke testmethode. Ontstekingspogingen worden uitgevoerd om te zien of 
het monster al dan niet tot ontbranding kan worden gebracht bij de 
testtemperatuur.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
1.5.1.  Reproduceerbaarheid  
De reproduceerbaarheid varieert met de gemeten waarde van het 
vlampunt en met de gebruikte testmethode; maximaal 2  o C. 
1.5.2.  Gevoeligheid  
De gevoeligheid is afhankelijk van de gebruikte testmethode.  
1.5.3.  Toepasbaarheid  
De toepasbaarheid van een aantal testmethoden blijft beperkt tot 
bepaalde vlampuntsbereiken en afhankelijk van stofeigenschappen 
(bijvoorbeeld hoge viscositeit).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
Een monster van de te onderzoeken stof wordt in een testapparaat 
overeenkomstig 1.6.3.1, respectievelijk 1.6.3.2, gebracht.  
Uit veiligheidsoverwegingen wordt aangeraden voor energetische of 
giftige stoffen een methode waarbij slechts een klein monstervolume 
(circa 2 cm  3 ) nodig is, toe te passen.  
1.6.2.  Testomstandigheden  
Het apparaat dient, voor zover de veiligheid dit toelaat, op een tocht ­
vrije plaats te worden opgesteld.  
1.6.3.  Uitvoering van de test  
1.6.3.1.  Evenwichtsmethode  
Zie ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 en ISO 3679.  
1.6.3.2.  Niet-evenwichtsmethode  
Apparatuur van Abel:  
Zie BS 2000-170, NF M 07-011 en NF T 66-009.  
Apparatuur van Abel-Pensky:  
Zie EN 57, DIN 51755, deel 1 (voor temperaturen van 5 tot 
65 o C) DIN 51755, deel 2 (voor temperaturen lager dan 5  o C), 
NF M 07-036.  
Apparatuur van Tag:  
Zie ASTM D 56.  
Apparatuur van Pensky-Martens:  
Zie ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 en NF 
M 07-019.  
Opmerkingen:  
Indien het vlampunt, bepaald volgens een van de niet-evenwichts ­
methoden onder 1.6.3.2, de volgende waarden blijkt te hebben: 0 ± 
2 o C, 21 ± 2  o C, 55 ± 2  o C, dient dit te worden bevestigd volgens 
een evenwichtsmethode met gebruik van dezelfde apparatuur.  
Alleen de methoden waarmee de temperatuur van het vlampunt kan 
worden bepaald, komen in aanmerking voor gebruik ten behoeve van een kennisgeving.
 
Voor de bepaling van het vlampunt van visceuze vloeistoffen (ver ­
ven, lijmen, e.d.) die oplosmiddelen bevatten, mag uitsluitend ge ­
bruik worden gemaakt van apparatuur en testmethoden die geschikt zijn voor bepaling van het vlampunt van visceuze vloeistoffen.
 
Zie ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 en DIN 53213, deel 1.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. GEGEVENS  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— nauwkeurige beschrijving van de stof (beschrijving en verontrei ­
nigingen);  
— de gebruikte testmethode alsmede eventuele wijzigingen;  
— de resultaten en alle gegevens en opmerkingen die van belang 
zijn voor de interpretatie van de resultaten.  
4. LITERATUUR  
Geen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  ONTVLAMBAARHEID (VASTE STOFFEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Alvorens de test uit te voeren is het nuttig te beschikken over oriën ­
terende gegevens inzake potentieel explosieve eigenschappen van de 
stof. 
Deze test dient alleen te worden toegepast op stoffen in poeder-, 
korrel- of pastavorm.  
Alleen stoffen waarvan de brandsnelheid hoger is dan een bepaalde 
drempelwaarde, worden als licht ontvlambaar beschouwd. Daarom worden niet alle stoffen die kunnen worden ontstoken, maar alleen 
die stoffen die snel branden of waarvan het brandgedrag buiten ­
gewoon gevaarlijk is, inbegrepen.
 
Het is buitengewoon gevaarlijk indien een smeulproces zich voort ­
plant door een metaalpoeder, vanwege de moeilijkheid om het vuur te doven. Daarom dienen metaalpoeders als licht ontvlambaar te worden beschouwd, als de smeulhaard zich binnen een zekere tijd 
door de gehele massa kan voortplanten.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Brandtijd in seconden.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Niet gekozen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Van de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn met een 
lengte van ongeveer 250 mm gevormd waarop een oriënterende proef wordt uitgevoerd om te bepalen of, na ontsteken van het mon ­
ster met behulp van een gasvlam, de vlam of het smeulproces zich 
voortplant. Als het vlamfront/smeulproces zich binnen een bepaalde 
tijdsduur over 200 mm van de sliert voortplant, dient een volledig testprogramma te worden uitgevoerd om de brandsnelheid vast te stellen.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Niet gegeven.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Oriënterende proef  
Van de stof wordt een ononderbroken rups of poederlijn van onge ­
veer 250 mm lengte, 20 mm breedte en 10 mm hoogte gevormd op 
een onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende grond ­
plaat. Een hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) wordt gedurende maximaal 2 minuten bij één uiteinde van de rups gehouden totdat het poeder ontbrandt (5 minuten voor me ­
taalpoeders of metaallegeringen). Men dient er op te letten of de 
ontbranding zich binnen 4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoe ­
ders) voortplant over 200 mm van de poederrups. Indien de stof niet 
ontbrandt of indien de vlam of het smeulproces zich niet binnen 
4 minuten (of 40 minuten bij metaalpoeders) voortplant over 200 mm poederrups dient de stof niet als licht ontvlambaar te wor ­
den beschouwd en behoeft geen verder onderzoek te worden uitge ­
voerd. Als het brandproces zich in minder dan 4 minuten, of minder 
dan 40 minuten bij metaalpoeders, voortplant over 200 mm van de poederrups dient de procedure zoals hieronder beschreven (punt 1.6.2. en volgende) te worden uitgevoerd.
 
1.6.2.  Brandsnelheidstest  
1.6.2.1.  Voorbereidingen  
Poeder of korrelvormige stoffen worden ingebracht (niet aandrukken) 
in een mal met een lengte van 250 mm en een driehoekige door ­
snede met een inwendige hoogte van 10 mm en een inwendige 
breedte van 20 mm. Om de zijkanten te begrenzen zijn aan beide kanten van de mal in de lengterichting twee metalen platen gemon ­
teerd die 2 mm uitsteken boven de rand van de driehoekige door ­
snede (zie figuur). Vervolgens laat men de mal driemaal van een 
hoogte van 2 cm op een massief oppervlak vallen. Indien nodig wordt de mal bijgevuld. Vervolgens worden de zijplaten verwijderd en wordt de overtollige stof met een stevig blad weggeveegd. Een 
onbrandbare, niet-poreuze en slecht warmtegeleidende plaat wordt 
bovenop de mal gelegd, het apparaat wordt omgekeerd, waarna de mal wordt verwijderd.
 
Pastavormige stoffen worden op een onbrandbare, niet-poreuze en 
slecht warmtegeleidende plaat aangebracht in de vorm van een rups met een lengte van 250 mm en een doorsnede van ongeveer 1 cm
 2 . 
1.6.2.2.  Testomstandigheden  
Bij een vochtgevoelige stof dient de test zo snel als mogelijk na het 
verwijderen van de verpakking te worden uitgevoerd.  
1.6.2.3.  Uitvoering van de test  
De rups wordt in een zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op 
de richting van de trek.  
De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat ver ­
brandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de lucht ­
snelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De appara ­
tuur moet worden omgeven door een vochtscherm.  
Met de hete vlam van een gasbrander (minimale diameter 5 mm) 
wordt de rups aan één kant ontstoken. Nadat de rups over een lengte 
van 80 mm heeft gebrand, wordt de brandsnelheid over de volgende 
100 mm gemeten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
De test, waarbij steeds een schone koude plaat wordt gebruikt, wordt 
zesmaal uitgevoerd, tenzij eerder een positief resultaat wordt ver ­
kregen.  
2. GEGEVENS  
Voor de beoordeling zijn de brandduur in de oriënterende proef 
(1.6.1) en de kortste brandduur uit de hoogstens zes testen (1.6.2.3) van belang.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en ver ­
ontreinigingen);  
— een beschrijving van de fysische toestand en het vochtgehalte 
van de onderzochte stof;  
— de resultaten van de oriënterende test en, indien uitgevoerd, de 
brandsnelheidstest;  
— alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpreta ­
tie van de resultaten.  
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Poedervormige, korrelvormige of pastavormige stoffen worden als 
licht ontvlambaar beschouwd indien in één van de tests uitgevoerd 
volgens 1.6.2 de brandduur minder dan 45 seconden bedraagt. Poe ­
ders van metalen of metaallegeringen worden als licht ontvlambaar beschouwd, indien zij kunnen worden ontstoken en indien de vlam of reactiezone zich binnen 10 minuten over het gehele monster uit ­
breidt.
 
4. LITERATUUR  
(1) NF T 20-042, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Aanhangsel  
Figuur  
Mal en toebehoren om een rups van de te onderzoeken stof te vormen  
(Afmetingen in mm)
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  ONTVLAMBAARHEID (GASSEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Met deze methode kan worden vastgesteld of mengsels van gassen 
en lucht bij kamertemperatuur (ongeveer 20  o C) en atmosferische 
druk brandbaar zijn, en zo ja, binnen welk concentratiebereik. Meng ­
sels met toenemende concentraties van het te onderzoeken gas in lucht worden blootgesteld aan een elektrische vonk, waarna wordt 
vastgesteld of ontbranding plaatsvindt.
 
1.2. DEFINITIE EN EENHEDEN  
De maat voor de brandbaarheid is het bereik van de concentratie ­
waarden tussen de onderste en bovenste ontploffingsgrens. De onder- 
en bovenexplosiegrenzen worden gevormd door de uiterste concen ­
traties van het brandbare gas in lucht waarbij een vlam zich niet voortplant.
 
1.3. REFERENTIESTOF  
Niet gegeven.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De concentratie van het gas in de lucht wordt stap voor stap opge ­
voerd, waarbij het mengsel in iedere stap wordt blootgesteld aan een 
elektrische vonk.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Niet gegeven.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
Het testvat is een staande glazen cilinder met een inwendige dia ­
meter van minimaal 50 mm en een hoogte van minimaal 300 mm. 
De ontstekingselektroden bevinden zich op een onderlinge afstand 
van 3 tot 5 mm en worden 60 mm boven de cilinderbodem geplaatst. De cilinder is voorzien van een overdrukventiel. Het apparaat moet worden afgeschermd om schade bij een eventuele ontploffing te 
beperken.
 
Als ontstekingsbron wordt gebruik gemaakt van een staande induc ­
tievonk met een duur van 0,5 sec, opgewekt door een hoogspan ­
ningstransformator met een uitgangsspanning van 10 tot 15 kV 
(maximaal ingangsvermogen 300 W). Een voorbeeld van een ge ­
schikt apparaat wordt gegeven in referentie (2).  
1.6.2.  Testomstandigheden  
De test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 
20 o C). ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Uitvoering van de test  
Met behulp van doseerpompen wordt een bekende concentratie van 
het gas in lucht naar de glazen cilinder geleid. Het mengsel wordt blootgesteld aan een vonk en er wordt vastgesteld of er zich vanaf de 
ontstekingsbron al dan niet een vlam ontwikkelt die zich zelfstandig 
voortplant. De gasconcentratie wordt in stappen van 1 % vol opge ­
voerd, totdat ontbranding zoals boven bedoeld, plaatsvindt.
 
Als de chemische structuur van het gas erop wijst dat het niet ont ­
vlambaar is en de samenstelling van het stoïchiometrische mengsel 
met lucht berekend kan worden, dienen alleen de mengsels in het bereik van 10 % beneden tot 10 % boven de stoïchiometrische samenstelling getest te worden in stappen van 1 %.
 
2. GEGEVENS  
Het enige gegeven van belang voor bepaling van deze eigenschap is 
het optreden van een vlam die zich zelfstandig voortplant.  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en ver ­
ontreinigingen);  
— een beschrijving van de gebruikte apparatuur inclusief de afme ­
tingen;  
— de temperatuur waarbij de test werd uitgevoerd;  
— de onderzochte concentraties en de verkregen resultaten;  
— het resultaat van de test: niet ontvlambaar of licht ontvlambaar 
gas. Indien geconcludeerd wordt dat het gas niet ontvlambaar is, moet het concentratiebereik waarover het gas in stappen van 1 % 
onderzocht werd, vermeld worden;
 
— alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de inter ­
pretatie van de resultaten.  
4. LITERATUUR  
(1) NF T 20-041, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker en H. Schacke. Entwicklung einer Standard-Apparatur 
zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech., 1984, 
vol. 56, 2, blz. 126-127.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  ONTVLAMBAARHEID (CONTACT MET WATER)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Deze testmethode kan worden gebruikt om vast te stellen of de 
reactie van een stof met water of vochtige lucht leidt tot het vrijko ­
men van een gevaarlijke hoeveelheid van één of meer eventueel licht ontvlambare gassen.
 
De testmethode kan zowel op vaste als op vloeibare stoffen worden 
toegepast. Deze methode is niet van toepassing op stoffen die in 
aanraking met lucht spontaan ontbranden.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Licht ontvlambaar: Stoffen die bij aanraking met water of vochtige 
lucht licht ontvlambare gassen produceren met een minimum ont ­
wikkelingshoeveelheid van 1 liter per kg stof per uur.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De stof wordt volgens de hieronder beschreven getrapte volgorde 
getest; als bij één van de stappen ontbranding optreedt, is verder 
onderzoek overbodig. Als bekend is dat de te onderzoeken stof niet heftig reageert met water kan worden verdergegaan met stap 4 (1.3.4).
 
1.3.1.  Stap 1  
De te onderzoeken stof wordt in een buis met gedistilleerd water op 
20 o C gebracht en er wordt nagegaan of het vrijgekomen gas ont ­
brandt.  
1.3.2.  Stap 2  
De te onderzoeken stof wordt gebracht op een filtreerpapier dat in 
een schotel met gedistilleerd water van 20  o C drijft, en er wordt 
nagegaan of het vrijkomende gas ontbrandt. Het filtreerpapier dient alleen om de stof op één plaats te houden, waardoor de kans op ontbranding toeneemt.
 
1.3.3.  Stap 3  
Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm 
hoog en 3 cm doorsnede gemaakt. Hierop worden een paar druppels 
water gebracht en er wordt nagegaan of het vrijkomende gas ont ­
brandt.  
1.3.4.  Stap 4  
De te onderzoeken stof wordt met gedistilleerd water van 20  o C 
gemengd en de snelheid van gasontwikkeling wordt ieder uur geme ­
ten gedurende een periode van 7 uur. Als de snelheid van de gas ­
ontwikkeling onregelmatig is of toeneemt tegen het eind van de periode van 7 uur, moet de duur van de meting tot maximaal 5 
dagen worden verlengd. De test kan worden gestaakt zodra een 
snelheid hoger dan 1 liter/kg per uur wordt gemeten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. REFERENTIESTOF  
Niet gegeven.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Niet gegeven.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODEN  
1.6.1.  Stap 1  
1.6.1.1.  Testomstandigheden  
De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  o C). 
1.6.1.2.  Uitvoering van de test  
Een kleine hoeveelheid (ongeveer 2 mm doorsnede) van de te onder ­
zoeken stof wordt in een bak met gedistilleerd water gebracht. Ge ­
noteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ont ­
brandt. Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onder ­
zoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt 
beschouwd.  
1.6.2.  Stap 2  
1.6.2.1.  Apparatuur  
Een filtreerpapier laat men plat op het oppervlak van een hoeveel ­
heid gedistilleerd water drijven in een geschikt vat, bijvoorbeeld een 
verdampingsschotel met een doorsnede van 100 mm.  
1.6.2.2.  Testomstandigheden  
De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  o C). 
1.6.2.3.  Uitvoering van de test  
Een kleine hoeveelheid van de te onderzoeken stof (ongeveer 2 mm 
doorsnede) wordt midden op het filtreerpapier gebracht. Genoteerd 
wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. 
Indien ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt be ­
schouwd.
 
1.6.3.  Stap 3  
1.6.3.1.  Testomstandigheden  
De proef wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20  o C). 
1.6.3.2.  Uitvoering van de test  
Van de te onderzoeken stof wordt een hoopje van ongeveer 2 cm 
hoogte en 3 cm doorsnede gemaakt met een kuiltje bovenin. In het kuiltje worden een paar druppels water gebracht en genoteerd wordt i) of er gas ontwijkt en ii) of het gas spontaan ontbrandt. Indien 
ontbranding van het gas plaatsvindt, is verder onderzoek van de stof 
niet nodig, omdat de stof dan als gevaarlijk wordt beschouwd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Stap 4  
1.6.4.1.  Apparatuur  
De apparatuur wordt opgesteld als in de figuur.  
1.6.4.2.  Testomstandigheden  
Kijk of het vat van de te onderzoeken stof poeder bevat bestaande 
uit deeltjes van minder dan 500 μm diameter. Indien meer dan 1 
gewichtsprocent van de stof poedervormig is of indien het monster brokkelig is, wordt de stof in zijn geheel vóór de test tot poeder 
gemalen; op deze manier wordt rekening gehouden met mogelijke 
verkleining van de deeltjesgrootte tijdens opslag en verwerking van de stof. In alle andere gevallen wordt de stof onderzocht zoals ze werd verkregen. De test moet worden uitgevoerd bij kamertempera ­
tuur (ongeveer 20
 o C) en atmosferische druk.  
1.6.4.3.  Uitvoering van de test  
10 tot 20 ml water wordt in de druppeltrechter van het apparaat 
gebracht en 10 g van de te onderzoeken stof wordt afgewogen in 
de erlenmeyerkolf. Het volume van het vrijkomende gas kan op elke 
geschikte wijze worden gemeten. De kraan van de druppeltrechter wordt geopend zodat het water in de erlenmeyerkolf komt, en een chronometer gestart. De hoeveelheid vrijkomend gas wordt ieder uur 
gemeten gedurende een periode van 7 uur. Als tijdens deze periode 
het vrijkomen van gas onregelmatig verloopt, of als aan het eind van de periode de hoeveelheid vrijkomend gas toeneemt moeten de me ­
tingen voortgezet worden tot maximaal 5 dagen. Indien de gasont ­
wikkelingssnelheid, tijdens de metingen, op welk ogenblik dan ook, 
meer dan 1 liter per kg stof en per uur bedraagt, kan het onderzoek gestaakt worden. De test moet in triplo worden uitgevoerd.
 
Indien de chemische identiteit van het gas niet bekend is, dient het te 
worden geanalyseerd. Indien het gas licht ontvlambare componenten bevat en niet bekend is of het totale mengsel licht ontvlambaar is, 
moet een mengsel van dezelfde samenstelling worden bereid en ge ­
test volgens methode A.11.
 
2. GEGEVENS  
De onderzochte stof wordt als gevaarlijk beschouwd indien:  
— spontane ontbranding plaatsvindt bij één van de stappen tijdens 
de testprocedure;  
of 
— een ontvlambaar gas vrijkomt met een grotere snelheid groter dan 
1 liter per kg van de te onderzoeken stof per uur.  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en ver ­
ontreinigingen);  
— gegevens over eventuele voorbehandeling van de onderzochte 
stof; ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— de resultaten van de tests (stappen 1, 2, 3 en 4);  
— de chemische identiteit van het vrijgekomen gas;  
— de snelheid waarmee het gas vrijkomt als stap 4 (1.6.4) wordt 
uitgevoerd;  
— alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie 
van de resultaten.  
4. LITERATUUR  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hy ­
drolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Aanhangsel  
Figuur  
Apparatuur
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  PYROFORE EIGENSCHAPPEN VAN VASTE STOFFEN EN 
VLOEISTOFFEN  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
De testprocedure is van toepassing op vaste en vloeibare stoffen, die 
spontaan kunnen ontbranden kort nadat ze bij kamertemperatuur (ongeveer 20
 o C) in aanraking zijn gekomen met lucht.  
Deze testprocedure is niet van toepassing op stoffen die bij kamer ­
temperatuur eerst na uren- of dagenlange blootstelling aan lucht 
spontaan ontbranden of die op hogere temperatuur moeten worden 
gebracht om tot zelfontbranding te komen.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Stoffen worden als pyrofoor beschouwd als ze ontbranden of ver ­
koling veroorzaken onder de omstandigheden zoals beschreven 
onder 1.6.  
Voor de zelfontvlambaarheid van vloeistoffen kan ook een test nodig 
zijn volgens methode A.15: Zelfontbrandingstemperatuur (vloeistof ­
fen en gassen).  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Niet gegeven.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De stof, vast of vloeibaar, wordt op een inerte drager gebracht en 
gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur in aanraking ge ­
bracht met lucht. Indien vloeistoffen niet ontbranden moeten ze ge ­
absorbeerd worden op filterpapier en gedurende 5 minuten bij om ­
gevingstemperatuur (ongeveer 20  o C) worden blootgesteld aan lucht. 
Als een vaste of vloeibare stof ontbrandt, of een vloeistof het filter ­
papier doet ontbranden of verkolen, wordt de stof beschouwd als pyrofoor.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Reproduceerbaarheid: gezien het belang met betrekking tot veiligheid 
is één enkel positief resultaat voldoende om de stof als pyrofoor te beschouwen.
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
Een porseleinen bakje van ongeveer 10 cm doorsnede wordt bij 
kamertemperatuur (ongeveer 20  o C) tot een hoogte van ongeveer 
5 mm gevuld met diatomeeënaarde.  
Opmerking:  
Diatomeeënaarde of een vergelijkbare en gangbare inerte stof wordt 
representatief geacht voor aarde waarmee gemorste stoffen in geval 
van een ongeluk in aanraking kunnen komen.  
Droog filterpapier is vereist om vloeistoffen te onderzoeken die niet 
ontbranden na aanraking met lucht wanneer ze in aanraking zijn met 
een inerte drager.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Uitvoering van de test  
a) Poedervormige vaste stoffen  
1 tot 2 cm  3 van de te onderzoeken, poedervormige stof wordt vanaf 
ongeveer 1 m hoogte op een niet-brandbaar oppervlak gestrooid; 
nagegaan wordt of de stof tijdens het vallen, of binnen 5 minuten 
na het neerkomen, ontbrandt.  
De proef wordt 6 keer uitgevoerd tenzij ontbranding optreedt.  
b) Vloeistoffen  
Ongeveer 5 cm  3 van de te onderzoeken vloeistof wordt in het por ­
seleinen bakje gegoten en nagegaan wordt of de stof binnen 
5 minuten ontbrandt.  
Als geen ontbranding optreedt tijdens de zes proeven, voer dan de 
volgende tests uit:  
Een hoeveelheid van 0,5 ml van de te onderzoeken stof wordt met 
behulp van een injectiespuit op een gekarteld filterpapiertje gebracht en er wordt nagegaan of ontbranding of verkoling van het filterpapier 
optreedt binnen vijf minuten nadat de vloeistof werd aangebracht. De 
test wordt driemaal uitgevoerd, tenzij ontbranding of verkoling op ­
treedt.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEWERKING VAN DE RESULTATEN  
Het onderzoek mag worden gestaakt zodra een positief resultaat 
optreedt in één van de tests.  
2.2. BEOORDELING  
Indien de stof ontbrandt binnen vijf minuten na opbrengen op een 
inerte drager en blootstelling aan de lucht, of indien een vloeistof een filterpapiertje verkoolt of doet ontbranden binnen vijf minuten na opbrengen en blootstelling aan de lucht, wordt de stof beschouwd 
als zijnde pyrofoor.
 
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— een nauwkeurige specificatie van de stof (beschrijving en ver ­
ontreinigingen);  
— de resultaten van de tests;  
— iedere bijkomende opmerking betreffende de interpretatie van de 
resultaten.  
4. LITERATUUR  
(1) NF T 20-039, (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  EXPLOSIEGEVAAR  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
De methode omvat een testschema om vast te stellen of een pasta 
explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam (thermische 
gevoeligheid) of aan een schok of wrijving (mechanische gevoelig ­
heid) wordt blootgesteld, alsmede of een vloeistof explosiegevaar oplevert wanneer de stof aan een vlam of aan een schok wordt 
blootgesteld.
 
De methode bestaat uit drie delen:  
a) een test voor de thermische gevoeligheid (1);  
b) een test voor de mechanische gevoeligheid bij schokken (1);  
c) een test voor de mechanische gevoeligheid bij wrijving (1).  
De methode levert gegevens op waarmee de kans op ontstaan van 
een explosie door bepaalde veel voorkomende stimuli kan worden beoordeeld. De methode is niet bedoeld om vast te stellen of een stof onder om het even welke omstandigheden kan exploderen.
 
De methode is geschikt om te bepalen of een stof explosiegevaar 
oplevert (thermische en mechanische gevoeligheid) onder omstandig ­
heden zoals beschreven in de richtlijn. De methode is gebaseerd op een aantal soorten apparaten die internationaal op grote schaal wor ­
den gebruikt (1) en die doorgaans zinvolle resultaten geven. Erkend 
wordt dat de methode geen definitief uitsluitsel geeft. Andere ap ­
paratuur dan beschreven, mag worden gebruikt op voorwaarde dat deze internationaal erkend is en dat de resultaten afdoende getoetst 
kunnen worden aan de resultaten met de beschreven apparatuur.
 
De proeven hoeven niet te worden uitgevoerd indien uit de beschik ­
bare thermodynamische gegevens (vormingswarmte, ontledings ­
warmte) en/of afwezigheid van bepaalde reactieve groepen (2) in 
de structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld 
dat de stof niet snel kan ontleden onder productie van gassen of warmte (dat wil zeggen: het materiaal vertegenwoordigt geen enkel explosiegevaar). Een test op mechanische gevoeligheid voor wrijving 
is niet vereist voor vloeistoffen.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Als explosief worden gedefinieerd: stoffen die door de werking van 
een vlam kunnen ontploffen of die gevoelig zijn voor schokken en wrijving in de beschreven apparatuur (of die mechanisch gevoeliger zijn dan 1,3-dinitrobenzeen in andere apparatuur).
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Technisch, kristallijn 1,3-dinitrobenzeen gezeefd door 0,5 mm maas ­
wijdte, voor de wrijvings- en schok-methode.  
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX, hexogeen, cycloniet — 
CAS 121-82-4), geherkristalliseerd uit waterig cyclohexanon, nat gezeefd door een 250 μm zeef en op een 150 μm zeef en gedroogd 
bij 103 ± 2
 o C (gedurende 4 uur) voor de tweede reeks wrijvings- en 
schoktests.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Tot vaststelling van veilige omstandigheden voor het uitvoeren van 
de drie gevoeligheidstests zijn oriënterende proeven noodzakelijk.  
1.4.1.  Oriënterende proef (3)  
Om veiligheidsredenen worden voor het uitvoeren van de gevoelig ­
heidsbeproevingen zeer kleine monsters (ongeveer 10 mg) van de 
stof zonder afsluiting verwarmd in een gasvlam, blootgesteld aan 
schokken in een geschikt apparaat, en aan wrijving door middel van een hamer tegen een aambeeld of door middel van elk ander wrijvingstoestel. Het doel is vast te stellen of de stof zo gevoelig en 
explosiegevaarlijk is dat de voorgeschreven gevoeligheidstests, 
vooral die van thermische gevoeligheid, moeten worden uitgevoerd met speciale voorzorgen om aldus te voorkomen dat de onderzoeker gewond kan raken.
 
1.4.2.  Thermische gevoeligheid  
Bij deze methode wordt de stof verwarmd in een stalen buis, afge ­
sloten door afsluitplaten met openingen van verschillende doorsnede, 
om vast te stellen of de stof bij thermische belasting en goed ge ­
definieerde opsluiting kan ontploffen.  
1.4.3.  Mechanische gevoeligheid (schok)  
Bij deze methode wordt de stof aan een schok, veroorzaakt door een 
bepaalde massa vallend vanaf een bepaalde hoogte, onderworpen.  
1.4.4.  Mechanische gevoeligheid (wrijving)  
Bij deze methode wordt de vaste stof of pasta onder bepaalde om ­
standigheden van belasting en relatieve beweging onderworpen aan wrijving russen standaardoppervlakken.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Niet gegeven.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN  
1.6.1.  Thermische gevoeligheid (werking van een vlam)  
1.6.1.1.  Apparatuur  
Het apparaat bestaat uit een stalen buis, bestemd voor éénmalig 
gebruik, voorzien van een herbruikbare afsluitinrichting (figuur 1), 
die in een verwarmings- en beschermingstoestel wordt geplaatst. Elke buis is diep getrokken uit plaatstaal (zie aanhangsel) en heeft een inwendige doorsnede van 24 mm, een lengte van 75 mm en een 
wanddikte van 0,5 mm. Aan het open einde is de buis van een flens 
voorzien om afsluiting met de afsluitinrichting mogelijk te maken. De afsluitinrichting bestaat uit een drukbestendige ronde afsluitplaat met een gat in het midden, die met behulp van een tweedelige 
schroefverbinding (moer en kraag met schroefdraad) stevig op de 
buis wordt bevestigd. De moer en de kraag zijn gemaakt van chroommangaanstaal (zie aanhangsel) dat tot 800
 o C vonkvrij is. 
De afsluitplaten zijn 6 mm dik en gemaakt van hittebestendig staal 
(zie aanhangsel), en zijn verkrijgbaar in een reeks verschillende ope ­
ningsmaten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Testomstandigheden  
Normaal wordt de stof getest zoals hij verkregen werd, alhoewel het 
in sommige gevallen noodzakelijk kan zijn om de stof te testen na verpulvering, bijvoorbeeld indien hij geperst, gegoten of op andere 
wijze verdicht is.
 
Voor vaste stoffen wordt de hoeveelheid voor elke test te gebruiken 
materiaal bepaald met behulp van een twee-staps vulprocedure. Een gewogen buis wordt gevuld met 9 cm
 3 van de stof, waarna deze 
wordt aangedrukt met een kracht van 80 N verdeeld over de hele 
doorsnede van de buis. Om veiligheidsredenen of in gevallen waar de fysische vorm van het monster kan veranderen onder druk, mogen andere vulmethoden worden gebruikt; aandrukken is bijvoorbeeld 
niet geschikt als de stof zeer wrijvingsgevoelig is. Als de stof samen ­
drukbaar is wordt meer materiaal bijgevoegd en aangeperst met 80 N totdat de buis gevuld is tot op 55 mm van de bovenkant. De massa 
van de stof die gebruikt wordt om de buis te vullen tot op het niveau 
van 55 mm wordt bepaald, vervolgens worden nog twee porties met deze massa, en elk aangedrukt met een kracht van 80 N, ingebracht. Daarna wordt het materiaal of wel bijgevuld of wel verwijderd en 
aangedrukt totdat de buis gevuld is tot op een hoogte van 15 mm 
van de bovenkant. Een tweede stap in de vulprocedure wordt uitge ­
voerd met een aangedrukte massa die een derde bedraagt van de totale hoeveelheid die in de eerste poging werd bepaald. Er worden 
nog twee van deze hoeveelheden toegevoegd en elk onder 80 N 
aangedrukt, waarna het niveau van de stof wordt aangepast tot op 15 mm van de bovenkant door materiaal naar behoefte toe te voegen of weg te halen. Voor elke beproeving wordt nu de hoeveelheid 
vaste stof gebruikt, die in de tweede vulprocedure is vastgesteld, 
waarbij het vullen wordt uitgevoerd met drie gelijke porties die achtereenvolgens worden samengeperst tot 9 cm
 3 met de daartoe 
benodigde kracht (het samenpersen kan worden vereenvoudigd met 
behulp van tussenringen).  
Vloeistoffen en gels worden in de buis gebracht tot op een hoogte 
van 60 mm, waarbij zorg dient te worden gedragen dat bij het vullen met gel geen luchtbellen ontstaan. De buis wordt in de kraag ge ­
schoven, de juiste afsluitplaat wordt opgelegd en de moer wordt op 
de kraag geschroefd na het aanbrengen van een beetje smeermiddel op basis van molybdeendisulfide. Het is van essentieel belang te controleren dat er geen materiaal achterblijft tussen de moer, de 
plaat, en de schroefdraad.
 
De verwarming geschiedt met behulp van propaan uit een industriële 
cilinder voorzien van een drukregelaar (60 tot 70 mbar), dat via een meter door een verdeelstuk evenredig verdeeld wordt over vier branders 
(hetgeen visueel te controleren is aan de vlammen uit de branders). De 
branders worden rond de beproevingsruimte geplaatst zoals aangegeven in figuur 1. De vier branders hebben een gezamenlijk verbruik van ongeveer 3,2 liter propaan per minuut. Andere stookgassen of branders 
mogen gebruikt worden, maar de opwarmsnelheid moet verlopen zoals 
in figuur 3 aangegeven. Voor alle apparatuur dient de opwarmsnelheid periodiek gecontroleerd te worden met behulp van met diburylftalaat gevulde buizen zoals in figuur 3 is aangeduid.
 
1.6.1.3.  Uitvoering van de proeven  
Elke test wordt uitgevoerd totdat ofwel de buis gefragmenteerd is of 
de buis gedurende vijf minuten is verhit. Als de test resulteert in 
fragmentatie van de buis in drie of meer stukken, die soms nog aan elkaar zijn verbonden door smalle metaalstrookjes zoals geïllustreerd in figuur 2, wordt het resultaat beoordeeld als een opgetreden ex ­
plosie. Een testresultaat, waarbij minder of geen fragmenten ontstaan, 
wordt beschouwd als niet explosief.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Een reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 
6,0 mm doorsnede wordt uitgevoerd en, als geen explosies optreden, 
een tweede reeks van drie proeven met een afsluitplaat met een opening van 2,0 mm. Indien een explosie plaatsvindt in een van de twee proefreeksen, kunnen verdere tests achterwege blijven.
 
1.6.1.4.  Beoordeling  
Het testresultaat wordt als positief beschouwd als er een explosie 
plaatsvindt in een van bovenstaande testreeksen.  
1.6.2.  Mechanische gevoeligheid (schok)  
1.6.2.1.  Apparatuur (figuur 4)  
De belangrijkste onderdelen van een doorsnee valhamerapparaat zijn 
een gietstalen blok met voet, aambeeld, kolom, geleiders, valgewich ­
ten, een ontkoppelinrichting en een monsterhouder. Op het stalen blok van 230 mm lengte × 250 mm breedte × 200 mm hoogte 
met een gegoten voet van 450 mm lengte × 450 mm breedte × 
60 mm hoogte, zit het stalen aambeeld van 100 mm doorsnede × 70 mm hoogte vastgeschroefd. Aan de achterkant van het stalen blok is de houder geschroefd waarin de kolom, bestaande uit een naadloze 
getrokken stalen buis, is bevestigd. Vier schroeven verankeren het 
apparaat aan een massief betonnen blok van 60 × 60 × 60 cm in een zodanige positie dat de geleiderbalken volkomen verticaal staan en het valgewicht vrij kan vallen. Gewichten van 5 en 10 kg massief 
staal kunnen worden gebruikt. Het slagoppervlak van de gewichten 
bestaat uit getemperd staal, HRC 60 tot 63, met een minimumdoor ­
snede van 25 mm.
 
Het te onderzoeken monster wordt gevat in een schokbeproevingsvat 
dat bestaat uit twee massieve, in het verlengde boven elkaar liggende stalen cilinders omhuld door een holle stalen geleidecilinder. De massief stalen cilinders hebben een doorsnede van 10 (- 0,003; - 
0,005) mm en een hoogte van 10 mm, gepolijste oppervlakken, 
afgeronde zijvlakken (rondingsstraal 0,5 mm) en een hardheid van HRC 58 tot 65. De holle cilinder heeft een uitwendige diameter van 16 mm, een gepolijste binnenkant met een doorsnede van 10 (+ 
0,005; + 0,010) mm en een hoogte van 13 mm. Het beproevingsvat 
wordt vastgezet op een stalen tussenaambeeld (26 mm doorsnede en 26 mm hoogte) en wordt gecentreerd door een ring met perforaties via welke de explosiegassen kunnen worden afgevoerd.
 
1.6.2.2.  Testomstandigheden  
Het monstervolume dient 40 mm  3 te bedragen of overeen te komen 
met het vulvolume in een alternatief apparaat. Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en worden als volgt voor ­
bewerkt:
 
a) poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); 
alles wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;  
b) samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen wor ­
den in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie van 0,5 tot 1 mm doorsnede wordt gebruikt voor de test en dient represen ­
tatief te zijn voor de oorspronkelijke stof.
 
Stoffen die normaal gezien geleverd worden als pasta's zouden, in de 
mate van het mogelijke, moeten worden getest in droge staat of, in ieder geval, na het zoveel mogelijk verwijderd hebben van vloeistof. 
Vloeistoffen worden onderzocht met een spleet van 1 mm tussen de 
bovenste en de onderste stalen cilinder.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Uitvoering van de proeven  
Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd waarbij men het ge ­
wicht van 10 kg van een hoogte van 0,40 m (40 J) laat vallen. Indien een explosie wordt verkregen in de reeks met 40 J moet een extra 
reeks van zes proeven worden uitgevoerd waarbij men 5 kg van 
0,15 m (7,5 J) laat vallen. In andere apparaten wordt het monster vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde pro ­
cedure (bijvoorbeeld op-en-neer techniek, enz.).
 
1.6.2.4.  Beoordeling  
Het testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste éénmaal 
in een van de proeven een explosie (ontbranden en/of een knal staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven slagapparaat of als het monster in een alternatieve slagproef gevoeliger is dan 1,3-dinitro ­
benzeen of RDX.
 
1.6.3.  Mechanische gevoeligheid (wrijving)  
1.6.3.1.  Apparatuur (figuur 5)  
Het wrijvingsapparaat bestaat uit een gietstalen grondplaat waarop 
het eigenlijke wrijvingstoestel gemonteerd is. Het wrijvingstoestel 
bestaat uit een vaste porseleinen pen en een bewegende porseleinen 
plaat. De porseleinen plaat zit vast in een slede welke tussen twee geleiders beweegt. De slede wordt via een aandrijfstang, een excen ­
trische nok en een geschikt drijfwerk op zodanige wijze met een 
elektromotor verbonden, dat de porseleinen plaat slechts éénmaal 
onder de porseleinen pen heen en weer wordt bewogen over een afstand van 10 mm. De porseleinen pen kan belast worden met bijvoorbeeld 120 of 360 newton.
 
De vlakke porseleinen platen worden van wit technisch porselein 
(oppervlakteruwheid tussen 9 en 32 μm) gemaakt en zijn 25 mm 
lang, 25 mm breed en 5 mm hoog. De cylindrische porseleinen pen wordt eveneens van wit technisch porselein gemaakt, is 15 mm lang, 
heeft een doorsnede van 10 mm en bolvormige uiteinden met een 
rondingsstraal van 10 mm, en geruwd oppervlak.
 
1.6.3.2.  Testomstandigheden  
Het monstervolume dient 10 mm  3 te bedragen of overeen te komen 
met het vulvolume in een alternatief apparaat.  
Vaste stoffen dienen in droge toestand te worden onderzocht en 
worden als volgt voorbewerkt:  
a) poedervormige stoffen worden gezeefd (maaswijdte 0,5 mm); al ­
les wat de zeef doorlaat, wordt voor de test gebruikt;  
b) samengeperste, gegoten of op andere wijze verdichte stoffen wor ­
den in stukken gebroken en gezeefd; de zeeffractie kleiner dan 0,5 mm wordt gebruikt voor de test.
 
Stoffen die gewoonlijk als pasta's geleverd zouden worden, moeten, 
in de mate van het mogelijke, in droge staat worden getest. Wanneer de stoffen niet in droge staat kunnen worden bereid, wordt de pasta (na het zoveel mogelijk verwijderen van vloeistof) getest als een 
0,5 mm dikke, 2 mm brede en 10 mm lange plak, bereid met behulp 
van een mal.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Uitvoering van de proeven  
De porseleinen pen wordt op het te onderzoeken monster geplaatst 
en de belasting wordt aangebracht. Tijdens de test moeten de groe ­
ven van de porseleinen plaat loodrecht op de bewegingsrichting 
liggen. Er moet goed op worden gelet dat de pen op het monster 
rust, dat voldoende van de te onderzoeken stof onder de pen ligt en dat de plaat op de juiste wijze onder de pen doorbeweegt. Voor pasta's wordt een 0,5 mm dikke mal met een gleuf van 2 bij 
10 mm gebruikt om de pasta op de plaat aan te brengen. De porse ­
leinen plaat moet in 0,44 seconden onder de porseleinen pen heen en weer bewegen over een afstand van 10 mm. De pen en elk gedeelte 
van het oppervlak mogen slechts voor één test worden gebruikt; de 
twee uiteinden van de pen kunnen dus dienen voor twee proeven en de twee oppervlakken van de plaat elk voor drie proeven.
 
Een reeks van zes proeven wordt uitgevoerd met 360 N belasting. 
Als een positief resultaat wordt verkregen tijdens deze zes proeven, moet een tweede reeks van zes proeven worden uitgevoerd met 120 N belasting. Bij gebruik van andere apparatuur wordt het monster 
vergeleken met de gekozen referentiestof via een vastgestelde pro ­
cedure (bijvoorbeeld op-en-neer-techniek, enz.).
 
1.6.3.4.  Beoordeling  
Het testresultaat wordt als positief beschouwd als ten minste in één 
van de proeven een explosie (knetteren en/of een knal of ontbranden 
staan hiermee gelijk) plaatsvindt met het beschreven wrijvingsappa ­
raat of als aan gelijkwaardige eisen voldaan wordt in andere wrij ­
vingsapparatuur.  
2. GEGEVENS  
In beginsel wordt in de zin van deze richtlijn aan een stof of preparaat 
explosiegevaar toegeschreven indien een positief resultaat wordt ver ­
kregen in de thermische-, schok- of wrijvingsgevoeligheidstest.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTRAPPORT  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— de identiteit, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de 
onderzochte stof;  
— de fysische vorm van het monster, en of het al dan niet werd 
verpulverd, gebroken en/of gezeefd;  
— waarnemingen tijdens de thermische-gevoeligheidstests (bijvoor ­
beeld de monstermassa, aantal fragmenten, enz.);  
— waarnemingen tijdens de mechanische-gevoeligheidstests (bij ­
voorbeeld de vorming van grote hoeveelheden rook of complete 
ontleding zonder knal, vlammen, vonken, knallen, knetteren, enz.);
 
— de resultaten van elke soort test;  
— indien afwijkende apparatuur is gebruikt, moet dit op weten ­
schappelijke gronden worden gerechtvaardigd; bovendien moet 
de correlatie tussen meetresultaten met de afwijkende apparatuur 
en de hierboven beschreven apparatuur bewezen worden;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— eventueel nuttige opmerkingen, zoals verwijzing naar proeven 
met soortgelijke producten, die van belang kunnen zijn voor 
een correcte interpretatie van de resultaten;  
— alle aanvullende opmerkingen die van belang kunnen zijn voor 
een goede interpretatie van de resultaten.  
3.2. INTERPRETATIE EN BEOORDELING VAN DE RESULTATEN  
In het testrapport moet worden vermeld welke resultaten als onjuist, 
afwijkend of niet-representatief worden beschouwd. Indien een van 
de resultaten moet worden verworpen, dient een toelichting én de 
resultaten van alle alternatieve of aanvullende proeven te worden gegeven. Indien een afwijkend resultaat niet kan worden verklaard, moet het worden aanvaard en gebruikt om de stof overeenkomstig in 
te delen.
 
4. LITERATUUR  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H., en Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 en 30-42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — 
Determination of explosive risk.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Aanhangsel  
Voorbeeld van materiaalspecificatie voor thermische-gevoeligheidstest (zie 
DIN 1623)  
(1) Buis: Materiaalspecificatie nr. 1.0336.505 g  
(2) Afsluitplaat: Materiaalspecificatie nr. 1.4873  
(3) Getapte kraag en moer: Materiaalspecificatie nr. 1.3817  
Figuur 1  
Apparatuur voor de thermische-gevoeligheidstest  
(Alle afmetingen in mm)
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figuur 2  
Thermische-gevoeligheidstest  
(Voorbeelden van fragmentatie)
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figuur 3  
IJking voor opwarmsnelheid in de thermische-gevoeligheidstest
  
Temperatuur/tijd-curve verkregen door verhitting van dibutylftalaat (27 cm  3 ) in een gesloten 
(1,5 mm afsluitplaat) buis met behulp van een propaandebiet van circa 3,2 liter/minuut. De 
temperatuur wordt gemeten met een chromel/alumel thermokoppel, roestvrijstalen omhulsel van 
1 mm doorsnede, in het midden van de buis geplaatst op 43 mm onder de rand. De opwarm ­
snelheid in het bereik van 135  o C tot 285  o C moet tussen 185 en 215 K/minuut liggen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figuur 4  
Schokgevoeligheidstest  
(Afmetingen in mm)
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figuur 4  
Vervolg
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figuur 5  
Wrijvingsgevoeligheidstest
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR (VLOEISTOFFEN EN 
GASSEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Explosieve stoffen en stoffen die spontaan ontbranden in aanraking 
met lucht bij kamertemperatuur moeten niet onderworpen worden aan dit onderzoek. De testprocedure is van toepassing op gassen, vloeistoffen en dampen die in aanwezigheid van lucht door een 
heet oppervlak tot ontbranding kunnen worden gebracht.
 
De temperatuur waarbij zelfontbranding optreedt, kan aanzienlijk 
worden verlaagd door de aanwezigheid van katalytische verontreini ­
gingen, door het oppervlakmateriaal, of door een groter volume van het proefvat.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De mate van zelfontbranding wordt uitgedrukt in de zelfontbran ­
dingstemperatuur. De zelfontbrandingstemperatuur is de laagste tem ­
peratuur waarbij de te onderzoeken stof gemengd met lucht tot ont ­
branding komt onder omstandigheden zoals beschreven in deze test ­
methode.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
De referentiestoffen worden beschreven in de normen (zie 1.6.3). 
Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om de werking van 
de methode regelmatig te controleren en om vergelijking met resul ­
taten van andere methoden mogelijk te maken.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De methode bepaalt de laagste temperatuur van het binnenoppervlak 
van een vat, die leidt tot ontbranding van een in het vat geïnjec ­
teerd(e) gas, damp, of vloeistof.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De reproduceerbaarheid is afhankelijk van het temperatuurgebied 
waarin de zelfontbranding optreedt, en van de gebruikte testmethode.  
De gevoeligheid en specificiteit zijn afhankelijk van de gebruikte 
testmethode.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
De apparatuur wordt beschreven in de onder 1.6.3 genoemde me ­
thode.  
1.6.2.  Testomstandigheden  
De te onderzoeken stof wordt onderzocht volgens de methode be ­
schreven onder 1.6.3.  
1.6.3.  Uitvoering van de test  
Zie: IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF 
T 20-037.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. GEGEVENS  
Registreer de testtemperatuur, de atmosferische druk, de gebruikte 
hoeveelheid stof en de tijdsduur tot ontbranding.  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrij ­
ving en verontreinigingen);  
— de gebruikte hoeveelheid stof en de atmosferische druk;  
— de gebruikte apparatuur;  
— de resultaten van metingen (testtemperaturen, resultaten met be ­
trekking tot ontbranding en bijbehorende tijdsduur);  
— alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie 
van de resultaten.  
4. LITERATUUR  
Geen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  RELATIEVE ZELFONTBRANDINGSTEMPERATUUR VAN 
VASTE STOFFEN  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Explosiegevaarlijke stoffen en stoffen die in contact met lucht bij 
kamertemperatuur spontaan ontbranden, moeten niet aan deze test worden onderworpen.
 
Deze test geeft oriënterende informatie over de zelfontbrandbaarheid 
van vaste stoffen bij verhoogde temperatuur.  
Indien de warmte, die vrijkomt bij reactie van de stof met zuurstof of 
bij exotherme ontleding, niet snel genoeg aan de omgeving wordt afgegeven, vindt zelfopwarming en uiteindelijk zelfontbranding 
plaats. Zelfontbranding kan dus slechts optreden als de snelheid 
van de warmteproductie groter is dan die van het warmteverlies.
 
De testprocedure is bruikbaar als een oriënterende proef voor vaste 
stoffen. Omdat de ontsteking en verbranding van vaste stoffen inge ­
wikkelde processen zijn, mag de volgens deze testmethode bepaalde 
zelfontbrandingstemperatuur alleen voor vergelijkingsdoeleinden 
worden gebruikt.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De zelfontbrandingstemperatuur, die met deze methode verkregen 
wordt, is de laagste omgevingstemperatuur in  o C waarbij een bepaald 
volume van een stof onder welbepaalde omstandigheden ontbrandt.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Niet gegeven.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Een bepaald volume van de te onderzoeken stof wordt bij kamer ­
temperatuur in een oven geplaatst; het temperatuurverloop in het 
midden van het monster wordt als functie van de tijd geregistreerd, terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5
 o C/­
minuut wordt opgevoerd tot 400  o C of tot de smelttemperatuur in ­
dien deze lager is. Voor het doel van deze test wordt de temperatuur 
van de oven, waarbij de temperatuur van het monster door zelf ­
opwarming 400  o C bereikt, de zelfontbrandingstemperatuur ge ­
noemd.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Niet gegeven.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
1.6.1.1.  Oven  
Een laboratoriumoven van ongeveer 2 liter, waarvan het tempera ­
tuurverloop lineair geregeld kan worden, en voorzien van natuurlijke luchtcirculatie en explosieontlasting. Teneinde eventueel explosie ­
gevaar te vermijden, moet voorkomen worden dat ontledingsgassen 
in contact kunnen komen met de elektrische verwarmingselementen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Gazen kubus  
Een stuk roestvrij staalgaas met openingen van 0,045 mm moet 
worden uitgeknipt volgens het patroon van figuur 1. Het gaas wordt gevouwen en met draad vastgemaakt in de vorm van een kubus met 
open bovenkant.
 
1.6.1.3.  Thermokoppels  
Geschikte thermokoppels.  
1.6.1.4.  Recorder  
Tweekanaalsrecorder, gecalibreerd van 0 tot 600  o C of hiermee over ­
eenkomstige spanning.  
1.6.2.  Testomstandigheden  
De stoffen worden getest zoals ontvangen.  
1.6.3.  Uitvoering van de test  
De kubus wordt gevuld met de te onderzoeken stof waarbij onder 
zachtjes tikken zoveel stof toegevoegd wordt dat de kubus volledig 
gevuld is. Vervolgens wordt de kubus bij kamertemperatuur midden 
in de oven gehangen. Het ene thermokoppel wordt in het middelpunt van de kubus gebracht en het tweede tussen de kubus en de oven ­
wand om de oventemperatuur te registreren.
 
De temperaturen van de oven en van het monster worden continu 
geregistreerd terwijl de temperatuur van de oven met een snelheid van 0,5
 o C/min wordt opgevoerd tot 400  o C of tot de smelttempe ­
ratuur indien deze lager is dan 400  o C. 
Wanneer de stof reageert, zal het thermokoppel in het monster een 
scherpe temperatuursstijging boven de oventemperatuur te zien geven.  
2. GEGEVENS  
De oventemperatuur, waarbij de temperatuur van het monster door 
zelfopwarming 400  o C bereikt, is van belang voor de beoordeling 
(zie figuur 2).  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— een beschrijving van de onderzochte stof;  
— de meetresultaten inclusief de temperatuur/tijd-grafiek;  
— alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor interpretatie 
van de resultaten.  
4. LITERATUUR  
(1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figuur 1  
Patroon van de testkubus met ribben van 20 mm
  
Figuur 2  
Karakteristieke temperatuur/tijd-curve
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VASTE STOFFEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Het is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken 
over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te 
onderzoeken stof.  
Deze test is niet toepasbaar op vloeistoffen en gassen, explosieve of 
licht ontvlambare vaste stoffen of organische peroxiden.  
Deze test hoeft niet uitgevoerd te worden als op grond van de 
structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof.
 
Teneinde vast te stellen of voor deze test speciale voorzorgsmaat ­
regelen nodig zijn, moet een oriënterende proef worden uitgevoerd.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Brandduur : de tijd in seconden die de reactiezone nodig heeft 
om zich langs een rups stof te verplaatsen, volgens de werkwijze 
van 1.6.  
Brandsnelheid : de bijbehorende snelheid in mm/s.  
Maximale brandsnelheid : de hoogste waarde van de brandsnelheden 
van mengsels die 10 tot 90 gewichtsprocent oxiderende stof bevat ­
ten. 
1.3. REFERENTIESTOF  
Als referentiestof voor de test en de oriënterende proef wordt bari ­
umnitraat (analytisch zuiver) gebruikt.  
Het referentiemengsel is het volgens 1.6 bereide mengsel van bari ­
umnitraat en poedervormige cellulose, dat de grootst mogelijke 
brandsnelheid heeft (doorgaans een mengsel met 60 gewichtsprocent bariumnitraat).
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Met het oog op de veiligheid wordt een oriënterende proef uitge ­
voerd. Verdere onderzoeken zijn onnodig wanneer uit de oriënte ­
rende proef overduidelijk blijkt dat de te onderzoeken stof oxide ­
rende eigenschappen heeft. In andere gevallen wordt de stof aan het 
volledige onderzoek onderworpen.  
In het volledige onderzoek wordt de te onderzoeken stof in verschil ­
lende verhoudingen gemengd met een bepaalde brandbare stof. Van 
ieder mengsel wordt een rups gevormd en deze wordt aan één uit ­
einde aangestoken. De maximale brandsnelheid wordt bepaald en vergeleken met de maximale brandsnelheid van het referentiemeng ­
sel.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Indien nodig kunnen de stoffen op willekeurige wijze worden ge ­
malen en gemengd, mits de maximale brandsnelheden uit de zes 
verschillende bepalingen niet meer dan 10 % verschillen van hun 
rekenkundige gemiddelde.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.6.1.  Voorbereiding  
1.6.1.1.  Teststof  
De deeltjesgrootte van het te onderzoeken monster wordt als volgt 
tot minder dan 0,125 mm verkleind: de stof wordt gezeefd en de 
overblijvende fractie gemalen; deze handelingen worden herhaald totdat de gehele portie door de zeef is gegaan.
 
Iedere methode voor malen en zeven kan worden gebruikt, zolang 
aan de kwaliteitscriteria is voldaan.  
Vóór het bereiden van het mengsel wordt de stof eerst tot constant 
gewicht gedroogd bij 105  o C. Indien de ontledingstemperatuur van 
de te onderzoeken stof beneden 105  o C ligt, wordt de stof bij een 
lagere temperatuur gedroogd.  
1.6.1.2.  Brandbare stof  
Poedervormige cellulose wordt gebruikt als brandbare stof. De cel ­
lulose moet het soort zijn dat wordt gebruikt bij dunne-laagchroma ­
tografie of kolomchromatografie. Een type waarbij meer dan 85 % 
van de vezels een lengte hebben tussen 0,020 en 0,075 mm is geschikt gebleken. Het cellulosepoeder wordt gezeefd door een zeef met openingen van 0,125 mm. Eén en dezelfde voorbewerkte 
batch cellulose wordt gebruikt gedurende de hele proef.
 
Vóór het bereiden van het mengsel wordt de poedervormige cellu ­
lose bij 105  o C tot constant gewicht gedroogd.  
Indien in de oriënterende proef houtmeel wordt gebruikt, wordt het 
houtmeel van naaldhout gebruikt dat door een zeef met openingen van 1,6 mm valt; het gezeefde houtmeel wordt grondig gemengd en vervolgens vier uur bij 105
 o C gedroogd in een laag van maximaal 
25 mm dikte. Na afkoelen wordt het houtmeel in een luchtdicht vat 
dat zover mogelijk gevuld is, bewaard tot het ogenblik waarop het wordt gebruikt, zo mogelijk binnen 24 uur na het drogen.
 
1.6.1.3.  Ontstekingsbron  
Als ontstekingsbron dient de hete vlam van een gasbrander (mini ­
male diameter 5 mm). Indien een andere ontstekingsbron wordt ge ­
bruikt (bijvoorbeeld bij proeven in een inerte atmosfeer), moeten 
beschrijving, redenen en geschiktheid worden gerapporteerd.  
1.6.2.  Uitvoering van de test  
Opmerking:  
In verband met mogelijk explosiegevaar moeten mengsels van oxi ­
derende stoffen en cellulose of houtmeel met de nodige voorzichtig ­
heid worden behandeld.  
1.6.2.1.  Oriënterende proef  
Twee gewichtsdelen gedroogde stof worden grondig gemengd met 
één gewichtsdeel cellulose of houtmeel. Van het mengsel wordt, bijvoorbeeld met behulp van een glazen trechter waarvan de steel 
is dichtgestopt, zonder aandrukken een kegelvormig hoopje gemaakt 
met een basisdiameter van 3,5 cm en een hoogte van 2,5 cm.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Het hoopje wordt op een koude onbrandbare, niet poreuze en slecht 
warmtegeleidende grondplaat geplaatst. De oriënterende proef moet 
worden uitgevoerd in een zuurkast zoals beschreven in 1.6.2.2.  
De ontstekingsbron wordt in contact gebracht met het hoopje stof. 
De heftigheid en de duur van de reactie worden geobserveerd en 
geregistreerd.  
De stof kan worden aangemerkt als oxiderend als de reactie heftig 
verloopt.  
Zodra het resultaat aanleiding geeft tot enige twijfel, dient de hier ­
onder beschreven volledige test te worden uitgevoerd.  
1.6.2.2.  Volledig onderzoek  
Er worden mengsels van de oxiderende stof en de brandbare stof 
gemaakt, waarbij het gehalte oxiderende stof in stappen van 10 
gewichtsprocenten oploopt van 10 tot 90 gewichtsprocenten. In 
grensgevallen moeten tussenliggende mengverhoudingen worden be ­
reid, zodat de maximale brandsnelheid nauwkeuriger kan worden bepaald.
 
Er wordt een rupsstof gevormd met behulp van een mal. Deze mal is 
van metaal, heeft een lengte van 250 mm en een driehoekige door ­
snede met een hoogte van 10 mm en een basis van 20 mm. Aan 
weerszijden van de mal worden in de lengterichting twee metalen platen aangebracht die 2 mm boven de driehoekige doorsnede uit ­
steken (zie figuur). De mal wordt zonder aandrukken gevuld met een 
kleine overmaat van het mengsel. Na de mal eenmaal van een hoogte 
van 2 cm op een vast oppervlak te hebben laten vallen, wordt de overmaat mengsel met een schuingehouden blad weggeveegd. De zijstroken worden verwijderd en het overblijvende poeder wordt 
met een rol glad gestreken. Ten slotte wordt bovenop de mal een 
vuurvaste, niet poreuze en slecht warmtegeleidende plaat gelegd, het geheel wordt omgekeerd en de mal verwijderd.
 
De rups wordt in de zuurkast geplaatst in een richting loodrecht op 
de richting van de trek.  
De luchtsnelheid moet voldoende zijn om te verhinderen dat ver ­
brandingsgassen naar de laboratoriumruimte ontsnappen; de lucht ­
snelheid mag gedurende de test niet veranderd worden. De appara ­
tuur moet worden omgeven door een tochtscherm.  
In verband met de hygroscopische eigenschappen van cellulose en 
sommige te onderzoeken stoffen moet de test zo snel mogelijk wor ­
den uitgevoerd.  
Eén uiteinde van de rups wordt aangestoken door aanraking met de 
vlam.  
De brandduur wordt gemeten over een lengte van 200 mm, nadat de 
reactiezone reeds een beginafstand van 30 mm heeft afgelegd.  
De test wordt uitgevoerd met de referentiestof en vervolgens ten 
minste éénmaal met elk mengsel uit de reeks van de te onderzoeken stof en cellulose.
 
Indien een maximale brandsnelheid wordt waargenomen die aanzien ­
lijk hoger is dan de maximale brandsnelheid van het referentiemeng ­
sel, kan de test worden gestaakt; zo niet, dan moet de test vijfmaal 
worden herhaald met de drie mengsels die de hoogste brandsnelheid 
opleverden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Indien men vermoedt dat het resultaat vals positief is, moet de test 
herhaald worden met een inerte stof met een zelfde deeltjesgrootte, 
zoals kiezelgoer, in plaats van cellulose. Ook kan het mengsel te onderzoeken stof/cellulose, dat de grootste verbrandingssnelheid heeft, opnieuw getest worden in een inerte atmosfeer (< 2 % v/v 
zuurstofgehalte).
 
2. GEGEVENS  
Om veiligheidsredenen moet de hoogste brandsnelheid — en niet de 
gemiddelde waarde — worden beschouwd als kenmerk voor de oxiderende eigenschappen van de stof.
 
De hoogste waarde van de brandsnelheid binnen een serie van zes 
metingen voor één bepaald mengsel geldt voor de beoordeling.  
Maak een grafiek waarin de hoogste waarde van de brandsnelheid 
van ieder mengsel wordt uitgezet tegen de concentratie van de oxi ­
derende stof in ieder mengsel; bepaal uit deze grafiek de maximale 
brandsnelheid.  
De zes waarden van de brandsnelheid, in een serie van zes metingen 
op het mengsel met de hoogste brandsnelheid, mogen niet meer dan 10 % afwijken van hun rekenkundig gemiddelde; anders moeten de 
gebruikte methoden voor malen en mengen verbeterd worden.
 
Vergelijk de verkregen maximale brandsnelheid met de maximale 
brandsnelheid van het referentiemengsel (zie 1.3).  
Als tests worden uitgevoerd in een inerte atmosfeer, moet de maxi ­
male reactiesnelheid worden vergeleken met die van het referentie ­
mengsel in een inerte atmosfeer.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— beschrijving, samenstelling, zuiverheid, vochtgehalte, enz. van de 
onderzochte stof;  
— eventuele voorbehandeling van de onderzochte stof (bijvoorbeeld 
malen, drogen enz.)  
— de in de onderzoeken gebruikte ontstekingsbron;  
— de resultaten van de metingen;  
— de wijze van reactie (bijvoorbeeld een „flashverbranding” aan het 
oppervlak of een verbranding door de gehele massa, eventuele 
informatie met betrekking tot de verbrandingsproducten enz.);  
— alle verdere opmerkingen die van belang zijn voor de interpreta ­
tie van de resultaten, inclusief een beschrijving van de heftigheid (vlammen, vonken, rook, smeulen, en dergelijke) en een schat ­
ting van de brandduur van de oriënterende proef, zowel voor de 
teststof als voor de referentiestof;
 
— de resultaten van proeven met een inerte stof, indien van toepas ­
sing;  
— de resultaten van proeven in een inerte atmosfeer, indien van 
toepassing.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Een stof wordt aangemerkt als een oxiderende stof wanneer:  
a) er in de oriënterende proef een heftige reactie optreedt;  
b) in de volledige test de maximale brandsnelheid van de onder ­
zochte mengsels groter is dan of gelijk is aan de maximale brand ­
snelheid van het referentiemengsel van cellulose en bariumnitraat.  
Om vals positieve resultaten te vermijden, dient bij het verwerken 
van de resultaten ook rekening gehouden te worden met de resultaten verkregen bij het testen van stof gemengd met inert materiaal en/of 
in een inerte atmosfeer.
 
4. LITERATUUR  
(1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Aanhangsel  
Figuur  
Mal en toebehoren voor de bereiding van de rups  
(Afmetingen in mm)
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  AANTALGEMIDDELD MOLECUULGEWICHT EN MOLE ­
CUULGEWICHTSVERDELING VAN POLYMEREN  
1. METHODE  
Deze methode voor gelpermeatiechromatografie is overgenomen van 
TG 118 van de OESO (1996). Voor de fundamentele beginselen en 
nadere technische informatie wordt verwezen naar de referenties.  
1.1. INLEIDING  
Aangezien de eigenschappen van polymeren zo sterk uiteenlopen, is 
het onmogelijk een enkele methode te beschrijven waarin voor alle mogelijkheden en specifieke gevallen bij de scheiding van poly ­
meren exact de omstandigheden voor scheiding en evaluatie worden 
aangegeven. Met name complexe polymeersystemen komen vaak niet in aanmerking voor gelpermeatiechromatografie (GPC). Wan ­
neer GPC niet uitvoerbaar is, kan het molecuulgewicht met behulp 
van andere methoden worden bepaald (zie bijlage). In dat geval moet 
een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gegeven.
 
De hier beschreven methode is gebaseerd op de norm DIN 
55672 (1). Deze norm bevat gedetailleerde informatie over de wijze 
waarop de experimenten moeten worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geëvalueerd. Wanneer veranderingen in de wijze van uitvoering nodig zijn, moet daarvoor een motivering worden gege ­
ven. Ook andere normen kunnen worden gebruikt, mits de referenties 
volledig worden vermeld. In de beschreven methode worden voor de kalibratie polystyreenmonsters met een bekende polydispersiteit ge ­
bruikt en wijzigingen kunnen nodig zijn om de methode geschikt te 
maken voor bepaalde polymeren zoals in water oplosbare polymeren 
en vertakte polymeren met een lange keten.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Het aantalgemiddeld molecuulgewicht (M  n ) en het gewichtgemiddeld 
molecuulgewicht (M  w ) worden bepaald met behulp van de volgende 
vergelijkingen: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
waarbij  
H i = de hoogte van het detectorsignaal vanaf de basislijn bij het 
retentievolume V  i ; 
M i = het molecuulgewicht van de polymeerfractie bij het retentie ­
volume V  i ; 
N = het aantal meetpunten.  
De verhouding M  w /M n is de breedte van de molecuulgewichtsver ­
deling, die een maat is voor de dispersiteit van het systeem.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Aangezien GPC een relatieve methode is, moet het systeem worden 
gekalibreerd. Als standaard worden normaal gesproken fijn verdeelde lineair opgebouwde polystyreenmonsters gebruikt met bekende ge ­
middelde molecuulgewichten (M
 n en M  w ) en een bekende molecuul ­
gewichtsverdeling. De kalibratiecurve kan alleen voor de bepaling van het molecuulgewicht van het onbekende monster worden ge ­
bruikt als de omstandigheden voor de scheiding van het monster 
en de standaards op identieke wijze zijn gekozen.
 
Een tijdens een bepaald experiment vastgesteld verband tussen het 
molecuulgewicht en het elutievolume is alleen onder de specifieke 
omstandigheden van dat experiment geldig. Daarbij gaat het vooral 
om de temperatuur, het oplosmiddel (of het oplosmiddelenmengsel), de omstandigheden tijdens chromatografie en de kolom of het ko ­
lomsysteem waarop de scheiding is uitgevoerd.
 
Een op deze manier bepaald molecuulgewicht van het monster is 
relatief en wordt beschreven als een „polystyreenequivalent mole ­
cuulgewicht”. Dit houdt in dat het molecuulgewicht afhankelijk 
van de structurele en chemische verschillen tussen het monster en de standaard in meer of mindere mate van de absolute waarde kan afwijken. Als een andere standaard wordt gebruikt, zoals polyethy ­
leenglycol, polyethyleenoxide, polymethylmethacrylaat of polyacryl ­
zuur, moet de reden daarvan worden vermeld.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Zowel de molecuulgewichtsverdeling van het monster als het gemid ­
delde molecuulgewicht (M  n of M  w ) kan met behulp van GPC wor ­
den bepaald. GPC is een speciaal soort vloeistofchromatografie waar ­
bij het monster aan de hand van het hydrodynamische volume van de verschillende bestanddelen wordt gescheiden (2).
 
De scheiding voltrekt zich tijdens de passage van het monster door 
een kolom die met een poreus materiaal, meestal een organische gel, is gevuld. Kleine moleculen kunnen de poriën binnendringen, terwijl grote moleculen dit niet kunnen. Grote moleculen volgen dan ook 
een kortere weg en worden het eerste geëlueerd. Middelgrote mole ­
culen kunnen sommige poriën binnendringen en worden later ge ­
ëlueerd. De kleinste moleculen, waarvan de gemiddelde hydrodyna ­
mische straal kleiner is dan de poriën van de gel, kunnen alle poriën 
binnendringen. Deze worden het laatst geëlueerd.
 
In het ideale geval wordt de scheiding uitsluitend door de grootte 
van het molecuul bepaald, maar enige storing door absorptie-effecten 
is in de praktijk vrijwel niet te voorkomen. Een ongelijkmatige pak ­
king van de kolom en dode ruimten kunnen de situatie nog ongun ­
stiger maken (2).  
Detectie gebeurt aan de hand van bijvoorbeeld de brekingsindex of 
uv-absorptie en levert een eenvoudige verdelingskromme op. Om echte waarden voor het molecuulgewicht aan de kromme te kunnen toekennen, moet de kolom echter worden gekalibreerd met behulp 
van polymeren met een bekend molecuulgewicht en liefst een in 
grote lijnen vergelijkbare structuur, bijvoorbeeld een aantal polysty ­
reenstandaards. Meestal levert dit een gausscurve op, soms met een kleine staart aan de kant van de lage molecuulgewichten, waarbij op 
de verticale as de geëlueerde hoeveelheid in gewicht wordt uitgezet 
en op de horizontale as de logaritme van het molecuulgewicht.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De herhaalbaarheid (relatieve standaardafwijking) van het elutie ­
volume moet beter zijn dan 0,3 %. Indien een chromatogram tijd ­
afhankelijk wordt geëvalueerd en niet aan dit criterium voldoet, moet 
door correctie met behulp van een interne standaard de vereiste her ­
haalbaarheid van de analyse worden gewaarborgd (1). De polydis ­
persiteit is afhankelijk van het molecuulgewicht van de standaard. Normale waarden voor polystyreenstandaards zijn: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p is het molecuulgewicht van de standaard bij de top van de piek).  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Bereiding van de polystyreenstandaardoplossingen  
De polystyreenstandaard wordt opgelost door deze zorgvuldig te 
mengen in de gekozen elutievloeistof. Bij de bereiding van de op ­
lossingen moet rekening worden gehouden met de aanbevelingen van de fabrikant.
 
De concentratie van de standaardoplossingen wordt bepaald aan de 
hand van verschillende factoren, zoals het geïnjecteerde volume, de viscositeit van de oplossing en de gevoeligheid van de detector. Het 
maximale geïnjecteerde volume moet aan de lengte van de kolom 
worden aangepast om overlading te voorkomen. Voor een scheiding met behulp van GPC over een kolom van 30 cm × 7,8 mm wordt meestal een volume van 40 tot 100 μl geïnjecteerd. Grotere volumes 
zijn mogelijk, maar niet groter dan 250 μl. De optimale verhouding 
tussen het geïnjecteerde volume en de concentratie moet vóór de kalibratie van de kolom worden bepaald.
 
1.6.2.  Bereiding van de monsteroplossing  
In beginsel gelden voor de bereiding van de monsteroplossingen 
dezelfde eisen. Het monster wordt door zorgvuldig schudden opge ­
lost in een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld tetrahydrofuraan 
(THF). Het mag in geen geval met behulp van een ultrasoon bad 
worden opgelost. Indien nodig, wordt de monsteroplossing gezuiverd over een membraanfilter met een poriegrootte tussen 0,2 en 2 μm.
 
Indien de oplossing onopgeloste deeltjes bevat, moet dit in het eind ­
verslag worden vermeld, aangezien deze door hoogmoleculaire be ­
standdelen kunnen ontstaan. Er moet aan adequate methode worden 
gebruikt om het gewichtspercentage van de onopgeloste deeltjes te 
bepalen. De oplossingen moeten binnen 24 uur worden gebruikt.  
1.6.3.  Apparatuur  
— oplosmiddelreservoir  
— ontgasser (indien van toepassing)  
— pomp  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— pulsdemper (indien van toepassing)  
— injectiesysteem  
— chromatografiekolommen  
— detector  
— stromingsmeter (indien van toepassing)  
— gegevensrecorder/verwerker  
— afvalreservoir  
Er moet voor worden gezorgd dat het GPC-systeem niet met de 
gebruikte oplosmiddelen reageert (bijvoorbeeld door stalen capillai ­
ren te gebruiken voor THF-oplossingen).  
1.6.4.  Injectie- en oplosmiddeltoevoersysteem  
Een bekend volume van de monsteroplossing wordt met behulp van 
een autosampler of manueel in een scherp begrensde zone op de 
kolom gebracht. Wanneer bij manueel opbrengen de plunjer van de injectiespuit te snel wordt ingedrukt of teruggetrokken, kan dit tot veranderingen in de waargenomen molecuulgewichtsverdeling 
leiden. Het oplosmiddeltoevoersysteem moet voorzover mogelijk 
pulsatievrij zijn en liefst een pulsdemper bevatten. De stroomsnelheid moet ongeveer 1 ml/min zijn.
 
1.6.5.  Kolom  
Afhankelijk van het monster wordt het polymeer gekarakteriseerd 
met behulp van één kolom of een aantal in serie gekoppelde kolom ­
men. In de handel zijn verschillende poreuze pakkingsmaterialen met bekende eigenschappen (bijvoorbeeld poriegrootte en exclusiegrens) 
verkrijgbaar. De keuze van de gel en de lengte van de kolom wordt 
bepaald door zowel de eigenschappen van het monster (hydrodyna ­
misch volume, molecuulgewichtsverdeling) als de specifieke omstan ­
digheden voor de scheiding zoals oplosmiddel, temperatuur en 
stroomsnelheid (1)(2)(3).
 
1.6.6.  Theoretische schotels  
De voor de scheiding gebruikte kolom of combinatie van kolommen 
moet worden gekarakteriseerd met behulp van het aantal theoretische schotels. Daartoe moet, indien THF als elutievloeistof wordt ge ­
bruikt, een oplossing van ethylbenzeen of een andere geschikte apo ­
laire stof op een kolom met een bekende lengte worden gebracht. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met de volgende vergelijking: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
of N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
waarbij:  
N = het aantal theoretische schotels;  
V c = het elutievolume bij de top van de piek;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = de piekbreedte aan de basis;  
W l/2 = de piekbreedte op halve hoogte.  
1.6.7.  Scheidend vermogen  
Naast het aantal theoretische schotels, een grootheid die bepalend is 
voor de bandbreedte, speelt ook het scheidend vermogen, dat wordt 
bepaald door de helling van de kalibratiecurve, een rol. Het schei ­
dend vermogen van een kolom kan als volgt worden bepaald:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
oppervlak doorsnede van de kolom ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
waarbij:  
V e, M x = het elutievolume voor polystyreen met molecuulge ­
wicht M  x ; 
V e,(10M x) = het elutievolume voor polystyreen met een tien keer zo 
hoog molecuulgewicht.  
De resolutie van het systeem wordt meestal als volgt gedefinieerd:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
waarbij:  
V el , V e2 = het elutievolume van de twee polystyreenstandaards bij 
de top van de piek;  
W l' W 2 = die piekbreedte aan de basis;  
M 1 , M  2 = het molecuulgewicht bij de top van de pieken (deze 
moeten een factor 10 van elkaar verschillen).  
De R-waarde voor het kolomsysteem moet groter zijn dan 1,7 (4).  
1.6.8.  Oplosmiddelen  
Alle oplosmiddelen moeten zeer zuiver zijn (THF wordt gebruikt 
met een zuiverheid van 99,5 %). Het oplosmiddelreservoir (indien nodig onder inert gas) moet groot genoeg zijn voor de kalibratie van 
de kolom en de analyse van verschillende monsters. Het oplosmiddel 
moet worden ontgast voordat het via de pomp naar de kolom wordt getransporteerd.
 
1.6.9.  Temperatuurbewaking  
De temperatuur van de kritische interne onderdelen (injectieblok, 
kolommen, detector en leidingen) moet constant zijn en in overeen ­
stemming zijn met het gekozen oplosmiddel.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detector  
De detector is bedoeld om de concentratie van het monster in het 
eluaat uit de kolom kwantitatief te registreren. Om een onnodige verbreding van de pieken te voorkomen, moet het volume van de 
meetcel van de detector zo klein mogelijk worden gehouden. Het 
volume mag niet groter zijn dan 10 μl, behalve voor lichtverstrooi ­
ings- en viscositeitsdetectoren. Meestal wordt voor de detectie diffe ­
rentiële refractometrie gebruikt. Indien dit in verband met de speci ­
fieke eigenschappen van het monster of de elutievloeistof nodig is, 
kunnen echter ook andere soorten detectors worden gebruikt, zoals UV/VIS, IR of viscositeitsdetectoren.
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
Voor de gedetailleerde beoordelingscriteria en voor de eisen ten aan ­
zien van het verzamelen en bewerken van de gegevens wordt ver ­
wezen naar de DIN-norm (1).  
Voor elk monster moeten twee onafhankelijke experimenten worden 
uitgevoerd die los van elkaar moeten worden geanalyseerd.  
Voor elke meting moet de waarde van M  n , M  R , M  w /M n en M 
worden vermeld. Daarbij moet expliciet worden vermeld dat de ge ­
meten waarden relatief zijn en worden uitgedrukt in equivalent-mo ­
lecuulgewicht van de gebruikte standaard.  
Na de bepaling van de retentievolumes of de retentietijden (eventueel 
gecorrigeerd met behulp van een interne standaard) wordt de logarit ­
mische waarde van M (waarbij M de top van de piek van de kali ­
bratiestandaard is) tegen een van deze grootheden uitgezet. Per log- interval zijn minimaal twee kalibratiepunten nodig en voor de curve 
als geheel minimaal vijf meetpunten. Het geraamde molecuulgewicht 
van het monster moet tussen het eerste en het laatste meetpunt liggen. Voor de bepaling van het laagste molecuulgewicht van de 
kalibratiecurve wordt een oplossing van n-hexylbenzeen of een an ­
dere geschikte apolaire stof gebruikt. Het aantalgemiddelde en het gewichtgemiddelde molecuulgewicht worden meestal aan de hand van de bij punt 1.2 vermelde vergelijkingen met behulp van een 
computer bepaald. Wanneer de digitalisering met de hand gebeurt, 
kan ASTM D 3536-91 (3) worden geraadpleegd.
 
De verdelingskromme moet in de vorm van een tabel of als figuur 
(al dan niet cumulatieve frequentieverdeling tegen log M) worden verstrekt. Bij de grafische weergave moet één log-interval van het molecuulgewicht normaal gesproken ongeveer 4 cm breed zijn en 
moet de top van de piek ongeveer 8 cm hoog zijn. Bij een cumu ­
latieve frequentieverdeling moet het verschil op de y-as tussen 0 en 100 % ongeveer 10 cm zijn.
 
2.2. TESTVERSLAG  
Het testverslag moet de volgende informatie bevatten:  
2.2.1.  Onderzochte stof:  
— beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, addi ­
tieven, verontreinigingen);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— beschrijving van de behandeling van het monster, opmerkingen, 
problemen.  
2.2.2.  Apparatuur:  
— elutievloeistofreservoir, inert gas, ontgassing van de elutievloei ­
stof, samenstelling van de elutievloeistof, verontreinigingen;  
— pomp, pulsdemper, injectiesysteem;  
— scheidingskolommen (fabrikant, alle informatie over de kenmer ­
ken van de kolommen zoals poriegrootte en aard van het pak ­
kingsmateriaal, aantal, lengte en volgorde van de gebruikte ko ­
lommen);  
— aantal theoretische schotels van de kolom (of de combinatie), 
scheidend vermogen (resolutie van het systeem);  
— informatie over de symmetrie van de pieken;  
— kolomtemperatuur, aard van de temperatuurregeling;  
— detector (meetprincipe, type, volume van de meetcel);  
— stromingsmeter, indien gebruikt (fabrikant, meetprincipe);  
— systeem voor gegevensregistratie en -verwerking (hardware en 
software).  
2.2.3.  Kalibratie van het systeem:  
— gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt 
om de kalibratiecurve samen te stellen;  
— informatie over de kwaliteitscriteria voor deze methode (bijvoor ­
beeld correlatiecoëfficiënt of som van de kwadraten).  
— informatie over alle extrapolaties, veronderstellingen en benade ­
ringen tijdens de experimentele procedure en de beoordeling en 
verwerking van gegevens.  
— alle metingen die voor de samenstelling van de kalibratiecurve 
worden gebruik, moeten in een tabel worden opgenomen waarbij 
voor elk kalibratiepunt de volgende informatie moet worden ver ­
meld:  
— naam van het monster;  
— fabrikant van het monster;  
— normale waarden van M  p , M  n , M  w en M  w /M n , zoals deze 
door de fabrikant zijn verstrekt of door latere metingen zijn bepaald, alsmede gedetailleerde informatie over de bepalings ­
methode;
 
— geïnjecteerd volume en concentratie daarin;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— voor kalibratie gebruikte waarde van M  p ; 
— bij de top van de piek gemeten elutievolume of gecorrigeerde 
retentietijd;  
— bij de top van de piek berekende M  p ; 
— procentuele fout van berekende M  p en de kalibratiewaarde.  
2.2.4.  Evaluatie:  
— evaluatie op basis van tijd: methoden die worden gebruikt om de 
vereiste reproduceerbaarheid te waarborgen (correctiemethode, interne standaard enz.);
 
— informatie over de keuze voor elutievolume of retentietijd als 
basis voor de evaluatie;  
— informatie over de grenzen van de evaluatie als een piek niet 
volledig wordt geanalyseerd;  
— beschrijving van afvlakmethoden indien deze zijn gebruikt;  
— procedures voor de bereiding en voorbehandeling van het mon ­
ster; 
— eventuele aanwezigheid van onopgeloste deeltjes;  
— geïnjecteerd volume ( μl) en concentratie daarin (mg/ml);  
— bespreking van effecten die tot afwijkingen van het ideale GPC- 
profiel leiden;  
— gedetailleerde beschrijving van alle wijzigingen in de testpro ­
cedures;  
— gedetailleerde informatie over de foutintervallen;  
— alle andere informatie en opmerkingen die relevant zijn voor de 
interpretatie van de resultaten.  
3. REFERENTIES  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- GPC). American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Aanhangsel  
Voorbeelden van andere methoden voor de bepaling van het 
aantalgemiddelde molecuulgewicht (M  n ) van polymeren  
Gelpermeatiechromatografie (GPC) geniet de voorkeur als methode voor de be ­
paling van M  n , vooral wanneer er verschillende standaards beschikbaar zijn waar ­
van de structuur vergelijkbaar is met die van het polymeer. Wanneer het gebruik 
van GPC praktische problemen oplevert of reeds wordt vermoed dat de stof niet aan een criterium voor M
 n in de regelgeving zal voldoen (en dit vermoeden moet 
worden bevestigd), zijn echter andere methoden beschikbaar:  
1. Gebruik van colligatieve eigenschappen  
1.1. Ebullioscopie/Cryoscopie:  
Hierbij wordt de kookpuntverhoging (ebullioscopie) of vriespuntver ­
laging (cryoscopie) van een oplosmiddel na toevoeging van het poly ­
meer gemeten. Bij deze methode wordt gebruik gemaakt van het feit dat het effect van het opgeloste polymeer op het kookpunt/vriespunt 
van de vloeistof afhankelijk is van het molecuulgewicht van het 
polymeer (1)(2).
 
Toepasbaarheid: M  n < 20 000.  
1.2. Dampspanningsverlaging:  
Hierbij wordt de dampspanning van een gekozen referentievloeistof 
voor en na toevoeging van bekende hoeveelheden polymeer 
gemeten (1)(2).  
Toepasbaarheid: M  n < 20 000 (theoretisch; in de praktijk is de bruik ­
baarheid van deze methode beperkt).  
1.3. Membraan-osmometrie:  
Berust op osmose, d.w.z. de natuurlijke neiging van moleculen van 
oplosmiddelen om zich via een semipermeabel membraan van een verdunde naar een geconcentreerde oplossing te verplaatsen om een evenwicht te bereiken. In dit geval bevat de verdunde oplossing geen 
polymeer en de geconcentreerde oplossing wel. Doordat het oplos ­
middel door het membraan wordt getrokken, ontstaat een drukver ­
schil dat afhankelijk is van de concentratie en het molecuulgewicht 
van het polymeer (1)(3)(4).
 
Toepasbaarheid: 20 000 < M  n < 200 000.  
1.4. Dampfase-osmometrie:  
Hierbij wordt de verdampingssnelheid van een zuivere oplosmidde ­
laërosol vergeleken met die van ten minste drie aerosolen die ver ­
schillende concentraties polymeer bevatten (1)(5)(6).  
Toepasbaarheid:  M n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Eindgroepanalyse  
Om deze methode te kunnen gebruiken is kennis nodig omtrent 
zowel de algehele structuur van het polymeer als de aard van de eindgroepen die de ketens afsluiten (deze moeten met behulp van bijvoorbeeld NMR of titratie/derivatisering van de hoofdketen kun ­
nen worden onderscheiden). Wanneer de concentratie van de eind ­
groepen in het polymeermolecuul wordt bepaald, kan op grond daar ­
van een waarde voor het molecuulgewicht worden afgeleid (7)(8)(9).
 
Toepasbaarheid: M  n tot 50 000 (met afnemende betrouwbaarheid).  
Referenties  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn, John Wiley, New York.  
(2) Glover, CA, (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr.ed., Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Mem ­
brane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25- 
52. 
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, Ame ­
rican Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl ­
vania.  
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: De ­
termination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E., Muller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Mar ­
cel Dekker, New York.  
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  GEHALTE VAN POLYMEREN AAN LAAGMOLECULAIRE 
BESTANDDELEN  
1. METHODE  
Deze methode voor gelpermeatiechromatografie is overgenomen van 
TG 119 van de OESO (1996). Voor de fundamentele beginselen en 
nadere technische informatie wordt verwezen naar de referenties.  
1.1. INLEIDING  
Aangezien de eigenschappen van polymeren zo sterk uiteenlopen, is 
het onmogelijk een enkele methode te beschrijven waarin voor alle 
mogelijkheden en specifieke gevallen bij de scheiding van poly ­
meren exact de omstandigheden voor scheiding en evaluatie worden aangegeven. Met name complexe polymeersystemen komen vaak 
niet in aanmerking voor gelpermeatiechromatografie (GPC). Wan ­
neer GPC niet uitvoerbaar is, kan het molecuulgewicht met behulp van andere methoden worden bepaald (zie bijlage). In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en een volledige motivering voor 
de gebruikte methode worden gegeven.
 
De hier beschreven methode is gebaseerd op de norm 
DIN 55672 (1). Deze norm bevat gedetailleerde informatie over de 
wijze waarop de experimenten moeten worden uitgevoerd en de 
gegevens moeten worden geëvalueerd. Wanneer veranderingen in de wijze van uitvoering nodig zijn, moet daarvoor een motivering 
worden gegeven. Ook andere normen kunnen worden gebruikt, mits 
de referenties volledig worden vermeld. In de beschreven methode worden voor de kalibratie polystyreenmonsters met een bekende polydispersiteit gebruikt en wijzigingen kunnen nodig zijn om de 
methode geschikt te maken voor bepaalde polymeren zoals in water 
oplosbare polymeren en vertakte polymeren met een lange keten.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Een laag molecuulgewicht wordt hier willekeurig gedefinieerd als 
een molecuulgewicht beneden 1 000 dalton.  
Het aantalgemiddelde molecuulgewicht (M  n ) en het gewichtgemid ­
delde molecuulgewicht (M  w ) worden bepaald met behulp van de 
volgende vergelijkingen: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
waarbij:  
H i = de hoogte van het detectorsignaal vanaf de basislijn bij het 
retentievolume V  i ; 
M i = het molecuulgewicht van de polymeerfractie bij het retentie ­
volume V  i ; 
n = het aantal meetpunten.  
De verhouding M  w /M n is de breedte van de molecuulgewichtsver ­
deling, die een maat is voor de dispersiteit van het systeem.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Aangezien GPC een relatieve methode is, moet het systeem worden 
gekalibreerd. Als standaard worden normaal gesproken fijn verdeelde lineair opgebouwde polystyreenmonsters gebruikt met bekende ge ­
middelde molecuulgewichten (M
 n en M  w ) en een bekende molecuul ­
gewichtsverdeling. De kalibratiecurve kan alleen voor de bepaling van het molecuulgewicht van het onbekende monster worden ge ­
bruikt als de omstandigheden voor de scheiding van het monster 
en de standaards op identieke wijze zijn gekozen.
 
Een tijdens een bepaald experiment vastgesteld verband tussen het 
molecuulgewicht en het elutievolume is alleen onder de specifieke 
omstandigheden van dat experiment geldig. Daarbij gaat het vooral 
om de temperatuur, het oplosmiddel (of het oplosmiddelenmengsel), de omstandigheden tijdens chromatografie en de kolom of het ko ­
lomsysteem waarop de scheiding is uitgevoerd.
 
Een op deze manier bepaald molecuulgewicht van het monster is 
relatief en wordt beschreven als een „polystyreen-equivalent mole ­
cuulgewicht”. Dit houdt in dat het molecuulgewicht afhankelijk van 
de structurele en chemische verschillen tussen het monster en de standaard in meer of mindere mate van de absolute waarde kan afwijken. Als een andere standaard wordt gebruikt, zoals polyethy ­
leenglycol, polyethyleenoxide, polymethylmethacrylaat of polyacryl ­
zuur, moet de reden daarvan worden vermeld.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Zowel de molecuulgewichtsverdeling van het monster als het gemid ­
delde molecuulgewicht (M  n of M  w ) kan met behulp van GPC wor ­
den bepaald. GPC is een speciaal soort vloeistofchromatografie waar ­
bij het monster aan de hand van het hydrodynamische volume van de verschillende bestanddelen wordt gescheiden (2).
 
De scheiding voltrekt zich tijdens de passage van het monster door 
een kolom die met een poreus materiaal, meestal een organische gel, is gevuld. Kleine moleculen kunnen de poriën binnendringen, terwijl grote moleculen dit niet kunnen. Grote moleculen volgen dan ook 
een kortere weg en worden het eerste geëlueerd. Middelgrote mole ­
culen kunnen sommige poriën binnendringen en worden later ge ­
ëlueerd. De kleinste moleculen, waarvan de gemiddelde hydrodyna ­
mische straal kleiner is dan de poriën van de gel, kunnen alle poriën 
binnendringen. Deze worden het laatst geëlueerd.
 
In het ideale geval wordt de scheiding uitsluitend door de grootte 
van het molecuul bepaald, maar enige storing door absorptie-effecten 
is in de praktijk vrijwel niet te voorkomen. Een ongelijkmatige pak ­
king van de kolom en dode ruimten kunnen de situatie nog ongun ­
stiger maken (2).  
Detectie gebeurt aan de hand van bijvoorbeeld de brekingsindex of 
uv-absorptie en levert een eenvoudige verdelingskromme op. Om echte waarden voor het molecuulgewicht aan de kromme te kunnen toekennen, moet de kolom echter worden gekalibreerd met behulp 
van polymeren met een bekend molecuulgewicht en liefst een in 
grote lijnen vergelijkbare structuur, bijvoorbeeld een aantal polysty ­
reenstandaards. Meestal levert dit een gausscurve op, soms met een kleine staart aan de kant van de lage molecuulgewichten, waarbij op 
de verticale as de geëlueerde hoeveelheid in gewicht wordt uitgezet 
en op de horizontale as de logaritme van het molecuulgewicht.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen wordt uit deze kromme 
afgeleid. De kalibratie kan alleen nauwkeurig zijn als de respons van 
de laagmoleculaire bestanddelen per massa-eenheid equivalent is met die van het polymeer als geheel.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De herhaalbaarheid (relatieve standaardafwijking) van het elutie ­
volume moet beter zijn dan 0,3 %. Indien een chromatogram tijd ­
afhankelijk wordt geëvalueerd en niet aan dit criterium voldoet, moet 
door correctie met behulp van een interne standaard de vereiste her ­
haalbaarheid van de analyse worden gewaarborgd (1). De polydis ­
persiteit is afhankelijk van het molecuulgewicht van de standaard. Normale waarden voor polystyreenstandaards zijn: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p is het molecuulewicht van de standaard bij de top van de piek.)  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Bereiding van de polystyreenstandaardoplossingen  
De polystyreenstandaard wordt opgelost door deze zorgvuldig te 
mengen in de gekozen elutievloeistof. Bij de bereiding van de op ­
lossingen moet rekening worden gehouden met de aanbevelingen van de fabrikant.
 
De concentratie van de standaardoplossingen wordt bepaald aan de 
hand van verschillende factoren, zoals het geïnjecteerde volume, de viscositeit van de oplossing en de gevoeligheid van de detector. Het maximale geïnjecteerde volume moet aan de lengte van de kolom 
worden aangepast om overlading te voorkomen. Voor een scheiding 
met behulp van GPC over een kolom van 30 cm × 7,8 mm wordt meestal een volume van 40 tot 100 μl geïnjecteerd. Grotere volumes 
zijn mogelijk, maar niet groter dan 250 μl. De optimale verhouding 
tussen het geïnjecteerde volume en de concentratie moet vóór de 
kalibratie van de kolom worden bepaald.
 
1.6.2.  Bereiding van de monsteroplossing  
In beginsel gelden voor de bereiding van de monsteroplossingen 
dezelfde eisen. Het monster wordt door zorgvuldig schudden opge ­
lost in een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld tetrahydrofuraan (THF). Het mag in geen geval met behulp van een ultrasoon bad 
worden opgelost. Indien nodig wordt de monsteroplossing gezuiverd 
over een membraanfilter met een poriegrootte tussen 0,2 en 2 μm.
 
Indien de oplossing onopgeloste deeltjes bevat, moet dit in het eind ­
verslag worden vermeld aangezien deze door hoogmoleculaire be ­
standdelen kunnen ontstaan. Er moet een adequate methode worden 
gebruikt om het gewichtspercentage van de onopgeloste deeltjes te 
bepalen. De oplossingen moeten binnen 24 uur worden gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Correctie voor het gehalte aan verontreinigingen en additieven  
Meestal moet het gehalte aan bestanddelen met M < 1 000 worden 
gecorrigeerd voor de bijdrage van niet polymeerspecifieke com ­
ponenten (zoals verontreinigingen en/of additieven), tenzij het geme ­
ten gehalte al lager is dan 1 %. Dit gebeurt door een directe analyse 
van de polymeeroplossing of van het GPC-eluaat.  
Wanneer het eluaat na de passage door de kolom te verdund is om 
nog te worden geanalyseerd, moet het worden geconcentreerd. Daar ­
bij kan het nodig zijn het eluaat droog te dampen en vervolgens weer op te lossen. Het concentreren van het eluaat moet onder zodanige omstandigheden gebeuren dat wordt gewaarborgd dat er geen ver ­
anderingen in het eluaat optreden. De behandeling van het eluaat na 
GPC is afhankelijk van de analysemethode die voor de kwantitatieve bepaling wordt gebruikt.
 
1.6.4.  Apparatuur  
De GPC-apparatuur bestaat uit de volgende onderdelen:  
— oplosmiddelreservoir  
— ontgasser (indien van toepassing)  
— pomp  
— pulsdemper (indien van toepassing)  
— injectiesysteem  
— chromatografiekolommen  
— detector  
— stromingsmeter (indien van toepassing)  
— gegevensrecorder/verwerker  
— afvalreservoir  
Er moet voor worden gezorgd dat het GPC-systeem niet met de 
gebruikte oplosmiddelen reageert (bijvoorbeeld door stalen capillai ­
ren te gebruiken voor THF-opIossingen).  
1.6.5.  Injectie- en oplosmiddeltoevoersysteem  
Een bekend volume van de monsteroplossing wordt met behulp van 
een autosampler of manueel in een scherp begrensde zone op de kolom gebracht. Wanneer bij manueel opbrengen de plunjer van 
de injectiespuit te snel wordt ingedrukt of teruggetrokken, kan dit 
tot veranderingen in de waargenomen molecuulgewichtsverdeling leiden. Het oplosmiddeltoevoersysteem moet voor zover mogelijk pulsatievrij zijn en liefst een pulsdemper bevatten. De stroomsnelheid 
moet ongeveer 1 ml/min zijn.
 
1.6.6.  Kolom  
Afhankelijk van het monster wordt het polymeer gekarakteriseerd 
met behulp van één kolom of een aantal in serie gekoppelde kolom ­
men. In de handel zijn verschillende poreuze pakkingsmaterialen met 
bekende eigenschappen (bijvoorbeeld poriegrootte en exclusiegrens) 
verkrijgbaar. De keuze van de gel en de lengte van de kolom wordt bepaald door zowel de eigenschappen van het monster (hydrodyna ­
misch volume, molecuulgewichtsverdeling) als de specifieke omstan ­
digheden voor de scheiding zoals oplosmiddel, temperatuur en 
stroomsnelheid (1)(2)(3).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Theoretische schotels  
De voor de scheiding gebruikte kolom of combinatie van kolommen 
moet worden gekarakteriseerd met behulp van het aantal theoretische schotels. Daartoe moet, indien THF als elutievloeistof wordt ge ­
bruikt, een oplossing van ethylbenzeen of een andere geschikte apo ­
laire stof op een kolom met een bekende lengte worden gebracht. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met de volgende vergelijking: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
of N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
waarbij:  
N = het aantal theoretische schotels;  
V e = het elutievolume bij de top van de piek;  
W = de piekbreedte aan de basis;  
W 1/2 = de piekbreedte op halve hoogte.  
1.6.8.  Scheidend vermogen  
Naast het aantal theoretische schotels, een grootheid die bepalend is 
voor de bandbreedte, speelt ook het scheidend vermogen, dat wordt 
bepaald door de helling van de kalibratiecurve, een rol. Het schei ­
dend vermogen van een kolom kan als volgt worden bepaald:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
oppervlak doorsnede van de kolom ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
waarbij:  
V e, Mr = het elutievolume voor polystyreen met molecuulge ­
wicht  M x ; 
V e,(10.Mr)  = het elutievolume voor polystyreen met een tien keer zo 
hoog molecuulgewicht.  
De resolutie van het systeem wordt meestal als volgt gedefinieerd:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
waarbij:  
Ve1, V  e2 = het elutievolume van de twee polystyreenstandaards bij 
de top van de piek;  
W 1 , W  2 = de piekbreedte aan de basis;  
M 1 , M  2 = het molecuulgewicht bij de top van de pieken (deze 
moeten een factor 10 van elkaar verschillen).  
De R-waarde voor het kolomsysteem moet groter zijn dan 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Oplosmiddelen  
Alle oplosmiddelen moeten zeer zuiver zijn (THF wordt gebruikt 
met een zuiverheid van 99,5 %). Het oplosmiddelreservoir (indien nodig onder inert gas) moet groot genoeg zijn voor de kalibratie van 
de kolom en de analyse van verschillende monsters. Het oplosmiddel 
moet worden ontgast voordat het via de pomp naar de kolom wordt getransporteerd.
 
1.6.10.  Temperatuurbewaking  
De temperatuur van de kritische interne onderdelen (injectieblok, 
kolommen, detector en leidingen) moet constant zijn en in overeen ­
stemming zijn met het gekozen oplosmiddel.  
1.6.11.  Detector  
De detector is bedoeld om de concentratie van het monster in het 
eluaat uit de kolom kwantitatief te registreren. Om een onnodige verbreding van de pieken te voorkomen, moet het volume van de meetcel van de detector zo klein mogelijk worden gehouden. Het 
volume mag niet groter zijn dan 10 μl, behalve voor lichtverstrooi ­
ings- en viscositeitsdetectoren. Meestal wordt voor de detectie diffe ­
rentiële refractometrie gebruikt. Indien dit in verband met de speci ­
fieke eigenschappen van het monster of de elutievloeistof nodig is, 
kunnen echter ook andere soorten detectors worden gebruikt, zoals 
UV/VIS, IR of viscositeitsdetectoren.
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
Voor de gedetailleerde beoordelingscriteria en voor de eisen ten aan ­
zien van het verzamelen en bewerken van de gegevens wordt ver ­
wezen naar de DIN-norm (1).  
Voor elk monster moeten twee onafhankelijke experimenten worden 
uitgevoerd die los van elkaar moeten worden geanalyseerd. Het is van essentieel belang dat in alle gevallen onder dezelfde omstandig ­
heden als de bepaling bij het monster ook een blancobepaling wordt 
uitgevoerd.
 
Er moet expliciet worden vermeld dat de gemeten waarden relatief 
zijn en worden uitgedrukt in equivalent-molecuulgewicht van de 
gebruikte standaard.  
Na de bepaling van de retentievolumes of de retentietijden (eventueel 
gecorrigeerd met behulp van een interne standaard) wordt de logarit ­
mische waarde van M (waarbij M de top van de piek van de kali ­
bratiestandaard is) tegen een van deze grootheden uitgezet. Per log- interval zijn minimaal twee kalibratiepunten nodig en voor de curve 
als geheel minimaal vijf meetpunten. Het geraamde molecuulgewicht 
van het monster moet tussen het eerste en het laatste meetpunt liggen. Voor de bepaling van het laagste molecuulgewicht van de kalibratiecurve wordt een oplossing van n-hexylbenzeen of een an ­
dere geschikte apolaire stof gebruikt. Het gedeelte van de curve dat 
overeenkomt met molecuul-gewichten lager dan 1 000 wordt indien nodig gecorrigeerd voor verontreinigingen en additieven. De evalu ­
atie van de elutiecurves gebeurt meestal met behulp van elektro ­
nische gegevensverwerking. Wanneer de digitalisering met de hand 
gebeurt, kan ASTM D 3536-91 (3) worden geraadpleegd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Als er onoplosbaar polymeer op de kolom achterblijft, zal dit waar ­
schijnlijk een hoger molecuulgewicht hebben dan de opgeloste frac ­
tie en als daar geen rekening mee wordt gehouden, zou het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen waarschijnlijk te hoog uitvallen. In de bijlage worden richtsnoeren gegeven om het gehalte aan laagmo ­
leculaire bestanddelen te corrigeren voor de aanwezigheid van on ­
oplosbaar polymeer.
 
De verdelingskromme moet in de vorm van een tabel of als figuur 
(al dan niet cumulatieve frequentieverdeling tegen log M) worden 
verstrekt. Bij de grafische weergave moet één log-interval van het 
molecuulgewicht normaal gesproken ongeveer 4 cm breed zijn en moet de top van de piek ongeveer 8 cm hoog zijn. Bij een cumu ­
latieve frequentieverdeling moet het verschil op de y-as tussen 0 en 
100 % ongeveer 10 cm zijn.
 
2.2. TESTVERSLAG  
Het testverslag moet de volgende informatie bevatten:  
2.2.1.  Onderzochte stof:  
— beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, addi ­
tieven, verontreinigingen);  
— beschrijving van de behandeling van het monster, opmerkingen, 
problemen.  
2.2.2.  Apparatuur:  
— elutievloeistofreservoir, inert gas, ontgassing van de elutievloei ­
stof, samenstelling van de elutievloeistof, verontreinigingen;  
— pomp, pulsdemper, injectiesysteem;  
— scheidingskolommen (fabrikant, alle informatie over de kenmer ­
ken van de kolommen zoals poriegrootte en aard van het pak ­
kingsmateriaal, aantal, lengte en volgorde van de gebruikte ko ­
lommen);  
— aantal theoretische schotels van de kolom (of de combinatie), 
scheidend vermogen (resolutie van het systeem);  
— informatie over de symmetrie van de pieken;  
— kolomtemperatuur, aard van de temperatuurregeling;  
— detector (meetprincipe, type, volume van de meetcel);  
— stromingsmeter, indien gebruikt (fabrikant, meetprincipe);  
— systeem voor gegevensregistratie en -verwerking (hardware en 
software).  
2.2.3.  Kalibratie van het systeem:  
— gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt 
om de kalibratiecurve samen te stellen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informatie over de kwaliteitscriteria voor deze methode (bijvoor ­
beeld correlatiecoëfficiënt of som van de kwadraten);  
— informatie over alle extrapolaties, veronderstellingen en benade ­
ringen tijdens de experimentele procedure en de beoordeling en 
verwerking van gegevens;  
— alle metingen die voor de samenstelling van de kalibratiecurve 
worden gebruikt, moeten in een tabel worden opgenomen waarbij 
voor elk kalibratiepunt de volgende informatie moet worden ver ­
meld:  
— naam van het monster;  
— fabrikant van het monster;  
— normale waarden van M  p , M  n , M  w en M  w /M n , zoals deze 
door de fabrikant zijn verstrekt of door latere metingen zijn bepaald, alsmede gedetailleerde informatie over de bepalings ­
methode;
 
— geïnjecteerd volume en concentratie daarin;  
— voor kalibratie gebruikte waarde van M;  
— bij de top van de piek gemeten elutievolume of gecorrigeerde 
retentietijd;  
— bij de top van de piek berekende M  p ; 
— procentuele fout van berekende M en de kalibratiewaarde.  
2.2.4.  Informatie over het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen:  
— beschrijving van de bij de analyse gebruikte methoden en de 
wijze waarop de experimenten zijn uitgevoerd;  
— informatie over het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen (als 
gewichtspercentage van het totale monster);  
— informatie over het gehalte aan verontreinigingen, additieven en 
andere niet-polymeerbestanddelen (als gewichtspercentage van het totale monster).
 
2.2.5.  Evaluatie:  
— evaluatie op basis van tijd: alle methoden die worden gebruikt 
om de vereiste reproduceerbaarheid te waarborgen (correctie ­
methode, interne standaard enz.);  
— informatie over de keuze voor elutievolume of retentietijd als 
basis voor de evaluatie;  
— informatie over de grenzen van de evaluatie als een piek niet 
volledig wordt geanalyseerd;  
— beschrijving van afvlakmethoden indien deze zijn gebruikt;  
— procedures voor de bereiding en voorbehandeling van het mon ­
ster; 
— eventuele aanwezigheid van onopgeloste deeltjes;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— geïnjecteerd volume ( μl) en concentratie daarin (mg/ml);  
— bespreking van effecten die tot afwijkingen van het ideale GPC- 
profiel leiden;  
— gedetailleerde beschrijving van alle wijzigingen in de testpro ­
cedures;  
— gedetailleerde informatie over de foutintervallen;  
— alle andere informatie en opmerkingen die relevant zijn voor de 
interpretatie van de resultaten.  
3. REFERENTIES  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography 
— GPC). American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phia, Pennsylvania.  
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
ryrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Aanhangsel  
Richtsnoeren om het gehalte aan laagmoleculaire bestanddelen te corrigeren 
voor de aanwezigheid van onoplosbaar polymeer  
Wanneer een monster onoplosbaar polymeer bevat, gaat tijdens de GPC-analyse 
massa verloren. Het onoplosbare polymeer blijft irreversibel op de kolom of het 
monsterfilter achter, terwijl het oplosbare gedeelte van het monster door de 
kolom loopt. Wanneer de stijging van de brekingsindex (dn/dc) van het polymeer kan worden geschat of gemeten, kan de massa van de hoeveelheid monster die op de kolom verloren is gegaan, worden geschat. In dat geval wordt de correctie 
bepaald met behulp van een externe kalibratie met standaardmaterialen met een 
bekende concentratie en dn/dc om de respons van de refractometer te kalibreren. In het hier gegeven voorbeeld wordt een PMM-standaard (polymethylmethacry ­
laat) gebruikt.
 
Bij de externe kalibratie voor de analyse van acrylpolymeren wordt een PMM- 
standaard met een bekende concentratie in tetrahydrofuraan met behulp van GPC 
geanalyseerd en worden de resultaten gebruikt voor de bepaling van de refrac ­
tometerconstante volgens de volgende vergelijking:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
waarbij  
K = de refractometerconstante (in microvoltseconde/ml);  
R = de respons van de PMM-standaard (in microvoltseconde);  
C = de concentratie van de PMM-standaard (in mg/ml);  
V = het geïnjecteerde volume (in ml);  
dn/dc = de stijging van de brekingsindex voor PMM in tetrahydrofuraan (in 
ml/mg).  
Normale waarden voor een PMM-standaard zijn:  
R = 2 937 891;  
C = 1,07 mg/ml;  
V = 0,1 ml;  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg.  
Met de aldus berekende waarde van K (3,05 × 10  11 ) wordt vervolgens de theo ­
retische respons van de detector berekend als het geïnjecteerde polymeer voor 100 % via de detector zou zijn geëlueerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  OPLOS/EXTRACTIEGEDRAG VAN POLYMEREN IN WATER  
1. METHODE  
De hier beschreven methode is overgenomen van de herziene versie 
van TG 120 van de OESO (1997). Voor nadere technische informa ­
tie wordt verwezen naar referentie (1).  
1.1. INLEIDING  
Voor bepaalde polymeren (bijvoorbeeld emulsiepolymeren) moeten 
eerst voorbereidende werkzaamheden worden uitgevoerd voordat de hier beschreven methode kan worden toegepast. De methode kan niet worden gebruikt voor vloeibare polymeren en voor polymeren die 
onder de testomstandigheden met water reageren.
 
Wanneer de methode niet geschikt of niet bruikbaar is, kan het 
oplos/extractiegedrag met behulp van andere methoden worden on ­
derzocht. In dat geval moet een gedetailleerde beschrijving van en 
een volledige motivering voor de gebruikte methode worden gege ­
ven. 
1.2. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Het oplos/extractiegedrag van polymeren in waterig milieu wordt 
bepaald met behulp van de kolfmethode (zie methode A.6: Oplos ­
baarheid in water, methode met de kolf) waarin onderstaande wijzi ­
gingen worden aangebracht.  
1.4. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Apparatuur  
Voor deze methode is de volgende apparatuur nodig:  
— een vergruizer, bijvoorbeeld een maalapparaat, om deeltjes met 
een bekende grootte te vervaardigen;  
— een schudapparaat met regelbare temperatuur;  
— een membraanfiltersysteem;  
— adequate analyseapparatuur;  
— gestandaardiseerde zeven.  
1.5.2.  Monstervoorbereiding  
Een representatief monster moet eerst worden vergruisd tot deeltjes 
met een grootte van 0,125 tot 0,25 mm (gebruik hierbij geschikte zeven). Voor de stabiliteit van het monster of voor het maalprocedé 
kan koeling nodig zijn. Rubberachtige materialen kunnen bij de 
temperatuur van vloeibare stikstof worden vergruisd (1).
 
Als het niet mogelijk is een fractie met de vereiste deeltjesgrootte te 
verkrijgen, moet worden getracht de deeltjesgrootte zoveel mogelijk te verlagen en moet het resultaat in het verslag worden vermeld. 
Tevens moet in het verslag worden vermeld hoe het vergruisde mon ­
ster voor de test is bewaard.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Procedure  
In drie kolven met een glazenstop wordt telkens 10 g van de te 
onderzoeken stof afgewogen. Vervolgens wordt aan elke kolf 1 000 ml water toegevoegd. Indien het niet mogelijk blijkt met een 
hoeveelheid van 10 g polymeer te werken, moet de eerst hogere 
hoeveelheid worden gebruikt waarmee wel kan worden gewerkt en moet de hoeveelheid water dienovereenkomstig worden aangepast.
 
De kolven worden goed afgesloten en vervolgens bij 20  o C geschud. 
Hiervoor wordt een schuld- of roermachine gebruikt waarmee bij constante temperatuur kan worden gewerkt. Na 24 uur wordt de inhoud van elke kolf gecentrifugeerd of gefiltreerd en wordt de poly ­
meerconcentratie in de heldere waterige fase met behulp van een 
geschikte analysemethode bepaald. Indien er geen geschikte analyse ­
methoden voor de waterige fase beschikbaar zijn, kan de totale oplosbaarheid/extraheerbaarheid op basis van het drooggewicht van 
het residu op het filter of het gecentrifugeerde neerslag worden be ­
paald.
 
Meestal moet bij de kwantitatieve bepaling onderscheid worden ge ­
maakt tussen de verontreinigingen en additieven enerzijds en het 
polymeer met een laag molecuulgewicht anderzijds. Bij een gravi ­
metrische bepaling is het ook belangrijk dat er een blancobepaling zonder te onderzoeken stof wordt uitgevoerd om rekening te kunnen 
houden met residuen ten gevolge van de experimentele procedure.
 
Het oplos/extractiegedrag van polymeren in water bij 37  o C bij pH 2 
en pH 9 kan op dezelfde wijze worden bepaald zoals beschreven 
voor de uitvoering van het experiment bij 20  o C. De pH kan worden 
aangepast door de toevoeging van geschikte bufferoplossingen of zuren of basen als zoutzuur, azijnzuur, natrium- of kahumhydroxide (p.a.) of NH
 3 . 
Afhankelijk van de gebruikte analysemethode moet de test een- of 
tweemaal worden uitgevoerd. Wanneer voldoende specifieke metho ­
den beschikbaar zijn voor een directe analyse van de polymeercom ­
ponent in de waterige fase, moet één in het voorgaande beschreven 
test voldoende zijn. Wanneer dergelijke methoden echter niet be ­
schikbaar zijn en het oplos/extractiegedrag van de polymeer uitslui ­
tend wordt bepaald via een indirecte analyse waarbij alleen het totale 
gehalte aan organische koolstof (TOC) van het waterig extract wordt 
bepaald, moet de test tweemaal worden uitgevoerd. Deze tweede test moet ook in triplo gebeuren met polymeermonsters die tien keer zo klein zijn als bij de eerste test en dezelfde hoeveelheden water.
 
1.5.4.  Analyse  
1.5.4.1.  Met één monsterhoeveelheid uitgevoerde test  
Het is mogelijk dat er methoden beschikbaar zijn voor een directe 
analyse van de polymeercomponent in de waterige fase. Als dit niet het geval is, kan worden overwogen een indirecte analyse van 
opgeloste/geëxtraheerde polymeercomponenten uit te voeren, waarbij 
het totale gehalte aan oplosbaar materiaal wordt bepaald en wordt gecorrigeerd voor componenten die niet polymeerspecifiek zijn.
 
Een analyse van de totale hoeveelheid polymeer in de waterige fase 
is mogelijk:  
met behulp van een voldoende gevoelige methode zoals:  
— TOC met ontleding door persulfaat of dichromaat tot CO  2 , ge­
volgd door bepaling met behulp van IR of chemische analyse;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atoomabsorptiespectrometrie (AAS) of emissiespectrometrie met 
inductief gekoppeld plasma (ICP) voor polymeren die silicium of 
metaal bevatten;  
— Uv-absorptie of spectrofluorimetrie voor arylpolymeren,  
— LC/MS voor monsters met een laag molecuulgewicht;  
door vacuümverdampmg van het waterig extract en analyse van het 
droge residu met behulp van spectroscopie (bijvoorbeeld IR of uv) of 
AAS/ICP.  
Als een analyse van de waterige fase als zodanig niet uitvoerbaar is, 
moet het waterige extract worden geëxtraheerd met een niet met water mengbaar organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld een gechlo ­
reerde koolwaterstof. Vervolgens wordt het oplosmiddel verdampt 
en wordt het polymeergehalte van het residu volgens een van boven ­
staande analysemethoden bepaald. Om de mate van oplossing/extractie van het polymeer zelf te bepalen, moeten com ­
ponenten van dit residu waarvan wordt vastgesteld dat ze verontrei ­
nigingen of additieven zijn, in mindering worden gebracht.
 
Wanneer betrekkelijk grote hoeveelheden van dergelijke materialen 
aanwezig zijn, kan het nodig zijn het residu met behulp van bijvoor ­
beeld HPLC of GC te analyseren om onderscheid te maken tussen de 
verontreinigingen en het monomeer en van het monomeer afgeleide stoffen zodat het werkelijke gehalte aan laatstgenoemde stoffen kan worden bepaald.
 
In sommige gevallen kan het voldoende zijn het organische oplos ­
middel te verdampen en het droge residu te wegen.  
1.5.4.2.  Met twee verschillende monsterhoeveelheden uitgevoerde test  
Alle waterige extracten worden op TOC geanalyseerd.  
Bij het niet-opgeloste/niet-geëxtraheerde deel van het monster wordt 
een gravimetrische bepaling uitgevoerd. Als na centrifugeren of fil ­
treren van de inhoud van de kolf polymeerresten op de rand van de 
kolf zijn achtergebleven, moet de kolf met het filtraat worden ge ­
spoeld totdat alle zichtbare resten zijn verdwenen. Vervolgens wordt het filtraat opnieuw gecentrifugeerd of gefiltreerd. De op de filter of 
in de centrifugebuis achtergebleven residuen worden bij 40
 o C onder 
vacuüm gedroogd tot constant gewicht en vervolgens gewogen.  
2. GEGEVENS  
2.1. MET ÉÉN MONSTERHOEVEELHEID UITGEVOERDE TEST  
De aparte resultaten voor de drie kolven en de gemiddelde waarden 
moeten worden vermeld, uitgedrukt in massa-eenheden per volume oplossing (meestal mg/l) of massa-eenheden per massa polymeer ­
monster (meestal mg/g). Daarnaast moet het gewichtsverlies van 
het monster worden vermeld (berekend als het gewicht van de opge ­
loste stof gedeeld door het gewicht van het oorspronkelijke monster). Bovendien moet de relatieve standaardafwijking worden berekend. Deze gegevens moeten worden vermeld voor de stof als geheel 
(polymeer + essentiële additieven enz.) en voor het zuivere polymeer 
(d.w.z. nadat de bijdrage van dergelijke additieven is afgetrokken).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. MET TWEE VERSCHILLENDE MONSTERHOEVEELHEDEN 
UITGEVOERDE TEST  
Voor elk waterig extract van de twee in triplo uitgevoerde experi ­
menten dient de TOC-waarde te worden vermeld en daarnaast de 
gemiddelde waarde voor elk experiment. Deze gegevens dienen te 
worden uitgedrukt in massa-eenheden per volume oplossing (meestal mg C/l) en massa-eenheden per gewicht van het oorspronkelijke monster (meestal mgC/g).
 
Als er geen verschil is tussen de resultaten met de hoge en de lage 
monster/waterverhouding, kan dit erop wijzen dat alle extraheerbare componenten inderdaad zijn geëxtraheerd. In dat geval zou een di ­
recte analyse normaal gesproken niet nodig zijn.
 
Voor elk residu moet het gewicht worden vermeld en worden uit ­
gedrukt als percentage van het oorspronkelijke gewicht van het mon ­
ster. Per experiment dient het gemiddelde te worden berekend. Het percentage oplosbaar en extraheerbaar materiaal in het oorspronke ­
lijke monster wordt berekend door het gevonden percentage van 
100 % af te trekken.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
3.1.1.  Onderzochte stof:  
— beschikbare informatie over de onderzochte stof (identiteit, addi ­
tieven, verontreinigingen, gehalte aan laagmoleculaire bestandde ­
len). 
3.1.2.  Testomstandigheden:  
— beschrijving van de gevolgde procedures en de testomstandighe ­
den; 
— beschrijving van de analyse- en detectiemethoden.  
3.1.3.  Resultaten  
— de oplosbaarheid/extraheerbaarheid in mg/l; aparte resultaten bij 
de verschillende oplossingen en gemiddelde waarden, gesplitst in polymeergehalte en verontreinigingen, additieven enz.;
 
— oplosbaarheid/extraheerbaarheid in mg/g polymeer;  
— TOC-waarden van de waterige extracten, gewicht van de opge ­
loste stof en berekende percentages, indien gemeten;  
— de pH van elk monster;  
— informatie over de blancobepalingen;  
— indien nodig gegevens over de chemische instabiliteit van de 
onderzochte stof, zowel tijdens de testprocedure als tijdens de analyse;
 
— alle informatie die voor de interpretatie van de resultaten van 
belang is.  
4. REFERENTIE  
(1) DIN 53733 (1976), Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  OXIDERENDE EIGENSCHAPPEN (VLOEISTOFFEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Deze testmethode is bedoeld om te meten in hoeverre een vloei ­
stof de verbrandingssnelheid of verbrandingsintensiteit van een 
brandbare stof kan verhogen of met een brandbare stof een meng ­
sel kan vormen dat spontaan ontbrandt wanneer beide stoffen grondig worden gemengd. De test is gebaseerd op de test voor 
oxiderende vloeistoffen van de VN (1) en is hieraan gelijkwaardig. 
Aangezien deze methode A.21 echter in de eerste plaats is bedoeld om te voldoen aan de vereisten van Verordening (EG) nr. 1907/ ­
2006, is slechts een vergelijking met één referentiestof vereist. 
Testen en vergelijken met bijkomende referentiestoffen kan nodig zijn wanneer het waarschijnlijk is dat de testresultaten voor andere doeleinden worden gebruikt (
 1 ). 
Deze test hoeft niet te worden uitgevoerd wanneer op grond van de 
structuurformule met afdoende zekerheid kan worden vastgesteld dat de stof niet exotherm kan reageren met een brandbare stof.
 
Het is nuttig om, voordat deze test wordt uitgevoerd, te beschikken 
over gegevens over de mogelijke explosieve eigenschappen van de te onderzoeken stof.
 
Deze test is niet toepasbaar op vaste stoffen, gassen, explosieve of 
licht ontvlambare stoffen of organische peroxiden.  
Deze test hoeft eventueel niet te worden uitgevoerd wanneer voor de 
te onderzoeken stof al resultaten beschikbaar zijn van de test voor oxiderende vloeistoffen van de VN (1).
 
1.2. DEFINITIES EN EEN HEDEN  
Gemiddelde stijgtijd van de druk: het gemiddelde van de gemeten 
tijden waarin een mengsel tijdens de test een drukstijging veroor ­
zaakt van 690 kPa tot 2 070 kPa boven de atmosferische druk.  
1.3. REFERENTIESTOF  
Als referentiestof wordt een waterige oplossing van 
65 gewichtsprocent salpeterzuur (analytisch zuiver) gebruikt (  2 ). ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Bijvoorbeeld in het kader van de vervoersvoorschriften van de VN. 
( 2 ) Het zuur moet vóór de test worden getitreerd om de concentratie ervan te bevestigen.
 Wanneer de experimentator verwacht dat de testresultaten wellicht 
voor andere doeleinden worden gebruikt (  1 ), kan het wenselijk zijn 
de test met bijkomende referentiestoffen uit te voeren (  2 ). 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De testvloeistof wordt in een massaverhouding van 1:1 met cellulo ­
sevezel gemengd en in een drukvat gebracht. Indien tijdens het mengen of vullen spontane ontbranding optreedt, is verder testen 
niet nodig.
 
Indien geen spontane ontbranding optreedt, wordt de volledige test 
uitgevoerd. Het mengsel wordt in een drukvat verwarmd en de ge ­
middelde tijd waarin de druk stijgt van 690 kPa tot 2 070 kPa boven de atmosferische druk, wordt gemeten. Deze tijd wordt vergeleken 
met de gemiddelde stijgtijd voor de druk voor het 1:1-mengsel van 
de referentiestof(fen) en cellulose.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
In een reeks van vijf proeven met dezelfde stof mag geen van de 
resultaten meer dan 30 % afwijken van het rekenkundige gemiddel ­
de. Resultaten die meer dan 30 % van het gemiddelde afwijken, 
moeten worden verworpen, de meng- en vulprocedure moet worden 
verbeterd en de test moet worden herhaald.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.6.1.  Voorbereiding  
1.6.1.1.  Brandbare stof  
Als brandbare stof wordt droge cellulose met een vezellengte tussen 
50 en 250 μm en een gemiddelde diameter van 25 μm gebruikt (  3 ). 
Dit wordt gedurende 4 uur in een laag van ten hoogste 25 mm dik bij 105
 o C gedroogd tot constant gewicht en in een exsiccator met 
droogmiddel bewaard totdat de vezel is afgekoeld en wordt gebruikt. 
Het watergehalte van de gedroogde cellulose moet minder zijn dan 
0,5 % van de droge massa (  4 ). Zo nodig dient de droogtijd te worden 
verlengd tot deze waarde is bereikt (  4 ). Gedurende de hele test wordt 
een en dezelfde batch cellulose gebruikt (  5 ). ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Bijvoorbeeld in het kader van de vervoersvoorschriften van de VN. 
( 2 ) In referentie 1 wordt bijvoorbeeld gebruikgemaakt van 50 gewichtprocent perchloorzuur 
en 40 gewichtprocent natriumchloraat. 
( 3 ) Bijvoorbeeld Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, catalogue no 
4021 050. 
( 4 ) Bevestigd met (bijvoorbeeld) Karl-Fisher titratie. 
( 5 ) Een andere mogelijkheid om dit watergehalte te bereiken is (bijv.) verhitting bij 105  o C 
onder vacuüm gedurende 24 uur.
 1.6.1.2.  Apparatuur  
1.6.1.2.1. D r u k v a t  
Voor de test wordt gebruik gemaakt van een drukvat. Dit is een 
cilindrisch stalen drukvat met een lengte van 89 mm en een uitwen ­
dige diameter van 60 mm (zie figuur 1). De cilinder wordt zo be ­
werkt dat aan de buitenkant recht tegenover elkaar twee vlakke 
zijden ontstaan (waardoor de doorsnede van het vat wordt geredu ­
ceerd tot 50 mm) zodat de cilinder gemakkelijker kan worden ge ­
manipuleerd wanneer de ontstekingsplug en ontluchtingsplug worden aangebracht. Het vat, dat een inwendige diameter van 20 mm heeft, 
wordt aan beide uiteinden tot een diepte van 19 mm opgeruimd en 
voorzien van een schroefdraad voor 1 „British Standard Pipe (BSP) of het metrische equivalent daarvan. Op 35 mm van een van de uiteinden wordt op 90
 o van de vlakke oppervlakken in het gebogen 
oppervlak van het vat een zijbuis geschroefd om de druk op te 
nemen. Daarvoor wordt een 12 mm diep gat geboord dat wordt voorzien van schroefdraad voor de ½” BSP (of metrisch equivalent) schroefdraad op het uiteinde van de zijbuis. Zo nodig wordt een 
inerte pakking aangebracht om een gasdichte verbinding te bekomen. 
De zijbuis steekt 55 mm buiten het drukvat uit en heeft een inwen ­
dige diameter van 6 mm. Het uiteinde van de zijbuis wordt opge ­
ruimd en voorzien van een schroefdraad voor een membraanman ­
ometer. Elk type manometer mag worden gebruikt, op voorwaarde 
dat de manometer bestand is tegen de hete gassen of ontledings ­
producten en kan reageren op een drukstijging van 690-2 070 kPa in maximaal 5 ms.
 
Het uiteinde van het drukvat dat het verst verwijderd is van de 
zijbuis, wordt afgesloten met een ontstekingsplug met twee elektro ­
des, de ene geïsoleerd van de plug, de andere via de plug met de 
massa verbonden. Het andere uiteinde van het drukvat wordt afge ­
sloten met een breekplaat (barstdruk ongeveer 2 200 kPa) die op zijn plaats wordt gehouden met een bevestigingsplug met een inwendige 
diameter van 20 mm. Zo nodig wordt voor de ontstekingsplug een 
inerte pakking gebruikt om een gasdichte verbinding te bekomen. Het drukvat wordt tijdens het gebruik in de juiste positie gehouden met een statief (figuur 2). Dit bestaat doorgaans uit een zachtstalen 
grondplaat van 235 mm × 184 mm × 6 mm en een 185 mm lange 
vierkante buis van 70 mm × 70 mm × 4 mm.
 
Van twee tegenover elkaar gelegen zijkanten van de vierkante buis 
wordt een deel verwijderd zodat een buis van 86 mm lengte over ­
blijft die uitloopt in twee vlakke benen. De uiteinden van deze vlakke benen worden onder een hoek van 60
 o ten opzichte van de 
as van de buis afgekort en op de grondplaat gelast. Aan de boven ­
kant van de vierkante buis wordt in één zijkant een gleuf van 22 mm 
breed × 46 mm diep uitgefreesd, zodat de zijbuis in de gleuf valt wanneer het drukvat met de ontstekingsplug naar beneden in de vierkante buis wordt geplaatst. Op de onderste binnenzijde van de 
vierkante buis wordt een stuk staal van 30 mm breed en 6 mm dik 
gelast als afstandstuk. In de tegenoverliggende zijde worden twee 7 mm vleugelschroeven gedraaid om het drukvat stevig op zijn plaats te houden. Om het drukvat van onderen te steunen worden 
op de zijkanten die doorlopen naar de basis van het statief, twee 
stroken van 12 mm breed en 6 mm dik staal gelast.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. O n t s t e k i n g s s y s t e e m  
Het ontstekingssysteem bestaat uit een 25 cm lange Ni/Cr-draad met 
een diameter van 0,6 mm en een weerstand van 3,85 ohm/m. De 
draad wordt om een staaf met een diamater van 5 mm tot een spoel gewikkeld en met de elektrodes van de ontstekingsplug verbonden. De spoel moet een van de in figuur 3 afgebeelde configuraties heb ­
ben. De afstand tussen de bodem van het vat en de onderzijde van de 
ontstekingsspoel moet 20 mm bedragen. Wanneer de elektroden niet instelbaar zijn, moeten de einden van de ontstekingsdraad tussen de spoel en de bodem van het vat met een keramische mantel worden 
geïsoleerd. De draad wordt verhit met een voeding die een constante 
stroom van ten minste 10 A kan leveren.
 
1.6.2.  Uitvoering van de test  ( 1 ) 
Het toestel wordt met manometer en verhittingssysteem, maar zonder 
de breekplaat, met de ontstekingsplug naar beneden neergezet. In een 
glazen beker worden met een glazen roerstaaf 2,5 g testvloeistof en 2,5 g gedroogde cellulose gemengd (
 2 ). Om veiligheidsredenen moet 
tijdens het mengen een veiligheidsschild tussen de experimentator en 
het mengsel zijn geplaatst. Indien het mengsel tot ontbranding komt tijdens het mengen of vullen, zijn geen verdere tests nodig. Het mengsel wordt in kleine hoeveelheden tegelijk in het drukvat gego ­
ten, terwijl tegen het drukvat wordt geklopt om ervoor te zorgen dat 
het mengsel de ruimte rond de ontstekingsspoel vult en daarmee goed contact maakt. Het is belangrijk dat de spoel tijdens het vullen niet verbuigt, aangezien dit tot foutieve resultaten kan leiden (
 3 ). De 
breekplaat wordt op zijn plaats gebracht en de bevestigingsplug 
wordt stevig vastgeschroefd. Het gevulde drukvat wordt met de breekplaat naar boven in het statief geplaatst. De gehele opstelling moet zich in een geschikte gewapende afzuigkast of ontstekingskast 
bevinden. De voeding wordt aangesloten op de uitwendige aanslui ­
tingen van de ontstekingsplug. De stroomsterkte bedraagt 10 A. De tijd tussen het begin van het mengen en het inschakelen van de voeding mag niet langer zijn dan tien minuten.
 
Het signaal van de manometer wordt geregistreerd met een systeem 
waarmee het drukverloop kan worden geanalyseerd en continu kan 
worden geregistreerd (bijv. een transiëntrecorder gekoppeld aan een 
papierschrijver). Het mengsel wordt verwarmd tot de breekplaat breekt of totdat ten minste 60 seconden zijn verstreken. Als de breekplaat niet breekt, moet het mengsel afkoelen voordat het toestel 
voorzichtig wordt geopend, waarbij de nodige voorzorgen worden 
getroffen voor het geval een plotselinge drukstijging optreedt. Er worden vijf proeven uitgevoerd met de teststof en de referentie ­
stof(fen). De tijd waarin de druk stijgt van 690 kPa tot 2 070 kPa 
boven de atmosferische druk, wordt genoteerd. Vervolgens wordt de 
gemiddelde stijgtijd van de druk berekend.
 
In sommige gevallen kunnen stoffen een (te hoge of te lage) druk ­
stijging veroorzaken als gevolg van chemische reacties die niet rele ­
vant zijn voor de oxiderende eigenschappen van de stof. In die gevallen kan het nodig zijn de test te herhalen met een inerte stof, 
bijvoorbeeld diatomiet (kieselgoehr), in plaats van cellulose, om het 
karakter van de reactie te bepalen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Mengsels van oxiderende stoffen en cellulose kunnen explosief zijn en moeten met de 
nodige voorzichtigheid worden behandeld. 
( 2 ) In de praktijk kan dit worden gedaan door een grotere hoeveelheid testvloeistof en 
cellulose te mengen in een verhouding 1:1 en vervolgens 5 ± 0,1 g van het mengsel 
in het drukvat te brengen. Het mengsel moet voor elke proef vers worden bereid. 
( 3 ) Met name moet contact tussen opeenvolgende wikkelingen van de spoel worden ver ­
meden.
 2. GEGEVENS  
Stijgtijd voor de teststof en voor de referentiestof(fen). Stijgtijd voor 
de tests met een inerte stof, indien uitgevoerd.  
2.1. VERWERKING VAN DE RESULTATEN  
De gemiddelde stijgtijden van de druk voor de teststof en de refe ­
rentiestof(fen) worden berekend.  
De gemiddelde stijgtijd voor de tests met een inerte stof (indien 
uitgevoerd) wordt berekend.  
Tabel 1 bevat enkele voorbeelden van resultaten  
Tabel 1  
Voorbeelden van resultaten  ( a ) 
Stof (  b ) Gemiddelde stijgtijd voor een 1:1 mengsel met cellulose 
(ms) 
Ammoniumdichromaat, verzadigde waterige oplos ­
sing 20 800 
Calciumnitraat, verzadigde waterige oplossing 6 700 
IJzer(III)nitraat, verzadigde waterige oplossing 4 133 Lithiumperchloraat, verzadigde waterige oplossing 1 686 Magnesiumperchloraat, verzadigde waterige oplos ­
sing 777 
Nikkelnitraat, verzadigde waterige oplossing 6 250 
Salpeterzuur, 65 % 4 767 (
 c ) 
Perchloorzuur, 50 % 121 (  a ) ( c ) 
Perchloorzuur, 55 % 59 
Kaliumnitraat, 30 % waterige oplossing 26 690 
Zilvernitraat, verzadigde waterige oplossing (  d ) 
Natriumchloraat, 40 % waterige oplossing 2 555 (  c ) 
Natriumnitraat, 45 % waterige oplossing 4 133  
Inerte stof  
Water:cellulose (  d ) 
( a ) Zie referentie (1) voor indeling volgens de vervoersvoorschriften van de VN. 
( b ) Verzadigde oplossingen worden bij 20  o C bereid. 
( c ) Gemiddelde waarde van vergelijkende interlaboratoriumproeven. 
( d ) Maximumdruk van 2 070 kPa niet bereikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
— identiteit, samenstelling, zuiverheid enz. van de teststof;  
— concentratie van de teststof;  
— procedure voor het drogen van de cellulose;  
— watergehalte van de gebruikte cellulose;  
— de meetresultaten;  
— eventuele resultaten van tests met een inerte stof;  
— berekende gemiddelde stijgtijden van de druk;  
— eventuele afwijkingen van deze methoden en redenen daarvoor;  
— alle verdere informatie of opmerkingen die van belang zijn voor 
de interpretatie van de resultaten.  
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN (  1 ) 
De testresultaten worden beoordeeld op grond van:  
a) de vraag of het mengsel van teststof en cellulose spontaan ont ­
brand; en  
b) een vergelijking van de gemiddelde stijgtijd voor de druk van 690 
KPa naar 2 070 kPa met die voor de referentiestof(fen).  
Een vloeistof wordt aangemerkt als een oxiderende stof wanneer:  
a) een mengsel in een 1:1 massaverhouding van de stof en cellulose 
spontaan ontbrand, of  
b) een mengsel in een massaverhouding van 1:1 van de stof en 
cellulose een gemiddelde stijgtijd oplevert kleiner dan of gelijk 
aan de gemiddelde stijgtijd van de druk van een mengsel in een 
1:1 massaverhouding van een waterige oplossing van 65 gewichtsprocent salpeterzuur en cellulose.
 
Om vals-positieve resultaten te vermijden, moet bij de interpretatie 
van de resultaten zo nodig ook rekening worden gehouden met 
resultaten verkregen bij het testen van de stof gemengd met inert materiaal.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Zie referentie 1 voor de interpretatie van de resultaten onder de vervoersvoorschriften 
van de VN met verschillende referentiestoffen.
 4. REFERENTIES  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Ma ­
nual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for 
oxidizing liquids.
 
Figuur 1  
Drukvat
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Figuur 2  
Statief
  
Figuur 3  
Ontstekingssysteem
  
Opmerking: Beide ontstekingssystemen kunnen worden gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  NAAR LENGTE GEWOGEN MEETKUNDIG GEMIDDELDE 
VAN DE DIAMETER VAN VEZELS  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
In deze methode wordt een procedure beschreven voor de bepaling 
van het naar lengte gewogen meetkundig gemiddelde van de dia ­
meter (Length Weighted Geometric Mean Diameter — LWGMD) van in bulk geproduceerde synthetische anorganische vezels (Man Made Mineral Fibres — MMMF). Aangezien er een waarschijnlijk ­
heid van 95 % is dat de LWGMD van de populatie tussen de 95 %- 
betrouwbaarheidsniveaus (LWGMD ± twee keer de standaardfout) van het monster ligt, zal als testwaarde de onderste 95 %-betrouw ­
baarheidsgrens van het monster worden gerapporteerd (d.w.z. 
LWGMD minus twee keer de standaardfout). De methode is geba ­
seerd op een bijwerking (juni 1994) van een ontwerp-bedrijfspro ­
cedure van de HSE, die is overeengekomen tijdens een bijeenkomst van de ECFIA en de HSE in Chester op 26 september 1993 en voor 
en op basis van een tweede interlaboratoriumproef is ontwikkeld (1, 
2). Deze meetmethode kan worden gebruikt voor de karakterisering van de vezeldiameter van bulkstoffen of producten die MMMF be ­
vatten, zoals refractaire keramische vezels (RKV), synthetische glas ­
vezels (Man Made Vitreous Fibres — MMVF) of kristallijne en polykristallijne vezels.
 
Weging naar lengte is een methode om te compenseren voor het 
effect op de diameterdistributie ten gevolge van het breken van lange vezels bij de bemonstering of behandeling van het materiaal. Voor de meting van de grootteverdeling van MMMF-diameters worden 
meetkundige statistische methoden (meetkundig gemiddelde) ge ­
bruikt, omdat deze diameters meestal een grootteverdeling hebben die een lognormaalverdeling benadert.
 
Meting van de lengte èn de diameter is zowel saai als tijdrovend, 
maar als alleen de vezels worden gemeten die een oneindig dunne lijn in een REM-gezichtsveld raken, is de waarschijnlijkheid dat een 
bepaalde vezel wordt geselecteerd evenredig met de lengte daarvan. 
Aangezien daarmee de lengte in de berekening van de weging naar lengte wordt verdisconteerd, behoeft alleen nog de diameter te wor ­
den gemeten en kan de LWGMD-2SE volgens de beschrijving wor ­
den berekend.
 
1.2. DEFINITIES  
Deeltje : Een object met een lengte/breedte-verhouding van minder 
dan 3:1.  
Vezel : Een object met een lengte/breedte-verhouding (aspectverhou ­
ding) van ten minste 3:1.  
1.3. TOEPASSINGSGEBIED EN BEPERKINGEN  
De methode is bedoeld voor diameterdistributies met een mediane 
diameter van 0,5 μm tot 6 μm. Grotere diameters kunnen met een 
lagere REM-vergrotingsfactor worden gemeten, maar de methode krijgt steeds meer beperkingen voor kleinere vezels en als de medi ­
ane diameter kleiner is dan 0,5 μm, wordt een TEM-meting (trans ­
missie-elektronenmicroscoop) aanbevolen.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Uit de vezelmat of uit losse bulkvezels wordt een aantal representa ­
tieve boormonsters genomen. De lengte van de bulkvezels wordt met behulp van een vergruisprocedure verkleind en een representatief 
deelmonster wordt gedispergeerd in water. Er worden meetmonsters
 
geëxtraheerd, gefiltreerd over een polycarbonaatfilter met een porie ­
grootte van 0,2 μm en geprepareerd voor onderzoek met een raster ­
elektronenmicroscoop (REM). De vezeldiameters worden gemeten 
bij een vergrotingsfactor van 10 000 × of meer (  1 ) met behulp van 
een steekproefname langs een lijn om een zuivere raming van de mediane diameter te krijgen. Het onderste 95 %-betrouwbaarheids ­
interval (op basis van een eenzijdige toets) wordt berekend om een 
raming te krijgen van de laagste waarde van het meetkundig gemid ­
delde van de vezeldiameter van het materiaal.
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Veiligheids/voorzorgmaatregelen  
De blootstelling van personen aan vezels in de lucht moet tot een 
minimum worden beperkt en voor het hanteren van de droge vezels 
moet een zuurkast of een handschoenenkast worden gebruikt. Om de effectiviteit van de beperkende maatregelen te bepalen moet perio ­
diek monitoring van de blootstelling van personen worden uitge ­
voerd. Bij het hanteren van MMMF moeten wegwerphandschoenen 
worden gebruikt om huidirritatie te beperken en kruisbesmetting te voorkomen.
 
1.5.2.  Apparatuur  
— Pers en matrijzen (voor 10 MPa).  
— Polycarbonaatfilter met capillaire poriën met een poriegrootte van 
0,2 μm (diameter 25 mm).  
— Cellulose-ester membraanfilter met een poriegrootte van 5 μm 
dat als secundair filter kan worden gebruikt.  
— Glazen filtreerapparaat (of wegwerp-filtratiesystemen) voor filters 
met een diameter van 25 mm (bv. glazen microanalysekit van 
Millipore, typenr. XX10 025 00).  
— Vers gedestilleerd water dat is gefiltreerd over een filter met een 
poriegrootte van 0,2 μm om micro-organismen te verwijderen.  
— Sputter coater met een goud- of goud/palladiumtarget.  
— Rasterelektronenmicroscoop met een resolutie tot 10 nm en een 
vergrotingsfactor van 10 000 ×.  
— Diversen: spatels, scalpelmesje type 24, pincet, REM-buisjes, 
koolstoflijm of koolstofkleefband, zilverpasta.  
— Ultrasone sonde of ultrasoon bad (tafelmodel).  
— Monsterboor of kurkboor om boormonsters van een MMMF-mat 
te nemen.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Deze vergrotingsfactor is geschikt voor vezels van 3 μm; voor vezels van 6 μm zal een 
vergrotingsfactor van 5 000 × wellicht geschikter zijn.
 1.5.3.  Testprocedure  
1.5.3.1.  Monstername  
Voor matten en platen wordt een 25 mm monsterboor of kurkboor 
gebruikt om monsters van de doorsnede te nemen. Deze moeten 
gelijkmatig gespreid over de breedte van een klein stuk van de 
mat worden genomen of, als een langer stuk van de mat beschikbaar is, uit aselect gekozen plaatsen. Dezelfde apparatuur kan worden gebruikt om aselecte monsters uit losse vezels te nemen. Indien 
mogelijk moeten er zes monsters worden genomen om de ruimtelijke 
variatie in het bulkmateriaal te verdisconteren.
 
De zes boormonsters worden in een matrijs met een diameter van 
50 mm bij 10 Mpa verbrijzeld. Het materiaal wordt met een spatel 
gemengd en opnieuw aan 10 Mpa blootgesteld. Vervolgens wordt het materiaal uit de matrijs verwijderd en in een gesloten glazen fles bewaard.
 
1.5.3.2.  Monstervoorbereiding  
Indien nodig kan organisch bindmiddel worden verwijderd door de 
vezels gedurende ongeveer één uur bij 450 °C in een oven te leggen.  
Verdeel het monster in vieren door een kegelvormig hoopje te ma ­
ken en dit in vieren te verdelen („cone and quarter”-techniek) (dit 
moet in een zuurkast gebeuren).  
Voeg met een spatel een kleine hoeveelheid (< 0,5 g) monster toe 
aan 100 ml vers gedestilleerd water dat over een membraanfilter van 
0,2 μm is gefiltreerd (ook andere bronnen van ultrazuiver water 
mogen worden gebruikt, als is aangetoond dat deze aan de eisen voldoen). Dispergeer grondig met een ultrasone sonde die bij een 
vermogen van 100 W zodanig is ingesteld dat cavitatie optreedt (als 
er geen sonde beschikbaar is, wordt de volgende methode gebruikt: gedurende 30 seconden herhaaldelijk schudden en omkeren; gedu ­
rende vijf minuten ultrasoneren in een tafelmodel ultrasoon bad; 
vervolgens nog eens gedurende 30 seconden herhaaldelijk schudden 
en omkeren).
 
Onmiddellijk na het dispergeren van de vezels wordt met een pipet 
met brede opening (inhoud 2-5 ml) een aantal analysemonsters ge ­
nomen (bv. drie monsters van 3, 6 en 10 ml).  
Elk analysemonster wordt onder vacuüm gefiltreerd over een poly ­
carbonaatfilter van 0,2 μm op een secundair MEC-filter met een 
poriegrootte van 5 μm, waarbij een glazen filterkroes van 25 mm 
met een cilindrisch reservoir wordt gebruikt. In de filterkroes wordt ongeveer 5 ml gefiltreerd gedestilleerd water gebracht en het analy ­
semonster wordt langzaam in het water gepipetteerd, waarbij de 
pipetpunt onder de meniscus wordt gehouden. De pipet en het re ­
servoir moeten na het pipetteren grondig worden gespoeld, aangezien dunne vezels de neiging hebben aan het oppervlak te blijven.
 
Verwijder het filter voorzichtig, maak het los van het secundaire 
filter en leg het in een houder om te laten drogen.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Snij met een type 24 scalpelmes met een schokkende beweging een 
kwart of halve filterschijf met het filterresidu af. Plak de doorsnede 
met een stukje koolstofkleefband of koolstoflijm zorgvuldig op een REM-stub. Op ten minste drie plaatsen wordt zilverpasta aangebracht om het elektrisch contact aan de randen van het filter en de stub te 
verbeteren. Als de lijm/zilverpasta droog is, wordt met een sputter 
coater ongeveer 50 nm goud of goud/palladium op het oppervlak van het neerslag aangebracht.
 
1.5.3.3.  REM: kalibratie en uitvoering  
1.5.3.3.1. K a l i b r a t i e  
De kalibratie van de REM moet ten minste één keer per week 
worden gecontroleerd (liefst één keer per dag) met een gecertificeerd 
kalibratierooster. De kalibratie moet aan de hand van een gecertifi ­
ceerde standaard worden gecontroleerd en als de gemeten waarde (REM) niet binnen ± 2 % van de gecertificeerde waarde ligt, moet de REM-kalibratie worden aangepast en opnieuw worden gecontro ­
leerd.
 
De REM moet met een reële monstermatrix bij een vergrotingsfactor 
van 2 000 × in staat zijn tot een resolutie van ten minste een mini ­
male zichtbare diameter van 0,2 μm. 
1.5.3.3.2. U i t v o e r i n g  
De REM moet worden gebruikt met een vergrotingsfactor van 
10 000 × (  1 ) onder omstandigheden die een goede resolutie met 
een aanvaardbaar beeld geven bij een lage aftastsnelheid van bijvoor ­
beeld 5 seconden per opname. Hoewel de operationele vereisten van 
verschillende REM’s kunnen uiteenlopen, wordt bij materialen met 
een betrekkelijk laag atoomgewicht in het algemeen de beste zicht ­
baarheid en resolutie verkregen bij gebruik van een versnellingsspan ­
ning van 5-10 keV met een kleine stipafmeting en een korte werk ­
afstand. Aangezien er een lineair traject wordt afgelegd, moet er een 
helling van 0° worden gebruikt om opnieuw scherpstellen tot een minimum te beperken of als de REM een eucentrische objecttafel heeft, moet de eucentrische werkafstand worden gebruikt. Er kan een 
lagere vergrotingsfactor worden gebruikt als het materiaal geen 
kleine vezels (kleine diameter) bevat en de vezeldiameter groot is (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Groottebepaling  
1.5.3.4.1. O n d e r z o e k b i j l a g e v e r g r o t i n g s f a c t o r o m h e t 
m o n s t e r t e e v a l u e r e n  
In eerste instantie wordt het monster bij een lage vergrotingsfactor 
onderzocht om na te gaan of grote vezels aan elkaar klitten en om de dichtheid van de vezels te bepalen. Als er te veel klitten zijn, wordt aanbevolen een nieuw monster te maken.
 
Met het oog op de statistische nauwkeurigheid moet er een minimaal 
aantal vezels worden gemeten en een hoge vezeldichtheid zal wel ­
licht wenselijk lijken, aangezien het bestuderen van lege velden tijd ­
rovend is en niet tot de analyse bijdraagt. Als het filter echter te veel materiaal bevat, wordt het moeilijk alle meetbare vezels te meten en omdat kleine vezels achter grotere vezels verborgen kunnen liggen, 
worden deze dan wellicht gemist.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Zie voor vezels van 3 μm de vorige voetnoot.
 Bij een vezeldichtheid van meer dan 150 vezels per millimeter van 
het lineaire traject kan een systematische fout tot een te hoge 
LWGMD leiden. Anderzijds leidt een lage vezelconcentratie tot een langere analysetijd en het is vaak kosteneffectief om een monster te maken met een vezeldichtheid die dichter bij het optimum ligt in 
plaats van tellingen te blijven uitvoeren bij filters met een lage con ­
centratie. Een optimale vezeldichtheid moet gemiddeld ongeveer één of twee telbare vezels per gezichtsveld bij een vergrotingsfactor 5 000 opleveren. De optimale dichtheid is echter wel afhankelijk 
van de grootte (diameter) van de vezels, dus de experimentator 
moet zijn kennis en ervaring gebruiken om te beoordelen of de vezeldichtheid in de buurt van de optimale dichtheid ligt of niet.
 
1.5.3.4.2. W e g i n g v a n d e v e z e l d i a m e t e r s n a a r l e n g t e  
Alleen de vezels die een op het scherm van de REM getrokken 
(oneindig) dunne lijn raken (of kruisen), worden geteld. Daartoe 
wordt over het centrum van het scherm een horizontale (of verticale) 
lijn getrokken.  
Er kan ook één punt in het centrum van het scherm worden aange ­
bracht, waarna een continue scan in één richting over het filter wordt gestart. Van elke vezel met een aspectverhouding van meer dan 3:1 die dit punt raakt of kruist, wordt de diameter gemeten en geregis ­
treerd.
 
1.5.3.4.3. G r o o t t e b e p a l i n g v a n d e v e z e l s  
Aanbevolen wordt ten minste 300 vezels te meten. Elke vezel wordt 
slechts eenmaal gemeten op het snijpunt met de lijn of het punt op het scherm (of vlakbij het snijpunt als de randen van de vezels niet goed te zien zijn). Als er vezels met een niet-uniforme doorsnede 
worden aangetroffen, wordt er een meting gebruikt van de gemid ­
delde diameter van de vezel. Bij de bepaling van de rand en het meten van de kortste afstand tussen de randen van de vezel moet zorgvuldig worden gewerkt. De groottebepaling kan on-line gebeu ­
ren of off-line met opgeslagen beelden of foto’s. Halfautomatische 
beeldmeetsystemen die de gegevens direct downloaden naar een spreadsheet worden aanbevolen, aangezien ze tijd besparen en fouten bij het overschrijven elimineren en de berekeningen kunnen worden 
geautomatiseerd.
 
Voor lange vezels moet bij een lage vergrotingsfactor worden ge ­
controleerd of de uiteinden niet naar het gezichtsveld van de meting 
terugkrullen, zodat vaststaat dat deze vezels slechts één keer worden gemeten.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Vezeldiameters hebben meestal geen normaalverdeling. Door een 
log-transformatie uit te voeren kan er echter een verdeling worden verkregen die de normaalverdeling benadert.
 
Bereken het rekenkundig gemiddelde (gemiddelde lnD) en de stan ­
daarddeviatie (SD  lnD ) van de natuurlijke logaritmen (lnD) van de n 
vezeldiameters (D): 
gemiddelde lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
ΣðlnD – gemiddelde lnD Þ 2 
n – 1 s 
(2) 
Om de standaardfout (SE  lnD ) te krijgen wordt de standaarddeviatie 
gedeeld door de vierkantswortel van het aantal metingen: 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Van het gemiddelde wordt twee keer de standaardfout afgetrokken 
en van deze waarde (gemiddelde minus twee keer de standaardfout) 
wordt de e-macht berekend; dit levert het meetkundig gemiddelde 
minus twee keer de standaardfout van het meetkundig gemiddelde: 
LWGMD – 2SE ¼ e ðgemiddelde lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden 
opgenomen:  
— de waarde van LWGMD-2SE;  
— eventuele afwijkingen van de procedure, met name degene die 
gevolgen kunnen hebben voor de precisie of de nauwkeurigheid van de resultaten, met een afdoende motivering.
 
4. REFERENTIES  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard me ­
thod to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety 
Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  1-OCTANOL/WATER-VERDELINGSCOËFFICIËNT: LANGZAAM- 
ROERENMETHODE  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 123 (2006) van de OESO 
(TG 123). De langzaam-roerenmethode („slow-stirring”-methode) heeft ac ­
curate waarden opgeleverd voor de 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt 
(P OW ) tot een log P  OW van 8,2 (1). Het is dan ook een geschikte experi ­
mentele benadering voor de directe bepaling van de P  OW van zeer hydrofobe 
stoffen.  
2. Andere methoden voor de bepaling van de 1-octanol/water-verdelingscoëf ­
ficiënt (P  OW ) zijn de „schudfles”-methode (2) en de bepaling van de P  OW 
aan de hand van het retentiegedrag bij omgekeerde-fase-HPLC (3). De 
„schudfles”-methode is gevoelig voor artefacten als gevolg van de overgang 
van microdruppeltjes octanol naar de waterfase. Hoe hoger de P  OW -waarde, 
hoe meer de aanwezigheid van deze druppeltjes in de waterfase leidt tot overschatting van de teststofconcentratie in het water. Daarom is het gebruik van deze methode beperkt tot stoffen met log P
 OW < 4. De tweede methode 
berust op betrouwbare gegevens van rechtstreeks bepaalde P  OW -waarden 
voor de kalibratie van het verband tussen het HPLC-retentiegedrag en de gemeten P
 OW -waarden. Er was een voorlopige OESO-testrichtlijn beschik ­
baar voor de bepaling van 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënten van ioni ­
seerbare stoffen (4), maar deze wordt niet langer gebruikt.  
3. Deze testmethode is ontwikkeld in Nederland. De nauwkeurigheid van de 
hier beschreven methoden is gevalideerd en geoptimaliseerd in een ringtest 
met medewerking van vijftien laboratoria (5).  
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
Significantie en gebruik  
4. Voor inerte organische stoffen zijn zeer significante verbanden gevonden 
tussen hun 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt (P  OW ) en hun bioaccumu ­
latie in vissen. Bovendien is een verband aangetoond tussen de P  OW en de 
toxiciteit voor vissen en de sorptie van chemicaliën aan vaste stoffen zoals bodems en sedimenten. Referentie (6) biedt een uitvoerig overzicht van deze 
verbanden.
 
5. Er is een grote verscheidenheid aan verbanden vastgesteld tussen de 1- 
octanol/water-verdelingscoëfficiënt en andere stofeigenschappen die van be ­
lang zijn voor milieutoxicologie en milieuchemie. Daardoor is de 1-octanol/ 
water-verdelingscoëfficiënt uitgegroeid tot een centrale parameter bij het beoordelen van het milieurisico van chemicaliën, alsmede bij het voorspel ­
len van de levensloop van chemicaliën in het milieu.
 
Toepassingsgebied  
6. De langzaam-roerenmethode wordt verondersteld de vorming van micro ­
druppeltjes uit druppeltjes 1-octanol in de waterfase te beperken. Hierdoor 
wordt overschatting van de concentratie in het water als gevolg van test ­
stofmoleculen in dergelijke druppeltjes vermeden. De langzaam-roeren ­
methode is dan ook bij uitstek geschikt voor de bepaling van de P  OW 
voor stoffen met een verwachte log P  OW -waarde van 5 of hoger, waarvoor 
de schudflesmethode (2) geneigd is foutieve resultaten te geven.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINITIE EN EENHEDEN  
7. De verdelingscoëfficiënt van een stof tussen water en een lipofiel oplosmid ­
del (1-octanol) is een maat voor de evenwichtsverdeling van de stof tussen de twee fasen. De verdelingscoëfficiënt tussen water en 1-octanol (P
 OW ) 
wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de evenwichtsconcentraties 
van de teststof in met water verzadigde 1-octanol (C  O ) en met 1-octanol 
verzadigd water (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Aangezien het om een verhouding van concentraties gaat, is de P  OW dimen­
sieloos. Meestal wordt de 10-logaritme van P  OW gegeven (log P  OW ). Van­
wege de temperatuurafhankelijkheid van de P  OW moet bij gerapporteerde 
gegevens de meettemperatuur worden vermeld.  
PRINCIPE VAN DE METHODE  
8. Om de verdelingscoëfficiënt vast te stellen worden water, 1-octanol en de 
teststof bij constante temperatuur met elkaar in evenwicht gebracht, waarna de concentraties van de teststof in de beide fasen worden bepaald.
 
9. De problemen bij de schudflesmethode, in verband met de vorming van 
microdruppeltjes tijdens het experiment, kunnen met de hier voorgestelde 
langzaam-roerenmethode worden verminderd. In het langzaam-roerenexperi ­
ment worden water, 1-octanol en de teststof in een thermostatisch geregelde geroerde reactor gebracht. Het roeren versnelt de uitwisseling tussen de fasen. De turbulentie als gevolg van het roeren blijft beperkt, waardoor de 
uitwisseling tussen 1-octanol en water wordt bevorderd zonder dat daarbij 
microdruppeltjes worden gevormd.
 
TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
10. Omdat de aanwezigheid van andere stoffen dan de teststof van invloed zou 
kunnen zijn op de activiteitscoëfficiënt van de teststof, moet deze als zuivere 
stof worden onderzocht. Voor de 1-octanol/water-verdelingstest moet de hoogste in de handel verkrijgbare zuiverheid worden gebruikt.
 
11. Deze methode is van toepassing op zuivere stoffen die niet dissociëren of 
verbindingen vormen en die geen significante grensvlakactiviteit vertonen. Zij is toepasbaar voor het bepalen van de verdelingscoëfficiënt tussen 1- 
octanol en water van dergelijke stoffen en van mengsels. Indien de methode 
voor mengsels wordt gebruikt, zijn de vastgestelde verdelingscoëfficiënten tussen 1-octanol en water voorwaardelijk en afhankelijk van de chemische samenstelling van het onderzochte mengsel en de elektrolytsamenstelling 
van de gebruikte waterfase. Mits aanvullende stappen worden genomen, is 
de methode ook toepasbaar voor verbindingen die dissociëren of verbindin ­
gen vormen (punt 12).
 
12. Wegens het voorkomen van meervoudige evenwichtstoestanden in water en 
1-octanol bij de 1-octanol/water-verdeling van dissociërende stoffen als or ­
ganische zuren en fenolen, organische basen en organometaalverbindingen, 
is de verdelingscoëfficiënt een voorwaardelijke constante die sterk afhangt 
van de elektrolytsamenstelling (7)(8). Bij het bepalen van de 1-octanol/wa ­
ter-verdelingscoëfficiënt moeten de pH en de elektrolytsamenstelling in het experiment dan ook worden gecontroleerd en gerapporteerd. De waardering 
van dergelijke verdelingscoëfficiënten vereist een deskundig oordeel. Op 
grond van de dissociatieconstanten moeten geschikte pH-waarden worden geselecteerd, zodat voor elke ionisatietoestand een verdelingscoëfficiënt wordt bepaald. Voor het onderzoeken van organometaalverbindingen zijn 
buffers nodig die geen complex vormen (8). Rekening houdend met be ­
staande kennis over het gedrag in water (complexconstanten, dissociatiecon ­
stanten), moeten de testomstandigheden zodanig worden gekozen dat een schatting kan worden gemaakt van de speciatie van de teststof in de water ­
fase. Ten behoeve van een gelijke ionsterkte in alle experimenten moet een 
achtergrondelektrolyt worden gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Bij het uitvoeren van de test op stoffen met een lage oplosbaarheid in water 
of een hoge P  OW kunnen problemen optreden doordat de concentraties in 
water zo laag kunnen worden dat het moeilijk wordt deze nog nauwkeurig te bepalen. Deze testmethode biedt aanwijzingen om met dit probleem om te gaan.
 
INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
14. De zuiverheid van de chemische reagentia moet ten minste pro analysi zijn. 
Aanbevolen wordt om ongemerkte teststoffen te gebruiken met bekende chemische samenstelling en bij voorkeur een zuiverheid van 99 %, dan 
wel met radioactieve koolstof gemerkte teststoffen met bekende chemische 
samenstelling en radiochemische zuiverheid. Bij merkstoffen met een korte halfwaardetijd moet voor het radioactief verval worden gecorrigeerd. Bij radioactief gemerkte teststoffen moet een analytische methode worden toe ­
gepast die specifiek is voor de verbinding, opdat de gemeten radioactiviteit 
rechtstreeks verband houdt met de teststof.
 
15. Een schatting van log P  OW kan worden verkregen met behulp van speciaal 
hiervoor in de handel verkrijgbare software of aan de hand van de ver ­
houding van de oplosbaarheidswaarden in beide oplosmiddelen.  
16. Alvorens met een langzaam-roerenexperiment een P  OW -waarde te bepalen 
moet de volgende informatie over een teststof beschikbaar zijn:  
a) structuurformule;  
b) geschikte analytische methoden voor de bepaling van de concentratie van 
de stof in water en 1-octanol;  
c) dissociatieconstante(n) van ioniseerbare stoffen (OESO-richtlijn 112 (9));  
d) oplosbaarheid in water (10);  
e) niet-biologische hydrolyse (11);  
f) gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (12);  
g) dampspanning (13).  
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Uitrusting en apparatuur  
17. Een standaard-laboratoriumuitrusting is vereist, in het bijzonder:  
— magneetroerders en teflongecoate roerstaafjes, gebruikt om de waterfase 
te roeren;  
— geschikte analyse-instrumenten voor het bepalen van de teststofconcen ­
tratie bij de verwachte concentraties;  
— een roervat met een kraan in de bodem. Afhankelijk van de schatting 
van log P  OW en de detectiegrens van de teststof moet worden overwogen 
een gelijkvormig reactievat van meer dan een liter te gebruiken, opdat 
een groot genoeg volume water kan worden gebruikt voor chemische extractie en analyse. Dit zal leiden tot hogere concentraties in het water ­
extract en daarmee een grotere betrouwbaarheid opleveren van de ana ­
lytische bepaling. Een tabel met schattingen van het minimaal benodigde volume, de detectiegrens van de verbinding, de geschatte log P
 OW en de 
oplosbaarheid in water is opgenomen in aanhangsel 1. De tabel is ge ­
baseerd op het verband tussen P  OW en de verhouding tussen de oplos ­
baarheidswaarden in octanol en water, volgens Pinsuwan  et al . (14):  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
waarbij  
SR ¼ S oct=S w (in molariteit);  
en op het verband volgens Lyman (15) voor het voorspellen van de 
oplosbaarheid in water. Waarden voor de oplosbaarheid in water die 
zijn berekend met de vergelijking uit aanhangsel 1 moeten worden be ­
schouwd als voorlopige schattingen. Er zij op gewezen dat het de ge ­
bruiker vrij staat een schatting te maken van de oplosbaarheid in water 
door middel van ieder ander verband waarvan hij of zij meent dat dit het 
verband tussen hydrofobiciteit en oplosbaarheid beter weergeeft. Voor vaste stoffen wordt hierbij aanbevolen het smeltpunt te betrekken bij het voorspellen van de oplosbaarheid. Bij gebruik van een gewijzigde ver ­
gelijking moet worden nagegaan of de vergelijking voor het berekenen 
van de oplosbaarheid in octanol nog opgaat. Een schematische weergave van een dubbelwandig glazen roervat met een volume van ongeveer een liter is opgenomen in aanhangsel 2. Van de verhoudingen van het re ­
actievat in aanhangsel 2 is gebleken dat ze gunstig zijn; deze moeten dan 
ook worden gehandhaafd bij gebruik van een apparaat van een andere omvang;
 
— een voorziening om de temperatuur tijdens het langzaam-roerenexperiment 
constant te houden is essentieel.  
18. Het reactievat moet zijn vervaardigd van inert materiaal, opdat de adsorptie 
aan het oppervlak van het reactievat verwaarloosbaar is.  
Bereiding van de testoplossingen  
19. De bepaling van de P  OW moet worden uitgevoerd met 1-octanol van de 
hoogste zuiverheid die in de handel verkrijgbaar is (ten minste + 99 %). Aanbevolen wordt de 1-octanol te zuiveren door extractie met zuur, base 
en water en vervolgens te drogen. Bovendien kan de 1-octanol worden 
gezuiverd door middel van destillatie. Bij de bereiding van de standaard ­
oplossingen van de teststof moet gezuiverde 1-octanol worden gebruikt. Het water dat voor de P
 OW -bepaling wordt gebruikt, moet zijn gedistilleerd in 
apparatuur van glas of kwarts, of verkregen uit een zuiveringssysteem. Ook 
kan HPLC-water worden gebruikt. Voor gedestilleerd water is filtratie door een 0,22 μm-filter vereist, en moeten blanco’s in het experiment worden 
opgenomen om na te gaan dat de geconcentreerde extracten geen onzui ­
verheden bevatten die kunnen interfereren met de teststof. Bij gebruik van 
een glasvezelfilter moet dit vooraf worden schoongemaakt door het ten minste drie uur bij 400 °C te verhitten.
 
20. Voorafgaand aan het experiment worden de beide oplosmiddelen met elkaar 
verzadigd door ze in een voldoende groot reactievat met elkaar in evenwicht 
te brengen. Hiertoe wordt het tweefasensysteem gedurende twee dagen ge ­
roerd.  
21. Een geschikte teststofconcentratie wordt gekozen en opgelost in 1-octanol 
(verzadigd met water). De 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt moet wor ­
den bepaald in verdunde oplossingen in 1-octanol en water. Daarom mag de 
teststofconcentratie niet hoger zijn dan 70 % van de oplosbaarheid van de stof, met een maximumconcentratie van 0,1 M in elk van beide fasen (1). De voor het experiment gebruikte 1-octanoloplossingen moeten vrij zijn van 
gesuspendeerde vaste teststofdeeltjes.
 
22. De geschikte hoeveelheid teststof wordt opgelost in 1-octanol (verzadigd 
met water). Als de geschatte waarde voor log P  OW hoger is dan 5, moet 
men goed opletten dat de voor het experiment gebruikte 1-octanoloplossin ­
gen geen gesuspendeerde vaste teststofdeeltjes bevatten. Daartoe moet bij 
een geschatte waarde van log P  OW > 5 de volgende werkwijze worden 
gevolgd:  
— de teststof wordt opgelost in 1-octanol (verzadigd met water);  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— de oplossing wordt lang genoeg weggezet om de gesuspendeerde vas ­
testofdeeltjes te laten bezinken. Gedurende het bezinkingsproces wordt 
de teststofconcentratie gemonitord;  
— nadat de gemeten concentraties in de 1-octanol-oplossing stabiele waar ­
den hebben bereikt, wordt de stockoplossing verdund met een geschikt volume 1-octanol;
 
— de concentratie van de verdunde stockoplossing wordt gemeten. Als de 
gemeten concentratie consistent is met de verdunning kan de verdunde stockoplossing worden gebruikt in het langzaam-roerenexperiment.
 
Extractie en analyse van de monsters  
23. Voor de bepaling van de teststofconcentratie moet een gevalideerde analyse ­
methode worden gebruikt. De onderzoekers moeten aantonen dat de con ­
centraties in de met water verzadigde 1-octanolfase en in de met 1-octanol 
verzadigde waterfase tijdens het experiment boven de bepaalbaarheidsgrens liggen van de gebruikte analysemethode. In gevallen waarin extractiemetho ­
den nodig zijn, moeten voorafgaand aan het experiment de recovery’s van 
de teststof uit de waterfase en uit de 1-octanolfase worden vastgesteld. Het 
analysesignaal moet worden gecorrigeerd voor blanco’s en er moet voor worden gezorgd dat geen carry-over van analyt van het ene monster naar het andere kan optreden.
 
24. Voorafgaand aan de analyse zijn waarschijnlijk extractie van de waterfase 
met een organisch oplosmiddel en preconcentratie van het extract nood ­
zakelijk. Om dezelfde reden is het noodzakelijk eventuele blancoconcentra ­
ties te verlagen. Daartoe moeten oplosmiddelen van hoge zuiverheid worden 
gebruikt, bij voorkeur oplosmiddelen voor restanalyse. Bovendien kan het 
voor het vermijden van kruisverontreiniging bevorderlijk zijn om te werken met vooraf zorgvuldig gereinigd glaswerk(bv. door te wassen met een op ­
losmiddel of tot hoge temperatuur te verhitten).
 
25. Een schatting van log P  OW kan worden verkregen met een schattingspro ­
gramma of op basis van het oordeel van een deskundige. Indien de waarde hoger is dan 6 moeten blancocorrecties en analytcarry-over nauwlettend worden gemonitord. Evenzo is het bij een geschatte log P
 OW > 6 geboden 
een surrogaatstandaard te gebruiken om te corrigeren voor de recovery. In 
de handel is een aantal softwareprogramma’s beschikbaar voor het schatten van log P
 OW ( 1 ), bv. Clog P(16), KOWWIN (17), ProLogP (18) en ACD log 
P (19). Beschrijvingen van de schattingaanpak zijn te vinden in de refe ­
renties (20-22).  
26. De bepaalbaarheidsgrenzen voor de teststofconcentratie in 1-octanol en wa ­
ter worden vastgesteld met behulp van beproefde methoden. Als vuistregel geldt dat de bepaalbaarheidsgrens van de methode kan worden bepaald als 
zijnde de concentratie in water of 1-octanol die een signaal-ruisverhouding 
geeft van tien. Er moet een geschikte extractie- en preconcentratiemethode worden gekozen en analytische recovery’s moeten eveneens worden gespe ­
cificeerd. Een geschikte preconcentratiefactor wordt gekozen om bij analy ­
tische bepaling een signaal van de vereiste sterkte te verkrijgen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Deze informatie wordt slechts gegeven om de gebruikers van dienst te zijn. Andere, 
equivalente computerprogramma’s kunnen worden gebruikt als kan worden aangetoond 
dat deze dezelfde resultaten geven.
 27. Op basis van de parameters van de analysemethode en de verwachte con ­
centraties wordt bepaald van welke orde van grootte de monsteromvang 
moet zijn voor een nauwkeurige bepaling van de stofconcentratie. Het ge ­
bruik van watermonsters die te klein zijn om voldoende analysesignaal te verkrijgen, moet worden vermeden. Het gebruik van buitensporig grote 
watermonsters moet eveneens worden vermeden, aangezien er anders te 
weinig water over is voor het minimaal vereiste aantal analysen (n = 5). In aanhangsel 1 wordt het minimale monstervolume aangegeven als functie van het volume van het reactievat, de detectiegrens van de teststof en de 
oplosbaarheid van de teststof.
 
28. De kwantitatieve bepaling van de teststoffen geschiedt door de kalibratie ­
curven van de respectieve verbinding te vergelijken. De concentraties van de geanalyseerde monsters moeten vergezeld gaan van de concentraties van de 
standaarden.
 
29. Voor teststoffen met een geschatte log P  OW > 6 moet voorafgaand aan de 
extractie een surrogaatstandaard aan het watermonster worden gekoppeld om 
de tijdens extractie en preconcentratie van de watermonsters optredende 
verliezen te registeren. Voor een nauwkeurige recoverycorrectie moeten de eigenschappen van de surrogaten vrijwel of geheel overeenkomen met die van de teststof. Bij voorkeur worden voor dit doel stabiele, isotopisch ge ­
merkte (bijvoorbeeld gedeutereerde of
 13 C-gemerkte) analogen van de be ­
treffende stoffen gebruikt. Indien het gebruik van gemerkte stabiele isotopen (bijvoorbeeld
 2 H of  13 C) niet mogelijk is, moet op basis van betrouwbare 
gegevens in de literatuur worden aangetoond dat de fysisch-chemische ei ­
genschappen van het surrogaat nagenoeg overeenkomen met die van de 
teststof. Bij vloeistof-vloeistofextractie van de waterfase kunnen zich emul ­
sies vormen. Dit kan worden beperkt door zout toe te voegen en de emulsie gedurende de nacht te laten bezinken. De voor de extractie en de precon ­
centratie van de monsters gebruikte methoden dienen te worden vermeld.
 
30. Monsters die uit de 1-octanolfase zijn onttrokken, kunnen zo nodig voor ­
afgaand aan de analyse worden verdund met een geschikt oplosmiddel. Bovendien wordt het gebruik van surrogaatstandaarden aanbevolen voor 
stoffen waarvoor recoveryexperimenten een grote mate van variatie hebben 
aangetoond in de recoveryexperimenten (een relatieve standaarddeviatie > 10 %).
 
31. De details van de analytische methode dienen te worden vermeld, waaronder 
de extractiemethode, de preconcentratie- en verdunningsfactoren, de instru ­
mentparameters, de kalibratieprocedure, het kalibratiebereik, de analytische recovery van de teststof uit water, de toevoeging van surrogaatstandaarden 
voor recoverycorrectie, blancowaarden, detectiegrenzen en bepaalbaarheids ­
grenzen.
 
Uitvoering van de test  
Optimale volumeverhoudingen 1-octanol/water  
32. Bij het kiezen van de water- en 1-octanolvolumes moet rekening worden 
gehouden met de bepaalbaarheidsgrenzen in 1-octanol en water, de precon ­
centratiefactoren die zijn toegepast op de watermonsters, de monstervolumes in 1-octanol en water, en de verwachte concentraties. Om experimentele 
redenen moet het volume 1-octanol in het langzaam-roerensysteem zodanig 
worden gekozen dat de 1-octanollaag dik genoeg is (> 0,5 cm) om een monster te kunnen nemen uit de 1-octanolfase zonder deze te verstoren.
 
33. Typische faseverhoudingen die worden gebruikt bij bepalingen van verbin ­
dingen met een log P  OW van 4,5 en hoger zijn 20 tot 50 ml 1-octanol en 
950 tot 980 ml water in een 1 litervat.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Testomstandigheden  
34. Tijdens de test wordt het reactievat thermostatisch geregeld om de tempe ­
ratuur tot op 1 °C constant te houden. De bepaling dient te worden uitge ­
voerd bij 25 °C.  
35. De proefopstelling moet worden beschermd tegen daglicht, hetzij door het 
experiment in een donkere ruimte uit te voeren, hetzij door het reactievat 
met aluminiumfolie te bedekken.  
36. Het experiment moet worden uitgevoerd in een (zo veel mogelijk) stofvrije 
omgeving.  
37. Het 1-octanol-watersysteem wordt geroerd tot zich een evenwicht heeft in ­
gesteld. In een pilotexperiment wordt de equilibratieperiode bepaald door 
een langzaam-roerenexperiment uit te voeren en op gezette tijden water- en 1-octanolmonsters te nemen. De monsters moeten worden genomen met een tussentijd van ten minste vijf uur.
 
38. Elke P  OW -bepaling moet worden uitgevoerd met ten minste drie onafhanke ­
lijke langzaam-roerenexperimenten.  
Bepaling van de equilibratietijd  
39. Aangenomen wordt dat zich een evenwicht heeft ingesteld wanneer een 
regressie van de 1-octanol/water-concentratieverhouding tegen de tijd over een periode van vier meetpunten een helling oplevert die niet significant 
afwijkt van nul bij een p-waarde van 0,05. De equilibratietijd is minimaal 
één dag voordat met de monsterneming kan worden begonnen. Als vuist ­
regel geldt dat de monsterneming van stoffen met een geschatte log P
 OW < 5 
op de dagen twee en drie kan plaatsvinden. Bij meer hydrofobe verbindin ­
gen kan het zijn dat de equilibratieperiode moet worden verlengd. Voor een 
verbinding met log P  OW = 8,23 (decachloorbifenyl) waren 144 uur vol ­
doende voor het instellen van een evenwicht. Of zich een evenwicht heeft ingesteld, wordt nagegaan door herhaaldelijk een monster te nemen uit 
hetzelfde reactievat.
 
Het experiment opstarten  
40. Bij het opstarten van het experiment wordt het reactievat gevuld met 1- 
octanol verzadigd water. Vervolgens wordt gewacht totdat de thermostatisch ingestelde temperatuur is bereikt.
 
41. De gewenste hoeveelheid teststof (opgelost in het vereiste volume met water 
verzadigde 1-octanol) wordt voorzichtig toegevoegd in het reactievat. Dit is 
een cruciale stap in het experiment, daar turbulente menging van de twee 
fasen vermeden moet worden. Daartoe kan de 1-octanolfase langzaam wor ­
den gepipetteerd tegen de wand van het proefvat, vlak boven het water ­
oppervlak. Het zal dan langs de glaswand stromen en een film vormen 
boven op de waterfase. Het rechtstreeks schenken van 1-octanol in het vat 
moet te allen tijde worden vermeden; er mogen geen 1-octanoldruppels rechtstreeks in het water vallen.
 
42. Nadat met roeren is begonnen, wordt de roersnelheid langzaam opgevoerd. 
Als de roermotoren niet op de vereiste manier kunnen worden ingesteld, moet worden overwogen een transformator te gebruiken. De roersnelheid 
moet zodanig worden ingesteld dat op het raakvlak van het water en de 1- 
octanol een vortex van 0,5 tot maximaal 2,5 cm diepte wordt gevormd. De roersnelheid moet worden verlaagd als de vortexdiepte van 2,5 cm wordt overschreden, aangezien anders microdruppeltjes kunnen worden gevormd 
uit druppeltjes 1-octanol in de waterfase, die leiden tot een overschatting van 
de teststofconcentratie in het water. De maximale roersnelheid van 2,5 cm vortexdiepte wordt aanbevolen op basis van de bevindingen uit het als ringtest uitgevoerde validatieonderzoek (5). Het is een compromis tussen 
een snelle evenwichtsinstelling en beperking van de vorming van micro ­
druppeltjes 1-octanol.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Monsterneming en monsterbehandeling  
43. Voordat een monster wordt genomen, moet de roerder worden uitgezet en 
moeten de vloeistoffen tot stilstand komen. Nadat het monster is genomen, wordt de roerder weer langzaam aangezet en wordt de roersnelheid weer 
geleidelijk opgevoerd, zoals hierboven beschreven.
 
44. Monsters uit de waterfase worden genomen via een kraan in de bodem van 
het reactievat. Het dode volume aan water dat zich in de kranen bevindt (in het in aanhangsel 2 beschreven vat ongeveer 5 ml) moet altijd worden weggegooid. Het water in de kranen wordt namelijk niet geroerd en is 
dan ook niet in evenwicht met de bulk. Noteer het volume van de water ­
monsters en zorg dat rekening wordt gehouden met de hoeveelheid teststof in het weggegooide water wanneer een massabalans wordt opgesteld. Ver ­
lies door verdamping moet zo veel mogelijk worden beperkt door het water 
rustig in de scheitrechter te laten lopen, zodat de water-1-octanollaag niet 
wordt verstoord.
 
45. 1-octanolmonsters worden verkregen door afname van een klein aliquot (ca. 
100 μl) uit de 1-octanollaag met een 100 microliterspuit van glas en metaal. 
Pas op dat het grensvlak niet wordt verstoord. Het volume van het vloei ­
stofmonster wordt opgeschreven. Een klein aliquot is voldoende, daar het 1- 
octanolmonster nog wordt verdund.  
46. Om onnodige overbrengingsstappen van het monster te vermijden moet het 
monstervolume gravimetrisch worden bepaald. Bij watermonsters kan dit 
worden gedaan door het watermonster in een scheitrechter op te vangen die al de vereiste hoeveelheid oplosmiddel bevat.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
47. Volgens deze testmethode wordt de P  OW bepaald door drie 
langzaam-roerenexperimenten uit te voeren (drie proefnemingen) met de te onderzoeken verbinding, onder identieke omstandigheden. De regressie om 
aan te tonen dat evenwicht is bereikt, moet zijn gebaseerd op de resultaten 
van ten minste vier bepalingen van C
 O /C W op opeenvolgende tijdstippen. 
Op die manier kan de variantie worden berekend als maat voor de onze ­
kerheid van de gemiddelde waarde die bij elke proefneming wordt verkre ­
gen. 
48. De P  OW kan worden gekarakteriseerd door de variantie in de gegevens die 
in elke proefneming zijn verkregen. Deze informatie wordt gebruikt om de 
P OW te berekenen als gewogen gemiddelde van de resultaten van de indi ­
viduele proefnemingen. Daartoe wordt de inverse variantie van de resultaten van de proefnemingen als gewicht gebruikt. Op die manier zullen gegevens 
met een grote spreiding (uitgedrukt in de variantie), en dus een lagere 
betrouwbaarheid, minder invloed hebben op de uitkomst dan gegevens met een lage variantie.
 
49. Op soortgelijke wijze wordt de gewogen standaarddeviatie berekend. Dit is 
een maat voor de herhaalbaarheid van de P  OW -meting. Een lage waarde 
voor de gewogen standaarddeviatie geeft aan dat de P  OW -bepaling binnen 
hetzelfde laboratorium een hoge herhaalbaarheid had. De formele statische 
behandeling van de gegevens wordt hieronder geschetst.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Verwerking van de resultaten  
Het aantonen dat een evenwicht is bereikt  
50. Voor iedere monstertijd wordt de logaritme berekend van de verhouding van 
de teststofconcentratie in 1-octanol en water (log (C  O /C w )). Het bereiken van 
chemisch evenwicht wordt aangetoond door deze verhouding uit te zetten tegen de tijd. Als deze curve een plateau laat zien op basis van ten minste 
vier opeenvolgende tijdpunten toont dit aan dat een evenwicht is bereikt, en 
dat de verbinding daadwerkelijk in de 1-octanol is opgelost. Zo niet, dan moet de test worden voortgezet totdat vier opeenvolgende tijdpunten een helling opleveren die niet significant afwijkt van 0 bij een p-waarde van 
0,05, hetgeen aangeeft dat log C
 o /C w niet langer afhangt van de tijd.  
Berekening van log P  OW 
51. De waarde van log P  OW van de proefneming wordt berekend als het gewo ­
gen gemiddelde van log C  o /C w voor het deel van de curve van log C  o /C w 
tegen de tijd waarvoor evenwicht is aangetoond. Het gewogen gemiddelde 
wordt berekend door de gegevens gewicht toe te kennen op basis van de inverse variantie, zodat de invloed van de gegevens op de einduitkomst omgekeerd evenredig is aan de onzekerheid van de gegevens.
 
Gemiddelde log P  OW 
52. De gemiddelde waarde van log P  OW van de verschillende proefnemingen 
wordt berekend als het gemiddelde van de uitkomsten van de individuele proefnemingen, gewogen naar hun respectieve varianties.
 
De berekening gaat als volgt:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
waarbij  
log P  OW,i = de log P  OW -waarde van de individuele proefneming i;  
log P  OW,Av  = de gewogen gemiddelde waarde van de individuele log P  OW - 
bepalingen;  
w i = het statistische gewicht dat aan de log P  OW -waarde van 
proefneming i wordt toegekend.  
Voor w  i wordt de reciproque waarde van de variantie van log P  OW,i gebruikt 
(w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 ). 
53. De fout in het gemiddelde van log P  OW , wordt geschat als de herhaalbaar ­
heid van de log C  o /C w die is bepaald in de evenwichtsfase in de verschil ­
lende proefnemingen, en deze wordt uitgedrukt als de gewogen standaard ­
deviatie van log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ), die op haar beurt een maat is voor de 
fout in log P  OW,Av  . De gewogen standaarddeviatie kan als volgt worden 
berekend uit de gewogen variantie (var  log Pow,Av  ): 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Het symbool n staat voor het aantal proefnemingen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Testverslag  
54. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de structuur ­
formule (waarin de plaats van het label wordt aangegeven bij gebruik van een radioactief gemerkte stof) en relevante fysisch-chemische eigen ­
schappen (zie punt 17),
 
— de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof,  
— de zuiverheid van het label van gemerkte chemicaliën en molaire acti ­
viteit (indien van toepassing),  
— de voorlopige schatting van log P  OW , alsmede de gebruikte methode om 
deze waarde af te leiden.  
Testomstandigheden:  
— de data waarop de onderzoeken zijn uitgevoerd,  
— de temperatuur tijdens het experiment,  
— de beginvolumes 1-octanol en water,  
— de volumes van de 1-octanol- en watermonsters,  
— de restvolumes 1-octanol en water in de testvaten,  
— een beschrijving van de testvaten en de gebruikte roeromstandigheden 
(vorm van het roerstaafje en het testvat, vortexdiepte in mm en, indien 
beschikbaar, de roersnelheid),  
— de gebruikte analysemethoden om de teststofconcentratie te bepalen en 
de bepaalbaarheidsgrens van de methode;  
— de monsternemingsintervallen,  
— de pH van de waterfase en de gebruikte buffers, wanneer de pH is 
bijgesteld voor ioniseerbare moleculen,  
— het aantal replicaatbepalingen.  
Resultaten:  
— de herhaalbaarheid en de gevoeligheid van de gebruikte analysemetho ­
den, 
— de gemeten teststofconcentraties in 1-octanol en water in de tijd,  
— de massabalans,  
— de temperatuur en standaarddeviatie of het bereik van de temperatuur 
tijdens het experiment,  
— een regressie van de concentratieverhouding tegen de tijd,  
— de gemiddelde waarde voor log P  ow,Av  met standaardfout,  
— een bespreking en interpretatie van de resultaten;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— voorbeelden van onbewerkte gegevens van representatieve analysen (alle 
ruwe gegevens moeten worden opgeslagen overeenkomstig 
GLP-normen) inclusief recovery’s van surrogaten, het aantal kalibratie ­
niveaus (samen met de criteria voor de correlatiecoëfficiënt van de ka ­
libratiecurve), en de resultaten van de kwaliteitsgarantie/kwaliteitscon ­
trole (QA/QC),  
— indien beschikbaar: validatierapport van de bepalingsmethode (op te 
nemen als referentie).  
LITERATUUR:  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Envi ­
ron. Toxicol. Chem. 8: 499-512.  
(2) Hoofdstuk A.8 van deze bijlage, Verdelingscoëfficiënt.  
(3) Hoofdstuk A.8 van deze bijlage, Verdelingscoëfficiënt.  
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Paris.  
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.  
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dis ­
sociation Constants in Water. Paris.  
(10) Hoofdstuk A.6 van deze bijlage, Oplosbaarheid in water.  
(11) Hoofdstuk C.7 van deze bijlage, Afbraak — Niet-biologische afbraak: 
hydrolyse in afhankelijkheid van de pH.  
(12) Hoofdstuk C.4 — Delen II tot en met VII (methoden A tot en met F) van 
deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid.  
(13) Hoofdstuk A.4 van deze bijlage, Dampspanning.  
(14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623- 
626. 
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Ly ­
man WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 tot en met 2-52.
 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Che ­
mical Information Systems, Irvine, CA.  
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, 
Reehl WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, DC.  
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488.  
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen Che ­
mie: 386-390.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Aanhangsel 1  
Spreadsheet voor het berekenen van de minimaal benodigde volumes water 
voor de detectie van teststoffen met verschillende log P  OW -waarden in de 
waterfase  
Aannamen:  
— het maximumvolume van de individuele aliquots = 10 % van het totaalvolu ­
me; 5 aliquots = 50 % van het totaalvolume,  
— deconcentratievandeteststoffen  ¼ 0; 7 Ü deoplosbaarheidinbeidefasen. Bij la ­
gere concentraties zouden grotere volumes nodig zijn,  
— het volume voor het bepalen van de detectiegrens = 100 ml,  
— log P  ow tegen log S  w en log P  ow tegen SR (S  oct /S w ) zijn goede manieren om 
de verbanden voor teststoffen weer te geven.  
Geschatte S  w 
Log P  ow Vergelijking Log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Geschatte S  oct 
Log P  ow Vergelijking S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Totale massa 
teststof 
(mg) Massa  oct /Massa  water Massa  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Massa  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Berekening volumes  
Minimaal benodigd volume voor de H  2 O-fase bij iedere detectiegrensconcentratie  
Log K  ow Detectiegrens (mg/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Gebruikt 
volume voor 
detectiegrens 
(l) 0,1 
Verklaring bij berekeningen  
Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat 
van 1 liter.  
Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat 
van 2 liter.  
Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat 
van 5 liter.  
Staat voor < 10 % van het totaalvolume van de waterfase in een equilibratievat 
van 10 liter.  
Is zelfs meer dan 10 % in een equilibratievat van 10 liter.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Overzicht van de benodigde volumes als functie van de oplosbaarheid in water en log P  ow 
Minimaal benodigd volume voor de H  2 O-fase bij elke detectiegrensconcentratie (ml)  
Log P  ow S w (mg/l) Detectiegrens (mg/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
Log P  ow S w (mg/l) Detectiegrens (mg/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Gebruikt volume voor 
detectiegrens (l) 0,1 
Aanhangsel 2  
Voorbeeld van een dubbelwandig glazen testvat voor de bepaling van P  OW 
met de langzaam-roerenmethode
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
DEEL B: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT EN 
ANDERE INVLOEDEN OP DE GEZONDHEID  
INHOUD 
ALGEMENE INLEIDING 
B.1 bis. ACUTE ORALE TOXICITEIT: PROCEDURE MET VASTE 
DOSES 
B.1 ter. ACUTE ORALE TOXICITEIT: METHODE TER BEPALING 
VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE 
B.2. ACUTE INHALATIETOXICITEIT 
B.3. ACUTE DERMALE TOXICITEIT 
B.4. ACUTE TOXICITEIT: HUIDIRRITATIE/CORROSIE 
B.5. ACUTE TOXICITEIT: OOGIRRITATIE/CORROSIE 
B.6. SENSIBILISATIE VAN DE HUID 
B.7. TOXICITEITSONDERZOEK (ORAAL) OP KNAAGDIEREN 
BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN) 
B.8. SUBACUTE INHALATIETOXICITEIT: ONDERZOEK VAN 28 
DAGEN 
B.9. TOXICITEIT (DERMAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING 
(28 DAGEN) 
B.10. MUTAGENITEIT —  IN VITRO  TEST OP CHROMOSOOM ­
AFWIJKINGEN IN ZOOGDIERCELLEN 
B.11. MUTAGENITEIT —  IN VIVO  TEST OP CHROMOSOOM ­
AFWIJKINGEN IN BEENMERGCELLEN VAN ZOOGDIEREN 
B.12. MUTAGENITEIT —  IN VIVO  MICRONUCLEUSTEST BIJ 
ERYTROCYTEN VAN ZOOGDIEREN 
B.13/14. MUTAGENITEIT: TERUGMUTATIETEST MET BACTERIËN 
B.15. MUTAGENITEITSONDERZOEK EN SCREENING OP CARCI ­
NOGENESE: GENMUTATIE- SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.16. MITOTISCHE RECOMBINATIE — SACCHAROMYCES CE ­
REVISIAE 
B.17. MUTAGENITEIT —  IN VITRO  GENMUTATIETEST MET 
ZOOGDIERCELLEN 
B.18. DNA-BESCHADIGING EN -HERSTEL — DNA-HERSTEL ­
SYNTHESE — ZOOGDIERCELLEN  IN VITRO  
B.19. ZUSTERCHROMATIDEN-UITWISSELINGSTEST  IN VITRO  
B.20. GESLACHTSGEBONDEN RECESSIEVE LETALITEITSTEST 
MET  DROSOPHILA MELANOGASTER  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. ZOOGDIERENCELTRANSFORMATIETEST  IN VITRO  
B.22. ONDERZOEK NAAR DOMINANTE LETALE MUTATIES BIJ 
KNAAGDIEREN 
B.23. TEST OP CHROMOSOOMAFWUKINGEN IN SPERMATOGO ­
NIA VAN ZOOGDIEREN 
B.24. VLEKKENTEST BIJ MUIZEN 
B.25. ERFELIJKE TRANSLOCATIES BIJ DE MUIS 
B.26. SUBCHRONISCHE ORALE TOXICITEITSTEST: TOXICI ­
TEITSONDERZOEK (ORAAL) OP KNAAGDIEREN BIJ HER ­
HAALDE TOEDIENING (90 DAGEN) 
B.27. SUBCHRONISCHE ORALE TOXICITEITSTEST: TOXICI ­
TEITSONDERZOEK (ORAAL) OP DIEREN ANDERS DAN 
KNAAGDIEREN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (90 DA ­
GEN) 
B.28. SUBCHRONISCHE DERMALE TOXICITEITSTEST: 90 DA ­
GEN-TEST MET HERHAALDE DERMALE TOEDIENING AAN KNAAGDIERSOORTEN 
B.29. SUBCHRONISCHE INHALATIETOXICITEIT: ONDERZOEK 
VAN 90 DAGEN 
B.30. ONDERZOEK NAAR CHRONISCHE TOXICITEIT 
B.31. ONDERZOEK NAAR PRENATALE ONTWIKKELINGSTOXI ­
CITEIT 
B.32. CARCINOGENITEITSONDERZOEK 
B.33. GECOMBINEERD ONDERZOEK NAAR CHRONISCHE 
TOXICITEIT EN CARCINOGENITEIT 
B.34. REPRODUCTIETOXICITEITSONDERZOEK OVER ÉÉN GE ­
NERATIE 
B.35. REPRODUCTIETOXICITEITSONDERZOEK OVER TWEE GE ­
NERATIES 
B.36. TOXICOKINETIEK 
B.37. VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE 
FOSFORVERBINDINGEN NA ACUTE BLOOTSTELLING 
B.38. VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE 
FOSFORVERBINDINGEN BIJ HERHAALDE TOEDIENING 
(28 DAGEN) 
B.39.  IN VIVO  TEST OP DNA-HERSTELSYNTHESE IN LEVER ­
CELLEN VAN ZOOGDIEREN 
B.40.  IN VITRO  HUIDCORROSIE: TEST OP BASIS VAN DE 
TRANSCUTANE ELEKTRISCHE WEERSTAND (TEW) 
B.40 BIS.  IN VITRO  HUIDCORROSIE: TEST MET HUMAAN HUIDMO ­
DEL
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU FOTOTOXICITEITSTEST 
B.42. HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST 
B.43. NEUROTOXICITEITSONDERZOEK BIJ KNAAGDIEREN 
B.44. ABSORPTIE DOOR DE HUID:  IN VIVO  METHODE 
B.45. ABSORPTIE DOOR DE HUID:  IN VITRO  METHODE 
B.46. IN-VITROHUIDIRRITATIE: TESTMETHODE MET GE ­
RECONSTRUEERDE HUMANE EPIDERMIS 
B.47. BOVINE CORNEAL OPACITY AND PERMEABILITY (BCOP-) 
TESTMETHODE VOOR DE IDENTIFICATIE VAN VOOR DE OGEN CORROSIEVE EN HEVIG IRRITERENDE STOFFEN 
B.48. ISOLATED CHICKEN EYE-TESTMETHODE VOOR DE 
IDENTIFICATIE VAN VOOR HET OOG CORROSIEVE EN HEVIG IRRITERENDE STOFFEN 
B.49. IN-VITROMICRONUCLEUSTEST BIJ ZOOGDIERCELLEN 
B.50. HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: AA 
B.51. HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: 
BrdU-ELISA
 
▼M4 
B.52. ACUTE INHALATIETOXICITEIT: METHODE TER BEPA ­
LING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE  
▼M5 
B.53. ONDERZOEK NAAR ONTWIKKELINGSNEUROTOXICITEIT 
B.54. UTEROTROFE BIOASSAY BIJ KNAAGDIEREN: EEN KORT ­
LOPENDE SCREENINGSTEST OP OESTROGENE EIGEN ­
SCHAPPEN 
B.55. HERSHBERGER-BIOASSAY BIJ RATTEN: EEN KORTLO ­
PENDE SCREENINGSTEST OP (ANTI)ANDROGENE EIGEN ­
SCHAPPEN 
B.56. UITGEBREID ONDERZOEK NAAR REPRODUCTIETOXICI ­
TEIT OVER ÉÉN GENERATIE 
B.57. H295R-STEROÏDOGENESETEST 
B.58. GENMUTATIETESTEN MET SOMATISCHE CELLEN EN GE ­
SLACHTSCELLEN VAN TRANSGENE KNAAGDIEREN  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
ALGEMENE INLEIDING  
A. KARAKTERISERING VAN DE TESTSTOF  
De samenstelling van de teststof, met inbegrip van de voornaamste 
verontreinigingen, en de relevante fysisch-chemische eigenschappen, 
waaronder de stabiliteit, moeten vóór de aanvang van ieder toxici ­
teitsonderzoek bekend zijn.  
De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof leveren belang ­
rijke informatie over de keuze van de manier van toedienen, de opzet van ieder afzonderlijk onderzoek en het hanteren en bewaren van de teststof.
 
Alvorens het onderzoek wordt aangevat, moet een analytische me ­
thode voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de teststof 
(zo mogelijk met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen) in 
het toedieningsmedium en in het biologisch materiaal ontwikkeld worden.
 
Alle gegevens met betrekking tot de identificatie, de fysisch-che ­
mische eigenschappen, de zuiverheid en het gedrag van de teststof moeten in het onderzoeksrapport worden opgenomen.
 
B. VERZORGING VAN DE DIEREN  
Bij toxiciteitstests zijn een stringente bewaking van de levensomstan ­
digheden en een goede verzorging van de dieren een eerste vereiste.  
i) Huisvesting  
De leefomstandigheden in de kamers of ruimten waar de proefdieren 
zijn ondergebracht, moeten geschikt zijn voor het soort proefdier. Voor ratten, muizen en cavia's is een kamertemperatuur van 22
 o C 
± 3 o C en een relatieve luchtvochtigheid van 30-70 % geschikt; voor 
konijnen moet de temperatuur 20  o C + 3  o C en de relatieve lucht ­
vochtigheid 30-70 % bedragen.  
Sommige experimentele technieken zijn bijzonder gevoelig voor 
temperatuureffecten; in dergelijke gevallen wordt in de beschrijving 
van de onderzoekmethode nader ingegaan op de correcte proef ­
omstandigheden. Bij ieder onderzoek naar toxische effecten moeten de temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd, opge ­
tekend en in het eindverslag van de studie worden opgenomen.
 
Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met afwisselend 
twaalf uur licht — twaalf uur duisternis. Nadere gegevens over de 
verlichting moeten worden opgetekend en in het eindverslag worden opgenomen.
 
Tenzij anders bij de methode vermeld, worden de dieren hetzij af ­
zonderlijk, hetzij in kleine groepen van hetzelfde geslacht gehuisvest In het laatste geval mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden 
gehuisvest.
 
Het is belangrijk om in verslagen over dierproeven steeds te ver ­
melden welk soort kooien is gebruikt en hoeveel dieren tijdens de 
blootstelling aan de chemische stof en tijdens latere waarnemings ­
perioden in iedere kooi waren gehuisvest.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Voeding  
Bij de samenstelling van het voedsel moet worden voldaan aan alle 
eisen die de proefdiersoorten aan hun voeding stellen. Indien che ­
mische stoffen via de voeding aan de dieren worden toegediend, kan 
de voedingswaarde door interactie tussen de stof en een bestanddeel 
van de voeding verminderd worden. Bij het interpreteren van de resultaten dient rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van dergelijke reacties. Er kan gebruik worden gemaakt van gebrui ­
kelijk laboratoriumvoeder met een onbeperkte hoeveelheid drink ­
water. De keuze van het voedsel kan mede worden bepaald door de noodzaak de teststof, wanneer die via het voedsel wordt toe ­
gediend, op een passende wijze daarmee te vermengen.
 
Onzuiverheden in de voeding waarvan bekend is dat ze de toxiciteit 
beïnvloeden, mogen niet in werkzame concentraties voorkomen.  
C. ALTERNATIEVE TESTEN  
De Europese Unie maakt zich sterk voor het ontwikkelen en valide ­
ren van alternatieve technieken die dezelfde hoeveelheid informatie opleveren als de huidige dierproeven, maar waarbij minder proefdie ­
ren worden gebruikt, die minder lijden veroorzaken of die het ge ­
bruik van dieren volledig overbodig maken.
 
Naarmate dergelijke methoden ter beschikking komen, moet het ge ­
bruik ervan waar mogelijk worden overwogen voor de risicobeoor ­
deling en de daaruit voortvloeiende classificatie en etikettering ten 
aanzien van de intrinsieke risico's.  
D. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Bij de evaluatie en interpretatie van de testresultaten moet rekening 
worden gehouden met de beperkingen ten aanzien van de mate waarin de resultaten van dierproeven en  in-vitro  tests kunnen worden 
geëxtrapoleerd naar de mens. Daarom kunnen aanwijzingen voor 
schadelijke effecten bij de mens, indien beschikbaar, gebruikt wor ­
den als bevestiging van de testresultaten.
 
E. LITERATUUR  
De meeste van deze methoden zijn ontwikkeld binnen het kader van 
het OESO-programma inzake richtsnoeren voor het testen; zij moe ­
ten worden toegepast overeenkomstig de beginselen van „goede la ­
boratoriumpraktijken”, om zoveel mogelijk te komen tot „onderlinge 
acceptatie van gegevens”.  
Verdere informatie kan worden gevonden in de referenties die te 
vinden zijn in de OESO-richtsnoeren en in relevante literatuur die 
elders is gepubliceerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.l bis.  ACUTE ORALE TOXICITEIT: PROCEDURE MET VASTE 
DOSES  
1. METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan TG 420 (2001) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
Bij klassieke methoden voor de bepaling van de acute toxiciteit 
wordt de dood van dieren als eindpunt gebruikt. In 1984 is door de British Toxicology Society een nieuwe aanpak voor acute toxici ­
teitstests voorgesteld op basis van de toediening van een reeks vaste 
doses (1). Deze aanpak gebruikt niet meer de dood van dieren als 
eindpunt, maar berust op de observatie van duidelijke toxiciteitsver ­
schijnselen bij één van een reeks vaste doses. Na  in-vivo  validerings ­
onderzoek in het VK (2) en in internationaal verband (3) is deze 
procedure in 1992 als testmethode goedgekeurd. Vervolgens zijn de 
statistische eigenschappen van de procedure met vaste doses bij een reeks onderzoeken met behulp van mathematische modellen geëva ­
lueerd (4)(5)(6). Met de combinatie van  in-vivo -onderzoek en mo ­
dellen is aangetoond dat de procedure reproduceerbaar is, minder 
dieren gebruikt en minder leed veroorzaakt dan de klassieke metho ­
den en stoffen op een vergelijkbare wijze kan rangschikken als de andere testmethoden voor acute toxiciteit.
 
Richtsnoeren voor de keuze van de meest geschikte testmethode 
voor een bepaald doel worden gegeven in de leidraad voor tests op acute orale toxiciteit (7). Deze leidraad bevat ook aanvullende 
informatie over de uitvoering en interpretatie van testmethode B.l 
bis.
 
De methode heeft als beginsel dat bij het hoofdonderzoek slechts 
beperkt toxische doses worden gebruikt en dat de toediening van 
doses waarvan wordt verwacht dat ze dodelijk zijn, moet worden 
vermeden. Ook doses waarvan bekend is dat ze door een bijtende of sterk irriterende werking hevige pijn en leed veroorzaken, behoe ­
ven niet te worden toegediend. Stervende dieren of dieren die dui ­
delijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed ver ­
tonen, worden op humane wijze gedood en worden bij de interpre ­
tatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Er is een aparte leidraad met 
criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten 
worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen (8).
 
De methode levert informatie over de gevaarlijke eigenschappen op 
en maakt het mogelijk de stof te rangschikken en in te delen aan de hand van het „Globally Harmonised System” (GHS) voor de inde ­
ling van chemische stoffen die acute toxiciteit veroorzaken (9).
 
Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle 
beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Hierbij gaat het om informatie als de identiteit en de chemische structuur van de stof, de fysisch-chemische eigenschappen, de resultaten van 
andere met de stof uitgevoerde toxiciteitstests  in vivo  of in vitro , 
toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen en de voorgenomen toepassing(en) van de stof. Deze informatie is nodig om alle betrokkenen ervan te overtuigen dat de test relevant is voor 
de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt tevens bij 
de keuze van een geschikte aanvangsdosis.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINITIES  
Acute orale toxiciteit:  de schadelijke effecten die zich voordoen na 
orale toediening van één dosis van een stof of verschillende doses die binnen 24 uur worden toegediend.
 
Vertraagde sterfte:  houdt in dat een dier niet binnen 48 uur sterft of 
stervende is maar later gedurende de observatieperiode van 14 dagen 
sterft.  
Dosis:  de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uit ­
gedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bijvoorbeeld mg/kg).
 
Manifeste toxiciteit:  een algemene term die zodanige duidelijke 
toxiciteitsverschijnselen na de toediening van de teststof beschrijft 
(zie (3) voor voorbeelden), dat bij de eerstvolgende vaste dosis he ­
vige pijn en blijvende verschijnselen van ernstig leed, stervende dieren (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor criteria) 
of waarschijnlijke sterfte bij de meeste dieren kunnen worden ver ­
wacht.
 
GHS:  het „Globally Harmonised Classification System” voor che ­
mische stoffen en mengsels. Een samenwerkingsproject van de OESO (gezondheid van de mens en milieu), het Comité van deskun ­
digen voor het vervoer van gevaarlijke goederen van de VN (fysisch- 
chemische eigenschappen) en de ILO (communicatie van gevaren) dat wordt gecoördineerd door het Gezamenlijk programma voor een verantwoord beheer van chemische stoffen (IOMC).
 
Ophanden zijnde sterfte:  wanneer vóór het eerstvolgende geplande 
observatietijdstip een stervende toestand of sterfte wordt verwacht. 
Voorbeelden van indicaties voor deze toestand bij knaagdieren zijn convulsies, zijligging, liggende positie en tremors (zie de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden).
 
LD 50 (mediaan van de letale dosis):  een statistisch afgeleide enkel ­
voudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat 50 % 
van de dieren waaraan deze dosis oraal wordt toegediend, sterft. De LD
 50 wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseen ­
heid van het proefdier (mg/kg).  
Limietdosis:  een dosis die bij tests als bovengrens wordt gehanteerd 
(2 000 of 5 000 mg/kg).  
Stervende toestand:  een toestand waarop de dood volgt of waarin 
overleven onmogelijk is, zelfs wanneer het dier wordt behandeld (zie 
de leidraad voor humane eindpunten (8) voor meer bijzonderheden).  
Voorspelbare sterfte:  een toestand met klinische verschijnselen die 
wijzen op sterfte op een bekend tijdstip in de toekomst vóór het geplande einde van het experiment, bijvoorbeeld wanneer het dier 
geen water of voer kan bereiken (zie de leidraad voor humane eind ­
punten (8) voor meer bijzonderheden).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Groepen met dieren van hetzelfde geslacht krijgen stapsgewijs de 
vaste doses 5, 50, 300 en 2 000 mg/kg toegediend (bij wijze van uitzondering kan een extra vaste dosis van 5 000 mg/kg worden 
overwogen; zie punt 1.6.2). Op basis van een verkennende test wordt 
de aanvangsdosis gekozen, waarvan wordt verwacht dat er enige toxiciteitsverschijnselen optreden zonder dat er sprake is van ernstige toxische effecten of sterfte. Klinische verschijnselen en situaties die 
gepaard gaan met pijn, leed en ophanden zijnde sterfte, worden 
gedetailleerd in een aparte OESO-leidraad beschreven (8). Afhanke ­
lijk van het al dan niet optreden van toxiciteitsverschijnselen of 
sterfte kan er aan andere groepen dieren een hogere of lagere dosis 
worden toegediend. Deze procedure wordt gestaakt zodra de dosis wordt bepaald waarbij manifeste toxiciteit optreedt of ten hoogste één dier sterft, of wanneer blijkt dat er bij de hoogste dosis geen 
effecten worden geconstateerd of bij de laagste dosis dieren sterven.
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Keuze van de diersoort  
Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoor ­
ten kunnen worden gebruikt. Normaal gesproken worden vrouwtjes 
gebruikt (7), omdat uit literatuuronderzoek van klassieke LD  50 -tests 
blijkt dat er meestal weinig verschil in gevoeligheid tussen mannetjes en vrouwtjes is, maar wanneer er een verschil wordt geconstateerd, 
zijn vrouwtjes meestal iets gevoeliger (10). Als echter uit kennis 
omtrent de toxicologische of toxicokinetische eigenschappen van qua structuur verwante chemische stoffen blijkt dat mannetjes waar ­
schijnlijk gevoeliger zullen zijn, moeten mannetjes worden gebruikt. 
Wanneer de test bij mannetjes wordt uitgevoerd, moet hiervoor een 
afdoende motivering worden gegeven. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt.
 
De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet 
drachtig zijn. Elk dier moet bij de eerste toediening 8 tot 12 weken oud zijn en het lichaamsgewicht mag niet meer dan ± 20 % afwijken 
van het gemiddelde gewicht van dieren waaraan al eerder een dosis 
is toegediend.
 
1.4.2.  Huisvesting en voeding  
De temperatuur in de proefdierruimte dient 22  o C (± 3  o C) te zijn. 
Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunst ­
licht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding 
mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbe ­
perkte hoeveelheid drinkwater. De dieren mogen per dosis in groe ­
pen worden gehuisvest, maar het aantal dieren per kooi mag niet zo 
groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord.
 
1.4.3.  Voorbereiding van de dieren  
De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonder ­
lijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de toediening 
gedurende minimaal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de 
omstandigheden in het laboratorium te laten wennen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Bereiding van de dosis  
In het algemeen worden alle doses van de teststof in het hele test ­
bereik in een constant volume toegediend door de concentratie van de toegediende dosis te variëren. Wanneer echter een vloeibaar eind ­
product of mengsel wordt getest, kan het voor de latere risicobeoor ­
deling van die stof zinvoller zijn de teststof onverdund, d.w.z. met een constante concentratie, te gebruiken en sommige regelgevende instanties hebben dit verplicht gesteld. Het maximaal toe te dienen 
volume mag echter in geen geval worden overschreden. Het is af ­
hankelijk van de grootte van het proefdier welk volume vloeistof in één keer kan worden toegediend. Bij knaagdieren mag het volume 
normaal gesproken niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. 
Bij een waterige oplossing kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden overwogen. Voor de formulering van de dosis wordt waar mogelijk het gebruik van een waterige oplossing/suspensie/emulsie 
aanbevolen, in volgorde van voorkeur gevolgd door een oplossing/ ­
suspensie/emulsie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en eventueel een oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxicologische kenmerken van het 
medium bekend zijn. De dosis moet kort vóór de toediening worden 
bereid, tenzij de stabiliteit van het preparaat gedurende de gebruiks ­
periode bekend is en is aangetoond dat deze aanvaardbaar is.
 
1.5. PROCEDURE  
1.5.1.  Toediening van de dosis  
De teststof wordt in één dosis toegediend met een maagsonde of een 
geschikte katheter. In het uitzonderlijke geval dat één dosis niet 
mogelijk is, kan de dosis in kleinere porties worden verdeeld die 
in de loop van maximaal 24 uur worden toegediend.  
De dieren moeten vóór de toediening vasten (ratten mogen bijvoor ­
beeld de nacht vóór de toediening geen voer maar wel water krijgen en muizen gedurende 3-4 uur). Na de vastperiode worden de dieren 
gewogen en wordt de teststof toegediend. Na de toediening van de 
stof kan men ratten nog eens 3-4 uur en muizen nog eens 1-2 uur laten vasten. Wanneer een dosis in de loop van de tijd in porties 
wordt toegediend, kan het afhankelijk van de lengte van de periode 
nodig zijn de dieren voer en water te geven.
 
1.5.2.  Verkennende test  
De verkennende test is bedoeld om de juiste aanvangsdosis voor het 
hoofdonderzoek te kunnen kiezen. De teststof wordt overeenkomstig het stroomschema in bijlage 1 achtereenvolgens telkens aan één dier toegediend. De verkennende test is afgelopen wanneer er een beslis ­
sing kan worden genomen over de aanvangsdosis voor het hoofd ­
onderzoek (of als er bij de laagste vaste dosis een dier sterft).
 
Als aanvangsdosis voor de verkennende test wordt uit de vaste doses 
5, 50, 300 en 2 000 mg/kg de dosis gekozen waarvan wordt ver ­
wacht dat er manifeste toxiciteit optreedt, waar mogelijk op basis van 
gegevens uit  in-vitro - en in-vivo -onderzoek met dezelfde chemische 
stof en andere qua structuur verwante chemische stoffen. Wanneer deze informatie niet beschikbaar is, wordt 300 mg/kg als aanvangs ­
dosis gebruikt.
 
Er wordt ten minste 24 uur gewacht voordat een dosis aan het 
volgende dier wordt toegediend. Alle dieren worden gedurende ten 
minste 14 dagen geobserveerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis 
van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een 
hogere vaste dosis van 5 000 mg/kg worden overwogen (zie bijlage 3). Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in GHS-categorie 5 tot 2 000-5 000 mg/kg niet wenselijk en moeten 
deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de 
resultaten van die test van direct belang zijn voor de bescherming van de gezondheid van mensen of dieren of het milieu.
 
Wanneer een dier waaraan bij de verkennende test de laagste vaste 
dosis (5 mg/kg) is toegediend, sterft, is de normale procedure dat de 
test wordt afgesloten en de stof wordt ingedeeld in GHS-categorie 1 
(zie bijlage 1). Als de indeling echter moet worden bevestigd, kan de volgende facultatieve aanvullende procedure worden uitgevoerd. De dosis van 5 mg/kg wordt aan een tweede dier toegediend. Als dit 
tweede dier sterft. is de indeling in GHS-categorie 1 bevestigd en 
wordt het onderzoek onmiddellijk beëindigd. Als het tweede dier blijft leven, wordt de dosis van 5 mg/kg aan ten hoogste nog eens drie dieren toegediend. Omdat er een hoog risico op sterfte zal zijn, 
moet de dosis met het oog op het welzijn van dieren achtereenvol ­
gens aan telkens één dier worden toegediend. Vóór de toediening aan het volgende dier moet lang genoeg worden gewacht om vast te kunnen stellen dat het vorige dier waarschijnlijk zal blijven leven. 
Als er een tweede dier sterft, wordt de toediening onmiddellijk ge ­
staakt en worden er geen dieren meer gebruikt. Een tweede dier dat sterft, levert (ongeacht het aantal dieren dat bij beëindiging is getest) het resultaat A op (2 of meer dode dieren), zodat de indelingsregel 
van bijlage 2 bij de vaste dosis van 5 mg/kg wordt gevolgd (cate ­
gorie 1 als er 2 of meer dode dieren zijn en categorie 2 als er niet meer dan één dood dier is). Daarnaast geeft bijlage 4 een leidraad voor de indeling in het EU-systeem totdat het nieuwe GHS inge ­
voerd is.
 
1.5.3.  Hoofdonderzoek  
1.5.3.1.  Aantal dieren en dosisniveaus  
Het stroomschema in bijlage 2 geeft aan wat er na de test op het 
aanvangsniveau moet gebeuren. Er zijn drie mogelijkheden: de test wordt gestaakt en de desbetreffende gevaar-indelingscategorie wordt toegekend, de test wordt bij een hogere vaste dosis voortgezet of de 
test wordt bij een lagere vaste dosis voortgezet. Met het oog op de 
bescherming van dieren wordt een dosisniveau dat bij de verken ­
nende test een dood dier opleverde, bij het hoofdonderzoek niet opnieuw getest (zie bijlage 2). De ervaring heeft geleerd dat het 
meest waarschijnlijke resultaat bij de aanvangsdosis is dat de stof 
kan worden ingedeeld en dat er geen verdere tests nodig zijn.
 
Normaal gesproken worden er voor elk dosisniveau in totaal vijf 
dieren van hetzelfde geslacht gebruikt, namelijk het dier dat deze dosis bij de verkennende test toegediend heeft gekregen en nog eens 
vier dieren (behalve wanneer bij wijze van uitzondering een dosisni ­
veau van het hoofdonderzoek niet in de verkennende test was opge ­
nomen).
 
Het tijdsverloop tussen de toediening op elk niveau wordt bepaald 
door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnse ­
len. Met de toediening van een volgende dosis wordt gewacht totdat 
men er zeker van is dat de eerder geteste dieren blijven leven. Indien nodig wordt een periode van drie of vier dagen tussen de toediening op elk dosisniveau aanbevolen om observatie van vertraagde toxici ­
teit mogelijk te maken. Dit interval kan indien gewenst worden 
aangepast, bijvoorbeeld bij een onduidelijke reactie.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Wanneer het gebruik van een hoogste vaste dosis van 5 000 mg/kg 
wordt overwogen, moet de procedure van bijlage 3 worden gevolgd 
(zie ook punt 1.6.2).  
1.5.3.2.  Limiettest  
De limiettest wordt voornamelijk uitgevoerd wanneer er informatie is 
die erop wijst dat het testmateriaal waarschijnlijk niet toxisch is c.q. alleen toxisch is in hogere doses dan de limieten in de regelgeving. Informatie over de toxiciteit van het testmateriaal kan afkomstig zijn 
van kennis omtrent vergelijkbare geteste verbindingen of vergelijk ­
bare geteste mengsels of producten, waarbij rekening wordt gehou ­
den met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat ze in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er 
weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is 
of wordt verwacht dat het toxisch is, moet het hoofdonderzoek wor ­
den uitgevoerd.
 
De limiettest voor deze testmethode wordt volgens de normale pro ­
cedure uitgevoerd met een verkennende test met een aanvangsdosis van 2 000 mg/kg (of in uitzonderingsgevallen 5 000 mg/kg), gevolgd 
door de toediening van deze dosis aan nog eens vier dieren.
 
1.6. OBSERVATIE  
De dieren worden gedurende de eerste 30 minuten na de toediening 
ten minste éénmaal elk afzonderlijk geobserveerd, gedurende de eer ­
ste 24 uur periodiek met bijzondere aandacht voor de eerste vier uur en vervolgens dagelijks gedurende in totaal 14 dagen, behalve wan ­
neer ze met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek 
moeten worden genomen en op humane wijze moeten worden ge ­
dood of dood aangetroffen worden. De observatieduur is echter geen regel waarvan niet kan worden afgeweken. Deze moet worden be ­
paald aan de hand van de toxische reacties, het tijdstip waarop ze 
beginnen en de duur van de herstelperiode en kan dus worden ver ­
lengd indien dit nodig wordt geacht. Het is belangrijk op welk tijd ­
stip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als 
er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen (11). Alle 
observaties worden systematisch geregistreerd en voor elk dier wordt een apart verslag bijgehouden.
 
Als de dieren toxiciteitsverschijnselen blijven vertonen, is aanvul ­
lende observatie nodig. Bij de observatie wordt gekeken naar ver ­
anderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de 
ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale 
zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedragspatroon. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Er moet 
rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de 
leidraad voor humane eindpunten (8). Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben of blijvende tekenen van ernstig leed vertonen, worden op humane wijze gedood. Wan ­
neer dieren op humane wijze worden gedood of dood worden 
aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
 
1.6.1.  Lichaamsgewicht  
Kort vóór de toediening van de teststof en vervolgens ten minste 
wekelijks wordt het gewicht van elk dier bepaald. De gewichtsver ­
andering wordt berekend en geregistreerd. Aan het einde van de test 
worden de dieren die nog leven gewogen en vervolgens op humane 
wijze gedood.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Pathologie  
Op alle proefdieren (ook degene die tijdens de test sterven of met het 
oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek worden genomen) wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Alle macroscopische pa ­
thologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd. Mi ­
croscopisch onderzoek van organen die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die 24 uur of langer na de toediening nog leven, kan ook worden overwogen aangezien 
dit nuttige informatie kan opleveren.
 
2. GEGEVENS  
Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast worden 
alle gegevens in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat 
toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de 
test dood is aangetroffen of op humane wijze is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische ef ­
fecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevin ­
dingen.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informa ­
tie opgenomen:  
Teststof:  
— de fysische aard, de zuiverheid en indien relevant de fysisch- 
chemische eigenschappen (bv. de isomeer-samenstelling);  
— identificatiegegevens, zoals het CAS-nr.  
Medium (indien van toepassing):  
— een motivering voor de keuze van het medium als een ander 
medium dan water wordt gebruikt.  
Proefdieren:  
— de gebruikte soort/stam;  
— de microbiologische status van de dieren, indien deze bekend is;  
— het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht (indien van toe ­
passing een motivering voor het gebruik van mannetjes in plaats van vrouwtjes);
 
— de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.  
Testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof met 
bijzonderheden over de fysische vorm van het toegediende ma ­
teriaal;  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof met 
vermelding van het toegediende volume en het toedieningstijd ­
stip; 
— gedetailleerde gegevens over het voer en het water (met vermel ­
ding van de aard/herkomst van het voer en de herkomst van het 
water);  
— de motivering voor de keuze van de aanvangsdosis.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Resultaten:  
— een tabel met gegevens over de respons en de dosis voor elk dier 
(bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen of sterfte en de aard, de 
hevigheid en de duur van de effecten);  
— een tabel met het lichaamsgewicht en de veranderingen in het 
lichaamsgewicht;  
— het gewicht van de dieren op de toedieningsdag, daarna een keer 
per week en tenslotte wanneer ze sterven of gedood worden;  
— de datum en het tijdstip waarop de dieren sterven als dit eerder 
gebeurt dan gepland;  
— voor elk dier de aanvang en het verloop van de toxiciteitsver ­
schijnselen en of ze reversibel waren;  
— voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische 
bevindingen, indien beschikbaar.  
Bespreking en interpretatie van de resultaten.  
Conclusies.  
4 REFERENTIES  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report a new approach to the classification of substan ­
ces and preparations on the basis of their acute toxicity. Hu ­
man Toxicol., 3, 85-92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of sub ­
stances and preparations for their acute toxicity. Human Toxi ­
col., 6, 279-291.  
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed dose pro ­
cedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469-482  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol.
 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002) Statistical 
evaluation on the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. 
Toxicol., 21, 183-196.  
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sessment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classifica ­
tion for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 
[http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/ ­
0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF html|.
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33,223-231.  
(11) Chan, P.K. and A.W. Hayes (1994). Chapter 16 Acute Toxi ­
city and Eye Irritation. In Principles and Methods of Toxico ­
logy. 3  rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New 
York, USA.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
BIJLAGE 1:  
STROOMSCHEMA VOOR DE VERKENNENDE TEST

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
BIJLAGE 2:  
STROOMSCHEMA VOOR HET HOOFDONDERZOEK

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
BIJLAGE 3  
CRITERIA VOOR DE INDELING VAN TESTSTOFFEN MET EEN 
VERWACHTE LD  50 , DIE HOGER LIGT DAN 2 000 MG/KG ZONDER 
DAT ER TESTS BEHOEVEN TE WORDEN UITGEVOERD  
De criteria voor de gevarencategorie 5 zijn bedoeld om reststoffen te kunnen 
signaleren die een betrekkelijk geringe acute toxiciteit hebben maar onder be ­
paalde omstandigheden een gevaar voor kwetsbare bevolkingsgroepen kunnen opleveren. Van deze stoffen wordt verwacht dat ze een orale of dermale LD
 50 
tussen 2 000 en 5 000 mg/kg hebben of een vergelijkbare toxiciteit voor andere 
routes. Deze teststoffen kunnen in de volgende gevallen in de gevarencategorie 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg worden ingedeeld (categorie 5 in het GHS):  
a) als ze via een van de testschema s van bijlage 2 op basis van de sterftecijfers 
in deze categorie terechtkomen;  
b) als er al betrouwbaar bewijsmateriaal beschikbaar is waaruit blijkt dat de 
LD 50 binnen het interval van categorie 5 valt of als uit ander onderzoek bij 
dieren of toxische effecten bij de mens blijkt dat er sprake is van een risico 
voor de gezondheid van de mens van acute aard;  
c) via extrapolatie, raming of meting van gegevens als indeling in een gevaar ­
lijkere categorie niet terecht is en  
— er betrouwbare informatie beschikbaar is die wijst op significante toxische 
effecten bij de mens, of  
— bij tests tot waarden van categorie 4 langs orale weg sterfte wordt waar ­
genomen, of  
— wanneer het oordeel van deskundigen bevestigt dat er bij tests tot waarden 
voor categorie 4 significante klinische toxiciteitsverschijnselen zijn met uitzondering van diarree, pilo-erectie of een onverzorgd uiterlijk, of
 
— wanneer het oordeel van deskundigen betrouwbare informatie bevestigt 
die op grond van andere dierproeven op mogelijke significante acute effecten wijst.
 
TESTEN BI J DOSES VAN MEER DAN 2 000 MG/KG  
Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis van specifieke 
regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5 000 
mg/kg worden overwogen. Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproe ­
ven bij 5 000 mg/kg niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die proeven van direct belang 
zijn voor de bescherming van de gezondheid van dieren of mensen (9).
 
Verkennende test  
De beslissingsregels voor de sequentiële procedure van bijlage 1 worden uit ­
gebreid met een dosis van 5 000 mg/kg. Dit betekent dat wanneer er bij een 
verkennende test een aanvangsdosis van 5 000 mg/kg wordt gebruikt die re ­
sultaat A (sterfte) oplevert, een tweede dier bij 2 000 mg/kg wordt getest; bij resultaat B of C (manifeste toxiciteit of geen toxiciteit) wordt 5 000 mg/kg als 
aanvangsdosis voor het hoofdonderzoek gekozen. Als een andere aanvangs ­
dosis dan 5 000 mg/kg wordt gebruikt, wordt de test bij resultaat B of C met 2 000 mg/kg voortgezet met 5 000 mg/kg; wanneer vervolgens 5 000 mg/kg resultaat A oplevert, wordt 2 000 mg/kg als aanvangsdosis voor het 
hoofdonderzoek gekozen en bij resultaat B of C wordt 5 000 mg/kg als 
aanvangsdosis gekozen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Hoofdonderzoek  
De beslissingsregels voor de sequentiële procedure van bijlage 2 worden uit ­
gebreid met een dosis van 5 000 mg/kg Dit betekent dat wanneer er bij het 
hoofdonderzoek een aanvangsdosis van 5 000 mg/kg wordt gebruikt die resultaat A (> 2 dode dieren) oplevert, een tweede groep bij 2 000 mg/kg wordt getest; bij resultaat B (manifeste toxiciteit en/of < 1 dood dier) of C (geen toxiciteit) wordt 
de stof niet volgens het GHS ingedeeld. Als een andere aanvangsdosis dan 5 000 
mg/kg wordt gebruikt, wordt de test bij resultaat C met 2 000 mg/kg voortgezet met 5 000 mg/kg; wanneer vervolgens 5 000 mg/kg resultaat A oplevert, wordt de stof ingedeeld in categorie 5 van het GHS en bij resultaat B of C wordt de 
stof niet ingedeeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
BIJLAGE 4:  
TESTMETHODE B.l bis  
Leidraad voor de indeling in het EU-systeem gedurende de overgangsperiode totdat het „Globally Harmonised Classification System ” (GHS) volledig is ingevoerd (overgenomen uit 
referentie (8))

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.l ter.  ACUTE ORALE TOXICITEIT: METHODE TER BEPALING 
VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE  
1. METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan TG 423 (2001) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
De in deze test beschreven methode ter bepaling van de acute-toxi ­
citeitsklasse (1) is een stapsgewijze procedure waarbij voor iedere 
stap drie dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Afhankelijk van het aantal dode en/of stervende dieren kunnen er gemiddeld twee tot vier stappen nodig zijn om een uitspraak over de acute toxiciteit 
van de teststof te kunnen doen. Deze procedure is reproduceerbaar, 
gebruikt heel weinig dieren en kan stoffen op een vergelijkbare wijze rangschikken als de andere testmethoden voor acute toxiciteit. De methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse is gebaseerd op 
biometrische evaluaties (2)(3)(4)(5) met vaste doses, die ver genoeg 
uiteenliggen om een stof met het oog op de indeling en de bepaling van de gevaren te kunnen rangschikken. De in 1996 goedgekeurde methode is zowel op nationaal (6) als op internationaal (7) niveau 
uitgebreid  in vivo  gevalideerd in vergelijking met LD
 50 -gegevens uit 
de literatuur.  
Richtsnoeren voor de keuze van de meest geschikte testmethode 
voor een bepaald doel worden gegeven in de leidraad voor tests 
op acute orale toxiciteit (8). Deze leidraad bevat ook aanvullende 
informatie over de uitvoering en interpretatie van testmethode B.l ter.  
Teststoffen behoeven niet te worden toegediend in doses waarvan 
bekend is dat ze door een bijtende of sterk irriterende werking he ­
vige pijn en leed veroorzaken. Stervende dieren of dieren die duide ­
lijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, 
worden op humane wijze gedood en worden bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Er is een aparte leidraad met criteria om te 
bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood 
en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te her ­
kennen (9).
 
Bij de methode worden vooraf bepaalde doses gebruikt en de resul ­
taten maken het mogelijk de stof te rangschikken en in te delen aan 
de hand van het „Globally Harmonised System” voor de indeling van chemische stoften die acute toxiciteit veroorzaken (10).
 
De methode is in principe niet bedoeld om de berekening van een 
exacte LD  50 mogelijk te maken, maar er kan wel een zeker bloot ­
stellingsinterval worden bepaald waar sterfte te verwachten valt, 
aangezien sterfte van een deel van de dieren het belangrijkste eindpunt van deze test blijft. Een LD
 50 kan met deze methode 
alleen worden bepaald wanneer ten minste twee doses een sterfte 
tussen 0 % en 100 % opleveren. Het gebruik van een aantal 
vooraf bepaalde doses, ongeacht de teststof, waarbij de indeling expliciet wordt gekoppeld aan het aantal dieren waarbij uiteen ­
lopende toestanden worden geobserveerd, biedt betere mogelijkhe ­
den voor consistentie en herhaalbaarheid bij rapportage door ver ­
schillende laboratoria.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle 
beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Hierbij 
gaat het om informatie als de identiteit en de chemische structuur van de stof, de fysisch-chemische eigenschappen, het resultaat van andere met de stof uitgevoerde toxiciteitstests  in vivo  of in vitro , 
toxicologische gegevens over de qua structuur verwante stoffen en 
de voorgenomen toepassing(en) van de stof. Deze informatie is no ­
dig om alle betrokkenen ervan te overtuigen dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt tevens 
bij de keuze van de geschiktste aanvangsdosis.
 
1.2. DEFINITIES  
Acute orale toxiciteit:  de schadelijke effecten die zich voordoen na 
orale toediening van een dosis van een stof of verschillende doses die binnen 24 uur worden toegediend.
 
Vertraagde sterfte:  houdt in dat een dier niet binnen 48 uur sterft of 
stervende is maar later gedurende de observatieperiode van 14 dagen sterft.
 
Dosis:  de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uit ­
gedrukt als gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het 
proefdier (bijvoorbeeld mg/kg).  
GHS:  het „Globally Harmonised Classification System” voor che ­
mische stoffen en mengsels. Een samenwerkingsproject van de 
OESO (gezondheid van de mens en milieu), het Comité van deskun ­
digen voor het vervoer van gevaarlijke goederen van de VN (fysisch- chemische eigenschappen) en de ILO (communicatie van gevaren) dat wordt gecoördineerd door het Gezamenlijk programma voor een 
verantwoord beheer van chemische stoften (IOMC).
 
Ophanden zijnde sterfte:  wanneer voor het eerstvolgende geplande 
observatietijdstip een stervende toestand of sterfte wordt verwacht. Voorbeelden van indicaties voor deze toestand bij knaagdieren zijn 
convulsies, zijligging, liggende positie en tremors (zie de leidraad 
voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden).
 
LD 50 (mediaan van de orale letale dosis):  een statistisch afgeleide 
enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat 
50 % van de dieren waaraan deze dosis oraal wordt toegediend, sterft. De LD
 50 wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per 
gewichtseenheid van het proefdier (mg/kg).  
Limietdosis:  een dosis die bij tests als bovengrens wordt gehanteerd 
(2 000 of 5 000 mg/kg).  
Stervende toestand:  een toestand waarop de dood volgt of waarin 
overleven onmogelijk is, zelfs wanneer het dier wordt behandeld (zie 
de leidraad voor humane eindpunten (9) voor meer bijzonderheden).  
Voorspelbare sterfte:  een toestand met klinische verschijnselen die 
wijzen op sterfte op een bekend tijdstip in de toekomst voor het geplande einde van het experiment, bijvoorbeeld wanneer het dier 
geen water of voer kan bereiken (zie de leidraad voor humane eind ­
punten (9) voor meer bijzonderheden).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TEST  
Het principe van de test is dat op basis van een stapsgewijze pro ­
cedure, waarbij per stap een zo klein mogelijk aantal dieren wordt gebruikt, voldoende informatie over de acute toxiciteit van de teststof 
wordt verkregen om deze in te kunnen delen. Een van de vaste doses 
van de stof wordt oraal aan een groep proefdieren toegediend. De stof wordt stapsgewijs getest en bij elke stap worden drie dieren van hetzelfde geslacht (normaal gesproken vrouwtjes) gebruikt. Het re ­
sultaat van de stap (dieren die ten gevolge van de toediening van de 
stof sterven of niet) is bepalend voor de volgende stap, namelijk:
 
— de test kan worden gestaakt,  
— dezelfde dosis wordt aan nog eens drie dieren toegediend of  
— de eerstvolgende hogere of lagere dosis wordt aan drie andere 
dieren toegediend.  
Bijlage 1 bevat een gedetailleerde beschrijving van de testprocedure. 
Met deze methode kan een uitspraak worden gedaan over de indeling van de teststof in een van de toxiciteitsklassen die elk worden be ­
grensd door vaste LD
 50 waarden.  
1.4. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.4.1.  Keuze van de diersoort  
Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoor ­
ten kunnen worden gebruikt Normaal gesproken worden vrouwtjes gebruikt (9), omdat uit literatuuronderzoek van klassieke LD
 50 -tests 
blijkt dat er weliswaar meestal weinig verschil in gevoeligheid tussen 
mannetjes en vrouwtjes is, maar dat vrouwtjes meestal iets gevoeli ­
ger zijn wanneer er verschillen worden geconstateerd (11). Als echter uit kennis omtrent de toxicologische of toxicokinetische eigenschap ­
pen van qua structuur verwante chemische stoffen blijkt dat man ­
netjes waarschijnlijk gevoeliger zullen zijn, moeten mannetjes wor ­
den gebruikt. Wanneer de test bij mannetjes wordt uitgevoerd, moet hiervoor een afdoende motivering worden gegeven.
 
Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laborato ­
riumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen heb ­
ben gehad en mogen niet drachtig zijn. Elk dier moet bij de eerste toediening 8 tot 12 weken oud zijn en het lichaamsgewicht mag niet 
meer dan ± 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht van dieren 
waaraan al eerder een dosis is toegediend.
 
1.4.2.  Huisvesting en voeding  
De temperatuur in de proefdierruimte dient 22  o C (± 3  o C) te zijn. 
Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, 
moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunst ­
licht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbe ­
perkte hoeveelheid drinkwater. De dieren mogen per dosis in groe ­
pen worden gehuisvest, maar het aantal dieren per kooi mag niet zo 
groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Voorbereiding van de dieren  
De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonder ­
lijk te kunnen identificeren en voor de toediening gedurende mini ­
maal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden 
in het laboratorium te laten wennen.  
1.4.4.  Bereiding van de dosis  
In het algemeen worden alle doses van de teststof in het hele 
testbereik in een constant volume toegediend door de concen ­
tratie van de toegediende dosis te variëren. Wanneer echter een vloeibaar eindproduct of mengsel wordt getest, kan het voor de 
latere risicobeoordeling van die stof zinvoller zijn de teststof 
onverdund, d.w.z. met een constante concentratie, te gebruiken en sommige regelgevende instanties hebben dit verplicht gesteld. Het maximaal toe te dienen volume mag echter in geen geval 
worden overschreden. Het is afhankelijk van de grootte van het 
proefdier welk volume vloeistof in één keer kan worden toe ­
gediend. Bij knaagdieren mag het volume normaal gesproken 
niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij een wate ­
rige oplossing kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden overwogen. Voor de formulering van de dosis wordt waar mo ­
gelijk het gebruik van een waterige oplossing/suspensie/emulsie 
aanbevolen, in volgorde van voorkeur gevolgd door een 
oplossing/suspensie/emulsie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en eventueel een oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxicologi ­
sche kenmerken van het medium bekend zijn. De dosis moet 
kort voor de toediening worden bereid, tenzij de stabiliteit van het preparaat gedurende de gebruiksperiode bekend is en is aangetoond dat deze aanvaardbaar is.
 
1.5. PROCEDURE  
1.5.1.  Toediening van de dosis  
De teststof wordt in een dosis toegediend met een maagsonde of een 
geschikte katheter In het uitzonderlijke geval dat een dosis niet mogelijk is, kan de dosis in kleinere porties worden verdeeld die in de loop van maximaal 24 uur worden toegediend.
 
De dieren moeten voor de toediening vasten (ratten mogen bijvoor ­
beeld de nacht voor de toediening geen voer maar wel water krijgen 
en muizen gedurende 3-4 uur). Na de vastpenode worden de dieren gewogen en wordt de teststof toegediend. Na de toediening van de stof kan men ratten nog eens 3-4 uur en muizen nog eens 1-2 uur 
laten vasten. Wanneer een dosis in de loop van de tijd in porties 
wordt toegediend, kan het afhankelijk van de lengte van de periode nodig zijn de dieren voer en water te geven.
 
1.5.2.  Aantal dieren en hoogte van de doses  
Voor elke stap worden er drie dieren gebruikt. Een van de vier vaste 
doses 5, 50, 300 en 2 000 mg/kg lichaamsgewicht wordt als aan ­
vangsdosis gekozen. Als aanvangsdosis wordt de dosis gekozen 
waarbij naar alle waarschijnlijkheid enkele dieren zullen sterven. In de stroomschema's van bijlage 1 wordt de procedure beschreven die bij elk van de aanvangsdoses moet worden gevolgd. Daarnaast bevat 
bijlage 4 een leidraad voor de indeling in het EU systeem totdat het 
nieuwe GHS is ingevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Wanneer de beschikbare informatie erop wijst dat er bij de hoogste 
aanvangdosis (2 000 mg/kg lichaamsgewicht) waarschijnlijk geen 
dieren zullen sterven, moet er een limiettest worden uitgevoerd. Wanneer er geen informatie over een te testen stof is, wordt met het oog op het welzijn van dieren aanbevolen 300 mg/kg lichaams ­
gewicht als aanvangsdosis te gebruiken.
 
Het tijdsverloop tussen de toediening aan de verschillende groepen 
wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxici ­
teitsverschijnselen. Met de toediening van een volgende dosis moet worden gewacht totdat men er zeker van is dat de eerder geteste 
dieren blijven leven.
 
Bij wijze van uitzondering kan alleen met een motivering op basis 
van specifieke regelgevingsvereisten daarnaast het gebruik van een hogere vaste dosis van 5 000 mg/kg lichaamsgewicht worden over ­
wogen (zie bijlage 2). Met het oog op het welzijn van dieren zijn 
dierproeven in GHS categorie 5 (2 000-5 000 mg/kg) niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de 
bescherming van de gezondheid van mens of dier of het milieu.
 
1.5.3.  Limiettest  
De limiettest wordt voornamelijk uitgevoerd wanneer er informatie is 
die erop wijst dat het testmateriaal waarschijnlijk niet toxisch is c.q. alleen toxisch is in hogere doses dan de limieten in de regelgeving. Informatie over de toxiciteit van het testmateriaal kan afkomstig zijn 
van kennis omtrent vergelijkbare geteste verbindingen of vergelijk ­
bare geteste mengsels of producten, waarbij rekening wordt gehou ­
den met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat ze in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er 
weinig of geen informatie over de toxiciteit van het testmateriaal is 
of wordt verwacht dat het toxisch is, moet het hoofdonderzoek wor ­
den uitgevoerd.
 
Er kan een limiettest met een dosisniveau van 2 000 mg/kg worden 
uitgevoerd met zes dieren (drie dieren per stap). Bij wijze van uit ­
zondering kan er een limiettest met een dosisniveau van 5 000 mg/kg 
worden uitgevoerd met drie dieren (zie bijlage 2). Als er dieren vanwege de toediening van de stof sterven, kan het nodig zijn de test bij de eerstvolgende lagere dosis voort te zetten.
 
1.6. OBSERVATIE  
De dieren worden gedurende de eerste 30 minuten na de toediening 
ten minste eenmaal elk afzonderlijk geobserveerd, gedurende de eer ­
ste 24 uur periodiek met bijzondere aandacht voor de eerste vier uur en vervolgens dagelijks gedurende in totaal 14 dagen, behalve wan ­
neer ze met het oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek 
moeten worden genomen en op humane wijze moeten worden ge ­
dood of dood aangetroffen worden. De observatieduur is echter geen regel waarvan niet kan worden afgeweken. Deze moet worden be ­
paald aan de hand van de toxische reacties, het tijdstip waarop ze 
beginnen en de duur van de herstelperiode en kan dus worden ver ­
lengd indien dit nodig wordt geacht. Het is belangrijk op welk tijd ­
stip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen (12). Alle 
observaties worden systematisch geregistreerd en voor elk dier wordt 
een apart verslag bijgehouden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Als de dieren toxiciteitsverschijnselen blijven vertonen, is aan ­
vullende observatie nodig. Bij de observatie wordt gekeken naar 
veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijm ­
vliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het 
gedragspatroon. Er moet worden gelet op de observatie van 
tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (9). Dieren 
die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn heb ­
ben of blijvende tekenen van ernstig leed vertonen, worden op humane wijze gedood. Wanneer dieren op humane wijze worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mo ­
gelijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
 
1.6.1.  Lichaamsgewicht  
Kort vóór de toediening van de teststof en vervolgens ten minste 
wekelijks wordt het gewicht van elk dier bepaald. De gewichtsver ­
andering wordt berekend en geregistreerd. Aan het einde van de test 
worden de dieren die nog leven gewogen en op humane wijze ge ­
dood.  
1.6.2.  Pathologie  
Op alle proefdieren (ook degene die tijdens de test sterven of met het 
oog op het welzijn van dieren uit het onderzoek worden genomen) 
wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Alle macroscopische pa ­
thologische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd. Mi ­
croscopisch onderzoek van organen die tekenen van macroscopische 
pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, kan ook worden overwogen aangezien dit nuttige informatie kan opleveren.
 
2. GEGEVENS  
Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast worden 
alle gegevens in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de 
test dood is aangetroffen of op humane wijze is gedood, het tijdstip 
waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische ef ­
fecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevin ­
dingen.
 
3. RAPPORTACE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informa ­
tie opgenomen:  
Teststof  
— de fysische aard, de zuiverheid en indien relevant de fysisch 
chemische eigenschappen (bv. de isomeersamenstelling);  
— identificatiegegevens, zoals het CAS-nr.  
Medium (indien van toepassing):  
— een motivering voor de keuze van het medium als een ander 
medium dan water wordt gebruikt.  
Proefdieren:  
— de gebruikte soort/stam;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— de microbiologische status van de dieren, indien deze bekend is;  
— het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht (indien van toe ­
passing een motivering voor het gebruik van mannetjes in plaats van vrouwtjes);
 
— de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.  
Testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof met 
bijzonderheden over de fysische vorm van het toegediende ma ­
teriaal;  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof met 
vermelding van het toegediende volume en het toedieningstijd ­
stip; 
— gedetailleerde gegevens over het voer en het water (met vermel ­
ding van de aard/herkomst van het voer en de herkomst van het water);
 
— de motivering voor de keuze van de aanvangsdosis.  
Resultaten:  
— een tabel met gegevens over de respons en de dosis voor elk dier 
(bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen of sterfte en de aard, de hevigheid en de duur van de effecten);
 
— een tabel met het lichaamsgewicht en de veranderingen in het 
lichaamsgewicht;  
— het gewicht van de dieren op de toedieningsdag, daarna een keer 
per week en tenslotte wanneer ze sterven of gedood worden;  
— de datum en het tijdstip waarop de dieren sterven, als dit eerder 
gebeurt dan gepland;  
— voor elk dier de aanvang en het verloop van de toxiciteitsver ­
schijnselen en of ze reversibel waren;  
— voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische 
bevindingen, indien beschikbaar.  
Bespreking en interpretatie van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Roll R., Hofer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.
 
(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute Toxic Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.  
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.  
(5) Diener W., and Schlede E. (1999). Acute Toxicity Class Me ­
thods- Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129-134.  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute Toxic Class Method 
— An Alternative to the LD  50 , Test. Arch Toxicol 66, 455-470.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E, Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute Toxic Class Me ­
thod (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Chemical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of 
the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals 
in November 1998, Part 2, p. 11. [http://webnetl.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 24-no-0,FF.html].
 
(11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel 
K.A., Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer, 
J.A. and Myers R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, 
Conventional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
BIJLAGE 1  
PROCEDURE VOOR ELKE AANVANGSDOSIS  
ALGEMENE OPMERKINGEN  
In de stroomschema's in deze bijlage wordt voor elke aanvangsdosis de te volgen 
procedure geschetst:  
— Bijlage 1 A: Aanvangsdosis 5 mg/kg lichaamsgewicht  
— Bijlage 1 B: Aanvangsdosis 50 mg/kg lichaamsgewicht  
— Bijlage 1 C: Aanvangsdosis 300 mg/kg lichaamsgewicht  
— Bijlage 1 D: Aanvangsdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht  
De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode 
dieren, de te volgen procedure aan.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
BIJLAGE 1 A  
TESTPROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 5 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
BIJLAGE 1 B  
TESTPROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 50 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
BIJLAGE 1 C  
TESTROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 300 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
BIJLAGE 1 D  
TESTPROCEDURE MET EEN AANVANGSDOSIS VAN 2 000 MG/KG LICHAAMSGEWICHT

BIJLAGE 2  
CRITERIA VOOR DE INDELING VAN TESTSTOFFEN MET EEN 
VERWACHTE LD  50 , DIE HOGER LIGT DAN 2 000 MG/KG ZONDER 
DAT ER TESTS BEHOEVEN TE WORDEN UITGEVOERD  
De criteria voor de gevarencategorie 5 zijn bedoeld om teststoffen te kunnen 
signaleren die een betrekkelijk geringe acute toxiciteit hebben, maar onder be ­
paalde omstandigheden een gevaar voor kwetsbare bevolkingsgroepen kunnen opleveren. Van deze stoffen wordt verwacht dat ze een orale of dermale LD
 50 
tussen 2 000 en 5 000 mg/kg hebben of een vergelijkbare toxiciteit voor andere 
routes. Deze teststoffen moeten in de volgende gevallen in de gevarencategorie 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg worden ingedeeld (categorie 5 in het GHS).  
a) als ze via een van de testschema's van bijlage 1A-1D op basis van de sterf ­
tecijfers in deze categorie terechtkomen;  
b) als er al betrouwbaar 
bewijsmateriaal beschikbaar is waaruit blijkt dat de LD  50 binnen het interval 
van categorie 5 valt of als uit ander onderzoek bij dieren of toxische effecten 
bij de mens blijkt dat er sprake is van een risico voor de gezondheid van de mens van acute aard;
 
c) via extrapolatie, raming of meting van gegevens als indeling in een gevaar ­
lijkere categorie niet terecht is en  
— er betrouwbare informatie beschikbaar is die wijst op significante toxische 
effecten bij de mens of  
— bij tests tot waarden van categorie 4 langs orale weg sterfte wordt waar ­
genomen of  
— wanneer het oordeel van deskundigen bevestigt dat er bij tests tot waarden 
voor categorie 4 significante klinische toxiciteitsverschijnselen zijn, met 
uitzondering van diarree, pilo-erectie of een onverzorgd uiterlijk of  
— wanneer het oordeel van deskundigen betrouwbare informatie bevestigt 
die op grond van andere dierproeven op mogelijke significante acute effecten wijst.
 
TESTEN BIJ DOSES VAN MEER DAN 2 000 MG/KG  
Met het oog op het welzijn van dieren zijn dierproeven in categorie 5 (5 000 
mg/kg) niet wenselijk en moeten deze alleen worden overwogen wanneer er een 
grote kans is dat de resultaten van die test van direct belang zijn voor de 
bescherming van de gezondheid van mens of dier (10). Er dienen geen verdere tests bij hogere doses te worden uitgevoerd.
 
Wanneer testen met een dosis van 5 000 mg/kg nodig is, wordt er slechts één 
stap (d.w.z. drie dieren) uitgevoerd. Als het eerste dier na toediening sterft, gaat 
de toediening verder met 2 000 mg/kg volgens de stroomschema's van 
bijlage 1. Als het eerste dier blijft leven, wordt aan nog eens twee dieren 5 000 mg/kg toegediend. Als slechts één van de drie dieren sterft, wordt ervan uitgegaan dat de LD
 50 hoger is dan 5 000 mg/kg. Als beide dieren sterven, gaat 
de toediening verder met 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
BIJLAGE 3  
TESTMETHODE B.1 ter: Leidraad voor de indeling in het EU-systeem gedurende de 
overgangsperiode totdat het „Globally Harmonised Classification System” (GHS) volledig is 
ingevoerd (overgenomen uit referentie (8))
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. ACUTE INHALATIETOXICITEIT  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 403 (2009) van de OESO 
(1). Testrichtlijn 403 (TG 403), de oorspronkelijke testrichtlijn voor acute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld. Deze herziene testmethode B.2 (die 
gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 403) is ontworpen om de 
flexibiliteit te vergroten, het gebruik van dieren terug te dringen en in regelgevingsbehoeften te voorzien. De herziene testmethode omvat twee soorten onderzoek: een traditioneel LC
 50 -protocol en een concentratie × 
tijd-protocol (c × t-protocol). Deze testmethode heeft als belangrijkste ken ­
merken dat zij het mogelijk maakt om een verband tussen concentratie en respons vast te stellen dat loopt van een niet-dodelijke tot een dodelijke afloop, teneinde een mediaan letale concentratie (LC
 50 ), niet-dodelijke drem ­
pelconcentratie (bv. LC  01 ), en helling af te leiden, en om mogelijke ge ­
slachtsgebonden gevoeligheid aan te tonen. Het c × t-protocol moet worden gebruikt wanneer specifieke behoeften op het gebied van regelgeving of wetenschap het nodig maken gedurende meerdere perioden van verschil ­
lende duur dierproeven uit te voeren, bijvoorbeeld met het oog op het 
opstellen van rampenbestrijdingsplannen (bv. om waarden voor de richt ­
niveaus voor acute blootstelling (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL’s), richtsnoeren voor rampenbestrijdingsplannen (Emergency Res ­
ponse Planning Guidelines (ERPG’s), of drempelniveaus voor acute bloot ­
stelling (Acute Exposure Threshold Levels, AETL’s) af te leiden) of ruimte ­
lijkeordeningsplannen.
 
2. Aanwijzingen voor de uitvoering en interpretatie van onderzoek volgens 
deze testmethode zijn opgenomen in de leidraad betreffende tests op acute 
inhalatietoxiciteit (GD 39 (2)).  
3. De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen 
in het laatste deel van dit hoofdstuk en in GD 39 (2).  
4. Deze testmethode maakt het mogelijk teststoffen te karakteriseren, er een 
kwantitatieve risicobeoordeling voor uit te voeren, en ze te rangschikken en in te delen overeenkomstig Verordening (EG) nr. 1272/2008 (3). GD 39 (2) 
bevat een leidraad voor de keuze van de geschikte testmethode voor acute 
toxiciteitstests. Wanneer alleen informatie over indeling en etikettering no ­
dig is, wordt over het algemeen hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) aan ­
bevolen (zie GD 39 (2)). Deze testmethode B.2 is niet specifiek bedoeld 
voor het testen van speciale materialen, zoals slecht oplosbare isometrische 
materialen of vezelmaterialen of gefabriceerde nanomaterialen.
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
5. Alvorens te overwegen deze testmethode toe te passen, moet het testlabo ­
ratorium alle beschikbare informatie over de teststof, met inbegrip van be ­
staande studies (bv. hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4)) waarvan de ge ­
gevens een argument vormen om geen aanvullende tests uit te voeren, in 
aanmerking nemen teneinde het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Voor de keuze van de geschiktste soorten, stam, geslacht, wijze van blootstelling en testconcentraties kan onder meer gebruik worden ge ­
maakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en 
fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventu ­
ele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepas ­
singen en de potentiële blootstelling van de mens; en de 
beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische 
stoffen met een verwante structuur (zie GD 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Het testen van bijtende en/of irriterende teststoffen bij concentraties die naar 
verwachting hevige pijn en/of angst zullen veroorzaken, moeten zo veel 
mogelijk worden vermeden. Het bijtende/irriterende potentieel moet op basis van het oordeel van deskundigen worden geëvalueerd, met behulp van bij ­
voorbeeld ervaring bij mens en dier (bv. op grond van onderzoek met her ­
haalde toediening, uitgevoerd bij niet-bijtende/niet-irriterende concentraties), 
bestaande in-vitrogegevens (bv. op grond van de hoofdstukken B.40 (5) en B.40 bis (6) van deze bijlage of van OESO TG 435 (7)), pH-waarden, informatie over soortgelijke stoffen of andere relevante gegevens, teneinde 
uit te zoeken of van verdere tests kan worden afgezien. Bij specifieke 
regelgevingsbehoeften (bv. voor het opstellen van rampenplannen) kan deze testmethode worden gebruikt voor het blootstellen van dieren aan deze materialen, aangezien zij de onderzoeksleider of hoofdonderzoeker 
de controle geeft over de keuze van de doelconcentraties. De doelconcen ­
traties mogen echter geen ernstige irriterende/bijtende effecten veroorzaken, maar moeten wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevings ­
doelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden 
gekozen en de keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemoti ­
veerd (zie GD 39 (2)).
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
7. Deze herziene testmethode B.2 is ontworpen om voldoende informatie te 
kunnen verzamelen over de acute toxiciteit van een teststof om deze in te 
kunnen delen, en om voor kwantitatieve risicobeoordelingen benodigde ge ­
gevens over de sterfte (bv. LC  50 , LC  01 en helling) voor één of beide ge ­
slachten te verkrijgen. Deze testmethode omvat twee methoden. De eerste methode is een traditioneel protocol waarin groepen dieren gedurende een 
vaststaande periode, doorgaans vier uur, aan een limietconcentratie (limiet ­
test) of een stapsgewijze reeks concentraties worden blootgesteld. Voor specifieke regelgevingsdoeleinden kan een andere blootstellingsduur vereist zijn. De tweede methode is een (c × t)-protocol waarin groepen dieren 
worden blootgesteld aan één concentratie (limietconcentratie) of een reeks 
van verschillende concentraties gedurende perioden van verschillende duur.
 
8. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige 
en voortdurende angst vertonen, worden op humane wijze gedood en wor ­
den bij de interpretatie van het testresultaat op dezelfde manier behandeld 
als dieren die tijdens de test gestorven zijn. OESO-leidraad nr. 19 inzake humane eindpunten (8) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of 
ophanden zijnde sterfte te herkennen.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
9. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriums ­
tammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten; het gebruik 
van andere soorten moet worden gemotiveerd.  
Voorbereiding van de dieren  
10. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig 
zijn. Op de dag van blootstelling moeten de jonge volwassen dieren acht tot twaalf weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht van eerder 
blootgestelde dieren van dezelfde leeftijd. De dieren worden willekeurig 
gekozen en gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren. De dieren blijven voordat de test begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Vlak voor de test acclimatiseren de die ­
ren ook enige tijd in het testapparaat, aangezien hierdoor de stress als gevolg 
van de nieuwe omgeving zal afnemen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Dierhouderij  
11. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 
± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd 
mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het alge ­
meen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en 
moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan 
als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen 
noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, ther ­
mische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstempe ­
ratuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gege ­
vens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als 
gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest 
om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun 
kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertifi ­
ceerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbe ­
perkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht ge ­
bruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.
 
Inhalatiekamers  
12. Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard 
van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft 
de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling 
via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. 
Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt 
door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren niet meer dan 
5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor 
blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).
 
BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Toediening van concentraties  
13. Voor de blootstelling via de neus alleen mag bij ratten elke tijdsduur worden 
gekozen, tot een maximum van zes uur. Bij muizen dient de blootstelling via de neus alleen in het algemeen niet langer dan vier uur te duren. Als er onderzoek met een langere tijdsduur nodig is, moet dit worden gemotiveerd 
(zie GD 39 (2)). Dieren die in een kamer voor het hele lijf aan aerosolen 
worden blootgesteld, worden afzonderlijk gehuisvest om ingestie van de teststof door het verzorgen van kooigenoten te voorkomen. Tijdens de bloot ­
stellingsperiode krijgen de dieren geen voeder. Tijdens een blootstelling van 
het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
 
14. De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, 
aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van 
de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentra ­
tie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve 
teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient 
op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Deeltjesgrootteverdeling  
15. Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, 
wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken worden aerosolen met een 
massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 
4 μm en een geometrische standaardafwijking ( σ
 g ) tussen 1,5 en 3,0 aan ­
bevolen (2)(9)(10). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze norm ­
waarden te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet 
mogelijk blijkt. Zo kunnen de deeltjes van metaaldampen kleiner zijn dan 
deze norm, terwijl geladen deeltjes, vezels en hygroscopische materialen (die in de vochtige omgeving van de ademhalingswegen opzwellen) de 
norm kunnen overschrijden.
 
Bereiding van de teststof in een medium  
16. Er kan een medium worden gebruikt om een passende concentratie en deel ­
tjesgrootte van de teststof in de atmosfeer te verkrijgen. Als algemene regel 
wordt de voorkeur gegeven aan water. Deeltjesmateriaal kan aan mecha ­
nische processen worden onderworpen om de gewenste deeltjesgroottever ­
deling te verkrijgen, waarbij er echter op moet worden gelet dat de teststof 
niet wordt ontbonden of gewijzigd. Als de samenstelling van de teststof 
mogelijk is gewijzigd door mechanische processen (bv. als er bij overvloe ­
dig malen door wrijving extreme temperaturen zijn ontstaan), wordt de samenstelling analytisch gecontroleerd. Er dient zorgvuldig op te worden 
gelet dat de teststof niet wordt verontreinigd. Niet-broze korrelige materialen 
die met opzet zo zijn samengesteld dat zij niet-inhaleerbaar zijn, hoeven niet te worden getest. Aan de hand van een slijtageproef moet worden aange ­
toond dat bij de hantering van het korrelige materiaal geen inhaleerbare 
deeltjes ontstaan. Als bij een slijtageproef inhaleerbare stoffen ontstaan, 
wordt een test op inhalatietoxiciteit verricht.
 
Controledieren  
17. Er is geen parallelle negatieve controlegroep (lucht) noodzakelijk. Wanneer 
voor het verkrijgen van de testatmosfeer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet alleen een controlegroep voor dat medium worden gebruikt 
wanneer er geen historische gegevens over de inhalatietoxiciteit beschikbaar 
zijn. Indien een toxiciteitsstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is; in dat geval is er geen mediumcontrole 
noodzakelijk.
 
CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Luchtdoorstroming in de kamer  
18. Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de kamer zorgvul ­
dig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. 
De controle van de concentratie (of stabiliteit) van de testatmosfeer is een 
integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle rele ­
vante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen 
worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgea ­
demde lucht niet opnieuw wordt ingeademd indien de luchtdoorstroming in het blootstellingssysteem ontoereikend is om een dynamische luchtdoorstro ­
ming van de teststofatmosfeer te verkrijgen. Er zijn voorgeschreven metho ­
den die kunnen worden toegepast om aan te tonen dat de uitgeademde lucht 
bij de gekozen operationele omstandigheden niet opnieuw wordt ingeademd (2)(11). Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kool ­
dioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat 
deze normwaarden niet kunnen worden gehaald, moet de zuurstof- en kool ­
dioxideconcentratie worden gemeten.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer  
19. De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Bij 
blootstelling via de neus alleen en bij blootstelling van het hele lijf wordt de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren gecontro ­
leerd en bij een blootstellingsduur tot vier uur ten minste drie keer en bij een 
kortere blootstelling ieder uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege 
interferentie tussen de teststof en de testmethode.
 
Teststof: nominale concentratie  
20. Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer 
berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de 
gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het ka ­
mersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing 
voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt 
om problemen bij het genereren te ontdekken.
 
Teststof: feitelijke concentratie  
21. De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof in het ademha ­
lingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties 
kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. 
rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie geba ­
seerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische 
analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één com ­
ponent of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moe ­
ten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poe ­
ders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische 
analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens ver ­
eist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht ver ­
gelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet 
beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden 
een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn 
verzameld. In het studieverslag worden de doelconcentratie, de nominale 
concentratie en de feitelijke concentratie vermeld, maar in statistische ana ­
lysen voor de berekening van de letale concentratiewaarden wordt uitslui ­
tend gebruikgemaakt van de feitelijke concentraties.
 
22. Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt en het testmonster 
wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit 
en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de 
teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzui ­
verheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens 
worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair ge ­
wicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium 
de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate beves ­
tigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
 
23. De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden en, afhan ­
kelijk van de analysemethode, voortdurend en/of met tussenpozen gecontro ­
leerd. Wanneer met tussenpozen wordt bemonsterd, wordt in een studie van vier uur ten minste twee keer een monster van de kameratmosfeer genomen. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet 
mogelijk is, kan één monster gedurende de volledige blootstellingsperiode 
worden verzameld. Indien significante fluctuaties tussen monsters optreden,
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
worden bij de volgende geteste concentraties vier monsters per blootstelling 
genomen. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentra ­
tie en de gemiddelde concentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t
 95 ) wordt berekend en geregistreerd. De 
blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gegenereerd en 
houdt rekening met de tijd die nodig is om t  95 te bereiken. In GD 39 (2) 
zijn richtsnoeren voor het schatten van t  95 opgenomen.  
24. Voor zeer complexe mengsels bestaande uit gassen/dampen en aerosolen 
(bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte 
eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer ver ­
schillend gedragen, zodat van elke fase (gas/damp en aerosol) ten minste 
één indicatorstof (analyt) moet worden gekozen, normaliter de voornaamste 
werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het mengsel, en niet slechts voor de werkzame stof of de component (analyt). Aanvullende informatie over fei ­
telijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).
 
Teststof: deeltjesgrootteverdeling  
25. De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt tijdens elke blootstelling 
van vier uur ten minste twee keer bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een 
cascade-impactor of een alternatief instrument verkregen resultaten gelijk ­
waardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler ge ­
bruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instru ­
ment te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filterana ­
lyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaar ­
digheid kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet 
nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden ge ­
nomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens 
worden verkregen waardoor herhaling van de blootstelling noodzakelijk is. 
Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid be ­
staat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of in ­
dien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde 
fasen kunnen optreden (zie punt 15).
 
PROCEDURE  
26. Hieronder worden twee soorten onderzoek beschreven: het traditionele pro ­
tocol en het c × t-protocol. Beide protocollen kunnen een verkennende test, een hoofdonderzoek, en/of een limiettest (traditioneel protocol) of tests bij een limietconcentratie (c × t) omvatten. Indien bekend is dat een van beide 
geslachten een grotere gevoeligheid heeft, kan de onderzoeksleider ervoor 
kiezen dit onderzoek alleen voor het gevoeligste geslacht uit te voeren. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden bloot ­
gesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soort ­
specifieke symptomen van angst te minimaliseren. Alvorens met het onder ­
zoek te beginnen moeten alle beschikbare gegevens worden bekeken om het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Zo kunnen gegevens die zijn verkregen op grond van hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) een ver ­
kennende test wellicht overbodig maken, en wellicht ook aantonen of het 
ene geslacht gevoeliger is dan het andere (zie GD 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TRADITIONEEL PROTOCOL  
Algemene overwegingen: traditioneel protocol  
27. Bij een traditioneel onderzoek, worden groepen dieren aan een teststof 
blootgesteld gedurende een vaste periode (doorgaans vier uur) in een kamer voor blootstelling via de neus alleen of voor blootstelling van het hele lijf. Dieren worden blootgesteld aan hetzij een limietconcentratie (limiettest), of 
stapsgewijs aan ten minste drie concentraties (hoofdonderzoek). Het hoofd ­
onderzoek kan worden voorafgegaan door een verkennende test, tenzij er al enige informatie over de teststof beschikbaar is, bijvoorbeeld uit een eerder uitgevoerd onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (zie GD 39 (2)).
 
Verkennende test: traditioneel protocol  
28. Een verkennende test wordt gebruikt om de werkzaamheid van de teststof te 
schatten en geslachtsafhankelijke verschillen in gevoeligheid aan te tonen, en ter ondersteuning bij de keuze van de blootstellingsconcentratieniveaus 
voor het hoofdonderzoek of de limiettest. Bij de keuze van concentratieni ­
veaus voor de verkennende test moet alle beschikbare informatie worden gebruikt, met inbegrip van de beschikbare (Q)SAR-gegevens en gegevens over soortgelijke chemische stoffen. Bij elke concentratie mogen ten hoogste 
drie mannetjes en drie vrouwtjes worden blootgesteld (om geslachtsafhan ­
kelijke verschillen vast te stellen kunnen drie dieren per geslacht nodig zijn). Een verkennende test kan betrekking hebben op één concentratie, maar indien nodig kunnen meerdere concentraties worden getest. In een verken ­
nende test mogen niet zo veel dieren en concentraties worden getest dat 
deze test eerder op een hoofdonderzoek lijkt. Een eerder uitgevoerd onder ­
zoek op grond van hoofdstuk B.52 (4) kan worden gebruikt in plaats van een verkennende test (zie GD 39 (2)).
 
Limiettest: traditioneel protocol  
29. Een limiettest wordt toegepast indien bekend is of verwacht wordt dat de 
teststof praktisch niet-toxisch is, d.w.z. dat een toxische reactie alleen op ­
treedt boven de in de regelgeving bepaalde limietconcentratie. Bij een li ­
miettest wordt één groep van drie mannetjes en drie vrouwtjes blootgesteld 
aan de teststof in een limietconcentratie. Informatie over de toxiciteit van de 
teststof kan afkomstig zijn van kennis omtrent vergelijkbare geteste stoffen, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat zij in toxicologisch opzicht relevant 
zijn. Wanneer er weinig of geen informatie over de toxiciteit van het test ­
materiaal is of wordt verwacht dat de teststof toxisch is, moet het hoofd ­
onderzoek worden uitgevoerd.
 
30. De keuze van de limietconcentraties hangt gewoonlijk af van wettelijke 
voorschriften. Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, be ­
dragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectie ­
velijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l (of de maximaal haalbare concen ­
tratie) (3). Het kan vanuit technisch oogpunt ingewikkeld zijn limietconcen ­
traties van sommige teststoffen te bereiken, vooral als dampen en aerosolen. Wanneer aerosolen worden getest, is het primaire doel een in te ademen 
deeltjesgrootte te verkrijgen (MMAD van 1-4 μm). Voor de meeste test ­
stoffen is dit mogelijk bij een concentratie van 2 mg/l. Aerosolen mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (2)). In 
Verordening (EG) nr. 1272/2008 worden tests boven een limietconcentratie 
met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. De limietconcentratie moet alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resulta ­
ten van een dergelijke test rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid 
van mensen te beschermen (3), en dit moet in het studieverslag worden 
gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om on ­
nodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de limiettest van tevoren een 
keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandig ­
heden voor een limiettest kunnen worden bereikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Indien bij de limietconcentratie wordt geconstateerd dat er dieren gestorven 
of stervende zijn, kunnen de resultaten van de limiettest dienen als een 
verkennende test voor verdere tests bij andere concentraties (zie hoofdonder ­
zoek). Indien de fysische of chemische eigenschappen van een teststof het onmogelijk maken een limietconcentratie te bereiken, moet bij de maximaal 
haalbare concentratie worden getest. Indien minder dan 50 % sterfte optreedt 
bij de maximaal haalbare concentratie, zijn geen verdere tests nodig. Als de limietconcentratie niet kon worden bereikt, moet dit in het studieverslag worden toegelicht en met ondersteunende gegevens worden gestaafd. Indien 
bij de maximaal haalbare concentratie van een damp geen toxiciteit optreedt, 
kan het nodig zijn de teststof in de vorm van een vloeibare aerosol te gebruiken.
 
Hoofdonderzoek: traditioneel protocol  
32. Een hoofdonderzoek wordt meestal uitgevoerd met vijf mannetjes en vijf 
vrouwtjes (of vijf dieren van het gevoeligste geslacht, indien dit bekend is) 
per concentratieniveau, en bij ten minste drie concentratieniveaus. Er moeten voldoende concentratieniveaus worden gebruikt om een robuuste statistische analyse mogelijk te maken. De tijdsduur tussen de blootstelling van de 
verschillende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de ernst 
van de toxiciteitsverschijnselen. De blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau wordt uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven. Dit stelt de onderzoeksleider 
in staat de doelconcentratie voor de volgende blootstellingsgroep aan te 
passen. Aangezien dit vanwege de afhankelijkheid van geavanceerde tech ­
nologieën wellicht niet altijd praktisch is bij inhalatieonderzoek, moet de blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau worden geba ­
seerd op eerdere ervaringen en wetenschappelijke afwegingen. Voor het 
testen van mengsels moet GD 39 (2) worden geraadpleegd.
 
CONCENTRATIE × TIJD-PROTOCOL (C × T-PROTOCOL)  
Algemene overwegingen: c × t-protocol  
33. Als alternatief voor het traditionele protocol kan een stapsgewijs 
c × t-onderzoek worden overwogen voor de beoordeling van de inhalatie ­
toxiciteit (12)(13)(14). Bij deze aanpak kunnen de dieren bij verschillende 
concentratieniveaus en gedurende meerdere perioden van verschillende duur aan een teststof worden blootgesteld. Alle tests worden uitgevoerd in een kamer voor blootstelling via de neus alleen (kamers voor het hele lijf zijn 
voor dit protocol niet geschikt). Aanhangsel 1 bevat een stroomdiagram van 
dit protocol. Een simulatieanalyse heeft uitgewezen dat zowel met het tra ­
ditionele protocol als met het c × t-protocol robuuste LC
 50 -waarden kunnen 
worden verkregen, maar dat het c × t-protocol doorgaans beter geschikt is 
voor het verkrijgen van robuuste LC  01 - en LC  10 -waarden (15).  
34. Een simulatieanalyse heeft aangetoond dat het voor het testen bij vier con ­
centraties en gedurende vijf blootstellingsperioden van verschillende duur in 
het kader van een hoofdonderzoek doorgaans volstaat om per c × t-interval 
twee dieren (één van elk geslacht als beide geslachten worden gebruikt, of twee van het gevoeligste geslacht) te gebruiken. Onder bepaalde omstandig ­
heden kan de onderzoeksleider ervoor kiezen twee ratten per geslacht per c 
× t-interval te gebruiken (15). Door twee dieren per geslacht per concentratie 
en tijdstip te gebruiken kan de bias en de variabiliteit van de schattingen worden verkleind, het percentage succesvolle schattingen worden verhoogd, en het dekkingspercentage van het betrouwbaarheidsinterval worden ver ­
beterd. Als er echter geen voldoende passende fitting met de gegevens 
mogelijk is om een schatting te kunnen maken (indien een dier per geslacht of twee dieren van het gevoeligste geslacht worden gebruikt), kan wellicht ook een vijfde blootstellingsconcentratie volstaan. Nadere richtsnoeren voor 
het bij een c × t-onderzoek te gebruiken aantal dieren en concentraties zijn 
opgenomen in GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Verkennende test: c × t-protocol  
35. Een verkennende test wordt gebruikt om de werkzaamheid van de teststof te 
schatten, en ter ondersteuning bij de keuze van de blootstellingsconcentra ­
tieniveaus voor het hoofdonderzoek. Een verkennende test met ten hoogste 
drie dieren per geslacht per concentratie (zie aanhangsel III van GD 39 (2) 
voor nadere bijzonderheden) kan nodig zijn om een geschikte aanvangscon ­
centratie voor het hoofdonderzoek te kunnen kiezen en het aantal gebruikte dieren te kunnen minimaliseren. Soms is het nodig om drie dieren per 
geslacht te gebruiken om geslachtsafhankelijke verschillen vast te stellen. 
Deze dieren moeten gedurende één periode, doorgaans met een duur van 240 minuten, worden blootgesteld. Om te beoordelen of het mogelijk is 
geschikte testatmosferen tot stand te brengen, moeten voorafgaande tests 
zonder dieren worden uitgevoerd. Een verkennende test is doorgaans niet nodig als er gegevens over de sterfte beschikbaar zijn uit een onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (4). Bij het kiezen van de aanvankelijke doelcon ­
centratie in een onderzoek volgens hoofdstuk B.2 moet de onderzoeksleider 
rekening houden met de sterftepatronen die zijn waargenomen in al het beschikbare onderzoek volgens hoofdstuk B.52 (4), voor beide geslachten en voor alle geteste concentraties (zie GD 39 (2)).
 
Beginconcentratie: c × t-protocol  
36. De beginconcentratie (blootstellingssessie I) (aanhangsel 1) is ofwel een 
limietconcentratie, ofwel een door de onderzoeksleider op basis van de verkennende test gekozen concentratie. Groepen van 1 dier per geslacht worden aan deze concentratie blootgesteld gedurende perioden van verschil ­
lende duur (bv. 15, 30, 60, 120, of 240 minuten), hetgeen betekent dat er in 
totaal 10 dieren worden gebruikt (dit wordt „blootstellingssessie I” ge ­
noemd) (aanhangsel 1).
 
37. De keuze van de limietconcentraties hangt gewoonlijk af van wettelijke 
voorschriften. Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, be ­
dragen de limietconcentraties voor gassen, dampen en aerosolen respectie ­
velijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l (of de maximaal haalbare concen ­
tratie) (3). Het kan vanuit technisch oogpunt ingewikkeld zijn limietconcen ­
traties van sommige teststoffen te bereiken, vooral als dampen en aerosolen. Wanneer aerosolen worden getest, is het doel een in te ademen deeltjes ­
grootte te verkrijgen (d.w.z. een MMAD van 1-4 μm) bij een limietconcen ­
tratie van 2 mg/l. Dat is met de meeste teststoffen mogelijk. Aerosolen 
mogen alleen bij een hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (2)). In Verordening (EG) nr. 1272/2008 worden tests boven een limietconcentratie 
met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. Tests boven de limietconcen ­
tratie moeten alleen worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van dergelijke tests rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen (3), en dit moet in het studieverslag 
worden gemotiveerd. Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden 
dat zich omstandigheden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de test bij de begincon ­
centratie van tevoren een keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen 
dat de kameromstandigheden voor deze concentratie kunnen worden bereikt.
 
38. Indien bij de beginconcentratie wordt geconstateerd dat er dieren gestorven 
of stervende zijn, kunnen de resultaten bij deze concentratie als uitgangspunt 
dienen voor verdere tests bij andere concentraties (zie hoofdonderzoek). 
Indien de fysische of chemische eigenschappen van een teststof het onmo ­
gelijk maken een limietconcentratie te bereiken, moet bij de maximaal haal ­
bare concentratie worden getest. Indien minder dan 50 % sterfte optreedt bij 
de maximaal haalbare concentratie, zijn geen verdere tests nodig. Als de 
limietconcentratie niet kon worden bereikt, moet dit in het studieverslag worden toegelicht en met ondersteunende gegevens worden gestaafd. Indien bij de maximaal haalbare concentratie van een damp geen toxiciteit optreedt, 
kan het nodig zijn de teststof in de vorm van een vloeibare aerosol te 
gebruiken.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Hoofdonderzoek: c × t-protocol  
39. De beginconcentratie (blootstellingssessie I) (aanhangsel 1) die tijdens het 
hoofdonderzoek wordt getest, is ofwel een limietconcentratie, ofwel een door de onderzoeksleider op basis van de verkennende test gekozen con ­
centratie. Indien tijdens of na blootstellingssessie I sterfte is geconstateerd, 
wordt de minimale blootstelling (c × t) die tot sterfte leidt als leidraad genomen voor het vaststellen van de concentratie en blootstellingsperioden voor blootstellingszitting II. Elke volgende blootstellingsessie hangt af van 
de sessie die eraan voorafgaat (zie aanhangsel 1).
 
40. Voor veel teststoffen zullen de resultaten die worden verkregen bij de begin ­
concentratie, plus drie extra blootstellingssessies met een kleinere tijdraster 
(d.w.z. de geometrische afstand tussen de blootstellingsperioden, zoals aan ­
gegeven door de factor tussen opeenvolgende perioden, doorgaans √2), 
toereikend zijn om de c × t-sterfteverhouding vast te stellen (15), maar 
het gebruik van een vijfde blootstellingsconcentratie kan van enig nut zijn 
(zie aanhangsel 1 en GD 39 (2)). Voor de mathematische behandeling van de resultaten voor het c × t-protocol, zie aanhangsel 1.
 
WAARNEMINGEN  
41. De dieren worden tijdens de blootstellingsperiode veelvuldig klinisch geob ­
serveerd. Na de blootstelling worden op dezelfde dag nog ten minste twee 
klinische observaties verricht, of meer als de respons van de dieren op de behandeling daartoe aanleiding geeft, en vervolgens gedurende veertien da ­
gen ten minste één keer per dag. De duur van de observatieperiode staat niet 
vast, maar wordt bepaald op grond van de aard en het aanvangstijdstip van 
klinische symptomen en de duur van de herstelperiode. Het is belangrijk op welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen. Alle observaties 
worden systematisch geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht 
bijgehouden. Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige pijn hebben en/of blijvende tekenen van hevige angst vertonen, worden met het oog op het dierenwelzijn op humane wijze gedood. Wanneer onderzoek 
wordt gedaan naar klinische toxiciteitsverschijnselen, moet erop worden 
gelet dat een aanvankelijk slecht uiterlijk aspect en voorbijgaande verande ­
ringen in de ademhaling als gevolg van de blootstellingsprocedure, niet worden aangezien voor aan de teststof gerelateerde toxiciteit die het nodig 
zou maken de dieren voortijdig te doden. Er moet rekening worden gehou ­
den met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (GD 19) (7). Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden gedood 
of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk geregistreerd 
op welk tijdstip ze zijn gestorven.
 
42. Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar 
veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de 
ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuw ­
stelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Waar mogelijk moet een onderscheid worden gemaakt tussen lokale en systemische effec ­
ten. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speek ­
selafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behan ­
deling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of 
hypo-/hyperthermie.
 
Lichaamsgewicht  
43. Het gewicht van elk dier wordt tijdens de acclimatiseringsperiode één keer 
geregistreerd, op dag 0 (de dag van blootstelling) voorafgaand aan de bloot ­
stelling en ten minste op de dagen 1, 3 en 7 (en vervolgens iedere week), 
alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd als dit 
na dag 1 is. Het lichaamsgewicht is erkend als een kritische indicator van toxiciteit en dieren die een blijvende gewichtsafname van ≥ 20 % vertonen 
ten opzichte van de voor de studie geregistreerde waarde, moeten zorgvuldig 
worden gevolgd. Aan het einde van de periode na de blootstelling worden 
de dieren die nog leven, gewogen en op humane wijze gedood.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Pathologie  
44. Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of 
met het oog op het dierenwelzijn worden geëuthanaseerd en uit het onder ­
zoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Als het 
niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een ob ­
ductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij temperaturen die laag genoeg zijn om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of 
twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische verande ­
ringen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
 
45. Om de interpretatieve waarde van de studie te vergroten kan worden over ­
wogen aanvullend onderzoek te verrichten dat vooraf in de opzet is opge ­
nomen, zoals bepaling van het longgewicht van overlevende ratten en/of 
microscopisch onderzoek van de luchtwegen om aanwijzingen voor irritatie te vinden. Ook kunnen de organen worden onderzocht die tekenen van macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 
uur of langer nog leven, alsmede organen waarvan bekend is of verwacht 
wordt dat zij zijn aangetast. Microscopisch onderzoek van de volledige luchtwegen kan nuttige informatie opleveren voor teststoffen die met water reageren, zoals zuren en hygroscopische teststoffen.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
46. Voor elk dier worden de gegevens over het lichaamsgewicht en de obduc ­
tiebevindingen vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteits ­
verschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aange ­
troffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.
 
Testverslag  
47. In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opge ­
nomen:  
Proefdieren en dierhouderij:  
— beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: 
aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omge ­
vingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie 
van de voeding;  
— gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort 
dan ratten;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— randomiseringsmethode;  
— details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst 
van het voeder en herkomst van het water);  
— beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, 
met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigen ­
schappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);  
— identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Ab ­
stracts Service).  
Medium:  
— motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan 
(indien een ander medium dan water wordt gebruikt);  
— historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet 
interfereert met de uitkomst van de studie.  
Inhalatiekamer:  
— beschrijving van de inhalatiekamer met inbegrip van afmetingen en 
volume;  
— herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van 
dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;  
— apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deel ­
tjesgrootte en de feitelijke concentratie;  
— herkomst van de lucht, behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde 
lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;  
— toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het ver ­
krijgen van een homogene testatmosfeer;  
— drukverschil (positief of negatief);  
— blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie 
van de dieren in het systeem (blootstelling van het hele lijf);  
— homogeniteit/stabiliteit van de testatmosfeer in de tijd;  
— locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van 
de testatmosfeer in de kamer;  
— luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus 
alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);  
— informatie over de apparatuur die voor de zuurstof- en kooldioxideme ­
ting is gebruikt, indien van toepassing;  
— equilibratietijd van de kamer (t  95 ); 
— aantal volumeveranderingen per uur;  
— meetapparaten (indien van toepassing).  
Blootstellingsgegevens:  
— motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;  
— nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide 
teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);  
— feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren 
verzamelde teststof; voor mengsels die heterogene fysische vormen pro ­
duceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden 
geanalyseerd;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (bv. mg/l, 
mg/m  3 enz.); de volume-eenheden (bv. ppm, ppb enz.) kunnen tevens 
tussen haakjes worden vermeld;  
— deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische 
diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking ( σ g ), onder ver ­
melding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjes ­
grootteanalysen worden vermeld.  
Testomstandigheden:  
— details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de 
procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vast materiaal te verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden. Als de samenstelling 
van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen, wor ­
den de resultaten opgenomen van de analysen die zijn verricht om de samenstelling van de teststof te controleren;
 
— een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de 
apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de bloot ­
stelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;  
— details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering 
van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
 
— motivering van de keuze van de testconcentraties.  
Resultaten:  
— een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de 
kamer;  
— een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de 
kamer;  
— een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens 
over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgroottever ­
deling en de berekening van de MMAD en σ g ; 
— een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor 
elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterf ­
te, en de aard, hevigheid, aanvangstijdstip en duur van de effecten);  
— voor elk dier het tijdens de studie bepaalde gewicht; de datum en het 
tijdstip waarop zij zijn gestorven, indien vóór de geplande euthanasie; en voor elk dier het aanvangstijdstip en het verloop van de toxiciteitsver ­
schijnselen en of ze reversibel waren;
 
— voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevin ­
dingen, indien beschikbaar;  
— schattingen van de mortaliteit (bv. LC  50 , LD  01 ) met inbegrip van de 
95 %-betrouwbaarheidsgrenzen en de helling (indien de evaluatie ­
methode daarin voorziet);  
— statistisch verband, met inbegrip van de geschatte waarde van de expo ­
nent n (c × t-protocol). De naam van de gebruikte statistische software 
moet worden vermeld.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Bespreking en interpretatie van de resultaten:  
— speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden 
die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;
 
— er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het 
licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;
 
— er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten 
worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voort ­
durende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad 
voor humane eindpunten (8);  
— indien het testen volgens hoofdstuk B.52 van deze bijlage (4) is gestaakt 
om over te gaan op deze testmethode B.2, moet dit worden gemotiveerd;  
— in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de 
consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale 
en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
 
— er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en over ­
heersende werking (systemisch of plaatselijk).  
LITERATUUR:  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Beschikbaar op: http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sessment No. 39, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/ testguidelines
 
(3) Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad 
van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) 
nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
 
(4) Hoofdstuk B.52 van deze bijlage, Acute inhalatietoxiciteit: methode ter 
bepaling van de acute-toxiciteitsklasse.  
(5) Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test op basis van de 
transcutane elektrische weerstand (TEW).  
(6) Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test met humaan 
huidmodel.  
(7) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosi ­
on. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
 
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167.  
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
(14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINITIE  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Aanhangsel 1  
C × t-protocol  
1. Als alternatief voor het traditionele protocol kan een stapsgewijs „concen ­
tratie × tijd”-onderzoek (c × t-onderzoek) worden overwogen voor de be ­
oordeling van de inhalatietoxiciteit (12)(13)(14). Het wordt bij voorkeur uitgevoerd wanneer specifieke behoeften op het gebied van regelgeving of 
wetenschap het nodig maken gedurende meerdere perioden van verschil ­
lende duur dierproeven uit te voeren, bijvoorbeeld met het oog op het opstellen van rampenbestrijdings- of ruimtelijkeordeningsplannen. Deze aan ­
pak begint meestal met het testen bij een limietconcentratie (blootstellings ­
sessie I), waarbij de dieren worden blootgesteld aan een teststof gedurende 
vijf perioden van verschillende duur (bv. 15, 30, 60, 120 en 240 minuten), zodat binnen één blootstellingssessie gegevens over meerdere perioden van verschillende duur worden verkregen (zie figuur 1). Indien 
Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietcon ­
centraties voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l. Deze niveaus mogen slechts worden overschreden wanneer er op grond van wetenschappelijke of regelgevingsoverwegingen behoefte 
bestaat aan het testen bij deze niveaus (zie punt 37 van de hoofdtekst van 
hoofdstuk B.2).
 
2. In situaties waarin er weinig of geen informatie over de toxiciteit van een 
teststof beschikbaar is, moet een verkennende test worden uitgevoerd waar ­
bij groepen van ten hoogste 3 dieren per geslacht worden blootgesteld aan door de onderzoeksleider gekozen doelconcentraties, doorgaans gedurende 240 minuten.
 
3. Indien een limietconcentratie is getest tijdens blootstellingssessie I en er 
minder dan 50 % sterfte is geconstateerd, zijn geen verdere tests nodig. Wanneer er op grond van wetenschappelijke of regelgevingsoverwegingen 
behoefte bestaat aan het vaststellen van de concentratie/tijdstip/responsver ­
houding bij hogere niveaus dan de aangegeven limietconcentratie, moet de volgende blootstelling bij een hoger niveau plaatsvinden, bijvoorbeeld bij twee keer de limietconcentratie (d.w.z. 2 L in figuur 1).
 
4. Wanneer bij de limietconcentratie toxiciteit wordt waargenomen, zijn aan ­
vullende tests (hoofdonderzoek) nodig. Deze aanvullende blootstellingen vinden ofwel bij lagere concentraties (in figuur 1: blootstellingssessies II, 
III of IV') ofwel bij hogere concentraties gedurende kortere perioden (in 
figuur 1: blootstellingssessie IV) plaats, waarbij de lengten van de perioden zijn aangepast en minder ver uit elkaar liggen.
 
5. De test (beginconcentratie en aanvullende concentraties) wordt uitgevoerd 
met 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip, of 2 dieren van het gevoeligste geslacht per concentratie/tijdstip. Onder bepaalde omstandigheden kan de onderzoeksleider ervoor kiezen om 2 ratten per geslacht per concentratie/ 
tijdstip (of 4 dieren van het gevoeligste geslacht per concentratie/tijdstip) te 
gebruiken (15). Door 2 dieren per geslacht per concentratie/tijdstip te ge ­
bruiken wordt doorgaans de bias en de variabiliteit van de schattingen ver ­
kleind, het percentage succesvolle schattingen verhoogd, en het dekkings ­
percentage van het betrouwbaarheidsinterval verbeterd. Nadere bijzonderhe ­
den zijn opgenomen in GD 39 (2).
 
6. In het ideale geval wordt elke blootstellingssessie binnen één dag uitge ­
voerd. Dit biedt de gelegenheid om de volgende blootstelling uit te stellen 
totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven, en het stelt de onderzoeksleider in staat de doelconcentratie en de duur van de verschillende perioden voor de volgende blootstellingssessie 
aan te passen. Het is aan te raden elke blootstellingssessie te beginnen 
met de groep die het langst zal worden blootgesteld, bv. de 240 minuten- blootstellingsgroep, gevolgd door de 120 minuten-blootstellingsgroep enz. Indien bijvoorbeeld de dieren in de 240 minuten-groep na 90 minuten 
sterven of ernstige toxiciteitsverschijnselen vertonen (bv. extreme verande ­
ringen van het ademhalingspatroon, zoals zware ademhaling), zou het niet zinvol zijn om een groep gedurende 120 minuten bloot te stellen, aangezien de sterfte waarschijnlijk 100 % zou bedragen. De onderzoeksleider moet dus 
kortere blootstellingsperioden kiezen voor die concentratie (bv. 90, 65, 45, 
33 en 25 minuten).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. De kamerconcentratie moet veelvuldig worden gemeten om de tijdgewogen 
gemiddelde concentratie voor elke blootstellingsduur te bepalen. Waar mo ­
gelijk moet het tijdstip waarop voor elk dier de dood intreedt (in plaats van de blootstellingsduur) worden gebruikt bij de statistische analyse.
 
8. De resultaten van de eerste vier blootstellingssessies moeten worden 
onderzocht om vast te stellen of er gegevens ontbreken in de concentratie-tijdcurve (zie figuur 1). Als er geen voldoende passende fitting mogelijk is, kan er een extra blootstelling (vijfde concentratie) worden uit ­
gevoerd. De concentratie en lengten van de blootstellingsperioden voor de 
vijfde blootstelling moeten zodanig worden gekozen dat de ontbrekende gegevens kunnen worden ingevuld.
 
9. Alle blootstellingssessies (met inbegrip van de eerste blootstellingssessie) 
worden om de concentratie-tijd-responsverhouding te berekenen met behulp van statistische analyse (16). Indien mogelijk moeten voor elk c × t-interval de tijdgewogen gemiddelde concentratie en de blootstellingsduur tot het 
intreden van de dood (indien de dood intreedt tijdens de blootstelling) 
worden gebruikt.
 
Figuur 1  
Hypothetisch voorbeeld van een concentratie-tijd-sterfteverhouding bij 
ratten
  
Open symbolen = overlevende dieren; gesloten symbolen = dode dieren  
Driehoeken = vrouwtjes; cirkels = mannetjes  
Doorlopende lijn = LC  50 -waarden (bereik 7,5-240 min) voor mannetjes met n = 1  
Streeplijn = LC  50 -waarden (bereik 7,5-240 min) voor vrouwtjes met n = 1  
Punt-streeplijnen = lijn door hypothetische LC  50 -waarden voor mannetjes en 
vrouwtjes als n gelijk was geweest aan 2 (12).  
Legenda:  
Concentratie:  
Blootstellingstijd:  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Hieronder volgt een voorbeeld van de stapsgewijze procedure:  
Blootstellingssessie I — tests bij de limietconcentratie (zie figuur 1)  
— 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren (  a ) 
— Doelconcentratie (  b ) = limietconcentratie  
— Stel vijf groepen dieren bloot bij deze doelconcentratie gedurende res ­
pectievelijk 15, 30, 60, 120 en 240 minuten.  
↓ 
Blootstellingssessie II  ( c ) — Hoofdonderzoek  
— 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren  
— Stel vijf groepen dieren bloot bij een lagere concentratie (  d ) (1/2 L) 
gedurende iets langere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie 
figuur 1).  
↓ 
Blootstellingssessie III — Hoofdonderzoek  
— 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren  
— Stel vijf groepen dieren bloot bij een lagere concentratie (  d ) (1/4 L) 
gedurende iets langere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie 
figuur 1).  
↓ 
Blootstellingssessie IV’— Hoofdonderzoek  
— 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren  
— Stel vijf groepen dieren bloot bij een lagere concentratie (  d ) (1/8 L) 
gedurende iets langere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie 
figuur 1).  
↓ of ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Indien er geen informatie beschikbaar is over mogelijke geslachtsgebonden gevoeligheid, 
worden ratten van beide geslachten gebruikt, d.w.z. 1 dier/geslacht per concentratie. Op basis van bestaande informatie, of als tijdens deze blootstellingssessie blijkt dat een van 
beide geslachten gevoeliger is, worden voor de volgende tests 10 dieren van het gevoe ­
ligste geslacht gebruikt (2 dieren per concentratie/tijdstip) bij elk concentratieniveau. 
(
 b ) Indien Verordening (EG) nr. 1272/2008 wordt toegepast, bedragen de limietconcentraties 
voor gassen, dampen en aerosolen respectievelijk 20 000 ppm, 20 mg/l en 5 mg/l. In 
geval van verwachte toxiciteit of op basis van de resultaten van de verkennende test 
moeten lagere aanvangsconcentraties worden gekozen. Wanneer daar op grond van we ­
tenschappelijke of regelgevingsoverwegingen behoefte aan bestaat, kunnen hogere con ­
centraties worden gebruikt. 
( c ) In het ideale geval wordt de blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau 
uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder behandelde dieren zullen 
overleven. Dit stelt de onderzoeksleider in staat de doelconcentratie en de duur van de 
verschillende perioden voor de volgende blootstellingssessie aan te passen. 
( d ) De minimale dosis (concentratie × tijd) die tot sterfte heeft geleid tijdens het testen bij de 
beginconcentratie (eerste blootstellingssessie) wordt als leidraad genomen voor het vast ­
stellen van de volgende combinatie van concentratie en blootstellingsperioden. Door ­
gaans wordt de concentratie gehalveerd (1/2 L) en wordt een nieuwe tijdspanne voor 
de blootstelling van de dieren vastgesteld met een nog fijner raster, waarbij de bloot ­
stellingsperioden een geometrische reeks met factor 1,4 ( √2, zie referentie 11) vormen, 
met in het midden daarvan de tijdsduur die overeenkomt met het tijdens de eerste blootstelling waargenomen minimale letale concentratieniveau (tijd × concentratie). In 
de figuur (figuur 1) werd in blootstellingssessie I bij 15 minuten voor het eerst sterfte 
geconstateerd; de in sessie II gebruikte perioden liggen daarom rond de 30 minuten en 
duren 15, 21, 30, 42 en 60 minuten. Het wordt sterk aanbevolen na de eerste twee 
blootstellingen de gegevens in een grafiek op te nemen die lijkt op de bovenstaande, 
en te controleren of de verhouding tussen concentratie en tijd een hoek van 45 graden 
vertoont (n = 1), of dat deze minder steil (bv. n = 2) of juist steiler (bv. n = 0,8) 
verloopt. In de laatstgenoemde gevallen wordt sterk aangeraden de volgende concentra ­
ties en perioden dienovereenkomstig aan te passen.
 Blootstellingssessie IV — Hoofdonderzoek  
— 1 dier/geslacht per concentratie/tijdstip; totaal 10 dieren  
— Stel vijf groepen dieren bloot bij een hogere concentratied (  e ) (2 L) 
gedurende iets kortere perioden (een factor √2 uit elkaar gelegen; zie 
figuur 1).  
Mathematische behandeling van de resultaten voor het c × t-protocol  
12. Een c × t-procedure met 4 of 5 blootstellingsconcentraties en vijf perioden 
van verschillende duur levert respectievelijk 20 of 25 datapunten op. Met 
deze datapunten kan de c × t-verhouding worden berekend met behulp van statistische analyse (16):
 
Vergelijking 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
waarbij C = concentratie; t = blootstellingsduur, of  
Vergelijking 2:  
Response ¼ ƒðC n tÞ 
waarbij  n ¼ b 1=b 2: 
Met behulp van van vergelijking 1 kan de LC  50 -waarde worden berekend 
voor een periode van een bepaalde duur (bv. 4 uur, 1 uur, 30 minuten, of elke tijdsduur die binnen het geteste bereik valt) door P = 5 te gebruiken 
(50 % respons). Er zij op gewezen dat de Wet van Haber alleen van toe ­
passing is bij n = 1. De LC
 01 kan worden berekend door P = 2,67 te 
gebruiken.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) In bepaalde gevallen kan het nodig zijn om de concentratie te verhogen (2 L) en een 
nieuwe tijdspanne met een nog fijner raster vast te stellen, waarbij de blootstellings ­
perioden een geometrische reeks met factor 1,4 ( √2) vormen, met in het midden daarvan 
de tijdsduur die overeenkomt met het tijdens de eerste blootstelling waargenomen mini ­
male letale concentratieniveau. De minimale blootstellingsduur moet bij voorkeur meer 
bedragen dan 5 minuten; de maximale blootstellingsduur mag niet meer bedragen dan 
uur.”.
 B.3. ACUTE DERMALE TOXICITEIT  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie algemene inleiding deel B (punt A).  
1.2. DEFINITIES  
Zie algemene inleiding deel B (punt B).  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt in geleidelijk stijgende doseringen op de huid van 
verscheidene groepen proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis 
per groep gebruikt. Vervolgens worden de symptomen en sterfte waargenomen. Bij dieren die tijdens het onderzoek stenen en bij dieren die aan het eind van de proefnemingen leven, wordt necropsie 
verricht.
 
Dieren die hevige en aanhoudende tekenen van nood en pijn ver ­
tonen, moeten eventueel op humane wijze worden gedood. Het do ­
seren van teststoffen op een manier waarvan bekend is dat deze als 
gevolg van bijtende of irriterende eigenschappen pijn en nood ver ­
oorzaakt, behoeft niet te worden uitgevoerd.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
Vóór het onderzoek worden de dieren in hun proefkooien ten minste 
5 dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden 
gehouden als tijdens de proef. Gezonde, jong volwassen dieren wor ­
den op een willekeurige manier vóór de behandeling in groepen ingedeeld. Ongeveer 24 uur vóór de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren door knippen of scheren 
verwijderd, bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de 
huid niet wordt bekrast, omdat daardoor de doorlaatbaarheid van de huid zou kunnen veranderen. Ten minste 10 % van de lichaams ­
oppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof worden ont ­
haard. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot een poeder 
kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Als van een medium gebruik 
wordt gemaakt, moet rekening worden gehouden met de invloed 
hiervan op de mate waarin de huid de teststof doorlaat. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt.
 
1.6.2.  Proefomstandigheden  
1.6.2.1.  Proefdieren  
Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten of konijnen. 
Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de noodzake ­
lijkheid hiervan moet worden gerechtvaardigd. De proef dient te worden uitgevoerd met een stam die gewoonlijk in laboratoria wordt gebruikt. Per geslacht mag bij het begin van de studie het gewicht 
van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het 
gemiddelde gewicht afwijken.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Aantal en geslacht  
Voor ieder dosisniveau moeten ten minste 5 knaagdieren worden 
gebruikt. Zij dienen van hetzelfde geslacht te zijn. Indien wijfjes worden gebruikt, moeten deze nullipaar zijn en niet zwanger. Indien 
informatie beschikbaar is die aantoont dat eén van beide geslachten 
duidelijk gevoeliger is, dienen dieren van dit geslacht gebruikt te worden.
 
Opmerking:  In onderzoeken naar acute toxiciteit met dieren van een 
hogere orde dan knaagdieren, dienen kleinere aantallen in over ­
weging te worden genomen. De doses dienen zorgvuldig te worden 
uitgekozen, en alle moeite dient te worden gedaan om matig toxische doses niet te boven te gaan. In dergelijke testen dient toediening van letale doses van de teststof te worden vermeden.
 
1.6.2.3.  Dosisniveaus  
Bij de proeven moeten voldoende (ten minste drie) dosisniveaus 
worden toegepast die zodanig onderling verschillen dat proefgroepen 
worden verkregen met duidelijke verschillen in toxische effecten en 
sterftecijfers. Bij de vaststelling van de dosisniveaus moet rekening worden gehouden met alle mogelijke irriterende of corrosieve effec ­
ten. De gegevens moeten voldoende zijn om een dosis/respons-curve 
te maken en om, indien mogelijk, op aanvaardbare wijze een LD
 50 te 
bepalen.  
1.6.2.4.  Limiettest  
Een limiettest met een dosis van ten minste 2 000 mg/kg lichaams ­
gewicht wordt uitgevoerd op een groep van 5 mannetjes en 5 wijfjes, 
met behulp van de hierboven beschreven testmethode. Indien sterfte wordt vastgesteld die met de teststof verband houdt, moet het uit ­
voeren van een volledig testprogramma overwogen worden.
 
1.6.2.5.  Observatieperiode  
De observatieperiode moet ten minste 14 dagen bedragen. Deze duur 
van de observatie moet echter niet als een streng vastgelegde periode 
beschouwd worden, maar moet door de toxische reacties, het tijdstip 
waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel worden bepaald, de observatieperiode kan dus, indien nood ­
zakelijk, worden verlengd. Van belang zijn het tijdstip waarop in ­
toxicatieverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijd ­
stip waarop zij weer verdwijnen, hun duur en het tijdstip waarop de dood intreedt, in het bijzonder wanneer de kans bestaat voor een vertraagde sterfte.
 
1.6.3.  Uitvoering  
Ieder dier moet individueel in een kooi worden gehuisvest. De test ­
stof wordt gelijkmatig verdeeld over een oppervlak van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen 
mag het te behandelen oppervlak kleiner zijn, maar een zo groot 
mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met een zo dun en zo gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag.
 
De teststof moet gedurende de expositietijd van 24 uur door middel 
van poreus verbandgaas en niet-irriterend plakband in contact met de huid blijven. Het behandelde gedeelte van de huid moet op een 
geschikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de 
teststof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof langs orale weg opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren, kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de 
teststof via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de 
dieren volledig te immobiliseren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Aan het eind van de expositieperiode wordt de resterende teststof — 
zo mogelijk met water — van de huid verwijderd of anders door 
middel van een andere geschikte reinigingstechniek.  
De gedane waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd 
voor ieder individueel dier. Tijdens de eerste dag worden de dieren regelmatig geobserveerd. Ten minste één keer per werkdag moet een 
zorgvuldig klinisch onderzoek worden verricht. De andere waarne ­
mingen moeten iedere dag worden verricht, waarbij erop moet wor ­
den toegezien dat er zo weinig mogelijk dieren voor het onderzoek verloren gaan, bijvoorbeeld door necropsie of koeling van dood 
aangetroffen dieren en door afzondering of opoffering van zwakke 
of stervende dieren.
 
Bij het observeren wordt aandacht besteed aan veranderingen van 
vacht, behandelde huid, ogen, slijmvliezen, ademhaling, bloedsom ­
loop, autonoom en centraal zenuwstelsel, somatomotorische activiteit 
en gedrag. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan de waarneming van tremoren, speekselvloed, diarree, lethargie, slaap en coma. Het tijdstip waarop de dood intreedt moet zo nauwkeurig 
mogelijk worden geregistreerd. Bij dieren die tijdens het onderzoek 
sterven en bij dieren die aan het einde van de proefnemingen leven, wordt necropsie verricht. Alle macroscopisch waarneembare patho ­
logische veranderingen worden geregistreerd. Als hiertoe aanleiding 
bestaat, worden weefselmonsters genomen voor histopathologisch 
onderzoek.
 
Bepaling van de toxiciteit bij het andere geslacht  
Na het voltooien van de studie voor het ene geslacht, moet ten 
minste een groep van 5 dieren van het andere geslacht worden bloot ­
gesteld aan de stof om te verzekeren dat dit geslacht niet duidelijk gevoeliger is voor de teststof. In bepaalde gevallen kunnen redenen bestaan voor het gebruik van minder dieren. Indien voldoende in ­
formatie beschikbaar is om aan te tonen dat dieren van het geteste 
geslacht duidelijk gevoeliger zijn, mag het testen van het andere geslacht achterwege worden gelaten.
 
2. GEGEVENS  
De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen 
worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onder ­
zoek, het tijdstip waarop de dood intreedt bij de individuele dieren, 
het aantal dieren dat andere intoxicatieverschijnselen vertoont, een beschrijving van de toxische effecten en de bevindingen bij de ne ­
cropsie. Het gewicht van ieder individueel dier wordt bepaald kort 
voordat de teststof wordt aangebracht, en vervolgens één keer iedere 
week en ten slotte bij zijn dood; veranderingen in het gewicht wor ­
den berekend en geregistreerd, indien de dieren langer dan één dag in leven blijven. Dieren die op humane wijze gedood worden om ­
wille van nood of ongemak en pijn in verband met de stof, worden 
geregistreerd als gestorven in verband met de stof. De LD
 50 moet 
door middel van een erkende methode worden bepaald.  
Bij de evaluatie van de gegevens moet ook aandacht worden besteed 
aan het eventuele verband dat bestaat tussen de blootstelling van de 
dieren aan de teststof en het aantal en de ernst van alle voorkomende afwijkingen, waaronder gedrags- en klinische afwijkingen, macrosco ­
pisch waarneembare beschadigingen, veranderingen in het lichaams ­
gewicht, sterfte en eventuele andere toxicologische effecten.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voeding, enzo ­
voort;  
— proefomstandigheden (met vermelding van de wijze waarop de 
huid is schoongemaakt en het soort verband: occlusief of niet occlusief);
 
— dosisniveaus (met het eventuele medium en de concentraties);  
— het geslacht van de blootgestelde dieren;  
— tabellarische gegevens betreffende de effecten per geslacht en 
dosisniveau (dat wil zeggen het aantal dieren dat tijdens de proef 
stierf of gedood werd, het aantal dieren dat intoxicatieverschijn ­
selen vertoont, het aantal blootgestelde dieren);  
— het tijdstip na de blootstelling waarop de dood intreedt, redenen 
en criteria voor het op humane wijze doden van dieren;  
— alle waarnemingen;  
— de LD  50 van het geslacht dat het volledige onderzoek onderging, 
bepaald na 14 dagen (waarbij de berekeningsmethode dient te worden omschreven);
 
— 95 %-betrouwbaarheidsinterval voor de LD  50 (waar dit gegeven 
kan worden);  
— dosis/sterfte-curve met helling (indien dit bij de gebruikte bepa ­
lingsmethode mogelijk is);  
— bevindingen bij de necropsie;  
— eventuele histopathologische bevindingen;  
— resultaten van de test die eventueel op het andere geslacht werd 
uitgevoerd;  
— bespreking van de resultaten (speciale aandacht dient besteed te 
worden aan het effect dat het op humane wijze doden van dieren 
tijdens de proeven zou kunnen hebben op de berekende LD  50 ); 
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie algemene inleiding deel B (punt D).  
4. LITERATUUR  
Zie algemene inleiding deel B (punt E).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. ACUTE TOXICITEIT: HUIDIRRITTATIE/CORROSIE  
1. METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan TG 404 (2002) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
Bij de samenstelling van deze bijgewerkte methode is bijzondere 
aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen met het oog op het 
welzijn van de dieren en aan de evaluatie van alle bestaande infor ­
matie over de teststof om onnodige tests bij proefdieren te vermijden. In deze methode wordt de aanbeveling opgenomen de bestaande 
relevante gegevens op bewijskracht te analyseren, alvorens de be ­
schreven  in-vivo  test op corrosie/irritatie van de stof wordt uitge ­
voerd. Wanneer er onvoldoende gegevens beschikbaar zijn, kunnen ze worden aangevuld door een sequentiële teststrategie te volgen (1). 
De aanbevolen teststrategie omvat de uitvoering van gevalideerde en 
erkende  in-vitro  tests en is als bijlage bij deze methode opgenomen. 
Bovendien wordt aanbevolen bij de voorlopige  in-vivo  test de drie 
testgaasjes waar mogelijk niet tegelijkertijd maar achtereenvolgens 
aan te brengen.
 
In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dieren ­
welzijn moeten er geen  in-vivo  tests worden uitgevoerd voordat alle 
beschikbare gegevens over de mogelijke huidcorrosie/irritatie door 
de stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoor ­
beeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proef ­
dieren, gegevens over corrosie/irritatie door een of meer qua struc ­
tuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens 
waaruit blijkt dat de stof sterk zuur of sterk alkalisch is (2)(3), en 
resultaten van gevalideerde en erkende  in-vitro - of  ex-vivo  
tests (4)(5)(5a). Door een dergelijke analyse zijn er minder  in-vivo  
tests nodig op huidcorrosie/irritatie door stoffen waarvoor al vol ­
doende bewijsmateriaal bestaat uit andere onderzoeken met deze 
twee eindpunten.  
Een aanbevolen sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van 
gevalideerde en erkende  in-vitro - of ex-vivo  tests op corrosie/irritatie 
is opgenomen, is als bijlage bij deze methode opgenomen. De stra ­
tegie is ontwikkeld tijdens een OESO-workshop (6), met algemene stemmen door de deelnemers aanbevolen en als aanbevolen teststra ­
tegie opgenomen in het „Globally Harmonised System for the Clas ­
sification of Chemical Substances” (GHS) (7). Hoewel deze sequen ­
tiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B 4 is, wordt aanbevolen deze teststrategie te volgen alvorens  in-vivo  tests 
uit te voeren. Voor nieuwe stoffen is het de aanbevolen stapsgewijze 
testbenadering om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over 
corrosie/irritatie door de stof te verkrijgen. Wanneer er voor be ­
staande stoften onvoldoende gegevens over de huidcorrosie/irritatie beschikbaar zijn, moet de strategie worden gebruikt om ontbrekende 
gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie 
of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden gegeven.
 
Als bij een bewijskrachtanalyse niet kan worden geconcludeerd of er 
sprake is van corrosie of irritatie, moet overeenkomstig de sequenti ­
ële teststrategie een  in-vivo  test worden overwogen (zie de bijlage).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. DEFINITIES  
Huidirritatie:  het ontstaan van een omkeerbare beschadiging van de 
huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur.  
Huidcorrosie:  het ontstaan van een onomkeerbare beschadiging van 
de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 
uur. Corrosie-reacties worden gekenmerkt door zweren, bloedingen, 
bloedkorsten en, tegen het eind van de observatieperiode van 14 dagen, ontkleuring door bleking van de huid, gebieden met volledige haaruitval en littekens. Voor de beoordeling van twijfelachtige letsels 
moet histopathologie worden overwogen.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt in een dosis op de huid van een proefdier aange ­
bracht; de onbehandelde huid van het proefdier wordt als controle 
gebruikt. De mate van irritatie/corrosie wordt op bepaalde tijdstippen afgelezen en ingeschaald en wordt nader beschreven om een vol ­
ledige evaluatie van de effecten mogelijk te maken. De duur van de 
studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de waar ­
genomen effecten reversibel of irreversibel van aard zijn.
 
Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van 
ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden be ­
oordeeld. Voor criteria voor de beslissing om stervende en hevig 
lijdende dieren op humane wijze te doden wordt verwezen naar 
referentie (8).
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding van de  in-vivo  test  
1.4.1.1.  Keuze van de diersoort  
Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er 
worden gezonde jonge volwassen konijnen gebruikt. Wanneer er een andere soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden 
gegeven.
 
1.4.1.2.  Voorbereiding van de dieren  
Ongeveer 24 uur voor de test wordt het haar op het ruggedeelte van 
de romp van de dieren door kort afknippen verwijderd. Er moet op 
worden gelet dat de huid niet wordt geschaafd. Alleen dieren met een gezonde en gave huid mogen worden gebruikt.
 
Sommige konijnenstammen hebben plekken met dichte haargroei, 
die in bepaalde perioden van het jaar meer op de voorgrond treden. De test mag niet op deze plekken met dichte haargroei worden 
uitgevoerd.
 
1.4.1.3.  Huisvesting en voeding  
De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de 
proefdierruimte dient 20  o C (± 3  o C) te zijn. Hoewel de relatieve 
vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % 
(behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het 
gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoe ­
veelheid drinkwater.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Testprocedure  
1.4.2.1.  Het aanbrengen van de teststof  
De teststof wordt aangebracht op een klein huidoppervlak (ongeveer 
6 cm  2 ) en de plek wordt bedekt met een gaasje dat met behulp van 
niet-irriterend plakband op zijn plaats wordt gehouden. Wanneer de 
stof niet direct kan worden aangebracht (bijvoorbeeld bij vloeistoffen of bepaalde pasta's), wordt de teststof eerst op het gaasje aangebracht en wordt dit daarna op de huid bevestigd. Het gaasje moet gedurende 
de blootstellingsperiode door middel van een geschikt semi-occlusief 
verband in licht contact met de huid blijven. Als de teststof op het gaasje wordt aangebracht, moet dit zodanig op de huid worden be ­
vestigd dat er een goed contact en een uniforme verdeling van de 
stof op de huid is. Er moet tevens voor worden gezorgd dat het gaasje voor het dier onbereikbaar is en dat inslikken of inademen van de teststof onmogelijk is.
 
Vloeibare stoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. Bij 
een proef met vaste stoffen (die indien nodig eventueel kunnen worden verpoederd) moet de teststof met een zo klein mogelijke 
hoeveelheid water (of indien nodig een ander geschikt medium) 
worden bevochtigd om voor een goed contact met de huid te zorgen. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet een eventuele invloed van het medium op de irritatie van de huid door 
de teststof minimaal zijn.
 
Aan het einde van de blootstellingsperiode, die normaal gesproken 4 
uur bedraagt, moeten de resten van de teststof zo mogelijk met water 
of met een geschikt oplosmiddel worden verwijderd zonder de be ­
staande respons of de intacte epidermis te wijzigen.  
1.4.2.2.  Dosisniveau  
Een dosis van 0,5 ml vloeistof of 0,5 g vaste stof of pasta wordt op 
het testgedeelte van de huid aangebracht.  
1.4.2.3.  Voorlopige test (in-vivo test op huidirritatie/corrosie met één dier)  
Het is zeer wenselijk dat de  in-vivo  test in eerste instantie met één 
dier wordt uitgevoerd, vooral wanneer wordt vermoed dat de stof corrosie kan veroorzaken. Dit is in overeenstemming met de sequen ­
tiële teststrategie (zie bijlage 1).
 
Wanneer een stof op basis van een bewijskrachtanalyse als corrosief 
wordt beschouwd, zijn er geen verdere dierproeven nodig. Bij de meeste stoffen waarvan wordt vermoed dat ze corrosief zijn, zijn 
verdere  in-vivo  tests normaal gesproken niet nodig. Wanneer aan ­
vullende gegevens nodig worden geacht omdat het bewijsmateriaal onvoldoende is, kunnen echter met de volgende aanpak beperkte 
dierproeven worden uitgevoerd. Bij het dier worden achtereenvol ­
gens maximaal drie testgaasjes aangebracht. Het eerste gaasje wordt na drie minuten verwijderd. Als er geen ernstige huidreactie wordt waargenomen, wordt een tweede gaasje aangebracht dat na een uur 
wordt verwijderd. Als de waarnemingen in deze fase erop wijzen dat 
het niet onmenselijk is de blootstelling tot vier uur te verlengen, wordt een derde gaasje aangebracht, dat na vier uur wordt verwij ­
derd, en wordt de reactie ingeschaald.
 
Als er na een van de drie achtereenvolgende blootstellingen een 
corrosiereactie wordt waargenomen, wordt de test onmiddellijk ge ­
staakt. Als er na de verwijdering van het laatste gaasje geen corrosie ­
reactie wordt waargenomen, wordt het dier gedurende 14 dagen 
geobserveerd tenzij er vóór die tijd al corrosie ontstaat.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Wanneer er niet wordt verwacht dat de teststof corrosie veroorzaakt 
maar deze wel irriterend kan zijn, wordt er één gaasje gedurende vier 
uur op één dier aangebracht.  
1.4.2.4.  Bevestigende test (in-vivo test op huidirritatie/corrosie met meer 
dieren)  
Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargeno ­
men, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren die elk gedurende vier uur aan één gaasje worden blootgesteld. Als er bij de voorlopige test irritatie wordt waargeno ­
men, kan de bevestigende test op sequentiële wijze worden uitge ­
voerd of door nog eens twee dieren tegelijkertijd bloot te stellen. Wanneer in een uitzonderlijk geval de voorlopige test niet wordt uitgevoerd, kunnen twee of drie dieren met één gaasje worden be ­
handeld dat na vier uur wordt verwijderd. Wanneer er twee dieren 
worden gebruikt die beide dezelfde reactie vertonen, is verder testen niet nodig. Als de reactie verschilt, wordt ook het derde dier getest. Er kunnen extra dieren nodig zijn om duidelijkheid te krijgen om ­
trent moeilijk te interpreteren reacties.
 
1.4.2.5.  Observatieperiode  
De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om volledig 
te kunnen beoordelen of de waargenomen effecten reversibel zijn. 
Het experiment moet echter worden beëindigd zodra het dier voort ­
durend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertoont. Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moeten de dieren maximaal 14 dagen na de verwijdering van de gaasjes worden geobserveerd. Als 
al vóór het verstrijken van de 14 dagen wordt geconstateerd dat de 
effecten reversibel zijn, wordt het experiment op dat moment beëin ­
digd.
 
1.4.2.6.  Klinische observatie en inschaling van de huidreacties  
Alle dieren worden op tekenen van erytheem en oedeem onderzocht 
en de respons wordt 60 minuten en vervolgens 24, 48 en 72 uur na de verwijdering van het gaasje ingeschaald. Bij de voorlopige test bij één dier wordt de huid ook onmiddellijk na de verwijdering van het 
gaasje onderzocht. De huidreactie wordt in een van de categorieën in 
de tabel ingeschaald en geregistreerd. Als er sprake is van een be ­
schadiging van de huid die na 72 uur niet als irritatie of corrosie kan worden geïdentificeerd, kan het nodig zijn de observatie tot dag 14 
voort te zetten om te bepalen of de effecten reversibel zijn. Naast de 
observatie van irritatie worden ook alle lokale toxische effecten, zoals ontvetting van de huid, en alle systemische schadelijke effecten 
(zoals effecten op klinische toxiciteitsverschijnselen en het lichaams ­
gewicht) volledig beschreven en geregistreerd. Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties moet histopatholo ­
gisch onderzoek worden overwogen.
 
De inschaling van huidreacties is per definitie subjectief. Om har ­
monisatie bij de inschaling van huidreacties te bevorderen en ter ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uit ­
voeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet 
het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het gebruikte scoresysteem (zie de tabel). Een geïllustreerde leidraad voor de inschaling van huidirritatie en ander letsel kan nuttig zijn 
(9). De inschaling van de huidreacties moet blind gebeuren.
 
2. GEGEVENS  
2.1. VERMELDING VAN DE RESULTATEN  
De resultaten van het onderzoek worden in het eindverslag in tabel ­
vorm vermeld en hierin worden alle onder punt 3.1 vermelde gege ­
vens opgenomen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN  
De scores voor de huidirritatie worden in samenhang met de aard en 
ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm 
voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien 
ook andere effecten van het testmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden be ­
schouwd, die in combinatie met alle andere observaties tijdens het 
onderzoek moeten worden geëvalueerd.
 
Bij de beoordeling van de irritatiereactie moet rekening worden ge ­
houden met de reversibiliteit van het huidletsel. Wanneer reacties als 
haaruitval (beperkt gebied), hyperkeratose, hyperplasie en schilfering tot het einde van de observatieperiode van 14 dagen blijven bestaan, moet de teststof als irriterend worden beschouwd.
 
3. RAPPORTACE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:  
Motivering voor  in-vivo  test: bewijskrachtanalyse van reeds be ­
staande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële test ­
strategie:  
— een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests 
beschikbaar zijn;  
— de gegevens die bij elke fase van de teststrategie verkregen zijn;  
— een beschrijving van de uitgevoerde  in-vitro  tests met een gede ­
tailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met 
test/referentiestoffen verkregen zijn;  
— een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-on ­
derzoek.  
Teststof:  
— identificatiegegevens (bv. het CAS-nr., de herkomst, de zuiver ­
heid, bekende verontreinigingen en het chargenummer);  
— de fysische aard en de fysisch chemische eigenschappen (bv. de 
pH, de vluchtigheid, de oplosbaarheid en de stabiliteit),  
— bij een mengsel: de samenstelling met voor elk bestanddeel het 
procentuele gehalte.  
Medium:  
— identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en 
het gebruikte volume;  
— een motivering voor de keuze van het medium.  
Proefdieren:  
— de gebruikte soort/stam en een motivering indien andere dieren 
dan het albinokonijn worden gebruikt;  
— het aantal dieren van elk geslacht;  
— het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;  
— de leeftijd aan het begin van het onderzoek;  
— de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Testomstandigheden:  
— de techniek voor de voorbereiding van de plaats waarop het 
gaasje wordt aangebracht;  
— een gedetailleerde beschrijving van het gebruikte verbandmateri ­
aal en de verbandtechniek;  
— gedetailleerde gegevens over het bereiden, het aanbrengen en het 
verwijderen van de teststof.  
Resultaten:  
— een tabel met de score van de irritatie/corrosie reactie voor elk 
dier op elk observatietijdstip;  
— beschrijvingen van alle waargenomen letsels;  
— een beschrijving in woorden van de aard en de ernst van de 
waargenomen irritatie of corrosie met eventuele histopathologi ­
sche bevindingen;  
— een beschrijving van andere schadelijke lokale (bijvoorbeeld ont ­
vetting van de huid) en systemische effecten naast de huidirritatie 
of corrosie.  
Bespreking van de resultaten.  
4. REFERENTIES  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ver ­
haar, H.J.M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998). Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, 709-720.  
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  in Vitro  12, pp.483-524.  
(5a) Testmethode B 40: Huidcorrosie.  
(6) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop onHarmonization of Vali ­
dation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological 
Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 
(http.//www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, 
November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos. 
htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, ( 20T-2004 ). United Sta ­
tes Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
[op verzoek verkrijgbaar bij het OESO secretariaat].  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabel I:  
INSCHALING VAN DE HUIDREACTIES  
Vorming van erytheem en korsten  
Geen erytheem 0 
Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar) 1 Duidelijk gedefinieerd erytheem 2 Matig tot ernstig erytheem 3 Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de inschaling 
van erytheem onmogelijk is 4
 
Maximale score 4  
Vorming van oedeem  
Geen oedeem 0 
Zeer licht oedeem (nauwelijks waarneembaar) 1 
Licht oedeem (de randen van het gebied zijn goed zichtbaar door dui ­
delijke zwelling) 2 
Matig oedeem (ongeveer 1 mm zwelling) 3 
Ernstig oedeem (meer dan 1 mm zwelling tot buiten het blootstellings ­
gebied) 4  
Maximale score. 4  
Om duidelijkheid te krijgen omtrent moeilijk te interpreteren reacties kan histop ­
athologisch onderzoek worden uitgevoerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
BIJLAGE  
Een sequentiële teststrategie voor huidirritatie en -corrosie  
ALGEMENE OVERWEGINGEN  
In het belang van verantwoorde wetenschap en het welzijn van dieren is het 
belangrijk dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden en dat tests waar ­
van hevige reacties bij dieren worden verwacht, tot een minimum worden be ­
perkt. Alle informatie over een stof die relevant is voor de mogelijke huidirritatie/corrosie door die stof moet worden geëvalueerd voordat een in-vivo ­
test wordt overwogen. Wellicht bestaat er al voldoende bewijsmateriaal om een 
teststof qua mogelijke huidirritatie of -corrosie in te delen zonder dat er tests bij 
proefdieren behoeven te worden uitgevoerd. Daarom zal het gebruik van een bewijskrachtanalyse en een sequentiële teststrategie de noodzaak van in-vivotests tot een minimum beperken, vooral als er van de stof hevige reacties worden 
verwacht.
 
Het gebruik van een bewijskrachtanalyse voor de evaluatie van bestaande infor ­
matie over huidirritatie en -corrosie door stoffen wordt aanbevolen om te bepalen 
of ander aanvullend onderzoek dan in-vivohuidonderzoek moet worden uitge ­
voerd om te helpen bij de bepaling van deze mogelijke effecten. Wanneer nader onderzoek nodig is, wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te gebruiken 
om de relevante experimentele gegevens te verkrijgen. Voor stoffen die nog niet 
zijn getest, moet de sequentiële teststrategie worden gebruikt om de gegevens te vergaren die nodig zijn om de mogelijke huidirritatie/corrosie te bepalen. De in deze bijlage beschreven teststrategie is tijdens een OESO-workshop (1) ontwik ­
keld en later bevestigd en opgenomen in het „Harmonised Integrated Hazard 
Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances”, die de steun heeft gekregen van de 28e gezamenlijke vergadering van het Comité chemische stoffen en de Werkgroep chemische stoffen in no ­
vember 1998 (2).
 
Hoewel deze sequentiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode 
B.4 is, vormt zij de aanbevolen aanpak voor de bepaling van de kenmerken qua 
huidirritatie/corrosie. Deze aanpak houdt zowel een optimale gedragscode als een ethische referentie voor in-vivotests op huidirritatie/corrosie in. De testmethode bevat een leidraad voor de uitvoering van de in-vivotest en geeft een overzicht 
van de factoren die vóór het begin van een dergelijke test in aanmerking moeten 
worden genomen. De strategie levert een benadering voor de evaluatie van bestaande gegevens over de eigenschappen van teststoffen inzake huidirritatie/ ­
corrosie en een trapsgewijze aanpak voor het vergaren van relevante gegevens 
over stoffen waarvoor nader onderzoek nodig is of waarvoor nog geen onderzoek 
is uitgevoerd. Ook wordt aanbevolen onder bepaalde omstandigheden gevali ­
deerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests op huidirritatie/corrosie uit te voeren.
 
BESCHRIJVING VAN DE EVALUATIE EN DE TESTSTRATEGIE  
Alvorens te beginnen met tests als onderdeel van de sequentiële teststrategie (zie 
figuur), moet alle beschikbare informatie worden geëvalueerd om te bepalen of 
in-vivohuidonderzoek nodig is. Hoewel de evaluatie van individuele parameters 
(bijvoorbeeld een extreme pH) significante informatie kan opleveren, moet re ­
kening worden gehouden met alle bestaande informatie. Alle relevante gegevens over de effecten van de betrokken stof of analoge verbindingen moeten bij het 
nemen van een beslissing over de bewijskracht worden geëvalueerd en er moet 
een motivering voor de beslissing worden gegeven. De nadruk moet in eerste instantie liggen op bestaande gegevens over de effecten van de stof bij mens en dier en vervolgens op de resultaten van in-vitro- of ex-vivotests. Waar mogelijk 
moet in-vivo-onderzoek aan corrosieve stoffen worden vermeden. Bij de test ­
strategie spelen de volgende factoren een rol:
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Evaluatie van bestaande gegevens over de effecten bij mens en dier (stap 1).  In 
de eerste plaats moet worden gekeken naar bestaande gegevens over de effecten 
bij de mens, zoals klinisch of bedrijfsgeneeskundig onderzoek en ziektegevallen, en/of gegevens van dierproeven, bijvoorbeeld van onderzoek naar huidtoxiciteit bij eenmalige of herhaalde blootstelling, omdat deze informatie opleveren die 
rechtstreeks verband houdt met huideffecten. Bij stoffen waarvan bekend is dat 
ze irritatie of corrosie veroorzaken en stoffen waarvoor duidelijk is aangetoond dat dit niet het geval is, behoeven geen in-vivotests te worden uitgevoerd.
 
Analyse van structuuractiviteit-relaties (SAR) (stap 2).  Er moet worden gekeken 
naar de resultaten van tests met qua structuur verwante stoffen, indien deze beschikbaar zijn. Wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn over de ef ­
fecten van qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen bij 
mens en/of dier om te kunnen concluderen dat deze huidcorrosie/irritatie kunnen veroorzaken, mag worden aangenomen dat de te evalueren teststof tot dezelfde 
reacties zal leiden. In dat geval behoeft de stof wellicht niet te worden getest. 
Negatieve gegevens van onderzoek met qua structuur verwante stoffen of meng ­
sels van dergelijke stoffen vormen in het kader van de sequentiële teststrategie niet een afdoende bewijs dat de stof geen corrosie of irritatie veroorzaakt. Voor 
de bepaling van de potentie voor zowel huidcorrosie als -irritatie moeten gevali ­
deerde en erkende SAR-methoden worden gebruikt.
 
Fysisch-chemische eigenschappen en chemische reactiviteit (stap 3).  Stoffen met 
een extreme pH van bijvoorbeeld < 2,0 en ≥ 11,5 kunnen hevige lokale effecten 
hebben. Als een stof op basis van een extreme pH als corrosief voor de huid wordt aangeduid, kan ook rekening worden gehouden met zijn zuur/alkalireserve 
(of buffercapaciteit) (3)(4). Als de buffercapaciteit erop wijst dat een stof wellicht 
niet corrosief voor de huid is, moeten er nadere tests worden uitgevoerd om dit te bevestigen, waarbij bij voorkeur een gevalideerde en erkende  in-vitro-  of ex- 
vivotest moet worden gebruikt (zie de stappen 5 en 6).
 
Huidtoxiciteit (slap 4).  Als van een stof is aangetoond dat deze via de huid zeer 
toxisch is, is een in-vivo-onderzoek naar huidirritatie/corrosie wellicht niet uit ­
voerbaar, omdat de normaal gesproken gebruikte hoeveelheid teststof al groter kan zijn dan de zeer toxische dosis en derhalve tot gevolg kan hebben dat de dieren sterven of hevig lijden. Wanneer er al onderzoek naar de huidtoxiciteit bij 
albinokonijnen tot de limietdosis van 2 000 mg/kg lichaamsgewicht of meer is 
uitgevoerd en er geen huidirritatie of -corrosie is waargenomen, zijn verdere tests op huidirritatie/corrosie bovendien wellicht niet nodig. Bij de evaluatie van acute huidtoxiciteit bij eerder uitgevoerd onderzoek moet er op een aantal aspecten 
worden gelet. Zo kan de gerapporteerde informatie over huidletsel onvolledig 
zijn. De tests en observaties kunnen bij een andere soort dan het konijn zijn uitgevoerd en de gevoeligheid kan van soort tot soort sterk verschillen. Het is 
ook mogelijk dat de stof op de dieren is aangebracht in een vorm die niet 
geschikt is voor de beoordeling van huidirritatie/corrosie, bijvoorbeeld omdat de stof voor de test op huidtoxiciteit is verdund (5). Wanneer er echter goed opgezette en uitgevoerde onderzoeken op huidtoxiciteit bij konijnen zijn verricht, 
kunnen negatieve resultaten als voldoende bewijs worden beschouwd dat de stof 
geen corrosie of irritatie veroorzaakt.
 
Resultaten van in-vitro of ex-vivotests (stappen 5 en 6).  Stoffen waarvan met een 
gevalideerde en erkende  in-vitro  of ex-vivo test (6)(7), die voor de beoordeling 
van deze specifieke effecten is opgezet, is aangetoond dat ze corrosieve of ernstig irriterende eigenschappen hebben, behoeven niet bij dieren te worden getest. Er 
kan worden aangenomen dat dergelijke stoffen  in vivo  vergelijkbare hevige ef ­
fecten veroorzaken.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In-vivotest bij konijnen (stappen 7 en 8).  Wanneer op grond van de bewijskracht 
wordt besloten over te gaan tot in-vivotests, dient eerst een voorlopige test met 
één dier te worden gedaan. Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de stof corrosief voor de huid is, dienen er geen verdere tests te worden uitgevoerd. Als er bij de voorlopige test geen corrosief effect wordt waargenomen, moet de 
irritatiereactie of de negatieve respons worden bevestigd met ten hoogste nog 
eens twee dieren gedurende een blootstellingsperiode van vier uur. Als er bij de voorlopige test een irritatiereactie wordt waargenomen, kan de bevestigingstest sequentieel of door gelijktijdige blootstelling van de twee dieren worden uitge ­
voerd.
 
REFERENTIES  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for 
Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 
22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/tests/background.htm).  
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6. 
htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD 
Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19-26.
 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996). Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411-436.
 
(6) Testmethode B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Figuur  
TEST- EN EVALUATIESTRATEGIE VOOR HUIDIRRITATIE/CORROSIE
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. ACUTE TOXICITEIT: OOGIRRITATIE/CORROSIE  
1. METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan TG 405 (2002) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
Bij de samenstelling van deze bijgewerkte methode is bijzondere 
aandacht besteed aan mogelijke verbeteringen via de evaluatie van alle bestaande informatie over de teststof om onnodige tests bij 
proefdieren te vermijden en zodoende rekening te houden met de 
bezorgdheid omtrent het welzijn van dieren. In deze methode wordt de aanbeveling opgenomen de bestaande relevante gegevens op be ­
wijskracht te analyseren (1), alvorens de beschreven in-vivotest op 
acute oogirritatie/corrosie wordt uitgevoerd. Wanneer er onvoldoende 
gegevens beschikbaar zijn, wordt aanbevolen deze aan te vullen door een sequentiële teststrategie te volgen (2)(3). De aanbevolen teststra ­
tegie omvat de uitvoering van gevalideerde en erkende in-vitrotests 
en is als bijlage bij de testmethode opgenomen. Bovendien wordt 
aanbevolen als prognose voor oogcorrosie een in-vivotest op huidirritatie/corrosie uit te voeren alvorens een in-vivo-oogtest te overwegen.
 
In het belang van zowel wetenschappelijke kwaliteit als het dieren ­
welzijn moeten er geen in-vivotests worden overwogen voordat alle 
beschikbare gegevens over de mogelijke oogcorrosie/irritatie door de 
stof zijn geëvalueerd op bewijskracht. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de resultaten van eerdere studies bij mensen en/of proefdieren, gegevens over corrosie/irritatie door een of meer qua structuur ver ­
wante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen, gegevens waaruit 
blijkt dat de stof sterk zuur of sterk alkalisch is (4)(5), en resultaten van gevalideerde en erkende in-vitro- of ex-vivotests op huidcorrosie en -irritatie (6)(6a). De studies kunnen al vóór de bewijskrachtana ­
lyse zijn uitgevoerd, maar dit kan ook naar aanleiding van deze 
analyse gebeuren.
 
Voor bepaalde stoffen kan uit een dergelijke analyse blijken dat er 
een in-vivo-onderzoek naar een mogelijke oogcorrosie/irritatie door de stof nodig is. In al deze gevallen verdient het de voorkeur, alvo ­
rens het gebruik van de in-vivo-oogtest te overwegen, eerst over ­
eenkomstig testmethode B.4 (7) een onderzoek naar de in-vivohuid ­
effecten van de stof uit te voeren en te beoordelen. Door toepassing van een bewijskrachtanalyse en de sequentiële teststrategie zal het minder vaak nodig zijn de in-vivotest op oogcorrosie/irritatie uit te 
voeren met stoffen waarvoor al voldoende bewijsmateriaal uit andere 
studies bestaat. Als met de sequentiële teststrategie niet kan worden bepaald of er sprake is van een mogelijke oogcorrosie of -irritatie, zelfs na de uitvoering van een in-vivo-onderzoek naar huidcorrosie 
en -irritatie, kan een in-vivotest op oogcorrosie/irritatie worden uit ­
gevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Een aanbevolen sequentiële teststrategie, waarin de uitvoering van 
gevalideerde in-vitro- of ex-vivotests op corrosie/irritatie is opge ­
nomen, is in de bijlage van deze testmethode opgenomen. De stra ­
tegie is ontwikkeld tijdens een OESO-workshop (8), met algemene stemmen door de deelnemers aanbevolen en als aanbevolen teststra ­
tegie opgenomen in het „Globally Harmonised System for the Clas ­
sification of Chemical Substances” (GHS) (9). Hoewel deze sequen ­
tiële teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.5 is, wordt aanbevolen deze teststrategie te volgen alvorens in-vivotests 
uit te voeren. Voor nieuwe stoffen is het de aanbevolen stapsgewijze 
testbenadering om wetenschappelijk verantwoorde gegevens over corrosie/irritatie door de stof te verkrijgen. Wanneer er voor bestaande stoffen onvoldoende gegevens over de huid- en 
oogcorrosie/irritatie beschikbaar zijn, moet de strategie worden 
gebruikt om ontbrekende gegevens aan te vullen. Voor het gebruik van een andere teststrategie of -procedure of de beslissing om geen stapsgewijze testbenadering te volgen moet een motivering worden 
gegeven.
 
1.2. DEFINITIES  
Oogirritatie : het ontstaan van veranderingen in het oog na het aan ­
brengen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen volledig reversibel zijn.
 
Oogcorrosie:  het ontstaan van weefselbeschadiging in het oog of 
een ernstige fysieke zichtvermindering na het aanbrengen van een 
teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog, die binnen 21 dagen na het aanbrengen niet volledig reversibel is.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt in één dosis op een van de ogen van het proefdier 
aangebracht; het onbehandelde oog wordt als controle gebruikt. De 
mate van oogirritatie/corrosie wordt geëvalueerd door op bepaalde tijdstippen het letsel aan de conjunctiva, de cornea en de iris in te schalen. Ook andere effecten in het oog en schadelijke systemische 
effecten worden beschreven om een volledige evaluatie van de ef ­
fecten mogelijk te maken. De duur van de studie moet voldoende zijn om te kunnen beoordelen of de effecten reversibel of irreversibel van aard zijn.
 
Dieren die gedurende een fase van de test voortdurend tekenen van 
ernstig ongerief en/of hevige pijn vertonen, moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienovereenkomstig te worden be ­
oordeeld. Voor criteria voor de beslissing om stervende en hevig 
lijdende dieren op humane wijze te doden wordt verwezen naar 
referentie (10).
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding van de in-vivotest  
1.4.1.1.  Keuze van de soort  
Als proefdier wordt de voorkeur gegeven aan het albinokonijn en er 
worden gezonde jonge volwassen dieren gebruikt. Wanneer er een 
andere stam of soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.
 
1.4.1.2.  Voorbereiding van de dieren  
Beide ogen van ieder voorlopig voor de test geselecteerd proefdier 
worden binnen 24 uur vóór het begin van de test onderzocht. Dieren 
die aan oogirritatie, oogaandoeningen of een reeds bestaand cornea ­
letsel lijden, mogen niet worden gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Huisvesting en voeding  
De dieren worden in aparte kooien gehuisvest. De temperatuur in de 
proefdierruimte dient voor konijnen 20  o C (+ 3  o C) te zijn. Hoewel 
de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger 
dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet 
worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte 
hoeveelheid drinkwater.
 
1.4.2.  Testprocedure  
1.4.2.1.  Het aanbrengen van de teststof  
De teststof wordt bij elk dier aangebracht in de conjunctivaalzak van 
één oog, waarbij het onderste ooglid voorzichtig van de oogbol wordt weggetrokken. Vervolgens worden de oogleden ongeveer 
één seconde zachtjes dichtgehouden om verlies van het materiaal 
te voorkomen. Het andere oog, dat niet behandeld wordt, fungeert als controle.
 
1.4.2.2.  Irrigatie  
De ogen van de proefdieren mogen gedurende ten minste 24 uur na 
het indruppelen van de teststof niet worden uitgewassen, tenzij het om een vaste stof gaat (zie punt 1.4.2.3.2) of wanneer er sprake is 
van onmiddellijke corrosieve of irriterende effecten. Na 24 uur mo ­
gen de ogen eventueel worden uitgewassen.
 
Het gebruik van een satellietgroep om de invloed van het uitwassen 
te onderzoeken wordt niet aanbevolen, tenzij dit wetenschappelijk verantwoord is. Als er een satellietgroep nodig is, dienen hiervoor 
twee konijnen te worden gebruikt. De wijze van uitwassen, waarbij 
het bijvoorbeeld gaat om het tijdstip, de samenstelling en tempera ­
tuur van de wasvloeistof, de duur, het volume en de stroomsnelheid, moet zorgvuldig worden vastgelegd.
 
1.4.2.3.  Dosisniveau  
1.4.2.3.1.  Vloeibare teststoffen  
Bij vloeibare reststoffen wordt een dosis van 0,1 ml gebruikt. Er 
mogen geen sproeipompjes worden gebruikt om de stof rechtstreeks in het oog te brengen. De vloeistof wordt na het sproeien opge ­
vangen en vervolgens wordt 0,1 ml in het oog gedruppeld.
 
1.4.2.3.2.  Vaste teststoffen  
Bij het testen van vaste stoffen, pasta's en vaste deeltjes wordt een 
hoeveelheid met een volume van 0,1 ml of een gewicht van ten hoogste 100 mg gebruikt. Het testmateriaal wordt tot een fijn poeder 
vermalen. Alvorens het volume te meten wordt het vaste materiaal 
licht ingeklonken, bijvoorbeeld door tegen de houder te tikken. Als de vaste stof op het eerste observatietijdstip (1 uur na de behan ­
deling) nog niet door fysiologische mechanismen uit het oog van 
het proefdier is verwijderd, kan het oog met fysiologisch zout of 
gedestilleerd water worden uitgewassen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Aerosol-teststoffen  
Aanbevolen wordt alle sproeivloeistoffen en aerosolen op te vangen 
voordat ze in het oog worden gedruppeld. Er wordt alleen een uit ­
zondering gemaakt voor stoffen in spuitbussen onder druk, die niet kunnen worden opgevangen omdat ze verdampen. In deze gevallen wordt het oog opengehouden en wordt de teststof aan het oog toe ­
gediend door in één keer gedurende ongeveer één seconde vanaf een 
afstand van 10 cm recht voor het oog te spuiten. Deze afstand kan afhankelijk van de druk van de nevel en de inhoud worden aange ­
past. Er moet voor worden gezorgd dat het oog niet door de druk 
van de nevel wordt beschadigd. In bepaalde gevallen kan het nodig 
zijn na te gaan of een „mechanische” beschadiging van het oog door de druk van de nevel mogelijk is.
 
De dosis uit een spuitbus kan door een simulatie als volgt worden 
geraamd: de stof wordt door een opening die zo groot is als het oog van een konijn en recht voor het papier wordt gehouden, op een weegpapiertje gespoten. De gewichtstoename van het papier wordt 
gebruikt voor een benadering van de hoeveelheid die in het oog 
wordt gespoten. Bij vluchtige stoffen kan de dosis worden geraamd door een opvangbakje voor en na de verwijdering van het testmate ­
riaal te wegen.
 
1.4.2.4.  Voorlopige test (in-vivotest op oogirritatie/corrosie met één dier)  
Zoals in de sequentiële teststrategie (zie bijlage 1) wordt gesteld, is 
het zeer wenselijk dat de in-vivotest in eerste instantie met één dier wordt uitgevoerd.
 
Als de resultaten van deze test erop wijzen dat de stof bij gebruik 
van de beschreven procedure corrosief of hevig irriterend is, dienen 
er geen verdere tests op oogirritatie te worden uitgevoerd.  
1.4.2.5.  Lokale anesthetica  
Van geval tot geval kan worden bekeken of er lokale anesthetica 
moeten worden gebruikt. Als de bewijskrachtanalyse erop wijst dat de stof pijn kan veroorzaken of als uit de eerste tests blijkt dat er een 
pijnlijke reactie optreedt, kan vóór het indruppelen van de teststof 
een lokaal anestheticum worden toegediend. De aard, de concentratie en de dosis van het lokaal anestheticum moeten met zorg worden gekozen om ervoor te zorgen dat het gebruik niet leidt tot verschillen 
in de reactie op de teststof. Het controleoog moet op dezelfde wijze 
worden verdoofd.
 
1.4.2.6.  Bevestigende test (in-vivotest op oogirritatie/corrosie met meer die ­
ren) 
Als er bij de voorlopige test geen corrosiereactie wordt waargeno ­
men, moet de irritatie of negatieve reactie worden bevestigd met nog eens twee dieren. Als er bij de voorlopige test hevige irritatie wordt waargenomen, hetgeen wijst op een mogelijk hevig (irreversibel) 
effect bij de bevestigende test, wordt aanbevolen de bevestigende 
test op sequentiële wijze bij één dier tegelijk uit te voeren en de twee andere dieren niet tegelijkertijd bloot te stellen. Als er bij het tweede dier corrosieve of hevig irriterende effecten optreden, wordt 
de test niet voortgezet. Er kunnen extra dieren nodig zijn om een 
zwakke of matige irritatiereactie te bevestigen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Observatieperiode  
De duur van de observatieperiode moet voldoende zijn om de om ­
vang en de reversibiliteit van de waargenomen effecten volledig te kunnen beoordelen. Het experiment moet echter worden beëindigd 
zodra het dier voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig onge ­
rief vertoont (9). Om te bepalen of de effecten reversibel zijn, moe ­
ten de dieren normaal gesproken gedurende 21 dagen na de toedie ­
ning van de teststof worden geobserveerd. Als al vóór het verstrijken 
van de 21 dagen wordt geconstateerd dat de effecten reversibel zijn, 
wordt het experiment op dat moment beëindigd.
 
1.4.2.7.1.  Klinische observatie en inschaling van de oogreacties  
De ogen worden 1, 24, 48 en 72 uur na het aanbrengen van de 
teststof onderzocht. De dieren worden niet langer dan nodig voor de test ingezet zodra er definitieve informatie is verkregen. Dieren die voortdurend tekenen van hevige pijn of ernstig ongerief vertonen, 
moeten op humane wijze worden gedood en de stof dient dienover ­
eenkomstig te worden beoordeeld. Dieren die na de indruppeling de volgende oogletsels ontwikkelen, moeten op humane wijze worden gedood: perforatie van de cornea, significante ulceratie van de cornea 
en stafyloom; bloed in de voorste oogkamer; klasse 4 troebelheid 
van de cornea die gedurende 48 uur aanhoudt; afwezigheid van een lichtreflex (iris-reactie klasse 2) die gedurende 72 uur aanhoudt; ulceratie van de conjunctivae; necrose van de conjunctivae of het 
knipvlies: loslatend dood weefsel. De reden hiervoor is dat dergelijke 
letsels in het algemeen irreversibel zijn.
 
Wanneer de dieren geen oogletsel ontwikkelen, mag de test niet 
eerder dan drie dagen na de indruppeling worden beëindigd. Dieren 
met licht tot matig letsel moeten worden geobserveerd tot het letsel 
verdwijnt of gedurende 21 dagen; op dat tijdstip wordt de test dan afgesloten. Op dag 7, dag 14 en dag 21 worden de dieren geobser ­
veerd om te bepalen wat de status van het letsel is en of het rever ­
sibel of irreversibel is.
 
Bij elk onderzoek wordt de score van de oogreactie (conjunctivae, 
cornea en iris) geregistreerd (zie tabel 1). Ook ander letsel in het oog 
(zoals pannus of verkleuring) en schadelijke systemische effecten 
worden gerapporteerd.  
Het onderzoek van de respons kan worden vergemakkelijkt door het 
gebruik van een binoculaire loep, een handspleetlamp, een biomicro ­
scoop of andere geschikte apparatuur. Na de registratie van de ob ­
servaties na 24 uur kunnen de ogen nader worden onderzocht met behulp van fluoresceïne.
 
De inschaling van oogreacties is per definitie subjectief. Om har ­
monisatie bij de inschaling van oogreacties te bevorderen en ter 
ondersteuning van de testlaboratoria en de personen die bij het uit ­
voeren en het interpreteren van de observatie betrokken zijn, moet 
het personeel dat de observatie uitvoert afdoende zijn opgeleid in het 
gebruikte scoresysteem.  
2. GEGEVENS  
2.1. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN  
De scores voor de oogirritatie worden in samenhang met de aard en 
ernst van het letsel en de vraag of dit al dan niet reversibel is, 
beoordeeld. De individuele scores vormen geen absolute norm 
voor de irriterende eigenschappen van een materiaal, aangezien ook andere effecten van het restmateriaal worden beoordeeld. De individuele scores moeten veeleer als referentiewaarden worden be ­
schouwd en zijn alleen zinvol wanneer ze worden ondersteund door 
een volledige beschrijving en evaluatie van alle observaties.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:  
Motivering voor in-vivotest: bewijskrachtanalyse van reeds be ­
staande testgegevens, zoals de resultaten van een sequentiële test ­
strategie:  
— een beschrijving van de relevante gegevens die van eerdere tests 
beschikbaar zijn;  
— de gegevens die bij elke stap van de teststrategie verkregen zijn;  
— een beschrijving van de uitgevoerde in-vitro tests met een gede ­
tailleerde beschrijving van de procedures en de resultaten die met test/referentiestoffen verkregen zijn;
 
— een beschrijving van het uitgevoerde in-vivo-onderzoek op 
huidirritatie/corrosie met de verkregen resultaten;  
— een bewijskrachtanalyse voor de uitvoering van het in-vivo-on ­
derzoek.  
Teststof:  
— identificatiegegevens (bv. het CAS-nr., de herkomst, de zuiver ­
heid, bekende verontreinigingen en het chargenummer):  
— de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de 
pH, de vluchtigheid, de oplosbaarheid, de stabiliteit en de reacti ­
viteit met water);  
— bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het 
procentuele gehalte;  
— als een lokaal anestheticum is gebruikt: identificatiegegevens, de 
zuiverheid, het type, de dosis en de potentiële interactie met de teststof.
 
Medium:  
— identificatiegegevens, de concentratie (indien van toepassing) en 
het gebruikte volume;  
— een motivering voor de keuze van het medium.  
Proefdieren:  
— de gebruikte soort/stam en een motivering indien andere dieren 
dan het albinokonijn worden gebruikt;  
— de leeftijd van elk dier aan het begin van het onderzoek;  
— het aantal dieren van elk geslacht in de test- en controlegroep 
(indien deze nodig is);  
— het gewicht van elk dier aan het begin en het eind van de test;  
— de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.  
Resultaten:  
— een beschrijving van de methode die is gebruikt om de irritatie 
op elk observatietijdstip in te schalen (bijvoorbeeld handspleet ­
lamp, biomicroscoop of fluoresceïne):  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— een tabel met de gegevens van de irritatie/corrosiereactie voor elk 
dier op elk observatietijdstip tot het moment waarop elk dier uit 
de test wordt genomen;  
— een beschrijving in woorden van de ernst en de aard van de 
waargenomen irritatie of corrosie;  
— een beschrijving van alle andere in het oog waargenomen letsels 
(bijvoorbeeld vascularisatie, pannusvorming, verkleving en ver ­
kleuring);  
— een beschrijving van schadelijke lokale effecten buiten het oog 
en schadelijke systemische effecten en eventuele histopathologi ­
sche bevindingen.  
Bespreking van de resultaten.  
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Een extrapolatie van de resultaten van het onderzoek naar oogirritatie 
bij proefdieren naar de mens heeft slechts een beperkte geldigheid. In 
veel gevallen is het albinokonijn gevoeliger voor stoffen die oog ­
irritatie of -corrosie veroorzaken dan de mens.  
Bij de interpretatie van de resultaten moet ervoor worden gezorgd 
dat irritatie ten gevolge van secundaire infectie wordt uitgesloten.  
4. REFERENTIES  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997). Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26.  
(5) Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227-231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  in Vitro  12, pp.483-524.  
(6a) Testmethode B.40: Huidcorrosie.  
(7) Testmethode B.4: Acute toxiciteit: huidirritatie/corrosie.  
(8) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Vali ­
dation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological 
Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(10) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane 
Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 
(http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabel I:  
INSCHALING VAN HET OOGLETSEL  
Cornea  
Troebelheid: dichtheidsgraad (wordt afgelezen in het gebied met de grootste 
dichtheid) (*) 
Geen ulceratie of troebelheid 0 
Verspreide of diffuse troebele gebieden (meer dan een lichte vertroebe ­
ling van de normale glans); details van de iris duidelijk zichtbaar 1 
Gemakkelijk te onderscheiden doorschijnend gebied; details van de iris 
enigszins vervaagd 2 
Parelmoerachtig gebied; details van de iris niet zichtbaar; omvang van 
de pupil nauwelijks zichtbaar 3 
Troebele cornea; iris niet zichtbaar door de troebelheid 4  
Maximale score: 4  
NOTEN  
(*) Er moet worden aangegeven welk gebied van de cornea troebel is  
Iris 
Normaal 0 
Duidelijk verdiepte rugae, congestie, zwelling, matige hyperemie rond 
de cornea of injectie; iris reageert op licht (een trage reactie wordt als 
een effect beschouwd) 1 
Bloeding, macroscopische destructie of geen reactie op licht 2  
Maximale score: 2  
Conjunctivae  
Roodheid (geldt voor palpebrale en bulbaire conjunctivae; niet voor cornea en 
iris) 
Normaal 0 
Hyperemie in sommige bloedvaten (geïnjecteerd) 1 Diffuse karmozijnrode kleur; individuele vaten niet gemakkelijk zicht ­
baar 2 
Diffuse dieprode kleur 3
 
Maximale score: 3  
Chemosis  
Zwelling (geldt voor oogleden en/of knipvliezen) 
Normaal 0 
Iets meer zwelling dan normaal 1 Duidelijke zwelling met gedeeltelijk uitpuilende oogleden 2 Zwelling met ongeveer half gesloten oogleden 3 Zwelling met meer dan half gesloten oogleden 4
 
Maximale score: 4  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
BIJLAGE  
Een sequentiële teststrategie voor oogirritatie en -corrosie  
ALGEMENE OVERWEGINGEN  
In het belang van verantwoorde wetenschap en het welzijn van dieren is het 
belangrijk dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden en dat tests waar ­
van hevige reacties bij dieren worden verwacht, tot een minimum worden be ­
perkt. Alle informatie over een stof die relevant is voor de mogelijke oogirritatie/corrosie door die stof moet worden geëvalueerd voordat een in-vivo ­
test wordt overwogen. Wellicht bestaat er al voldoende bewijsmateriaal om een 
teststof qua mogelijke oogirritatie of -corrosie in te delen zonder dat er tests bij 
proefdieren behoeven te worden uitgevoerd. Daarom zal het gebruik van een bewijskrachtanalyse en een sequentiële teststrategie de noodzaak van in-vivotests tot een minimum beperken, vooral als er van de stof hevige reacties worden 
verwacht.
 
Er wordt aanbevolen dat een bewijskrachtanalyse wordt gebruikt om bestaande 
informatie over oogirritatie en -corrosie door stoffen te evalueren en om te 
bepalen of ander aanvullend onderzoek dan in-vivo-oogonderzoek moet worden 
uitgevoerd om te helpen bij de bepaling van deze mogelijke effecten. Wanneer nader onderzoek nodig is, wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te ge ­
bruiken om de relevante experimentele gegevens te verkrijgen. Voor stoffen die 
nog niet zijn getest, moet de sequentiële teststrategie worden gebruikt om de 
gegevens te vergaren die nodig zijn om de oogcorrosie/irritatie te bepalen. De in deze bijlage beschreven teststrategie is tijdens een OESO-workshop (1) ontwik ­
keld. Later is zij bevestigd en opgenomen in het „Harmonised Integrated Hazard 
Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances”, die de steun heeft gekregen van de 28e gezamenlijke vergadering van het Comité chemische stoffen en de Werkgroep chemische stoffen in no ­
vember 1998 (2).
 
Hoewel deze teststrategie geen integrerend onderdeel van testmethode B.5 is, 
vormt zij de aanbevolen aanpak voor de bepaling van de eigenschappen qua oogirritatie/corrosie. Deze aanpak houdt zowel een optimale gedragscode als 
een ethische referentie voor in-vivotests op oogirritatie/corrosie in. De test ­
methode bevat een leidraad voor de uitvoering van de in-vivotest en geeft een overzicht van de factoren die vóór het overwegen van een dergelijke test in aanmerking moeten worden genomen. De sequentiële teststrategie levert een 
bewijskrachtbenadering voor de evaluatie van bestaande gegevens over de eigen ­
schappen van stoffen inzake oogirritatie/corrosie en een trapsgewijze aanpak voor het vergaren van relevante gegevens over stoffen waarvoor nader onderzoek nodig is of waarvoor nog geen onderzoek is uitgevoerd. De strategie houdt in 
dat onder bepaalde omstandigheden eerst gevalideerde en erkende in-vitro of ex- 
vivotests en vervolgens testmethode B.4 op huidirritatie/corrosie worden uitge ­
voerd (3)(4).
 
BESCHRIJVING VAN DE STAPSGEWIJZE TESTSTRATEGIE  
Alvorens te beginnen met tests als onderdeel van de sequentiële teststrategie (zie 
figuur), moet alle beschikbare informatie worden geëvalueerd om te bepalen of 
in-vivo-oogonderzoek nodig is. Hoewel de evaluatie van individuele parameters 
(bijvoorbeeld een extreme pH) significante informatie kan opleveren, moet alle bestaande informatie worden geëvalueerd. Alle relevante gegevens over de ef ­
fecten van de betrokken stof en de qua structuur analoge verbindingen moeten bij 
het nemen van een beslissing over de bewijskracht worden geëvalueerd en er 
moet een motivering voor de beslissing worden gegeven. De nadruk moet in eerste instantie liggen op bestaande gegevens over de effecten van de stof bij mens en dier en vervolgens op de resultaten van in-vitro- of ex-vivotests. Waar 
mogelijk moet in-vivo-onderzoek aan corrosieve stoffen worden vermeden. Bij 
de teststrategie spelen de volgende factoren een rol:
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Evaluatie van bestaande gegevens over de effecten bij mens en dier (stap 1).  In 
de eerste plaats moet worden gekeken naar bestaande gegevens over de effecten 
bij de mens, zoals klinisch en bedrijfsgeneeskundig onderzoek en ziektegevallen, en/of gegevens van oogonderzoek bij proefdieren, omdat deze informatie opleve ­
ren die rechtstreeks verband houdt met oogeffecten. Vervolgens moeten de be ­
schikbare gegevens van onderzoek bij mens en/of dier naar huidcorrosie/irritatie 
worden geëvalueerd. Stoffen waarvan bekend is dat ze corrosief of hevig irrite ­
rend voor het oog zijn, mogen niet in de ogen van dieren worden gedruppeld en dit geldt ook voor stoffen met corrosieve of irriterende effecten op de huid; deze 
stoffen moeten ook als corrosief en/of irriterend voor het oog worden beschouwd. 
Ook stoffen waarvoor bij eerder uitgevoerd oogonderzoek afdoende is aange ­
toond dat ze niet corrosief en niet irriterend zijn, dienen niet meer bij in-vivo- oogonderzoek te worden getest.
 
Analyse van structuuractiviteitrelaties (SAR) (stap 2).  Er moet worden gekeken 
naar de resultaten van tests met qua structuur verwante chemische stoffen, indien deze beschikbaar zijn. Wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn over de 
effecten van qua structuur verwante stoffen of mengsels van dergelijke stoffen bij 
mens en/of dier om te kunnen concluderen dat deze oogcorrosie/irritatie kunnen veroorzaken, mag worden aangenomen dat de teststof tot dezelfde reacties zal leiden. In dat geval behoeft de stof wellicht niet te worden getest. Negatieve 
gegevens van onderzoek met qua structuur verwante stoffen of mengsels van 
dergelijke stoffen vormen in het kader van de sequentiële teststrategie niet een afdoende bewijs dat de stof geen corrosie of irritatie veroorzaakt. Voor de be ­
paling van de potentie voor zowel huidcorrosie en -irritatie als oogcorrosie en 
-irritatie moeten gevalideerde en erkende SAR-methoden worden gebruikt.
 
Fysisch-chemische eigenschappen en chemische reactiviteit (stap 3).  Stoffen met 
een extreme pH van bijvoorbeeld ≤ 2,0 of ≥ 11,5 kunnen hevige lokale effecten 
hebben. Als een stof op basis van een extreme pH als corrosief of irriterend voor 
het oog wordt aangeduid, kan ook rekening worden gehouden met zijn zuur/ ­
alkalireserve (buffercapaciteit) (5)(6). Als de buffercapaciteit erop wijst dat een stof wellicht niet corrosief voor het oog is, moeten er nadere tests worden 
uitgevoerd om dit te bevestigen, waarbij bij voorkeur een gevalideerde en er ­
kende in-vitro- of ex-vivotest moet worden gebruikt (zie het gedeelte over de stappen 5 en 6).
 
Overweging van andere bestaande informatie (stap 4).  In deze fase moet alle 
beschikbare informatie over systemische toxiciteit via de huid worden geëvalu ­
eerd. Ook de acute huidtoxiciteit van de teststof moet in de overwegingen wor ­
den betrokken. Als er is aangetoond dat de teststof via de huid zeer toxisch is, 
behoeft deze wellicht niet in het oog te worden getest. Hoewel er niet nood ­
zakelijkerwijs een verband is tussen acute huidtoxiciteit en oogirritatie/corrosie, kan worden aangenomen dat een stof die via de huid zeer toxisch is, ook bij indruppelen in het oog hoge toxiciteit zal vertonen. Deze gegevens kunnen ook 
tussen de stappen 2 en 3 worden bezien.
 
Resultaten van in-vitro- of ex-vivotests (stappen 5 en 6).  Stoffen waarvan met een 
in-vitro- of ex-vivotest (7)(8), die specifiek voor de beoordeling van oog- of 
huidcorrosie/irritatie is gevalideerd en erkend, is aangetoond dat ze corrosieve 
of hevig irriterende eigenschappen hebben, behoeven niet bij dieren te worden getest. Er kan worden aangenomen dat dergelijke stoffen in vivo vergelijkbare hevige effecten veroorzaken. Als er geen gevalideerde en erkende in-vitro/ex- 
vivotests beschikbaar zijn, worden de stappen 5 en 6 overgeslagen en wordt 
direct doorgegaan naar stap 7.
 
Evaluatie van in-vivohuidirritatie of -corrosie door de stof (stap 7).  Wanneer er 
onvoldoende bewijsmateriaal bestaat voor de uitvoering van een doorslaggevende 
bewijskrachtanalyse van de mogelijke oogirritatie/corrosie door een stof op basis van gegevens uit bovengenoemde onderzoeken, moet eerst de mogelijke in- vivohuidirritatie/corrosie worden geëvalueerd met behulp van testmethode B.4 
(4) en de bijbehorende bijlage (9). Als blijkt dat de stof huidcorrosie of hevige 
huidirritatie veroorzaakt, moet deze worden beschouwd als een stof die oogcor ­
rosie veroorzaakt, tenzij er andere informatie is die tot een andere conclusie leidt. Dit betekent dat er dan geen in-vivotest op oogirritatie behoeft te worden uitge ­
voerd. Als de stof voor de huid niet corrosief of hevig irriterend is, moet er een 
in-vivotest op oogirritatie worden uitgevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In-vivotest bij konijnen (slappen 8 en 9).  Een in-vivo-oogonderzoek dient te 
beginnen met een voorlopige test met één dier. Als de resultaten van deze test 
erop wijzen dat de stof hevig irriterend of corrosief voor de ogen is, dienen er geen verdere tests te worden uitgevoerd. Als er bij deze test geen corrosief of hevig irriterend effect wordt waargenomen, wordt er een bevestigende test met 
nog eens twee dieren uitgevoerd.
 
REFERENTIES  
(1) OECD (1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Cri ­
teria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Swe ­
den, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm).  
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.  
(4) Testmethode B.4: Acute toxiciteit: huidirritatie/corrosie.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988). Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential 
of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 
12, 227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., 
Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corro ­
sivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology 
in Vitro 12, pp.483-524.
 
(8) Testmethode B.40: Huidcorrosie.  
(9) Bijlage van testmethode B.4: Een sequentiële teststrategie voor huidirritatie 
en -corrosie.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Figuur  
TEST- EN EVALUATIESTRATEGIE VOOR OOGIRRITATIE/CORROSIE
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. SENSIBILISATIE VAN DE HUID  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Opmerkingen:  
De gevoeligheid en het vermogen van een test om stoffen op te 
sporen met potentieel huidsensibiliserende eigenschappen bij de mens zijn belangrijk in een systeem voor de classificatie van toxi ­
sche stoffen ten behoeve van de volksgezondheid.
 
Er bestaat géén universele testmethode waarmee alle stoffen die de 
menselijke huid kunnen sensibiliseren, adequaat kunnen worden ge ­
ïdentificeerd en die voor alle stoffen toepasbaar is.  
Bij de keuze van een test moet rekening worden gehouden met 
factoren zoals de fysische kenmerken van een stof, met inbegrip van het vermogen om de huid binnen te dringen.
 
Er zijn twee soorten tests ontwikkeld die gebruik maken van cavia's: 
het type waarbij een adjuvans wordt gebruikt en waarbij een ver ­
hoogde allergische reactie wordt opgewekt door het oplossen of suspenderen van de teststof in Freunds compleet adjuvans (FCA), en tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt.
 
Proeven met adjuvans voorspellen een eventueel huidsensibiliserend 
effect van een stof bij mensen wellicht nauwkeuriger dan methoden die geen gebruik maken van Freunds compleet adjuvans; zij ver ­
dienen dan ook de voorkeur.
 
De maximalisatietest met cavia's is een algemeen toegepaste test 
waarbij een adjuvans gebruikt wordt. Alhoewel verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om het huidsensibiliserend ver ­
mogen van een stof aan te tonen, wordt de maximalisatietest be ­
schouwd als de adjuvanstechniek die de voorkeur heeft.
 
Voor veel soorten chemicaliën worden tests waarbij geen adjuvans 
wordt gebruikt (de Buehlertest heeft de voorkeur) als minder gevoe ­
lig beschouwd.  
In bepaalde gevallen kunnen er goede redenen zijn om de Buehler ­
test te verkiezen, met lokale applicatie in plaats van intradermale 
injectie zoals in de maximalisatietest met cavia's. Voor het gebruik 
van de Buehlertest dient een wetenschappelijke motivering te worden gegeven.
 
De maximalisatietest met cavia's en de Buehlertest worden hier be ­
schreven. Andere methoden mogen worden gebruikt op voorwaarde 
dat zij goed zijn gevalideerd en wetenschappelijk verantwoord zijn.  
Indien een erkende screeningtest werd uitgevoerd en daarbij een 
positief resultaat werd geconstateerd, mag de teststof als een poten ­
tieel sensibiliserende stof worden aangemerkt en is het niet nodig 
ook nog een test met cavia's uit te voeren. Indien een dergelijke test evenwel tot een negatief resultaat heeft geleid, moet een caviatest worden uitgevoerd overeenkomstig de onder deze testmethode be ­
schreven procedure.
 
Zie ook algemene inleiding deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINITIES  
Huidsensibilisatie (allergische contactdermatitis): is een door een 
immuunrespons veroorzaakte huidreactie op een stof. Bij mensen kan de reactie de vorm aannemen van jeuk, erytheem, oedeem (wa ­
terzucht), pukkels, blaasjes, blaren of een combinatie hiervan. Bij 
andere soorten kunnen de reacties anders zijn en kan alleen erytheem of oedeem optreden.
 
Inductieblootstelling: een experimentele blootstelling van een proef ­
dier aan een teststof met de bedoeling een hypersensitieve toestand te 
induceren.  
Inductieperiode: een periode van ten minste een week na de inductie ­
blootstelling, gedurende welke een hypersensitieve toestand ontwik ­
keld kan worden.  
Provocatieblootstelling een experimentele blootstelling — na de in ­
ductieperiode — van een voorheen reeds blootgesteld proefdier aan een teststof, om vast te stellen of het dier een hypersensitieve reactie 
vertoont.
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
De gevoeligheid en de betrouwbaarheid van de gebruikte technieken 
moet iedere zes maanden worden vastgesteld door het gebruik van 
stoffen waarvan bekend is dat ze lichte tot matige huidsensibilise ­
rende eigenschappen hebben.  
Bij een goed uitgevoerde test kan een reactie van ten minste 30 % 
worden verwacht bij een adjuvanstest en van ten minste 15 % bij een 
niet-adjuvanstest, bij gebruikmaking van zwakke/middelsterke sensi ­
bilisatoren.  
De volgende stoffen genieten de voorkeur:  
CAS-nummer EINECS-nummer EINECS-naam Triviale naam  
101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyde α-hexylcinnamaldehyde 
149-30-4 205-736-8 benzothiazol-2-thiol (mercapto- 
benzothiazol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzocaïne norcaïne  
Er kunnen omstandigheden zijn waarbij andere referentiestoffen, die 
aan bovenstaande eisen voldoen, kunnen worden gebruikt; dit moet 
wetenschappelijk verantwoord worden.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De proefdieren worden eerst aan de teststof blootgesteld door een 
intradermale injectie en/of epidermale toepassing (inductieblootstel ­
ling). Na een rustperiode van 10 tot 14 dagen (inductieperiode), tijdens welke een immuunreactie op gang kan komen, worden de dieren blootgesteld aan een provocatiedosis. De omvang en intensi ­
teit van de cutane reactie op de provocatieblootstelling bij de proef ­
dieren wordt vergeleken met die van de controlegroep die een blanco behandeling ondergaat bij de industrie maar wél de provocatiedosis toegediend krijgt.
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODEN  
Als het nodig wordt geacht om de teststof te verwijderen, moet dit 
gebeuren met behulp van water of een ander geschikt oplosmiddel 
zonder dat de optredende reactie daardoor wordt beïnvloed of de 
opperhuid daardoor wordt geschonden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Maximalisatietest met cavia's (GPMT)  
1.5.1.1. V o o r b e r e i d i n g  
Gezonde jonge volwassen albinocavia's worden ten minste 5 dagen 
voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumoms ­
tandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze ver ­
deeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar ge ­
beurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te 
worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden 
gewogen vóór het begin en aan het einde van de test.
 
1.5.1.2. P r o e f o m s t a n d i g h e d e n  
1.5.1.2.1. Proefdieren  
Er wordt gebruik gemaakt van stammen albinocavia's die gewoonlijk 
in laboratoria worden gebruikt.  
1.5.1.2.2. Aantal en geslacht  
Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke 
dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet 
zwanger zijn.  
Minimaal 10 dieren worden gebruikt voor de behandelde groep en 
ten minste vijf voor de controlegroep. Als er minder dan 20 test ­
cavia's en 10 controlecavia's worden gebruikt en het niet mogelijk is om vast te stellen of de teststof sensibiliserende eigenschappen heeft, 
wordt ten sterkste aangeraden om meer dieren te testen zodat een 
totaal van ten minste 20 testdieren en 10 controledieren wordt be ­
reikt.
 
1.5.1.2.3. Dosisniveaus  
De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt ge ­
bruikt moet systemisch goed te verdragen zijn en gelijk zijn aan de 
hoogste concentratie die lichte tot matige huidirritatie veroorzaakt. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kun ­
nen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een 
verkennende studie bij twee of drie proefdieren. Hierbij kan worden overwogen gebruik te maken van met FCA behandelde proefdieren.
 
1.5.1.3. P r o c e d u r e  
1.5.1.3.1. Inductie  
Dag 0 — Testgroep  
In de onthaarde schouderstreek worden drie paar injecties van 0,1 ml 
gegeven, zó dat van ieder paar er één aan elke zijde ligt:  
Injectie 1: een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water 
of fysiologische zoutoplossing;  
Injectie 2: de teststof in een geschikt vehiculum en in de geschikte 
concentratie;  
Injectie 3: de teststof in de gekozen concentratie, opgelost in een l:l- 
mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische 
zoutoplossing.  
Voor injectie 3 worden de in water oplosbare teststoffen in water 
opgelost vóór het mengen met FCA. In vet oplosbare of onoplosbare stoffen worden in FCA gesuspendeerd vóór het mengen met water. 
De uiteindelijke concentratie van de teststof moet gelijk zijn aan die 
welke voor injectie 2 wordt gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
De injecties 1 en 2 worden dicht bij elkaar en het dichtst bij het 
hoofd toegediend en injectie 3 aan de staartzijde van het testgebied.  
Dag 0 — Controlegroep  
Op dezelfde plaatsen als bij de proefdieren worden drie paar intra ­
dermale injecties van 0,1 ml toegediend:  
Injectie 1: een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water 
of fysiologische zoutoplossing;  
Injectie 2: het onverdunde vehiculum;  
Injectie 3: een 50 %-formulering (gewicht/volume) van het vehicu ­
lum in een 1:1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing.
 
Dag 5-7 — Testgroep en controlegroep  
Als de te onderzoeken stof geen huidirritatie geeft wordt het test ­
gebied ongeveer 24 uur vóór de plaatselijke inductiebehandeling na knippen en/of scheren behandeld met 0,5 ml van een 10 %-formu ­
lering van natriumlaurylsulfaat in vaseline om een plaatselijke irrita ­
tie op te wekken.
 
Dag 6-8 — Testgroep  
Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Een filtreerpapier (2 cm × 
4 cm) wordt gedrenkt met de teststof in een geschikt vehiculum en door middel van een occlusief verband gedurende 48 uur op het 
testgebied aangebracht. De keuze van het vehiculum moet worden 
verantwoord. Vaste stoffen worden verpulverd en in een geschikt vehiculum opgenomen. Vloeistoffen kunnen, zo nodig, onverdund worden aangebracht.
 
Dag 6-8 — Controlegroep  
Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Op dezelfde wijze als bij de 
testgroep wordt alleen het vehiculum aangebracht en gedurende 48 uur met het testgebied in contact gehouden door een occlusief verband.
 
1.5.1.3.2. Provocatie  
Dag 20-22 — Testgroep en controlegroep  
Beide flanken van de dieren uit de testgroep en de controlegroep 
worden onthaard. Op één flank van de behandelde dieren wordt een gaasje of cupje met de teststof aangebracht en, waar nodig, een 
gaasje of cupje met alleen het vehiculum op de andere flank. Door 
middel van een occlusief verband wordt het gaasje gedurende 24 uur met de huid in contact gehouden.
 
1.5.1.3.3. Observatie en scoring; testgroep en controlegroep  
— Ongeveer 21 uur nadat het gaasje is verwijderd, wordt het pro ­
vocatiegebied gereinigd en zo nodig zorgvuldig geknipt en/of geschoren en onthaard.
 
— Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 48 uur na het begin van de 
provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en ge ­
registreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores.  
— Ongeveer 24 uur na deze waarneming wordt een tweede waarneming 
gedaan (72 uur na aanvang provocatie) en eveneens geregistreerd.  
Aangeraden wordt om de proefdieren en controledieren „blind” 
(d.w.z. zonder te weten of het test- of controledieren betreft) te 
scoren.  
Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van 
de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) worden overwogen met, zo nodig, een nieuwe 
controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronke ­
lijke controlegroep.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder 
ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en 
provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de scoreschaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting 
van de dikte van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaar ­
heid te verschaffen omtrent onduidelijke reacties.
 
1.5.2.  Buehlertest  
1.5.2.1. V o o r b e r e i d i n g  
Gezonde jonge volwassen albinocavia's worden ten minste 5 dagen 
voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumoms ­
tandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze ver ­
deeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar ge ­
beurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden 
gewogen vóór het begin en aan het eind van de test.
 
1.5.2.2. P r o e f o m s t a n d i g h e d e n  
1.5.2.2.1. Proefdieren  
Er wordt gebruik gemaakt van stammen albinocavia's die gewoonlijk 
in laboratoria worden gebruikt.  
1.5.2.2.2. Aantal en geslacht  
Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke 
dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn.
 
Voor de behandelde groep worden minimaal 20 dieren gebruikt en 
voor de controlegroep ten minste 10.  
1.5.2.2.3. Dosisniveaus  
De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt ge ­
bruikt moet de hoogste zijn die lichte maar geen excessieve huidir ­
ritatie geeft. De concentratie die voor de provocatieblootstelling 
wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien 
noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren.
 
Als de teststoffen in water oplosbaar zijn verdient water of een ver ­
dunde, niet-irriterende oplossing van een surfactans de voorkeur als 
vehiculum. Bij andere teststoffen wordt de voorkeur gegeven aan 80 % alcohol/water bij de inductie en aan aceton bij de provocatie.
 
1.5.2.3. P r o c e d u r e  
5.5.2.3.1. Inductie  
Dag 0 — Testgroep  
Eén flank wordt onthaard. Het testgaasje moet doordrenkt zijn met 
de teststof in een geschikt vehiculum (de keuze van het vehiculum moet worden verantwoord; vloeibare teststoffen kunnen eventueel onverdund worden aangebracht).
 
Het testgaasje wordt op het testgebied aangebracht en daarmee ge ­
durende 6 uur in contact gehouden door een occlusieve pleister of 
een cupje en een geschikt verband.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Het testgaasje moet afdekkend zijn. Er kan gebruik worden gemaakt 
van een rond of vierkant wattenschijfje met een oppervlakte van 
ongeveer 4-6 cm  2 . Om een goede afdekking te garanderen kan een 
passende voorziening worden gebruikt waardoor de bewegingsvrij ­
heid van de dieren wordt beperkt. Bij gebruik van een zwachtel 
alléén kan herhaalde blootstelling nodig zijn.  
Dag 0 — Controlegroep  
Een flank wordt onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep 
wordt nu alleen het vehiculum aangebracht. Het testgaasje wordt 
op het testgebied aangebracht en daarmee gedurende 6 uur in contact 
gehouden door een occlusieve pleister of een cupje en een geschikt verband. Als kan worden aangetoond dat een blanco controlegroep niet nodig is, kunnen niet-behandelde dieren als controlegroep wor ­
den gebruikt.
 
Dag 6-8 en 13-15 — Testgroep en controlegroep  
Hetzelfde testoppervlak van dezelfde flank ondergaat, na eventuele 
verwijdering van de beharing, op dag 6-8 en nogmaals op dag 13-15 
dezelfde blootstelling als op dag 0.  
1.5.2.3.2. Provocatie  
Dag 27-29 — Testgroep en controlegroep  
De onbehandelde flank van de test- en controledieren wordt ont ­
haard. Een occlusieve pleister of een cupje met de juiste hoeveelheid teststof in de maximale niet-irriterende concentratie, wordt aange ­
bracht op het achterste deel van de flank van de testdieren en van 
de controledieren.
 
Indien dit wenselijk is wordt op het voorste gedeelte van de onbe ­
handelde flank van zowel de testdieren als de controledieren een 
occlusieve pleister of een cupje met alleen het vehiculum aange ­
bracht. De pleisters of cupjes worden gedurende 6 uur op hun plaats gehouden door een geschikt verband.
 
1.5.2.3.3. Observatie en scoring  
— Ongeveer 21 uur nadat de pleister is verwijderd wordt het pro ­
vocatiegebied onthaard.  
— Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 30 uur na het begin van de 
provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en ge ­
registreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores.  
— Ongeveer 24 uur na de 30-uurswaarneming wordt een tweede 
waarneming van de huidreacties gedaan (ongeveer 54 uur na 
aanvang van de provocatie) en worden de resultaten weer ge ­
registreerd.  
Aangeraden wordt om de testdieren en controledieren „blind” (d.w.z. 
zonder te weten of het test-of controledieren betreft) te scoren.  
Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten 
van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) overwogen worden met, zo 
nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvin ­
den bij de oorspronkelijke controlegroep.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder 
ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en 
provocatieprocedures moeten worden geobserveerd en geregistreerd volgens de schaal van Magnusson/Kligman (zie aanhangsel). Andere technieken zoals histopathologisch onderzoek of meting van de dikte 
van de huidplooi kunnen worden toegepast om klaarheid te verschaf ­
fen omtrent onduidelijke reacties.
 
2. GEGEVENS (GPMT EN BUEHLERTEST)  
Alle gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat, waarbij 
voor ieder dier de bij iedere controle waargenomen huidreacties worden vermeld.
 
3. RAPPORTAGE (GPMT EN BUEHLERTEST)  
Wanneer vóór de proef met cavia's een screeningstest wordt uitge ­
voerd, moet een beschrijving van of verwijzing naar de test in kwes ­
tie (bijvoorbeeld de Local Lymph Node Assay (LI.NA) of de Mouse Ear Swelling Test (MEST)) worden gegeven en moeten bijzonder ­
heden over de procedure worden verstrekt. Verder moeten de resul ­
taten worden gerapporteerd die met de teststof en de referentiestof zijn verkregen.
 
Verslag van de proefnemingen (GPMT en Buehlertest)  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
Proefdieren:  
— gebruikte caviastam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— herkomst, behuizing, dieet, enz.;  
— gewicht van ieder dier bij het begin van de proefneming.  
Proefomstandigheden:  
— gebruikte techniek bij het prepareren van het te behandelen op ­
pervlak;  
— bijzonderheden met betrekking tot het pleister- of gaasmateriaal 
en de wijze van aanbrengen;  
— resultaten van de voorstudie met conclusies over de inductie- en 
provocatieconcentraties die bij de test moeten worden gebruikt;  
— bijzonderheden over de bereiding van de teststof, het toedienen 
en het verwijderen hiervan;  
— motivering van de keuze van het vehiculum;  
— concentraties van vehiculum en teststof die gebruikt zijn bij de 
inductie en de provocatie en de totale hoeveelheid teststof die 
gebruikt is voor inductie en provocatie.  
Resultaten:  
— een samenvatting van de resultaten van de meest recente gevoe ­
ligheids- en betrouwbaarheidscontrole (zie 1.3), met inbegrip van 
informatie over gebruikte teststof, concentratie en vehiculum;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— resultaten voor ieder dier afzonderlijk, inclusief scores;  
— beschrijving van de aard en de intensiteit van de waargenomen 
effecten;  
— eventuele histopathologische bevindingen.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. LITERATUUR  
Deze methode komt overeen met TG 406 van de OESO  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Aanhangsel  
TABEL  
Magnusson/Kligman-scoreschaal voor de evaluatie van reacties op de 
provocatiepleister  
0 = geen zichtbare verandering  
1 = discontinu of vlekkerig erytheem  
2 = matig en aaneengesloten erytheem  
3 = ernstig erytheem met zwelling  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. TOXICITEITSONDERZOEK (ORAAL) OP KNAAGDIEREN BIJ 
HERHAALDE TOEDIENING (28 DAGEN)  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 407 (2008) van de OESO 
(TG 407). De oorspronkelijke testrichtlijn TG 407 werd in 1981 vastgesteld. 
In 1995 werd een herziene versie vastgesteld, met als doel aanvullende 
informatie te verkrijgen met behulp van de in het onderzoek gebruikte dieren, met name over neurotoxiciteit en immunotoxiciteit.
 
2. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien 
en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (8), en heeft zij daaraan een hoge prioriteit 
toegekend. Een onderdeel van deze actie was het bijwerken van de be ­
staande OESO-richtlijn voor „toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen)” (TG 407) door er geschikte parameters in op te nemen om de endocriene werking van teststoffen vast te kunnen 
stellen. Deze procedure ging gepaard met een uitgebreid internationaal pro ­
gramma voor het testen van de relevantie en praktische uitvoerbaarheid van de aanvullende parameters, de mate waarin met deze parameters de (an ­
ti)oestrogene, (anti)androgene, en (anti)thyreoïde werking van stoffen kan 
worden vastgesteld, de intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en de 
interferentie tussen de nieuwe parameters en die welke in de vroegere TG 407 waren voorgeschreven. De vele gegevens die daarbij zijn verkregen, zijn bijeengebracht en in detail geëvalueerd in een uitgebreid OESO-verslag 
(9). Deze bijgewerkte testmethode B.7 (gelijkwaardig met TG 407) is het 
resultaat van de ervaringen en resultaten van het internationale testprogram ­
ma. Met deze testmethode kunnen bepaalde met het endocrien systeem samenhangende effecten in de context van andere toxicologische effecten 
worden geplaatst.
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN  
3. Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een che ­
mische stof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests eerst informatie over 
de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de orale toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Deze testmethode heeft tot doel de effecten van toxiciteit op een zeer grote verscheidenheid aan potentiële 
doelwitten te onderzoeken. Zij levert informatie op over de mogelijke ge ­
varen voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstel ­
ling gedurende een relatief beperkte periode, met inbegrip van effecten op het zenuwstelsel, het immuunsysteem en het endocrien systeem. Met betrek ­
king tot deze specifieke eindpunten moet zij de identificatie mogelijk maken 
van potentieel neurotoxische stoffen, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzochtt, en stoffen die de fysiologie van de schildklier versto ­
ren. Ook kan zij gegevens opleveren over stoffen die van invloed zijn op de 
mannelijke en/of vrouwelijke voortplantingsorganen van jonge volwassen 
dieren en een indicatie geven van de immunologische effecten.
 
4. De resultaten van deze testmethode B.7 moeten worden gebruikt voor de 
identificatie van de gevaren en het beoordelen van risico’s. De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel 
kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende 
stoffen (11). De methode omvat het basale toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening dat kan worden gebruikt voor stoffen waarvoor een onderzoek van 90 dagen niet gerechtvaardigd is (bv. als het productievolume binnen 
bepaalde grenzen blijft), of ter voorbereiding op een langetermijnsonder ­
zoek. De blootstellingstijd bedraagt 28 dagen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Het internationale programma voor de validering van geschikte parameters 
om de mogelijke endocriene werking van een teststof vast te stellen, heeft 
aangetoond dat de kwaliteit van de met behulp van deze testmethode B.7 verkregen gegevens sterk zal afhangen van de ervaring waarover het test ­
laboratorium beschikt. Het gaat daarbij met name om de histopathologische 
bepaling van cyclische veranderingen in de vrouwelijke voortplantingsorga ­
nen en de bepaling van het gewicht van de kleine hormoonafhankelijke organen die moeilijk te ontleden zijn. Er zijn richtsnoeren ontwikkeld voor histopathologisch onderzoek (19). Deze zijn beschikbaar op de open ­
bare website van de OESO over de testrichtsnoeren. Zij zijn bedoeld om de 
pathologen te helpen bij hun onderzoek en om de gevoeligheid van de bepalingen te helpen vergroten. Van diverse parameters werd vastgesteld dat zij als indicator kunnen dienen van met het endocrien systeem samen ­
hangende toxiciteit; deze zijn in de testmethode opgenomen. Parameters 
waarvoor onvoldoende gegevens beschikbaar waren om het nut ervan te kunnen vaststellen of waarvan tijdens het valideringsprogramma slechts in geringe mate kon worden aangetoond dat zij zouden kunnen helpen bij de 
opsporing van hormoonontregelaars, worden voorgesteld als facultatieve 
eindpunten (zie aanhangsel 2).
 
6. Op grond van de tijdens het valideringsproces verkregen gegevens moet 
worden benadrukt dat deze bepaling onvoldoende gevoelig is om alle stof ­
fen met (anti)androgene of (anti)oestrogene werking te kunnen identificeren (9). De testmethode wordt niet uitgevoerd in het levensstadium dat het 
gevoeligst is voor hormoonontregeling. Met de testmethode zijn tijdens 
het valideringsproces desondanks stoffen geïdentificeerd die de schildklier ­
functie in sterke of lichte mate beïnvloeden, alsmede sterk of matig endo ­
crien werkzame stoffen die via de oestrogeen- of androgeenreceptoren wer ­
ken, maar in de meeste gevallen konden endocrien werkzame stoffen die de 
oestrogeen- of androgeenreceptoren in lichte mate beïnvloeden niet worden geïdentificeerd. Daarom kan de methode niet als screeningtest voor endo ­
criene activiteit worden omschreven.
 
7. Het ontbreken van effecten die verband houden met deze werkingswijzen 
kan derhalve niet als bewijs worden beschouwd voor het ontbreken van 
effecten op het endocrien systeem. Wat de met het endocrien systeem sa ­
menhangende effecten betreft, moet de karakterisering van stoffen derhalve niet worden gebaseerd op de resultaten van deze testmethode alleen, maar 
moeten deze resultaten gebruikt worden in een benadering met meervoudige 
bewijsvoering („weight of evidence”-benadering), waarin alle bestaande ge ­
gevens over een stof worden benut om de mogelijke endocriene werking ervan te karakteriseren. Voor de besluitvorming over regelgeving inzake 
endocriene werking (karakterisering van stoffen) moet daarom een brede 
benadering worden gevolgd, die niet slechts leunt op de resultaten van de toepassing van deze testmethode.
 
8. Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de 
plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen; bij de beschrijvingen van de verzorging en behandeling hieronder gaat het om 
minimale prestatienormen, die door de lokale regelgeving worden vervangen 
indien deze strikter is. De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (14).
 
9. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
10. De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks oraal toe ­
gediend aan verscheidene groepen proefdieren, in geleidelijk stijgende do ­
ses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek 
sterven of worden geëuthanaseerd, wordt obductie verricht. Dieren die aan 
het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden geëuthanaseerd en ook
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
hierop wordt obductie verricht. Een onderzoek van 28 dagen levert infor ­
matie op over de effecten van herhaalde orale blootstelling en kan erop 
wijzen dat verdere langetermijnonderzoeken nodig zijn. Ook kan het infor ­
matie opleveren over de te kiezen concentraties voor langetermijnonderzoek. Met de met behulp van deze testmethode verkregen gegevens kan de toxi ­
citeit van de teststof worden gekarakteriseerd, een indicatie van de 
dosis-responsverhouding worden gegeven en het niveau waarbij geen scha ­
delijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) worden bepaald.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
11. De voorkeur wordt gegeven aan ratten, hoewel andere knaagdiersoorten 
kunnen worden gebruikt. Indien de in deze testmethode B.7 gespecificeerde 
parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uit ­
voerig worden gemotiveerd. Hoewel het vanuit biologisch oogpunt aan ­
nemelijk is dat andere soorten op vergelijkbare wijze op toxische stoffen 
reageren als de rat, kan het gebruik van kleinere soorten leiden tot een 
hogere variabiliteit als gevolg van technische moeilijkheden bij het ontleden van kleinere organen. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars zijn alleen ratten gebruikt. Er worden 
gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen ge ­
bruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. De toediening moet zo snel mogelijk na het spenen beginnen maar in ieder geval voordat de dieren negen weken oud zijn. 
Per geslacht mag bij het begin van het onderzoek het gewicht van de dieren 
die worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Als een herhaalde orale toediening wordt uitgevoerd als inleiding op een studie van langere duur, moeten de dieren in beide studies bij voor ­
keur tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben.
 
Huisvesting en voeding  
12. Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen 
voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % 
en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) 
dient te zijn, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt 
met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan 
worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; 
dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk ge ­
rechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden onder ­
gebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest.
 
13. Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een 
monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afge ­
rond.  
Voorbereiding van de dieren  
14. Gezonde jonge volwassen dieren worden willekeurig ingedeeld in de behan ­
delde en controlegroepen. De kooien worden zodanig opgesteld dat moge ­
lijke effecten door de plaatsing van de kooien tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven voordat de 
behandeling begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium 
te acclimatiseren.
 
Voorbereiding van de doses  
15. De teststof kan via een maagsonde, met de voeding of met het drinkwater 
worden toegediend. De wijze van de orale toediening hangt af van het doel 
van het onderzoek en van de fysische/chemische/toxicokinetische eigen ­
schappen van de teststof.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Indien nodig wordt de teststof opgelost of gesuspendeerd in een geschikt 
medium. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige 
oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/suspensie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Van niet-waterige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn. De 
stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald.
 
PROCEDURE  
Aantal en geslacht van de dieren  
17. Op ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf mannetjes en vijf 
vrouwtjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te 
euthanaseren, moet het aantal worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden geëuthanaseerd. Er moet worden overwogen een aanvullende satellietgroep van tien dieren 
(vijf per geslacht) op te nemen in de controlegroep en de groep met het 
hoogste dosisniveau, voor observatie van reversibiliteit, persistentie of ver ­
traagd tot uiting komen van toxische effecten gedurende ten minste 14 dagen na de behandeling.
 
Dosering  
18. In het algemeen moeten er ten minste drie testgroepen en één controlegroep 
worden gebruikt, maar als er op grond van de beoordeling van andere 
gegevens bij toediening van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag geen effecten worden verwacht, kan er een limiettest worden uitgevoerd. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek wor ­
den uitgevoerd (bij dieren van dezelfde stam en dezelfde herkomst) om de 
orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de 
toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient 
dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.
 
19. De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande 
gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Daarna moet een 
dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele dose ­
ringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) aan te tonen. Intervallen van een factor twee of vier zijn vaak optimaal om de 
dalende dosisniveaus vast te stellen en het is vaak beter een vierde testgroep 
toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.
 
20. Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, 
hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op immunologische, neurologische of 
endocriene eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd.
 
Limiettest  
21. Als volgens de hier beschreven procedures een test wordt uitgevoerd met 
één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag — of, in het geval van toediening via het voer of het drinkwater, het equivalente percentage in het voer of het drinkwater (berekend overeenkomstig het 
lichaamsgewicht) — en er geen waarneembare toxische effecten optreden, 
en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betref ­
fende chemische stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige test met drie dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing, 
behalve wanneer vanwege de verwachte blootstelling van de mens een hoger 
dosisniveau nodig wordt geacht.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Toediening van de doses  
22. De dieren krijgen gedurende een periode van 28 dagen, zeven dagen per 
week, een dosis van de teststof toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis 
gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intuba ­
tiecanule. Het maximale vloeistofvolume dat in één keer kan worden toe ­
gediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een 
waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht 
worden gebruikt. Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volu ­
meverschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te 
passen, zodat er op alle dosisniveaus hetzelfde volume wordt toegediend.
 
23. Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet 
erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren 
met de normale voedings- of waterbalans. Wanneer de teststof in het voer 
wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; de gekozen methode moet worden gespecificeerd. Wanneer een 
stof met een sonde wordt toegediend, moet de dosis elke dag op een ver ­
gelijkbaar tijdstip worden toegediend en indien nodig worden aangepast om een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier te houden. Wanneer een onderzoek met herhaalde toediening als voorbereiding 
op een langdurig onderzoek wordt gebruikt, moet bij beide onderzoeken een 
vergelijkbare voeding worden gebruikt.
 
Waarnemingen  
24. De dieren moeten 28 dagen worden geobserveerd. Dieren uit een satelliet ­
groep die bestemd is voor vervolgwaarnemingen moeten ten minste 14 dagen zonder behandeling worden geobserveerd om de persistentie van de 
toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van ver ­
traagde toxiciteit te kunnen waarnemen.
 
25. Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag 
plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met in achtneming 
van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De ge ­
zondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziektever ­
schijnselen en sterfte.
 
26. Alle dieren worden eenmaal voor de eerste blootstelling nauwkeurig klinisch 
onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en ver ­
volgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op 
een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op hetzelfde moment van 
de dag worden uitgevoerd. De gegevens moeten zorgvuldig worden opge ­
tekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het test ­
laboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet zo veel mogelijk worden 
gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en dat de 
waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft onder ­
gaan. Tekenen waarop moet worden gelet, zijn onder meer (maar niet al ­
leen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en 
uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan 
van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademha ­
lingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpak ­
ken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, ste ­
reotiep gedrag (bijvoorbeeld overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk 
ronddraaien) of bizar gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (2).
 
27. Gedurende de vierde week van de blootstelling moet de sensorische reacti ­
viteit op stimuli van verschillende aard (2) (bv. auditief, visueel of propri ­
oceptief) (3)(4)(5) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht (6) en de motorische activiteit (7) plaatsvinden. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende 
literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures 
worden toegepast.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Als de studie wordt verricht bij wijze van inleidend onderzoek voor daar ­
opvolgend subchronisch onderzoek van 90 dagen, kunnen functionele ob ­
servaties in de vierde week achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele observaties in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende 
functionele observaties uit het onderzoek met herhaalde toediening, de keuze 
van de dosisniveaus voor het daaropvolgende subchronische onderzoek ten goede kan komen.
 
29. Bij wijze van uitzondering kunnen functionele waarnemingen ook achter ­
wege worden gelaten bij groepen die anders tekenen van toxiciteit vertonen 
in een mate die aanzienlijk zou interfereren met de uitvoering van de func ­
tionele test.  
30. Tijdens de necropsie kan de oestruscyclus van alle vrouwtjes worden vast ­
gesteld (facultatief) door vaginale uitstrijkjes te nemen. Deze observaties leveren informatie op over de fase van de oestruscyclus op het moment 
waarop de dieren zijn gedood, en kunnen van pas komen bij de histologi ­
sche evaluatie van oestrogeengevoelige weefsels (zie de richtsnoeren voor histopathologie (19)).
 
Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water  
31. Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week worden gewogen. Ook het 
voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Indien de test ­
stof met het drinkwater wordt toegediend, moet ook het waterverbruik ten minste wekelijks worden gemeten.
 
Hematologie  
32. Aan het eind van de testperiode moeten de volgende onderzoeken worden 
verricht: bepaling van hematocriet en hemoglobinegehalte, telling van de 
erytrocyten, totale en gedifferentieerde telling van de leukocyten, telling 
van de bloedplaatjes en meting van de stollingstijd en het stollingsver ­
mogen. Indien de teststof of de vermeende metabolieten ervan oxiderende eigenschappen hebben, of hiervan een vermoeden bestaat, moeten andere 
bepalingen worden uitgevoerd, zoals van de methemoglobineconcentratie en 
de Heinz-lichaampjes.
 
33. De bloedmonsters moeten worden genomen net vóór of tijdens het eutha ­
naseren van de dieren; er moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard. Gedu ­
rende de nacht voordat zij geëuthanaseerd worden, mogen dieren geen 
voedsel krijgen (
 1 ). 
Klinische biochemie  
34. Om belangrijke toxische effecten op de weefsels en met name op de nieren 
en de lever te onderzoeken moet klinisch-biochemisch onderzoek worden verricht op bloedmonsters van alle dieren, met uitzondering van de dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn geëuthanaseerd vóór het beëindigen 
van het onderzoek. Deze monsters moeten juist vóór het euthanaseren of als 
onderdeel van de procedure hiervoor worden genomen. Onderzoek van plasma of serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal choleste ­
rol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albumine, ten minste twee enzymen 
die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineamino ­
transferase, aspartaataminotransferase, alkalische fosfatase, gamma-glutamyl ­
transpeptidase en glutamaatdehydrogenase), en galzuren. Bepaling van an ­
dere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en bilirubine kan onder 
bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven.
 
35. Als optie kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek de volgende 
urineonderzoeken worden verricht, waarbij op regelmatige tijdstippen urine ­
monsters moeten worden genomen: uitzien, volume, osmolaliteit of soorte ­
lijk gewicht, pH, eiwit, glucose en bloed/bloedcellen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Voor een aantal metingen in serum en plasma, met name voor glucose, is het aan te 
bevelen de nacht ervoor de dieren voedsel te onthouden. De voornaamste reden is dat de 
toegenomen variabiliteit die onvermijdelijk het gevolg is van niet-vasten, subtiele effec ­
ten maskeert en de interpretatie bemoeilijkt. Aan de andere kant kan het 's nachts 
onthouden van voedsel echter interfereren met het algemene metabolisme van de dieren 
en, met name in voedingsonderzoeken, de dagelijkse blootstelling aan de teststof ver ­
storen. Als men de dieren een nacht laat vasten, moeten de klinisch-biochemische be ­
palingen verricht worden na de functionele observaties in week 4 van de studie.
 36. Bovendien moet worden overwogen plasma- of serummarkers van algemene 
weefselbeschadiging te onderzoeken. Andere onderzoeken die moeten wor ­
den uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, tri ­
glyceriden, specifieke hormonen, en cholesterinase. Deze moeten voor che ­
mische stoffen in bepaalde klassen of per geval geïdentificeerd worden.
 
37. Hoewel bij de internationale evaluatie van de endocriene eindpunten geen 
duidelijke voordelen van de bepaling van schildklierhormonen (T  3 , T 4 ) en 
TSH konden worden aangetoond, kan het nuttig zijn monsters van serum of 
plasma te bewaren voor het meten van T  3 , T 4 en TSH (facultatief) als er 
aanwijzingen zijn voor een effect op de hypofyse-schildklieras. Deze mon ­
sters kunnen worden ingevroren bij – 20 °C voor opslag. De volgende 
factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concen ­
traties van de hormoonbepalingen:  
— tijdstip waarop de dieren worden gedood, vanwege de schommelingen in 
de hormoonconcentraties gedurende de dag;  
— wijze waarop de dieren worden gedood: onnodige stress bij de dieren, 
waardoor de hormoonconcentraties kunnen worden beïnvloed, moet wor ­
den voorkomen;  
— testkits voor hormoonbepalingen, die verschillende standaardkrommen 
kunnen hebben.  
Histopathologisch onderzoek maakt een betrouwbaardere definitieve identi ­
ficatie van stoffen met thyreoïde werking mogelijk dan bepaling van de hormoonniveaus.
 
38. Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten 
telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. Het verdient aanbeveling speciale aandacht te schenken aan bepalingen van T
 3 -, T  4 - en 
TSH-niveaus die het gevolg zijn van histopathologische veranderingen van 
de schildklier. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kun ­
nen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hor ­
moonconcentraties. Als gevolg daarvan kunnen wellicht geen prestatiecrite ­
ria op basis van uniforme historische gegevens worden gegeven. In plaats 
daarvan moeten de laboratoria zich inspannen om de variatiecoëfficiënten voor T
 3 en T  4 lager dan 25, en voor TSH lager dan 35, te houden. Alle 
concentraties worden geregistreerd in ng/ml.  
39. In het geval van ontoereikende basisgegevens uit het verleden moet worden 
overwogen de hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepa ­
len, bij voorkeur bij een groep dieren die niet in de testgroepen zijn opge ­
nomen, of anders voordat met de toediening wordt begonnen.  
PATHOLOGIE  
Macroscopische obductie  
40. Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische obductie 
worden uitgevoerd, waaronder een  zorgvuldig onderzoek van het huidopper ­ 
vlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de  
buikholte, en de inhoud daarvan. Lever, nieren, bijnieren, testes, epididymi ­ 
des, prostaat + zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel,  
thymus, milt, hersenen en hart van alle dieren (afgezien van de dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn geëuthanaseerd vóór het beëindigen van 
het onderzoek) moeten zo nodig ontdaan worden van aanhechtend weefsel, 
en ze moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Het prostaatcomplex moet voorzichtig worden ontdaan van aanhechtend weefsel om te voorkomen dat de met vloeistof 
gevulde zaadblaasjes lek raken. Als alternatief kunnen zaadblaasjes en pros ­
taat na de fixatie worden ontdaan van aanhechtend weefsel en gewogen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Daarnaast kunnen facultatief twee andere weefsels worden gewogen, zo snel 
mogelijk na de sectie om uitdroging te voorkomen: gepaarde ovaria (nat 
gewicht) en uterus, inclusief cervix (richtsnoeren voor het verwijderen en prepareren van baarmoederweefsel voor gewichtsmeting zijn opgenomen in OESO TG 440 (18)).
 
42. Het gewicht van de schildklier (facultatief) kan na de fixatie worden be ­
paald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbescha ­
digingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden.
 
43. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische 
onderzoek (zie punt 47) geschikt is: elk  macroscopisch waarneembaar letsel,  
hersenen (representatieve delen waaronder cerebrum, cerebellum en pons), ruggenmerg, oog, maag,
 dunne en dikke darm (inclusief Peyerse platen),  
lever,  nieren,  bijnieren,  milt,  hart,  thymus,  schildklier,  luchtpijp en  longen 
(conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen),  ge­ 
slachtsklieren (testes en ovaria), secundaire geslachtsorganen (uterus en cer ­
vix, epididymides, prostaat + zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klie ­
ren), vagina, urineblaas, lymfeklieren [naast de meest proximale afvoerende 
lymfeklier moet ook een andere lymfeklier worden uitgenomen, afhankelijk van de ervaringen van het laboratorium (15)),
 perifere zenuwen (nervus 
ischiadicus of nervus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier,  skeletspier 
en bot, met  beenmerg (een coupe, of in plaats daarvan een direct op een 
objectglaasje aangebracht stukje beenmergaspiraat). Aanbevolen wordt de testes te fixeren door middel van onderdompeling in Bouin-oplossing of gemodificeerde Davidson-oplossing (16)(17). De tunica albuginea moet 
voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen 
van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onder ­
zoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van 
de teststof wordt verondersteld dat ze kunnen worden aangetast, moeten 
worden bewaard.
 
44. De volgende weefsels kunnen nuttige aanwijzingen geven voor met het 
endocrien systeem samenhangende effecten: geslachtsklieren (ovaria en tes ­
tes), secundaire geslachtsorganen (uterus inclusief cervix, epididymides, zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren, dorsolaterale en ventrale prostaat), vagina, hypofyse, mannelijke borstklier, schildklier en bijnier. Er 
bestaat onvoldoende documentatie over veranderingen in de mannelijke 
borstklieren, maar deze parameter zou kan erg gevoelig kunnen zijn voor stoffen met oestrogene werking. De observatie van niet in de lijst van punt 43 opgenomen organen/weefsels is facultatief (zie aanhangsel 2).
 
45. In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (19) zijn nadere gege ­
vens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de 
histopathologie van endocriene weefsels.  
46. In het kader van het internationale testprogramma zijn enkele aanwijzingen 
gevonden dat subtiele endocriene effecten van stoffen die de homeostase 
van geslachtshormonen in beperkte mate kunnen beïnvloeden, kunnen wor ­
den herkend aan verstoring van de synchronisatie van de oestruscyclus in verschillende weefsels, en niet zozeer door uitgesproken histopathologische veranderingen in de vrouwelijke geslachtsorganen. Hoewel dergelijke effec ­
ten niet eenduidig konden worden aangetoond, wordt aanbevolen rekening 
te houden met aanwijzingen voor mogelijke asynchronie van de oestrus ­
cyclus bij het interpreteren van de histopathologie van de ovaria (folliculai ­
re, thecale en granulosacellen), uterus, cervix en vagina. Indien de door 
middel van vaginale uitstrijkjes vastgestelde fase van de cyclus wordt be ­
oordeeld, kan deze ook in de vergelijking worden betrokken.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopathologie  
47. Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en bij de 
dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels. Organen en weefsels 
die blijken te zijn beschadigd door de teststof op het hoogste dosisniveau, 
moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht.
 
48. Elk macroscopisch waarneembaar letsel moet worden onderzocht.  
49. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroepen 
moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten 
blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde groepen.  
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
50. Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt. Bovendien moeten alle 
gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten 
zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren 
dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is geëuthanaseerd en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoont, een be ­
schrijving van de waargenomen toxische effecten, met inbegrip van de aan ­
vang, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren met letsel, het type letsel en de ernst ervan, en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt.
 
51. Waar mogelijk moeten getalsmatige resultaten met behulp van een geschikte 
en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. Het gebruik 
van meerdere t-tests moet worden voorkomen door vergelijking van het 
effect over een dosisbereik. De statistische methoden moeten gedurende de opzet van het onderzoek worden gekozen.
 
52. Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te 
verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van 
hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden 
worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëva ­
lueerd.
 
Testverslag  
53. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;  
— identificatiegegevens.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium, indien geen water wordt 
gebruikt.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort/stam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— herkomst, huisvesting, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de test;  
— motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten.  
Testomstandigheden:  
— motivering voor de keuze van de dosisniveaus;  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding 
van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van 
het preparaat;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater 
(in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien 
van toepassing;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water.  
Facultatieve onderzochte eindpunten  
— lijst van facultatieve onderzochte eindpunten.  
Resultaten:  
— lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;  
— waar van toepassing, voedselverbruik en waterverbruik;  
— gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosisniveau, met 
inbegrip van toxiciteitsverschijnselen;  
— aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische waarnemingen;  
— bepalingen van de sensorische activiteit, grijpkracht en motorische ac ­
tiviteit;  
— uitgevoerde hematologische onderzoeken en de relevante referentiewaar ­
den; 
— uitgevoerde klinisch-biochemische onderzoeken en de relevante referen ­
tiewaarden;  
— lichaamsgewicht ten tijde van het euthanaseren en gegevens over het 
gewicht van de organen;  
— obductiebevindingen;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen;  
— indien beschikbaar, absorptiegegevens;  
— statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing.  
Bespreking van de resultaten  
Conclusies  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Androgene werking : het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme 
als een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te werken.  
Antiandrogene werking : het vermogen van een stof om in een zoogdierorga ­
nisme de werking van een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te 
onderdrukken.  
Antioestrogene werking : het vermogen van een stof om in een zoogdierorga ­
nisme de werking van een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17ß-oestradiol) te onderdrukken.
 
Antithyreoïde werking : het vermogen van een stof om in een zoogdierorga ­
nisme de werking van een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T  3 ) te onderdruk ­
ken. 
Dosering : een algemene term die de dosis en de frequentie en de duur van de 
toediening omvat.  
Dosis : de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht 
van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van het proefdier per dag (bv. mg/kg 
lichaamsgewicht/dag), of als constante voedingsconcentratie.  
Manifeste toxiciteit : een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen 
beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een beoordeling van de gevaren mogelijk maken en van een zodanige 
aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige 
toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden.
 
NOAEL : afkorting van „No-Observed Adverse Effect Level”, het niveau waarbij 
geen schadelijk effect werd vastgesteld. Dit is het hoogste dosisniveau waarbij nog geen aan de behandeling gebonden nadelige effecten worden vastgesteld.
 
Oestrogene werking  is het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme 
als een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17ß-oestradiol) te werken.  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  
Thyreoïde werking : het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme als 
een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T  3 ) te werken.  
Validatie : een wetenschappelijke procedure die is ontworpen om de operationele 
vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de betrouwbaar ­
heid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Aanhangsel 2  
Aanbevolen eindpunten voor het opsporen van hormoonontregelaars met 
deze testmethode B.7  
Verplichte eindpunten Facultatieve eindpunten 
Gewicht  
— Testes 
— Epididymides 
— Bijnieren 
— Prostaat + zaadblaasjes met coagu ­
lans uitscheidende klieren — Eierstokken 
— Uterus inclusief cervix 
— Schildklier  
Histopathologie  
— Geslachtsklieren: 
— Testes en — Eierstokken 
— Secundaire geslachtsorganen: 
— Epididymides, — Prostaat + zaadblaasje met coa ­
gulans uitscheidende klieren 
— Uterus inclusief cervix 
— Bijnieren — Schildklier 
— Vagina — Vaginale uitstrijkjes 
— Mannelijke borstklier — Hypofyse
 
Hormoonmeting  
— T  3 -, T  4 -niveau in bloedsomloop 
— TSH-niveau in bloedsomloop  
LITERATUUR:  
(1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity.  
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599-609.  
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 
407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods 
for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
(11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of En ­
docrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.htm l
 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407.  
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
 
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of En ­
docrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. SUBACUTE INHALATIETOXICITEIT: ONDERZOEK VAN 28 
DAGEN  
SAMENVATTING  
Deze herziene testmethode B.8 is ontworpen om de toxiciteit van een teststof via 
de inhalatieweg na herhaalde blootstelling gedurende een beperkte periode (28 
dagen) volledig te karakteriseren, en gegevens op te leveren voor kwantitatieve beoordelingen van de inhalatierisico’s. Groepen van ten minste 5 mannelijke en 5 vrouwelijke knaagdieren worden gedurende 28 dagen 6 uur per dag blootgesteld 
aan a) de teststof bij drie of meer concentraties, b) gefilterde lucht (negatieve 
controle) en/of c) het medium (mediumcontrole). De dieren worden doorgaans vijf dagen per week blootgesteld, maar zeven dagen per week is ook toegestaan. Er worden altijd zowel mannetjes als vrouwtjes getest, maar zij kunnen bij 
verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld indien bekend is dat een 
van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof. Deze methode geeft de onderzoeksleider de flexibiliteit om satellietgroepen (reversibiliteitsgroe ­
pen), bronchoalveolaire lavage, neurologische tests en aanvullende 
klinisch-pathologische en histopathologische beoordelingen in het onderzoek op 
te nemen, om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren.
 
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 412 (2009) van de OE ­
SO. Testrichtlijn 412 (TG 412), de oorspronkelijke testrichtlijn voor sub ­
acute inhalatie, werd in 1981 vastgesteld (1). Deze testmethode B.8 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 412) is bijgewerkt om haar in overeenstemming te brengen met de stand van de wetenschap en om te 
voldoen aan de huidige en toekomstige regelgevingsbehoeften.
 
2. Met deze methode kunnen nadelige effecten na herhaalde dagelijkse bloot ­
stelling aan een teststof door inhalatie gedurende 28 dagen worden geka ­
rakteriseerd. De gegevens uit het onderzoek van 28 dagen naar subacute inhalatietoxiciteit kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve risicobeoor ­
delingen (indien niet gevolgd door een onderzoek van 90 dagen naar sub ­
chronische inhalatietoxiciteit (hoofdstuk B.29 van deze bijlage)). De gege ­
vens kunnen ook informatie opleveren over de te kiezen concentraties voor langetermijnonderzoek, zoals het onderzoek van 90 dagen naar subchro ­
nische inhalatietoxiciteit. Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor 
het testen van nanomaterialen. De in de context van deze testmethode ge ­
bruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in leidraad GD 39 (2).
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
3. Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof in 
overweging nemen voordat het onderzoek wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het gebruik van 
dieren tot een minimum wordt beperkt. Voor de keuze van geschikte test ­
concentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde 
toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling 
van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; en aan tests op acute inhalatietoxiciteit ontleende gegevens. In het geval van verwachte of in de 
loop van het onderzoek waargenomen neurotoxiciteit, kan de onderzoeks ­
leider ervoor kiezen om geschikte evaluaties op te nemen, zoals een „func ­
tional observational battery” (FOB) en meting van de motorische activiteit. Hoewel de timing van de blootstellingen ten opzichte van specifiek onder ­
zoek een kritieke factor kan vormen, mogen deze nieuwe activiteiten niet 
interfereren met de basisopzet van het onderzoek.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Verdunningen van bijtende of irriterende teststoffen kunnen worden getest 
bij concentraties die de gewenste mate van toxiciteit opleveren (zie GD 39 
(2)). Bij blootstelling van dieren aan deze materialen, moeten de doelcon ­
centraties laag genoeg zijn om geen hevige pijn en angst te veroorzaken, maar wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve uit te breiden tot 
niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelgevingsdoelstellingen 
van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen, bij voor ­
keur op basis van een adequaat opgezet bereikbepalingonderzoek dat infor ­
matie oplevert over het kritische eindpunt, eventuele irritatiedrempelwaarden 
en het moment van optreden (zie de punten 11 tot en met 13). De keuze 
voor een bepaalde concentratie moet worden gemotiveerd.
 
5. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige 
en voortdurende angst vertonen, moeten op humane wijze worden gedood. 
Stervende dieren worden op dezelfde wijze beschouwd als dieren die tijdens 
de test sterven. De OESO-leidraad inzake humane eindpunten (3) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te her ­
kennen.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
6. Er worden gezonde jonge volwassen knaagdieren van gangbare laboratori ­
umstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Als een 
andere soort wordt gebruikt, moet dit worden gemotiveerd.  
Voorbereiding van de dieren  
7. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig 
zijn. Op de dag waarop zij willekeurig worden ingedeeld, moeten de jonge volwassen dieren zeven tot negen weken oud zijn en een lichaamsgewicht 
hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk 
geslacht. De dieren worden willekeurig gekozen, gemerkt om elk dier af ­
zonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de test gedurende minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in 
het laboratorium te laten wennen.
 
Dierhouderij  
8. De dieren moeten individueel worden onderscheiden, indien mogelijk met 
behulp van onderhuidse transponders, om de waarnemingen te vergemakke ­
lijken en verwarring te voorkomen. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt 
idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium 
wordt gebruikt, zal dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal 
dieren per kooi mag echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie 
van elk dier wordt gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan accli ­
matisatie voor de fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen 
geen onnodige lichamelijke, thermische of immobilisatiestress voor de die ­
ren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eind ­
punten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuut ­
volume. Als er generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen 
significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de bloot ­
stelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol 
filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterlei ­
ding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur 
donker.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalatiekamers  
9. Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard 
van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling 
via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de 
neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt 
door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag 
worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale „volume” van de test ­
dieren niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De 
technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteen ­
gezet in GD 39 (2).
 
TOXICITEITSONDERZOEK  
Limietconcentraties  
10. Anders dan bij acuut onderzoek zijn er bij onderzoek van 28 dagen naar 
subacute inhalatietoxiciteit geen vastgestelde limietconcentraties. Bij het 
vaststellen van de maximale geteste concentratie moet rekening worden gehouden met: 1) de maximaal haalbare concentratie, 2) het niveau waaraan 
mensen in het ongunstigste geval zouden worden blootgesteld („worst 
case”), 3) de noodzaak een toereikende zuurstoftoevoer in stand te houden, en/of 4) overwegingen met het oog op dierenwelzijn. Indien geen op reële gegevens gebaseerde grenswaarden beschikbaar zijn, kunnen de limietwaar ­
den voor acute-toxiciteitsonderzoek van Verordening (EG) nr. 1272/2008 
(13) worden gebruikt (d.w.z. tot een maximale concentratie van 5 mg/l voor aerosolen, 20 mg/l voor dampen en 20 000 ppm voor gassen); zie GD 39 (2). Als het nodig is deze limietwaarden te overschrijden voor het 
testen van gassen of zeer vluchtige teststoffen (bv. koelmiddelen), moet dit 
worden gemotiveerd. De limietconcentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levens ­
duur te beïnvloeden (3).
 
Bereikbepalingonderzoek  
11. Alvorens te beginnen met het hoofdonderzoek, kan het nodig zijn een 
bereikbepalingonderzoek uit te voeren. Een bereikbepalingonderzoek is uit ­
gebreider dan een verkennende test, omdat het zicht niet beperkt tot de 
keuze van de concentratie. De tijdens een bereikbepalingonderzoek opge ­
dane kennis kan ervoor helpen zorgen dat het hoofdonderzoek succesvol verloopt. Een bereikbepalingonderzoek kan bijvoorbeeld technische informa ­
tie opleveren met betrekking tot analysemethoden, deeltjesgroottebepaling, 
het herkennen van toxische mechanismen, klinisch-pathologische en histop ­
athologische gegevens, en schattingen van mogelijke NOAEL- en MTC-concentraties in het hoofdonderzoek. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen het bereikbepalingonderzoek te gebruiken om de drempelwaarde voor 
irritatie van de luchtwegen (bv. door middel van histopathologisch onder ­
zoek van de luchtwegen, het testen van de longfunctie, of bronchoalveolaire lavage), de hoogste concentratie die zonder onnodige stress door de dieren wordt verdragen en de parameters waarmee de toxiciteit van een teststof het 
best kan worden gekarakteriseerd, te bepalen.
 
12. Een bereikbepalingonderzoek kan één of meer concentratieniveaus omvatten. 
Bij elk concentratieniveau worden ten hoogste drie mannetjes en drie vrouw ­
tjes blootgesteld. Een bereikbepalingonderzoek duurt ten minste vijf dagen en doorgaans niet langer dan veertien dagen. In het testverslag moet de keuze van de concentraties voor het hoofdonderzoek worden gemotiveerd. Het 
hoofdonderzoek heeft tot doel een verband tussen concentratie en respons 
aan te tonen op basis van wat naar verwachting het gevoeligste eindpunt zal zijn. De lage concentratie is bij voorkeur de concentratie waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld („no-observed adverse effect”), de hoge 
concentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress 
bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Bij het kiezen van de concentratieniveaus voor het bereikbepalingonderzoek 
moet met alle beschikbare informatie rekening worden gehouden, met in ­
begrip van structuur-activiteitrelaties en gegevens over vergelijkbare stoffen (zie punt 3). Een bereikbepalingonderzoek kan de vanuit mechanistisch oogpunt als meest gevoelig beschouwde eindpunten bevestigen of weerleg ­
gen, bv. cholinesteraseremming door organofosfaten, vorming van methe ­
moglobine door voor erytrocyten toxische stoffen, schildklierhormonen (T
 3 , 
T 4 ) voor thyreotoxische stoffen, eiwit, LDH, of neutrofielen in bronchoal ­
veolaire lavage voor onschadelijke, slecht oplosbare deeltjes of longirritatie 
veroorzakende aerosolen.  
Hoofdonderzoek  
14. Het hoofdonderzoek naar subacute toxiciteit omvat doorgaans drie concen ­
tratieniveaus en, waar nodig, parallelle negatieve controles (luchtcontroles) en/of mediumcontroles (zie punt 17). Voor de keuze van geschikte bloot ­
stellingsniveaus moet gebruik worden gemaakt van alle beschikbare gege ­
vens, met inbegrip van de resultaten van onderzoek naar systemische toxi ­
citeit, metabolisme en kinetiek (er moet speciaal op worden gelet dat hoge concentratieniveaus waardoor kinetische processen worden verzadigd, wor ­
den vermeden). Elke testgroep bestaat uit ten minste tien knaagdieren (vijf 
mannetjes en vijf vrouwtjes) die over een periode van vier weken gedurende vijf dagen per week telkens zes uur per dag aan de teststof worden bloot ­
gesteld (de totale duur van het onderzoek is 28 dagen). De dieren mogen 
ook zeven dagen per week worden blootgesteld (bv. bij het testen van 
geneesmiddelen die worden geïnhaleerd). Indien bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof, kunnen beide geslachten bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld om het verband 
tussen concentratie en respons nauwkeuriger te kunnen bepalen, zoals be ­
schreven in punt 15. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Indien 
een blootstellingsduur van minder dan 6 uur/dag wordt gebruikt, of er 
onderzoek naar blootstelling van het hele lijf met een lange tijdsduur (bv. 22 uur/dag) moet worden verricht, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder, tenzij 
de blootstelling langer duurt dan 6 uur. Tijdens een blootstelling van het 
hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
 
15. De gekozen doelconcentraties moeten het mogelijk maken de doelorganen te 
identificeren en een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te 
tonen:  
— het hoge concentratieniveau moet toxische effecten veroorzaken, maar 
niet tot aanhoudende verschijnselen of sterfte leiden die een deugdelijke 
evaluatie belemmeren;  
— het (de) tussenliggende concentratieniveau(s) moet(en) zodanig zijn ver ­
deeld dat een gradatie in toxische effecten tussen de lage en hoge con ­
centratie wordt verkregen;  
— het lage concentratieniveau moet weinig of geen tekenen van toxiciteit 
opleveren.  
Satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek)  
16. Een satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek) kan worden gebruikt voor 
observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxiciteit gedurende een geschikte periode van ten minste 14 dagen na de 
behandeling. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) bestaan uit vijf man ­
netjes en vijf vrouwtjes die gelijktijdig met de proefdieren in het hoofd ­
onderzoek worden blootgesteld. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) moeten bij het hoogste concentratieniveau aan de teststof worden bloot ­
gesteld en waar nodig moeten er parallelle luchtcontroles en/of mediumcon ­
troles zijn (zie punt 17).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Controledieren  
17. De dieren voor de parallelle negatieve controle (luchtcontrole) worden op 
identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen, behalve dat zij worden blootgesteld aan gefilterde lucht in plaats van aan de teststof. Wan ­
neer voor het verkrijgen van de testatmosfeer water of een andere stof wordt 
gebruikt, moet in plaats van een negatieve controlegroep (luchtcontro ­
legroep) een mediumcontrolegroep in het onderzoek worden opgenomen. Waar mogelijk moet water worden gebruikt als het medium. Wanneer water 
wordt gebruikt als het medium moeten de controledieren worden bloot ­
gesteld aan lucht met dezelfde relatieve luchtvochtigheid als voor de bloot ­
gestelde groepen wordt gebruikt. De keuze van een geschikt medium vindt 
plaats op basis van een correct uitgevoerde voorstudie of van historische 
gegevens. Als de toxiciteit van een medium niet goed bekend is, kan de onderzoeksleider ervoor kiezen zowel een negatieve controle (luchcontrole) als een mediumcontrole te gebruiken, maar dit wordt sterk afgeraden. Indien 
uit historische gegevens blijkt dat een medium niet toxisch is, is een nega ­
tieve controlegroep (luchtcontrolegroep) niet nodig, en wordt alleen een mediumcontrole gebruikt. Indien een voorstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het 
medium bij de geteste concentratie niet toxisch is en dat deze mediumcon ­
trole moet worden gebruikt.
 
BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Toediening van concentraties  
18. De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, 
aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentra ­
tie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij 
hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve 
teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden. Deeltjes ­
materiaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om een 
kleinere deeltjesgrootte te verkrijgen. Nadere richtsnoeren zijn opgenomen 
in GD 39 (2).
 
Deeltjesgrootteverdeling  
19. Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, 
wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen 
van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een 
massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 3 μm 
en een geometrische standaardafwijking ( σ g ) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen 
(4). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te ha ­
len, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk 
blijkt. Metaaldampdeeltjes kunnen bijvoorbeeld kleiner zijn dan deze norm ­
waarde, en geladen deeltjes en vezels juist groter.  
Bereiding van de teststof in een medium  
20. In het ideale geval wordt de teststof zonder medium getest. Indien het 
noodzakelijk is een medium te gebruiken om een geschikte deeltjesgrootte 
en concentratie van de teststof te verkrijgen, wordt de voorkeur gegeven aan water. Wanneer een teststof wordt opgelost in een medium, moet de stabi ­
liteit ervan worden aangetoond.
 
CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Luchtdoorstroming in de kamer  
21. Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de blootstellings ­
kamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur 
geregistreerd. De realtimecontrole van de concentratie (of stabiliteit in de 
tijd) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische pa ­
rameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Indien de concentratie 
realtime wordt gecontroleerd, kan de frequentie waarmee de luchtdoorstro ­
ming wordt gemeten, worden teruggebracht tot één meting per blootstelling
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
per dag. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden 
gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht 
niet opnieuw wordt ingeademd. Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarde niet kan worden gehaald, moet de 
zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten. Wanneer uit de me ­
tingen op de eerste blootstellingsdag blijkt dat de waarden voor deze gassen op het juiste niveau liggen, zijn geen verdere metingen nodig.
 
Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer  
22. De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Voor 
zover mogelijk wordt, zowel bij blootstelling via de neus alleen als bij blootstelling van het hele lijf, tijdens elke blootstelling de relatieve vochtig ­
heid in het ademhalingsgebied van de dieren doorlopend gecontroleerd en 
ten minste elk uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt bij voorkeur tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferen ­
tie tussen de teststof en de testmethode.
 
Teststof: nominale concentratie  
23. Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer 
berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het in ­
halatiekamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet ge ­
bruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een ver ­
gelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.
 
Teststof: feitelijke concentratie  
24. De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof zoals bemonsterd 
in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke 
concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke me ­
thoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of 
niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische 
analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één com ­
ponent of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moe ­
ten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de 
teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poe ­
ders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens ver ­
eist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht ver ­
gelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet 
beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, 
moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn 
verzameld.
 
25. Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt gedurende het 
onderzoek, en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij 
de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang 
van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde ver ­
ontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met 
de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekopper ­
vlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromato ­
grafie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoor ­
delijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het 
testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in be ­
perkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden. Een voor ­
ziening voor realtimecontrole, zoals een aerosol-fotometer voor aerosolen, of 
een totaal-koolwaterstofanalysator voor dampen, kunnen worden gebruikt om de stabiliteit van de blootstellingsvoorwaarden aan te tonen. De feitelijke concentratie in de kamer moet gedurende elke blootstellingsdag voor elk 
blootstellingsniveau ten minste 3 keer worden gemeten. Als dit vanwege de 
beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, is één monster per blootstellingsperiode aanvaardbaar. In het ideale geval wordt dit monster in dat geval gedurende de volledige blootstellingsperiode ver ­
zameld. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie 
en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t
 95 ) wordt berekend en gerap ­
porteerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt ge ­
genereerd. Hierbij wordt rekening gehouden met de equilibratietijd van de kamer (t
 95 ) en de vervaltijd. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten 
van t  95 opgenomen.  
27. Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen 
(bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer ver ­
schillend gedragen. Daarom moet van elke fase (damp/gas en aerosol) ten 
minste één indicatorstof (analyt) worden gekozen, normaliter de voornaam ­
ste werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts 
voor het werkzame bestanddeel of de indicatorstof (analyt). Aanvullende 
informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (2).
 
Teststof: deeltjesgrootteverdeling  
28. De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt voor ieder concentratieni ­
veau ten minste wekelijks bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. 
Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor en het 
alternatieve instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het al ­
ternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt.
 
29. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een 
gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltref ­
fendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massacon ­
centraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in 
een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid bij alle geteste con ­
centraties kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden ge ­
nomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens 
worden verkregen waardoor herhaling van het onderzoek noodzakelijk is.
 
30. Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid be ­
staat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of in ­
dien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden.
 
WAARNEMINGEN  
31. De dieren worden voor, tijdens en na de blootstellingsperiode klinisch ge ­
observeerd. Afhankelijk van de reactie van de dieren tijdens de blootstelling 
kunnen frequentere observaties nodig zijn. Indien het observeren van de 
dieren wordt belemmerd door het gebruik van fixeerbuizen, slecht verlichte kamers voor het hele lijf, of ondoorzichtige atmosferen, moeten de dieren zorgvuldig worden geobserveerd na afloop van de blootstelling. Door de 
volgende dag vóór de blootstelling te observeren kan eventuele reversibiliteit 
of verergering van toxische effecten worden beoordeeld.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Alle observaties worden geregistreerd en van elk dier wordt een apart over ­
zicht bijgehouden. Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden 
gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk ge ­
registreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.  
33. Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar 
veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het zenuwstelsel, de somatomotori ­
sche activiteit en gedragspatronen. Er moet worden gelet op de observatie 
van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en 
coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflec ­
toire bradypneu of hypo-/hyperthermie. In het onderzoeksprotocol kunnen 
aanvullende beoordelingen worden opgenomen, zoals kinetiek, biomonito ­
ring, longfunctie, retentie van slecht oplosbare stoffen die zich in longweef ­
sel ophopen, en gedragsveranderingen.
 
LICHAAMSGEWICHT  
34. Het gewicht van elk dier wordt kort voor de eerste blootstelling geregis ­
treerd, op dag 0 en vervolgens twee keer per week (bijvoorbeeld op vrijdag 
en maandag, om het herstel gedurende een weekend zonder blootstelling aan te tonen, of volgens een tijdsinterval om de systemische toxiciteit te kunnen beoordelen), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geë ­
uthanaseerd. Indien er gedurende de eerste twee weken geen effecten op ­
treden, kan het lichaamsgewicht van de dieren gedurende het vervolg van de studie wekelijks worden gemeten. Indien satellietgroepen (reversibiliteits ­
groepen) worden gebruikt, moeten de dieren in deze groepen ook gedurende 
de hele herstelperiode wekelijks worden gewogen. Bij de beëindiging van 
het onderzoek moeten alle dieren kort voordat zij worden gedood, worden gewogen om een onvertekende berekening van de verhouding tussen or ­
gaangewichten en lichaamsgewicht mogelijk te maken.
 
VOEDSEL- EN WATERVERBRUIK  
35. Het voedselverbruik wordt wekelijks gemeten. Het waterverbruik kan ook 
worden gemeten.  
KLINISCHE PATHOLOGIE  
36. Voor alle dieren, met inbegrip van de dieren in de controlegroepen en 
satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), worden klinisch-pathologische be ­
oordelingen uitgevoerd wanneer zij worden gedood. Het tijdsinterval tussen het einde van de blootstelling en de aftapping van het bloed moet worden geregistreerd, met name wanneer het desbetreffende eindpunt snel naar de 
uitgangswaarde terugkeert. Voor parameters met een korte plasmahalfwaar ­
detijd (bv. COHb, CHE, en MetHb) is het wenselijk om na het einde van de blootstelling monsters te nemen.
 
37. Tabel 1 bevat een lijst van de klinisch-pathologische parameters die door ­
gaans voor elk toxicologisch onderzoek vereist zijn. Urineonderzoek hoeft niet routinematig te worden uitgevoerd, maar kan worden verricht wanneer dit op grond van de verwachte of waargenomen toxiciteit nuttig wordt 
geacht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen aanvullende parameters te 
beoordelen om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren (bijv. cholinesterase, lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglo ­
bine of Heinz-lichaampjes, creatinekinase, verhouding myeloïde/erytroïde 
cellen, troponines, arteriële bloedgassen, lactaatdehydrogenase, sorbitolde ­
hydrogenase, glutamaatdehydrogenase, en gamma- glutamyltranspeptidase).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabel 1  
Klinisch-pathologische standaardparameters  
Hematologisch  
Telling van de erytrocyten 
Hematocriet 
Hemoglobinegehalte 
Hemoglobinegehalte per erytrocyt Gemiddeld volume van de erytrocyten 
Hemoglobinegehalte per 
volume-eenheid erytrocyten 
Reticulocyten Totale telling van de leukocyten 
Gedifferentieerde telling van de 
leukocyten 
Telling van de bloedplaatjes Stollingsvermogen (een van de 
mogelijkheden kiezen): 
— Prothrombinetijd 
— Stollingstijd — Partiële thromboplastinetijd
 
Klinisch-chemisch  
Glucose (*) 
Totaal cholesterol 
Triglyceriden 
Bloedureumstikstof Totaal bilirubine Creatinine 
Totaal eiwit 
Albumine Globuline Alanineaminotransferase 
Aspartaataminotransferase 
Alkalische 
fosfatase Kalium Natrium 
Calcium 
Fosfor Chloride
 
Urineonderzoek (facultatief)  
Voorkomen (kleur en troebelheid) 
Volume Soortelijk gewicht of osmolaliteit 
pH Totaal eiwit 
Glucose Bloed/bloedcellen
 
(*) Omdat een lange vastperiode tot systematische fouten in de glucosemetingen voor 
de behandelde versus de controledieren kan leiden, moet de onderzoeksleider 
bepalen of het passend is om de dieren te laten vasten. Indien een vastperiode 
wordt gebruikt, moet deze zijn afgestemd op de gebruikte diersoort; voor de rat 
kan dit 16 uur zijn (een nacht vasten). De bepaling van het glucosegehalte in 
nuchtere toestand kan plaatsvinden na een nacht vasten tijdens de laatste week van de blootstelling, of na een nacht vasten voorafgaand aan de obductie (in het laatste 
geval gelijktijdig met de bepaling van alle andere klinisch-pathologische parame ­
ters).
 
38. Wanneer er aanwijzingen zijn dat afzetting en retentie primair in de onderste 
luchtwegen (d.w.z. de alveolen) plaatsvindt, kan bronchoalveolaire lavage de aangewezen techniek zijn voor kwantitatieve analyse van op hypothesen gebaseerde dosis-effectparameters, waarbij de nadruk ligt op alveolitis, long ­
ontsteking en fosfolipidose. Op deze manier kunnen veranderingen in de 
dosis-responsverhouding en het verloop in de tijd van alveolair letsel ade ­
quaat worden onderzocht. De bronchoalveolaire lavagevloeistof kan worden geanalyseerd met betrekking tot de totale en gedifferentieerde tellingen van 
de leukocyten, totaal eiwit, en lactaatdehydrogenase. Ook parameters die 
wijzen op lysosomale beschadigingen, fosfolipidose, fibrose en door irritatie of allergie veroorzaakte ontstekingen, kunnen worden overwogen; het kan 
hierbij onder meer gaan om de bepaling van pro-inflammatoire cytokinen/ 
chemokinen. Bronchoalveolaire lavagemetingen vormen doorgaans een aan ­
vulling op de resultaten van histopathologisch onderzoek, maar kunnen deze niet vervangen. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het uitvoeren van 
longlavage opgenomen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MACROPATHOLOGIE EN ORGAANGEWICHTEN  
39. Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of 
met het oog op het dierenwelzijn uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd, indien mogelijk na volledig uitbloeden. 
Voor ieder dier moet worden geregistreerd hoeveel tijd er is verstreken 
tussen het einde van hun laatste blootstelling en het moment waarop zij zijn gedood. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevro ­
ren) bij een temperatuur die laag genoeg is om de autolyse tot een minimum 
te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare patholo ­
gische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere 
aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
 
40. Tabel 2 bevat een lijst van de organen en weefsels die tijdens de macro ­
scopische obductie in een geschikt medium moeten worden bewaard voor histopathologisch onderzoek. Het is aan de onderzoeksleider om te beoor ­
delen of de organen en weefsels tussen [vierkante haken] en alle andere 
organen en weefsels worden bewaard. De  vet weergegeven organen moeten 
zo spoedig mogelijk na de sectie worden ontdaan van aanhechtend weefsel en nat worden gewogen om uitdroging te voorkomen. De schildklier en 
epididymides moeten alleen worden gewogen indien dit nodig is, omdat 
bij het ontdoen van aanhechtend weefsel artefacten kunnen ontstaan die het histopathologische onderzoek kunnen belemmeren. Weefsels en organen moeten worden gefixeerd in 10 % gebufferde formaldehyde of een ander 
geschikt fixeermiddel zodra de obductie is verricht, en ten minste 24 tot 48 
uur vóór het ontdoen van aanhangend weefsel, afhankelijk van het gebruikte fixeermiddel.
 
Tabel 2  
Tijdens de macroscopische obductie bewaarde organen en weefsels  
Bijnieren  
Beenmerg (en/of vers aspiraat)  
Hersenen  (inclusief delen van cerebrum, ce ­
rebellum en medulla/pons)  
[Ogen (netvlies, oogzenuw) en oogleden]  
Hart  
Nieren  
Larynx (3 niveaus, 1 niveau moet de steel 
van de epiglottis bevatten)  
Lever  
Long  (alle lobben op één niveau, inclusief de 
hoofdbronchiën)  
Lymfeklieren van de longhilus, met name bij 
slecht oplosbare teststoffen in deeltjesvorm. 
Voor grondiger onderzoek en/of studies met een immunologische focus kunnen aanvul ­
lende lymfeklieren worden overwogen, bv. 
uit de mediastinale, cervicale/submandibulaire 
en/of auriculaire streek.
 
Weefsels van de nasofarynx (ten minste 4 
niveaus; 1 niveau moet het nasofaryngaal ka ­
naal en het nasofarynx-geassocieerd lymfa ­
tisch weefsel (nasal associated lymphoid tis ­
sue, NALT) omvatten.  
Slokdarm  
[Reukkolf]  
Ovaria  Zaadblaasjes  
Ruggenmerg (cervicaal, middenthoracaal en 
lumbaal)  
Milt 
Maag  
Testes  
Thymus  
Schildklier  
Luchtpijp (ten minste 2 niveaus, inclusief 1 
lengtecoupe door de carina en 1 dwarscou ­
pe) 
[Urineblaas]  
Uterus  
Elk macroscopisch waarneembaar letsel  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. De longen worden in hun geheel verwijderd, gewogen en ingedruppeld met 
een geschikt fixeermiddel bij 20-30 cm waterdruk om ervoor te zorgen dat 
de longstructuur intact blijft (5). De coupes worden voor alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën, gemaakt, maar als longlavage wordt uitgevoerd, worden van de niet gespoelde lob op drie niveaus coupes ge ­
maakt (geen seriële coupes).
 
42. Ten minste 4 niveaus van de weefsels van de nasofarynx worden onder ­
zocht, waarvan er één het nasofaryngaal kanaal moet omvatten 
(5)(6)(7)(8)(9), om adequaat onderzoek mogelijk te maken van het plavei ­
selcelepitheel, overgangsepitheel (respiratoir zonder trilharen), ademhalings ­
epitheel (respiratoir met trilharen) en reukepitheel, alsmede het drainerend 
lymfatisch weefsel (NALT; (10)(11)). Er worden drie niveaus van de larynx 
onderzocht; een van deze niveaus moet de steel van de epiglottis omvatten (12). Er worden ten minste twee niveaus van de luchtpijp onderzocht, in ­
clusief één lengtecoupe door de carina van de splitsing van de extrapulmo ­
nale bronchiën, en één dwarscoupe.
 
HISTOPATHOLOGIE  
43. Alle in tabel 2 genoemde organen en weefsels wordt histopathologisch 
onderzocht bij de controle- en hogeconcentratiegroepen, en bij alle dieren 
die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood. Bijzondere aandacht 
moet worden besteed aan de luchtwegen, doelorganen, en macroscopisch waarneembaar letsel. De organen en weefsels die in de hogeconcentratie ­
groep letsel vertonen, worden bij alle groepen onderzocht. De onderzoeks ­
leider kan ervoor kiezen bij meer groepen histopathologisch onderzoek te 
verrichten, om een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen. Indien van een satellietgroep (reversibiliteitsgroep) gebruik wordt gemaakt, dan wordt histopathologisch onderzoek verricht op alle weefsels 
en organen waar bij de behandelde groepen effecten blijken te zijn opge ­
treden. Indien er bij de hogeblootstellingsgroep buitensporig veel vroegtij ­
dige sterfte of andere problemen optreden die afbreuk doen aan de signifi ­
cantie van de gegevens, wordt de groep die bij de op één na hoogste con ­
centratie is blootgesteld, histopathologisch onderzocht. Getracht moet wor ­
den om de macroscopische waarnemingen te correleren aan microscopische bevindingen.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
44. Voor elk dier apart worden gegevens over lichaamsgewicht, voedselver ­
bruik, klinische pathologie, orgaangewichten en histopathologie vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal 
dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, 
het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een be ­
schrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en 
de obductiebevindingen. Alle resultaten, zowel numerieke als incidenteel, 
moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëva ­
lueerd. Iedere algemeen aanvaarde statistische methode mag worden ge ­
bruikt; de statistische methoden worden bij de opzet van het onderzoek 
gekozen.
 
Testverslag  
45. In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opge ­
nomen:  
Proefdieren en dierhouderij:  
— beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: 
aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omge ­
vingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie 
van de voeding;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort 
dan ratten; herkomst en historische gegevens kunnen worden vermeld, 
indien afkomstig van dieren die zijn blootgesteld onder vergelijkbare omstandigheden wat betreft blootstelling, huisvesting en vasten;
 
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— randomiseringsmethode;  
— beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, 
met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigen ­
schappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);  
— identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Ab ­
stracts Service).  
Medium  
— motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan 
(indien een ander medium dan water wordt gebruikt);  
— historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet 
interfereert met de uitkomst van de studie.  
Inhalatiekamer:  
— gedetailleerde beschrijving van de inhalatiekamer, met inbegrip van de 
afmetingen en een schematische weergave;  
— herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van 
dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;  
— apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deel ­
tjesgrootte en de feitelijke concentratie;  
— herkomst van de lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;  
— toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het ver ­
krijgen van een homogene testatmosfeer;  
— drukverschil (positief of negatief);  
— blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie 
van de dieren in de kamer (blootstelling van het hele lijf);  
— stabiliteit van de testatmosfeer;  
— locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van 
de testatmosfeer in de kamer;  
— behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde lucht;  
— luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus 
alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);  
— equilibratietijd van de kamer (t  95 ); 
— aantal volumeveranderingen per uur;  
— meetapparaten (indien van toepassing).  
Blootstellingsgegevens:  
— motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide 
teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);  
— feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren 
verzamelde teststof; voor mengsels die heterogene fysische vormen pro ­
duceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden 
geanalyseerd;  
— alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (mg/l, mg/m  3 
enz.), in plaats van in volume-eenheden (ppm, ppb enz.);  
— deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische 
diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking ( σ g ), onder ver ­
melding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjes ­
grootteanalysen worden vermeld.  
Testomstandigheden:  
— details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de 
procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vaste stoffen te 
verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden;  
— een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de 
apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de bloot ­
stelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;  
— details van de apparatuur die wordt gebruikt om de temperatuur in de 
kamer, de vochtigheid en de luchtdoorstroming in de kamer te contro ­
leren (d.w.z. ontwikkeling van een kalibratiecurve);  
— details van de apparatuur die wordt gebruikt om monsters te verzamelen 
voor de bepaling van de kamerconcentratie en deeltjesgrootteverdeling;  
— details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering 
van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
 
— randomiseringsmethode voor het indelen van de dieren in test- en con ­
trolegroepen;  
— details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst 
van het voeder en herkomst van het water);  
— motivering van de keuze van de testconcentraties.  
Resultaten:  
— een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de 
kamer;  
— een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de 
kamer;  
— een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens 
over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgroottever ­
deling en de berekening van de MMAD en σ g ; 
— een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor 
elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterf ­
te, en de aard, hevigheid, tijdstip van aanvang en duur van de effecten);  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— een tabel met het gewicht van elk dier;  
— een tabel met het voedselverbruik;  
— een tabel met klinisch-pathologische gegevens;  
— voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevin ­
dingen, indien beschikbaar;  
— een tabel met eventuele andere gemeten parameters.  
Bespreking en interpretatie van de resultaten:  
— speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden 
die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, 
bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;  
— er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het 
licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de 
deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;  
— in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de 
consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
 
— er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en over ­
heersende werking (systemisch of plaatselijk);  
— er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten 
worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voort ­
durende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad 
voor humane eindpunten (3);  
— het doelorgaan (de doelorganen) moet (moeten) worden aangegeven;  
— het NOAEL en LOAEL moet worden bepaald.  
LITERATUUR:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Gui ­
deline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal dia ­
grams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nas ­
opharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lym ­
phoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad 
van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking 
van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 
67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIE  
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze testmethode wordt getest.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOXICITEIT (DERMAAL) BIJ HERHAALDE TOEDIENING (28 
DAGEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie algemene inleiding deel B (punt A).  
1.2. DEFINITIES  
Zie algemene inleiding deel B (punt B).  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks in 
geleidelijk stijgende doseringen op de huid van verscheidene groepen 
proefdieren aangebracht. Er wordt één dosis per groep gebruikt. 
Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdek ­
ken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die 
aan het eind van de proef leven, wordt necropsie verricht.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
Voor het onderzoek worden de dieren ten minste 5 dagen onder 
gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tij ­
dens de proef voorkomen. Gezonde jonge dieren worden op wille ­
keurige wijze voor de behandeling ingedeeld bij testgroepen en con ­
trolegroepen. Kort voor de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren geknipt; het haar kan ook worden geschoren, maar dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef worden 
gedaan. Gewoonlijk zal het dier ongeveer om de week opnieuw 
moeten worden geknipt of geschoren. Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast. Ten minste 10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de 
teststof worden onthaard. Bij het bepalen van de oppervlakte die 
moet worden onthaard en de afmetingen van de aan te brengen bedekking moet rekening worden gehouden met het gewicht van het dier. Bij een proef met vaste stoffen, die eventueel tot poeder 
kunnen worden fijngemaakt, moet de teststof voldoende met water 
of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, zodat de stof goed in contact met de huid komt. Vloeibare teststoffen worden 
in het algemeen onverdund gebruikt. De teststof wordt gedurende 5 
tot 7 dagen per week dagelijks aangebracht.
 
1.6.2.  Proefomstandigheden  
1.6.2.1.  Proefdieren  
Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten, konijnen of 
cavia's. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de 
noodzaak hiervoor moet worden aangetoond.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Bij het begin van de studie mag het gewicht van de dieren die bij de 
test worden gebruikt niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde 
gewicht afwijken.  
1.6.2.2.  Aantal en geslacht  
Voor ieder dosisniveau moeten ten minste tien dieren (vijf wijfjes en 
vijf mannetjes) met een gezonde huid worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal worden verhoogd met het 
aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal 
worden gedood. Daarnaast kan een satellietgroep van tien dieren (vijf per geslacht) gedurende 28 dagen worden behandeld met het hoge dosisniveau waarna zij nog gedurende 14 dagen na de behandeling 
worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventu ­
eel verdwijnen, voortduren of pas later tot uiting komen. Tevens wordt een satellietgroep van tien controledieren (vijf per geslacht) gebruikt.
 
1.6.2.3.  Dosisniveau  
Ten minste drie dosisniveaus, met een controlegroep of een medium ­
controlegroep, indien een medium wordt gebruikt, zijn vereist. De 
expositieduur moet ten minste 6 uur per dag bedragen. De teststof 
moet iedere dag op ongeveer dezelfde tijd worden aangebracht; op vastgestelde tijden (iedere week of twee keer per week) is een cor ­
rectie vereist om ervoor te zorgen dat het dosisniveau in verhouding 
tot het lichaamsgewicht van het dier constant blijft. Afgezien van de 
toediening van de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze als de dieren in de proefgroep worden behandeld. 
Indien een medium is gebruikt om het doseren te vergemakkelijken 
moet aan de mediumcontrolegroep op dezelfde wijze als aan de testgroep een dosis van het medium worden toegediend en deze dosis moet even groot zijn als die van de dieren in de groep met 
het hoogste dosisniveau. Het hoogste dosisniveau van de teststof 
moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij het laagste dosisniveau mogen geen tekenen van toxiciteit optreden. Indien het blootstellingsniveau van 
de mens kan worden geschat, moet het laagste niveau deze over ­
schrijden. In het ideale geval treden bij het middelste dosisniveau minimaal waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tus ­
sendosis moet het verschil tussen de dosisniveaus zo groot zijn dat 
een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. In de groep met 
de laagste dosis en in de tussengroepen, alsmede in de controlegroe ­
pen, mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.
 
Indien toediening van de teststof tot ernstige huidirritatie leidt, moe ­
ten de concentraties worden verlaagd, wat vermindering of ontbreken 
van andere toxische effecten bij het hoge dosisniveau tot gevolg kan hebben. Indien de huid ernstig is beschadigd, kan het zelfs nood ­
zakelijk zijn de studie te beëindigen en een nieuwe studie met lagere 
concentraties te beginnen.
 
1.6.2.4.  Limiettest  
Indien bij een verkennende proef geen toxische effecten optreden bij 
een dosisniveau van 1 000 mg/kg, of een hoger niveau dat verband 
houdt met het niveau waaraan de mens, voor zover bekend, kan worden blootgesteld, is het wellicht niet noodzakelijk om verdere proeven te nemen.
 
1.6.2.5.  Observatieperiode  
De proefdieren moeten dagelijks worden onderzocht op tekenen van 
toxiciteit. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop 
toxiciteitsverschijnselen voor het eerst zijn waargenomen en het tijd ­
stip waarop zij weer verdwijnen, moeten worden opgetekend.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Uitvoering  
De dieren moeten afzonderlijk in kooien worden gehuisvest. De 
dieren worden gedurende een periode van 28 dagen, zo mogelijk 7 dagen per week, met de teststof behandeld. Dieren in eventuele 
satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 14 dagen 
zonder behandeling worden gehouden om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. De blootstellingstijd moet 6 uur per dag bedragen.
 
De teststof moet gelijkmatig worden aangebracht over een opper ­
vlakte van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen kan de te bedekken oppervlakte kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet worden bedekt met 
een zo dun en gelijkmatig mogelijk aangebrachte laag.
 
De teststof moet gedurende de blootstellingstijd door middel van 
poreus gaasverband en niet-irriterend plakband in contact met de huid worden gehouden. Het testgedeelte van de huid moet op ge ­
schikte wijze verder worden bedekt om het verbandgaas en de test ­
stof op hun plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof via de mond opnemen. Hulpmiddelen om de dieren te fixeren kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat de dieren de teststof 
via de mond opnemen, maar het wordt niet aangeraden de dieren 
volledig te immobiliseren. Als alternatief kan een „beschermende halskraag” worden gebruikt.
 
Aan het einde van de blootstellingsperiode wordt de resterende test ­
stof zo mogelijk met water van de huid verwijderd of anders door 
middel van een andere geschikte reinigingstechniek.  
Alle dieren moeten dagelijks worden geobserveerd; tekenen van 
toxiciteit moeten worden genoteerd met inbegrip van het tijdstip 
waarop deze voor het eerst optraden en de mate en de duur ervan. 
Bij het observeren moet aandacht worden besteed aan veranderingen van de huid, de vacht, de ogen en de slijmvliezen, alsmede adem ­
halingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en het centrale ze ­
nuwstelsel, de somatomotorische activiteit en het gedrag. Wekelijks 
moeten de dieren worden gewogen. Het is eveneens aanbevolen het voerverbruik wekelijks te meten. De dieren moeten regelmatig wor ­
den geobserveerd om te voorkomen dat ze voor de studie verloren 
gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weef ­
sels of omdat de dieren in verkeerde kooien zijn geplaatst. Na afloop van de onderzoekperiode wordt bij alle overlevende dieren in de 
behandelde groepen (afgezien van de dieren in de satellietgroep), 
necropsie verricht. Indien stervende dieren of dieren met hevige nood/ongemak of pijn worden aangetroffen, moeten deze worden verwijderd en op een humane manier worden gedood; bij hen wordt 
eveneens necropsie verricht.
 
Na afloop van de studie moeten bij alle dieren, met inbegrip van die 
uit de controlegroepen, de volgende onderzoekingen worden uitge ­
voerd:  
1) Hematologie waarbij ten minste bepaling van hematocriet en he ­
moglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde 
telling van de leucocyten en meting van stollingsvermogen.  
2) Klinisch-biochemische bepalingen in het bloed waarbij ten minste 
één parameter van de lever- en nierfunctie: serum alanineamino ­
transferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-pyrodrui ­
venzuur-transaminase (SGPT)), serum aspartaataminotransferase (vroegere benaming: serum glutaminezuur-oxaalazijnzuur-trans ­
aminase (SGOT)), ureum, albumine, bloedcreatinine, totaal bili ­
rubine en totaal serumeiwit.
 
Voor een goede toxicologische evaluatie kan het nodig zijn het 
onderzoek uit te breiden met: calcium, fosfor chloride, natrium, ka ­
lium, glucosegehalte bij nuchtere toestand, analyse van de lipiden, 
hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglobine en cholinesterase- 
activiteit.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Zo nodig kan verder klinisch-biochemisch onderzoek worden ver ­
richt om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden.  
1.6.4.  Macroscopische necropsie  
Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische ne ­
cropsie worden uitgevoerd. Zo spoedig mogelijk na sectie moeten ten minste lever, nieren, bijnieren en testes nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Organen en weefsels (de normale en 
de behandelde huid, lever, nieren, milt, testes, bijnieren, hart en alle 
organen die macroscopisch waarneembare beschadigingen of ver ­
anderingen in omvang vertonen moeten in een geschikt medium worden bewaard voor eventueel later histopathologisch onderzoek.
 
1.6.5.  Histopathologisch onderzoek  
Bij de dieren in de groep die een hoge dosis heeft ontvangen en bij 
die in de controlegroep moet histopathologisch onderzoek op de 
bewaarde organen en weefsels worden verricht. Organen en weefsels die bij het hoogste doseringsniveau door de teststof blijken te zijn beschadigd, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden 
onderzocht. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de 
satellietgroep moet speciaal worden gelet op de organen en weefsels waar, bij de andere behandelde groepen, effecten blijken te zijn opgetreden.
 
2. GEGEVENS  
De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen 
worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onder ­
zoek en het aantal dieren waarbij ieder type beschadiging voorkomt.  
Alle waargenomen resultaten moeten met behulp van een geschikte 
statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische 
methode kan hiervoor worden gebruikt.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, dieet, enzovoort;  
— proefomstandigheden (met inbegrip van het soort verband: occlu ­
sief of niet-occlusief);  
— dosisniveaus (met het eventueel medium) en concentraties;  
— waar mogelijk het hoogste dosisniveau waarbij geen effect op ­
treedt;  
— gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis;  
— tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt, of aange ­
ven of dieren tot het eind van de proef bleven leven;  
— toxische of andere effecten;  
— tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en 
het verloop hiervan;  
— gegevens over voedsel en lichaamsgewicht;  
— uitgevoerde hematologische proeven en alle resultaten;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— uitgevoerde klinisch-biochemische proeven en alle resultaten;  
— bevindingen bij de necropsie;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevin ­
dingen;  
— waar mogelijk statistische behandeling van de resultaten;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie algemene inleiding deel B (punt D).  
4. LITERATUUR  
Zie algemene inleiding deel B (punt E).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENITEIT —  IN-VITRO  TEST OP 
CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN ZOOGDIERCELLEN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 473 van de OESO:  In-vitro  
test op chromosoomafwijkingen in zoogdiercellen (1997).  
1.1. INLEIDING  
De in-vitrotest op chromosoomafwijkingen is bedoeld om te bepalen 
welke stoffen structurele chromosoomafwijkingen bij gekweekte 
menselijke cellen veroorzaken (1)(2)(3). Er zijn twee soorten struc ­
turele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. De meeste chemische mutagenen veroorzaken afwijkingen van het chro ­
matidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Een toename 
van polyploïdie kan erop wijzen dat een chemische stof numerieke 
afwijkingen kan veroorzaken. Deze methode is echter niet opgezet om numerieke afwijkingen te meten en wordt normaal gesproken niet voor dat doel gebruikt. Chromosoommutaties en soortgelijke 
voorvallen veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het 
lijkt er sterk op dat chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen die veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen van soma ­
tische cellen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker 
bij de mens en bij proefdieren.
 
Bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen kunnen culturen van 
permanente cellijnen, celstammen of primaire celculturen worden 
gebruikt. De gebruikte cellen worden geselecteerd op basis van het 
groeivermogen in een cultuur, de stabiliteit van het karyotype, het aantal chromosomen, de verscheidenheid van de chromosomen en de frequentie van spontane chromosoomafwijkingen.
 
Bij in vitro  uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole 
activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel  in vivo  niet volledig 
nabootsen. Er moet goed op worden gelet dat omstandigheden die 
kunnen leiden tot positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit maar door veranderingen in de pH of de osmolaliteit of een sterke cytotoxiciteit worden veroorzaakt, worden 
vermeden (4)(5).
 
Deze test wordt gebruikt voor de screening op mogelijke mutagenen 
en carcinogenen voor zoogdieren. Veel stoffen die positief op deze test reageren, zijn carcinogeen voor zoogdieren, maar er is geen 
absolute correlatie tussen deze test en carcinogeniteit. De correlatie 
is afhankelijk van de chemische klasse en het lijkt er steeds meer op dat er carcinogenen zijn die met deze test worden gesignaleerd om ­
dat ze blijkbaar via andere mechanismen dan directe DNA-bescha ­
diging werken.
 
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Afwijking van het chromatidetype:  structurele chromosoombescha ­
diging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventu ­
eel gevolgd door recombinatie.  
Afwijking van het chromosoomtype:  structurele chromosoombe ­
schadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats 
ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplicatie:  een proces waarbij de kern na een S-fase met 
DNA-replicatie niet tot mitose overgaat, maar opnieuw een S-fase 
begint. Het resultaat is chromosomen met 4, 8, 16, ... chromatiden.  
Hiaat:  een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte 
van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chro ­
matiden minimaal is.  
Mitotische index:  de verhouding tussen het aantal cellen in de me ­
tafase en het totale aantal cellen in een populatie: deze index geeft 
een indicatie van de snelheid waarmee deze populatie zich voort ­
plant.  
Numerieke afwijking:  een verandering in het aantal chromosomen 
ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de 
gebruikte cellen.  
Polyploïdie:  het voorkomen van een ander veelvoud van het haplo ­
ïde aantal chromosomen ( n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3 n, 4n, 
enz.).  
Structurele afwijking:  een verandering in de chromosoomstructuur 
die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling 
kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en intra- of interchromosomale uitwisselingen.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Celculturen worden zowel met als zonder metabole activering aan de 
teststof blootgesteld. Op vooraf bepaalde tijdstippen na de blootstel ­
ling van de celculturen aan de teststof worden ze met een metafase ­
stopper (bv. Colcemid® of colchicine) behandeld, geoogst en ge ­
kleurd en worden de cellen in de metafase microscopisch onderzocht op de aanwezigheid van chromosoomafwijkingen.
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding  
1.4.1.1.  Cellen  
Er kunnen verschillende soorten cellijnen, stammen of primaire cel ­
culturen worden gebruikt, waaronder ook menselijke cellen (bv. fi ­
broblasten van Chinese hamsters of menselijke of van andere zoog ­
dieren afkomstige perifere bloedlymfocyten).  
1.4.1.2.  Media en kweekomstandigheden  
Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatie ­
omstandigheden (kweekvat, CO  2 -concentratie, temperatuur en voch ­
tigheid) voor de culturen. Permanente cellijnen en stammen moeten geregeld worden gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal 
chromosomen stabiel is en er geen besmetting met mycoplasma heeft 
plaatsgevonden; indien dit laatste het geval is, mogen ze niet worden gebruikt. De normale tijd voor de celcyclus bij de gebruikte cellen en kweekomstandigheden moet bekend zijn.
 
1.4.1.3.  Bereiding van de culturen  
Permanente cellijnen en stammen: cellen uit stamculturen worden 
met een zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de ko ­
lonies voor het oogsten niet aaneengroeien, en bij 37  o C geïncu ­
beerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lymphocyten: met een stollingsremmer (bv. heparine) behandeld 
volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten van gezonde proefpersonen 
worden toegevoegd aan het kweekmedium met een mitogeen (bv. fytohemagglutinine) en bij 37
 o C geïncubeerd.  
1.4.1.4.  Metabole activering  
De cellen dienen zowel met als zonder een geschikt metabool active ­
ringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest ge ­
bruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een 
cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn be ­
handeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (6)(7)(8)(9) of een mengsel van fenobarbiton en ß-naftoflavon (10)(11)(12).
 
De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een con ­
centratie van 1-10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De omstan ­
digheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische ver ­
binding. In sommige gevallen zal wellicht meer dan een concentratie 
van de post-mitochondriale fractie moeten worden gebruikt.
 
Een aantal ontwikkelingen, bijvoorbeeld de opbouw van genetisch 
aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen tot ex ­
pressie komen, kan endogene activering mogelijk maken. Voor de 
keuze van de gebruikte cellijnen moet een wetenschappelijke ver ­
antwoording worden gegeven (bv. aan de hand van de relevantie van het cytochroom P450-isoenzym voor het metabolisme van de test ­
stof).
 
1.4.1.5.  Teststof/Bereiding  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van de cellen worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks aan het testsysteem worden toegediend en/of vóór de behandeling 
worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aan ­
vaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden ge ­
bruikt.
 
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Oplosmiddel/Medium  
Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof 
moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenig ­
baar zijn met het overleven van de cellen en de S9-activiteit. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten 
gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen 
opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer stoffen worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte orga ­
nische oplosmiddelen watervrij zijn. Water kan door toevoeging van 
een moleculaire zeef worden verwijderd.
 
1.4.2.2.  Blootstellingsconcentraties  
Bij de bepaling van de hoogste concentratie moet onder andere 
rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit, de oplosbaarheid in het testsysteem en veranderingen in de pH of de osmolaliteit.
 
De cytotoxiciteit moet met en zonder metabole activering in het 
hoofdexperiment worden bepaald aan de hand van adequate indica ­
ties omtrent de integriteit en de groei van de cellen, zoals de mate van confluentie. het aantal levensvatbare cellen of de mitotische 
index. Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren 
om de cytotoxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Er moeten ten minste drie analyseerbare concentraties worden ge ­
bruikt. Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten deze concentraties 
een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken; dit betekent meestal dat de concentraties niet meer dan een factor 2 tot √10 uit elkaar mogen liggen. Bij het oogsten moet de 
hoogste concentratie een significante verlaging van de mate van 
confluentie, het aantal cellen of de mitotische index veroorzaken (voor alle parameters meer dan 50 %). De mitotische index is slechts een indirecte maat voor de cytotoxische/cytostatische effecten en is 
afhankelijk van het tijdstip na de behandeling. De mitotische index is 
echter aanvaardbaar voor culturen in suspensie, waarbij andere me ­
tingen van de toxiciteit omslachtig en onpraktisch kunnen zijn. In ­
formatie over de kinetiek van de celcyclus, zoals de gemiddelde 
generatietijd (GGT), kan als aanvulling worden gebruikt. De GGT 
is echter een algeheel gemiddelde waaruit niet altijd blijkt of er achterblijvende deelpopulaties zijn en zelfs een geringe stijging van de GGT kan samengaan met een zeer aanzienlijke vertraging 
op het moment waarop de hoeveelheid afwijkingen maximaal is.
 
Bij stoffen met een betrekkelijk geringe cytotoxiciteit moet de maxi ­
male concentratie 5 μl/ml, 5 mg/ml of 0,01 M (de laagste van deze 
drie) zijn.  
Bij betrekkelijk onoplosbare stoffen die bij lagere concentraties dan 
de oplosbaarheidsgrens niet toxisch zijn, moet de hoogste dosis een 
concentratie boven de oplosbaarheidsgrens in het uiteindelijke kweekmedium aan het eind van de behandelingsperiode zijn. In sommige gevallen (bv. wanneer de toxiciteit alleen optreedt bij ho ­
gere concentraties dan de oplosbaarheidsgrens, is het raadzaam bij 
meer dan één concentratie met zichtbaar neerslag te testen. Het kan nuttig zijn de oplosbaarheid aan het begin en het eind van de be ­
handeling te bepalen, aangezien de oplosbaarheid tijdens de bloot ­
stelling in het testsysteem door de aanwezigheid van bijvoorbeeld 
cellen, S9 of serum kan veranderen. Onoplosbaarheid kan met het blote oog worden geconstateerd. Het neerslag mag niet storen bij het scoren.
 
1.4.2.3.  Negatieve en positieve controles  
Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve (op ­
losmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als 
zonder metabole activering. Wanneer metabole activering wordt ge ­
bruikt, moet de voor de positieve controle gebruikte chemische stof activering vereisen om een mutagene reactie te veroorzaken.
 
Voor de positieve controles moet een bekend klastogeen worden 
gebruikt, waarvan op het blootstellingsniveau een reproduceerbare en detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht om de gevoeligheid van het testsysteem aan 
te tonen.
 
De concentraties van de positieve controle moeten zodanig worden 
gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde object ­
glaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Als positieve 
controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:  
Metabole activering Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Zonder exogene metabole acti ­
vering Methylmethaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 
Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Metabole activering Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 
4-Nitrochinoline- N-oxide 56-57-5 200-281-1 
Met exogene metabole active ­
ring Benzo[ a]pyreen 50-32-8 200-028-5 
Cyclofosfamide 
Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Ook andere geschikte stoffen kunnen als positieve controle worden 
gebruikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een ver ­
wante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen.  
Voor elk oogsttijdstip dienen negatieve controles in het experiment 
te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het 
medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de 
culturen met teststof worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel 
geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.
 
1.4.3.  Uitvoering  
1.4.3.1.  Behandeling met de teststof  
Delende cellen worden zowel met als zonder metabool activerings ­
systeem met de teststof behandeld. De behandeling van lymfocyten 
moet ongeveer 48 uur na de mitogene stimulering beginnen.  
1.4.3.2. Normaal gesproken moeten voor elke concentratie twee culturen 
worden gebruikt en voor culturen met negatieve/oplosmiddelcontrole 
wordt dit sterk aanbevolen. Wanneer aan de hand van gegevens uit 
het verleden kan worden aangetoond dat de verschillen tussen du ­
ploculturen minimaal zijn (13)(14), kan het gebruik van één cultuur voor elke concentratie aanvaardbaar zijn.
 
Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor 
geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (15)(16).
 
1.4.3.3.  Oogsttijdstippen  
Bij het eerste experiment moeten de cellen zowel met als zonder 
metabole activering gedurende drie tot zes uur aan de teststof worden 
blootgesteld en wordt op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5-maal de normale lengte van een celcyclus na het begin van de behandeling bemonsterd (12). Als op deze wijze zowel met als zon ­
der activering negatieve resultaten worden verkregen, wordt een 
nieuw experiment zonder activering uitgevoerd, waarbij de behan ­
deling wordt voortgezet totdat op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5-maal de normale lengte van een celcyclus wordt be ­
monsterd. Voor sommige stoffen gaat de detectie beter bij een 
behandelings/bemonsteringstijd van meer dan 1,5-maal de lengte van de celcyclus. Negatieve resultaten met metabole activering moe ­
ten per geval worden bevestigd. Wanneer bevestiging van negatieve 
resultaten niet nodig wordt geacht, moet hiervoor een motivering 
worden gegeven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Chromosoompreparaten  
De celculturen worden meestal gedurende één tot drie uur vóór het 
oogsten behandeld met Colcemid  ® of colchicine. Elke celcultuur 
wordt afzonderlijk geoogst en behandeld voor het maken van chro ­
mosoompreparaten. Dit houdt in dat de cellen een hypotone behan ­
deling krijgen, gevolgd door fixatie en kleuring.  
1.4.3.5.  Analyse  
Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, 
worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de fixatie vaak een gedeelte van de metafasecellen 
breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moeten de gescoorde 
cellen voor alle celtypes het modale aantal ± 2 centromeren bevatten. Per concentratie en controle moeten minimaal 200 goed gespreide metafasen worden gescoord, indien van toepassing gelijkelijk ver ­
deeld over de duplobepalingen. Wanneer een groot aantal afwijkin ­
gen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden verlaagd.
 
Hoewel de test bedoeld is om structurele chromosoomafwijkingen op 
te sporen, is het belangrijk dat bij waarneming van polyploïdie en endoreduplicatie ook deze verschijnselen worden geregistreerd.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Aangezien de cel bij dit experiment de eenheid is, moet het percen ­
tage cellen met één of meer structurele chromosoomafwijkingen worden bepaald. Er moet een overzicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de 
aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en contro ­
leculturen voorkomen. Hiaten worden apart geregistreerd en gerap ­
porteerd, maar worden meestal niet in de totale frequentie van de afwijkingen opgenomen.
 
Gelijktijdige metingen van de cytotoxiciteit voor alle behandelde en 
negatieve controleculturen bij de hoofdexperimenten dienen ook te 
worden geregistreerd.  
De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daar ­
naast moet er een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden samengesteld.
 
Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij 
onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij 
voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. De nood ­
zakelijke bevestiging van negatieve resultaten is al onder punt 1.4.3.3. besproken. Bij vervolgexperimenten dient wijziging van pa ­
rameters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een 
breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen en de omstandigheden bij metabole activering.
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, 
zoals een concentratieafhankelijke of een reproduceerbare stijging 
van het aantal cellen met chromosoomafwijkingen. In eerste instantie 
moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden geke ­
ken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (3)(13). Statistische signifi ­
cantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve 
reactie zijn.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Een stijging van het aantal polyploïde cellen kan erop wijzen dat de 
teststof in staat is mitotische processen te remmen en numerieke 
chromosoomafwijkingen te induceren. Een stijging van het aantal cellen met endoreduplicatie van chromosomen kan erop wijzen dat de teststof in staat is de voortgang van de celcyclus te remmen 
(17)(18).
 
Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria 
voldoen, wordt de stof in dit systeem als niet-mutageen beschouwd.  
Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve 
resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de 
effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de in-vitrotest op chromosoomafwijkingen 
wijzen erop dat de teststof in gekweekte somatische zoogdiercellen structurele chromosoomafwijkingen induceert. Negatieve resultaten 
wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in gekweekte 
somatische zoogdiercellen geen chromosoomafwijkingen induceert.
 
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— motivering voor de keuze van het medium;  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Cellen:  
— aard en herkomst van de cellen;  
— kenmerken van het karyotype en bruikbaarheid van het gebruikte 
celtype;  
— afwezigheid van mycoplasma, indien van toepassing;  
— informatie over de lengte van de celcyclus;  
— geslacht van de bloeddonors, volledig bloed of geïsoleerde lym ­
focyten, gebruikt mitogeen;  
— aantal overentingen, indien van toepassing;  
— methoden om de celcultuur in leven te houden, indien van toe ­
passing;  
— modaal aantal chromosomen.  
Testomstandigheden:  
— naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en bloot ­
stellingsduur;  
— achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal 
culturen, bijvoorbeeld gegevens over de cytotoxiciteit en be ­
perkte oplosbaarheid, indien beschikbaar;  
— samenstelling van het medium en CO  2 -concentratie, indien van 
toepassing;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— concentratie van de teststof;  
— toegevoegd volume medium en teststof;  
— incubatietemperatuur;  
— incubatietijd;  
— duur van de behandeling;  
— celdichtheid bij het enten, indien van toepassing;  
— aard en samenstelling van het metabole activeringssysteem. met 
inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria;  
— positieve en negatieve controles;  
— methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;  
— criteria voor het scoren van afwijkingen:  
— aantal geanalyseerde metafases;  
— methoden voor de meting van de toxiciteit;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of ondui ­
delijk is.  
Resultaten:  
— tekenen van toxiciteit, bijvoorbeeld de mate van confluentie, 
gegevens over de celcyclus, het aantal cellen en de mitotische index;
 
— neerslagverschijnselen:  
— gegevens over de pH en de osmolaliteit van het behandelings ­
medium, indien bepaald;  
— definitie voor afwijkingen, met inbegrip van hiaten;  
— het aantal cellen met chromosoomafwijkingen en de aard van de 
chromosoomafwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elke behan ­
delde en controlecultuur;  
— veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen;  
— indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;  
— eventuele statistische analyses;  
— gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/ ­
medium) en positieve controles;  
— gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve 
(oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding 
van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemi ­
cal Mutagens. In: Chemical mutagens, Prin-ciples and Methods 
for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press. 
New York and Lon-don, pp. 1-29.  
(2) Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T. (1985). The  in Vitro  Chromoso ­
mal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fi ­
broblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C Colman. S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A., An ­
derson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 
(suppl.10), pp. 1-175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate. M.Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr. B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from)CPEMC Task Group 9. Mutation Res.. 257, pp. 147-204.
 
(5) Morita. T., Nagaki, T.. Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, pp. 297-305.  
(6) Ames, B.N., McCann. J. and Yamasaki, E. (1975). Me ­
thods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the 
Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mu ­
tation Res., 31, pp. 347-364.  
(7) Maron, D.M. and Ames. B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 17 3- 215.
 
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de 
Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens 
after Activation in a Microsomal System  In Vitro , I. Induction 
of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation 
Res., 37, pp. 83-90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M and Ishidate, M. Jr. (1979). Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro . Mutation Res., 66, pp. 277-290.  
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe. C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay,].M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds)  In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- 
Holland, pp. 85-88.
 
(12) Galloway, S.M., Aardema. M.J.. Ishidate, M.Jr., Ivett, J.L., 
Kirkland, DJ., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). 
Report from Working Group on  In Vitro  Tests for Chromoso ­
mal Aberrations. Mutation Res., 312, pp. 241-261.  
(13) Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mu ­
tagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, pp. 141-154.  
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M, (1994). Replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149.  
(15) Krahn. D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Ge ­
notoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 
91-103.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels of Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis. 5, pp. 795-801.
 
(17) Locke-Huhle. C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 
119, pp. 403-413.  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko. J.E. (1983). Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENITEIT —  IN-VIVO  TEST OP 
CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN BEENMERGCELLEN 
VAN ZOOGDIEREN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 475 van de OESO: Test op 
chromosoomafwijkingen in beenmergcellen van zoogdieren (1997).  
1.1. INLEIDING  
De in-vivotest op chromosoomafwijkingen bij zoogdieren wordt ge ­
bruikt om te bepalen welke stoffen structurele chromosoomafwijkin ­
gen bij beenmergcellen van dieren, meestal knaagdieren, veroorzaken (1) (2) (3) (4). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: het chromosoomtype en het chromatidetype. Een toename van polyplo ­
ïdie kan erop wijzen dat een chemische stof numerieke afwijkingen 
kan veroorzaken. De meeste chemische mutagenen veroorzaken af ­
wijkingen van het chromatidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen veroor ­
zaken veel genetische ziekten bij de mens en het lijkt er sterk op dat 
chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen die veranderingen in oncogenen en tumorsuppressorgenen veroorzaken, betrokken zijn bij de inductie van kanker bij de mens en bij proefdieren.
 
Voor deze test worden meestal knaagdieren gebruikt. Het doelweef ­
sel is het beenmerg aangezien dit een sterk doorbloed weefsel is en 
een populatie snel delende cellen bevat die gemakkelijk kunnen 
worden geïsoleerd en verwerkt. De methode is niet geschikt voor andere diersoorten en doelweefsels.
 
Deze test op chromosoomafwijkingen is bijzonder geschikt om het 
gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien rekening kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabo ­
lisme  in vivo , de farmacokinetiek en de DNA-herstelsynthese, hoe ­
wel deze aspecten van soort tot soort en van weefsel tot weefsel 
kunnen verschillen. Een in-vivotest is ook geschikt om een  in vitro  
gesignaleerd mutageen effect nader te onderzoeken.
 
Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet 
daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet ge ­
schikt.  
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Afwijking van het chromatidetype:  structurele chromosoombescha ­
diging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventu ­
eel gevolgd door recombinatie.  
Afwijking van het chromosoomtype:  structurele chromosoombe ­
schadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats 
ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.  
Endoreduplicatie:  een proces waarbij de kern na een S-fase met 
DNA-replicatie niet tot mitose overgaat, maar opnieuw een S-fase 
begint. Het resultaat is chromosomen met 4, 8, 16, ... chromatiden.  
Hiaat:  een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte 
van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chro ­
matiden minimaal is.  
Numerieke afwijking:  een verandering in het aantal chromosomen 
ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de 
gebruikte cellen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Polyploïdie:  het voorkomen van een ander veelvoud van het haplo ­
ïde aantal chromosomen ( n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3 n, 4n. 
enz.).  
Structurele afwijking:  een verandering in de chromosoomstructuur 
die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling 
kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en 
intra- of interchromosomale uitwisselingen.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof bloot ­
gesteld en op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood. Voor ­
dat de dieren worden gedood, worden ze behandeld met een meta ­
fasestopper (bv. colchicine of Colcemid  ® ). Vervolgens worden chro ­
mosoompreparaten van de beenmergcellen gemaakt, die worden ge ­
kleurd; de cellen in de metafase worden geanalyseerd op chromo ­
soomafwijkingen.  
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding  
1.4.1.1.  Keuze van de diersoort  
Meestal worden ratten, muizen of Chinese hamsters gebruikt, maar 
in principe komt elke geschikte zoogdiersoort in aanmerking. Er 
dient gebruik te worden gemaakt van jonge gezonde volwassen die ­
ren van in het laboratorium gangbare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk 
zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht van 
elk geslacht bedragen.
 
1.4.1.2.  Huisvesting en voeding  
De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene om ­
standigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid 
wordt gestreefd naar 50-60 %.  
1.4.1.3.  Voorbereiding van de dieren  
Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de 
behandelde en controlegroepen. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden 
beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie. Ze krijgen mini ­
maal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren.
 
1.4.1.4.  Bereiding van de doseringen  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan 
de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks 
worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.
 
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Oplosmiddel/Medium  
Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen toxi ­
sche effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media wor ­
den gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze 
geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te 
bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Controles  
Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve 
(oplosmiddel/medium) controles voor elk geslacht worden uitge ­
voerd. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren 
in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de 
dieren in de andere groepen.  
Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die  in 
vivo structurele afwijkingen veroorzaakt op een blootstellingsniveau 
waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrond ­
niveau kan worden verwacht. De doseringen van de positieve con ­
troles moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk ais zodanig her ­
kenbaar zijn. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een 
andere weg toe te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. Waar mogelijk kan het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. 
Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:
 
Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclofosfamide 
Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 
605 5-19-2 200-015-4 
Triethyleenmelamine 51-18-3 200-083-5
 
Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het 
experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmid ­
del of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde 
manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het 
verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen met chromosoomafwijkingen. Als voor de negatieve controles één 
bemonsteringstijdstip wordt gebruikt, kan hiervoor het beste het eer ­
ste bemonsteringstijdstip worden gekozen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of 
medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.
 
1.5. UITVOERING  
1.5.1.  Aantal en geslacht van de dieren  
Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare 
dieren per geslacht bevatten. Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde blootstellings ­
weg beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er geen significante verschil ­
len in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een che ­
mische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals bij ­
voorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij 
dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.
 
1.5.2.  Behandelingsschema  
De teststof wordt bij voorkeur in één dosis toegediend. De dosis kan 
eventueel worden gesplitst, waarbij de twee porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening van een groot volume te vergemakkelijken. Voor 
een ander doseringsschema moet een wetenschappelijke motivering 
worden gegeven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
De monsters worden op twee aparte tijdstippen na de behandeling op 
één dag genomen. Voor knaagdieren ligt het eerste bemonsterings ­
tijdstip op 1,5 maal de normale lengte van een celcyclus (deze cyclus duurt meestal 12 tot 18 uur) na de behandeling. Aangezien de voor de opname en het metabolisme van de teststof vereiste tijd en de 
effecten op de kinetiek van de celcyclus gevolgen kunnen hebben 
voor het optimale tijdstip om chromosoomafwijkingen te detecteren, verdient het aanbeveling 24 uur na het eerste bemonsteringstijdstip opnieuw te bemonsteren. Indien het doseringsschema meer dan één 
dag beslaat, moet één bemonsteringstijdstip op 1,5 maal de normale 
lengte van een celcyclus na de laatste toediening worden gebruikt.
 
Voordat de dieren worden gedood, worden ze intraperitoneaal geïn ­
jecteerd met een adequate dosis metafasestopper (bv. Colcemid  ® of 
colchicine). De dieren worden na een adequate pauze bemonsterd. Voor muizen moet er ongeveer drie tot vijf uur worden gewacht en voor Chinese hamsters ongeveer vier tot vijf uur. De cellen worden 
uit het beenmerg gehaald en op chromosoomafwijkingen geanaly ­
seerd.
 
1.5.3.  Dosisniveaus  
Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen 
bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in 
hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, 
hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofd ­
onderzoek (5). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het eerste bemonsteringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisni ­
veaus moeten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen 
toxiciteit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft al ­
leen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen ver ­
oorzaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema 
waarschijnlijk sterfte zal optreden. Stoften met een specifieke bio ­
logische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op deze criteria om de 
dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De 
hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die eniger ­
lei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een daling van de mitotische index met meer dan 50 %).
 
1.5.4.  Limiettest  
Als een test met één dosis van minimaal 2 000 mg/kg lichaams ­
gewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van 
gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit 
te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onderzoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2 000mg/kg lichaamsgewicht/dag 
bij toediening gedurende maximaal 14 dagen en 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende meer dan 14 dagen. Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger dosisniveau bij de limiettest 
nodig worden geacht.
 
1.5.5.  Toediening van de doses  
De teststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een 
geschikte intubatiecanule of door intraperitoneale injectie toegediend. Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daar ­
voor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume 
vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan worden toe ­
gediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2ml/100g lichaamsgewicht. Voor het ge ­
bruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. 
Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere concentra ­
ties meestal hevigere effecten veroorzaken, moeten volumeverschil ­
len tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te 
passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden 
gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Chromosoompreparaten  
Onmiddellijk nadat het dier is gedood wordt beenmerg verwijderd, in 
een hypotone oplossing gebracht en gefixeerd. De cellen worden vervolgens op objectglaasjes uitgesmeerd en gekleurd.
 
1.5.7.  Analyse  
Als maat voor de cytotoxiciteit wordt in ten minste 1 000 cellen per 
dier voor alle behandelde dieren (ook de positieve controles) en 
onbehandelde dieren voor de negatieve controle de mitotische index 
bepaald.  
Voor elk dier worden minimaal 100 cellen geanalyseerd. Wanneer 
een groot aantal afwijkingen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden verlaagd. Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse on ­
afhankelijk gecodeerd. Aangezien bij de bereiding van de object ­
glaasjes vaak een gedeelte van de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moeten de gescoorde cellen 2n ± 2 centromeren bevatten.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens moeten voor elk dier apart in tabelvorm worden ver ­
strekt. De eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk dier moet 
het aantal gescoorde cellen, het aantal afwijkingen per cel en het percentage cellen met een of meer structurele chromosoomafwijkin ­
gen worden bepaald. Er moet een overzicht worden gegeven van de 
verschillende soorten structurele chromosoomafwijkingen met de 
aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en contro ­
legroepen voorkomen. Hiaten worden apart geregistreerd en gerap ­
porteerd maar meestal niet in de totale frequentie van de afwijkingen 
opgenomen. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie 
tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor de statistische analyse worden gecombineerd.
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, 
zoals een dosisafhankelijke stijging van het relatieve aantal cellen met chromosoomafwijkingen of een duidelijke stijging van het aantal 
cellen met afwijkingen in één dosisgroep bij één bemonsteringstijd. 
In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resul ­
taten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de test ­
resultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (6). Statis ­
tische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor 
een positieve reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimen ­
tele omstandigheden.
 
Een toename van polyploïdie kan erop wijzen dat de teststof in staat 
is numerieke chromosoomafwijkingen te induceren. Een toename 
van endoreduplicatie kan erop wijzen dat de teststof in staat is de 
voortgang van de celcyclus te remmen (7)(8).  
Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria 
voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve 
resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de 
effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt uitge ­
voerd, onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de in-vivotest op chromosoomafwijkingen 
wijzen erop dat een stof in het beenmerg van de geteste soort chro ­
mosoomafwijkingen induceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat 
de stof onder de testomstandigheden in het beenmerg van de geteste soort geen chromosoomafwijkingen induceert.
 
De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in 
de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen 
(systemische toxiciteit), dient te worden besproken.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— motivering voor de keuze van het medium;  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort/stam:  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren:  
— herkomst, huisvesting, voeding, enz.;  
— het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met ver ­
melding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwij ­
king van het lichaamsgewicht voor elke groep.  
Testomstandigheden:  
— positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles:  
— gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd:  
— achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;  
— gegevens over de bereiding van de teststof;  
— gegevens over de toediening van de teststof;  
— achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;  
— methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop 
of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing;  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), 
indien van toepassing;  
— gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;  
— een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemon ­
steringsschema;  
— methoden voor de meting van de toxiciteit;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— naam van de metafasestopper, gebruikte concentratie en bloot ­
stellingsduur;  
— methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;  
— criteria voor het scoren van afwijkingen;  
— aantal geanalyseerde cellen per dier;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of ondui ­
delijk is.  
Resultaten:  
— tekenen van toxiciteit;  
— mitotische index;  
— aard en aantal van de afwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elk 
dier; 
— totaal aantal afwijkingen per groep, met vermelding van het ge ­
middelde en de standaardafwijking;  
— aantal cellen met afwijkingen per groep, met vermelding van het 
gemiddelde en de standaardafwijking;  
— veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen;  
— indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;  
— eventuele statistische analyses;  
— gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles;  
— gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve controles, 
met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwij ­
king;  
— gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Adler, I.D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306.
 
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, 
A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, pp. 157-165.
 
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby,)., Gatehouse, D.G., Boot ­
man, J. and Henderson, L. (1990). In  In Vivo  Cytogenetic As ­
says. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cam ­
bridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Bla ­
key, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., 
Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Simada, H., Sutou, 
S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the in Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration 
Test. Mutation Res., 312, pp. 305-312.
 
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe. J., 
Esdaile, DJ., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. Mu ­
tagenesis, 7, pp. 31 3-319.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese. R., Amphlett, G.E., Cla ­
re, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, 
J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In \'ivo Cytogenetic As ­
says. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutageni ­
city Testing. Report Part. III. Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University 
Press. Cambridge. pp. 184-232.  
(7) Locke-Huhle, C. (198 3). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, pp. 403-413.
 
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer 
Res.. 43, pp. 1362-1364.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENITEIT —  IN-VIVO  MICRONUCLEUSTEST BIJ 
ERYTROCYTEN VAN ZOOGDIEREN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 474 van de OESO: Micro ­
nuleustest bij erytrocyten van zoogdieren (1997).  
1.1. INLEIDING  
De in-vivo micronuleustest bij zoogdieren wordt gebruikt om na te 
gaan of de teststof schade toebrengt aan de chromosomen of het 
mitotisch apparaat van erytroblasten door de analyse van erytrocyten die worden verkregen uit het beenmerg en/of de perifere bloedcellen van dieren, meestal knaagdieren.
 
De micronuleustest is bedoeld om stoften te signaleren die cytoge ­
netische schade veroorzaken waarbij micro-nuclei ontstaan met ach ­
tergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen.  
Wanneer een erytroblast uit het beenmerg zich ontwikkelt tot een 
polychromatische erytrocyt, wordt de hoofdkern uitgestoten: wanneer 
een micronucleus is ontstaan, kan deze in het overigens kernloze cytoplasma achterblijven. Omdat deze cellen geen hoofdkern bevat ­
ten, zijn de micronuclei gemakkelijker zichtbaar te maken. Een stij ­
ging van de frequentie waarmee bij behandelde dieren polychroma ­
tische erytrocyten met micronuclei worden aangetroffen, wijst op chromosoombeschadiging.
 
Voor deze test wordt meestal het beenmerg van knaagdieren ge ­
bruikt, aangezien in dit weefsel polychromatische erytrocyten worden gevormd. Het is ook aanvaardbaar het aantal onrijpe (polychromati ­
sche) erytrocyten met micronuclei in perifeer bloed te bepalen bij 
soorten waarvan is aangetoond dat de milt niet in staat is erytrocyten met micronuclei op te ruimen of dat de gevoeligheid om stoffen die structurele of numerieke chromosoomafwijkingen veroorzaken te de ­
tecteren afdoende is. Micronuclei kunnen aan de hand van een aantal 
criteria worden onderscheiden, bijvoorbeeld op grond van de aan- of afwezigheid van een kinetochoor-of centromeer-DNA in de micro ­
nuclei. Het belangrijkste eindpunt is de frequentie van onrijpe (poly ­
chromatische) erytrocyten met micronuclei. Het aantal rijpe (normo ­
chromatische) erytrocyten in het perifere bloed met micronuclei, bepaald bij een bekend aantal rijpe erytrocyten, kan ook als eindpunt van de bepaling worden gebruikt wanneer de dieren gedurende ten 
minste vier weken ononderbroken worden behandeld.
 
Deze in-vivo micronucleustest bij zoogdieren is bijzonder geschikt 
om het gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien reke ­
ning kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabolisme  in vivo , de farmacokinetiek en de DNA-herstelsynthese, 
hoewel deze aspecten van soort tot soort, van weefsel tot weefsel en 
voor de verschillende genetische eindpunten kunnen verschillen. Een 
in-vivo bepaling is ook geschikt om een  in vitro  gesignaleerd muta ­
geen effect nader te onderzoeken.
 
Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet 
daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet ge ­
schikt.  
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINITIES  
Centromeer (kinetochoor):  het deel of de delen van een chromo ­
soom waar tijdens de celdeling de spoeldraden aan vastzitten, zodat de verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de 
dochtercellen regelmatig kan verlopen.
 
Micronucleus:  een kleine kern die buiten en naast de hoofdkern van 
cellen tijdens de telofase van de mitose (meiose) ontstaat door ach ­
tergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen.  
Normochromatische erytrocyt:  een rijpe erytrocyt zonder ribos ­
omen die van onrijpe polychromatische erytrocyten kan worden on ­
derscheiden door de selectieve kleuring van ribosomen.  
Polychromatische erytrocyt:  een onrijpe erytrocyt in een tussen ­
tijdse ontwikkelingsfase die nog ribosomen bevat en derhalve van rijpe normochromatische erytrocyten kan worden onderscheiden door de selectieve kleuring van ribosomen.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof bloot ­
gesteld. Als beenmerg wordt gebruikt, worden de dieren op geschikte 
tijdstippen na de behandeling gedood, wordt het beenmerg verwij ­
derd en worden er preparaten gemaakt die worden gekleurd (l)(2) ­
(3)(4)(5)(6)(7). Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, wordt op geschikte tijdstippen na de behandeling bloed afgenomen en worden 
er uitstrijkpreparaten gemaakt die worden gekleurd (4)(8)(9)(10). Bij 
studies met perifeer bloed moet er zo weinig mogelijk tijd verstrijken tussen de laatste blootstelling en het oogsten van de cellen. De pre ­
paraten worden onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei.
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding  
1.4.1.1.  Keuze van de diersoort  
Als beenmerg wordt gebruikt, worden muizen of ratten aanbevolen, 
maar in principe komt elke geschikte zoogdiersoort in aanmerking. Wanneer perifeer bloed wordt gebruikt, worden muizen aanbevolen. 
In principe komt elke geschikte zoogdiersoort echter in aanmerking, 
mits het een soort is waarvan de milt niet in staat is erytrocyten met micronuclei op te ruimen of een soort waarvan is aangetoond dat de gevoeligheid om stoffen die structurele of numerieke chromosoom ­
afwijkingen veroorzaken te detecteren afdoende is. Er dient gebruik 
te worden gemaakt van jonge gezonde dieren van in het laboratorium gangbare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichts ­
verschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal 
± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht bedragen.
 
1.4.1.2.  Huisvesting en voeding  
De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene om ­
standigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid 
wordt gestreefd naar 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Voorbereiding van de dieren  
Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de 
behandelde en controlegroepen. De dieren krijgen een unieke iden ­
tificatie. Ze krijgen minimaal vijf dagen de tijd om in het laborato ­
rium te acclimatiseren. De kooien moeten zodanig worden geplaatst 
dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden beperkt.  
1.4.1.4.  Bereiding van de doseringen  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan 
de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks 
worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.
 
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Oplosmiddel/Medium  
Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen 
toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/ ­
media worden gebruikt, moeten referentiegegevens worden verstrekt 
waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.
 
1.4.2.2.  Controles  
Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve 
(oplosmiddel/medium) controles voor elk geslacht worden uitge ­
voerd. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen.
 
Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die in- 
vivo micronuclei veroorzaakt op een blootstellingsniveau waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan 
worden verwacht. De doseringen van de positieve controles moeten 
zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de geco ­
deerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe 
te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. 
Waar mogelijk kan bovendien het gebruik van stoffen uit een ver ­
wante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:
 
Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
N-Ethyl-N-nitrosoureum 759-73-9 212-072-2 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Cyclofosfamide 
Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 
60 5 5-19-2 200-015-4 
Triethyleenmelamine 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het 
experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmid ­
del of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar 
zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen 
met micronuclei. Als voor de negatieve controles één bemonsterings ­
tijdstip wordt gebruikt, kan hiervoor het beste het eerste bemonste ­
ringstijdstip worden gekozen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde 
controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de literatuur 
reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of medium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.
 
Als perifeer bloed wordt gebruikt, kan een monster dat vóór de 
behandeling wordt genomen ook aanvaardbaar zijn als gelijktijdige 
negatieve controle, maar alleen wanneer het gaat om een korte studie met perifeer bloed (bv. één tot drie behandelingen) en het resultaat binnen het verwachte interval door de in het verleden uitgevoerde 
controle ligt.
 
1.5. UITVOERING  
1.5.1.  Aantal en geslacht van de dieren  
Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare 
dieren per geslacht bevatten (11). Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij dezelfde soort en met dezelfde bloot ­
stellingsweg beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er geen significante 
verschillen in toxiciteit tussen de geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een 
chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals 
bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de test bij dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.
 
1.5.2.  Behandelingsschema  
Er kan geen standaardbehandelingsschema (d.w.z. één, twee of meer 
behandelingen met een interval van 24 uur) worden aanbevolen. De 
monsters van verlengde doseringsschema's zijn aanvaardbaar, mits 
een positief effect voor deze studie is aangetoond of, voor een ne ­
gatieve studie, mits toxiciteit is aangetoond of de limietdosis is ge ­
bruikt, en de toediening tot het bemonsteringstijdstip is voortgezet. 
De dosis kan eventueel worden gesplitst, waarbij de twee porties op 
dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening van een groot volume te vergemakke ­
lijken.
 
De test kan op twee manieren worden uitgevoerd:  
a) De dieren worden eenmaal met de teststof behandeld. Beenmerg ­
monsters worden ten minste tweemaal genomen, de eerste keer niet eerder dan 24 uur na de behandeling en de laatste keer 
uiterlijk 48 uur na de behandeling, met een afdoende interval 
tussen de monsters. Voor het gebruik van een bemonsteringstijd ­
stip binnen 24 uur na de behandeling moet een motivering wor ­
den gegeven. Monsters van perifeer bloed worden ten minste 
tweemaal genomen, de eerste keer niet eerder dan 36 uur na de 
behandeling, met een afdoende interval na het eerste monster, en de laatste keer uiterlijk 72 uur na de behandeling. Wanneer op één bemonsteringstijdstip een positieve reactie wordt gesigna ­
leerd, behoeven er geen verdere monsters meer te worden ge ­
nomen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) Als twee of meer dagelijkse behandelingen worden gebruikt (bv. 
twee of meer behandelingen met een interval van 24 uur), moet 
de bemonstering voor het beenmerg eenmaal gebeuren tussen 18 en 24 uur na de laatste behandeling en voor het perifere bloed eenmaal tussen 36 en 48 uur na de laatste behandeling (12).
 
Indien dit nuttig is, kunnen daarnaast ook andere bemonsteringstijd ­
stippen worden gebruikt.  
1.5.3.  Dosisniveaus  
Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen 
bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in 
hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam, 
hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofd ­
onderzoek (13). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het 
eerste bemonsteringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisni ­
veaus moeten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft al ­
leen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt 
gedefinieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen ver ­
oorzaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema waarschijnlijk sterfte zal optreden. Stoffen met een specifieke bio ­
logische activiteit bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en 
mitogenen) kunnen een uitzondering vormen op deze criteria om de 
dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die eniger ­
lei aanwijzing van toxiciteit voor het beenmerg oplevert (bv. een 
daling van de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en 
het totale aantal erytrocyten in het beenmerg of het perifere bloed).
 
1.5.4.  Limiettest  
Als een test met één dosis van minimaal 2 000 mg/kg lichaams ­
gewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit 
te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig 
onderzoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Voor studies met een langere duur is de limietdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende maximaal 14 dagen en 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag bij toediening gedurende meer dan 14 dagen. 
Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger dosisniveau bij de limiettest nodig worden geacht.
 
1.5.5.  Toediening van de doses  
De reststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een 
geschikte intubatiecanule of door intraperitoneale injectie toegediend. 
Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daar ­
voor een motivering kan worden gegeven. Het maximale volume vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan worden toe ­
gediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume 
mag niet groter zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Voor het 
gebruik van grotere volumes moet een motivering worden gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere concentra ­
ties meestal heviger effecten veroorzaken, moeten volumeverschillen 
tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, 
zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Beenmerg/bloedpreparaten  
De beenmergcellen worden meestal volgens gangbare methoden uit 
het dijbeen of scheenbeen van pas gedode dieren verwijderd, gepre ­
pareerd en gekleurd. Perifeer bloed wordt uit de staartader of een 
ander geschikt bloedvat afgenomen. De bloedcellen worden onmid ­
dellijk supravitaal gekleurd (8)(9)(10) of er wordt een uitstrijkprepa ­
raat gemaakt dat vervolgens wordt gekleurd. Door het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof (bv. acridine oranje (14) of Hoechst 
33258 plus pyronine-Y (15)) kunnen sommige artefacten die zich bij 
het gebruik van niet voor DNA specifieke kleurstoffen kunnen voor ­
doen, worden voorkomen. Dit neemt niet weg dat ook klassieke 
kleurstoffen (zoals Giemsa) kunnen worden gebruikt. Ook andere 
systemen (zoals cellulosekolommen om cellen die een kern bevatten te verwijderen (16)) kunnen worden gebruikt, mits is aangetoond dat deze methoden geschikt zijn voor micronucleuspreparaten in het 
laboratorium.
 
1.5.7.  Analyse  
Voor elk dier wordt de verhouding tussen het aantal onrijpe erytro ­
cyten en het totale aantal (onrijpe + rijpe) erytrocyten bepaald door in totaal voor het beenmerg ten minste 200 erytrocyten en voor het 
perifere bloed ten minste 1 000 erytrocyten te tellen (17). Alle ob ­
jectglaasjes, ook die van de negatieve en positieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Voor de bepaling van de frequentie waarmee onrijpe erytrocyten met micro ­
nuclei voorkomen, worden ten minste 2 000 rijpe erytrocyten per 
dier gescoord. Aanvullende informatie kan worden verkregen door rijpe erytrocyten op micronuclei te scoren. Bij de analyse van de objectglaasjes mag de verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocy ­
ten en het totale aantal erytrocyten niet lager dan 20 % van de 
controlewaarde zijn. Wanneer de dieren onafgebroken gedurende ten minste vier weken zijn behandeld, kunnen ook ten minste 2 000 rijpe erytrocyten per dier op het voorkomen van micronuclei 
worden gescoord. Geautomatiseerde analysesystemen (beeldanalyse 
en celsuspensiedoorstroomcytometrie) zijn aanvaardbaar als alterna ­
tief voor handmatige beoordeling, indien ze afdoende zijn gemoti ­
veerd en gevalideerd.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens moeten voor elke dier apart in tabelvorm worden ver ­
strekt. De eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk onderzocht dier worden het aantal gescoorde onrijpe erytrocyten, het aantal on ­
rijpe erytrocyten met micronuclei en het aantal onrijpe erytrocyten op 
het totale aantal apart vermeld. Wanneer de dieren onafgebroken gedurende ten minste vier weken zijn behandeld, moeten de gege ­
vens over rijpe erytrocyten ook worden vermeld als deze zijn ver ­
zameld. Voor elk dier worden de verhouding tussen het aantal on ­
rijpe erytrocyten en het totale aantal erytrocyten en, indien dit zinnig wordt geacht, het percentage van de erytrocyten met micronuclei vermeld. Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in reactie 
tussen de geslachten, kunnen de gegevens van beide geslachten voor 
de statistische analyse worden gecombineerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, 
zoals een dosisafhankelijke stijging van het aantal cellen met micro ­
nuclei of een duidelijke stijging van het aantal cellen met micronu ­
clei in één dosis-groep bij één bemonsteringstijd. In eerste instantie 
moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden geke ­
ken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt (18)(19). Statistische signifi ­
cantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve 
reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onderzoek wor ­
den gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandig ­
heden.
 
Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria 
voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.  
Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve 
resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de 
effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de micronucleustest wijzen erop dat de stof 
micronuclei induceert die ontstaan door chromosoombeschadigingen of beschadiging van het mitotisch apparaat in de erytroblasten van de 
geteste soort. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de 
testomstandigheden geen micronuclei in de onrijpe erytrocyten van de geteste soort veroorzaakt.
 
De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in 
de grote bloedsomloop of specifiek het doelweefsel terechtkomen 
(systemische toxiciteit), dient te worden besproken.  
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— motivering voor de keuze van het medium;  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort/stam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren:  
— herkomst, huisvesting, voeding enz.:  
— het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met ver ­
melding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwij ­
king van het lichaamsgewicht voor elke groep.  
Testomstandigheden:  
— gegevens over positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) con ­
troles;  
— gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;  
— gegevens over de bereiding van de teststof;  
— gegevens over de toediening van de reststof;  
— achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;  
— methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop 
of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing;  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), 
indien van toepassing;  
— gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;  
— een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemon ­
steringsschema;  
— methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;  
— methoden voor de meting van de toxiciteit;  
— criteria voor het scoren van onrijpe erytrocyten met micronuclei;  
— aantal geanalyseerde cellen per dier;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of ondui ­
delijk is.  
Resultaten:  
— tekenen van toxiciteit;  
— verhouding tussen het aantal onrijpe erytrocyten en het totale 
aantal erytrocyten;  
— aantal onrijpe erytrocyten met micronuclei, afzonderlijk vermeld 
voor elk dier;  
— gemiddelde ± standaardafwijking van het aantal onrijpe erytro ­
cyten met micronuclei per groep;  
— indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;  
— statistische analyses en gevolgde methodes;  
— gegevens over tegelijkertijd en in het verleden uitgevoerde nega ­
tieve controles;  
— gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Heddle, J.A. (1973). A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.  
(2) Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
pp. 9-15.  
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavour ­
nin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The In ­
duction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation 
Res. 123, pp. 61-118.  
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, 
M.F. and Heddle, J.A. (1990). The  In Vivo  Micronucleus As ­
say in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program, Mutation Res.. 239, pp. 29-80.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R., Choy, W.N., and Wehr, C.M. 
(1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. In: „Developments in Science and Practice of Toxicology”, Hd. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
 
(6) MacGregor, J.T., Heddle. J.A. Hite. M., Margolin, G.H.. Ra ­
mel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987). 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mam ­
malian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189, pp. 103- 122.
 
(7) MacGregor, J.T., Wehr, CM., Henika, P.R., and Shelby, M.E. 
(1990). The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T.. Kodama. Y., Sofuni. T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coates Slides. 
Mutation Res., 245, pp. 245-249.  
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). 
Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 
5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation 
Res., 278, pp. 83-98.
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 153-159.
 
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blac ­
key, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994).  In Vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mu ­
tation Res., 312, pp. 293-304.
 
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 313- 319.
 
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, 
D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose Setting in  In vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, pp. 313-319.  
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Ap ­
plication of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Mi ­
cronucleus Test. Mutation Res., 120, pp. 241-247.  
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y., Mutation Res., 120, pp. 269-275.
 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res.. 213, pp. 91-104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ra ­
tio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, 
pp. 97-99.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetics Assay. 
In: D.J. Kirkland (lid.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Re ­
commended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guideli ­
nes for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cam ­
bridge University Press, Cambridge, New York. Port Chester, 
Melbourne, Sydney, pp. 115-141.  
(19) Lovell, D.P., Anderson. D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guideli ­
nes for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14. MUTAGENITEIT — TERUGMUTATIETEST MET BACTE ­
RIËN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 471 van de OESO: Terug ­
mutatietest met bacteriën (1997).  
1.1. INLEIDING  
Bij de terugmutatietest met bacteriën worden aminozuurafhankelijke 
stammen van  Salmonella typhimurium  en Eschenchia coli  gebruikt 
voor de detectie van puntmutaties, waarbij vervanging, toevoeging of 
deletie van een of enkele DNA-basenparen optreedt (1)(2)(3). Deze 
terugmutatietest met bacteriën is gebaseerd op het beginsel dat mu ­
taties worden gedetecteerd die ertoe leiden dat in de teststammen aanwezige mutaties en daarmee de functionele capaciteit van de 
bacteriën om een essentieel aminozuur te synthetiseren worden her ­
steld. Deze teruggemuteerde bacteriën worden zichtbaar doordat ze kunnen groeien zonder het aminozuur dat de ouderstam nodig heeft.
 
Puntmutaties veroorzaken veel genetische ziekten bij de mens en het 
lijkt er sterk op dat puntmutaties in oncogenen en tumorsuppressor ­
genen van somatische cellen betrokken zijn bij het ontstaan van 
tumoren bij de mens en bij proefdieren. De terugmutatietest met bacteriën is snel, goedkoop en betrekkelijk gemakkelijk uit te voeren. Veel van de teststammen hebben verschillende kenmerken waardoor 
ze gevoeliger zijn voor de detectie van mutaties, zoals reactieve 
DNA-sequenties op de terugmutatieplaatsen, een verhoogde permea ­
biliteit van de cel voor grote moleculen en de afwezigheid van DNA- herstelsystemen of de stimulering van fout-gevoelige DNA-herstel ­
processen. De specificiteit van de teststammen kan enige nuttige 
informatie opleveren over de aard van de mutaties die door geno ­
toxische stoffen worden geïnduceerd. Er zijn zeer veel gegevens beschikbaar over de resultaten van de terugmutatietest met bacteriën 
voor een grote verscheidenheid van structuren en er zijn betrouware 
mehtodologieën ontwikkeld voor het testen van chemische stoffen met uiteenlopende fysisch-chemische eigenschappen, waaronder ook 
vluchtige stoffen.
 
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Terugmutatietest  bij Salmonella typhimurium  of Escherichia coli : 
een test voor de detectie van mutaties in een aminozuurafhankelijke stam (respectievelijk histidine of tryptofaan), waarbij een stam ont ­
staat die onafhankelijk is van een externe aminozuurbron.
 
Mutageen met basenpaarvervanging:  een stof die een wijziging 
van een base in het DNA veroorzaakt. Bij een terugmutatietest kan dit op de plaats van de oorspronkelijke mutatie of op een andere plaats in het bacteriële genoom gebeuren.
 
Mutageen met leesraamverschuiving:  een stof die invoeging of 
deletie van een of meer basenparen in het DNA veroorzaakt, waar ­
door het leesraam in het RNA wijzigt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. TOELICHTING  
Voor de terugmutatietest met bacteriën worden prokaryote cellen 
gebruikt, die in bijvoorbeeld opname, metabolisme, chromosoom ­
structuur en DNA-herstelprocessen van zoogdiercellen verschillen. 
Bij in vitro  uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole 
activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in een zoogdiercel  in vivo  niet volledig 
nabootsen. De test levert dan ook geen directe informatie op over 
de potentiële mutagene en carcinogene werking van een stof bij 
zoogdieren.
 
De terugmutatietest met bacteriën wordt meestal gebruikt als een 
eerste screening voor een genotoxische werking en met name de 
inductie van puntmutaties. Op basis van een groot aantal gegevens 
is gebleken dat veel stoffen die bij deze test positief reageren, ook bij andere tests een mutagene werking vertonen. Er zijn voorbeelden 
van mutagene stoffen die met deze test niet worden gesignaleerd; 
dit kan wellicht worden toegeschreven aan de specifieke aard van het gedetecteerde eindpunt, verschillen in metabole activering of ver ­
schillen in biologische beschikbaarheid. Anderzijds kunnen factoren 
die de gevoeligheid van de terugmutatietest met bacteriën bevorde ­
ren, leiden tot een te hoge inschatting van de mutagene werking.
 
De terugmutatietest met bacteriën zal wellicht niet geschikt zijn voor 
de beoordeling van bepaalde klassen chemische stoffen zoals sterk 
bactericide verbindingen (bv. bepaalde antibiotica) en stoffen waar ­
van vermoed wordt (of bekend is) dat ze specifiek het replicatiesys ­
teem van zoogdiercellen storen (bv. bepaalde topoisomeraseremmers en bepaalde nucleosideanalogen). In deze gevallen zullen mutatie ­
tests met zoogdiercellen wellicht geschikter zijn.
 
Hoewel veel stoffen die positief op deze test reageren, ook carcino ­
geen voor zoogdieren zijn, is de correlatie niet absoluut. De corre ­
latie is afhankelijk van de chemische klasse en er zijn carcinogenen 
die niet met deze test worden gesignaleerd omdat ze via andere niet- 
genotoxische mechanismen werken of via mechanismen die in bac ­
teriecellen ontbreken.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Suspensies van bacteriecellen worden zowel met als zonder een exo ­
geen metabool activeringssysteem aan de teststof blootgesteld. Bij de 
methode met geïntegreerde voedingsbodem worden deze suspensies 
met een topagar vermengd en direct op minimaal medium uitgeplaat. Bij de preïncubatiemethode wordt het behandelde mengsel geïncu ­
beerd en vervolgens met een topagar vermengd voordat het op mini ­
maal medium wordt uitgeplaat. Bij beide technieken worden na twee 
of drie dagen incuberen de terugmutantkolonies geteld en wordt dit aantal vergeleken met het aantal spontane terugmutantkolonies op controleplaten met oplosmiddel.
 
Er zijn verschillende procedures voor de uitvoering van de terugmu ­
tatietest met bacteriën beschreven. Het meest gebruikt worden de methode met geïntegreerde voedingsbodem (1)(2)(3)(4), de preïncu ­
batiemethode (2)(3)(5)(6)(7)(8), de fluctuatiemethode (9)(10) en de 
suspensiemethode (11). Ook wijzigingen voor het testen van gassen 
of dampen zijn beschreven (12).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
De hier beschreven procedures gelden vooral voor de methode met 
geïntegreerde voedingsbodem en de preïncubatiemethode. Beide zijn 
aanvaarbaar voor de uitvoering van experimenten zowel met als zonder metabole activering. Bij sommige stoffen verloopt de detectie efficiënter met de preïncubatiemethode. Deze stoffen behoren tot 
chemische klassen als alifatische nitrosamines met een korte keten, 
divalente metalen, aldehyden, azokleurstoffen en diazoverbindingen, pyrollizidine-alkaloïden, allylverbindingen en nitroverbindingen (3). Tevens is het bekend dat bepaalde klassen mutagene verbindingen 
niet altijd met standaardprocedures als de methode met geïntegreerde 
voedingsbodem of de preïncubatiemethode worden gesignaleerd. Deze moeten als „speciale gevallen” worden beschouwd en voor de signalering daarvan wordt sterk aangeraden andere procedures 
te gebruiken. De volgende „speciale gevallen” kunnen worden ge ­
noemd (met voorbeelden van procedures die voor deze stoffen kun ­
nen worden gebruikt): azokleurstoffen en diazoverbindingen (3)(5) ­
(6)(13), gassen en vluchtige stoffen (12)(14)(15)(16) en glycosiden 
(17)(18). Voor een afwijking van de standaardprocedure moet een 
wetenschappelijke motivering worden gegeven.
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Voorbereiding  
1.5.1.1.  Bacteriën  
Verse bacterieculturen worden gekweekt tot het laat-exponentiële of 
vroeg-stationaire groeistadium (ongeveer 10  9 cellen per ml). Culturen 
in de laat-stationaire fase mogen niet worden gebruikt. Het is van 
essentieel belang dat de bij het experiment gebruikte culturen een 
hoog gehalte aan levensvatbare bacteriën bevatten. De titer kan aan de hand van gegevens over groeicurves uit in het verleden uitge ­
voerde controles worden bepaald of door met behulp van een uit ­
plaatexperiment het aantal levensvatbare cellen te bepalen.
 
De aanbevolen incubatietemperatuur is 37  o C. 
Er moeten ten minste vijf bacteriestammen worden gebruikt. Daarbij 
moeten vier stammen van  S. typhimurium  zijn (TA 1535, TA 1537, 
TA 97a of TA 97; Ta 98: en TA 100) waarvan is aangetoond dat de 
resultaten betrouwbaar en in verschillende laboratoria reproduceer ­
baar zijn. Deze vier stammen van S. typhimunum hebben GC-basen ­
paren op de primaire terugmutatieplaats en het is bekend dat be ­
paalde oxiderende mutagenen, cross-linkende stoffen en hydrazines 
daarmee niet altijd worden gesignaleerd. Voor deze stoffen kunnen de stammen WP2 van  E. coli  of TA 102 van  S. typhimurium  worden 
gebruikt (19), die een AT-basenpaar op de primaire terugmutatie ­
plaats hebben. Als combinatie van stammen wordt derhalve aanbe ­
volen:
 
— TA 1535 van  S. typhimurium  en 
— TA 1537 of TA 97 of TA 97a van  S. typhimurium  en 
— TA 98 van  S. typhimurium  en 
— TA 100 van  S. typhimurium  en 
— WP2 uvrA van  E. coli  of WP2 uvrA (pKM101) van  E. coli  of 
TA 102 van  S. typhimurium . 
Om cross-linkende mutagenen te signaleren kan het de voorkeur 
verdienen TA 102 of een stam van  E. coli  die bedreven is in 
DNA-herstel (bv. WP2 (pKM101) van E. coli) te gebruiken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Er moeten erkende procedures voor de bereiding van voorraadcultu ­
ren, markercontrole en opslag worden gebruikt. Voor elk preparaat 
van de ingevroren voorraadcultuur moet de aminozuurafhankelijk ­
heid voor de groei worden aangetoond (histidine voor stammen van S. typhimurium  en tryptofaan voor stammen van  E. coli ). Ook 
ander fenotypekenmerken moeten worden gecontroleerd, namelijk: 
de aan- of afwezigheid van plasmiden met de R-factor, indien van toepassing (bv. resistentie tegen ampicilline bij de stammen TA 98, TA 100 en TA 97a of TA 97, WP2 uvrA en WP2 uvrA (pKM101) 
en resistentie tegen ampicilline en tetracycline bij stam TA 102); de 
aanwezigheid van karakteristieke mutaties (bv. de rfa-mutatie bij  S. 
typhimurium  door de gevoeligheid voor kristalviolet en de uvrA- 
mutatie bij  E. coli  of de uvrB-mutatie bij  S. typhimurium  door de 
gevoeligheid voor ultraviolet licht) (2)(3). Bij de stammen moeten 
ook spontane terugmutantkolonies voorkomen met een frequentie die ligt binnen het interval dat op grond van controlegegevens van het laboratorium uit het verleden kan worden verwacht en bij voorkeur 
binnen het interval dat in de literatuur wordt opgegeven.
 
1.5.1.2.  Medium  
Er wordt gebruikgemaakt van een geschikte minimale agar (bv. met 
minimaal medium E van Vogel-Bonner en glucose) en een topagar 
met histidine en bioline of tryptofaan om een aantal celdelingen 
mogelijk te maken (1)(2)(9).  
1.5.1.3.  Metabole activering  
De bacteriën dienen zowel met als zonder een geschikt metabool 
activeringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest 
gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (1)(2) of 
een combinatie van fenobarbiton en ß-naftoflavon (18)(20)(21). De 
post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een concen ­
tratie van 5 tot 30 % (v/v) in het S9-mengsel. De keuze en de omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssys ­
teem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische 
verbinding. In sommige gevallen kan het nuttig zijn meer dan een concentratie van de post-mitochondriale fractie te gebruiken. Voor azokleurstoffen en diazoverbindingen kan wellicht beter een reductief 
metabool activeringssysteem worden gebruikt (6)(13).
 
1.5.1.4.  Teststof/Bereiding  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van 
de bacteriën worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen recht ­
streeks aan het test-systeem worden toegediend en/of vóór behan ­
deling worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat op ­
slag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen worden gebruikt.  
Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof 
moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenig ­
baar zijn met het overleven van de bacteriën en de S9-activiteit (22). 
Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, 
moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen proble ­
men opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer 
stoffen worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte 
organische oplosmiddelen watervrij zijn.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Testomstandigheden  
1.5.2.1.  Teststammen (zie punt 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Blootstellingsconcentraties  
Bij de bepaling van de grootste te gebruiken hoeveelheid teststof 
moet onder andere rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit 
en de oplosbaarheid in het uiteindelijke behandelingsmengsel.  
Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren om de 
toxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen. De cytotoxiciteit kan wor ­
den bepaald aan de hand van een daling in het aantal terugmutant ­
kolonies, een opheldering of afname van de achtergrond of de mate waarin de behandelde culturen overleven. De cytotoxiciteit van een 
stof kan in aanwezigheid van een metabool activeringssysteem ver ­
anderen. De oplosbaarheid moet worden beoordeeld aan de hand van het met het blote oog zichtbare neerslaggedrag in het uiteindelijke mengsel onder de feitelijke testomstandigheden.
 
De aanbevolen maximale concentratie voor oplosbare niet-cytotoxi ­
sche stoffen is 5 mg/plaat of 5 μl/plaat. Voor niet-cytotoxische stof ­
fen die bij 5 mg/plaat of 5 μl/plaat niet oplosbaar zijn, moet een of 
meer van de geteste concentraties in het uiteindelijke behandelings ­
mengsel onoplosbaar zijn. Teststoffen die al bij lagere concentraties 
dan 5 mg/plaat of 5 μl/plaat cytotoxisch zijn, moeten tot een cyto ­
toxische concentratie worden getest. Het neerslag mag niet storen bij het scoren.
 
Er moeten ten minste vijf analyseerbare concentraties van de 
teststof worden gebruikt met ongeveer een half log-interval (d.w.z. een factor √10) tussen de concentraties voor een 
eerste experiment. Kleinere intervallen kunnen nuttig zijn 
wanneer het verband tussen concentratie en respons wordt 
onderzocht. Hogere concentraties dan 5 mg/plaat of 5 μl/plaat 
kunnen worden overwogen bij de beoordeling van stoffen die significante hoeveelheden potentieel mutagene verontreini ­
gingen bevatten.
 
1.5.2.3.  Negatieve en positieve controles  
Bij elke bepaling moeten tegelijkertijd stamspecifieke positieve en 
negatieve (oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. De concentraties van de 
positieve controle moeten zodanig worden gekozen dat voor elke 
bepaling wordt aangetoond dat deze correcte resultaten oplevert.
 
Voor bepalingen waarbij een metabool activeringssysteem wordt ge ­
bruikt, moet(en) de voor de positieve controle gebruikte referentie ­
stof(fen) op basis van de aard van de gebruikte bacteriestam worden 
gekozen.  
Voor bepalingen met metabole activering kunnen als positieve con ­
trole bijvoorbeeld worden gebruikt:  
Stof Cas-nr Einecs-nr.  
9,10-dimethylanthraceen 78l-43-l 212-308-4 
7,12-dimethylbenz[a]anthraceen 57-97-6 200-359-5 
Benzo[a]pyreen 50-32-8 200-028-5 
2-aminoantraceen 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Stof Cas-nr Einecs-nr.  
Cyclofosfamide 50-18-0 200-015-4 
Cyclofosfamide monohydraat 6055-19-2  
Voor de methode met reductieve metabole activering kan als posi ­
tieve controle worden gebruikt:  
Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Kongo rood 5 7 3-58-0 209-358-4  
2-aminoantraceen mag niet als enige indicator voor de werkzaamheid 
van het S9-mengsel worden gebruikt. Als 2-aminoantraceen wordt 
gebruikt, moet elke charge S9 ook worden gekarakteriseerd met een mutageen waarvoor metabole activering met microsomale enzymen nodig is, zoals benzo[a]pyreen of dimethylbenzant-raceen.
 
Voor bepalingen zonder exogeen metabool activeringssysteem kun ­
nen als stamspecifieke positieve controle bijvoorbeeld worden ge ­
bruikt:  
Stof CAS-nr. Einecs-nr. Stam  
Natriumazide 26628-22-S 247-852-1 TA 1535 en TA 100 
2-nitrofluoreen 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-aminoacridine 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 en TA 97a 
ICR 191 1 7070-4 5-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 en TA 97a 
Cumeenhydroper ­
oxide 80-15-9 201-254-7 TA 102 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA en TA 102 
N-ethyl-N-nitro- 
N-nitrosoguani ­
dine 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA en WP2 
uvrA(pKM101) 
4-nitroquinoline- 
1-oxide 56-5 7-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA en WP2 
uvrA(pKM101) 
Furylfuramide 
(AF2) 3688-53-7 Stammen die plasmiden bevat ­
ten 
Ook andere geschikte stoffen kunnen als positieve controle worden 
gebruikt. Waar mogelijk dient het gebruik van stoffen uit een ver ­
wante chemische klasse als positieve controle te worden overwogen.  
In het experiment dienen negatieve controles te worden opgenomen, 
waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium zonder teststof 
wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles wor ­
den gebruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden 
reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of 
mutagene effecten veroorzaakt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Uitvoering  
Voor de methode met geïntegreerde voedingsbodem (1)(2)(3)(4) zon ­
der metabole activering wordt meestal 0,05 ml of 0,1 ml testoplos ­
sing, 0,1 ml verse bacteriecultuur (met ongeveer 10  8 levensvatbare 
cellen) en 0,5 ml steriele buffer gemengd met 2,0 ml topagar. Voor 
de bepaling met metabole activering wordt meestal 0,5 ml van het metabool activeringsmengsel met een afdoende hoeveelheid post-mi ­
tochondriale fractie (tussen 5 en 30 % (v/v) in het metabole active ­
ringsmengsel) gemengd met de topagar (2,0 ml), de bacteriën en de 
test-stof/testoplossing. De inhoud van elke buis wordt gemengd en uitgegoten over het oppervlak van een minimale agarplaat. De topa ­
gar krijgt voor de incubatie de gelegenheid te stollen.
 
Voor de preïncubatiemethode (2)(3)(5)(6) wordt de teststof/ ­
testoplossing gepreïncubeerd met de teststam (met ongeveer 10  8 le­
vensvatbare cellen) en steriele buffer of het metabole activeringssys ­
teem (0,5 ml), meestal gedurende minimaal 20 minuten bij 30-37  o C, 
en vervolgens gemengd met de topagar en uitgegoten over het op ­
pervlak van een minimale agarplaat. Meestal wordt 0,05 ml of 0,1 ml teststof/testoplossing, 0,1 ml bacteriën en 0,5 ml S9-mengsel of ste ­
riele buffer gemengd met 2,0 ml topagar. De buizen dienen gedu ­
rende de preïncubatie met behulp van een schudmachine te worden belucht.
 
Om een adequate raming van de spreiding te kunnen maken moeten 
voor elk dosisniveau drie platen worden gebruikt. Het gebruik van 
twee platen is aanvaardbaar wanneer daarvoor een wetenschappelijke motivering wordt gegeven. Wanneer nu en dan een plaat verloren gaat, maakt dit de bepaling niet noodzakelijkerwijs onbruikbaar.
 
Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor 
geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (12)(14)(15)(16).
 
1.5.4.  Incubatie  
Alle platen voor een bepaling worden gedurende 48-72 uur bij 37  o C 
geïncubeerd. Na de incubatieperiode wordt het aantal terugmutant ­
kolonies per plaat geteld.  
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens worden vermeld als het aantal terugmutantkolonies per 
plaat. Daarnaast moet ook het aantal terugmutantkolonies op de 
platen voor zowel negatieve (oplosmiddel en zonder behandeling, 
indien gebruikt) als positieve controle worden vermeld. Voor zowel de teststof als de positieve en negatieve (zonder behandeling en/of oplosmiddel) controle, moeten de tellingen per plaat, het gemiddelde 
aantal terugmutantkolonies per plaat en de standaardafwijking wor ­
den vermeld.
 
Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij 
onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij 
voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Nega ­
tieve resultaten moeten per geval worden bevestigd. Wanneer een bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet daarvoor een motivering worden gegeven. Bij vervolgexperimenten 
dient wijziging van parameters te worden overwogen om de bepaling 
uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de con ­
centratie-intervallen, de wijze van behandeling (geïntegreerde voe ­
dingsbodem of preïncubatie in vloeistof) en de omstandigheden bij 
metabole activering.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, 
zoals een concentratieafhankelijke stijging op het geteste interval en/of een reproduceerbare stijging bij een of meer concentraties 
van het aantal terugmutantkolonies per plaat bij ten minste één 
stam met of zonder metabool activeringssysteem (23). In eerste in ­
stantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kun ­
nen statistische methoden worden gebruikt (24). Statistische signifi ­
cantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een positieve reactie zijn.
 
Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria 
voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.  
Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve 
resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de 
effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de terugmutatietest met bacteriën wijzen erop 
dat de teststof puntmutaties door basen-paarvervanging of leesraam ­
verschuiving in het genoom van  Salmonella typhimurium  en/of  
Escherichia coli  induceeert. Negatieve resultaten wijzen erop dat 
de stof onder de testomstandigheden bij de geteste soort niet muta ­
geen is.  
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium;  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Stammen:  
— gebruikte stammen;  
— aantal cellen per cultuur;  
— kenmerken van de stam.  
Testomstandigheden:  
— hoeveelheid teststof per plaat (in mg/plaat of ( μl/plaat) met ver ­
melding van de achtergrond voor de keuze van de dosis en het 
aantal platen per concentratie;  
— gebruikte media;  
— aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met 
inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria;  
— procedures voor de behandeling.  
Resultaten:  
— tekenen van toxiciteit;  
— neerslagverschijnselen;  
— tellingen per plaat;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— gemiddeld aantal terugmutantkolonies per plaat met de standaard ­
afwijking;  
— indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;  
— eventuele statistische analyses;  
— gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/ ­
medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, 
gemiddelde en standaardafwijking;  
— gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve 
(oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding 
van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364.
 
(2) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173- 
215. 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, pp. 217-233.
 
(4) Kier, L.D., Brusick, D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., 
Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortel ­
mans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray, V. (1986). The  
Salmonella typhimurium /Mammalian Microsomal Assay: A 
Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program. Mutation Res., 168, pp. 69-240.  
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 
pp. 91-96.
 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao. M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting 
Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner. R.C., Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York. pp. 273-285.  
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. 
and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirk ­
land, Cambridge University Press, pp. 13-61.  
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, 
pp. 167-177.  
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of 
a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. 
Mutation Res., 38, pp. 33-42.  
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and Bridges, 
J.W. (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., 
Legator, M, Nichols, W. and Ramel, C. Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, pp. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium . Environmental Mutagene ­
sis, 3, pp. 453-465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994). 
lmproved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Com ­
pounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, pp. 335-344.
 
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and 
Vaughan, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modi ­
fied Salmonella Assay. Mutation Res., 136, pp. 33-47.  
(14) Zeiger. E., Anderson, B.E.. Haworth. S., Lawlor, T. and Mor ­
telmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.
 
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutage ­
nic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.
 
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. 
(1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. 
Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and 
Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Con ­
jugates in  Salmonella typhimurium . Cancer Res., 39, pp. 3780- 
3782.  
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.
 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. 
(1990). Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains. Mutagenesis. 5, pp. 285- 
291. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: „ In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing”. Eds. F.J. de 
Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
 
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxicity As ­
says. Mutagenesis, 7, (21) pp. 175-177.  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Com ­
patibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome 
Test. Mutation Res., 88. pp. 343-350.  
(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity. Mutation Res. 189, pp. 83-91.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L, Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity testing. Part II. Statistical Eva ­
luation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cam ­
bridge University Press, pp. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B. 15.  MUTAGENITEITSONDERZOEK EN SCREENING OP 
CARCINOGENESEGENMUTATIE —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Er kunnen verschillende haploïde en diploïde stammen van de gist  
Saccharomyces cerevisiae  worden gebruikt om de door chemische 
stoffen geïnduceerde genmutaties te meten, dit zowel met als zonder metabole activering.
 
Voorwaartse mutatiesystemen bij haploïde stammen zoals de meting 
van mutatie van rode mutanten met adeninebehoefte ( ade-1, ade-2) 
naar witte mutanten met dubbele adeninebehoefte en selectieve sys ­
temen zoals de inductie van canavanine- en cycloheximideresistentie 
zijn gebruikt.  
Het meest uitgebreid gevalideerde terugwaartse mutatiesysteem 
maakt gebruik van de haploïde stam XV 185-14C welke de oker nonsens mutaties  ade 2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 en  trp 5-48 draagt die 
omkeerbaar zijn door basesubstitutiemutagenen die plaatsspecifieke 
mutaties of oker suppressor mutaties induceren. XV 185-14C heeft 
ook het his 1-7 kenmerk, een „missense” mutatie die hoofdzakelijk wordt gereverteerd door tweede-plaatsmutaties, en het  hom  3-10 
kenmerk, dat wordt gereverteerd door „frame shift”-mutagenen (ver ­
schuivingen in het leeskader).
 
Van de diploïde stammen van  S.cerevisiae  wordt alleen D7, die 
homozygoot is voor  ilv 1-92, uitgebreid gebruikt.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
V oorbereidingen  
De oplossingen van de teststof en van controle- of referentiestoffen 
dienen kort voor het uitvoeren van de test te worden bereid met 
behulp van een geschikt medium. Voor niet in water oplosbare or ­
ganische stoffen moet een oplossing van niet meer dan 2 % v/v organische oplosmiddelen, zoals ethanol, aceton of dimethylsulf ­
oxyde (DMSO) worden gebruikt. De eindconcentratie van het oplos ­
middel dient de levensvatbaarheid en de groeikarakteristieken van de 
cel niet significant te beïnvloeden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l e a c t i v e r i n g  
De cellen moeten met en zonder een geschikt exogeen metabool 
activeringssysteem aan de teststoffen worden blootgesteld.  
Het meest gebruikte systeem is een met een cofactor aangevulde 
postmitochondriale fractie bereid uit levers van knaagdieren die 
met enzyminducerende agentia zijn voorbehandeld. Het gebruik 
van andere diersoorten, weefsels, postmitochondriale fracties of pro ­
cedures kan ook geschikt zijn voor het verkrijgen van metabole activering.
 
Proefomstandigheden  
P r o e f s t a m m e n  
De haploïde stam XV 185-14 C en de diploïde stam D  7 zijn het 
meest gebruikt voor onderzoek naar genmutaties. Andere stammen kunnen eveneens geschikt zijn.
 
M e d i a  
Er worden geschikte media gebruikt voor de bepaling van overleving 
en het aantal mutaties.  
G e b r u i k v a n n e g a t i e v e e n p o s i t i e v e c o n t r o l e s  
Positieve, onbehandelde en oplosmiddelencontroles moeten parallel 
worden uitgevoerd. Voor elk specifiek mutatie-eindpunt moeten ge ­
schikte positieve controlechemicaliën worden gebruikt.  
B l o o t s t e l l i n g s c o n c e n t r a t i e s  
Er zijn ten minste vijf behoorlijk gespreide concentraties van de 
teststof vereist. Voor toxische stoffen mag de hoogste geteste con ­
centratie het overlevingspercentage niet tot minder dan 5 à 10 % verlagen. In water relatief onoplosbare stoffen dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te wor ­
den onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stof ­
fen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.
 
I n c u b a t i e o m s t a n d i g h e d e n  
De platen worden gedurende vier tot zeven dagen bij 28 tot 30  o C in 
het donker geïncubeerd.  
S p o n t a n e m u t a t i e f r e q u ë n t i e s  
Er dienen subculturen te worden gebruikt met een spontane mutatie ­
frequentie binnen de normaal aanvaarde grenzen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
A a n t a l r e p l i c a ' s  
Voor de analyse van door genmutatie geproduceerde prototrofen en 
de levensvatbaarheid van de cellen moeten per concentratie ten min ­
ste drie replicaplaten worden gebruikt. Voor proefnemingen met kenmerken zoals  hom  3-10 met een laag mutatieniveau moet het 
aantal gebruikte platen worden verhoogd, teneinde statistisch rele ­
vante gegevens te verkrijgen.
 
Uitvoering  
S. cerevisiae -stammen worden gewoonlijk behandeld in een vloei ­
stoftest met hetzij stationaire hetzij groeiende cellen. Het eerste ex ­
periment moet worden uitgevoerd met groeiende cellen. 1 — 5 × 10  7 
cellen per ml worden gedurende maximaal achttien uur bij 28 tot 
37 o C onder schudden aan de teststof blootgesteld; een passende 
hoeveelheid van een metabool activeringssysteem wordt tijdens de 
behandeling toegevoegd, waar dat van toepassing is. Na de behan ­
deling worden de cellen gecentrifugeerd, uitgewassen en uitgezaaid op een geschikt cultuurmedium. Na incubatie worden op de platen 
overleving en de inductie van genmutaties bepaald. Indien het eerste 
experiment negatief is, moet een tweede experiment worden uitge ­
voerd met stationaire cellen. Als het eerste experiment positief is, dient dit in een passend, onafhankelijk experiment te worden beves ­
tigd.
 
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding 
van het aantal getelde kolonies, het aantal mutanten, overlevings- en mutatiefrequenties. Alle resultaten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd. De gegevens moeten met behulp van een 
geschikte statistische methode worden geëvalueerd.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— gebruikte stam;  
— proefomstandigheden: stationaire fase of groeiende cellen, sa ­
menstelling van de media, incubatietemperatuur en -duur, meta ­
bool activeringssysteem;  
— behandelingsomstandigheden: blootstellingsniveaus, procedure en 
duur van de behandeling, behandelingstemperatuur, positieve en negatieve controles;
 
— aantal getelde kolonies, aantal mutanten, overlevings- en muta ­
tiefrequentie, dosis-responsverhouding (waar dat van toepassing 
is), statistische beoordeling van gegevens;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B. 16.  MITOTISCHE RECOMBINATIE — SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Mitotische recombinatie bij  Saccharomyces cerevisiae  kan worden 
vastgesteld tussen genen (of meer algemeen tussen een gen en zijn centromeer) en binnen genen. Het eerste verschijnsel wordt mitoti ­
sche overkruising genoemd en genereert reciproke producten terwijl 
het laatste verschijnsel meestal niet reciprook is en genconversie 
wordt genoemd. Overkruising kan over het algemeen worden vast ­
gesteld door de productie van recessieve homozygote kolonies of 
sectoren in een heterozygote stam terwijl genconversie wordt vast ­
gesteld door de productie van prototrofe revertanten in een auxotrofe heteroallele stam die twee verschillende defecte allelen van hetzelfde gen draagt. De voor het opsporen van mitotische genconversie meest 
gebruikte stammen zijn D
 4 (heteroalleel in  ade  2 en  trp 5), D  7 
(heteroalleel in  trp 5), BZ  34 (heteroalleel in  arg 4) en JD1 (hetero ­
alleel in  his 4 en  trp 5). Mitotische overkruising waarbij rode en roze 
homozygote sectoren worden geproduceerd, kan worden vastgesteld 
in D  5 of D  7 (waarin ook de mitotische genconversie en de terug ­
waartse mutatie in  ilv 1-92 worden gemeten), aangezien beide stam ­
men heteroalleel zijn voor complementerende allelen van ade2.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereidingen  
Oplossingen van de teststof en van controle- of referentiestoffen 
dienen kort voor het uitvoeren van de test te worden bereid met behulp van een geschikt medium. Voor niet in water oplosbare or ­
ganische stoffen moet een oplossing van niet meer dan 2 % v/v 
organische oplosmiddelen, zoals ethanol, aceton en dimethylsulf ­
oxyde (DMSO) worden gebruikt. De eindconcentratie van het oplos ­
middel dient de levensvatbaarheid en de groeikarakteristieken van de cel niet significant te beïnvloeden.
 
M e t a b o l e a c t i v e r i n g  
De cellen moeten zowel met als zonder een geschikt exogeen meta ­
bool activeringssysteem aan de teststoffen worden blootgesteld. Het 
meest gebruikte systeem is een met cofactor aangevulde postmito ­
chondriale fractie bereid uit de levers van knaagdieren die voor ­
behandeld zijn met enzyminducerende agentia. Het gebruik van an ­
dere diersoorten, weefsels, postmitochondriale fracties of procedures 
kan eveneens geschikt zijn voor het verkrijgen van metabole active ­
ring. ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Proefomstandigheden  
P r o e f s t a m m e n  
De meest gebruikte stammen zijn de diploïden D  4 , D  5 , D  7 en 
JD1. Andere stammen kunnen ook gebruikt worden.  
M e d i a  
Er worden geschikte cultuurmedia gebruikt voor de bepaling van 
overleving en de mitotische recombinatiefrequentie.  
G e b r u i k v a n n e g a t i e v e e n p o s i t i e v e c o n t r o l e s  
Positieve, onbehandelde en oplosmiddelcontroles moeten parallel 
worden uitgevoerd. Voor elk specifiek recombinatie-eindpunt moeten 
geschikte positieve controlestoffen worden gebruikt.  
B l o o t s t e l l i n g s c o n c e n t r a t i e s  
Er zijn ten minste vijf behoorlijk gespreide concentraties van de 
teststof vereist. Factoren waarmee rekening moet worden gehouden 
zijn cytotoxiciteit en oplosbaarheid. De laagste concentratie mag 
geen effect hebben op de levensvatbaarheid van de cellen. Voor toxische chemicaliën mag de hoogste geteste concentratie het over ­
levingspercentage niet tot minder dan 5 a 10 % verlagen. In water 
relatief onoplosbare chemicaliën dienen met behulp van geschikte 
methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoog ­
ste concentratie per geval te worden bepaald.
 
De cellen kunnen, hetzij in de stationaire fase hetzij tijdens de groei, 
gedurende perioden van maximaal achttien uur aan de teststof wor ­
den blootgesteld. Bij lange behandelingstijden dienen de culturen 
evenwel microscopisch te worden gecontroleerd op spoorvorming, aangezien de proef daardoor zijn waarde verliest.
 
I n c u b a t i e o m s t a n d i g h e d e n  
De platen worden in het donker gedurende vier tot zeven dagen bij 
28 tot 30  o C geïncubeerd. Platen die worden gebruikt voor het 
opsporen van door mitotische overkruising geproduceerde rode en 
roze homozygote sectoren dienen voor het tellen nog een à twee dagen in een koelkast te worden bewaard (± 4
 o C), teneinde de 
ontwikkeling van de geschikt gepigmenteerde kolonies te laten 
plaatsvinden.  
S p o n t a n e m i t o t i s c h e r e c o m b i n a t i e f r e q u e n t i e  
Er moeten subculturen worden gebruikt met een spontane mitotische 
recombinatiefrequentie binnen de normaal aanvaarde grenzen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
A a n t a l r e p l i c a ' s  
Per concentratie moeten ten minste drie replicaplaten worden ge ­
bruikt voor de bepaling van het aantal door mitotische genconversie geproduceerde prototrofen en de levensvatbaarheid van de cellen. Indien het aantal door mitotische overkruising geproduceerde reces ­
sieve homozygoten wordt bepaald, dient het aantal platen te worden 
verhoogd, opdat een voldoende aantal kolonies kan worden onder ­
zocht.
 
Uitvoering  
S. cerevisiae -stammen worden gewoonlijk in een vloeistoftest behan ­
deld en er worden hetzij stationaire hetzij groeiende cellen gebruikt. 
Het eerste experiment moet worden uitgevoerd met groeiende cellen. 1 — 5 × 10
 7 cellen per ml worden gedurende maximaal 
achttien uur bij 28 tot 37  o C onder schudden aan de teststof bloot ­
gesteld; tijdens de behandeling wordt een passende hoeveelheid van 
een metabool activeringssysteem toegevoegd, waar dat van toepas ­
sing is.  
Na de behandeling worden de cellen gecentrifugeerd, uitgewassen en 
uitgeplaat op een geschikt cultuurmedium. Na incubatie wordt op de 
platen de overleving en de inductie van mitotische recombinaties 
bepaald.  
Indien het eerste experiment negatief is, moet een tweede experiment 
worden uitgevoerd met stationaire cellen. Als het eerste experiment positief is, dient dit in een passend, onafhankelijk experiment te worden bevestigd.
 
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding 
van het aantal getelde kolonies, het aantal recombinanten, overleving 
en recombinatiefrequentie.  
Alle resultaten worden in een onafhankelijke proef bevestigd.  
De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische me ­
thode worden geëvalueerd.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— gebruikte stam;  
— proefomstandigheden: stationaire fase of groeiende cellen, sa ­
menstelling van de media, incubatietemperatuur en –duur, meta ­
bool activeringssysteem;  
— behandelingsomstandigheden: blootstellingsconcentratie, pro ­
cedure en duur van de behandeling, behandelingstemperatuur, 
positieve en negatieve controles;  
— aantal getelde kolonies, aantal recombinanten, overleving en re ­
combinatie-frequentie, dosis-responsverhouding (waar dat van toepassing is), statistische evaluatie van de gegevens;
 
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENITEIT —  IN-VITRO  GENMUTATIETEST MET 
ZOOGDIERCELLEN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 476 van de OESO: In-vitro 
genmutatietest met zoogdiercellen (1997).  
1.1. INLEIDING  
De in-vitro genmutatietest met zoogdiercellen kan worden gebruikt voor 
de detectie van genmutaties die door chemische stoffen zijn geïnduceerd. Geschikte cellijnen zijn bijvoorbeeld de L5178Y-muizenlymfoomcellen, de cellijnen CHO, CHO-AS52 en V79 van Chinese hamsters en de 
humane TK6-lymfoblastoïdcellen (1). Bij deze cellijnen zijn de meest 
gangbare genetische eindpunten: een mutatie bij thymidinekinase (TK), hypoxan-thineguanine-fosforibosyltransferase (HPRT) en transgeen xanthine-guanine-fosforibosyltransferase (XPRT). Bij de mutatietests 
met TK, HPRT en XPRT worden verschillende spectra van genetische 
gebeurtenissen gedetecteerd. Door de ligging van TK en XPRT op au ­
tosomen kunnen genetische gebeurtenissen worden gedetecteerd (bv. grote deleties) die niet op de HPRT-locus op X-chromosomen worden 
gesignaleerd (2)(3)(4)(5)(6).
 
Bij de in-vitro genmutatietest met zoogdiercellen kunnen culturen 
van permanente cellijnen of celstammen worden gebruikt. De ge ­
bruikte cellen worden geselecteerd op basis van het groeivermogen in een cultuur en de stabiliteit van de spontane mutatiefrequentie.
 
Bij in vitro  uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole 
activeringsbron worden gebruikt. Dit metabole activeringssysteem 
kan de omstandigheden in een zoogdiercel  in vivo  niet volledig 
nabootsen. Er moet goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot positieve resultaten die niet het gevolg zijn van 
intrinsieke mutageniteit, worden vermeden. Positieve resultaten die 
niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit kunnen ontstaan door veranderingen in de pH of de osmolaliteit of een sterke cyto ­
toxiciteit (7).
 
Deze test wordt gebruikt voor de screening op mogelijke mutagenen 
en carcinogenen voor zoogdieren. Veel stoffen die positief op deze 
test reageren, zijn carcinogeen voor zoogdieren, maar er is geen absolute correlatie tussen deze test en carcinogeniteit. De correlatie is afhankelijk van de chemische klasse en het lijkt er steeds meer op 
dat er carcinogenen zijn die niet met deze test worden gesignaleerd 
omdat ze blijkbaar via andere niet-genotoxische of in bacteriecellen afwezige mechanismen werken (6).
 
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Voorwaartse mutatie:  een genmutatie van het oudertype naar de 
mutantvorm die leidt tot wijziging of verlies van de enzymactiviteit of de functie van het gecodeerde eiwit.
 
Mutageen met basenpaarvervanging:  een stof die vervanging van 
een of meer basenparen in het DNA veroorzaakt.  
Mutageen met leesraamverschuiving:  een stof die invoeging of 
deletie van een of meer basenparen in het DNA-molecuul veroor ­
zaakt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Fenotypische expressietijd:  de periode gedurende welke ongewij ­
zigde genproducten uit pas gemuteerde cellen verdwijnen.  
Mutantfrequentie:  de verhouding tussen het aantal waargenomen 
mutantcellen en het aantal levensvatbare cellen.  
Relatieve totale groei: d e toename van het aantal cellen in de loop 
van de tijd in vergelijking met een controle-celpopulatie, berekend als het product van de suspensiegroei in vergelijking met de nega ­
tieve controle en de kloneringsefficiéntie in vergelijking met de ne ­
gatieve controle.
 
Relatieve suspensiegroei:  de toename van het aantal cellen tijdens 
de expressieperiode in vergelijking met de negatieve controle.  
Levensvatbaarheid:  de kloneringsefficiëntie van de behandelde cel ­
len bij het uitplaten in selectieve omstandigheden na de expressie ­
periode.  
Overleving:  de kloneringsefficiëntie van de behandelde cellen bij het 
uitplaten aan het eind van de behandelingsperiode; de overleving 
wordt meestal uitgedrukt in vergelijking met de controlecelpopulatie.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Cellen met een deficiëntie aan thymidinekinase (TK) door de mutatie 
TK+/- —> TK -/- zijn resistent voor de cytotoxische effecten van de 
pyrimidine-analoog trifluorthymidine (TFT). Cellen zonder deficiën ­
tie aan thymidinekinase zijn gevoelig voor TFT, waardoor het cel ­
metabolisme wordt geremd en er geen celdeling meer plaatsvindt. Dit betekent dat mutantcellen zich in aanwezigheid van TFT kunnen 
voortplanten en normale cellen, die thymidinekinase bevatten, niet. 
Analoog hieraan worden ook cellen met een deficiëntie aan HPRT of XPRT geselecteerd door resistentie voor 6-thioguanine (TG) of 8- azaguanine (AG). De eigenschappen van de teststof moeten zorgvul ­
dig worden bekeken als een base-analoog of een met de selecterende 
stof verwante verbinding aan een van de genmutatietests met zoog ­
diercellen wordt onderworpen. Eventuele vermoedens omtrent selec ­
tieve toxiciteit van de teststof bij mutantcellen en gewone cellen 
moeten nader worden onderzocht. Bij het testen van chemische stof ­
fen die verwant zijn met de selecterende stof moet worden bevestigd of het selectiesysteem en de selecterende stof bruikbaar zijn (8).
 
Cellen in een suspensie of een monolaagcultuur worden zowel met 
als zonder metabole activering gedurende een geschikte periode aan de teststof blootgesteld en overgeënt om de cytotoxiciteit te bepalen en fenotypische expressie mogelijk te maken alvorens de mutanten te 
selecteren (9)(10)(l l)(12)(13). De cytotoxiciteit wordt meestal be ­
paald door de relatieve kloneringsefficiëntie (overleving) of de rela ­
tieve totale groei van de culturen na de behandelingsperiode te me ­
ten. De behandelde culturen blijven een voldoende lange periode, 
kenmerkend voor elke locus en elk celtype, in groeimedium om 
een vrijwel optimale fenotypische expressie van de geïnduceerde mutaties mogelijk te maken. De mutantfrequentie wordt bepaald door bekende aantallen cellen te enten in medium met de selecte ­
rende stof voor de detectie van mutantcellen en in medium zonder de 
selecterende stof voor de bepaling van de kloneringsefficiëntie (le ­
vensvatbaarheid). Na een geschikte incubatietijd worden de kolonies geteld. De mutantfrequentie wordt bepaald aan de hand van het 
aantal mutantkolonies in het selectieve medium en het aantal kolo ­
nies in het niet-selectieve medium.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding  
1.4.1.1.  Cellen  
Er kunnen verschillende soorten cellen voor deze test worden ge ­
bruikt, zoals subklonen van de cellijnen L5178Y, CHO, CHO-AS52, 
V79 of TK6. Van de bij deze test gebruikte cellen moet worden aangetoond dat ze gevoelig zijn voor chemische mutagenen en een hoge kloneringsefficiëntie en een stabiele spontane mutantfrequentie 
hebben. De cellen moeten op besmetting met mycoplasma worden 
gecontroleerd en mogen bij besmetting niet worden gebruikt.
 
De test moet zodanig worden opgezet dat deze een vooraf bepaalde 
gevoeligheid en onderscheidingsvermogen heeft. Het aantal cellen, 
culturen en concentraties van de teststof moet aan de hand van deze 
vooraf bepaalde parameters worden gekozen (14). Het minimale aan ­
tal levensvatbare cellen dat de behandeling overleeft en bij elke fase van de test wordt gebruikt, moet op basis van de spontane mutatie ­
frequentie worden gekozen. Een vuistregel is dat het gebruikte aantal 
cellen ten minste tien keer zo groot moet zijn als de inverse van de spontane mutatiefrequentie. Aanbevolen wordt echter ten minste 10
 6 
cellen te gebruiken. Er moeten afdoende gegevens uit het verleden 
over het gebruikte celsysteem beschikbaar zijn om aan te kunnen 
nemen dat de test consistente resultaten oplevert.  
1.4.1.2.  Media en kweekomstandigheden  
Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatie ­
omstandigheden (kweekvat), temperatuur, CO  2 -concentratie, en 
vochtigheid). De media moeten worden gekozen op basis van de 
bij de test gebruikte selectieve systemen en celtypes. Het is vooral 
belangrijk dat de kweekomstandigheden zodanig worden gekozen dat de celgroei tijdens de expressieperiode en het kolonievormend ver ­
mogen van zowel de mutantcellen als de gewone cellen optimaal 
zijn.
 
1.4.1.3.  Bereiding van de culturen  
Cellen uit stamculturen worden in een kweekmedium geënt en bij 
37 o C geïncubeerd. Het is wellicht nodig reeds aanwezige mutant ­
cellen uit de cultuur te verwijderen voordat deze voor de test wordt gebruikt.
 
1.4.1.4.  Metabole activering  
De cellen dienen zowel met als zonder een geschikt metabool active ­
ringssysteem aan de teststof te worden blootgesteld. Het meest ge ­
bruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een 
cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn be ­
handeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (15)(16) ­
(17)(18) of een combinatie van fenobarbiton en β-naftoflavon (19) ­
(20).  
De post-mitochondriale fractie wordt meestal gebruikt bij een con ­
centratie van 1-10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De keuze en omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssys ­
teem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische 
verbinding. In sommige gevallen zal wellicht meer dan een concen ­
tratie van de post-mitochondriale fractie moeten worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Een aantal ontwikkelingen, bijvoorbeeld de opbouw van genetisch 
aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen tot ex ­
pressie komen, kan endogene activering mogelijk maken. Voor de keuze van de gebruikte cellijnen moet een wetenschappelijke ver ­
antwoording worden gegeven (bv. aan de hand van de relevantie van 
het cytochroom P450-isoenzym vuur het metabolisme van de test ­
stof).
 
1.4.1.5.  Teststof/Bereiding  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de behandeling van 
de cellen worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks aan het testsysteem worden toegediend en/of vóór de behandeling 
worden verdund. Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aan ­
vaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden ge ­
bruikt.
 
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Oplosmiddel/Medium  
Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof 
moeten uitgesloten zijn en het oplosmiddel/medium moet verenig ­
baar zijn met het overleven van de cellen en de S9-activiteit. Als er 
andere dan gangbare oplosmiddelen/media worden gebruikt, moeten 
gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een 
waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Wanneer stoffen 
worden getest die in water instabiel zijn, moeten de gebruikte orga ­
nische oplosmiddelen watervrij zijn. Water kan door toevoeging van een moleculaire zeef worden verwijderd.
 
1.4.2.2.  Blootstellingsconcentraties  
Bij de bepaling van de hoogste concentratie moet onder andere 
rekening worden gehouden met de cytotoxiciteit, de oplosbaarheid in het testsysteem en veranderingen in de pH of de osmolaliteit.
 
De cytotoxiciteit moet met en zonder metabole activering in het 
hoofdexperiment worden bepaald aan de hand van adequate indica ­
ties omtrent de integriteit en de groei van de cellen, zoals de rela ­
tieve kloneringsefficiëntie (overleving) of de relatieve totale groei. Het kan nuttig zijn vooraf een apart experiment uit te voeren om de 
cytotoxiciteit en de oplosbaarheid te bepalen.
 
Er moeten ten minste vier analyseerbare concentraties worden ge ­
bruikt. Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten deze concentraties 
een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken; dit betekent meestal dat de concentratieniveaus niet meer dan een factor 2 tot √10 uit elkaar mogen liggen. Als de 
maximale concentratie op cytotoxische eflecten is gebaseerd, moet 
de relatieve overleving (relatieve kloneringsefficiëntie) of de relatieve totale groei daarbij op ongeveer 10-20 % liggen (maar niet lager dan 10 %). Bij stoffen met een betrekkelijk geringe cytotoxiciteit moet de 
maximale concentratie 5 mg/ml, 5 μl/ml of 0,01 M (de laagste van 
deze drie) zijn.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Bij betrekkelijk onoplosbare stoffen moet de hoogste dosis bij of 
boven de oplosbaarheidsgrens onder de kweekomstandigheden lig ­
gen. De oplosbaarheidsgegevens moeten worden bepaald in het uit ­
eindelijke behandelingsmedium waaraan de cellen worden bloot ­
gesteld. Het kan nuttig zijn de oplosbaarheid aan het begin en het 
eind van de behandeling te bepalen, aangezien de oplosbaarheid 
tijdens de blootstelling in het testsysteem door de aanwezigheid van bijvoorbeeld cellen. S9 of serum kan veranderen. Onoplosbaar ­
heid kan met het blote oog worden geconstateerd. Het neerslag mag 
niet storen bij het scoren.
 
1.4.2.3.  Controles  
Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve 
(oplosmiddel of medium) controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. Wanneer metabole activering wordt gebruikt, moet de voor de positieve controle gebruikte che ­
mische stof activering vereisen om een mutagene reactie te ver ­
oorzaken.
 
Als positieve controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:  
Metabole activering Locus Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Zonder exogene 
metabole active ­
ring HPRT Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 
TK (kleine en 
grote kolo ­
nies) Methylmethaansulfonaat 66-27-3 200-625-0 
XPRT Ethylmethaansulfonaat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosoureum 759-73-9 212-072-2 
Met exogene me ­
tabole activering HPRT 3-Methylcholanthreen 56-49-5 200-276-4 
N-.Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-549-8 7,1 2-Dimethylbenzanthraceen 57-97-6 200-359-5 
TK (kleine en 
grote kolo ­
nies) Cyclofosfamide 50-18-0 200-015-4 
Cyclofosfamide monohydraat 6055-19-2 Benzo[ a]pyreen 50-32-8 200-028-5 
3-Methvlcholanthreen 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrosodimethylamine (voor 
hoge concentraties van S9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]pyreen 50-32-8 200-028-5
 
Ook andere geschikte referentiestoffen kunnen als positieve controle 
worden gebruikt, bijvoorbeeld 5-broom-2'-deoxyuridine (CAS-nr. 59- 14-3 en EINECS-nr. 200-415-9) als het laboratorium over referen ­
tiegegevens uit het verleden beschikt. Waar mogelijk dient het ge ­
bruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve 
controle te worden overwogen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Er dienen negatieve controles in het experiment te worden opge ­
nomen, waaraan uitsluitend het oplosmiddel of het medium wordt 
toegediend en die verder op dezelfde manier als de testgroepen worden behandeld. Daarnaast moeten er ook controles worden ge ­
bruikt waaraan niets wordt toegediend, tenzij in het verleden reeds is 
aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen schadelijke of muta ­
gene effecten veroorzaakt.
 
1.4.3.  Uitvoering  
1.4.3.1.  Behandeling met de teststof  
Delende cellen worden zowel met als zonder metabole activering aan 
de teststof blootgesteld. De blootstelling moet gedurende een ge ­
schikte periode worden uitgevoerd (meestal is drie tot zes uur vol ­
doende). De blootstelling kan een of meer celcycli beslaan.  
Voor elke concentratie kan de bepaling met één behandelde cultuur 
of in duplo worden uitgevoerd. Wanneer één cultuur wordt gebruikt, moet het aantal concentraties worden verhoogd om ervoor te zorgen dat een afdoende aantal culturen kan worden geanalyseerd (d.w.z. 
ten minste acht analyseerbare concentraties). Voor de negatieve con ­
trole (oplosmiddel) moeten duploculturen worden gebruikt.
 
Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moet een daarvoor 
geschikte methode worden gevolgd, bijvoorbeeld in een gesloten kweekvat (21)(22).
 
1.4.3.2.  Meting van de overleving, de levensvatbaarheid en de mutatiefre ­
quentie  
Aan het eind van de blootstellingsperiode worden de cellen gewas ­
sen en gekweekt om de overleving te bepalen en expressie van het mutantfenotype mogelijk te maken. Meestal wordt na de behan ­
delingsperiode begonnen met de meting van de cytotoxiciteit door 
bepaling van de relatieve kloneringsefficiëntie (overleving) of de 
relatieve totale groei van de culturen.
 
Voor elke locus is er een bepaalde minimale tijd nodig om een 
vrijwel optimale fenotypische expressie van de geïnduceerde muta ­
ties mogelijk te maken (voor HPRT en XPRT is ten minste zes tot 
acht dagen nodig en voor TK ten minste twee dagen). De cellen 
worden gekweekt in medium met en zonder de selecterende stof(fen) om respectievelijk het aantal mutanten en de kloneringsefficiëntie te bepalen. Aan het eind van de expressieperiode wordt een begin 
gemaakt met de meting van de levensvatbaarheid (gebruikt voor de 
berekening van de mutantfrequentie) door uitplating in het niet-se ­
lectieve medium.
 
Als de teststof positief reageert of de TK  +/- -test met L5178Y, moet 
bij ten minste een van de testculturen (de hoogste positieve concen ­
tratie) en bij de negatieve en positieve controles de grootte van de 
kolonies worden geïnventariseerd. Als de teststof negatief reageert op de TK
 +/- -test met L5178Y, moet bij de negatieve en positieve con ­
troles de grootte van de kolonies worden geïnventariseerd. Als de 
TK +/- -test met TK6 wordt gebruikt, kan de grootte van de kolonies 
ook worden geïnventariseerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Er moeten gegevens worden verstrekt over de bepaling van de cy ­
totoxiciteit en de levensvatbaarheid, het aantal kolonies en de mu ­
tantfrequentie bij de behandelde en de controleculturen. Als de test ­
stof positief reageert op de TK  +/- -test met L5178Y, moeten de ko ­
lonies bij ten minste één concentratie van de teststof (de hoogste positieve concentratie) en bij de negatieve en positieve controles 
worden gescoord aan de hand van de criteria voor grote en kleine 
kolonies. Er is een gedetailleerde analyse gemaakt van de molecu ­
laire en cytogenetische aard van zowel grote als kleine mutantkolo ­
nies (23)(24). Bij de TK
 +/- -test worden de kolonies gescoord aan de 
hand van de criteria voor normale groei (grote kolonies) en langzame groei (kleine kolonies) (25). Mutantcellen die de omvangrijkste ge ­
netische beschadigingen hebben opgelopen, hebben een langere ver ­
dubbelingstijd en vormen derhalve kleine kolonies. De omvang van 
deze beschadiging varieert meestal van verlies van het hele gen tot karyotypisch zichtbare chromosoomafwijkingen. Er is een verband gelegd tussen mutanten met kleine kolonies en chemische stoffen die 
grootschalige chromosoomafwijkingen induceren (26). Minder ern ­
stig aangetaste mutantcellen hebben een groeitempo dat vergelijkbaar is met de oudercellen en vormen grote kolonies.
 
De overleving (relatieve kloneringsefiiciëntie) of de relatieve totale 
groei moet worden vermeld. De mutantfrequentie moet worden uit ­
gedrukt als de verhouding tussen het aantal mutantcellen en het 
aantal overlevende cellen.  
De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daar ­
naast moet er een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden 
samengesteld.  
Een duidelijk positieve reactie behoeft niet te worden bevestigd. Bij 
onduidelijke resultaten moet nader onderzoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden. Nega ­
tieve resultaten moeten per geval worden bevestigd. Wanneer een 
bevestiging van negatieve resultaten niet nodig wordt geacht, moet 
daarvoor een motivering worden gegeven. Bij vervolgexperimenten na onduidelijke of negatieve resultaten dient wijziging van parame ­
ters te worden overwogen om de bepaling uit te breiden tot een 
breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in 
aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de concentratie-intervallen en de omstandigheden bij metabole activering.
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, 
zoals een concentratieafhankelijke of een reproduceerbare stijging 
van de mutantfrequentie. In eerste instantie moet naar de biologische 
relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt. Statistische significantie mag echter niet de enige bepalende 
factor voor een positieve reactie zijn.
 
Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria 
voldoen, wordt de stof in dit systeem als niet-mutageen beschouwd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Hoewel de meeste studies duidelijk positieve of negatieve resultaten 
zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van 
de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de in-vitro genmutatietest met zoogdiercellen 
wijzen erop dat de teststof in de gebruikte gekweekte zoogdiercellen 
oenmutaties induceert. Het duidelijkst is een positieve concentratie ­
afhankelijke respons die reproduceerbaar is. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in de gebruikte gekweekte zoogdiercellen geen genmutaties induceert.
 
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium;  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Cellen:  
— aard en herkomst van de cellen;  
— aantal celculturen;  
— aantal overentingen, indien van toepassing;  
— methoden om de celcultuur in leven te houden, indien van toe ­
passing;  
— afwezigheid van mycoplasma.  
Testomstandigheden:  
— achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal 
culturen, bijvoorbeeld gegevens over de cytotoxiciteit en be ­
perkte oplosbaarheid, indien beschikbaar;  
— samenstelling van het medium, CO  2 -concentratie;  
— concentratie van de teststof;  
— toegevoegd volume medium en teststof;  
— incubatietemperatuur;  
— incubatietijd;  
— duur van de behandeling;  
— celdichtheid bij de behandeling;  
— aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met 
inbegrip van aanvaardbaarheidscntena;  
— positieve en negatieve controles;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— lengte van de expressieperiode (met vermelding van het aantal 
geënte cellen en schema's voor enting en overenting, indien van 
toepassing;  
— selecterende stoften;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of ondui ­
delijk is;  
— methoden die zijn gebruikt om het aantal levensvatbare en mu ­
tantcellen te bepalen;  
— definitie van kolonies van een bepaalde omvang en aard (bv. 
criteria voor „kleine” en „grote” kolonies).  
Resultaten:  
— tekenen van toxiciteit;  
— neerslagverschijnselen;  
— gegevens over de pH en de osmolaliteit tijdens de blootstelling 
aan de teststof, indien bepaald;  
— grootte van een gescoorde kolonie voor ten minste de negatieve 
en positieve controles;  
— mogelijkheden van het laboratorium voor de detectie van mutan ­
ten met een kleine kolonie bij de TK  +/- -test met L5178Y, indien 
van toepassing;  
— indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;  
— eventuele statistische analyses;  
— gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/ ­
medium) en positieve controles;  
— gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve 
(oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding 
van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking;  
— mutantfrequentie.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mu ­
tagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E.H.Y. and Mailing, H.V. (1968). Mammalian Cell Ge ­
netics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In Vitro . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
61, pp. 1306-1312.
 
(3) Liber, H.I. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485.
 
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 
394-403.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C.S., and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates Mutation Res., 223, pp. 121-128.  
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, 
Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Re ­
port. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, pp. 235-239.
 
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Bru ­
sick, D., Ashby, I. and Myhr. B.C. (1991). Genotoxicity Under 
Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, pp. 147-204.
 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavou ­
min. K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells 
in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.
 
(9) Li. A.P., Gupta, R.S., Heflich. R.H. and Wasson, J.S. (1988), 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/ ­
Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.
 
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N.. Hsie. A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F.Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phospho ­
ribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, pp. 135-141.
 
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W. and Little, J.B. (1989). A Com ­
parison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, pp. 9-17.
 
(12) Stankowski, L.F.Jr., Tindall, K.R., and Hsie, A.W. (1986). 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate — and ICR 191 Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR-191 Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, pp. 133-147.
 
(13) Turner, N.T., Baltson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures 
for the L5178Y/TK  +/- — TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mu ­
tagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers. New 
York, pp. 239-268.  
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays. Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D.J., Ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.
 
(15) Abbondandolo. A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, pp. 365-373.
 
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the 
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicïty Test. Muta ­
tion Res., 31, pp. 347-364.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson. K.O., Spector. J.H.S.. Batson A.G. and 
Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. 
Mutat. Res., 59, pp. 61-108.  
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods 
for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 
pp. 173-215.  
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D.. Elcombe, C.R., Gatehouse. D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254-lnduced S9 in:  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara. K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In Vitro  Me­
tabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., 
Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot. R.M. (eds), Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88.
 
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice. R.R., Costa. D.L., Schaich. 
K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New 
York. Plenum, pp. 91-103.
 
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5. pp. 79 5-801.
 
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the 
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.  
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard. B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluo ­
rothymidine-Resistant (TFT  1 ) Mutants of L5178Y/TK  +/- Mouse 
Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, pp. 161-174.  
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little. J.B. (1990). Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, pp. 
89-102.
 
(26) Moore, M.M. and Doerr. C.L. (1990). Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Defi ­
cient Mutant Frequency in L5178Y/TK  +/- — 3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, pp. 609-614.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DNA-BESCHADIGING EN HERSTEL — DNA-HERSTELSYN ­
THESE — ZOOGDIERENCELLEN  IN VITRO  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Het onderzoek naar DNA-herstelsynthese (Unscheduled DNA Syn ­
thesis, UDS) meet de DNA-herstelsynthese na excisie en verwijde ­
ring van een DNA-streng die de door chemische en fysische agentia 
geïnduceerde beschadiging bevat. De proef is gebaseerd op de op ­
name van met tritium gemerkt thymidine (  3 H-TdR) in het DNA van 
zoogdierencellen die zich niet in de S-fase van de celcyclus bevin ­
den. De opname van  3 H-TdR kan worden bepaald met behulp van 
autoradiografie of van vloeistofscintillatietelling (liquid scintillation 
counting, LSC) van DNA uit behandelde cellen. Tenzij primaire rattenhepatocyten worden gebruikt, worden de zoogdierencellen in cultuur met en zonder een exogeen metabool activeringssysteem 
met de teststof behandeld. UDS kan eveneens in in-vivo-systemen 
worden gemeten.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereidingen  
Teststoffen en controle- of referentiestoffen moeten in groeimedium 
worden bereid of opgelost of gesuspendeerd in geschikte media en 
voor gebruik in de proef verder worden verdund in groeimedium. De uiteindelijke concentratie van het medium mag geen effect hebben 
op de levensvatbaarheid van de cel.
 
Primaire culturen van rattenhepatocyten, menselijke lymfocyten of 
permanente cellijnen (bijvoorbeeld menselijke diploïde fibroblasten) 
kunnen voor deze toets worden gebruikt.  
De cellen moeten met en zonder geschikt metabool activeringssys ­
teem aan de teststof worden blootgesteld.  
Proefomstandigheden  
A a n t a l c u l t u r e n  
Er zijn ten minste twee celculturen voor autoradiografie en zes (of 
minder als dit wetenschappelijk verantwoord is) celculturen voor 
LSC-UDS-metingen vereist voor elk punt in de proef.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
G e b r u i k v a n n e g a t i e v e e n p o s i t i e v e c o n t r o l e s  
Bij elke proef moeten parallelle positieve en negatieve (onbehan ­
delde en/of medium) controles met en zonder metabole activering worden uitgevoerd.
 
Voorbeelden van positieve controles voor de proef met rattenhepa ­
tocyten zijn onder meer 7,12-dimethylbenzathraceen (7,12-DMBA) of 2-acetylaminofluoreen (2-AAF). Voor gevestigde cellijnen is 4- 
nitroquinoline-N-oxyde (4-NQO) een voorbeeld van een positieve 
controle voor autoradiografie en LSC-proeven, uitgevoerd zonder metabole activering; wanneer metabole activeringssystemen worden gebruikt is N-dimethylnitrosamine een positieve controleverbinding.
 
B l o o t s t e l l i n g s c o n c e n t r a t i e  
Er zijn meerdere concentraties van de teststof vereist die voldoende 
gespreid moeten zijn om de respons te bepalen. De hoogste con ­
centratie moet een cytotoxisch effect veroorzaken. In water relatief onoplosbare stoffen dienen tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te 
worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische 
stoffen dient de hoogste concentratie per geval te worden bepaald.
 
C e l l e n  
Om de culturen in stand te houden moeten geschikte groeimedia, 
CO 2 -concentraties, temperatuur en vochtigheidsgraad worden ge ­
bruikt. Permanente cellijnen moeten regelmatig worden gecontro ­
leerd op  Myco-plasma  contaminatie.  
M e t a b o l e a c t i v e r i n g  
Voor primaire hepatocytculturen wordt geen metabool activerings ­
systeem gebruikt. Permanente cellijnen en lymfocyten worden met 
en zonder geschikt metabool activeringssysteem aan de teststof blootgesteld.
 
Uitvoering  
B e r e i d i n g v a n c u l t u r e n  
Permanente cellijnen worden uit stamculturen gegenereerd (bijvoor ­
beeld door trypsinebehandeling of door uitspoelen), met een ge ­
schikte dichtheid op kweekflessen uitgezaaid en geïncubeerd bij 37
 o C. 
Korte levende culturen rattenhepatocyten worden gekweekt door pas 
gedissocieerde hepatocyten in een geschikt medium te laten vast ­
hechten aan de groeiende laag.  
Menselijke lymfocytculturen worden met behulp van geschikte tech ­
nieken gemaakt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
B e h a n d e l i n g v a n d e c u l t u r e n m e t d e t e s t s t o f  
Primaire rattenhepatocyten  
Pas geïsoleerde rattenhepatocyten worden gedurende een geschikte 
periode met de teststof behandeld in een medium dat  3 H-TdR bevat. 
Na de behandelingsperiode wordt medium van de cellen verwijderd, 
de cellen worden gespoeld, gefixeerd en gedroogd. De glaasjes wor ­
den in een autoradiografische emulsie gedoopt, blootgesteld, ontwik ­
keld (als alternatief kan ook stripping film worden gebruikt), ge ­
kleurd en geteld.  
Permanente cellijnen en lymfocyten  
Autoradiografische methode: de celculturen worden voor een ge ­
schikte duur aan de teststof blootgesteld en daarna behandeld met  
3 H-TdR. De blootstellingstijd wordt bepaald door de aard van de 
stof, de activiteit van het metaboliseringssysteem en het soort cel. Om de UDS-piek op te sporen, moet het
 3 H-TdR hetzij samen met 
de teststof hetzij binnen enkele minuten na de blootstelling aan de 
teststof worden toegevoegd. De keuze tussen deze twee methoden is 
afhankelijk van een mogelijke interactie tussen teststof en  3 H-TdR. 
Teneinde een onderscheid te maken tussen UDS en semiconserva ­
tieve DNA-repIicatie kan dit laatste verschijnsel worden geremd door 
toepassing van een arginine-deficiënt medium, laag serumgehalte of 
door hydroxyurea in het cultuurmedium.  
LSC-metingen van UDS: vóór de behandeling met de teststof moet 
zoals hierboven beschreven worden voorkomen dat de cellen in de 
S-fase treden; nadien worden de cellen aan de teststof blootgesteld 
overeenkomstig de beschrijving voor autoradiografie. Na de incuba ­
tieperiode wordt het DNA uit de cellen gehaald en worden het totale 
DNA-gehalte en de  3 H-TdR-opname bepaald.  
Opgemerkt wordt dat bij gebruik van menselijke lymfocyten in de 
hierboven beschreven methoden de semiconservarieve DNA-replica ­
tie niet moet worden onderdrukt in ongestimuleerde culturen.  
Analyse  
A u t o r a d i o g r a f i s c h e a n a l y s e  
Voor de UDS-analyse van cellen in cultuur worden de S-fase kernen 
niet geteld. Per concentratie dienen ten minste 50 cellen te worden 
geteld. Voor de telling dienen de glaasjes te worden gecodeerd. Op elk glaasje moeten ver uiteenliggende, willekeurig gekozen velden worden geteld. De opgenomen hoeveelheid
 3 H-TdR in het cyto ­
plasma moet worden bepaald door telling van drie gebieden ter 
grootte van een kern in het cytoplasma van elke getelde cel.  
L S C - a n a l y s e  
Voor de LSC-UDS-analyse moet van elke concentratie en van de 
controlepopulaties een passend aantal culturen worden gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Alle resultaten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd.  
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten in tabellen worden samengevat.  
2.1. AUTORADIOGRAFISCHE ANALYSE  
De mate van  3 H-TdR-opname in het cytoplasma en het aantal aange ­
troffen korrels op de celkern moeten afzonderlijk worden vermeld.  
Gemiddelde, mediaan en modus kunnen worden gebruikt om de 
distributie van de  3 H-TdR-opname in het cytoplasma en het aantal 
korrels per kern te beschrijven.  
2.2. LSC-ANALYSE  
Voor LSC-analyses moet de  3 H-TdR-opname worden vermeld in 
dpm/μg DNA. Het gemiddeld aantal dpm/ μg DNA met standaard ­
deviatie kan worden gebruikt om de distributie van de opname te beschrijven.
 
De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische me ­
thode worden geëvalueerd.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— gebruikte cellen, dichtheid en passagegetal op het ogenblik van 
de behandeling, aantal celculturen;  
— toegepaste methode voor instandhouding van de celculturen met 
inbegrip van medium, temperatuur en CO  2 -concentratie;  
— teststof, medium, concentraties en verantwoording voor de in de 
test gebruikte concentraties;  
— gegevens over het metabole activeringssysteem;  
— behandelingsschema;  
— positieve en negatieve controles;  
— toegepaste autoradiografische techniek;  
— toegepaste methode om te voorkomen dat de cellen in de S-fase 
treden;  
— toegepaste methode voor DNA-extractie en bepaling van het 
totale DNA-gehalte in LSC-analyses;  
— indien mogelijk de dosis-responsverhouding;  
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  ZUSTERCHROMATIDEN-UlTWISSE LINGSTEST  IN VITRO  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
De zusterchromatiden-uitwisselingstest (Sister Chromatid Exchange, 
SCE), is een kortdurende proef voor het opsporen van reciproke 
DNA-uitwisselingen tussen twee zusterchromatiden van een duplice ­
rend chromosoom. SCE's zijn onderlinge uitwisselingen van DNA- replicatieproducten in ogenschijnlijk homologe loci. Vermoed wordt dat het uitwisselingsproces verband houdt met een DNA-breuk en 
-hereniging, ofschoon weinig bekend is over de moleculaire basis 
ervan. Om SCE's op te sporen moet een middel beschikbaar zijn om zusterchromatiden verschillend te merken. Dat kan gebeuren 
door gedurende twee celcycli broomdeoxyuridine (BrdU) in her 
chromosomaal DNA in te brengen.
 
In-vitro zoogdierencellen worden met en zonder een exogeen meta ­
bool activeringssysteem verkregen uit zoogdieren aan de teststof 
blootgesteld en gedurende twee replicatiecycli in een BrdU-bevattend 
medium gekweekt. Na behandeling met een „spindle”-remmer (bij ­
voorbeeld colchicine) om cellen in een metafaseachtig stadium van de mirose (c-metafase) te verzamelen, worden de cellen gewonnen 
en chromosoompreparaten gemaakt.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
— Voor de test kunnen primaire culturen (menselijke lymfocyten) of 
gevestigde cellijnen (bij voorbeeld ovariumcellen van de Chinese 
hamster) worden gebruikt. De cellijnen moeten worden gecontro ­
leerd op  Mycoplasma -contaminatie.  
— Er moeten geschikte cultuurmedia en incubaneomstandigheden 
worden gebruikt (bijvoorbeeld temperatuur, cultuurflessen, CO  2 - 
gehalte en vochtigheidsgraad).  
— Vóór de behandeling van de cellen dienen de reststoffen te wor ­
den klaargemaakt in cultuurmedia of opgelost of gesuspendeerd 
in geschikte middelen. De uiteindelijke concentratie van een me ­
dium in het cultuursysteem mag geen significante invloed hebben op de levensvatbaarheid of de groeisnelheid van de cel en effec ­
ten op de SCE-frequentie moeten door middel van een oplosmid ­
del controle worden nagegaan.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— De cellen moeten met en zonder exogeen metabool activerings ­
systeem bereid uit zoogdieren aan de reststoffen worden bloot ­
gesteld. Indien evenwel cellen met intrinsieke metabole activiteit worden gebruikt, moeten de aard en de omvang van de activiteit geschikt zijn voor de te onderzoeken chemische klasse.
 
1.6.2.  Proefomstandigheden  
A a n t a l c u l t u r e n  
Voor elk punt in de proef moeten culturen ten minste in tweevoud 
worden gebruikt.  
G e b r u i k v a n p o s i t i e v e e n n e g a t i e v e c o n t r o l e s  
Positieve controles waarbij gebruik wordt gemaakt van een direct 
werkende stof en een stof die metabole activering vereist, moeten bij elke proefneming worden uitgevoerd: er dient eveneens een me ­
diumcontrole te worden gebruikt.
 
Hierna volgen voorbeelden van stoffen die als positieve controle 
kunnen worden gebruikt:  
— direct werkende stof:  
— ethylmethaansulfonaat,  
— niet-rechtstreeks werkende stof:  
— cyclofosfamide.  
Waar dar van toepassing is, kan ook een aanvullende positieve con ­
trole van dezelfde chemische klasse als de te onderzoeken stof wor ­
den meegenomen.  
B l o o t s t e l l i n g s c o n c e n t r a t i e  
Er zijn ten minste drie behoorlijk gespreide concentraties van de 
teststof vereist. De hoogste concentratie moet een duidelijk toxisch effect veroorzaken en moet laag genoeg zijn om een goede celrepli ­
catie te doen plaatsvinden. In water relatief onoplosbare stoffen die ­
nen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaar ­
heidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water oplosbare niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per geval te wor ­
den bepaald.
 
1.6.3.  Uitvoering  
B e r e i d i n g v a n c u l t u r e n  
Permanente cellijnen worden gegenereerd uit stamculturen (bijvoor ­
beeld door trypsinebehandeling of uitspoelen), met een geschikte dichtheid uitgezaaid in kweekflessen en geincubeerd bij 37
 o C. 
Voor eenlagige culturen moet het aantal cellen per kweekfles worden 
aangepast zodat de culturen op het tijdstip van winning niet veel meer dan 50 % confluent zijn. Anderzijds kunnen cellen worden gebruikt in een suspensiecultuur. Culturen van menselijke lymfocy ­
ten worden met behulp van geschikte technieken opgezet uit gehe ­
pariniseerd bloed en bij 37
 o C geïncubeerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
B e h a n d e l i n g  
Cellen in exponentiële groeifase worden voor een geschikte duur 
blootgesteld aan de teststof; in de meeste gevallen volstaan een tot twee uur maar in bepaalde gevallen mag de behandelingstijd worden verlengd tot maximaal twee complete celcycli. Cellen zonder toerei ­
kende intrinsieke metabole activiteit moeten met en zonder geschikt 
metabool activeringssysteem aan de teststof worden blootgesteld. Na de blootstellingsperiode worden de teststoffen van de cellen gewas ­
sen en worden de cellen gedurende twee replicatieronden in aan ­
wezigheid van BrdU in cultuur gebracht. Een andere methode is 
de cellen gedurende de volledige cultuurtijd van twee celycli gelijk ­
tijdig bloot te stellen aan de teststof en aan BrdU.
 
Culturen van menselijke lymfocyten worden behandeld terwijl ze 
zich in een semisynchrone staat bevinden.  
De cellen worden geanalyseerd in de tweede deling na de behan ­
deling omdat het dan zeker is dat de gevoeligste fasen van de cel ­
cyclus aan de teststof zijn blootgesteld. Alle culturen waaraan BrdU 
is toegevoegd, moeten tot aan de winning van de cellen in het 
donker of in geschemerd licht van gloeilampen worden behandeld, teneinde de fotolyse van BrdU-bevattend DNA tot een minimum te beperken.
 
W i n n i n g v a n d e c e l l e n  
De celculturen worden een tot vier uren voor het winnen behandeld 
met een „spindle”-remmer (bijvoorbeeld colchicine). Elke cultuur 
wordt afzonderlijk gewonnen en bewerkt met het oog op het prepa ­
reren van chromosomen.  
C h r o m o s o o m p r e p a r a t i e e n k l e u r i n g  
Chromosoompreparaten worden gemaakt met behulp van standaard ­
cytogenetische technieken. De glaasjes kunnen met behulp van di ­
verse technieken (bij voorbeeld fluorescentie plus Giemsa-methode) worden gekleurd om de SCE's aan te tonen.
 
A n a l y s e  
Het aantal te analyseren cellen dient te zijn gebaseerd op de door 
controleproeven bepaalde spontane SCE-frequentie. Gewoonlijk wor ­
den ten minste 25 goed gespreide metafasen per cultuur geanalyseerd 
op SCE's. De glaasjes worden voor de analyse gecodeerd. Voor menselijke lymfocyten worden uitsluitend metafasen geanalyseerd die 46 centromeren bevatten. Voor gevestigde cellijnen worden uit ­
sluitend metafasen geanalyseerd die ± 2 centromeren van het modale 
aantal bevatten. Er moet worden vermeld of een centromere ver ­
andering van kenmerk als SCE wordt beschouwd of niet. De resul ­
taten moeten in een onafhankelijke proef worden bevestigd.
 
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten in tabellen worden samengevat. Voor alle be ­
handelde en controleculturen moet het aantal SCE's in elke metafase en het aantal SCE's per chromosoom in elke metafase afzonderlijk worden vermeld.
 
De gegevens moeten met behulp van een geschikte statistische me ­
thode worden geëvalueerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag van de proefneming moeten de volgende gegevens 
worden opgenomen:  
— gebruikte cellen, methoden voor het in stand houden van de 
celculturen;  
— proefomstandigheden: samenstelling van cultuurmedia, CO  2 -con­
centratie, concentratie van de teststof, gebruikt oplosmiddel, in ­
cubatietemperatuur, behandelingstijd, toegepaste „spindle”-rem ­
mer, de concentratie ervan en de duur van de behandeling, ge ­
bruikte soort metabool activeringssysteem bereid uit zoogdieren, positieve en negatieve controles;
 
— aantal celculturen per punt in de proef;  
— nadere gegevens omtrent de toegepaste techniek voor het prepa ­
reren van glaasjes;  
— aantal geanalyseerde metafasen (de gegevens dienen voor elke 
cultuur afzonderlijk te worden vermeld);  
— gemiddeld aantal SCE's per metafase en per chromosoom (de 
gegevens dienen voor elke cultuur afzonderlijk te worden ver ­
meld);  
— criteria voor het tellen van SCE's;  
— verantwoording voor de gekozen dosis;  
— dosis-responsverhouding (indien mogelijk);  
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  GESLACHTSGEBONDEN RECESSIEVE LETALITEITSTEST 
MET  DROSOPH1LA MELANOGASTER  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Het onderzoek naar geslachtsgebonden recessieve letaliteit (Sex-lin ­
ked recessive lethaltest, SLRL) waarbij  Drosophila melanogaster  
wordt gebruikt, spoort mutaties, zowel puntsmutaties als kleine de ­
leties, in de geslachtslijn van het insekt op. Deze test is een voor ­
waartse mutatietest waarmee kan worden gezocht naar mutaties in circa 800 loci op het X-chromosoom. Dat is circa 80 % van alle X- 
chromosoomloci. Het X-chromosoom vertegenwoordigt circa een 
vijfde van het gehele haploïde genoom.
 
Mutaties in het X-chromosoom van  Drosophila melanogaster  komen 
fenotypisch tot uiting bij mannetjes die drager zijn van het mutant 
gen. Indien de mutatie letaal is in de homozygote staat wordt dit afgeleid uit het ontbreken van een klasse mannelijke nakomelingen van de twee die normaal door een heterozygoot vrouwtje worden 
voortgebracht. Bij de SLRL-toets wordt van deze feiten gebruik 
gemaakt door middel van speciaal gemerkte en gerangschikte chro ­
mosomen.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereidingen  
S t a m c u l t u r e n  
Mannetjes van een goed gedefinieerd wild-type stamcultuur en 
vrouwtjes van de Muller-5 stamcultuur kunnen worden gebruikt. Andere goed gemerkte vrouwelijke stamculturen met meermaals 
geïnverteerde X-chromosomen kunnen eveneens worden gebruikt.
 
T e s t s t o f  
De teststoffen dienen in water te worden opgelost. In water onoplos ­
bare stoffen kunnen in geschikte media worden opgelost of gesus ­
pendeerd {bijvoorbeeld een mengsel van ethanol en Tween-60 of 80) en voor de toediening worden verdund in water of een zoutoplos ­
sing. Dimethylsulfoxyde (DMSO) moet als medium worden ver ­
meden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
A a n t a l d i e r e n  
De proef moet worden opgezet met een vooraf bepaalde gevoelig ­
heid en statistische kracht. De tijdens de desbetreffende controle waargenomen spontane mutatiefrequentie zal het aantal te analyseren behandelde chromosomen in sterke mate beïnvloeden.
 
T o e d e n i n g s w e g  
Blootstelling kan oraal geschieden, door injectie of door blootstelling 
aan gassen of dampen. De teststof kan ook als voedsel worden toe ­
gediend in een suikeroplossing. Waar dat nodig is kunnen de stoffen 
worden opgelost in een 0,7 % natriumchlorideoplossing en in de 
thorax of abdomen worden geïnjecteerd.  
G e b r u i k v a n n e g a t i e v e e n p o s i t i e v e c o n t r o l e s  
Negatieve (medium) en positieve controles moeten worden meegeno ­
men. Indien evenwel in het laboratorium geschikte controlegegevens 
uit het verleden beschikbaar zijn, behoeven geen parallelle controles te worden uitgevoerd.
 
B l o o t s t e l l i n g s n i v e a u  
Drie blootstellingsniveaus moeten worden gebruikt. Voor een voor ­
bereidende beoordeling kan met een blootstellingsniveau van de test ­
stof worden volstaan. Dat blootstellingsniveau is hetzij de hoogste getolereerde concentratie of de concentratie waarbij zich enige teke ­
nen van toxiciteit voordoen. Voor niet-toxische stoffen dient een 
blootstelling tot maximale concentratie die uitvoerbaar is te worden gebruikt.
 
U i t v o e r i n g  
Wild-type mannetjes (drie tot vijf dagen oud) worden met teststof 
behandeld en individueel gepaard met een overmaat aan niet-gedekte vrouwtjes van de Muller-5 stamcultuur of van een andere goed ge ­
merkte (met meervoudig geïnverteerde X-chromosomen) stamcul ­
tuur. Om de twee à drie dagen worden de vrouwtjes vervangen 
door andere niet-gedekte vrouwtjes, teneinde de volledige geslachts ­
celcyclus te bestrijken. Bij de nakomelingen van deze vrouwtjes worden letale effecten opgespoord die overeenstemmen met de ef ­
fecten op rijp sperma, spermatiden in vroeg, midden of laat stadium, 
spermatocyten en spermatogonia op het ogenblik van de behan ­
deling.
 
Heterozygote F  1 -vrouwtjes uit de hierboven beschreven kruising 
worden individueel gepaard (dat wil zeggen een vrouwtje per fles) 
met hun broertjes. In de F  2 -generatie wordt in elke cultuur de afwe ­
zigheid van wild-type mannetjes onderzocht. Indien een cultuur lijkt te zijn ontstaan uit een F
 1 -vrouwtje dat een letaal kenmerk in het 
ouderlijk X-chromosoom draagt (dat wil zeggen er worden geen 
mannetjes met het behandelde chromosoom aangetroffen), dienen 
dochters van dat vrouwtje met hetzelfde genotype te worden onder ­
zocht, teneinde na te gaan of de letaliteit in de volgende generatie 
wordt herhaald.  
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten in tabellen worden samengevat met vermelding 
van het aantal geteste X-chromosomen, het aantal niet-vruchtbare 
mannetjes en het aantal letale chromosomen voor elke blootstellings ­
concentratie en voor elke paringsperiode van elk mannetje. Per man ­
netje dient het aantal groepen van verschillende omvang te worden 
vermeld. De resultaten moeten in een afzonderlijke proef worden 
bevestigd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
De geslachtsgebonden recessieve letaliteitstest moet met behulp van 
geschikte statistische methoden worden geëvalueerd. Groeperingen 
van uit een mannetje ontstane recessief letalen moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden behandeld en geëva ­
lueerd.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— stamcultuur: gebruikte Drosophilastammen, leeftijd van de insek ­
ten, aantal behandelde mannetjes, aantal steriele mannetjes, aantal gevormde F
 2 -culturen, aantal F  2 -culturen zonder nakomelingen, 
aantal in elke geslachtscelfase aangetroffen chromosomen met 
een letaal kenmerk;  
— criteria voor de bepaling van de omvang van de behandelde 
groepen;  
— proefomstandigheden: gedetailleerde beschrijving van het behan ­
delings- en bemonsteringsschema, blootstellingsniveaus, toxici ­
teitsgegevens, negatieve (oplosmiddel) en positieve controles (waar dat van toepassing is);
 
— criteria voor het tellen van letale mutaties;  
— blootstelling/effectverhouding (indien mogelijk);  
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  ZOOGDIERENCELTRANSFORMATI ETEST  IN VITRO  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Cultuursystemen van zoogdierencellen kunnen worden gebruikt voor 
het onderzoek van fenotypische veranderingen  in vitro  die worden 
geïnduceerd door chemische stoffen die betrokken zijn bij maligne transformaties  in vivo . Algemeen gebruikte cellen zijn onder meer 
C3H10T½, 3T3, SHE, en Fischer-rat. De test is gebaseerd op wij ­
zigingen in de celmorfologie, focusvorming of wijzigingen in de afhankelijkheid van de aanhechting in halfvast agar. Er bestaan an ­
dere, minder gebruikte systemen die andere fysiologische of morfo ­
logische wijzigingen in cellen ten gevolge van blootstelling aan car ­
cinogene chemische stoffen opsporen. Van geen van de eindpunten van de  in-vitro -proef staat vast dat er een mechanistische band is met 
kanker. Met enkele testsystemen kunnen tumorpromotoren worden 
opgespoord. Cytotoxiciteit kan worden bepaald door meting van het 
effect van de teststof op de kolonievorming (cloningsefficiëntie) of de groeisnelheid van de culturen. De cytotoxiciteitsbepaling kan worden gebruikt om vast te stellen dat blootstelling aan de teststof 
een toxisch effect heeft gehad, maar kan niet in alle testen worden 
gebruikt om de transformatiefrequentie te berekenen, aangezien voor sommige testen een langere incubatie en/of opnieuw uitplaten nood ­
zakelijk kunnen zijn.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereidingen  
C e l l e n  
Een verscheidenheid aan cellijnen of primaire cellen is beschikbaar 
afhankelijk van de toegepaste transformatietest. De onderzoeker moet nagaan of de cellen voor de uit te voeren proef na blootstelling aan 
bekende carcinogenen de juiste fenotypische wijzigingen vertonen en 
dient ervoor te zorgen dat de validiteit en betrouwbaarheid van de in zijn laboratorium uitgevoerde test aangetoond en gedocumenteerd wordt.
 
M e d i u m  
De gebruikte media en proefomstandigheden dienen geschikt te zijn 
voor de uit te voeren transformatietesten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
T e s t s t o f  
De teststof mag in cultuurmedia worden bereid of voor de behan ­
deling van de cellen worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte middelen. De uiteindelijke concentratie van het (oplos)middel in het cultuursysteem mag de levensvatbaarheid van de cellen, de groei ­
snelheid of de mate van voorkomen van transformaties niet beïn ­
vloeden.
 
M e t a b o l e a c t i v e r i n g  
De cellen dienen met en zonder geschikt metabool activeringssys ­
teem aan de teststof te worden blootgesteld. Indien evenwel celsoor ­
ten worden gebruikt met een intrinsieke metabole activiteit, moet worden nagegaan of de aard van de activiteit geschikt is voor de onderzochte chemische klasse.
 
Proefomstandigheden  
G e b r u i k v a n p o s i t i e v e e n n e g a t i e v e c o n t r o l e s  
Voor elke proef moet een positieve controle worden uitgevoerd 
waarbij zowel een rechtstreeks werkende verbinding als een verbin ­
ding die metabole activering vereist, moeten worden meegenomen: 
er dient eveneens een negatieve (oplos)middelcontrole te worden gebruikt.
 
Hierna volgen voorbeelden van stoffen die als positieve controle 
kunnen worden gebruikt:  
— Direct werkende stoffen:  
— ethylmethaansulfonaat,  
— β-propiolacton;  
— Verbindingen die metabole activering vereisen:  
— 2-acetylaminofluoreen,  
— 4-dimethylaminoazobenzeen,  
— 7,12-dimethylbenzanthraceen.  
Wanneer dat van toepassing is, dient een aanvullende positieve con ­
trole van dezelfde chemische klasse als de teststof te worden uitge ­
voerd.  
B l o o t s t e l l i n g s c o n c e n t r a t i e s  
Meerdere concentraties van de teststof moeten worden gebruikt. 
Deze concentraties moeten een concentratieafhankelijk toxisch effect veroorzaken waarbij de hoogste concentratie een laag overlevingspeil 
geeft en de overleving in de laagste concentratie nagenoeg dezelfde 
is als die in de negatieve controle. In water relatief onoplosbare stoffen dienen met behulp van geschikte methoden tot de uiterste oplosbaarheidsgrens te worden onderzocht. Voor volledig in water 
oplosbare, niet-toxische stoffen dient de hoogste concentratie per 
geval te worden bepaald.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Uitvoering  
De cellen moeten voldoende lang worden blootgesteld. De tijd is 
afhankelijk van het toegepaste testsysteem en bij langere blootstel ­
lingstijden kan het noodzakelijk zijn een nieuwe dosis toe te dienen en gelijktijdig het medium te veranderen (met indien noodzakelijk 
een vers metabool activeringsmengsel). Cellen met een ontoerei ­
kende intrinsieke metabole activiteit moeten met en zonder een ge ­
schikt metabool activeringssysteem aan de teststof worden bloot ­
gesteld. Na de blootstellingsperiode wordt de teststof van de cellen 
gewassen en worden de cellen op cultuurmedia gebracht onder om ­
standigheden die gunstig zijn om het verschijnen van getransfor ­
meerde fenotypes te controleren en wordt de mate van voorkomen van de transformaties bepaald. Alle resultaten worden in een on ­
afhankelijke proef bevestigd.
 
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten in tabellen worden samengevat en kunnen naar 
gelang van de gebruikte toets in diverse vormen worden voorgesteld, bijvoorbeeld plaattellingen, positieve platen of aantal getransfor ­
meerde cellen. Wanneer dat van toepassing is, dient de overleving 
te worden uitgedrukt als een percentage van het controleniveau en de 
transformatiefrequentie als het aantal transformaties per aantal over ­
levenden. De gegevens moeten met behulp van een geschikte statis ­
tische methode worden geëvalueerd.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag van de proef moeten, indien mogelijk, de volgende 
gegevens worden opgenomen:  
— gebruikt celtype, aantal celculturen, methode voor het in stand 
houden van celculturen;  
— proefomstandigheden: concentratie van de teststof, gebruikt (op ­
los)middel, incubatietemperatuur, incubatietijd, duur en frequen ­
tie van de behandeling, celdichtheid tijdens de behandeling, type 
van het gebruikte exogeen metabool activeringssysteem, posi ­
tieve en negatieve controles, specificatie van het onderzochte fenotype, gebruikt selectief systeem (wanneer dat van toepassing 
is); verantwoording voor de keuze van de doses;
 
— gebruikte methode voor het tellen van het aantal levensvatbare en 
getransformeerde cellen;  
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  ONDERZOEK NAAR DOMINANTE LETALE MUTATIES BIJ 
KNAAGDIEREN  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Dominante letale effecten veroorzaken de dood van het embryo of 
van de foetus. De inductie van dominante letale mutaties door bloot ­
stelling aan een chemische stof wijst erop dat de stof het geslachts ­
weefsel van de proefdiersoort heeft aangetast. Algemeen wordt aan ­
genomen dat dominante letale mutaties het gevolg zijn van bescha ­
diging van de chromosomen (structurele en numerieke anomalieën). 
Als vrouwtjes worden behandeld, kan de dood van het embryo even ­
eens het gevolg zijn van toxische effecten.  
In het algemeen worden mannetjes aan de teststof blootgesteld en 
met niet-behandelde, niet-gedekte vrouwtjes gepaard. De diverse ge ­
slachtscelstadia kunnen door middel van geregelde intervallen in de paring afzonderlijk worden onderzocht. De toename van het aantal dode implantaten per vrouwtje in de behandelde groep in vergelij ­
king met het aantal dode implantaten per vrouwtje in de contro ­
legroep geeft het verlies na implantatie weer. Het verlies voor im ­
plantatie kan worden geschat op grond van tellingen van de corpora lutea of door het totale aantal implantaten per vrouwtje in de behan ­
delde en de controlegroep met elkaar te vergelijken. Het totale do ­
minante letale effect is de som van het verlies voor en na de im ­
plantatie. De berekening van het totale dominante letale effect is 
gebaseerd op de vergelijking van de levende implantaten per vrouw ­
tje in de testgroep met de levende implantaten per vrouwtje in de controlegroep. Een vermindering van het aantal implantaten op be ­
paalde tijdstippen kan het gevolg zijn van het doodgaan van cellen 
(bijvoorbeeld van spermatocyten en/of spermatogonia).
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereidingen  
Zo mogelijk moeten de teststoffen in een isotone zoutoplossing wor ­
den opgelost of gesuspendeerd. Niet in water oplosbare chemische stoffen kunnen in geschikte (oplos)middelen worden opgelost of gesuspendeerd. Het gebruikte (oplos)middel mag niet met de teststof 
interfereren en mag ook geen toxische effecten produceren. Er die ­
nen verse bereidingen van de teststof te worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Proefomstandigheden  
T o e d i e n i n g s w e g  
De teststof moet in het algemeen slechts eenmaal worden toegediend. 
Op grond van toxicologische gegevens kan een schema met her ­
haalde behandelingen worden gebruikt. De normale toedienings ­
wegen zijn orale intubatie of intraperitoneale injectie. Andere toedie ­
ningswegen kunnen eveneens geschikt zijn.  
P r o e f d i e r e n  
Ratten of muizen worden als proefdieren aanbevolen. Gezonde, ge ­
slachtelijk volledig rijpe dieren worden willekeurig ingedeeld in te 
behandelen groepen en controlegroepen.  
A a n t a l e n g e s l a c h t  
Er dient een passend aantal behandelde mannetjes te worden ge ­
bruikt, rekening houdend met de spontane variatie van het te onder ­
zoeken biologische kenmerk. Het gekozen aantal moet gebaseerd zijn op de van tevoren vastgestelde detectiegevoeligheid en significantie. Zo moet bijvoorbeeld bij een kenmerkende test het aantal mannetjes 
in elke dosisgroep voldoende zijn om per paringsinterval 30 à 50 
drachtige vrouwtjes te hebben.
 
N e g a t i e v e e n p o s i t i e v e c o n t r o l e s  
In het algemeen moet elk experiment parallelle positieve en nega ­
tieve (oplos)middelcontroles omvatten. Indien aanvaardbare positieve 
controleresultaten uit het recente verleden van in hetzelfde laborato ­
rium verrichte experimenten beschikbaar zijn, kunnen deze worden gebruikt in plaats van een parallelle positieve controle. Positieve 
controlestoffen moeten in een voldoende lage dosis (bijvoorbeeld 
MMS, i.p., bij 10 mg/kg) worden gebruikt om de gevoeligheid van de test aan te tonen.
 
D o s i s n i v e a u s  
Normaliter moeten drie dosisniveaus worden gebruikt. De hoge dosis 
moet bij de behandelde dieren tekenen van toxiciteit of verminderde vruchtbaarheid teweegbrengen. In sommige gevallen kan met één enkele hoge dosis worden volstaan.
 
H o o g s t e t e t e s t e n d o s i s  
Niet-toxische stoffen moeten in doses van 5 g/kg bij één enkele 
toediening of in doses van 1 g/kg/dag bij herhaalde toediening wor ­
den getest.  
Uitvoering  
Er zijn diverse behandelingsschema's beschikbaar. Enkelvoudige toe ­
diening van de teststof is de meest toegepaste methode. Er kunnen ook andere behandelingsschema's worden gebruikt.
 
Na de behandeling laat men individuele mannetjes opeenvolgend na 
geschikte intervallen, met een of twee niet-behandelde, nog niet-ge ­
dekte vrouwtjes paren. De vrouwtjes moeten bij de mannetjes wor ­
den gelaten gedurende ten minste één volledige oestruscyclus of tot op het ogenblik dat de paring heeft plaatsgevonden, hetgeen wordt 
bepaald door de aanwezigheid van sperma in de vagina of door de 
aanwezigheid van een vaginale plug.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Het aantal paringen na de behandeling is afhankelijk van het behan ­
delingsschema en moet groot genoeg zijn om alle geslachtscelstadia 
na de behandeling te kunnen onderzoeken.  
De vrouwtjes worden in de tweede helft van de dracht gedood en de 
inhoud van de uterus wordt onderzocht om het aantal dode en le ­
vende implantaties te bepalen. Ook de eierstokken kunnen worden onderzocht om het aantal corpora lutea te bepalen.
 
2. GEGEVENS  
De volgende gegevens moeten in tabellen worden weergegeven: aan ­
tal mannetjes, aantal drachtige vrouwtjes en aantal niet-drachtige 
vrouwtjes. De resultaten van elke paring, met inbegrip van de iden ­
titeit van elk mannetje en elk vrouwtje, moeten afzonderlijk worden gerapporteerd. Voor elk vrouwtje moet de week van de paring, het 
dosisniveau van het mannetje en de frequentie van levende en dode 
implantaten worden aangegeven.
 
De berekening van het totale dominante letale effect is gebaseerd op 
de vergelijking van de levende implantaten per vrouwtje in de test ­
groep met de levende implantaten per vrouwtje in de controlegroep. 
De verhouding tussen dode en levende implantaten bij de behandelde 
groep, vergeleken met dezelfde verhouding bij de controlegroep, wordt geanalyseerd om het verlies na implantatie na te gaan.
 
Als de gegevens van vroegtijdige en laattijdige sterften worden ge ­
registreerd, moet dat uit de tabellen duidelijk blijken. Als het verlies 
vóór implantatie wordt geschat, moet dat worden gerapporteerd. Het 
verlies vóór implantatie kan worden berekend als een discrepantie tussen het aantal corpora lutea en het aantal implantaten of als een daling van het gemiddelde aantal implantaten per uterus in vergelij ­
king met controleparingen.
 
De gegevens worden met behulp van geschikte statistische methoden 
geëvalueerd.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— diersoort, stam, leeftijd en gewicht van de gebruikte dieren, aan ­
tal dieren van elk geslacht in de experimentele en controlegroe ­
pen; 
— teststof, (oplos)middel, geteste dosisniveaus en verantwoording 
voor de selectie van de dosering, negatieve en positieve contro ­
les, gegevens over de toxiciteit;  
— expositiewijze en -duur;  
— paringsschema;  
— gebruikte methode om te bepalen dat de paring heeft plaats ­
gevonden;  
— tijdstip waarop de dieren worden gedood;  
— criteria voor de beoordeling van dominante letale mutaties;  
— dosis/responsverhouding (waar dat van toepassing is);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  TEST OP CHROMOSOOMAFWIJKINGEN IN SPERMATOGO ­
NIA VAN ZOOGDIEREN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 48 3 van de OESO: Test op 
chromosoomafwijkingen in spermatogonia van zoogdieren (1997).  
1.1. INLEIDING  
De in-vivotest op chromosoomafwijkingen in spermatogonia van 
zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen welke stoffen structurele 
chromosoomafwijkingen in spermatogonia van zoogdieren veroor ­
zaken (1)(2)(3)(4)(5). Er zijn twee soorten structurele afwijkingen: 
het chromosoomtype en het chromatidetype. De meeste chemische 
mutagenen veroorzaken afwijkingen van het chromatidetype, maar ook het chromosoomtype komt voor. Deze methode is niet bedoeld om numerieke afwijkingen te meten en wordt meestal niet voor dat 
doel gebruikt. Chromosoommutaties en soortgelijke voorvallen ver ­
oorzaken veel genetische ziekten bij de mens.
 
Bij deze test wordt gemeten wat er met de chromosomen van be ­
paalde kiemcellen (spermatogonia) gebeurt en op grond van het resultaat zullen wellicht voorspellingen kunnen worden gedaan over de inductie van erfelijke mutaties in kiemcellen.
 
Voor deze test worden meestal knaagdieren gebruikt. Het is een  in 
vivo cytogenetische test waarbij chromosoomafwijkingen worden ge ­
detecteerd die zich voordoen bij mitose van spermatogonia. De me ­
thode is niet geschikt voor andere doelweefsels.  
Om afwijkingen van het chromatidetype in spermatogonia te detec ­
teren, wordt de eerste mitose na de behandeling onderzocht, voordat 
deze beschadigingen bij latere celdelingen verloren gaan. Aanvul ­
lende informatie van behandelde spermatogoniastamcellen kan wor ­
den verkregen door de chromosomen bij de meiose te analyseren op afwijkingen van het chromosoomtype tijdens de diakinese-metafase 
I, wanneer de behandelde cellen spermatocyten worden.
 
Deze in-vivotest is bedoeld om na te gaan of mutagenen voor so ­
matische cellen ook in kiemcellen mutageen zijn. Daarnaast is de test 
met spermatogonia geschikt om het gevaar van mutagene effecten te evalueren, aangezien rekening kan worden gehouden met factoren die samenhangen met het metabolisme  in vivo , de farmacokinetiek 
en de DNA-herstelsynthese.
 
De testis bevat een aantal generaties spermalogonia met een uiteen ­
lopende gevoeligheid voor chemische stoffen. De geconstateerde af ­
wijkingen vertegenwoordigen dan ook een gecombineerde respons van de behandelde spermatogoniacelpopulaties, waarbij de in grotere 
aantallen voorkomende gedifferentieerde spermatogonia overheersen. 
Afhankelijk van hun plaats binnen de testis kunnen verschillende generaties spermatogonia vanwege de fysische en fysiologische bar ­
rière van de cellen van Sertoli en de bloed-testisbarrière al dan niet 
via de grote bloedsomloop bereikbaar zijn.
 
Als er aanwijzingen zijn dat de teststof of een reactieve metaboliet 
daarvan niet in het doelweefsel terechtkomt, is deze test niet ge ­
schikt.  
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINITIES  
Afwijking van het chromatidetype : structurele chromosoombescha ­
diging waarbij breuken in individuele chromatiden ontstaan, eventu ­
eel gevolgd door recombinatie.  
Afwijking van het chromosoomtype : structurele chromosoombe ­
schadiging waarbij breuken in beide chromatiden op dezelfde plaats 
ontstaan, eventueel gevolgd door recombinatie.  
Hiaat:  een achromatische beschadiging die kleiner is dan de breedte 
van één chromatide en waarbij de fout in de uitlijning van de chro ­
matiden minimaal is.  
Numerieke afwijking:  een verandering in het aantal chromosomen 
ten opzichte van het normale aantal dat kenmerkend is voor de 
gebruikte dieren.  
Polyploïdie:  het voorkomen van een ander veelvoud van het haplo ­
ïde aantal chromosomen ( n) dan het diploïde aantal (d.w.z. 3 n, 4n, 
enz.).  
Structurele afwijking:  een verandering in de chromosoomstructuur 
die bij microscopisch onderzoek tijdens de metafase van de celdeling 
kan worden waargenomen in de vorm van deleties, fragmenten en 
intra- of interchromosomale uitwisselingen.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De dieren worden langs een geschikte weg aan de teststof bloot ­
gesteld en op geschikte tijdstippen na de behandeling gedood. Voor ­
dat de dieren worden gedood, worden ze behandeld met een meta ­
fasestopper (bv. colchicine of Colcemid  R ). Vervolgens worden chro ­
mosoompreparaten van de kiemcellen gemaakt, die worden gekleurd; 
de cellen in de metafase worden geanalyseerd op chromosoomafwij ­
kingen.  
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding  
1.4.1.1.  Keuze van de diersoort  
Meestal worden mannetjes van Chinese hamsters of muizen gebruikt. 
Ook mannetjes van andere geschikte zoogdiersoorten komen echter in aanmerking. Er dient gebruik te worden gemaakt van jonge ge ­
zonde vowassen dieren van in het laboratorium gangbare stammen. 
Bij het begin van de studie moet het gewichtsver-schil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ± 20 % van het gemiddelde gewicht bedragen.
 
1.4.1.2.  Huisvesting en voeding  
De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene om ­
standigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid wordt gestreeld naar 50-60 %.
 
1.4.1.3.  Voorbereiding van de dieren.  
Gezonde jonge volwassen mannetjes worden aselect ingedeeld in de 
behandelde en controlegroepen. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie. Ze krijgen mini ­
maal vijf dagen de tijd om in het laboratorium te acclimatiseren 
voordat de test begint.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Bereiding van de doseringen  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks 
worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit 
stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.
 
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Oplosmiddel/Medium  
Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen 
toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/ ­
media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit 
blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar 
mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt.
 
1.4.2.2.  Controles  
Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en negatieve 
(oplosmiddel/medium) controles worden uitgevoerd. Afgezien van 
de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroe ­
pen op identieke wijze worden behandeld als de dieren in de andere groepen.
 
Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt die  in 
vivo structurele chromosoomafwijkingen in spermatogonia veroor ­
zaakt bij toediening op een blootstellingsniveau waarbij een detec ­
teerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht.
 
De doseringen van de positieve controles moeten zodanig worden 
gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde object ­
glaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Het is aan ­
vaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe te dienen dan de teststof en slechts op één tijdstip te bemonsteren. Tevens kan 
waar mogelijk het gebruik van stoffen uit een verwante chemische 
klasse als positieve controle worden overwogen. Als positieve con ­
trole kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:
 
Stof CAS-nr. Einecs-nr.  
Cyclofosfamide 
Cyclofosfamide monohydraat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cyclohexylamine 108-91-8 203-629-0 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 Acrylamide-monomeer 79-06-1 201-173-7 Triethyleenmelamine 51-18-3 200-083-5
 
Voor elk bemonsteringstijdstip dienen negatieve controles in het 
experiment te worden opgenomen, waaraan uitsluitend het oplosmid ­
del of het medium wordt toegediend en die verder op dezelfde manier als de andere groepen worden behandeld, tenzij uit in het 
verleden uitgevoerde controles aanvaardbare gegevens beschikbaar 
zijn over de spreiding over de dieren en de frequentie van cellen met chromosoomafwijkingen. Daarnaast moeten er ook onbehan ­
delde controles worden gebruikt, tenzij in het verleden of in de 
literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel of me ­
dium geen schadelijke of mutagene effecten veroorzaakt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. UITVOERING  
1.5.1.  Aantal dieren  
Elke behandelde en controlegroep moet minimaal vijf analyseerbare 
mannetjes bevatten.  
1.5.2.  Behandelingsschema  
De teststof wordt bij voorkeur een of twee keer (d.w.z. als één of 
twee behandelingen) toegediend. De dosis kan eventueel worden 
gesplitst, waarbij de twee porties op dezelfde dag met een interval van niet meer dan enkele uren worden toegediend, om de toediening 
van een groot volume te vergemakkelijken. Voor een ander dose ­
ringsschema moet een wetenschappelijke motivering worden gege ­
ven.
 
In de hoogste doseringsgroep worden twee bemonsteringstijdstippen 
na de behandeling gebruikt. Aangezien de kinetiek van de celcyclus 
door de teststof kan worden beïnvloed, wordt er één vroeg en één 
laat bemonsteringstijdstip gebruikt rond 24 en 48 uur na de behan ­
deling. Voor andere doses dan de hoogste dosering moet een bemon ­
steringstijdstip op 24 uur of 1,5-maal de lengte van de celcyclus na 
de behandeling worden gekozen, tenzij bekend is dat een ander 
bemonsteringstijdstip geschikter is voor de detectie van effecten (6).  
Daarnaast kunnen ook andere bemonsteringstijdstippen worden ge ­
bruikt. Een vroeger bemonsteringstijdstip zal bijvoorbeeld wellicht 
beter zijn bij stoffen die tot achterblijvende chromosomen kunnen 
leiden of S-onafhankelijke effecten kunnen hebben (1).  
Per geval moet worden onderzocht of een schema voor herhaalde 
behandeling nodig is. Na herhaalde behandeling worden de dieren 24 uur (1,5-maal de lengte van de celcyclus) na de laatste behandeling 
gedood. Waar mogelijk kunnen aanvullende bemonsteringstijdstip ­
pen worden gebruikt.
 
Voordat de dieren worden gedood, worden ze intraperitoneaal geïn ­
jecteerd met een adequate dosis metafase-stopper (bv. Colcemid  R of 
colchicine). De dieren worden na een adequate wachttijd bemonsterd. 
Voor muizen moet er ongeveer drie tot vijf uur worden gewacht en voor Chinese hamsters ongeveer vier tot vijf uur.
 
1.5.3.  Dosisniveaus  
Als er een oriënterend onderzoek wordt uitgevoerd omdat er geen 
bruikbare gegevens over de dosering beschikbaar zijn, moet dit in 
hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde stam 
en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek (7). Als er sprake is van toxiciteit, worden er voor het eerste bemon ­
steringstijdstip drie dosisniveaus gebruikt. Deze dosisniveaus moe ­
ten een interval van de maximale tot geen of vrijwel geen toxici ­
teit bestrijken. Op het latere bemonsteringstijdstip behoeft alleen de hoogste dosis te worden gebruikt. De hoogste dosis wordt gedefi ­
nieerd als de dosis die zodanige toxiciteitsverschijnselen veroor ­
zaakt dat er bij hogere doses met hetzelfde doseringsschema waar ­
schijnlijk sterfte zal optreden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Stoffen met een specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische 
doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vor ­
men op deze criteria om de dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die enigerlei aanwijzing van toxiciteit voor de sperma ­
togonia oplevert (bv. een daling van de verhouding tussen cellen in 
spermatogniamitose en eerste en tweede meiosemetafase: deze daling mag niet groter zijn dan 50 %).
 
1.5.4.  Limiettest  
Als een test met één dosis minimaal 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/ ­
dag, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van gege ­
vens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit te 
verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onder ­
zoek met drie dosisniveaus uit te voeren. Op grond van gegevens omtrent de verwachte blootstelling van de mens kan het gebruik van 
een hoger dosisniveau bij de limiettest nodig worden geacht.
 
1.5.5.  Toediening van de doses  
De teststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een 
geschikte intubatiecanule of door intraperi-toneale injectie toe ­
gediend. Ook andere toedieningswegen kunnen aanvaardbaar zijn, als daarvoor een motivering kan worden gegeven. Het maximale 
volume vloeistof dat in één keer met een sonde of injectie kan 
worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een motivering worden 
gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die in hogere 
concentraties meestal heviger effecten veroorzaken, moeten volume ­
verschillen tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan wor ­
den gebruikt.
 
1.5.6.  Chromosoompreparaten  
Onmiddellijk nadat het dier is gedood worden suspensies gemaakt 
van cellen uit één testis of beide testes en worden deze in een 
hypotone oplossing gebracht en gefixeerd. De cellen worden ver ­
volgens op objectglaasjes uitgesmeerd en gekleurd.  
1.5.7.  Analyse  
Voor elk dier worden minimaal 100 goed gespreide metafases ge ­
analyseerd (d.w.z. ten minste 500 metafases per groep). Wanneer een 
groot aantal afwijkingen wordt geconstateerd, kan dit aantal worden 
verlaagd. Alle objectglaasjes, ook die van de positieve en negatieve controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk ge ­
codeerd. Aangezien bij de fixatieprocedures vaak een gedeelte van 
de metafasecellen breekt, waarbij chromosomen verloren gaan, moe ­
ten de gescoorde cellen 2n ± 2 centromeren bevatten.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens moeten voor elk dier in tabelvorm worden verstrekt. De 
eenheid bij dit experiment is het dier. Voor elk dier apart moet het aantal cellen met structurele chromosoomafwijkingen en het aantal 
chromosoomafwijkingen per cel worden bepaald. Er moet een over ­
zicht worden gegeven van de verschillende soorten structurele chro ­
mosoomafwijkingen met de aantallen en de frequentie waarmee ze in de behandelde en controlegroepen voorkomen. Hiaten worden apart 
geregistreerd en gerapporteerd maar meestal niet in de totale frequen ­
tie van de afwijkingen opgenomen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Als zowel mitose als meiose wordt geobserveerd, wordt als maat 
voor de cytotoxiciteit bij alle behandelde dieren en negatieve con ­
troles in een monster van in totaal 100 delende cellen per dier de verhouding tussen cellen in spermatogoniamitose en eerste en tweede meiosemetafase bepaald om een mogelijk cytotoxisch effect vast te 
stellen. Als alleen de mitose wordt geobserveerd, moet in ten minste 
1 000 cellen voor elk dier de mitotische index worden bepaald.
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, 
zoals een dosisafhankelijke stijging van het relatieve aantal cellen met chromosoomafwijkingen of een duidelijke stijging van het aantal 
cellen met afwijkingen bij één dosis en één bemonsteringstijd. In 
eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresulta ­
ten kunnen statistische methoden worden gebruikt (8). Statistische 
significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor een 
positieve reactie zijn. Bij onduidelijke resultaten moet nader onder ­
zoek worden gedaan, bij voorkeur onder gewijzigde experimentele omstandigheden.
 
Indien de resultaten voor een teststof niet aan bovenstaande criteria 
voldoen, wordt de stof bij deze test als niet-mutageen beschouwd.  
Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve 
resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. 
De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, 
onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de in-vivotest op chromosoomafwijkingen in 
spermatogonia wijzen erop dat de teststof in de kiemcellen van de geteste soort structurele chromosoomafwijkingen induceert. Nega ­
tieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden 
in de kiemcellen van de geteste soort geen chromosoomafwijkingen induceert.
 
De waarschijnlijkheid dat de teststof of de metabolieten daarvan in 
het doelweefsel terechtkomen, dient te worden besproken.  
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— Motivering voor de keuze van het medium;  
— Oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Proefdieren:  
— Gebruikte soort/stam;  
— Aantal en leeftijd van de dieren;  
— Herkomst, huisvesting, voeding, enz.;  
— Het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met ver ­
melding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwij ­
king van het lichaamsgewicht voor elke groep.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Testomstandigheden:  
— Gegevens uit het oriënterend onderzoek, indien dit is uitgevoerd;  
— Achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus;  
— Achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg;  
— Gegevens over de bereiding van de teststof;  
— Gegevens over de toediening van de teststof;  
— Achtergrond voor de keuze van het tijdstip waarop de dieren 
gedood worden;  
— Omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) in de dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;
 
— Gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater;  
— Een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemon ­
steringsschema;  
— Methoden voor de meting van de toxiciteit;  
— Naam van de metafasestopper, gebruikt concentratie en blootstel ­
lingsduur;  
— Methoden voor de bereiding van de objectglaasjes;  
— Criteria voor het scoren van afwijkingen;  
— Aantal geanalyseerde cellen per dier;  
— Criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of on ­
duidelijk is.  
Resultaten:  
— Tekenen van toxiciteit;  
— Mitotische index;  
— Verhouding tussen cellen in spermatogoniamitose en eerste en 
tweede meiosemetafase;  
— Aard en aantal van de afwijkingen, afzonderlijk vermeld voor elk 
dier; 
— Totaal aantal afwijkingen per groep;  
— Aantal cellen met afwijkingen per groep;  
— Indien mogelijk het verband tussen dosis en respons;  
— Eventuele statistische analyses;  
— Gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles;  
— Gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve controles, 
met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwij ­
king;  
— Gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde positieve controles;  
— Veranderingen in de ploïdie, indien waargenomen.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. REFERENTIES  
(1) Adler, L.D., (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spcrma ­
togonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Che ­
micals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, 
Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.
 
(2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. 
Parry, IRL Press. Oxford, Washington DC. pp. 275-306.  
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford. C.E. (1964). An Air-drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cy ­
togenetics and Cell Genetics, 3. pp. 289-294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays. In: D.J. 
Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester. Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mu ­
tation Res. 52. pp. 207-209.  
(6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J.. Generoso. W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests. Mutation Res., 312, pp. 313-318.
 
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis. A.R., Botham, P.A.. Doe, J.. 
Esdaile. D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays, Mu ­
tagenesis, 7, pp. 313-319.
 
(8) Lovell, D.P., Anderson. D., Albanese, R., Amphlett. G.E., Cla ­
re, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage 
J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic As ­
says. In: D.J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  VLEKKENTEST BIJ MUIZEN  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Het betreft een in-vivo-test bij muizen waarbij zich ontwikkelende 
embryo's worden blootgesteld aan chemische stoffen. De cellen in de zich ontwikkelende embryo's waarop de test is gericht, zijn melano ­
blasten en de genen waarop de test is gericht, zijn die welke de 
pigmentering van de vachtharen regelen. De zich ontwikkelende 
embryo's zijn heterozygoot voor een aantal van deze vachtkleurge ­
nen. Door een mutatie in of verlies van (door een verscheidenheid van genetische gebeurtenissen) het dominant alleel van een dergelijk 
gen in een melanoblast komt het recessief fenotype in de cellen van 
de afstammelingen tot uiting, waardoor een vlek met een andere kleur wordt gevormd in de vacht van de volgende generatie muizen. Het aantal nakomelingen met deze vlekken wordt geteld en de fre ­
quentie ervan vergeleken met het aantal nakomelingen van embryo's 
die uitsluitend met het oplosmiddel zijn behandeld. Het wordt ver ­
ondersteld dat de vlekkentest somatische mutaties in foetale cellen detecteert.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereidingen  
Indien mogelijk worden de teststoffen opgelost of gesuspendeerd in 
een isotonische zoutoplossing. Niet in water oplosbare chemische 
stoffen worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte (oplos)mid ­
delen. Het gebruikte (oplos)middel mag niet interfereren met de test ­
stof en geen toxische effecten veroorzaken. Er dienen verse teststof ­
preparaten te worden gebruikt.  
P r o e f d i e r e n  
Muizen van de T-stam (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c  ch p/c ch p; 
brown b/b; dilute, short ear, d se/d se, piebald spotting, s/s) worden 
gepaard hetzij met de HT-stam (palled, nonagouti, brachypodie, pa a 
bp/pa a bp; leaden fuzzy, 1n fz/ln fz; pearl pe/pe) of met C57 BL (nonagouti, a/a). Andere mogelijke kruisingen zoals tussen NMRI (no ­
nagouti, a/a; albino, c/c) en DBA (nonagouti, a/a; brown b/b; dilute d/d) 
kunnen worden gebruikt op voorwaarde dat ze nonagouti-nakomelin ­
gen voortbrengen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
A a n t a l e n g e s l a c h t  
Er dient een voldoende aantal drachtige vrouwtjes te worden behan ­
deld om voor elk gebruikt dosisniveau een geschikt aantal over ­
levende nakomelingen te verkrijgen. De omvang van het monster wordt bepaald door het aantal waargenomen vlekken bij de behan ­
delde muizen en door de omvang van controlegegevens. Een negatief 
resultaat is alleen aanvaardbaar indien ten minste 300 nakomelingen van met de hoogste dosis behandelde vrouwtjes zijn geteld.
 
G e b r u i k v a n p o s i t i e v e e n n e g a t i e v e c o n t r o l e s  
Er dienen parallelle controlegegevens van uitsluitend met het me ­
dium (negatieve controle) behandelde muizen beschikbaar te zijn. 
Controlegegevens uit het verleden van hetzelfde laboratorium kunnen 
bij elkaar worden genomen teneinde de gevoeligheid van de test te verhogen, op voorwaarde dat ze homogeen zijn. Indien geen muta ­
geniteit van de teststof wordt ontdekt, dienen eveneens positieve 
controlegegevens beschikbaar te zijn die recent in hetzelfde labora ­
torium zijn verkregen na behandeling met een stof waarvan bekend is dat zij mutageen is in deze test.
 
T o e d i e n i n g s w e g  
De normale toedieningsweg is orale intubatie of intraperitoneale in ­
jectie van de drachtige vrouwtjes. In voorkomend geval kan de be ­
handeling ook via inhalatie of andere toedieningswegen geschieden.  
D o s i s n i v e a u s  
Ten minste twee dosisniveaus waarvan één tekenen van toxiciteit of 
een kleinere nestgrootte laat zien, worden gebruikt. Voor niet-toxi ­
sche stoffen dient een blootstelling aan de hoogste dosis die is toe te passen te worden gebruikt.
 
Uitvoering  
Normaliter wordt een enkele behandeling gegeven op dag acht, ne ­
gen of tien van de dracht waarbij dag één de dag is waarop voor het 
eerst een vaginale plug wordt aangetroffen. Deze dagen stemmen overeen met 7,25, 8,25 en 9,25 dagen na conceptie. Tijdens deze dagen kunnen ook opeenvolgende behandelingen worden gegeven.
 
A n a l y s e  
Drie à vier weken na de geboorte worden de nakomelingen geco ­
deerd en onderzocht op vlekken. Er dient een onderscheid te worden 
gemaakt tussen drie klassen van vlekken:  
a) witte vlekken op minder dan vijf mm van de mid-ventrale lijn die 
waarschijnlijk worden veroorzaakt door celsterfte (WMVS),  
b) gele, agouti-achtige vlekken, in de buurt van mammae, genitalia, 
keel, oksels en nierstreek en op het midden van het voorhoofd 
waarvan verondersteld wordt dat zij worden veroorzaakt door 
misdifferentiatie (MDS), en  
c) willekeurig op de vacht verspreide gepigmenteerde en witte vlek ­
ken waarvan verondersteld wordt dat zij worden veroorzaakt door 
somatische mutaties (RS).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Alle drie klassen moeten worden geteld maar alleen de laatste, RS, 
heeft een genetisch belang. Moeilijkheden met betrekking tot het 
onderscheid tussen MDS en RS kunnen worden opgelost door haar ­
monsters te onderzoeken met de fluorescentiemicroscoop.  
Duidelijke macromorfologische abnormaliteiten bij de nakomelingen 
moeten worden vastgelegd.  
2. GEGEVENS  
De gegevens worden weergegeven als het totaal aantal getelde na ­
komelingen en het aantal met een of meer vermoedelijke somatische 
mutatievlekken. Gegevens van de behandelde en negatieve contro ­
legroep worden met behulp van een geschikte statistische methode vergeleken. De gegevens worden ook per nest weergegeven.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag van de proef dienen de volgende gegevens te worden 
vermeld:  
— de voor de kruising gebruikte stam;  
— aantal drachtige vrouwtjes in de experimentele en de contro ­
legroep;  
— gemiddelde nestgrootte in de experimentele en controlegroepen 
bij de geboorte en bij het spenen;  
— dosisniveau(s) van de teststof;  
— gebruikt oplosmiddel;  
— dag van de dracht waarop de behandeling is gegeven;  
— toedieningsweg;  
— totaal aantal nakomelingen en het aantal met WMVS, MDS en 
RS in de experimentele en de controlegroepen;  
— macromorfologische abnormaliteiten;  
— dosis-responsverhouding van RS (waar dat van toepassing is);  
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  ERFELIJKE TRANSLOCATIE BIJ DE MUIS  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Met de erfelijke translocatietest bij de muis worden structurele en 
numerieke wijzigingen in de geslachtscelchromosomen van zoogdie ­
ren gedetecteerd wanneer zij voorkomen in het nageslacht van de 
eerste generatie. De soorten chromosoomwijzigingen die gedetec ­
teerd worden, zijn reciproke translocaties en indien het vrouwelijk nageslacht wordt meegerekend, verlies van het X-chromosoom. Dra ­
gers van translocaties en XO-vrouwtjes vertonen een verminderde 
vruchtbaarheid die wordt gebruikt voor de selectie van het F
 1 -na­
geslacht met het oog op een cytogenetische analyse. Volledige ste ­
riliteit wordt veroorzaakt door bepaalde soorten translocaties (X-au ­
tosoom en c-t). Translocaties worden cytogenetisch vastgesteld in 
meiotische cellen in de diakinesemetafase I van mannelijke dieren, 
hetzij F  1 -mannetjes hetzij mannelijk nageslacht van F  1 -vrouwtjes. De 
XO-vrouwtjes zijn cytogenetisch bepaald door de aanwezigheid van slechts 39 chromosomen in beenmergmitoses.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
Voorbereiding  
De teststoffen worden opgelost in een isotonische zoutoplossing. 
Onoplosbare stoffen worden opgelost of gesuspendeerd in geschikte 
(oplos)middelen. Er dienen vers bereide oplossingen van de testver ­
binding te worden gebruikt. Indien een (oplos)middel wordt gebruikt om het toedienen te vergemakkelijken, mag deze niet interfereren met de teststof en geen toxische effecten veroorzaken.
 
T o e d i e n i n g s w e g  
De normale toedieningswegen zijn orale intubatie of intraperitoneale 
injectie. Ook andere toedieningswegen kunnen geschikt zijn.  
P r o e f d i e r e n  
Deze proef wordt verricht met muizen die gemakkelijk zijn te kwe ­
ken en cytologisch te analyseren. Er is geen specifieke stam vereist. De gemiddelde nestgrootte bij de stam moet echter groter zijn dan acht en relatief constant.
 
Er worden gezonde geslachtsrijpe dieren gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
A a n t a l d i e r e n  
Het vereiste aantal dieren wordt bepaald door de spontane transloca ­
tiefrequentie en het voor een positief resultaat vereiste minimale inductieniveau.
 
De proef wordt gewoonlijk uitgevoerd door analyse van het manne ­
lijke F  1 -nageslacht. Per dosisgroep dienen ten minste 500 mannelijke 
F 1 -nakomelingen te worden onderzocht. Indien ook vrouwelijke F  1 - 
nakomelingen bij het onderzoek worden betrokken, zijn 
300 mannetjes en 300 vrouwtjes vereist.  
G e b r u i k v a n n e g a t i e v e e n p o s i t i e v e c o n t r o l e s  
Geschikte controlegegevens, afkomstig van parallelle en historische 
controles, dienen beschikbaar te zijn. Indien aanvaardbare positieve controlegegevens beschikbaar zijn van experimenten die recent in hetzelfde laboratorium zijn uitgevoerd, kunnen deze resultaten ge ­
bruikt worden in plaats van een parallelle positieve controle.
 
D o s i s n i v e a u  
Een dosisniveau wordt getest, gewoonlijk de hoogste dosis waarbij 
een minimaal toxisch effect wordt veroorzaakt zonder dat het repro ­
ductiegedrag of de overleving wordt beïnvloed. Om de dosis-res ­
ponsverhouding vast te stellen, zijn nog twee lagere doses vereist. 
Voor niet-toxische stoffen dient blootstelling aan de hoogste dosis 
die is toe te passen te worden gebruikt.  
Uitvoering  
B e h a n d e l i n g e n p a r i n g  
Er zijn twee behandelingsschema's beschikbaar. Een enkele toedie ­
ning van de teststof wordt het meest gebruikt. Ook kan de teststof 
zeven dagen per week gedurende 35 dagen worden toegediend. Het aantal paringen na de behandeling wordt bepaald door het behan ­
delingsschema en dient voldoende groot te zijn om alle celstadia van 
de behandelde geslachtscellen te bemonsteren. Na de paringsperiode 
worden de vrouwtjes in afzonderlijke kooien ondergebracht. Bij de geboorte worden de datum, de nestgrootte en het geslacht van de nakomelingen geregistreerd. Alle mannelijke nakomelingen worden 
gespeend en de vrouwelijke nakomelingen worden niet gebruikt, 
tenzij ze worden meegenomen in de proef.
 
O n d e r z o e k n a a r h e t e r o z y g o t e t r a n s l o c a t i e s  
Een van de volgende twee methoden wordt gebruikt:  
— vruchtbaarheidsonderzoek van het F  1 -nageslacht gevolgd door 
onderzoek van eventuele translocatiedragers door middel van 
een cytogenetische analyse.  
— Cytogenetische analyse van alle mannelijke F  1 -nakomelingen 
zonder voorafgaande selectie op basis van een vruchtbaarheids ­
onderzoek.  
a) Vruchtbaarheidsonderzoek  
Verminderde vruchtbaarheid van een F  1 -individu kan worden 
vastgesteld door observatie van de nestgrootte en/of analyse 
van de uterusinhoud van vrouwelijke dieren.  
Er dienen criteria te worden vastgelegd voor het bepalen van 
normale en verminderde vruchtbaarheid van de gebruikte mui ­
zenstam.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Observatie van de nestgrootte: De te testen F  1 -mannetjes worden 
in afzonderlijke kooien geplaatst met vrouwtjes van dezelfde 
proef of van de kolonie. De kooien worden dagelijks gecontro ­
leerd vanaf de achttiende dag na de paring. Bij de geboorte worden de nestgrootte en het geslacht van de F
 2 -nakomelingen 
geregistreerd; hierna worden de nesten niet meer gebruikt. Indien 
vrouwelijke F  1 -nakomelingen worden onderzocht, worden de F  2 - 
nakomelingen uit kleine nesten voor verder onderzoek behouden. Vrouwelijke translocatiedragers worden opgespoord door cytoge ­
netische analyse van een translocatie in een van de mannelijke 
nakomelingen. XO-vrouwtjes kunnen worden herkend door een verandering in de geslachtsverhouding van de nakomelingen van 1:1 naar 1:2 mannetjes/vrouwtjes. Bij een sequentiële methode 
worden normale F
 1 -dieren niet verder onderzocht indien het eer ­
ste F  2 -nest een vooraf bepaalde normaalwaarde bereikt of over ­
schrijdt; indien dit niet zo is, wordt een tweede of derde F  2 -nest 
onderzocht.  
F 1 -dieren die niet als normaal kunnen worden geclassificeerd na 
observatie van maximaal drie F  2 -nesten, worden hetzij verder 
onderzocht door analyse van de uterusinhoud van vrouwelijke 
dieren hetzij rechtstreeks onderworpen aan een cytogenetische 
analyse.  
Analyse van de uterusinhoud; De kleinere nestgrootte bij trans ­
locatiedragers is een gevolg van de dood van embryo's en dus 
wijst een hoog aantal dode implantaten op de aanwezigheid van een translocatie in het onderzochte dier. Men laat de te testen F
 1 - 
mannetjes elk met twee tot drie vrouwtjes paren. De bevruchting 
kan worden vastgesteld door middel van een dagelijkse controle 
op vaginale plugs in de morgen. Veertien tot zestien dagen later worden de vrouwtjes gedood en wordt het aantal levende en dode implantaten in de uteri geregistreerd.
 
b) Cytogenetische analyse  
Testespreparaten worden bereid door droging aan de lucht. 
Translocatiedragers worden opgespoord op grond van de aan ­
wezigheid van multivalente configuraties tijdens de diakineseme ­
tafase I in primaire spermatocyten. Indien ten minste twee cellen met multivalente associaties kunnen worden waargenomen, 
vormt dit een bewijs dat het onderzochte dier een translocatie ­
drager is.
 
Indien voor het kweken geen selectie is gemaakt, worden alle F  1 - 
mannetjes cytogenetisch onderzocht. Per mannetje dienen ten 
minste 25 diakinesemetafasen I microscopisch te worden onder ­
zocht. Voor F  1 -mannetjes met kleine testes en meiotische afbraak 
vóór de diakinese of voor F  1 -vrouwtjes waarbij XO wordt ver ­
moed, is een onderzoek van de mitotische metafasen, de sperma ­
togonia of het beenmerg noodzakelijk. De aanwezigheid van een ongewoon lang en/of kort chromosoom in tien afzonderlijke cel ­
len is een bewijs voor een bepaalde mannelijke steriele trans ­
locatie (c-t type). Sommige mannelijke steriliteit veroorzakende 
X-autosoomtranslocaties kunnen uitsluitend aan de hand van ana ­
lyse van de bandering van de mitotische chromosomen worden vastgesteld. De aanwezigheid van 39 chromosomen in alle tien 
mitoses geldt als bewijs voor een XO-toestand bij een vrouwtje.
 
2. GEGEVENS  
De gegevens worden in tabellarische vorm gepresenteerd.  
Voor elke paringsinterval worden de gemiddelde nestgrootte en de 
geslachtsverhouding bij de geboorte en bij het spenen vermeld voor 
de paring van de ouders.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Voor vruchtbaarheidsonderzoek van F  1 -dieren worden de gemiddelde 
nestgrootten van alle normale paringen en de afzonderlijke nest ­
grootte voor F  1 -translocatiedragers gegeven. Voor de analyse van 
de uterusinhoud wordt het gemiddelde aantal levende en dode im ­
plantaten na normale paring en het individuele aantal levende en 
dode implantaten voor elke paring van F  1 -translocatiedragers ver ­
meld.  
Bij cytogenetische analyse van de diakinesemetafase I worden voor 
elke translocatiedrager het aantal soorten multivalente configuraties 
en het totaal aantal cellen genoteerd.  
Voor steriele F  1 -dieren wordt het totaal aantal paringen en de duur 
van de paartijd vermeld. Het gewicht van de testes en gegevens van de cytogenetische analyse worden opgegeven.
 
Voor XO-vrouwtjes dienen de gemiddelde nestgrootte, geslachtsver ­
houding van F  1 -nakomelingen en resultaten van de cytogenetische 
analyse te worden vermeld.  
Indien mogelijke F  1 -translocatiedragers vooraf geselecteerd zijn op 
basis van vruchtbaarheidsonderzoekingen, dienen de tabellen te ver ­
melden hoeveel ervan bevestigde translocatieheterozygoten waren.  
De gegevens van negatieve en positieve controleproeven worden op 
dezelfde manier voorgesteld.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMING  
In het verslag van de proef moeten, indien mogelijk, de volgende 
gegevens worden opgenomen:  
— gebruikte stam, leeftijd van de dieren, gewicht van behandelde 
dieren;  
— aantal ouderdieren van elk geslacht in experimentele en contro ­
legroepen;  
— proefomstandigheden, gedetailleerde beschrijving van de behan ­
deling, dosisniveaus, oplosmiddelen, paringsschema;  
— aantal en geslacht van de nakomelingen per vrouwtje, aantal en 
geslacht van voor translocatieanalyse gekweekte nakomelingen;  
— tijdstip en criteria voor de translocatieanalyse;  
— aantal en nauwkeurige beschrijving van translocatiedragers, in ­
clusief gegevens over het kweken en de uterusinhoud (wanneer dat van toepassing is);
 
— cytogenetische methoden en resultaten van de microscopische 
analyse, bij voorkeur met foto's;  
— statistische evaluatie;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  SUBCHRONISCHE ORALE TOXICITEITSTEST TOXICI ­
TEITSONDERZOEK (ORAAL) OP KNAAGDIEREN BIJ HER ­
HAALDE TOEDIENING (90 DAGEN)  
1. METHODE  
De methode die voor deze subchronische orale toxiciteitstest wordt 
gebruikt, is een kopie van de OECD TG 408 (1998).  
1.1. INLEIDING  
Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een 
chemische stof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests of toxici ­
teitstests met herhaalde toediening (28 dagen) eerste informatie over 
de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de subchronische orale toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Het onderzoek van 90 dagen levert informatie op over de mogelijke 
gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde 
langdurige blootstelling vanaf de tijd na het spenen en de groeitijd tot aan de volgroeidheid. Het onderzoek zal informatie opleveren 
over de belangrijkste toxische effecten, er zullen organen die bescha ­
digd kunnen worden en de mogelijkheid van accumulatie worden aangegeven, en er kan een inschatting worden gemaakt van een blootstellingsniveau zonder schadelijk effect, dat kan worden ge ­
bruikt bij de keuze van dosisniveaus voor chronische onderzoeken 
en voor de vaststelling van veiligheidscriteria voor de blootstelling van de mens.
 
De methode legt extra nadruk op de neurologische eindpunten en 
geeft een indicatie van de immunologische effecten en de effecten 
voor de voortplantingsorganen. Bovendien wordt benadrukt dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen. Met dit onderzoek moeten 
chemische stollen geïdentificeerd kunnen worden die neurotoxische 
of immunologische effecten kunnen hebben of die schadelijk voor de voortplantingsorganen kunnen zijn, waardoor verder diepteonderzoek gerechtvaardigd kan worden.
 
Zie ook algemene inleiding deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Dosis:  is de hoeveelheid teststof die wordt toegediend. De dosis 
wordt uitgedrukt in gewicht (g, mg) of in het gewicht van de teststof 
per gewichtseenheid proefdier (bv. mg/kg), of als constante voe ­
dingsconcentraties (ppm).  
Dosering:  is een algemene term die de dosis alsook de frequentie 
daarvan en de doseringsperiode omvat.  
NOAEL:  is de afkorting voor het niveau zonder waarneembaar 
schadelijk effect en is de hoogste dosis waarbij nog geen waarneem ­
bare toxiciteitsverschijnselen optreden.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt gedurende een periode van 90 dagen dagelijks 
oraal toegediend aan verscheidene groepen proefdieren, in geleidelijk 
stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die 
tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van het 
onderzoek leven, wordt necropsie verricht.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding van de dieren  
Voor het onderzoek worden gezonde dieren gebruikt die ten minste 
vijf dagen onder gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden 
zijn gehouden als tijdens de test en die niet eerder voor experimenten 
zijn gebruikt. De proefdieren worden op basis van kenmerken als soort, stam. oorsprong, geslacht, gewicht en/of leeftijd ingedeeld. De dieren worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen 
ingedeeld. De kooien worden zodanig neergezet dat mogelijke ef ­
fecten door de plaatsing daarvan tot een minimum worden beperkt. Elk dier krijgt een uniek identificatienummer.
 
1.4.2.  Voorbereiding van de doses  
De teststof kan via een maagsonde, met de voeding of met het 
drinkwater worden toegediend. De wijze van de orale toediening 
hangt af van het doel van het onderzoek en van de fysisch-chemische eigenschappen van het restmateriaal.
 
Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of 
gesuspendeerd. Het verdient aanbeveling om in eerste instantie een 
oplossing/suspensie in water te overwegen. Als dit niet mogelijk is, kan een oplossing/emulsie in achtereenvolgens plantaardige olie (bv. maïsolie) of een ander medium worden overwogen. Van niet-wate ­
rige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn. De sta ­
biliteit van de teststof tijdens de toediening moet worden vastgesteld.
 
1.4.3.  Proefomstandigheden  
1.4.3.1.  Proefdieren  
De voorkeur wordt gegeven aan ratten, maar er kunnen ook andere 
soorten knaagdieren worden gebruikt, bijvoorbeeld muizen. De proef 
dient te worden uitgevoerd met stammen van gezonde, jonge volg ­
roeide dieren die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. De wijfjes moeten nullipaar zijn en niet zwanger. De toediening moet 
zo snel mogelijk na het spenen beginnen maar in ieder geval voordat 
de dieren negen weken oud zijn. Per geslacht mag bij het begin van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan ±20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Indien het 
onderzoek wordt uitgevoerd als voorstudie van een langdurig chro ­
nische-toxiciteitsonderzoek. moeten dieren van dezelfde stam en oor ­
sprong voor beide onderzoeken worden gebruikt.
 
1.4.3.2.  Aantal en geslacht  
Voor ieder dosisniveau moeten ten minste 20 dieren (tien wijfjes en 
tien mannetjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is tussen ­
tijds dieren te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met 
het aantal dat tussentijds zal worden gedood. Op basis van de aan ­
wezige kennis van de chemische stof of een stof die daar veel op lijkt, verdient het overweging een extra satellietgroep van tien dieren 
(vijf per geslacht) op te nemen in de controlegroep en in de groep 
met het hoogste dosisniveau, om na de behandeling te kunnen na ­
gaan of er sprake is van reversibiliteit of persistentie van eventuele toxische effecten. De duur van deze nabehandelingsperiode moet 
worden vastgesteld in overeenstemming met de waargenomen effec ­
ten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Dosisniveaus  
Ten minste drie dosisniveaus en een bijbehorende controle zijn ver ­
eist, tenzij een limiettest wordt uitgevoerd (zie 1.4.3.4). De dosisni ­
veaus kunnen gebaseerd zijn op de resultaten van onderzoeken met 
herhaalde toediening of van verkennende onderzoeken, en er moet 
rekening worden gehouden met bestaande toxicologische en toxico ­
kinetische gegevens die voor de teststof of aanverwante materialen beschikbaar zijn. Indien er geen beperkingen vanwege de fysisch- 
chemische aard of de biologische effecten van de teststof zijn, moet 
het hoogste dosisniveau worden gekozen om toxiciteit te veroor ­
zaken, maar niet de dood of ernstige pijn. Er moet een afnemende 
reeks dosisniveaus worden gekozen om elke doseringsgerelateerde 
respons en een niveau zonder schadelijk effect (NOAEL) op het laagste dosisniveau aan te tonen. Doorgaans zijn twee- tot viervou ­
dige intervallen optimaal voor de instelling van de afnemende dosi ­
sniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te ver ­
kiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van 6 à 10) tussen twee doseringen.
 
De controlegroep moet een onbehandelde groep of een mediumcon ­
trolegroep zijn, voorzover een medium wordt gebruikt voor de toe ­
diening van de teststof. Afgezien van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als die in de testgroep. Indien een medium wordt gebruikt, 
moet het medium aan de controlegroep in het voor de proef maxi ­
maal gebruikte volume worden toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de voeding en een geringere voedingsopname ver ­
oorzaakt, kan een paargevoede controlegroep nuttig zijn om onder ­
scheid te maken tussen een vermindering vanwege de eetbaarheid of 
vanwege toxicologische veranderingen in het testmodel.
 
Er moet rekening worden gehouden met de navolgende eigenschap ­
pen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van 
toepassing is: effecten op de absorptie, distributie, metabolisme of 
retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische karakteristieken daarvan kunnen verande ­
ren; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedings ­
status van de dieren.
 
1.4.3.4.  Limiettest  
Indien een test bij een dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag en met gebruikmaking van de procedures die voor deze studie worden beschreven, een niveau zonder schadelijk 
effect oplevert en indien toxiciteit op grond van informatie over qua 
samenstelling aanverwante stoffen niet te verwachten is, hoeft wel ­
licht niet het uitvoeren van een volledig onderzoek met gebruikma ­
king van drie doseringsniveaus overwogen te worden. De limiettest 
moet worden uitgevoerd tenzij het blootstellingsniveau van de mens 
duidt op de noodzaak een hoger dosisniveau te gebruiken.
 
1.5. PROCEDURE  
1.5.1.  Toediening van de doses  
De dieren krijgen gedurende een periode van 90 dagen, 7 dagen per 
week, een dosis van de teststof toegediend. Voor elk ander dose ­
ringsinterval, bv. vijf dagen per week, moet een goede reden zijn. 
Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. De maximale hoeveel ­
heid vloeistof die in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk 
van de grootte van het proefdier. Het maximale volume dat voor de proef wordt gebruikt, mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaams ­
gewicht, behalve bij oplossingen in water, waarvan het volume maxi ­
maal 2 ml/100 g lichaamsgewicht mag bedragen. Afgezien van irri ­
terende of bijtende stoffen die normaliter bij hogere concentraties ergere effecten vertonen, moet de variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume zo klein mogelijk worden gehouden door de con ­
centratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant 
volume wordt gewaarborgd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toe ­
gediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de 
teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een con ­
stante voedingsconcentratie (ppm) of een constant dosisniveau als 
functie van het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; de 
gekozen methode moet worden gespecificeerd. Indien de stof via een maagsonde wordt toegediend, moeten de doses dagelijks op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten geregeld worden aan ­
gepast om een constant dosisniveau als functie van het lichaams ­
gewicht van het dier te verkrijgen. Indien een onderzoek gedurende een periode van 90 dagen wordt gebruikt als voorstudie van een langdurig chronisch toxiciteitsonderzoek, moet in beide onderzoeken 
dezelfde voeding worden gebruikt.
 
1.5.2.  Waarnemingen  
De observatieperiode moet ten minste 90 dagen duren. Dieren in 
satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog gedurende 
een gepaste periode zonder behandeling worden gehouden om herstel 
of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen.  
De proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobser ­
veerd, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip, waarbij rekening moet wor ­
den gehouden met de piekperiode van verwachte effecten na de toediening van de dosis. De klinische conditie van de dieren moet 
geregistreerd worden. Ten minste tweemaal per dag, normaliter aan 
het begin en eind van elke dag, moeten alle dieren worden onder ­
zocht op tekenen van ziekelijkheid of sterfte.
 
Ten minste eenmaal vóór de eerste blootstelling (om vergelijkingen op 
hetzelfde gebied te kunnen trekken) en eenmalig een week daarna moe ­
ten alle dieren aan een uitgebreid klinisch onderzoek worden onderwor ­
pen. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobserveerd, bij voor ­
keur telkens in een standaardgebied en op hetzelfde tijdstip. De gegevens moeten zorgvuldig geregistreerd worden, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het proeflaboratorium expliciet zijn gedefini ­
eerd. Er moet getracht worden verschillen in de observatiecondities tot 
een minimum te beperken. Er dient onder meer te worden gelet op ver ­
anderingen van huid en vacht, ogen en slijmvliezen, her voorkomen van secreties en excreties, en autonome activiteiten (bv. tranenvloed, pilo- 
erectie, pupilgrootte, abnormaal ademhalingspatroon). Ook veranderin ­
gen in de manier van lopen, de houding en de reactie op de behandeling alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereo ­
typen (bv. abnormaal poetsgedrag, blijven ronddraaien) of bizar gedrag 
(bv. zelfverminking, achteruit lopen) moeten geregistreerd worden (1).
 
Vóór de toediening van de teststof en na beëindiging van het onder ­
zoek wordt een oftalmologisch onderzoek uitgevoerd, waarbij ge ­
bruik wordt gemaakt van een oftalmoscoop of een even geschikt apparaat. Dit onderzoek wordt bij voorkeur op alle dieren verricht, maar ten minste op die in de groepen met het hoge dosisniveau en in 
de controlegroepen. Wanneer oogafwijkingen worden vastgesteld, 
moeten alle dieren worden onderzocht.
 
Tegen het einde van de blootstellingsperiode maar in geen geval 
vóór de elfde week moeten onderzoeken naar de sensorische reacties 
op verschillende soorten stimuli (1) (bv. auditieve, visuele en pro ­
prioceptieve stimuli) (2), (3), (4), alsmede een bepaling van de grijp ­
kracht (5) en van de motorische activiteit (6) worden verricht. Meer 
informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook an ­
dere dan de genoemde procedures worden toegepast.
 
De uitvoering van functionele waarnemingen tegen het eind van het 
onderzoek kan achterwege worden gelaten indien andere onderzoe ­
ken al gegevens over functionele waarnemingen hebben opgeleverd 
en uit de dagelijkse klinische waarnemingen geen functionele gebre ­
ken zijn gebleken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
In uitzonderingsgevallen kunnen functionele waarnemingen ook ach ­
terwege worden gelaten bij groepen die anders tekenen van toxiciteit 
vertonen in een mate die aanzienlijk zou interfereren met de uitvoe ­
ring van de functionele test.  
1.5.2.1.  Lichaamsgewicht en voedsel-/waterverbruik  
Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week worden gewogen. 
Ook het voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Indien de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet ook het waterverbruik ten minste wekelijks worden gemeten. Het meten van 
het waterverbruik kan ook worden overwogen bij voedsel- of maag ­
sondeonderzoeken, gedurende welke de drinkactiviteit kan verande ­
ren.
 
1.5.2.2.  Hematologie en klinisch-biochemische bepalingen  
Van een bepaalde plek moeten bloedmonsters worden genomen die, 
voorzover van toepassing, onder gepaste omstandigheden bewaard moeten worden. Aan het einde van de testperiode moeten de mon ­
sters worden genomen vlak vóór het doden van de dieren of als 
onderdeel van de dodingsprocedure.
 
Aan het einde van de testperiode en indien tussentijds bloedmonsters 
zijn genomen, moeten de volgende hematologische onderzoeken 
worden venijn: bepaling van het hematocriet en het hemoglobinege ­
halte, erythrocytentelling, totale en gedifferentieerde telling van de leukocyten, telling van de bloedplaatjes en meting van een maat voor 
het stollingsvermogen.
 
Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke 
toxische effecten in weefsels en met name effecten op de nier en 
lever te onderzoeken, moeten worden verricht op de bloedmonsters 
die van elk dier zijn genomen vlak vóór het doden daarvan of als onderdeel van de dodingsprocedure (afgezien van stervende en/of 
tussentijds gedode dieren). Op dezelfde wijze als bij de hematologi ­
sche onderzoeken kunnen tussentijds bloedmonsters worden ge ­
nomen ten behoeve van klinisch-biochemische tests. Het is aan te bevelen in de nacht voordat de bloedmonsters worden genomen de 
dieren voedsel te onthouden (
 1 ). Bepalingen in plasma of serum 
moeten het volgende omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cho ­
lesterol, ureum, bloedureum. stikstof, creatinine, totaal eiweit en al ­
bumine, en meer dan twee enzymen die symptomatisch zijn voor 
hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase. aspartaat ­
aminotransferase, alkalinefosfatase, gammaglutamyl-transpeptidase en sorbitoldehydrogenase). Er kunnen ook metingen worden verricht van extra enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en galzu ­
ren, die onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie kunnen 
opleveren.
 
Als optie kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek de 
volgende urineonderzoeken worden verricht, waarbij op regelmatige 
tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen: uitzien, volume, osmolaliteit of relatieve dichtheid, pH, eiwit, glucose en bloed, bloedcellen.
 
Bovendien moet worden overwogen serummarkers van algemene 
weefselbeschadiging te onderzoeken. Andere bepalingen die uitge ­
voerd moeten worden wanneer de bekende eigenschappen van de 
teststof invloed hebben of kunnen hebben op de bijbehorende meta ­
bolische profielen: calcium, fosfor, triglyceriden bij nuchtere toe ­
stand, bepaalde hormonen, methemoglobine en cholinesterase-activi ­
teit. Deze moeten voor chemische stoffen in bepaalde klassen of per 
geval geïdentificeerd worden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Voor een aantal metingen serum en plasma, met name voor glucose, is het aan te bevelen 
de nacht ervoor de dieren voedsel te onthouden. De belangrijkste reden hiervoor is dat de 
verhoogde variabiliteit die onvermijdelijk voortvloeit uit het nuttigen van voedsel, ertoe 
zou leiden dat subtielere effecten verborgen en de interpretatie moeilijker zou worden. 
Aan de andere kant kan het 's nachts onthouden van voedsel echter interfereren met bet 
algemene metabolisme van de dieren en. met name in voedingsonderzoeken, de dage ­
lijkse blootstelling aan de teststof verstoren. Indien ervoor wordt gekozen 's nachts 
voedsel te onthouden, moeten de klinisch-biochemische bepalingen worden uitgevoerd 
na de functionele waarnemingen van het onderzoek.
 Algemeen is een flexibele aanpak nodig, afhankelijk van de dier ­
soorten en het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde 
stol. 
Wanneer historische basisgegevens ontoereikend zijn, moet worden 
overwogen of het noodzakelijk is vóór aanvang van de toediening 
hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen: het is algemeen niet aan te bevelen deze gegevens vóór de behandeling te genereren (7).
 
1.5.2.3.  Macroscopische necropsie  
Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische ne ­
cropsie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, 
de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Lever, nieren, 
bijnieren, testes, epididymides, uterus, ovaria, thymus, milt, hersenen en het hart van alle dieren (afgezien van stervende en/of tussentijds gedode dieren) moeten zo nodig ontdaan worden van aanhechtend 
weefsel, en ze moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden 
gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
 
De volgende weefsels moeten in een medium worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopatho ­
logische onderzoek geschikt is: elk macroscopisch waarneembaar letsel, hersenen (alle relevante delen, waaronder cerebrum, cerebel ­
lum en merg/brug), ruggenmerg (op drie niveaus: cervicaal, middent ­
horacaal en lumbaal), hypofyse, schildklier, bijschildklier, thymus, slokdarm, speekselklieren, maag. dunne en dikke darmen (met in ­
begrip van de eilandjes van Peyer), lever, alvleesklier, nieren, bij ­
nieren, milt, hart, luchtpijp en longen (behandeling door opblazen 
met een fixatief en vervolgens onderdompelen), aorta, geslachtsklie ­
ren, uterus, bijbehorende geslachtsorganen, borstklieren van wijfjes, prostaat, urineblaas, galblaas (muizen), lymfklieren (bij voorkeur één 
lymfklier op de toedieningsroute en één op een afstand van de toe ­
dieningsroute om systemische effecten op te vangen), perifere zenuw (grote beenzenuw of scheenbeen) bij voorkeur zeer dicht bij de spier, een beenmergsectie (en/of een vers beenmergaspiraat), huid en ogen 
(indien tijdens de oftalmologische onderzoeken veranderingen wer ­
den waargenomen). Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waar ­
van op basis van de bekende eigenschappen van de teststof veronder ­
steld wordt dat ze beschadigd kunnen worden, moeten worden be ­
waard.
 
1.5.2.4.  Histopathologisch onderzoek  
Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en 
bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch 
onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels. Organen en weefsels die blijken te zijn beschadigd door de teststof op het hoogste dosisniveau, moeten in alle groepen met een lagere 
dosering worden onderzocht.
 
Alle macroscopisch waarneembare beschadigingen moeten onder ­
zocht worden.  
Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satelliet ­
groepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels 
waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde 
groepen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
Er moeten individuele gegevens voor iedere testgroep worden ver ­
strekt. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in ta ­
bellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het 
begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of humaan moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat 
toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargeno ­
men toxische effecten, met inbegrip van het verloop in de tijd, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren 
dat beschadigingen vertoont, de aard van de beschadigingen en het 
percentage dieren dat elk type beschadiging vertoont.
 
Voorzover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met 
behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode 
worden geëvalueerd. De statistische methoden en de te analyseren 
gegevens moeten tijdens het ontwerp van het onderzoek worden gekozen.
 
2.2. VERSLAG VAN HET ONDERZOEK  
In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
2.2.1.  Teststof:  
— fysieke aard, zuiverheid en fysico-chemische eigenschappen;  
— identificatiegegevens;  
— medium (waar van toepassing): rechtvaardiging van het gekozen 
medium wanneer dat geen water is.  
2.2.2.  Diersoort:  
— gebruikte diersoort en stam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de proef.  
2.2.3.  Proefomstandigheden:  
— redenen voor de keuze van het dosisniveau;  
— details over de samenstelling van de teststof en voedselbereiding, 
gerealiseerde concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het pre ­
paraat;  
— details over de toediening van de teststof;  
— toegepaste, werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en 
conversiefactor van de teststofconcentratie (ppm) in het voedsel/ ­
drinkwater naar de werkelijke dosis, voorzover van toepassing;  
— details over de kwaliteit van het voedsel en drinkwater.  
2.2.4.  Resultaten:  
— lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;  
— waar van toepassing voedselverbruik en waterverbruik;  
— gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosis, inclu ­
sief toxiciteitsverschijnselen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— aard, ernst en duur van de klinische waarnemingen (al dan niet 
reversibel);  
— uitgevoerd oftalmologisch onderzoek;  
— bepalingen van de activiteit van de zintuigen, de grijpkracht en 
de motorische activiteit (indien beschikbaar);  
— uitgevoerde hematologische onderzoeken en alle resultaten;  
— uitgevoerde klinisch-biochemische onderzoeken en alle resulta ­
ten; 
— lichaamsgewicht, orgaangewichten en verhoudingen lichaams-/ ­
orgaangewicht van gestorven dieren;  
— bevindingen bij de necropsie;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevin ­
dingen;  
— indien beschikbaar absorptiegegevens;  
— waar van toepassing statistische behandeling van de resultaten.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
3. REFERENTIES  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D. E., Wallace. R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40. pp. 999—1003.  
(3) Gad. S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology.). Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691—704.  
(4) Moser, V.C, Mc Daniel, K.M., Philips, P. M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational Bat ­
tery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. 
Pharmacol, 108, pp. 267—283.  
(5) Meyer O.A.., Tilson, H. A., Byrd, W.C., Riley, M.T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233—236.
 
(6) Crofton, K. M., Howard, J.L., Moser V. C. Gill, M.W., Reiter, 
L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13. 
pp. 599—609.
 
(7) Weingand, K., Brown, G., Hall, R.  et al . (1996). „Harmonisa ­
tion of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29. pp. 198—201.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  SUBCHRONISCHE ORALE TOXICITEITSTEST: TOXICI ­
TEITSONDERZOEK (ORAAL) OP DIEREN ANDERS DAN 
KNAAGDIEREN BIJ HERHAALDE TOEDIENING (90 DAGEN)  
1. METHODE  
De methode die voor deze subchronische orale toxiciteitstest wordt 
gebruikt, is een kopie van de OECD TG 409 (1998).  
1.1. INLEIDING  
Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een 
chemische stof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests of toxici ­
teitstests met herhaalde toediening (28 dagen) eerst informatie over de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de subchronische orale 
toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Het 
onderzoek van 90 dagen levert informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde 
blootstelling gedurende een periode van snelle groei tot aan de jonge 
volgroeidheid. Het onderzoek zal informatie opleveren over de be ­
langrijkste toxische effecten, er zullen organen die beschadigd kun ­
nen worden en de mogelijkheid van accumulatie worden aange ­
geven, en er kan een inschatting worden gemaakt van een bloot ­
stellingsniveau zonder schadelijk effect, dat kan worden gebruikt bij de keuze van dosisniveaus voor chronische onderzoeken en voor de vaststelling van veiligheidscriteria voor de blootstelling 
van de mens.
 
Met de testmethode kunnen negatieve effecten van blootstelling aan 
een chemische stof bij diersoorten anders dan knaagdieren worden 
geïdentificeerd. De test wordt uitsluitend gebruikt:  
— indien uit effecten die in andere studies zijn vastgesteld, blijkt dat 
er behoefte is aan verduidelijking/karakterisering in een tweede diersoort anders dan knaagdieren;
 
— indien uit toxicokinetische studies blijkt dar het gebruik van een 
specifieke diersoort anders dan knaagdieren de beste keuze als 
proefdier is, of  
— indien andere specifieke redenen het gebruik van diersoorten 
anders dan knaagdieren rechtvaardigen.  
Zie ook algemene inleiding deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Dosis:  is de hoeveelheid teststof die wordt toegediend. De dosis 
wordt uitgedrukt in gewicht (g, mg) of in het gewicht van de teststof 
per gewichtseenheid proefdier (bv. mg/kg), of als constante voe ­
dingsconcentraties (ppm).  
Dosering:  is een algemene term die de dosis alsook de frequentie 
daarvan en de doseringsperiode omvat.  
NOAEL:  is de afkorting voor het niveau zonder waarneembaar 
schadelijk effect en is de hoogste dosis waarbij nog geen waarneem ­
bare toxiciteitsverschijnselen optreden.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt gedurende een periode van 90 dagen dagelijks 
oraal toegediend aan verscheidene groepen proefdieren, in geleidelijk 
stijgende doses. Er wordt één dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die 
tijdens het onderzoek sterven en bij dieren die aan het eind van het 
onderzoek leven, wordt necropsie verricht.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Keuze van de diersoort  
De meest gebruikte diersoort anders dan, knaagdieren is de hond, die 
van een bepaald ras moet zijn; de beagle wordt in dit verband vaak 
gebruikt. Ook andere diersoorten, bv. zwijnen en minivarkens, kun ­
nen gebruikt worden. Primaten zijn niet aan te bevelen en voor het gebruik daarvan moeten goede redenen zijn. Er moeten jonge, ge ­
zonde dieren worden gebruikt. In het geval van honden moet met de 
toediening van de dosis bij voorkeur worden begonnen als de hon ­
den 4-6 maanden maar in geen geval meer dan 9 maanden oud zijn. Indien het onderzoek wordt uitgevoerd als voorstudie van een lang ­
durig chronisch toxiciteitsonderzoek, moeten dieren van dezelfde 
soort/ras voor beide onderzoeken worden gebruikt.
 
1.4.2.  Voorbereiding van de dieren  
Voor het onderzoek worden gezonde, jonge dieren gebruikt die on ­
der gelijke huisvestings- en voedingsomstandigheden zijn gehouden 
als tijdens de test en die niet eerder voor experimenten zijn gebruikt. De duur van de acclimatisering hangt af van de gekozen diersoort en de oorsprong daarvan. In dit verband gelden de volgende aanbeve ­
lingen: ten minste vijf dagen voor honden of voor dit doel speciaal 
gefokte varkens uit een eigen kolonie en ten minste twee weken als deze dieren van externe oorsprong zijn. De proefdieren worden op basis van kenmerken als soort, stam, oorsprong, geslacht, gewicht 
en/of leeftijd ingedeeld. De dieren worden willekeurig in de controle- 
en behandelingsgroepen ingedeeld. De kooien worden zodanig neer ­
gezet dat mogelijke effecten door de plaatsing daarvan tot een mini ­
mum worden beperkt. Elk dier krijgt een uniek identificatienummer.
 
1.4.3.  Voorbereiding van de doses  
De teststof kan met de voeding, met het drinkwater, via een maag ­
sonde of in capsules worden toegediend. De wijze van de orale toediening hangt af van het doel van het onderzoek en van de 
fysisch-chemische eigenschappen van het testmateriaal.
 
Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of 
gesuspendeerd. Het verdient aanbeveling om in eerste instantie een 
oplossing suspensie in water te overwegen. Als dit niet mogelijk is, kan een oplossing/emulsie in achtereenvolgens plantaardige olie (bv. maïsolie) of een ander medium worden overwogen. Van niet-wate ­
rige media moeten de toxische eigenschappen bekend zijn. De sta ­
biliteit van de teststof tijdens de toediening moet worden vastgesteld.
 
1.5. PROCEDURE  
1.5.1.  Aantal en geslacht van de dieren  
Voor ieder dosisniveau moeten ten minste acht dieren (vier wijfjes 
en vier mannetjes) worden gebruikt. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal dieren worden ver ­
hoogd met het aantal dat tussentijds zal worden gedood. Aan 
het einde van het onderzoek moeten voldoende dieren overblijven 
om een zinvolle evaluatie van de toxische effecten mogelijk te maken. Op basis van de aanwezige kennis van de chemische stof of een stof die daar veel op lijkt, verdient het overweging 
een extra satellietgroep van acht dieren (vier per geslacht) op te 
nemen in de controlegroep en in de groep met het hoogste dosi ­
sniveau, om na de behandeling te kunnen nagaan of er sprake is van reversibiliteit of persistentie van eventuele toxische effecten. 
De duur van deze nabehandelingsperiode moet worden vastgesteld 
in overeenstemming met de waargenomen effecten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Dosisniveaus  
Ten minste drie dosisniveaus en een bijbehorende controle zijn ver ­
eist, tenzij een limiettest wordt uitgevoerd (zie 1.5.3). De dosisni ­
veaus kunnen gebaseerd zijn op de resultaten van onderzoeken met 
herhaalde toediening of van verkennende onderzoeken, en er moet 
rekening worden gehouden met bestaande toxicologische en toxico ­
kinetische gegevens die voor de teststof of aanverwante materialen beschikbaar zijn. Indien er geen beperkingen vanwege de fvsisch- 
chemische aard of de biologische effecten van de teststof zijn, moet 
het hoogste dosisniveau worden gekozen om toxiciteit te veroor ­
zaken, maar niet de dood of ernstige pijn. Er moet een afnemende 
reeks dosisniveaus worden gekozen om elke doseringsgerelateerde 
respons en een niveau zonder schadelijk effect (NOAEL) op het laagste dosisniveau aan te tonen. Doorgaans zijn twee- tot viervou ­
dige intervallen optimaal voor de instelling van de afnemende dosi ­
sniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te ver ­
kiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van 6 à 10) tussen twee doseringen.
 
De controlegroep moet een onbehandelde groep of een mediumcon ­
trolegroep zijn, voorzover een medium wordt gebruikt voor de toe ­
diening van de teststof. Afgezien van de behandeling met de teststof 
moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze worden 
behandeld als die in de testgroep. Indien een medium wordt gebruikt, moet het medium aan de controlegroep in het voor de proef maxi ­
maal gebruikte volume worden toegediend. Indien een teststof wordt 
toegediend via de voeding en een geringere voedingsopname ver ­
oorzaakt, kan een paargevoede controlegroep nuttig zijn om onder ­
scheid te maken tussen een vermindering vanwege de eetbaarheid of vanwege toxicologische veranderingen in het testmodel.
 
Er moet rekening worden gehouden met de navolgende eigenschap ­
pen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepassing is: effecten op de absorptie, distributie, metabolisme of 
retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van 
de teststof die de toxische karakteristieken daarvan kunnen verande ­
ren; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedings ­
status van de dieren.
 
1.5.3.  Limiettest  
Indien een test bij een dosisniveau van ten minste 1 000 mg/'kg 
lichaamsgewicht/dag en met gebruikmaking van de procedures die 
voor deze studie worden beschreven, een niveau zonder schadelijk 
effect oplevert en indien toxiciteit op grond van informatie over qua samenstelling aanverwante stoffen niet te verwachten is, hoeft wel ­
licht niet het uitvoeren van een volledig onderzoek met gebruikma ­
king van drie doseringsniveaus overwogen te worden. De limiettest 
moet worden uitgevoerd tenzij het blootstellingsniveau van de mens duidt op de noodzaak een hoger dosisniveau te gebruiken.
 
1.5.4.  Toediening van de doses  
De dieren krijgen gedurende een periode van 90 dagen, zeven dagen 
per week, een dosis van de teststof toegediend. Voor elk ander doseringsinterval, bv. vijf dagen per week. moet een goede reden zijn. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toe ­
gediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking 
van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. De maximale hoeveelheid vloeistof die in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het proefdier. Normaliter moet het 
volume zo laag mogelijk worden gehouden. Afgezien van irriterende 
of bijtende stoffen die normaliter bij hogere concentraties ergere effecten vertonen, moet de variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie 
zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume 
wordt gewaarborgd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toe ­
gediend, moet erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de 
teststof niet interfereren met de normale voedings- of waterbalans. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een con ­
stante voedingsconcentratie (ppm) of een constant dosisniveau als 
functie van het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; de 
gekozen methode moet worden gespecificeerd. Indien de stof via een maagsonde wordt toegediend, moeten de doses dagelijks op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten geregeld worden aan ­
gepast om een constant dosisniveau als functie van het lichaams ­
gewicht van het dier te verkrijgen. Indien een onderzoek gedurende een periode van 90 dagen wordt gebruikt als voorstudie van een langdurig chronisch toxiciteitsonderzoek, moet in beide onderzoeken 
dezelfde voeding worden gebruikt.
 
1.5.5.  Waarnemingen  
De observatieperiode moet ten minste 90 dagen duren. Dieren in 
satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog gedurende 
een gepaste periode zonder behandeling worden gehouden om herstel 
of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen.  
De proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobser ­
veerd, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip, waarbij rekening moet wor ­
den gehouden met de piekperiode van verwachte effecten na de toediening van de dosis. De klinische conditie van de dieren moet 
geregistreerd worden. Ten minste tweemaal per dag, normaliter aan 
het begin en eind van elke dag moeten alle dieren worden onder ­
zocht op tekenen van ziekelijkheid of sterfte.
 
Ten minste eenmaal vóór de eerste blootstelling (om vergelijkingen 
op hetzelfde gebied te kunnen trekken) en eenmalig een week daarna moeten alle dieren aan een uitgebreid klinisch onderzoek worden 
onderworpen. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobser ­
veerd, bij voorkeur telkens in een standaardgebied en op hetzelfde tijdstip. Er moet getracht worden verschillen in de observatiecon ­
dities tot een minimum te beperken. Alle waargenomen toxiciteits ­
verschijnselen moeten zorgvuldig worden geregistreerd, met inbegrip 
van het verloop in de tijd, de duur en de ernst ervan. Er dient onder meer te worden gelet op veranderingen van huid en vacht, ogen en slijmvliezen, het voorkomen van secreties en excreties, en autonome 
activiteiten (bv. tranenvloed, pilo-crectie, pupilgrootte, abnormaal 
ademhalingspatroon). Ook veranderingen in de manier van lopen, de houding en de reactie op de behandeling alsmede de aanwezig ­
heid van klonische of tonische bewegingen, stereotypen (bv. abnor ­
maal poetsgedrag. blijven ronddraaien) of bizar gedrag moeten ge ­
registreerd worden.
 
Vóór de toediening van de teststof en na beëindiging van het onder ­
zoek wordt een oftalmologisch onderzoek uitgevoerd, waarbij ge ­
bruik wordt gemaakt van een oftalmoscoop of een even geschikt apparaat. Dit onderzoek wordt bij voorkeur op alle dieren verricht, 
maar ten minste op die in de groepen met het hoge dosisniveau en in 
de controlegroepen. Wanneer oogafwijkingen worden vastgesteld, moeten alle dieren worden onderzocht.
 
1.5.5.1.  Lichaamsgewicht en voedsel-/waterverbruik  
Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week worden gewogen. 
Ook het voedselverbruik moet ten minste wekelijks worden gemeten. Indien de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet ook het waterverbruik ten minste wekelijks worden gemeten. Het meten van 
het waterverbruik kan ook worden overwogen bij voedsel- of maag ­
sondeonderzoeken, gedurende welke de drinkactiviteit kan veranderen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematologie en klinisch-biochemische bepalingen  
Van een bepaalde plek moeten bloedmonsters worden genomen die, 
voorzover van toepassing, onder gepaste omstandigheden bewaard moeten worden. Aan het einde van de testperiode moeten de mon ­
sters worden genomen vlak vóór het doden van de dieren of als 
onderdeel van de dodingsprocedure.
 
Aan het begin van de testperiode moeten de volgende hematologi ­
sche onderzoeken worden verricht: bepaling van het hematocriet en 
het hemoglobinegehalte, erythrocytentelling, totale en gedifferen ­
tieerde telling van de leukocyten, telling van de bloedplaatjes en meting van een maat voor het stollingsvermogen, zoals prothrombi ­
netijd of thromboplastinetijd. Deze onderzoeken moeten vervolgens 
om de maand of halverwege de testperiode en ten slotte aan het 
einde van de test worden herhaald.
 
Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke 
toxische effecten in weefsels en met name effecten op de nier en 
lever te onderzoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die 
van elk dier worden genomen aan het begin van de testperiode, om de maand of halverwege de test en ten slotte aan het einde van de 
testperiode. Tot de testgebieden die overwogen moeten worden, be ­
horen elektrolytisch evenwicht, koolhydraatstofwisseling en de lever- en nierwerking. De keuze van specifieke tests wordt beïnvloed door waarnemingen van de werking van de teststof. Vóór het nemen van 
de bloedmonsters moet de dieren gedurende een voor die diersoort 
gepaste periode voedsel worden onthouden. Tot de aanbevolen on ­
derzoeken behoren de meting van calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, glucose bij nuchtere toestand, alanineaminotransferase, 
aspartaataminotransferase, ornithinedecarboxylase, gammaglutamyl ­
transpeptidase, ureumstikstof, albumine, bloedcreatinine, totaal bili ­
rubine en totaal serumeiwit.
 
Ten minste aan het begin, vervolgens halverwege en ten slotte aan 
het einde van de studie moeten urine-onderzoeken worden verricht, 
waarbij de urinemonsters op regelmatige tijdstippen genomen moeten worden. Het volgende moet worden onderzocht: uitzien, volume, osmolaliteit of relatieve dichtheid, pH, eiwit, glucose en bloed/ ­
bloedcellen. Wanneer nodig kunnen hieraan nog parameters worden 
toegevoegd om het onderzoek van de waargenomen effecten te ver ­
lengen.
 
Bovendien moet worden overwogen markers van algemene weefsel ­
beschadiging te onderzoeken. Andere bepalingen die nodig kunnen 
zijn voor een adequate toxicologische evaluatie zijn: analyse van lipiden, hormonen, het zuur-base-evenwicht. methemoglobine en cholinesteraseremming. Wanneer nodig kunnen hieraan nog kli ­
nisch-chemische parameters worden toegevoegd om het onderzoek 
van de waargenomen effecten te verlengen. Deze moeten voor che ­
mische stoffen in bepaalde klassen of per geval geïdentificeerd wor ­
den.
 
Algemeen is een flexibele aanpak nodig afhankelijk van de diersoort 
en het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.  
1.5.5.3.  Macroscopische necropsie  
Bij alle dieren in de studie moet een volledige macroscopische ne ­
cropsie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, 
de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Lever, nieren, 
bijnieren, testes, epididymides. uterus, ovaria, thymus, milt, hersenen en het hart van alle dieren (afgezien van stervende en/of tussentijds gedode dieren) moeten zo nodig ontdaan worden van aanhechtend 
weefsel, en ze moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden 
gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
De volgende weefsels moeten in een medium worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopatho ­
logische onderzoek geschikt is: elk macroscopisch waarneembaar letsel, hersenen (alle relevante delen, waaronder cerebrum cerebellum en merg/brug), ruggenmerg (op drie niveaus: cervicaal, middentho ­
racaal en lumbaal), hypofyse. ogen, schildklier, bijschildklier, thy ­
mus, slokdarm, speekselklieren, maag, dunne en dikke darmen (met in begrip van de eilandjes van Peyer), lever, galblaas, alvleesklier, nieren, bijnieren, milt, hart, luchtpijp en longen, aorta, geslachtsklie ­
ren, uterus, bijbehorende geslachtsorganen, borstklieren van wijfjes, 
prostaat. urineblaas, lymfklieren (hij voorkeur één lymfklier op de toedieningsroute en één op een afstand van de toedieningsroute om systemische effecten op te vangen), perifere zenuw (grote beenzenuw 
of scheenbeen) bij voorkeur zeer dicht bij de spier, een beenmerg ­
sectie (en/of een vers beenmergaspiraat) en huid. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onder ­
zoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschap ­
pen van de teststof verondersteld wordt dat ze beschadigd kunnen 
worden, moeten worden bewaard.
 
1.5.5.4.  Histopathologisch onderzoek  
Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en 
bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels. 
Organen en weefsels die blijken te zijn beschadigd door de teststof 
op het hoogste dosisniveau, moeten in alle groepen met een lagere dosering worden onderzocht.
 
Alle macroscopisch waarneembare beschadigingen moeten onder ­
zocht worden.  
Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satelliet ­
groepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde 
groepen.
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
Er moeten individuele gegevens voor iedere testgroep worden ver ­
strekt. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in ta ­
bellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het 
begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of humaan moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat 
toxiciteitsverschijnselen vertoont, een beschrijving van de waargeno ­
men toxische effecten, met inbegrip van het verloop in de tijd, de duur en de ernst van eventuele toxische effecten, het aantal dieren dat beschadigingen vertoont, de aard van de beschadigingen en het 
percentage dieren dat elk type beschadiging vertoont.
 
Voorzover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met 
behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. De statistische methoden en de te analyseren 
gegevens moeten tijdens het ontwerp van het onderzoek worden 
gekozen.
 
2.2. VERSLAG VAN HET ONDERZOEK  
In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Teststof:  
— fysieke aard. zuiverheid en fysico-chemische eigenschappen;  
— identificatiegegevens;  
— medium (waar van toepassing): rechtvaardiging van het gekozen 
medium wanneer dat geen water is.  
2.2.2.  Diersoort:  
— gebruikte diersoort en stam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de proef.  
2.2.3.  Proefomstandigheden:  
— redenen voor de keuze van het dosisniveau;  
— details over de samenstelling van de teststof en voedselbereiding, 
gerealiseerde concentratie, — stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;
 
— details over de toediening van de teststof;  
— toegepaste, werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en 
conversiefactor van de teststofconcentratie (ppm) in het voedsel/ ­
drinkwater naar de werkelijke dosis, voorzover van toepassing;  
— details over de kwaliteit van het voedsel en het drinkwater.  
2.2.4.  Resultaten:  
— lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;  
— waar van toepassing voedselverbruik en waterverbruik;  
— gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosis, inclu ­
sief toxiciteitsverschijnselen;  
— aard, ernst en duur van de klinische waarnemingen (al dan niet 
reversibel);  
— uitgevoerd oftalmologisch onderzoek;  
— uitgevoerde hematologische onderzoeken en alle resultaten;  
— uitgevoerde klinisch-biochemischc onderzoeken en alle resulta ­
ten; 
— lichaamsgewicht, orgaangewichten en verhoudingen lichaams-/ ­
orgaangewicht van gestorven dieren;  
— bevindingen bij de necropsie;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevin ­
dingen;  
— indien beschikbaar absorptiegegevens;  
— waar van toepassing statistische behandeling van de resultaten.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  SUBCHRONISCHE DERMALE TOXIClTEITSTEST 90 
DAGEN-TEST MET HERHAALDE DERMALE TOEDIENING 
AAN KNAAGDIERSOORTEN  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
De teststof wordt gedurende een periode van 90 dagen dagelijks in 
geleidelijk stijgende doseringen bij verscheidene groepen proefdieren 
op de huid aangebracht. Er wordt een dosis per groep gebruikt. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks op tekenen van toxiciteit onderzocht. Op de dieren 
die tijdens het onderzoek sterven en die welke aan het eind van de 
proefnemingen nog in leven zijn, wordt necropsie verricht.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
Voor het onderzoek worden de dieren ten minste vijf dagen onder de ­
zelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Voor her onderzoek worden gezonde, jonge dieren op willekeu ­
rige wijze in de te behandelen groepen en controlegroepen ingedeeld. 
Kort voor de proefneming wordt het haar op het ruggedeelte van de romp van de proefdieren geknipt. Het dier kan ook worden geschoren, maar dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef worden uitgevoerd. Gewoonlijk 
zal het dier ongeveer om de week opnieuw moeten worden geknipt of 
geschoren. Bij het knippen of scheren van de vacht moet erop worden geler dar de huid niet wordt beschadigd. Ten minste 10 % van de li ­
chaamsoppervlakte moet voor de aanbrenging van de teststof worden 
onthaard. Bij het bepalen van de oppervlakte die moet worden onthaard, 
en de afmetingen van het verband moet rekening worden gehouden met her gewicht van het dier. Bij proefnemingen met vaste stoffen, die even ­
tueel tot poeder kunnen worden fijngemalen, moer de teststof voldoende 
met water of, zo nodig, met een passend medium worden bevochtigd, 
zodat de stof goed in contact met de huid komt. Vloeibare teststoffen worden in het algemeen onverdund gebruikt. De teststof wordt gedu ­
rende vijf tot zeven dagen per week dagelijks aangebracht.
 
1.6.2.  Proefomstandigheden  
1.6.2.1. P r o e f d i e r e n  
Er kan gebruik worden gemaakt van volwassen ratten, konijnen of 
cavia's. Ook andere diersoorten kunnen worden gebruikt, maar de 
noodzaak hiervan moet worden aangetoond. Bij het begin van het 
onderzoek mag het gewicht van de dieren niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Indien een studie naar de subchro ­
nische dermale toxiciteit wordt verricht ter voorbereiding op een 
chronisch onderzoek, dienen in beide studies dezelfde soort en 
stam te worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2. A a n t a l e n g e s l a c h t  
Voor ieder dosisniveau moeten ten minste twintig dieren (tien wijfjes 
en tien mannetjes) met een gezonde huid worden gebruikt. De vrouwtjes moeten nulliparae zijn en mogen niet drachtig zijn. Indien 
het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal 
worden verhoogd met het aantal dieren dat volgens plan voor de voltooiing van de studie zal worden gedood. Daarnaast kan een satelliet groep van twintig dieren (tien per geslacht) gedurende 90 
dagen met het hoge dosisniveau worden behandeld en nog gedurende 
28 dagen na de behandeling worden geobserveerd om na te gaan of de toxische effecten eventueel verdwijnen, voortduren of vertraagd 
tot uiting komen.
 
1.6.2.3. D o s i s n i v e a u s  
Er zijn ten minste drie dosisniveaus vereist, met een controle of een 
mediumcontrole indien een medium wordt gebruikt. De blootstel ­
lingsduur dient ten minste zes uur per dag te bedragen. De teststof moet iedere dag op dezelfde tijd worden toegediend; op gezette tijden (iedere week of om de veertien dagen) is een correctie vereist 
om ervoor te zorgen dat het dosisniveau in verhouding tot het li ­
chaamsgewicht van het dier constant blijft. Afgezien van de toedie ­
ning van de teststof, moeten de dieren in de controlegroep op de ­
zelfde wijze worden behandeld als de dieren in de proefgroep. 
Indien ter vergemakkelijking van de dosering gebruik wordt gemaakt 
van een medium, moet aan de dieren in de mediumcontrolegroep de dosis op dezelfde wijze worden toegediend als aan de dieren in de behandelde groepen en moet deze dosis even groot zijn als die van 
de dieren in de groep met het hoogste dosisniveau. Het hoogste 
dosisniveau moet leiden tot toxische effecten, maar er mogen geen of weinig sterfgevallen voorkomen. Bij het laagste dosisniveau mo ­
gen geen tekenen van toxiciteit optreden. Wanneer er een bruikbare 
schatting van de menselijke blootstelling bestaat, moet het laagste 
niveau deze overschrijden. In het ideale geval treden bij het middel ­
ste dosisniveau nauwelijks waarneembare toxische effecten op. Bij meer dan één tussendosis moet het verschil tussen de dosisniveaus 
zo groot zijn dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. 
In de groep met de geringe dosis en in de tussengroepen alsmede in de controlegroepen mogen niet veel sterfgevallen voorkomen, omdat anders een zinvolle evaluatie van de resultaten niet mogelijk is.
 
Indien toediening van de teststof tot ernstige huidirritatie leidt, moe ­
ten de concentraties worden verlaagd, wat vermindering of uitblijven 
van andere toxische effecten bij het hoge dosisniveau tot gevolg kan hebben. Indien de huid ernstig is beschadigd, kan het bovendien noodzakelijk zijn de studie te beëindigen en een nieuwe studie met 
lagere concentraties te beginnen.
 
1.6.3. H o o g s t e t e t e s t e n d o s i s  
Indien bij een voorafgaand onderzoek bij een dosisniveau van 1 000 
mg/kg of een hoger niveau, dat is gerelateerd aan het niveau waaraan de mens, voor zover bekend, kan worden blootgesteld, geen toxische effecten optreden, zijn verdere proeven wellicht niet noodzakelijk.
 
1.6.4 O b s e r v a t i e p e r i o d e  
De proefdieren moeten dagelijks worden onderzocht op tekenen van 
toxiciteit. Het tijdstip waarop de dood intreedt, het tijdstip waarop de 
toxiciteitsverschijnselen zich voor het eerst voordoen, en het tijdstip 
waarop zij weer verdwijnen, moeten worden vastgelegd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5.  U i t v o e r i n g  
De dieren moeten apart in kooien worden ondergebracht. De dieren 
worden in het ideale geval gedurende een periode van 90 dagen, zeven dagen per week, met de teststof behandeld.
 
Dieren in satellietgroepen voor latere waarnemingen moeten nog 28 
dagen onbehandeld blijven om herstel of voortduren van de toxische effecten te kunnen vaststellen. De blootstellingsduur moet zes uur per dag bedragen.
 
De teststof moet gelijkmatig worden verdeeld over een oppervlakte 
van ongeveer 10 % van de totale lichaamsoppervlakte. Bij zeer toxische stoffen mag de te bedekken oppervlakte kleiner zijn, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet met een zo dun en gelijk ­
matig mogelijk aangebrachte laag worden bedekt.
 
De teststof moet voor de duur van de blootstelling door middel van 
poreus verbandgaas en niet-irriterend plakband in contact met de huid blijven. Dit gedeelte van de huid moet op een geschikte wijze 
nog verder worden bedekt om het verbandgaas en de teststof op hun 
plaats te houden en om te verhinderen dat de dieren de teststof oraal opnemen. Om dit te voorkomen kunnen hulpmiddelen worden ge ­
bruikt waarmee de dieren in hun bewegingsvrijheid worden belem ­
merd, maar het is niet aan te bevelen de bewegingsvrijheid van de 
dieren volledig te beperken,
 
Aan het eind van de blootstellingsperiode wordt de testerende test ­
stof waar mogelijk met water van de huid verwijderd of anders door middel van een andere geschikte schoonmaakmethode.
 
Alle dieren moeten dagelijks worden gecontroleerd; tekenen van 
toxiciteit moeten samen met het tijdstip waarop deze voor het eerst zijn opgetreden, de mate en de duur ervan worden genoteerd. Bij het observeren van de dieren in de kooien moet aandacht worden be ­
steed aan veranderingen in huid en vacht, ogen en slijmvliezen, 
ademhaling, bloedsomloop, autonoom en centraal zenuwstelsel, so ­
matomotorische activiteit en gedrag. Het verbruik van voer moet wekelijks worden gemeten en de dieren moeten iedere week worden 
gewogen. De dieren moeten regelmatig worden geobserveerd om te 
voorkomen dat zij voor de studie verloren gaan als gevolg van oorzaken als kannibalisme, autolyse van weefsels of verkeerde huis ­
vesting. Na afloop van de onderzoekperiode wordt op alle over ­
levende dieren van de behandelde groepen, afgezien van die in de 
satellietgroepen, necropsie verricht. Indien stervende dieren worden aangetroffen, moeten zij worden verwijderd; ook op hen wordt ne ­
cropsie verricht.
 
Bij alle dieren, met inbegrip van die uit de controlegroep, worden 
gewoonlijk de volgende onderzoekingen verricht:  
a) Voor de blootstelling aan de teststof en na afloop van het onder ­
zoek dient bij voorkeur bij alle dieren, maar ten minste bij de 
groep met de hoge dosis en de controlegroep oogonderzoek met 
behulp van een oogspiegel of een ander voor dit doel geschikt instrument plaats te vinden. Indien er veranderingen in de ogen worden vastgesteld, moeten alle dieren worden onderzocht.
 
b) Aan het einde van de onderzoekperiode vindt een hematologisch 
onderzoek plaats, dat onder meer omvat: bepaling van het hema ­
tocriet en het hemoglobinegehalte, telling van de erytrocyten, totaaltelling en gedifferentieerde telling van de leukocyten, als ­
mede meting van de stollingseigenschappen zoals stollingstijd, 
protrombinetijd en tromboplastinetijd, of telling van de bloed ­
plaatjes.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Aan het einde van de onderzoekperiode dienen klinische en bio ­
chemische bepalingen op het bloed te worden verricht. Voor alle 
studies in aanmerking komende testen zijn: elektrolytenbalans, koolhydraatstofwisseling, alsmede de lever- en nierfunctie. De selectie van specifieke testen is afhankelijk van de waarnemingen 
met betrekking tot het werkingsmechanisme van de stof. Het 
onderzoek is eventueel uit te breiden met metingen van: calcium, fosfor, chloride, natrium, kalium, nuchter glucosegehalte (met een aan de diersoort aangepaste periode van vasten), 
serumglutamaatpyruvaattransaminase (
 1 ), serumglutamaatoxaala 
cetaattransaminase (  2 ), ornithinedecarboxylase, gammaglutamyl ­
transpeptidase, ureumstikstof, albumine, bloedcreatinine, totaal bi ­
lirubine en totaal serumproteïne. Voor een goede toxicologische 
evaluatie kan de bepaling van de lipiden, hormonen, zuur/base- 
evenwicht, methemoglobine en cholinesterase-activiteit noodzake ­
lijk zijn. Om het onderzoek van de waargenomen effecten uit te breiden kan zo nodig verder klinisch-biochemisch onderzoek 
worden verricht.
 
d) Routinematig urineonderzoek is alleen vereist wanneer daartoe op 
grond van de verwachte of waargenomen toxiciteit een indicatie bestaat.
 
In het geval van ontoereikende basisgegevens uit het verleden dient 
de bepaling van hematologische en klinisch-biochemische parameters 
voordat met de dosering wordt begonnen aandacht te krijgen.  
M a c r o s c o p i s c h e n e c r o p s i e  
Op alle dieren moet een volledige macroscopische necropsie worden 
verricht, waarbij het uitwendige lichaamsoppervlak, alle lichaams ­
openingen, alsmede de schedel-, borst- en buikholte en hun inhoud worden onderzocht. De lever, nieren, bijnieren en testes moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om uitdroging te 
voorkomen. De volgende organen en weefsels moeten in een ge ­
schikt medium worden bewaard voor eventueel later histopatholo ­
gisch onderzoek: alle organen die met het blote oog zichtbare letsels vertonen, hersenen — inclusief delen van medulla/pons, cortex cere ­
belli en cortex cerebri, hypofyse, schildklier/bijschildklieren, thymus ­
weefsel, (luchtpijp), longen, hart, aorta, speekselklieren, lever, milt, nieren, bijnieren, alvleesklier, geslachtsklieren, secundaire geslachts ­
organen, galblaas (indien aanwezig), slokdarm, maag, duodenum, 
jejunum, ileum, blinde darm, colon, rectum, urineblaas, representa ­
tieve lymfklieren, (vrouwelijke borstklier), (dijbeenspieren), perifere zenuwen, (ogen), (borstbeen met beenmerg), (dijbeen — inclusief gewrichtsvlak), (ruggenmerg op drie plaatsen — cervicaal, mediot ­
horacaal en lumbaal) en (traanklieren). (De tussen haakjes vermelde 
weefsels hoeven alleen te worden onderzocht als daarvoor aanwij ­
zingen zijn vanwege toxicologische waarnemingen of als het orgaan is aangetast.)
 
H i s t o p a t h o l o g i s c h o n d e r z o e k  
a) Op de normale en behandelde huid en de organen en weefsels 
van alle dieren in de controlegroep en in de groep die de hoogste dosis heeft ontvangen, moet een volledig histopathologisch onder ­
zoek worden verricht.
 
b) Alle met het blote oog zichtbare letsels moeten worden onder ­
zocht.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Thans bekend als serumalanineaminotransferase. 
( 2 ) Thans bekend als serumaspartaataminotransferase.
 c) De aangetaste organen dienen in dieren in andere dosisgroepen te 
worden onderzocht.  
d) Bij gebruikmaking van ratten dienen de longen van de dieren in 
de groep die een lage dosis heeft ontvangen en van die in de 
tussengroep histopathologisch te worden onderzocht op tekenen van infectie, aangezien op deze manier een goed beeld van de gezondheidstoestand van de dieren wordt verkregen. Verder rou ­
tinematig histopathologisch onderzoek is bij de dieren in deze 
groepen niet vereist, maar moet steeds worden verricht op de organen die in de groep die een hoge dosis heeft ontvangen, letsels bleken te vertonen.
 
e) Wordt van een satellietgroep gebruik gemaakt, dan moet histop ­
athologisch onderzoek worden verricht op de weefsels en organen 
waar bij andere behandelde groepen effecten blijken te zijn opge ­
treden.  
2. GEGEVENS  
De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen 
worden samengevat: het aantal dieren bij het begin van het onder ­
zoek, het aantal dieren dat letsels vertoont, de aard van de letsels en 
het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. De resul ­
taten moeten met behulp van een voor dit doel geschikte statistische methode worden geëvalueerd. Iedere erkende statistische methode 
kan hiervoor worden gebruikt.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
— diersoort, stam, herkomst, leefomstandigheden, voer, enzovoort;  
— proefomstandigheden;  
— dosisniveaus (met het eventuele medium) en concentraties;  
— waar mogelijk, het dosisniveau waarop geen effect is waargeno ­
men;  
— gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis;  
— tijdstip gedurende de studie waarop de dood intreedt of aangeven 
of dieren tot het einde van de proef in leven bleven;  
— beschrijving van toxische of andere effecten;  
— tijdstip waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en 
verloop hiervan;  
— gegevens over voer en lichaamsgewicht;  
— oftalmologische bevindingen;  
— uitgevoerd hematologisch onderzoek en resultaten;  
— uitgevoerd klinisch-biochemisch onderzoek en resultaten (resul ­
taten van het urineonderzoek inbegrepen);  
— bevindingen van de necropsie;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindin ­
gen; 
— waar toepasselijk, statistische verwerking van de resultaten;  
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  SUBCHRONISCHE INHALATIETOXICITEIT: ONDERZOEK VAN 
90 DAGEN  
SAMENVATTING  
Deze herziene testmethode B.29 is ontworpen om de toxiciteit van een teststof 
via de inhalatieweg gedurende een subchronische periode (90 dagen) volledig te 
karakteriseren, en robuuste gegevens op te leveren voor kwantitatieve beoordelin ­
gen van de inhalatierisico’s. Groepen van tien mannelijke en 10 vrouwelijke knaagdieren worden gedurende een periode van 90 dagen (13 weken) 6 uur per dag blootgesteld aan a) de teststof bij drie of meer concentraties, b) gefilterde 
lucht (negatieve controle) en/of c) het medium (mediumcontrole). De dieren 
worden doorgaans vijf dagen per week blootgesteld, maar zeven dagen per week is ook toegestaan. Er worden altijd zowel mannetjes als vrouwtjes getest, maar zij kunnen bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld indien 
bekend is dat een van beide geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof. 
Deze methode geeft de onderzoeksleider de flexibiliteit om satellietgroepen (re ­
versibiliteitsgroepen), het tussentijds doden van dieren, bronchoalveolaire lavage, neurologische tests en aanvullende klinisch-pathologische en histopathologische 
beoordelingen in het onderzoek op te nemen, om de toxiciteit van een teststof 
beter te kunnen karakteriseren.
 
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 413 (2009) van de OE ­
SO. Testrichtlijn 413 (TG 413), de oorspronkelijke testrichtlijn voor sub ­
chronische inhalatie, werd in 1981 vastgesteld (1). Deze testmethode B.29 (die gelijkwaardig is aan de herziene versie van TG 413 (2009)) is bij ­
gewerkt om haar in overeenstemming te brengen met de stand van de 
wetenschap en om te voldoen aan de huidige en toekomstige regelgevings ­
behoeften.
 
2. Onderzoek naar subchronische inhalatietoxiciteit wordt in de eerste plaats 
gebruikt om de concentraties waarmee de risico’s voor werknemers op de 
werkplek worden beoordeeld in regelgeving vast te leggen. Ook wordt het 
gebruikt om de risico’s voor mensen te beoordelen in de woonomgeving, het verkeer en het milieu. Met deze methode kunnen nadelige effecten na herhaalde dagelijkse blootstelling aan een teststof door inhalatie gedurende 
90 dagen (ongeveer 10 % van de levensduur van een rat) worden gekarak ­
teriseerd. De uit onderzoek naar subchronische inhalatietoxiciteit verkregen gegevens kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve risicobeoordelingen en voor de keuze van de concentraties voor onderzoek naar chronische toxici ­
teit. Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor het testen van nanoma ­
terialen. De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in het laatste deel van dit hoofdstuk en in GD 39 (2).
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
3. Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof in 
overweging nemen voordat het onderzoek wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het gebruik van 
dieren tot een minimum wordt beperkt. Voor de keuze van geschikte test ­
concentraties kan onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde 
toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling 
van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische stoffen met een verwante structuur; en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende gegevens. In het geval van verwachte 
of in de loop van het onderzoek waargenomen neurotoxiciteit, kan de onder ­
zoeksleider ervoor kiezen om geschikte evaluaties op te nemen, zoals een „functional observational battery” (FOB) en meting van de motorische ac ­
tiviteit. Hoewel de timing van de blootstellingen ten opzichte van specifiek 
onderzoek een kritieke factor kan vormen, mogen deze nieuwe activiteiten 
niet interfereren met de basisopzet van het onderzoek.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Verdunningen van bijtende of irriterende teststoffen kunnen worden getest 
bij concentraties die de gewenste mate van toxiciteit opleveren. Zie GD 39 
(2) voor nadere informatie. Bij blootstelling van dieren aan deze materialen moeten de doelconcentraties laag genoeg zijn om geen hevige pijn en angst te veroorzaken, maar wel toereikend zijn om de concentratie/responscurve 
uit te breiden tot niveaus die stroken met de wetenschappelijke en regelge ­
vingsdoelstellingen van de test. Deze concentraties moeten per geval worden gekozen, bij voorkeur op basis van een adequaat opgezet bereikbepaling ­
onderzoek dat informatie oplevert over het kritische eindpunt, eventuele 
irritatiedrempels en het moment van optreden (zie de punten 11 tot en 
met 13). De keuze voor een bepaalde concentratie moet worden gemoti ­
veerd.
 
5. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige 
en voortdurende angst vertonen, moeten op humane wijze worden gedood. 
Stervende dieren worden op dezelfde wijze beschouwd als dieren die tijdens 
de test sterven. De OESO-leidraad inzake humane eindpunten (3) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te her ­
kennen.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
6. Er worden gezonde jonge volwassen knaagdieren van gangbare laboratori ­
umstammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten. Als een andere soort wordt gebruikt, moet dit worden gemotiveerd.
 
Voorbereiding van de dieren  
7. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig 
zijn. Op de dag waarop zij willekeurig worden ingedeeld, moeten de jonge 
volwassen dieren zeven tot negen weken oud zijn en een lichaamsgewicht 
hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht. De dieren worden willekeurig gekozen, gemerkt om elk dier af ­
zonderlijk te kunnen identificeren en vóór het begin van de test gedurende 
minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in 
het laboratorium te laten wennen.
 
Dierhouderij  
8. De dieren moeten individueel worden gemerkt, bij voorkeur met onder ­
huidse transponders, om de waarnemingen te vergemakkelijken en verwar ­
ring te voorkomen. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren ver ­
blijven, moet 22 ± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 
30 en 70 % gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt zal 
dit niet altijd mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het algemeen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag 
echter niet zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt 
gestoord en moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de 
fixeerbuizen noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige licha ­
melijke, thermische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstemperatuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er 
generieke gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante 
veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voor ­
afgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol worden blootgesteld, worden tijdens de bloot ­
stelling individueel gehuisvest om te voorkomen dat zij het testaerosol 
filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertificeerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater uit de waterlei ­
ding. Er wordt kunstlicht gebruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur 
donker.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalatiekamers  
9. Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard 
van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling 
via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de 
neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt 
door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag 
worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren 
niet meer dan 5 % van het volume van de kamer innemen. De technische 
principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (2).
 
TOXICITEITSONDERZOEK  
Limietconcentraties  
10. Anders dan bij acuut onderzoek zijn er geen vastgestelde limietconcentraties 
bij onderzoek naar subchronische inhalatietoxiciteit. Bij het vaststellen van 
de maximale geteste concentratie moet rekening worden gehouden met: 1) 
de maximaal haalbare concentratie, 2) het niveau waaraan mensen in het ongunstigste geval zouden worden blootgesteld („worst case”), 3) de nood ­
zaak een toereikende zuurstoftoevoer in stand te houden, en/of 4) over ­
wegingen met het oog op dierenwelzijn. Indien geen op reële gegevens 
gebaseerde grenswaarden beschikbaar zijn, kunnen de limietwaarden voor acute-toxiciteitsonderzoek van Verordening (EG) nr. 1272/2008 (13) worden gebruikt (d.w.z. tot een maximale concentratie van 5 mg/l voor aerosolen, 
20 mg/l voor dampen en 20 000 ppm voor gassen); zie GD 39 (2). Als het 
nodig is deze limietwaarden te overschrijden voor het testen van gassen of zeer vluchtige teststoffen (bv. koelmiddelen), moet dit worden gemotiveerd. De limietconcentratie moet tot onmiskenbare toxiciteit leiden zonder onno ­
dige stress bij de dieren te veroorzaken of hun levensduur te beïnvloeden 
(3).
 
Bereikbepalingonderzoek  
11. Alvorens te beginnen met het hoofdonderzoek, is het doorgaans nodig een 
bereikbepalingonderzoek uit te voeren. Een bereikbepalingonderzoek is uit ­
gebreider dan een verkennende test, omdat het zicht niet beperkt tot de 
keuze van de concentratie. De tijdens een bereikbepalingonderzoek opge ­
dane kennis kan ervoor zorgen dat het hoofdonderzoek succesvol verloopt. Een bereikbepalingonderzoek kan bijvoorbeeld technische informatie op ­
leveren met betrekking tot analysemethoden, deeltjesgroottebepaling, het 
herkennen van toxische mechanismen, klinisch-pathologische en histopatho ­
logische gegevens, en schattingen van mogelijke NOAEL- en MTC-concentraties in het hoofdonderzoek. De onderzoeksleider kan ervoor 
kiezen het bereikbepalingonderzoek te gebruiken om de drempelwaarde voor 
irritatie van de luchtwegen (bv. door middel van histopathologisch onder ­
zoek van de luchtwegen, het testen van de longfunctie, of bronchoalveolaire lavage), de hoogste concentratie die zonder onnodige stress door de dieren 
wordt verdragen en de parameters waarmee de toxiciteit van een teststof het 
best kan worden gekarakteriseerd, te bepalen.
 
12. Een bereikbepalingonderzoek kan één of meer concentratieniveaus omvat ­
ten. Afhankelijk van de gekozen eindpunten worden bij elk concentratieni ­
veau drie tot zes mannetjes en drie tot zes vrouwtjes blootgesteld. Een 
bereikbepalingonderzoek duurt ten minste vijf dagen en doorgaans niet lan ­
ger dan 28 dagen. In het testverslag moet de keuze van de concentraties voor het hoofdonderzoek worden gemotiveerd. Het hoofdonderzoek heeft tot 
doel een verband tussen concentratie en respons aan te tonen op basis van 
wat naar verwachting het gevoeligste eindpunt zal zijn. De lage concentratie is bij voorkeur de concentratie waarbij geen schadelijk effect werd vast ­
gesteld („no-observed adverse effect”), de hoge concentratie moet tot on ­
miskenbare toxiciteit leiden zonder onnodige stress bij de dieren te veroor ­
zaken of hun levensduur te beïnvloeden (3).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Bij het kiezen van de concentratieniveaus voor het bereikbepalingonderzoek 
moet met alle beschikbare informatie rekening worden gehouden, met in ­
begrip van structuur-activiteitrelaties en gegevens over vergelijkbare stoffen (zie punt 3). Een bereikbepaling onderzoek kan de vanuit mechanistisch oogpunt als het meest gevoelig beschouwde eindpunten bevestigen of weer ­
leggen, bv. cholinesteraseremming door organofosfaten, vorming van me ­
themoglobine door voor erytrocyten toxische stoffen, schildklierhormonen (T
 3 , T 4 ) voor thyreotoxische stoffen, eiwit, LDH, of neutrofielen in bron ­
choalveolaire lavage voor onschadelijke, slecht oplosbare deeltjes of longir ­
ritatie veroorzakende aerosolen.  
Hoofdonderzoek  
14. Het hoofdonderzoek naar subchronische toxiciteit omvat doorgaans drie 
concentratieniveaus en, waar nodig, parallelle negatieve controles (luchtcon ­
troles) en/of mediumcontroles (zie punt 18). Voor de keuze van geschikte blootstellingsniveaus moet gebruik worden gemaakt van alle beschikbare 
gegevens, met inbegrip van de resultaten van onderzoek naar systemische 
toxiciteit, metabolisme en kinetiek (er moet speciaal op worden gelet dat hoge concentratieniveaus waardoor kinetische processen worden verzadigd, worden vermeden). Elke testgroep bestaat uit twintig knaagdieren (tien man ­
netjes en tien vrouwtjes) die over een periode van 13 weken gedurende vijf 
dagen per week telkens 6 uur per dag aan de teststof worden blootgesteld (de totale duur van het onderzoek is ten minste 90 dagen). De dieren mogen ook zeven dagen per week worden blootgesteld (bv. bij het testen van 
geneesmiddelen die worden geïnhaleerd). Indien bekend is dat een van beide 
geslachten gevoeliger is voor een bepaalde teststof, kunnen beide geslachten bij verschillende concentratieniveaus worden blootgesteld om het verband tussen concentratie en respons nauwkeuriger te kunnen bepalen, zoals be ­
schreven in punt 15. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via 
de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. Indien een blootstellingsduur van minder dan 6 uur/dag wordt gebruikt, of er 
onderzoek naar blootstelling van het hele lijf met een lange tijdsduur (bv. 
22 uur/dag) moet worden verricht, moet dit worden gemotiveerd (zie GD 39 (2)). Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder, tenzij de blootstelling langer duurt dan 6 uur. Tijdens een blootstelling van het 
hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
 
15. De gekozen doelconcentraties moeten het mogelijk maken de doelorganen te 
identificeren en een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te 
tonen:  
— het hoge concentratieniveau moet toxische effecten veroorzaken, maar 
niet tot aanhoudende verschijnselen of sterfte leiden die een deugdelijke evaluatie belemmeren;
 
— het (de) tussenliggende concentratieniveau(s) moeten zodanig zijn ver ­
deeld dat een gradatie in toxische effecten tussen de lage en hoge con ­
centratie wordt verkregen;  
— het lage concentratieniveau moet weinig of geen tekenen van toxiciteit 
opleveren.  
Tussentijds doden van dieren  
16. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal dieren 
bij elk blootstellingsniveau worden verhoogd met het aantal dieren dat voor de voltooiing van het onderzoek zal worden gedood. Het tussentijds doden 
van dieren moet worden gemotiveerd, en er moet op adequate wijze reke ­
ning mee worden gehouden bij de statistische analysen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek)  
17. Een satellietonderzoek (reversibiliteitsonderzoek) kan worden gebruikt voor 
observatie van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van toxiciteit gedurende een geschikte periode van ten minste 14 dagen na de 
behandeling. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) bestaan uit tien man ­
netjes en tien vrouwtjes die gelijktijdig met de proefdieren in het hoofd ­
onderzoek worden blootgesteld. Satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen) moeten bij het hoogste concentratieniveau aan de teststof worden bloot ­
gesteld en waar nodig moeten er parallelle luchtcontroles en/of mediumcon ­
troles zijn (zie punt 18).
 
Controledieren  
18. De dieren voor de parallelle negatieve controle (luchtcontrole) worden op 
identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen, behalve dat zij worden blootgesteld aan gefilterde lucht in plaats van aan de teststof. Wan ­
neer voor het verkrijgen van de testatmosfeer water of een andere stof wordt 
gebruikt, moet in plaats van een negatieve controlegroep (luchtcontro ­
legroep) een mediumcontrolegroep in het onderzoek worden opgenomen. Waar mogelijk moet water worden gebruikt als het medium. Wanneer water wordt gebruikt als het medium moeten de controledieren worden bloot ­
gesteld aan lucht met dezelfde relatieve luchtvochtigheid als voor de bloot ­
gestelde groepen wordt gebruikt. De keuze van een geschikt medium vindt plaats op basis van een correct uitgevoerde voorstudie of van historische 
gegevens. Als de toxiciteit van een medium niet goed bekend is, kan de 
onderzoeksleider ervoor kiezen zowel een negatieve controle (luchtcontrole) als een mediumcontrole te gebruiken, maar dit wordt sterk afgeraden. Indien uit historische gegevens blijkt dat een medium niet toxisch is, is een nega ­
tieve controlegroep (luchtcontrolegroep) niet nodig, en wordt alleen een 
mediumcontrole gebruikt. Indien een voorstudie van een in een medium bereide teststof uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is en dat deze mediumcon ­
trole moet worden gebruikt.
 
BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Toediening van concentraties  
19. De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, 
aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentra ­
ties en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij 
hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden. Deeltjes ­
materiaal kan aan mechanische processen worden onderworpen om een 
kleinere deeltjesgrootte te verkrijgen. Nadere richtsnoeren zijn opgenomen in GD 39 (2).
 
Deeltjesgrootteverdeling  
20. Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, 
wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een 
massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 3 μm 
en een geometrische standaardafwijking ( σ
 g ) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen 
(4). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden te ha ­
len, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk 
blijkt. Metaaldampdeeltjes kunnen bijvoorbeeld kleiner zijn dan deze norm ­
waarde, en geladen deeltjes en vezels juist groter.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Bereiding van de teststof in een medium  
21. In het ideale geval wordt de teststof zonder medium getest. Indien het 
noodzakelijk is een medium te gebruiken om een geschikte deeltjesgrootte en concentratie van de teststof te verkrijgen, wordt de voorkeur gegeven aan 
water. Wanneer een teststof wordt opgelost in een medium, moet de stabi ­
liteit ervan worden aangetoond.
 
CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Luchtdoorstroming in de kamer  
22. Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de blootstellings ­
kamer zorgvuldig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur 
geregistreerd. De real-time controle van de concentratie (of stabiliteit in de tijd) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische pa ­
rameters waarbij indirect alle relevante dynamische parameters voor het 
verkrijgen van de atmosfeer kunnen worden geregeld. Indien de concentratie 
real-time wordt gecontroleerd, kan de frequentie waarmee de luchtdoorstro ­
ming wordt gemeten, worden teruggebracht tot één meting per blootstelling per dag. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen worden 
gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgeademde lucht 
niet opnieuw wordt ingeademd. Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kooldioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat deze normwaarde niet kan worden gehaald, moet de 
zuurstof- en kooldioxideconcentratie worden gemeten. Wanneer uit de me ­
tingen op de eerste blootstellingsdag blijkt dat de waarden voor deze gassen op het juiste niveau liggen, zijn geen verdere metingen nodig.
 
Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer  
23. De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Voor 
zover mogelijk wordt, zowel bij blootstelling via de neus alleen als bij blootstelling van het hele lijf, tijdens elke blootstelling de relatieve vochtig ­
heid in het ademhalingsgebied van de dieren doorlopend gecontroleerd en 
ten minste elk uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt bij voorkeur tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege interferen ­
tie tussen de teststof en de testmethode.
 
Teststof: nominale concentratie  
24. Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer 
berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de 
gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het in ­
halatiekamersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet ge ­
bruikt om de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een ver ­
gelijking tussen de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vormt 
een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om problemen bij het genereren te ontdekken.
 
Teststof: feitelijke concentratie  
25. De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof zoals bemonsterd 
in het ademhalingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke me ­
thoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische 
reactie gebaseerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of 
niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één component of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en 
moeten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van 
de teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
poeders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetri ­
sche analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens 
vereist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht vergelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette 
tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de 
lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn verzameld.
 
26. Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt gedurende het 
onderzoek en het testmonster wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien 
technisch mogelijk de identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde ver ­
ontreinigingen en onzuiverheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekopper ­
vlak, moleculair gewicht op basis van massaspectroscopie of gaschromato ­
grafie, of andere schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoor ­
delijk is voor de identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in be ­
perkte mate bevestigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
 
27. De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden. Een voor ­
ziening voor real-time controle, zoals een aerosol-fotometer voor aerosolen, of een totaal-koolwaterstofanalysator voor dampen, kunnen worden gebruikt 
om de stabiliteit van de blootstellingsvoorwaarden aan te tonen. De feitelijke 
concentratie in de kamer moet gedurende elke blootstellingsdag voor elk blootstellingsniveau ten minste 3 keer worden gemeten. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet mogelijk is, is één 
monster per blootstellingsperiode aanvaardbaar. In het ideale geval wordt 
dit monster in dat geval gedurende de volledige blootstellingsperiode ver ­
zameld. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentratie en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer 
dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % 
bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t
 95 ) wordt berekend en gerap ­
porteerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt ge ­
genereerd. Hierbij wordt rekening gehouden met de equilibratietijd van de 
kamer (t  95 ) en de vervaltijd. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het schatten 
van t  95 opgenomen.  
28. Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen 
(bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte 
eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer ver ­
schillend gedragen. Daarom moet van elke fase (damp/gas en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) worden gekozen, normaliter het voornaam ­
ste werkzame bestanddeel in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel 
is, wordt de analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts voor het werkzame bestanddeel of de indicatorstof (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 
39 (2).
 
Teststof: deeltjesgrootteverdeling  
29. De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt voor ieder concentratieni ­
veau ten minste wekelijks bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een cascade-impactor en het 
alternatieve instrument verkregen resultaten gelijkwaardig zijn, mag het al ­
ternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een 
gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler gebruikt om de doeltref ­
fendheid van de verzameling met het primaire instrument te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filteranalyse verkregen massacon ­
centraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (2)). Indien in 
een vroeg stadium van de studie de gelijkwaardigheid bij alle geteste con ­
centraties kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden ge ­
nomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens 
worden verkregen waardoor herhaling van het onderzoek noodzakelijk is.
 
31. Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid be ­
staat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of in ­
dien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden.
 
WAARNEMINGEN  
32. De dieren worden voor, tijdens en na de blootstellingsperiode klinisch ge ­
observeerd. Afhankelijk van de reactie van de dieren tijdens de blootstelling kunnen frequentere observaties nodig zijn. Indien het observeren van de dieren wordt belemmerd door het gebruik van fixeerbuizen, slecht verlichte 
kamers voor het hele lijf, of ondoorzichtige atmosferen, moeten de dieren 
zorgvuldig worden geobserveerd na afloop van de blootstelling. Door de volgende dag vóór de blootstelling te observeren kan eventuele reversibiliteit 
of verergering van toxische effecten worden beoordeeld.
 
33. Alle observaties worden geregistreerd en van elk dier wordt een apart over ­
zicht bijgehouden. Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn worden 
gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig mogelijk ge ­
registreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.  
34. Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar 
veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de 
ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het zenuwstelsel, de somatomotori ­
sche activiteit en gedragspatronen. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speekselafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens 
opleveren voor met de behandeling of opsluiting verband houdende reflec ­
toire bradypneu of hypo-/hyperthermie. In het onderzoeksprotocol kunnen aanvullende beoordelingen worden opgenomen, zoals kinetiek, biomonito ­
ring, longfunctie, retentie van slecht oplosbare stoffen die zich in longweef ­
sel ophopen, en gedragsveranderingen.
 
LICHAAMSGEWICHT  
35. Het gewicht van elk dier wordt kort voor de eerste blootstelling geregis ­
treerd, op dag 0 en vervolgens twee keer per week (bijvoorbeeld op vrijdag 
en maandag, om het herstel gedurende een weekend zonder blootstelling aan 
te tonen, of volgens een tijdsinterval om de systemische toxiciteit te kunnen beoordelen), alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geë ­
uthanaseerd. Indien er gedurende de eerste vier weken geen effecten optre ­
den, kan het lichaamsgewicht van de dieren gedurende het vervolg van de 
studie wekelijks worden gemeten. Indien satellietgroepen (reversibiliteits ­
groepen) worden gebruikt, moeten de dieren in deze groepen ook gedurende de hele herstelperiode wekelijks gewogen worden. Bij de beëindiging van 
het onderzoek moeten alle dieren kort voordat zij worden gedood, worden 
gewogen om een onvertekende berekening van de verhouding tussen or ­
gaangewichten en lichaamsgewicht mogelijk te maken.
 
VOEDSEL- EN WATERVERBRUIK  
36. Het voedselverbruik wordt wekelijks gemeten. Het waterverbruik kan ook 
worden gemeten.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINISCHE PATHOLOGIE  
37. Voor alle dieren, met inbegrip van de dieren in de controlegroepen en 
satellietgroepen (reversibiliteitsgroepen), worden klinisch-pathologische be ­
oordelingen uitgevoerd wanneer zij worden gedood. Het tijdsinterval tussen 
het einde van de blootstelling en de aftapping van het bloed moet worden 
geregistreerd, met name wanneer het desbetreffende eindpunt snel naar de uitgangswaarde terugkeert. Voor parameters met een korte plasmahalfwaar ­
detijd (bv. COHb, CHE, en MetHb) is het wenselijk om na het einde van de 
blootstelling monsters te nemen.
 
38. Tabel 1 bevat een lijst van de klinisch-pathologische parameters die door ­
gaans voor elk toxicologisch onderzoek vereist zijn. Urineonderzoek hoeft 
niet routinematig te worden uitgevoerd, maar kan worden verricht wanneer 
dit op grond van de verwachte of waargenomen toxiciteit nuttig wordt geacht. De onderzoeksleider kan ervoor kiezen aanvullende parameters te 
beoordelen om de toxiciteit van een teststof beter te kunnen karakteriseren 
(bijv. cholinesterase, lipiden, hormonen, zuur/base-evenwicht, methemoglo ­
bine of Heinz-lichaampjes, creatinekinase, verhouding myeloïde/erytroïde cellen, troponines, arteriële bloedgassen, lactaatdehydrogenase, sorbitolde ­
hydrogenase, glutamaatdehydrogenase, en gamma-glutamyltranspeptidase.
 
Tabel 1  
Klinisch-pathologische standaardparameters  
Hematologisch  
Telling van de erytrocyten 
Hematocriet 
Hemoglobinegehalte 
Hemoglobinegehalte per erytrocyt Gemiddeld volume van de erytrocyten Hemoglobinegehalte per volume-een ­
heid erytrocyten 
Reticulocyten Totale telling van de leukocyten 
Gedifferentieerde telling van de 
leukocyten 
Telling van de bloedplaatjes 
Stollingsvermogen (een van de 
mogelijkheden kiezen): 
— Prothrombinetijd 
— Stollingstijd — Partiële thromboplastinetijd
 
Klinisch-chemisch  
Glucose (*) 
Totaal cholesterol Triglyceriden 
Bloedureumstikstof 
Totaal bilirubine Creatinine 
Totaal eiwit 
Albumine Globuline Alanineaminotransferase 
Aspartaataminotransferase Alkalische fosfatase 
Kalium 
Natrium Calcium 
Fosfor 
Chloride
 
Urineonderzoek (facultatief)  
Voorkomen (kleur en troebelheid) 
Volume 
Soortelijk gewicht of osmolaliteit pH Totaal eiwit 
Glucose 
Bloed/bloedcellen
 
(*) omdat een lange vastperiode tot systematische fouten in de glucosemetingen voor 
de behandelde versus de controledieren kan leiden, moet de onderzoeksleider 
bepalen of het passend is om de dieren te laten vasten. Indien een vastperiode 
wordt gebruikt, moet deze zijn afgestemd op de gebruikte diersoort; voor de rat 
kan dit 16 uur zijn (een nacht vasten). De bepaling van het glucosegehalte in 
nuchtere toestand kan plaatsvinden na een nacht vasten tijdens de laatste week van 
de blootstelling, of na een nacht vasten voorafgaand aan de obductie (in het laatste 
geval gelijktijdig met de bepaling van alle andere klinisch-pathologische 
parameters).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Wanneer er aanwijzingen zijn dat afzetting en retentie primair in de onderste 
luchtwegen (d.w.z. de alveolen) plaatsvindt, kan bronchoalveolaire lavage de 
aangewezen techniek zijn voor kwantitatieve analyse van op hypothesen gebaseerde dosis-effectparameters, waarbij de nadruk ligt op alveolitis, long ­
ontsteking en fosfolipidose. Op deze manier kunnen veranderingen in de 
dosis-responsverhouding en het verloop in de tijd van alveolair letsel ade ­
quaat worden onderzocht. De bronchoalveolaire lavagevloeistof kan worden geanalyseerd met betrekking tot de totale en gedifferentieerde tellingen van de leukocyten, totaal eiwit, en lactaatdehydrogenase. Ook parameters die 
wijzen op lysosomale beschadigingen, fosfolipidose, fibrose en door irritatie 
of allergie veroorzaakte ontstekingen, kunnen worden overwogen; het kan hierbij onder meer gaan om de bepaling van pro-inflammatoire cytokinen/ chemokinen. Bronchoalveolaire lavagemetingen vormen doorgaans een aan ­
vulling op de resultaten van histopathologisch onderzoek, maar kunnen deze 
niet vervangen. In GD 39 (2) zijn richtsnoeren voor het uitvoeren van longlavage opgenomen.
 
OFTALMOLOGISCH ONDERZOEK  
40. Met behulp van een oftalmoscoop of een ander geschikt apparaat wordt vóór 
de toediening van de teststof bij alle dieren, en bij de beëindiging van het 
onderzoek bij alle hogeconcentratie- en controlegroepen, een oftalmologisch 
onderzoek uitgevoerd van de fundus, refractieve media, iris en bindvliezen. Indien er veranderingen in de ogen worden vastgesteld, moeten alle dieren in de andere groepen worden onderzocht, met inbegrip van de satellietgroep 
(reversibiliteitsgroep).
 
MACROPATHOLOGIE EN ORGAANGEWICHTEN  
41. Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of 
met het oog op het dierenwelzijn uit het onderzoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd, indien mogelijk na volledig uitbloeden. Voor ieder dier moet worden geregistreerd hoeveel tijd er is verstreken 
tussen het einde van hun laatste blootstelling en het moment waarop zij 
zijn gedood. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een obductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevro ­
ren) bij een temperatuur die laag genoeg is om de autolyse tot een minimum 
te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter 
binnen een of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare patholo ­
gische veranderingen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor veranderingen in de luchtwegen.
 
42. Tabel 2 bevat een lijst van de organen en weefsels die tijdens de macro ­
scopische obductie in een geschikt medium moeten worden bewaard voor histopathologisch onderzoek. Het is aan de onderzoeksleider om te beoor ­
delen of de organen en weefsels tussen  [vierkante haken ] en alle andere 
organen en weefsels worden bewaard. De  vet weergegeven organen moeten 
zo spoedig mogelijk na de sectie ontdaan worden van aanhechtend weefsel en nat worden gewogen om uitdroging te voorkomen. De schildklier en epididymides moeten alleen worden gewogen indien dit nodig is, omdat 
bij het ontdoen van aanhechtend weefsel artefacten kunnen ontstaan die 
het histopathologische onderzoek kunnen belemmeren. Weefsels en organen moeten worden gefixeerd in 10 % gebufferde formaldehyde of een ander geschikt fixeermiddel zodra de obductie is verricht, en ten minste 24 tot 48 
uur vóór het ontdoen van aanhangend weefsel, afhankelijk van het gebruikte 
fixeermiddel.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Tabel 2  
Tijdens de macroscopische obductie bewaarde organen en weefsels  
Bijnieren  
Aorta  
Beenmerg (en/of vers aspiraat)  
Hersenen  (inclusief coupes van cerebrum, ce ­
rebellum en medulla/pons)  
Blindedarm  
Colon  
Duodenum  
[Epididymides ] 
[Ogen (netvlies, oogzenuw) en oogleden]  
Dijbeen en kniegewricht  
Galblaas (indien aanwezig)  
[Klieren van Harder]  
Hart  
Ileum  
Jejunum  
Nieren  
[Traanklieren (extraorbitaal)]  
Larynx (3 niveaus, inclusief de steel van de 
epiglottis)  
Lever  
Long  (alle lobben op één niveau, inclusief de 
hoofdbronchiën)  
Lymfeklieren van de longhilus, met name bij 
slecht oplosbare teststoffen in deeltjesvorm. 
Voor grondiger onderzoek en/of studies met een immunologische focus kunnen aanvul ­
lende lymfeklieren worden overwogen, bv. 
uit de mediastinale, cervicale/submandibulaire 
en/of auriculaire streek.
 
Lymfeklieren (distaal van de porte d’entrée)  
Borstklier (vrouwelijk)  
Spieren (dij)  
Weefsels van de nasofarynx (ten minste 4 
niveaus; 1 niveau moet het nasofaryngaal ka ­
naal en het nasofarynx-geassocieerd lymfa ­
tisch weefsel (nasal associated lymphoid tis ­
sue, NALT) omvatten.  Slokdarm  
[Reukkolf]  
Ovaria  
Alvleesklier  
Bijschildklieren  
Perifere zenuwen (nervus ischiadicus of ner ­
vus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier  
Hypofyse  
Prostaat  
Rectum  
Speekselklieren  
Zaadblaasjes  
Huid  
Ruggenmerg (cervicaal, middenthoracaal en 
lumbaal)  
Milt 
Borstbeen  
Maag  
Tanden  
Testes  
Thymus  
Schildklieren  
[Tong]  
Luchtpijp (ten minste 2 niveaus, inclusief 1 
lengtecoupe door de carina en 1 dwarscou ­
pe) 
[Ureter]  
[Urinebuis]  
[Urineblaas]  
Uterus  
Doelorganen  
Alle macroscopisch waarneembare letsels en 
massa’s  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. De longen worden in hun geheel verwijderd, gewogen en ingedruppeld met 
een geschikt fixeermiddel bij 20-30 cm waterdruk om ervoor te zorgen dat 
de longstructuur intact blijft (5). De coupes worden voor alle lobben op één niveau, inclusief de hoofdbronchiën, gemaakt, maar als longlavage wordt uitgevoerd, worden van de niet gespoelde lob op drie niveaus coupes ge ­
maakt (geen seriële coupes).
 
44. Ten minste 4 niveaus van de weefsels van de nasofarynx worden onder ­
zocht, waarvan er één het nasofaryngaal kanaal moet omvatten 
(5)(6)(7)(8)(9), om adequaat onderzoek mogelijk te maken van het plavei ­
selcelepitheel, overgangsepitheel (respiratoir zonder trilharen), ademhalings ­
epitheel (respiratoir met trilharen) en reukepitheel, alsmede het drainerend 
lymfatisch weefsel (NALT) (10)(11). Er worden drie niveaus van de larynx 
onderzocht; een van deze niveaus moet de steel van de epiglottis omvatten (12). Er worden ten minste twee niveaus van de luchtpijp onderzocht, in ­
clusief één lengtecoupe door de carina van de splitsing van de extrapulmo ­
nale bronchiën, en één dwarscoupe.
 
HISTOPATHOLOGIE  
45. Alle in tabel 2 genoemde organen en weefsels worden histopathologisch 
onderzocht bij de controle- en hogeconcentratiegroepen, en bij alle dieren 
die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood. Bijzondere aandacht 
moet worden besteed aan de luchtwegen, doelorganen, en macroscopisch waarneembaar letsel. De organen en weefsels die in de hogeconcentratie ­
groep letsel vertonen worden bij alle groepen onderzocht. De onderzoeks ­
leider kan ervoor kiezen bij meer groepen histopathologisch onderzoek te 
verrichten, om een duidelijk verband tussen concentratie en respons aan te tonen. Indien van een satellietgroep (reversibiliteitsgroep) gebruik wordt gemaakt, dan wordt histopathologisch onderzoek verricht op alle weefsels 
en organen waar bij de behandelde groepen effecten blijken te zijn opge ­
treden. Indien er bij de hogeblootstellingsgroep buitensporig veel vroegtij ­
dige sterfte of andere problemen optreden die afbreuk doen aan de signifi ­
cantie van de gegevens, wordt de groep die bij de op een na hoogste con ­
centratie is blootgesteld, histopathologisch onderzocht. Getracht moet wor ­
den om de macroscopische waarnemingen te correleren aan microscopische bevindingen.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
46. Voor elk dier apart worden gegevens over lichaamsgewicht, voedselver ­
bruik, klinische pathologie, orgaangewichten en histopathologie vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding van het gebruikte aantal 
dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteitsverschijnselen vertoonde, 
het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk dier is gestorven, een be ­
schrijving van de toxische effecten met het verloop en de omkeerbaarheid en 
de obductiebevindingen. Alle resultaten, zowel numerieke als incidenteel, 
moeten met behulp van een geschikte statistische methode worden geëva ­
lueerd. Iedere algemeen aanvaarde statistische methode mag worden ge ­
bruikt; de statistische methoden worden bij de opzet van het onderzoek 
gekozen.
 
Testverslag  
47. In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opge ­
nomen:  
Proefdieren en dierhouderij:  
— beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: 
aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omge ­
vingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie 
van de voeding;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort 
dan ratten; herkomst en historische gegevens kunnen worden vermeld, 
indien zij betrekking hebben op dieren die zijn blootgesteld onder ver ­
gelijkbare omstandigheden wat betreft blootstelling, huisvesting en vas ­
ten; 
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— randomiseringsmethode;  
— beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, 
met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigen ­
schappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);  
— identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Ab ­
stracts Service).  
Medium:  
— motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan 
(indien een ander medium dan water wordt gebruikt);  
— historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet 
interfereert met de uitkomst van de studie.  
Inhalatiekamer:  
— gedetailleerde beschrijving van de inhalatiekamer, met inbegrip van de 
afmetingen en een schematische weergave;  
— herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van 
dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;  
— apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deel ­
tjesgrootte en de feitelijke concentratie;  
— herkomst van de lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;  
— toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het ver ­
krijgen van een homogene testatmosfeer;  
— drukverschil (positief of negatief);  
— blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie 
van de dieren in de kamer (blootstelling van het hele lijf);  
— stabiliteit van de testatmosfeer;  
— locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van 
de testatmosfeer in de kamer;  
— behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde lucht;  
— luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus 
alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);  
— equilibratietijd van de kamer (t  95 ); 
— aantal volumeveranderingen per uur;  
— meetapparaten (indien van toepassing).  
Blootstellingsgegevens:  
— motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide 
teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);  
— feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren 
verzamelde teststof; voor mengsels die heterogene fysische vormen pro ­
duceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk worden 
geanalyseerd;  
— alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (mg/l, mg/m  3 
enz.), in plaats van in volume-eenheden (ppm, ppb enz.);  
— deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische 
diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking ( σ g ), onder ver ­
melding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjes ­
grootteanalysen worden vermeld.  
Testomstandigheden:  
— details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de 
procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vast materiaal te 
verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden;  
— een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de 
apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de bloot ­
stelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;  
— details van de apparatuur die wordt gebruikt om de temperatuur in de 
kamer, de vochtigheid en de luchtdoorstroming in de kamer te contro ­
leren (d.w.z. ontwikkeling van een kalibratiecurve);  
— details van de apparatuur die wordt gebruikt om monsters te verzamelen 
voor de bepaling van de kamerconcentratie en deeltjesgrootteverdeling;  
— details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering 
van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
 
— randomiseringsmethode voor het indelen van de dieren in test- en con ­
trolegroepen;  
— details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst 
van het voeder en herkomst van het water);  
— motivering van de keuze van de testconcentraties.  
Resultaten:  
— een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de 
kamer;  
— een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de 
kamer;  
— een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens 
over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgroottever ­
deling en de berekening van de MMAD en σ g ; 
— een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor 
elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterf ­
te, en de aard, hevigheid, tijdstip van aanvang en duur van de effecten);  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— een tabel met het gewicht van elk dier;  
— een tabel met het voedselverbruik;  
— een tabel met klinisch-pathologische gegevens;  
— voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevin ­
dingen, indien beschikbaar.  
Bespreking en interpretatie van de resultaten:  
— speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden 
die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, 
bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;  
— er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het 
licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de 
deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;  
— in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de 
consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale 
en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
 
— er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en over ­
heersende werking (systemisch of plaatselijk);  
— er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten 
worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voort ­
durende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad 
voor humane eindpunten (3);  
— het doelorganen (de doelorganen) moet (moeten) worden aangegeven;  
— het NOAEL en LOAEL moet worden bepaald.  
LITERATUUR:  
(1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Gui ­
deline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material , Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal dia ­
grams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nas ­
opharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lym ­
phoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad 
van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking 
van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 
67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIE  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  ONDERZOEK NAAR CHRONISCHE TOXICITEIT  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 452 (2009) van de 
OESO. De oorspronkelijke TG 452 werd in 1981 vastgesteld. De ontwik ­
keling van deze herziene testmethode B.30 werd noodzakelijk geacht in het 
licht van recente ontwikkelingen op het gebied van dierenwelzijn en wette ­
lijke voorschriften (1)(2)(3)(4). De actualisering van deze testmethode B.30 is gelijktijdig uitgevoerd met de herziening van hoofdstuk B.32 van deze 
bijlage, Carcinogeniteitsonderzoek, en hoofdstuk B.33 van deze bijlage, Ge ­
combineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit, en had tot doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de bij het onderzoek gebruikte dieren en nadere bijzonderheden over de keuze van 
de dosis te verschaffen. Deze testmethode is bedoeld voor gebruik bij het 
testen van een breed scala van stoffen, waaronder bestrijdingsmiddelen en industriële chemische stoffen.
 
2. Het meeste onderzoek naar chronische toxiciteit wordt uitgevoerd bij knaag ­
diersoorten en deze testmethode is daarom voornamelijk bedoeld voor on ­
derzoek dat bij deze soorten wordt verricht. Als dergelijk onderzoek ook bij andere diersoorten dan knaagdieren moet worden uitgevoerd, kunnen de principes en procedures van deze testmethode, met de nodige aanpassingen, 
ook samen met die in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek 
(oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 da ­
gen) (5), worden toegepast, zoals bedoeld in OESO-leidraad nr. 116 over het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcino ­
geniteit (6).
 
3. De drie belangrijkste toedieningswegen bij onderzoek naar chronische toxi ­
citeit zijn de orale, de dermale en de inhalatieweg. De keuze van de toe ­
dieningsweg is afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van 
de teststof en de voornaamste blootstellingsroute bij de mens. Nadere in ­
formatie over de keuze van de blootstellingsroute wordt verschaft in OESO-leidraad nr. 116 (6).
 
4. Deze testmethode spitst zich toe op blootstelling via de orale weg, de meest 
gebruikte route bij onderzoek naar chronische toxiciteit. Hoewel langeter ­
mijnonderzoek naar chronische toxiciteit met blootstelling via de dermale of de inhalatieweg ook noodzakelijk kan zijn om de risico’s voor de menselijke gezondheid te beoordelen, en/of vereist kan zijn op grond van bepaalde 
regelgevingskaders, zijn beide blootstellingsroutes technisch bijzonder com ­
plex. Dergelijk onderzoek dient per geval te worden opgezet, hoewel de hier beschreven testmethode voor het beoordelen en evalueren van chronische toxiciteit bij orale toediening kan worden gebruikt als basis voor een pro ­
tocol voor dermaal en inhalatieonderzoek, rekening houdend met aanbeve ­
lingen ten aanzien van de behandelingsperiode, klinische en pathologische parameters enz. Er zijn OESO-richtsnoeren beschikbaar voor de toediening van teststoffen via de inhalatieweg (6)(7) en de dermale weg (6). Bij het 
opzetten van langetermijnonderzoek naar blootstelling via de inhalatieweg 
moet met name aandacht worden geschonken aan hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (9), samen met de OESO-leidraad voor acuut inhalatieonderzoek (7). In geval van tests die 
via de dermale weg worden uitgevoerd, dient hoofdstuk B.9 van deze 
bijlage (10) te worden geraadpleegd.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Het onderzoek naar chronische toxiciteit levert informatie op over de mo ­
gelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde 
blootstelling gedurende een aanzienlijk deel van de levensduur van de ge ­
bruikte diersoort. Het onderzoek zal informatie opleveren over de toxische effecten van de teststof, de doelorganen aanwijzen en de mogelijkheid van 
accumulatie aangeven. Daarnaast kan er een inschatting worden gemaakt 
van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld. Aan de hand van deze inschatting kunnen vervolgens veiligheidscriteria voor de blootstelling van de mens worden vastgesteld. Bovendien wordt benadrukt 
dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om 
zo veel mogelijk informatie te verkrijgen.
 
6. De doelstellingen van het onder deze testmethode vallende onderzoek om ­
vatten:  
— het vaststellen van de chronische toxiciteit van een teststof;  
— het vaststellen van de doelorganen;  
— het karakteriseren van de dosis-responsverhouding;  
— het vaststellen van een niveau waarbij geen schadelijk effect werd vast ­
gesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) of een uitgangs ­
punt voor het bepalen van een benchmarkdosis (BMD);  
— het voorspellen van chronische toxische effecten bij niveaus waaraan 
mensen worden blootgesteld;  
— het verschaffen van gegevens om hypothesen over de werkingswijze te 
toetsen (6).  
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
7. Bij het beoordelen en evalueren van de toxicologische kenmerken van een 
teststof moet het testlaboratorium, alvorens het onderzoek uit te voeren, alle beschikbare informatie over de teststof in aanmerking nemen, zodat de opzet 
van het onderzoek zodanig kan worden afgestemd dat doelmatiger wordt 
getest op potentiële chronische toxiciteit en het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. Bij het opzetten van het onderzoek kan onder meer ge ­
bruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, chemische structuur 
en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van even ­
tuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toe ­
passing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over chemische 
stoffen met een verwante structuur; de beschikbare toxicokinetische gege ­
vens (kinetiek bij zowel eenmalige toediening als herhaalde toediening, indien beschikbaar), en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling 
ontleende gegevens. De chronische toxiciteit mag pas worden bepaald nadat 
eerst toxiciteitsgegevens zijn verkregen van toxiciteitsonderzoek met her ­
haalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen. Als onderdeel van de algemene beoordeling van de potentiële schadelijke gezondheidseffecten 
van een bepaalde teststof (11)(12)(13)(14) moet een gefaseerde benadering 
van de chronische-toxiciteitstests worden overwogen.
 
8. Voordat met het onderzoek wordt begonnen, moet worden bepaald welke 
statistische methoden gezien de opzet van de proeven en de doelstellingen het best geschikt zijn voor de analyse van de uitkomsten. Zo moet onder meer worden overwogen of de statistische gegevens tevens een correctie 
voor overleving en een analyse in geval van voortijdige beëindiging van 
één of meer groepen moeten omvatten. Aanwijzingen voor de juiste statis ­
tische analysen en belangrijke verwijzingen naar internationaal erkende sta ­
tistische methoden worden gegeven in richtsnoer nr. 116 (6) en richtsnoer 
nr. 35 over de analyse en evaluatie van onderzoek naar chronische toxiciteit 
en carcinogeniteit (15).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Bij het uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit moeten altijd de 
richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in het 
OESO-leidraad nr. 19 betreffende het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische symptomen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (16), en met name punt 62 ervan. In dat punt 
wordt verklaard dat wanneer een dier bij onderzoek met herhaalde toedie ­
ning klinische symptomen met een voortschrijdend karakter vertoont die leiden tot een verdere verslechtering van de toestand van het dier, op basis van de beschikbare informatie moet worden overwogen of het dier op hu ­
mane wijze moet worden gedood. Hierbij moet tevens worden overwogen 
hoe de waarde van de informatie die kan worden gewonnen door het dier in kwestie te handhaven in het onderzoek zich verhoudt tot de algehele con ­
ditie van het dier. Als wordt besloten het dier in het onderzoek te hand ­
haven, moet de frequentie van de waarnemingen zo nodig worden verhoogd. 
Het kan ook zijn dat het mogelijk is de pijn of angst te verlichten door de toediening van de dosis tijdelijk stop te zetten of de testdosis te verminde ­
ren, zonder dat dit het doel van het onderzoek nadelig beïnvloedt.
 
10. Nadere aanwijzingen en een bespreking van de principes voor de keuze van 
de dosis bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn te 
vinden in leidraad nr. 116 (6) en twee publicaties van het International Life 
Sciences Institute (17)(18). Welke strategie voor dosiskeuze uiteindelijk wordt toegepast, is afhankelijk van de primaire doelstelling of doelstellingen van het onderzoek (punt 6). Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet 
een evenwicht worden getroffen tussen enerzijds de gevarenscreening en 
anderzijds de karakterisering van de lagedosisrespons en de wisselwerking tussen de twee. Dit is met name relevant in situaties waarin gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van 
deze bijlage) moet worden uitgevoerd (punt 11).
 
11. Er moet worden nagegaan of gecombineerd onderzoek naar chronische 
toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) kan worden uitgevoerd in plaats van afzonderlijke studies naar chronische toxiciteit (deze testmethode B.30) en carcinogeniteit (hoofdstuk B.32 van deze bij ­
lage). De gecombineerde test kost minder tijd en geld dan twee afzonderlijke 
studies, zonder dat dit ten koste gaat van de gegevenskwaliteit van de onderzoeksfasen. Bij uitvoering van gecombineerd onderzoek naar chro ­
nische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet 
echter zorgvuldig rekening worden gehouden met de principes voor dosis ­
keuze (punt 9 en de punten 20 tot en met 25); bovendien kan de uitvoering van afzonderlijke studies verplicht zijn uit hoofde van bepaalde regelge ­
vingskaders.
 
12. De definities die in de context van deze testmethode worden gebruikt, zijn te 
vinden aan het eind van dit hoofdstuk en in leidraad nr. 116 (6).  
PRINCIPE VAN DE TEST  
13. De teststof wordt dagelijks in trapsgewijs stijgende doses aan diverse groe ­
pen proefdieren toegediend, normaal gezien twaalf maanden achter elkaar, hoewel afhankelijk van de wettelijke voorschriften een kortere of langere 
duur kan worden gekozen (zie punt 33). De gekozen duur moet voldoende 
lang zijn zodat de eventuele effecten van cumulatieve toxiciteit tot uiting komen, zonder de storende effecten van geriatrische veranderingen. Afwij ­
kingen van een blootstellingsduur van twaalf maanden moeten worden ver ­
antwoord, met name als voor een kortere duur wordt gekozen. De teststof 
wordt normaal gezien toegediend via de orale weg, hoewel ook de inhalatie- of de dermale weg geschikt kan zijn. Het onderzoek kan ook zo worden opgezet dat sommige dieren tussentijds worden gedood, bv. na drie en zes 
maanden, en dat met het oog hierop nieuwe groepen proefdieren kunnen 
worden toegevoegd (zie punt 19). Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks geobserveerd om tekenen van toxi ­
citeit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden 
gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek 
nog in leven zijn worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
14. Deze testmethode heeft hoofdzakelijk betrekking op de beoordeling en eva ­
luatie van chronische toxiciteit bij knaagdieren (zie punt 2). Op grond van bepaalde regelgevingskaders kan echter vergelijkbaar onderzoek bij niet-knaagdieren vereist zijn. De keuze van de soort moet worden verant ­
woord. Bij het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxi ­
citeit bij andere diersoorten dan knaagdieren moeten, zo nodig, de in deze testmethode beschreven principes als uitgangspunt worden genomen, in combinatie met de principes in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteits ­
onderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening 
(90 dagen) (5). Nadere informatie over de keuze van de soort en de stam is te vinden in leidraad nr. 116 (6).
 
15. In deze testmethode wordt de voorkeur gegeven aan ratten, maar er kunnen 
ook andere knaagdiersoorten worden gebruikt, bijvoorbeeld muizen. Aan het 
gebruik van ratten en muizen als experimentele modellen wordt de voorkeur gegeven vanwege hun betrekkelijk korte levensduur, het grootschalige ge ­
bruik ervan bij farmacologisch en toxicologisch onderzoek, hun gevoelig ­
heid voor tumorinductie en de beschikbaarheid van voldoende gekarakteri ­
seerde stammen. Vanwege deze kenmerken is een grote hoeveelheid infor ­
matie over hun fysiologie en pathologie beschikbaar. Er worden jonge ge ­
zonde volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. Het 
onderzoek naar chronische toxiciteit uitgevoerd bij dieren van dezelfde stam 
en herkomst als die welke zijn gebruikt voor het inleidende toxiciteitsonder ­
zoek van kortere duur. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn.
 
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
16. De dieren kunnen individueel of in kleine groepjes van hetzelfde geslacht 
worden ondergebracht; individuele hokken moeten alleen worden overwo ­
gen als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (19)(20)(21). De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De temperatuur in de proefdier ­
ruimte dient 22 °C (± 3 °C) te zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid 
ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een 
cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone 
laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drink ­
water. Het voer moet aan alle behoeften van de geteste soort voldoen en het gehalte aan onzuiverheden in het voer, met inbegrip van maar niet beperkt 
tot residuen van bestrijdingsmiddelen, persistente organische verontreini ­
gende stoffen, fyto-oestrogenen, zware metalen en mycotoxinen, die van invloed kunnen zijn op de resultaten van het onderzoek, moet zo laag 
mogelijk zijn. Van tijd tot tijd moet er analytische informatie over het 
gehalte aan nutriënten en onzuiverheden in het voer worden samengesteld, ten minste aan het begin van het onderzoek en wanneer er veranderingen zijn in de gebruikte partij. Deze informatie moet in het eindverslag worden 
opgenomen. Ook over het bij het onderzoek gebruikte drinkwater moet 
analytische informatie worden verstrekt. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende vermenging van de teststof te zorgen en te voldoen aan de voedingsbehoeften van de dieren 
wanneer die teststof via het voer wordt toegediend.
 
Voorbereiding van de dieren  
17. Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste zeven dagen 
aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en 
waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Bij knaagdieren moet de toediening van de dosis zo snel mogelijk na het spenen en de acclimatisatie beginnen en bij voorkeur voordat de dieren acht weken oud zijn. Van de 
proefdieren worden de volgende kenmerken vastgelegd: soort, stam, her ­
komst, geslacht, gewicht en leeftijd. Aan het begin van het onderzoek
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
moeten de gewichtsverschillen tussen de geslachten minimaal zijn en niet 
meer bedragen dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht. 
De dieren worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen in ­
gedeeld. Na de willekeurige indeling mogen er binnen de geslachten geen significante verschillen in lichaamsgewicht zijn tussen de groepen. Als er 
statistisch significante verschillen zijn, moet de willekeurige indeling zo 
mogelijk opnieuw worden uitgevoerd. Aan elk dier moet een uniek identi ­
ficatienummer worden toegekend in de vorm van een permanent merkteken dat met behulp van een tatoeage, een onder de huid ingebrachte microchip 
of via een andere geschikte methode wordt aangebracht.
 
PROCEDURE  
Aantal en geslacht van de dieren  
18. Beide geslachten moeten worden gebruikt. Er moet een voldoende groot 
aantal dieren worden gebruikt om een grondige biologische en statistische evaluatie aan het einde van het onderzoek mogelijk te maken. Bij gebruik 
van knaagdieren moeten normaal gezien bij elk dosisniveau ten minste 20 
dieren per geslacht per groep worden gebruikt. Bij gebruik van niet-knaagdieren wordt aanbevolen ten minste 4 dieren per geslacht per groep te gebruiken. Bij onderzoek waarbij muizen zijn betrokken, is het 
mogelijk dat per dosisgroep meer dieren nodig zijn om alle vereiste hema ­
tologische bepalingen uit te voeren.
 
Dieren tussentijds doden, satellietgroepen en verklikkerdieren  
19. Als onderdeel van het onderzoek kunnen sommige dieren (ten minste 10 
dieren/geslacht/groep) tussentijds worden gedood, bijvoorbeeld na zes maan ­
den voor de chronische-toxiciteitsfase, om informatie te verschaffen over de ontwikkeling van toxicologische veranderingen en mechanistische informa ­
tie, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Als dergelijke informatie 
al beschikbaar is uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening van de teststof, is het tussentijds doden van dieren mogelijk niet weten ­
schappelijk gerechtvaardigd. Ook satellietgroepen kunnen in het onderzoek 
worden opgenomen om de reversibiliteit van eventuele toxicologische ef ­
fecten als gevolg van de onderzochte teststof te controleren. Hiervoor wordt doorgaans alleen het hoogste dosisniveau van het onderzoek met contro ­
legroep gebruikt. Tijdens het onderzoek kan zo nodig ook een aanvullende 
groep verklikkerdieren (doorgaans vijf dieren per geslacht) worden opge ­
nomen met het oog op de monitoring van de ziektestatus (22). Als dieren tussentijds zullen worden gedood, of satelliet- of verklikkergroepen in het onderzoek zullen worden opgenomen, moet het aantal dieren in de onder ­
zoeksopzet worden vermeerderd met het aantal dieren dat voor afronding 
van het onderzoek zal worden gedood. Deze dieren moeten normaal gezien aan dezelfde waarnemingen worden onderworpen, met inbegrip van waar ­
nemingen met betrekking tot het lichaamsgewicht, het voedsel- en water ­
verbruik, hematologische en klinisch-biochemische metingen en patholo ­
gisch onderzoek, als de dieren in de chronische-toxiciteitsfase van het hoofdonderzoek, hoewel de metingen (in de groepen met dieren die tussen ­
tijds worden gedood) ook kunnen worden beperkt tot specifieke, belangrijke 
parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit.
 
Dosisgroepen en dosering  
20. Aanwijzingen voor alle aspecten van de dosiskeuze en het interval tussen de 
dosisniveaus zijn te vinden in leidraad nr. 116 (6). Ten minste drie dosisni ­
veaus en een bijbehorende controle zijn vereist, tenzij een limiettest wordt 
uitgevoerd (zie punt 27). De dosisniveaus worden doorgaans gebaseerd op de resultaten van korter onderzoek met herhaalde toediening of van bereik ­
bepalingonderzoek, en er moet rekening worden gehouden met bestaande 
toxicologische en toxicokinetische gegevens die voor de teststof of aanver ­
wante stoffen beschikbaar zijn.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Tenzij dit vanwege de fysisch-chemische aard of biologische kenmerken van 
de teststof onmogelijk is, moet de hoogste dosis normaliter zodanig worden 
gekozen dat de voornaamste doelorganen en toxische effecten worden vast ­
gesteld zonder dat dit leed, ernstige toxiciteit, ziekteverschijnselen of sterfte veroorzaakt. Het hoogste dosisniveau moet, rekening houdend met de in 
punt 22 beschreven factoren, zodanig worden gekozen dat er tekenen van 
toxiciteit optreden, die bijvoorbeeld blijken uit een lichte achteruitgang van de gewichtstoename (ca. 10 %).
 
22. Afhankelijk van het doel van het onderzoek (zie punt 6), kan echter een 
hoogste dosis worden gekozen die lager is dan de dosis waarbij tekenen van toxiciteit optreden, bv. als een dosis een zorgwekkend schadelijk effect heeft 
dat niettemin weinig invloed heeft op de levensduur of het lichaamsgewicht. 
De hoogste dosis mag niet hoger zijn dan 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag (limietdosis: zie punt 27).
 
23. De dosisniveaus en het interval tussen de dosisniveaus kunnen zo worden 
gekozen dat een dosisrespons en een NOAEL of ander beoogd resultaat van het onderzoek, bv. een BMD (zie punt 25), bij het laagste dosisniveau 
worden vastgesteld. Factoren die moeten worden meegewogen bij de toe ­
diening van lagere doses omvatten de verwachte helling van de dosis-responscurve, de doses waarbij belangrijke veranderingen in het me ­
tabolisme of de toxische werking kunnen optreden, de verwachte locatie van 
een drempelwaarde of de verwachte locatie van een uitgangspunt voor extrapolatie naar lage doses.
 
24. Het gekozen interval tussen de dosisniveaus hangt van de kenmerken van de 
teststof af en kan niet in deze testmethode worden voorgeschreven, maar doorgaans leveren twee- tot viervoudige intervallen goede testresultaten op 
wanneer zij worden gebruikt voor de instelling van de afnemende dosisni ­
veaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te verkiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van ongeveer 6 à 10) tussen twee doseringen. In het algemeen moet het gebruik van 
factoren boven de 10 worden vermeden en worden verantwoord als deze 
toch worden gebruikt.
 
25. Zoals nader wordt beschreven in leidraad nr. 6 (6), moet bij de keuze van de 
dosis rekening worden gehouden met het volgende:  
— bekende of vermoedelijke niet-lineariteiten of buigpunten in de dosis ­
respons;  
— toxicokinetiek en dosisbereiken waarbij metabolische inductie, verzadi ­
ging of niet-lineariteit tussen externe en interne doses al dan niet op ­
treden;  
— precursorletsels en merkstoffen die het effect of indicatoren die de wer ­
king van de voornaamste fundamentele biologische processen aangeven;  
— de voornaamste (of vermoedelijke) aspecten van de werkingswijze, zoals 
doses waarbij de cytotoxiciteit begint toe te nemen, hormoonniveaus 
verstoord raken, homeostatische mechanismen het onderspit delven enz.;  
— gebieden van de dosis-responscurve die een bijzonder robuuste schatting 
behoeven, bv. op het gebied van de verwachte BMD of een vermoede ­
lijke drempelwaarde;  
— de verwachte blootstellingsniveaus bij de mens.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof een 
medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van de behan ­
deling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde wijze worden behandeld als die in de testgroep. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoogste gebruikte mediumdosis van 
de dosisgroepen toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de 
voeding en deze een geringere voedingsopname veroorzaakt omdat de voe ­
ding daardoor minder appetijtelijk is, kan een aanvullende paargevoede controlegroep dienen als een meer geschikte controle.
 
27. Indien op grond van tijdens inleidend onderzoek verkregen informatie kan 
worden verwacht dat een test op één dosisniveau dat overeenstemt met ten 
minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag, bij gebruikmaking van de be ­
schreven procedures voor dit onderzoek waarschijnlijk geen schadelijke effecten geeft en als, op grond van gegevens van tests met structureel ver ­
wante stoffen, geen toxiciteit wordt verwacht, kan een volledig onderzoek 
waarbij van drie dosisniveaus gebruik wordt gemaakt mogelijk achterwege 
blijven. Een limiet van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag kan van toepas ­
sing zijn, tenzij het blootstellingsniveau bij de mens duidt op de noodzaak een hoger dosisniveau te gebruiken.
 
Bereiding en toediening van doses van de teststof  
28. De teststof wordt normaal gezien oraal, met de voeding of het drinkwater, of 
via een maagsonde toegediend. Nadere informatie over de toedieningswegen en -methoden is te vinden in leidraad nr. 116 (6). De toedieningsweg en de 
toedieningsmethode zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek, de 
fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de biologische beschik ­
baarheid ervan en de voornaamste blootstellingsroute en -methode bij de mens. De keuze van de toedieningsweg en de toedieningsmethode moet 
worden gemotiveerd. In het belang van het welzijn van de dieren moet de 
orale maagsonde normaal gesproken alleen worden gekozen in geval van agentia waarvoor de gekozen toedieningsweg- en methode redelijk overeen ­
komen met de mogelijke blootstelling van de mens (bijvoorbeeld bij genees ­
middelen). Bij in de voeding of het milieu voorkomende chemische stoffen 
zoals bestrijdingsmiddelen wordt de teststof doorgaans toegediend via de voeding of het drinkwater. In sommige scenario’s, bijvoorbeeld bij beroeps ­
matige blootstelling, kan toediening via andere wegen geschikter zijn.
 
29. Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspen ­
deerd. Er moet rekening worden gehouden met de volgende eigenschappen 
van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepassing is: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de 
toxische kenmerken ervan kunnen veranderen; en effecten op het voedsel- of 
waterverbruik of de voedingsstatus van de dieren. Aanbevolen wordt eerst na te gaan of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en 
daarna eventueel een ander medium. Wanneer een ander medium dan water 
wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Er moet informatie beschikbaar zijn over de stabiliteit van de teststof en de homogeniteit van de doseeroplossingen of het voer (naargelang hetgeen van 
toepassing is) onder de toedieningsomstandigheden (bv. dieet).
 
30. Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet 
erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren 
met de normale voedings- of waterbalans. Bij langetermijnonderzoek naar toxiciteit waarbij de teststof via het voer wordt toegediend, mag de con ­
centratie van de teststof in de voeding de bovengrens van 5 % van de totale 
hoeveelheid voer normaal gesproken niet overschrijden om onevenwichtig ­
heden in de voeding te vermijden. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een constante voedingsconcentratie (mg/kg voer of ppm) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier 
(mg/kg lichaamsgewicht), berekend op weekbasis, worden gebruikt. Aange ­
geven moet worden welk alternatief is gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Bij orale toediening wordt de teststof dagelijks (zeven dagen per week) aan 
de dieren toegediend, doorgaans gedurende twaalf maanden (zie ook punt 
33), hoewel afhankelijk van de wettelijke voorschriften een langere duur nodig kan zijn. Elk ander doseringsschema, bv. vijf dagen per week, moet worden gemotiveerd. Bij toediening via de huid worden de dieren normaal 
gesproken ten minste 6 uur per dag, zeven dagen per week met de teststof 
behandeld, zoals wordt beschreven in hoofdstuk B.9 van deze bijlage (10), gedurende twaalf maanden. Blootstelling via inhalatie geschiedt 6 uur per dag, zeven dagen per week, maar ook blootstelling gedurende vijf dagen is 
mogelijk, indien dit wordt verantwoord. De blootstellingsperiode duurt door ­
gaans twaalf maanden. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur wor ­
den aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te minimaliseren. 
Een blootstellingsduur van minder dan 6 uur per dag moet worden gemoti ­
veerd. Zie ook hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8).
 
32. Indien de teststof via een maagsonde aan de dieren wordt toegediend, moet 
dit iedere dag op hetzelfde tijdstip gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Normaliter zal eenmaal per dag één dosis worden toegediend; als een stof lokale irritaties veroorzaakt, kan 
de dagelijkse doseersnelheid mogelijk worden gehandhaafd door de toe te 
dienen dosis te splitsen (tweemaal per dag). Het maximale vloeistofvolume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume moet zo laag mogelijk worden gehouden als praktisch 
uitvoerbaar is en mag bij knaagdieren normaliter niet meer dan 1 ml/100 g 
lichaamsgewicht bedragen (22). Variaties in het testvolume moeten tot een minimum worden beperkt door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Een uit ­
zondering vormen mogelijk bijtende of irriterende stoffen, die moeten wor ­
den verdund om ernstige lokale effecten te vermijden. Tests bij concentraties die waarschijnlijk een bijtende of irriterende werking hebben op het 
maag-darmkanaal, moeten worden vermeden.
 
Duur van het onderzoek  
33. Hoewel deze testmethode in de eerste plaats is opgezet als een onderzoek 
van twaalf maanden naar de chronische toxiciteit, maakt de onderzoeksopzet 
ook een kortere (bv. 6 of negen maanden) of langere (bv. 18 of 24 maan ­
den) onderzoeksduur mogelijk, afhankelijk van de eisen van de regelgeving of met het oog op specifieke mechanistische doeleinden. Afwijkingen van een blootstellingsduur van twaalf maanden moeten worden verantwoord, 
met name als voor een kortere duur wordt gekozen. Satellietgroepen die 
zijn opgenomen ter controle van de omkeerbaarheid van eventuele toxico ­
logische veranderingen als gevolg van de onderzochte teststof moet dosering worden onthouden gedurende niet minder dan vier weken en niet meer dan 
een derde van de totale onderzoeksduur nadat de blootstelling is gestaakt. 
Nadere aanwijzingen, onder meer over de overleving tijdens het onderzoek, zijn te vinden in leidraad nr. 116 (6).
 
WAARNEMINGEN  
34. Alle dieren moeten worden onderzocht op ziekelijkheid of sterfte, gewoon ­
lijk aan het begin en einde van elke dag, ook tijdens de weekends en de feestdagen. De proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobserveerd, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip, waarbij rekening moet 
worden gehouden met de piekperiode van verwachte effecten na toediening 
van de dosis via een maagsonde.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Alle dieren moeten ten minste eenmaal voor de eerste blootstelling aan een 
uitgebreid klinisch onderzoek worden onderworpen (om intra-individuele 
vergelijking mogelijk te maken), aan het einde van de eerste week van het onderzoek en vervolgens elke maand. Het waarnemingsprotocol moet zodanig worden opgezet dat verschillen tussen individuele waarnemers wor ­
den geminimaliseerd en onafhankelijk zijn van de testgroep. De dieren 
moeten buiten hun kooi worden geobserveerd, bij voorkeur telkens in een standaardgebied en op hetzelfde tijdstip. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door 
het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet worden getracht 
verschillen in de observatiecondities tot een minimum te beperken. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en 
onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, ver ­
andering van de pupilgrootte en een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bij ­
voorbeeld overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bi ­
zar gedrag (bijvoorbeeld zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (24).
 
36. Vóór de eerste toediening van de teststof wordt bij alle dieren een oftalmo ­
logisch onderzoek uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van een of ­
talmoscoop of een ander geschikt apparaat. Bij beëindiging van het onder ­
zoek wordt dit oftalmologisch onderzoek bij alle dieren verricht, maar ten 
minste bij die in de hogedosisgroep en in de controlegroep. Als met de 
behandeling samenhangende veranderingen in de ogen worden geconsta ­
teerd, moeten alle dieren worden onderzocht. Als de structurele analyse of andere informatie wijst op oculaire toxiciteit, moet de frequentie van het 
oogonderzoek worden verhoogd.
 
37. Voordat met het onderzoek wordt begonnen en met tussenpozen van drie 
maanden tot ten hoogste twaalf maanden na aanvang van het onderzoek, alsmede bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf 
maanden) kunnen, in geval van chemische stoffen waarvoor uit eerdere 
toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat deze kunnen leiden tot neurotoxische effecten, facultatief onderzoeken van de sensorische reacties op verschillende soorten 
stimuli (24) (bijvoorbeeld van auditieve, visuele en proprioceptieve aard) 
(25)(26)(27), alsmede een bepaling van de grijpkracht (28) en de motorische activiteit (29) worden verricht. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er 
kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast.
 
38. In geval van chemische stoffen waarvoor uit eerder toxiciteitsonderzoek met 
herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat 
deze kunnen leiden tot immunotoxische effecten kan facultatief nader onder ­
zoek van dit eindpunt worden verricht bij beëindiging van het onderzoek.  
Lichaamsgewicht. voedsel-/waterverbruik en voedselefficiëntie  
39. Aan het begin van het onderzoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten 
minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de 
eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna 
ten minste één keer per maand. Het waterverbruik moet de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand als de stof met het drinkwater wordt toegediend. Meting van het 
waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drink ­
activiteit verandert.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologie en klinisch-biochemische bepalingen  
40. Bij onderzoek waarbij knaagdieren zijn betrokken, wordt na drie, zes en 
twaalf maanden, alsook bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf maanden) hematologisch onderzoek verricht op ten minste 
tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep, waarbij telkens dezelfde dieren 
worden gebruikt. Bij muizen moeten mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste hematologische bepalingen te verrichten (zie punt 18). Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden 
monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bijvoorbeeld 4 dieren per 
geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse bemon ­
steringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals beschreven 
voor knaagdieren. Er hoeven bij knaagdieren of andere soorten dan knaag ­
dieren na drie maanden geen metingen te worden verricht als er geen effect is opgetreden op de hematologische parameters in een eerder onderzoek van 90 dagen met vergelijkbare dosisniveaus. Er moeten bloedmonsters worden 
genomen en daarbij dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe 
de monsters zijn genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving.
 
41. De volgende parameters worden onderzocht (30): totale en gedifferentieerde 
telling van de leukocyten, telling van de erytrocyten, telling van de bloed ­
plaatjes, hemoglobinegehalte, hematocriet, gemiddeld volume van de erytro ­
cyten (Mean Corpuscular Volume, MCV), hemoglobinegehalte per erytrocyt 
(Mean Corpuscular Haemoglobin, MCH), hemoglobinegehalte per volume-eenheid erytrocyten (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentra ­
tion, MCHC), prothrombinetijd en geactiveerde partiële thromboplastinetijd. 
Afhankelijk van de toxiciteit van de teststof kunnen ook andere hematolo ­
gische parameters worden gemeten, zoals de Heinz-lichaampjes of andere morfologische afwijkingen van de erytrocyten of methemoglobine. In het algemeen moet een flexibele aanpak worden gehanteerd, afhankelijk van het 
waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde teststof. Als de test ­
stof een effect heeft op het hematopoëtisch systeem, moeten mogelijk ook reticulocytentellingen en beenmergcytologie worden getest, hoewel deze niet routinematig hoeven te worden onderzocht.
 
42. Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke toxische 
effecten in weefsels en met name effecten op de nieren en lever te onder ­
zoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die van ten minste tien 
mannetjes en 10 vrouwtjes per groep worden genomen, met dezelfde inter ­
vallen als wordt aangegeven voor hematologisch onderzoek, waarbij telkens dezelfde dieren worden gebruikt. Bij muizen moeten mogelijk dieren in 
satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste klinisch-biochemische be ­
palingen te verrichten. Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bijvoorbeeld 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse 
bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals be ­
schreven voor knaagdieren. Er hoeven na drie maanden geen metingen te worden verricht, noch bij knaagdieren noch bij andere diersoorten, als er in een eerder onderzoek van 90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen 
effect op klinisch-biochemische parameters is geconstateerd. Het verdient 
aanbeveling om de dieren (met uitzondering van muizen) vóór de bloed ­
afname een nacht te laten vasten. De volgende parameters worden onder ­
zocht (30): glucose, ureum (ureumstikstof), creatinine, totaal eiwit, albumi ­
ne, calcium, natrium, kalium, totaal cholesterol, ten minste twee tests voor 
een hepatocellulaire evaluatie (alanineaminotransferase, aspartaataminotrans ­
ferase, glutamaatdehydrogenase, totaal galzuren) (31), en ten minste twee tests voor hepatobiliaire evaluatie (alkalische fosfatase, 
gamma-glutamyltransferase, 5’-nucleotidase, totaal bilirubine, totaal galzu ­
ren) (31). Naargelang hetgeen van toepassing is, kunnen andere klinisch-chemische parameters als triglyceriden bij nuchtere toestand, speci ­
fieke hormonen en cholinesterase worden gemeten, afhankelijk van de toxi ­
citeit van de teststof. In het algemeen is een flexibele aanpak nodig, afhan ­
kelijk van het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Bij ten minste tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep moet de urine 
worden geanalyseerd, waarbij op dezelfde regelmatige tijdstippen urinemon ­
sters moeten worden genomen als bij de hematologische en klinisch-chemische monsters. Metingen na drie maanden hoeven niet te worden verricht als bij het urineonderzoek in een eerder onderzoek van 
90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen effect is geconstateerd. De 
volgende lijst van parameters is afkomstig uit een deskundige aanbeveling inzake klinisch-pathologisch onderzoek (30): uitzien, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, totaal eiwit, en glucose. Andere bepalingen omvatten 
keton, urobilinogeen, bilirubine en occult bloed. Indien nodig kunnen hier ­
aan nog andere parameters worden toegevoegd om het onderzoek van de waargenomen effecten verder uit te breiden.
 
44. Er wordt in het algemeen van uitgegaan dat in geval van onderzoek bij 
honden basisgegevens voor hematologische en klinisch-biochemische varia ­
belen vereist zijn vóór aanvang van de behandeling, maar dat die voor 
onderzoek bij knaagdieren niet hoeven te worden bepaald (30). Als de basisgegevens uit het verleden (zie paragraaf 50) ontoereikend zijn, moet worden overwogen om dergelijke gegevens alsnog te genereren.
 
Pathologie  
Macroscopische obductie  
45. Bij alle dieren in het onderzoek moet normaal gesproken een volledige 
macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig on ­
derzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedel ­
holte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Het is echter 
mogelijk dat (bij de groepen met dieren die tussentijds moeten worden gedood of in de satellietgroepen) de metingen moeten worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit 
(zie punt 19). Bij deze dieren hoeft geen obductie te worden uitgevoerd 
en kunnen ook de in de volgende punten beschreven vervolgprocedures achterwege blijven. De onderzoeksleider bepaalt van geval tot geval of 
obductie op de verklikkerdieren noodzakelijk is.
 
46. Voor alle dieren, behalve die welke op grond van het tweede deel van punt 
45 worden uitgesloten, moeten de orgaangewichten worden bepaald. De bijnieren, de hersenen, de epididymides, het hart, de nieren, de lever, de eierstokken, de milt, de testes, de schildklier (gewogen na fixatie, inclusief 
bijschildklieren) en de baarmoeder van alle dieren (afgezien van stervende 
en/of tussentijds gedode dieren) moeten worden ontdaan van aanhechtend weefsel, naargelang hetgeen van toepassing is, en moeten zo spoedig mo ­
gelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. 
In een onderzoek dat gebruikmaakt van muizen is weging van de bijnieren 
facultatief.
 
47. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische 
onderzoek (32) geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief): 
elk macroscopisch waar ­
neembaar letsel hart alvleesklier maag (voormaag, kliermaag) 
bijnier ileum bijschildklier [tanden] 
aorta jejunum perifere zenuw testis hersenen (inclusief coupes 
van cerebrum, cerebellum en medulla/pons) nier hypofyse thymus 
blindedarm traanklier (extraorbitaal) prostaat schildklier 
cervix lever rectum [tong]
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
coagulans afscheidende 
klier long speekselklier luchtpijp 
colon lymfeklieren (zowel op ­
pervlakkig als dieper ge ­
legen) zaadblaasje urineblaas 
duodenum borstklier (verplicht bij 
vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien 
zichtbaar ontleedbaar) skeletspier uterus (inclusief cervix) 
epididymis [bovenste luchtwegen, 
inclusief neus, neus ­
schelpen en paranasale 
sinussen] huid [ureter] 
oog (inclusief netvlies) slokdarm ruggenmerg (drie ni ­
veaus: cervicaal, medi ­
othoracaal en lumbaal) [urinebuis] 
[dijbeen met gewricht] [reukkolf] milt vagina 
galblaas (bij andere dier ­
soorten dan ratten) ovarium [borstbeen] coupe van het beenmerg en/ 
of vers beenmergaspiraat 
klier van Harder
 
Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide 
worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak 
blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze kun ­
nen worden aangetast, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de 
dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden be ­
waard die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en is het van essentieel belang dat specifieke monsters van de huid op de toedienings ­
locatie worden genomen en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst 
van luchtwegweefsels die moeten worden bewaard en onderzocht, worden 
gebaseerd op de aanbevelingen in hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (9). In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) 
moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg 
zijn vastgesteld.
 
Histopathologie  
48. Er zijn aanwijzingen beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering 
van toxicologisch-pathologisch onderzoek (32). Ten minste het volgende 
histopathologische onderzoek dient te worden verricht:  
— alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;  
— alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden 
gedood;  
— alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen;  
— doelweefsels of weefsels die met de behandeling samenhangende ver ­
anderingen vertonen in de hogedosisgroep en van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
 
— organen die paarsgewijs voorkomen, bijvoorbeeld nieren en bijnieren, 
moeten beide worden onderzocht.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
49. Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt over alle geëvalueerde pa ­
rameters. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om redenen 
van dierenwelzijn moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij 
de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijn ­
selen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxische effecten, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische ef ­
fecten, het aantal dieren met letsel, de aard van het letsel en het percentage 
dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. De gemiddelden en standaard ­
deviaties (voor continue testgegevens) van de dieren waarbij toxische effec ­
ten of letsels voorkomen, worden in tabelvorm samengevat, in aanvulling op 
de inschaling van de letsels.
 
50. Bij de interpretatie van de onderzoeksresultaten kunnen controlegegevens uit 
het verleden nuttig zijn, bv. wanneer er aanwijzingen zijn dat de gegevens 
van de parallelle controlegroepen aanzienlijk afwijken van de recente gege ­
vens van de controledieren in dezelfde testfaciliteit/kolonie. Controlegege ­
vens uit het verleden die ter evaluatie worden aangeboden, moeten afkom ­
stig zijn uit hetzelfde laboratorium, verband houden met dieren van dezelfde 
leeftijd en stam, en zijn gegenereerd gedurende de vijf jaar die zijn voor ­
afgegaan aan het onderzoek in kwestie.  
51. Voor zover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met behulp 
van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëva ­
lueerd. De statistische methoden en de te analyseren gegevens moeten tij ­
dens het opzetten van het onderzoek worden gekozen (zie punt 8). Bij de 
selectie moet zo nodig worden gecorrigeerd voor overleving.  
Testverslag  
52. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;  
— identificatiegegevens;  
— herkomst van de stof;  
— partijnummer;  
— certificaat van chemische analyse.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).  
Proefdieren:  
— gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren bij aanvang van de test;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— herkomst, huisvesting, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de test.  
Testomstandigheden:  
— motivering voor de gekozen toedieningsweg en de keuze van de dosis;  
— toegepaste statistische methoden voor analyse van de gegevens, indien 
van toepassing;  
— bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de 
samenstelling van het voer;  
— analytische gegevens over de bereikte concentratie, stabiliteit en homo ­
geniteit van het preparaat;  
— de toedieningsweg en bijzonderheden over de toediening van de teststof;  
— bij inhalatieonderzoek, alleen via de neus of via het hele lichaam;  
— werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en conversiefactor van de 
teststofconcentratie (mg/kg of ppm) in het voedsel/drinkwater naar de werkelijke dosis, voor zover van toepassing;
 
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water.  
Resultaten (er moeten samengevatte gegevens in tabelvorm en gegevens 
voor elk dier apart worden verstrekt):  
— overlevingsgegevens;  
— lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;  
— voedselverbruik, voedselefficiëntie, indien berekend, en waterverbruik, 
indien van toepassing;  
— gegevens over de toxische reacties naar geslacht en dosisniveau, met 
inbegrip van toxiciteitsverschijnselen;  
— aard, frequentie (en indien beoordeeld, ernst) en duur van de klinische 
waarnemingen (van voorbijgaande aard dan wel blijvend);  
— uitgevoerd oftalmologisch onderzoek;  
— hematologische tests;  
— klinisch-biochemische tests;  
— urinalysetests;  
— resultaten van eventueel onderzoek naar neurotoxiciteit of immunotoxi ­
citeit;  
— lichaamsgewicht aan het einde van het onderzoek;  
— orgaangewichten (en hun verhoudingen, indien van toepassing);  
— obductiebevindingen;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle met de behandeling samenhan ­
gende histopathologische bevindingen;  
— indien beschikbaar, absorptiegegevens.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing  
Bespreking van de resultaten, waaronder:  
— dosis-responsverhoudingen;  
— beoordeling van eventuele informatie over de werkingswijze;  
— bespreking van eventuele modelleringsbenaderingen;  
— bepaling van BMD, NOAEL of LOAEL;  
— controlegegevens uit het verleden;  
— relevantie voor de mens.  
Conclusies  
LITERATUUR:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Pro ­
gramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  
(5) Hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Subchronische orale toxiciteitstest: toxi ­
citeitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde 
toediening (90 dagen).  
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment nr. 116, 
beschikbaar op de openbare website voor onderzoeksrichtlijnen van de OESO op www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(8) Hoofdstuk B.8 van deze bijlage, Subacute inhalatietoxiciteit: onderzoek van 
28 dagen.  
(9) Hoofdstuk B.29 van deze bijlage, Subchronische inhalatietoxiciteit: onder ­
zoek van 90 dagen.  
(10) Hoofdstuk B.9 van deze bijlage, Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toedie ­
ning (28 dagen).  
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Che ­
mical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of 
Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.  
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69-98.  
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, 
Paris.  
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers 
D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
(19) Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 
22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor weten ­
schappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, 
blz. 33).  
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of He ­
alth and Human Services.  
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal 
Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255- 
04-2.  
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems.  
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
(25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(31) EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126-131.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIE  
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze testmethode wordt getest..  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  ONDERZOEK NAAR DE PRENATALE ONTWIKKELINGS ­
TOXICITEIT  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 414 (2001) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
Deze testmethode voor ontwikkelingstoxiciteit is bedoeld om alge ­
mene informatie te verschaffen over de effecten van prenatale bloot ­
stelling op het drachtige proefdier en het zich ontwikkelende orga ­
nisme in utero; daarbij kunnen de effecten op het moederdier en het afsterven, structurele abnormaliteiten of afwijkende groei bij de foe ­
tus worden bepaald. Functionele gebreken zijn weliswaar een belang ­
rijk aspect van ontwikkeling, maar zijn niet in deze testmethode 
opgenomen. Hierop kan worden getest door een apart onderzoek uit te voeren of door als uitbreiding van dit onderzoek de test ­
methode voor ontwikkelingsneurotoxiciteit uit te voeren. Voor infor ­
matie over het testen op functionele gebreken en andere postnatale 
effecten kan waar nodig de testmethode voor het reproductietoxici ­
teitsonderzoek over twee generaties en het onderzoek naar ontwik ­
kelingsneurotoxiciteit worden geraadpleegd.
 
Specifieke aanpassingen van deze testmethode op basis van speci ­
fieke kennis omtrent bijvoorbeeld de fysisch-chemische of toxicolo ­
gische eigenschappen van de teststof kunnen in bepaalde gevallen nodig zijn. Dergelijke aanpassingen zijn aanvaardbaar wanneer over ­
tuigend wetenschappelijk bewijsmateriaal erop wijst dat de test door 
de aanpassing meer informatie oplevert. In zo'n geval dient het we ­
tenschappelijk bewijsmateriaal zorgvuldig in het verslag te worden vermeld.
 
1.2. DEFINITIES  
Ontwikkelingstoxicologie:  de bestudering van schadelijke effecten 
op het zich ontwikkelende organisme die kunnen voortvloeien uit blootstelling vóór de bevruchting, tijdens de prenatale ontwikkeling of postnataal tot het tijdstip van geslachtelijke rijping. De belang ­
rijkste uitingen van ontwikkelingstoxiciteit zijn: 1) dood van het 
organisme, 2) structurele abnormaliteiten, 3) afwijkende groei en 4) functionele gebreken. Ontwikkelingstoxicologie werd vroeger vaak teratologie genoemd.
 
Schadelijk effect:  een aan de behandeling gerelateerde afwijking 
van de normale toestand die het vermogen van een organisme om 
te overleven, zich te reproduceren of zich aan de omgeving aan te passen vermindert. In het kader van de ontwikkelingstoxicologie in de ruimste zin vallen hier alle effecten onder die de normale ont ­
wikkeling van de vrucht zowel voor als na de geboorte storen.
 
Afwijkende groei:  een afwijking in het gewicht of de grootte van 
een of meer organen of het lichaam van een jong.  
Afwijkingen (anomalieën):  structurele afwijkingen in de ontwikke ­
ling; hieronder vallen zowel misvormingen als variaties (28).  
Misvorming/ernstige abnormaliteit:  een structurele verandering die 
als schadelijk voor het dier wordt beschouwd (en ook dodelijk kan 
zijn) en meestal zelden voorkomt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Variatie/lichte abnormaliteit:  een structurele verandering die wordt 
geacht weinig of geen nadelige gevolgen voor het dier te hebben; 
deze kan van voorbijgaande aard zijn en betrekkelijk vaak in de controlepopulatie voorkomen.
 
Vrucht:  alles wat in enige fase van de ontwikkeling vanaf de be ­
vruchting tot de geboorte uit een bevruchte eicel ontstaat, met in ­
begrip van de extra-embryonale vliezen alsmede het embryo of de foetus.
 
Implantatie (innesteling):  de hechting van de blastocyst aan de 
epitheelbekleding van de uterus, met inbegrip van de penetratie 
door het epitheel van de uterus en de inbedding in het endometrium.  
Embryo:  de vroege of ontwikkelingsfase van een organisme, meer 
in het bijzonder het ontwikkelingsproduct van de bevruchting van 
een eicel nadat de lange as verschenen is en totdat alle belangrijke 
structuren aanwezig zijn.  
Embryotoxiciteit:  schadelijke effecten op de normale structuur, ont ­
wikkeling, groei en/of levensvatbaarheid van een embryo.  
Foetus:  het ongeboren jong in de post-embryonale periode.  
Foetotoxiciteit:  schadelijke effecten op de normale structuur, ont ­
wikkeling, groei en/of levensvatbaarheid van een foetus.  
Abortus:  de voortijdige uitstoting uit de uterus van de producten van 
de conceptie: het embryo of een niet-levensvatbare foetus.  
Resorptie:  een vrucht die na de implantatie in de uterus sterft en 
wordt of is geresorbeerd.  
Vroege resorptie:  aanwijzingen voor implantatie zonder als zodanig 
te herkennen embryo/foetus.  
Late resorptie:  een dood embryo of een dode foetus met 
uiterlijke degeneratieve veranderingen.  
NOAEL : afkorting voor „no-observed-adverse-effect level” (dosis 
zonder waargenomen schadelijke effecten): de hoogste dosis of het 
hoogste blootstellingsniveau waarbij geen aan de behandeling ver ­
bonden schadelijke effecten worden waargenomen.  
1.3. REFERENTIESTOF  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt aan drachtige dieren toegediend, normaal gespro ­
ken ten minste vanaf de implantatie tot één dag voor de dag waarop 
ze zullen worden gedood en deze dag dient zo dicht mogelijk bij de 
normale werpdatum te liggen zonder het risico te lopen dat er gege ­
vens verloren gaan door een voortijdige worp. De testmethode is niet bedoeld om uitsluitend de organogenese-periode te onderzoeken 
(d.w.z. dag 5-15 bij knaagdieren en dag 6-18 bij het konijn), maar 
ook de effecten vanaf een eventuele pre-implantatie gedurende de gehele dracht tot de dag vóór de keizersnede. Kort voor de keizer ­
snede worden de vrouwtjes gedood, wordt de inhoud van de uterus 
onderzocht en worden de foetussen onderzocht op van buitenaf zicht ­
bare anomalieën en veranderingen in zachte weefsels en het skelet.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Keuze van de diersoort  
Er wordt aanbevolen de test bij de meest relevante soort uit te voeren 
en laboratoriumsoorten en -stammen te gebruiken die meestal bij 
tests op prenatale ontwikkelingstoxiciteit worden gebruikt. Van de 
knaagdiersoorten verdient de rat de voorkeur en van de niet-knaag ­
dieren het konijn. Als een andere soort wordt gebruikt, dient hier ­
voor een motivering te worden gegeven.  
1.5.2.  Huisvesting en voeding  
De temperatuur in de proefdierruimte dient voor knaagdieren 22  o C 
(+ 3  o C) en voor konijnen 18  o C (+ 3  o C) te zijn. Hoewel de 
relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, 
moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunst ­
licht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbe ­
perkte hoeveelheid drinkwater.
 
De dekking gebeurt in daarvoor geschikte kooien. Dieren die gedekt 
zijn worden bij voorkeur apart gehuisvest, maar ook groepjes met kleine aantallen dieren zijn aanvaardbaar.
 
1.5.3.  Voorbereiding van de dieren  
Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste 5 
dagen aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen 
wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. De ken ­
merken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, geslacht, ge ­
wicht en/of leeftijd worden vastgelegd. De dieren van alle testgroe ­
pen dienen zo veel mogelijk hetzelfde gewicht en dezelfde leeftijd te 
hebben. Op elk dosisniveau worden jonge volwassen vrouwtjes ge ­
bruikt die nog geen jongen hebben gehad. De vrouwtjes worden door mannetjes van dezelfde soort en stam gedekt en dekking door man ­
netjes met dezelfde ouders wordt vermeden. Voor knaagdieren is dag 
0 van de dracht de dag waarop een vaginale prop en/of sperma wordt waargenomen. Voor konijnen is dag 0 meestal de dag van de coïtus of kunstmatige inseminatie als deze techniek wordt gebruikt. De 
kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de 
plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Elk dier krijgt een uniek identificatienummer. Vrouwtjes die gedekt zijn wor ­
den aselect ingedeeld in de controle- en behandelingsgroepen en als 
de vrouwtjes in groepjes gedekt zijn, worden de dieren in elk groepje 
gelijkelijk over de groepen verdeeld. Ook vrouwtjes die door het ­
zelfde mannetje bevrucht zijn, worden gelijkelijk over de groepen verdeeld.
 
1.6. UITVOERING  
1.6.1.  Aantal en geslacht van de dieren  
Elke test- en controlegroep bevat een zodanig aantal vrouwtjes dat er 
bij obductie ongeveer 20 vrouwtjesdieren met implantatieplaatsen zijn. Groepen met minder dan 16 dieren met implantatieplaatsen zullen wellicht niet aan de eisen voldoen. Sterfte bij moederdieren 
maakt het onderzoek niet noodzakelijkerwijs onbruikbaar, mits deze 
niet hoger ligt dan ongeveer 10 %.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Bereiding van de doses  
Als een medium of een ander additief wordt gebruikt om de toedie ­
ning te vergemakkelijken, moet op de volgende kenmerken worden gelet: de effecten op de resorptie, de distributie, het metabolisme en 
de retentie of uitscheiding van de teststof, de effecten op de che ­
mische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken kunnen wijzigen en de effecten op het verbruik van voer of water of de voedingstoestand van de dieren. Het medium mag geen toxi ­
sche effecten op de ontwikkeling of de voortplanting hebben.
 
1.6.3.  Dosering  
Normaal gesproken wordt de teststof dagelijks toegediend vanaf de 
implantatie (bv. dag 5 na de dekking) tot de dag vóór de geplande 
keizersnede. Als er voorbereidende onderzoeken beschikbaar zijn 
waaruit blijkt dat er geen grote kans is op verlies vóór implantatie, kan de behandeling worden uitgebreid tot de volledige drachtperiode vanaf de dekking tot één dag voor de dag waarop de dieren zullen 
worden gedood. Het is bekend dat een onjuiste behandeling of stress 
tijdens de dracht tot prenataal verlies kan leiden. Om prenataal ver ­
lies door niet aan de behandeling gerelateerde factoren te voorkomen worden onnodige manipulaties van drachtige dieren en stress door 
externe factoren zoals geluiden vermeden.
 
Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige contro ­
legroep gebruikt. Gezonde dieren worden aselect in de behandelde 
en controlegroepen ingedeeld. De dosisniveaus worden zodanig ge ­
kozen dat er sprake is van geleidelijk oplopende toxische effecten. Tenzij dit vanwege de fysisch/chemische aard of biologische ken ­
merken van de teststof onmogelijk is, wordt de hoogste dosis zoda ­
nig gekozen dat er enige ontwikkelingstoxiciteit en/of toxiciteit bij 
het moederdier wordt veroorzaakt (klinische verschijnselen of een afname van het lichaamsgewicht), maar geen sterfte of ernstig leed. Ten minste één lagere dosis moet minimale waarneembare toxische 
effecten veroorzaken. De laagste dosis mag geen verschijnselen van 
ontwikkelingstoxiciteit of toxiciteit bij het moederdier veroorzaken. Er wordt een dalende reeks dosisniveaus gekozen teneinde een dosis ­
afhankelijke respons en de dosis zonder waargenomen schadelijke 
effecten (NOAEL) te bepalen. Intervallen van een factor twee of vier 
zijn vaak optimaal om de dalende dosisniveaus vast te stellen en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te 
gebruiken. Hoewel het de bedoeling is een NOAEL bij het moeder ­
dier vast te stellen, kunnen ook onderzoeken waarbij een dergelijke dosis niet wordt bepaald aanvaardbaar zijn (1).
 
Bij de keuze van de dosisniveaus wordt rekening gehouden met 
eventueel bestaande gegevens over de toxiciteit en aanvullende in ­
formatie over het metabolisme en de toxicokinetiek van de teststof of verwante materialen. Deze informatie zal ook helpen aan te tonen dat 
het doseringsschema adequaat is.
 
Er wordt een gelijktijdige controlegroep gebruikt. Deze contro ­
legroep krijgt een schijnbehandeling of, als bij de toediening van 
de teststof een medium wordt gebruikt, een behandeling met medi ­
um. Aan alle groepen wordt hetzelfde volume teststof of medium toegediend. De aanpak van de dieren in de controlegroep(en) is identiek aan die van de dieren in de testgroepen. Aan de medium ­
controlegroepen wordt de hoogste gebruikte mediumdosis toegediend 
(zoals in de laagste dosisgroep).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Limiettest  
Als een test met één dosis van ten minste 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag bij orale toediening volgens de voor dit onder ­
zoek beschreven procedure geen waarneembare toxiciteit bij drach ­
tige dieren of hun jongen veroorzaakt en op grond van bestaande 
gegevens (bv. over verwante verbindingen qua structuur en/of meta ­
bolisme) geen effect te verwachten valt, zal een volledig onderzoek met drie dosisniveaus wellicht niet nodig zijn. Het kan nodig zijn bij 
de limiettest op grond van de verwachte blootstelling van de mens 
een hogere orale dosis te gebruiken. Voor andere toedieningsvormen, zoals inhalatie of toediening op de huid, zal het maximaal haalbare 
blootstellingsniveau vaak worden bepaald en beperkt door de fy ­
sisch-chemische eigenschappen van de teststof (bij toediening op de huid mag bijvoorbeeld geen ernstige lokale toxiciteit optreden).
 
1.6.5.  Toediening van de doses  
De teststof of het medium wordt meestal oraal met een sonde toe ­
gediend. Als er een andere toedieningsweg wordt gebruikt, moet worden uitgelegd en gemotiveerd waarom deze gekozen is en kun ­
nen er aanpassingen nodig zijn (2)(3)(4). De teststof wordt elke dag 
op ongeveer hetzelfde tijdstip toegediend.
 
De dosis voor een bepaald dier wordt normaal gesproken gebaseerd 
op de meest recente bepaling van het lichaamsgewicht. Bij de aan ­
passing van de dosis gedurende het laatste derde deel van de dracht moet echter zorgvuldigheid worden betracht. Voor de keuze van de dosis wordt gebruik gemaakt van bestaande gegevens om overmatige 
toxiciteit bij het moederdier te voorkomen. Als echter bij de behan ­
delde moederdieren overmatige toxiciteit wordt geconstateerd, wor ­
den deze op humane wijze gedood. Als verschillende drachtige die ­
ren tekenen van overmatige toxiciteit vertonen, moet worden over ­
wogen de test bij deze dosisgroep tebeëindigen. Als de stof met een 
sonde wordt toegediend, wordt deze bij voorkeur met behulp van een maagsonde of een geschikte catheter in één dosis aan de dieren gegeven. Het maximale volume dat in één keer kan worden toe ­
gediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume 
mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wan ­
neer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Wanneer maïsolie als medium 
wordt gebruikt, mag het volume niet groter zijn dan 0,4 ml/100 g 
lichaamsgewicht. Variaties in het toegediende volume worden tot een minimum beperkt door de concentratie aan te passen, zodat er voor alle dosisniveaus een constant volume wordt toegediend.
 
1.6.6.  Observatie van de moederdieren  
Ten minste eens per dag wordt er een klinische observatie uitgevoerd 
en vastgelegd, bij voorkeur elke dag op dezelfde tijd(en), waarbij rekening wordt gehouden met de periode na de toediening waarin de 
verwachte effecten maximaal zijn. De toestand van de dieren wordt 
geregistreerd, met inbegrip van dieren die gestorven of stervende zijn, relevante gedragsveranderingen en alle zichtbare tekenen van toxiciteit.
 
1.6.7.  Lichaamsgewicht en voerconsumptie  
De dieren worden op dag 0 van de dracht of uiterlijk op dag 3 van 
de dracht als door een externe fokker op een bekend tijdstip gedekte dieren worden geleverd, op de dag waarop de eerste dosis wordt 
toegediend, ten minste om de drie dagen gedurende de toedienings ­
periode en op de dag waarop ze zullen worden gedood, gewogen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
De voerconsumptie wordt om de drie dagen geregistreerd en dit 
gebeurt op dezelfde dagen als waarop het lichaamsgewicht wordt 
bepaald.  
1.6.8.  Obductie  
De vrouwtjes worden één dag voor de verwachte worp gedood. 
Vrouwtjes die vóór de dag waarop ze zullen worden gedood tekenen van abortus of voortijdige worp vertonen, worden gedood en aan een 
grondig macroscopisch onderzoek onderworpen.
 
Op het tijdstip waarop het moederdier wordt gedood of tijdens het 
onderzoek sterft, wordt het macroscopisch onderzocht op structurele 
abnormaliteiten of pathologische veranderingen. Om beïnvloeding tot 
een minimum te beperken worden de beoordeling van het moeder ­
dier tijdens de keizersnede en de latere analyse van de foetussen bij voorkeur uitgevoerd zonder de testgroep te kennen.
 
1.6.9.  Onderzoek van de inhoud van de uterus  
Onmiddellijk nadat het dier gedood is of zo spoedig mogelijk na 
sterfte wordt de uterus verwijderd en wordt nagegaan of de dieren drachtig zijn. Wanneer een dier niet drachtig lijkt, wordt de uterus nader onderzocht (bijvoorbeeld door kleuring met ammoniumsulfide 
voor knaagdieren en Salewski-kleuring of een andere geschikte me ­
thode voor konijnen) om dit te bevestigen (5).
 
De uterus van drachtige dieren wordt met de cervix gewogen. Bij 
drachtige dieren die tijdens het onderzoek dood zijn aangetroffen 
wordt het gewicht van de uterus niet bepaald.  
Bij drachtige dieren wordt het aantal corpora lutea bepaald.  
De inhoud van de uterus wordt onderzocht op het aantal dode em ­
bryo's of foetussen en levensvatbare foetussen. Om het relatieve 
tijdstip te bepalen waarop de vrucht gestorven is, wordt de mate van resorptie beschreven (zie punt 1.2),
 
1.6.10.  Onderzoek van de foetussen  
Van elke foetus worden het geslacht en het lichaamsgewicht bepaald.  
Elke foetus wordt onderzocht op uitwendige afwijkingen (6).  
De foetussen worden onderzocht op afwijkingen in het skelet en de 
zachte weefsels (zoals variaties en misvormingen of anomalieën) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) 
(23)(24). Indeling van afwijkingen in de foetus in categorieën ver ­
dient de voorkeur, maar is niet noodzakelijk. Wanneer indeling wel plaatsvindt, worden de criteria voor elke categorie duidelijk vermeld. Er wordt met name gelet op de voortplantingsorganen, die op teke ­
nen van een afwijkende ontwikkeling worden onderzocht.
 
Bij knaagdieren wordt ongeveer de helft van elk nest behandeld en 
onderzocht met het oog op skeletafwijkingen. De andere helft wordt behandeld en onderzocht met het oog op afwijkingen in zachte 
weefsels, waarbij erkende of geschikte methoden voor seriesneden 
of zorgvuldige macroscopische ontleedtechnieken worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Bij niet-knaagdieren zoals konijnen worden alle foetussen onderzocht 
op afwijkingen van zowel de zachte weefsels als het skelet. De 
lichamen van deze foetussen worden met behulp van zorgvuldige ontleedtechnieken beoordeeld op afwijkingen van de zachte weefsels, waarbij ook procedures kunnen worden gebruikt om de interne hart ­
structuur nader te beoordelen (25). Van de helft van de op deze 
wijze onderzochte foetussen wordt het hoofd verwijderd en behan ­
deld met het oog op de beoordeling van de zachte weefsels (zoals de ogen, de hersenen, de neusgangen en de tong) met gangbare metho ­
den voor seriesneden (26) of een even gevoelige methode. De licha ­
men van deze foetussen en de overige intacte foetussen worden met behulp van dezelfde methoden als voor knaagdieren zijn beschreven, behandeld en onderzocht met het oog op skeletafwijkingen.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens worden voor de moederdieren en hun jongen individu ­
eel gerapporteerd met een overzicht in tabelvorm, waarbij voor elke testgroep worden vermeld: het aantal dieren aan het begin van de 
test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met 
het oog op een humane behandeling is gedood, het tijdstip van sterfte of humane doding, het aantal drachtige vrouwtjes, het aantal dieren met toxiciteitsverschijnselen, een beschrijving van de waar ­
genomen toxiciteitsverschijnselen met vermelding van de aanvang, 
de duur en de ernst van de toxische effecten, de aard van de waar ­
nemingen bij de embryo's/foetussen en alle relevante gegevens over de nesten.
 
De getalsmatige resultaten worden met een geschikte statistische 
methode geëvalueerd, waarbij het nest als de eenheid voor gegeven ­
sanalyse wordt gebruikt. Er wordt een algemeen aanvaarde statisti ­
sche methode gebruikt; de statistische methoden worden bij de opzet 
van het onderzoek gekozen en gemotiveerd. Ook de gegevens over 
de dieren die niet overleven tot het tijdstip waarop ze zouden worden gedood, worden gerapporteerd. Deze gegevens kunnen in de groeps ­
gemiddelden worden opgenomen als dit relevant is. De relevantie 
van de over deze dieren verkregen gegevens, en derhalve de opname 
in of uitsluiting van groepsgemiddelden, moet van geval tot geval worden beoordeeld en gemotiveerd.
 
2.2. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN  
De resultaten van het onderzoek naar de prenatale ontwikkelings ­
toxiciteit worden aan de hand van de waargenomen effecten beoor ­
deeld. In deze evaluatie wordt de volgende informatie opgenomen:  
— de testresultaten bij de moederdieren en de embryo's/foetussen, 
met inbegrip van een evaluatie van het verband of het ontbreken 
daarvan tussen de blootstelling van de dieren aan de teststof en het optreden en de ernst van alle bevindingen;
 
— de criteria die zijn gehanteerd voor de indeling van externe af ­
wijkingen en afwijkingen in de zachte weefsels en het skelet bij 
foetussen in categorieën, als deze indeling heeft plaatsgevonden;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— eventueel controlegegevens uit het verleden om de interpretatie 
van de resultaten van het onderzoek te bevorderen;  
— de getallen die bij de berekening van alle percentages of indices 
zijn gebruikt;  
— een adequate statistische analyse van de resultaten van het onder ­
zoek, indien van toepassing, waarbij voldoende informatie over 
de analysemethode wordt vermeld, zodat een onafhankelijke 
evaluator/statisticus de analyse kan beoordelen en reconstrueren.  
Wanneer bij een onderzoek wordt aangetoond dat er geen sprake is 
van toxische effecten, moet nader onderzoek worden overwogen om de resorptie en de biologische beschikbaarheid van de teststof vast te 
stellen.
 
2.3. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Een onderzoek naar de prenatale ontwikkelingstoxiciteit levert infor ­
matie op over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens de dracht op de moederdieren en de ontwikkeling van hun jongen in de uterus. De resultaten van het onderzoek moeten in 
samenhang met de resultaten van het onderzoek naar subchronische 
en reproductietoxiciteit alsmede toxicokinetisch en ander onderzoek worden geïnterpreteerd. Aangezien de nadruk ligt op zowel de alge ­
mene toxiciteit voor de moederdieren als de ontwikkelingstoxiciteit, 
zal met de resultaten van het onderzoek tot op zekere hoogte onder ­
scheid kunnen worden gemaakt tussen effecten op de ontwikkeling zonder algemene toxiciteit en effecten die zich alleen voordoen bij niveaus die ook voor het moederdier toxisch zijn (27).
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag wordt de volgende specifieke informatie opge ­
nomen:  
Teststof:  
— de fysische aard en indien relevant de fysisch-chemische eigen ­
schappen;  
— de identiteit met vermelding van het CAS-nummer indien dit 
bekend/toegekend is;  
— de zuiverheid.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium, indien geen water 
wordt gebruikt.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort en stam;  
— aantal en leeftijd van de dieren;  
— herkomst, huisvesting, voeding enz.;  
— het gewicht van elk dier aan het begin van de test.  
Testomstandigheden:  
— beweegredenen voor de keuze van de dosisniveaus;  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof c.q. 
de samenstelling van het voer, de concentratie en de stabiliteit en 
homogeniteit van het preparaat;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg 
lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;  
— de leefomstandigheden;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het 
water.  
Resultaten:  
Gegevens over de toxische reacties bij de moederdieren per dosis, 
waaronder in elk geval maar niet uitsluitend:  
— het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat 
aan het eind nog in leven is, het aantal drachtige dieren en het aantal dieren waarbij abortus of een voortijdige worp optreedt;
 
— de sterfdag van dieren die aan het eind van de test niet meer in 
leven zijn;  
— de gegevens van dieren die niet meer in leven zijn op het tijdstip 
waarop ze zouden worden gedood, worden wel gerapporteerd maar niet in de statistische vergelijking tussen de groepen opge ­
nomen;
 
— de dag waarop elk afwijkend klinisch verschijnsel wordt waar ­
genomen en het verdere verloop daarvan;  
— het lichaamsgewicht, de veranderingen in het lichaamsgewicht en 
het gewicht van de drachtige uterus, waarbij facultatief de ver ­
anderingen in het lichaamsgewicht voor het gewicht van de drachtige uterus kunnen worden gecorrigeerd;
 
— de voerconsumptie en, indien dit gemeten is, het watergebruik;  
— de obductiebevindingen, met inbegrip van het gewicht van de 
uterus;  
— de NOAEL-waarden voor de effecten op de moederdieren en op 
de ontwikkeling dienen te worden gerapporteerd.  
Eindpunten voor ontwikkelingstoxiciteit per dosis voor nesten met 
implantaties, met inbegrip van:  
— het aantal corpora lutea;  
— het aantal implantaties en het aantal en percentage levende en 
dode foetussen en resorpties;  
— het aantal en percentage verloren vruchten vóór en na implanta ­
tie. 
Eindpunten voor ontwikkelingstoxiciteit per dosis voor nesten met 
levende foetussen, met inbegrip van:  
— het aantal en percentage levende jongen;  
— de verhouding mannetjes/vrouwtjes;  
— het lichaamsgewicht van de foetussen, bij voorkeur per geslacht 
en voor mannetjes en vrouwtjes samen;  
— externe misvormingen, misvormingen in de zachte weefsels en 
het skelet en andere relevante afwijkingen;  
— de criteria voor indeling in categorieën, indien van toepassing:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— het totale aantal en het percentage foetussen en nesten met ex ­
terne afwijkingen en afwijkingen in de zachte weefsels en het 
skelet, alsmede de aard en de frequentie van de verschillende anomalieën en andere relevante afwijkingen.
 
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Kavlock, R.J. et al. (1996). A Simulation Study of the Influ ­
ence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses 
for Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399-410.  
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990). Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386-398.
 
(3) Wong, B.A., et al. (1997). Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1-8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Speci ­
fic Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation De ­
velopmental Toxicity Study.  
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterus der Ratte.  Nau­
nyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimen ­
telle Pathologie  247:367.  
(6) Edwards, J.A. (1968). The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo.  In Advances in Teratology . D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976). Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171-173.  
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Technique for Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  Con­
genital Anomalies  32; 381-391.
 
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47: 229-242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.  
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969). A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127; 291 -306.  
(12) Fritz, H. (1974). Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313-320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966). Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  'Toxicology and Applied Pharmacology  9; 398-408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973). Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309-316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992). Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Matemal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169-181.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foe ­
tuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histo ­
logical Study of Viscera.  Supplement to Teratology Workshop 
Manual , pp. 163-173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928). The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Pos ­
sible Influence of the Sex Factor.  American Journal of Ana ­
tomy  41; 411 -445.  
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone.  Slain 'Technology  39; 61-63.  
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313-355.
 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984). Fresh Visceral Exa ­
mination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity 
Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181-188.  
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957).  The Genesis of the 
Rat Skeleton . Thomas, Springfield, IL.  
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy.  In Teratology: Principles and Techniques , Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977).  Handbook of Te ­
ratology , Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vel. 
Acad. Sci. Hung.  28; 233-239.  
(25) Staples, R.E. (1974). Detection of visceral Alterations in Mam ­
malian Foetuses.  Teratology  9; 37-38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977). A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology Neubert , D., Mer ­
ker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, 
Chicago, IL, pp. 126-144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991). Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56: 63798-63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Ab ­
normalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Te ­
ratology 55; 249-292.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  CARCINOGENITEITSONDERZOEK  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 451 (2009) van de OESO 
(TG 451). De oorspronkelijke TG 451 betreffende carcinogeniteitsonderzoek is in 1981 vastgesteld. De actualisering van testmethode B.32 werd nood ­
zakelijk geacht in het licht van recente ontwikkelingen op het gebied van 
dierenwelzijn en wettelijke voorschriften (2)(3)(4)(5)(6). De actualisering van deze testmethode B.32 is gelijktijdig uitgevoerd met de herziening van hoofdstuk B.30 van deze bijlage, Onderzoek naar chronische toxiciteit, 
en hoofdstuk B.33 van deze bijlage, Gecombineerd onderzoek naar chro ­
nische toxiciteit en carcinogeniteit, en had tot doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de bij het onderzoek gebruikte dieren en nadere bijzonderheden over de keuze van de dosis te verschaffen. Deze testmethode 
B.32 is bedoeld voor het testen van een breed scala van chemische stoffen, 
waaronder bestrijdingsmiddelen en industriële chemische stoffen. Hierbij zij evenwel opgemerkt dat bepaalde details en voorschriften voor genees ­
middelen kunnen verschillen (zie Guidance S1B on Testing for Carcinoge ­
nicity of Pharmaceuticals van de Internationale Conferentie voor 
harmonisatie (ICH)).
 
2. Het meeste carcinogeniteitsonderzoek wordt uitgevoerd bij knaagdiersoorten 
en deze testmethode is daarom voornamelijk bedoeld voor onderzoek dat bij 
deze soorten wordt verricht. Als dergelijk onderzoek ook bij andere dier ­
soorten dan knaagdieren moet worden uitgevoerd, kunnen de principes en procedures van deze testmethode, met de nodige aanpassingen, ook samen 
met die in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op 
dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (6), worden toegepast. Nadere aanwijzingen zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 116 betreffende het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische 
toxiciteit en carcinogeniteit (7).
 
3. De drie belangrijkste toedieningswegen bij carcinogeniteitsonderzoek zijn de 
orale, de dermale en de inhalatieweg. De keuze van de toedieningsweg is afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de teststof en 
de voornaamste blootstellingsroute bij de mens. Nadere informatie over de 
keuze van de blootstellingsroute wordt verschaft in leidraad nr. 116 (7).
 
4. Deze testmethode spitst zich toe op blootstelling via de orale weg, de meest 
gebruikte route bij carcinogeniteitsonderzoek. Hoewel carcinogeniteitsonder ­
zoek met blootstelling via de dermale of de inhalatieweg ook noodzakelijk kan zijn om de risico’s voor de menselijke gezondheid te beoordelen en/of vereist kan zijn op grond van bepaalde regelgevingskaders, zijn beide bloot ­
stellingsroutes technisch bijzonder complex. Dergelijk onderzoek dient per 
geval te worden opgezet, hoewel de hier beschreven testmethode voor het beoordelen en evalueren van de carcinogeniteit bij orale toediening kan worden gebruikt als basis voor een protocol voor dermaal en inhalatieonder ­
zoek, rekening houdend met aanbevelingen ten aanzien van de behan ­
delingsperiode, klinische en pathologische parameters enz. Er zijn OESO-richtsnoeren beschikbaar voor de toediening van teststoffen via de dermale weg (7) en de inhalatieweg (7)(8). Bij het opzetten van langeter ­
mijnonderzoek naar blootstelling via de inhalatieweg moet met name aan ­
dacht worden geschonken aan hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (10), samen met de OESO-leidraad voor acuut inhalatieonderzoek (8). In geval van tests die via de dermale weg 
worden uitgevoerd, dient hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11) te worden 
geraadpleegd.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Carcinogeniteitsonderzoek levert informatie op over de mogelijke gevaren 
voor de gezondheid die kunnen voortvloeien uit herhaalde blootstelling 
gedurende een periode die kan oplopen tot de gehele levensduur van de gebruikte diersoort. Het onderzoek zal informatie opleveren over de toxische effecten van de teststof, met inbegrip van potentiële carcinogeniteit, en kan 
de doelorganen aanwijzen en de mogelijkheid van accumulatie aangeven. 
Daarnaast kan er een inschatting worden gemaakt van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld bij toxische effecten en, in het geval van niet-genotoxische carcinogene agentia, bij tumorreacties. Aan de hand 
van deze inschatting kunnen vervolgens veiligheidscriteria voor de bloot ­
stelling van de mens worden vastgesteld. Bovendien wordt benadrukt dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om zo veel mogelijk informatie te verkrijgen.
 
6. De doelstellingen van het onder deze testmethode vallende carcinogeniteits ­
onderzoek omvatten:  
— het vaststellen van de carcinogene eigenschappen van een teststof die 
leiden tot een toegenomen incidentie van gezwellen, een toename van het aandeel kwaadaardige gezwellen of een vermindering van de tijd totdat gezwellen optreden, in vergelijking met parallelle controlegroepen;
 
— het vaststellen van de organen die door carcinogeniteit kunnen worden 
aangetast;  
— het vaststellen van de tijd totdat gezwellen optreden;  
— het karakteriseren van de dosis-responsverhouding van de tumor;  
— het vaststellen van een niveau waarbij geen schadelijk effect werd vast ­
gesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) of een uitgangs ­
punt voor het bepalen van een benchmarkdosis (BMD);  
— het extrapoleren van de carcinogene effecten naar lage doses waaraan 
mensen worden blootgesteld;  
— het verschaffen van gegevens om hypothesen over de werkingswijze 
(2)(7)(12)(13)(14)(15) te toetsen.  
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
7. Bij het beoordelen en evalueren van de potentiële carcinogeniteit van een 
teststof moet het testlaboratorium, alvorens het onderzoek uit te voeren, alle 
beschikbare informatie over de teststof in aanmerking nemen, zodat de opzet van het onderzoek zodanig kan worden afgestemd dat doelmatiger wordt getest op potentiële carcinogeniteit en het gebruik van dieren wordt gemini ­
maliseerd. Informatie over en aandacht voor de werkingswijze van een stof 
waarvan het vermoeden bestaat dat deze een carcinogene stof is (2)(7)(12)(13)(14)(15) is van groot belang, aangezien de optimale opzet van het onderzoek kan verschillen afhankelijk van het antwoord op de vraag 
of de teststof een stof is waarvan is gebleken of vermoed wordt dat deze een 
genotoxische carcinogene stof is. Raadpleeg leidraad nr. 116 (7) voor nadere aanwijzingen voor het beoordelen van de werkingswijze.
 
8. Informatie die behulpzaam kan zijn bij het opzetten van het onderzoek 
omvat de identiteit, de chemische structuur en de fysisch-chemische eigen ­
schappen van de teststof; de uitkomsten van eventuele in vitro of in vivo 
uitgevoerde toxiciteitstests, met inbegrip van genotoxiciteitstests; voorgeno ­
men toepassing(en) en de kans op blootstelling van de mens; beschikbare (Q)SAR-gegevens, gegevens over de mutageniteit/genotoxiciteit 
en carcinogeniteit alsmede andere toxicologische gegevens van chemische 
stoffen met een verwante structuur; beschikbare toxicokinetische gegevens
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
(kinetiek bij zowel eenmalige als herhaalde toediening, indien beschikbaar) 
en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende gegevens. De 
carcinogeniteit moet worden beoordeeld nadat initiële informatie over de toxiciteit is verkregen door middel van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen. Ook kortdurend onderzoek 
naar de initiatie/promotie van kanker kan nuttige informatie opleveren. Als 
onderdeel van de algemene beoordeling van de potentiële schadelijke ge ­
zondheidseffecten van een bepaalde teststof (16)(17)(18)(19) moet een ge ­
faseerde benadering van de carcinogeniteitstesten worden overwogen.
 
9. Voordat met het onderzoek wordt begonnen, moet worden bepaald welke 
statistische methoden gezien de opzet van de proeven en de doelstellingen 
het best geschikt zijn voor de analyse van de uitkomsten. Zo moet onder meer worden overwogen of de statistische gegevens tevens een correctie voor overleving, een analyse van de cumulatieve risico’s op tumoren in 
verhouding tot de duur van overleving, een analyse van de tijd totdat tu ­
moren optreden en een analyse in geval van voortijdige beëindiging van één of meer groepen moeten omvatten. Aanwijzingen voor de juiste statistische analysen en belangrijke verwijzingen naar internationaal erkende statistische 
methoden worden gegeven in leidraad nr. 116 (7) en leidraad nr. 35 over de 
analyse en evaluatie van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinoge ­
niteit (20).
 
10. Bij het uitvoeren van carcinogeniteitsonderzoek moeten altijd de richtsnoe ­
ren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in het 
OESO-leidraad nr. 19 betreffende het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische symptomen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (21), en met name punt 62. In dat punt wordt 
verklaard dat wanneer een dier bij onderzoek met herhaalde toediening kli ­
nische symptomen met een voortschrijdend karakter vertoont die leiden tot een verdere verslechtering van de toestand van het dier, op basis van de beschikbare informatie moet worden overwogen of het dier op humane 
wijze moet worden gedood. Hierbij moet tevens worden overwogen hoe 
de waarde van de informatie die kan worden gewonnen door het dier in kwestie te handhaven in het onderzoek zich verhoudt tot de algehele con ­
ditie van het dier. Als wordt besloten het dier in het onderzoek te hand ­
haven, moet de frequentie van de waarnemingen zo nodig worden verhoogd. 
Het kan ook zijn dat het mogelijk is de pijn of het ongerief te verlichten door de toediening van de dosis tijdelijk stop te zetten of de testdosis te verminderen, zonder dat dit het doel van het onderzoek nadelig beïnvloedt.
 
11. Nadere aanwijzingen en een bespreking van de principes voor de keuze van 
de dosis bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7) en twee publicaties van het International Life Sciences Institute (22)(23). Welke strategie voor dosiskeuze uiteindelijk 
wordt toegepast, is afhankelijk van de primaire doelstelling of doelstellingen 
van het onderzoek (punt 6). Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet een evenwicht worden getroffen tussen enerzijds de gevarenscreening en anderzijds de karakterisering van de lagedosisrespons en de wisselwerking 
tussen de twee. Dit is met name relevant in situaties waarin gecombineerd 
onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet worden uitgevoerd (punt 12).
 
12. Er moet worden nagegaan of gecombineerd onderzoek naar chronische 
toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) kan worden 
uitgevoerd in plaats van afzonderlijke studies naar chronische toxiciteit 
(hoofdstuk B.30 van deze bijlage) en carcinogeniteit (deze testmethode B.32). De gecombineerde test kost minder tijd en geld dan twee afzonder ­
lijke studies, zonder dat dit ten koste gaat van de gegevenskwaliteit van de 
onderzoeksfasen. Bij uitvoering van gecombineerd onderzoek naar chro ­
nische toxiciteit en carcinogeniteit (hoofdstuk B.33 van deze bijlage) moet echter zorgvuldig rekening worden gehouden met de principes voor dosis ­
keuze (punt 11 en de punten 22 tot en met 25); bovendien kan de uitvoering 
van afzonderlijke studies verplicht zijn uit hoofde van bepaalde regelge ­
vingskaders.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. De definities die in de context van deze testmethode worden gebruikt, zijn te 
vinden aan het eind van dit hoofdstuk en in leidraad nr. 116 (7).  
PRINCIPE VAN DE TEST  
14. De teststof wordt gedurende het grootste deel van de levensduur van de 
proefdieren dagelijks in trapsgewijs stijgende doses aan diverse groepen 
toegediend; gewoonlijk geschiedt dit oraal. Ook de inhalatie- of dermale 
weg kan geschikt zijn. De proefdieren worden zorgvuldig op tekenen van toxiciteit en zich ontwikkelend neoplastisch letsel onderzocht. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. 
Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden gedood 
en ook hierop wordt obductie verricht.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
15. Deze testmethode heeft hoofdzakelijk betrekking op de beoordeling en eva ­
luatie van carcinogeniteit bij knaagdieren (punt 2). Het gebruik van andere 
diersoorten dan knaagdieren kan worden overwogen als het op grond van de beschikbare gegevens aannemelijk is dat deze relevanter zijn voor het voor ­
spellen van gezondheidseffecten bij de mens. De keuze van de soort moet 
worden verantwoord. De voorkeur wordt gegeven aan ratten, maar er kun ­
nen ook andere knaagdiersoorten worden gebruikt, bv. muizen. Hoewel het gebruik van muizen bij carcinogeniteitstest van beperkt nut kan zijn (24)(25)(26), zijn carcinogeniteitstests bij muizen op grond van bepaalde 
vigerende regelgevingsprogramma’s nog steeds vereist, tenzij wordt vast ­
gesteld dat een dergelijk onderzoek vanuit wetenschappelijk oogpunt over ­
bodig is. Aan het gebruik van ratten en muizen als experimentele modellen wordt de voorkeur gegeven vanwege hun betrekkelijk korte levensduur, het 
grootschalige gebruik ervan bij farmacologisch en toxicologisch onderzoek, 
hun gevoeligheid voor tumorinductie en de beschikbaarheid van voldoende gekarakteriseerde stammen. Vanwege deze kenmerken is een grote hoeveel ­
heid informatie over hun fysiologie en pathologie beschikbaar. Nadere in ­
formatie over de keuze van de soort en de stam is te vinden in leidraad 
nr. 116 (7).
 
16. Er worden jonge gezonde volwassen dieren van gangbare laboratoriums ­
tammen gebruikt. Het carcinogeniteitsonderzoek wordt bij voorkeur uitge ­
voerd bij dieren van dezelfde stam en herkomst als die welke zijn gebruikt 
voor het inleidende toxiciteitsonderzoek van kortere duur. Als echter bekend 
is dat het moeilijk is om met dieren van deze stam en herkomst te voldoen aan de algemeen aanvaarde overlevingscriteria voor langetermijnonderzoek (zie leidraad nr. 116 (7)), moet worden overwogen voor het langetermijn ­
onderzoek een stam met een hoger overlevingspercentage te gebruiken. De 
vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn.
 
Huisvesting en voeding  
17. De dieren kunnen individueel of in kleine groepjes van hetzelfde geslacht 
worden ondergebracht; individuele hokken moeten alleen worden overwo ­
gen als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (27)(28)(29). De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de 
kooi tot een minimum worden beperkt. De temperatuur in de proefdier ­
ruimte dient 22 °C (± 3 °C) te zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd 
naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een 
cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drink ­
water. Het voer moet aan alle voedingsbehoeften van de geteste soort vol ­
doen en het gehalte aan onzuiverheden in het voer, met inbegrip van maar 
niet beperkt tot residuen van bestrijdingsmiddelen, persistente organische
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
verontreinigende stoffen, fyto-oestrogenen, zware metalen en mycotoxinen, 
die van invloed kunnen zijn op de resultaten van de test, moet zo laag 
mogelijk zijn. Van tijd tot tijd moet er analytische informatie over het gehalte aan nutriënten en onzuiverheden in het voer worden samengesteld, ten minste aan het begin van het onderzoek en wanneer er veranderingen 
zijn in de gebruikte partij. Deze informatie moet in het eindverslag worden 
opgenomen. Ook over het bij het onderzoek gebruikte drinkwater moet analytische informatie worden verstrekt. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende vermenging van de 
teststof te zorgen en te voldoen aan de voedingsbehoeften van de dieren 
wanneer die teststof via het voer wordt toegediend.
 
Voorbereiding van de dieren  
18. Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste zeven dagen 
aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Bij knaagdieren moet de 
toediening van de dosis zo snel mogelijk na het spenen en de acclimatisatie 
beginnen en bij voorkeur voordat de dieren acht weken oud zijn. Van de proefdieren worden de volgende kenmerken vastgelegd: soort, stam, her ­
komst, geslacht, gewicht en leeftijd. Aan het begin van het onderzoek 
moeten de gewichtsverschillen binnen elk geslacht minimaal zijn en niet 
meer bedragen dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van alle in het onderzoek gebruikte dieren van dat geslacht. De dieren worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen ingedeeld. Na de willekeurige inde ­
ling mogen er binnen de geslachten geen significante verschillen in li ­
chaamsgewicht zijn tussen de groepen. Als er statistisch significante ver ­
schillen zijn, moet de willekeurige indeling zo mogelijk opnieuw worden uitgevoerd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toe ­
gekend in de vorm van een permanent merkteken dat met behulp van een 
tatoeage, een onder de huid ingebrachte microchip of via een andere ge ­
schikte methode wordt aangebracht.
 
PROCEDURE  
Aantal en geslacht van de dieren  
19. Beide geslachten moeten worden gebruikt. Er moet een voldoende groot 
aantal dieren worden gebruikt om een grondige biologische en statistische 
evaluatie mogelijk te maken. Daarom moet elke dosisgroep en elke gelijk ­
tijdige controlegroep ten minste 50 dieren van elk geslacht omvatten. Af ­
hankelijk van het doel van het onderzoek, kan het statistisch onderschei ­
dingsvermogen van de belangrijkste schattingen mogelijk worden vergroot 
door de dieren ongelijk over de diverse dosisgroepen te verdelen, met meer 
dan 50 dieren in de lagedosisgroepen, bv. om potentiële carcinogeniteit bij lage doses te schatten. Er moet echter worden onderkend dat een geringe verhoging van de groepsgrootte relatief weinig zal bijdragen tot het statis ­
tisch onderscheidingsvermogen van het onderzoek. Nadere informatie over 
de statistische opzet van het onderzoek en de keuze van de dosisniveaus voor een zo groot mogelijk statistisch onderscheidingsvermogen is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
 
Dieren tussentijds doden en satellietgroepen (verklikkergroepen)  
20. Als onderdeel van het onderzoek kunnen sommige dieren tussentijds worden 
gedood, bv. na twaalf maanden, om informatie te verschaffen over de ont ­
wikkeling van neoplastische veranderingen en mechanistische informatie, indien dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Als dergelijke informatie al beschikbaar is uit eerder toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening 
van de teststof, is het tussentijds doden van dieren mogelijk niet weten ­
schappelijk gerechtvaardigd. Als de onderzoeksopzet voorziet in het tussen ­
tijds doden van dieren, bedraagt het geplande aantal tussentijds te doden dieren in elke dosisgroep gewoonlijk 10 per geslacht en moet het totale 
aantal dieren in de onderzoeksopzet worden vermeerderd met het aantal 
dieren dat voor afronding van het onderzoek zal worden gedood. Tijdens het onderzoek kan zo nodig een aanvullende groep verklikkerdieren (door ­
gaans 5 dieren per geslacht) worden opgenomen met het oog op de moni ­
toring van de ziektestatus (30). Nadere richtsnoeren zijn opgenomen in 
leidraad nr. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Dosisgroepen en dosering  
21. Aanwijzingen voor alle aspecten van de dosiskeuze en het interval tussen de 
dosisniveaus zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controlegroep gebruikt. De dosisni ­
veaus worden doorgaans gebaseerd op de resultaten van korter onderzoek 
met herhaalde toediening of van bereikbepalingonderzoek, en er moet re ­
kening worden gehouden met bestaande toxicologische en toxicokinetische gegevens die voor de teststof of aanverwante stoffen beschikbaar zijn.
 
22. Tenzij dit vanwege de fysisch-chemische aard of biologische kenmerken van 
de teststof onmogelijk is, moet de hoogste dosis zodanig worden gekozen dat de voornaamste doelorganen en toxische effecten worden vastgesteld 
zonder dat dit leed, ernstige toxiciteit, ziekten of sterfte veroorzaakt. Het 
hoogste dosisniveau moet normaliter, rekening houdend met de in punt 23 beschreven factoren, zodanig worden gekozen dat er tekenen van toxiciteit optreden, die bijvoorbeeld blijken uit een lichte achteruitgang van de ge ­
wichtstoename (ca. 10 %). Afhankelijk van het doel van het onderzoek (zie 
punt 6), kan echter een hoogste dosis worden gekozen die lager is dan de dosis waarbij tekenen van toxiciteit optreden, bv. als een dosis een zorg ­
wekkend schadelijk effect heeft dat niettemin weinig invloed heeft op de 
levensduur of het lichaamsgewicht.
 
23. De dosisniveaus en het interval tussen de dosisniveaus kunnen zo worden 
gekozen dat een dosisrespons en, afhankelijk van de werkingswijze van de teststof, een NOAEL of ander beoogd resultaat van het onderzoek, bv. een 
BMD (zie punt 25), bij het laagste dosisniveau worden vastgesteld. Factoren 
die moeten worden meegewogen bij de toediening van lagere doses omvat ­
ten de verwachte helling van de dosis-responscurve, de doses waarbij be ­
langrijke veranderingen in het metabolisme of de toxische werking kunnen 
optreden, de verwachte locatie van een drempelwaarde of de verwachte 
locatie van een uitgangspunt voor extrapolatie naar lage doses.
 
24. Het gekozen interval tussen de dosisniveaus hangt van de kenmerken van de 
teststof af en kan niet in deze testmethode worden voorgeschreven, maar 
doorgaans leveren twee- tot viervoudige intervallen goede testresultaten op 
voor de instelling van de afnemende dosisniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep is vaak te verkiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van ongeveer 6 à 10) tussen twee 
doseringen. In het algemeen moet het gebruik van factoren boven de 10 
worden vermeden en worden verantwoord als deze toch worden gebruikt.
 
25. Zoals nader wordt besproken in leidraad nr. 116 (7), moet bij de keuze van 
de dosis rekening worden gehouden met het volgende:  
— bekende of vermoedelijke niet-lineariteiten of buigpunten in de dosis ­
respons;  
— toxicokinetiek en dosisbereiken waarbij metabolische inductie, verzadi ­
ging of niet-lineariteit tussen externe en interne doses al dan niet op ­
treden;  
— precursorletsels en merkstoffen die het effect of indicatoren die de wer ­
king van de voornaamste fundamentele biologische processen aangeven;  
— de voornaamste (of vermoedelijke) aspecten van de werkingswijze, zoals 
doses waarbij de cytotoxiciteit begint toe te nemen, hormoonniveaus 
verstoord raken, homeostatische mechanismen het onderspit delven enz.;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— gebieden van de dosis-responscurve die een bijzonder robuuste schatting 
behoeven, bv. op het gebied van de verwachte BMD of een vermoede ­
lijke drempelwaarde;  
— de verwachte blootstellingsniveaus bij de mens.  
26. De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof een 
medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van de behan ­
deling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde 
wijze worden behandeld als die in de testgroep. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoogste gebruikte mediumdosis van de dosisgroepen toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de 
voeding en deze een geringere voedingsopname veroorzaakt omdat de voe ­
ding daardoor minder appetijtelijk is, kan een aanvullende paargevoede controlegroep dienen als een meer geschikte controle.
 
Bereiding en toediening van doses van de teststof  
27. De teststof wordt normaliter oraal, met de voeding of het drinkwater, of via 
een maagsonde toegediend. Nadere informatie over de toedieningswegen en 
-methoden is te vinden in leidraad nr. 116 (7). De toedieningsweg en de 
toedieningsmethode zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek, de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de biologische beschik ­
baarheid ervan en de voornaamste blootstellingsroute en -methode bij de 
mens. De keuze van de toedieningsweg en de toedieningsmethode moet 
worden gemotiveerd. In het belang van het welzijn van de dieren moet de orale maagsonde normaliter alleen worden gekozen in geval van agentia waarvoor deze toedieningsweg- en methode redelijk overeenkomen met de 
mogelijke blootstelling van de mens (bv. bij geneesmiddelen). Bij in de 
voeding of het milieu voorkomende chemische stoffen zoals bestrijdings ­
middelen wordt de teststof doorgaans toegediend via de voeding of het drinkwater. In sommige scenario’s, bv. bij beroepsmatige blootstelling, 
kan toediening via andere wegen geschikter zijn.
 
28. Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspen ­
deerd. Er moet rekening worden gehouden met de volgende eigenschappen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepassing is: 
effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van 
de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken ervan kunnen veranderen; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedingsstatus van de dieren. Aanbevolen wordt eerst 
na te gaan of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, 
als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Er 
moet informatie beschikbaar zijn over de stabiliteit van de teststof en de 
homogeniteit van de doseeroplossingen of het voer (naargelang hetgeen van toepassing is) onder de toedieningsomstandigheden (bv. dieet).
 
29. Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet 
erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren 
met de normale voedings- of waterbalans. Bij langetermijnonderzoek naar toxiciteit waarbij de teststof via het voer wordt toegediend, mag de con ­
centratie van de teststof in de voeding de bovengrens van 5 % van de totale 
hoeveelheid voer normaliter niet overschrijden om onevenwichtigheden in 
de voeding te vermijden. Indien de teststof met de voeding wordt toe ­
gediend, kan een constante voedingsconcentratie (mg/kg voer of ppm) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier 
(mg/kg lichaamsgewicht), berekend op weekbasis, worden gebruikt. Aange ­
geven moet worden welk alternatief is gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Bij orale toediening wordt de teststof dagelijks (zeven dagen per week) aan 
de dieren toegediend, bij knaagdieren normaliter gedurende 24 maanden (zie 
ook punt 32). Elk ander doseringsregime, bv. vijf dagen per week, moet worden gemotiveerd. Bij toediening via de huid worden de dieren gedurende 24 maanden normaliter ten minste 6 uur per dag, zeven dagen per week met 
de teststof behandeld, zoals beschreven is in hoofdstuk B.9 van deze 
bijlage (11). Blootstelling via inhalatie geschiedt 6 uur per dag, zeven dagen per week, maar ook blootstelling gedurende vijf dagen is mogelijk, indien dit wordt verantwoord. De blootstellingsduur bedraagt normaliter 24 maan ­
den. Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de neus worden 
blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van leed te minimaliseren. Een blootstellings ­
duur van minder dan 6 uur per dag moet worden gemotiveerd. Zie ook 
hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9).
 
31. Indien de teststof via een maagsonde aan de dieren wordt toegediend, moet 
dit iedere dag op hetzelfde tijdstip gebeuren met gebruikmaking van een 
maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Normaliter zal eenmaal per dag 
één dosis worden toegediend; als een stof lokale irritaties veroorzaakt, kan de dagelijkse doseersnelheid mogelijk worden gehandhaafd door de toe te dienen dosis te splitsen (tweemaal per dag). Het maximale vloeistofvolume 
dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het 
dier. Het volume moet zo laag mogelijk worden gehouden als praktisch uitvoerbaar is en mag bij knaagdieren normaliter niet meer dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht bedragen (31). Variaties in het testvolume moeten tot een 
minimum worden beperkt door de concentratie zodanig aan te passen dat bij 
alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Een uit ­
zondering vormen mogelijk bijtende of irriterende stoffen, die moeten wor ­
den verdund om ernstige lokale effecten te vermijden. Tests bij concentraties 
die waarschijnlijk een bijtende of irriterende werking hebben op het 
maag-darmkanaal, moeten worden vermeden.
 
Duur van het onderzoek  
32. De duur van het onderzoek bedraagt normaliter 24 maanden bij knaagdieren, 
hetgeen overeenkomt met het grootste deel van de normale levensduur van de gebruikte dieren. Afhankelijk van de levensduur van de bij het onderzoek 
gebruikte stam van de diersoort kan een langere of kortere onderzoeksduur 
worden gehanteerd, maar deze moet wel worden verantwoord. Voor be ­
paalde muizenstammen, bv. AKR/J, C3H/J of C57BL/6J, kan een duur van 18 maanden geschikter zijn. Hier volgen enkele aanwijzingen met be ­
trekking tot de duur, de beëindiging van het onderzoek en de overleving; 
nadere aanwijzingen, onder meer over de aanvaardbaarheid van negatieve carcinogeniteit ten opzichte van de overleving in het onderzoek, zijn te 
vinden in OESO-leidraad nr. 116 betreffende het opzetten en uitvoeren 
van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit (7):
 
— beëindiging van het onderzoek moet worden overwogen wanneer het 
aantal overlevenden in de groepen met lagere doses of de controlegroep 
onder de 25 % daalt;  
— als alleen dieren in de groep met de hoogste dosis voortijdig sterven als 
gevolg van toxiciteit, hoeft dit niet tot beëindiging van het onderzoek te 
leiden;  
— de overleving moet voor elk geslacht afzonderlijk worden beschouwd;  
— het onderzoek mag niet dusdanig worden verlengd dat gegevens die uit 
het onderzoek zijn verkregen niet meer voldoende zijn voor een statis ­
tisch geldige evaluatie.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
WAARNEMINGEN  
33. Alle dieren moeten worden onderzocht op tekenen van ziekte of sterfte, 
gewoonlijk aan het begin en eind van elke dag, ook tijdens de weekends en op feestdagen. Daarnaast moeten de dieren eenmaal per dag worden 
onderzocht op specifieke tekenen van toxicologische relevantie, waarbij in 
het geval van toediening via een maagsonde rekening moet worden gehou ­
den met de piekperiode van de verwachte effecten na toediening. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan zich ontwikkelende tumoren; van elke 
met het blote oog zichtbare of voelbare tumor moeten het tijdstip waarop 
deze voor het eerst is opgetreden, de plaats, de afmetingen, het uiterlijk en het verloop worden opgetekend.
 
Lichaamsgewicht. voedsel-/waterverbruik en voedselefficiëntie  
34. Bij het begin van de behandeling moeten alle dieren de eerste 13 weken ten 
minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer 
per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Als de teststof met het drinkwater wordt 
toegediend, moet het waterverbruik de eerste 13 weken ten minste één keer 
per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Meting van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drinkactiviteit verandert.
 
Hematologische, klinisch-biochemische en andere metingen  
35. Om te zorgen dat het onderzoek zo veel mogelijk informatie oplevert, met 
name voor het beoordelen van de werkingswijze, kunnen bloedmonsters 
worden genomen voor hematologie en klinisch-biochemische bepalingen indien de onderzoeksleider dit noodzakelijk acht. Ook urineonderzoek kan passend zijn. Nadere aanwijzingen over de waarde van dergelijke monsters 
in het kader van carcinogeniteitsonderzoek zijn te vinden in leidraad nr. 116 
(7). Zo nodig kunnen bij de dieren die tussentijds worden gedood (punt 20), alsook bij beëindiging van het onderzoek op ten minste 10 dieren per geslacht per groep, bloedmonsters met het oog op hematologische en 
klinisch-chemische analyse worden genomen en urineonderzoek worden ver ­
richt. Genoteerd wordt uit welk lichaamsdeel de bloedmonsters worden genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving; deze worden in voorkomend geval 
onder passende omstandigheden bewaard. Er kunnen ook bloedpreparaten 
worden voorbereid voor onderzoek, met name als het beenmerg lijkt te zijn aangetast, hoewel er wordt getwijfeld aan de waarde die een dergelijk onderzoek heeft voor het beoordelen van het carcinogeen/oncogeen 
potentieel (32).
 
PATHOLOGIE  
Macroscopische obductie  
36. Bij alle dieren in het onderzoek, behalve verklikkerdieren (zie punt 20) en 
andere dieren in satellietgroepen, moet een volledige macroscopische obduc ­
tie worden verricht, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het lichaams ­
oppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud ervan. De onderzoeksleider moet van geval tot 
geval beoordelen of obductie van verklikkerdieren en andere dieren in de 
satellietgroepen noodzakelijk is. Het gewicht van de organen maakt normaal gesproken geen deel uit van een carcinogeniteitsonderzoek, aangezien geri ­
atrische veranderingen en, in latere stadia, zich ontwikkelende tumoren de 
bruikbaarheid van gegevens over de orgaangewichten verstoren. Deze gege ­
vens kunnen echter van groot belang zijn voor het bepalen van de bewijs ­
kracht en in het bijzonder voor het beoordelen van de werkingswijze. Ge ­
gevens over het orgaangewicht van dieren die deel uitmaken van een satel ­
lietonderzoek dienen uiterlijk één jaar nadat het onderzoek is aangevat te 
worden verzameld.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische 
onderzoek (33) geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief): 
elk macroscopisch waar ­
neembaar letsel hart alvleesklier maag (voormaag, kliermaag) 
bijnier ileum bijschildklier [tanden] 
aorta jejunum perifere zenuw testis hersenen (inclusief coupes 
van cerebrum, cerebellum 
en medulla/pons) nier hypofyse thymus 
blindedarm traanklier (extraorbitaal) prostaat schildklier 
cervix lever rectum [tong] coagulans afscheidende 
klier long speekselklier luchtpijp 
colon lymfeklieren (zowel op ­
pervlakkig als dieper ge ­
legen) zaadblaasje urineblaas 
duodenum borstklier (verplicht bij 
vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien zichtbaar ontleedbaar) skeletspier uterus (inclusief cervix) 
epididymis [bovenste luchtwegen, 
inclusief neus, neus ­
schelpen en paranasale sinussen] huid [ureter] 
oog (inclusief netvlies) slokdarm ruggenmerg (drie ni ­
veaus: cervicaal, medi ­
othoracaal en lumbaal) [urinebuis] 
[dijbeen met gewricht] [reukkolf] milt vagina 
galblaas (bij andere dier ­
soorten dan ratten) ovarium [borstbeen] coupe van het beenmerg en/ 
of vers beenmergaspiraat 
klier van Harder
 
Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide 
worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze be ­
schadigd kunnen worden, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij 
de dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en moeten specifieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen 
en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die 
moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbeve ­
lingen in de hoofdstukken B.8 en B.29 van deze bijlage. In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van 
de luchtwegen) moeten de organen worden onderzocht die voor de orale 
toedieningsweg zijn vastgesteld.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopathologie  
38. Er zijn richtsnoeren beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering 
van toxicologisch pathologisch onderzoek (33). Ten minste de volgende weefsel moeten worden onderzocht:
 
— alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;  
— alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden 
gedood;  
— alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen, met inbegrip 
van tumoren;  
— bij waarneming van met de behandeling samenhangende histopathologi ­
sche veranderingen bij dieren in de hogedosisgroep, dezelfde weefsels 
van alle dieren in alle andere dosisgroepen;  
— alle organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten 
beide worden onderzocht.  
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
39. Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt over alle geëvalueerde pa ­
rameters. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om redenen 
van dierenwelzijn moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij 
de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijn ­
selen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnse ­
len, met inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxi ­
sche effecten, het aantal dieren met letsel, de aard van het letsel en het 
percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. De gemiddelden en standaarddeviaties (voor continue testgegevens) van de dieren waarbij toxi ­
sche effecten of letsels voorkomen, worden in tabelvorm samengevat, in 
aanvulling op de inschaling van de letsels.
 
40. Bij de interpretatie van de onderzoeksresultaten kunnen controlegegevens uit 
het verleden nuttig zijn, bv. wanneer er aanwijzingen zijn dat de gegevens 
van de parallelle controlegroepen aanzienlijk afwijken van de recente gege ­
vens van de controledieren in dezelfde testfaciliteit/kolonie. Controlegege ­
vens uit het verleden die ter evaluatie worden aangeboden, moeten afkom ­
stig zijn uit hetzelfde laboratorium, verband houden met dieren van dezelfde 
leeftijd en stam, en zijn gegenereerd gedurende de vijf jaar die zijn voor ­
afgegaan aan het onderzoek in kwestie.  
41. Voor zover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met behulp 
van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëva ­
lueerd. De statistische methoden en de te analyseren gegevens moeten tij ­
dens het opzetten van het onderzoek worden gekozen (zie punt 9). Bij de 
selectie moet zo nodig worden gecorrigeerd voor overleving.  
Testverslag  
42. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;  
— identificatiegegevens;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— herkomst van de stof;  
— partijnummer;  
— certificaat van chemische analyse.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium (wanneer dat geen water is);  
Proefdieren:  
— gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren bij aanvang van de test;  
— herkomst, huisvesting, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de test.  
Testomstandigheden:  
— motivering voor de gekozen toedieningsweg en de keuze van de dosis;  
— toegepaste statistische methoden voor analyse van de gegevens, indien 
van toepassing;  
— bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de 
samenstelling van het voer;  
— analytische gegevens over de bereikte concentratie, stabiliteit en homo ­
geniteit van het preparaat;  
— de toedieningsweg en bijzonderheden over de toediening van de teststof;  
— bij inhalatieonderzoek, alleen via de neus of via het hele lichaam;  
— werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en conversiefactor van de 
teststofconcentratie (mg/kg of ppm) in het voedsel/drinkwater naar de werkelijke dosis, voor zover van toepassing;
 
— gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater.  
Resultaten (er moeten samengevatte gegevens in tabelvorm en gegevens 
voor elk dier apart worden verstrekt)  
Algemeen:  
— overlevingsgegevens;  
— lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht;  
— voedselverbruik, voedselefficiëntie, indien berekend, en waterverbruik, 
indien van toepassing;  
— toxicokinetische gegevens (indien beschikbaar);  
— oftalmoscopie (indien beschikbaar);  
— hematologie (indien beschikbaar);  
— klinische chemie (indien beschikbaar).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Klinische bevindingen:  
— tekenen van toxiciteit;  
— incidentie (en indien beoordeeld, ernst) van eventuele abnormaliteiten;  
— aard, ernst en duur van de klinische waarnemingen (van voorbijgaande 
aard dan wel blijvend).  
Obductiegegevens:  
— lichaamsgewicht aan het eind van het onderzoek;  
— orgaangewichten en verhoudingen ervan, indien van toepassing;  
— obductiebevindingen; incidentie en ernst van abnormaliteiten.  
Histopathologie:  
— niet-neoplastische histopathologische bevindingen;  
— neoplastische histopathologische bevindingen;  
— correlatie van macroscopische en microscopische bevindingen;  
— gedetailleerde beschrijving van alle met de behandeling samenhangende 
histopathologische bevindingen, met inbegrip van een inschaling van de 
ernst;  
— een verslag van eventuele intercollegiale toetsing van objectglaasjes.  
Statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing  
Bespreking van de resultaten, waaronder:  
— bespreking van eventuele modelleringsbenaderingen;  
— dosis-responsverhoudingen;  
— controlegegevens uit het verleden;  
— beoordeling van eventuele informatie over de werkingswijze;  
— bepaling van BMD, NOAEL of LOAEL;  
— relevantie voor de mens.  
Conclusies  
LITERATUUR:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.  
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Pro ­
gramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Subchronische orale toxiciteitstest: toxi ­
citeitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde 
toediening (90 dagen).  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment nr. 116, beschikbaar op de openbare website voor onderzoeksrichtlijnen van de 
OESO op www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
(9) Hoofdstuk B.8 van deze bijlage, Subacute inhalatietoxiciteit: onderzoek van 
28 dagen.  
(10) Hoofdstuk B.29 van deze bijlage, Subchronische inhalatietoxiciteit: onder ­
zoek van 90 dagen.  
(11) Hoofdstuk B.9 van deze bijlage, Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toedie ­
ning (28 dagen).  
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 
793-801.  
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.  
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE 
(2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemi ­
cal Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Cri ­
tical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69-98.  
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Con ­
ference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
 
(27) Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 
22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor weten ­
schappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, DC, US Dept. of Health 
and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255- 
04-2.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
(32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIE  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  GECOMBINEERD ONDERZOEK NAAR CHRONISCHE 
TOXICITEIT EN CARCINOGENITEIT  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 453 (2009) van de OESO 
(TG 453). De oorspronkelijke TG 453 werd in 1981 vastgesteld. De actua ­
lisering van testmethode B.33 werd noodzakelijk geacht in het licht van recente ontwikkelingen op het gebied van dierenwelzijn en wettelijke voor ­
schriften (1)(2)(3)(4)(5). De actualisering van deze testmethode B.33 is 
gelijktijdig uitgevoerd met de herziening van hoofdstuk B.32 van deze bij ­
lage, Carcinogeniteitsonderzoek, en hoofdstuk B.30 van deze bijlage, Onder ­
zoek naar chronische toxiciteit, en had tot doel aanvullende informatie te verkrijgen met behulp van de bij het onderzoek gebruikte dieren en nadere 
bijzonderheden over de keuze van de dosis te verschaffen. Deze testmethode 
is bedoeld voor gebruik bij het testen van een breed scala van stoffen, waaronder bestrijdingsmiddelen en industriële chemische stoffen. Hierbij zij evenwel opgemerkt dat bepaalde details en voorschriften voor genees ­
middelen kunnen verschillen (zie Guidance S1B on Testing for Carcinoge ­
nicity of Pharmaceuticals van de Internationale Conferentie voor harmonisatie (ICH)).
 
2. Het meeste onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit wordt 
uitgevoerd bij knaagdiersoorten en deze testmethode is daarom voornamelijk bedoeld voor onderzoek dat bij deze soorten wordt verricht. Als dergelijk onderzoek ook bij andere diersoorten dan knaagdieren moet worden uitge ­
voerd, kunnen de beschreven principes en procedures, met de nodige aan ­
passingen, ook samen met die in hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Toxici ­
teitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toe ­
diening (90 dagen) (6), worden toegepast, zoals bedoeld in OESO-leidraad 
nr. 116 over het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische 
toxiciteit en carcinogeniteit (7).
 
3. De drie belangrijkste toedieningswegen bij onderzoek naar chronische toxi ­
citeit en carcinogeniteit zijn de orale, de dermale en de inhalatieweg. De keuze van de toedieningsweg is afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de teststof en de voornaamste blootstellingsroute bij de 
mens. Nadere informatie over de keuze van de blootstellingsroute wordt 
verschaft in leidraad nr. 116 (7).
 
4. Deze testmethode spitst zich toe op blootstelling via de orale weg, de meest 
gebruikte route bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit. 
Hoewel langetermijnonderzoek met blootstelling via de dermale of de inha ­
latieweg ook noodzakelijk kan zijn om de risico’s voor de menselijke ge ­
zondheid te beoordelen, en/of vereist kan zijn op grond van bepaalde regel ­
gevingskaders, zijn beide blootstellingsroutes technisch bijzonder complex. 
Dergelijk onderzoek dient per geval te worden opgezet, hoewel de hier beschreven testmethode voor het beoordelen en evalueren van chronische toxiciteit en carcinogeniteit bij orale toediening kan worden gebruikt als 
basis voor een protocol voor dermaal en inhalatieonderzoek, rekening hou ­
dend met aanbevelingen ten aanzien van de behandelingsperiode, klinische en pathologische parameters enz. Er zijn OESO-richtsnoeren beschikbaar voor de toediening van teststoffen via de inhalatieweg (7)(8) en de dermale 
weg (7). Bij het opzetten van langetermijnonderzoek naar blootstelling via 
de inhalatieweg moet met name aandacht worden geschonken aan hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (10), samen met de OESO-leidraad voor acuut inhalatieonderzoek 
(8). In geval van tests die via de dermale weg worden uitgevoerd, dient 
hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11) te worden geraadpleegd.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit levert 
informatie op over de mogelijke gevaren voor de gezondheid die kunnen 
voortvloeien uit herhaalde blootstelling gedurende een periode die kan op ­
lopen tot de gehele levensduur van de gebruikte diersoort. Het onderzoek zal informatie opleveren over de toxische effecten van de teststof, met inbegrip 
van potentiële carcinogeniteit, de doelorganen aanwijzen en de mogelijkheid 
van accumulatie aangeven. Daarnaast kan er een inschatting worden ge ­
maakt van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld bij toxische effecten en, in het geval van niet-genotoxische carcinogene agentia, 
bij tumorreacties. Aan de hand van deze inschatting kunnen vervolgens 
veiligheidscriteria voor de blootstelling van de mens worden vastgesteld. Bovendien wordt benadrukt dat het van groot belang is de dieren klinisch zorgvuldig te observeren, om zo veel mogelijk informatie te verkrijgen.
 
6. De doelstellingen van het onder deze testmethode vallende onderzoek naar 
chronische toxiciteit en carcinogeniteit omvatten:  
— het vaststellen van de carcinogene eigenschappen van een teststof die 
leiden tot een toengenomen incidentie van gezwellen, een toename van het aandeel kwaadaardige gezwellen of een vermindering van de tijd totdat gezwellen optreden, in vergelijking met parallelle controlegroepen;
 
— het vaststellen van de tijd todat gezwellen optreden;  
— het vaststellen van de chronische toxiciteit van de teststof;  
— het vaststellen van de organen die kunnen worden aangetast door chro ­
nische toxiciteit en carcinogeniteit;  
— het karakteriseren van de dosis-responsverhouding;  
— het vaststellen van een niveau waarbij geen schadelijk effect werd vast ­
gesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) of een uitgangs ­
punt voor het bepalen van een benchmarkdosis (BMD);  
— het extrapoleren van de carcinogene effecten naar lage doses waaraan 
mensen worden blootgesteld;  
— het voorspellen van chronische toxische effecten bij niveaus waaraan 
mensen worden blootgesteld;  
— het verschaffen van gegevens om hypothesen over de werkingswijze 
(2)(7)(12)(13)(14)(15) te toetsen.  
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
7. Bij het beoordelen en evalueren van de potentiële carcinogeniteit en chro ­
nische toxiciteit van een teststof moet het testlaboratorium, alvorens het 
onderzoek uit te voeren, alle beschikbare informatie over de teststof in aanmerking nemen, zodat de opzet van het onderzoek zodanig kan worden afgestemd dat doelmatiger wordt getest op de toxicologische eigenschappen 
en het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. Informatie over en aan ­
dacht voor de werkingswijze van een stof waarvan het vermoeden bestaat dat deze een carcinogene stof is (2)(7)(12)(13)(14)(15), is van groot belang, aangezien de optimale opzet van het onderzoek kan verschillen afhankelijk 
van het antwoord op de vraag of de teststof een stof is waarvan is gebleken 
of vermoed wordt dat deze een genotoxische carcinogene stof is. Raadpleeg leidraad nr. 116 (7) voor nadere aanwijzingen voor het beoordelen van de werkingswijze.
 
8. Bij het opzetten van het onderzoek kan onder meer gebruik worden gemaakt 
van informatie over de identiteit, chemische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo 
uitgevoerde toxiciteitstests, met inbegrip van genotoxiciteitstests; de voor ­
genomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; de beschikbare (Q)SAR-gegevens, gegevens over de mutageniteit/genotoxiciteit en carcinogeniteit, en andere toxicologische gegevens over chemische stof ­
fen met een verwante structuur; de beschikbare toxicokinetische gegevens 
(kinetiek bij zowel eenmalige toediening als herhaalde toediening, indien
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
beschikbaar), en aan ander onderzoek met herhaalde blootstelling ontleende 
gegevens. De chronische toxiciteit/carcinogeniteit mag pas worden bepaald 
nadat eerst toxiciteitsgegevens zijn verkregen van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen. Ook kortdurend onderzoek naar de initiatie/promotie van kanker kan nuttige informatie op ­
leveren. Als onderdeel van de algemene beoordeling van de potentiële 
schadelijke gezondheidseffecten van een bepaalde teststof (16)(17)(18)(19) moet een gefaseerde benadering van de carcinogeniteitstests worden over ­
wogen.
 
9. Voordat met het onderzoek wordt begonnen, moet worden bepaald welke 
statistische methoden gezien de opzet van de proeven en de doelstellingen 
het best geschikt zijn voor de analyse van de uitkomsten. Zo moet onder meer worden overwogen of de statistische gegevens tevens een correctie voor overleving, een analyse van de cumulatieve risico’s op tumoren in 
verhouding tot de duur van overleving, een analyse van de tijd totdat tu ­
moren optreden en een analyse in geval van voortijdige beëindiging van één of meer groepen moeten omvatten. Aanwijzingen voor de juiste statistische 
analysen en belangrijke verwijzingen naar internationaal erkende statistische 
methoden worden gegeven in leidraad nr. 116 (7) en leidraad nr. 35 over de analyse en evaluatie van onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinoge ­
niteit (20).
 
10. Bij het uitvoeren van carcinogeniteitsonderzoek moeten altijd de richtsnoe ­
ren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de 
OESO-leidraad voor het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische symptomen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheids ­
beoordelingen (21), en met name punt 62 ervan. In dat punt wordt verklaard 
dat wanneer een dier bij onderzoek met herhaalde toediening klinische 
symptomen met een voortschrijdend karakter vertoont die leiden tot een verdere verslechtering van de toestand van het dier, op basis van de be ­
schikbare informatie moet worden overwogen of het dier op humane wijze 
moet worden gedood. Hierbij moet tevens worden overwogen hoe de 
waarde van de informatie die kan worden gewonnen door het dier in kwestie te handhaven in het onderzoek zich verhoudt tot de algehele conditie van het 
dier. Als wordt besloten het dier in het onderzoek te handhaven, moet de 
frequentie van de waarnemingen zo nodig worden verhoogd. Het kan ook zijn dat het mogelijk is de pijn of het leed te verlichten door de toediening van de dosis tijdelijk stop te zetten of de testdosis te verminderen, zonder 
dat dit het doel van het onderzoek nadelig beïnvloedt.
 
11. Nadere aanwijzingen en een bespreking van de principes voor de keuze van 
de dosis bij onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7) en twee publicaties van het International Life Sciences Institute (22)(23). Welke strategie voor dosiskeuze uiteindelijk 
wordt toegepast, is afhankelijk van de primaire doelstelling of doelstellingen 
van het onderzoek (punt 6). Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet een evenwicht worden getroffen tussen enerzijds de risicoscreening en an ­
derzijds de karakterisering van de lage-dosisrespons en de wisselwerking 
tussen de twee. Dit is met name relevant voor dit gecombineerde onderzoek 
naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit.
 
12. Er moet worden nagegaan of dit gecombineerde onderzoek naar chronische 
toxiciteit en carcinogeniteit moet worden uitgevoerd in plaats van afzon ­
derlijk onderzoek naar chronische toxiciteit (hoofdstuk B.30 van deze bij ­
lage), respectievelijk naar carcinogeniteit (hoofdstuk B.32 van deze bijlage). Het gecombineerde onderzoek biedt als voordeel dat het minder tijd en kosten vergt en dat er minder gebruik wordt gemaakt van proefdieren dan 
bij twee afzonderlijke studies, zonder dat dit ten koste gaat van de gegevens ­
kwaliteit van de onderzoeksfasen. Bij het uitvoeren van een gecombineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit moet echter zorgvul ­
dig rekening worden gehouden met de principes voor dosiskeuze (punt 11 
en de punten 22 tot en met 26); bovendien kan de uitvoering van afzon ­
derlijke studies verplicht zijn uit hoofde van bepaalde regelgevingskaders. Nadere aanwijzingen voor het opzetten van een zo efficiënt mogelijk ge ­
combineerd onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit, zowel 
wat betreft het aantal gebruikte proefdieren als het stroomlijnen van de 
diverse experimentele procedures, zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. De definities die in de context van deze testmethode worden gebruikt, zijn te 
vinden aan het einde van dit hoofdstuk en in leidraad nr. 116 (7).  
PRINCIPE VAN HET ONDERZOEK  
14. Het onderzoek is opgebouwd uit twee fasen die tegelijkertijd lopen: de ene 
fase heeft betrekking op de chronische toxiciteit en de andere op de carci ­
nogeniteit (zie de punten 34 en 35 voor de duur van de fasen). De teststof wordt normaal gezien toegediend via de orale weg, hoewel ook de inhalatie- 
of de dermale weg geschikt kan zijn. Tijdens de chronische-toxiciteitsfase 
wordt de teststof dagelijks in trapsgewijs stijgende doses aan diverse groe ­
pen proefdieren toegediend. Daarbij wordt één dosis per groep gebruikt, normaal gezien twaalf maanden achter elkaar, hoewel afhankelijk van de 
wettelijke voorschriften een kortere of langere duur kan worden gekozen 
(zie punt 34). De gekozen duur moet voldoende lang zijn zodat de eventuele effecten van cumulatieve toxiciteit tot uiting komen, zonder de storende effecten van geriatrische veranderingen. Het onderzoek kan ook zo worden 
opgezet dat sommige dieren tussentijds worden gedood, bv. na drie en zes 
maanden, en dat met het oog hierop nieuwe groepen proefdieren kunnen worden toegevoegd (zie punt 20). In de carcinogeniteitsfase wordt de test ­
stof dagelijks aan diverse groepen proefdieren toegediend, gedurende een 
groot deel van hun levensduur. Tijdens beide fasen worden de proefdieren 
zorgvuldig op tekenen van toxiciteit en zich ontwikkelend neoplastisch letsel onderzocht. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in 
leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
15. Deze testmethode heeft hoofdzakelijk betrekking op de beoordeling en eva ­
luatie van chronische toxiciteit en carcinogeniteit bij knaagdieren (punt 2). 
Het gebruik van andere diersoorten dan knaagdieren kan worden overwogen als het op grond van de beschikbare gegevens aannemelijk is dat deze relevanter zijn voor het voorspellen van gezondheidseffecten bij de mens. 
De keuze van de soort moet worden verantwoord. De voorkeur wordt ge ­
geven aan ratten, maar er kunnen ook andere knaagdiersoorten worden gebruikt, bv. muizen. Hoewel het gebruik van muizen bij carcinogeniteitstest 
van beperkt nut kan zijn (24)(25)(26), is testen op carcinogeniteit op grond 
van bepaalde vigerende regelgevingsprogramma’s nog steeds vereist, tenzij wordt vastgesteld dat een dergelijk onderzoek vanuit wetenschappelijk oog ­
punt overbodig is. Aan het gebruik van ratten en muizen als experimentele 
modellen wordt de voorkeur gegeven vanwege hun betrekkelijk korte le ­
vensduur, het grootschalige gebruik ervan bij farmacologisch en toxicolo ­
gisch onderzoek, hun gevoeligheid voor tumorinductie en de beschikbaar ­
heid van voldoende gekarakteriseerde stammen. Vanwege deze kenmerken 
is een grote hoeveelheid informatie over hun fysiologie en pathologie be ­
schikbaar. Bij het opzetten en uitvoeren van onderzoek naar chronische toxiciteit of carcinogeniteit bij andere diersoorten dan knaagdieren moeten, zo nodig, de in deze testmethode beschreven principes als uitgangspunt 
worden genomen, in combinatie met de principes in hoofdstuk B.27 van 
deze bijlage, Toxiciteitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen) (6). Nadere informatie over de keuze van de soort en de stam is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
 
16. Er worden jonge gezonde volwassen dieren van gangbare laboratoriums ­
tammen gebruikt. Het gecombineerde onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit moet worden uitgevoerd bij dieren van dezelfde stam en herkomst als die welke zijn gebruikt voor het inleidend toxiciteitsonderzoek 
van kortere duur. Als echter bekend is dat het moeilijk is om met dieren van 
deze stam en herkomst te voldoen aan de algemeen aanvaarde overlevings ­
criteria voor langetermijnonderzoek (zie leidraad nr. 116 (7)), moet worden overwogen een stam met een aanvaardbaar overlevingspercentage voor het 
langetermijnonderzoek te gebruiken. De vrouwtjes mogen nog geen jongen 
hebben gehad en mogen niet drachtig zijn.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Huisvesting en voeding  
17. De dieren kunnen elk apart of in kleine groepjes met hetzelfde geslacht 
worden ondergebracht; aparte hokken moeten alleen worden overwogen als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is (27)(28)(29). De kooien worden 
zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot 
een minimum worden beperkt. De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C (± 3 °C) te zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, 
bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50- 
60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratorium ­
voer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het voer 
moet aan alle behoeften van de geteste soort voldoen en het gehalte aan onzuiverheden in het voer, met inbegrip van maar niet beperkt tot residuen van bestrijdingsmiddelen, persistente organische verontreinigende stoffen, 
fyto-oestrogenen, zware metalen en mycotoxinen, die van invloed kunnen 
zijn op de resultaten van het onderzoek, moet zo laag mogelijk zijn. Van tijd tot tijd moet er analytische informatie over het gehalte aan nutriënten en onzuiverheden in het voer worden samengesteld, ten minste aan het begin 
van het onderzoek en wanneer er veranderingen zijn in de gebruikte partij. 
Deze informatie moet in het eindverslag worden opgenomen. Ook over het bij het onderzoek gebruikte drinkwater moet analytische informatie worden verstrekt. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak 
om voor een afdoende vermenging van de teststof te zorgen en te voldoen 
aan de voedingsbehoeften van de dieren wanneer die teststof via het voer wordt toegediend.
 
Voorbereiding van de dieren  
18. Er worden gezonde dieren gebruikt die gedurende ten minste zeven dagen 
aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en 
waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. Bij knaagdieren moet de toediening van de dosis zo snel mogelijk na het spenen en de acclimatisatie beginnen en bij voorkeur voordat de dieren acht weken oud zijn. De ken ­
merken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst , geslacht, gewicht en 
leeftijd worden vastgelegd. Aan het begin van het onderzoek moeten de gewichtsverschillen tussen de geslachten minimaal zijn en niet meer bedra ­
gen dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van elk geslacht. De dieren 
worden willekeurig in de controle- en behandelingsgroepen ingedeeld. Na 
de willekeurige indeling mogen er binnen de geslachten geen significante verschillen in lichaamsgewicht zijn tussen de groepen. Als er statistisch significante verschillen zijn, moet de willekeurige indeling zo mogelijk op ­
nieuw worden uitgevoerd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer 
worden toegekend in de vorm van een permanent merkteken dat met behulp van een tatoeage, een onder de huid ingebrachte microchip of via een andere geschikte methode wordt aangebracht.
 
PROCEDURE  
Aantal en geslacht van de dieren  
19. Beide geslachten moeten worden gebruikt. Er moet een voldoende groot 
aantal dieren worden gebruikt zodat een grondige biologische en statistische 
evaluatie mogelijk is. Bij knaagdieren moeten alle dosisgroepen (zoals be ­
schreven in punt 22) en parallelle controlegroepen die in de carcinogeniteits ­
fase worden gebruikt daarom ten minste 50 dieren van elk geslacht omvat ­
ten. Afhankelijk van het doel van het onderzoek kan het statistisch onder ­
scheidingsvermogen van de belangrijkste schattingen mogelijk worden ver ­
groot door de dieren ongelijk over de diverse dosisgroepen te verdelen, met meer dan 50 dieren in de lage-dosisgroepen, bv. om potentiële carcinoge ­
niteit bij lage doses te schatten. Er moet echter worden onderkend dat een 
gematigde verhoging van de groepsgrootte relatief weinig zal bijdragen tot
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
het statistisch onderscheidingsvermogen van het onderzoek. Bij knaagdieren 
moeten alle dosisgroepen (zoals beschreven in punt 22) en parallelle con ­
trolegroepen die in de chronische-toxiciteitsfase worden gebruikt, ten minste 10 dieren per geslacht omvatten. Hierbij zij opgemerkt dat dit aantal lager is dan bij het onderzoek naar chronische toxiciteit (hoofdstuk B.30 van deze 
bijlage). Bij de interpretatie van de gegevens over het kleinere aantal dieren 
per groep in de chronische-toxiciteitsfase van dit gecombineerde onderzoek kan echter ook gebruik worden gemaakt van de gegevens over de grotere groep dieren in de carcinogeniteitsfase van het onderzoek. Bij onderzoek 
waarbij muizen zijn betrokken, is het mogelijk dat in de 
chronische-toxiciteitsfase per dosisgroep meer dieren nodig zijn om alle vereiste hematologische bepalingen uit te voeren. Nadere informatie over de statistische opzet van het onderzoek en de keuze van de dosisniveaus 
voor een zo groot mogelijk statistisch onderscheidingsvermogen is te vinden 
in leidraad nr. 116 (7).
 
Dieren tussentijds doden, satellietgroepen en verklikkerdieren  
20. Als onderdeel van het onderzoek kunnen sommige dieren tussentijds worden 
gedood, bv. na zes maanden voor de chronische-toxiciteitsfase, om infor ­
matie te verschaffen over de ontwikkeling van niet-neoplastische verande ­
ringen en mechanistische informatie, indien dat wetenschappelijk gerecht ­
vaardigd is. Als dergelijke informatie al beschikbaar is uit eerder toxiciteits ­
onderzoek met herhaalde toediening van de teststof, is het tussentijds doden 
van dieren mogelijk niet wetenschappelijk gerechtvaardigd. Het tussentijds doden van de dieren die worden gebruikt in de chronische-toxiciteitsfase van 
het onderzoek, die normaal twaalf maanden duurt (zie punt 34), levert 
gegevens voor de carcinogeniciteitsfase van het onderzoek, waardoor het totale aantal gebruikte dieren kan worden verminderd. Ook satellietgroepen kunnen in de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek worden opge ­
nomen om de reversibiliteit van eventuele toxicologische effecten als gevolg 
van de onderzochte teststof te controleren. Hiervoor kan het hoogste dosi ­
sniveau van het onderzoek met controlegroep worden gebruikt. Tijdens het onderzoek kan zo nodig een aanvullende groep verklikkerdieren (doorgaans 
5 dieren per geslacht) worden opgenomen met het oog op de monitoring van 
de ziektestatus (30). Nadere aanwijzingen voor het opzetten van het onder ­
zoek in verband met het tussentijds doden van dieren, satellietgroepen en verklikkerdieren, alsmede het minimaliseren van het aantal gebruikte dieren 
is te vinden in leidraad nr. 116 (7).
 
21. Als de onderzoeksopzet het gebruik van satellietgroepen en/of het tussen ­
tijds doden van dieren omvat, bevat elke opgenomen dosisgroep gewoonlijk 10 dieren per geslacht en moet het totaal aantal dieren in de onderzoeks ­
opzet wordt vermeerderd met het aantal dieren dat tussentijds zal worden 
gedood. Dieren die tussentijds worden gedood en dieren die deel uitmaken 
van satellietgroepen moeten normaal gezien aan dezelfde waarnemingen worden onderworpen, met inbegrip van waarnemingen met betrekking tot het lichaamsgewicht, het voedsel- en waterverbruik, hematologische en 
klinisch-biochemische metingen en pathologisch onderzoek, als de dieren 
in de chronische-toxiciteitsfase van het hoofdonderzoek, hoewel de metin ­
gen (in de groepen met dieren die tussentijds worden gedood) ook kunnen worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of 
immunotoxiciteit.
 
Dosisgroepen en dosering  
22. Aanwijzingen voor alle aspecten van de dosiskeuze en het interval tussen de 
dosisniveaus zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Er moeten ten minste drie 
dosisniveaus en een gelijktijdige controle worden gebruikt, voor zowel de 
chronische-toxiciteitsfase als de carcinogeniteitsfase. De dosisniveaus wor ­
den doorgaans gebaseerd op de resultaten van korter onderzoek met her ­
haalde toediening of van bereikbepalingonderzoek, en er moet rekening 
worden gehouden met bestaande toxicologische en toxicokinetische gege ­
vens die voor de teststof of aanverwante stoffen beschikbaar zijn.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Voor de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek is een volledig onder ­
zoek met drie dosisniveaus mogelijk niet noodzakelijk, als kan worden ver ­
wacht dat een test met een bepaald dosisniveau, dat gelijkwaardig is aan ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag, geen schadelijke effecten zal heb ­
ben. Hierbij moet men zich baseren op informatie die afkomstig is van 
inleidend onderzoek en de overweging dat toxiciteit niet is te verwachten 
op grond van gegevens betreffende stoffen met een verwante structuur. Een limiet van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag kan van toepassing zijn, tenzij het blootstellingsniveau bij de mens duidt op de noodzaak een hoger dosi ­
sniveau te gebruiken.
 
24. Tenzij dit vanwege de fysisch-chemische aard of biologische kenmerken van 
de teststof onmogelijk is, moet de hoogste dosis zodanig worden gekozen dat de voornaamste doelorganen en toxische effecten worden vastgesteld 
zonder dat dit leed, ernstige toxiciteit, ziekteverschijnselen of sterfte ver ­
oorzaakt. Het hoogste dosisniveau moet zodanig worden gekozen dat er tekenen van toxiciteit optreden, die bijvoorbeeld blijken uit een lichte ach ­
teruitgang van de gewichtstoename (ca. 10 %). Afhankelijk van het doel van 
het onderzoek (zie punt 6), kan een hoogste dosis worden gekozen die lager 
is dan de dosis waarbij tekenen van toxiciteit optreden, bv. als een dosis een zorgwekkend schadelijk effect heeft dat niettemin weinig invloed heeft op de levensduur of het lichaamsgewicht.
 
25. De dosisniveaus en het interval tussen de dosisniveaus kunnen zo worden 
gekozen dat een dosisrespons en, afhankelijk van de werkingswijze van de teststof, een NOAEL of ander beoogd resultaat van het onderzoek, bv. een BMD (zie punt 27), worden vastgesteld. Factoren die moeten worden mee ­
gewogen bij de toediening van lagere doses omvatten de verwachte helling 
van de dosis-responscurve, de doses waarbij belangrijke veranderingen in het metabolisme of de toxische werking kunnen optreden, de verwachte locatie van een drempelwaarde of de verwachte locatie van een uitgangspunt 
voor extrapolatie naar lage doses. Bij het uitvoeren van een gecombineerd 
onderzoek naar chronische toxiciteit en carcinogeniteit bestaat het hoofddoel eruit informatie te verkrijgen met het oog op het beoordelen van het carci ­
nogeniteitsrisico, en zal informatie over de chronische toxiciteit normaal 
gezien een secundair doel zijn. Hierbij dient rekening te worden gehouden 
bij de keuze van de doses en het interval tussen de dosisniveaus voor het onderzoek.
 
26. Het gekozen interval tussen de dosisniveaus is afhankelijk van de onder ­
zoeksdoelen en de kenmerken van de teststof en kan in deze testmethode niet gedetailleerd worden voorgeschreven, maar doorgaans leveren twee- tot viervoudige intervallen goede testrestultaten op bij gebruik voor de instelling 
van de afnemende dosisniveaus, en de toevoeging van een vierde testgroep 
is vaak te verkiezen boven het gebruik van zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor van ongeveer 6 à 10) tussen twee doseringen. In het alge ­
meen moet het gebruik van factoren boven de 10 worden vermeden en 
worden verantwoord als deze toch worden gebruikt.
 
27. Zoals nader wordt beschreven in leidraad nr. 116 (7), moet bij de keuze van 
de dosis rekening worden gehouden met het volgende:  
— bekende of vermoedelijke niet-lineariteiten of buigpunten in de dosis ­
respons;  
— toxicokinetiek en dosisbereiken waarbij metabolische inductie, verzadi ­
ging of niet-lineariteit tussen externe en interne doses al dan niet op ­
treden;  
— precursorletsels en merkstoffen die het effect of indicatoren die de wer ­
king van de voornaamste fundamentele biologische processen aangeven;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— de voornaamste (of vermoedelijke) aspecten van de werkingswijze, zoals 
doses waarbij de cytotoxiciteit begint toe te nemen, hormoonniveaus 
verstoord raken, homeostatische mechanismen het onderspit delven enz.;  
— gebieden van de dosis-responscurve die een bijzonder robuuste schatting 
behoeven, bv. op het gebied van de verwachte BMD of een vermoede ­
lijke drempelwaarde;  
— de verwachte blootstellingniveaus bij de mens, met name met betrekking 
tot de keuze van middelhoge en lage doses.  
28. De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof een 
medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van de behan ­
deling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op dezelfde 
wijze worden behandeld als die in de testgroep. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoogste gebruikte mediumdosis van de dosisgroepen toegediend. Indien een teststof wordt toegediend via de 
voeding en deze een geringere voedingsopname veroorzaakt omdat de voe ­
ding daardoor minder appetijtelijk is, kan een paargevoede controlegroep dienen als een meer geschikte controle.
 
Bereiding en toediening van doses van de teststof  
29. De teststof wordt normaal gezien oraal, met de voeding of het drinkwater, of 
via een maagsonde toegediend. Nadere informatie over de toedieningswegen en -methoden is te vinden in leidraad nr. 116 (7). De toedieningsweg en de 
toedieningsmethode zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek, de 
fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de biologische beschik ­
baarheid ervan en de voornaamste blootstellingsroute en -methode bij de mens. De keuze van de toedieningsweg en de toedieningsmethode moet 
worden gemotiveerd. In het belang van het welzijn van de dieren moet de 
orale maagsonde normaal gesproken alleen worden gekozen in geval van agentia waarvoor de gekozen toedieningsweg en -methode redelijk overeen ­
komen met de mogelijke blootstelling van de mens (bv. bij geneesmidde ­
len). Bij in de voeding of het milieu voorkomende chemische stoffen zoals bestrijdingsmiddelen wordt de teststof doorgaans toegediend via de voeding of het drinkwater. In sommige scenario’s, bv. bij beroepsmatige blootstel ­
ling, kan toediening via andere wegen beter geschikt zijn.
 
30. Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspen ­
deerd. Er moet rekening worden gehouden met de navolgende eigenschap ­
pen van het medium en andere additieven, naargelang hetgeen van toepas ­
sing is: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de 
retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de 
teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen; en effecten op het voedsel- of waterverbruik of de voedingsstatus van de dieren. Aan ­
bevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/ 
suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. 
maïsolie) te overwegen en daarna eventueel oplossing in een ander medium. Wanneer een ander medium dan water wordt gebruikt, moeten de toxische 
kenmerken daarvan bekend zijn. Er moet informatie beschikbaar zijn over 
de stabiliteit van de teststof en de homogeniteit van de doseeroplossingen of het voer (naargelang hetgeen van toepassing is) onder de toedieningsomstan ­
digheden (bv. dieet).
 
31. Wanneer stoffen met de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet 
erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren 
met de normale voedings- of waterbalans. Bij langetermijnonderzoek naar toxiciteit waarbij de teststof via het voer wordt toegediend, mag de con ­
centratie van de teststof in de voeding de bovengrens van 5 % van de totale 
hoeveelheid voer normaal gesproken niet overschrijden om onevenwichtig ­
heden in de voeding te vermijden. Indien de teststof met de voeding wordt toegediend, kan een constante voedingsconcentratie (mg/kg voer of ppm) of een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier 
(mg/kg lichaamsgewicht), berekend op weekbasis, worden gebruikt. Aange ­
geven moet worden welk alternatief is gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Bij orale toediening wordt de teststof dagelijks (zeven dagen per week) aan 
de dieren toegediend gedurende 12 maanden (chronische-toxiciteitsfase) of 
24 maanden (carcinogeniteitsfase). Zie in dat verband ook de punten 33 en 34. Gebruik van een ander toedieningsschema, bv. vijf dagen per week, moet worden verantwoord. Bij toediening via de huid worden de dieren 
normaal gesproken ten minste 6 uur per dag, zeven dagen per week met 
de teststof behandeld, zoals wordt beschreven in hoofdstuk B.9 van deze bijlage (11), gedurende 12 maanden (chronische-toxiciteitsfase) of 24 maan ­
den (carcinogeniteitsfase). Blootstelling via inhalatie geschiedt 6 uur per 
dag, zeven dagen per week, maar ook blootstelling gedurende vijf dagen 
is mogelijk, indien dit wordt verantwoord. De blootstellingsduur bedraagt normaal gezien 12 maanden (chronische-toxiciteitsfase) of 24 maanden (car ­
cinogeniteitsfase). Als andere knaagdiersoorten dan ratten uitsluitend via de 
neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellingsduur worden aan ­
gepast om soortspecifieke symptomen van leed te minimaliseren. Gebruik van een blootstellingsduur van minder dan 6 uur per dag moet worden gemotiveerd. Zie ook hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9).
 
33. Indien de teststof via een maagsonde aan de dieren wordt toegediend, moet 
dit iedere dag op hetzelfde tijdstip gebeuren met gebruikmaking van een 
maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Normaliter zal eenmaal per dag één dosis worden toegediend; als een stof lokale irritaties veroorzaakt, kan de dagelijkse doseersnelheid mogelijk worden gehandhaafd door de toe te 
dienen dosis te splitsen (tweemaal per dag). Het maximale volume dat in 
één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume moet zo laag mogelijk worden gehouden als praktisch uitvoer ­
baar is en mag bij knaagdieren normaal gezien niet meer dan 1 ml/100 g 
lichaamsgewicht bedragen (31). Variaties in het testvolume moeten gemini ­
maliseerd worden door het aanpassen van de concentratie zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Een uitzon ­
dering vormen mogelijk bijtende of irriterende stoffen, die moeten worden 
verdund om ernstige lokale effecten te vermijden. Tests bij concentraties die 
waarschijnlijk een bijtende of irriterende werking hebben op het maag-darmkanaal, moeten worden vermeden.
 
Duur van het onderzoek  
34. De toedieningsperiode en de duur van de chronische-toxiciteitsfase van dit 
onderzoek bedraagt normaal gezien 12 maanden, hoewel gegeven de onder ­
zoeksopzet ook een kortere (bv. 6 of 9 maanden) of langere (bv. 18 of 24 
maanden) onderzoeksduur mogelijk is, afhankelijk van de eisen van de regelgeving of met het oog op specifieke mechanistische doeleinden. Af ­
wijkingen van een blootstellingsduur van twaalf maanden moeten worden 
verantwoord, met name als voor een kortere duur wordt gekozen. Alle 
dosisgroepen die in deze fase worden gebruikt, moeten op de aangegeven tijd worden beëindigd met het oog op de evaluatie van chronische toxiciteit en niet-neoplastische pathologie. Satellietgroepen die zijn opgenomen ter 
controle van de reversibiliteit van eventuele toxicologische veranderingen 
als gevolg van de onderzochte teststof moet dosering worden onthouden gedurende niet minder dan vier weken en niet meer dan een derde van de totale onderzoeksduur nadat de blootstelling is gestaakt.
 
35. De duur van de carcinogeniteitsfase van dit onderzoek bedraagt normaal 
gezien 24 maanden bij knaagdieren, hetgeen overeenkomt met het grootste 
deel van de normale levensduur van de gebruikte dieren. Afhankelijk van de levensduur van de bij het onderzoek gebruikte stam van de diersoort kan een langere of kortere onderzoeksduur worden gehanteerd, maar deze moet wel 
worden verantwoord. Voor bepaalde muizenstammen, bv. AKR/J, C3H/J of 
C57BL/6J, kan een duur van 18 maanden beter geschikt zijn. Hier volgen enkele aanwijzingen met betrekking tot de duur, de beëindiging van het onderzoek en de overleving; nadere aanwijzingen, onder meer over het ver ­
band tussen de aanvaardbaarheid van negatief carcinogeniteitsonderzoek en de 
overleving tijdens het onderzoek, zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7):
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— beëindiging van het onderzoek moet worden overwogen wanneer het 
aantal overlevenden in de groepen met lagere doses of de controlegroep 
onder de 25 % daalt;  
— als alleen dieren in de groep met de hoogste dosis voortijdig sterven als 
gevolg van toxiciteit, hoeft dit niet tot beëindiging van het onderzoek te leiden;
 
— als blijkt dat de geslachten qua overleving verschillen, moeten de ge ­
slachten afzonderlijk worden beschouwd;  
— het onderzoek mag niet dusdanig worden verlengd dat gegevens die uit 
het onderzoek zijn verkregen niet meer voldoende zijn voor een statis ­
tisch geldige evaluatie.  
WAARNEMINGEN (CHRONISCHE-TOXICITEITSFASE)  
36. Alle dieren moeten worden onderzocht op ziekelijkheid of sterfte, gewoon ­
lijk aan het begin en einde van elke dag, ook tijdens de weekends en de 
feestdagen. De proefdieren moeten ten minste eenmaal per dag worden 
geobserveerd, bij voorkeur op hetzelfde tijdstip, waarbij rekening moet worden gehouden met de piekperiode van verwachte effecten na toediening van de dosis via een maagsonde.
 
37. Alle dieren moeten ten minste eenmaal voor de eerste blootstelling aan een 
uitgebreid klinisch onderzoek worden onderworpen (om intra-individuele 
vergelijking mogelijk te maken), aan het einde van de eerste week van het onderzoek en vervolgens elke maand. Het waarnemingsprotocol moet zodanig worden opgezet dat verschillen tussen individuele waarnemers wor ­
den geminimaliseerd en onafhankelijk zijn van de testgroep. De dieren 
moeten buiten hun kooi worden geobserveerd, bij voorkeur telkens in een standaardgebied en op hetzelfde tijdstip. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door 
het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet worden getracht 
verschillen in de observatiecondities tot een minimum te beperken. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en 
onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, ver ­
andering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag 
(bv. overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar ge ­
drag (bv. zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (32).
 
38. Vóór de eerste toediening van de teststof wordt bij alle dieren een oftalmo ­
logisch onderzoek uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van een of ­
talmoscoop of een ander geschikt apparaat. Bij beëindiging van het onder ­
zoek wordt dit oftalmologisch onderzoek bij alle dieren verricht, maar ten minste bij die in de hogedosisgroep en in de controlegroep. Als met de behandeling samenhangende veranderingen in de ogen worden geconsta ­
teerd, moeten alle dieren worden onderzocht. Als de structurele analyse of 
andere informatie wijst op oculaire toxiciteit, moet de frequentie van het oogonderzoek worden verhoogd.
 
39. Voordat met het onderzoek wordt begonnen en met tussenpozen van drie 
maanden tot ten hoogste twaalf maanden na aanvang van het onderzoek, 
alsmede bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf 
maanden) kunnen, in geval van chemische stoffen waarvoor uit eerdere toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat deze kunnen leiden tot neurotoxische effecten, 
facultatief onderzoeken van de sensorische reacties op verschillende soorten 
stimuli (32) (bv. van auditieve, visuele en proprioceptieve aard) (33)(34)(35), alsmede een bepaling van de grijpkracht (36) en de motorische activiteit (37) worden verricht. Meer informatie over de procedures die 
kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er 
kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. In geval van chemische stoffen waarvoor uit eerder toxiciteitsonderzoek met 
herhaalde toediening gedurende 28 dagen en/of 90 dagen is gebleken dat 
deze kunnen leiden tot immunotoxische effecten, kan facultatief nader on ­
derzoek van dit eindpunt worden verricht bij beëindiging van het onderzoek.  
Lichaamsgewicht. voedsel-/waterverbruik en voedselefficiëntie  
41. Aan het begin van het onderzoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten 
minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer 
per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de 
eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand. Het waterverbruik moet de eerste 13 weken 
ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer 
per maand als de teststof met het drinkwater wordt toegediend. Het meten van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij de drinkactiviteit verandert.
 
Hematologie en klinisch-biochemische bepalingen  
42. Bij onderzoek waarbij knaagdieren zijn betrokken, wordt na drie, zes en 
twaalf maanden, alsook bij beëindiging van het onderzoek (als dit langer duurt dan twaalf maanden) hematologisch onderzoek verricht op alle proef ­
dieren (tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep). Bij muizen moeten 
mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste hema ­
tologische bepalingen te verrichten (zie punt 19). Bij onderzoek met andere soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal dieren (bv. 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op 
tussentijdse bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, 
zoals beschreven voor knaagdieren. Er hoeven bij knaagdieren of andere soorten dan knaagdieren na drie maanden geen metingen te worden verricht als er geen effect is opgetreden op de hematologische parameters in een 
eerder onderzoek van 90 dagen met vergelijkbare dosisniveaus. Er moeten 
bloedmonsters worden genomen en daarbij dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving.
 
43. De volgende parameters worden onderzocht (38): totale en gedifferentieerde 
telling van de leukocyten, telling van de erytrocyten, telling van de bloed ­
plaatjes, hemoglobinegehalte, hematocriet, gemiddeld volume van de erytro ­
cyten (Mean Corpuscular Volume, MCV), hemoglobinegehalte per erytrocyt 
(Mean Corpuscular Haemoglobin, MCH), hemoglobinegehalte per volume-eenheid erytrocyten (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentra ­
tion, MCHC), prothrombinetijd en geactiveerde partiële thromboplastinetijd. 
Afhankelijk van de toxiciteit van de teststof kunnen ook andere hematolo ­
gische parameters worden gemeten, zoals de Heinz-lichaampjes of andere morfologische afwijkingen van de erytrocyten of methemoglobine. In het algemeen moet een flexibele aanpak worden gehanteerd, afhankelijk van het 
waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde teststof. Als de test ­
stof een effect heeft op het hematopoëtisch systeem, moeten mogelijk ook reticulocytentellingen en beenmergcytologie worden getest, hoewel deze niet routinematig hoeven te worden onderzocht.
 
44. Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke toxische 
effecten in weefsels en met name effecten op de nieren en lever te onder ­
zoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die van elk dier worden 
genomen (tien mannetjes en tien vrouwtjes per groep), met dezelfde inter ­
vallen als wordt aangegeven voor hematologisch onderzoek. Bij muizen moeten mogelijk dieren in satellietgroepen worden gebruikt om alle vereiste klinisch-biochemische bepalingen te verrichten. Bij onderzoek met andere 
soorten dan knaagdieren worden monsters genomen bij een kleiner aantal 
dieren (bv. 4 dieren per geslacht en per groep bij onderzoek bij honden), op tussentijdse bemonsteringstijdstippen en bij beëindiging van het onderzoek, zoals beschreven voor knaagdieren. Er hoeven na drie maanden geen me ­
tingen te worden verricht, noch bij knaagdieren noch bij andere diersoorten, 
als er in een eerder onderzoek van 90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
geen effect op klinisch-biochemische parameters is geconstateerd. Het ver ­
dient aanbeveling om de dieren (met uitzondering van muizen) vóór de 
bloedafname een nacht te laten vasten (  1 ). De volgende parameters worden 
onderzocht (38): glucose, ureum (ureumstikstof), creatinine, totaal eiwit, albumine, calcium, natrium, kalium, totaal cholesterol, ten minste twee tests 
voor een hepatocellulaire evaluatie (alanineaminotransferase, aspartaatami ­
notransferase, glutamaatdehydrogenase, totaal galzuren) (39), en ten minste twee tests voor hepatobiliaire evaluatie (alkalische fosfatase, gamma-glutamyltransferase, 5’-nucleotidase, totaal bilirubine, totaal galzu ­
ren) (39). Naargelang hetgeen van toepassing is, kunnen andere 
klinisch-chemische parameters als triglyceriden bij nuchtere toestand, speci ­
fieke hormonen en cholinesterase worden gemeten, afhankelijk van de toxi ­
citeit van de teststof. In het algemeen is een flexibele aanpak nodig, afhan ­
kelijk van het waargenomen en/of verwachte effect van een bepaalde stof.
 
45. Bij alle proefdieren (tien mannetjes en 10 vrouwtjes per groep) moet de 
urine worden geanalyseerd, waarbij op dezelfde regelmatige tijdstippen uri ­
nemonsters moeten worden genomen als bij de hematologische en klinisch-chemische monsters. Metingen na drie maanden hoeven niet te 
worden verricht als bij het urineonderzoek in een eerder onderzoek van 
90 dagen bij vergelijkbare dosisniveaus geen effect is geconstateerd. De volgende lijst van parameters is afkomstig uit een deskundige aanbeveling inzake klinisch-pathologisch onderzoek (38): uitzien, volume, osmolaliteit of 
soortelijk gewicht, pH, totaal eiwit, en glucose. Andere bepalingen omvatten 
keton, urobilinogeen, bilirubine en occult bloed. Indien nodig kunnen hier ­
aan nog andere parameters worden toegevoegd om het onderzoek van het(de) waargenomen effect(en) verder uit te breiden.
 
46. Er wordt in het algemeen van uitgegaan dat in geval van onderzoek bij 
honden basisgegevens voor hematologische en klinisch-biochemische varia ­
belen dienen te worden bepaald vóór aanvang van de behandeling, maar dat dit voor onderzoek bij knaagdieren niet nodig is (38). Als de basisgegevens uit het verleden (zie punt 58) ontoereikend zijn, moet worden overwogen 
om dergelijke gegevens alsnog te genereren.
 
PATHOLOGIE  
Macroscopische obductie  
47. Bij alle dieren in het onderzoek moet normaal gesproken een volledige 
macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig on ­
derzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedel ­
holte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Het is echter 
mogelijk dat (bij de groepen met dieren die tussentijds moeten worden gedood of in de satellietgroepen) de metingen moeten worden beperkt tot specifieke, belangrijke parameters als neurotoxiciteit of immunotoxiciteit 
(zie punt 21). Bij deze dieren hoeft geen obductie te worden uitgevoerd 
en kunnen ook de in de volgende punten beschreven vervolgprocedures achterwege blijven. De onderzoeksleider bepaalt van geval tot geval of obductie op de verklikkerdieren noodzakelijk is.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Voor een aantal metingen van serum en plasma, met name voor glucose, verdient het 
aanbeveling om de dieren een nacht te laten vasten. De voornaamste reden is dat de 
toegenomen variabiliteit die onvermijdelijk het gevolg is van niet-vasten, subtiele effec ­
ten maskeert en de interpretatie bemoeilijkt. Daarbij moet echter worden opgemerkt dat 
een nacht vasten van invloed kan zijn op het algemene metabolisme van de dieren en dat 
dit in het bijzonder bij voedingsonderzoek de dagelijkse blootstelling aan de teststof kan 
verstoren. Alle beoordeelde dieren moeten in dezelfde fysiologische toestand verkeren en 
daarom moeten gedetailleerde of neurologische beoordelingen bij voorkeur worden ge ­
pland op een andere dag dan die waarop klinische biochemische monsters worden ge ­
nomen.
 48. Voor alle dieren, behalve die welke op grond van het tweede deel van punt 
47 worden uitgesloten, moeten de orgaangewichten worden bepaald. De 
bijnieren, de hersenen, de epididymides, het hart, de nieren, de lever, de ovaria, de milt, de testes, de schildklier (gewogen na fixatie, inclusief bij ­
schildklieren) en de uterus van alle dieren (afgezien van stervende en/of 
tussentijds gedode dieren) moeten worden ontdaan van aanhechtend weefsel, 
naargelang hetgeen van toepassing is, en moeten zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
 
49. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische 
onderzoek (40) het meest geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn 
facultatief): 
elk macroscopisch waar ­
neembaar letsel hart alvleesklier maag (voormaag, kliermaag) 
bijnier ileum bijschildklier [tanden] 
aorta jejunum perifere zenuw testis hersenen (inclusief coupes 
van cerebrum, cerebellum 
en medulla/pons) nier hypofyse thymus 
blindedarm traanklier (extraorbitaal) prostaat schildklier 
cervix lever rectum [tong] coagulans afscheidende 
klier long speekselklier luchtpijp 
colon lymfeklieren (zowel op ­
pervlakkig als dieper ge ­
legen) zaadblaasje urineblaas 
duodenum borstklier (verplicht bij 
vrouwtjes en facultatief bij mannetjes, indien 
zichtbaar ontleedbaar) skeletspier uterus (inclusief cervix) 
epididymis [bovenste luchtwegen, 
inclusief neus, neus ­
schelpen en paranasale sinussen] huid [ureter] 
oog (inclusief netvlies) slokdarm ruggenmerg (drie ni ­
veaus: cervicaal, medi ­
othoracaal en lumbaal) [urinebuis] 
[dijbeen met gewricht] [reukkolf] milt vagina 
galblaas (bij andere dier ­
soorten dan ratten) ovarium [borstbeen] coupe van het beenmerg en/ 
of vers beenmergaspiraat 
klier van Harder
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide 
worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak 
blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze kun ­
nen worden aangetast, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de 
dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden onder ­
zocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en moeten speci ­
fieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die 
moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbeve ­
lingen in hoofdstuk B.8 van deze bijlage (9) en hoofdstuk B.29 van deze bijlage (10). In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) moeten de organen worden 
onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld.
 
Histopathologie  
50. Er zijn aanwijzingen beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering 
van toxicologisch pathologisch onderzoek (40). Ten minste het volgende 
histopathologische onderzoek dient te worden verricht:  
— alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;  
— alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden 
gedood;  
— alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen;  
— doelweefsels of weefsels die met de behandeling samenhangende ver ­
anderingen vertonen in de hogedosisgroep en van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
 
— organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten 
beide worden onderzocht.  
WAARNEMINGEN (CARCINOGENITEITSFASE)  
51. Alle dieren moeten worden onderzocht op tekenen van ziekelijkheid of 
sterfte, gewoonlijk aan het begin en einde van elke dag, ook tijdens de weekends en op feestdagen. Daarnaast moeten de dieren eenmaal per dag 
worden onderzocht op specifieke tekenen van toxicologische relevantie. Bij 
maagsondeonderzoek moeten de dieren worden onderzocht in de periode die onmiddellijk volgt op de toediening van de dosis. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan zich ontwikkelende tumoren; van elke met het blote oog 
zichtbare of voelbare tumor moeten het tijdstip waarop deze voor het eerst is 
opgetreden, de plaats, de afmetingen, het uiterlijk en het verloop worden opgetekend.
 
52. Aan het begin van het onderzoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten 
minste één keer per week worden gewogen en daarna ten minste één keer per maand. Ook het voedselverbruik en de voedselefficiëntie moeten de 
eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna 
ten minste één keer per maand. Het waterverbruik moet de eerste 13 weken ten minste één keer per week worden gemeten en daarna ten minste één keer per maand als de teststof met het drinkwater wordt toegediend. Het meten 
van het waterverbruik moet ook worden overwogen bij onderzoek waarbij 
de drinkactiviteit verandert.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologische, klinisch-biochemische en andere metingen  
53. Om de hoeveelheid uit het onderzoek verkregen informatie te maximalise ­
ren, met name voor het beoordelen van de werkingswijze, kunnen bloed ­
monsters worden genomen voor hematologie en klinisch-biochemische be ­
palingen, indien de onderzoeksleider dit noodzakelijk acht. Ook urineonder ­
zoek kan aangewezen zijn. De gegevens over de dieren die zijn gebruikt in de chronische-toxiciteitsfase van het onderzoek, die doorgaans twaalf maan ­
den duurt (zie punt 34), zullen informatie over deze parameters verschaffen. 
Nadere aanwijzingen over de waarde van dergelijke monsters in het kader 
van carcinogeniteitsonderzoek zijn te vinden in leidraad nr. 116 (7). Als bloedmonsters worden genomen, moeten deze aan het einde van de test ­
periode worden genomen, net vóór of tijdens het doden van de dieren. 
Daarbij dient te worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen, bijvoorbeeld door middel van een hartpunctie of uit de retro-orbitale sinus, onder verdoving. Er kunnen ook bloedpreparaten wor ­
den voorbereid voor onderzoek, met name als het beenmerg lijkt te zijn 
aangetast, hoewel er wordt getwijfeld aan de waarde die een dergelijk onder ­
zoek in de carcinogeniteitsfase heeft voor het beoordelen van het carcino ­
geen/oncogeen potentieel (38).
 
PATHOLOGIE  
Macroscopische obductie  
54. Bij alle dieren in het onderzoek, behalve verklikkerdieren en andere dieren 
in satellietgroepen (zie punt 20), moet een volledige macroscopische obduc ­
tie worden verricht, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidopper ­
vlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de 
buikholte, en de inhoud daarvan. De onderzoeksleider moet van geval tot geval beoordelen of obductie van verklikkerdieren en andere dieren in de satellietgroepen noodzakelijk is. Het gewicht van de organen maakt normaal 
gesproken geen deel uit van carcinogeniteitsonderzoek, aangezien geriatri ­
sche veranderingen en, in latere stadia, zich ontwikkelende tumoren de bruikbaarheid van gegevens over de orgaangewichten verstoren. Deze gege ­
vens kunnen echter van groot belang zijn voor het bepalen van de bewijs ­
kracht van deze gegevens en voor het beoordelen van de werkingswijze. Gegevens over het orgaangewicht van dieren die deel uitmaken van een satellietonderzoek dienen uiterlijk één jaar nadat het onderzoek is aangevat 
te worden verzameld.
 
55. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat 
zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek (40) geschikt is (de weefsels tussen rechte haken zijn facultatief): 
elk macroscopisch waar ­
neembaar letsel hart alvleesklier maag (voormaag, kliermaag) 
bijnier ileum bijschildklier [tanden] 
aorta jejunum perifere zenuw testis hersenen (inclusief coupes 
van cerebrum, cerebellum en medulla/pons) nier hypofyse thymus 
blindedarm traanklier (extraorbitaal) prostaat schildklier 
cervix lever rectum [tong] coagulans afscheidende kli ­
er long speekselklier luchtpijp 
colon lymfeklieren (zowel op ­
pervlakkig als dieper ge ­
legen) zaadblaasje urineblaas
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
duodenum borstklier (verplicht bij 
vrouwtjes en facultatief 
bij mannetjes, indien zichtbaar ontleedbaar) skeletspier uterus (inclusief cervix) 
epididymis [bovenste luchtwegen, 
inclusief neus, neus ­
schelpen en paranasale 
sinussen] huid [ureter] 
oog (inclusief netvlies) slokdarm ruggenmerg (drie ni ­
veaus: cervicaal, medi ­
othoracaal en lumbaal) [urinebuis] 
[dijbeen met gewricht] [reukkolf] milt vagina 
galblaas (bij andere dier ­
soorten dan ratten) ovarium [borstbeen] coupe van het beenmerg en/ 
of vers beenmergaspiraat 
klier van Harder
 
Organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten beide 
worden bewaard. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van 
de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze be ­
schadigd kunnen worden, moeten worden bewaard. Bij onderzoek waarbij de dermale toedieningsweg wordt gebruikt, moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld en moeten 
specifieke monsters van de huid op de toedieningslocatie worden genomen 
en bewaard. Bij inhalatieonderzoek moet de lijst van luchtwegweefsels die moeten worden bewaard en onderzocht, worden gebaseerd op de aanbeve ­
lingen in hoofdstuk B.8 van deze bijlage (8) en hoofdstuk B.29 van deze 
bijlage (9). In geval van andere organen/weefsels (en in aanvulling op de 
specifiek bewaarde weefsels van de luchtwegen) moeten de organen worden onderzocht die voor de orale toedieningsweg zijn vastgesteld.
 
Histopathologie  
56. Er zijn aanwijzingen beschikbaar voor beste praktijken voor de uitvoering 
van toxicologisch pathologisch onderzoek (40). Ten minste de volgende weefsel moeten worden onderzocht:
 
— alle weefsels van de dieren in de hogedosisgroep en de controlegroep;  
— alle weefsels van dieren die tijdens het onderzoek stierven of werden 
gedood;  
— alle weefsels die macroscopische abnormaliteiten vertonen, met inbegrip 
van tumoren;  
— bij waarneming van met de behandeling samenhangende histopathologi ­
sche veranderingen bij dieren in de hogedosisgroep, dezelfde weefsels van alle dieren in alle andere dosisgroepen;
 
— alle organen die paarsgewijs voorkomen, bv. nieren en bijnieren, moeten 
beide worden onderzocht.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE (CARCINOGENITEIT EN CHRO ­
NISCHE TOXICITEIT)  
Gegevens  
57. Voor elk dier worden apart gegevens verstrekt over alle geëvalueerde pa ­
rameters. Bovendien moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen die voor iedere testgroep laten zien: het aantal dieren aan het begin van het 
onderzoek, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om redenen 
van dierenwelzijn moest worden gedood en het tijdstip waarop de dood bij de individuele dieren is ingetreden, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijn ­
selen vertoont, een beschrijving van de waargenomen toxische effecten, met 
inbegrip van de aanvang, de duur en de ernst van eventuele toxische ef ­
fecten, het aantal dieren met letsel, de aard van het letsel en het percentage dieren waarbij ieder type letsel voorkomt. Samengevatte gegevens in tabel ­
vorm moeten de gemiddelde en standaarddeviatie (voor continue testgege ­
vens) verschaffen van dieren waarbij toxische effecten of letsels voorkomen, 
in aanvulling op de inschaling van de letsels.
 
58. Bij de interpretatie van de onderzoeksresultaten kunnen controlegegevens uit 
het verleden nuttig zijn, bv. wanneer er aanwijzingen zijn dat de gegevens van de parallelle controlegroepen aanzienlijk afwijken van de recente gege ­
vens van de controledieren in dezelfde testfaciliteit/kolonie. Controlegege ­
vens uit het verleden die ter evaluatie worden aangeboden, moeten afkom ­
stig zijn uit hetzelfde laboratorium, verband houden met dieren van dezelfde leeftijd en stam, en zijn gegenereerd gedurende de vijf jaar die zijn voor ­
afgegaan aan het onderzoek in kwestie.
 
59. Voor zover van toepassing moeten alle waargenomen resultaten met behulp 
van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëva ­
lueerd. De statistische methoden en de te analyseren gegevens moeten tij ­
dens het opzetten van het onderzoek worden gekozen (zie punt 9). Bij de 
selectie moet zo nodig worden gecorrigeerd voor overleving.  
60. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en fysisch-chemische eigenschappen;  
— identificatiegegevens;  
— herkomst van de stof;  
— partijnummer;  
— certificaat van chemische analyse.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).  
Proefdieren:  
— gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren bij aanvang van de test;  
— herkomst, huisvesting, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de test.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Testomstandigheden:  
— motivering voor de gekozen toedieningsweg en de keuze van de dosis;  
— toegepaste statistische methoden voor analyse van de gegevens, indien 
van toepassing;  
— bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de 
samenstelling van het voer;  
— analytische gegevens over de bereikte concentratie, stabiliteit en homo ­
geniteit van het preparaat;  
— de toedieningsweg en bijzonderheden over de toediening van de teststof;  
— bij inhalatieonderzoek, alleen via de neus of via het hele lichaam;  
— werkelijke doses (mg/kg lichaamsgewicht/dag) en conversiefactor van de 
teststofconcentratie (mg/kg of ppm) in het voedsel/drinkwater naar de 
werkelijke dosis, voor zover van toepassing;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water.  
Resultaten (er moeten samengevatte gegevens in tabelvorm en gegevens 
voor elk dier apart worden verstrekt)  
Algemeen:  
— overlevingsgegevens;  
— lichaamsgewicht/veranderingen hierin;  
— voedselverbruik, voedselefficiëntie, indien berekend, en waterverbruik, 
indien van toepassing;  
— toxicokinetische gegevens, indien beschikbaar;  
— oftalmoscopie (indien beschikbaar);  
— hematologie (indien beschikbaar);  
— klinische chemie (indien beschikbaar).  
Klinische bevindingen:  
— tekenen van toxiciteit;  
— incidentie (en indien gescoord, ernst) van eventuele abnormaliteiten;  
— aard, ernst en duur van de klinische waarnemingen (van voorbijgaande 
aard dan wel blijvend).  
Obductiegegevens:  
— lichaamsgewicht aan het einde van het onderzoek;  
— orgaangewichten en hun verhoudingen, indien van toepassing;  
— obductieverslagen, incidentie en ernst van abnormaliteiten.  
Histopathologie:  
— niet-neoplastische histopathologische bevindingen;  
— neoplastische histopathologische bevindingen;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— correlatie van macroscopische en microscopische bevindingen;  
— gedetailleerde beschrijving van alle met de behandeling samenhangende 
histopathologische bevindingen, met inbegrip van een inschaling van de ernst;
 
— een verslag van eventuele intercollegiale toetsing van objectglaasjes.  
Statistische behandeling van de resultaten, naargelang hetgeen van toepas ­
sing is  
Bespreking van de resultaten, waaronder:  
— bespreking van eventuele modelleringsbenaderingen;  
— dosis-responsverhoudingen;  
— controlegegevens uit het verleden;  
— beoordeling van eventuele informatie over de werkingswijze;  
— bepaling van BMD, NOAEL of LOAEL;  
— relevantie voor de mens.  
Conclusies  
LITERATUUR:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.
 
(4) Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W. et al. (2002). Hazard identification 
by methods of animal-based toxicology. Food and Chemical Toxicology 40: 145-191.
 
(5) Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003). Toxicity charac ­
terization of environmental chemicals by the US National Toxicology Pro ­
gramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health, nr. 206, 437-445.  
(6) Hoofdstuk B.27 van deze bijlage, Subchronische orale toxiciteitstest: toxi ­
citeitsonderzoek (oraal) op dieren anders dan knaagdieren bij herhaalde toediening (90 dagen).
 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment nr. 116, beschikbaar op de openbare website voor onderzoeksrichtlijnen van de OESO op www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Hoofdstuk B.8 van deze bijlage, Subacute inhalatietoxiciteit: onderzoek van 
28 dagen.  
(10) Hoofdstuk B.29 van deze bijlage, Subchronische inhalatietoxiciteit: onder ­
zoek van 90 dagen.  
(11) Hoofdstuk B.9 van deze bijlage, Toxiciteit (dermaal) bij herhaalde toedie ­
ning (28 dagen).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers 
C., Willcocks D., Farland W. (2006). IPCS Framework for analyzing the 
Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans, Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
(13) Cohen S.M., Meek M.E., Klaunig J.E., Patton D.E., Fenner-Crisp P.A. 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
(14) Holsapple M.P., Pitot H.C., Cohen S.N., Boobis A.R., Klaunig J.E., Pas ­
toor T., Dellarco V.L., Dragan Y.P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
 
(15) Meek E.M., Bucher J.R., Cohen S.M., Dellarco V., Hill R.N., 
Lehman-McKemmon L.D., Longfellow D.G., Pastoor T., Seed J., Patton D.E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
(16) Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R.  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Moderniza ­
tion of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.  
(17) Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T.  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.  
(18) Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A.  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.  
(19) Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M.  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  
(22) Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., 
Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs 
A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (Ed.), ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C., McAuslane J.A.N. en Lumley C.E. (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T., Griffiths SA and Lumley C.E. (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Con ­
ference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.  
(26) Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997). The Signifi ­
cance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assess ­
ment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing 
by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 
22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor weten ­
schappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, DC, US Dept. of Health 
and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments, ISBN 3-906255-06-9.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
(31) Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., 
Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.  
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(33) Tupper D.E., Wallace R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination 
in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(34) Gad S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicolo ­
gy. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(35) Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.  
(36) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for 
the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
(37) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson 
H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxi ­
col. Teratol. 13: 599-609.
 
(38) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
(39) EMEA (concept)document „Non-clinical guideline on drug-induced hepa ­
totoxicity” (doc. ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(40) Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K.  et al.  (2004). Best Prac ­
tices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126-131.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIE  
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze testmethode wordt getest..  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  REPRODUKTIETOXICITEITSONDERZOEK OVER ÉÉN 
GENERATIE  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
De teststof wordt in geleidelijk stijgende doseringen aan verschei ­
dene groepen mannelijke en vrouwelijke dieren toegediend. Aan de mannetjes dient de teststof gedurende de groei en gedurende ten minste één volledige spermatogene cyclus (ongeveer 56 dagen bij 
de muis en 70 dagen bij de rat) toegediend te worden, teneinde 
eventuele, door de reststof veroorzaakte nadelige effecten op de spermatogenese aan het licht te brengen.
 
Aan de vrouwelijke ouderdieren (P-generatie) moet de reststof ten 
minste gedurende twee volledige oestruscycli worden toegediend, teneinde eventuele door de teststof veroorzaakte nadelige effecten op de oestrus aan het licht te brengen. Vervolgens laat men de dieren 
paren. Gedurende de paartijd wordt de teststof aan beide geslachten 
toegediend; daarna alleen aan de wijfjes gedurende de dracht en de zoogtijd. Bij toediening van de teststof via inhalatie zal de methode 
op een aantal punten moeten worden aangepast.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Geen.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKMETHODE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
Voor het onderzoek worden gezonde, jonge dieren op willekeurige 
wijze in de te behandelen en controlegroepen ingedeeld. Voor het 
onderzoek worden de dieren ten minste vijf dagen onder dezelfde huisvestings- en voedingsomstandigheden gehouden als tijdens de proef. Aanbevolen wordt de teststof in het voedsel of drinkwater 
toe te dienen. Ook andere toedieningswegen komen in aanmerking. 
De teststof moet bij alle dieren voor de gehele duur van het experi ­
ment op dezelfde manier worden toegediend. Indien een medium of andere additieven worden gebruikt om de dosering re vergemakke ­
lijken, moet ervan bekend zijn dat zij geen toxische effecten ver ­
oorzaken. Toediening geschiedt gedurende zeven dagen per week.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1.6.2. P r o e f d i e r e n  
Selectie van de soort  
Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten of muizen. Stammen met 
een lage vruchtbaarheid dienen niet te worden gebruikt. Er dient gebruik te worden gemaakt van gezonde dieren die nog niet eerder 
aan experimenten zijn onderworpen. Van de proefdieren dienen 
soort, stam, geslacht, gewicht en/of leeftijd bekend te zijn.
 
Voor een juiste beoordeling van de vruchtbaarheid dienen zowel de 
mannetjes als de wijfjes te worden onderzocht. Alle behandelde en controledieren dienen gespeend te zijn voordat met de dosering 
wordt begonnen.
 
Aantal en geslacht  
Elke behandelde en controlegroep dient zoveel dieren te bevatten dat 
er steeds ongeveer 20 drachtige wijfjes zijn die op ongeveer het ­
zelfde tijdstip verwacht worden te werpen.  
Dit om te komen tot voldoende drachten en nakomelingen om een 
zinvolle evaluatie te kunnen maken van de mogelijke effecten van de stof op de vruchtbaarheid, de dracht en het gedrag van de moeder bij de dieren van de oudergeneratie en het zogen, de groei en de ont ­
wikkeling van de F
 1 -generatie vanaf de conceptie tot aan de spening.  
1.6.3. P r o e f o m s t a n d i g h e d e n  
Voer en water dienen ad libitum te worden verstrekt. Vlak voor de 
partus moeten de drachtige wijfjes apart in speciale hokken worden ondergebracht; eventueel kan nestmateriaal worden verstrekt.
 
1.6.3.1. D o s i s n i v e a u s  
Er dienen ten minste drie dosisgroepen en een controlegroep te 
worden gebruikt. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het 
hoogste gebruikte volume toegediend te worden. Indien een teststof 
leidt tot een verminderde voeropname of -absorptie, dan kan het noodzakelijk zijn een parallelle controlegroep te gebruiken. In het ideale gevat moet het hoogste dosisniveau bij de ouderdieren leiden 
tot toxische verschijnselen, maar niet tot sterfte, tenzij zulks op 
grond van de fysisch-chemische eigenschappen of de biologische effecten van de teststof onmogelijk is. In het ideale geval moeten 
de tussenliggende doses leiden rot minimale toxische effecten die 
aan de teststof zijn toe te schrijven, en mag de lage dosis niet tot enige waarneembare nadelige effecten bij de ouders of de nakome ­
lingen leiden. Wanneer de teststof via een maagsonde of in capsules 
wordt toegediend, moet de aan elk dier toegediende dosis gebaseerd 
zijn op het lichaamsgewicht van het dier en wekelijks aan het ge ­
wijzigde lichaamsgewicht worden aangepast. Bij drachtige wijfjes kan de dosis desgewenst gebaseerd worden op het lichaamsgewicht 
op dag nul of dag zes van de dracht.
 
1.6.3.2. H o o g s t e t e t e s t e n d o s i s  
Indien stoffen met een lage toxiciteit bij een dosisniveau van ten 
minste 1 000 mg/kg het voortplantingsvermogen op generlei wijze 
blijkt te zijn verstoord, zijn studies bij andere dosisniveaus wellicht niet noodzakelijk. Indien uit een voorafgaand onderzoek bij het hoge dosisniveau waarbij duidelijke tekenen van toxiciteit bij het moeder ­
dier voorkomen geen nadelige effecten op de vruchtbaarheid blijken, 
zijn studies bij andere dosisniveaus wellicht niet noodzakelijk.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3.  Uitvoering van het onderzoek  
T i j d s c h e m a  
Met de dagelijkse toediening van de teststof aan de mannelijke ou ­
derdieren dient te worden begonnen wanneer deze vijf à negen we ­
ken oud zijn, nadat zij zijn gespeend en gedurende ten minste vijf 
dagen aan de proefomstandigheden zijn gewend. Bij ratten wordt de 
teststof gedurende tien weken vóór de paartijd toegediend (bij mui ­
zen gedurende acht weken). De mannetjes kunnen hetzij aan het einde van de paartijd worden gedood en onderzocht, hetzij op hun 
voer met de teststof in leven worden gehouden voor de eventuele 
voortbrenging van een tweede nest en dan enige tijd voor het eind van het onderzoek worden gedood en onderzocht. Bij vrouwelijke ouderdieren dient met de dosering na ten minste vijf dagen van 
gewenning aan de proefomstandigheden te worden begonnen en 
deze dient ten minste twee weken te hebben geduurd vóór de paring plaatsvindt. De dagelijkse toediening van de teststof aan de vrouwe ­
lijke ouderdieren dient te worden voortgezet gedurende de hele pa ­
ringstijd van drie weken, de dracht en tot aan het spenen van de 
nakomelingen van de eerste generatie. Er dient aandacht te worden geschonken aan wijzigingen in het doseringsschema op grond van andere beschikbare informatie over de teststof, zoals inductie van het 
teststofmetabolisme of bioaccumulatie.
 
P a r i n g  
Bij studies naar de reproductietoxiciteit kan men hetzij één mannetje 
met één wijfje (1:1) of één mannetje met twee wijfjes (1:2) laten paren.
 
In het eerste geval (1:1) wordt één wijfje bij hetzelfde mannetje 
geplaatst totdat het drachtig is of er drie weken zijn verstreken. Elke ochtend worden de wijfjes onderzocht op de aanwezigheid van sperma of vaginale plugs. Dag nul van de dracht is de dag 
waarop een vaginale plug of sperma wordt aangetroffen, waarbij 
rekening wordt gehouden rnet de spermatogenese.
 
Bij de paartjes waarbij de paring mislukt, dient te worden nagegaan 
wat de oorzaak van deze kennelijke onvruchtbaarheid is.  
Dit kan onder meer geschieden door de dieren nogmaals te laten 
paren, maar dan met vader- of moederdieren van bewezen vrucht ­
baarheid, door microscopisch onderzoek van de voortplantingsorga ­
nen en onderzoek van de oestruscyclus of de spermatogenese.  
N e s t g r o o t t e  
De dieren waaraan gedurende het vruchtbaarheidsonderzoek de test ­
stof wordt toegediend, worden in de gelegenheid gesteld normaal te 
werpen en hun jongen tot de speentijd groot te brengen. De nest ­
grootte wordt hierbij niet gestandaardiseerd.  
Als standaardisatie wel gebeurt, dan wordt voorgesteld als volgt 
tewerk te gaan. Tussen de eerste en de vierde dag na de geboorte 
kan de grootte van elk nest worden aangepast door het teveel aan jongen, via selectie, uil het nest te nemen om uiteindelijk vier man ­
netjes en vier wijfjes per nest over te houden.
 
Indien het aantal mannetjes of wijfjes niet voldoende is om er per 
nest vier van elk geslacht over te houden, kan worden volstaan met een gedeeltelijke aanpassing (bijvoorbeeld vijf mannetjes en drie 
wijfjes). Een en ander is niet van toepassing op nesten met minder 
dan acht jongen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4. W a a r n e m i n g e n  
Gedurende de hele onderzoekperiode wordt elk dier ten minste een ­
maal per dag geobserveerd. Met de teststof samenhangende verande ­
ringen in het gedrag, tekenen van een moeilijke of langdurige ge ­
boorte en alle tekenen van toxiciteit, inclusief sterfte, dienen te wor ­
den vastgelegd. Gedurende de tijd die aan de paring voorafgaat en de paartijd dient het verbruik van voer wekelijks te worden gemeten. Tijdens de dracht kan het verbruik van voer eventueel dagelijks 
worden gemeten. Na het werpen en tijdens de zoogtijd dient het 
verbruik van voer (en van water indien de teststof met het drinkwater wordt toegediend) te worden gemeten op dezelfde dag als de nesten 
worden gewogen. De mannelijke en vrouwelijke ouderdieren moeten 
worden gewogen op de eerste dag dat zij de teststof krijgen toe ­
gediend en daarna eenmaal per week. Deze waarnemingen moeten voor elk volwassen dier afzonderlijk worden vastgelegd.
 
De drachttijd dient te worden berekend vanaf dag nul van de dracht. 
Elke worp dient zo spoedig mogelijk na de geboorte te worden 
onderzocht, teneinde het aantal en geslacht van de jongen vast te 
stellen, alsmede het aantal dood- en levendgeboren jongen en de aanwezigheid van met het blote oog zichtbare afwijkingen.
 
Dode jongen en jongen die op de vierde dag worden gedood, dienen 
te worden bewaard en op eventuele afwijkingen te worden onder ­
zocht. De levende jongen moeten worden geteld en de nesten moeten 
worden gewogen op de ochtend na de geboorte, op de vierde en de zevende dag en vervolgens wekelijks tot het eind van het onderzoek, wanneer de dieren afzonderlijk dienen te worden gewogen.
 
De bij de moederdieren en nakomelingen waargenomen lichamelijke 
of gedragsafwijkingen dienen te worden opgetekend.  
1.6.5.  P a t h o l o g i e  
1.6.5.1. N e c r o p s i e  
Wanneer er ouderdieren tijdens het onderzoek worden gedood of 
sterven, dienen zij macroscopisch te worden onderzocht op eventuele 
structurele afwijkingen of pathologische veranderingen, waarbij spe ­
ciaal aandacht moet worden geschonken aan de voortplantingsorga ­
nen. Dode of stervende jongen moeten op afwijkingen worden on ­
derzocht.  
1.6.5.2. H i s t o p a t h o l o g i e  
Van alle ouderdieren moeten de eierstokken, uterus, cervix, vagina, 
testes, epididymides, zaadblaasjes, prostaat, coagulans afscheidende klier, de hypofyse en aangetaste organen voor microscopisch onder ­
zoek worden bewaard. In het geval dat deze organen nog niet bij 
andere onderzoeken, waarbij herhaalde doseringen zijn toegediend, 
zijn onderzocht, dienen zij microscopisch te worden onderzocht bij alle dieren uit de hoogste dosisgroep en de controlegroep en de dieren die tijdens het onderzoek sterven.
 
De organen die bij deze dieren afwijkingen vertonen, dienen ver ­
volgens bij alle andere ouderdieren te worden onderzocht. In deze 
gevallen dienen alle weefsels die met het blote oog zichtbare patho ­
logische veranderingen vertonen, microscopisch te worden onder ­
zocht. Zoals hierboven reeds werd gesuggereerd, kunnen de voort ­
plantingsorganen van dieren waarvan wordt vermoed dat zij on ­
vruchtbaar zijn, aan een microscopisch onderzoek worden onderwor ­
pen. ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. GEGEVENS  
De volgende gegevens moeten voor iedere proefgroep in tabellen 
worden samengevat; het aantal dieren bij het begin van het onder ­
zoek, het aantal vruchtbare mannetjes, het aantal drachtige wijfjes, de 
aard van de veranderingen en het percentage dieren dat elk type 
verandering vertoont.  
Indien mogelijk, moeten alle numerieke resultaten met behulp van 
een voor dit doel geschikte statistische methode worden geëvalueerd. 
Iedere algemeen erkende statistische methode kan hiervoor worden 
gebruikt.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het verslag moeien, indien mogelijk, ook de volgende gegevens 
worden opgenomen:  
— gebruikte diersoort/stam;  
— gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis, met 
inbegrip van vruchtbaarheid, dracht en levensvatbaarheid;  
— tijdstip gedurende het onderzoek waarop de dood intreedt of 
aangeven of dieren tot de tijd waarop zij volgens plan zouden worden gedood of tot het einde van de proef in leven bleven;
 
— tabel met het gewicht van elke worp, het gemiddelde gewicht 
van de jongen en het gewicht van elk jong afzonderlijk aan het 
eind van het onderzoek;  
— toxische of andere effecten op de reproductie, het nageslacht, 
postnatale groei, enzovoort;  
— dag waarop een abnormaal verschijnsel werd waargenomen en 
verloop hiervan;  
— gegevens over het lichaamsgewicht van de ouderdieren;  
— bevindingen van de necropsie;  
— gedetailleerde beschrijving van eventuele microscopische bevin ­
dingen;  
— statistische verwerking van de resultaten, waar dat van toepassing 
is; 
— bespreking van de resultaten;  
— interpretatie van de resultaten.  
3.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  
4. LITERATUUR  
Zie Algemene inleiding — Deel B.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  REPRODUCTIETOXICITEITSONDERZOEK OVER TWEE 
GENERATIES  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 416 (2001) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
Deze testmethode voor de reproductietoxiciteit over twee generaties 
is bedoeld om algemene informatie te verschaffen over de effecten 
van een teststof op de toestand en het functioneren van het manne ­
lijke en vrouwelijke reproductiesysteem, met inbegrip van de functie van de geslachtsorganen, de oestruscyclus, het paargedrag, de be ­
vruchting, de zwangerschap, de geboorte, de lactatie en het spenen, 
en de groei en ontwikkeling van de nakomelingen. De studie kan 
ook informatie verschaffen over de effecten van de teststof op de neonatale morbiditeit en mortaliteit en voorlopige gegevens over de prenatale en postnatale ontwikkelingstoxiciteit en kan als leidraad 
voor verdere tests fungeren. Deze testmethode is niet alleen bedoeld 
om de groei en ontwikkeling van de F
 1 -generatie te bestuderen, maar 
ook om de toestand en het functioneren van het mannelijke en 
vrouwelijke reproductiesysteem daarvan en de groei en ontwikkeling 
van de F  2 -generatie te beoordelen. Om meer informatie te verkrijgen 
over de ontwikkelingstoxiciteit en functionele gebreken kunnen aan ­
vullende tests in dit protocol worden opgenomen, waarbij eventueel 
de methoden voor ontwikkelingstoxiciteit en/of ontwikkelingsneuro ­
toxiciteit kunnen worden geraadpleegd, of kunnen deze eindpunten bij aparte onderzoeken met de daartoe geschikte testmethoden wor ­
den bestudeerd.
 
1.2. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt in geleidelijk oplopende doseringen aan verschil ­
lende groepen mannetjes en vrouwtjes toegediend. De mannetjes van 
de P-generatie krijgen de teststof gedurende de groei en ten minste 
één volledige spermatogenese-cyclus toegediend (ongeveer 56 dagen bij de muis en 70 dagen bij de rat) om eventuele schadelijke effecten op de spermatogenese aan het licht te brengen. De effecten op het 
sperma worden aan de hand van een aantal spermaparameters (zoals 
de morfologie en beweeglijkheid van het sperma) en door weefsel ­
preparatie en gedetailleerde histopathologie bepaald. Als er gegevens over de spermatogenese beschikbaar zijn uit een eerder uitgevoerd 
onderzoek met herhaalde toediening dat lang genoeg geduurd heeft, 
bv. een onderzoek van 90 dagen, behoeven de mannetjes van de P- generatie niet in de evaluatie te worden opgenomen. Wel wordt echter aanbevolen monsters of opgenomen digitale beelden van 
sperma van de P-generatie te bewaren om een latere evaluatie mo ­
gelijk te maken. De vrouwtjes van de P-generatie krijgen de teststof gedurende de groei en enkele volledige oestruscycli toegediend om eventuele schadelijke effecten van de teststof op de normale oestrus ­
cyclus te detecteren. De teststof wordt gedurende de dekperiode, 
gedurende de daaruit voortvloeiende dracht en tot en met het spenen van hun F
 1 -jongen aan de ouderdieren (P-generatie) toegediend. Bij 
het spenen van de F  l -generatie wordt de toediening van de stof 
voortgezet bij de F  l -jongen, en wel gedurende hun groei tot vol ­
wassenheid, de dekking en de productie van een F  2 -generatie tot 
de F  2 -generatie wordt gespeend.  
Alle dieren worden klinisch geobserveerd en pathologisch onder ­
zocht op toxiciteitsverschijnselen, waarbij vooral wordt gelet op ef ­
fecten op de toestand en het functioneren van het mannelijke en 
vrouwelijke reproductiesysteem en de groei en ontwikkeling van 
de jongen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.3.1.  Keuze van de diersoort  
Voor de test worden bij voorkeur ratten gebruikt. Als er een andere 
soort wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven 
en zullen er de nodige wijzigingen moeten worden aangebracht. 
Stammen met een lage vruchtbaarheid of waarvan bekend is dat er vaak ontwikkelingsstoornissen optreden, mogen niet worden ge ­
bruikt. Aan het begin van het onderzoek moeten de gewichtsver ­
schillen tussen de dieren minimaal zijn en niet groter dan 20 % 
van het gemiddelde gewicht van elke sekse.
 
1.3.2.  Huisvesting en voeding  
De temperatuur in de proefdierruimte dient 22  o C (± 3  o C) te zijn. 
Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, 
moet worden gestreefd naar 50-60 %. De verlichting dient met 
kunstlicht te gebeuren met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden ge ­
bruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het 
voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende 
vermenging van de teststof te zorgen wanneer die langs deze weg wordt toegediend.
 
De dieren kunnen elk apart of in kleine groepjes met hetzelfde 
geslacht worden ondergebracht. De dekking gebeurt in daarvoor ge ­
schikte kooien. Wanneer de dekking blijkt te hebben plaatsgevonden, 
worden de vrouwtjes apart gezet in werp- of drachthokken. Dieren die gedekt zijn kunnen ook in groepjes worden gehuisvest en één of twee dagen voor het werpen apart worden gezet. Dieren die gedekt 
zijn krijgen geschikt en gespecificeerd nestmateriaal wanneer ze gaan 
werpen.
 
1.3.3.  Voorbereiding van de dieren  
Er worden gezonde jonge dieren gebruikt die gedurende ten minste 5 
dagen aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd. De ken ­
merken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, geslacht, ge ­
wicht en/of leeftijd worden vastgelegd. Alle broer/zus-verhoudingen tussen de dieren moeten bekend zijn, zodat dekking van zus door broer wordt vermeden. De dieren worden aselect ingedeeld in con ­
trolegroepen en behandelde groepen (waarbij geleding aan de hand 
van het lichaamsgewicht wordt aanbevolen). De kooien worden zo ­
danig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Elk dier krijgt een uniek identifi ­
catienummer. Bij de P-generatie gebeurt dit voordat de toediening 
begint. Bij de F
 1 -generatie gebeurt dit bij het spenen voor de dieren 
die voor dekking worden geselecteerd. Voor alle geselecteerde F  1 - 
dieren wordt bijgehouden uit welk nest ze afkomstig zijn. Daarnaast 
wordt aanbevolen de jongen zo spoedig mogelijk na de geboorte een 
eigen identificatie te geven, wanneer wordt overwogen de jongen apart te wegen of functieproeven uit te voeren.
 
Wanneer met de toediening aan de ouderdieren (P-generatie) wordt 
gestart, dienen deze ongeveer 5-9 weken oud te zijn. De dieren van 
alle testgroepen dienen zo veel mogelijk hetzelfde gewicht en de ­
zelfde leeftijd te hebben.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. UITVOERING  
1.4.1.  Aantal en geslacht van de dieren  
Elke test- en controlegroep dient een zodanig aantal dieren te bevat ­
ten dat er bij voorkeur ten minste 20 drachtige vrouwtjes op of vlak 
voor de werpdatum zijn. Bij stoffen die ongewenste aan de behan ­
deling gerelateerde effecten veroorzaken (bv. steriliteit of te grote toxiciteit bij hoge doses), is dit soms onmogelijk. Het is de bedoeling dat er genoeg drachtige vrouwtjes zijn om een zinnige beoordeling 
mogelijk te maken van het vermogen van de stof om invloed te 
hebben op de vruchtbaarheid, de dracht en het gedrag van de moe ­
der, het zogen, de groei en ontwikkeling van de F
 1 -generatie vanaf 
de bevruchting tot aan de geslachtsrijpheid en de ontwikkeling van 
hun jongen (de F  2 -generatie) tot ze gespeend worden. Als het ge ­
wenste aantal drachtige dieren (d.w.z. 20) niet kan worden gehaald, betekent dit niet automatisch dat het onderzoek onbruikbaar is; dit 
moet van geval tot geval worden beoordeeld.
 
1.4.2.  Bereiding van de doses  
De teststof wordt bij voorkeur oraal (in het voer, in het drinkwater of 
met een sonde) toegediend, tenzij een andere toedieningsweg (b.v. dermaal of door inhalatie) geschikter wordt geacht.
 
Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of 
gesuspendeerd. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is 
een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel een ander medium. Wanneer een ander medium dan water 
wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. 
De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald.
 
1.4.3.  Dosering  
Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige contro ­
legroep gebruikt. Tenzij dit vanwege de fysisch/chemische aard of biologische kenmerken van de teststof onmogelijk is, moet de hoog ­
ste dosis zodanig worden gekozen dat er enige toxiciteit wordt ver ­
oorzaakt, maar geen sterfte of ernstig leed. Bij onverwachte sterfte zijn onderzoeken met een sterfte van minder dan ongeveer 10 % bij de ouderdieren (de P-generatie) normaal gesproken nog aanvaard ­
baar. Er wordt een dalende reeks dosisniveaus gekozen teneinde 
een dosisafhankelijk effect en de dosis zonder waargenomen scha ­
delijke effecten (NOAEL) te bepalen. Intervallen van een factor twee of vier zijn vaak optimaal om de dalende dosisniveaus vast te stellen 
en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote 
intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken. Bij toediening in het voer mag het dosisinterval niet meer dan een factor drie zijn. Bij de keuze van de dosisniveaus wordt 
rekening gehouden met bekende toxiciteitsgegevens, met name re ­
sultaten van onderzoek met herhaalde toediening. Ook met beschik ­
bare gegevens over het metabolisme en de kinetiek van de teststof of verwante verbindingen dient rekening te worden gehouden. Boven ­
dien zal met deze informatie ook makkelijker kunnen worden aange ­
toond dat het doseringsschema adequaat is.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
De controlegroep wordt niet of, als bij de toediening van de teststof 
een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Afgezien van 
de toediening van de teststof is de behandeling van de dieren in de controlegroep identiek aan die van de dieren in de testgroepen. Als er een medium wordt gebruikt, wordt aan de controlegroep de hoog ­
ste gebruikte mediumdosis toegediend. Als een teststof in het voer 
wordt toegediend en leidt tot een lagere voeropname of voerbenut ­
ting, kan het gebruik van een paarsgewijs gevoerde controlegroep nodig worden geacht. In plaats van een gelijktijdige paarsgewijs 
gevoerde controlegroep kunnen ook gegevens worden gebruikt uit 
gecontroleerd onderzoek dat is opgezet om de effecten van een lagere voerconsumptie op reproductieparameters te bepalen.
 
Er moet aandacht worden geschonken aan de volgende kenmerken 
van het medium en andere additieven: effecten op de resorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof, effecten op 
de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmer ­
ken daarvan kunnen wijzigen en effecten op het voer- of water ­
gebruik of de voedingstoestand van de dieren.
 
1.4.4.  Limiettest  
Als een onderzoek met orale toediening van één dosis van ten minste 
1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag of, bij toediening in het voer of het drinkwater, een equivalent percentage in het voer of drinkwater volgens de voor dit onderzoek beschreven procedure geen waar ­
neembare toxiciteit bij de ouderdieren of hun jongen veroorzaakt 
en op grond van gegevens over verwante verbindingen qua structuur en/of metabolisme geen toxiciteit te verwachten valt, zal een volledig onderzoek met verschillende dosisniveaus wellicht niet nodig zijn. 
De limiettest is bruikbaar, behalve wanneer vanwege de verwachte 
blootstelling van de mens een hogere orale dosis nodig wordt geacht. Voor andere toedieningsvormen, zoals inhalatie of toediening op de 
huid, zal het maximaal haalbare blootstellingsniveau vaak worden 
bepaald en beperkt door de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof zoals de oplosbaarheid.
 
1.4.5.  Toediening van de doses  
De teststof wordt 7 dagen per week aan de dieren toegediend. Bij 
voorkeur wordt voor de orale toedieningsweg (in het voer, in het drinkwater of met een sonde) gekozen. Als er een andere toedie ­
ningsweg wordt gebruikt, moet er een motivering worden gegeven 
en kunnen er aanpassingen nodig zijn. De stof wordt aan alle dieren 
gedurende de vereiste proefperiode met dezelfde methode toe ­
gediend. Als de stof met een sonde wordt toegediend, moet dit met een maagsonde gebeuren. Het volume vloeistof dat in één 
keer wordt toegediend, mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaams ­
gewicht (voor maïsolie is het maximum 0,4 ml/100 g lichaams ­
gewicht), behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat; in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Behalve 
wanneer het om irriterende of bijtende stoffen gaat, waarbij meestal 
bij hogere concentraties heviger effecten optreden, worden variaties in het toegediende volume tot een minimum beperkt door de con ­
centratie aan te passen, zodat er voor alle dosisniveaus een constant 
volume wordt toegediend. Bij sondetoediening krijgen de jongen de 
teststof meestal alleen indirect via de melk, totdat ze worden ge ­
speend en directe toediening begint. Bij toediening in het voer of het drinkwater krijgen de jongen de teststof ook direct binnen wan ­
neer ze in de laatste week van de lactatieperiode zelf beginnen te 
eten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Wanneer stoffen via het voer of het drinkwater worden toegediend, 
is het belangrijk ervoor te zorgen dat de hoeveelheid teststof de 
normale voedings- of waterbalans niet stoort. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante voerconcentratie (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht 
van het dier worden gebruikt. De gekozen methode dient te worden 
vermeld. Wanneer de stof met een sonde wordt toegediend, gebeurt dit elke dag op ongeveer hetzelfde tijdstip en wordt de dosis ten minste een keer per week aangepast om een constante dosis in ver ­
houding tot het lichaamsgewicht te houden. Wanneer de met een 
sonde toegediende dosis op basis van het gewicht wordt aangepast, moet rekening worden gehouden met informatie over de placenta ­
verdeling.
 
1.4.6.  Testschema's  
De dagelijkse toediening aan de ouderdieren (de mannetjes en 
vrouwtjes van de P-generatie) begint wanneer ze 5 tot 9 weken 
oud zijn. De dagelijkse toediening aan de mannetjes en vrouwtjes van de F
 1 -generatie begint wanneer ze worden gespeend; er moet aan 
worden gedacht dat de directe blootstelling van de F  1 -jongen bij 
toediening van de teststof via het voer of het drinkwater al tijdens 
de lactatieperiode kan beginnen. Voor beide geslachten (P en F  1 ) 
vindt de toediening ten minste 10 weken vóór de dekperiode plaats. Voor beide geslachten wordt de toediening gedurende de dekperiode 
van twee weken voortgezet. De mannetjes worden op humane wijze 
gedood en onderzocht wanneer ze niet meer nodig zijn voor de bepaling van de effecten op de reproductie. Bij de moederdieren 
(P-generatie) wordt de toediening gedurende de dracht en tot het 
spenen van de F
 1 -jongen voortgezet. Op basis van de beschikbare 
informatie over de teststof, bijvoorbeeld over de toxiciteit, de meta ­
bolisme-inductie of de bioaccumulatie, moet worden overwogen of 
er wijzigingen in het toedieningsschema nodig zijn. De dosis voor 
een bepaald dier wordt normaal gesproken gebaseerd op de meest recente bepaling van het lichaamsgewicht. Bij de aanpassing van de dosis gedurende het laatste derde deel van de dracht moet echter 
zorgvuldigheid worden betracht.
 
De mannetjes en vrouwtjes van de P- en de F  1 -generatie worden 
behandeld tot ze worden gedood. Alle volwassen mannetjes en vrouwtjes van de P- en de F
 1 -generatie worden op humane wijze 
gedood wanneer ze niet meer nodig zijn voor de bepaling van de 
effecten op de reproductie. De F  1 -jongen die niet voor dekking 
worden geselecteerd en alle F  2 -jongen worden na het spenen op 
humane wijze gedood.  
1.4.7.  De dekprocedure  
1.4.7.1.  Dekking bij de ouderdieren (P-generatie)  
Voor elke dekking wordt één vrouwtje bij één mannetje van dezelfde 
dosisgroep gezet (1:1-dekking) totdat ze copuleren of er twee weken zijn verstreken. Elke dag worden de vrouwtjes onderzocht op de aanwezigheid van sperma of een vaginale prop. Als dag 0 van de 
dracht geldt de dag waarop een vaginale prop of sperma wordt 
gevonden. Wanneer de dekking geen succes heeft, kan worden over ­
wogen de vrouwtjes opnieuw te laten dekken door mannetjes van dezelfde groep waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond. In de ge ­
gevens wordt duidelijk vermeld welke dieren gepaard hebben. Dek ­
king door een mannetje met dezelfde ouders wordt vermeden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  Dekking bij de F  1 -generatie  
Voor de dekking van de F  1 -jongen worden uit elk nest bij het spenen 
ten minste één mannetje en één vrouwtje gekozen om te paren met andere jongen van hetzelfde dosisniveau maar een ander nest, het ­
geen de F
 2 -generatie oplevert. Wanneer er tussen de jongen uit één 
nest geen significante verschillen in lichaamsgewicht of uiterlijk worden waargenomen, worden de jongen aselect gekozen. Wanneer deze verschillen wel worden waargenomen, worden de beste ver ­
tegenwoordigers van elk nest gekozen. In de praktijk gebeurt dit 
het gemakkelijkst op basis van het lichaamsgewicht, maar het kan beter zijn om het op basis van het uiterlijk te doen. De dekking bij 
de F
 1 -generatie gebeurt niet voordat ze volledig tot geslachtsrijpheid 
zijn gekomen.  
Paren zonder jongen worden beoordeeld om te bepalen wat de oor ­
zaak van de onvruchtbaarheid lijkt te zijn. Daartoe kan de gelegen ­
heid worden gegeven voor paringen met andere mannetjes of vrouw ­
tjes waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond, kunnen de voortplan ­
tingsorganen microscopisch worden onderzocht en kan de oestrus ­
cyclus of de spermatogenese nader worden onderzocht.  
1.4.7.3.  Tweede dekking  
In bepaalde gevallen, bijvoorbeeld bij aan de behandeling gerela ­
teerde veranderingen in de nestgrootte of bij de waarneming van 
een twijfelachtig effect bij de eerste dekking, wordt aanbevolen de volwassen P- en F
 1 -dieren opnieuw te laten paren om een tweede 
nest te krijgen. Daarbij wordt aanbevolen vrouwtjes of mannetjes die 
geen nest hebben gekregen te laten paren met dieren van het andere 
geslacht waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond. Als in een van beide generaties een tweede nest nodig wordt geacht, laat men de dieren ongeveer een week na het spenen van het laatste nest opnieuw 
paren.
 
1.4.7.4.  Nestgrootte  
De dieren krijgen de gelegenheid hun jongen normaal te werpen en 
groot te brengen tot ze worden gespeend. Standaardisatie van de 
nestgrootte is facultatief. Wanneer standaardisatie gebeurt, moet de 
gebruikte methode gedetailleerd worden beschreven.  
1.5 WAARNEMINGEN  
1.5.1.  Klinische observaties  
Elke dag wordt een algemene klinische observatie uitgevoerd en bij 
sondetoediening wordt voor het tijdstip rekening gehouden met de periode na de toediening waarin maximale effecten worden ver ­
wacht. Gedragsveranderingen, tekenen dat het werpen moeilijk ver ­
loopt of langer duurt en alle toxiciteitsverschijnselen worden geregis ­
treerd. Ten minste één maal per week wordt daarnaast een gedetail ­
leerder onderzoek van elk dier uitgevoerd; dit kan gemakkelijk ge ­
beuren wanneer het dier wordt gewogen. Tweemaal per dag en in het 
weekend eventueel éénmaal per dag wordt bij alle dieren naar ziekte 
of sterfte gekeken.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Lichaamsgewicht en voer/waterconsumptie van de ouderdieren  
De ouderdieren (P- en F1-generatie) worden op de eerste dag van 
toediening en vervolgens ten minste één maal per week gewogen. De moederdieren (P- en F1-generatie) worden ten minste op de dagen 0, 
7, 14 en 20 of 21 van de dracht gewogen en tijdens de lactatiepe ­
riode op de dagen waarop de nesten worden gewogen en op de dag waarop de dieren worden gedood. Deze observaties worden voor elk volwassen dier apart gerapporteerd. In de periode vóór de dekking en 
tijdens de dracht wordt de voerconsumptie ten minste wekelijks 
gemeten. Het watergebruik wordt ten minste wekelijks gemeten als de teststof in het water wordt toegediend.
 
1.5.3.  De oestrus-cyclus  
Bij de vrouwtjes van de P- en de F1-generatie worden de lengte en 
de normaliteit van de oestrus-cyclus geëvalueerd door vaginale uit ­
strijkjes vóór de dekking en facultatief tijdens de dekking totdat kan worden aangetoond dat de dekking heeft plaatsgevonden. Bij het 
verwijderen van cellen van de vagina/cervix moet ervoor worden 
gezorgd dat verstoring van de mucosa en daardoor schijnzwanger ­
schap worden voorkomen (1).
 
1.5.4.  Sperma-parameters  
Van alle mannetjes van de P- en de F1-generatie wordt, wanneer ze 
worden gedood, het gewicht van de testis en de epididymis geregis ­
treerd en wordt één exemplaar van elk orgaan bewaard voor histop ­
athologisch onderzoek (zie de punten 1.5.7. en 1.5.8.1). Van een subgroep van ten minste tien mannetjes van elke groep P- en Fl- 
mannetjes worden de andere testis en epididymis gebruikt voor de 
telling van respectievelijk de homogenisatie-resistente spermatiden en de spermareserve in de staart van de epididymis. Bij deze zelfde subgroep wordt sperma uit de staart van de epididymis of het vas 
deferens verzameld om de beweeglijkheid en de morfologie van het 
sperma te beoordelen. Als er aan de behandeling gerelateerde effec ­
ten worden waargenomen of uit andere onderzoeken is gebleken dat effecten op de spermatogenese mogelijk zijn, wordt de beoordeling 
van het sperma bij alle mannetjes van elke dosisgroep uitgevoerd; in 
andere gevallen kan de telling worden beperkt tot de P- en F1-man ­
netjes uit de controlegroep en de groep met de hoogste dosis.
 
Het totale aantal homogenisatie-resistente spermatiden uit de testis en 
het sperma in de staart van de epididymis worden geteld (2)(3). De spermareserve in de staart kan worden afgeleid uit de concentratie en het volume van het sperma in de suspensie die voor de kwalitatieve 
beoordeling wordt gebruikt en het aantal spermatozoën dat later door 
het resterende staartweefsel fijn te malen en/of te homogeniseren wordt gevonden. De telling gebeurt direct na het doden van de dieren bij de gekozen subgroep van de mannetjes van alle dosis ­
groepen, tenzij er video- of digitale beelden worden gemaakt of 
tenzij de exemplaren worden ingevroren en later worden geanaly ­
seerd. In deze gevallen kunnen de controlegroep en de groep met de hoogste dosis als eerste worden geanalyseerd. Als er geen aan de 
behandeling gerelateerde effecten (bv. effecten op het aantal sperma ­
tozoën, op de beweeglijkheid of op de morfologie) worden waar ­
genomen, behoeven de andere dosisgroepen niet te worden geanaly ­
seerd. Wanneer bij de groep met de hoogste dosis wel aan de be ­
handeling gerelateerde effecten worden waargenomen, moeten de 
groepen met een lagere dosis ook worden beoordeeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
De beweeglijkheid van sperma uit de epididymis (of het ductus 
deferens) wordt onmiddellijk na het doden beoordeeld of op video 
opgenomen. Het sperma wordt verwijderd, waarbij de beschadiging tot het minimum wordt beperkt, en met aanvaardbare methoden ver ­
dund voor de beweeglijkheidsanalyse (4). Het percentage spermato ­
zoën in oplopende beweeglijkheidscategorieën wordt subjectief of 
objectief bepaald. Wanneer computergesteunde bewegingsanalyse wordt gebruikt (5)(6)(7)(8)(9)(10), worden de oplopende beweeglijk ­
heidscategorieën bepaald door drempelwaarden voor de gemiddelde 
snelheid en rechtheid van het pad of een lineaire index die door de 
gebruiker worden bepaald. Als bij obductie de monsters op video worden opgenomen (11) of de beelden op een andere wijze worden vastgelegd, kan later een analyse van alleen de P- en F1-mannetjes 
van de controlegroep en de groep met de hoogste dosis worden 
uitgevoerd, tenzij er aan de behandeling gerelateerde effecten worden waargenomen; in dat geval moeten de groepen met een lagere dosis ook worden beoordeeld. Wanneer er geen video- of digitale beelden 
worden opgenomen, worden alle monsters in alle behandelingsgroe ­
pen bij de obductie geanalyseerd.
 
Er wordt een morfologische evaluatie van een spermamonster uit de 
epididymis (of het vas deferens) uitgevoerd. De spermatozoën (ten 
minste 200 per monster) worden als gefixeerde natte preparaten on ­
derzocht (12) en als normaal of abnormaal ingedeeld. Morfologische abnormaliteiten van sperma zijn bijvoorbeeld versmelting, ge ­
ïsoleerde koppen of misvormde koppen en/of staarten. De evaluatie 
wordt bij de geselecteerde subgroep mannetjes van alle dosisgroepen direct na het doden van de dieren of, wanneer er video- of digitale 
beelden worden opgenomen, op een later tijdstip uitgevoerd. Ook 
uitstrijkjes kunnen, wanneer ze gefixeerd zijn, later worden afgele ­
zen. In deze gevallen kunnen de controlegroep en de groep met de hoogste dosis als eerste worden geanalyseerd. Als er geen aan de 
behandeling gerelateerde effecten (bv. effecten op de morfologie van 
het sperma ) worden waargenomen, behoeven de andere dosisgroe ­
pen niet te worden geanalyseerd. Wanneer bij de groep met de hoogste dosis wel aan de behandeling gerelateerde effecten worden 
waargenomen, moeten de groepen met een lagere dosis ook worden 
beoordeeld.
 
Als een van de bovengenoemde parameters voor de sperma-evaluatie 
al eerder als onderdeel van een onderzoek naar systemische toxiciteit 
van ten minste 90 dagen is onderzocht, behoeft deze bij het onder ­
zoek over twee generaties niet noodzakelijkerwijs opnieuw te worden onderzocht. Wel wordt echter aanbevolen monsters of digitale beel ­
den van het sperma van de P-generatie te bewaren om eventueel een 
latere evaluatie mogelijk te maken.
 
1.5.5.  Jongen  
Elk nest wordt zo spoedig mogelijk na het werpen (lactatiedag 0) 
onderzocht om het aantal en het geslacht van de jongen, de dood ­
geboren jongen en de levend geboren jongen en de aanwezigheid van macroscopische afwijkingen vast te stellen. Jongen die op dag 0 dood worden aangetroffen worden, als ze niet verweekt zijn, bij 
voorkeur onderzocht op mogelijke gebreken en de doodsoorzaak 
en geconserveerd. Levende jongen worden bij de geboorte (lactatie ­
dag 0) of op dag 1 en vervolgens periodiek op weegdagen, zoals bijvoorbeeld de dagen 4, 7, 14 en 21 van de lactatie, geteld en apart 
gewogen. Bij de moederdieren of de jongen waargenomen lichame ­
lijke of gedragsafwijkingen worden geregistreerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
De lichamelijke ontwikkeling van de jongen wordt voornamelijk 
door de toename van het lichaamsgewicht geregistreerd. Andere li ­
chamelijke parameters (zoals de oor- en oogopening, het doorkomen van tanden en de haargroei) kunnen aanvullende informatie opleve ­
ren, maar deze gegevens dienen bij voorkeur te worden beoordeeld 
in de context van gegevens over de geslachtelijke rijping (zoals 
leeftijd en lichaamsgewicht bij de opening van de vagina of de scheiding tussen eikel en voorhuid) (13). Functioneel onderzoek (bv. motorische activiteit, sensorische functie of reflex-ontogenie) 
bij de jongen van de F1-generatie voor en/of na het spenen, met 
name in verband met geslachtelijke rijping, wordt aanbevolen als dergelijk onderzoek niet in afzonderlijke studies is opgenomen. Bij gespeende jongen van de F1-generatie die voor dekking worden 
geselecteerd, wordt de leeftijd bij de opening van de vagina of de 
scheiding van de voorhuid bepaald. De anaal-genitale afstand wordt bij jongen van de F2-generatie op dag 0 na het werpen gemeten als dit in verband met wijzigingen in de verhouding mannetjes/vrouwtjes 
of het tijdstip van geslachtelijke rijping bij de F1-generatie wenselijk 
wordt geacht.
 
Functioneel onderzoek kan achterwege worden gelaten bij groepen 
met andere duidelijke tekenen van schadelijke effecten (zoals een significante daling van de gewichtstoename). Als functioneel onder ­
zoek wordt uitgevoerd, moet dit niet gebeuren bij de jongen die voor 
dekking worden geselecteerd.
 
1.5.6.  Macroscopische obductie  
Alle ouderdieren (P- en F1-generatie), alle jongen met uiterlijke af ­
wijkingen of klinische verschijnselen en één aselect gekozen jong/ ­
geslacht/nest van zowel de F1- als de F2-generatie worden, wanneer ze worden gedood of tijdens het onderzoek sterven, macroscopisch onderzocht op structurele afwijkingen of pathologische veranderin ­
gen. Daarbij wordt speciale aandacht besteed aan de organen van het 
reproductiesysteem. Jongen die op humane wijze zijn gedood omdat ze stervend waren en dode jongen (wanneer ze niet verweekt zijn) worden onderzocht op mogelijke gebreken en/of de doodsoorzaak en 
geconserveerd.
 
Bij alle vrouwtjes die voor het eerst een nest werpen wordt de uterus 
op een zodanige wijze onderzocht op de aanwezigheid van en het aantal implantatieplaatsen dat geen afbreuk wordt gedaan aan het histopathologische onderzoek.
 
1.5.7.  Gewicht van de organen  
Van alle ouderdieren van de P- en F1-generatie worden, wanneer ze 
worden gedood, het lichaamsgewicht en het gewicht van de volgende organen bepaald (organen die paarsgewijs voorkomen worden apart 
gewogen):
 
— de uterus en de eierstokken;  
— de testes en de epididymes (totaal en staart);  
— de prostaat;  
— de zaadblaasjes met de coagulatieklieren en hun vloeistof en de 
prostaat (als één geheel);  
— de hersenen, de lever, de nieren, de milt, de hypofyse, de schild ­
klier, de bijnieren en bekende doelorganen.  
Bij de jongen van de F1- en de F2-generatie die voor obductie zijn 
geselecteerd, wordt het uiteindelijke lichaamsgewicht bepaald en van 
één aselect gekozen jong/geslacht/nest (zie punt 1.5.6) worden de 
volgende organen gewogen: hersenen, milt en thymus.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
De resultaten van de macroscopische obductie en het wegen van de 
organen worden indien mogelijk beoordeeld in de context van waar ­
nemingen bij andere onderzoeken met herhaalde toediening.  
1.5.8.  Histopathologie  
1.5.8.1.  Ouderdieren  
De volgende organen en weefsels van de ouderdieren (P- en F1- 
generatie) of representatieve monsters daarvan worden in een ge ­
schikt medium gefixeerd en bewaard voor histopathologisch onder ­
zoek:  
— de vagina, de uterus met de cervix en de eierstokken (geconser ­
veerd in een geschikt fixatief);  
— één testis (geconserveerd in Bouin's of een vergelijkbaar fixatief), 
één epididymis, de zaadblaasjes, de prostaat en de coagulatiek ­
lier; 
— eerder gespecificeerde doelorganen uit alle dieren van de P- en 
de F1-generatie die voor dekking zijn geselecteerd.  
Bij alle bovengenoemde geconserveerde organen en weefsels wordt 
voor alle P- en F1-dieren van de controlegroep en de groep met de 
hoogste dosis die voor dekking zijn geselecteerd, een volledig hi ­
stopathologisch onderzoek uitgevoerd. Een onderzoek van de eier ­
stokken van de P-dieren is facultatief. Organen waarin aan de be ­
handeling gerelateerde wijzigingen worden aangetoond, worden ook 
in de groepen met een lagere dosis onderzocht om bij te dragen tot 
de bepaling van de NOAEL. Daarnaast worden de voortplantings ­
organen van de dieren uit de groepen met een lagere dosis waarbij een verminderde vruchtbaarheid wordt vermoed, bijvoorbeeld degene 
die in gebreke zijn gebleven bij de dekking, de bevruchting of het 
werpen van gezonde jongen of waarvoor de periodiciteit van de oestrus of het aantal, de beweeglijkheid of de morfologie van de 
spermatozoën is aangetast, histopathologisch onderzocht. Alle ma ­
croscopische letsels zoals atrofie of tumoren worden onderzocht.
 
Er wordt uitgebreid histopathologisch onderzoek van de testis uitge ­
voerd (bv. met Bouin's fixatief, inbedding met paraffine en dwars ­
coupes met een dikte van 4-5 μm) om aan de behandeling gerela ­
teerde effecten te signaleren, zoals achtergebleven spermatiden, ont ­
brekende kiemcellagen of -soorten, meerkernige reuzencellen of spermatogene cellen die in het lumen terechtkomen (14). Het onder ­
zoek van de intacte epididymis omvat de kop, het lichaam en de 
staart en dit kan gebeuren door een lengtecoupe te onderzoeken. De epididymis wordt onderzocht op infiltratie van leukocyten, wijzigin ­
gen in het voorkomen van celtypen, afwijkende celtypen en fagocy ­
tose van spermatozoën. Voor het onderzoek van de mannelijke 
voortplantingsorganen kan kleuring met PAS en hematoxyline wor ­
den gebruikt.
 
De eierstok na de lactatieperiode moet primaire en groeiende folli ­
kels en de grote corpora lutea van de lactatie bevatten. Bij histop ­
athologisch onderzoek moet een kwalitatieve depletie van de pri ­
maire follikelpopulatie worden waargenomen. Voor de F1-vrouwtjes wordt een kwantitatieve evaluatie van de primaire follikels uitge ­
voerd; het aantal dieren, de keuze van de coupe van de eierstok 
en de monstergrootte van de coupe moeten in statistisch opzicht adequaat zijn voor de gebruikte evaluatieprocedure. Bij het onder ­
zoek wordt het aantal primaire follikels geteld en dit kan worden 
gecombineerd met het aantal kleine groeiende follikels om de behan ­
delde en de controle-eierstokken te vergelijken (15)(16)(17)(18)(19).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Gespeende dieren  
Macroscopisch abnormale weefsels en doelorganen van alle jongen 
met uitwendige afwijkingen of klinische verschijnselen en van het ene aselect gekozen jong/geslacht/nest uit zowel de F1- als de F2- 
generatie die niet voor dekking zijn geselecteerd, worden in een 
geschikt medium gefixeerd en bewaard voor histopathologisch on ­
derzoek. Van de geconserveerde weefsels wordt een volledige hi ­
stopathologische karakterisering uitgevoerd, waarbij de nadruk 
vooral ligt op de organen van het reproductiesysteem.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens worden individueel gerapporteerd met een overzicht in 
tabelvorm, waarbij voor elke testgroep en elke generatie worden vermeld: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met het oog op een 
humane behandeling is gedood, het tijdstip van sterfte of humane 
doding, het aantal vruchtbare dieren, het aantal drachtige vrouwtjes, het aantal dieren met toxiciteitsverschijnselen, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen met vermelding van de 
aanvang, de duur en de ernst van de toxische effecten, de aard 
van de waarnemingen bij de ouderdieren en de jongen, de aard van de histopathologische veranderingen en alle relevante gegevens over de nesten.
 
De getalsmatige resultaten worden met een geschikte algemeen aan ­
vaarde statistische methode geëvalueerd; de statistische methoden worden bij de opzet van het onderzoek gekozen en gemotiveerd. 
Statistische dosis/respons-modellen kunnen nuttig zijn voor de ana ­
lyse van de gegevens. In het verslag wordt voldoende informatie over de analysemethode en het gebruikte computerprogramma ver ­
meld, zodat een onafhankelijke evaluator/statisticus de analyse kan 
beoordelen en reconstrueren.
 
2.2. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN  
De resultaten van dit reproductietoxiciteitsonderzoek over twee ge ­
neraties worden aan de hand van de waargenomen effecten, zoals de 
resultaten van de obductie en microscopisch onderzoek, beoordeeld. De beoordeling omvat het verband, of het ontbreken daarvan, tussen de dosis van de teststof en de aanwezigheid of afwezigheid, de 
frequentie en de ernst van abnormaliteiten zoals macroscopisch let ­
sel, gespecificeerde doelorganen, verminderde vruchtbaarheid, kli ­
nische abnormaliteiten, aantasting van de reproductie- en nestresul ­
taten, veranderingen in het lichaamsgewicht, effecten op de mortali ­
teit en andere toxische effecten. Bij de beoordeling van de testresul ­
taten wordt rekening gehouden met de fysisch-chemische eigen ­
schappen van de teststof en, wanneer deze beschikbaar zijn, gege ­
vens over de toxicokinetiek.
 
Een adequaat uitgevoerd reproductietoxiciteitsonderzoek levert een 
bevredigende raming van een dosis zonder effect op en een inzicht in schadelijke effecten op de reproductie, de geboorte, de lactatie en 
de postnatale ontwikkeling met inbegrip van de groei en de geslach ­
telijke ontwikkeling.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Een reproductietoxiciteitsonderzoek over twee generaties levert in ­
formatie op over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof gedurende alle fasen van de reproductiecyclus. Het onderzoek levert 
met name informatie op over de reproductieparameters en over de 
ontwikkeling, de groei, de rijping en het overleven van de jongen. De resultaten van het onderzoek moeten in samenhang met de resul ­
taten van het onderzoek naar subchronische en prenatale ontwikke ­
lingstoxiciteit alsmede toxicokinetisch en ander beschikbaar onder ­
zoek worden geïnterpreteerd. De resultaten van dit onderzoek kunnen worden gebruikt bij de evaluatie van de noodzaak om een chemische 
stof nader te onderzoeken. De resultaten van het onderzoek kunnen 
in beperkte mate naar de mens worden geëxtrapoleerd. Ze kunnen het best worden gebruikt voor informatie over de doses zonder effect en de toelaatbare blootstelling van de mens (20)(21)(22)(23).
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:  
Teststof:  
— de fysische aard en indien relevant de fysisch-chemische eigen ­
schappen;  
— identificatiegegevens;  
— de zuiverheid.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium, indien geen water 
wordt gebruikt.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort en stam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— herkomst, huisvesting, voeding, nestmateriaal enz.;  
— het gewicht van elk dier aan het begin van de test.  
Testomstandigheden:  
— beweegredenen voor de keuze van de dosisniveaus;  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof c.q. 
de samenstelling van het voer en de concentratie;  
— de stabiliteit en homogeniteit van het preparaat;  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg 
lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het 
water.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Resultaten:  
— de voerconsumptie en indien beschikbaar de waterconsumptie, 
het voerrendement (de toename van het lichaamsgewicht per gram geconsumeerd voer) en de consumptie van testmateriaal 
voor de P- en F1-dieren, behalve gedurende de periode dat ze 
samen in één hok zitten en gedurende ten minste het laatste derde deel van de lactatie;
 
— resorptiegegevens (indien beschikbaar);  
— gegevens over het lichaamsgewicht voor de P- en F1-dieren die 
voor dekking zijn geselecteerd;  
— gegevens over het gewicht van het nest en de jongen;  
— het lichaamsgewicht bij het doden van de dieren en gegevens 
over het absolute en relatieve gewicht van organen voor de ou ­
derdieren;  
— de aard, de ernst en de duur van (al dan niet reversibele) kli ­
nische waarnemingen;  
— de sterftijd van dieren die tijdens het onderzoek gestorven zijn;  
— gegevens over de toxische reacties per geslacht en dosis, met 
inbegrip van indexen voor de dekking, de vruchtbaarheid, de dracht, de geboorte, de levensvatbaarheid en de lactatie; in het verslag worden ook de getallen vermeld die bij de berekening 
van deze indexen zijn gebruikt;
 
— toxische of andere effecten op de reproductie, de jongen, de 
postnatale groei enz.;  
— de obductiebevindingen;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevin ­
dingen;  
— het aantal P- en F1-vrouwtjes met een normale cyclus en de 
lengte van de cyclus;  
— het totale aantal spermatozoën in de staart van de epididymis, het 
percentage spermatozoën in oplopende beweeglijkheidscatego ­
rieën, het percentage morfologisch normale spermatozoën en 
het percentage spermatozoën met elke gespecificeerde abnorma ­
liteit;  
— de tijd tot dekking, met inbegrip van het aantal dagen tot de 
dekking;  
— de duur van de dracht;  
— het aantal implantaties, het aantal corpora lutea en de nestgrootte;  
— het aantal levend geboren jongen en verliezen na implantatie;  
— het aantal jongen met macroscopisch zichtbare abnormaliteiten; 
indien dit is bepaald, wordt het aantal ondermaatse jongen ge ­
rapporteerd;  
— gegevens over ijkpunten in de lichamelijke ontwikkeling van de 
jongen en andere gegevens over de postnatale ontwikkeling: voor de geëvalueerde ijkpunten dient een motivering te worden gege ­
ven;
 
— gegevens over functionele observaties bij jongen en volwassen 
dieren, indien van toepassing;  
— een statistische behandeling van de resultaten, indien van toepas ­
sing. ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies, met inbegrip van de NOAEL-waarden voor de effecten 
op de moederdieren en de jongen.  
4. REFERENTIES  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduction 
in Mammals : I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and 
R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al. (1989). A Dose-Response Analysis of Me ­
thoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  
12:92-108.
 
(3) Robb, G.W. et al. (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54:103-107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al. (1991). The Method of Sperm Collection 
Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  Repro­
ductive Toxicology  5:39 44.
 
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Con ­
sensus Report.  Reproductive'Toxicology  10(3):237-244.  
(6) Chapin, R.E. et al. (1992).Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6:267-273.  
(7) Klinefelter, G.R. et al. (1992). Direct Effects of Ethane Di ­
methanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  
In Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13:409-421.  
(8) Slott, V.L. et al. (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5:449-458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D. (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thom Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.
 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations.  Journal of Andro ­
logy 10: 401-415.
 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomi ­
crographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8:330-337.  
(12) Linder, R.E. et al. (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants.  Reproductive Toxicology  6:491-505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al. (1977). Preputial Separation as an Ex ­
ternal Sign of Pubertal Development in the Male Rat.  Biologi­
cal Reproduction  17:298303.  
(14) Russell, L.D. et al. (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Flori ­
da. 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Or ­
lando, Florida.  
(16) Heindel, J.J. et al. (1989). Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.
 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Ra ­
ven, New York.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379-383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histolo ­
gy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive End ­
points for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and 
CA. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.  
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg (1989). Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles 
and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOXICOKINETIEK  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 417 (2010) van de OESO 
(TG 417). De toxicokinetiek van een teststof wordt onderzocht om afdoende informatie te verkrijgen over de absorptie, de distributie, de biotransformatie 
(d.w.z. metabolisme) en de uitscheiding. Met behulp van deze informatie 
kan de concentratie of dosering aan de waargenomen toxiciteit worden gerelateerd en het toxiciteitsmechanisme worden doorgrond. Door aan te tonen dat de proefdieren stelselmatig aan de teststof worden blootgesteld 
en de circulerende bestanddelen te onthullen (oorspronkelijke stof/metabo ­
lieten) kan de toxicokinetiek bijdragen tot een beter begrip van toxicologisch onderzoek. De voornaamste voor dit onderzoek te bepalen toxicokinetische parameters verschaffen tevens informatie over de mogelijkheid van accumu ­
latie van de teststof in weefsels en/of organen en de mogelijkheid van 
inductie van biotransformatie als gevolg van de blootstelling aan de teststof.
 
2. Toxicokinetische gegevens kunnen helpen te beoordelen in hoeverre de 
gegevens over de toxiciteit bij dieren geschikt en relevant zijn om te worden geëxtrapoleerd voor gebruik bij de afweging van de gevaren/risico’s voor de 
mens. Daarnaast bewijst toxicokinetisch onderzoek goede diensten bij het 
bepalen van de dosisniveaus voor toxiciteitsonderzoek (lineaire tegenover niet-lineaire kinetiek), de effecten van de toedieningsweg, de biologische 
beschikbaarheid en de onderzoeksopzet. Bepaalde soorten toxicokinetische 
gegevens kunnen worden gebruikt bij het opstellen van fysiologische toxi ­
cokinetische modellen (PBTK).
 
3. Daarnaast kunnen gegevens over metabolieten/toxicokinetiek worden ge ­
bruikt voor het voorspellen van mogelijke toxische effecten en werkings ­
wijzen, en het verband met dosisniveaus en blootstellingsroute. Verder kun ­
nen gegevens over het metabolisme nuttige informatie verschaffen met het oog op de beoordeling van het toxicologisch belang van blootstellingen aan exogeen gevormde metabolieten van de teststof.
 
4. Adequate toxicokinetische gegevens kunnen worden gebruikt om de aan ­
vaardbaarheid en toepasselijkheid van kwantitatieve structuur-activiteitsrela ­
ties en „read-across”- of groeperingsbenaderingen voor de beoordeling van de veiligheid van chemische stoffen te versterken. Kinetische gegevens 
kunnen ook worden gebruikt om de toxicologische relevantie van ander 
onderzoek (bv. in vivo/in vitro) te beoordelen.
 
5. Tenzij een andere toedieningsweg wordt vermeld (zie met name de punten 
74-78), is deze testmethode toepasbaar op de orale toediening van de test ­
stof. 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
6. Afhankelijk van het regelgevingssysteem gelden er verschillende voorschrif ­
ten en eisen met betrekking tot het meten van eindpunten en parameters die 
verband houden met de toxicokinetiek voor verschillende categorieën che ­
mische stoffen (bv. bestrijdingsmiddelen, biociden, industriële chemische stoffen). Anders dan bij de meeste andere testmethoden worden in deze 
testmethode toxicokinetische tests beschreven, waarbij van meerdere metin ­
gen en eindpunten gebruik wordt gemaakt. Het is mogelijk dat er in de toekomst nieuwe testmethoden en/of leidraden worden ontwikkeld om de afzonderlijke eindpunten nader te beschrijven. Welke tests of beoordelingen 
in het kader van deze testmethode worden uitgevoerd, is afhankelijk van de 
voorschriften en/of eisen van het desbetreffende regelgevingssysteem.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Er kunnen tal van studies worden uitgevoerd om het toxicokinetische gedrag 
van een bepaalde teststof voor regelgevingsdoeleinden te evalueren. Het is 
echter mogelijk dat, afhankelijk van de specifieke regelgevingsbehoeften of -situaties, niet al deze mogelijke studies noodzakelijk zijn om een teststof te evalueren. Bij het opzetten van toxicokinetisch onderzoek moet op flexibele 
wijze rekening worden gehouden met de kenmerken van de onderzochte 
teststof. In sommige gevallen is het mogelijk dat slechts een bepaalde reeks vragen hoeft te worden onderzocht in verband met de gevaren en risico’s van de teststof. In andere gevallen kunnen toxicokinetische gegevens wor ­
den verzameld als onderdeel van de evaluatie in het kader van ander toxi ­
cologisch onderzoek. In weer andere gevallen kunnen aanvullend en/of uit ­
gebreider toxicologisch onderzoek noodzakelijk zijn, afhankelijk van de regelgevingsbehoeften en/of eventuele nieuwe vragen die rijzen tijdens de 
evaluatie van de chemische stof.
 
8. Het testlaboratorium moet alle beschikbare informatie over de teststof, rele ­
vante metabolieten en analogen in overweging nemen voordat het onderzoek 
wordt uitgevoerd. Dit komt de kwaliteit van het onderzoek ten goede en zorgt ervoor dat het onnodig gebruik van dieren wordt vermeden. Deze informatie omvat ook gegevens van andere relevante testmethoden (onder ­
zoek in vivo of in vitro en/of evaluaties in silico). Fysisch-chemische eigen ­
schappen, zoals de partitiecoëfficiënt octanol/water (uitgedrukt als log P
 OW ), 
pKa, de oplosbaarheid in water, de dampdruk en het molecuulgewicht van een chemische stof, kunnen goede diensten bewijzen bij het plannen van het 
onderzoek en het interpreteren van de resultaten. Deze eigenschappen kun ­
nen worden bepaald aan de hand van de methoden die in de relevante testmethoden worden beschreven.
 
BEPERKINGEN  
9. Deze testmethode is niet bedoeld voor bijzondere gevallen, zoals drachtige 
of zogende dieren en hun nakomelingen, of ter evaluatie van mogelijke 
residuen in voedselproducerende dieren die aan de teststof worden bloot ­
gesteld. De gegevens die met een onderzoek volgens B.36 zijn verkregen, 
kunnen echter achtergrondinformatie verschaffen die van pas komt bij het 
opzetten van specifiek onderzoek op dit terrein. Deze testmethode is niet bedoeld voor het testen van nanomaterialen. Uit een verslag van de voor ­
lopige evaluatie van de toepasbaarheid van de OESO-richtlijnen voor onder ­
zoek op nanomaterialen blijkt dat TG 417 (gelijkwaardig aan deze test ­
methode B.36) mogelijk niet op nanomaterialen van toepassing is (1).
 
DEFINITIES  
10. De in deze testmethode gebruikte definities worden gegeven in het aan ­
hangsel.  
OVERWEGINGEN INZAKE DIERENWELZIJN  
11. Aanwijzingen voor de humane behandeling van dieren zijn opgenomen in 
OESO-leidraad nr. 19 (2). Het verdient aanbeveling OESO-richtsnoer nr. 19 te raadplegen bij alle studies in vivo en in vitro dat in deze testmethode 
wordt beschreven.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODEN  
Verkennend onderzoek  
12. Het gebruik van verkennend onderzoek voor het kiezen van de onderzoeks ­
parameters voor toxicokinetisch onderzoek (bv. metabolisme, massabalans, analytische procedures, bepalen van de dosering, uitademing van CO
 2 enz.) 
wordt aanbevolen en aangemoedigd. Het is mogelijk dat het voor de karak ­
terisering van sommige van deze parameters niet noodzakelijk is radioactief 
gemerkte stoffen te gebruiken.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Keuze van de dieren  
Soort  
13. De diersoort (en de stam) die voor toxicokinetische tests wordt gebruikt, 
moet bij voorkeur gelijk zijn aan de diersoort die is gebruikt bij ander toxicologisch onderzoek van de onderzochte teststof. Normaal gesproken moeten ratten worden gebruikt, aangezien deze op grote schaal worden 
ingezet bij toxicologisch onderzoek. Het gebruik van andere of aanvullende 
soorten kan gerechtvaardigd zijn als fundamenteel toxicologisch onderzoek significante toxiciteit bij deze soorten aantoont of als wordt aangetoond dat de toxiciteit/toxicokinetiek voor de mens relevanter is. Als een andere soort 
wordt gekozen, dient hiervoor een motivering te worden gegeven.
 
14. Tenzij anders vermeld, worden bij deze testmethode ratten gebruikt als 
proefdiersoort. Het is mogelijk dat de testmethode op bepaalde punten 
moet worden aangepast als er andere proefdiersoorten worden gebruikt.  
Leeftijd en stam  
15. Er moeten gezonde, jong-volwassen dieren (normaal gesproken zes-twaalf 
weken oud ten tijde van de toediening van de doses) worden gebruikt (zie ook de punten 13 en 14). Als er dieren uit een andere leeftijdscategorie worden gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven. Alle dieren 
moeten bij aanvang van het onderzoek ongeveer even oud zijn. Het gewicht 
van de afzonderlijke dieren mag niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht van de testgroep afwijken. In het ideale geval moet de gebruikte 
stam gelijk zijn aan die welke is gebruikt voor het samenstellen van de 
toxicologische databank voor de teststof.
 
Aantal en geslacht van de dieren  
16. Per geteste dosis moeten minimaal vier dieren van hetzelfde geslacht worden 
gebruikt. Het gebruikte geslacht dient te worden gemotiveerd. Als er vol ­
doende aanwijzingen zijn om aan te nemen dat er significante verschillen in 
toxiciteit zijn die samenhangen met het geslacht, moet het gebruik van beide 
geslachten (vier mannetjes en vier vrouwtjes) worden overwogen.  
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
17. In het algemeen moeten de dieren tijdens de onderzoeksperiode in aparte 
kooien worden gehuisvest. In bijzondere omstandigheden kan huisvesting in 
groepen gerechtvaardigd zijn. Er moet gebruik worden gemaakt van kunst ­
licht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. De temperatuur van de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) en de relatieve vochtigheid 30-70 % bedragen. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt 
met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.
 
Teststof  
18. Een met  14 C radioactief gemerkte teststof moet worden gebruikt bij het 
bepalen van de massabalans en het identificeren van metabolieten, tenzij kan worden aangetoond dat:
 
— de massabalans en de metabolieten afdoende kunnen worden geëvalu ­
eerd met de niet-radioactief gemerkte teststof;  
— de analytische specificiteit en gevoeligheid van de methode waarbij 
gebruikgemaakt wordt van de niet-radioactief gemerkte teststof gelijk 
zijn aan of groter zijn dan die welke kunnen worden verkregen met 
de radioactief gemerkte teststof.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
In dat geval hoeft er geen radioactief gemerkte teststof te worden gebruikt. 
Daarnaast kunnen andere radioactieve en stabiele isotopen worden gebruikt, 
met name als het element verantwoordelijk is voor of onderdeel is van het toxische bestanddeel van de teststof. Indien mogelijk moet het radioactief gemerkte materiaal zich in een metabolisch stabiel gedeelte van het hoofd ­
molecuul (het neemt niet deel aan het metabolisme, wordt niet via de 
stofwisseling uitgescheiden als CO
 2 en wordt geen onderdeel van het kool ­
stofreservoir van het organisme) bevinden. Markering van meerdere locaties of gebieden van het molecuul kan noodzakelijk zijn om de rol van de 
teststof in de stofwisseling te volgen.
 
19. De zuiverheid en de identiteit van de al dan niet radioactief gemerkte test ­
stoffen moeten met geschikte methoden worden geanalyseerd. De radiolo ­
gische zuiverheid van de radioactieve teststof moet van het hoogst bereik ­
bare niveau zijn voor de specifieke teststof (in het ideale geval hoger dan 95 %) en er moeten redelijke inspanningen worden gedaan om onzuiver ­
heden groter dan of gelijk aan 2 % op te sporen. De zuiverheid, de identiteit 
en het aandeel van eventuele geconstateerde onzuiverheden moeten worden 
vermeld. Het is mogelijk dat specifieke regelgevingsprogramma’s aanvul ­
lende aanwijzingen verstrekken met betrekking tot de definitie en specifica ­
ties van uit mengsels bestaande teststoffen en methoden om de zuiverheid 
ervan te bepalen.
 
Keuze van de dosis  
Verkennend onderzoek  
20. Voor het verkennend onderzoek volstaat gewoonlijk één orale dosis. Deze 
dosis moet niet-toxisch zijn, maar hoog genoeg opdat de metabolieten in excreta (en plasma, indien van toepassing) kunnen worden geïdentificeerd 
en voldoen aan de aangegeven doelstelling van het verkennend onderzoek, 
zoals wordt vermeld in punt 12 van deze testmethode.
 
Hoofdonderzoek  
21. Voor het hoofdonderzoek wordt de voorkeur gegeven aan minimaal twee 
doses aangezien de informatie van ten minste twee dosisgroepen kan helpen 
bij het bepalen van de dosering voor ander toxiciteitsonderzoek en bij de 
dosis-responsbepaling van bestaand toxiciteitsonderzoek.  
22. Als twee doses worden toegediend, moeten beide doses hoog genoeg zijn 
opdat de metabolieten in excreta (en plasma, indien van toepassing) kunnen worden geïdentificeerd. Bij de keuze van de dosis moet rekening worden gehouden met informatie op basis van beschikbare toxiciteitsgegevens. Als 
dergelijke informatie niet beschikbaar is (bv. op basis van onderzoek naar 
acute orale toxiciteit waarbij klinische toxiciteitsverschijnselen zijn opge ­
tekend, of op basis van toxiciteitsonderzoek met herhaalde toediening), kan voor de hoogste dosis een waarde worden overwogen die lager is 
dan de geschatte LD
 50 -waarde (oraal en dermaal) of LC  50 -waarde (inhala ­
tie), of die lager is dan de laagste waarde van het geschatte acute toxiciteits ­
bereik. De laagste dosis moet een fractie van de hoogste dosis zijn.  
23. Als een bepaald dosisniveau wordt onderzocht, dient de dosis idealiter hoog 
genoeg te zijn zodat de metabolieten in excreta (en plasma, indien van toepassing) kunnen worden geïdentificeerd, zonder dat dit tot klaarblijkelijke 
toxiciteit leidt. Als er geen tweede dosisniveau is opgenomen, moet dat 
worden gemotiveerd.
 
24. Het is mogelijk dat twee doses niet voldoende zijn voor het bepalen van het 
effect van de dosis op kinetische processen. Ten minste een van de doses 
moet voldoende hoog zijn om deze processen te verzadigen. Als de opper ­
vlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve (area under the curve, AUC) tussen de twee in het hoofdonderzoek gebruikte dosisniveaus niet lineair is, 
vormt dit een duidelijke aanwijzing dat ergens tussen de twee dosisniveaus 
verzadiging optreedt van één of meer kinetische processen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Voor teststoffen met lage toxiciteit moet een maximale dosis van 1 000 
mg/kg lichaamsgewicht (oraal en dermaal) worden toegediend (zie 
hoofdstuk B.2 van deze bijlage voor aanwijzingen betreffende toediening door middel van inhalatie; deze dosis is doorgaans niet hoger dan 2 mg/l). Afhankelijk van de chemische stof en de regelgevingsbehoeften kan het 
noodzakelijk zijn een hogere dosis te gebruiken. De keuze van de dosis 
moet altijd worden gemotiveerd.
 
26. Toxicokinetische gegevens over de eenmalige toediening en gegevens over 
de weefseldistributie afkomstig van onderzoek met eenmalige toediening kunnen volstaan voor het bepalen van de mogelijkheid van accumulatie 
en/of persistentie. In bepaalde gevallen kan herhaalde toediening van de 
dosis echter noodzakelijk zijn i) om een vollediger beeld te krijgen van de mogelijkheid van accumulatie en/of persistentie of veranderingen in de toxicokinetiek (zoals bijvoorbeeld inductie en inhibitie van enzymen), of ii) 
om te voldoen aan de voorschriften van het desbetreffende regelgevings ­
systeem. Bij onderzoek met herhaalde toediening zal herhaalde toediening van een lage dosis meestal volstaan, maar in bepaalde omstandigheden kan eveneens herhaalde toediening van een hoge dosis noodzakelijk zijn (zie 
ook punt 57).
 
Toediening van de teststof  
27. De teststof moet zijn opgelost of homogeen zijn gesuspendeerd in hetzelfde 
medium dat is gebruikt voor het andere toxiciteitsonderzoek met maagsonde 
dat met de teststof is verricht, als informatie daarover beschikbaar is. De keuze van het medium moet worden gemotiveerd. Bij de opzet van het onderzoek moet aandacht worden besteed aan de keuze van het medium 
en het doseringsvolume. Gewoonlijk wordt de teststof toegediend via een 
maagsonde; toediening via gelatinecapsules of vermengd met het voer kan in bepaalde gevallen de voorkeur verdienen (in beide gevallen moet een motivering worden gegeven). De aan elk dier werkelijk toegediende dosis 
dient te worden geverifieerd.
 
28. Het maximale vloeistofvolume dat tegelijkertijd via een orale maagsonde 
moet worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van de proefdieren, het soort toedieningsmedium en de vraag of de proefdieren nuchter zijn 
voordat de teststof wordt toegediend. Het verstrekken of beperken van het 
voedsel voor toediening van de dosis moet worden gemotiveerd. Normaal gesproken moet het volume van zowel waterige als niet-waterige media zo laag mogelijk worden gehouden. De dosisvolumes bij knaagdieren mogen 
10 ml/kg lichaamsgewicht normaal gezien niet overschrijden. Voor meer 
lipofiele teststoffen worden mediavolumes vanaf 4 ml/kg lichaamsgewicht gebruikt. Voor herhaalde dosering, waarbij dagelijks vasten is gecontra-indiceerd, moeten lagere dosisvolumes (bijvoorbeeld 2-4 ml/kg li ­
chaamsgewicht) worden overwogen. Indien mogelijk kan het gebruik van 
een dosisvolume worden overwogen dat consistent is met het volume dat is toegediend bij ander onderzoek met orale maagsonde dat voor een teststof is verricht.
 
29. Aan de hand van intraveneuze toediening van de teststof en meting van de 
teststof in het bloed en/of de excreta kan de biologische beschikbaarheid of 
de relatieve orale absorptie worden vastgesteld. Bij intraveneus onderzoek wordt een eenmalige dosis (gewoonlijk gelijkwaardig aan maar niet hoger dan de laagste orale dosis; zie de informatie over de keuze van de dosis) van 
de teststof toegediend met een geschikt medium. Dit materiaal moet in een 
passende hoeveelheid (bijvoorbeeld 1 ml/kg lichaamsgewicht) via de geko ­
zen locatie worden toegediend aan ten minste vier dieren van het juiste geslacht (mits gerechtvaardigd mogen beide geslachten worden gebruikt; 
zie punt 16). Bij intraveneuze toediening van de teststof moet een volledig 
opgelost of gesuspendeerd dosispreparaat worden gebruikt. Het medium
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
voor intraveneuze toediening mag de integriteit of de doorstroming van het 
bloed niet verstoren. Als de teststof via een infuus wordt toegediend, moet 
de infusiesnelheid worden vermeld en tussen de dieren worden gestandaar ­
diseerd, mits een infuuspomp wordt gebruikt. Er moet een verdovingsmiddel worden gebruikt als de halsader wordt gecanuleerd (voor toediening van de 
teststof en/of aftapping van bloed) of als de dijbeenslagader wordt gebruikt 
voor de toediening. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan het soort verdoving dat wordt toegepast, aangezien dit de toxicokinetiek kan beïnvloeden. De dieren moeten in de gelegenheid worden gesteld zich vol ­
doende te herstellen voordat de teststof en het medium worden toegediend.
 
30. Ook andere toedieningswegen, zoals de dermale of de inhalatieweg (zie de 
punten 74-78), kunnen worden toegepast bij bepaalde teststoffen, afhanke ­
lijk van hun fysisch-chemische eigenschappen en het verwachte gebruik of 
de verwachte blootstelling bij de mens.  
Metingen  
Massabalans  
31. De massabalans wordt bepaald door het percentage toegediende (radioactie ­
ve) dosis dat via de urine, de feces en de uitgeademde lucht is uitgescheiden op te tellen bij het percentage dat in de weefsels, het resterende karkas en de wasvloeistof van de kooi aanwezig is (zie punt 46). In het algemeen wordt 
een totale recovery van de toegediende teststof (radioactiviteit) van ca. > 
90 % als afdoende beschouwd.
 
Absorptie  
32. Een eerste schatting van de absorptie kan worden verkregen door het per ­
centage van de dosis in het maag-darmkanaal en/of de feces uit te sluiten bij 
het bepalen van de massabalans. Zie punt 33 voor informatie over het 
berekenen van het absorptiepercentage. Zie de punten 44-49 voor informatie over het onderzoeken van de excreta. Als de exacte mate van absorptie na orale toediening van de dosis niet kan worden vastgesteld op basis van 
massabalansonderzoek (bv. wanneer meer dan 20 % van de toegediende 
dosis aanwezig is in de feces), kan nader onderzoek noodzakelijk zijn. Dit onderzoek moet hetzij 1) de orale toediening van de teststof en de meting van de teststof in de gal, hetzij 2) de orale en intraveneuze toedie ­
ning van de teststof en de meting van de nettohoeveelheid teststof die aan ­
wezig is in de urine plus de uitgeademde lucht plus het karkas voor elk van beide toedieningswegen, omvatten. Welke van beide onderzoeksopzetten ook wordt gekozen, de meting van de radioactiviteit wordt verricht als 
surrogaatmethode voor de stofspecifieke analyse van de teststof plus meta ­
bolieten.
 
33. Als de galexcretie wordt onderzocht, wordt gewoonlijk de orale toedienings ­
weg gebruikt. Bij dit onderzoek worden de galwegen van ten minste vier 
dieren van het juiste geslacht (of beide geslachten, indien gerechtvaardigd) gecanuleerd en wordt een eenmalige dosis van de teststof toegediend. Na toediening van de teststof wordt de galexcretie gecontroleerd op radioacti ­
viteit/teststof zolang dit noodzakelijk is om een schatting te kunnen maken 
van het percentage toegediende dosis dat via deze weg wordt uitgescheiden. Op basis hiervan kan rechtstreeks de mate van orale absorptie worden berekend:
 
absorptiepercentage  ¼ ðhoeveelheid in gal þ urine þ uitgeademde lucht  þ 
karkas exclusief de inhoud van het maag  Ä darmkanaalÞ= 
toegediende hoeveelheid  Ü 100 
34. Bij sommige categorieën chemische stoffen kan rechtstreekse uitscheiding 
van de geabsorbeerde dosis plaatsvinden via de intestinale membranen. In 
dergelijke gevallen wordt meting van het percentage dosis in de feces na 
orale toediening aan ratten met gecanuleerde galwegen niet geacht represen ­
tatief te zijn voor de niet-geabsorbeerde dosis. Als intestinale secretie wordt vermoed, is het raadzaam om het percentage geabsorbeerde dosis te baseren 
op de absorptie die is berekend op basis van een vergelijking van de uit ­
scheiding na de orale toediening en de intraveneuze toediening (intacte ratten of ratten met gecanuleerde galwegen) (zie punt 35). Als kwantifice ­
ring van de intestinale secretie noodzakelijk wordt geacht, is het daarnaast 
raadzaam om de uitscheiding bij ratten met gecanuleerde galwegen te meten 
na intraveneuze toediening van de dosis.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biologische beschikbaarheid  
35. De biologische beschikbaarheid kan worden bepaald op basis van de kine ­
tiek in het plasma/bloed van de orale en intraveneuze groepen, zoals be ­
schreven in de punten 50-52, door middel van een specifieke chemische 
analyse van de teststof en/of relevante metabolieten; hiervoor is derhalve 
geen radioactief gemerkte teststof vereist. De biologische beschikbaarheid (F) van de teststof of relevante metabolieten kan dan als volgt worden berekend:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðdosis  IV=dosis  exp Þ 
Hierbij is AUC de oppervlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve en exp 
de toedieningsweg (oraal, dermaal of via inhalatie).  
36. Met het oog op de risicobeoordeling van systemische effecten wordt in het 
algemeen de voorkeur gegeven aan de biologische beschikbaarheid van het 
toxische bestanddeel boven het absorptiepercentage voor het vergelijken van 
systemische concentraties die zijn vastgesteld in het kader van onderzoek bij dieren met gelijkwaardige biomonitoringgegevens die afkomstig zijn van blootstellingsonderzoek onder werknemers. De complexiteit kan toenemen 
als de doses in het niet-lineaire bereik liggen. Het is daarom belangrijk dat 
bij de toxicokinetische screening de doses in het lineaire bereik worden bepaald.
 
Weefseldistributie  
37. Kennis van de weefseldistributie van een teststof en/of de metabolieten 
ervan is van belang voor de identificatie van doelweefsels en een beter begrip van het onderliggende toxiciteitsmechanisme, alsook voor het ver ­
krijgen van informatie over de mogelijkheid van accumulatie en persistentie 
van teststof en metabolieten. Het percentage totale (radioactieve) dosis in de 
weefsels en het resterende karkas moet ten minste worden gemeten bij beëindiging van het uitscheidingsexperiment (gewoonlijk zeven dagen of minder na toediening van de dosis, afhankelijk van het gedrag van de 
specifieke teststof). Als er bij beëindiging van het onderzoek geen teststof 
wordt gevonden in weefsels (bv. omdat de teststof vanwege zijn korte hal ­
veringstijd vóór de beëindiging van het onderzoek is verdwenen), moet erop worden gelet dat de gegevens niet verkeerd worden geïnterpreteerd. In 
dergelijke gevallen moet de weefseldistributie worden onderzocht ten tijde 
van de piekconcentratie van de teststof (en/of metabolieten) in het plasma/ bloed (T
 max ) of de hoogste uitscheiding via de urine, naargelang hetgeen 
van toepassing is (zie punt 38). Daarnaast kan het noodzakelijk zijn vaker 
weefsels te verzamelen om de weefseldistributie van de teststof en/of de 
metabolieten ervan te bepalen, zodat de tijdafhankelijkheid kan worden geëvalueerd (indien van toepassing) en de massabalans kan worden bepaald, indien een bevoegde autoriteit dat verlangt. De weefsels die moeten worden 
verzameld, omvatten lever, vet, maag-darmkanaal, nier, milt, volledig bloed, 
resterend karkas, weefsels van doelorganen en andere weefsels, bijvoorbeeld schildklier, erytrocyten, voortplantingsorganen, huid, oog (met name bij gepigmenteerde dieren) die mogelijk van belang zijn voor de toxicologische 
evaluatie van de teststof. Er moet worden overwogen aanvullende weefsels 
op dezelfde tijdstippen te analyseren om de dieren zo doelmatig mogelijk te gebruiken en indien bij onderzoek naar de subchronische en/of chronische toxiciteit doelorgaantoxiciteit wordt waargenomen. Ook de concentratie van 
(radioactieve) residuen en de verhouding weefsel/plasma (bloed) moeten 
worden vermeld.
 
38. Het is mogelijk dat ook de weefseldistributie op aanvullende tijdstippen, 
zoals ten tijde van de piekconcentratie in het plasma/bloed (bijvoorbeeld T
 max ) of de hoogste uitscheiding via de urine, die zijn verkregen op basis 
van het desbetreffende onderzoek naar de kinetiek in het plasma/bloed of de 
uitscheiding, moet worden geëvalueerd of dat dit door een bevoegde auto ­
riteit wordt verlangd. Deze informatie kan nuttig zijn om een beter begrip te krijgen van de toxiciteit en de mogelijkheid van accumulatie en persistentie van de teststof en metabolieten. De keuze van de monsters moet worden 
gemotiveerd; de monsters voor de analyse moeten in het algemeen gelijk 
zijn aan die welke hierboven worden vermeld (zie punt 37).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Bij onderzoek naar de weefseldistributie kan radioactiviteit worden gekwan ­
tificeerd door middel van sectie op de organen, homogenisering, verbran ­
ding en/of solubilisatie, gevolgd door een vloeistofscintillatietelling van de ingesloten residuen. Bepaalde technieken die momenteel worden ontwik ­
keld, zoals Quantitative whole-body autoradiography en receptor microsco ­
pic autoradiography, kunnen nuttig zijn bij het bepalen van de verdeling van 
een teststof over de organen en/of weefsels (3)(4).
 
40. Voor andere blootstellingsroutes dan de orale moeten specifieke weefsels 
worden verzameld en geanalyseerd, zoals de longen bij inhalatieonderzoek 
en de huid bij dermaal onderzoek. Zie hiervoor de punten 74-78.  
Metabolisme  
41. Excreta (en plasma, indien van toepassing) moeten worden verzameld ter 
identificatie en kwantificering van de onveranderde teststof en metabolieten, zoals beschreven in de punten 44-49. Samenvoeging van de excreta is aan ­
vaardbaar ter vereenvoudiging van de identificatie van metabolieten binnen 
een specifieke dosisgroep. Profilering van de metabolieten uit elke periode wordt aanbevolen. Als dit vanwege een gebrek aan monsters en/of radio ­
activiteit niet mogelijk is, is het samenvoegen van op diverse tijdstippen 
verzamelde urine en feces aanvaardbaar, maar het samenvoegen daarvan 
voor de geslachten of doses is niet aanvaardbaar. Er moeten passende kwa ­
litatieve en kwantitatieve methoden worden toegepast om urine, feces, door de behandelde dieren uitgeademde radioactiviteit en gal, indien van toepas ­
sing, te analyseren.
 
42. Er moeten redelijke inspanningen worden gedaan om alle metabolieten te 
identificeren die 5 % of meer van de toegediende dosis uitmaken en een 
metabolismeschema op te stellen voor de teststof. Teststoffen waarvan de 
aanwezigheid in de excreta in concentraties van 5 % of hoger van de toe ­
gediende dosis is vastgesteld, moeten worden geïdentificeerd. Hiermee wordt bedoeld dat de exacte structuur van de bestanddelen moet worden 
bepaald. Doorgaans wordt de identiteit van de stoffen bepaald door middel 
van co-chromatografie van de metaboliet aan de hand van bekende normen met behulp van twee ongelijke systemen of technieken die een positieve identificatie van de structuur mogelijk maken, zoals massaspectrometrie, 
kernspinresonantie (nuclear magnetic resonance, NMR) enz. In geval van 
co-chromatografie worden chromatografische technieken waarbij dezelfde stationaire fase wordt gebruikt met twee verschillende oplossingssystemen niet geacht een adequate verificatie van de identiteit van de metaboliet met 
behulp van twee methoden op te leveren, aangezien de toegepaste methoden 
niet onafhankelijk van elkaar zijn. Voor de identificatie met behulp van co-chromatografie moeten twee ongelijke, onafhankelijke analysesystemen worden gebruikt, zoals dunnelaagchromatografie (thin layer chromatogra ­
phy, TLC) met omgekeerde en normale fase en hogedrukvloeistofchroma ­
tografie (high performance liquid chromatography, HPLC). Mits de chroma ­
tografische scheiding van voldoende hoge kwaliteit is, is aanvullende be ­
vestiging door middel van spectroscopie niet noodzakelijk. Als alternatief 
kan ondubbelzinnige identificatie worden verkregen met behulp van metho ­
den die informatie over de structuur bieden zoals: vloeistofchromatografie/ massaspectrometrie (LC-MS), of vloeistofchromatografie/tandemmassaspec ­
trometrie (LC-MS/MS), gaschromatografie/massaspectrometrie (GC-MS) en 
NMR-spectrometrie.
 
43. Als het niet mogelijk is metabolieten met 5 % of hoger van de toegediende 
dosis te identificeren, moet een rechtvaardiging/toelichting in het eindverslag 
worden opgenomen. Het kan passend zijn om metabolieten die minder dan 
5 % van de toegediende dosis vertegenwoordigen te identificeren om een beter begrip te verwerven van de metabole route met het oog op de beoor ­
deling van de gevaren en/of risico’s die aan de teststof kleven. Zo mogelijk 
moet de structuur worden bevestigd. Hiertoe kan een metabool profiel in het 
plasma, bloed of andere weefsels worden opgesteld.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Uitscheiding  
44. De snelheid en omvang van de uitscheiding van de toegediende dosis 
moeten worden bepaald door het percentage (radioactieve) dosis te meten dat is teruggevonden in urine, feces en uitgeademde lucht. Aan de hand van 
deze gegevens kan tevens de massabalans worden bepaald. De in de urine, 
feces en uitgeademde lucht verwijderde hoeveelheden van de teststof (radioactiviteit) moeten met de juiste tussenpozen worden bepaald (zie de punten 47-49). Experimenten met herhaalde toediening moeten zodanig 
worden opgezet dat het mogelijk is uitscheidingsgevens te verzamelen over ­
eenkomstig de doelstellingen die in punt 26 worden beschreven. Op die manier kunnen experimenten met eenmalige toediening met elkaar worden 
vergeleken.
 
45. Als uit verkennend onderzoek is gebleken dat er geen significante hoeveel ­
heid van de teststof (radioactiviteit) (overeenkomstig punt 49) in de uit ­
geademde lucht wordt uitgescheiden, hoeft de uitgeademde lucht in het 
definitieve onderzoek niet te worden verzameld.  
46. Elk dier wordt in een aparte behuizing geplaatst zodat de excreta (urine, 
feces en uitgeademde lucht) kunnen worden verzameld. Aan het einde van elke verzamelperiode (zie de punten 47-49) worden deze metabole eenheden 
gereinigd met een geschikt oplosmiddel (het „uitwassen”) om ervoor te 
zorgen dat zo veel mogelijk teststof (radioactiviteit) wordt teruggevonden. Het verzamelen van excreta moet worden beëindigd na zeven dagen of, indien dit eerder plaatsvindt, nadat 90 % van de toegediende dosis is terug ­
gevonden.
 
47. De totale hoeveelheden van de teststof (radioactiviteit) in de urine dienen op 
ten minste twee tijdstippen op dag 1 van de verzameling te worden bepaald, 
eenmaal 24 uur na toediening van de dosis en daarna dagelijks totdat het onderzoek wordt beëindigd. Het wordt aangeraden op dag 1 meer dan twee bemonsteringstijdstippen (bv. om 6, 12 en 24 uur) te kiezen. De resultaten 
van verkenned onderzoek moeten worden geanalyseerd om informatie te 
verkrijgen over alternatieve of aanvullende bemonsteringstijdstippen. Wan ­
neer een ander bemonsteringsschema wordt gebruikt, moet hiervoor een motivering worden gegeven.
 
48. De totale hoeveelheden van de teststof (radioactiviteit) in feces dienen da ­
gelijks te worden bepaald, vanaf 24 uur na toediening van de dosis totdat 
het onderzoek wordt beëindigd, tenzij op grond van modelonderzoek alter ­
natieve of aanvullende bemonsteringstijdstippen worden aangeraden. Wan ­
neer een ander bemonsteringsschema wordt toegepast, moet dit worden gemotiveerd.
 
49. Het verzamelen van uitgeademd CO  2 en andere vluchtige stoffen tijdens een 
onderzoeksexperiment kan worden gestaakt wanneer in de uitgeademde 
lucht minder dan 1 % van de toegediende dosis wordt gevonden in de 
loop van een bemonsteringsperiode van 24 uur.  
Onderzoek naar het tijdsverloop  
Kinetiek in plasma/bloed  
50. Dit onderzoek heeft tot doel schattingen te verkrijgen van toxicokinetische 
basisparameters (bijvoorbeeld C  max , T max , halveringstijd (t  1/2 ), AUC) voor 
de teststof. Dergelijk onderzoek kan worden verricht met één dosis of, bij 
voorkeur, met twee of meer doses. De dosering wordt bepaald door de aard 
van het experiment en/of het onderzochte vraagstuk. Om antwoord te geven op vraagstukken over bijvoorbeeld de biologische beschikbaarheid van de teststof en/of het effect van de dosis op de zuivering door de nieren (bv. om 
te verduidelijken of afhankelijk van de dosering verzadiging van de zui ­
vering optreedt) kunnen kinetische gegevens noodzakelijk zijn.
 
51. Voor dergelijk onderzoek moeten per dosisgroep ten minste vier dieren van 
hetzelfde geslacht worden gebruikt. Het gebruikte geslacht dient te worden gemotiveerd. Als er voldoende aanwijzingen zijn om aan te nemen dat er significante verschillen in toxiciteit zijn die samenhangen met het geslacht, 
moet het gebruik van beide geslachten (vier mannetjes en vier vrouwtjes) 
worden overwogen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Na toediening van de teststof (radioactief gemerkt) moeten op geschikte 
bemonsteringstijdstippen van elk dier bloedmonsters worden genomen vol ­
gens de passende bemonsteringsmethode. De hoeveelheid en het aantal bloedmonsters die per dier kunnen worden afgenomen kunnen worden be ­
perkt door de mogelijke effecten van de herhaalde bemonstering op de 
gezondheid/fysiologie van het dier en/of de gevoeligheid van de analyse ­
methode. De monsters moeten voor elk dier afzonderlijk worden geanaly ­
seerd. In bepaalde gevallen (bijvoorbeeld met het oog op de karakterisering van metabolieten) kan het noodzakelijk zijn monsters van meerdere dieren 
samen te voegen. Samengevoegde monsters moeten duidelijk als zodanig 
worden gemarkeerd en er moet een motivering worden gegeven voor het samenvoegen. Als een radioactief gemerkte teststof wordt gebruikt, kan een analyse van de totaal aanwezige radioactiviteit toereikend zijn. In dat geval 
wordt de totale radioactiviteit geanalyseerd in volledig bloed en plasma of 
plasma en rode bloedcellen om berekening van de verhouding bloed/plasma mogelijk te maken. In andere gevallen kan nader onderzoek noodzakelijk zijn waarvoor identificatie van de oorspronkelijke verbinding en/of metabo ­
lieten vereist is of ter beoordeling van de eiwitbinding.
 
Kinetiek in andere weefsels  
53. Dit onderzoek heeft tot doel tijdgebonden informatie te verkrijgen met be ­
trekking tot vraagstukken die verband houden met de toxische werkings ­
wijze, bioaccumulatie en biopersistentie door de niveaus van de teststof in 
uiteenlopende weefsels te bepalen. Welke weefsels worden gekozen en hoe ­
veel tijdstippen worden geëvalueerd is afhankelijk van het te onderzoeken weefsel en de toxicologische databank voor de teststof. Bij het opzetten van aanvullend onderzoek naar de kinetiek in weefsels moet rekening worden 
gehouden met de informatie die overeenkomstig de punten 37-40 is ver ­
zameld. Dit onderzoek kan worden verricht met eenmalige of herhaalde toediening. De gekozen aanpak moet nader worden gemotiveerd.
 
54. Er kan onderzoek naar kinetiek in andere weefsels worden verricht:  
— als er aanwijzingen zijn voor een verlengde halveringstijd in bloed, wat 
zou kunnen wijzen op de mogelijke accumulatie van de teststof in di ­
verse weefsels, of  
— om te zien of een stabiele waarde is bereikt voor bepaalde weefsels (bij 
onderzoek met herhaalde toediening kan het bv. interessant zijn te be ­
palen of er ook een stabiele waarde is bereikt in de doelweefsels, ook al 
is er in het bloed blijkbaar een stabiele waarde voor de teststof bereikt).  
55. Voor dergelijk onderzoek naar het tijdsverloop dient een passende orale 
dosis van de teststof te worden toegediend aan ten minste vier dieren per 
dosis per tijdstip en het tijdsverloop van de distributie in geselecteerde weefsels te worden gevolgd. Hierbij mogen dieren van één geslacht worden gebruikt, tenzij geslachtsspecifieke toxiciteit wordt waargenomen. Of de 
totale radioactiviteit of de oorspronkelijke chemische stof en/of metabolieten 
worden geanalyseerd, is mede afhankelijk van het onderzochte vraagstuk. De beoordeling van de weefseldistributie dient te worden verricht met ge ­
bruikmaking van passende technieken.
 
Inductie/remming van enzymen  
56. Het is mogelijk dat onderzoek moet worden verricht naar de mogelijke 
effecten van inductie/remming van enzymen of biotransformatie van de onderzochte teststof als aan één of meer van de volgende voorwaarden wordt voldaan:
 
1. de beschikbare gegevens wijzen op een verband tussen de biotransfor ­
matie van de teststof en een verhoogde toxiciteit;  
2. de beschikbare toxiciteitsgegevens wijzen op een niet-lineair verband 
tussen dosis en metabolisme;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. de resultaten van onderzoek dat was gericht op de identificatie van 
metabolieten wijzen op een mogelijk toxische metaboliet die het resultaat 
kan zijn van een enzympad dat door de teststof wordt geïnduceerd;  
4. effecten waarvan men vermoed dat ze verband houden met enzyminduc ­
tie zouden door dergelijk onderzoek kunnen worden verklaard;  
5. als er vanuit toxicologisch opzicht significante veranderingen in het me ­
tabole profiel van de teststof worden waargenomen tijdens proeven in vitro of in vivo met verschillende diersoorten of onder verschillende omstandigheden, kan karakterisering van de betrokken enzymen nood ­
zakelijk zijn (bijvoorbeeld fase I-enzymen zoals de iso-enzymen van het 
cytochroom P450-afhankelijk mono-oxygenasesysteem, fase II-enzymen zoals de iso-enzymen van sulfotransferase of UDP-glucuronyltransferase of andere relevante enzymen). Deze informatie kan worden gebruikt om 
het belang van bepaalde soorten voor extrapolatie naar andere soorten te 
evalueren.
 
57. Er moeten passende onderzoeksprotocollen worden gebruikt om veranderin ­
gen in de toxicokinetiek die verband houden met de teststof te evalueren, 
mits deze gevalideerd en voorzien zijn van een passende motivering. Voor ­
beelden van onderzoeksopzetten zijn onderzoek met herhaalde toediening van een niet-gemerkte teststof, gevolgd door een eenmalige radioactief ge ­
merkte dosis op dag 14, of met herhaalde toediening van een radioactief 
gemerkte teststof en bemonstering op dag 1, 7 en 14 om de metabole 
profielen te bepalen. Herhaalde toediening van een radioactief gemerkte teststof kan ook informatie opleveren over bioaccumulatie (zie punt 26).
 
AANVULLENDE BENADERINGEN  
58. Benaderingen in aanvulling op de proeven in vivo die in deze testmethode 
worden beschreven, kunnen nuttige informatie verschaffen over de absorp ­
tie, de distributie, het metabolisme of de verwijdering van een teststof bij 
bepaalde diersoorten.  
Gebruik van in-vitro-informatie  
59. Met behulp van de juiste testsystemen kunnen bij onderzoek in vitro vraag ­
stukken in verband met het metabolisme van de teststof worden onderzocht. Pas geïsoleerde of gekweekte hepatocyten en subcellulaire fracties (bv. mi ­
crosomen en cytosol of S9-fractie) uit de lever kunnen worden gebruikt om 
mogelijke metabolieten te onderzoeken. Het lokaal metabolisme van het doelorgaan, bv. de long, kan van belang zijn voor de risicobeoordeling. Hiertoe kunnen microsomiale fracties van doelweefsels van nut zijn. Onder ­
zoek op het gebied van microsomen kan dienen om mogelijke, van het 
geslacht en het levensstadium afhankelijke verschillen te onderzoeken en enzymparameters (K
 m en V  max ) te karakteriseren die kunnen helpen bij 
het beoordelen van de mate waarin de dosisafhankelijkheid van het meta ­
bolisme reageert op verschillende blootstellingsniveaus. Daarnaast kunnen 
met behulp van microsomen de specifieke bij het metabolisme van de test ­
stof betrokken microsomiale enzymen worden geïdentificeerd die relevant kunnen zijn voor de extrapolatie naar andere soorten (zie ook punt 56). De 
mogelijkheid van inductie van biotransformatie kan ook worden onderzocht 
met behulp van subcellulaire fracties uit de lever (bv. microsomen en cyto ­
sol) van dieren die vooraf zijn behandeld met de onderzochte teststof, in vitro via onderzoek naar de inductie van hepatocyten of op basis van spe ­
cifieke cellijnen waarin specifieke enzymen tot expressie komen. In be ­
paalde gevallen en onder de juiste omstandigheden kan worden overwogen subcellulaire fracties van menselijke weefsels te gebruiken bij het bepalen van mogelijke soortafhankelijke verschillen op het gebied van biotransfor ­
matie. De resultaten van onderzoek in vitro kunnen ook nuttig zijn bij het 
ontwikkelen van PBTK-modellen (5).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Onderzoek in vitro naar dermale absorptie kan aanvullende informatie op ­
leveren voor het karakteriseren van de absorptie (6).  
61. Met primaire celculturen van levercellen en verse weefselcoupes kunnen 
vergelijkbare vraagstukken worden onderzocht als met levermicrosomen. 
In bepaalde gevallen kunnen cellijnen waarin het relevante enzym tot spe ­
cifieke expressie komt of genetisch aangepaste cellijnen antwoord verschaf ­
fen op specifieke vragen. In andere gevallen kan het nuttig zijn de inductie 
en de remming van specifieke cytochrome P450-iso-enzymen (bv. CYP1A1, 2E1, 1A2 e.a.) en/of van fase II-enzymen door de oorspronkelijke verbin ­
ding door middel van onderzoek in vitro te bestuderen. De verkregen in ­
formatie kan nut hebben voor verbindingen met een verwante structuur.
 
Het gebruik van toxicokinetische gegevens uit toxiciteitsonderzoek als 
aanvullende informatie  
62. Aan de analyse van bloed-, weefsel- en/of excretamonsters die zijn ver ­
kregen tijdens ander toxiciteitsonderzoek kunnen gegevens worden ontleend 
over de biologische beschikbaarheid, veranderingen in de plasmaconcentra ­
tie in de tijd (AUC, C  max ), de mogelijkheid van bioaccumulatie, de zui ­
veringssnelheid en van het geslacht of het levensstadium afhankelijke ver ­
anderingen in metabolisme en kinetiek.  
63. Aan de hand van de onderzoeksopzet kunnen vraagstukken worden onder ­
zocht in verband met: de verzadiging van de absorptie-, biotransformatie- of uitscheidingsroutes bij hogere doseringen; de werking van nieuwe metabole 
routes bij hogere doseringen en de beperking van toxische metabolieten tot 
hogere doseringen.
 
64. In verband met de beoordeling van de gevaren kunnen ook de volgende 
vraagstukken worden onderzocht:  
— leeftijdsafhankelijke gevoeligheid vanwege verschillen in status van de 
bloed-hersenbarrière, de nieren en/of het detoxificatievermogen;  
— de gevoeligheid van subpopulaties voor verschillen in biotransformatie ­
vermogen of andere toxicokinetische verschillen;  
— de mate van blootstelling van de foetus als gevolg van de transplacentale 
overdracht van chemische stoffen of van het pasgeboren jong als gevolg 
van de lactatie.  
Het gebruik van toxicokinetische modellering  
65. Toxicokinetische modellen kunnen van nut zijn voor diverse aspecten van 
de gevaar- en risicobeoordeling, zoals het voorspellen van de systemische blootstelling en de interne dosis in weefsels. Daarnaast kunnen specifieke vragen over de werkingswijze worden onderzocht en deze modellen kunnen 
de basis vormen voor de extrapolatie naar andere soorten, blootstellings ­
routes, doseringspatronen en de risicobeoordeling bij de mens. Gegevens die nuttig zijn voor het ontwikkelen van PBTK-modellen voor een teststof bij een willekeurige soort omvatten 1) partitiecoëfficiënten, 2) biochemische 
constanten en fysiologische parameters, 3) routespecifieke absorptieparame ­
ters en 4) kinetische in-vivogegevens voor de evaluatie van modellen (bij ­
voorbeeld zuiveringsparameters voor relevante (> 10 %) uitscheidingsroutes, K
 m en V  max voor het metabolisme]. De experimentele gegevens die worden 
gebruikt bij het ontwikkelen van modellen moeten met wetenschappelijk 
verantwoorde methoden worden gegenereerd en de modelresultaten moeten worden gevalideerd. Vaak worden aan de hand van voor de teststof en diersoort specifieke parameters als de absorptiesnelheid, de partitionering 
van bloed en weefsel en de metabole constanten niet-gecompartimenteerde 
of op de fysiologie gebaseerde modellen ontwikkeld (7).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
66. Het verdient aanbeveling een inhoudsopgave op te nemen in het onder ­
zoeksverslag.  
Hoofdtekst van het verslag  
67. De hoofdtekst van het verslag moet de in deze testmethode behandelde 
informatie bevatten, die als volgt is onderverdeeld in afdelingen en punten:  
Samenvatting  
68. In deze afdeling van het onderzoeksverslag moeten een samenvatting van de 
onderzoeksopzet en een beschrijving van de gebruikte methoden worden 
opgenomen. Daarnaast moet aandacht worden besteed aan de voornaamste bevindingen op het gebied van de massabalans, de aard en omvang van de metabolieten, weefselresiduen, de zuiveringssnelheid, de mogelijkheid van 
bioaccumulatie, geslachtsafhankelijke verschillen enz. De samenvatting moet 
voldoende gedetailleerd zijn om evaluatie van de bevindingen mogelijk te maken.
 
Inleiding  
69. In deze afdeling van het verslag moeten de doelstellingen, de motivering en 
de opzet van het onderzoek worden beschreven, alsmede passende referen ­
ties en eventuele achtergrondinformatie worden verschaft.  
Materialen en methoden  
70. In deze afdeling van het verslag moet een gedetailleerde beschrijving van 
alle ter zake doende informatie worden opgenomen:  
a) Teststof  
In deze onderafdeling moet de aard van de teststof worden beschreven: 
de chemische naam, de moleculaire structuur, de kwalitatieve en kwan ­
titatieve analyse van de chemische samenstelling, de chemische zuiver ­
heid en zo mogelijk de aard en de hoeveelheden van eventuele onzui ­
verheden. Daarnaast moet informatie over de fysisch-chemische eigen ­
schappen worden opgenomen, met inbegrip van de fysische toestand, de 
kleur, de algemene oplosbaarheid en/of de partitiecoëfficiënt, de stabili ­
teit, en, indien van toepassing, de corrosiviteit. Daarnaast moet informa ­
tie over eventuele isomeren worden verstrekt, indien van toepassing. Als de teststof radioactief gemerkt is, moet ook de volgende informatie wor ­
den opgenomen: het soort radio-isotoop, de positie van het radioactief 
merkteken, de specifieke activiteit en de radiochemische zuiverheid.
 
Verder dient te worden beschreven wat voor soort media, verdunnings ­
middelen, suspenderingsmiddelen en emulgatoren of andere materialen 
bij het toedienen van de teststof zijn gebruikt;  
b) Proefdieren  
Deze onderafdeling moet informatie bevatten over de proefdieren, alsook 
over de keuze van de diersoort, de stam en de leeftijd bij aanvang van 
het onderzoek, het geslacht, het lichaamsgewicht, de gezondheidstoe ­
stand en de verzorging van de dieren, samen met een motivering;  
c) Methoden  
Deze onderafdeling bevat bijzonderheden van de onderzoeksopzet en de 
gebruikte methodologie, met inbegrip van:  
1) een motivering voor eventuele aanpassingen van de blootstellings ­
route en de blootstellingsomstandigheden, indien van toepassing;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) een motivering voor de keuze van de dosisniveaus;  
3) een beschrijving van verkennend onderzoek dat is gebruikt bij het 
opzetten van de proeven van het vervolgonderzoek, indien van toe ­
passing. Er moeten ondersteunende gegevens van verkennend onder ­
zoek worden verstrekt;  
4) de manier waarop de doseeroplossing is bereid en het soort oplos ­
middel of medium dat is gebruikt, indien van toepassing;  
5) het aantal behandelingsgroepen en het aantal dieren in elke groep;  
6) de doseringsniveaus en -hoeveelheden (en de specifieke activiteit 
van de dosis bij gebruik van radioactiviteit);  
7) de toedieningsweg(en) en -methoden;  
8) de doseerfrequenties;  
9) de vastperiode (indien van toepassing);  
10) de totale radioactiviteit per dier;  
11) de behandeling van dieren;  
12) de bemonstering en de behandeling van de monsters;  
13) de analysemethoden die zijn gebruikt voor het scheiden, kwantifice ­
ren en identificeren van de metabolieten;  
14) de detectiegrens voor de toegepaste methoden;  
15) andere metingen en procedures die tijdens het onderzoek zijn uitge ­
voerd (met inbegrip van de validatie van de methoden voor de 
analyse van metabolieten).  
d) Statistische analyse  
Als gebruik wordt gemaakt van statistische analyse om de bevindingen 
van het onderzoek te analyseren, moet het verslag voldoende informatie over de analysemethode en het gebruikte computerprogramma bevatten, zodat een onafhankelijke evaluator/statisticus de analyse kan beoordelen 
en reconstrueren.
 
Ingeval van onderzoek aan de hand van systeemmodellen zoals PBTK 
moeten de gepresenteerde modellen een volledige modelomschrijving omvatten om onafhankelijke reconstructie en validatie van het model 
mogelijk te maken (zie punt 65 en het aanhangsel: Definities).
 
Resultaten  
71. Alle gegevens in deze afdeling moeten worden samengevat en in tabelvorm 
worden gepresenteerd, voorzien van een passende statistische evaluatie en 
een beschrijving. De gegevens van de radioactiviteitsbepaling moeten op passende wijze worden samengevat en gepresenteerd, gewoonlijk als microgram- of milligramequivalent per monstermassa, hoewel ook andere 
eenheden mogen worden gebruikt. Neem in deze afdeling grafische illustra ­
ties van de bevindingen, reproducties van representatieve chromatografische en spectrometrische gegevens, gekwantificeerde/geïdentificeerde metabolie ­
ten en de voorgestelde metabole routes, inclusief de moleculaire structuur 
van de metabolieten, op. Neem daarnaast ook de volgende informatie op, 
indien van toepassing:
 
1) de hoeveelheid en het percentage teruggevonden radioactiviteit in de 
urine, de feces, de uitgeademde lucht alsmede de wasvloeistof uit de 
kooien.  
— Neem in geval van huidonderzoek ook gegevens op over de recovery 
van de teststof van de behandelde huid, de wasvloeistof na het was ­
sen van de huid en de resterende radioactiviteit in het toestel dat de huid bedekt en de metabole eenheid, alsmede de resultaten van het 
onderzoek waarbij de huid wordt gewassen. Zie de punten 74-77 
voor nadere informatie.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— Neem in geval van inhalatieonderzoek ook gegevens op over de 
recovery van de teststof uit de longen en weefsels uit de neus (8). 
Zie punt 78 voor nadere informatie.  
2) de weefseldistributie uitgedrukt als percentage van de toegediende dosis 
en de concentratie (microgramequivalenten per gram weefsel), alsmede de verhouding weefsel-bloed of weefsel-plasma;
 
3) de materiaalbalans die is opgemaakt op basis van de verschillende stu ­
dies aan de hand van de analyse van lichaamsweefsels en excreta;  
4) plasmaconcentraties en toxicokinetische parameters (biologische beschik ­
baarheid, AUC, C  max , T max , zuivering, halveringstijd) na toediening via 
de relevante blootstellingsroute(s);  
5) de snelheid en omvang van de absorptie van de teststof na toediening via 
de relevante blootstellingsroute(s);  
6) de hoeveelheden van de teststof en metabolieten (uitgedrukt als een 
percentage van de toegediende dosis) die in de excreta zijn verzameld;  
7) verwijzingen naar gegevens in de bijlage over alle gemeten eindpunten 
voor alle afzonderlijke dieren (bv. toediening van de dosis, percentage 
recovery, concentraties, toxicokinetische parameters enz.);  
8) een illustratie van de veronderstelde metabole routes en de moleculaire 
structuren van de metabolieten.  
Bespreking en conclusies  
72. In deze afdeling moet de auteur:  
1) een veronderstelde metabole route voorstellen die is gebaseerd op de 
resultaten van het metabolisme en de dispositie van de teststof;  
2) mogelijke soort- en geslachtsafhankelijke verschillen bespreken met be ­
trekking tot de dispositie en/of de biotransformatie van de teststof;  
3) de identificatie en omvang van metabolieten, zuiveringssnelheden, mo ­
gelijkheid van bioaccumulatie, en niveau van weefselresiduen van oor ­
spronkelijke verbindingen en/of metaboliet(en), alsmede mogelijke dosis ­
afhankelijke veranderingen in toxicokinetische parameters, naargelang hetgeen van toepassing is, in tabellen zetten en bespreken;
 
4) eventuele relevante toxicokinetische gegevens opnemen die zijn verkre ­
gen tijdens het verrichte toxiciteitsonderzoek;  
5) een beknopte conclusie formuleren die door de bevindingen van het 
onderzoek wordt gestaafd;  
6) afdelingen toevoegen (voor zover noodzakelijk of van toepassing).  
73. Er moeten afdelingen worden toegevoegd voor ondersteunende bibliografi ­
sche gegevens, tabellen, illustraties, aanhangsels enz.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATIEVE BLOOTSTELLINGSROUTES  
Dermaal  
Dermale behandeling  
74. In deze afdeling wordt specifieke informatie verschaft over het onderzoek 
naar de toxicokinetiek van de teststof via de dermale route. Raadpleeg voor 
dermale absorptie hoofdstuk B.44 van deze bijlage (Absorptie door de huid: in-vivomethode (9)). Voor andere eindpunten, zoals distributie en metabo ­
lisme, kan deze testmethode B.36, worden gebruikt. Bij de dermale behan ­
deling moeten één of meer dosisniveaus worden gebruikt voor de teststof. 
De teststof (bijvoorbeeld puur, verdund of geformuleerd materiaal met de teststof dat op de huid wordt aangebracht) moet hetzelfde zijn (of een realistisch surrogaat) als die waaraan mensen of andere potentiële doelsoor ­
ten kunnen worden blootgesteld. De dosisniveaus moeten overeenkomstig 
de punten 20-26 van deze testmethode worden gekozen. Bij het kiezen van de dermale dosis kan rekening worden gehouden met factoren als de ver ­
wachte blootstelling bij de mens en/of doses waarbij toxiciteit is waargeno ­
men bij ander onderzoek naar de huidtoxiciteit. Indien nodig moet/moeten 
de dermale dosis/doses worden opgelost in een geschikt medium en worden aangebracht in een hoeveelheid die toereikend is voor toediening van de dosis/doses. Kort voor de proef wordt het haar op het ruggedeelte van de 
romp van de proefdieren geknipt. Het dier kan ook worden geschoren, maar 
dit moet dan ongeveer 24 uur voor de proef geschieden. Bij het knippen of scheren moet erop worden gelet dat de huid niet wordt bekrast, omdat daardoor de doorlaatbaarheid van de huid zou kunnen veranderen. Ca. 
10 % van de lichaamsoppervlakte moet voor het aanbrengen van de teststof 
worden onthaard. Bij zeer toxische stoffen mag de te bedekken oppervlakte kleiner zijn dan ca. 10 %, maar een zo groot mogelijke oppervlakte moet met een dunne en gelijkmatig aangebrachte laag worden bedekt. Van alle bij 
dermaal onderzoek gebruikte testgroepen moet dezelfde oppervlakte worden 
behandeld. De toedieningsgebieden moeten worden beschermd met een ge ­
schikte afdekking die niet kan verschuiven. De dieren worden in aparte 
kooien gehuisvest.
 
75. Er moet onderzoek worden verricht om te beoordelen hoeveel van de opge ­
brachte dosis van de teststof van de huid kan worden verwijderd door de behandelde huid te wassen met een milde oplossing van zeep en water. Dit 
onderzoek kan ook nuttig zijn bij het bepalen van de massabalans wanneer 
de teststof via de huid wordt toegediend. Bij onderzoek waarbij de huid wordt gewassen moet een eenmalige dosis van de teststof bij twee dieren 
worden opgebracht. Het dosisniveau wordt gekozen overeenkomstig punt 23 
van deze testmethode (zie ook punt 76 voor een bespreking van de duur van het huidcontact). De hoeveelheid in de wasvloeistof teruggevonden teststof moet worden bepaald om te beoordelen hoe effectief de teststof door middel 
van wassen wordt verwijderd.
 
76. Tenzij de corrosiviteit dit onmogelijk maakt, moet de opgebrachte teststof 
ten minste 6 uur op de huid aanwezig blijven. Wanneer de afdekking wordt verwijderd, moet het behandelde gebied worden gewassen nadat de pro ­
cedure is toegepast die wordt beschreven in punt 75. Zowel de afdekking 
als de wasvloeistof moeten worden geanalyseerd op resterende teststof. Bij beëindiging van het onderzoek moet elk dier overeenkomstig (2) op humane 
wijze worden gedood en moet de behandelde huid worden verwijderd. Een 
geschikt gedeelte van de behandelde huid moet worden geanalyseerd om de resterende teststof (radioactiviteit) te bepalen.
 
77. Het is mogelijk dat voor de toxicokinetische beoordeling van geneesmidde ­
len andere procedures moeten worden toegepast, afhankelijk van het des ­
betreffende regelgevingssysteem.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalatie  
78. Er dient één concentratie (of meer, indien noodzakelijk) van de teststof te 
worden gebruikt. De concentraties moeten worden gekozen overeenkomstig de punten 20-26 van deze testmethode. Inhalatiebehandelingen moeten wor ­
den uitgevoerd met behulp van een „neuskegel” of een apparaat dat de 
toediening beperkt tot het hoofd ter voorkoming van absorptie via andere blootstellingsroutes (8). Als andere blootstellingsvormen dan inhalatie wor ­
den gebruikt, moet worden gedocumenteerd waarom. De duur van de bloot ­
stelling via inhalatie moet worden vastgesteld; de inhalatieduur bedraagt 
doorgaans 4-6 uur.
 
LITERATUUR:  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Ma ­
nufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
(3) Solon E.G., Kraus L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
(4) Stumpf W.E. (2005). Drug localization and targeting with receptor micro ­
scopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
 
(5) Loizou G., Spendiff M., Barton H.A., Bessems J., Bois F.Y., d’Yvoire 
M.B., Buist H., Clewell H.J. 3rd, Meek B., Gundert-Remy U., Goerlitz 
G., Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for phy ­
siologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400-411.
 
(6) Hoofdstuk B.45 van deze bijlage, Absorptie door de huid: in-vitromethode.  
(7) IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-Based 
Pharmacokinetic Models in Risk Assessment, IPCS Harmonization Project Document No. 9. Geneva, World Health Organization, International Pro ­
gramme on Chemical Safety.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) Hoofdstuk B.44 van deze bijlage, Absorptie door de huid: in-vivomethode.  
(10) Barton H.A.,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
(11) Gibaldi M. en Perrier D., (1982). Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Aanhangsel  
DEFINITIES  
Absorptie:  de processen die verband houden met de opname van chemische 
stoffen in of door weefsels. De term absorptie heeft betrekking op de oorspron ­
kelijke verbinding en alle metabolieten ervan en mag niet worden verward met „biologische beschikbaarheid”.
 
Accumulatie (bioaccumulatie):  de toename in de tijd van de hoeveelheid van 
een teststof in weefsels (doorgaans vetweefsels, na herhaalde blootstelling); als de 
hoeveelheid toegevoegde teststof in het lichaam groter is dan de snelheid waar ­
mee deze verdwijnt, stapelt de teststof zich op in het organisme en kunnen er toxische concentraties van de teststof worden bereikt.
 
ADME:  een acroniem voor „absorptie, distributie, metabolisme en excretie”.  
AUC:  (area under the curve, oppervlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve): 
de oppervlakte onder de curve in een grafiek van de ontwikkeling in de tijd van 
de concentratie van een teststof in plasma. Deze oppervlakte is een maat voor de totale hoeveelheid van de teststof die gedurende een vooraf bepaalde tijd door het lichaam is geabsorbeerd. Onder lineaire omstandigheden is de AUC (vanaf tijd ­
stip nul tot oneindig) evenredig aan de totale hoeveelheid van een teststof die 
door het lichaam wordt geabsorbeerd, ongeacht de absorptiesnelheid.
 
Autoradiografie:  (autoradiografie van het gehele lichaam): een kwalitatieve of 
kwantitatieve techniek die wordt gebruikt om de ligging in het weefsel van een 
radioactieve teststof te bepalen. Hiertoe worden met behulp van röntgenopnamen 
of meer recentelijk met behulp van Digital Phosphor Imaging radioactief ge ­
merkte moleculen of fragmenten van moleculen in beeld gebracht door de stra ­
ling vast te leggen die door het onderzochte voorwerp wordt uitgezonden. Ten 
opzichte van sectie op de organen kan kwantitatieve autoradiografie van het 
gehele lichaam voordelen bieden bij de evaluatie van de distributie van de test ­
stof en de beoordeling van de algemene recovery en resolutie van radioactief materiaal in weefsels. Zo heeft deze techniek bijvoorbeeld als voordeel dat deze 
kan worden toegepast bij een gepigmenteerd diermodel om een mogelijke bin ­
ding van de teststof aan melanine, dat zich aan bepaalde moleculen kan binden, te beoordelen. Hoewel op deze manier voor het hele lichaam een overzicht kan worden verkregen van de bindingsplaatsen met een grote capaciteit en een ge ­
ringe affiniteit, is het nut van deze techniek beperkt als het erom gaat specifieke 
doelgebieden te herkennen zoals receptorbindende gebieden waar voor detectie een betrekkelijk hoge resolutie en hoge gevoeligheid vereist is. Wanneer autora ­
diografie wordt toegepast, moeten proeven die zijn bedoeld om de massabalans 
van de toegediende verbinding te bepalen in een andere groep of in een ander 
onderzoek worden uitgevoerd dan in de proef waarmee de weefseldistributie wordt onderzocht, waarbij alle excreta (eventueel met inbegrip van de uitgea ­
demde lucht) en hele karkassen worden gehomogeniseerd en door middel van 
vloeistofscintillatietelling worden geanalyseerd.
 
Galexcretie:  uitscheiding via de galwegen.  
Bioaccumulatie:  zie „accumulatie”.  
Biologische beschikbaarheid:  de fractie van de toegediende dosis die in de 
systemische circulatie terechtkomt of beschikbaar wordt gemaakt op de plaats waar de fysiologische activiteit zich voordoet. De biologische beschikbaarheid 
van een teststof heeft gewoonlijk betrekking op de oorspronkelijke verbinding, 
maar kan ook betrekking hebben op de metaboliet(en) ervan. Slechts één che ­
mische vorm wordt onderzocht.  NB:  biologische beschikbaarheid en absorptie 
zijn niet hetzelfde. Het verschil tussen bijvoorbeeld orale absorptie (d.w.z. aan ­
wezigheid in de darmwand en de portaalcirculatie) en biologische beschikbaar ­
heid (d.w.z. aanwezigheid in systemisch bloed en in weefsels) kan onder meer worden toegeschreven aan chemische afbraak als gevolg van het metabolisme in de darmwand of het transport van efflux naar het darmlumen of het presyste ­
misch metabolisme in de lever (10). De biologische beschikbaarheid van een 
toxisch bestanddeel (oorspronkelijke verbinding of een metaboliet) is een essen ­
tiële parameter voor de risicobeoordeling bij de mens (extrapolatie van hoge naar lage dosis, extrapolatie van de ene route naar de andere), aan de hand waarvan 
een interne waarde kan worden afgeleid van de externe NOAEL of BMD (toe ­
gepaste dosis). Voor het bepalen van levereffecten bij orale toediening volstaat de orale absorptie. Voor alle andere effecten die niet met de toedieningsplaats sa ­
menhangen, levert de biologische beschikbaarheid in het algemeen betrouwbaar ­
der resultaten op als parameter voor gebruik bij de risicobeoordeling dan de 
absorptie.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biopersistentie:  zie „persistentie”.  
Biotransformatie:  (gewoonlijk een enzymatische) chemische omzetting van de 
onderzochte teststof in een andere chemische stof in het lichaam. Synoniem met 
„metabolisme”.  
C max : hetzij de piekconcentratie in het bloed (plasma/serum) na toediening hetzij 
de hoogste uitscheiding (in urine of feces) na toediening.  
Zuiveringssnelheid:  een kwantitatieve maat voor de snelheid per tijdseenheid 
waarmee de teststof uit het bloed, het plasma of een bepaald weefsel wordt 
verwijderd.  
Compartiment:  een structureel of biochemisch onderdeel (of eenheid) van een 
lichaam, weefsel of cel, dat is gescheiden van de rest.  
Detoxificatiewegen:  een reeks stappen die leidt tot de verwijdering van toxische 
stoffen uit het lichaam, hetzij via metabole verandering, hetzij via uitscheiding.  
Distributie:  de verspreiding van de teststof en de daarvan afgeleide stoffen door 
een organisme.  
Enzymen/iso-enzymen:  eiwitten die optreden als katalysator van chemische re ­
acties. Iso-enzymen zijn enzymen die vergelijkbare chemische reacties katalyse ­
ren, maar een andere aminozuurvolgorde hebben.  
Enzymatische parameters:  K m : constante van Michaelis en V  max : maximale 
snelheid.  
Uitscheiding:  één of meer processen waardoor de toegediende teststof en/of de 
metabolieten ervan door het lichaam worden uitgescheiden.  
Exogeen:  afkomstig van of het gevolg van invloed van buiten het organisme of 
systeem.  
Extrapolatie:  op basis van wat bekend is of wat waargenomen is uitspraken 
doen over één of meer onbekende waarden.  
Halveringstijd (t  1/2 ): de tijd waarin de concentratie van de teststof in een com ­
partiment met de helft afneemt. Doorgaans verwijst deze term naar de plasma ­
concentratie of de hoeveelheid van de teststof in het hele lichaam.  
Inductie (van enzymen):  de aanmaak van één of meer enzymen als reactie op 
een prikkel vanuit de omgeving of een inducerend molecuul.  
Lineariteit/lineaire kinetiek:  volgens de kinetiek is een proces lineair als de 
snelheid van alle overdrachten tussen de compartimenten evenredig is aan de aanwezige hoeveelheden of concentraties, d.w.z. van de eerste orde is. Bijgevolg zijn de zuiverings- en de distributievolumes constant, evenals de halveringstijden. 
De bereikte concentraties zijn evenredig aan de toedieningssnelheid (blootstel ­
ling) en accumulatie kan eenvoudiger worden voorspeld. De lineariteit/niet-line ­
ariteit kan worden bepaald door de relevante parameters, bijvoorbeeld de AUC, met elkaar te vergelijken na verschillende doses of na eenmalige en herhaalde 
blootstelling. Het achterwege blijven van dosisafhankelijkheid kan wijzen op 
verzadiging van de enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van de verbinding, terwijl een toename van de AUC na herhaalde blootstelling in ver ­
gelijking met eenmalige blootstelling kan wijzen op remming van het metabo ­
lisme en een afname van de AUC kan wijzen op inductie van het metabolisme 
(zie ook (11)).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Massabalans:  het bijhouden van de hoeveelheid teststof die het systeem binnen ­
komt en verlaat.  
Materiaalbalans:  zie „massabalans”.  
Toxisch werkingsmechanisme/werkingswijze:  het werkingsmechanisme heeft 
betrekking op de specifieke biochemische wisselwerkingen waaraan de teststof 
zijn effect ontleent. De werkingswijze heeft betrekking op algemenere wegen die 
leiden tot de toxiciteit van de teststof.  
Metabolisme:  synoniem met „biotransformatie”.  
Metabolieten:  producten van het metabolisme of metabole processen.  
Orale absorptie:  het percentage van de dosis van de teststof dat wordt geabsor ­
beerd op de toedieningsplaats (bijvoorbeeld het spijsverteringskanaal). Aan de hand van deze kritische parameter kan de fractie van de toegediende teststof 
worden onderzocht die de poortader en vervolgens de lever bereikt.
 
Partitiecoëfficiënt:  ook verdelingscoëfficiënt genoemd. Een maat voor de diffe ­
rentiële oplosbaarheid van een chemische stof in twee oplosmiddelen.  
Piekconcentraties in het bloed (plasma/serum):  de hoogste concentratie in het 
bloed (plasma/serum) na toediening (zie ook „C  max ”). 
Persistentie (biopersistentie):  de langdurige aanwezigheid van een chemische 
stof (in een biologisch systeem) die bestand is tegen afbraak/verwijdering.  
Read-across:  aan de hand van de informatie over het eindpunt van één of meer 
chemische stoffen kan het eindpunt van de onderzochte stof worden voorspeld.  
Receptor Microscopic Autoradiography (of Receptor Micro-Autoradiography):  
deze techniek kan worden gebruikt om de wisselwerking tussen lichaamsvreemde 
stoffen en specifieke weefsellocaties of celpopulaties te onderzoeken in het kader van bijvoorbeeld onderzoek naar receptorbinding of specifieke werkingswijzen waarvoor een hoge resolutie en een hoge gevoeligheid vereist zijn en die met 
andere technieken, zoals autoradiografie van het gehele lichaam, niet mogelijk zijn.
 
Toedieningsweg (oraal, intraveneus, dermaal, inhalatie enz):  heeft betrekking 
op de manier waarop chemische stoffen aan het lichaam worden toegediend 
(bijvoorbeeld via een orale maagsonde, via de voeding, via de huid, door inade ­
ming, intraveneus enz.).  
Verzadiging:  de toestand waarbij één of meer kinetische processen (bijvoorbeeld 
absorptie, metabolisme of zuivering) hun hoogste punt hebben bereikt (verzadigd zijn).
 
Gevoeligheid:  het vermogen van een methode of instrument om onderscheid te 
maken tussen gemeten reacties die overeenstemmen met verschillende niveaus 
van de onderzochte variabele.  
Concentratie in het bloed (plasma) in stationaire toestand:  een 
niet-evenwichtstoestand van een open systeem waarbij alle krachten die op het 
systeem inwerken exact worden opgeheven door tegengestelde krachten, zodanig dat de concentratie van alle elementen in het systeem stabiel is hoewel er ma ­
teriaal door het systeem stroomt.
 
Systeemmodellering (op fysiologie gebaseerde toxicokinetische, op farmaco ­
kinetiek gebaseerde, op fysiologie gebaseerde farmacokinetische, op biologie 
gebaseerde enz.):  het opstellen van een abstract model waarin het gedrag van 
een systeem wiskundig wordt beschreven.  
Doelweefsel:  het weefsel waarin een belangrijk schadelijk effect van een toxische 
stof optreedt.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Teststof:  iedere chemische stof of ieder mengsel die/dat met deze testmethode 
wordt getest.  
Weefseldistributie:  de omkeerbare beweging van een teststof tussen verschil ­
lende plaatsen in het lichaam. De weefseldistributie kan worden onderzocht door middel van sectie op de organen, homogenisering, verbranding en vloeistofs ­
cintillatietelling of met behulp van kwalitatieve en/of kwantitatieve autoradiogra ­
fie van het gehele lichaam. De eerste techniek is nuttig voor het bepalen van de 
concentratie en het recoverypercentage bij weefsels en het resterende karkas van dezelfde dieren, maar biedt mogelijk niet voldoende onderscheidingsvermogen voor alle weefsels en biedt mogelijk een minder gunstige algemene recovery 
(< 90 %). Zie hierboven voor een definitie van de laatste techniek.
 
T max : de tijd die nodig is om C  max te bereiken.  
Toxicokinetiek:  (farmacokinetiek): de bestudering van de absorptie, de distribu ­
tie, het metabolisme en de uitscheiding van teststoffen in de loop van de tijd.  
Validatie van modellen:  het beoordelen van de mate waarin een model in staat 
is de beschikbare toxicokinetische gegevens toereikend te beschrijven. Modellen 
kunnen worden geëvalueerd door een statistische en visuele vergelijking van de 
voorspellingen met de experimentele waarden aan de hand van een gemeenschap ­
pelijke onafhankelijke variabele (bijvoorbeeld de tijd). De omvang van de eva ­
luatie moet in verhouding staan tot het beoogde gebruik van het model..  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37  VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE 
FOSFORVERBIN-DINGEN NA ACUTE BLOOTSTELLING  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Bij de bepaling en evaluatie van de toxische effecten van stoffen is 
het van belang rekening te houden met het vermogen van sommige soorten stoffen om specifieke typen neurotoxiciteit te veroorzaken die niet met andere toxiciteitstesten kunnen worden aangetoond. 
Bij sommige organische fosforverbindingen is waargenomen dat ver ­
traagde neurotoxiciteit optreedt; deze stoffen moeten worden be ­
schouwd als kandidaten voor evaluatie.
 
Door screening  in vitro  kan worden nagegaan welke stoffen ver ­
traagde polyneuropathie kunnen veroorzaken; negatieve uitkomsten 
vormen echter geen bewijs dat de teststof niet neurotoxisch is.  
Zie ook de algemene inleiding deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Organische fosforverbindingen omvatten ongeladen organische es ­
ters, thioesters of anhydriden van organische fosforzuren, organische fosforzuren of organische fosforamidezuren of van verwante fosfort ­
hiozuren, fosforthiozurcn of fosforthioamidezuren, of andere stoffen 
die de vertraagde neurotoxiciteit kunnen veroorzaken die soms bij stoffen uit deze klasse wordt waargenomen.
 
Vertraagde neurotoxiciteit is een syndroom dat gepaard gaat met het 
langdurig vertraagde begin van ataxie, distale axonopathieén in het 
ruggemerg en perifere zenuwen en inhibitie en veroudering van NTE 
(neuropathy target esterase) in zenuwweefsel.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Een referentiestof kan worden getest met een positieve controlegroep 
om aan te tonen dat de respons van geteste diersoorten onder labo ­
ratoriumomstandigheden niet significant is veranderd.  
Een voorbeeld van een vaak toegepaste neurotoxicum is tri-o-tolyl ­
fosfaat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS-naam: fosforzuur, tris(2,methylfenyl)ester), ook bekend als tri-o-kresylfosfaat.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt oraal in één enkele dosis toegediend aan hennen 
die, zo nodig, beschermd zijn tegen acute cholinerge effecten. De dieren worden gedurende 21 dagen geobserveerd op abnormaal ge ­
drag, ataxie en verlammingsverschijnselen. Bij willekeurig geselec ­
teerde hennen uit elke groep worden, gewoonlijk 24 en 48 uur na de toediening, biochemische bepalingen verricht, met name op inhibitie van NTE. Eenentwintig dagen na de toediening worden de resterende 
hennen gedood en wordt histopathologisch onderzoek verricht aan 
geselecteerd zenuwweefsel.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Voorbereidingen  
Gezonde jonge volwassen hennen die geen storende virusinfecties of 
medicatie hebben en die een normale gang vertonen worden aselect 
verdeeld over behandelde en controlegroepen en ten minste gedu ­
rende vijf dagen voor de aanvang van het onderzoek geacclimati ­
seerd aan de laborato-riumomstandigheden.  
De kooien of verblijven moeten zó ruim zijn, dat de hennen vrij 
kunnen bewegen en dat de gang van de dieren makkelijk kan worden waargenomen.
 
Het toedienen van de teststof gebeurt gewoonlijk langs orale weg 
door middel van een maagsonde, gelatinecapsules of een vergelijk ­
bare methode.Vloeistoffen kunnen onverdund of opgelost in een 
geschikt vehiculum zoals maïsolie worden toegediend. Vaste stoffen moeten waar mogelijk worden opgelost omdat grote hoeveelheden vaste stof in gelatinecapsules mogelijk niet helemaal worden geresor ­
beerd. Van een niet-waterig vehiculum dienen de toxische eigen ­
schappen bekend te zijn. Als dit niet zo is moeten deze voor de aanvang van de proef worden bepaald.
 
1.5.2.  Proefomstandigheden  
1.5.2.1.  Proefdieren  
Het gebruik var jonge volwassen leghennen ( Gallus gallus domesti ­
cus) van 8-12 maanden wordt aanbevolen. Er moet gebruik worden 
gemaakt van rassen en stammen van normale grootte en de hennen 
moeten zijn gefokt onder omstandigheden die vrij bewegen mogelijk 
maken.  
1.5.2.2.  Aantal en geslacht  
Als aanvulling op de behandelde groep moet een controlegroep (ve ­
hiculum) en een positieve controlegroep worden gebruikt. De con ­
trolegroep (vehiculum) wordt op dezelfde wijze behandeld als de behandelde groep; alleen het toedienen van de teststof wordt achter ­
wege gelaten.
 
Iedere groep vogels moet uit zoveel hennen beslaan dat er ten minste 
zes kunnen worden gedood voor biochemische bepalingen (telkens 
drie op twee tijdstippen) en zes de observatieperiode van 21 dagen kunnen overleven ten behoeve van pathologisch onderzoek.
 
Als positieve controle kan een gelijktijdig geobserveerde groep wor ­
den gebruikt of een groep uit een recent verricht onderzoek. De groep moet uit ten minste zes hennen bestaan die worden behandeld met een stof waarvan bekend is dat deze een vertraagd neurotoxische 
werking heeft. Drie hennen zijn bestemd voor biochemisch onder ­
zoek en drie voor pathologisch onderzoek. Aangeraden wordt om gegevens uit eerdere onderzoeken periodiek aan te vullen. Als een essentieel onderdeel van de proef door het uitvoerend laboratorium 
wordt veranderd (bijvoorbeeld stam, voedsel, behuizing), motten 
nieuwe positieve controlegegevens worden ontwikkeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Dosisniveaus  
Om het dosisniveau in het hoofdonderzoek vast te stellen moet een 
vooronderzoek worden verricht met een voldoende aantal hennen en dosis niveaugroepen. Er dient, om een juist dosisniveau voor de 
hoofdstudie te kunnen vaststellen, normaal gesproken enige mortali ­
teit op de treden in deze voorstudie. Om echter sterfte ten gevolge van acute cholinerge effecten te voorkomen, kan atropine of een ander preventief middel, waarvan bekend is dat het niet interfereert 
met vertraagde neurotoxische reacties, worden toegediend. Voor het 
vaststellen van de maximale niet-letale dosis van [eststoffen kan een aantal verschillende methoden worden gebruikt (zie methode B.1bis). 
Gegevens uit eerdere onderzoeken bij de hen of andere toxicologi ­
sche gegevens kunnen ook nuttig zijn bij de keuze van de dosis.
 
Het dosisniveau van de teststof in de hoofdstudie moet zo hoog 
mogelijk liggen, rekening houdend met de resultaten van de voor ­
studie en de bovengrens van 2 000 mg/kg lichaamsgewicht. Als er 
tussentijdse mortaliteit optreedt mag dit er niet toe leiden dat er te 
weinig proefdieren overblijven voor biochemisch (6) en pathologisch (6) onderzoek na 21 dagen. Ter voorkoming van sterfte door acute cholinerge effecten kan atropine of een ander preventief middel 
worden toegediend waarvan bekend is dat het niet interfereert met 
vertraagde neuro-toxische reacties.
 
1.5.2.4.  Limiettest  
Als een test op een dosisniveau van ten minste 2 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag bij gebruikmaking van de beschreven procedu ­
res voor dit onderzoek geen waarneembare toxische effecten geeft en 
als dit, door gegevens van proeven met structureel verwante stoffen, 
ook niet verwacht mag worden, kan een onderzoek waarbij van een hogere dosering gebruik wordt gemaakt achterwege blijven. De li ­
miettest is van toepassing tenzij blootstelling bij mensen een hogere 
dosering noodzakelijk maakt.
 
1.5.3.  Observatieperiode  
De observatieperiode dient 21 dagen te zijn.  
1.5.4.  Procedure  
Na toediening van een preventief middel om sterfte ten gevolge van 
acute cholinerge effecten te voorkomen, wordt de teststof in één 
enkele dosis toegediend.  
Algemene observatie  
Het observeren moet onmiddellijk na het toedienen beginnen. Alle 
hennen moeten gedurende de eerste twee dagen enkele malen per 
dag worden geobserveerd en daarna ten minste eenmaal per dag over een periode van 21 dagen of totdat de dieren worden gedood Alle tekenen van toxiciteit moeten worden geregistreerd, zoals tijdstip van 
aanvang, soort, ernst en duur van abnormaal gedrag Ataxie moet 
worden gemeten op een schaalverdeling met ten minste vier niveaus en er moe[ worden gelet op verlammingsverschijnselen. De hennen die zijn geselecteerd voor pathologie moeten ten minste tweemaal 
per week uit de kooi worden genomen voor een periode van ge ­
dwongen motorische activiteit, zoals het beklimmen van een ladder, om het observeren van minimale toxische effecten te vergemakkelij ­
ken. Stervende dieren en dieren die hevige stress of pijn vertonen 
moeten, zodra dit wordt opgemerkt, worden verwijderd, op humane 
wijze worden gedood en worden geobduceerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
Lichaamsgewicht  
Alle dieren worden vlak voor het toedienen van de teststof en daarna 
minstens éénmaal per week gewogen.  
Biochemie  
Zes hennen die willekeurig uit iedere behandelde en vehiculumcon ­
trolegroep worden gekozen en drie hennen uit de positieve contro ­
legroep (als die tegelijkertijd wordt onderzocht) moeten binnen een 
paar dagen na toediening worden gedood. De hersenen en het lum ­
bale ruggemerg worden geprepareerd en onderzocht op NTE-rem ­
mende effecten. Verder kan het nuttig zijn om weefsel van de nervus 
ischiadicus voor hetzelfde doel te prepareren en te onderzoeken. 
Meestal worden van de controlegroep en alle behandelde groepen na 14 uur drie vogels gedood en na 48 uur nog eens drie, terwijl de drie hennen van de positieve controlegroep na 24 uur worden ge ­
dood. Als de waarneming van klinische verschijnselen van toxiciteit 
(vaak op grond van het begin van choli-nerge verschijnselen) er op duidt dat du toxische stol zeer langzaam wordt uitgescheiden, kan het aan te bevelen zijn om op twee tijdstippen tussen 24 uur en 
maximaal 72 uur na toediening weefsel van drie vogels te verzame ­
len.
 
Bepaling van acetylcholesterinase (AChE) kan ook bij deze monsters 
worden uitgevoerd als dat nodig lijkt. Er kan echter spontane reacti ­
vering van AChE  in vivo  optreden: dit kan leiden tot onderschatting 
van de remmende werking van de teststof op AChE.  
Marcroscopische necropsie  
Bij macroscopische necropsie van alle (volgens plan of omdat ze 
stervend waren) gedode dieren moet onder meer het uiterlijk van de hersenen en het ruggemerg worden onderzocht.
 
Histopathologisch onderzoek  
Zenuwweefsel van dieren die de observatieperiode hebben overleefd 
en niet gebruikt zijn voor biochemisch onderzoek, moet microsco ­
pisch worden onderzocht- Het weefsel moet  in situ  worden gefixeerd 
door perfusietechnieken, Ondere andere moeten preparaten worden 
gemaakt van de kleine hersenen [ongeveer halverwege de lengte-as), 
het verlengde merg, het ruggemerg en perifere zenuwen. De pre ­
paraten van het ruggemerg moeten worden genomen uit het bovenste cervicaal segment, het midden van de thoracale regio en de Jumbo- 
sacrale regio. Ook moeten er preparaten van het distale deel van de 
nervus tibialis, de vertakkingen hiervan naar de musculus gastrocne ­
mius en van de nervus ischiadicus worden genomen. De preparaten 
moeten worden gekleurd met de juiste voor myeline en axonen 
specifieke kleurstoffen.
 
2. GEGEVENS  
Indien negatieve resultaten worden behaald met betrekking tot de 
parameters van deze methoden (biochemie, histopathologie en ge ­
dragsobservatie) is in het algemeen verder testen op vertraagde neu ­
rotoxiciteit niel nodig. Bij onduidelijke of dubbelzinnige resultaten 
voor deze parameters kan verdere evaluatie nodig zijn.  
Er moeten individuele gegevens worden verstrekt. Verder moeten 
alle resultaten in tabelvorm worden gepresenteerd, waarbij voor ie ­
dere testgroep het aantal dieren bij aanvang moet worden vermeld, het aantal dieren dat laesies of gedrags- of biochemische effecten vertoont, het soort en de ernst van deze laesies of effecten en het 
percentage dieren dat een bepaalde laesie of een bepaald effect in 
een bepaalde mate vertoont
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
De bevindingen van dit onderzoek moeten worden geëvalueerd wal 
betreft het voorkomen, de ernst en de correlatie van gedrags-, bio ­
chemische en histopathologische effecten en ieder ander waargeno ­
men effect bij de behandelde en de controlegroepen.  
Numerieke resultaten moeten wordien geinterpreteerd met behulp 
van geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methoden. De 
gebruikte statistische methoden moeten bij het ontwerp van het on ­
derzoek worden gekozen.  
3. RAPPORTAGE  
VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het rapport moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
3.1. proefdieren:  
— gebruikte stam;  
— aantal en leeftijd van de dieren;  
— herkomst, behuizing, enz.;  
— individueel gewicht van de dieren bij het begin van de proef.  
3.2. Proefomstandigheden:  
— bijzonderheden over de bereiding van de teststof, de stabiliteit en 
homogeniteit, waar dat van toepassing is;  
— motivering van de keuze van het vehiculum;  
— bijzonderheden over de toediening van de teststof;  
— bijzonderheden over voedsel en water;  
— motivering van de dosiskeuze;  
— specificatie van de toegediende doses. met inbegrip van bijzon ­
derheden over het vehiculum, het volume en de fysische vorm 
van het toegediende materiaal;  
— naam van het eventueel toegediende preventieve middel en ge ­
gevens over de wijze van toedie ning.  
3.3. Resultaten:  
— gegevens over het lichaamsgewicht;  
— gegevens over de toxische respons, uitgesplitst naar groep, met 
inbegrip van de mortaliteit;  
— aard, ernst en duur van de klinische observaties (al of niet rever ­
sibel);  
— een gedetailleerde beschrijving van de biochemische methoden 
en bevindingen;  
— necropsieverslagen;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevin ­
dingen, statistische bewerking van de resultaten,  
— indien van toepassing.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. LITERATUUR  
Deze methode komt overeen met TG 418 van de OESO.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38  VERTRAAGDE NEUROTOXICITEIT VAN ORGANISCHE 
FOSFORVERBINDINGEN BIJ HERHAALDE TOEDIENING 
(28 DAGEN)  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Bij de bepaling en evaluatie van de toxische effecten van stoffen is 
het van belang rekening te houden met het vermogen van sommige soorten stoffen om specifieke typen neurotoxiciteit te veroorzaken 
die niet met andere toxiciteitstesten kunnen worden aangetoond Bij 
sommige organische fosforverbindingen is waargenomen dat ver ­
traagde neurotoxiciteit optreedt, deze stoffen moeten worden be ­
schouwd als kandidaten voor evaluatie.
 
Door screening  in vitro  kan worden nagegaan welke stoffen ver ­
traagde polyneuropathie kunnen veroorzaken; negatieve uitkomsten vormen echter geen bewijs dat de teststof niet neurotoxisch is.
 
Deze 28-daagse test op vertraagde neurotoxiciteit geeft informatie 
over mogelijke gevaren voor de gezondheid die zich kunnen voor ­
doen bij herhaalde blootstelling gedurende een beperkte tijd en over 
de relatie tussen dosis en respons. Tevens kan op grond van de test een schatting worden gemaakt van een dosis zonder waargenomen 
schadelijke effecten, hetgeen van nut kan zijn bij het vaststellen van 
veiligheidseisen bij blootstelling.
 
Zie ook de algemene inleiding deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Organische fosforverbindingen omvatten ongeladen organische es ­
ters, thioesters of anhydriden van organische fosforzuren, organische fosforzuren of organische fosforamidezuren of van verwante fosfort ­
hiozuren, fosforthiozuren of fosforthioamidezuren, of andere stoffen 
die de vertraagde neurotoxiciteit kunnen veroorzaken die soms bij stoffen uit deze klasse wordt waargenomen.
 
Vertraagde neurotoxiciteit is een syndroom dat gepaard gaat met het 
langdurig vertraagde begin van ataxie, distale axonopathieen in het 
ruggemerg en perifere zenuwen en inhibitie en veroudering van NTE 
(neuropathy target esterase) in zenuwweefsel.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Aan hennen wordt dagelijks, gedurende 28 dagen, oraal een dosis 
van de teststof toegediend. De dieren worden tot 14 dagen na de laatste dosis tenminste eenmaal per dag geobserveerd op abnormaal 
gedrag, ataxie en verlammingsverschijnselen. Bij willekeurig gese ­
lecteerde hennen uit elke groep worden, gewoonlijk 24 en 48 uur na de laatste toediening, biochemische bepalingen verricht, met name op inhibitie van NTE. Twee weken na de laatste dosis worden de res ­
terende hennen gedood en wordt histopathologisch onderzoek ver ­
richt aan geselecteerd zenuwweefsel.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1  Voorbereidingen  
Gezonde jonge volwassen hennen die geen storende virusinfecties of 
medicatie hebben en die een normale gang verronen worden aselect 
verdeeld over behandelde en controlegroepen en ten minste gedu ­
rende vijf dagen voor de aanvang van het onderzoek geacclimati ­
seerd aan de laborato-riumomstandigheden  
De kooien of verblijven moeten zó ruim zijn. dat de hennen vrij 
kunnen bewegen en dat de gang van de dieren makkelijk kan warden waargenomen.
 
Het tot-dienen van de teststof moet iedere dag plaatsvinden, zeven 
dagen per week. bij voorkeur door middel van een maagsonde of gelatinecapsules. Vloeistoffen kunnen onverdund of opgelost in een geschikt vehiculum zoals maïsolie worden toegediend. Vaste stoffen 
moeten waar mogelijk worden opgelost omdat grote hoeveelheden 
vaste stof in gelatinecapsules mogelijk niet helemaal worden geresor ­
beerd. Van een niet-waterig vehiculum dienen de toxische eigen ­
schappen bekend te zijn Als dit niet zo is moeten deze voor de 
aanvang van de proef worden bepaald.
 
1.4.2.  Proefomstandigheden  
Proefdieren  
Het gebruik van jonge volwassen leghennen (Gallus gallus domesti ­
cus), 8-12 maanden oud, wordt aanbevolen. Er moet gebruik worden gemaakt van gangbare rassen en stammen van normale grootte en de 
hennen moeten zijn gefokt onder omstandigheden die vrij bewegen 
mogelijk maken.
 
Aantal en geslacht  
In het algemeen moeten ten minste drie behandelde groepen en een 
controlegroep (vehiculum) worden gebruikt. De controlegroep (vehi ­
culum) wordt op dezelfde wijze behandeld als de behandelde groep; 
alleen het toedienen van de testof wordt achterwege gelaten.  
ledere groep vogels moet uit zoveel hennen bestaan dal er ten minste 
zes kunnen worden gedood voor biochemische bepalingen (telkens 
drie op twee tijdstippen) en zes de observatieperiode van 14 dagen 
na de behandeling kunnen overleven ten behoeve van pathologisch onderzoek.
 
Dosisniveaus  
De keuze dosisniveaus moet worden gemaakt met inachtneming van 
de resultaten van een acute test op vertraagde neurotoxiciteit en alle andere beschikbare gegevens over toxiciteit of kinetica van de test ­
stof Het hoogste dosisniveau moet gekozen worden met het doel 
toxische effecten te veroorzaken, bij voorkeur vertraagde neurotoxi ­
citeit, zonder dat deze leiden tot sterfte of duidelijk lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus gekozen worden om het ver ­
band tussen dosis en respons aan te tonen en bij het laagste niveau te 
komen tot een dosis zonder waargenomen schadelijke effecten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
Limiettest  
Als een test op een dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag bij gebruikmaking van de beschreven procedu ­
res voor dit onderzoek geen waarneembare toxische effecten geeft en als dit, door gegevens van proeven met structureel verwante stoffen, 
ook niet verwacht mag worden, kan een onderzoek waarbij van een 
hogere dosering gebruik wordt gemaakt achterwege blijven. De li ­
miettest is van toepassing tenzij de verwachte blootstelling bij men ­
sen een hogere dosering noodzakelijk maakt.
 
Observatie periode  
Alle dieren moeten ten minste eenmaal per dag worden geobserveerd 
gedurende de periode van blootstelling en 14 dagen daarna of totdat ze worden geobduceerd.
 
1.4.3.  Procedure  
De teststof wordt gedurende een periode van 28 dagen dagelijks 
(zeven dagen per week) aan de proefdieren toegediend.  
Algemene observaties  
Het observeren moet onmiddellijk na de eerste toediening beginnen. 
Alle hennen moeten gedurende de periode van 28 dagen waarop de 
stof wordt toegediend en gedurende 14 dagen daarna of totdat ze 
worden gedood, tenminste eenmaal per dag worden geobserveerd. Alle tekenen van toxiciteit moeten worden geregistreerd, zoals tijd ­
stip van aanvang, soort, ernst en duur. Waarnemingen moeten onder 
meer, maar niet alleen, het observeren van abnormaal gedrag inhou ­
den. Ataxie moet worden gemeten op een schaalverdeling met ten minste vier niveaus en er moet worden gelet op verlammingsver ­
schijnselen. De hennen moeten ten minste tweemaal per week uit 
de kooi worden genomen voor ten periode van gedwongen motori ­
sche activiteit, zoals het beklimmen van een ladder, om het obser ­
veren van minimale toxische effecten te vergemakkelijken. Stervende dieten die hevige stress of pijn vertonen moeten, zodra dit wordt 
opgemerkt, worden verwijderd, op humane wijze worden gedood 
en worden geobduceerd.
 
Lichaamsgewicht  
Alle dieren worden vlak voor het toedienen van de teststof en daarna 
minstens éénmaal per weck gewogen.  
Biochemie  
Zes hennen die willekeurig uit iedere behandelde en vehiculumcon ­
trolegroep worden gekozen moeten binnen een paar dagen na toe ­
diening van de laatste dosis worden gedood. De hersenen en het 
lumbale ruggemerg worden geprepareerd en onderzocht op NTE- remmende effecten. Verder kan het nuttig zijn om weefsel van de nervus ischiadicus voor hetzelfde doel (NTE) te prepareren en te 
onderzoeken. Meestal worden van de controlegroep en alle behan ­
delde groepen drie vogels 24 uur (en drie vogels 48 uur na de laatste dosis gedood Als gegevens van het acute onderzoek of andere (hij voorbeeld toxicokinetische) onderzoeken er op duiden dat het doden 
na de laatste dosis beter op een ander tijdstip kan gebeuren, dan 
moet dat tijdstip aangehouden worden en de motivering worden gedocumenteerd.
 
Bepaling van acetylcholesterinase (AChE) kan ook bij deze monsters 
worden uitgevoerd als dal nodig lijkt. Er kan echter spontane reacti ­
vering van AChE  in vivo  optreden; dit kan leiden tot onderschatting 
van de remmende werking van de teststof op AChE.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
Macroscopische necropsie  
Bij macroscopische necropsie van alle (volgens plan of omdat ze 
stervend waren) gedode dieren moet onder meer het uiterlijk van de hersenen en het ruggemerg worden onderzocht.
 
Histopathologisch onderzoek  
Zenuwweefsel van dieren die de observatieperiode hebben overleefd 
en niet gebruikt zijn voor biochemisch onderzoek, moet microsco ­
pisch worden onderzocht. Het weefsel moet  in situ  worden gefixeerd 
door perfusietechnieken. Onder andere moeten preparaten worden gemaakt van de kleine hersenen (ongeveer halverwege de lengte- as), het verlengde merg, het ruggemerg en perifere zenuwen. De 
preparaten van tiet ruggemerg moeten worden genomen uit het bo ­
venste cervicaal segment, het midden van de thoracale regio en de lumbo-sacrale regio. Ook motten er preparaten van het distale deel van de nervus tibialis, de vertakkingen hiervan naar de musculus 
gastrocnemius en van de nervus ischiadicus worden genomen. De 
preparaten moeten worden gekleurd met de juiste voor myeline en axonen specifieke kleurstoffen. In eerste instantie moet microsco ­
pisch onderzoek worden verricht op de geprepareerde weefsels van 
alle dieren uit de controlegroep en de groep met de hoogste dosis. 
Als er aanwijzingen zijn voor effecten in de groep met de hoogste dosering, moeten ook dieren uit de groepen met lagere doseringen worden onderzocht.
 
2. GEGEVENS  
Indien negatieve resultaten worden behaald met betrekking tot de 
parameters van deze methode (biochemie, histopathologie en gedrag ­
sobservatie) is in het algemeen verder testen op vertraagde neuro ­
toxiciteit niet nodig. Bij onduidelijke of dubbelzinnige resultaten 
voor deze parameters kan verdere evaluatie nodig zijn.  
Er moeten individuele gegevens worden verstrekt- Verder moeten 
alle resultaten in tabelvorm worden gepresenteerd, waarbij voor ie ­
dere testgroep moeten worden vermeld het aantal dieren bij aanvang, het aantal dieren dat laesies of gedrags- of biochemische effecten vertoont, het soort en de ernst van deze laesies of effecten en het 
percentage dieren dat een bepaalde laesie of een bepaald effect in 
een bepaalde mate vertoont.
 
De bevindingen van dit onderzoek moeten worden geëvalueerd wat 
betreft het voorkomen, de ernst en de correlatie van gedrags-, bio ­
chemische en histopathologische effecten en ieder ander waargeno ­
men effect bij de behandelde en de controlegroepen.  
Numerieke resultaten moeten worden geïnterpreteerd met behulp van 
geschikte en algemeen geaccepteerde statistische methoden. De te gebruiken statistische methoden moeten bij het ontwerp van het 
onderzoek worden gekozen.
 
3. RAPPORTAGE  
VERSLAG VAN DE PROEFNEMINGEN  
In het rapport moeten, indien mogelijk, de volgende gegevens wor ­
den opgenomen:  
3.1. Proefdieren:  
— gebruikte stam;  
— aantal en leeftijd van de dieren;  
— herkomst, behuizing, enz.;  
— individueel gewicht van de dieren bij het begin van de proef.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2. Proefomstandigheden:  
— bijzonderheden over de bereiding van de teststof, de stabiliteit en 
homogeniteit, waar van toepassing;  
— motivering van de keuze van het vehiculum;  
— bijzonderheden over de toediening van de teststof;  
— bijzonderheden over voedsel en water;  
— motivering van de dosiskeuze;  
— specificatie van de toegediende doses, met inbegrip van bijzon ­
derheden over het vehiculum, het volume en de fysische vorm 
van het toegediende materiaal,  
— motivering van de keuze van andere tijden voor de biochemische 
bepaling dan 24 en 48 uur.  
3.3. Resultaten:  
— gegevens over het lichaamsgewicht;  
— gegevens over de toxische respons, uitgesplitst naar dosisniveau, 
met inbegrip van de mortali- teit;  
— niveau waarop geen schadelijke effecten werden waargenomen 
(NOAEL);  
— aard, ernst en duur van de klinische observaties (al dan niet 
reversibel);  
— een gedetailleerde beschrijving van de biochemische methoden 
en bevindingen;  
— necropsieverslagen;  
— ten gedetailleerde beschrijving van alle histopathologisch e be ­
vindingen;  
— statistische bewerking van de resultaten, indien dit van toepassing 
is. 
Bespreking van de resultaten  
Conclusies.  
4. LITERATUUR  
Deze methode komt overeen met TG 419 van de OESO.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  IN-VIVO  TEST OP DNA-HERSTELSYNTHESE IN LEVERCELLEN 
VAN ZOOGDIEREN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 486 van de OESO: in-vivo ­
test op DNA-herstelsynthese in levercellen van zoogdieren (1997).  
1.1. INLEIDING  
De in-vivo  test op DNA-herstelsynthese (unscheduled DNA synthesis 
— UDS) in levercellen van zoogdieren wordt gebruikt om te bepalen welke stoften DNA-herstel in levercellen van behandelde dieren in ­
duceren (1)(2)(3)(4).
 
Deze in-vivotest maakt het mogelijk de genotoxische effecten van 
chemische stoffen in de lever te onderzoeken. Het gemeten eindpunt 
levert een indicatie op van de DNA-beschadiging en het herstel 
daarvan in lever-cellen. De lever is de plaats waar het metabolisme van geresorbeerde verbindingen zich meestal voor het grootste deel afspeelt en is derhalve een goede plaats om DNA-beschadiging  in 
vivo te meten.
 
Als er aanwijzingen zijn dat de teststof niet in het doelweefsel te ­
rechtkomt, is deze test niet geschikt.  
Het eindpunt van UDS wordt gemeten door bepaling van de opname 
van gelabelde nucleosiden in cellen waar geen geprogrammeerde 
DNA-synthese (in de S-fase) plaatsvindt. De meest gebruikte tech ­
niek is bepaling van de opname van met tritium gelabeld thymidine ('H-TdR) met behulp van autoradiografie. Bij een  in vivo  UDS-test 
wordt bij voorkeur gebruikgemaakt van de rattenlever. Ook andere 
weefsels dan de lever kunnen worden gebruikt, maar daarvoor is deze methode niet geschikt.
 
De detectie van een UDS-respons is afhankelijk van het aantal DNA- 
basen dat op de beschadigde plaats wordt verwijderd en vervangen. De UDS-test is dan ook bijzonder geschikt voor de detectie van stoffen die leiden tot vervanging van grote stukken van 20-30 basen 
(„longpatch repair”). De gevoeligheid bij de detectie van „shortpatch 
repair”, waarbij één tot drie basen worden vervangen, is daarentegen veel lager. Bovendien kunnen mutagene effecten een gevolg zijn van niet of verkeerd herstelde of verkeerd gerepliceerde DNA-beschadi- 
gingen. De intensiteit van de UDS-respons levert geen indicatie op 
omtrent de betrouwbaarheid van het herstelproces. Daarnaast is het mogelijk dat een mutagene stot met DNA reageert, maar dat de DNA-beschadiging niet via een excisieherstelproces wordt gerepa ­
reerd. De UDS-test levert dus niet veel specifieke informatie over 
een mutagene werking op, maar dit wordt gecompenseerd door de potentiële gevoeligheid van dit eindpunt omdat het in het hele ge ­
noom wordt gemeten.
 
Zie ook de algemene inleiding van deel B.  
1.2. DEFINITIES  
Cel in herstel:  een cel met een hogere nettokernkorreling (NKK) 
dan een vooraf bepaalde waarde, waarvoor het laboratorium dat de test uitvoert een motivering moet geven.
 
Nettokernkorreling:  een kwantitatieve maat voor de UDS-activiteit 
van cellen bij een UDS-test met autoradiografie, berekend door het gemiddelde aantal cytoplasmakorrels in kern-equivalente cytoplasma ­
gebieden (CK) af te trekken van het aantal kernkorrels (KK): NKK = 
NK — CK. De NKK wordt per cel apart berekend en vervolgens 
samengevoegd voor cellen in een cultuur, in parallelle culturen, enz.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
DNA-herstelsynthese (unscheduled DNA synthesis — UDS):  her­
stelsynthese van DNA na excisie en verwijdering van een stuk DNA 
dat gedeeltelijk beschadigd is door een chemische stof of een fysisch agens.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De in vivo  UDS-test in levercellen van zoogdieren levert een indi ­
catie op van de herstelsynthese van DNA na excisie en verwijdering 
van een stuk DNA dat gedeeltelijk beschadigd is door een chemische stof of een fysisch agens. Meestal is de test gebaseerd op de inbouw van
 3 H-TdR in het DNA van levercellen met een geringe frequentie 
van cellen in de S-fase van de celcyclus. De opname van  3 H-TdR 
wordt meestal bepaald met behulp van autoradiogralie. aangezien deze techniek niet zo gevoelig is voor storing door cellen in de S- fase als bijvoorbeeld vloeistofscintillatietelling.
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereiding  
1.4.1.1.  Keuze van de diersoort  
Meestal worden ratten gebruikt, maar in principe komt elke geschikte 
zoogdiersoort in aanmerking. Er dient gebruik te worden gemaakt 
van jonge gezonde volwassen dieren van in het laboratorium gang ­
bare stammen. Bij het begin van de studie moet het gewichtsverschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit maximaal ±20 % 
van het gemiddelde gewicht van eik geslacht bedragen.
 
1.4.1.2.  Huisvesting en voeding  
De in de algemene inleiding van deel B genoemde algemene om ­
standigheden worden aangehouden, maar voor de luchtvochtigheid 
wordt gestreefd naar 50-60 %.  
1.4.1.3.  Voorbereiding van de dieren  
Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de 
behandelde en controlegroepen. De kooien moeten zodanig worden geplaatst dat mogelijke effecten daarvan tot een minimum worden 
beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven voordat 
de test begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laborato ­
rium te acclimatiseren.
 
1.4.1.4.  Teststof/Bereiding  
Vaste teststoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media wor ­
den opgelost of gesuspendeerd en eventueel vóór de toediening aan de dieren worden verdund. Vloeibare teststoffen kunnen rechtstreeks worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Tenzij uit 
stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse 
bereidingen van de teststof worden gebruikt.
 
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Oplosmiddel/Medium  
Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisniveaus geen 
toxische effecten veroorzaken en chemische reacties met de teststof 
moeten uitgesloten zijn. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/ ­
media worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze geen problemen opleveren. Aanbevolen wordt waar 
mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan 
worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Controles  
In elk onafhankelijk uitgevoerd deel van het experiment moeten 
tegelijkertijd positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles worden uitgevoerd. Afgezien van de behandeling met de teststof 
moeten de dieren in de controlegroepen op identieke wijze worden 
behandeld als de dieren in de andere groepen.
 
Voor de positieve controles moet een stof worden gebruikt waarvan 
bekend is dat deze tot UDS leidt op een blootstellingsniveau waarbij een detecteerbare stijging ten opzichte van het achtergrondniveau kan worden verwacht. Wanneer voor een positieve controle metabole 
activering nodig is, moet de dosering zodanig worden gekozen dat 
de respons gematigd is (4). De doseringen kunnen zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde object ­
glaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. Als positieve 
controle kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt:
 
Stof Bemonsteringstijdstip Stut CAS-nr Einecs-nr.  
Vroeg (2-4 uur) N'-Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-249-8 
Laat (12-16 uur) N-Fluoreen-2-ylaceetamide 
(2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Ook andere geschikte stollen kunnen als positieve controle worden 
gebruikt. Het is aanvaardbaar de positieve controle langs een andere weg toe te dienen dan de teststof.
 
1.5. UITVOERING  
1.5.1.  Aantal en geslacht van de dieren  
Er moet een afdoende aantal dieren worden gebruikt om rekening te 
houden met de natuurlijke biologische variatie in de respons op de 
test. Elke groep moet minimaal drie analyseerbare dieren bevatten. 
Wanneer er een significant basisbestand met gegevens uit het ver ­
leden is opgebouwd, zijn er voor de gelijktijdige negatieve en po ­
sitieve controlegroepen slechts één o(twee dieren nodig.  
Als er bij de uitvoering van de studie gegevens uit studies bij de ­
zelfde soort en met dezelfde blootstellingsweg beschikbaar zijn waar ­
uit blijkt dat er geen significante verschillen in toxiciteit tussen de 
geslachten zijn, is het voldoende de test bij één geslacht, bij voor ­
keur mannetjes, uit te voeren. Wanneer de blootstelling aan een chemische stof bij de mens door het geslacht wordt bepaald, zoals 
dit bijvoorbeeld bij sommige geneesmiddelen het geval is, moet de 
test bij dieren van het desbetreffende geslacht worden uitgevoerd.
 
1.5.2.  Behandelingsschema  
De teststof wordt in het algemeen in één behandeling toegediend.  
1.5.3.  Dosisniveaus  
Normaal gesproken worden er ten minste twee dosisniveaus gebruikt. 
De hoogste dosis wordt gedefinieerd als de dosis die zodanige toxi ­
citeitsverschijnselen veroorzaakt dat er bij hogere doses met het ­
zelfde doseringsschema waarschijnlijk sterfte zal optreden. In het 
algemeen wordt als laagste dosis 25-50 % van de hoogste dosis 
gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Stoffen met een specifieke biologische activiteit bij lage niet-toxische 
doses (zoals hormonen en mitogenen) kunnen een uitzondering vor ­
men op deze criteria om de dosering te bepalen en moeten per geval worden beoordeeld. Als er een oriënterend onderzoek wordt uitge ­
voerd omdat er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, moet dit 
in hetzelfde laboratorium gebeuren met dezelfde soort, dezelfde 
stam, hetzelfde geslacht en hetzelfde behandelingsschema als bij het hoofdonderzoek.
 
De hoogste dosis kan ook worden gedefinieerd als een dosis die 
enigerlei aanwijzing van toxiciteit in de lever oplevert (bv. pyknoti ­
sche kernen).  
1.5.4.  Limiettest  
Als een test met één dosis van minimaal 2 000 mg/kg lichaams ­
gewicht, in één keer of in twee porties op dezelfde dag toegediend, geen waarneembare toxische effecten veroorzaakt en op basis van 
gegevens over stoffen met een verwante structuur geen genotoxiciteit 
te verwachten valt, zal het wellicht niet nodig zijn een volledig onderzoek uit te voeren. Op grond van gegevens omtrent de ver ­
wachte blootstelling van de mens kan het gebruik van een hoger 
dosisniveau, bij de limiettest nodig worden geacht.
 
1.5.5.  Toediening van de doses  
De teststof wordt meestal met behulp van een maagsonde of een ge ­
schikte intubatiecanule toegediend. Ook andere toedieningswegen kun ­
nen aanvaardbaar zijn, als daarvoor een motivering kan worden gegeven. 
Intra-peritoneale toediening wordt echter niet aanbevolen, aangezien de lever dan rechtstreeks aan de teststof kan worden blootgesteld in plaats van via de bloedsomloop, tiet maximale volume vloeistof dat in één keer 
met een sonde of injectie kan worden toegediend, is afhankelijk van de 
grootte van het proefdier. Het volume mag niet groter zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Voor het gebruik van grotere volumes moet een moti ­
vering worden gegeven. Behalve bij prikkelende of bijtende stoffen, die 
in hogere concentraties meestal heviger effecten veroorzaken, moeten 
volumeverschillen tot een minimum worden beperkt door de concen ­
tratie aan te passen, zodat op alle dosisniveaus hetzelfde volume kan worden gebruikt.
 
1.5.6.  Levercelpreparaten  
Normaal gesproken worden twaalf tot 1» uur na de toediening van 
de teststof levercelpreparaten van de behandelde dieren gemaakt. Meestal is ook een eerder bemonsteringstijdstip (normaal gesproken 
twee tot vier uur na de behandeling! nodig, tenzij er op twaalf tot 16 
uur een duidelijke positieve reactie is. Er kunnen echter ook andere bemonsteringstijdstippen worden gebruikt, wanneer daarvoor op ba ­
sis van toxicokinetische gegevens een motivering kan worden gege ­
ven.
 
Meestal worden kortetermijnculturen van zoogdierlevercellen ge ­
maakt door de lever  in situ  met collagenase te perfuseren en de 
net losgemaakte levercellen zich te laten hechten aan een geschikt oppervlak. De levercellen van dieren uit de negatieve controlegroep moeten een levensvatbaarheid (5) van ten minste 50 % hebben
 
1.5.7.  Bepaling van de UDS  
Net geïsoleerde zoogdierlevercellen worden gedurende een geschikte 
periode, bijvoorbeeld drie tot acht uur, geïncubeerd met een medium dat meestal
 3 H-TdR bevat. Aan het eind van de incubatieperiode 
worden de cellen uit het medium verwijderd en kunnen ze vervol ­
gens worden geïncubeerd met medium dat een overmaat ongelabeld thymidine bevat, om de niet ingebouwde radioactiviteit te verdrijven („cold chase”). De cellen worden vervolgens gespoeld, gefixeerd en 
gedroogd. Bij een langduriger incubatietijd zal de „cold chase” wel ­
licht niet nodig zijn. De objectglaasjes worden in autoradiografischc emulsie gedoopt, in het donker belicht (bv. gekoeld gedurende zeven tot 14 dagen), ontwikkeld en gekleurd, waarna de belichte zilver ­
korrels worden geteld. Voor elk dier worden twee tot drie object ­
glaasjes geprepareerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analyse  
De geprepareerde objectglaasjes moeten voldoende cellen met een 
normale morfologie bevatten om een zinvolle bepaling van de UDS mogelijk te maken. De preparaten worden microscopisch onderzocht 
op tekenen van duidelijke cytotoxiciteit (bv. pyknose of een verlaagd 
gehalte aan het radioactieve isotoop).
 
De objectglaasjes worden vóór het tellen van de korrels gecodeerd. 
Normaal gesproken worden voor elk dier 100 cellen van ten minste twee objectglaasjes gescoord. Voor het scoren van minder dan 100 
cellen per dier moet een motivering worden gegeven.
 
Kr worden geen korrels geteld bij cellen waarvan de kern in de S- 
fase is, maar het relatieve aantal cellen in de S-fase kan wel geregis ­
treerd worden.  
Met behulp van geschikte methoden wordt aan de hand van de 
neergeslagen zilverkorrels de hoeveelheid ingebouwd  3 H-TdR in de 
kern en het cytoplasma van morfologisch normale cellen bepaald.  
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
De gegevens moeten voor elk objectglaasje en elk dier apart worden 
verstrekt. Daarnaast moet een overzicht van alle gegevens in tabel ­
vorm worden gegeven. Voor elke cel, voor elk dier en voor elke dosis en tijd wordt de nettokernkorreling (NKK) berekend volgens de formule: NKK = NK — CK. Als het aantal „cellen in herstel” 
wordt geteld, moet een motivering worden gegeven voor de criteria 
voor de definitie van „cel in herstel” op basis van de resultaten bij in het verleden of tegelijkertijd uitgevoerde negatieve controles. De numerieke resultaten kunnen met behulp van statistische methoden 
worden geëvalueerd. Als statistische tests worden gebruikt, moeten 
deze vóór de uitvoering van het onderzoek worden gekozen en ge ­
motiveerd.
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Criteria voor een positieve/negatieve respons zijn bijvoorbeeld: 
Positief i) NKK-waarden boven een vooraf bepaalde 
drempelwaarde die op basis van gegevens 
van het laboratorium uit het verleden wordt 
gemotiveerd; 
of ii) NKK-waarden die significant hoger zijn dan 
de gelijktijdige controle. 
Negatief i) NKK-waarden binnen/onder de controledrem ­
pelwaarde uit het verleden: 
of ii) NKK-waarden die niet significant hoger zijn 
dan de gelijktijdige controle.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Er moet naar de biologische relevantie van de gegevens worden 
gekeken. Daarbij moet bijvoorbeeld rekening worden gehouden 
met parameters als de spreiding over dieren, het verband tussen dosis en respons en de cytotoxiciteit. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen statistische methoden worden gebruikt. Sta ­
tistische significantie mag echter niet de enige bepalende factor voor 
een positieve reactie zijn.
 
Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve 
resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de 
effecten van de teststot in uitzonderingsgevallen onmogelijk zijn. 
De resultaten kunnen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald, onduidelijk of twijfelachtig blijven.
 
Positieve resultaten bij de UDS-test met levercellen van zoogdieren  
in vivo  wijzen erop dat een teststof  in vivo  DNA-beschadigingen in 
levercellen van zoogdieren induceert, die  in vitro  door DNA-herstel ­
synthese kunnen worden gerepareerd. Negatieve resultaten wijzen erop dat de teststof onder de testomstandigheden geen DNA-bescha ­
digingen induceert die met deze test kunnen worden gedetecteerd.
 
De waarschijnlijkheid dat de teststof in cc grote bloedsomloop of 
specifiek het doelweefsel terechtkomt (syste-mische toxiciteit), dient 
te worden besproken.  
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Oplosmiddel/Medium:  
— Motivering voor de keuze van het medium.  
— Oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/ ­
medium, indien bekend.  
Proefdieren:  
— Gebruikte soort/stam.  
— Aantal, leeftijd en geslacht van de dieren.  
— Herkomst, huisvesting, voeding, enz.  
— Het gewicht van elk dier aan het begin van de test, met ver ­
melding van de spreiding, het gemiddelde en de standaardafwij ­
king van het lichaamsgewicht voor elke groep.  
Testomstandigheden:  
— Positieve en negatieve (oplosmiddel/medium) controles.  
— Gegevens uit het oriënterende onderzoek, indien dit is uitge ­
voerd.  
— Achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus.  
— Gegevens over de bereiding van de teststof.  
— Gegevens over de toediening van de teststof.  
— Achtergrond voor de keuze van de toedieningsweg.  
— Methoden om na te gaan of de teststof in de grote bloedsomloop 
of het doelweefsel is terechtgekomen, indien van toepassing.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— Omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) in de feitelijke dosis (in mg/kg 
lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing.  
— Gegevens over de kwaliteit van het \oer en het drinkwater.  
— Een gedetailleerde beschrijving van het behandelings- en bemon ­
steringsschema.  
— Methoden voor de meting van de toxiciteit.  
— Methoden voor het kweken en prepareren van de levercellen.  
— Gebruikte autoradiografietechniek.  
— Aantal geprepareerde objectglaasjes en aantal gescoorde cellen.  
— Criteria voor de beoordeling.  
— Criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of on ­
duidelijk is.  
Resultaten:  
— Waarden voor de kernkorrels, de cytoplasmakorrels en de netto ­
kernkorreling voor elk objectglaasje apart, — gemiddeld voor elk 
dier en gemiddeld per groep.  
— Indien beschikbaar het verband tussen dosis en respons.  
— Eventuele statistische analyses.  
— Tekenen van toxiciteit.  
— Gegevens over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/ ­
medium) en positieve controles.  
— Gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve 
(oplosmiddel/medium) en positieve controles, met vermelding van spreiding, gemiddelde en standaardafwijking.
 
— Aantal „cellen in herstel”, indien bepaald.  
— Aantal cellen in de S-fase, indien bepaald.  
— Levensvatbaarheid van de cellen.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
(1) Ashby, j. Lefevre, P.A.., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985). An Assessment of the  In Vivo  Rat. Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.  
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mir ­
salis,). Probst, G. and Williams, G. (1987); A Protocol and Guide tor the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mu ­
tation Res., 189, pp. 123-133.
 
(3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
IS., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993),  In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (eds), 
Supplementary Muta- genicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge University 
Press. Cambridge, New York, Port Chester, Mel- bourne, Syd ­
ney, pp. 5 2-77.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean. S.W., Andrae, U., Brambilla. G., Burlinson, 
B., Doolittle, D.J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, CA. and 
Mori, H. (199 3). Recommendations tor the Performance of UDS Tests  In Vitro  and  In Vivo , Mutation Res., 312, pp. 26 
3-285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Via ­
bility and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the  In Vivo /In Vitro  DNA Repair Assay (UD.Sj. Mu ­
tation Res., 291, pp. 21-27.
 
(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982), De ­
tection of Genotoxic Carcinogens in the  in Vivo /In Vitro  Hepa­
tocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562.”  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  IN VITRO  -HUIDCORROSIE: TEST OP BASIS VAN DE 
TRANSCUTANE ELEKTRISCHE WEERSTAND (TEW)  
1. METHODE  
Deze testmethode komt overeen met OESO TG 430 (2004).  
1.1. INLEIDING  
Onder huidcorrosie wordt verstaan: het ontstaan van irreversibele 
weefselschade in de huid na het aanbrengen van een testmateriaal 
[zoals gedefinieerd in het GHS (Globally Harmonised System for 
Classification and Labelling of Chemicals, wereldwijd geharmoni ­
seerd stelsel voor de indeling en etikettering van chemische stoffen] (1). Bij deze testmethode wordt de corrosiviteit bepaald volgens een 
procedure waarbij geen levende dieren worden gebruikt.
 
De bepaling van de huidcorrosiviteit ging meestal gepaard met het 
gebruik van proefdieren (2). Vanwege de pijn en het lijden van dieren waarvan bij deze procedure sprake was, is testmethode B.4 zodanig aangepast dat huidcorrosie met behulp van alternatieve  in 
vitro -methoden kan worden bepaald, zodat pijn en lijden bij dieren 
kunnen worden vermeden.
 
Als eerste stap op weg naar de vaststelling van alternatieve tests die 
voor de bepaling van de huidcorrosiviteit met het oog op regelgeving kunnen worden gebruikt, zijn er prevalideringsstudies uitgevoerd (3). 
Daarna is een formele valideringsstudie van  in vitro -methoden voor 
de bepaling van de huidcorrosie (4)(5) uitgevoerd (6)(7)(8). Het resultaat van deze studies en andere gepubliceerde literatuur hebben geleid tot de aanbeveling dat de volgende tests voor de bepaling van 
de in vivo -huidcorrosiviteit kunnen worden gebruikt (9)(10)(11): de 
test met het humane huidmodel (zie testmethode B.40 bis) en de test op basis van de transcutane elektrische weerstand (deze methode).
 
Op grond van een valideringsstudie en andere gepubliceerde studies 
is gerapporteerd dat met de bepaling op basis van de transcutane elektrische weerstand (TEW) bij rattenhuid (12)(13) een betrouwbaar 
onderscheid kan worden gemaakt tussen stoffen waarvan bekend is 
dat ze corrosief c.q. niet-corrosief voor de huid zijn (5)(9).
 
Met de in deze methode beschreven test kunnen corrosieve che ­
mische stoffen en mengsels worden geïdentificeerd. Daarnaast kun ­
nen ook niet-corrosieve stoffen en mengsels worden geïdentificeerd 
wanneer ter ondersteuning de bewijskracht wordt bepaald met behulp 
van andere bestaande informatie (b.v. pH, structuur/activiteitrelaties en gegevens over mens en/of dier) (1)(2)(11)(14). De test levert geen informatie over huidirritatie op en ook een onderverdeling van cor ­
rosieve stoffen zoals in het GHS (1) is niet mogelijk.
 
Voor een volledige beoordeling van lokale huideffecten na één bloot ­
stelling op de huid wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te 
volgen die als bijlage bij testmethode B.4 (2) is opgenomen en ook in het GHS (1) wordt beschreven. Deze teststrategie behelst de uit ­
voering van  in vitro -tests op huidcorrosie (zoals in deze methode 
wordt beschreven) en huidirritatie voordat tests op levende dieren 
worden overwogen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINITIE  
Huidcorrosie  in vivo : het ontstaan van een irreversibele beschadi ­
ging van de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het aanbrengen van een teststof gedurende ten 
hoogste vier uur. Corrosieve reacties worden gekenmerkt door zwe ­
ren, bloedingen, bloederige korsten en aan het eind van de observatie na 14 dagen door verkleuring ten gevolge van het verbleken van de huid, stukken huidoppervlak die kaal geworden zijn en littekens. Om 
twijfelachtig letsel te evalueren moet histopathologie worden over ­
wogen.
 
Transcutane elektrische weerstand (TEW):  een maat voor de elek ­
trische impedantie van de huid, uitgedrukt als elektrische weerstand in kiloOhm. Dit is een eenvoudige en krachtige methode om de 
barrièrefunctie te bepalen door de passage van ionen door de huid 
met behulp van een brug van Wheatstone te registreren.
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Tabel 1:  
Referentiestoffen  
Naam EINECS-nr. CAS-nr.  
1,2-Diaminopropaan 201-155-9 78-90-0 Sterk corrosief 
Acrylzuur 201-177-9 79-10-7 Sterk corrosief 2-tert. Butylfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosief Kaliumhydroxide (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosief Zwavelzuur (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosief Octaanzuur (caprylzuur) 204-677-5 124-07-02 Corrosief 
4-Amino-1,2,4-triazool 209-533-5 584-13-4 Niet corrosief 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Niet corrosief Fenethylbromide 203-130-8 103-63-9 Niet corrosief Tetrachloorethyleen 204-825-9 27-18-4 Niet corrosief Isostearinezuur 250-178-0 30399-84-9 Niet corrosief 4-(Methylthio)benzaldeh yd 222-365-7 3446-89-7 Niet corrosief
 
De meeste vermelde chemische stoffen zijn afkomstig van de lijst 
van chemische stoffen die voor de internationale valideringsstudie 
van het ECVAM zijn gekozen (4). Ze zijn aan de hand van de volgende criteria gekozen:
 
i) een gelijk aantal corrosieve en niet-corrosieve stoffen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) in de handel verkrijgbare stoffen waarmee de meeste relevante 
chemische categorieën worden bestreken;  
iii) opneming van stoffen die sterk corrosief zijn en stoffen die 
minder corrosief zijn om onderscheid te kunnen maken op basis van de corrosiepotentie;
 
iv) keuze van chemische stoffen die in een laboratorium kunnen 
worden gebruikt zonder andere ernstige gevaren op te leveren 
dan corrosiviteit.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Het testmateriaal wordt gedurende maximaal 24 uur aangebracht op 
het oppervlak van de epidermis van huidschijfjes in een testsysteem met twee compartimenten waarin de huidschijfjes als scheiding tus ­
sen de compartimenten fungeren. De huidschijfjes worden weggeno ­
men uit de huid van op humane wijze gedode ratten met een leeftijd 
van 28-30 dagen. Corrosief materiaal wordt gekenmerkt doordat het een verlies van de normale intacte staat en barrièrefunctie van het stratum corneum kan veroorzaken, dat wordt gemeten als een daling 
van de TEW tot onder een drempelwaarde (12). Voor de TEW bij 
rattenhuid is een drempelwaarde van 5 k Ω gekozen op basis van 
uitgebreide gegevens voor een breed scala van chemische stoffen, waarbij de overgrote meerderheid van de waarden duidelijk boven 
(vaak > 10 k Ω) of duidelijk onder (vaak < 3 k Ω) deze waarde lag 
(12). In het algemeen verlagen materialen die bij dieren niet corrosief zijn maar wel irriterend of niet-irriterend, de TEW niet tot onder de drempelwaarde. Bovendien kan het gebruik van andere huidprepara ­
ten of andere apparatuur deze drempelwaarde veranderen, zodat een 
verdere validering nodig is.
 
In de testprocedure wordt een kleurstofbindende stap opgenomen als 
bevestigende test voor positieve resultaten bij de TEW, onder andere voor waarden rond de 5 k Ω. Met de kleurstofbindende stap wordt 
bepaald of de toename van de permeabiliteit voor ionen door een 
fysieke vernietiging van het stratum corneum wordt veroorzaakt. Er is aangetoond dat met de TEW-methode met rattenhuid een prognose 
kan worden gegeven voor de  in vivo -bepaling van de corrosiviteit bij 
het konijn volgens testmethode B.4 (2). Er dient te worden opge ­
merkt dat de  in vivo -test bij het konijn ten aanzien van huidcorrosi ­
viteit en huidirritatie zeer conservatief is in vergelijking met de test 
met een humane huidpatch (15).
 
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Dieren  
Omdat de gevoeligheid van de huid van ratten voor chemische stof ­
fen bij deze test al eerder is aangetoond (10), wordt de voorkeur gegeven aan deze species. De leeftijd (wanneer de huid wordt weg ­
genomen) en de stam van de rat zijn heel belangrijk om ervoor te 
zorgen dat de haarfollikels in de rustfase verkeren voordat de vol ­
wassen haargroei begint.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Het haar op de rug en de flanken van jonge (ongeveer 22 dagen 
oude) mannetjes- of vrouwtjesratten (Wistar of een vergelijkbare 
stam) wordt met een kleine schaar zorgvuldig verwijderd. De dieren worden vervolgens gewassen door zorgvuldig te wrijven terwijl het geknipte gebied wordt ondergedompeld in een antibiotica-oplossing 
(die bijvoorbeeld streptomycine, penicilline, chlooramfenicol en am ­
fotericine bevat in concentraties die werkzaam zijn voor het remmen van de groei van bacteriën). De dieren worden op de derde of vierde dag na de eerste keer wassen opnieuw met antibiotica gewassen en 
worden binnen drie dagen na de tweede keer wassen, wanneer het 
stratum corneum zich van de verwijdering van het haar hersteld heeft, gebruikt.
 
1.5.2.  Het prepareren van de huidschijfjes  
De dieren worden op humane wijze gedood wanneer ze 28-30 dagen 
oud zijn; deze leeftijd is van cruciaal belang. Vervolgens wordt de 
huid van de rug en de flanken van elk dier verwijderd en van overtollig onderhuids vet ontdaan door het voorzichtig van de huid 
los te trekken. Daarna worden er huidschijfjes verwijderd met een 
diameter van ongeveer 20 mm per stuk. De huid mag worden be ­
waard voordat de schijfjes worden gebruikt, wanneer wordt aange ­
toond dat de gegevens van de positieve en negatieve controles gelijk ­
waardig zijn aan die van verse huid.
 
Elk huidschijfje wordt over een van de uiteinden van een PTFE-buis 
(polytetrafluoretheen) gelegd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het 
oppervlak van de epidermis in contact met de buis is. Een rubber 
„O”-ring wordt strak over het uiteinde van de buis geschoven om de huid op zijn plaats te houden en het overtollige weefsel wordt weg ­
geknipt. In figuur 2 worden de afmetingen van de buis en de „O”- 
ring aangegeven. Vervolgens wordt de rubber „O”-ring zorgvuldig 
met vaseline aan de PTFE-buis vastgekit. De buis wordt met een klemring vastgezet in een receptorcompartiment dat een MgSO
 4 -op­
lossing (154 mM) bevat (figuur 1). Het huidschijfje moet volledig in 
de MgSO  4 -oplossing worden ondergedompeld. Van één rattenhuid 
kunnen wel 10-15 huidschijfjes worden gemaakt.  
Voordat de test begint, wordt als kwaliteitsborgingsprocedure voor 
elke rattenhuid de elektrische weerstand van twee huidschijfjes ge ­
meten. Als bij beide schijfjes een weerstand van meer dan 10 k Ω 
wordt gemeten, mogen de overige schijfjes voor de test worden gebruikt. Als de gemeten weerstand lager dan 10 k Ω is, mogen de 
overige schijfjes van die huid niet worden gebruikt.
 
1.5.3.  Aanbrengen van de test- en controlestoffen  
Voor elke studie moeten parallelle positieve en negatieve controles 
worden gebruikt om na te gaan of het experimentele model afdoende 
functioneert. Er moeten huidschijfjes van één dier worden gebruikt. 
Als positieve en negatieve controlestof worden respectievelijk 10 M zoutzuur en gedestilleerd water aanbevolen.
 
Vloeibare teststoffen (150 μl) worden gelijkmatig op het oppervlak 
van de epidermis in de buis aangebracht. Wanneer vast materiaal wordt getest, wordt een zodanige hoeveelheid van de vaste stof gelijkmatig op het schijfje aangebracht, dat het hele oppervlak van 
de epidermis bedekt is. Vervolgens wordt gedeïoniseerd water (150 
μl) boven op de vaste stof toegevoegd en wordt de buis voorzichtig 
geschud. Om voor een maximaal contact met de huid te zorgen kan het nodig zijn dat vaste stoffen tot 30
 o C worden verwarmd om de 
teststof te laten smelten of zachter te maken of worden fijngemalen 
om een korrelig materiaal of poeder te verkrijgen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Voor elke test- en controlestof worden drie huidschijfjes gebruikt. De 
teststoffen worden gedurende 24 uur bij 20-23  o C aangebracht. De test ­
stof wordt verwijderd door onder een straal leidingwater van maximaal 30
 o C te wassen tot er geen materiaal meer kan worden verwijderd.  
1.5.4.  TEW-metingen  
De impedantie van de huid wordt als TEW gemeten met een wissel ­
stroommeetbrug van Wheatstone voor zwakstroom (13). Algemene spe ­
cificaties van de brug zijn: bedrijfsspanning 1-3 Volt, een sinusvormige 
of rechthoekige wisselstroom van 50-1 000 Hz en een meetbereik van ten minste 0,1-30 k Ω. Met de bij de valideringsstudie gebruikte meet ­
brug konden inductantie, capacitantie en weerstand worden gemeten tot 
waarden van respectievelijk 2 000 H, 2 000 μF en 2 MΩ, bij frequenties 
van 100 Hz of 1 kHz, met seriële of parallelle waarden. Voor de TEW- corrosiviteitsbepaling worden de metingen geregistreerd in weerstand bij een frequentie van 100 Hz en met seriële waarden. Alvorens de elek ­
trische weerstand te meten wordt de oppervlaktespanning van de huid 
verlaagd door zoveel 70 % ethanol toe te voegen dat de epidermis bedekt is. Na enkele seconden wordt de ethanol uit de buis verwijderd en wordt 
het weefsel gehydrateerd door 3 ml MgSO
 4 -oplossing (154 mM) toe te 
voegen. De elektroden van de meetbrug worden aan weerszijden van het huidschijfje geplaatst om de weerstand in k Ω/huidschijfje te meten (zie 
figuur 1). De afmetingen van de elektrode en de lengte van het stuk 
elektrode dat onder de krokodillenklem uitkomt, zijn vermeld in figuur 
2. De klem van de binnenste elektrode rust tijdens de weerstandsmeting op de bovenkant van de PTFE-buis om ervoor te zorgen dat steeds een even lang stuk van de elektrode in de MgSO
 4 -oplossing steekt. De 
buitenste elektrode wordt zodanig in het receptorcompartiment geplaatst 
dat deze op de bodem van het compartiment rust. De afstand tussen de klemring en de onderkant van de PTFE-buis wordt constant gehouden (zie figuur 2), aangezien deze afstand de gemeten weerstand beïnvloedt. 
Dit houdt in dat de afstand tussen de binnenste elektrode en het huid ­
schijfje constant en minimaal moet zijn (1-2 mm).
 
Als de gemeten weerstand hoger is dan 20 k Ω, kan dit worden 
veroorzaakt door de resten van de teststof waarmee het oppervlak 
van de epidermis van het huidschijfje bedekt is. Deze laag kan men 
verder trachten te verwijderen door bijvoorbeeld de PTFE-buis met de duim (met handschoen) dicht te houden en gedurende ongeveer 10 seconden te schudden. De MgSO
 4 -oplossing wordt weggegooid 
en de weerstandsmeting wordt met verse MgSO  4 -oplossing herhaald.  
De eigenschappen en afmetingen van de gebruikte testapparatuur en 
de testprocedure kunnen de gevonden TEW-waarden beïnvloeden. De drempelwaarde voor corrosie van 5 k Ω is bepaald op grond 
van gegevens die met de specifieke hier beschreven apparatuur en 
procedure zijn verkregen. Als de testomstandigheden worden gewij ­
zigd of andere apparatuur wordt gebruikt, zullen de drempel- en controlewaarden dan ook wellicht verschillen. Daarom moeten de 
methodologie en de drempelwaarden voor de weerstand worden ge ­
kalibreerd door een aantal referentiestandaards te testen die worden gekozen uit de chemische stoffen die bij de valideringsstudie zijn gebruikt (4)(5) of uit vergelijkbare chemische categorieën als de 
chemische stoffen die worden bestudeerd. In tabel 1 is een verzame ­
ling geschikte referentiestoffen opgenomen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Kleurstofbindingsmethoden  
Blootstelling aan bepaalde niet-corrosieve materialen kan leiden tot 
een daling van de weerstand tot onder de drempelwaarde van 5 k Ω, 
waardoor ionen het stratum corneum kunnen passeren en de elek ­
trische weerstand daalt (5). Neutrale organische stoffen en chemische 
stoffen met oppervlakteactieve eigenschappen (zoals detergenten, emulgatoren en andere surfactanten) kunnen huidlipiden verwijderen waardoor de permeabiliteit van de barrière voor ionen toeneemt. Dit 
betekent dat er, als de TEW-waarden van teststoffen lager zijn dan 5 
kΩ of rond deze waarde liggen en er geen sprake is van visuele 
schade, een bepaling van de kleurstofpenetratie bij de controles en de 
behandelde weefsels dient te worden uitgevoerd om vast te stellen of 
de gemeten TEW-waarden het gevolg zijn van een toegenomen per ­
meabiliteit van de huid of huidcorrosie (3)(5). Wanneer in het laatste geval het stratum corneum beschadigd is, penetreert de kleurstof 
sulforhodamine B snel na aanbrengen op het huidoppervlak en kleurt 
deze het weefsel daaronder. Deze specifieke kleurstof is stabiel voor een breed scala van chemische stoffen en wordt niet beïnvloed door onderstaande extractieprocedure.
 
1.5.5.1.  Aanbrengen en verwijderen van de kleurstof sulforhodamine B  
Na de TEW-bepaling wordt de magnesiumsulfaatoplossing uit de 
buis verwijderd en wordt de huid zorgvuldig onderzocht op zichtbare beschadiging. Als er geen zichtbare significante beschadiging is, wordt 150 μl van een 10 %-verdunning (g/v) van de kleurstof sul ­
forhodamine B (Acid Red 52; C.I. 45100; EINECS-nummer 222- 
529-8; CAS-nummer 3520-42-1) in gedestilleerd water gedurende twee uur op het oppervlak van de epidermis van elk huidschijfje aangebracht. De huidschijfjes worden vervolgens gedurende onge ­
veer 10 seconden met leidingwater van ten hoogste kamertempera ­
tuur gewassen om een eventuele overmaat of ongebonden kleurstof te verwijderen. Elk huidschijfje wordt voorzichtig van de PTFE-buis verwijderd en in een flesje (bv. een glazen scintillatieflesje van 
20 ml) met gedeïoniseerd water (8 ml) gelegd. De flesjes worden 
gedurende 5 minuten zachtjes geschud om eventueel nog resterende ongebonden kleurstof te verwijderen. Daarna wordt deze waspro ­
cedure herhaald en vervolgens worden de huidschijfjes in flesjes 
met 5 ml 30 % (g/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedestilleerd 
water gelegd en een nacht bij 60
 o C geïncubeerd.  
Na incubatie wordt elk huidschijfje verwijderd en weggegooid en 
wordt de resterende oplossing gedurende 8 minuten bij 21  o C gecen­
trifugeerd (relatieve centrifugale kracht ~ 175 × g). Vervolgens wordt 1 ml van het supernatans 1:5 (v/v) [d.w.z. 1 ml + 4 ml] verdund met 30 % (g/v) SDS in gedestilleerd water. De optische dichtheid (OD) 
van de oplossing wordt bij 565 nm gemeten.
 
1.5.5.2.  Berekening van het kleurstofgehalte  
Het gehalte aan de kleurstof sulforhodamine B per schijfje wordt 
berekend uit de OD-waarden (5) (de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof sulforhodamine B bij 565 nm = 8,7 × 10
 4 en het 
molecuulgewicht = 580). Het gehalte aan de kleurstof wordt voor elk 
huidschijfje bepaald door een geschikte kalibratiecurve te gebruiken en vervolgens wordt voor de duplo's een gemiddeld kleurstofgehalte berekend.
 
2. GEGEVENS  
De weerstand (in k Ω) en, indien van toepassing, het gemiddelde 
kleurstofgehalte (in Hg/schijfje) voor het testmateriaal en de posi ­
tieve en negatieve controles worden in tabelvorm gerapporteerd (ge ­
gevens van de experimenten afzonderlijk en gemiddelden ± stan ­
daarddeviatie), met vermelding van gegevens voor duplobepalingen, 
herhaalde bepalingen, gemiddelden en de afzonderlijke waarden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De gemiddelde TEW-resultaten worden geaccepteerd als de parallelle 
positieve en negatieve controlewaarden binnen het voor de methode in het testlaboratorium aanvaardbare bereik liggen. Het aanvaardbare 
weerstandsbereik voor de in het voorgaande beschreven methodolo ­
gie en apparatuur wordt in onderstaande tabel vermeld:
 
Controle Stof Weerstandsbe ­
reik (kΩ) 
Positief 10 M zoutzuur 0,5-1,0 
Negatief Gedestilleerd water 10-25  
De gemiddelde resultaten voor de kleurstofbinding worden geaccep ­
teerd, mits de parallelle controlewaarden binnen het voor de methode aanvaardbare bereik liggen. Als aanvaardbaar bereik voor het kleur ­
stofgehalte bij de controlestoffen voor de in het voorgaande beschre ­
ven methodologie en apparatuur wordt voorgesteld:
 
Controle Stof Bereik 
kleurstofgehalte 
(μg/schijf)  
Positief 10 M zoutzuur 40-100 
Negatief Gedestilleerd water 15-35  
De teststof wordt als niet-corrosief voor de huid beschouwd:  
i) als de gemiddelde TEW-waarde voor de teststof hoger dan 5 k Ω 
is of  
ii) als de gemiddelde TEW-waarde niet hoger dan 5 k Ω is en  
— het huidschijfje geen duidelijke beschadiging vertoont en  
— het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje duidelijk la ­
ger is dan het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje van de parallel behandelde positieve controle met 10 M HCl.
 
De teststof wordt als corrosief voor de huid beschouwd:  
i) als de gemiddelde TEW-waarde niet hoger dan 5 k Ω is en het 
huidschijfje duidelijk beschadigd is of  
ii) als de gemiddelde TEW-waarde niet hoger dan 5 k Ω is en  
— het huidschijfje geen duidelijke beschadiging vertoont maar  
— het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje ten minste 
gelijk is aan het gemiddelde kleurstofgehalte van het schijfje 
van de parallel behandelde positieve controle met 10 M HCl.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTRAPPORT  
In het testrapport moet ten minste de volgende informatie worden 
opgenomen:  
Test- en controlestoffen:  
— de chemische naam of namen, zoals de IUPAC- of de CAS- 
naam, en het CAS-nummer, indien dit bekend is;  
— de zuiverheid en de samenstelling van de stof of het preparaat (in 
gewichtsprocent) en de fysische toestand;  
— fysisch-chemische eigenschappen, zoals de fysische toestand, de 
pH, de stabiliteit, de oplosbaarheid in water, die voor de uitvoe ­
ring van het onderzoek relevant zijn;  
— de behandeling van de test- en controlestoffen vóór de test, in ­
dien van toepassing (bv. verwarmen of fijnmalen);  
— de stabiliteit, indien bekend.  
Proefdieren:  
— gebruikte stam en geslacht;  
— leeftijd van de dieren wanneer ze als donordieren worden ge ­
bruikt;  
— bron, huisvestingsomstandigheden, voer enz.;  
— gedetailleerde gegevens over het prepareren van de huid  
Testomstandigheden:  
— kalibratiecurves voor de testapparatuur;  
— kalibratiecurves voor de resultaten voor de kleurstofbindingstest;  
— gedetailleerde gegevens over de voor de TEW-metingen ge ­
bruikte testprocedure;  
— gedetailleerde gegevens over de voor de bepaling van de kleur ­
stofbinding gebruikte testprocedure, indien van toepassing;  
— een beschrijving van eventuele wijzigingen in de testprocedure;  
— een beschrijving van de gebruikte evaluatiecriteria.  
Resultaten:  
— een tabel met de gegevens van de bepaling van de TEW en de 
kleurstofbinding (indien van toepassing) voor afzonderlijke die ­
ren en afzonderlijke huidmonsters;  
— een beschrijving van waargenomen effecten.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusie.  
4. REFERENTIES  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification 
System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, 
Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2. Testmethode B.4. Acute toxiciteit: Huidirritatie/corrosie.  
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, DJ., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 
23, 219-255.
 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international valida ­
tion study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic,  in Vitro  12, 471-482.  
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhiitter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic,  in Vitro  12, 483-524.
 
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62 pp.  
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sci ­
ences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs. 
nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 
9. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.  
10. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In Vitro  test me­
thods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Sci ­
ences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. mehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
11. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
Vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat.  
12. Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13. Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. 
(1992). The skin corrosivity test  in vitro : results of an inter ­
laboratory trial. Toxic,  in Vitro  6, 191-194.  
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 
709-720.  
15. Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845- 852.
 
16. Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An  In 
Vitro  model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic.  in Vitro . 2, 7-17.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figuur 1:  
Apparatuur voor de TEW-bepaling bij rattenhuid binnenste (dikke) elektrode
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figuur 2:  
Afmetingen van de PTFE-buis (polytetrafluoretheen) en het receptorcompartiment 
en de gebruikte elektroden
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Kritische factoren van bovenstaande apparatuur:  
— de binnendiameter van de PTFE-buis;  
— de lengte van de elektroden in vergelijking met de PTFE-buis en 
het receptorcompartiment, zodat de elektroden het huidschijfje 
niet raken en altijd een even lang stuk van de elektrode in contact met de MgSO
 4 -oplossing is;  
— de hoeveelheid MgSO  4 -oplossing in het receptorcompartiment 
moet zodanig zijn dat het vloeistofniveau lager is dan in de 
PTFE-buis (zie figuur 1);  
— het huidschijfje moet stevig genoeg op de PTFE-buis worden 
bevestigd, zodat de elektrische weerstand een reële maat voor de eigenschappen van de huid is.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40 BIS.  IN-VITRO  HUIDCORROSIE: TEST MET HUMAAN 
HUIDMODEL  
1. METHODE  
Deze testmethode komt overeen met OESO TG 431 (2004).  
1.1. INLEIDING  
Onder huidcorrosie wordt verstaan: het ontstaan van irreversibele 
weefselschade in de huid na het opbrengen van een testmateriaal 
(zoals gedefinieerd in het GHS (Globally Harmonised System for 
Classification and Labelling of Chemicals, wereldwijd geharmoni ­
seerd stelsel voor de indeling en etikettering van chemische stoffen) (1). Bij deze testmethode behoeven voor de bepaling van de huid ­
corrosiviteit geen levende dieren of dierlijk weefsel te worden ge ­
bruikt.
 
De bepaling van de huidcorrosiviteit ging meestal gepaard met het 
gebruik van proefdieren (2). Vanwege de pijn en het lijden van dieren waarvan bij deze procedure sprake was, is testmethode B.4 
zodanig aangepast dat huidcorrosie met behulp van alternatieve in- 
vitro methoden kan worden bepaald, zodat pijn en lijden bij dieren kunnen worden vermeden.
 
Als eerste stap op weg naar de vaststelling van alternatieve tests die 
voor de bepaling van de huidcorrosiviteit met het oog op regelgeving kunnen worden gebruikt, zijn er prevalideringsstudies uitgevoerd (3). 
Daarna is een formele valideringsstudie van in-vitro methoden voor 
de bepaling van de huidcorrosie (4)(5) uitgevoerd (6)(7)(8). Het resultaat van deze studies en andere gepubliceerde literatuur (9) hebben geleid tot de aanbeveling dat de volgende tests voor de 
bepaling van de in-vivo huidcorrosiviteit kunnen worden gebruikt 
(10)(11)(12)(13): de test met het humane huidmodel (deze methode) en de test op basis van de transcutane elektrische weerstand (zie testmethode B.40).
 
Op grond van valideringsstudies is gerapporteerd dat met tests waar ­
bij humane huidmodellen worden gebruikt (3)(4)(5)(9), een betrouw ­
baar onderscheid kan worden gemaakt tussen stoffen waarvan be ­
kend is dat ze corrosief c.q. niet-corrosief voor de huid zijn. Boven ­
dien kan met het testprotocol wellicht ook een indicatief onderscheid 
worden gemaakt tussen stoffen met een meer of minder hevige cor ­
rosieve werking op de huid.  
Met de in deze methode beschreven test kunnen corrosieve che ­
mische stoffen en mengsels worden geïdentificeerd. Daarnaast kun ­
nen ook niet-corrosieve stoffen en mengsels worden geïdentificeerd wanneer ter ondersteuning de bewijskracht wordt bepaald met behulp 
van andere bestaande informatie (bv. pH, structuur/activiteitrelaties 
en gegevens over mens en/of dier) (1)(2)(13)(14). Normaal gespro ­
ken levert de test niet voldoende informatie over huidirritatie op en is ook een onderverdeling van corrosieve stoffen zoals in het GHS (1) 
niet mogelijk.
 
Voor een volledige beoordeling van lokale huideffecten na één bloot ­
stelling op de huid wordt aanbevolen de sequentiële teststrategie te 
volgen die als bijlage bij testmethode B.4 (2) is opgenomen en ook in het GHS (1) wordt beschreven. Deze teststrategie behelst de uit ­
voering van in-vitrotests op huidcorrosie (zoals in deze methode 
wordt beschreven) en huidirritatie voordat tests op levende dieren 
worden overwogen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. DEFINITIES  
Huidcorrosie  in vivo : het ontstaan van een irreversibele beschadi ­
ging van de huid, namelijk zichtbare necrose door de epidermis heen in de dermis, na het opbrengen van een teststof gedurende ten hoog ­
ste vier uur. Corrosieve reacties worden gekenmerkt door zweren, 
bloedingen, bloederige korsten en aan het eind van de observatie na 14 dagen door verkleuring ten gevolge van het verbleken van de huid, stukken huidoppervlak die kaal geworden zijn en littekens. Om 
twijfelachtig letsel te evalueren moet histopathologie worden over ­
wogen.
 
Levensvatbaarheid van cellen:  een parameter waarmee de totale 
activiteit van een celpopulatie wordt gemeten (bv. het vermogen 
van cellulaire mitochondriale dehydrogenases om de vitale kleurstof MTT te reduceren) die, afhankelijk van het gemeten eindpunt en de opzet van de test, is gecorreleerd met het totale aantal en/of de 
vitaliteit van de cellen.
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Tabel 1:  
Referentiestoffen  
Naam EINECS-nr. CAS-nr.  
1,2-Diaminopropaan 201-155-9 78-90-0 Sterk corrosief 
Acrylzuur 201-177-9 79-10-7 Sterk corrosief 2-tert.-Butylfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosief 
Kaliumhydroxide (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosief 
Zwavelzuur (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosief Octaanzuur (caprylzuur) 204-677-5 124-07-02 Corrosief 4-Amino-1,2,4-triazool 209-533-5 584-13-4 Niet-corrosief Eugenol 202-589-1 97-53-0 Niet-corrosief Fenethylbromide 203-130-8 103-63-9 Niet-corrosief 
Tetrachloorethyleen 204-825-9 27-18-4 Niet-corrosief 
Isostearinezuur 250-178-0 30399-84-9 Niet-corrosief 4- (Methylthio)benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Niet-corrosief
 
De meeste vermelde chemische stoffen zijn afkomstig van de lijst 
van chemische stoffen die voor de internationale valideringsstudie 
van het ECVAM zijn gekozen (4). Ze zijn aan de hand van de 
volgende criteria gekozen:  
i) een gelijk aantal corrosieve en niet-corrosieve stoffen;  
ii) in de handel verkrijgbare stoffen waarmee de meeste relevante 
chemische categorieën worden bestreken;  
iii) opneming van stoffen die sterk corrosief zijn en stoffen die 
minder corrosief zijn om onderscheid te kunnen maken op basis 
van de corrosiepotentie;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) keuze van chemische stoffen die in een laboratorium kunnen 
worden gebruikt zonder andere ernstige gevaren op te leveren 
dan corrosiviteit.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Het testmateriaal wordt plaatselijk aangebracht op een driedimensi ­
onaal humaan huidmodel, bestaande uit ten minste een gereconstru ­
eerde epidermis met een functioneel stratum corneum. Corrosieve 
materialen worden geïdentificeerd doordat zij bij gespecificeerde 
blootstellingsperioden een daling van de levensvatbaarheid van de cellen [die bijvoorbeeld wordt bepaald door de reductie van MTT te meten (15)] tot onder gedefinieerde drempelwaarden kunnen veroor ­
zaken. Het principe van de bepaling met het humane huidmodel is 
gebaseerd op de hypothese dat corrosieve chemische stoffen door diffusie of erosie het stratum corneum kunnen penetreren en cyto ­
toxisch zijn voor de daaronder liggende cellagen.
 
1.4.1.  Procedure  
1.4.1.1.  Humane huidmodellen  
Humane huidmodellen kunnen op commerciële basis worden ver ­
vaardigd of verkregen (bv. de modellen EpiDerm™ en EPISKIN™) (16)(17)(18)(19) of in het testlaboratorium worden ontwikkeld of vervaardigd (20)(21). Voor het gebruik van menselijke huid gelden 
nationale en internationale ethische overwegingen en voorwaarden. 
Elk nieuw model moet worden gevalideerd (ten minste overeenkom ­
stig de beschrijving onder 1.4.1.1.2). De voor deze test gebruikte humane huidmodellen moeten aan de volgende voorwaarden vol ­
doen:
 
1.4.1.1.1. A l g e m e n e m o d e l v o o r w a a r d e n :  
Om het epitheel op te bouwen moeten humane keratocyten worden 
gebruikt. Er moeten verschillende lagen levende epitheelcellen aan ­
wezig zijn onder een functioneel stratum corneum. Het huidmodel 
kan ook een laag met een stromale component hebben. Het stratum 
corneum moet uit verschillende lagen bestaan met het benodigde lipidenprofiel om te zorgen voor een functionele barrière die krachtig genoeg is om een snelle penetratie van cytotoxische markers tegen te 
gaan. De insluitingseigenschappen van het model moeten voorkomen 
dat materiaal om het stratum corneum heen in het levende weefsel terechtkomt. Als teststoffen om het stratum corneum heen kunnen 
komen, levert dit een slecht model voor blootstelling van de huid op. 
Het huidmodel mag niet verontreinigd zijn met bacteriën (met in ­
begrip van mycoplasma) of fungi.
 
1.4.1.1.2 F u n c t i o n e l e m o d e l v o o r w a a r d e n :  
De levensvatbaarheid wordt meestal gekwantificeerd met behulp van 
MTT of de andere metabool omgezette vitale kleurstoffen. In deze 
gevallen moet de optische dichtheid (OD) van de geëxtraheerde (opgeloste) kleurstof uit het negatieve controleweefsel ten minste 20 keer zo hoog zijn als de OD van het extractieoplosmiddel alleen 
[zie voor een overzicht (22)]. Het negatieve controleweefsel moet 
gedurende de volledige blootstellingsperiode van de test in cultuur stabiel zijn (een vergelijkbare gemeten levensvatbaarheid opleveren). Het stratum corneum moet krachtig genoeg zijn om de snelle pene ­
tratie van bepaalde cytotoxische markers (bv. 1 % Triton X-100) 
tegen te gaan. Deze eigenschap kan worden bepaald aan de hand van de blootstellingstijd die nodig is om de levensvatbaarheid van de cellen met 50 % te verlagen (ET
 50 ) (voor de modellen EpiDerm™ en 
EPISKIN™ is dit bv. > 2 uur). Er moet worden aangetoond dat het 
weefsel in de loop van de tijd en bij voorkeur van laboratorium tot laboratorium reproduceerbaar is. Bovendien moet daarmee een prog ­
nose kunnen worden gegeven van de corrosiepotentie van de refe ­
rentiechemicaliën (zie tabel 1) wanneer deze volgens het gekozen 
testprotocol worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Opbrengen van de teststof en de controlestoffen  
Voor elke behandeling (blootstellingstijd), ook voor de controles, 
worden twee duploweefsels gebruikt. Voor vloeibaar materiaal moet er zo veel teststof worden opgebracht dat het huidoppervlak 
uniform bedekt is: er moet ten minste 25 μl/cm
 2 worden gebruikt. 
Voor vast materiaal moet er zo veel teststof worden opgebracht dat het huidoppervlak gelijkmatig bedekt is en dit moet vervolgens met gedeïoniseerd of gedestilleerd water worden bevochtigd om voor een 
goed contact met de huid te zorgen. Indien nodig moeten vaste 
stoffen tot een poeder worden vermalen voordat ze worden opge ­
bracht. De wijze van opbrengen moet geschikt zijn voor de teststof 
(zie bijvoorbeeld referentie 5). Aan het eind van de blootstellings ­
periode moet het testmateriaal zorgvuldig van het huidoppervlak worden gewassen met een geschikte buffer of 0,9 % NaCl.
 
Voor elke studie moeten parallelle positieve en negatieve controles 
worden gebruikt om na te gaan of het experimentele model afdoende functioneert. Als positieve controlestoffen worden ijsazijn of 8 N 
KOH aanbevolen. Als negatieve controles worden 0,9 % NaCl of 
water aanbevolen.
 
1.4.1.3.  Meting van de levensvatbaarheid van de cellen  
Voor de meting van de levensvatbaarheid van de cellen kunnen 
alleen kwantitatieve gevalideerde methoden worden gebruikt. Boven ­
dien moet de meting van de levensvatbaarheid compatibel zijn met gebruik in een driedimensionaal weefselpreparaat. De meting van de 
levensvatbaarheid mag niet worden gestoord door niet-specifieke 
kleurstofbinding. Eiwitbindende kleurstoffen en kleurstoffen die geen metabole omzetting ondergaan (bijvoorbeeld neutraalrood), zijn derhalve niet geschikt. De meest gebruikte bepaling is de reduc ­
tie van MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbro ­
mide, thiazolylblauw: EINECS-nummer 206-069-5, CAS-nummer 298-93-1)], waarvan is aangetoond dat deze nauwkeurige en repro ­
duceerbare resultaten oplevert (5), maar ook andere bepalingen kun ­
nen worden gebruikt. Het huidmonster wordt gedurende 3 uur bij 
een geschikte incubatietemperatuur in een MTT-oplossing met een geschikte concentratie (bv. 0,3-1 mg/ml) gelegd. Er ontstaat een 
blauw formazanneerslag dat vervolgens wordt geëxtraheerd met 
een oplosmiddel (isopropanol) en de formazanconcentratie wordt gemeten door de OD bij een golflengte tussen 540 en 595 nm te bepalen.
 
De chemische effecten van het testmateriaal op de vitale kleurstof 
kunnen de effecten van het cellulaire metabolisme nabootsen, het ­
geen tot een onjuiste bepaling van de levensvatbaarheid leidt. Er is 
aangetoond dat dit gebeurt wanneer dit testmateriaal niet volledig door wassen van de huid wordt verwijderd (9). Als het testmateriaal rechtstreekse effecten op de vitale kleurstof heeft, moeten er aan ­
vullende controles worden gebruikt om storing van de meting van de 
levensvatbaarheid door de teststoffen te detecteren en daarvoor te corrigeren (9)(23).
 
2. GEGEVENS  
Voor elk weefsel moeten de OD-waarden en de berekende procen ­
tuele levensvatbaarheid van de cellen voor het testmateriaal en de positieve en negatieve controles in tabelvorm worden gerapporteerd, 
met vermelding van gegevens over duplobepalingen, eventueel her ­
haalde bepalingen, gemiddelden en de afzonderlijke waarden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De voor elk testmonster verkregen OD-waarden kunnen worden ge ­
bruikt voor de berekening van een procentuele levensvatbaarheid in vergelijking met de negatieve controle, die a priori op 100 % wordt 
gesteld. De drempelwaarde van de procentuele levensvatbaarheid van 
de cellen die als scheiding tussen corrosieve en niet-corrosieve test ­
materialen (of tussen verschillende klassen van corrosiviteit) fun ­
geert, of de statistische procedure die wordt gebruikt om de resulta ­
ten te evalueren en corrosieve materialen te identificeren, moet dui ­
delijk worden gespecificeerd en gedocumenteerd en de juistheid daarvan moet worden aangetoond. In het algemeen worden deze 
drempelwaarden tijdens het optimaliseren van de test bepaald, tijdens 
de prevalideringsfase getest en bij een valideringsstudie bevestigd. De voorspelling van corrosiviteit bij het model EpiDerm™ is bij ­
voorbeeld (9):
 
De teststof wordt als  corrosief voor de huid beschouwd:  
i) als de levensvatbaarheid na 3 minuten blootstelling minder dan 
50 % is of  
ii) als de levensvatbaarheid na 3 minuten blootstelling 50 % of 
hoger is en de levensvatbaarheid na 1 uur blootstelling minder 
dan 15 % is.  
De teststof wordt als  niet-corrosief voor de huid beschouwd:  
i) als de levensvatbaarheid na 3 minuten blootstelling 50 % of 
hoger is en de levensvatbaarheid na 1 uur blootstelling 15 % 
of hoger is.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTRAPPORT  
In het testrapport moet ten minste de volgende informatie worden 
opgenomen:  
Test- en controlestof:  
— de chemische naam of namen, zoals de IUPAC- of de CAS- 
naam, en het CAS- nummer, indien dit bekend is;  
— de zuiverheid en de samenstelling van de stof of het preparaat (in 
gewichtsprocent);  
— fysisch-chemische eigenschappen, zoals de fysische toestand, de 
pH, de stabiliteit, de oplosbaarheid in water, die voor de uitvoe ­
ring van het onderzoek relevant zijn;  
— de behandeling van de test- en controlestoffen vóór de test, in ­
dien van toepassing (bv. verwarmen of fijnmalen);  
— de stabiliteit, indien bekend.  
Een motivering voor het gebruikte huidmodel en protocol.  
Testomstandigheden:  
— het gebruikte celsysteem;  
— kalibratie-informatie voor de meetapparatuur die voor het meten 
van de levensvatbaarheid van de cellen is gebruikt (bijvoorbeeld 
een spectrofotometer);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— volledige ondersteunende informatie voor het specifieke ge ­
bruikte huidmodel, met inbegrip van de deugdelijkheid daarvan;  
— gedetailleerde informatie over de gebruikte testprocedure;  
— de gebruikte testdoses;  
— een beschrijving van eventuele wijzigingen in de testprocedure;  
— een referentie naar historische gegevens over het model;  
— een beschrijving van de gebruikte evaluatiecriteria.  
Resultaten:  
— een tabel met de gegevens van de afzonderlijke testmonsters;  
— een beschrijving van andere waargenomen effecten.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusie.  
4. REFERENTIES  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification 
System for Human Health and Environmental Hazards 
of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on 
Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2001)6.
 
2. Testmethode B.4. Acute toxiciteit: Huidirritatie/corrosie.  
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, DJ., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., 
Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). 
A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23,219— 255.
 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international valida ­
tion study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic.  In Vitro  12, 471-482.  
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  In Vitro  12, 483-524.  
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62pp.  
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sci ­
ences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs. 
nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9. Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhütter, H.G. (2000). The ECVAM pre ­
validation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401.
 
10. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.  
11. ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.  
12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evalua ­
tion of EpiDerm™, EPISKTN™ (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In Vitro  test 
methods for assessing dermal corrosivity potential of 
chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology 
Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
13. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
Vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
 
15 Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.  
16. Cannon, CL., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klau ­
sner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy tes ­
ting. Toxic.  In Vitro  8, 889-891.  
17. Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characte ­
rization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211- 225.
 
18. Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pou ­
radier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis  in vitro . In In vitro  Skin Toxicology. Edi ­
ted by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133-140
 
19. Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thi ­
volet J (1991).  In vitro  and post -transplantation differentiation 
of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Re ­
search 193: 310-319
 
20. Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, H. (1992). The organotypic culture of human skin kerati ­
nocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotech ­
nology 9, 163-171.  
21. Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Pa ­
rentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747-756.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22. Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, SJ. (1995). A critical as ­
sessment of the use of microculture tetrazolium assays to mea ­
sure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.  
23. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, J.W., 
Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in vitro  tests 
for acute skin irritation: results and evaluation by the Manage ­
ment Team. Toxic.  In Vitro  15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU FOTOTOXICITEITSTEST  
1. METHODE  
Deze methode komt overeen met OESO TG 432 (2004).  
1.1. INLEIDING  
Fototoxiciteit wordt gedefinieerd als een toxische respons ten ge ­
volge van een op het lichaam opgebrachte stof die wordt opgewekt 
of toeneemt (zichtbaar bij lagere doses) na een daaropvolgende blootstelling aan licht of die wordt geïnduceerd door bestraling van de huid na systemische toediening van een stof.
 
De in-vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest wordt gebruikt om na te 
gaan in hoeverre een teststof fototoxische effecten kan hebben, die na de blootstelling aan licht door de geëxciteerde chemische stof 
worden geïnduceerd. De test evalueert de fotocytotoxiciteit aan de 
hand van de relatieve verlaging van de levensvatbaarheid van cellen die in aanwezigheid van licht aan de chemische stof worden bloot ­
gesteld ten opzichte van blootstelling zonder licht. Stoffen die po ­
sitief op deze test reageren, zullen  in vivo  na systemische toediening 
en distributie naar de huid of na lokale toediening waarschijnlijk fototoxisch zijn.
 
Van veel soorten chemische stoffen is gerapporteerd dat ze fototoxi ­
sche effecten induceren (1)(2)(3)(4). Deze hebben als gemeenschap ­
pelijk kenmerk dat ze lichtenergie binnen het zonlichtspectrum kun ­
nen absorberen. Volgens de eerste wet van de fotochemie (wet van 
Grotthaus-Draper) is voor een fotoreactie de absorptie van voldoende 
lichtquanta nodig. Voordat een biologische test wordt overwogen, moet dan ook een absorptiespectrum van de teststof in UV/zichtbaar licht worden bepaald volgens OESO-testrichtsnoer 101. Er is wel 
gesuggereerd dat het onwaarschijnlijk is dat een stof waarvan de 
molaire extinctie/absorptiecoëfficiënt lager is dan 10 liter × mol
 -1 
× cm  -1 , fotoreactief is. Een dergelijke chemische stof hoeft wellicht 
niet volgens de  in vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest of een andere 
biologische test op schadelijke fotochemische effecten te worden 
getest (1)(5). Zie ook bijlage 1.  
De betrouwbaarheid en relevantie van de  in-vitro  3T3 NRU foto ­
toxiciteitstest is onlangs geëvalueerd (6)(7)(8)(9). Daarbij is aange ­
toond dat de  in-vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest acute fototoxische 
effecten  in vivo  bij mens en dier voorspelt. De test is niet bedoeld 
om andere schadelijke effecten te voorspellen die zich door een 
gecombineerde werking van een chemische stof en licht kunnen 
voordoen, zoals fotogenotoxische, fotoallergische of fotocarcinogene effecten, en ook een bepaling van de fototoxische potentie is niet mogelijk. Bovendien is de test niet bedoeld voor de bestudering van 
indirecte mechanismen van fototoxiciteit, effecten van metabolieten 
van de teststof of effecten van mengsels.
 
Terwijl het gebruik van metaboliserende systemen een algemene 
voorwaarde is voor alle  in-vitro  tests voor de voorspelling van mo ­
gelijke genotoxische en carcinogene effecten, zijn er in het geval van 
de fototoxicologie tot op heden slechts enkele voorbeelden waarbij metabole omzetting nodig is om een chemische stof  in vivo  of in 
vitro  als fototoxine te laten werken. Het wordt dan ook niet nodig of 
vanuit wetenschappelijk oogpunt wenselijk geacht om deze test met 
een metabool activerings systeem uit te voeren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINITIES  
Bestralingssterke:  de intensiteit van het ultraviolette (UV) of zicht ­
bare licht dat op een oppervlak valt, uitgedrukt in W/m  3 of mW/cm  2 . 
Lichtdosis:  de hoeveelheid ( = intensiteit × tijd) ultraviolette (UV) 
of zichtbare straling die op een oppervlak valt, uitgedrukt in Joules (= W × s) per oppervlakte-eenheid, d.w.z. J/m
 3 of J/cm  2 . 
UV-golflengtebanden:  de door de CIE (Commission Internationale 
de L'Eclairage) aanbevolen indeling is: UVA (315-400 nm), UVB 
(280-315 nm) en UVC (100-280 nm). Er worden ook andere inde ­
lingen gehanteerd: de grens tussen UVB en UVA wordt vaak op 320 nm gelegd en UVA wordt soms onderverdeeld in UV-A1 en UV-A2, waarbij de grens op ongeveer 340 nm ligt.
 
Levensvatbaarheid van cellen:  een parameter waarmee de totale 
activiteit van een celpopulatie wordt gemeten (bv. opname van de 
vitale kleurstof neutraalrood in cellulaire lysosomen) die, afhankelijk 
van het gemeten eindpunt en de opzet van de test, is gecorreleerd met het totale aantal en/of de vitaliteit van de cellen.
 
Relatieve levensvatbaarheid van cellen:  de levensvatbaarheid van 
cellen, uitgedrukt in verhouding tot (negatieve) oplosmiddelcontro ­
lecellen die de gehele testprocedure doorlopen hebben (+Irr of -Irr) 
maar niet met de teststof zijn behandeld.  
PIF (foto-irritatiefactor):  een factor die wordt verkregen door twee 
even effectieve cytotoxische concentraties (IC  50 ) van de teststof te 
vergelijken die zijn verkregen zonder (-Irr) en met (+Irr) een niet- cytotoxische bestraling met UVA/zichtbaar licht.
 
IC 50 : de concentratie van de teststof waarbij de levensvatbaarheid 
van de cellen met 50 % daalt.  
MPE (gemiddeld foto-effect):  een parameter die wordt bepaald 
aan de hand van een mathematische analyse van de 
concentratie/responscurves die zijn verkregen zonder (-Irr) en met 
(+Irr) een niet-cytotoxische bestraling met UV A/zichtbaar licht.  
Fototoxiciteit:  een acute toxische respons die wordt opgewekt na de 
eerste blootstelling van de huid aan bepaalde chemische stoffen, gevolgd door de blootstelling aan licht, of op vergelijkbare wijze wordt geïnduceerd door bestraling van de huid na systemische toe ­
diening van een chemische stof.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De in-vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest is gebaseerd op een vergelij ­
king van de cytotoxiciteit van een chemische stof met en zonder 
blootstelling aan een niet-cytotoxische dosis gesimuleerd zonlicht. 
De cytotoxiciteit wordt in deze test uitgedrukt als een concentratie ­
afhankelijke verlaging van de opname van de vitale kleurstof neu ­
traalrood, die 24 uur na de behandeling met de teststof en de be ­
straling wordt gemeten (10). Neutraalrood is een zwakke kationische 
kleurstof die celmembranen gemakkelijk via andere processen dan diffusie penetreert en intracellulair in lysosomen accumuleert. Ver ­
anderingen in het oppervlak van het gevoelige lysosoom-membraan 
leiden tot kwetsbaarheid van de lysosomen en andere veranderingen 
die geleidelijk irreversibel worden. Dergelijke door xenobiotica ver ­
oorzaakte veranderingen leiden tot een daling van de opname en binding van neutraalrood. Het is derhalve mogelijk onderscheid te 
maken tussen levensvatbare, beschadigde en dode cellen en dat is de 
basis van deze test.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Balb/c 3T3 cellen worden gedurende 24 uur in cultuur gehouden 
zodat zich een monolaag vormt. Vervolgens worden voor elke test ­
stof twee 96-wells-platen gedurende één uur gepreïncubeerd met 8 verschillende concentraties van de teststof. Daarna wordt een van de twee platen blootgesteld aan de hoogste niet-cytotoxische stralings ­
dosis, terwijl de andere plaat in het donker wordt bewaard. In beide 
platen wordt het behandelingsmedium vervolgens vervangen door cultuurmedium en na nog eens 24 uur incubatie wordt de levens ­
vatbaarheid van de cellen bepaald aan de hand van de opname van 
neutraalrood. De levensvatbaarheid van de cellen wordt uitgedrukt 
als percentage van de levensvatbaarheid van onbehandelde oplosmid ­
delcontroles en wordt voor elke testconcentratie berekend. Om een uitspraak te doen over het fototoxische potentieel wordt de concen ­
tratie-afhankelijke respons met en zonder bestraling vergeleken, ge ­
woonlijk op het niveau van de IC
 50 , d.w.z. de concentratie die de 
levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de onbehandelde controles met 50 % vermindert.
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1.  Voorbereidingen  
1.4.1.1.  Cellen  
In de valideringsstudie is een permanente fibroblastcellijn van mui ­
zen — Balb/c 3T3, kloon 31 — van de American Type Culture 
Collection (ATCC), Manassas, VA (VS) of van de European Col ­
lection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire (VK) ge ­
bruikt en daarom wordt aanbevolen deze van een goed gekwalifi ­
ceerde celbank te betrekken. Andere cellen of cellijnen kunnen met 
dezelfde testprocedure worden gebruikt als de cultuuromstandighe ­
den aan de specifieke behoeften van de cellen worden aangepast, maar de gelijkwaardigheid moet worden aangetoond.
 
De cellen moeten periodiek worden gecontroleerd op de afwezigheid 
van mycoplasmabesmetting en mogen alleen worden gebruikt als 
deze niet wordt geconstateerd (11).  
Het is belangrijk dat de UV-gevoeligheid van de cellen periodiek 
wordt gecontroleerd volgens de kwaliteitscontroleprocedure die in 
deze methode wordt beschreven. Aangezien de UVA-gevoeligheid van cellen met het aantal passages kan toenemen, moeten Balb/c 3T3 cellen met het laagst verkrijgbare aantal passages worden gebruikt, 
bij voorkeur lager dan 100 (zie punt 1.4.2.2.2 en bijlage 2).
 
1.4.1.2.  Media en cultuuromstandigheden  
Voor routinematige passage van de cellen en tijdens de testprocedure 
moeten geschikte cultuurmedia en incubatieomstandigheden worden 
gebruikt, voor Balb/c 3T3 cellen bijvoorbeeld DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aangevuld met 10 % serum van pasge ­
boren kalveren, 4 mM glutamine, penicilline (100 IE) en streptomy ­
cine (100 μg/ml), en incubatie onder vochtige omstandigheden bij 
37
 o C en 5-7,5 % CO  2 , afhankelijk van de buffer (zie punt 1.4.1.4, 
tweede alinea). Het is vooral belangrijk dat de celcultuuromstandig ­
heden zo zijn dat de celcyclustijd binnen het normale gedocumen ­
teerde bereik van de gebruikte cellen of cellijn ligt.  
1.4.1.3.  Prepareren van de culturen  
Cellen uit ingevroren stamculturen worden met een geschikte dicht ­
heid overgeënt in cultuurmedium en ten minste één maal in subcul ­
tuur gebracht voordat zij bij de  in-vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest 
worden gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Voor de fototoxiciteitstest gebruikte cellen worden overgeënt in cul ­
tuurmedium, waarbij de dichtheid zo is dat de culturen niet samen ­
vloeien vóór het einde van de test, d.w.z. wanneer 48 uur na het overenten van de cellen de levensvatbaarheid van de cellen wordt bepaald. Voor Balb/c 3T3 cellen die worden gekweekt in 96-wells- 
platen, wordt bij het overenten een celdichtheid van 1 × 10
 4 cellen 
per well aanbevolen  
Voor elke teststof worden cellen op identieke wijze overgeënt op 
twee afzonderlijke 96-wells-platen die vervolgens parallel onder 
identieke cultuuromstandigheden de gehele testprocedure doorlopen, met uitzondering van de periode waarin een van de platen wordt bestraald (+Irr) en de andere in het donker wordt bewaard (-Irr).
 
1.4.1.4.  Voorbereiding van de teststof  
Teststoffen moeten vlak voor het gebruik vers worden bereid, tenzij 
er gegevens zijn waaruit blijkt dat ze tijdens opslag stabiel zijn. Aanbevolen wordt elke chemische bewerking en de eerste behan ­
deling van de cellen onder zodanige lichtomstandigheden uit te voe ­
ren dat fotoactivering of afbraak van de teststof vóór de bestraling wordt voorkomen.
 
De teststoffen moeten worden opgelost in gebufferde zoutoplossin ­
gen, bijvoorbeeld Earl's Balanced Salt Solution (EBSS) of andere fysiologisch uitgebalanceerde bufferoplossingen, die vrij moeten 
zijn van eiwitcomponenten en licht absorberende componenten (bv. 
pH-indicatorkleurstoffen en vitaminen) om storing tijdens de bestra ­
ling te voorkomen. Aangezien de cellen tijdens de bestraling gedu ­
rende ongeveer 50 minuten buiten de CC
 2 -incubator verblijven, moet 
er op worden gelet dat alkalisering wordt voorkomen. Als er zwakke 
buffers zoals EBSS worden gebruikt, kan dit gebeuren door de cellen bij 7,5 % CO
 2 te incuberen. Als de cellen bij slechts 5 % CO  2 
worden geïncubeerd, moet er een sterkere buffer worden gekozen.  
Teststoffen met een beperkte oplosbaarheid in water moeten in een 
geschikt oplosmiddel worden opgelost. Als er een oplosmiddel wordt gebruikt, moet hiervan in alle culturen een constant volume aanwezig 
zijn, d.w.z. zowel in de negatieve (oplosmiddel)controles als in alle 
concentraties van de teststof, en mag het bij die concentratie niet cytotoxisch zijn. De concentraties van de teststof moeten zo worden gekozen dat neerslagen of troebele oplossingen worden voorkomen.
 
De aanbevolen oplosmiddelen zijn dimethylsulfoxide (DMSO) en 
ethanol (EtOH). Andere oplosmiddelen met een lage cytotoxiciteit 
kunnen in aanmerking komen. Voor het gebruik moeten alle oplos ­
middelen worden onderzocht op specifieke eigenschappen, bijvoor ­
beeld reactie met de teststof, onderdrukking van het fototoxische effect, het vermogen om radicalen weg te vangen en/of chemische 
stabiliteit in het oplosmiddel.
 
Om het oplossen te bevorderen kan gebruik worden gemaakt van 
vortex-menging en/of sonificatie en/of verwarming tot geschikte tem ­
peraturen, tenzij dit nadelige gevolgen zou hebben voor de stabiliteit 
van de teststof.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Bestralingsomstandigheden  
1.4.1.5.1. L i c h t b r o n  
De keuze van een geschikte lichtbron en filters is een cruciale factor 
bij fototoxiciteitstests. UVA en zichtbaar licht worden gewoonlijk geassocieerd met fototoxische reactie  in vivo  (3)(12), terwijl UVB 
in het algemeen minder relevant is maar sterk cytotoxisch is; de 
cytotoxiciteit neemt van 313 nm tot 280 nm met een factor 1 000 
toe (13). Een van de criteria bij de keuze van een geschikte lichtbron is de eis dat de lichtbron golflengtes uitzendt die door de teststof worden geabsorbeerd (absorptiespectrum) en dat de lichtdosis (die 
binnen een redelijke blootstellingstijd haalbaar is) voldoende is om 
bekende fototoxische stoffen te detecteren. Bovendien mogen de gebruikte golflengtes en doses niet te veel schade aan het testsysteem toebrengen, bijvoorbeeld door de emissie van warmte (infraroodspec ­
trum).
 
Simulatie van zonlicht met zonnesimulatoren wordt als de optimale 
kunstlichtbron beschouwd. De spectrale verdeling van de gefilterde zonnesimulator moet in de buurt liggen van die van daglicht, zoals vermeld in (14). In zonnesimulatoren worden xenonbooglampen en 
(gedoteerde) kwik-metaalhalidebooglampen gebruikt (15). Laatst ­
genoemde hebben het voordeel dat zij minder warmte afgeven en goedkoper zijn, maar de overeenstemming met zonlicht is minder volmaakt dan bij xenonbooglampen. Aangezien alle zonnesimulato ­
ren significante hoeveelheden UVB uitstralen, moeten deze afdoende 
worden gefilterd om de sterk cytotoxische UVB-golflengtes te ver ­
zwakken. Omdat de kunststof materialen voor celculturen UV-stabi ­
lisatoren bevatten, moet het spectrum worden gemeten door hetzelfde 
type deksel van 96-wells-platen als bij de bepaling wordt gebruikt. 
Ongeacht de maatregelen die worden genomen om delen van het spectrum te verzwakken door filtering of onvermijdelijke filtereffec ­
ten van de apparatuur mag het spectrum dat onder deze filters wordt 
geregistreerd, niet afwijken van gestandaardiseerd daglicht (14). Een 
voorbeeld van de spectrale verdeling van de gefilterde zonnesimula ­
tor die bij de valideringsstudie van de  in vitro  3T3 NRU fototoxici ­
teitstest is gebruikt, wordt vermeld in (8)(16). Zie ook figuur 1 van 
bijlage 2.
 
1.4.1.5.2. D o s i m e t r i e  
De intensiteit van het licht (bestralingssterkte) moet periodiek vóór 
elke fototoxiciteitstest worden gecontroleerd met een geschikte breedband-UV-meter. De intensiteit moet worden gemeten door het ­
zelfde type deksel van 96-wells-platen als bij de bepaling wordt 
gebruikt. De UV-meter moet op de bron zijn gekalibreerd. De wer ­
king van de UV-meter moet worden gecontroleerd en daarvoor wordt het gebruik van een tweede referentie-UV-meter van hetzelfde type 
en met dezelfde kalibratie aanbevolen. In het ideale geval moet met 
grotere intervallen een spectroradiometer worden gebruikt om de spectrale bestralingssterkte van de gefilterde lichtbron te meten en de kalibratie van de breedband-UV-meter te controleren.
 
Er is vastgesteld dat een dosis van 5 J/cm  2 (gemeten in het UVA- 
spectrum) niet cytotoxisch is voor Balb/c 3T3 cellen en voldoende 
sterk om chemische stoffen te exciteren en zo tot foto toxische reacties te leiden (6) (17); om in 50 minuten een bestralingsdosis van 5 J/cm
 2 te bereiken, werd de bestralingssterkte bijvoorbeeld 
afgesteld op 1,7 mW/cm  2 . Zie figuur 2 van bijlage 2. Als een andere 
cellijn of een andere lichtbron wordt gebruikt, kan het nodig zijn de bestralingsdosis te kalibreren, zodat de dosering zodanig kan worden gekozen dat deze niet schadelijk is voor de cellen maar wel vol ­
doende om standaard-fototoxines te exciteren. De duur van de bloot ­
stelling aan het licht wordt als volgt berekend:
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ bestralingsdosis ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
bestralingssterkte ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2.  Testomstandigheden  
1.4.2.1.  Concentraties van de teststof  
Het bereik waarbinnen de concentraties van een met (+Irr) en zonder 
(-Irr) licht geteste stof moeten liggen, moet op correcte wijze worden bepaald in oriënterende experimenten. Het kan nuttig zijn eerst de aanvankelijke oplosbaarheid en de oplosbaarheid na 60 min (of een 
andere behandelingstijd, als daarvoor wordt gekozen) te bepalen, 
aangezien de oplosbaarheid in de loop van de tijd en tijdens de blootstelling kan veranderen. Om toxiciteit door onjuiste cultuur ­
omstandigheden of door sterk zure of alkalische chemische stoffen 
te voorkomen, moet de pH van de celculturen met toegevoegde 
teststof tussen 6,5 en 7,8 liggen.
 
De hoogste concentratie van de teststof moet binnen fysiologische 
testomstandigheden vallen, hetgeen wil zeggen dat osmotische en 
pH-stress moeten worden vermeden. Afhankelijk van de teststof kan het nodig zijn rekening te houden met andere fysisch-chemische eigenschappen als factoren die de hoogste testconcentratie beperken. 
Bij betrekkelijk onoplosbare stoffen die bij concentraties tot het ver ­
zadigingspunt niet toxisch zijn, moet de hoogst haalbare concentratie worden getest. In het algemeen moet neerslaan van de teststof on ­
geacht de concentratie worden voorkomen. De maximale concentra ­
tie van een teststof mag niet hoger zijn dan 1 000 μg/ml; de osmo ­
lariteit mag niet hoger zijn dan 10 mmol/l. Er moet een meetkundige verdunningsreeks van 8 teststof-concentraties met een constante ver ­
dunningsfactor worden gebruikt (zie de tweede alinea van punt 2.1).
 
Als er informatie (uit een oriënterend experiment) is dat de teststof 
bij het experiment in het donker (-Irr) tot de hoogste concentratie niet cytotoxisch is, maar bij bestraling (+Irr) sterk cytotoxisch, kan 
het nodig zijn voor het (+Irr)-experiment een ander concentratiebe ­
reik te kiezen dan voor het (-Irr)-experiment om aan de eis van afdoende gegevenskwaliteit te voldoen.
 
1.4.2.2.  Controles  
1.4.2.2.1. S t r a l i n g s g e v o e l i g h e i d v a n d e c e l l e n , v a s t s t e l ­
l i n g v a n h i s t o r i s c h e g e g e v e n s :  
De cellen moeten periodiek (ongeveer elke vijfde passage) op ge ­
voeligheid voor de lichtbron worden gecontroleerd door hun levens ­
vatbaarheid na blootstelling aan oplopende bestralingsdoses te bepa ­
len. Bij deze bepaling moeten verschillende bestralingsdoses worden gebruikt, waaronder doses die aanzienlijk hoger zijn dan voor de  in- 
vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest worden gebruikt. Deze doses wor ­
den het gemakkelijkst kwantitatief bepaald door de UV-delen van de lichtbron te meten. De cellen worden overgeënt met de dichtheid die wordt gebruikt bij de  in-vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest en de 
volgende dag bestraald. Vervolgens wordt één dag later door middel 
van de opname van neutraalrood de levensvatbaarheid van de cellen bepaald. Er moet worden aangetoond dat de resulterende hoogste niet-cytotoxische dosis (bijvoorbeeld bij de valideringsstudie 5 J/cm
 2 
[UVA]) voldoende is om de referentiechemicaliën (tabel 1) op de 
juiste wijze in te delen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S t r a l i n g s g e v o e l i g h e i d , c o n t r o l e v a n d e l o p e n d e 
t e s t :  
De test voldoet aan de kwaliteitscriteria als de bestraalde negatieve/ ­
oplosmiddelcontroles een levensvatbaarheid vertonen van ten minste 80 % van die van niet-bestraalde negatieve/oplosmiddelcontroles.
 
1.4.2.2.3. L e v e n s v a t b a a r h e i d v a n o p l o s m i d d e l c o n t r o l e s :  
Uit de absolute optische dichtheid (OD540 NRU) van het uit de 
oplosmiddelcontroles geëxtraheerde neutraalrood blijkt of de 1 × 10
 4 cellen die per well zijn overgeënt tijdens de twee dagen van 
de test met een normale verdubbelingstijd zijn gegroeid. Een test 
voldoet aan de aanvaardbaarheidscriteria als de gemiddelde OD  540 
NRU van de onbehandelde controles ≥ 0,4 is (d.w.z. ongeveer twin ­
tig keer zo hoog als de achtergrondextinctie van het oplosmiddel).  
1.4.2.2.4. P o s i t i e v e c o n t r o l e :  
Parallel aan elke  in vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest moet een che ­
mische stof worden getest waarvan bekend is dat deze fototoxisch is. Chloorpromazine (CPZ) wordt aanbevolen. Voor CPZ dat wordt getest volgens het standaardprotocol in de  in-vitro  3T3 NRU foto ­
toxiciteitstest, zijn de volgende aanvaardbaarheidscriteria gedefini ­
eerd: CPZ bestraald (+Irr): IC
 50 = 0,1 tot 2,0 μg/ml, CPZ niet-be ­
straald (-Irr): IC  50 = 7,0 tot 90,0 Dg/ml. De foto-irritatiefactor (PIF) 
moet > 6 zijn. De resultaten van de positieve controle moeten in de 
loop der tijd worden gevolgd.  
Ook andere fototoxische stoffen die met het oog op de chemische 
categorie of oplosbaarheidskenmerken van de onderzochte chemische stof geschikt zijn, kunnen in plaats van chloorpromazine als paral ­
lelle positieve controle worden gebruikt.
 
1.4.3.  Testprocedure (6)(7)(8)(16)(17):  
1.4.3.1.  Eerste dag:  
Breng in de buitenste wells van een 96-wells microtiterplaat voor 
weefselculturen 100 μl cultuurmedium (= blanco's). Breng in de 
overige wells 100 μl celsuspensie met 1 × 10  5 cellen/ml in cultuur ­
medium (= 1 × 10  4 cellen/well). Er worden twee platen gemaakt 
voor elke reeks teststofconcentraties en voor de positieve en oplos ­
middelcontroles.  
Incubeer de cellen gedurende 24 uur (zie punt 1.4.1.2) tot ze een half 
samenvloeiende monolaag vormen. Deze incubatieperiode is lang 
genoeg voor het herstel, de hechting en de exponentiële groei van de cellen.
 
1.4.3.2.  Tweede dag:  
Na incubatie wordt het cultuurmedium van de cellen gedecanteerd en 
worden ze zorgvuldig gewassen met 150 μl van de voor de incubatie 
gebruikte gebufferde oplossing. Voeg 100 μl buffer met de gewenste 
concentratie teststof of oplosmiddel (oplosmiddelcontrole) toe. Ge ­
bruik acht verschillende concentraties teststof. Incubeer de cellen met de teststof in het donker gedurende 60 minuten (zie punt 1.4.1.2 en 
punt 1.4.1.4, tweede alinea).
 
Van de twee voor elke reeks teststofconcentraties en de controles 
gemaakte platen wordt er één gekozen (meestal aselect) voor de bepaling van de cytotoxiciteit (-Irr) (d.w.z. de controleplaat) 
en één (de behandelde plaat) voor de bepaling van de 
fotocytotoxiciteit (+Irr).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Voor de +Irr-blootstelling worden de cellen gedurende 50 minuten 
bij kamertemperatuur door het deksel van de 96-wells-plaat bestraald 
met de hoogste stralingsdosis die niet cytotoxisch is (zie ook bijlage 2). De niet-bestraalde platen (-Irr) worden gedurende 50 minuten (= lichtblootstellingstijd) bij kamertemperatuur in een 
donkere kast bewaard.
 
Decanteer de testoplossing en was zorgvuldig tweemaal met 150 μl 
van de voor de incubatie gebruikte gebufferde oplossing zonder test ­
materiaal. Vervang de buffer door cultuurmedium en incubeer (zie punt 1.4.1.2) tot de volgende dag (18-22 uur).
 
1.4.3.3.  Derde dag:  
1.4.3.3.1. M i c r o s c o p i s c h o n d e r z o e k  
De cellen worden met een fasecontrastmicroscoop onderzocht op 
groei, morfologie en integriteit van de monolaag. Veranderingen in 
de morfologie van de cellen en effecten op de celgroei worden 
geregistreerd.  
1.4.3.3.2. O p n a m e v a n n e u t r a a l r o o d  
Was de cellen met 150 μl voorverwarmde buffer. Verwijder de was ­
vloeistof door voorzichtig te tikken. Voeg 100 μl van een oplossing 
van 50 μg/ml neutraalrood (NR) (3-amino-7-dimethylamino-2-me ­
thylfenazine hydrochloride, EINECS-nummer 209-035-8; CAS-num ­
mer 553-24-2; C.I. 50040) in medium zonder serum (16) toe en incubeer gedurende 3 uur volgens de beschrijving onder punt 
1.4.1.2. Na incubatie wordt het NR-medium verwijderd en worden 
de cellen gewassen met 150 μl buffer. Decanteer en verwijder de 
overmaat buffer door afvloeien of centrifugeren.
 
Voeg precies 150 μl NR-desorptieoplossing (vers bereid: 49 delen 
water + 50 delen ethanol + 1 deel azijnzuur) toe.  
Schud de microtiterplaat gedurende 10 minuten zachtjes op een mi ­
crotiterplaatschudder totdat het NR uit de cellen is geëxtraheerd en zich een homogene oplossing heeft gevormd.
 
Meet de optische dichtheid van het NR-extract bij 540 nm in een 
spectrofotometer, waarbij de blanco's als referentie worden gebruikt. 
Sla de gegevens in een geschikt elektronisch bestandsformaat op voor latere analyse.
 
2. GEGEVENS  
2.1. KWALITEIT EN HOEVEELHEID VAN DE GEGEVENS  
De testgegevens moeten een zinvolle analyse mogelijk maken van de 
met en zonder bestraling verkregen concentratie-afhankelijke respons 
en indien mogelijk de concentratie van de teststof waardoor de le ­
vensvatbaarheid van de cellen tot 50 % daalt (IC50). Als er cyto ­
toxiciteit wordt geconstateerd, moeten zowel het concentratiebereik 
als de intervallen tussen de verschillende concentraties zo worden 
gekozen dat er een curve aan de experimentele gegevens kan worden gefit.
 
Zowel bij duidelijk positieve resultaten als bij duidelijk negatieve 
resultaten (zie punt 2.3, eerste alinea) zal het hoofdexperiment, voor ­
afgegaan door een of meer oriënterende experimenten om het con ­
centratiebereik te bepalen, wellicht volstaan.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Twijfelachtige resultaten, grensgevallen of onduidelijke resultaten 
moeten door verdere tests worden verduidelijkt (zie punt 2.4, tweede 
alinea). In deze gevallen moet een wijziging van de experimentele omstandigheden worden overwogen. Experimentele omstandigheden die voor wijziging in aanmerking komen, zijn bijvoorbeeld: het con ­
centratiebereik of de intervallen, de preïncubatietijd en de 
bestralings/blootstellingstijd. Een kortere blootstellingstijd kan zinvol zijn voor chemische stoffen die in water instabiel zijn.
 
2.2. EVALUATIE VAN DE RESULTATEN  
Om evaluatie van de gegevens mogelijk te maken kan een foto- 
irritatiefactor (PIF) of gemiddeld foto-effect worden berekend.  
Voor de berekening van de mate van fotocytotoxiciteit (zie hieronder) 
moet de verzameling discrete concentratie/responswaarden worden benaderd met een passende continue concentratie/responscurve 
(model). Voor het fitten van de curve aan de gegevens wordt meestal 
een niet-lineaire regressiemethode gebruikt (18). Om de invloed van de variabiliteit van de gegevens op de gefitte curve te bepalen wordt een bootstrapprocedure aanbevolen.
 
Met behulp van de volgende formule wordt een foto-irritatiefactor 
(PIF) berekend:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Als een IC  50 met of zonder licht niet kan worden berekend, kan er 
voor het testmateriaal geen PIF worden bepaald.  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Het foto-effect PE  C bij een concentratie C wordt gedefinieerd als het 
product van het responseffect RE  C en het dosiseffect DE  C , d.w.z. 
PE C = RE  C × DE  C . Het responseffect RE  C is het verschil tussen de 
waargenomen respons met en zonder licht, d.w.z. RE  C = R  c (-Irr) – 
R c (+Irr). Het dosiseffect wordt als volgt berekend:  
DE  c ¼ Æ Æ Æ Æ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ 
Het gemiddelde foto-effect (MPE) wordt gebaseerd op een vergelij ­
king van de volledige concentratie/responscurves (19). Het wordt 
gedefinieerd als het gewogen gemiddelde van een representatieve 
verzameling foto-effectwaarden:  
waarbij C* de equivalentieconcentratie is, d.w.z. de concentratie 
waarbij de +Irr-respons gelijk is aan de -Irr-respons bij concentratie C. Als C* niet kan worden bepaald omdat de responswaarden van de +Irr-curve systematisch hoger of lager zijn dan R
 c (-Irr), wordt het 
dosiseffect gelijk aan 1 gesteld. De weegfactoren w  i worden gegeven 
door de hoogste responswaarde, d.w.z. w  i = MAX {R  i (+Irr), R  i 
(-Irr)}. Het concentratieraster C  i wordt zodanig gekozen dat in elk 
van de concentratieintervallen die worden bepaald door de bij het 
experiment gebruikte concentratiewaarden, hetzelfde aantal punten 
valt. De berekening van het MPE blijft beperkt tot de maximale concentratiewaarde waarbij ten minste een van de twee curves nog een responswaarde van ten minste 10 % vertegenwoordigt. Als deze 
maximale concentratie hoger is dan de hoogste concentratie die bij 
het +Irr-experiment is gebruikt, wordt het resterende gedeelte van de +Irr-curve op responswaarde „0” gesteld. Aan de hand van het ant ­
woord op de vraag of de MPE-waarde al dan niet hoger is dan een 
op correcte wijze gekozen drempelwaarde (MPE
 C = 0,15), wordt de 
chemische stof al dan niet als fototoxisch ingedeeld.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Een softwarepakket voor de berekening van de PIF en het MPE is 
verkrijgbaar bij (20).  
2.3. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Op basis van de valideringsstudie (8) geldt voor een teststof met PIF 
< 2 of een MPE < 0,1 de prognose: „geen fototoxiciteit”. Bij een 
PIF > 2 en < 5 of een MPE > 0,1 en < 0,15 geldt de prognose: „waarschijnlijk fototoxiciteit”; en bij een PIF > 5 of een MPE > 0,15 geldt de prognose: „fototoxiciteit”.
 
Wanneer deze bepaling voor het eerst in een laboratorium wordt 
uitgevoerd, moeten de in tabel 1 vermelde referentiematerialen wor ­
den getest voordat teststoffen voor een bepaling van de fototoxiciteit worden getest. De PIF- of MPE-waarden moeten in de buurt van de in tabel 1 vermelde waarden liggen.
 
Tabel 1  
Chemische naam EINECS-nr. CAS-nr. PIF MPE Absorptiepiek Oplosmidde (  1 ) 
Amiodaron 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm (schouder) ethanol 
Chloorproma ­
zine HCL 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33-0,63 309 nm ethanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34-0,90 316 nm acetonitril 
Antraceen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19-0,81 356 nm acetonitril 
Protoporfyrine 
IX, dinatrium 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54-0,74 402 nm ethanol 
L-Histidine [7006-35-1] geen PIF 0,05-0,10 211 nm water 
Hexachlorofeen 200-733-8 [70-30-4] 1,1-1,7 0,00-0,05 299 nm 
317 nm 
(schouder) ethanol 
Natriumlauryl ­
sulfaat 205-788-1 [151-21-3] 1,0-1,9 0,00-0,05 geen ab ­
sorptie water
 
( 1 ) Het voor het meten van de absorptie gebruikte oplosmiddel.  
2.4. INTERPRETATIE VAN DE GEGEVENS  
Als er alleen bij de hoogste testconcentratie fototoxische effecten 
worden waargenomen (met name voor in water oplosbare test ­
stoffen), kunnen er aanvullende gegevens nodig zijn om de 
gevaren te bepalen. Hierbij kan het gaan om gegevens over de absorptie door de huid en accumulatie van de chemische stof in de huid en/of gegevens uit andere tests waarbij de che ­
mische stof bijvoorbeeld  in vitro  is getest op dierlijke of men ­
selijke huid of huidmodellen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Als er geen toxiciteit wordt aangetoond (+Irr en -Irr) en als een 
slechte oplosbaarheid beperkingen oplegt aan de concentraties die 
kunnen worden getest, kan men zich afvragen of de teststof wel compatibel is met de bepaling en moet een bevestigende test worden overwogen, bijvoorbeeld met een ander model.
 
3. RAPPORTAGE  
TESTRAPPORT  
Het testrapport moet ten minste de volgende informatie bevatten:  
Teststof:  
— identificatiegegevens, gangbare algemene naam en IUPAC- en 
CAS-nummer, indien bekend;  
— fysische toestand en zuiverheid;  
— fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van de 
studie relevant zijn;  
— UV/VIS-absorptiespectrum;  
— stabiliteit en foto stabiliteit, indien bekend.  
Oplosmiddel:  
— motivering van de keuze van het oplosmiddel;  
— oplosbaarheid van de teststof in het oplosmiddel;  
— percentage oplosmiddel in het behandelingsmedium.  
Cellen:  
— type en bron van de cellen;  
— afwezigheid van mycoplasma's;  
— aantal celpassages indien bekend;  
— stralingsgevoeligheid van de cellen, bepaald met de bestralings ­
apparatuur die bij de  in vitro  3T3 NRU fototoxiciteitstest wordt 
gebruikt.  
Testomstandigheden (1); incubatie vóór en na behandeling:  
— type en samenstelling van het cultuurmedium;  
— incubatieomstandigheden (CC  2 -concentratie, temperatuur, voch ­
tigheid);  
— incubatieduur (voorbehandeling, nabehandeling).  
Testomstandigheden (2); behandeling met de chemische stof:  
— motivering van de keuze van de concentraties van de teststof die 
met en zonder bestraling zijn gebruikt;  
— in geval van beperkte oplosbaarheid van de teststof en afwezig ­
heid van cytotoxiciteit: motivering voor de hoogste geteste con ­
centratie;  
— type en samenstelling van het behandelingsmedium (gebufferde 
zoutoplossing);  
— duur van de chemische behandeling.  
Testomstandigheden (3); bestraling:  
— motivering voor de keuze van de gebruikte lichtbron;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— fabrikant en aard van de lichtbron en de radiometer;  
— spectrale bestralingskarakteristieken van de lichtbron;  
— transmissie- en absorptiekarakteristieken van de gebruikte filters;  
— karakteristieken van de radiometer en gedetailleerde gegevens 
over de kalibratie ervan;  
— afstand van de lichtbron tot het testsysteem;  
— UVA-bestralingssterkte op deze afstand, uitgedrukt in mW/cm  2 ; 
— duur van de blootstelling aan UV/zichtbaar licht;  
— UVA-dosis (bestralingssterkte x tijd), uitgedrukt in J/cm  2 ; 
— temperatuur van de celculturen tijdens bestraling en de celcultu ­
ren die gelijktijdig in het donker worden bewaard.  
Testomstandigheden (4); neutraalrood-levensvatbaarheidstest:  
— samenstelling van het neutraalrood-behandelingsmedium;  
— duur van de neutraalrood-incubatie;  
— incubatieomstandigheden (CO  2 -concentratie, temperatuur, voch ­
tigheid);  
— neutraalrood-extractieomstandigheden (extractiemiddel, duur);  
— golflengte voor de spectrofotometrische bepaling van de optische 
dichtheid van neutraalrood;  
— tweede golflengte (referentie) indien gebruikt;  
— inhoud van de blanco-cuvetten van de spectrofotometer, indien 
gebruikt.  
Resultaten:  
— levensvatbaarheid van de cellen, bepaald bij elke concentratie 
van de teststof, uitgedrukt in procentuele levensvatbaarheid ten 
opzichte van het gemiddelde van de parallelle oplosmiddelcon ­
troles;  
— concentratie/responscurves (concentratie van de teststof tegen de 
relatieve levensvatbaarheid van de cellen), verkregen bij de pa ­
rallelle +Irr en -Irr-experimenten;  
— analyse van de concentratie/responscurves: zo mogelijk bereke ­
ning van de IC  50 (+Irr) en de IC  50 (-Irr);  
— vergelijking van de twee concentratie/responscurves die met en 
zonder bestraling zijn verkregen, door berekening van de foto- irritatiefactor (PIF) of door berekening van het gemiddelde foto- effect (MPE);
 
— aanvaardbaarheidscriteria voor de test; parallelle oplosmiddelcon ­
trole:  
— absolute levensvatbaarheid (optische dichtheid van het neutraal ­
rood-extract) van bestraalde en niet-bestraalde cellen;  
— historische gegevens over negatieve en oplosmiddelcontrole; ge ­
middelden en standaarddeviaties;  
— aanvaardbaarheidscriteria voor de test; parallelle positieve con ­
trole:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+Irr) en IC  50 (-Irr) en PIF/MPE van de als positieve con ­
trole gebruikte chemische stof;  
— historische gegevens van de als positieve controle gebruikte che ­
mische stof: IC  50 (+Irr) en IC  50 (-Irr) en PIF/MPE; gemiddelden 
en standaarddeviaties.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
1. Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of sub ­
stances for photoallergenic potential. Toxic.  In Vitro  7: 95-102.  
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam, p XI-XXXV.
 
3. Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Mau ­
rer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladows ­
ki, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report and 
recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
314-348.  
4. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of Pho ­
tobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 
2nd edition, p 79-110.  
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
6. Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kal ­
weit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., 
Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and 
Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic.  In Vitro  8, 793-796.
 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European Com ­
mission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3 November 1997, ATLA, 26, 7-8.  
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, 
W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic.  In Vitro  
12, 305-327.  
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30 th -31 th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat.  
10. Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red ab ­
sorption. Toxicology Lett., 24, 119-124.  
11. Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, edi ­
ted by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515-530.
 
13. Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epider ­
mal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.  
14. ISO 10977. (1993). Photography — Processed photographic 
colour films and paper prints — Methods for measuring image stability.
 
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vien ­
na, 1993, ISBN 3900734275  
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 pgs.  
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, 
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708.
 
18. Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127-138.
 
19. Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445-462.  
20. http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349 
687_l_l_l_l, 00. html  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
BIJLAGE 1  
Rol van de 3T3 NRU fototoxiciteitstest in een sequentiële aanpak van het testen van de 
fototoxiciteit van chemische stoffen
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
BIJLAGE 2  
Figuur 1  
Spectrale verdeling van een gefilterde zonnesimulator
  
(zie punt 1.4.1.5, tweede alinea)  
Figuur 1 geeft een voorbeeld van een aanvaardbare spectrale verdeling van de bestralingssterkte van 
een gefilterde zonnesimulator. Deze is afkomstig van de gedoteerde metaalhalide-bron die is ge ­
bruikt bij de valideringsstudie van de 3T3 NRU fototoxiciteitstest (6)(8)(17). In de figuur worden de effecten van twee verschillende filters en de extra filterende werking van het deksel van een 96- 
wells-celcultuurplaat aangegeven. Het H2-filter is alleen gebruikt bij testsystemen die een grotere 
hoeveelheid UVB kunnen verdragen (de huidmodeltest en de fotohemolysetest met rode bloedcel ­
len). Bij de 3T3 NRU fototoxiciteitstest is het Hl-filter gebruikt. Uit de figuur blijkt dat de extra filterende werking van het deksel van de plaat vooral in het UVB-spectrum wordt waargenomen, 
maar nog genoeg UVB in het stralingsspectrum doorlaat voor de excitatie van chemische stoffen die 
een karakteristieke absorptie in het UVB-spectrum vertonen, zoals amiodaron (zie tabel 1).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figuur 2  
Bestralingsgevoeligheid van Balb/c 3T3-cellen (zoals gemeten in het UVA-spectrum)  
Levensvatbaarheid van de cellen ( % opname van neutraal rood van onbestraalde controle)
  
bestralingstijd (minuten) (10 min = 1 joule UVA/cm  2 ) (zie punt 1.4.1.5.2, tweede alinea, en de 
punten 1.4.2.2.1 en 1.4.2.2.2)  
De gevoeligheid van Balb/c 3T3-cellen voor bestraling met de in de valideringsstudie van de 3T3 
NRU fototoxiciteitstest gebruikte zonnesimulator, zoals gemeten in het UVA-spectrum. In de figuur 
zijn de resultaten weergegeven die in de pre-valideringsstudie in zeven verschillende laboratoria zijn verkregen (1). De twee curves met open symbolen zijn verkregen met oudere cellen (groot aantal passages), die door nieuwe celstammen moesten worden vervangen, terwijl de curves met dichte 
symbolen afkomstig zijn van cellen met een aanvaardbare bestralingstolerantie.
 
Uit deze gegevens is de hoogste niet-cytotoxische bestralingsdosis van 5 J/cm  2 afgeleid (verticale 
stippellijn). Daarnaast geeft de horizontale stippellijn het in punt 1.4.2.2 vermelde maximaal aan ­
vaardbare bestralingseffect aan.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST  
INLEIDING  
1. De OESO-richtlijnen inzake het testen van chemische stoffen (Guidelines 
for the Testing of Chemicals) en de daarop gebaseerde EU-testmethoden 
worden regelmatig herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruit ­
gang, zich wijzigende behoeften aan regelgeving en overwegingen met het oog op dierenwelzijn. De oorspronkelijke testmethode (TM) voor het be ­
palen van de huidsensibilisatie bij muizen, de lokale lymfkliertest (LLKT; 
OESO-testrichtlijn 429; hoofdstuk B.42 van deze bijlage) werd eerder goedgekeurd (1). Er zijn publicaties verschenen met de gegevens over de validering van de LLKT en een overzicht van gerelateerd onderzoek 
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). De bijgewerkte LLKT is gebaseerd 
op de evaluatie van ervaringen en wetenschappelijke gegevens (12). Dit is de tweede TM die is ontworpen om de potentiële huidsensibilisatie door chemische stoffen (stoffen en mengsels) bij dieren te bepalen. Bij de 
andere TM (d.w.z. OESO-testrichtlijn 406; hoofdstuk B.6 van deze bij ­
lage) worden cavia's gebruikt: de maximalisatietest en de Buehlertest (13). De LLKT biedt ten opzichte van B.6 en OESO-testrichtlijn 406 (13) voor ­
delen op het gebied van dierenwelzijn. Deze bijgewerkte 
LLKT-testmethode omvat een reeks prestatienormen (aanhangsel 1) die gebruikt kunnen worden om de valideringsstatus te evalueren van de nieuwe en/of gewijzigde testmethoden die in functioneel en mechanistisch 
opzicht vergelijkbaar zijn met de LLKT, overeenkomstig de beginselen 
van OESO-leidraad nr. 34 (14).
 
2. De LLKT bestudeert de inductiefase van huidsensibilisatie en levert kwan ­
titatieve gegevens op die voor een dosis/responsbepaling kunnen worden 
gebruikt. Opgemerkt dient te worden dat de milde/gematigde sensibilisa ­
toren die worden aanbevolen als geschikte chemische stoffen voor posi ­
tieve controle bij tests met cavia's (d.w.z. B. 6; OESO-testrichtlijn 406) 
(13) ook geschikt zijn om bij de LLKT te worden gebruikt (6) (8) (15). 
Een benadering gericht op vermindering van het proefdiergebruik (ver ­
minderde LLKT (vLLKT)), die kan leiden tot een vermindering van het 
proefdiergebruik met wel 40 %, wordt in deze TM tevens als een optie 
beschreven (16) (17) (18). De vLLKT kan worden gebruikt indien op grond van regelgeving een noodzaak bestaat om een negatieve prognose van het huidsensibilisatiepotentieel te bevestigen, op voorwaarde dat aan 
alle andere specificaties van het LLKT-protocol wordt voldaan, zoals be ­
schreven in deze TM. De prognose van een negatief resultaat moet geba ­
seerd zijn op alle beschikbare informatie als bedoeld in punt 4. Voordat de vLLKT-benadering wordt toegepast, moeten een duidelijke rechtvaardiging 
en een wetenschappelijke motivering voor de toepassing ervan worden 
overgelegd. Indien in de vLLKT, tegen de verwachtingen in, een positief of moeilijk te interpreteren resultaat wordt verkregen, kunnen aanvullende tests nodig zijn om de bevinding te interpreteren of te verduidelijken. De 
vLLKT mag niet worden gebruikt om gevaren van stoffen die worden 
gebruikt in huidsensibilisatietests te signaleren indien dosis/responsinfor ­
matie nodig is, zoals in het geval van de onderverdeling voor Verordening (EG) nr. 1272/2008 betreffende de indeling, etikettering en 
verpakking van stoffen en mengsels en het mondiaal geharmoniseerd 
classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen van de Ver ­
enigde Naties.
 
DEFINITIES  
3. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 2.  
TOELICHTING EN BEPERKINGEN  
4. De LLKT is een alternatieve methode die kan worden gebruikt om poten ­
tiële huidsensibilisatie door chemische stoffen te signaleren. Dit houdt niet 
noodzakelijkerwijs in dat de LLKT in alle gevallen in plaats van de proef 
met cavia's moet worden gebruikt (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406) (13), maar veeleer dat de test gelijkwaardig is en als alternatief kan worden gebruikt, waarbij positieve en negatieve resultaten niet langer behoeven te 
worden bevestigd. Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het 
onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
nemen. Dergelijke informatie omvat tevens de identiteit en chemische 
structuur van de teststof; de fysisch-chemische eigenschappen van de test ­
stof; de uitkomsten van eventuele andere met de teststof in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; en toxicologische gegevens betreffende struc ­
tureel verwante chemische stoffen. Deze informatie moet in overweging 
worden genomen om te bepalen of de LLKT geschikt is voor de stof 
(gezien de incompatibiliteit van sommige soorten chemische stoffen met de LLKT, zie punt 5) en om de dosis beter te kunnen vaststellen.
 
5. De LLKT is een in-vivomethode en leidt er derhalve niet toe dat er bij de 
bepaling van allergische contactsensibilisatie geen dieren meer worden 
gebruikt. Het is echter wel mogelijk dat het aantal daarvoor gebruikte 
dieren wordt beperkt. Bovendien zorgt de LLKT voor een aanzienlijke verfijning (minder pijn en leed) van de manier waarop dieren voor het testen op allergische contactsensibilisatie worden gebruikt. De LLKT is 
gebaseerd op het onderzoek van immunologische gebeurtenissen die tij ­
dens de inductiefase van sensibilisatie door chemische stoffen worden gestimuleerd. In tegenstelling tot de proeven met cavia's (d.w.z. B.6; 
OESO-testrichtlijn 406) (13) behoeven bij de LLKT geen door provocatie 
geïnduceerde overgevoeligheidsreacties van de huid te worden opgewekt. Bovendien behoeft bij de LLKT geen adjuvans te worden gebruikt, het ­
geen bij de maximalisatietest bij cavia's wel nodig is (13). Dit betekent dat 
de pijn en het ongerief voor dieren bij de LLKT geringer zijn. Ondanks de 
voordelen van de LLKT ten opzichte van B.6 en OESO-testrichtlijn 406 moet worden gesteld dat er bepaalde beperkingen zijn waardoor het ge ­
bruik van B.6 of OESO-testrichtlijn 406 (13) nodig kan zijn (bijvoorbeeld 
valsnegatieve resultaten bij de LLKT met bepaalde metalen of valsposi ­
tieve resultaten met bepaalde stoffen die de huid irriteren [zoals bepaalde soorten oppervlakteactieve chemische stoffen] (19) (20), of de oplosbaar ­
heid van de teststof). Daarnaast kan in het geval van chemische klassen of 
stoffen die functionele groepen bevatten waarvan is aangetoond dat ze als 
potentiële stoorfactoren (21) werken, het gebruik van proeven met  cavia's  
(d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406) (13) nodig zijn. Ook bestaat er bij de LLKT, op basis van de databank van stoffen met beperkte validering, die 
hoofdzakelijk uit pesticideformuleringen bestond, een hogere kans op een 
positieve uitkomst voor deze soorten teststoffen dan bij proeven met ca ­
via's (22). Echter, het is het overwegen waard om soortgelijke stoffen met bekende uitkomsten als referentiestoffen te gebruiken, teneinde aan te 
tonen dat de LLKT correct functioneert (zie punt 16). Afgezien van der ­
gelijke bekende beperkingen zou de LLKT toepasbaar moeten zijn voor het testen van alle stoffen, tenzij deze stoffen eigenschappen hebben die de nauwkeurigheid van de LLKT negatief kunnen beïnvloeden.
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
6. Het beginsel dat aan de LLKT ten grondslag ligt, is dat sensibilisatoren de 
proliferatie induceren van lymfocyten in de lymfklieren die de afvoer verzorgen van de plaats waar de teststof wordt aangebracht. Deze prolife ­
ratie is evenredig met de dosis en de potentie van het aangebrachte aller ­
geen en biedt een eenvoudige mogelijkheid om een kwantitatieve meting van de sensibilisatie uit te voeren. De proliferatie wordt gemeten door de gemiddelde proliferatie in iedere testgroep te vergelijken met de gemid ­
delde proliferatie in de met medium behandelde controlegroepen. De ver ­
houding tussen de gemiddelde proliferatie bij iedere behandelde groep en bij de gelijktijdige medium-controlegroep wordt bepaald en deze zo ­
genaamde stimuleringsindex moet minimaal drie zijn, voordat het gerecht ­
vaardigd is om de teststof in te delen als potentiële huidsensibilisator. De 
hier beschreven procedures zijn gebaseerd op het gebruik van in vivo radioactieve markering om een toegenomen aantal delende cellen in de afvoerende lymfklieren te meten. Echter, ook andere eindpunten voor de 
bepaling van het aantal delende cellen kunnen worden gebruikt, mits vol ­
ledig wordt voldaan aan de prestatienormvereisten (aanhangsel 1).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
BESCHRIJVING VAN DE TEST  
Keuze van de diersoort  
7. Voor deze test worden bij voorkeur muizen gebruikt. Er worden jonge 
volwassen vrouwtjesmuizen van de CBA/Ca- of CBA/J-stam gebruikt, die 
nog geen jongen hebben gehad en niet drachtig zijn. Bij het begin van het onderzoek moeten de dieren 8-twaalf weken oud zijn; het gewichtsverschil 
tussen de dieren moet minimaal zijn en de afwijking mag niet groter zijn 
dan 20 % van het gemiddelde gewicht. Er mogen ook andere stammen of mannetjes worden gebruikt, wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn om aan te tonen dat er geen significante stam- en/of geslachtsspeci ­
fieke verschillen in de LLKT-respons zijn.
 
Huisvesting en voeding  
8. De muizen moeten in groepjes worden ondergebracht (23), tenzij een 
individuele behuizing van de muizen naar behoren wetenschappelijk wordt 
gemotiveerd. De temperatuur van de proefdierruimte dient 22 ± 3 °C te 
zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik 
worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur 
donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.
 
Voorbereiding van de dieren  
9. De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te 
kunnen identificeren (maar niet door enigerlei vorm van oormerking) en vóór het begin van de toediening gedurende minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten 
wennen. Vóór het begin van de behandeling worden alle dieren onderzocht 
om vast te stellen dat ze geen waarneembaar huidletsel hebben.
 
Bereiding van de doseeroplossingen  
10. Vaste chemische stoffen moeten in oplosmiddelen/media worden opgelost 
of gesuspendeerd en, indien nodig, verdund vóór aanbrenging op een oor 
van de muis. Vloeibare chemische stoffen kunnen onverdund worden toe ­
gediend of vóór de toediening worden verdund. Onoplosbare chemische stoffen, zoals die gewoonlijk voorkomen in medische apparaten, moeten 
worden onderworpen aan een maximale extractie in een geschikt oplos ­
middel om alle extraheerbare bestanddelen voor het testen vrij te maken vóór aanbrenging op een oor van de muis. Teststoffen moeten dagelijks worden geprepareerd, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aan ­
vaardbaar is.
 
Betrouwbaarheidscontrole  
11. Voor positieve controle gebruikte stoffen (PC's) worden gebruikt om aan 
te tonen dat de test correct werkt in de zin dat de test leidt tot een respons 
met voldoende en reproduceerbare gevoeligheid, waarbij de omvang van 
de respons goed gedocumenteerd is. Gelijktijdig gebruik van een PC wordt aanbevolen, omdat hiermee wordt aangetoond dat het laboratorium de competentie bezit om iedere test succesvol uit te voeren en omdat de 
intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en -overdraagbaarheid hier ­
mee kan worden beoordeeld. Een PC voor iedere studie wordt ook vereist door sommige regelgevende autoriteiten en derhalve worden gebruikers aangemoedigd de relevante autoriteiten te raadplegen alvorens de LLKT 
uit te voeren. Derhalve wordt het routinematige gelijktijdige gebruik van 
een PC aangemoedigd, zodat geen noodzaak bestaat om aanvullende dierproeven uit te voeren om te voldoen aan dergelijke vereisten die kun ­
nen voortkomen uit het gebruik van een periodieke PC (zie punt 12). De 
PC moet een positieve LLKT-respons opleveren bij een blootstellings ­
niveau waarbij in vergelijking met de negatieve controlegroep een stijging
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
van de SI met > 3 wordt verwacht. De dosis van de PC moet zo worden 
gekozen dat de stof geen overmatige huidirritatie of systemische toxiciteit 
veroorzaakt en de inductie reproduceerbaar is, maar niet buitensporig (d.w.z. een SI > 20 zou buitensporig zijn). Bij voorkeur moeten 25 % hexylcinnamaldehyde (Chemical Abstracts Service [CAS] nr. 101-86-0) 
in aceton: olijfolie (4:1, v/v) en 5 % mercaptobenzothiazool (CAS- 
nr. 149-30-4) in  N,N -dimethylformamide worden gebruikt (zie aanhangsel 
1, tabel 1). Onder bepaalde omstandigheden kunnen andere PC's worden gebruikt die aan bovengenoemde criteria voldoen, mits een afdoende moti ­
vering wordt gegeven.
 
12. Hoewel het gelijktijdige gebruik van een PC-groep aanbevolen wordt, 
kunnen er situaties zijn waarin periodiek testen (d.w.z. met intervallen ≤ 
zes maanden) van de PC toereikend kan zijn voor laboratoria die de LLKT regelmatig uitvoeren (d.w.z. de LLKT uitvoeren met een frequentie van niet minder dan eenmaal per maand) en die een historische PC-databank 
hebben die aantoont dat het laboratorium in staat is om reproduceerbare en 
nauwkeurige uitkomsten met PC's te verkrijgen. Toereikende ervaring met de LLKT kan worden aangetoond door consequent positieve uitkomsten te genereren in ten minste tien onafhankelijke tests die binnen een redelijke 
tijdspanne (d.w.z. binnen één jaar) worden uitgevoerd.
 
13. Gelijktijdig gebruik van een PC-groep is verplicht in geval van een pro ­
cedurewijziging in de LLKT (bv. wijziging van gekwalificeerd personeel, 
wijziging in de materialen en/of reagentia van de testmethode, wijziging van de testapparatuur, wijziging van de bron van proefdieren), en derge ­
lijke wijzigingen moeten in laboratoriumverslagen worden gedocumen ­
teerd. Het effect van dergelijke wijzigingen op de nauwkeurigheid van 
de eerder opgerichte historische databank moet in overweging worden genomen om te bepalen of het nodig is een nieuwe historische databank op te richten, teneinde consistentie in de documentatie van de 
PC-uitkomsten te waarborgen.
 
14. Onderzoekers dienen zich ervan bewust te zijn dat de beslissing om een 
PC-onderzoek op periodieke basis uit te voeren in plaats van gelijktijdig, 
consequenties heeft voor de nauwkeurigheid en aanvaardbaarheid van ne ­
gatieve onderzoeksuitkomsten die zijn gegenereerd zonder gelijktijdig ge ­
bruik van een PC tijdens het interval tussen opeenvolgende periodieke 
PC-onderzoeken. Indien bijvoorbeeld een valsnegatieve uitkomst is ver ­
kregen in het periodieke PC-onderzoek, kunnen negatieve resultaten voor teststoffen die zijn verkregen in het interval tussen het laatste aanvaardbare periodieke PC-onderzoek en het onaanvaardbare PC-onderzoek in twijfel 
worden getrokken. De implicaties van deze uitkomsten moeten zorgvuldig 
in overweging worden genomen om te bepalen of PC's gelijktijdig moeten worden gebruikt of dat alleen periodieke PC-onderzoeken moeten worden uitgevoerd. Tevens moet overwogen worden om minder dieren te gebrui ­
ken in de gelijktijdige PC-groep, indien dit wetenschappelijk gerechtvaar ­
digd is en indien het laboratorium aantoont, op basis van laboratoriums ­
pecifieke historische gegevens, dat minder muizen gebruikt kunnen wor ­
den (12).
 
15. Hoewel de PC moet worden getest in een medium waarvan bekend is dat 
het een consequente respons oplevert (bv. aceton: olijfolie; 4:1, v/v), kan 
de regelgeving in bepaalde gevallen vereisen dat de tests ook in een 
ongebruikelijk medium (een klinisch/chemisch relevante formulering) wor ­
den uitgevoerd (24). Indien de gelijktijdig gebruikte PC in een ander medium wordt getest dan de teststof, moet een afzonderlijke met medium 
behandelde groep voor de gelijktijdig gebruikte PC worden gebruikt.
 
16. In gevallen waarin teststoffen van een specifieke chemische klasse of 
bereik van responsen worden geëvalueerd, kunnen referentiestoffen ook 
nuttig zijn om aan te tonen dat de testmethode correct functioneert voor het signaleren van het huidsensibilisatiepotentieel van deze soorten stoffen. Geschikte referentiestoffen moeten de volgende eigenschappen hebben:
 
— ze moeten structureel en functioneel vergelijkbaar zijn met de klasse 
van de teststof die wordt getest;  
— hun fysische/chemische kenmerken moeten bekend zijn;  
— uit de LLKT afkomstige gegevens ondersteunen;  
— uit andere diermodellen en/of van mensen afkomstige gegevens onder ­
steunen.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
UITVOERING VAN DE PROEF  
Aantal dieren en hoogte van de doses  
17. Er worden minimaal vier dieren per dosisgroep gebruikt en ten minste drie 
concentraties van de teststof plus een negatieve controlegroep (NC-groep), 
die alleen met het medium voor de teststof wordt behandeld, en een PC (gelijktijdig of recentelijk uitgevoerd, op basis van het laboratoriumbeleid 
zoals beschreven in de punten 11-15). Het testen van meerdere doses van 
de PC moet overwogen worden, in het bijzonder wanneer de PC op periodieke basis wordt getest. Behalve dat de dieren in de controlegroepen niet met de teststof worden behandeld, worden ze verder op identieke 
wijze behandeld als de dieren in de behandelde groepen.
 
18. De keuze van de doses en het medium wordt gebaseerd op de aanbeve ­
lingen in de referenties (3) en (5), Opeenvolgende doses worden doorgaans gekozen uit een geschikte concentratiereeks, zoals 100 %, 50 %, 25 %, 
10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % enz. Aan de keuze van de gebruikte con ­
centratiereeks moet een toereikende wetenschappelijke motivering ten grondslag liggen. Bij de keuze van de drie opeenvolgende concentraties moet rekening worden gehouden met alle bestaande toxicologische gege ­
vens (bv. met betrekking tot acute toxiciteit en huidirritatie), wanneer die 
beschikbaar zijn, zodat bij de hoogste concentratie de blootstelling maxi ­
maal is zonder dat dit tot systemische toxiciteit en bovenmatige lokale huidirritatie leidt (3) (25). Wanneer dergelijke informatie niet beschikbaar 
is, kan een initiële voorafgaande screeningtest nodig zijn (zie punten 21- 
24).
 
19. Het medium mag het testresultaat niet verstoren of er invloed op uitoefe ­
nen en moet worden gekozen met het oog op de hoogste mate van op ­
losbaarheid, zodat de hoogst mogelijke concentratie wordt verkregen, ter ­
wijl de oplossing/suspensie geschikt moet zijn om de teststof mee aan te brengen. Aanbevolen media zijn aceton: olijfolie (4:1, v/v),  N,N -dimethyl ­
formamide, methylethylketon, propyleenglycol en dimethylsulfoxide (19), 
maar ook een ander medium mag worden gebruikt als daarvoor een af ­
doende wetenschappelijke motivering wordt gegeven. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn als extra controle een klinisch relevant oplosmiddel te gebruiken of de commerciële formulering waarin de teststof in de handel 
wordt gebracht. Er moet vooral voor worden gezorgd dat hydrofiele test ­
stoffen worden opgenomen in een medium dat de huid vochtig maakt en niet onmiddellijk wegloopt. Dit kan worden bereikt door geschikte oplos ­
baar makende stoffen (bv. 1 % Pluronic® L92) toe te voegen. Een volledig 
waterig medium moet derhalve worden vermeden.
 
20. Door de verwerking van lymfklieren van individuele muizen kan de sprei ­
ding over de dieren worden beoordeeld en kan een statistische vergelijking tussen de teststofmetingen en de metingen voor de met medium behan ­
delde controlegroep worden uitgevoerd (zie punt 35). Daarnaast kan door 
het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren de mogelijkheid onderzocht worden om het aantal muizen in de PC-groep te verminderen (12). Verder vereisen sommige regelgevende autoriteiten 
het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren. Niet ­
temin kunnen gepoolde diergegevens aanvaardbaar zijn voor bepaalde regelgevende autoriteiten en in dergelijke situaties kunnen gebruikers mo ­
gelijk kiezen of ze individuele of gepoolde diergegevens verzamelen.
 
Voorafgaande screeningtest  
21. Wanneer er geen gegevens beschikbaar zijn om de hoogste te testen dosis 
te bepalen (zie punt 18), moet een voorafgaande screeningtest worden uitgevoerd om de juiste dosis te bepalen die in de LLKT getest moet worden. Het doel van de voorafgaande screeningtest is om richtsnoeren 
te bieden voor het kiezen van de maximale dosis in het hoofdonderzoek 
van de LLKT, indien informatie over de concentratie die systemische toxiciteit induceert (zie punt 24) en/of bovenmatige huidirritatie (zie punt 23) niet beschikbaar is. De maximale dosis die wordt getest, moet 
100 % zijn van de teststof voor vloeibare stoffen of de hoogst mogelijke 
concentratie voor vaste stoffen of suspensies.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. De voorafgaande screeningtest wordt uitgevoerd onder omstandigheden die 
identiek zijn aan die van het hoofdonderzoek van de LLKT, behalve dat er 
geen beoordeling is van de lymfklierproliferatie en er minder dieren per dosisgroep kunnen worden gebruikt. Aanbevolen wordt per dosisgroep een of twee dieren te gebruiken. Alle muizen worden dagelijks geobserveerd 
op klinische verschijnselen van systemische toxiciteit of op lokale irritatie 
op de plaats van aanbrengen. Het lichaamsgewicht van de dieren wordt geregistreerd voorafgaand aan de test en vóór de beëindiging van de test (dag 6). Beide oren van iedere muis worden onderzocht op erytheem en de 
responsen worden ingeschaald met behulp van tabel 1 (25). De dikte van 
de oren wordt gemeten met behulp van een diktemeter (bv. een digitale micrometer of een Peacock Dial-diktemeter) op dag 1 (vóór aanbrenging van de dosis), dag 3 (ongeveer 48 uur na de eerste dosis) en dag 6. 
Daarnaast kan op dag 6 de dikte worden bepaald door oorperforatiemetin ­
gen, die uitgevoerd moeten worden nadat de dieren op humane wijze zijn gedood. Bovenmatige huidirritatie wordt aangegeven door een erytheem ­
score ≥ 3 en/of een toename van de oordikte ≥ 25 % op een of meer van 
de meetdagen (26) (27). De hoogste dosis die voor het hoofdonderzoek 
van de LLKT wordt gekozen, is de volgende lagere dosis in de concen ­
tratiereeks van de voorafgaande screeningtest (zie punt 18) die geen sys ­
temische toxiciteit en/of bovenmatige huidirritatie veroorzaakt.
 
Tabel 1  
Erytheemscores  
Waarneming Score  
Geen erytheem 0 
Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar) 1 Duidelijk gedefinieerd erytheem 2 Matig tot ernstig erytheem 3 Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de 
inschaling van erytheem onmogelijk is 4
 
23. Naast een toename van de oordikte met 25 % (26) (27), is een statistisch 
significante toename van de oordikte bij de behandelde muizen in ver ­
gelijking met de controlemuizen ook gebruikt om irriterende stoffen in de 
LLKT te signaleren (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Echter, hoewel 
statistisch significante toenamen kunnen voorkomen bij een toename van de oordikte met minder dan 25 %, worden ze niet specifiek met boven ­
matige huidirritatie in verband gebracht (30) (32) (33) (34).
 
24. De volgende klinische waarnemingen kunnen duiden op systemische toxi ­
citeit (35) (36) wanneer gebruikt als onderdeel van een geïntegreerde be ­
oordeling en kunnen derhalve de maximale dosis aangeven die in het hoofd ­
onderzoek van de LLKT moet worden gebruikt: veranderingen in de wer ­
king van het zenuwstelsel (bv. pilo-erectie, ataxie, tremors en convulsies); veranderingen in gedrag (bv. agressiviteit, verandering in lichaamsverzor ­
ging, duidelijke verandering in het activiteitsniveau); veranderingen in 
ademhalingspatronen (bv. veranderingen in de frequentie en intensiteit van het ademhalen, zoals kortademigheid, benauwdheid en gereutel) en verande ­
ringen in de voedsel- en waterconsumptie. Daarnaast moet in de evaluatie 
rekening worden gehouden met tekenen van lethargie en/of gebrek aan 
reactiviteit alsmede klinische tekenen van meer dan lichte of voorbijgaande pijn en leed of een vermindering van het lichaamsgewicht van meer dan 5 % tussen dag 1 en dag 6, evenals het sterftecijfer. Stervende dieren of 
dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed 
vertonen, moeten op humane wijze worden gedood (37)
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Proefopzet hoofdonderzoek  
25. De proefopzet van het onderzoek is als volgt:  
— Dag 1:  Van elk dier apart wordt het gewicht en iedere klinische 
waarneming bepaald en vastgelegd. Vervolgens wordt 25 μl van de 
verdunning van de teststof, het medium zonder teststof of de positieve controle (gelijktijdig of recent, op basis van het in de punten 11-15 beschreven beleid), open aangebracht op het dorsum van elk oor.
 
— Dagen 2 en 3:  Herhaal de aanbrengprocedure van dag 1.  
— Dagen 4 en 5:  Geen behandeling.  
— Dag 6:  Van elk dier wordt het gewicht vastgelegd. Injecteer bij de 
muizen van alle test- en controlegroepen 250 μl PBS (phosphate-buf ­
fered saline) die 20 μCi (7,4 × 10  5 Bq) tritiumhoudende (  3 H)-methylt ­
hymidine bevat in de staartader. Een andere mogelijkheid is injectie van 250 μl PBS die 2 μCi (7,4 × 10
 4 Bq)  125 I-jooddeoxyuridine en 
10 –5 M fluordeoxyuridine bevat bij alle muizen in de staartader. Vijf 
uur (5 u) later worden de dieren op humane wijze gedood. De afvoe ­
rende auriculaire lymfklieren van elk oor worden uitgeprepareerd en voor ieder dier afzonderlijk gepoold in PBS (individuele aanpak); het is ook mogelijk de lymfklieren van elk oor uit te prepareren en in PBS 
te poolen voor iedere behandelgroep (groepsgewijze aanpak). Refe ­
rentie (12) bevat gedetailleerde informatie en diagrammen voor de identificatie en het uitprepareren van de lymfklieren. Om de lokale huidreacties in het hoofdonderzoek nader te onderzoeken, kunnen aan ­
vullende parameters in het onderzoeksprotocol worden opgenomen, 
zoals de inschaling van oorerytheem of oordiktemetingen (verkregen door gebruik van een diktemeter of door oorperforatiemetingen bij de necropsie).
 
Bereiding van de celsuspensies  
26. Er wordt een eencellige suspensie gemaakt met lymfkliercellen van aparte 
dieren of van gepoolde groepen door het weefsel voorzichtig door een 
roestvrij stalen gaas met een maaswijdte van 200 μm te persen of met 
behulp van een andere acceptabele techniek voor het genereren van een eencellige suspensie. De lymfkliercellen worden tweemaal gewassen met een overmaat PBS en het DNA wordt neergeslagen met 5 % 
trichloorazijnzuur (TCA) bij 4 °C gedurende 18 uur (3). Het neerslag 
wordt geresuspendeerd in 1 ml TCA en voor
 3 H-telling overgebracht in 
scintillatie-telflesjes die 10 ml scintillatievloeistof bevatten, of direct over ­
gebracht in gamma-telbuizen voor  l25 I-telling.  
Bepaling van celproliferatie (opgenomen radioactiviteit)  
27. De opname van  3 H-methylthymidine wordt gemeten door β-scintillatietel ­
ling als desintegraties per minuut (DPM). De opname van  125 I-jooddeoxy ­
uridine wordt gemeten door  125 I-telling en ook als DPM uitgedrukt. Af ­
hankelijk van de gevolgde werkwijze wordt de opname uitgedrukt als DPM/muis (individuele aanpak) of DPM/behandelingsgroep (groeps ­
gewijze aanpak).
 
Verminderde LLKT  
28. In bepaalde situaties, wanneer er op grond van regelgeving een noodzaak 
bestaat om een negatieve voorspelling van het huidsensibilisatiepotentieel 
te bevestigen, kan een optioneel protocol voor verminderde LLKT (vLLKT) (16) (17) (18) met gebruikmaking van minder dieren worden gebruikt, op voorwaarde dat aan alle andere LLKT-protocolspecificaties 
in deze TM wordt voldaan. Voordat de vLLKT-benadering wordt toege ­
past, moeten een duidelijke rechtvaardiging en een wetenschappelijke mo ­
tivering voor de toepassing ervan worden overgelegd. Als een positief of moeilijk te interpreteren uitkomst wordt verkregen, kan het nodig zijn om 
aanvullende tests uit te voeren om de bevinding te interpreteren of te 
verduidelijken.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. De vermindering van het aantal dosisgroepen is het enige verschil tussen 
de LLKT- en de vLLKT-testmethodeprotocollen en derhalve levert de 
vLLKT geen dosis/responsgegevens op. Dit betekent dat de vLLKT niet mag worden gebruikt indien dosis-responsgegevens benodigd zijn. Zoals bij de LLKT met meerdere doses, moet de teststofconcentratie die bij de 
vLLKT wordt beoordeeld de maximale concentratie zijn die geen duide ­
lijke systemische toxiciteit en/of bovenmatige huidirritatie bij de muis veroorzaakt (zie punt 18).
 
WAARNEMINGEN  
Klinische waarnemingen  
30. Iedere muis wordt ten minste één keer per dag zorgvuldig geobserveerd op 
klinische verschijnselen van lokale irritatie op de plaats van aanbrengen of 
systemische toxiciteit. Alle waarnemingen worden systematisch geregis ­
treerd en van elke muis wordt een apart overzicht bijgehouden. Waarne ­
mingsschema's dienen criteria te omvatten om muizen die tekenen ver ­
tonen van systemische toxiciteit, overmatige lokale huidirritatie of huid ­
corrosie onmiddellijk aan te wijzen voor euthanasie (37).  
Lichaamsgewicht  
31. Zoals in punt 25 is vermeld, wordt aan het begin van de test en wanneer 
de dieren volgens schema op humane wijze worden gedood, van elk dier 
het lichaamsgewicht bepaald.  
BEREKENING VAN RESULTATEN  
32. De resultaten voor iedere behandelingsgroep worden uitgedrukt als de 
stimuleringsindex (SI). Bij de individuele aanpak wordt de SI berekend door de gemiddelde DPM/muis van elke groep behandeld met teststof en de positieve cont rolegroep, te delen door de gemiddelde DPM/muis voor 
de medium-controlegroep. De gemiddelde SI voor de met medium behan ­
delde controles is dan 1. Bij de groepsgewijze aanpak wordt de SI bere ­
kend door de totale opname van radioactiviteit voor elke behandelde groep te delen door de totale opname van radioactiviteit voor de 
medium-controlegroep; dit levert een gemiddelde SI op.
 
33. Binnen het beslissingsproces wordt een resultaat als positief beschouwd, 
indien SI ≥ 3. Echter, de sterkte van de dosis/respons, de statistische 
significantie en de consistentie van de medium-controlegroep- en PC-responsen kunnen ook worden gebruikt om te bepalen of een resultaat dat een grensgeval is, positief wordt verklaard (4) (5) (6).
 
34. Als de verkregen resultaten onduidelijk zijn, moet worden gekeken naar 
verschillende eigenschappen van de teststof, bijvoorbeeld of deze qua 
structuur verwant is met bekende huidsensibilisatoren, of de stof overma ­
tige huidirritatie veroorzaakt en wat de aard van de waargenomen dosis/ responsverhouding is. Deze en andere overwegingen worden elders gede ­
tailleerd besproken (7).
 
35. Door radioactiviteitsgegevens te verzamelen op het niveau van de indivi ­
duele muis, kan een statistische analyse worden uitgevoerd voor het be ­
staan van een dosis/responsverhouding binnen de gegevens en de mate 
waarin deze verhouding voorkomt. Iedere statistische beoordeling kan 
een evaluatie omvatten van de dosis/responsverhouding evenals afdoende aangepaste vergelijkingen van testgroepen (bv. paarsgewijs gedoseerde groep tegenover vergelijkingen van een gelijktijdig met medium behan ­
delde controlegroep). Statistische analyses kunnen  bijvoorbeeld  lineaire 
regressie omvatten of de test van William voor het beoordelen van dosis/ responstrends, alsmede de test van Dunnett voor paarsgewijze vergelijkin ­
gen. Bij het kiezen van een geschikte statistische analysemethode moet de 
onderzoeker zich bewust blijven van mogelijke variantie-heterogeniteit en 
andere soortgelijke problemen, die een gegevenstransformatie of een niet-parametrische statistische analyse noodzakelijk kunnen maken. In ie ­
der geval kan het nodig zijn dat de onderzoeker SI-berekeningen en sta ­
tistische analyses uitvoert met en zonder bepaalde gegevenspunten (soms 
„uitbijters” genoemd).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
36. Gegevens moeten in tabelvorm worden samengevat. Bij de individuele 
aanpak moeten de DPM-waarden voor individuele dieren worden weer ­
gegeven, alsmede de gemiddelde DPM/dier per groep, het bijbehorende residu (bv. SD, SEM), en de gemiddelde SI voor iedere dosisgroep in 
vergelijking met de gelijktijdig met medium behandelde controlegroep. 
Bij gebruik van de benadering voor gepoolde behandelingsgroepen moet de gemiddelde/mediane DPM en de gemiddelde SI voor iedere dosisgroep in vergelijking met de gelijktijdig met medium behandelde controlegroep 
worden weergegeven.
 
Testverslag  
37. In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:  
Test- en controlestoffen:  
— identificatiegegevens (bv. CAS- en EG-nummers, indien beschikbaar; 
bron; zuiverheid; bekende onzuiverheden; partijnummer);  
— de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de vluch ­
tigheid, de stabiliteit en de oplosbaarheid);  
— bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het pro ­
centuele gehalte;  
Oplosmiddel/medium:  
— identificatiegegevens (zuiverheid; concentratie, indien van toepassing; 
gebruikt volume);  
— motivering van de keuze van het medium;  
Proefdieren:  
— bron van CBA-muizen;  
— microbiologische status van de dieren, indien bekend;  
— aantal en leeftijd van de dieren;  
— de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.;  
Testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de formulering en het aanbrengen van de 
teststof;  
— motivering voor dosiskeuze (met inbegrip van resultaten van voor ­
afgaande screeningtest, indien uitgevoerd);  
— gebruikte concentraties van medium en teststof en totale hoeveelheid 
teststof die is aangebracht;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water 
(waaronder de aard en de herkomst van het voer en de herkomst van 
het water);  
— gedetailleerde gegevens met betrekking tot het behandelings- en be ­
monsteringsschema;  
— methoden voor de meting van de toxiciteit;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief of negatief is;  
— gedetailleerde gegevens met betrekking tot protocolafwijkingen en een 
uitleg van hoe de afwijking van invloed is op de opzet en resultaten van het onderzoek;
 
Betrouwbaarheidscontrole:  
— overzicht van de resultaten van de meest recente betrouwbaarheids ­
controle met informatie over de teststof, de concentratie en het ge ­
bruikte medium;  
— tegelijkertijd en/of in het verleden bepaalde positieve en negatieve 
controlegegevens voor het testlaboratorium;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— indien geen gelijktijdige PC is uitgevoerd, de datum en het laborato ­
riumverslag voor de meest recente periodieke PC en een verslag met 
de historische PC-gegevens voor het laboratorium waarin de beslissing om geen gelijktijdige PC uit te voeren, wordt gemotiveerd;
 
Resultaten:  
— het gewicht van elke muis aan het begin van de test en wanneer deze 
volgens schema wordt gedood; evenals het gemiddelde bijbehorende 
residu (bv. SD, SEM) voor iedere behandelingsgroep;  
— voor elk dier het tijdstip waarop de eventuele toxiciteitsverschijnselen 
zich voordoen, met inbegrip van huidirritatie op de toedieningsplaats, 
en het verloop daarvan;  
— een tabel met de DPM-waarden van individuele muizen (individuele 
aanpak per dier) of de gemiddelde/mediane DPM-waarden (groeps ­
gewijze aanpak) en de SI-waarden voor iedere behandelingsgroep;  
— gemiddeld bijbehorend residu (bv. SD, SEM) voor de DPM/muis voor 
elke behandelingsgroep en de resultaten van uitbijteranalyses voor elke 
behandelingsgroep bij toepassing van de individuele aanpak per dier;  
— berekende SI en een geschikte meting van de variabiliteit die rekening 
houdt met de spreiding over de dieren in zowel de teststof- als de 
controlegroepen bij toepassing van de individuele benadering per dier;  
— dosis/responsverhouding;  
— statistische analyses, indien van toepassing;  
Bespreking van de resultaten:  
— een korte bespreking van de resultaten, de dosis/respons-analyse en de 
statistische analyses, indien van toepassing, met een conclusie ten aan ­
zien van de vraag of de teststof als huidsensibilisator moet worden beschouwd.
 
LITERATUUR  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Gui ­
deline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. Toxi ­
col., 30, 165-169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 13-31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563-79.
 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999-1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985-997.  
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327-33.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins,  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258-273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274-286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249-257.
 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemic ­
als No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguide ­
lines]  
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kim ­
ber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to 
hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281-284.  
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181-185.  
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Cen ­
tre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the 
Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ec ­
vam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]  
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Me ­
thod Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Po ­
tential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Re ­
search Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sci ­
ences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]  
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordina ­
ted by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Inter ­
agency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available 
at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Phar ­
macol., 55, 90-96.  
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http:// www.oecd.org/document/40/ 
0,3343,en_2649_34377_37051368_ 1_1_1_1,00.html]
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.
 
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http:// iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol ., 153, 83-94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245-256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and com ­
parison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, 
R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60-68.  
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Re ­
search Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sci ­
ences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]  
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Aanhangsel 1  
Prestatienormen voor beoordeling van voorgestelde soortgelijke of 
gewijzigde LLKT-testmethoden voor huidsensibilisatie  
INLEIDING  
1. Prestatienormen zijn bedoeld om mee te delen op welke grondslag kan 
worden vastgesteld dat nieuwe testmethoden, zowel niet-generieke metho ­
den (d.w.z. methoden die beschermd zijn door het auteursrecht, die een handelsmerk hebben en die geregistreerd zijn) als generieke methoden, bepaald kunnen worden teneinde voldoende nauwkeurigheid en betrouw ­
baarheid te bieden voor specifieke testdoeleinden. Deze prestatienormen, die 
gebaseerd zijn op gevalideerde en geaccepteerde testmethoden, kunnen wor ­
den gebruikt om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid te beoordelen van andere soortgelijke methoden (informeel „me too”-tests genoemd) die ge ­
baseerd zijn op soortgelijke wetenschappelijke principes en die hetzelfde 
biologische of toxische effect meten of voorspellen (14).
 
2. Voordat gewijzigde methoden (d.w.z. voorgestelde potentiële verbeteringen 
van een goedgekeurde testmethode) gebruikt kunnen worden, moet een 
evaluatie worden uitgevoerd ter bepaling van het effect van de voorgestelde wijzigingen op de prestaties van de test en de mate waarin dergelijke wijzigingen de informatie beïnvloeden die beschikbaar is voor de andere 
componenten van het valideringsproces. Afhankelijk van de aard van de 
voorgestelde wijzigingen en hun aantal, de gegenereerde gegevens en on ­
dersteunende documentatie voor deze wijzigingen, moeten ze onderworpen worden aan hetzelfde valideringsproces als het voor een nieuwe test be ­
schreven proces of, indien van toepassing, aan een beperkte beoordeling van 
betrouwbaarheid en relevantie met gebruikmaking van geaccepteerde pres ­
tatienormen (14).
 
3. Soortgelijke of gewijzigde methoden die worden voorgesteld voor gebruik 
binnen deze TM moeten worden geëvalueerd om hun betrouwbaarheid en nauwkeurigheid te bepalen met gebruikmaking van chemische stoffen die 
het volledige bereik van de LLKT-scores vertegenwoordigen. Teneinde 
onnodig gebruik van dieren te voorkomen, wordt ten stelligste aanbevolen dat modelontwikkelaars de relevante autoriteiten raadplegen, voordat zij valideringsonderzoeken starten overeenkomstig de prestatienormen en richt ­
snoeren die deze TM bevat.
 
4. Deze prestatienormen zijn gebaseerd op de geharmoniseerde prestatienorm 
op basis van ICCVAM (Verenigde Staten), ECVAM (EU) en JaCVAM 
(Japan) (12), voor de evaluatie van de validiteit van soortgelijke of gewij ­
zigde versies van de LLKT. De prestatienorm bestaat uit essentiële com ­
ponenten van de testmethode, aanbevolen referentiestoffen en nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidsnormen waaraan de voorgestelde me ­
thode moet voldoen of die de voorgestelde methode moet overtreffen.
 
I. Essentiële componenten van de testmethode  
5. Om te waarborgen dat een soortgelijke of gewijzigde LLKT-methode in 
functioneel en mechanistisch opzicht vergelijkbaar is met de LLKT en 
hetzelfde biologische effect meet, moeten de volgende componenten in het protocol van de testmethode worden opgenomen:
 
— De teststof moet plaatselijk worden aangebracht op beide oren van de 
muis;  
— De proliferatie van lymfocyten moet worden gemeten in de lymfklieren 
die de afvoer verzorgen van de plaats waar de teststof wordt aange ­
bracht;  
— De proliferatie van lymfocyten moet worden gemeten tijdens de induc ­
tiefase van huidsensibilisatie;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— Voor teststoffen moet de hoogste gekozen dosis de maximale concen ­
tratie zijn die geen systemische toxiciteit en/of bovenmatige lokale hui ­
dirritatie bij de muis veroorzaakt. Voor positieve referentiestoffen moet de hoogste dosis minimaal zo hoog zijn als de LLKT EC3-waarden van de overeenkomstige referentiestoffen (zie tabel 1) zonder systemische 
toxiciteit en/of bovenmatige lokale huidirritatie bij de muis te veroor ­
zaken;
 
— Een gelijktijdige controlegroep moet in elk onderzoek worden opge ­
nomen en er moet, indien van toepassing, tevens een gelijktijdige PC worden gebruikt;
 
— Per dosisgroep moeten minimaal vier dieren worden gebruikt;  
— De gegevens kunnen worden verzameld van elk dier apart of van ge ­
poolde groepen.  
Indien aan een van deze criteria niet wordt voldaan, kunnen deze prestatie ­
normen niet worden gebruikt om de soortgelijke of gewijzigde methode te valideren.
 
II. Minimumlijst van referentiestoffen  
6. De geharmoniseerde prestatienorm op basis van ICCVAM, ECVAM en 
JaCVAM (12) bevat een minimumlijst van 18 referentiestoffen die gebruikt moeten worden en vier optionele referentiestoffen (d.w.z. stoffen die vals ­
positieve of valsnegatieve uitkomsten gaven in de LLKT in vergelijking met 
de resultaten van tests met mensen en cavia's (B.6 of OESO-testrichtlijn 
406) (13) en die derhalve de mogelijkheid bieden om gelijkwaardige of betere prestaties dan de LLKT aan te tonen) die zijn opgenomen in de prestatienormen voor de LLKT. De selectiecriteria voor de aanwijzing 
van deze chemische stoffen waren:
 
— de lijst van referentiestoffen kwam overeen met de soorten stoffen die 
doorgaans getest worden op huidsensibilisatiepotentieel en met het be ­
reik van de responsen dat de LLKT kan meten of voorspellen;  
— de stoffen hadden goed gedefinieerde chemische structuren;  
— LLNA-gegevens van tests met cavia's (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 
406) (13) en, zo mogelijk, gegevens van tests met mensen waren 
voor iedere stof beschikbaar; en  
— de stoffen waren gemakkelijk verkrijgbaar via een commerciële bron.  
De aanbevolen referentiestoffen worden vermeld in tabel 1. Onderzoeken 
die gebruikmaken van de aanbevolen referentiestoffen moeten geëvalueerd 
worden in het medium waarmee ze worden vermeld in tabel 1. In situaties 
waarin een stof op de lijst niet verkrijgbaar is, mogen andere stoffen die aan de selectiecriteria voldoen, worden gebruikt, mits met een afdoende moti ­
vering.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabel 1  
Aanbevolen referentiestoffen voor de prestatienormen van de LLKT  
Nummer Chemische stoffen (  1 ) CAS-nr. Toestand Med (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x - 2,0x EC3 Werkelijk 
EC3-bereik LLKT vs. 
CT LLKT vs. 
test bij 
mensen  
1 5-chloor-2-methyl-4-isothiazoline-3-on (CMI)/2- 
methyl-4-isothiazoline-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Vlb DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NB +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Vast AOO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-fenyleendiamine 106-50-3 Vast AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 
4 Kobaltchloride 7646-79-9 Vast DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 Iso-eugenol 97-54-1 Vlb AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 6 2-mercaptobenzothiazool 149-30-4 Vast DMF 1,7 1 0,85-3,4 NB +/+ +/+ 7 Citral 5392-40-5 Vlb AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Vlb AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 
9 Eugenol 97-53-0 Vlb AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Fenylbenzoaat 93-99-2 Vast AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 Cinnamylalcohol 104-54-1 Vast AOO 21 1 10,5-42 NB +/+ +/+ 12 Imidazolidinylureum 39236-46-9 Vast DMF 24 1 12-48 NB +/+ +/+ 13 Methylmethacrylaat 80-62-6 Vlb AOO 90 1 45-100 NB +/+ +/+ 14 Chloorbenzeen 108-90-7 Vlb AOO 25 1 n.v.t. n.v.t. –/– –/ (*) 15 Isopropanol 67-63-0 Vlb AOO 50 1 n.v.t. n.v.t. –/– –/+
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Nummer Chemische stoffen (  1 ) CAS-nr. Toestand Med (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x - 2,0x EC3 Werkelijk 
EC3-bereik LLKT vs. 
CT LLKT vs. 
test bij 
mensen  
16 Melkzuur 50-21-5 Vlb DMSO 25 1 n.v.t. n.v.t. –/– –/ (*) 
17 Methylsalicylaat 119-36-8 Vlb AOO 20 9 n.v.t. n.v.t. –/– –/– 18 Salicylzuur 69-72-7 Vast AOO 25 1 n.v.t. n.v.t. –/– –/– 
Optionele stoffen om betere prestaties ten opzichte van de LLKT aan te tonen 
19 Natriumlaurylsulfaat 151-21-3 Vast DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Ethyleenglycoldimethacrylaat 97-90-5 Vlb MEK 28 1 14-56 NB +/– +/+ 
21 Xyleen 1330-20-7 Vlb AOO 95,8 1 47,9-100 NB +/ (**) +/– 
22 Nikkel(II)chloride 7718-54-9 Vast DMSO 5 2 n.v.t. n.v.t. –/+ –/+
 
Afkortingen: AOO = aceton: olijfolie (4:1, v/v); CAS-nr. = nummer bij de Chemical Abstracts Service (CAS); DMF =  N,N -dimethylformamide; DMSO = dimethylsulfoxide; DNCB = 2,4-dinitrochloorbenzeen; EC3 = geschatte 
concentratie die nodig is om een stimuleringsindex van 3 te genereren; CT = resultaat van caviatest (d.w.z. B.6 of OESO-testric htlijn 406) (13) HCA = hexylcinnamaldehyde; Vlb = vloeibaar; LLNA = resultaat van lokale 
lymfkliertest (d.w.z. B.42 of OESO-testrichtlijn 429) (1); MEK = methylethylketon; N.v.t. = niet van toepassing, omdat stimuler ingsindex < 3; NB = niet berekend, omdat gegevens werden verkregen uit één onderzoek; Med = 
medium. 
(*) aangezien deze stof wordt verondersteld niet sensibiliserend te werken bij mensen vanwege het feit dat er geen resultaten v an tests met provocatiepleisters beschikbaar zijn, is de stof niet opgenomen als een stof die geschikt 
is voor tests met provocatiepleisters; daarnaast zijn er geen gevallen van sensibilisatie bij mensen bekend. 
(**) geen gegevens van caviatests beschikbaar. 
( 1 ) Chemische stoffen moeten dagelijks worden geprepareerd, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is. 
( 2 ) Vanwege het potentiële effect van verschillende media op de prestaties van de LLKT, moet voor iedere referentiestof het aanbe volen medium worden gebruikt (24) (32). 
( 3 ) Gemiddelde waarde, indien meer dan één EC3-waarde beschikbaar was. Voor negatieve stoffen (d.w.z. met stimuleringsindex < 3) wordt de hoogste concentratie die getest is, gegeven. 
( 4 ) Aantal LLKT-onderzoeken waaruit gegevens werden verkregen. 
( 5 ) In de handel verkrijgbaar als Kathon CG (CAS-nr. 55965-84-9), dat een mengsel van CMI en MI is in de verhouding 3:1. De relat ieve concentraties van elke component gaan van 1,1 % tot 1,25 % (CMI) en van 0,3 % tot 
0,45 % (MI). De inactieve componenten zijn magnesiumzouten (21,5 % tot 24 %) en kopernitraat (0,15 % tot 0,17 %), waarbij de re sterende formulering bestaat uit 74 % tot 77 % water. Kathon CG is gemakkelijk 
verkrijgbaar via Sigma-Aldrich en Rohm and Haas (nu Dow Chemical Corporation).
 III. Gedefinieerde betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidsnormen  
7. De nauwkeurigheid van een soortgelijke of gewijzigde LLKT-methode moet 
gelijk zijn aan of beter zijn dan die van de prestatienorm voor de LLKT, 
wanneer de test beoordeeld wordt met gebruikmaking van de 18 referen ­
tiestoffen die gebruikt moeten worden. De nieuwe of gewijzigde methode moeten resulteren in de correcte indeling op basis van een „ja/nee”-beslis ­
sing. Het kan echter voorkomen dat de nieuwe of gewijzigde methode niet 
alle stoffen op de minimumlijst van referentiestoffen correct indeelt. Indien bijvoorbeeld een van de zwakke sensibilisatoren onjuist wordt ingedeeld, kunnen een motivering voor de onjuiste indeling en relevante aanvullende 
gegevens (d.w.z. testresultaten die tot correcte indelingen leiden voor andere 
stoffen met fysieke, chemische en sensibilisatie-eigenschappen die vergelijk ­
baar zijn met die van de onjuist ingedeelde stof) geacht worden gelijk ­
waardige prestaties aan te tonen. In dergelijke omstandigheden zou de 
valideringsstatus van de nieuwe of gewijzigde LLKT-testmethode van geval 
tot geval worden beoordeeld.
 
Intralaboratoriumreproduceerbaarheid  
8. Om de intralaboratoriumreproduceerbaarheid te bepalen, moet een nieuwe 
of gewijzigde LLKT-methode worden beoordeeld met gebruikmaking van 
een sensibiliserende stof waarvan de eigenschappen bekend zijn binnen de 
LLKT. Derhalve zijn de prestatienormen voor de LLKT gebaseerd op de variabiliteit van de resultaten van herhaalde tests met hexylcinnamaldehyde (HCA). Om de intralaboratoriumbetrouwbaarheid te 
beoordelen, moeten de grenswaarden voor de geschatte concentratie voor 
HCA verkregen worden op vier afzonderlijke tijdstippen met ten minste een week tussen de tests. Aanvaardbare intralaboratoriumreproduceerbaarheid wordt aangetoond door het vermogen van een laboratorium om in iedere 
HCA-test grenswaarden voor de geschatte concentratie te verkrijgen van 
5 % tot 20 %, hetgeen staat voor het bereik van 0,5 tot 2,0 maal de ge ­
middelde EC3 die voor HCA (10 %) wordt gespecificeerd in de LLKT (zie tabel 1).
 
Interlaboratoriumreproduceerbaarheid  
9. Interlaboratoriumreproduceerbaarheid van een nieuwe of gewijzigde 
LLKT-testmethode moet worden beoordeeld met behulp van twee sensibi ­
lisatoren waarvan de eigenschappen voldoende bekend zijn binnen de LLKT. De prestatienormen voor de LLKT zijn gebaseerd op de variabiliteit 
van de resultaten van tests met HCA en 2,4-dinitrochloorbenzeen (DNCB) 
in verschillende laboratoria. De grenswaarden voor de geschatte concentra ­
tie moeten onafhankelijk verkregen worden uit één onderzoek dat in ten minste drie afzonderlijke laboratoria wordt uitgevoerd. Om aanvaardbare 
interlaboratoriumreproduceerbaarheid aan te tonen, moet ieder laboratorium 
grenswaarden voor de geschatte concentratie (EC) verkrijgen van 5 % tot 20 % voor HCA en van 0,025 % tot 0,1 % voor DNCB, wat overeenkomt met het bereik van 0,5 tot 2,0 maal de gemiddelde EC3-concentraties die 
zijn gespecificeerd voor respectievelijk HCA (10 %) en DNCB (0,05 %) in 
de LLKT (zie tabel 1).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Aanhangsel 2  
Definities  
Nauwkeurigheid:  de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met 
de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties 
van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „con ­
cordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode 
wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (14).  
IJkstof:  een sensibiliserende of niet-sensibiliserende stof die gebruikt wordt als 
norm voor vergelijking met een teststof. Een ijkstof moet de volgende eigen ­
schappen hebben: i) consistente en betrouwbare bron(nen); ii) in structureel en functioneel opzicht soortgelijk aan de geteste klasse stoffen; iii) bekende fysisch-chemische eigenschappen; iv) ondersteunende gegevens met betrekking 
tot bekende effecten, en v) bekende potentie binnen het bereik van de gewenste 
respons.
 
Drempelwaarde voor de geschatte concentratie:  geschatte concentratie van een 
teststof die nodig is om een stimuleringsindex te genereren die duidt op een positieve respons.
 
Geschatte concentratie drie (EC3):  Geschatte concentratie van een teststof die 
nodig is om een stimuleringsindex van drie te genereren.  
Valsnegatief:  een teststof die door een testmethode ten onrechte als negatief of 
niet-actief wordt geïdentificeerd, terwijl de stof feitelijk positief of actief is.  
Valspositief:  een teststof die ten onrechte als positief of actief wordt geïdentifi ­
ceerd, terwijl de stof in feite negatief of niet-actief is.  
Gevaar:  het risico van een nadelig effect op de gezondheid of het milieu. Het 
nadelige effect doet zich alleen voor indien er voldoende blootstelling is.  
Interlaboratoriumreproduceerbaarheid:  een maatstaf voor de mate waarin ver ­
schillende gekwalificeerde laboratoria die gebruikmaken van hetzelfde protocol 
en die dezelfde teststoffen testen, in kwalitatief en kwantitatief opzicht vergelijk ­
bare resultaten kunnen produceren. De interlaboratoriumreproduceerbaarheid wordt bepaald tijdens de prevaliderings- en valideringsprocessen en geeft aan in hoeverre een test met succes tussen laboratoria kan worden overgedragen; 
dit wordt ook wel reproduceerbaarheid tussen laboratoria genoemd (14).
 
Intralaboratoriumreproduceerbaarheid:  een bepaling van de mate waarin gekwa ­
lificeerde mensen binnen hetzelfde laboratorium met succes resultaten kunnen 
repliceren met gebruikmaking van een specifiek protocol op verschillende tijd ­
stippen. Dit wordt ook reproduceerbaarheid binnen laboratoria genoemd (14).  
„Me too”-test:  een informele uitdrukking voor een testmethode die in structureel 
en functioneel opzicht vergelijkbaar is met een gevalideerde en geaccepteerde 
testmethode. Een dergelijke testmethode zou geschikt zijn voor inhaalvalidering. 
Dit is een alternatieve benaming voor gelijksoortige testmethode (14).  
Uitbijter:  een uitbijter is een waarneming die duidelijk afwijkt van andere waar ­
den binnen een willekeurige steekproef uit een populatie.  
Prestatienormen:  normen, gebaseerd op een gevalideerde referentiemethode, die 
de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voor ­
gestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: i) essentiële componenten van de testmethode; ii) een 
minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn ge ­
bruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde referentiemethode aan te tonen; en iii) de nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidsniveaus die door de voorgestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld 
aan de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn geba ­
seerd op de waarden die voor de gevalideerde testmethode zijn verkregen (14).
 
Niet-generieke testmethode:  een testmethode waarvan de productie en distributie 
beperkt worden door octrooien, auteursrechten, handelsmerken enz.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Kwaliteitsborging:  een beheerproces waarbij de naleving van de testnormen, 
eisen en boekhoudingsprocedures voor laboratoria alsmede de nauwkeurigheid 
van de gegevensoverdracht worden beoordeeld door personen die onafhankelijk zijn van degenen die de tests uitvoeren.
 
Referentiestoffen:  chemische stoffen die gebruikt worden in het valideringspro ­
ces, waarvan de responsen in het in-vitro- of in-vivoreferentietestsysteem of de 
doelsoort reeds bekend zijn. Deze chemische stoffen moeten representatief zijn 
voor de klassen van chemische stoffen waarvoor de testmethode zal worden gebruikt en moeten het volledige bereik van responses bestrijken dat verwacht kan worden van de chemische stoffen waarvoor de test gebruikt zal worden, van 
sterk tot zwak, tot negatief. Het kan nodig zijn om verschillende reeksen refe ­
rentiestoffen te gebruiken voor de verschillende fasen van het valideringsproces en voor verschillende testmethoden en -doeleinden (14).
 
Relevantie:  beschrijving van het verband van de test met het te onderzoeken 
effect en of de test betekenis heeft en nuttig is voor een bepaald doel. Het is 
de mate waarin de test het te onderzoeken biologische effect correct meet of 
voorspelt. Relevantie omvat een beoordeling van de nauwkeurigheid (concordan ­
tie) van een testmethode (14).  
Betrouwbaarheid:  indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd 
volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium 
en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden toegepast. De betrouw ­
baarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumrepro ­
duceerbaarheid (14).  
Huidsensibilisatie:  een immunologisch proces dat ontstaat wanneer een vatbare 
persoon of proefdier plaatselijk wordt blootgesteld aan een inducerend chemisch 
allergeen, dat een immunologische huidreactie veroorzaakt die kan leiden tot de ontwikkeling van contactsensibilisatie.
 
Stimuleringsindex (SI):  een waarde die wordt berekend om het huidsensibilisa ­
tiepotentieel van een teststof te beoordelen en die gelijk is aan de verhouding van 
de proliferatie bij behandelde groepen ten opzichte van de proliferatie bij de gelijktijdig met medium behandelde controlegroep.
 
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze TM wordt getest.  
Gevalideerde testmethode:  een testmethode waarvoor valideringsonderzoeken 
werden gedaan om de relevantie (inclusief nauwkeurigheid) en betrouwbaarheid 
voor een bepaald doel te bepalen. Er dient te worden opgemerkt dat een gevali ­
deerde testmethode niet per definitie voldoende nauwkeurig en betrouwbaar is om aanvaardbaar te worden bevonden voor het voorgestelde doel (14).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  NEUROTOXICITEITSONDERZOEK BIJ KNAAGDIEREN  
1 METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan TG 424 (1997) van de OESO.  
Deze testmethode is bedoeld om de nodige informatie te krijgen om 
de mogelijke neurotoxiciteit van chemische stoffen bij volwassen dieren te bevestigen of nader te karakteriseren. Hij kan in combinatie met bestaande testmethoden voor onderzoek naar toxiciteit bij her ­
haalde toediening worden gebruikt of als zelfstandig onderzoek wor ­
den uitgevoerd. Raadpleging van de OESO-leidraad voor strategieën en methoden voor neurotoxiciteitsonderzoek (1) als ondersteuning bij 
de opzet van onderzoek op basis van deze testmethode wordt aan ­
bevolen. Dit is vooral belangrijk wanneer wordt overwogen de voor het standaardgebruik van deze methode aanbevolen observaties en testprocedures te wijzigen. De leidraad is opgesteld om de keuze van 
andere testprocedures voor specifieke omstandigheden te vergemak ­
kelijken.
 
Deze methode is niet geschikt voor de beoordeling van ontwikke ­
lingsneurotoxiciteit.  
1.1 INLEIDING  
Bij de beoordeling en evaluatie van de toxische karakteristieken van 
chemische stoffen is het belangrijk de mogelijkheid van neurotoxi ­
sche effecten te bezien. In de testmethode voor systemische toxiciteit bij herhaalde toediening zijn al observaties opgenomen om op mo ­
gelijke neurotoxiciteit te screenen. Deze testmethode kan worden 
gebruikt voor de opzet van een onderzoek om nadere informatie te verkrijgen over de neurotoxische effecten die bij het onderzoek naar systemische toxiciteit bij herhaalde toediening zijn gesignaleerd of 
om deze effecten te bevestigen. Ook zonder dat onderzoek naar 
systemische toxiciteit bij herhaalde toediening aanwijzingen voor een mogelijke neurotoxiciteit heeft opgeleverd, kunnen er voor som ­
mige categorieën chemische stoffen echter aanwijzingen zijn dat ze 
beter met behulp van deze methode kunnen worden beoordeeld. 
Voorbeelden van dergelijke aanwijzingen zijn:
 
— waarneming van neurologische verschijnselen of neuropatholo ­
gisch letsel bij ander toxiciteitsonderzoek dan onderzoek naar 
systemische toxiciteit bij herhaalde toediening of  
— een structurele verwantschap met stoffen waarvan bekend is dat 
ze neurotoxisch zijn of andere informatie die een verband met 
dergelijke stoffen legt.  
Daarnaast kan het gebruik van deze testmethode ook in andere ge ­
vallen nuttig zijn; zie voor nadere bijzonderheden (1).  
Deze methode is zodanig opgezet dat hij op maat kan worden aange ­
past aan bepaalde behoeften om de specifieke histopathologische en gedragsmatige neurotoxiciteit van een chemische stof te bevestigen 
en voor een karakterisering en kwantificering van de neurotoxische 
reacties te zorgen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
In het verleden werd neurotoxiciteit gelijkgesteld met neuropathie 
met neuropathologisch letsel of neurologische stoornissen zoals een 
epileptische aanval, verlamming of tremor. Hoewel neuropathie een belangrijke uiting van neurotoxiciteit is, is het nu duidelijk dat er vele andere verschijnselen van toxiciteit voor het zenuwstelsel zijn 
(bv. het verlies van motorische coördinatie, sensorische afwijkingen 
en leer- en geheugenstoornissen) die bij een onderzoek naar neuro ­
pathie of ander onderzoek niet altijd naar voren komen.
 
Deze testmethode voor neurotoxiciteit is bedoeld om ernstige neuro ­
pathologische en neurogedragseffecten bij volwassen knaagdieren te 
detecteren. Gedragseffecten kunnen weliswaar ook zonder morfolo ­
gische veranderingen nadelige gevolgen voor het organisme inhou ­
den, maar niet alle gedragsveranderingen zijn specifiek voor het zenuwstelsel. Daarom moeten waargenomen veranderingen worden 
geëvalueerd in samenhang met gerelateerde histopathologische, he ­
matologische of biochemische gegevens en gegevens over andere vormen van systemische toxiciteit. De in deze methode opgenomen tests met het oog op een karakterisering en kwantificering van de 
neurotoxische reacties omvatten specifieke histopathologische en ge ­
dragsprocedures die nader kunnen worden ondersteund met elektro ­
fysiologisch en/of biochemisch onderzoek (1)(2)(3)(4).
 
Neurotoxica kunnen optreden via een aantal aangrijpingspunten bin ­
nen het zenuwstelsel en een scala van mechanismen. Aangezien er 
niet één pakket tests is waarmee de neurotoxische potentie van alle stoffen volledig kan worden beoordeeld, kan het nodig zijn andere  in 
vivo of in vitro  tests te gebruiken die specifiek zijn voor de waar ­
genomen of verwachte soorten neurotoxiciteit.
 
Deze testmethode kan ook in combinatie met de richtsnoeren van de 
OESO-leidraad voor strategieën en methoden voor neurotoxiciteits ­
onderzoek (1) worden gebruikt om onderzoek op te zetten waarmee 
de dosis/respons-kwantificering nader kan worden gekarakteriseerd 
of de gevoeligheid kan worden verhoogd teneinde een betere bepa ­
ling van de dosis zonder waargenomen schadelijke effecten mogelijk te maken of bekende of vermoede gevaren van de chemische stof te 
staven. Er kan bijvoorbeeld onderzoek worden opgezet om de neu ­
rotoxische mechanismen te bepalen en te evalueren of om de gege ­
vens aan te vullen die al beschikbaar zijn door het gebruik van basisprocedures voor neuropathologische en neurogedragsobservatie. 
Als gegevens die door het gebruik van de in deze methode aanbe ­
volen standaardprocedures worden verkregen, al beschikbaar zijn en niet nodig worden geacht voor de interpretatie van de resultaten van het onderzoek, behoeven ze niet met dit onderzoek opnieuw te wor ­
den vergaard.
 
Dit onderzoek naar neurotoxiciteit levert, zelfstandig of in combina ­
tie gebruikt, informatie op die:  
— kan aangeven of het zenuwstelsel door de geteste chemische stof 
permanent of reversibel wordt aangetast;  
— kan bijdragen tot de karakterisering van de wijzigingen in het 
zenuwstelsel ten gevolge van de blootstelling aan de chemische 
stof en tot inzicht in het mechanisme daarvan;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— het verband tussen dosis en respons en tussen tijd en respons kan 
bepalen teneinde een dosis zonder waargenomen schadelijke ef ­
fecten te kunnen bepalen (die kan worden gebruikt om veilig ­
heidscriteria voor de chemische stof vast testellen).  
Bij deze testmethode wordt de teststof oraal toegediend. Andere 
toedieningswegen (bv. dermaal of inhalatie) kunnen geschikter zijn 
en hiervoor kan het nodig zijn de aanbevolen procedures te wijzigen. 
De keuze van de toedieningsweg wordt bepaald door het blootstel ­
lingsprofiel bij de mens en de beschikbare toxicologische of kineti ­
sche informatie.  
1.2 DEFINITIES  
Schadelijk effect:  een met de behandeling samenhangende afwijking 
van de normale situatie waardoor het organisme minder goed in staat 
is tot overleven, reproductie of aanpassing aan de omgeving.  
Dosis:  de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uit ­
gedrukt als gewicht (g, mg), als gewicht van de teststof per ge ­
wichtseenheid van het proefdier (bijvoorbeeld mg/kg) of als con ­
stante concentratie in het voer (ppm).  
Dosering:  een algemene term die de dosis en de frequentie en de 
duur van de toediening omvat.  
Neurotoxiciteit:  een schadelijke verandering in de structuur of de 
functie van het zenuwstelsel die een gevolg is van blootstelling aan een chemisch, biologisch of fysisch agens.
 
Neurotoxicum:  een chemisch, biologisch of fysisch agens dat in 
staat is neurotoxiciteit te veroorzaken.  
NOAEL:  de afkorting van „no-observed-adverse effect level” (dosis 
zonder waargenomen schadelijke effecten), d.w.z. de hoogste dosis waarbij er geen met de behandeling samenhangende schadelijke ge ­
volgen worden waargenomen.
 
1.3 PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt in een aantal doses oraal toegediend aan verschil ­
lende groepen knaagdieren. Meestal is herhaalde toediening nodig 
gedurende 28 dagen of in de vorm van subchronisch (90 dagen) of chronisch (een jaar of langer) onderzoek. De in deze testmethode beschreven procedures kunnen ook worden gebruikt voor een onder ­
zoek naar acute neurotoxiciteit. De dieren worden getest om afwij ­
kend gedrag en/of neurologische afwijkingen te kunnen detecteren of karakteriseren. Gedurende elke observatieperiode wordt een scala van gedragsuitingen beoordeeld dat door neurotoxica kan worden 
beïnvloed. Aan het eind van de test wordt een deel van de dieren 
van elk geslacht van elke groep in situ geperfundeerd en worden er secties van de hersenen, het ruggenmerg en de perifere zenuwen geprepareerd en onderzocht.
 
Wanneer het onderzoek zelfstandig als screening voor neurotoxiciteit 
of voor de karakterisering van neurotoxische effecten wordt uitge ­
voerd, kunnen de dieren van elke groep die niet voor perfusie en vervolgens histopathologie worden gebruikt (zie tabel 1), voor spe ­
cifieke neuropathologische, neurochemische, elektrofysiologische of 
neurogedragsprocedures worden gebruikt waarmee de gegevens kun ­
nen worden aangevuld die worden verkregen uit het verplichte stan ­
daardonderzoek van deze methode (1). Deze aanvullende procedures 
kunnen bijzonder nuttig zijn wanneer empirische observaties of ver ­
wachte effecten wijzen op een specifiek type of aangrijpingspunt voor de neurotoxiciteit van een chemische stof. Anderzijds is het ook mogelijk de resterende dieren te gebruiken voor evaluaties zoals 
die zijn opgenomen in testmethoden voor onderzoek naar toxiciteit 
bij herhaalde toediening bij knaagdieren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Wanneer de procedures van deze testmethode in combinatie met die 
van andere testmethoden worden gebruikt, is er een voldoende aantal 
dieren nodig om aan de observatievereisten voor beide onderzoeken te voldoen.
 
1.4 BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1  Keuze van de diersoort  
Bij voorkeur wordt de rat gebruikt, maar ook andere knaagdiersoor ­
ten kunnen worden gebruikt wanneer hiervoor een motivering wordt 
gegeven. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriumstammen gebruikt. De vrouwtjes mogen nog geen jon ­
gen hebben gehad en mogen niet drachtig zijn. De toediening begint 
zo spoedig mogelijk na het spenen, bij voorkeur uiterlijk wanneer de 
dieren zes weken oud zijn en in elk geval voordat de dieren negen weken oud zijn. Wanneer dit onderzoek met andere onderzoeken wordt gecombineerd, kan het echter nodig zijn deze leeftijdseis aan 
te passen. Aan het begin van het onderzoek mag het lichaamsgewicht 
van de dieren niet meer dan ± 20 % afwijken van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht. Wanneer een onderzoek met herhaalde toediening van korte duur als voorbereiding op een langdurig onder ­
zoek wordt uitgevoerd, moeten bij beide onderzoeken dieren van 
dezelfde stam en dezelfde herkomst worden gebruikt.
 
1.4.2  Huisvesting en voeding  
De temperatuur in de proefdierruimte dient 22  o C (± 3  o C) te zijn. 
Hoewel de relatieve vochtigheid minimaal 30 % en bij voorkeur niet 
hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, 
moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunst ­
licht met een ritme van 12 uur licht en 12 uur donker. Harde on ­
regelmatige geluiden moeten tot een minimum worden beperkt. Als 
voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een 
onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan wor ­
den beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaar ­
heid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt 
toegediend. De dieren mogen apart of in kleine groepen met het ­
zelfde geslacht worden gehuisvest.  
1.4.3  Voorbereiding van de dieren  
De gezonde jonge dieren worden aselect ingedeeld in de behan ­
delings- en controlegroepen. De kooien worden zodanig opgesteld 
dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooien tot een mini ­
mum worden beperkt. De dieren worden op unieke wijze gemerkt en vóór het begin van het onderzoek gedurende minimaal 5 dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laborato ­
rium te laten wennen.
 
1.4.4  Toedieningsweg en bereiding van de dosis  
Deze testmethode behandelt specifiek de orale toediening van de 
teststof. De orale toediening kan met een maagsonde, in het voer, in het drinkwater of met capsules gebeuren. Ook andere toedienings ­
wegen (bv. dermaal of inhalatie) kunnen worden gebruikt, maar 
hiervoor moeten de aanbevolen procedures wellicht worden gewij ­
zigd. De keuze van de toedieningsweg wordt bepaald door het bloot ­
stellingsprofiel bij de mens en de beschikbare toxicologische of ki ­
netische informatie. De motivering voor de keuze van de toedie ­
ningsweg en hieruit voortvloeiende wijzigingen in de procedures 
van deze testmethode moeten worden vermeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Waar nodig kan de teststof in een geschikt medium worden opgelost 
of gesuspendeerd. In eerste instantie wordt het gebruik van een 
waterige oplossing/suspensie aanbevolen, als tweede keuze een oplossing/suspensie in olie (bijvoorbeeld maïsolie) en uiteindelijk eventueel een oplossing/suspensie in een ander medium. De toxico ­
logische kenmerken van het medium moeten bekend zijn. Daarnaast 
moet aandacht worden besteed aan de volgende kenmerken van het medium: effecten van het medium op de resorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof die wellicht gevolgen 
kunnen hebben voor de toxicologische kenmerken, en effecten op 
de consumptie van voer of water of de voedingsstatus van de dieren.
 
1.5 PROCEDURE  
1.5.1  Aantal en geslacht van de dieren  
Wanneer het onderzoek zelfstandig wordt uitgevoerd, moeten er in 
elke dosis- en controlegroep ten minste 20 dieren (10 vrouwtjes en 
10 mannetjes) worden gebruikt voor de evaluatie van gedetailleerde klinische en functionele observaties. Van deze 10 vrouwtjes en 10 mannetjes moeten ten minste 5 vrouwtjes en 5 mannetjes aan 
het eind van het onderzoek in situ worden geperfundeerd en voor 
gedetailleerde neurohistopathologie worden gebruikt. Wanneer in een bepaalde dosisgroep slechts bij een beperkt aantal dieren verschijn ­
selen van neurotoxische effecten worden geobserveerd, moet worden 
overwogen onder andere deze dieren voor perfusie te selecteren. 
Wanneer het onderzoek in combinatie met een onderzoek naar toxi ­
citeit bij herhaalde toediening wordt uitgevoerd, moeten er vol ­
doende dieren worden gebruikt om aan de doelstellingen van beide 
onderzoeken te voldoen. Tabel 1 bevat een overzicht van de mini ­
male aantallen dieren per groep voor verschillende onderzoekcom ­
binaties. Als het de bedoeling is tussentijds dieren te doden of bij bepaalde groepen na de behandeling te observeren of de toxische 
effecten reversibel zijn, blijven bestaan of vertraagd optreden of 
wanneer aanvullende observaties worden overwogen, moet het aantal dieren worden opgevoerd om ervoor te zorgen dat er voldoende dieren beschikbaar zijn voor observatie en histopathologie.
 
1.5.2  Behandelings- en controlegroepen  
In het algemeen moeten er ten minste drie dosisgroepen en één 
controlegroep worden gebruikt, maar als er op grond van de beoor ­
deling van andere gegevens bij herhaalde toediening van 1 000 mg/ ­
kg lichaamsgewicht/dag geen effecten worden verwacht, kan er een 
limiettest worden uitgevoerd. Als er geen geschikte gegevens be ­
schikbaar zijn, kan er een verkennend onderzoek worden uitgevoerd om de te gebruiken doses te helpen bepalen. Afgezien van de toe ­
diening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op 
identieke wijze behandeld als de dieren in de dosisgroepen. Als er 
bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, moet het hoogste gebruikte volume van het medium aan de controlegroep worden toegediend.
 
1.5.3  Betrouwbaarheidscontrole  
Het laboratorium dat het onderzoek uitvoert, moet gegevens verstrek ­
ken waaruit blijkt dat het in staat is het onderzoek uit te voeren en 
wat de gevoeligheid van de gebruikte procedures is. Uit deze gege ­
vens moet blijken dat het veranderingen in de verschillende voor observatie aanbevolen eindpunten, zoals autonome verschijnselen, sensorische reactiviteit, grijpkracht van de ledematen en motorische 
activiteit, kan detecteren en eventueel kwantificeren. Voor informatie 
over chemische stoffen die verschillende soorten neurotoxische re ­
acties veroorzaken en als positieve controle kunnen worden gebruikt, wordt verwezen naar de referenties (2) tot en met (9). Als de pro ­
cedures in grote lijnen gelijk blijven, kunnen gegevens uit het ver ­
leden worden gebruikt. Periodieke bijwerking van gegevens uit het verleden wordt aanbevolen. Wanneer de uitvoering van de test of de procedures door het laboratorium op een essentieel punt wordt ge ­
wijzigd, moet met nieuwe gegevens worden aangetoond dat de ge ­
voeligheid van de procedures op peil blijft.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  Keuze van de doses  
Bij de keuze van de dosisniveaus wordt rekening gehouden met 
eerder waargenomen toxiciteit en kinetische gegevens die voor de teststof of verwante materialen beschikbaar zijn. De hoogste dosis 
wordt zodanig gekozen dat er neurotoxische effecten of duidelijke 
systemische toxische effecten optreden. Vervolgens wordt er een zodanige dalende reeks dosisniveaus gekozen dat er een verband tussen dosis en respons kan worden gelegd en er bij de laagste dosis 
geen schadelijke effecten worden waargenomen (NOAEU). In begin ­
sel worden de dosisniveaus zodanig gekozen dat primaire toxische effecten op het zenuwstelsel kunnen worden onderscheiden van ef ­
fecten die samenhangen met systemische toxiciteit. Twee of drie 
intervals is vaak optimaal en in plaats van een zeer groot interval tussen de doses (bv. meer dan een factor 10) verdient toevoeging van een vierde testgroep vaak de voorkeur. Wanneer er een redelijke 
raming van de blootstelling van de mens is, moet hier ook rekening 
mee worden gehouden.
 
1.5.5  Limiettest  
Als een onderzoek met één dosis van ten minste 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag volgens de beschreven procedures geen waar ­
neembare neurotoxische effecten oplevert en als toxiciteit op grond van gegevens van qua structuur verwante verbindingen niet te ver ­
wachten valt, zal een volledig onderzoek met drie dosisniveaus wel ­
licht niet nodig worden geacht. Op grond van de verwachte bloot ­
stelling van de mens kan het gebruik van een hogere orale dosis bij de limiettest nodig worden geacht. Bij andere toedieningswegen, 
bijvoorbeeld dermaal of inhalatie, wordt het maximaal haalbare 
blootstellingsniveau vaak bepaald door de fysisch-chemische eigen ­
schappen van de teststof. Bij de uitvoering van een oraal acuut onderzoek moet de dosis voor een limiettest ten minste 2 000 mg/kg 
zijn.
 
1.5.6  Toediening van de dosis  
De teststof wordt dagelijks, zeven dagen per week, gedurende ten 
minste 28 dagen aan de dieren toegediend; voor een toedienings ­
schema van vijf dagen per week of een kortere blootstellingsperiode 
moet een motivering worden gegeven. Wanneer de teststof met een sonde wordt toegediend, moet dit in één keer met een maagsonde of 
een geschikte katheter gebeuren. Het maximale volume van een 
vloeistof dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van de proefdieren. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Bij waterige oplossingen kan 
echter het gebruik van maximaal 2 ml/100 mg lichaamsgewicht 
worden overwogen. Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten heb ­
ben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden beperkt 
door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus 
hetzelfde volume wordt toegediend.
 
Het is belangrijk dat er bij stoffen die via het voer of het drinkwater 
worden toegediend, voor wordt gezorgd dat de hoeveelheden teststof 
de normale voer- of waterbalans niet verstoren. Wanneer de teststof 
in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaams ­
gewicht van de dieren worden gebruikt; de gekozen methode moet 
worden gespecificeerd. Wanneer een stof met een sonde wordt toe ­
gediend, moet de dosis elke dag op een vergelijkbaar tijdstip worden toegediend en indien nodig worden aangepast om een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier te houden. 
Wanneer een onderzoek met herhaalde toediening als voorbereiding 
op een langdurig onderzoek wordt gebruikt, moet bij beide onder ­
zoeken een vergelijkbare voeding worden gebruikt. Bij acuut onder ­
zoek kan de dosis, als toediening in één keer niet mogelijk is, in 
kleinere porties worden verdeeld die in de loop van maximaal 24 uur 
worden toegediend.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6 OBSERVATIE  
1.6.1  Frequentie van de observaties en tests  
Bij onderzoek met herhaalde toediening bestrijkt de observatieperi ­
ode de toedieningsperiode. Bij acuut onderzoek vindt de observatie gedurende 14 dagen na de toediening plaats. Bij dieren in satelliet ­
groepen die gedurende een periode na de behandeling zonder bloot ­
stelling worden gehouden, moeten de observaties ook deze periode 
bestrijken.
 
De frequentie van de observaties moet voldoende zijn voor een 
maximale kans op detectie van eventuele neurologische en/of ge ­
dragsafwijkingen. De observatie moet bij voorkeur elke dag op het ­
zelfde tijdstip plaatsvinden en hierbij moet rekening worden gehou ­
den met de piekperiode voor de verwachte effecten na de toediening. 
Tabel 2 bevat een overzicht van de frequentie van de klinische 
observaties en functionele tests. Als kinetische of andere gegevens uit eerder onderzoek erop wijzen dat verschillende tijdstippen voor observaties, tests of periodes na observaties nodig zijn, moet er een 
ander schema worden opgesteld om zo veel mogelijk informatie te 
verkrijgen. Voor veranderingen in het schema moet een motivering worden gegeven.
 
1.6.1.1  Observatie van de algemene gezondheidstoestand en de mortaliteit/ ­
morbiditeit  
Alle dieren worden ten minste één keer per dag zorgvuldig geobser ­
veerd om hun gezondheidstoestand te beoordelen en ten minste twee keer per dag op morbiditeit en mortaliteit.
 
1.6.1.2  Gedetailleerde klinische observatie  
Bij alle hiervoor geselecteerde dieren (zie tabel 1) wordt één keer 
vóór de eerste blootstelling (om vergelijking per dier mogelijk te maken) en daarna met verschillende tussenpozen afhankelijk van de duur van het onderzoek (zie tabel 2) een gedetailleerde klinische 
observatie uitgevoerd. Bij satellietherstelgroepen dienen aan het eind 
van de herstelperiode gedetailleerde klinische observaties te worden uitgevoerd. Gedetailleerde klinische observaties dienen buiten het eigen hok in een standaardloopruimte te gebeuren. Ze moeten zorg ­
vuldig worden geregistreerd met behulp van scoresystemen met cri ­
teria of schalen voor elke meting bij de observatie. De gebruikte criteria of schalen moeten expliciet door het laboratorium worden gedefinieerd. Er moet worden getracht ervoor te zorgen dat de vari ­
aties in de testomstandigheden minimaal zijn (niet systematisch ge ­
relateerd aan de behandeling) en dat de observaties worden uitge ­
voerd door geschoolde waarnemers die niet op de hoogte zijn van de gegeven behandeling.
 
Het verdient aanbeveling de observaties gestructureerd uit te voeren, 
waarbij voor elk dier op elk observatietijdstip systematisch goed gedefinieerde criteria worden gehanteerd (met inbegrip van een de ­
finitie van het „normale bereik”). Het „normale bereik” moet af ­
doende worden gedocumenteerd. Alle waargenomen verschijnselen moeten worden geregistreerd. Waar mogelijk moet ook de omvang van de waargenomen verschijnselen worden geregistreerd. Klinische 
observatie moet ten minste maar niet uitsluitend omvatten: verande ­
ringen in huid, vacht, ogen en slijmvliezen, secretie en excretie van stoffen en autonome activiteit (bv. tranen, pilo-erectie, verandering in pupilgrootte, een ongebruikelijk ademhalingspatroon en/of ademen 
door de mond, ongebruikelijke urineer- of ontlastingsverschijnselen 
en verkleuring van de urine).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Ook ongebruikelijke reacties ten aanzien van de lichaamshouding, de 
mate van activiteit (bv. meer of minder exploratie van de standaard ­
loopruimte) en de coördinatie van de bewegingen dienen te worden geregistreerd. Verandering in gang (bv. waggelen of ataxie), houding (bv. gebocheld) en reactiviteit op vastpakken, neerzetten of andere 
omgevingsprikkels, alsmede de aanwezigheid van klonische of to ­
nische bewegingen, convulsies of tremors, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, ongebruikelijke hoofdbewegingen, herhaaldelijk ronddraaien) of bizar gedrag (bv. bijten of overmatig 
likken, zelfverminking, achteruitlopen, stemgeluiden) of agressie 
moeten worden geregistreerd.
 
1.6.1.3  Functionele tests  
Net als bij de gedetailleerde klinische observatie moeten ook de 
functionele tests bij alle hiervoor geselecteerde dieren (zie tabel 1) één keer vóór de eerste blootstelling en daarna geregeld worden uitgevoerd. Ook de frequentie van de functionele tests is afhankelijk 
van de duur van het onderzoek (zie tabel 2). Afgezien van de in tabel 
2 vermelde observatieperioden moeten ook zo kort mogelijk voordat de dieren worden gedood, functionele observaties bij satellietherstel ­
groepen worden uitgevoerd. Bij de functionele tests moet worden 
gekeken naar de sensorische reactiviteit op verschillende soorten 
prikkels [bv. auditieve, visuele en proprioceptieve prikkels (5)(6)(7), een beoordeling van de grijpkracht van ledematen (8) en een beoor ­
deling van de motorische activiteit (9). De motorische activiteit moet 
worden gemeten met een geautomatiseerd apparaat dat zowel een afname als een toename van de activiteit kan detecteren. Als er een ander gedefinieerd systeem wordt gebruikt, moet dit kwantitatief 
zijn en moeten de gevoeligheid en de betrouwbaarheid worden aan ­
getoond. Elk apparaat moet worden getest om de betrouwbaarheid in de loop der tijd en de consistentie van apparaat tot apparaat te waarborgen. Voor een gedetailleerdere beschrijving van de te volgen 
procedures wordt verwezen naar de respectieve referenties. Als er 
geen gegevens zijn (bv. structuur/activiteit-relaties, epidemiologische gegevens of ander toxicologisch onderzoek) die aanwijzingen geven omtrent de mogelijke neurotoxische effecten, moet worden overwo ­
gen gespecialiseerdere tests op de sensorische en motorische functie 
of leren en geheugen uit te voeren om deze mogelijke effecten meer in detail te onderzoeken. Voor meer informatie over gespecialiseer ­
dere tests en het gebruik daarvan wordt verwezen naar (1).
 
Bij wijze van uitzondering kunnen dieren die zodanige toxiciteitsver ­
schijnselen vertonen dat deze de functionele test significant zouden 
storen, van deze test worden uitgesloten. Voor het uitsluiten van die ­
ren van een functionele test moet een motivering worden gegeven.  
1.6.2  Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water  
Bij onderzoek met een duur tot 90 dagen moeten alle dieren ten 
minste één keer per week worden gewogen en moet de voercon ­
sumptie (de waterconsumptie als de teststof in het water wordt toe ­
gediend) ten minste wekelijks worden gemeten. Bij langdurig onder ­
zoek moeten alle dieren de eerste 13 weken ten minste één keer per 
week worden gewogen en daarna ten minste één keer per vier we ­
ken. De eerste 13 weken wordt de voerconsumptie (de watercon ­
sumptie als de teststof in het water wordt toegediend) ten minste wekelijks gemeten en daarna ongeveer één keer per drie maanden, 
tenzij met het oog op de gezondheidstoestand of de veranderingen in 
het lichaamsgewicht een ander ritme nodig is.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3  Oogheelkundig onderzoek  
Bij een onderzoek dat langer dan 28 dagen duurt, moet vóór de 
toediening van de teststof en aan het einde van het onderzoek bij voorkeur bij alle dieren maar ten minste bij de dieren in de hoge 
dosis- en controlegroepen een oogheelkundig onderzoek worden uit ­
gevoerd met een oftalmoscoop of een gelijkwaardig geschikt instru ­
ment. Als er veranderingen in de ogen worden waargenomen of als dit met het oog op klinische verschijnselen nodig is, moeten alle 
dieren worden onderzocht. Bij een langdurig onderzoek moet er 
ook na 13 weken een oogheelkundig onderzoek worden uitgevoerd. Het oogheelkundig onderzoek behoeft niet te worden uitgevoerd als 
deze gegevens al beschikbaar zijn uit ander onderzoek met een ver ­
gelijkbare duur en vergelijkbare dosisniveaus.
 
1.6.4  Hematologisch en klinisch-biochemisch onderzoek  
Wanneer het onderzoek naar neurotoxiciteit in combinatie met een 
onderzoek naar systemische toxiciteit bij herhaalde toediening wordt uitgevoerd, moeten er hematologisch onderzoek en klinisch-bioche ­
mische bepalingen worden uitgevoerd zoals dit in de desbetreffende 
methode voor het onderzoek naar systemische toxiciteit is beschre ­
ven. De monsterneming moet zodanig gebeuren dat mogelijke neuro ­
gedragseffecten tot een minimum worden beperkt.
 
1.6.5  Histopathologie  
Het neuropathologisch onderzoek moet worden opgezet als aanvul ­
ling op en uitbreiding van de observaties tijdens de  in vivo  fase van 
het onderzoek. Weefsels van ten minste 5 dieren/geslacht/groep (zie 
tabel 1 en volgende pragraaf) worden in situ gefixeerd met behulp van algemeen erkende perfusie- en fixatietechnieken (zie referentie 3, hoofdstuk 5, en referentie 4, hoofdstuk 50). Waarneembare macro ­
scopische veranderingen worden geregistreerd. Wanneer het onder ­
zoek zelfstandig als screening voor neurotoxiciteit of voor de karak ­
terisering van neurotoxische effecten wordt uitgevoerd, kunnen de overige dieren worden gebruikt voor specifieke neurogedragspro ­
cedures (10)(ll), neuropathologische procedures (10)(11)(12)(13), 
neurochemische procedures (1())(11)(14)(15) of elektrofysiologische procedures (1())(11)(16)(17) waarmee de hier beschreven procedures en onderzoeken kunnen worden aangevuld, of om meer dieren be ­
schikbaar te hebben voor histopathologisch onderzoek. Deze aanvul ­
lende procedures zijn vooral nuttig wanneer empirische observaties of verwachte effecten wijzen op een specifiek type of aangrijpings ­
punt van de neurotoxiciteit (2)(3). Anderzijds is het ook mogelijk de 
resterende dieren te gebruiken voor standaardpathologisch onderzoek 
zoals dat in de testmethode voor onderzoek naar toxiciteit bij her ­
haalde toediening wordt beschreven.
 
Bij elk weefselspecimen in paraffine wordt een algemene kleurproce ­
dure uitgevoerd, zoals hematoxyline en eosine (H&E), en wordt een microscopisch onderzoek uitgevoerd. Als er verschijnselen van peri ­
fere neuropathie worden waargenomen of vermoed, worden er mon ­
sters van perifeer zenuwweefsel in kunststof onderzocht. Klinische 
verschijnselen kunnen ook aanwijzingen opleveren voor andere onder ­
zoekplaatsen of het gebruik van speciale kleurprocedures. Richtsnoe ­
ren voor andere plaatsen die kunnen worden onderzocht, zijn te vin ­
den in (3)(4). Ook geschikte speciale kleurstoffen om specifieke soor ­
ten pathologische veranderingen aan te tonen, kunnen nuttig zijn (18).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Representatieve secties van het centrale en perifere zenuwstelsel 
worden histologisch onderzocht (zie referentie 3, hoofdstuk 5, en 
referentie 4, hoofdstuk 50). Normaal gesproken moeten onder andere de volgende gebieden worden onderzocht: de voorhersenen, het cen ­
trum van het cerebrum met een sectie door de hippocampus, de 
middenhersenen, het cerebellum, de pons, de medulla oblongata, 
het oog met oogzenuw en netvlies, het ruggenmerg bij de cervicale en lumbale verdikkingen, de ganglia van de dorsale wortel, de vezels van de dorsale en ventrale wortel, de proximale nervus ischiadicus, 
de proximale nervus tibialis (bij de knie) en de kuitspiervertakkingen 
van de nervus tibialis. Van het ruggenmerg en de perifere zenuwen moeten zowel dwarse of transversale als longitudinale secties worden gemaakt. Er moet worden gelet op het vaatstelsel van het zenuw ­
stelsel. Tevens moet er een monster van een skeletspier, met name de 
kuitspier, worden onderzocht. Er moet bijzondere aandacht worden besteed aan plaatsen met een cellulaire en vezelstructuur en -patroon in het CZS en het PZS waarvan bekend is dat ze bijzonder gevoelig 
zijn voor neurotoxica.
 
Voor een leidraad voor neuropathologische veranderingen die vaak 
een gevolg zijn van blootstelling aan een toxische stof, wordt ver ­
wezen naar de referenties (3) en (4). Een stapsgewijs onderzoek van de weefselmonsters wordt aanbevolen, waarbij secties van de hoog ­
ste dosisgroep eerst worden vergeleken met die van de contro ­
legroep. Als er in de monsters van deze groepen geen neuropatho ­
logische veranderingen worden waargenomen, is een verdere analyse niet nodig. Als er in de hoogste dosisgroep neuropathologische ver ­
anderingen worden waargenomen, worden er van elk van de moge ­
lijk aangetaste weefsels van de tussengroepen en de laagste groep monsters genomen en sequentieel onderzocht.
 
Als er bij het kwalitatieve onderzoek bewijzen van neuropathologi ­
sche veranderingen worden gevonden, moet er een tweede onderzoek 
worden uitgevoerd bij alle gebieden van het zenuwstelsel die deze veranderingen vertonen. Bij alle dosisgroepen worden er van elk van de mogelijkerwijs aangetaste gebieden secties gecodeerd en aselect 
zonder de code te kennen onderzocht. De frequentie en de ernst van 
elk letsel worden geregistreerd. Nadat van alle gebieden van alle dosisgroepen de score is bepaald, kan de code worden verbroken en kan er een statistische analyse worden uitgevoerd om het verband 
tussen dosis en respons te bepalen. Van elk letsel moeten er voor ­
beelden van uiteenlopende ernst worden beschreven.
 
De neuropathologische bevindingen moeten in de context van de 
gedragsobservaties en metingen alsmede andere gegevens uit eerder en tegelijkertijd uitgevoerd onderzoek naar de systemische toxiciteit 
van de teststof worden geëvalueerd.
 
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast worden 
alle gegevens in tabelvorm samengevat met voor alle test- en con ­
trolegroepen vermelding van het aantal dieren aan het begin van het onderzoek, het aantal dieren dat tijdens het onderzoek dood is aange ­
troffen of op humane wijze is gedood met het tijdstip waarop ze zijn 
gestorven of gedood, het aantal dieren dat toxiciteitsverschijnselen vertoonde, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsver ­
schijnselen, met inbegrip van de aanvang, de duur, de aard en de 
ernst van eventuele toxische effecten, en het aantal dieren met letsel, 
met vermelding van de aard en de ernst van het letsel of de letsels.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De resultaten van het onderzoek moeten worden geëvalueerd, waar ­
bij wordt gekeken naar de incidentie, de ernst en de correlatie van neurogedragseffecten en neuropathologische effecten (en ook neuro ­
chemische en elektrofysiologische effecten als dit aanvullende onder ­
zoek is uitgevoerd) en andere waargenomen schadelijke effecten. Waar mogelijk moeten getalsmatige resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëva ­
lueerd. De statistische methoden moeten gedurende de opzet van het 
onderzoek worden gekozen.
 
3 RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— de fysische aard (met inbegrip van isomerie, de zuiverheid en de 
fysisch-chemische eigenschappen);  
— identificatiegegevens.  
Medium (indien van toepassing):  
— een motivering voor de keuze van het medium.  
Proefdieren:  
— de gebruikte soort/stam;  
— het aantal dieren, hun leeftijd en hun geslacht;  
— de herkomst, de huisvesting, de acclimatisering, de voeding enz;  
— het gewicht van elk dier aan het begin van het onderzoek.  
Testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de 
bereiding van het voer en de concentratie, de stabiliteit en de homogeniteit van het preparaat;
 
— een specificatie van de toegediende doses met gedetailleerde ge ­
gevens over het medium, het volume en de fysische vorm van 
het toegediende materiaal;  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof;  
— een motivering voor de gekozen dosisniveaus;  
— een motivering voor de blootstellingsroute en -duur;  
— een omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/ ­
drinkwater (in ppm) in de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing;
 
— gedetailleerde gegevens over het voer en het water.  
Observatie en testprocedures:  
— gedetailleerde gegevens over de keuze van dieren uit elke groep 
voor de perfusiesubgroepen;  
— gedetailleerde gegevens over de scoresystemen met vermelding 
van de criteria en schaalindeling voor elke meting bij de gedetail ­
leerde klinische observaties;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— gedetailleerde gegevens over de functionele tests voor de senso ­
rische reactiviteit op verschillende soorten prikkels (bv. auditieve, 
visuele en proprioceptieve prikkels), voor de beoordeling van de grijpkracht van ledematen, voor de beoordeling van de motori ­
sche activiteit (met een beschrijving van geautomatiseerde ap ­
paraten voor de detectie van de activiteit) en andere gebruikte 
procedures;
 
— gedetailleerde gegevens over het oogheelkundige onderzoek en 
eventueel het hematologische onderzoek en de klinisch-bioche ­
mische tests met de desbetreffende referentiewaarden;  
— gedetailleerde gegevens over specifieke neuropathologische, neu ­
rochemische, elektrofysiologische of neurogedragsprocedures.  
Resultaten:  
— het lichaamsgewicht/veranderingen in het lichaamsgewicht en het 
lichaamsgewicht bij de dood van het dier;  
— de consumptie van voer en de consumptie van water, indien van 
toepassing;  
— gegevens over de toxische respons per geslacht en dosisgroep, 
met vermelding van toxiciteitsverschijnselen of mortaliteit;  
— de aard, de ernst en de duur (aanvangstijdstip en verloop) van de 
gedetailleerde klinische observaties (al dan niet reversibel);  
— een gedetailleerde beschrijving van alle resultaten van de functi ­
onele tests;  
— de obductiebevindingen;  
— een gedetailleerde beschrijving van alle resultaten van neuro ­
pathologische, neurochemische, elektrofysiologische of neuro ­
gedragsprocedures, indien beschikbaar;  
— gegevens over de resorptie en het metabolisme, indien beschik ­
baar;  
— een statistische behandeling van de resultaten, indien van toepas ­
sing.  
Bespreking van de resultaten:  
— informatie over de dosis/respons-relatie;  
— het verband tussen eventuele andere toxische effecten en een 
conclusie over het neurotoxische vermogen van de teststof;  
— de dosis zonder waargenomen schadelijke effecten.  
Conclusies:  
— een specifieke vermelding van de algehele neurotoxiciteit van de 
teststof is wenselijk.  
4. REFERENTIES  
1. OECD Giudance Document on Neorutoxicity Testing Strategies 
and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
2. Test Guidline for a Developmental Neurotoxicitu Study, OECD 
Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
3. World Health Organization (WHO) (1986). Environmental He ­
alth Criteria document 60: Principles and Methods for the As ­
sessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemic ­
als. 
4. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5. Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurolo ­
gical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.  
6. Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.  
7. Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. 
Pharmacol., 108, 267-283.
 
8. Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., I, 233- 
236.
 
9. Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599-609.
 
10. Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
11. Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel 
Dekker, New York.  
12. Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity 
Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., _10, 689-695.  
13. Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2- Hy ­
droxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxi ­
col., 18, 343-352.  
14. O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., H), 445-452.
 
15. O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in 
Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
 
16. Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, 
p 299-335.  
17. Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wil ­
kins Co.,. Baltimore/London, p. 726- 742.
 
18. Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livings ­
tone. ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Table 1  
Minimum numbers of animals needed per group when the neurotoxicity study is conducted separately or in 
combination whit studies  
NEUROTOXICITY STUDY CONDUCTED AS: 
Separate study Combined study with 
the 28-day study Combined study with 
the 90-day study Combined study with 
the chronic toxicity 
study  
Total number of animals per 
group 10 males and 
10 females 10 males and 
10 females 15 males and 
15 females 25 males and 
25 females 
Number of animals selected 
for functional testing inclu ­
ding detailed clinical obser ­
vations 10 males and 
10 females 10 males and 
10 females 10 males and 
10 females 10 males and 
10 females 
Number of animals selected 
per perfusion  in situ  and 
neurohistopathology 5 males and 
5 females 5 males and 
5 females 5 males and 
5 females 5 males and 
5 females 
Number of animals selected 
for repeated dose/subchro ­
nic/chronic toxicity obser ­
vations, haematology, clini ­
cal biochemistry, histop ­
athology, etc. as indicate in the respective  Guidelines  5 males and 
5 females 10 males † and 
10 females † 20 males † and 
20 females † 
Supplemental observations, 
as appropriate 5 males and 
5 females
 
† Includes five animals selected for functional testing and detailed clinical observations as part of the neurotoxicity study  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabel 2  
Frequentie van de klinische observatie en functionele tests  
Aard van de observaties Duur van het onderzoek 
Acuut 28 dagen 90 dagen Chronisch  
Bij alle dieren Algemene ge ­
zondheidstoe ­
stand dagelijks dagelijks dagelijks dagelijks 
Mortaliteit/mor ­
biditeit Twee keer per 
dag Twee keer per 
dag Twee keer per 
dag Twee keer per 
dag 
Bij dieren die voor 
de functionele ob ­
servaties gekozen 
zijn Gedetailleerde 
klinische obser ­
vaties — vóór eerste 
blootstelling 
— binnen 8 uur 
na toedie ­
ning op ge ­
raamde tijd ­
stip piek­
effect 
— op dagen 7 
en 14 na 
toediening — vóór eerste 
blootstelling 
— vervolgens 
één keer per 
week — vóór eerste 
blootstelling 
— één keer tij ­
dens de eer ­
ste of 
tweede week van bloot ­
stelling 
— vervolgens 
één keer per 
maand — vóór eerste 
blootstelling 
— één keer aan 
het eind van 
de eerste 
maand van blootstelling 
— vervolgens 
één keer per drie maanden 
Functionele tests — vóór eerste 
blootstelling 
— binnen 8 uur 
na toedie ­
ning op ge ­
raamde tijd ­
stip piek­
effect 
— op dagen 7 
en 14 na 
toediening — vóór eerste 
blootstelling 
— tijdens de 
vierde week van behan ­
deling, zo 
dicht moge ­
lijk bij het eind van de 
blootstel­
lingsperiode — vóór eerste 
blootstelling 
— één keer tij ­
dens de eer ­
ste of 
tweede week 
van bloot ­
stelling 
— vervolgens 
één keer per 
maand — vóór eerste 
blootstelling 
— één keer aan 
het eind van de eerste 
maand van 
blootstelling 
— vervolgens 
één keer per drie maanden
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  ABSORPTIE DOOR DE HUID:  IN-VIVO  METHODE  
1. METHODE  
Deze testmethode komt overeen met OESO TG 427 (2004).  
1.1. INLEIDING  
De blootstelling aan veel chemische stoffen gebeurt vooral via de 
huid, terwijl bij de meeste bij laboratoriumdieren uitgevoerde toxi ­
cologische onderzoeken de orale toedieningsroute wordt gebruikt. Het in deze methode beschreven  in-vivo -onderzoek naar percutane 
absorptie biedt de koppeling die nodig is voor een extrapolatie vanuit 
oraal onderzoek bij de uitvoering van een veiligheidsbeoordeling na blootstelling via de huid.
 
Een stof moet een groot aantal cellagen van de huid passeren alvo ­
rens deze in de circulatie terecht kan komen. De snelheidsbepalende laag is voor de meeste stoffen het stratum corneum, dat bestaat uit dode cellen. De permeabiliteit van de huid is afhankelijk van zowel 
de lipofiliteit van de chemische stof en de dikte van de buitenste laag 
van de epidermis als andere factoren zoals het molecuulgewicht en de concentratie van de stof. In het algemeen is de permeabiliteit van de huid van ratten en konijnen groter dan die van de huid van de 
mens, terwijl de permeabiliteit van de huid van cavia's en apen meer 
lijkt op die van de huid van de mens.
 
De methoden om de percutane absorptie te meten kunnen in twee 
categorieën worden verdeeld:  in vivo  en in vitro . De in-vivo  methode 
kan bij verschillende soorten laboratoriumdieren goede informatie over de absorptie door de huid opleveren. De ontwikkeling van  in- 
vitro  methoden is van een recenter datum. Daarbij wordt gebruik 
gemaakt van het transport over dierlijke of menselijke huid met 
een volledige of partiële dikte naar een vloeistofreservoir. De  in-vitro  
methode wordt apart in een andere testmethode (1) beschreven. Als hulp bij het kiezen van de geschiktste methode in een bepaalde 
situatie wordt aanbevolen de richtsnoeren van de OESO voor de 
uitvoering van studies inzake absorptie door de huid (2) te raadple ­
gen, aangezien hierin gedetailleerdere informatie wordt gegeven over de geschiktheid van zowel  in-vivo  methoden als  in-vitro  methoden.
 
De hier beschreven  in-vivo  methode maakt het mogelijk de penetratie 
van de teststof in het systemische compartiment via de huid te be ­
palen. De techniek is al vele jaren lang op grote schaal gebruikt 
(3)(4)(5)(6)(7). Hoewel  in-vitro -onderzoek naar de percutane absorp ­
tie in veel gevallen geschikt kan zijn, kunnen er ook situaties zijn waarin alleen een  in-vivo -onderzoek de benodigde gegevens kan op ­
leveren.
 
De voordelen van de  in-vivo  methode zijn dat deze een fysiologisch 
en metabool intact systeem gebruikt, een ook in andere toxicologi ­
sche onderzoeken veel gebruikte species gebruikt en voor gebruik 
met andere species kan worden aangepast. De nadelen zijn dat er 
levende dieren moeten worden gebruikt, dat er radioactief gelabeld materiaal nodig is om gemakkelijker betrouwbare resultaten te krij ­
gen, dat er problemen zijn bij het bepalen van de vroege absorptie ­
fase en dat er een verschil in permeabiliteit is tussen de species die 
de voorkeur heeft (de rat) en de menselijke huid. Dierlijke huid heeft in het algemeen een grotere permeabiliteit en kan daardoor tot een overschatting van de percutane absorptie bij de mens leiden (6)(8) ­
(9). Bijtende/corrosieve stoffen mogen niet bij levende dieren wor ­
den getest.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. DEFINITIES  
Ongeabsorbeerde dosis:  de hoeveelheid die na blootstelling van het 
huidoppervlak wordt afgespoeld en nog op de niet-occlusieve bedek ­
king aanwezig is, met inbegrip van de hoeveelheid waarvan wordt 
aangetoond dat deze tijdens de blootstelling vanaf de huid is ver ­
dampt.  
Geabsorbeerde dosis ( in vivo ): de hoeveelheid teststof die aanwezig 
is in de urine, de wasvloeistof van de kooi, de feces, de uitgeademde lucht (indien gemeten), het bloed, de weefsels (indien verzameld) en het resterende karkas na verwijdering van de huid op de opbrenglo ­
catie.
 
Absorbeerbare dosis:  de hoeveelheid die na het spoelen op of in de 
huid aanwezig is.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof, die bij voorkeur radioactief gelabeld is, wordt bij een of 
meer geschikte dosisniveaus in de vorm van een representatief gang ­
baar preparaat op de geschoren huid van dieren aangebracht. Het 
testpreparaat wordt gedurende een vaste periode in contact met de 
huid gelaten onder een geschikte afdekking (niet-occlusief, semi-oc ­
clusief of occlusief) teneinde inslikken van het testpreparaat te voor ­
komen. Aan het eind van de blootstellingstijd wordt de afdekking 
verwijderd en wordt de huid met een geschikt reinigingsmiddel ge ­
reinigd; de afdekking en het reinigingsmateriaal worden voor analyse bewaard en er wordt een nieuwe afdekking aangebracht. De dieren worden vóór, gedurende en na de blootstellingsperiode in individuele 
metabole kooien gehuisvest en de uitwerpselen en uitgeademde lucht 
worden gedurende deze perioden voor analyse verzameld. De uit ­
geademde lucht behoeft niet te worden opgevangen wanneer er vol ­
doende informatie is waaruit blijkt dat er weinig of geen vluchtige 
radioactieve metabolieten worden gevormd. Voor elke studie worden 
normaal gesproken verscheidene groepen dieren gebruikt die aan het testpreparaat worden blootgesteld. Eén groep wordt aan het eind van de blootstellingsperiode gedood. Andere groepen worden met gepro ­
grammeerde tussenpozen daarna gedood (2). Aan het eind van de 
bemonsteringstijd worden de resterende dieren gedood, wordt het bloed voor analyse verzameld, wordt de opbrenglocatie voor analyse verwijderd en wordt het karkas op eventueel niet-uitgescheiden ma ­
teriaal geanalyseerd. De monsters worden op correcte wijze geanaly ­
seerd en de mate van percutane absorptie wordt bepaald (6)(8)(9).
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.4.1.  Keuze van de diersoort  
Meestal wordt de rat als species gebruikt, maar ook haarloze stam ­
men en species waarvan de huidabsorptiesnelheid vergelijkbaarder is met die van de mens kunnen worden gebruikt (3)(6)(7)(8)(9). Er 
dienen jonge volwassen gezonde dieren van één geslacht (in principe 
mannetjes) van gangbare laboratoriumstammen te worden gebruikt. Aan het begin van de studie mag de gewichtsvariatie tussen de dieren niet groter zijn dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht. 
Mannetjesratten van 200-250 g zijn bijvoorbeeld geschikt, vooral 
in de bovenste helft van dit interval.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Aantal en geslacht van de dieren  
Voor elk testpreparaat en elke geprogrammeerde beëindigingstijd 
moet een groep van ten minste vier dieren van één geslacht worden gebruikt. Elke groep zal na een verschillende tijdsduur worden ge ­
dood, bijvoorbeeld aan het eind van de blootstellingsperiode (meestal 
6 of 24 uur) en op tijdstippen daarna (bv. 48 en 72 uur). Als er gegevens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat er aanzienlijke verschil ­
len in huidtoxiciteit tussen mannetjes en vrouwtjes zijn, moet het 
gevoeligste geslacht worden gekozen. Als dergelijke gegevens niet 
beschikbaar zijn, kan elk van beide geslachten worden gebruikt.
 
1.4.3.  Huisvesting en voeding  
De temperatuur in de proefdierruimte moet 22  o C (± 3  o C) zijn. De 
relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % en (behalve tijdens 
het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 
12 uur donker. Als voer mag gewoon laboratoriumvoer worden ge ­
bruikt en dit moet in ruime mate beschikbaar zijn met daarnaast een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Tijdens de studie en bij voorkeur ook tijdens het acclimatiseren worden de dieren individueel in me ­
tabole kooien gehuisvest. Aangezien de resultaten worden beïnvloed 
door het morsen van voer en water, moet de kans op dergelijke voorvallen tot een minimum worden beperkt.
 
1.4.4.  Voorbereiding van de dieren  
De dieren worden gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen iden ­
tificeren en gedurende ten minste vijf dagen vóór het begin van de studie in hun kooi gehouden, zodat ze aan de laboratoriumomstan ­
digheden kunnen acclimatiseren.
 
Na de acclimatiseringsperiode en ongeveer 24 uur vóór de toediening 
wordt bij elk dier een stuk huid in de omgeving van de schouders en 
de rug geschoren. De permeabiliteit van beschadigde huid verschilt van die van intacte huid en er moet goed op worden gelet dat de huid niet wordt geschaafd. Na het scheren en ongeveer 24 uur voor ­
dat de teststof op de huid wordt aangebracht (zie punt 1.4.7), wordt 
het huidoppervlak met aceton schoongeveegd om talgvet te verwij ­
deren. Nog eens met water en zeep wassen wordt niet aanbevolen, omdat zeepresten de absorptie van de teststof kunnen bevorderen. 
Het huidoppervlak moet groot genoeg zijn om een betrouwbare be ­
rekening van de geabsorbeerde hoeveelheid teststof per cm
 2 huid 
mogelijk te maken, bij voorkeur ten minste 10 cm  2 . Dit oppervlak 
is uitvoerbaar bij ratten met een lichaamsgewicht van 200-250 g. Na 
de voorbereiding worden de dieren in de metabole kooien terug ­
geplaatst.  
1.4.5.  Teststof  
De teststof is de stof waarvan de penetratiekenmerken worden bestu ­
deerd. De teststof moet bij voorkeur radioactief worden gelabeld.  
1.4.6.  Testpreparaat  
Het preparaat van de teststof (bijvoorbeeld puur, verdund of gefor ­
muleerd materiaal met de teststof dat op de huid wordt aangebracht) moet hetzelfde zijn (of een realistisch surrogaat) als het preparaat 
waaraan mensen of andere potentiële doelsoorten kunnen worden 
blootgesteld. Voor een afwijking van het gangbare preparaat moet een motivering worden gegeven. Indien nodig wordt de teststof op ­
gelost of gesuspendeerd in een geschikt medium. Voor een ander 
medium dan water moeten de absorptiekenmerken en de mogelijke 
interactie met de teststof bekend zijn.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Opbrengen op de huid  
Er wordt een specifiek stuk van het huidoppervlak bepaald waar de 
teststof wordt opgebracht. Vervolgens wordt een bekende hoeveel ­
heid testpreparaat gelijkmatig op deze plaats aangebracht. Deze hoe ­
veelheid moet normaal gesproken representatief zijn voor de poten ­
tiële blootstelling van de mens, meestal 1-5 mg/cm  2 huid voor een 
vaste stof en maximaal 10 μl/cm  2 voor vloeistoffen. Voor andere 
hoeveelheden moet een motivering worden gegeven op basis van 
de verwachte gebruiksomstandigheden, de doelstellingen van de stu ­
die of de fysische kenmerken van het testpreparaat. Na opbrengen moet de behandelde locatie tegen verzorging door het dier zelf wor ­
den beschermd. Figuur 1 bevat een voorbeeld van een gangbaar 
instrument hiervoor. Meestal wordt de opbrenglocatie beschermd met een niet-occlusieve afdekking (bijvoorbeeld een permeabel nylon gaas). Bij oneindig opbrengen moet de opbrenglocatie echter occlu ­
sief worden afgedekt. Wanneer de recovery-efficiëntie van de teststof 
door verdamping van een half-vluchtige teststof in onaanvaardbare mate wordt verlaagd (zie ook de eerste alinea van punt 1.4.10), moet de verdampte stof worden opgevangen in een koolfilter waarmee het 
opbrenginstrument wordt afgedekt (zie figuur 1). Het is belangrijk 
dat een instrument de huid niet beschadigt en het testpreparaat niet absorbeert of daarmee reageert. De dieren worden in de individuele metabole kooien teruggeplaatst om de uitwerpselen te kunnen ver ­
zamelen.
 
1.4.8.  Duur van de blootstelling en bemonstering  
De blootstellingsduur is de tijdsduur tussen het opbrengen en ver ­
wijderen van het testpreparaat door de huid te wassen. Er moet op 
basis van de verwachte blootstellingsduur bij de mens een relevante blootstellingsduur worden gebruikt (meestal 6 of 24 uur). Na de blootstellingsperiode worden de dieren tot het geprogrammeerde tijd ­
stip van doden in de metabole kooien gehouden. Gedurende de hele 
studie moet op periodieke tijdstippen worden geobserveerd of de dieren tekenen van toxiciteit/abnormale reacties vertonen. Aan het eind van de blootstellingsperiode wordt geobserveerd of de behan ­
delde huid zichtbare tekenen van irritatie vertoont.
 
De metabole kooien moeten het mogelijk maken dat gedurende de 
hele studie de urine en de feces apart worden opgevangen. Ook 
moeten 14C-kooldioxide en vluchtige C-koolstofverbindingen kun ­
nen worden opgevangen en deze moeten worden geanalyseerd wan ­
neer ze in significante hoeveelheden worden geproduceerd (> 5 %). De urine, de feces en de opvangvloeistoffen (bijvoorbeeld
 14 C-kool­
dioxide en vluchtige  14 C-koolstofverbindingen) moeten van elke 
groep op elk bemonsteringstijdstip apart worden verzameld. Als er voldoende informatie is waaruit blijkt dat er weinig of geen vluchtige radioactieve metabolieten worden gevormd, kunnen open kooien 
worden gebruikt.
 
De uitwerpselen worden gedurende de blootstellingsperiode, maxi ­
maal 24 uur na het eerste huidcontact, en vervolgens dagelijks tot het einde van het experiment verzameld. Drie intervallen voor de ver ­
zameling van de uitwerpselen zijn normaal gesproken voldoende, 
maar op grond van de beoogde toepassing van het testpreparaat of bestaande kinetische gegevens kunnen geschiktere of extra tijdstip ­
pen voor bestudering worden gekozen.
 
Aan het eind van de blootstellingsperiode wordt het beschermende 
instrument van elk dier verwijderd en apart bewaard om te worden geanalyseerd. De behandelde huid van alle dieren wordt ten minste 
drie keer gewassen met een reinigingsmiddel en bijvoorbeeld ge ­
schikte wattenproppen. Er moet voor worden gezorgd dat andere lichaamsdelen niet worden verontreinigd. Het reinigingsmiddel moet representatief zijn voor normale reinigingsmethoden, bijvoor ­
beeld een oplossing van zeep in water. Ten slotte moet de huid 
worden gedroogd. Alle wattenproppen en al het waswater moeten voor analyse worden bewaard. Er wordt een nieuwe afdekking aangebracht ter bescherming van de behandelde locatie van de dieren 
die behoren tot groepen die voor een later tijdstip bestemd zijn, 
voordat ze in hun eigen aparte kooien worden teruggeplaatst.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Slotprocedures  
In elke groep worden de dieren op het geprogrammeerde tijdstip elk 
afzonderlijk gedood en wordt het bloed voor analyse opgevangen. Het beschermende instrument of de afdekking wordt voor analyse 
verwijderd. Bij elk dier wordt de huid van de opbrenglocatie en een 
vergelijkbaar oppervlak onbehandelde geschoren huid weggenomen om apart te worden geanalyseerd. De opbrenglocatie kan worden gefractioneerd om het stratum corneum te scheiden van de epidermis 
daaronder om meer informatie over de verdeling van de teststof te 
krijgen. De bepaling van deze verdeling gedurende een zekere peri ­
ode na de blootstellingsperiode moet enige aanwijzingen opleveren 
over de lotgevallen van de teststof in het stratum corneum. Om het 
fractioneren van de huid (na het wassen van de huid aan het eind en het doden van het dier) te vergemakkelijken wordt elke bescher ­
mende afdekking verwijderd. De huid van de opbrenglocatie, met 
een ronde rand van de omringende huid daaromheen, wordt van de 
rat verwijderd en op een plaat geprikt. Op het huidoppervlak wordt met lichte druk een strook kleefband aangebracht en de kleefband wordt samen met een deel van het stratum corneum verwijderd. 
Vervolgens worden opnieuw stroken kleefband aangebracht totdat 
het kleefband niet meer aan het huidoppervlak blijft plakken, wan ­
neer het stratum corneum volledig is verwijderd. Voor elk dier kun ­
nen alle stroken kleefband in één houder worden verzameld en hier ­
aan wordt een stof toegevoegd om het weefsel te verteren, waarin het 
stratum corneum wordt opgenomen. Potentiële doelorganen kunnen worden verwijderd om apart te worden geanalyseerd, voordat het resterende karkas op de daarin geabsorbeerde dosis wordt geanaly ­
seerd. De karkassen van de dieren moeten apart worden bewaard 
voor analyse. Meestal zal een analyse van de totale inhoud volstaan. Doelorganen kunnen worden verwijderd om apart te worden ge ­
analyseerd (indien andere studies daar aanleiding toe geven). De 
urine die op het geprogrammeerde tijdstip van doden nog in de blaas 
aanwezig is, moet aan de eerder verzamelde urine worden toege ­
voegd. Na het verzamelen van de uitwerpselen in de metabole kooien op het geprogrammeerde tijdstip van doden worden de 
kooien en de opvangbakken daarvan met een geschikt oplosmiddel 
gewassen. Ook andere mogelijk verontreinigde apparatuur wordt op dezelfde wijze geanalyseerd.
 
1.4.10.  Analyse  
In alle studies moet een afdoende recovery worden gehaald (daarbij 
moet worden gestreefd naar een gemiddelde van 100 ± 10 % van de radioactiviteit). Voor een recovery buiten dit interval moet een moti ­
vering worden gegeven. De hoeveelheid van de toegediende dosis in 
elk monster moet met geschikte gevalideerde procedures worden geanalyseerd.
 
In de statistische analyse moet een meting van de variantie van de 
duplo's voor elke opgebrachte hoeveelheid worden opgenomen.  
2. GEGEVENS  
Voor elk dier moeten op elk bemonsteringstijdstip voor de teststof 
en/of metabolieten de volgende metingen worden uitgevoerd. Naast 
de individuele gegevens moeten de voor elk bemonsteringstijdstip gegroepeerde gegevens als gemiddelden worden gerapporteerd.
 
— de hoeveelheid op de beschermende instrumenten;  
— de hoeveelheid die uit de huid kan worden verwijderd;  
— de hoeveelheid in/op de huid die niet van de huid kan worden 
gewassen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— de hoeveelheid in het bloedmonster;  
— de hoeveelheid in de uitwerpselen en de uitgeademde lucht (in ­
dien van toepassing);  
— de hoeveelheid die achterblijft in het karkas en in organen die 
voor aparte analyse zijn verwijderd.  
Aan de hand van de hoeveelheid teststof en/of metabolieten in de 
uitwerpselen, de uitgeademde lucht, het bloed en het karkas kan op 
elk tijdstip de totale geabsorbeerde hoeveelheid worden bepaald. Ook 
kan de hoeveelheid gedurende de blootstellingsduur geabsorbeerde teststof per cm
 2 aan de teststof blootgestelde huid worden berekend.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTRAPPORT  
In het testrapport moeten de in het protocol vermelde voorschriften 
worden opgenomen, met inbegrip van een motivering voor het ge ­
bruikte testsysteem, en de volgende gegevens:  
Teststof:  
— informatie ter identificatie (bv. het CAS-nummer, indien beschik ­
baar; bron; zuiverheid (radiochemische zuiverheid); bekende ver ­
ontreinigingen; chargenummer);  
— fysische aard, fysisch-chemische eigenschappen (bv. pH, vluch ­
tigheid, oplosbaarheid, stabiliteit, molecuulgewicht en log P  ow ). 
Testpreparaat:  
— formulering en motivering van het gebruik;  
— gedetailleerde gegevens over het testpreparaat, zoals opgebrachte 
hoeveelheid, bereikte concentratie, medium, stabiliteit en homo ­
geniteit.  
Proefdier:  
— gebruikte species/stam;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— bron van de dieren, huisvestingsomstandigheden, voeding enz.;  
— gewicht van elk dier aan het begin van de test.  
Testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van het testpreparaat 
(opbrenglocatie, analysemethoden, occlusie/niet-occlusie, volu ­
me, extractie, detectie);  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het 
water.  
Resultaten:  
— eventuele verschijnselen van toxiciteit;  
— tabel met absorptiegegevens (uitgedrukt als snelheid, hoeveelheid 
of percentage);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— algehele recovery van het experiment;  
— interpretatie van de resultaten, vergelijking met eventueel be ­
schikbare gegevens over de percutane absorptie van de teststof.  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
1. Testmethode B.45. Absorptie door de huid:  in vitro -methode.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.  
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for En ­
vironmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. Toxi ­
col. 8(5), 829-835.  
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin ab ­
sorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and En ­
vironmental Assessment.  
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369-373.  
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some or ­
ganic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, 399-404.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figuur 1  
Voorbeeld van een ontwerp voor een gangbaar instrument om de opbrenglocatie op de huid te 
bepalen en te beschermen bij  in vivo -onderzoek van de percutane absorptie
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  ABSORPTIE DOOR DE HUID:  IN-VITRO  METHODE  
1. METHODE  
Deze testmethode komt overeen met OESO TG 428 (2004).  
1.1. INLEIDING  
Deze methode is ontworpen om informatie te verschaffen over de 
absorptie van een teststof die op weggenomen huid wordt aange ­
bracht. De methode kan worden gecombineerd met de  in-vivo  me­
thode voor absorptie door de huid (1) of afzonderlijk worden uitge ­
voerd. Als hulp bij het opzetten van studies op basis van deze 
methode wordt aanbevolen de richtsnoeren van de OESO voor de uitvoering van studies inzake absorptie door de huid (2) te raadple ­
gen. Deze richtsnoeren zijn opgesteld om gemakkelijker geschikte  
in-vitro  procedures voor specifieke omstandigheden te kunnen kie ­
zen, zodat de betrouwbaarheid van resultaten die met deze methode worden verkregen, wordt gewaarborgd.
 
De methoden om de absorptie door de huid en de toediening via de 
huid te meten kunnen in twee categorieën worden verdeeld:  in vivo  
en in vitro . In vivo -methoden voor absorptie door de huid zijn gang ­
baar en leveren farmacokinetische informatie bij een scala van dier ­
soorten op. Een  in-vivo  methode wordt apart in een andere test ­
methode (1) beschreven. Ook  in-vitro  methoden worden al vele jaren 
gebruikt om de absorptie door de huid te meten. Hoewel er voor de in deze testmethode beschreven  in-vitro  methoden geen formeel va ­
lideringsonderzoek is uitgevoerd, waren deskundigen van de OESO 
het er in 1999 over eens dat er voldoende gegevens geëvalueerd waren om de  in-vitro  methode te ondersteunen (3). Nadere 
bijzonderheden ter motivering van deze ondersteuning, waaronder 
een significant aantal directe vergelijkingen van  in vitro - en in-vivo  
methoden, worden in de richtsnoeren (2) vermeld. Er zijn verschil ­
lende monografieën waarin dit onderwerp wordt besproken en gede ­
tailleerde achtergrondinformatie over het gebruik van een  in-vitro  
methode wordt gegeven (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12).  In-vitro  me­
thoden meten de diffusie van chemische stoffen naar de huid en via de huid naar een vloeistofreservoir en kunnen niet-levende huid gebruiken om uitsluitend de diffusie te meten of verse metabool 
actieve huid om tegelijkertijd de diffusie en het metabolisme in de 
huid te meten. Dergelijke methoden worden specifiek gebruikt als screening om de toediening van chemische stoffen op en door de 
huid uit verschillende formuleringen te vergelijken en kunnen ook 
nuttige modellen bieden voor de evaluatie van de absorptie door de huid bij de mens.
 
De in-vitro  methode is wellicht niet voor alle situaties en categorieën 
chemische stoffen bruikbaar. Het kan mogelijk zijn de  in-vitro  
testmethode te gebruiken voor een eerste kwalitatieve evaluatie van de penetratie door de huid. In bepaalde gevallen zal het wellicht 
nodig zijn als vervolg hierop  in-vivo  gegevens te verzamelen. Voor 
een verdere uitwerking van situaties waarin de  in-vitro  methode 
geschikt is, wordt verwezen naar de richtsnoeren (2). Aanvullende gedetailleerde informatie om deze beslissing te ondersteunen is te 
vinden in (3).
 
Deze methode bevat algemene beginselen voor het meten van de 
absorptie door en de toediening via de huid van een teststof met 
behulp van verwijderde huid. Huid van vele zoogdiersoorten en ook 
van de mens kan worden gebruikt. De permeabiliteit van huid blijft na verwijdering uit het lichaam onveranderd, omdat de belangrijkste barrière voor diffusie het niet-levende stratum corneum is; actief 
transport van chemische stoffen door de huid is niet waargenomen. 
Er is aangetoond dat de huid in staat is bepaalde chemische stoffen tijdens de absorptie door de huid te metaboliseren (6), maar dit proces is niet snelheidsbeperkend ten aanzien van de feitelijk ge ­
absorbeerde dosis, hoewel het de aard van het materiaal dat in de 
bloedsomloop terechtkomt wel kan beïnvloeden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINITIES  
Ongeabsorbeerde dosis:  de hoeveelheid die na blootstelling van het 
huidoppervlak wordt afgespoeld en nog op de niet-occlusieve bedek ­
king aanwezig is, met inbegrip van de hoeveelheid waarvan wordt 
aangetoond dat deze tijdens de blootstelling vanaf de huid is ver ­
dampt.  
Geabsorbeerde dosis ( in vitro ): massa teststof die binnen een ge ­
specificeerd tijdsbestek in de receptorvloeistof of de systemische 
circulatie terechtkomt.  
Absorbeerbare dosis ( in vitro ): de hoeveelheid die na het spoelen 
op of in de huid aanwezig is.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof, die radioactief gelabeld kan zijn, wordt aangebracht op 
het oppervlak van een huidmonster dat de twee compartimenten van een diffusiecel van elkaar scheidt. De chemische stof blijft gedurende 
een gespecificeerde tijd onder gespecificeerde omstandigheden op de 
huid aanwezig en wordt daarna met een geschikte reinigingspro ­
cedure verwijderd. De receptorvloeistof wordt gedurende het experi ­
ment op bepaalde tijdstippen bemonsterd en geanalyseerd op de test ­
stof en/of metabolieten.
 
Wanneer metabool actieve systemen worden gebruikt, kunnen met 
geschikte methoden metabolieten van de teststof worden geanaly ­
seerd. Aan het eind van het experiment wordt, indien van toepassing, de distributie van de teststof en de metabolieten kwantitatief bepaald.
 
Onder geschikte omstandigheden, die in deze methode en de richt ­
snoeren (2) worden beschreven, wordt de absorptie van een teststof 
gedurende een bepaalde tijd gemeten door analyse van de receptor ­
vloeistof en de behandelde huid. De hoeveelheid teststof die in de huid achterblijft, moet als geabsorbeerd worden beschouwd tenzij 
kan worden aangetoond dat de absorptie op grond van uitsluitend 
de waarden in de receptorvloeistof kan worden bepaald. Op grond van een analyse van de andere componenten (materiaal dat van de 
huid wordt gewassen of in de huidlagen achterblijft) kunnen nadere 
gegevens worden bepaald, bijvoorbeeld de totale verdeling van de teststof en de procentuele recovery.
 
Om de goede uitvoering en betrouwbaarheid van het testsysteem in 
het uitvoerende laboratorium aan te tonen moeten de resultaten voor 
relevante referentiechemicaliën beschikbaar zijn en in overeenstem ­
ming zijn met de gepubliceerde literatuur voor de gebruikte methode. Aan deze eis kan worden voldaan door tegelijk met de teststof een geschikte referentiestof (waarvan de lipofiliteit bij voorkeur ver ­
gelijkbaar is met die van de teststof) te testen of door adequate 
historische gegevens voor een aantal referentiestoffen met uiteen ­
lopende lipofiliteit (bv. cafeïne, benzoëzuur en testosteron) te ver ­
strekken.
 
1.4. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.4.1  Diffusiecel  
Een diffusiecel bestaat uit een donor- en een receptorcompartiment 
waartussen een stukje huid wordt geklemd (figuur 1 geeft een voor ­
beeld van een gangbaar ontwerp). De cel moet voor een goede 
afdichting rondom de huid zorgen en mogelijkheden bieden voor 
een gemakkelijke bemonstering en een goede menging van de re ­
ceptorvloeistof die in contact staat met de onderkant van de huid, alsmede voor een goede regulering van de temperatuur van de cel en 
de inhoud daarvan. Zowel statische als doorstroom-diffusiecellen zijn 
aanvaardbaar. Normaal gesproken is er bij de blootstelling aan een eindige dosis van een testpreparaat geen sprake van occlusie van het donorcompartiment. Voor oneindige toepassingen en bepaalde sce ­
nario's voor eindige doses kan er echter wel occlusie van het donor ­
compartiment worden toegepast.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2  Receptorvloeistof  
Het gebruik van een fysiologisch compatibele receptorvloeistof 
wordt aanbevolen, maar ook andere vloeistoffen mogen worden ge ­
bruikt, mits daarvoor een motivering wordt gegeven. De exacte sa ­
menstelling van de receptorvloeistof moet worden vermeld. Er moet 
worden aangetoond dat de teststof voldoende oplosbaar is in de receptorvloeistof, zodat deze geen belemmering voor absorptie vormt. Daarnaast mag de receptorvloeistof geen nadelige invloed 
op de intacte staat van de huid hebben. In een doorstroomsysteem 
mag de stroomsnelheid de diffusie van de teststof naar de receptor ­
vloeistof niet belemmeren. In een systeem met een statische cel moet 
de vloeistof continu worden geroerd en periodiek worden bemon ­
sterd. Als het metabolisme wordt onderzocht, moet de receptorvloei ­
stof de levensvatbaarheid van de huid gedurende het hele experiment ondersteunen.
 
1.4.3  Huidpreparaten  
Er kan huid van menselijke of dierlijke bronnen worden gebruikt. 
Voor het gebruik van menselijke huid gelden nationale en internatio ­
nale ethische overwegingen en voorwaarden. Hoewel levende huid de voorkeur verdient, kan ook niet-levende huid worden gebruikt, 
mits kan worden aangetoond dat de huid intact is. Zowel epidermis- 
membranen (enzymatisch, met warmte of chemisch gescheiden) als huid met een partiële dikte (meestal 200-400 μm dik), verkregen met 
een dermatoom, kunnen worden gebruikt. Ook huid met een vol ­
ledige dikte kan worden gebruikt, maar een al te dikke huid (d.w.z. 
ongeveer > 1 mm) moet worden vermeden, tenzij dit specifiek nodig is voor de bepaling van de teststof in de huidlagen. Voor de keuze van species, anatomische locatie en preparatietechniek moet een mo ­
tivering worden gegeven. Er zijn aanvaardbare gegevens nodig van 
ten minste vier duplo's per testpreparaat.
 
1.4.4  Intacte staat van het huidpreparaat  
Het is van cruciaal belang dat de huid op correcte wijze wordt 
geprepareerd. Een onjuiste behandeling kan leiden tot beschadiging 
van het stratum corneum en daarom moet de intacte staat van de 
geprepareerde huid worden gecontroleerd. Wanneer het huidmetabo ­
lisme wordt bestudeerd, moet de verse weggenomen huid zo spoedig mogelijk en onder omstandigheden waarvan bekend is dat ze meta ­
bole activiteit ondersteunen, worden gebruikt. Als algemene leidraad 
geldt dat verse weggenomen huid binnen 24 uur moet worden ge ­
bruikt, maar de aanvaardbare bewaartermijn kan afhangen van het bij de metabolisering betrokken enzymsysteem en de opslagtemperatuur 
(13). Wanneer de huidpreparaten vóór gebruik bewaard zijn, moet 
worden aangetoond dat de barrièrefunctie intact is gebleven.
 
1.4.5  Teststof  
De teststof is de stof waarvan de penetratiekenmerken worden bestu ­
deerd. De teststof moet bij voorkeur radioactief worden gelabeld.  
1.4.6  Testpreparaat  
Het preparaat van de teststof (bijvoorbeeld puur, verdund of gefor ­
muleerd materiaal met de teststof dat op de huid wordt aangebracht) moet hetzelfde zijn (of een realistisch surrogaat) als het preparaat waaraan mensen of andere potentiële doelsoorten kunnen worden 
blootgesteld. Voor een afwijking van het gangbare preparaat moet 
een motivering worden gegeven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7  Concentraties en formuleringen van de teststof  
Normaal gesproken wordt meer dan een concentratie van de teststof 
gebruikt, waarmee het bereik wordt bestreken van de concentraties waaraan de mens kan worden blootgesteld. Ook moet worden over ­
wogen een aantal gangbare formuleringen te testen.
 
1.4.8  Opbrengen op de huid  
Bij blootstelling van de mens aan chemische stoffen gaat het onder 
normale omstandigheden meestal om een eindige dosis. Daarom 
moet een zodanige hoeveelheid teststof worden opgebracht dat de 
blootstelling van de mens wordt nagebootst, normaal gesproken 1- 5 mg/cm
 2 huid voor een vaste stof en maximaal 10 μl/cm  2 voor 
vloeistoffen. Voor de hoeveelheid moet een motivering worden ge ­
geven op basis van de verwachte gebruiksomstandigheden, de doel ­
stellingen van de studie of de fysische kenmerken van het testpre ­
paraat. De op de huid opgebrachte hoeveelheid kan bijvoorbeeld oneindig zijn wanneer er grote volumes per oppervlakte-eenheid 
worden opgebracht.
 
1.4.9  Temperatuur  
De passieve diffusie van chemische stoffen (en derhalve ook de 
absorptie door de huid) wordt beïnvloed door de temperatuur. Het 
diffusiecompartiment en de huid moeten op een constante tempera ­
tuur rond de normale huidtemperatuur van 32 + 1  o C worden ge ­
houden. Het ontwerp van de cel bepaalt op welke temperatuur het waterbad of het verwarmingsblok moet worden gehouden om ervoor 
te zorgen dat de temperatuur van het receptorcompartiment en de 
huid aan de fysiologische norm voldoet. De vochtigheid moet bij voorkeur tussen 30 % en 70 % liggen.
 
1.4.10  Duur van de blootstelling en bemonstering  
De huid kan gedurende het hele experiment of een kortere tijd (bij ­
voorbeeld om een specifiek type blootstelling van de mens na te 
bootsen) aan het testpreparaat worden blootgesteld. De overmaat test ­
preparaat wordt met een geschikt reinigingsmiddel van de huid ge ­
wassen en de wasvloeistof wordt voor analyse opgevangen. De pro ­
cedure om het testpreparaat te verwijderen is afhankelijk van de ver ­
wachte gebruiksomstandigheden en hiervoor moet een motivering worden gegeven. Normaal gesproken is een bemonsteringsperiode van 24 uur nodig om een afdoende karakterisering van het absorptie ­
profiel mogelijk te maken. Aangezien de toestand van de huid na 24 
uur slechter kan worden, mag de bemonsteringstijd normaal gesproken niet langer zijn dan 24 uur. Voor teststoffen die snel in de huid penetreren zal dit wellicht niet nodig zijn, mar voor teststoffen die 
langzaam penetreren kan een langere periode nodig zijn. De bemon ­
steringsfrequentie van de receptorvloeistof moet zodanig zijn dat het absorptieprofiel van de teststof grafisch kan worden weergegeven.
 
1.4.11  Slotprocedures  
Alle componenten van het testsysteem moeten worden geanalyseerd 
en de recovery moet worden bepaald. Deze omvat het donorcom ­
partiment, het waswater van het huidoppervlak, het huidpreparaat en het receptorcompartiment met de receptorvloeistof. In sommige ge ­
vallen kan de huid worden gefractioneerd in blootgesteld huidopper ­
vlak en huid onder de flens van de cel en in stratum corneum, epidermis en dermis, die dan apart kunnen worden geanalyseerd.
 
1.4.12  Analyse  
In alle studies moet een afdoende recovery worden gehaald (daarbij 
moet worden gestreefd naar een gemiddelde van 100 ± 10 % van de 
radioactiviteit en voor afwijkingen moet een motivering worden ge ­
geven). De hoeveelheid teststof in de receptorvloeistof, het huidpre ­
paraat, het waswater van het huidoppervlak en het spoelwater van de 
apparatuur moet met behulp van een geschikte techniek worden 
geanalyseerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. GEGEVENS  
De analyse van de receptorvloeistof, de distributie van de teststof in 
het testsysteem en het absorptieprofiel in de loop van de tijd moeten worden gerapporteerd. Wanneer de blootstellingsvoorwaarden zoda ­
nig zijn dat er sprake is van een eindige dosis, moeten de van de 
huid gewassen hoeveelheid, de in en aan de huid gebonden hoe ­
veelheid (en de hoeveelheid in de verschillende huidlagen, indien deze is geanalyseerd) en de hoeveelheid in de receptorvloeistof (snel ­
heid en hoeveelheid of percentage van de opgebrachte hoeveelheid) 
worden berekend. De absorptie door de huid kan soms alleen met behulp van de gegevens over de receptorvloeistof worden uitgedrukt. 
Wanneer de teststof echter aan het eind van de studie nog in de huid 
aanwezig is, moet deze hoeveelheid wellicht worden meegerekend in de totale geabsorbeerde hoeveelheid (zie punt 66 van referentie (3)). Wanneer er sprake is van blootstellingsomstandigheden met een on ­
eindige dosis, kunnen de gegevens de berekening van een permea ­
biliteitsconstante (Kp) mogelijk maken. In deze laatste situatie is het geabsorbeerde percentage niet relevant.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTRAPPORT  
In het testrapport moeten de in het protocol vermelde voorschriften 
worden opgenomen, met inbegrip van een motivering voor het ge ­
bruikte testsysteem, en de volgende gegevens:  
Teststof:  
— fysische aard, fysisch-chemische eigenschappen (ten minste het 
molecuulgewicht en log P  ow ) en de zuiverheid (radiochemische 
zuiverheid);  
— informatie ter identificatie (bv. het chargenummer);  
— oplosbaarheid in de receptorvloeistof.  
Testpreparaat:  
— formulering en motivering van het gebruik;  
— homogeniteit.  
Testomstandigheden:  
— bronnen en locatie van de huid, preparatiemethode, bewaar ­
omstandigheden vóór het gebruik, eventuele voorbehandeling (reiniging, behandeling met antibiotica enz.), metingen inzake de intacte staat van de huid, metabole status, motivering van 
het gebruik;
 
— ontwerp van de cel, samenstelling van de receptorvloeistof, 
stroomsnelheid van de receptorvloeistof of bemonsteringstijdstip ­
pen en -procedures;  
— gedetailleerde gegevens over het opbrengen van het testpreparaat 
en kwantificering van de opgebrachte dosis;  
— duur van de blootstelling;  
— gedetailleerde gegevens over de verwijdering van het testprepa ­
raat van de huid, bijvoorbeeld wassen van de huid;  
— gedetailleerde gegevens over de analyse van de huid en eventueel 
gebruikte fractioneringstechnieken om de distributie in de huid 
aan te tonen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— spoelprocedures voor cel en apparatuur;  
— bepalingsmethoden, extractietechnieken, detectiegrenzen en vali ­
dering van de analysemethode.  
Resultaten:  
— algehele recovery van het experiment (opgebrachte dosis = was ­
water van de huid + huid + receptorvloeistof + spoelwater van de cel);
 
— tabel met de individuele recovery van de cel in elk compartiment;  
— absorptieprofiel;  
— tabel met absorptiegegevens (uitgedrukt als snelheid, hoeveelheid 
of percentage).  
Bespreking van de resultaten.  
Conclusies.  
4. REFERENTIES  
1. Testmethode B.44. Absorptie door de huid:  in-vivo  methode.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, An ­
nex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
4. Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5. Bronaugh RL and Collier, SW (1991). Protocol for  In vitro  Per­
cutaneous Absorption Studies, in  In vitro  Percutaneous Absorpti ­
on: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241.
 
6. Bronaugh RL and Maibach HL (1991).  In vitro  Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
 
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemic ­
als (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECE ­
TOC, Brussels.  
8. Diembeck W, Beek H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Du ­
puis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test 
Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption and 
Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205.
 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10. Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al.  (1996). Me ­
thods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Work ­
shop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11. Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12. Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13. Jewell, C, Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene  in vitro . Arch Toxicol 74: 356-365.  
Figuur 1  
Voorbeeld van een gangbaar ontwerp voor een statische diffusiecel voor  in-vitro - 
onderzoek van de percutane absorptie
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN-VITROHUIDIRRITATIE: TESTMETHODE MET GERECON- 
STRUEERDE HUMANE EPIDERMIS  
INLEIDING  
1. Onder huidirritatie wordt verstaan: het ontstaan van reversibele weefsel ­
schade aan de huid na het aanbrengen van een testmateriaal gedurende maximaal vier uur (zoals gedefinieerd in het GHS (Globally Harmonised System for Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal gehar ­
moniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor chemische stoffen 
van de Verenigde Naties) en Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels, de zogeheten 
CLP-Verordening (1)(3)). Deze testmethode bevat een in-vitroprocedure 
die gebruikt kan worden om de gevaren van irriterende chemische stoffen (stoffen en mengsels) te identificeren in overeenstemming met het VN-GHS en de EU-CLP-categorie 2 (1) (2) (3). In de EU en andere 
regio's die niet de optionele GHS-categorie 3 (licht irriterende stoffen) 
hebben aangenomen, kan deze TM ook worden gebruikt om chemische stoffen te identificeren die niet zijn ingedeeld, d.w.z. stoffen in de 
VN-GHS- en EU-CLP-categorie „Geen categorie” (1)(3). Deze TM kan 
worden gebruikt om de door chemische stoffen veroorzaakte huidirritatie te bepalen als een zelfstandige vervangende test voor in-vivohuidirritatietests binnen een teststrategie met verschillende niveaus 
(4 en hoofdstuk B.4 in deze bijlage).
 
2. De bepaling van de huidirritatie ging meestal gepaard met het gebruik van 
proefdieren [OESO-testrichtlijn 404; hoofdstuk B.4 in deze bijlage] (4). In 
verband met bezorgdheid ten aanzien van dierenwelzijn is B.4 in 2004 herzien, waarbij de bepaling van huidcorrosie/-irritatie wordt uitgevoerd door een teststrategie met meerdere niveaus toe te passen, met gebruikma ­
king van gevalideerde in-vitro- of ex-vivotestmethoden, ter voorkoming 
van pijn en leed bij dieren. Drie gevalideerde in-vitrotestmethoden zijn aangenomen als OESO-testrichtlijnen 430, 431 en 435 (5) (6) (7) en 
twee methoden zijn als de hoofdstukken B.40 en B.40 bis in deze 
bijlage opgenomen, die bedoeld zijn om gebruikt te worden voor het corrosiviteitsgedeelte van de teststrategie met meerdere niveaus van B.4 of OESO-testrichtlijn 404 (4).
 
3. Deze TM heeft betrekking op huidirritatie als eindpunt voor de menselijke 
gezondheid. De methode is gebaseerd op gereconstrueerde humane epider ­
mis (RhE), die qua algemeen ontwerp (het gebruik van uit mensen ver ­
kregen niet-getransformeerde epidermiskeratinocyten als celbron en het gebruik van representatief weefsel en cytoarchitectuur) nauwe overeen ­
komsten heeft met de biochemische en fysiologische eigenschappen van 
de bovenste delen van de menselijke huid, d.w.z. de epidermis. Deze TM 
omvat tevens een reeks prestatienormen (aanhangsel 2) voor de beoor ­
deling van soortgelijke en gewijzigde RhE-gebaseerde methoden die zijn 
ontwikkeld door EC-ECVAM (8), in overeenstemming met de beginselen 
van OESO-richtsnoer nr. 34 (9).
 
4. Er zijn drie gevalideerde methoden die voldoen aan de eisen van deze TM. 
Prevaliderings-, optimaliserings- en valideringsonderzoeken zijn afgerond voor een in-vitromethode (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), met gebruikmaking van een RhE-model, die in de handel verkrijg ­
baar is als EpiSkin
 TM (aangeduid als de Validated Reference 
Method (VRM), gevalideerde referentiemethode). Twee andere in de han ­
del verkrijgbare in vitro uitgevoerde huidirritatietestmethoden op basis van RhE hebben soortgelijke resultaten opgeleverd als de VRM overeenkom ­
stig op prestatienormen gebaseerde validering (21), en dit zijn de 
RhE-methoden EpiDerm
 TM SIT (EPI-200) en SkinEthic  TM (22). ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Voordat een voorgestelde soortgelijke of gewijzigde in-vitro-RhE-methode 
anders dan de RhE-methoden VRM, EpiDerm  TM SIT (EPI-200) of Ski ­
nEthic  TM kan worden gebruikt voor gereglementeerde doeleinden, moeten 
de betrouwbaarheid, relevantie (nauwkeurigheid) en beperkingen ervan voor het voorgestelde gebruik bepaald worden om te waarborgen dat de 
methode als vergelijkbaar met de VRM kan worden beschouwd, overeen ­
komstig de vereisten van de in deze TM vastgestelde prestatienormen (aanhangsel 2). Daarnaast wordt aanbevolen de OESO-toelichting (OECD Explanatory Background Document) inzake in vitro uitgevoerde huidirri ­
tatietests te raadplegen alvorens een soortgelijke of gewijzigde in-vitro- 
RhE-methode te ontwikkelen, te valideren en in te dienen voor wettelijke goedkeuring (23).
 
DEFINITIES  
6. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.  
TOELICHTING EN BEPERKINGEN  
7. Zoals het valideringsonderzoek (16) aantoont, bevat de TM de beperking 
dat de chemische stoffen niet kunnen worden ingedeeld in de optionele GHS-categorie 3 (licht irriterende stoffen) (1). Indien de methode wordt 
gebruikt als een gedeeltelijk vervangende test, kan het nodig zijn aanvul ­
lende in-vivotests uit te voeren om het huidirritatiepotentieel volledig te karakteriseren (4 en hoofdstuk B.4 van deze bijlage). Voor het gebruik van menselijke huid gelden nationale en internationale ethische overwegingen 
en voorwaarden.
 
8. Deze TM heeft betrekking op de in-vitrohuidirritatiecomponent van de 
teststrategie met meerdere niveaus van B.4 (OESO-testrichtlijn 404) inzake huidcorrosie/-irritatie (4). Hoewel deze TM geen toereikende informatie 
over huidcorrosie oplevert, moet worden opgemerkt dat B.40 bis (OE ­
SO-testrichtlijn 431) betreffende huidcorrosie gebaseerd is op hetzelfde RhE-testsysteem, maar met gebruikmaking van een ander protocol (hoofd ­
stuk B.40 bis). Deze methode is gebaseerd op RhE-modellen die gebruik ­
maken van menselijke keratinocyten, die derhalve in vitro het doelorgaan 
van het te onderzoeken bestanddeel vertegenwoordigen. Bovendien heeft de methode direct betrekking op de eerste fase van de inflammatoire reactie/het werkingsmechanisme (celbeschadiging en weefselbeschadiging 
leidend tot plaatselijk trauma) die tijdens irritatie in vivo plaatsvindt. Een 
brede reeks chemische stoffen is getest binnen het onderliggende valide ­
ringsproces voor deze TM en de empirische databank van het validerings ­
onderzoek bevat in totaal 58 chemische stoffen (16)(18)(23). Dit is van 
toepassing op vaste stoffen, vloeibare stoffen, halfvaste stoffen en wassen. 
De vloeibare stoffen mogen waterig of niet-waterig zijn; vaste stoffen mogen oplosbaar of niet oplosbaar in water zijn. Indien mogelijk moeten vaste stoffen tot een poeder worden vermalen, voordat ze worden aange ­
bracht; geen andere voorbehandeling van het monster is vereist. Gassen en 
aerosols zijn nog niet gevalideerd in een valideringsonderzoek (24). Hoe ­
wel het denkbaar is dat deze met behulp van RhE-technologie kunnen worden getest, staat de huidige TM het testen van gassen en aerosols 
niet toe. Tevens dient opgemerkt te worden dat sterk gekleurde chemische 
stoffen de metingen van levensvatbaarheid van cellen kunnen verstoren en het bij deze stoffen nodig is aangepaste controles te gebruiken met het oog op correcties (zie punten 24-26).
 
9. Eén test bestaande uit drie gerepliceerde weefsels zou voldoende moeten 
zijn voor een teststof, indien de indeling ervan ondubbelzinnig is. Echter, bij grensgevallen zoals niet-concordante metingen van replicaties en/of een gemiddeld levensvatbaarheidspercentage van 50 ± 5 %, moet een tweede 
test worden overwogen, evenals een derde test in geval van 
niet-concordante resultaten tussen de eerste twee tests.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
10. De teststof wordt plaatselijk aangebracht op een driedimensionaal 
RhE-model dat bestaat uit niet-getransformeerde, uit mensen verkregen 
epidermiskeratinocyten, die gekweekt zijn om een meerlagig, hooggediffe ­
rentieerd model van de menselijke  epidermis  te vormen. Het model bestaat 
uit een georganiseerd  stratum basale , stratum spinosum  en stratum gra ­
nulosum , en een meerlagig  stratum corneum , die intercellulaire lamelvor ­
mige lipidelagen bevatten die representatief zijn voor de belangrijkste lipideklassen, analoog aan die in vivo worden aangetroffen.
 
11. Door chemische stoffen geïnduceerde huidirritatie, die zich manifesteert als 
erytheem en oedeem, is het gevolg van een cascade van gebeurtenissen, beginnend met de penetratie van de  stratum corneum  en beschadiging van 
de onderliggende keratinocytlagen. Uit de afstervende keratinocyten ko ­
men mediatoren vrij die de inflammatoire cascade veroorzaken die inwerkt op de cellen in de  dermis , in het bijzonder de stroma- en endotheliale 
cellen. Het zijn de dilatatie en verhoogde permeabiliteit van de endothe ­
liale cellen waardoor de waargenomen erytheem en oedeem ontstaan (24). 
De op RhE gebaseerde methoden meten de initiërende gebeurtenissen in de cascade.
 
12. De levensvatbaarheid van cellen wordt gemeten door enzymatische omzet ­
ting van de vitale kleurstof MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl ­
tetrazolium bromide, thiazolylblauw; CAS-nummer 298-93-1) in een 
blauw formazanzout dat kwantitatief wordt gemeten na extractie uit weef ­
sels (25). Irriterende chemische stoffen worden geïdentificeerd op hun vermogen om de levensvatbaarheid van cellen te reduceren tot minder 
dan gedefinieerde drempelwaarden (d.w.z. ≤ 50 %, voor GHS-/CLP-cate ­
gorie 2). Afhankelijk van het regelgevend kader waarin de resultaten van deze TM worden gebruikt, kunnen chemische stoffen die leiden tot een levensvatbaarheid van cellen van meer dan de gedefinieerde grenswaarde 
beschouwd worden als niet-irriterende stoffen (d.w.z. > 50 %, geen cate ­
gorie).
 
AANTONING VAN BEKWAAMHEID  
13. Voordat de drie gevalideerde methoden die aan deze TM voldoen, routi ­
nematig worden gebruikt, moeten laboratoria technische bekwaamheid aantonen, met gebruikmaking van de tien referentiestoffen die in tabel 1 
worden vermeld. Voor soortgelijke methoden die op grond van deze TM 
worden ontwikkeld of voor wijzigingen van enige van de drie gevalideerde methoden, moet aan de in aanhangsel 2 van deze TM beschreven presta ­
tienormvereisten worden voldaan, voordat de methode wordt gebruikt voor 
gereglementeerde tests.
 
14. Als onderdeel van deze bekwaamheidsdemonstratie wordt aanbevolen dat 
de gebruiker na ontvangst de door de fabrikant van het RhE-model ge ­
specificeerde barrière-eigenschappen van de weefsels verifieert. Dit is in het bijzonder van belang indien weefsels over lange afstanden/gedurende 
lange perioden zijn vervoerd. Zodra een methode met succes is opgezet en 
de bekwaamheid in het gebruik ervan is aangetoond, behoeft een derge ­
lijke verificatie niet routinematig te worden uitgevoerd. Echter, indien een methode routinematig wordt gebruikt, wordt aanbevolen om de barrière- 
eigenschappen op regelmatige basis te blijven toetsen.
 
Tabel 1  
Referentiestoffen  ( 1 ) 
Chemische stof CAS-nr. In-vivoscore (  2 ) Fysische toestand VN-GHS-/EU- 
CLP-categorie  
Naftaleenazijnzuur 86-87-3 0 vast geen cat. 
isopropanol 67-63-0 0,3 vloeibaar geen cat.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Chemische stof CAS-nr. In-vivoscore (  2 ) Fysische toestand VN-GHS-/EU- 
CLP-categorie  
Methylstearaat 112-61-8 1 vast geen cat. 
Heptylbutyraat 5870-93-9 1,7 vloeibaar geen cat. 
(optionele cat. 
3) ( 3 ) ( 4 ) 
Hexylsalicylaat 6259-76-3 2 vloeibaar geen cat. 
(optionele cat. 
3) ( 3 ) ( 4 ) 
Cyclamenaldehyde 103-95-7 2,3 vloeibaar cat. 2 1-broomhexaan 111-25-1 2,7 vloeibaar cat. 2 
kaliumhydroxide (5 % water) 1310-58-3 3 vloeibaar cat. 2 
1-methyl-3-fenyl-1-piperazine 5271-27-2 3,3 vast cat. 2 Heptanal 111-71-7 3,4 vloeibaar cat. 2
 
( 1 ) Deze referentiestoffen zijn een subgroep van de in het valideringsonderzoek gebruikte referentiestoffen. 
( 2 ) In-vivoscore overeenkomstig B.4 en OESO-testrichtlijn 404 (4). 
( 3 ) Bij deze testmethode wordt de optionele GHS-categorie 3 (licht irriterende stoffen) (1) beschouwd als geen categorie. 
( 4 ) De optionele VN-GHS-categorie 3 is niet toepasbaar op grond van de CLP-verordening van de EU.  
PROCEDURE  
15. Het onderstaande is een beschrijving van de componenten en procedures 
van een RhE-methode voor beoordeling van huidirritatie. Een RhE-model 
moet gereconstrueerd zijn en kan in het laboratorium zelf worden ontwik ­
keld of in de handel worden verkregen. Standard Operating Procedures (SOP's) voor de RhE-methoden EpiSkin
 TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) en 
SkinEthic  TM zijn beschikbaar (26)(27)(28). Het testen moet op de vol ­
gende wijze worden uitgevoerd:  
Componenten van de RhE-Testmethode  
Algemene voorwaarden  
16. Om het epitheel op te bouwen moeten niet-getransformeerde humane ke ­
ratinocyten worden gebruikt. Er moeten verschillende lagen levende epi ­
theelcellen (basale laag,  stratum spinosum, stratum granulosum ) aanwezig 
zijn onder een functioneel  stratum corneum . Het  stratum corneum  moet uit 
meerdere lagen bestaan en het vereiste lipideprofiel hebben, zodat een sterke en functionele barrière wordt gevormd waar cytotoxische marker ­
stoffen, bv. natriumdodecylsulfaat (SDS) of Triton X-100, niet snel door ­
heen kunnen dringen. De barrièrefunctie kan beoordeeld worden door de 
concentratie te bepalen waarin een markerstof de levensvatbaarheid van het weefsel met 50 % doet dalen (IC
 50 ) na een vaste blootstellingstijd, of 
door de blootstellingstijd te bepalen die nodig is om de levensvatbaarheid 
van de cellen met 50 % te doen dalen (ET  50 ) bij aanbrenging van de 
markerstof in een bepaalde, vaste concentratie. De omsluitingseigenschap ­
pen van het model moeten voorkomen dat materiaal om het  stratum cor ­
neum  heen het levende weefsel kan bereiken. Dat zou een slecht model 
voor huidblootstelling opleveren. Het RhE-model mag niet verontreinigd 
zijn met bacteriën, virussen, mycoplasma of fungi.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Functionele voorwaarden  
Levensvatbaarheid  
17. De levensvatbaarheid wordt bij voorkeur gekwantificeerd door middel van 
de MTT-test (25). Gebruikers van het RhE-model moeten waarborgen dat 
iedere gebruikte batch van het RhE-model voldoet aan gedefinieerde cri ­
teria voor de negatieve controle (NC). De optische densiteit (OD) van het extractieoplosmiddel alleen moet voldoende klein zijn, d.w.z. OD< 0,1. 
Een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) voor de OD-waarden 
van de negatieve controle (onder de voorwaarden van de huidirritatietest ­
methode) is vastgesteld door de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model en de aanvaardbaarheidsbereiken voor de drie gevalideerde 
methoden worden in tabel 2 gegeven. Er dient te worden gedocumenteerd 
dat de weefsels die in de negatieve controle worden gebruikt gedurende de volledige blootstellingsperiode van de test in cultuur stabiel zijn (een ver ­
gelijkbare gemeten levensvatbaarheid opleveren).
 
Tabel 2  
Aanvaardbaarheidsbereiken voor OD-waarden in negatieve controle  
Ondergrens aanvaardbaarheid Bovengrens aanvaardbaarheid  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Barrièrefunctie  
18. Het  stratum corneum  met de daarin aanwezige lipiden dient sterk genoeg 
te zijn om snelle penetratie van cytotoxische markerstoffen, bv. SDS of 
Triton X-100, te weerstaan, wat wordt beoordeeld aan de hand van de IC  50 
of ET  50 (tabel 3).  
Morfologie  
19. Histologisch onderzoek van het RhE-model moet worden uitgevoerd om 
aan te tonen dat de structuur van het weefsel op die van de menselijke  
epidermis  lijkt (onder meer een meerlagig  stratum corneum ). 
Reproduceerbaarheid  
20. De resultaten van de positieve controlestof (PC) en negatieve 
controles (NC) van de testmethode moeten reproduceerbaar zijn in de tijd.  
Kwaliteitscontrole (QC)  
21. De ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model moet garanderen en aan ­
tonen dat iedere batch van het gebruikte RhE-model voldoet aan gedefini ­
eerde productievrijgavecriteria, waarvan die voor  levensvatbaarheid  (punt 
17), barrièrefunctie  (punt 18) en  morfologie  (punt 19) het meest relevant 
zijn. Deze gegevens moeten beschikbaar worden gesteld aan de gebruikers van de methode, zodat ze deze informatie kunnen opnemen in het testver ­
slag. Een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) voor de IC
 50 of 
de ET  50 moet door de ontwikkelaar/leverancier van het RhE-model worden 
vastgesteld (of door de onderzoeker die een in eigen laboratorium ontwik ­
keld model gebruikt). Een betrouwbare voorspelling van irritatie-effecten kan uitsluitend worden gedaan op grond van resultaten verkregen met deug ­
delijk weefsel. Bij wijze van voorbeeld zijn in tabel 3 de aanvaardbaarheids ­
bereiken voor de drie gevalideerde methoden gegeven.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabel 3  
Voorbeelden van QC-criteria voor batchvrijgave  
Ondergrens aanvaardbaarheid Bovengrens aanvaardbaarheid  
EpiSkin  TM (SM) 
(SDS-behandeling van 18 uur) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 hr ET  50 = 8,7 hr 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 hr ET  50 = 9,0 hr  
Het aanbrengen van de test- en controlestoffen  
22. Ten minste drie weefselmonsters moeten worden gebruikt voor iedere 
teststof en voor de controles in ieder experiment. Voor zowel vloeibare 
als vaste stoffen geldt dat er zo veel teststof moet worden aangebracht dat 
het epidermisoppervlak  gelijkmatig bedekt is, d.w.z. ten minste 25 μL/cm  2 
of 25 mg/cm  2 moet worden gebruikt, maar er mag geen oneindige dosis 
worden gebruikt. In het geval van vaste stoffen moet het  epidermisopper ­
vlak voor aanbrenging worden bevochtigd met gedeïoniseerd of gedestil ­
leerd water, om voor een goed contact van de teststof met het  epidermis ­
oppervlak  te zorgen. Indien mogelijk moeten vaste stoffen in de vorm van 
een fijn poeder worden getest. Aan het eind van de blootstellingsperiode 
moet de teststof zorgvuldig met waterige buffer of 0,9 % NaCl van het  
epidermisoppervlak  worden gewassen. Afhankelijk van welke van de drie 
gevalideerde RhE-methoden wordt gebruikt, varieert de blootstellingsperi ­
ode van 15 tot 60 minuten, en de incubatietemperatuur van 20 tot 37 °C. 
Deze blootstellingsperioden en temperaturen zijn voor iedere RhE-methode 
geoptimaliseerd en vertegenwoordigen de verschillende intrinsieke eigen ­
schappen van de methoden; zie voor details de Standard Operating Pro ­
cedures (SOP's) voor de methoden (26)(27)(28).  
23. In elk experiment moeten gelijktijdig uitgevoerde negatieve controles (NC) 
en positieve controles (PC) worden gebruikt om aan te tonen dat de 
levensvatbaarheid (met de NC), de barrièrefunctie en de resulterende ge ­
voeligheid (met de PC) van de weefsels binnen een gedefinieerd historisch aanvaardbaarheidsbereik liggen. Als PC-stof wordt een waterige SDS-oplossing van 5 % aanbevolen. Als NC-stoffen zijn water of met 
fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) geschikt.
 
Metingen van de levensvatbaarheid van de cellen  
24. Het belangrijkste aspect van de testprocedure is dat de levensvatbaarheid 
niet onmiddellijk na de blootstelling aan de teststoffen wordt gemeten, maar pas nadat de behandelde en gewassen weefsels voldoende lang 
zijn geïncubeerd in vers medium. Gedurende deze periode kan het weefsel 
herstellen van zwak irriterende effecten en vertonen zich duidelijke cyto ­
toxische effecten. In de optimaliseringsfase van de test (11) (12) (13) (14) (15) is gebleken dat een na-incubatie van 42 uur optimaal is.
 
25. De MTT-omzettingstest is een gevalideerde kwantitatieve methode, en de 
aangewezen methode voor het meten van de levensvatbaarheid van de cellen binnen deze TM. De test werkt goed met geconstrueerd driedimen ­
sionaal weefsel. Het huidmonster wordt 3 uur in een MTT-oplossing met 
een geschikte concentratie (bv. 0,3 - 1 mg/mL) gelegd. Het neergeslagen blauwe formazanproduct wordt vervolgens met een oplosmiddel (bv. is ­
opropanol, aangezuurde isopropanol) uit het weefsel geëxtraheerd, en de 
formazanconcentratie wordt bepaald door de OD te meten bij 570 nm, bij 
een bandbreedte van maximaal ongeveer 30 nm.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. De optische eigenschappen van de teststof of chemische effecten van de 
teststof op het MTT kunnen de test storen en tot een foutieve bepaling van 
de levensvatbaarheid leiden (omdat de teststof de kleurproductie kan voor ­
komen of omkeren, of juist veroorzaken). Dit kan gebeuren als een be ­
paalde teststof niet volledig van de huid wordt verwijderd door wassen, of 
als de stof in de  epidermis  penetreert. Als de teststof rechtstreekse effecten 
op het MTT heeft (MTT-reductie), zelf gekleurd is, of tijdens de weefsel ­
behandeling gekleurd raakt, moeten er aanvullende controles worden uit ­
gevoerd om storing van de levensvatbaarheidsmeting door de teststof te 
detecteren en daarvoor te corrigeren. Een gedetailleerde beschrijving van 
hoe rechtstreekse MTT-reductie kan worden gecorrigeerd, is te vinden in de SOP's voor de drie gevalideerde testmethoden (26)(27)(28).
 
Aanvaardbaarheidscriteria  
27. Bij elke test met deugdelijke weefselbatches (zie paragraaf 21) geeft de 
OD die men meet voor met NC behandelde weefsels, per definitie de kwaliteit weer van de weefsels die het hele proces van verzending en ontvangst, evenals alle stappen uit het irritatietestprotocol hebben door ­
gemaakt. De OD-waarden van controles mogen niet onder historisch vast ­
gestelde ondergrenzen komen. Evenzo komt het vermogen van de weefsels om op een irriterende stof te reageren onder de specifieke omstandigheden van de TM (26)(27)(28) tot uitdrukking in metingen met weefsels die met 
PC, d.w.z. 5 % waterige SDS-oplossing, zijn behandeld. Er moeten bij ­
behorende en geschikte grenzen voor de toegestane variabiliteit tussen weefselmonsters worden gedefinieerd (bv. als standaarddeviaties worden gebruikt moeten die binnen het eenzijdige tolerantie-interval van 95 % 
vallen dat berekend is op grond van historische gegevens). voor de stan ­
daarddeviaties van VRM < 18 %).
 
Interpretatie van de resultaten en voorspellingsmodel  
28. De met elke teststof verkregen OD-waarden kunnen worden gebruikt voor 
de berekening van een levensvatbaarheid die genormaliseerd is ten op ­
zichte van NC, die op 100 % wordt gesteld. De drempelwaarde van de procentuele levensvatbaarheid van de cellen die als scheiding tussen irri ­
terende en niet-geclassificeerde teststoffen fungeert, en de statistische pro ­
cedure(s) die worden gebruikt om de resultaten te evalueren en irriterende 
stoffen te identificeren, moeten duidelijk worden gespecificeerd en gedocu ­
menteerd, en de juistheid daarvan moet worden aangetoond. De drempel ­
waarden voor de voorspelling van irritatie zijn hieronder gegeven:
 
— de teststof wordt beschouwd als irriterend voor de huid overeenkom ­
stig VN-GHS-/EU-CLP-categorie 2, indien de levensvatbaarheid van 
het weefsel na blootstelling en na-incubatie minder is dan of gelijk is aan (≤) 50 %;
 
— afhankelijk van het regelgevend kader waarin de resultaten van deze 
TM worden gebruikt, mag de teststof als niet irriterend voor de huid 
worden beschouwd overeenkomstig de VN-GHS-/EU-CLP-categorie 
„Geen categorie”, indien de levensvatbaarheid van het weefsel na blootstelling en na-incubatie meer is dan (>) 50 %.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
29. Voor elk experiment moeten gegevens van individuele weefselmonsters 
(bv. de OD-waarden en de berekende procentuele levensvatbaarheid van 
de cellen voor elke teststof, met inbegrip van de indeling) in tabelvorm 
worden gerapporteerd, met vermelding van gegevens uit herhaalde experi ­
menten, indien van toepassing. Daarnaast moeten voor elk experiment gemiddelden ± standaarddeviatie worden vermeld. Waargenomen inter ­
acties met het MTT-reagens en gekleurde teststoffen moeten voor alle 
geteste stoffen worden gemeld.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Testverslag  
30. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Test- en controlestoffen:  
— de chemische naam of namen, zoals de CAS-naam en het 
CAS-nummer, alsmede de EG-naam en het EG-nummer, indien dit bekend is;
 
— de zuiverheid en de samenstelling van de stof (in gewichtsprocent(en));  
— de fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het 
onderzoek relevant zijn (bv. fysische toestand, stabiliteit en vluchtig ­
heid, pH, oplosbaarheid in water indien bekend);  
— de behandeling van de test-/controlestoffen voorafgaand aan de test, 
indien van toepassing (bv. verwarmen, fijnmalen);  
— bewaaromstandigheden.  
Motivering voor het gebruikte RhE-model en protocol  
Testomstandigheden:  
— het gebruikte celsysteem;  
— volledige ondersteunende informatie over het specifieke gebruikte 
huidmodel, met inbegrip van de deugdelijkheid daarvan. Hieronder moet ten minste informatie zijn over:
 
i) de levensvatbaarheid,  
ii) de barrièrefunctie,  
iii) de morfologie,  
iv) de reproduceerbaarheid en voorspelbaarheid,  
v) kwaliteitscontroles (QC) van het model;  
— gedetailleerde informatie over de gebruikte testprocedure;  
— de gebruikte testdoses, duur van de blootstelling en de na-incubatie;  
— een beschrijving van eventuele modificaties van de testprocedure;  
— verwijzingen naar historische gegevens over het model. Deze moeten 
ten minste omvatten:  
i) de aanvaardbaarheid van de QC-gegevens met verwijzing naar his ­
torische batchgegevens,  
ii) de aanvaardbaarheid van de waarden voor de positieve en negatieve 
controles met verwijzing naar gemiddelde waarden en bereiken van negatieve en positieve controles;
 
— een beschrijving van de gebruikte evaluatiecriteria inclusief een moti ­
vering van de geselecteerde drempelwaarde(n) voor het voorspellings ­
model;  
— verwijzingen naar historische controlegegevens;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Resultaten:  
— een tabel met de gegevens voor de individuele teststoffen voor ieder 
experiment en iedere meting van een weefselmonster;  
— indicatie van de controles die zijn gebruikt voor rechtstreeks 
MTT-reducerende stoffen en/of gekleurde teststoffen;  
— beschrijving van andere waargenomen effecten.  
Bespreking van de resultaten  
Conclusie  
LITERATUUR  
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York 
and Geneva. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_rev03/03files_e.html]  
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin 
irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC30), 9 april 2009. Available at: [http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu]  
(3) Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the 
Council of 16 december 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OJ L 353, 
31.12.2008, p. 1.
 
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 
430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 
16, 765-770.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107-114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests - An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.
 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.
 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the 
skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603- 
619. 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.
 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 april 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin mo ­
dels to  in vitro  skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.euro ­
pa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 november 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/do ­
cument/24/0,3746,en_2649_34377_4 7858904_1_1_1_1,00.html]  
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231-243.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55-63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min - 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Availa ­
ble at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42 bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
(30) Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical 
progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approxi ­
mation of laws, regulations and administrative provisions relating to the 
classification, packaging and labelling of dangerous substances, OJ L 225, 21.8.2001, p. 1.
 
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Con ­
tact Dermatitis 51, 1-4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359-365.  
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Der ­
matitis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Aanhangsel 1  
Definities  
Nauwkeurigheid:  de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met 
de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties 
van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „con ­
cordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (9).
 
Levensvatbaarheid van cellen:  een parameter waarmee de totale activiteit van een 
celpopulatie wordt gemeten, bv. het vermogen van cellulaire mitochondriale de ­
hydrogenases om de vitale kleurstof MTT (3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5-di ­
fenyltetrazoliumbromide, thiazolylblauw) te reduceren, dat, afhankelijk van het 
gemeten eindpunt en de opzet van de test, is gecorreleerd met het totale aantal 
levende cellen en/of de vitaliteit van de cellen.  
Concordantie:  dit is een maat voor de prestaties van de testmethode voor test ­
methoden die een categoriale uitkomst geven en het is één aspect van relevantie. Deze term en de term „nauwkeurigheid” worden vaak door elkaar gebruikt; de 
term wordt gedefinieerd als het percentage van alle geteste chemische stoffen die 
correct als positief of negatief worden geclassificeerd (9).
 
ET 50 : kan worden geraamd door vaststelling van de blootstellingstijd die nodig is 
om de levensvatbaarheid van de cellen met 50 % te doen dalen bij aanbrenging 
van de markerstof in een bepaalde, vaste concentratie. Zie ook IC  50 . 
EU CLP (Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de 
Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels):  voert in de Europese Unie (EU) het GHS-systeem van 
de VN uit dat chemicaliën (stoffen en mengsels) indeelt en etiketteert (3).
 
GHS (mondiaal geharmoniseerd classificatie- en etiketteringssysteem voor che ­
mische stoffen van de Verenigde Naties (VN)):  een systeem voor de indeling van 
chemische producten (stoffen en mengsels) op basis van gestandaardiseerde soor ­
ten en niveaus van gevaren van fysische aard en gevaren voor de gezondheid en 
het milieu, en dat de desbetreffende voorlichtingselementen bepaalt, zoals picto ­
grammen, signaalwoorden, gevarenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en vei ­
ligheidsinformatiebladen, waarmee informatie over de schadelijke effecten van de 
stoffen kenbaar wordt gemaakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werk ­
nemers, transporteurs, consumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te be ­
schermen (1).  
IC 50 : kan worden geraamd door vaststelling van de concentratie waarin een 
markerstof de levensvatbaarheid van de weefsels met 50 % doet dalen (IC  50 ) 
na een vaste blootstellingstijd. Zie ook ET  50 . 
Oneindige dosis:  hoeveelheid op de  epidermis  aangebrachte teststof die groter is 
dan de hoeveelheid die nodig is om het  epidermisoppervlak  volledig en gelijk ­
matig te bedekken.  
„Me too”-test:  een informele uitdrukking voor een testmethode die in structureel 
en functioneel opzicht vergelijkbaar is met een gevalideerde en geaccepteerde testmethode. Een dergelijke testmethode zou geschikt zijn voor inhaalvalidering. 
Dit is een alternatieve benaming voor gelijksoortige testmethode (9).
 
Prestatienormen:  Normen, gebaseerd op een gevalideerde referentiemethode, die 
de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voor ­
gestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: i) essentiële componenten van de testmethode; ii) een 
minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn ge ­
bruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde testmethode aan te tonen; en iii) de nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidsniveaus die door de voor ­
gestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld aan 
de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn gebaseerd 
op de waarden die voor de gevalideerde testmethode zijn verkregen (9).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Referentiestoffen:  chemische stoffen die gebruikt worden in het valideringspro ­
ces, waarvan de responsen in het in-vitro- of in-vivoreferentietestsysteem of de 
doelsoort reeds bekend zijn. Deze chemische stoffen moeten representatief zijn voor de klassen van chemische stoffen waarvoor de testmethode zal worden gebruikt en moeten het volledige bereik van responses bestrijken dat verwacht 
kan worden van de chemische stoffen waarvoor de test gebruikt zal worden, van 
sterk tot zwak, tot negatief. Het kan nodig zijn om verschillende reeksen refe ­
rentiestoffen te gebruiken voor de verschillende fasen van het valideringsproces en voor verschillende testmethoden en -doeleinden (9).
 
Relevantie:  beschrijving van het verband van de test met het te onderzoeken 
effect en of de test betekenis heeft en nuttig is voor een bepaald doel. Het is 
de mate waarin de test het te onderzoeken biologische effect correct meet of voorspelt. Relevantie omvat een beoordeling van de nauwkeurigheid (concordan ­
tie) van een testmethode (9).
 
Betrouwbaarheid:  indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd 
volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium 
en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden toegepast. De betrouw ­
baarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumrepro ­
duceerbaarheid (9).  
Vervangende test:  een test, ontworpen ter vervanging van een voor de identificatie 
van gevaren en/of risicobeoordeling geaccepteerde en routinematig gebruikte test, waarvan is vastgesteld dat hij, in vergelijking met de geaccepteerde test, de ge ­
zondheid van mens of dier of het milieu, naargelang het geval, gelijke of betere 
bescherming biedt voor alle mogelijke testsituaties en chemische stoffen (9).
 
Gevoeligheid:  het percentage van alle positieve/actieve teststoffen dat door de 
test correct wordt ingedeeld. De gevoeligheid is een maat voor de nauwkeurig ­
heid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert en is een belangrijke factor voor de beoordeling van de relevantie van een testmethode (9).
 
Huidirritatie:  het ontstaan van reversibele weefselschade aan de huid na het 
aanbrengen van een testmateriaal gedurende maximaal vier uur. Huidirritatie is een lokaal optredende, niet-immunogene reactie die zich kort na stimulatie voor ­
doet (29). Het voornaamste kenmerk is dat het een reversibel proces is waarbij 
inflammatoire reacties en de meeste klinische symptomen van ontstekinggerela ­
teerde irritatie (erytheem, oedeem, jeuk en pijn) optreden.
 
Specificiteit:  het percentage van alle negatieve/inactieve teststoffen dat door de 
test correct wordt ingedeeld. De specificiteit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert, en is een belangrijke 
factor bij de beoordeling van de relevantie van een testmethode (9).
 
Trapsgewijze teststrategie:  teststrategie waarbij opeenvolgende testmethoden 
worden gebruikt; de in elke volgende stap geselecteerde testmethoden worden gekozen op basis van de resultaten van de vorige teststap (9).
 
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze TM wordt getest.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Aanhangsel 2  
Prestatienormen voor beoordeling van voorgestelde soortgelijke of 
gewijzigde  in vitro  testmethoden met gereconstrueerde humane  epidermis  
(RhE) voor de bepaling van huidirritatie  
INLEIDING  
1. Prestatienormen zijn bedoeld om mee te delen op welke grondslag kan 
worden vastgesteld dat nieuwe testmethoden, zowel niet-generieke metho ­
den (d.w.z. methoden die beschermd zijn door het auteursrecht, die een handelsmerk hebben en die geregistreerd zijn) als generieke methoden, bepaald kunnen worden teneinde voldoende nauwkeurigheid en betrouw ­
baarheid te bieden voor specifieke testdoeleinden. Deze prestatienormen, 
die gebaseerd zijn op gevalideerde en geaccepteerde testmethoden, kunnen worden gebruikt om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid te beoordelen van andere soortgelijke methoden (informeel „me too”-tests genoemd) die 
gebaseerd zijn op soortgelijke wetenschappelijke principes en die hetzelfde 
biologische of toxische effect meten of voorspellen (9).
 
2. Voordat gewijzigde methoden (d.w.z. voorgestelde potentiële verbeterin ­
gen van een goedgekeurde testmethode) gebruikt kunnen worden, moet 
een evaluatie worden uitgevoerd ter bepaling van het effect van de voor ­
gestelde wijzigingen op de prestaties van de test en de mate waarin der ­
gelijke wijzigingen de informatie beïnvloeden die beschikbaar is voor de 
andere componenten van het valideringsproces. Afhankelijk van de aard 
van de voorgestelde wijzigingen en hun aantal, de gegenereerde gegevens en ondersteunende documentatie voor deze wijzigingen, moeten ze onder ­
worpen worden aan hetzelfde valideringsproces als het voor een nieuwe 
test beschreven proces of, indien van toepassing, aan een beperkte beoor ­
deling van betrouwbaarheid en relevantie met gebruikmaking van geaccep ­
teerde prestatienormen (9).
 
3. Soortgelijke („me too”) of gewijzigde methoden van elk van de drie 
gevalideerde methoden (EpiSkin™ (aangeduid als de Validated Reference Method (VRM), gevalideerde referentiemethode), EpiDerm™ SIT (EPI- 200) en SkinEthic™ RHE) die zijn voorgesteld voor gebruik in het kader 
van deze testmethode, moeten worden beoordeeld om hun betrouwbaar ­
heid en nauwkeurigheid na te gaan met behulp van chemische stoffen die het volledige bereik van Draize-irritatiescores bestrijken. Wanneer de voor ­
gestelde soortgelijke of gewijzigde methoden zijn beoordeeld aan de hand 
van de 20 aanbevolen referentiestoffen van de prestatienormen (tabel 1), 
moeten ze betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidswaarden opleveren die vergelijkbaar zijn met of beter zijn dan die van de VRM (tabel 2) (2) (16). De te behalen betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidswaarden wor ­
den vermeld in de punten 8 tot 12 van dit aanhangsel. De groep refe ­
rentiestoffen omvat niet-geclassificeerde (VN GHS/EU CLP geen catego ­
rie) en geclassificeerde (VN GHS/EU CLP categorie 2) (1) stoffen, die verschillende chemische klassen vertegenwoordigen, zodat de betrouw ­
baarheid en nauwkeurigheid (gevoeligheid, specificiteit en algemene nauw ­
keurigheid) van de voorgestelde testmethode vergeleken kunnen worden met die van de VRM. Zowel de betrouwbaarheid van de methode als het vermogen om irriterende stoffen van VN GHS/EU CLP categorie 2 correct 
te identificeren en, afhankelijk van het regelgevingskader waarvoor gege ­
vens worden geproduceerd, ook het vermogen om stoffen van VN GHS/EU CLP geen categorie correct te identificeren, moeten worden be ­
paald voordat de methode kan worden gebruikt voor het testen van nieuwe 
stoffen.
 
4. Deze prestatienormen zijn gebaseerd op de prestatienormen van het 
EC-CEVMA (8), bijgewerkt volgens de VN-GHS- en EU-CLP-systemen 
betreffende indeling en etikettering (1) (3). De oorspronkelijke prestatie ­
normen werden vastgesteld na voltooiing van het valideringsonderzoek (21) en werden gebaseerd op het classificatiesysteem van de EU als be ­
paald in Richtlijn 2001/59/EG van de Commissie van 6 augustus 2001 tot 
achtentwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richt ­
lijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het 
kenmerken van gevaarlijke stoffen (
 1 ). Omwille van de aanname van het  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) PB L 225 van 21.8.2001, blz. 1
 VN-GHS-systeem voor indeling en etikettering in de EU (EU CLP) (3), 
die plaatsvond tussen de voltooiing van het valideringsonderzoek en de 
voltooiing van deze TM, werden de pretatienormen bijgewerkt (8). Deze bijwerking betrof voornamelijk wijzigingen (i) in de reeks referentiestoffen voor de prestatienormen, en (ii) aan de vastgestelde betrouwbaarheids- en 
nauwkeurigheidswaarden (2) (23).
 
PRESTATIENORMEN VOOR IN-VITRO-RhE-TESTMETHODEN VOOR 
HUIDIRRITATIE  
5. De prestatienormen omvatten de volgende drie elementen (9):  
I) essentiële componenten van de testmethode;  
II) minimumlijst van referentiestoffen;  
III) vastgestelde betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidswaarden.  
I) Essentiële componenten van de testmethode  
6. Deze bestaan uit essentiële structurele, functionele en procedurele com ­
ponenten van een gevalideerde methode die moeten worden opgenomen in 
het protocol van een voorgestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht 
soortgelijke of gewijzigde methode. Deze componenten omvatten unieke kenmerken van de methode, cruciale procedurele gegevens en metingen in het kader van de kwaliteitscontrole. Het vasthouden aan essentiële com ­
ponenten van de testmethode zorgt ervoor dat een soortgelijke of gewij ­
zigde voorgestelde methode uitgaat van dezelfde begrippen als de bijbeho ­
rende VRM (9). De essentiële componenten van de testmethode worden uitvoerig beschreven in de punten 16 tot 21 van de TM en het testen moet 
als volgt plaatsvinden:
 
— De algemene voorwaarden (punt 16)  
— De functionele voorwaarden, namelijk:  
— levensvatbaarheid (punt 17);  
— barrièrefunctie (punt 18);  
— morfologie (punt 19);  
— reproduceerbaarheid (punt 20); en  
— kwaliteitscontrole (punt 21).  
II) Minimumlijst van referentiestoffen  
7. Referentiestoffen worden gebruikt om na te gaan of de betrouwbaarheid en 
nauwkeurigheid van een voorgestelde soortgelijke of gewijzigde methode, waarvan is aangetoond dat deze in structureel en functioneel opzicht vol ­
doende gelijkt op de VRM, of die een kleine wijziging aan een van de drie 
gevalideerde methoden aanbrengt, vergelijkbaar zijn als of beter zijn dan de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de VRM (2) (8) (16) (23). De 20 aanbevolen referentiestoffen die in tabel 1 worden opgesomd, omvatten 
stoffen uit verschillende chemische klassen (d.w.z. chemische categorieën 
op basis van functionele groepen), die het volledige bereik van Draize-irritatiescores bestrijken (van niet-irriterend tot sterk irriterend). De in deze lijst opgenomen stoffen omvatten 10 stoffen ingedeeld bij 
VN GHS/EU-CLP categorie 2 en 10 niet in een categorie ingedeelde 
stoffen, waarvan er drie optioneel worden ingedeeld bij VN GHS categorie 3. In het kader van deze testmethode wordt de optionele categorie 3 beschouwd als „geen categorie”. De in tabel 1 opgenomen stoffen zijn 
geselecteerd uit de stoffen die worden gebruikt tijdens de optimalisatiefase 
die volgde op de prevalidering en in het valideringsonderzoek van de VRM, met betrekking tot hun chemische functionaliteit en fysische toe ­
stand (14) (18). Deze referentiestoffen vormen het minimumaantal stoffen 
dat gebruikt moet worden voor de evaluatie van de nauwkeurigheid en 
betrouwbaarheid van een voorgestelde soortgelijke of gewijzigde methode,
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
maar mogen niet worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe me ­
thoden. Wanneer een stof uit de lijst niet beschikbaar is, kan een andere 
stof waarvoor voldoende in-vivoreferentiegegevens beschikbaar zijn, wor ­
den gebruikt, voornamelijk een van de stoffen die zijn gebruikt in de optimaliseringsfase na de prevalidering of het valideringsonderzoek van 
de VRM. Indien gewenst, kan de minimumlijst van referentiestoffen wor ­
den uitgebreid met stoffen die andere chemische klassen vertegenwoordi ­
gen en waarvoor voldoende in-vivoreferentiegegevens beschikbaar zijn, om de nauwkeurigheid van de voorgestelde methode nader te evalueren.
 
Tabel 1  
Minimumlijst van referentiestoffen voor de bepaling van de nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidswaarden van 
soortgelijke of gewijzigde huidirritatiemethoden met gereconstrueerde humane epidermis (RhE)  ( 1 ) 
Chemische stof CAS-nummer Fysische toestand In-vivo-score VRM in vitro cat. VN GHS/EU CLP in 
vivo cat.  
1-broom-4-chloorbutaan 6940-78-9 vloeibaar 0 cat. 2 geen cat. 
diethylftalaat 84-66-2 vloeibaar 0 geen cat. geen cat. 
naftaleenazijnzuur 86-87-3 vast 0 geen cat. geen cat. allylfenoxyacetaat 7493-74-5 vloeibaar 0,3 geen cat. geen cat. 
isopropanol 67-63-0 vloeibaar 0,3 geen cat. geen cat. 
4-methylthiobenzaldehyde 3446-89-7 vloeibaar 1 cat. 2 geen cat. methylstearaat 112-61-8 vast 1 geen cat. geen cat. heptylbutyraat 5870-93-9 vloeibaar 1,7 geen cat. geen cat. 
hexylsalicylaat 6259-76-3 vloeibaar 2 geen cat. geen cat. 
cinnamaldehyde 104-55-2 vloeibaar 2 cat. 2 geen cat. 
(optionele cat. 
3) (
 3 ) 
1-decanol (  ( 2 ) 112-30-1 vloeibaar 2,3 cat. 2 cat. 2  
cyclamenaldehyde 103-95-7 vloeibaar 2,3 cat. 2 cat. 2 1-broomhexaan 111-25-1 vloeibaar 2,7 cat. 2 cat. 2 2-chloormethyl-3,5-dimethyl- 
4-methoxypyridine HCl 86604-75-3 vast 2,7 cat. 2 cat. 2  
di-n-propyldisulfide (  (
 2 ) 629-19-6 vloeibaar 3 geen cat. cat. 2  
kaliumhydroxide (5 % water) 1310-58-3 vloeibaar 3 cat. 2 cat. 2 benzeenethiol, 5-(1,1-di ­
methylethyl)-2-methyl 7340-90-1 vloeibaar 3,3 cat. 2 cat. 2 
1-methyl-3-fenyl-1-pipera ­
zine 5271-27-2 vast 3,3 cat. 2 cat. 2
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Chemische stof CAS-nummer Fysische toestand In-vivo-score VRM in vitro cat. VN GHS/EU CLP in 
vivo cat.  
heptanal 111-71-7 vloeibaar 3,4 cat. 2 cat. 2 
tetrachloorethyleen 127-18-4 vloeibaar 4 cat. 2 cat. 2  
( 1 ) De chemische stoffen zijn gekozen aan de hand van de volgende criteria: i) de stoffen zijn verkrijgbaar in de handel; ii) ze 
bestrijken het volledige bereik van Draize-irritatiescores (van niet-irriterend tot sterk irriterend); iii) de chemische struct uur van de 
stoffen is goed omschreven; iv) ze zijn representatief voor de chemische functionaliteit die in het valideringsproces is gebrui kt; en 
v) ze kennen geen extreem toxisch profiel (bv. carcinogeen of toxisch voor het voortplantingssysteem) en er zijn ook geen buitensporige verwijderingskosten aan verbonden. 
(
 2 ) Stoffen die irriterend zijn voor konijnen, maar waarvoor betrouwbaar bewijs is dat ze niet-irriterend zijn voor mensen (31) ( 32) 
(33). 
( 3 ) Volgens de VN GHS, niet in de EU CLP ()  
III) Vastgestelde betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidswaarden  
8. Teneinde de betrouwbaarheid en relevantie vast te stellen van voorgestelde 
soortgelijke of gewijzigde methoden die tussen laboratoria worden over ­
gedragen, moeten de 20 referentiestoffen uit tabel 1 in ten minste drie laboratoria worden getest. Indien de voorgestelde methode echter in slechts één laboratorium zal worden gebruikt, is het niet nodig om de methode te 
valideren aan de hand van tests in verschillende laboratoria. Het is echter 
van essentieel belang dat dergelijke valideringsonderzoeken onafhankelijk worden beoordeeld door internationaal erkende valideringsinstanties, in overeenstemming met internationale richtsnoeren (9). In elk laboratorium 
dienen alle 20 referentiestoffen te worden getest in drie onafhankelijke 
experimenten met verschillende weefselbatches en op tijdstippen die vol ­
doende ver uit elkaar liggen. Elk experiment moet bestaan uit minstens drie gelijktijdig geteste weefselmonsters voor elke opgenomen teststof, 
negatieve controle (NC) en positieve controle (PC).
 
9. De betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidswaarden van de voorgestelde 
methode moeten worden berekend met inachtneming van alle vier de onderstaande criteria, waardoor de betrouwbaarheids- en relevantiewaarden 
op een vooraf gedefinieerde en consistente manier worden berekend:
 
1. Alleen de gegevens van experimenten van volledige reeksen komen in 
aanmerking voor de berekening van de methode voor variabiliteit en voorspellingskracht (nauwkeurigheid) binnen een laboratorium en tus ­
sen laboratoria.
 
2. In elk deelnemend laboratorium moet de uiteindelijke classificatie van 
elke referentiestof plaatsvinden op basis van de gemiddelde levensvat ­
baarheid over de verschillende experimenten van een volledige reeks.  
3. Alleen de gegevens verkregen voor stoffen met volledige reeksen ex ­
perimenten in alle deelnemende laboratoria komen in aanmerking voor 
de berekening van de methode voor variabiliteit tussen laboratoria.  
4. De nauwkeurigheidswaarden moeten worden berekend op basis van de 
afzonderlijke laboratoriumvoorspellingen die de verschillende deel ­
nemende laboratoria hebben verkregen voor de 20 referentiestoffen.  
In dit verband bestaat een  reeks experimenten  uit drie afzonderlijke ex ­
perimenten van één laboratorium voor één teststof. Een  volledige reeks 
experimenten  is een reeks experimenten van één laboratorium voor één 
teststof waarbij de drie experimenten allemaal geldig zijn. Dit betekent dat één ongeldig experiment een volledige reeks van drie experimenten ongel ­
dig maakt.
 
Intralaboratoriumreproduceerbaarheid  
10. Een beoordeling van intralaboratoriumreproduceerbaarheid zou een con ­
cordantie van ten minste ( ≥) 90 % moeten vertonen tussen de classificaties 
van de 20 referentiestoffen (VN GHS/EU CLP categorie 2 en geen cate ­
gorie) die in verschillende, onafhankelijke experimenten binnen één labo ­
ratorium tot stand zijn gekomen.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Interlaboratoriumreproduceerbaarheid  
11. Het is niet nodig de interlaboratoriumreproduceerbaarheid te beoordelen 
als de voorgestelde methode in slechts één laboratorium zal worden ge ­
bruikt; Voor methoden die tussen laboratoria moeten worden overgedra ­
gen, moet de concordantie van classificaties van de 20 referentiestoffen (VN GHS/EU CLP categorie 2 en geen categorie) die tot stand zijn ge ­
komen in verschillende, onafhankelijke experimenten in bij voorkeur mini ­
maal drie laboratoria, ten minste ( ≥) 80 % zijn.
 
Voorspellingskracht (nauwkeurigheid)  
12. De nauwkeurigheid (gevoeligheid, specificiteit en algemene nauwkeurig ­
heid) van de voorgestelde soortgelijke of gewijzigde methode moet ver ­
gelijkbaar zijn met of beter zijn dan die van de VRM, rekening houdend met aanvullende informatie betreffende de relevantie in de onderzochte 
soort (tabel 2). De gevoeligheid moet ten minste ( ≥) 80 % zijn (2) (8) 
(23). Een bijkomende specifieke beperking geldt echter voor de gevoelig ­
heid van de voorgestelde in-vitromethode, omdat slechts twee in-vivostoffen van categorie 2,  1-decanol  en di-n-propyldisulfide  door 
meer dan één deelnemend laboratorium verkeerdelijk ingedeeld kunnen 
worden als „geen categorie”. De specificiteit moet ten minste ( ≥) 70 % 
zijn (2) (8) (23). Er zijn geen verdere beperkingen met betrekking tot de specificiteit van de voorgestelde in-vitromethode, d.w.z. een deelnemend 
laboratorium kan eender welke in-vivostof die tot geen categorie behoort, 
verkeerdelijk indelen zolang de uiteindelijke specificiteit van de test ­
methode binnen het aanvaardbare bereik blijft. De algemene nauwkeurig ­
heid moet ten minste ( ≥) 75 % zijn (2) (8) (23). Hoewel de gevoeligheid 
van de VRM die is berekend voor de 20 referentiestoffen in tabel 1 gelijk 
is aan 90 %, wordt de vastgestelde minimale gevoeligheidswaarde die vereist is voor een soortgelijke of gewijzigde methode vastgesteld op 80 % opdat deze geldig zou worden beschouwd, aangezien zowel  1-deca­
nol (een grensgeval) en  di-n-propyldisulfide  (een valsnegatief van de 
VRM) erom bekend staan dat zij niet-irriterend zijn voor mensen (31) (32) (33), hoewel ze in de proef met konijnen als irriterende stoffen zijn aangemerkt. Aangezien RhE-modellen uitgaan van cellen van humane oor ­
sprong, kunnen ze voorspellen dat deze stoffen niet-irriterend zijn (VN 
GHS/EU CLP geen categorie).
 
Tabel 2  
Voorspellingswaarden voor gevoeligheid, specificiteit en algemene nauwkeurigheid die vereist 
zijn opdat soortgelijke of gewijzigde methoden geldig worden geacht.  
Gevoeligheid Specificiteit Algemene nauwkeurigheid  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Acceptatiecriteria van het onderzoek  
13. Het is mogelijk dat een of meer tests betreffende een of meer teststoffen 
niet voldoen aan de acceptatiecriteria van de test- en controlestoffen of dat 
zij om andere redenen niet aanvaardbaar zijn. Voor elke teststof mogen ten 
hoogste twee aanvullende tests worden verricht om ontbrekende gegevens aan te vullen („hertesten”). Omdat bij hertesten ook PC en NC gelijktijdig moeten worden getest, mogen met name voor elke teststof ten hoogste 
twee aanvullende experimenten worden verricht.
 
14. Het is denkbaar dat het minimumaantal van drie geldige experimenten 
voor elke geteste stof zelfs na hertesten niet wordt bereikt voor elke refe ­
rentiestof in elk deelnemend laboratorium, wat leidt tot een onvolledige 
gegevensmatrix. In zulke gevallen worden de gegevensreeksen uitsluitend aanvaardbaar geacht als aan de volgende drie criteria is voldaan:
 
1. Op alle 20 referentiestoffen moet ten minste één volledige reeks experi ­
menten zijn verricht.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. In elk van de ten minste drie deelnemende laboratoria moet ten minste 
85 % van de reeksen experimenten volledig zijn (voor 20 stoffen; 
d.w.z. in één laboratorium zijn 3 ongeldige reeksen experimenten toe ­
gestaan).  
3. Ten minste 90 % van alle mogelijke reeksen experimenten van ten 
minste drie laboratoria moet volledig zijn (voor 20 stoffen getest in 3 
laboratoria; d.w.z. in totaal zijn 6 ongeldige reeksen experimenten toe ­
gestaan).  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B.47  BOVINE CORNEAL OPACITY AND PERMEABILITY (BCOP-) 
TESTMETHODE VOOR DE IDENTIFICATIE VAN VOOR DE OGEN CORROSIEVE EN HEVIG IRRITERENDE STOFFEN
 
INLEIDING  
01. De BCOP-testmethode is een  in-vitro testmethode die, onder bepaalde om ­
standigheden en met bepaalde beperkingen, kan worden gebruikt om stoffen en mengsels in te delen als „voor de ogen corrosief en hevig irriterend” (1) (2) (3). Voor het doel van deze testmethode worden hevig irriterende stoffen 
gedefinieerd als stoffen die bij konijnen oogletsels veroorzaken die minstens 
21 dagen na de aanbrenging voortduren. Hoewel BCOP niet als een vol ­
waardige vervanger voor de  in-vivo -oogtest bij konijnen wordt beschouwd, 
wordt deze methode toch aangeraden als onderdeel van een trapsgewijze 
teststrategie voor de indeling en etikettering volgens de regelgeving binnen 
een bepaald toepassingsgebied (4) (5). Teststoffen en –mengsels (6) kunnen worden ingedeeld als voor de ogen corrosieve of hevig irriterende stoffen zonder bijkomende testen op konijnen. Een stof die negatief test, dient op 
konijnen te worden getest met een sequentiële teststrategie zoals uiteengezet 
in de technische richtsnoeren van de OESO (OECD Test Guidelines 405 (7) - zie hoofdstuk B.5 van deze bijlage).
 
02. Het doel van deze testmethode is het beschrijven van de procedures die 
worden gebruikt om de mogelijke corrosie of hevige irritatie van een teststof voor de ogen te beoordelen aan de hand van het vermogen van deze stof om troebelheid en verhoogde permeabiliteit in een afgezonderde boviene cornea 
te veroorzaken. Toxische effecten op de cornea worden als volgt gemeten: 
(i) verminderde lichttransmissie (troebelheid) en (ii) verhoogde doorlating van natriumfluoresceïne (permeabiliteit). De beoordelingen van de troebel ­
heid en permeabiliteit van de cornea na blootstelling aan een teststof worden 
samengevoegd om een  in-vitro -irritatiescore (IVIS) af te leiden die gebruikt 
wordt om het irritatieniveau van de teststof te bepalen.
 
03. Voor de ogen irriterende stoffen die letsels veroorzaken die in minder dan 
21 dagen verdwijnen en stoffen die niet-irriterend zijn, werden ook getest 
met de BCOP-testmethode. De nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de BCOP-testmethode voor stoffen van deze klassen werden echter nog niet formeel beoordeeld.
 
04. Definities worden gegeven in bijlage 1.  
TOELICHTING EN BEPERKINGEN  
05. Deze testmethode is gebaseerd op het protocol van de BCOP-testmethode 
van het Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alterna ­
tive Methods (ICCVAM) (8) dat ontwikkeld werd naar aanleiding van een 
internationale valideringsstudie (4)(5)(9) met bijdragen van het European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) en het Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM). Het protocol is 
gebaseerd op van het Institute for In Vitro Sciences (IIVS) en INVITTOX 
Protocol 124 (10) verkregen informatie die het door de Europese Gemeen ­
schap gesteunde protocol vertegenwoordigt dat gebruikt werd voor het pre ­
valideringsonderzoek van het in 1997-1998 gevoerde BCOP-onderzoek. 
Beide protocollen zijn gebaseerd op de BCOP-onderzoeksmethodologie 
die voor het eerst werd beschreven door Gautheron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
06. De geïdentificeerde beperkingen van deze testmethode zijn gebaseerd op het 
grote aantal vals-positieve resultaten voor alcoholen en ketonen en het grote 
aantal vals-negatieve resultaten voor vaste stoffen die werden waargenomen in de valideringsgegevensbank (zie paragraaf 44) (5). De nauwkeurigheid van BCOP in het EU-, EPA- en GHS-classificatiesysteem verbetert aan ­
zienlijk als stoffen die tot deze chemische en fysische klassen behoren uit 
de gegevensbank worden verwijderd (5). Op basis van het doel van dit onderzoek (d.w.z. het identificeren van enkel stoffen die corrosie/hevige irritatie aan de ogen veroorzaken) zijn vals-negatieve resultaten niet door ­
slaggevend aangezien deze stoffen nadien op konijnen of met andere gevali ­
deerde  in-vitro testen, afhankelijk van de geldende voorschriften, worden 
getest met behulp van een sequentiële teststrategie in een benadering met meervoudige bewijsvoering („weight of evidence” benadering). Bovendien 
liet de huidige valideringsgegevensbank geen ruimte voor een adequate 
beoordeling van sommige chemische producten of productklassen (bv. mengsels). Onderzoekers kunnen echter overwegen deze testmethode te ge ­
bruiken voor alle soorten testmateriaal (met inbegrip van mengsels) waarbij 
een positief resultaat kan worden aangenomen als een aanwijzing van een 
voor de ogen corrosieve of hevig irriterende respons. Positieve resultaten die verkregen werden met alcoholen of ketonen dienen echter met voorzichtig ­
heid te worden geïnterpreteerd omwille van het risico voor overpredictie.
 
07. Alle procedures met boviene ogen en cornea dienen de op de testinrichting 
toepasselijke regelgeving en procedures voor de behandeling van van dieren afkomstig materiaal na te leven, met inbegrip van maar niet beperkt tot 
weefsels en weefselvloeistoffen. Universele voorzorgsmaatregelen voor la ­
boratoria zijn aanbevolen (12).
 
08. Een beperking van de testmethode is dat deze methode weliswaar rekening 
houdt met sommige in de oogirritatietestmethode bij het konijn waargeno ­
men effecten op het oog en in bepaalde mate met hun ernst, maar dat ze geen rekening houdt met letsels van het ooglid en de iris. Hoewel de re ­
versibiliteit van hoornvliesletsels op zichzelf niet kan worden beoordeeld in 
het BCOP-onderzoek, werd eveneens voorgesteld, op basis van studies op de ogen van konijnen, dat een beoordeling van de aanvankelijke diepte van het hoornvliesletsel kan worden gebruikt om een onderscheid te maken 
tussen reversibele en irreversibele effecten (13). Tot slot kan de potentiële 
systemische toxiciteit die gepaard gaat met de blootstelling van het oog, met de BCOP-methode niet beoordeeld worden.
 
09. Er worden inspanningen geleverd om het nut en de beperkingen van het 
BCOP-onderzoek voor de identificatie van niet-hevig irriterende stoffen en niet-irriterende stoffen (zie ook paragraaf 45) verder te typeren. Gebruikers 
worden eveneens aangemoedigd om monsters en/of gegevens te leveren aan 
valideringsorganisaties voor een formele beoordeling van mogelijk toekom ­
stig gebruik van de BCOP-testmethode, met inbegrip van de identificatie van niet-hevig irriterende stoffen en niet-irriterende stoffen.
 
10. Elk laboratorium dat dit onderzoek voor het eerst opstelt, dient gebruik te 
maken van de in bijlage 2 voorziene chemicaliën voor bekwaamheidstoet ­
sing. Een laboratorium kan deze chemicaliën gebruiken om zijn technische 
bekwaamheden met betrekking tot het uitvoeren van de BCOP-testmethode 
aan te tonen vooraleer het BCOP-onderzoeksgegevens indient voor de wet ­
telijke gevarenclassificatie.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
11. De BCOP-testmethode is een organotypisch model dat handhaving op korte 
termijn van de normale fysiologische en biochemische werking van boviene cornea  in vitro  vereist. In deze testmethode wordt schade door de teststof 
beoordeeld door kwantitatieve metingen van de wijzigingen in de troebel ­
heid en permeabiliteit van de cornea door gebruik van een opacitometer, respectievelijk een VIS-spectrofotometer. Beide metingen worden gebruikt om een IVIS te berekenen die gebruikt wordt om een  in-vitro -irritatiegeva ­
renclassificatie toe te kennen voor de voorspelling van mogelijke  in-vivo - 
oogirritatie van een teststof (zie beslissingscriteria).
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. De BCOP-testmethode gebruikt afgezonderde cornea's van de ogen van pas 
geslacht vee. De troebelheid van cornea's wordt kwantitatief gemeten als de 
hoeveelheid lichttransmissie door de cornea. De permeabiliteit wordt kwan ­
titatief gemeten als de hoeveelheid natriumfluoresceïne die door de volledige dikte van de cornea passeert, wat gemeten wordt in het medium dat zich 
bevindt in de achterkamer. Teststoffen worden aangebracht op de epitheel ­
laag van de cornea door toevoeging aan de voorkamer van de corneahouder. Bijlage 3 geeft een beschrijving en een diagram van een corneahouder die wordt gebruikt in de BCOP. Corneahouders zijn verkrijgbaar in de handel of 
kunnen zelf worden gemaakt.
 
Bron en ouderdom van runderogen en selectie van diersoorten  
13. Vee dat naar de slachterij wordt gebracht, wordt meestal geslacht ofwel voor 
menselijke consumptie ofwel voor ander commercieel gebruik. Voor gebruik 
in BCOP worden enkel de cornea's van gezonde dieren die geschikt worden 
geacht voor de menselijke voedselketen in aanmerking genomen. Aangezien vee een grote verscheidenheid aan gewicht vertoont, afhankelijk van ras, leeftijd en geslacht, is er geen aanbevolen gewicht van het dier op het 
ogenblik van de slachting.
 
14. De afmetingen van de cornea's kunnen variëren als gevolg van het gebruik 
van de ogen van dieren van verschillende leeftijdscategorieën. Cornea's met 
een horizontale diameter van > 30,5 mm en een centrale corneale dikte (CCT) ≥ 1 100 μm zijn meestal afkomstig van vee dat ouder is dan 
acht jaar terwijl cornea's met een horizontale diameter van < 28,5 mm en 
een CCT < 900 μm meestal afkomstig zijn van vee dat jonger is dan vijf 
jaar (14). Om die reden worden doorgaans geen ogen gebruikt van vee dat ouder is dan 60 maanden. Ogen van vee jonger dan 12 maanden worden doorgaans niet gebruikt aangezien de ogen dan nog niet volgroeid zijn en de 
corneale dikte en diameter aanzienlijk kleiner zijn dan deze opgetekend voor 
ogen van volwassen vee. Het gebruik van cornea's van jonge dieren (d.w.z. 6 tot 12 maanden oud) is toegestaan aangezien hieraan voordelen verbonden zijn zoals grotere beschikbaarheid, een nauwe leeftijdsgroep en minder ge ­
vaar met betrekking tot de blootstelling van werknemers aan boviene spon ­
giforme encefalopathie (15). Aangezien nadere evaluatie van het effect van corneale grootte of dikte op de responsiviteit op corrosieve en irriterende stoffen nuttig kan zijn, worden gebruikers aangemoedigd om de geschatte 
leeftijd en/of het gewicht van de dieren waarvan de cornea's in onderzoek 
worden gebruikt, te rapporteren.
 
Verzameling en vervoer van ogen naar het laboratorium  
15. De ogen worden verzameld door werknemers van de slachterij. Om mecha ­
nische en andere vormen van oogschade te minimaliseren, dienen de ogen na de dood zo spoedig mogelijk verwijderd te worden. Om blootstelling van de ogen aan mogelijk irriterende stoffen te voorkomen, mogen de werk ­
nemers van de slachterij geen detergent gebruiken bij het afspoelen van de 
kop van het dier.
 
16. De ogen dienen onmiddellijk te worden ondergedompeld in Hanks’ Balan ­
ced Salt Solution (HBSS) in een houder van aangepaste grootte en naar het 
laboratorium te worden vervoerd op een wijze die bederf en/of bacteriële contaminatie minimaliseert. Omdat de ogen worden verzameld tijdens het slachtproces, is het mogelijk dat ze blootgesteld worden aan bloed en andere 
biologische stoffen zoals bacteriën en andere micro-organismen. Om die 
reden dient te worden verzekerd dat het risico op besmetting zo klein mogelijk is (bv. door de houder met de ogen op nat ijs te plaatsen, door antibiotica toe te voegen aan de HBSS die gebruikt wordt om de ogen 
tijdens het vervoer te bewaren [bv. penicilline aan 100 IU/ml en streptomy ­
cine aan 100 μg/ml]).
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Het tijdsinterval tussen de verzameling van de ogen en het gebruik van de 
cornea's in de BCOP dient te worden beperkt tot een minimum (gewoonlijk 
verzameling en gebruik dezelfde dag) en mag de onderzoeksresultaten niet in gevaar brengen. Deze resultaten zijn gebaseerd op de selectiecriteria voor de ogen alsook op de positieve en negatieve controleresponsen. Alle in het 
onderzoek gebruikte ogen dienen van dezelfde groep op een bepaalde dag 
verzamelde ogen te zijn.
 
Selectiecriteria voor in de BCOP-test gebruikte ogen  
18. In het laboratorium aangekomen, worden de ogen zorgvuldig onderzocht 
voor gebreken zoals verhoogde troebelheid, krassen en neovascularisatie. 
Enkel cornea's zonder deze gebreken mogen worden gebruikt.  
19. De kwaliteit van elke cornea wordt ook op latere tijdstippen van het onder ­
zoek beoordeeld. Cornea's met een troebelheid van meer dan zeven een ­
heden (OPMERKING: de opacitometer dient te worden geijkt met troebel ­
heidsnormen die worden gebruikt voor de vaststelling van de troebelheids ­
eenheden, zie bijlage 3) na een initiële equilibreerperiode van een uur, 
dienen te worden weggegooid.  
20. Elke behandelingsgroep (teststof, tegelijkertijd gemeten negatieve en posi ­
tieve controles) bevat minstens drie ogen. Drie cornea's dienen te worden 
gebruikt voor de negatieve controle in het BCOP-onderzoek. Aangezien alle 
cornea's uit de oogbol worden verwijderd en in de corneale kamers worden geplaatst, bestaat het risico voor artefacten door de behandeling van de individuele corneale troebelheids- en permeabiliteitswaarden (met inbegrip 
van de negatieve controle). Bovendien worden de troebelheids- en permea ­
biliteitswaarden van de cornea's van de negatieve controle gebruikt om de troebelheids- en permeabiliteitswaarden van het testartikel en de cornea's van de positieve controle in de IVIS-berekeningen te corrigeren.
 
PROCEDURE  
Voorbereiding van de ogen  
21. Cornea's zonder gebreken worden voorzichtig losgemaakt van de harde 
oogrok met een rand van 2 tot 3 mm, die nodig zal zijn voor de opeen ­
volgende handelingen, zodat geen schade ontstaat aan het corneale epitheel 
en endotheel. De afzonderlijke cornea's worden in een speciaal ontworpen 
corneahouder geplaatst die bestaat uit een voorkamer en een achterkamer die de epitheellaag, respectievelijk de endotheellaag van de cornea raken. Beide kamers zijn overvloedig gevuld met voorverwarmde Eagle’s Minimum Es ­
sential Medium (EMEM) (eerst de achterkamer) om de vorming van bellen 
te voorkomen. Het apparaat wordt dan geëquilibreerd op 32 ± 1 °C voor een periode van minstens één uur om de cornea's met het medium te laten equilibreren en een normale metabolische activiteit te bereiken voor zover 
mogelijk (de temperatuur van het hoornvliesoppervlak  in vivo  is 
ongeveer 32 °C).
 
22. Na het equilibreren wordt nieuwe voorverwarmde EMEM toegevoegd aan 
beide kamers en referentietroebelheidswaarden worden gemeten in elke cor ­
nea. Cornea's die macroscopische weefselschade (bv. krassen, pigmentatie, 
neovascularisatie) of een troebelheid > 7 eenheden vertonen, worden ver ­
wijderd. De gemiddelde troebelheid van alle geëquilibreerde cornea's wordt berekend. Minstens drie cornea's met troebelheidswaarden rond de mediaan voor alle cornea's worden geselecteerd als cornea's voor negatieve (of op ­
losmiddel-) controle. De resterende cornea's worden dan onderverdeeld in 
een behandelings- en een positieve-controlegroep.
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Aangezien de warmtecapaciteit van water groter is dan die van lucht, geeft 
water stabielere temperatuuromstandigheden voor incubatie. Om die reden 
wordt het gebruik van een waterbad aanbevolen om de temperatuur van de corneahouder met inhoud op 32 ± 1°C te houden. Luchtincubators kunnen echter ook worden gebruikt met de nodige voorzorgsmaatregelen voor be ­
houd van de temperatuurstabiliteit (bv. door voorverwarming van de hou ­
ders en media).
 
Aanbrengen van de teststof  
24. Twee verschillende behandelingsprotocollen worden gebruikt, één voor 
vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen (vaste stoffen en vloeistoffen), en één voor niet-oppervlakteactieve vaste stoffen.
 
25. Vloeistoffen worden onverdund getest. Oppervlakteactieve stoffen worden 
getest met een concentratie van 10 % g/v in een oplossing van 0,9 % 
natriumchloride, gedistilleerd water of een ander oplosmiddel waarvan ge ­
weten is dat het geen nadelig effect heeft op het testsysteem. Halfvaste stoffen, pasta’s en was worden getest op dezelfde wijze als vloeistoffen. 
Alternatieve verdunningen dienen te worden gemotiveerd. Cornea's worden 
blootgesteld aan vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen voor een periode van 10 minuten. Andere blootstellingsperioden dienen op adequate weten ­
schappelijke manier te worden gemotiveerd.
 
26. Niet-oppervlakteactieve stoffen worden gewoonlijk getest als oplossingen of 
suspensies met een concentratie van 20 % in een oplossing van 0,9 % 
natriumchloride, gedistilleerd water of een ander oplosmiddel waarvan ge ­
weten is dat het geen nadelig effect heeft op het testsysteem. In bepaalde 
omstandigheden en met de juiste wetenschappelijke verklaring, kunnen vaste 
stoffen ook zuiver getest worden door rechtstreekse aanbrenging op het cornea-oppervlak aan de hand van de open-kamermethode (zie paragraaf 29). Cornea's worden blootgesteld aan vaste stoffen voor een periode van 
vier uur maar, zoals bij vloeistoffen en oppervlakteactieve stoffen, kunnen 
alternatieve blootstellingsperioden gebruikt worden met de juiste weten ­
schappelijke motivering.
 
27. Verschillende behandelingsmethoden kunnen worden gebruikt afhankelijk 
van de fysische aard en chemische kenmerken (bv. vaste stoffen, vloeistof ­
fen, viskeuze of niet-viskeuze vloeistoffen) van de teststof. Essentieel is dat 
de teststof de hele epitheellaag bedekt en dat deze stof voldoende wordt verwijderd tijdens het uitwassen. Een gesloten-kamermethode wordt ge ­
woonlijk gebruikt voor niet-viskeuze tot licht-viskeuze vloeibare teststoffen, 
terwijl een open-kamermethode gewoonlijk wordt gebruikt voor 
semi-viskeuze en viskeuze vloeibare teststoffen en voor zuiver vaste stoffen.
 
28. In de gesloten-kamermethode wordt voldoende teststof (750 μL) om de 
epitheelzijde van de cornea te bedekken, ingebracht in de voorkamer via de doseergaten aan de bovenzijde van de kamer waarna de gaten tijdens de 
blootstelling met kamerstoppen worden verzegeld. Het is belangrijk na te 
gaan dat elke cornea gedurende het juiste tijdsinterval is blootgesteld aan een teststof.
 
29. In de open-kamermethode worden de afsluitring van het glas en het glas van 
de voorkamer verwijderd voor de behandeling. De controle- of teststof 
(750 μL of voldoende teststof om de cornea volledig te bedekken) wordt 
rechtstreeks op de epitheellaag van de cornea aangebracht met een micro ­
pipet. Als de teststof moeilijk te pipetteren is, kan de teststof onder druk worden geladen in een plunjerpipet om de dosering te vergemakkelijken. De 
pipetpunt van de plunjerpipet wordt ingebracht in de verdeelpunt van de 
spuit zodat het materiaal onder druk kan worden opgeladen in de verdeel ­
punt. Gelijktijdig worden de spuitplunjer ingedrukt en de pipetzuiger opge ­
trokken. Als er zich luchtbellen vormen in de pipetpunt, dan wordt het 
testartikel verwijderd (uitgedreven) en het proces herhaald tot de punt ge ­
vuld is zonder luchtbellen. Indien nodig, kan een gewone spuit (zonder naald) worden gebruikt aangezien hiermee een nauwkeurige hoeveelheid teststof kan worden gemeten en de teststof gemakkelijk op de epitheellaag 
van de cornea kan worden aangebracht. Na de dosering wordt het glas van 
de voorkamer teruggeplaatst om opnieuw een gesloten systeem te creëren.
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Incubatie na blootstelling  
30. Na de blootstellingsperiode worden de teststof, de negatieve-controle- of 
positieve-controlestof verwijderd uit de voorkamer en wordt het epitheel 
ten minste drie keer (of tot geen spoor van de teststof meer kan worden waargenomen) gewassen met EMEM (dat fenolrood bevat). Een medium dat fenolrood bevat, wordt voor het uitwassen gebruikt aangezien verkleuring 
van het fenolrood kan worden gecontroleerd om de doeltreffendheid van het 
uitwassen van zuurrijke of alkalische materialen te bepalen. De cornea's worden meer dan drie keer gewassen als het fenolrood nog steeds verkleurt (geel of purper) of als er nog teststof zichtbaar is. Zodra het medium vrij is 
van teststof, krijgen de cornea's een laatste uitwassing met EMEM (zonder 
fenolrood). EMEM (zonder fenolrood) wordt gebruikt als laatste uitwassing om te verzekeren dat alle fenolrood uit de voorkamer is verwijderd voordat de troebelheid wordt gemeten. De voorkamer wordt dan gevuld met nieuwe 
EMEM zonder fenolrood.
 
31. Voor vloeistoffen of oppervlakteactieve stoffen worden de cornea's eerst 
uitgewassen en vervolgens geïncubeerd op 32 ± 1°C voor een bijkomende 
periode van twee uur. Langere post-blootstellingstijd kan nuttig zijn in 
bepaalde omstandigheden en kan geval per geval worden beschouwd. Met vaste stoffen behandelde cornea's worden grondig uitgewassen na een bloot ­
stelling van vier uur maar hebben geen bijkomende incubatietijd nodig.
 
32. Aan het einde van de incubatietijd na blootstelling voor vloeistoffen en 
oppervlakteactieve stoffen en aan het einde van vier uur blootstelling voor niet-oppervlakteactieve vaste stoffen, worden de troebelheid en permeabili ­
teit van elke cornea opgetekend. Elke cornea wordt eveneens visueel geob ­
serveerd en relevante waarnemingen worden opgetekend (bv. loskomend 
weefsel, overblijvende teststof, niet-uniforme troebelheidspatronen). Deze waarnemingen kunnen belangrijk zijn aangezien ze kunnen worden weer ­
spiegeld door variaties in de metingen van de opacitometer.
 
Controlestoffen  
33. In elk experiment worden gelijktijdig negatieve controles of controles met 
oplosmiddel/medium en positieve controles uitgevoerd.  
34. Bij het testen van een vloeistof aan 100 %, wordt een gelijktijdige negatieve 
controle (d.w.z. 0,9 % natriumchlorideoplossing of gedistilleerd water) in de 
BCOP-testmethode opgenomen zodat niet-specifieke wijzigingen in het test ­
systeem kunnen worden opgespoord; dit levert tevens een referentiekader voor de eindpunten van het onderzoek. Het verzekert ook dat de omstandig ­
heden van het onderzoek niet op ongepaste wijze leiden tot een irriterende 
respons.
 
35. Bij het testen van een verdunde vloeistof, oppervlakteactieve stof of vaste 
stof, wordt gelijktijdig een controlegroep met een oplosmiddel/medium in de 
BCOP-testmethode opgenomen zodat niet-specifieke wijzigingen in het test ­
systeem kunnen worden opgespoord; dit levert tevens een referentiekader voor de eindpunten van het onderzoek. Er kunnen enkel oplosmiddelen/ ­
media worden gebruikt waarvan geweten is dat ze geen nadelig effect op het 
testsysteem hebben.
 
36. Een bekende voor de ogen irriterende stof wordt opgenomen in elk experi ­
ment als gelijktijdige positieve controle om na te gaan of de juiste respons 
wordt opgewekt. Aangezien het BCOP-onderzoek in deze testmethode wordt 
gebruikt om corrosieve en hevig irriterende stoffen te identificeren, is het best dat de positieve controle gebeurt met een stof die een hevige respons opwekt in deze testmethode. Om te verzekeren dat de variabiliteit in de 
positieve-controlerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag 
de grootte van irriterende respons niet buitensporig zijn.
 
37. Voorbeelden van positieve controles voor vloeibare teststoffen zijn di ­
methylformamide of 1 % natriumhydroxide. Een voorbeeld van een posi ­
tieve controle voor vaste teststoffen is 20 % (gewicht/volume) imidazool in 
0,9 % natriumchlorideoplossing.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. IJkstoffen zijn nuttig voor de beoordeling van potentiële oogirritatie bij 
onbekende chemicaliën uit een specifieke chemische klasse of productklasse, 
of voor de beoordeling van potentiële relatieve irritatie van een voor het oog irriterende stof binnen een reeks van irritatieresponsen.
 
Gemeten eindpunten  
39. De troebelheid wordt gemeten door de hoeveelheid lichttransmissie door de 
cornea. De corneale troebelheid wordt kwantitatief gemeten met behulp van 
een opacitometer. De resultaten zijn troebelheidswaarden op een continue 
schaal.  
40. De permeabiliteit wordt bepaald door de hoeveelheid natriumfluoresceïne 
die alle corneale cellagen penetreert (d.w.z. van de epitheellaag aan het 
buitenste corneale oppervlak tot de endotheellaag aan de binnenkant). 
1 ml natriumfluoresceïneoplossing (4 of 5 mg/ml voor vloeistoffen en op ­
pervlakteactieve stoffen respectievelijk niet-oppervlakteactieve vaste stoffen) wordt toegevoegd aan de voorkamer van de corneahouder, die in verbinding 
staat met de epitheelzijde van de cornea, terwijl de achterkamer, die in 
verbinding staat met de endotheelzijde van de cornea, gevuld is met nieuwe EMEM. De houder wordt dan gedurende 90 ± 5 min op 32 ± 1 °C geïncu ­
beerd in een horizontale positie. De hoeveelheid natriumfluoresceïne die 
doordringt naar de achterkamer wordt kwantitatief gemeten met behulp 
van UV/VIS-spectrofotometrie. Op 490 nm beoordeelde spectrofotometri ­
sche metingen worden opgetekend als optische dichtheid (OD
 490 ) of absorp ­
tiewaarden, die gemeten worden op een continue schaal. De permeabiliteits ­
waarden van fluoresceïne worden bepaald aan de hand van de OD  490 -waar­
den op basis van een VIS-spectrofotometer met een standaardweglengte van 1 cm.
 
41. Ook kan een 96-wells-microtiterplaatlezer gebruikt worden op voorwaarde 
dat (i) het lineaire bereik van de plaatlezer voor de vaststelling van fluores ­
ceïne OD  490 -waarden kan worden vastgesteld; en (ii) de juiste hoeveelheid 
fluoresceïnemonsters in de 96-wells-plaat wordt gebruikt om OD  490 -waarden 
te verkrijgen die gelijk zijn aan een standaardweglengte van 1 cm (hiervoor 
kan een volledige well noodzakelijk zijn [meestal 360mL]).  
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Evaluatie van de gegevens  
42. Zodra de troebelheids- en gemiddelde permeabiliteits-(OD  490 )waarden ge ­
corrigeerd zijn voor achtergrondtroebelheid en de permeabiliteits-OD  490 - 
waarden van de negatieve controle, dienen de gemiddelde troebelheids- en 
permeabiliteits-OD  490 -waarden voor elke behandelingsgroep als volgt sa ­
mengevoegd te worden in een empirisch afgeleide formule om voor elke behandelingsgroep een  in-vitro -irritatiescore (IVIS) te berekenen:
 
IVIS = gemiddelde troebelheidswaarde + (15 × gemiddelde 
permeabiliteits-OD  490 -waarde)  
Sina et al . (16) schreef dat deze formule afgeleid was tijdens onderzoeken in 
eigen laboratorium en interlaboratoriumonderzoeken. De gegevens die ge ­
genereerd werden voor een reeks van 36 verbindingen in een multilabora ­
toriumonderzoek werden onderworpen aan een multivariate analyse om de 
best passende verhouding tussen  in-vivo-  en in-vitro  gegevens te bepalen. 
Deze analyse werd uitgevoerd door wetenschappers van twee verschillende bedrijven die op ongeveer identieke verhoudingen uitkwamen.
 
43. De troebelheids- en permeabiliteitswaarden dienen ook onafhankelijk van 
elkaar beoordeeld te worden om te bepalen of een teststof corrosiviteit of 
hevige irritatie opwekt via slechts een van de twee eindpunten (zie beslis ­
singscriteria).  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Beslissingscriteria  
44. Een stof die een IVIS ≥ 55,1 opwekt, wordt gedefinieerd als een corrosieve 
of hevig irriterende stof. Zoals reeds in paragraaf 1 vermeld, dienen bij ­
komende testen te worden uitgevoerd om deze stof te kunnen indelen en etiketteren, indien de teststof niet geïdentificeerd werd als corrosief of hevig irriterend voor de ogen. De BCOP-testmethode heeft een algemene nauw ­
keurigheidsgraad van 79 % (113/143) tot 81 % (119/147), een percentage 
vals-positieve uitslagen van 19 % (20/103) tot 21 % (22/103) en een per ­
centage vals-negatieve uitslagen van 16 % (7/43) tot 25 % (10/40) in ver ­
gelijking met de gegevens van de  in-vivo testmethode op konijnenogen die 
ingedeeld zijn volgens de EPA- (1), EU- (2) of GHS- (3) classificatiesys ­
temen. Als stoffen binnen bepaalde chemische klassen (d.w.z. alcoholen, ketonen) of fysische klassen (d.w.z. vaste stoffen) uit de gegevensbank gesloten worden, dan varieert de nauwkeurigheid van BCOP tussen de 
EU-, EPA- en GHS-classificatiesystemen van 87 % (72/83) tot 92 % 
(78/85), het percentage vals-positieve uitslagen van 12 % (7/58) tot 16 % (9/56) en het percentage vals-negatieve uitslagen van 0 % (0/27) tot 12 % (3/26).
 
45. Zelfs indien een teststof geen classificatie als voor de ogen corrosief en 
hevig irriterend verkrijgt, dan nog kunnen BCOP-gegevens nuttig zijn in combinatie met testgegevens van de  in-vivo test op konijnenogen of van 
een degelijk gevalideerde  in-vitro test voor verdergaande beoordeling van 
het nut en de beperkingen van de BCOP-testmethode voor de identificatie 
van niet-hevig irriterende en niet-irriterende stoffen (een richtsnoer over het gebruik van  in-vitro toxiciteitstestmethoden op ogen is in voorbereiding).
 
Acceptatiecriteria van het onderzoek  
46. Een test wordt als aanvaardbaar beschouwd als de positieve controle een 
IVIS oplevert die tussen twee standaardafwijkingen van het huidige histo ­
rische gemiddelde valt, dat minstens om de drie maanden wordt bijgewerkt 
of telkens als een aanvaardbare test wordt uitgevoerd in laboratoria waar op onregelmatige basis testen worden uitgevoerd (d.w.z. minder dan een keer per maand). De negatieve-controlerespons of controlerespons met 
oplosmiddel/medium dient te resulteren in troebelheids- en permeabiliteits ­
waarden die lager zijn dan de vastgestelde bovengrenswaarden voor achter ­
grondtroebelheid en permeabiliteit voor boviene cornea’s die werden gebruikt voor de negatieve controle respectievelijk oplosmiddel/mediumcontrole.
 
Testverslag  
47. Het testverslag dient de volgende informatie te bevatten, indien relevant 
voor het voeren van het onderzoek:  
Test- en controlestoffen  
Chemische benaming(en) zoals de gestructureerde benaming gebruikt door 
de Chemical Abstracts Service (CAS), gevolgd door andere benamingen 
indien bekend.  
Het CAS-registratienummer (RN), indien bekend.  
Zuiverheid en samenstelling van de stof of het mengsel (in percentage(s) per 
gewicht) voor zover deze informatie beschikbaar is.  
Fysisch-chemische eigenschappen zoals de fysische staat, vluchtigheid, pH, 
stabiliteit, scheikundige klasse, oplosbaarheid in water, die van belang zijn 
voor het voeren van het onderzoek.  
Behandeling van de test-/controlestoffen voorafgaand aan de testen, indien 
van toepassing (bv. opwarming, malen).  
Stabiliteit, indien bekend.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informatie met betrekking tot de opdrachtgever en de testinstallatie  
Naam en adres van de opdrachtgever, testinstallatie en de directeur van het 
onderzoek.  
Identificatie van de herkomst van de ogen (d.w.z. de plaats waar ze ver ­
zameld werden).  
Opslag- en transportomstandigheden van de ogen (bv. datum en tijdstip van 
de verzameling, tijdsinterval tot aan de aanvang van de testen, transport ­
media en temperatuuromstandigheden, eventueel gebruikte antibiotica).  
Indien beschikbaar, specifieke kenmerken van de dieren waarvan de ogen 
werden verzameld (bv. leeftijd, geslacht, gewicht van het donordier).  
Motivering van de gebruikte testmethode en het gebruikte protocol  
Integriteit van de testmethode  
De gebruikte procedure ter verzekering van de integriteit (d.w.z. nauwkeu ­
righeid en betrouwbaarheid) van de testmethode in de tijd (d.w.z. periodiek testen van stoffen voor bekwaamheidstoetsing, gebruik van historische negatieve en positieve controlegegevens).
 
Criteria voor aanvaardbare test  
Aanvaardbare tegelijkertijd gemeten positieve en negatieve controlebereiken 
gebaseerd op historische gegevens.  
Indien van toepassing, aanvaardbare tegelijkertijd gemeten referentiecontro ­
lebereiken gebaseerd op historische gegevens.  
Testomstandigheden  
Beschrijving van het gebruikte testsysteem.  
Type gebruikte corneahouder.  
Informatie met betrekking tot de kalibratie voor apparaten die voor de 
meting van troebelheid en permeabiliteit worden gebruikt (bv. opacitometer en spectrofotometer).
 
Informatie over de gebruikte boviene cornea’s, met inbegrip van de ver ­
klaring betreffende hun kwaliteit.  
Gedetailleerde informatie over de gebruikte testprocedure.  
De gehanteerde concentratie(s) van de teststoffen.  
Beschrijving van enige wijziging van de testprocedure.  
Verwijzing naar historische gegevens van het model (bv. negatieve en 
positieve controles, stoffen voor de bekwaamheidstoetsing, ijkstoffen).  
Beschrijving van de gebruikte beoordelingscriteria.  
Resultaten  
Tabel met de gegevens van individuele testmonsters (bv. troebelheid en 
OD  490 -waarden en berekende IVIS voor de teststof en de positieve, nega ­
tieve en referentiecontroles [indien inbegrepen], weergegeven in tabelvorm, met inbegrip van gegevens van herhaalde experimenten met identieke mon ­
sters indien van toepassing, en gemiddelde ± de standaardafwijking voor elk 
experiment).
 
Beschrijving van andere waargenomen effecten.  
Bespreking van de resultaten  
Conclusies  
LITERATUUR  
0(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
0(2) Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de 
Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en 
verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1907/2006. PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1.
 
0(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Label ­
ling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Beschikbaar:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html].  
0(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Beschik ­
baar:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
0(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Beschikbaar:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
0(6) Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de 
Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor 
chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en 
houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 
93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie. PB L 396 van 
30.12.2006, blz. 1.
 
0(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Beschikbaar:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37 051368_ 
1_1_1_1,00.html].  
0(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Pro ­
tocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Beschikbaar:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
0(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity 
and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Re ­
search Triangle Park: National Toxicology Program. Beschikbaar:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm].  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Per ­
meability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: 
European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18: 442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the He ­
althcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Gui ­
deline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings. Beschikbaar:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36: 106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  Can. 
J. Zool.  73: 2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irrita ­
tion test using pharmaceutical intermediates.  Fundam. Appl. Toxicol  
26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Me ­
thod. Beschikbaar:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm].  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Beschikbaar:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm].  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Bijlage 1  
DEFINITIES  
Nauwkeurigheid:  de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met 
de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties 
van de testmethode en één aspect van „relevantie”. Deze term en de term „con ­
cordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt.
 
IJkstof:  een stof die gebruikt wordt als norm voor vergelijking met een teststof. 
Een ijkstof dient de volgende eigenschappen te hebben: (i) (een) constante en 
betrouwbare bron(nen); (ii) een structurele en functionele gelijkenis met de klasse 
stoffen die getest wordt; (iii) bekende fysische/chemische kenmerken; (iv) onder ­
steunende gegevens over bekende effecten en (v) een bekende werkzaamheid binnen het bereik van de gewenste respons.
 
Cornea:  het doorschijnende gedeelte van het voorste deel van de oogbal dat de 
iris en pupil bedekt en licht naar binnen toelaat.  
Corneale troebelheid:  meting van de mate van troebelheid van de cornea na 
blootstelling aan een teststof. Verhoogde corneale troebelheid is een aanwijzing 
voor schade aan de cornea. De troebelheid kan subjectief worden beoordeeld aan de hand van bijvoorbeeld de Draize-oogtest bij konijnen of objectief met een instrument zoals een „opacitometer”.
 
Corneale permeabiliteit:  kwantitatieve meting van de schade aan het hoorn ­
vliesepitheel door bepaling van de hoeveelheid natriumfluoresceïne die door 
alle corneale cellagen dringt.  
EPA-klasse 1:  corrosieve (irreversibele afbraak van oogweefsel) of corneale 
aandoening of irritatie die gedurende meer dan 21 dagen aanhoudt (1).  
EU-klasse R41:  veroorzaking van weefselschade aan het oog of ernstige fysische 
gezichtsvermindering na aanbrenging van een teststof op de voorste ooglaag die niet volledig reversibel is binnen 21 dagen na de aanbrenging (2).
 
Percentage vals-negatieve uitslagen:  het percentage van alle positieve stoffen 
dat door een testmethode onterecht als negatief wordt geïdentificeerd. Het is één 
indicator van de prestaties van de testmethode.  
Percentage vals-positieve uitslagen:  het percentage van alle negatieve stoffen 
dat door een testmethode onterecht als positief wordt geïdentificeerd. Het is één indicator van de prestaties van de testmethode.
 
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Che ­
micals):  een systeem voor de indeling van chemische producten (stoffen en 
mengsels) op basis van gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van 
fysische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetref ­
fende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, ge ­
varenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waar ­
mee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar wordt ge ­
maakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, con ­
sumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te beschermen (3).  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS-klasse 1:  veroorzaking van weefselschade aan het oog of ernstige fysische 
gezichtsvermindering na aanbrenging van een teststof op de voorste ooglaag, die 
niet volledig reversibel is binnen 21 dagen na de aanbrenging (3).  
Gevaar:  inherente eigenschap van een agens of situatie die schadelijke effecten 
kan veroorzaken als een organisme, systeem of (sub)populatie aan dit agens wordt blootgesteld.
 
In-vitro -irritatiescore (IVIS):  een empirisch afgeleide formule die gebruikt 
wordt in het BCOP-onderzoek waarbij de gemiddelde troebelheid en de gemid ­
delde permeabiliteit voor elke behandelingsgroep gecombineerd worden in één 
enkele  in-vitro score voor elke behandelingsgroep.  IVIS  = gemiddelde 
troebelheidswaarde + (15 x gemiddelde permeabiliteitswaarde)  
Negatieve controle:  een onbehandeld monster dat alle bestanddelen van een 
testsysteem bevat. Dit monster wordt tezamen met de met de teststof behandelde monsters en andere controlemonsters verwerkt om te bepalen of het oplosmiddel 
interageert met het testsysteem.
 
Niet-irriterend:  een stof die niet is ingedeeld als voor de ogen irriterende stof 
van EPA-klasse I, II, of III, EU-klasse R41 of R36 of GHS-klasse 1, 2A, of 2B.  
Voor de ogen corrosieve stof:  (a) een stof die irreversibele weefselschade ver ­
oorzaakt aan de ogen; (b) een stof die is ingedeeld als voor de ogen irriterende stof van GHS-klasse 1, EPA-klasse I of EU-klasse R41 (1) (2) (3).
 
Voor de ogen irriterende stof:  (a) een stof die een reversibele wijziging in het 
oog teweegbrengt na aanbrenging op het voorste oogoppervlak; (b) een stof die is 
ingedeeld als voor de ogen irriterende stof van EPA-klasse II of III, EU-klasse 
R36 of GHS-klasse 2A of 2B (1) (2) (3).  
Voor de ogen hevig irriterende stof:  (a) een stof die na aanbrenging op het 
voorste oogoppervlak weefselschade aan het oog veroorzaakt die meer dan 21 dagen na aanbrenging aanhoudt of die ernstige fysische gezichtsvermindering teweegbrengt; (b) een stof die is ingedeeld als voor de ogen irriterende stof 
van GHS-klasse 1, EPA-klasse I of EU-klasse R41 (1) (2) (3).
 
Opacitometer:  een instrument dat gebruikt wordt om de „corneale troebelheid” 
te meten door kwantitatieve beoordeling van lichttransmissie door de cornea. Gewoonlijk bestaat dit instrument uit twee compartimenten, elk met een eigen lichtbron en fotocel. Eén compartiment wordt gebruikt voor de behandelde cor ­
nea, terwijl het andere wordt gebruikt voor de ijking en de nulinstelling van het 
instrument. Licht van een halogeenlamp wordt door een controlecompartiment (lege kamer zonder vensters of vloeistof) naar een fotocel gestuurd en vergeleken met het licht dat door een experimenteel compartiment, bestaande uit de kamer 
met de cornea, naar een fotocel wordt gestuurd. Het verschil in lichttransmissie 
van de fotocellen wordt vergeleken en er wordt een numerieke troebelheids ­
waarde weergegeven op een digitaal scherm.
 
Positieve controle:  een monster met alle bestanddelen van een testsysteem dat 
met een stof behandeld werd waarvan bekend is dat deze een positieve respons opwekt. Om te verzekeren dat de variabiliteit in de positieve-controlerespons 
doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de „hevige irrita ­
tie”-respons niet buitensporig zijn.
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Betrouwbaarheid:  indicator van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd 
volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium 
en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouw ­
baarheid wordt bepaald door berekening van intra- en interlaboratoriumreprodu ­
ceerbaarheid en intralaboratoriumherhaalbaarheid.  
Controle met oplosmiddel/medium:  een onbehandeld monster dat alle com ­
ponenten bevat van een testsysteem, met inbegrip van het oplosmiddel of medi ­
um, dat tezamen met de met de teststof behandelde monsters en andere contro ­
lemonsters verwerkt wordt om de referentierespons voor de monsters die behan ­
deld werden met de in hetzelfde oplosmiddel of medium opgeloste teststof vast te 
stellen. Als dit monster getest wordt met een tegelijkertijd gemeten negatieve 
controle, toont het ook aan of het oplosmiddel of medium met het testsysteem interageert.
 
Trapsgewijs testen:  een trapsgewijze teststrategie waarbij alle bestaande infor ­
matie over een teststof in een bepaalde volgorde wordt herbezien aan de hand 
van een proces op basis van bewijskracht op elke trap om te bepalen of er 
voldoende informatie beschikbaar is voor een beslissing tot gevarenclassificatie, vooraleer wordt overgegaan tot de volgende trap. Indien het irritatiepotentieel van 
een teststof kan worden bepaald op basis van de bestaande informatie, dan zijn 
bijkomende testen niet vereist. Indien het irritatiepotentieel van een teststof niet kan worden bepaald op basis van de bestaande informatie, dan wordt een traps ­
gewijze testprocedure op dieren uitgevoerd tot een ondubbelzinnige indeling 
mogelijk is.
 
Gevalideerde testmethode:  een testmethode waarvoor valideringsonderzoeken 
werden gedaan om de relevantie (inclusief nauwkeurigheid) en betrouwbaarheid voor een bepaald doel te bepalen. Er dient te worden opgemerkt dat een gevali ­
deerde testmethode niet per definitie voldoende nauwkeurig en betrouwbaar is 
om aanvaardbaar te worden bevonden voor het voorgestelde doel.
 
Bewijskracht:  het proces waarbij de sterke en zwakke punten van verschillende 
gegevens worden onderzocht bij het komen tot en ondersteunen van een con ­
clusie met betrekking tot het gevarenpotentieel van een stof.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Bijlage 2  
Stoffen voor bekwaamheidstoetsing voor de BCOP-testmethode  
Vooraleer over te gaan tot routinegebruik van een testmethode die samenhangt 
met deze testmethode, kan het zijn dat laboratoria de technische bekwaamheid 
wensen aan te tonen door een correcte identificatie van de indeling als corrosief voor de ogen van de 10 stoffen die in tabel 1 worden aangeraden. Deze stoffen werden geselecteerd om een reeks responsen te vertegenwoordigen voor plaatse ­
lijke oogirritatie/-corrosie die gebaseerd is op de resultaten van de  in-vivo -oog­
testen op konijnen (TG 405) (d.w.z. klassen 1, 2A, 2B of niet ingedeeld en geëtiketteerd volgens de UN GHS (3) (7). Rekening houdend met het gevali ­
deerde nut van deze onderzoeken (d.w.z. enkel om voor de ogen corrosieve/hevig 
irriterende stoffen te identificeren), zijn er slechts twee testresultaten voor clas ­
sificatiedoeleinden (corrosief/hevig irriterend of niet-corrosief/niet-hevig irrite ­
rend) om bekwaamheid aan te tonen. Andere selectiecriteria zijn dat stoffen commercieel beschikbaar zijn, dat er  in-vivo referentiegegevens van zeer goede 
kwaliteit beschikbaar zijn, en dat er gegevens van zeer goede kwaliteit beschik ­
baar zijn van de twee  in-vitro methoden waarvoor op dit ogenblik testrichtsnoeren 
worden opgesteld. Om die reden werden irriterende stoffen geselecteerd van de ICCVAM-lijst van 122 aanbevolen ijkstoffen voor de validering van  in-vitro test­
methoden voor oogtoxiciteit (zie bijlage H: ICCVAM Recommended Reference 
Substances) (5). Referentiegegevens zijn beschikbaar in de ICCVAM Back ­
ground Review Documents for BCOP and Isolated Chicken Eye (ICE) test methods (17) (18).
 
Tabel 1  
Aanbevolen stoffen voor het aantonen van technische bekwaamheid met BCOP  
Stof CAS RN Chemische klasse (  1 ) Fysische 
vorm  In-vivo -classifi­
catie (  2 ) In-vitro -classificatie (  3 ) 
Benzalkonium ­
chloride (5 %) 8001-54-5 Onium-verbin ­
ding Vloeibaar Klasse 1 Corrosief/Hevig irriterend 
Chloorhexidine 55-56-1 Amine, amidine Vast Klasse 1 Corrosief/Hevig irriterend 
Dibenzoyl-L-wijn ­
steenzuur 2743-38-6 Carbonzuur, es ­
ter Vast Klasse 1 Corrosief/Hevig irriterend 
Imidazool 288-32-4 Hetero-cyclisch Vast Klasse 1 Corrosief/Hevig irriterend 
Trichloorazijn- 
zuur (30 %) 76-03-9 Carbonzuur Vloeibaar Klasse 1 Corrosief/Hevig irriterend 
2,6-Dichloor-ben ­
zoylchloride 4659-45-4 Acylhalo-genide Vloeibaar Klasse 2A Niet-corrosief/Niet-hevig 
irriterend 
Ethyl-2-methyla ­
ceto-acetaat 609-14-3 Keton, ester Vloeibaar Klasse 2B Niet-corrosief/Niet-hevig 
irriterend 
Ammonium-ni ­
traat 6484-52-2 Anorganisch 
zout Vast Klasse 2A Niet-corrosief/Niet-hevig 
irriterend  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Stof CAS RN Chemische klasse (  1 ) Fysische 
vorm  In-vivo -classifi­
catie (  2 ) In-vitro -classificatie (  3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alcohol Vloeibaar Niet in ­
gedeeld Niet-corrosief/Niet-hevig 
irriterend 
n-Hexaan 110-54-3 Koolwater-stof 
(acyclisch) Vloeibaar Niet in ­
gedeeld Niet-corrosief/Niet-hevig 
irriterend  
Afkortingen: CAS RN = Chemical Abstracts Service Registry Number. 
( 1 ) Scheikundige klassen werden toegekend aan elke teststof aan de hand van een standaardclassificatieschema gebaseerd op het 
classificatiesysteem van de National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (beschikbaar op: http//www.nlm.nih. 
gov/mesh). 
( 2 ) Gebaseerd op de resultaten van de  in-vivo -oogtest op konijnen (OESO TG 405) en aan de hand van de UN GHS (3)(7). 
( 3 ) Gebaseerd op resultaten in BCOP en ICE.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Bijlage 3  
DE BCOP-CORNEAHOUDER  
1. De BCOP-corneahouders zijn gemaakt van inert materiaal (bv. polypropy ­
leen). De houders bestaan uit twee helften (een voorste en een achterste 
kamer) en hebben twee gelijke cilindrische inwendige kamers. Elke kamer heeft een inhoud van 5 ml en is afgewerkt met een glazen venster waardoor de troebelheidsmetingen worden opgetekend. Elk van de inwendige kamers 
heeft een diameter van 1,7 cm en is 2,2 cm diep (
 1 ). De achterste kamer is 
voorzien van een o-ring om lekkage te voorkomen. De cornea's worden op de o-ring van de achterste kamers geplaatst met de endotheelzijde naar beneden en de voorste kamers worden op de epitheelzijde van de cornea's 
geplaatst. De kamers worden op hun plaats gehouden door drie schroeven 
van roestvrij staal die zich bevinden aan de randen van de kamer. Aan het einde van elke kamer bevindt zich een vensterglas dat verwijderd kan wor ­
den voor gemakkelijke toegang tot de cornea. Tussen het vensterglas en de 
kamer bevindt zich eveneens een o-ring om lekkage te voorkomen. Elke 
kamer heeft bovenaan twee openingen voor toevoeging en verwijdering van media en testverbindingen. Tijdens de behandeling en de incubatieperiode worden zij afgesloten met een rubberdop.
 
Legenda  
Glass disc: vensterglas  
PTFE-O-ring: PTFE-o-ring  
Refill: vulopening  
Hanger: houder  
Cap: rubberdop  
Nut: moer  
O-ring: o-ring  
Posterior compartment: achterste kamer  
Anterior compartment: voorste kamer  
Fixing screws: bevestigingsschroeven  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) De opgegeven afmetingen zijn gebaseerd op een corneahouder die wordt gebruikt voor 
koeien tussen 12 en 60 maanden oud. Indien dieren tussen 6 en 12 maanden worden 
gebruikt, dan dient de houder zodanig te worden ontworpen dat elke kamer een inhoud 
heeft van 4 mL en elk van de interne kamers een diameter heeft van 1,5 cm en diepte 
van 2,2 cm. Voor elke nieuw-ontworpen corneahouder is het zeer belangrijk dat de 
verhouding tussen het blootgestelde corneale oppervlak en de kamerinhoud dezelfde is 
als de verhouding in de traditionele corneahouder. Dit is noodzakelijk om te verzekeren 
dat de permeabiliteitswaarden correct bepaald worden voor de berekening van de IVIS 
aan de hand van de voorgestelde formule.
 DE OPACITOMETER  
2. De opacitometer is een meetapparaat voor lichttransmissie. Licht van een 
halogeenlamp wordt door een controlebestanddeel (lege kamer zonder ven ­
sters of vloeistof) naar een fotocel gestuurd en vergeleken met het licht dat door een experimenteel bestanddeel, dat de kamer met de cornea bevat, naar een fotocel wordt gestuurd. Het verschil in lichttransmissie van de fotocellen 
wordt vergeleken en er wordt een numerieke troebelheidswaarde weergege ­
ven op een digitaal scherm. De troebelheidseenheden worden vastgesteld.
 
3. De troebelheidsmeter dient een lineaire respons te geven met een reeks 
troebelheidswaarden inclusief de grenswaarden van de verschillende klassen zoals beschreven in het voorspellend model (d.w.z. tot aan de grenswaarde 
die de corrosiviteit/het hevig irriterend karakter bepaalt). Om lineaire en 
nauwkeurige waarden tot een troebelheid van 75-80 te verzekeren, dient de opacitometer te worden gekalibreerd met een reeks kalibratiemiddelen. Kalibratiemiddelen (ondoorschijnende polyesterplaten) worden in de kalibra ­
tiekamer (een corneale kamer speciaal ontworpen voor het plaatsen van de 
kalibratiemiddelen) geplaatst en afgelezen op de opacitometer. De kalibra ­
tiekamer is zodanig ontworpen dat de kalibratiemiddelen op ongeveer de ­
zelfde afstand tussen het licht en de fotocel geplaatst zijn als de cornea's 
tijdens de troebelheidsmetingen. De opacitometer wordt eerst op 0 troebel ­
heidseenheden gekalibreerd aan de hand van een kalibratiekamer zonder kalibreermiddel. Daarna worden drie verschillende kalibratiemiddelen één 
voor één in de kalibratiekamer geplaatst en worden de troebelheidswaarden 
gemeten. Kalibratiemiddelen 1, 2 en 3 dienen te resulteren in troebelheids ­
metingen die gelijk zijn aan hun vastgestelde waarden van respectievelijk 75, 150 en 225 troebelheidseenheden ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B.48  ISOLATED CHICKEN EYE-TESTMETHODE VOOR DE 
IDENTIFICATIE VAN VOOR HET OOG CORROSIEVE EN 
HEVIG IRRITERENDE STOFFEN  
INLEIDING  
01. De Isolated Chicken Eye-testmethode (ICE) is een  in-vitro testmethode die 
onder bepaalde omstandigheden en met bepaalde beperkingen kan worden gebruikt om stoffen en mengsels in te delen als voor de ogen corrosief en 
hevig irriterend (1) (2) (3). Voor het doel van dit testmethode worden 
hevig irriterende stoffen gedefinieerd als stoffen die bij konijnen ooglet ­
sels veroorzaken die minstens 21 dagen na de aanbrenging voortduren. Hoewel ICE niet als een volwaardige vervanger voor de  in-vivo -oogtest 
bij konijnen wordt beschouwd, wordt deze methode toch aangeraden als 
onderdeel van een trapsgewijze teststrategie voor de indeling en etikette ­
ring volgens de regelgeving binnen een bepaald toepassingsgebied (4) (5). Teststoffen en mengsels (6) die in dit onderzoek positief zijn, kunnen 
zonder bijkomende testen op konijnen worden ingedeeld als stoffen die 
oogcorrosie of hevige irritatie veroorzaken. Een stof die negatief test, dient op konijnen te worden getest met een sequentiële teststrategie zoals uiteengezet in de technische richtsnoeren van de OESO (OECD Test 
Guidelines 405 (7) - zie hoofdstuk B.5 van deze bijlage).
 
02. Het doel van deze testmethode is het beschrijven van de procedures die 
worden gebruikt om de mogelijke corrosie of hevige irritatie van een 
teststof voor de ogen te beoordelen aan de hand van het vermogen van 
deze stof om toxiciteit op te wekken in een verwijderd kippenoog. Toxi ­
sche effecten op de cornea worden gemeten door (i) een kwalitatieve beoordeling van de troebelheid, (ii) een kwalitatieve beoordeling van de 
schade aan de epitheellaag op basis van aanbrenging van fluoresceïne op 
het oog (fluoresceïne-retentie), (iii) een kwantitatieve meting van toegeno ­
men dikte (zwelling) en (iv) een kwalitatieve beoordeling van macrosco ­
pische morfologische schade aan het oppervlak. De beoordelingen van de 
corneale troebelheid, zwelling en schade na blootstelling aan een teststof 
worden individueel beoordeeld en daarna gecombineerd om een oogirri ­
tatieklasse te kunnen afleiden.
 
03. Voor de ogen irriterende stoffen die letsels veroorzaken die in minder dan 
21 dagen verdwijnen en stoffen die niet-irriterend zijn, werden ook getest 
met de ICE-methode. De nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de ICE-testmethode voor stoffen van deze klassen werden echter nog niet for ­
meel beoordeeld.
 
04. Definities worden gegeven in bijlage 1.  
TOELICHTING EN BEPERKINGEN  
05. Deze testmethode is gebaseerd op het protocol van de ICE-testmethode 
van het Interagency Coordinating Committee on the Validation of Al ­
ternative Methods (ICCVAM) (8) dat ontwikkeld werd naar aanleiding van een internationale valideringsstudie (4)(5)(9) met bijdragen van het 
European Centre for the Validation of Alternative Methods, het Japa ­
nese Center for the Validation of Alternative Methods en TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology (Neder ­
land). Het protocol is gebaseerd op informatie verkregen uit gepu ­
bliceerde protocollen alsook het huidige door TNO gebruikte proto ­
col (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
06. De geïdentificeerde beperkingen van deze methode zijn gebaseerd op het 
percentage vals-positieve resultaten voor alcoholen en het percentage 
vals-negatieve resultaten voor vaste stoffen en oppervlakteactieve stoffen (zie paragraaf 47) (4). De nauwkeurigheid van ICE in het EU-, EPA- en GHS-classificatiesysteem verbetert aanzienlijk als stoffen die tot deze che ­
mische en fysische klassen behoren uit de gegevensbank worden verwijderd 
(4). Op basis van het doel van dit onderzoek (d.w.z. het identificeren van enkel stoffen die oogcorrosie/hevige irritatie veroorzaken) zijn vals-negatieve resultaten niet doorslaggevend aangezien deze stoffen nadien 
getest worden op konijnen of met andere gevalideerde  in-vitro testen afhan ­
kelijk van wetgevende vereisten, door gebruik van een sequentiële teststra ­
tegie in een benadering met meervoudige bewijsvoering („weight of eviden ­
ce” benadering). Bovendien liet de huidige valideringsgegevensbank geen 
ruimte voor een adequate beoordeling van sommige chemische producten of 
productklassen (bv. mengsels). Onderzoekers kunnen echter overwegen deze testmethode te gebruiken voor alle soorten testmateriaal (met inbegrip van mengsels) waarbij een positief resultaat kan worden aangenomen als een 
aanwijzing van een voor de ogen corrosieve of hevige irriterende respons. 
Positieve resultaten die verkregen werden met alcoholen dienen echter met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd omwille van het risico van over ­
predictie.
 
07. Alle procedures met kippenogen dienen de op de testinrichting toepasselijke 
regelgeving en procedures voor de behandeling van menselijke of van dieren 
afkomstige materialen na te leven, met inbegrip van maar niet beperkt tot weefsels en weefselvloeistoffen. Universele voorzorgsmaatregelen voor la ­
boratoria zijn aanbevolen (15).
 
08. Een beperking van de testmethode is dat deze methode weliswaar rekening 
houdt met sommige in de oogirritatietestmethode bij het konijn waargeno ­
men effecten op het oog en in bepaalde mate hun ernst, maar dat ze geen rekening houdt met letsels van het ooglid en de iris. Hoewel de reversibi ­
liteit van hoornvliesletsels op zichzelf niet kan worden beoordeeld in de 
ICE-testmethode, werd bovendien voorgesteld, op basis van studies op de ogen van konijnen, dat een beoordeling van de aanvankelijke diepte van het hoornvliesletsel kan worden gebruikt om een onderscheid te maken tussen 
reversibele en irreversibele effecten (16). Tot slot kan de ICE-testmethode 
niet worden gebruikt voor een beoordeling van de mogelijkheid van met blootstelling van het oog geassocieerde systemische toxiciteit.
 
09. Er worden inspanningen geleverd om het nut en de beperkingen van de 
ICE-testmethode voor de identificatie van niet-hevig irriterende stoffen en 
niet-irriterende stoffen (zie ook paragraaf 48) verder te typeren. Gebruikers 
worden eveneens aangemoedigd om monsters en/of gegevens te leveren aan valideringsorganisaties voor een formele evaluatie van mogelijk toekomstig gebruik van de ICE-testmethode, met inbegrip van de identificatie van voor 
de ogen niet-hevig irriterende stoffen en niet-irriterende stoffen.
 
10. Elk laboratorium dat dit onderzoek voor het eerst opstelt, dient gebruik te 
maken van de in bijlage 2 voorziene chemicaliën voor bekwaamheidstoet ­
sing. Een laboratorium kan deze chemicaliën gebruiken om zijn technische 
bekwaamheden met betrekking tot het uitvoeren van de ICE-testmethode 
aan te tonen vooraleer het ICE-onderzoeksgegevens indient voor de wette ­
lijke gevarenclassificatie.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
11. De ICE-testmethode is een organotypisch model dat handhaving op korte 
termijn van het kippenoog  in vitro  vereist. In deze testmethode wordt schade 
door de teststof beoordeeld door vaststelling van corneale zwelling, troebel ­
heid en fluoresceïne-retentie. Daar waar de laatste twee parameters een kwalitatieve beoordeling vergen, vereist de analyse van de corneale zwelling een kwantitatieve beoordeling. Elke meting wordt ofwel omgezet in een 
kwantitatieve score die gebruikt wordt voor de berekening van een algemene 
irritatie-index, ofwel een kwalitatieve indeling toegekend die gebruikt wordt voor de toekenning van een  in-vitro -indeling van corrosiviteit en hevig 
irriterend karakter voor de ogen. Elk van deze resultaten kan dan worden 
aangewend om de potentiële  in-vivo corrosiviteit en het hevig-irriterende 
karakter van een teststof te voorspellen (zie beslissingscriteria).
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Bron en ouderdom van de kippenogen  
12. In het verleden werden voor dit onderzoek steeds ogen verzameld van 
kippen uit de slachterij die geslacht werden voor de menselijke consumptie 
waardoor er geen nood was aan proefdieren. Enkel ogen van gezonde dieren die geschikt zijn voor de menselijke voedselketen worden gebruikt.
 
13. Hoewel een gecontroleerde studie voor de beoordeling van de ideale leeftijd 
van de kip nog niet werd gevoerd, was de leeftijd en het gewicht van de in deze testmethode gebruikte kippen in het verleden dat van piepkuikens van 
oudsher geslacht in een pluimveeslachterij (d.w.z. ongeveer 7 weken oud, 
1,5 - 2,5 kg).
 
Verzameling en vervoer van ogen naar het laboratorium  
14. Na verdoving van de kippen, meestal met een elektrische schok, en incisie 
in de nek voor bloeding, dient de kop onmiddellijk verwijderd te worden. Er dient een plaatselijke bron van kippen, niet ver van het laboratorium te 
worden gezocht zodat de koppen snel genoeg van de slachterij naar het 
laboratorium kunnen worden vervoerd om bederf en/of bacteriële besmetting zoveel mogelijk te beperken. Het tijdsinterval tussen de verzameling van de koppen en het gebruik van de ogen in de ICE-testmethode dient te worden 
beperkt tot een minimum (gewoonlijk minder dan twee uur) en mag de 
onderzoeksresultaten niet in gevaar brengen. Deze resultaten zijn gebaseerd op de selectiecriteria voor de ogen alsook op de positieve en negatieve controleresponsen. Alle in het onderzoek gebruikte ogen dienen van de ­
zelfde groep op een bepaalde dag verzamelde ogen te zijn.
 
15. Aangezien de ogen in het laboratorium ontleed worden, worden de koppen 
intact en op omgevingstemperatuur van de slachterij vervoerd in plastic 
dozen, bevochtigd met in isotoon zout gedrenkte doeken.  
Selectiecriteria voor in de ICE-test gebruikte ogen  
16. Ogen die een hoge referentie-fluoresceïneverkleuring (d.w.z. > 0,5) of cor ­
neale troebelheidsscore (d.w.z. > 0,5) vertonen, worden na verwijdering verworpen.
 
17. Elke behandelingsgroep en tegelijkertijd gemeten positieve controle bestaat 
uit ten minste drie ogen. De negatieve controlegroep of de controle met oplosmiddel (indien een ander oplosmiddel dan zout gebruikt wordt) bestaat 
uit ten minste één oog.
 
PROCEDURE  
Voorbereiding van de ogen  
18. De oogleden worden zorgvuldig verwijderd zodat geen schade wordt berok ­
kend aan de cornea. De corneale integriteit kan eenvoudig worden beoor ­
deeld met een druppel van 2 % (g/v) natriumfluoresceïne die gedurende enkele seconden wordt aangebracht op het hoornvliesoppervlak en daarna 
uitgewassen met een isotone zoutoplossing. Met fluoresceïne behandelde 
ogen worden daarna onderzocht met een spleetlampmicroscoop om er zeker van te zijn dat de cornea niet beschadigd is (d.w.z. fluoresceïne-retentie en corneale troebelheidsscore ≤ 0,5).
 
19. Indien het oog onbeschadigd is, wordt het voorzichtig verder verwijderd uit 
de schedel zonder de cornea te beschadigen. De oogbal wordt van de 
oogrand getrokken door het derde ooglid stevig vast te houden met een 
chirurgische tang terwijl de oogspier afgesneden wordt met een kromme schaar met botte punten. Het is belangrijk schade aan de cornea door buiten ­
sporige druk (d.w.z. misvorming door samendrukking) te voorkomen.
 
20. Als het oog van de oogrand verwijderd is, zou een zichtbaar gedeelte van de 
oogzenuw nog aangehecht moeten zijn. Zodra het oog van de oogrand 
verwijderd is, wordt het op een absorberend verband gelegd en worden 
het derde ooglid en ander bindweefsel weggesneden.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Het verwijderde oog wordt op een klem van roestvrij staal geplaatst met de 
cornea in verticale positie. De klem wordt dan overgebracht naar een kamer 
van het superfusieapparaat (16). De klemmen dienen zodanig in het super ­
fusieapparaat te worden gemonteerd dat de volledige cornea bedekt wordt door de isotone zoutinfusie. In de kamers van het superfusieapparaat moet 
een temperatuur van 32 ± 1,5 °C worden gehandhaafd. Bijlage 3 bevat een 
diagram van een typisch superfusieapparaat met oogklemmen, dat verkrijg ­
baar is in de handel of zelf kan worden gemaakt. Het apparaat kan worden aangepast aan de behoeften van elk individueel laboratorium (bv. om ander 
aantal ogen te houden).
 
22. Nadat ze in het superfusieapparaat geplaatst zijn, worden de ogen nogmaals 
onderzocht met een spleetlampmicroscoop om te controleren dat er zich tijdens de dissectieprocedure geen schade heeft voorgedaan. Met behulp van de dieptemeter van de spleetlampmicroscoop wordt meteen ook de 
corneale dikte gemeten ter hoogte van de corneale apex. Ogen met (i) een 
fluoresceïne-retentiescore van > 0,5; (ii) corneale troebelheid > 0,5; (iii) elk bijkomend teken van schade, dienen te worden vervangen. Individuele ogen die niet werden verwijderd op basis van de voorgaande criteria dienen te 
worden verwijderd indien de corneale dikte met meer dan 10 % afwijkt van 
de gemiddelde waarde van alle ogen. Gebruikers dienen zich te realiseren dat spleetlampmicroscopen verschillende resultaten voor corneale dikte kun ­
nen opleveren naargelang van de instelling van de breedte van de spleet. De 
breedte van de spleet dient te worden ingesteld op 0,095 mm.
 
23. Zodra alle ogen onderzocht en goedgekeurd zijn, worden de ogen gedurende 
ongeveer 45 tot 60 minuten geïncubeerd om ze vóór de dosering te equili ­
breren met het testsysteem. Na de equilibreerperiode wordt een nulreferen ­
tiemeting opgetekend voor de corneale dikte en troebelheid die zal dienen 
als referentie (d.w.z. tijd = 0). De fluoresceïnescore die bepaald wordt bij de ontleding wordt gebruikt als referentiemeting voor dat eindpunt.
 
Aanbrengen van de teststof  
24. Onmiddellijk na de nulreferentiemetingen wordt het oog (in de houder) 
verwijderd uit het superfusieapparaat, in horizontale positie geplaatst, en 
wordt de teststof aangebracht op de cornea.  
25. Vloeibare teststoffen worden gewoonlijk onverdund getest, maar kunnen 
worden verdund indien dit nodig blijkt te zijn (bv. als onderdeel van de onderzoeksopzet). Het aanbevolen oplosmiddel voor verdunde stoffen is 
fysiologische zoutoplossing. Andere oplosmiddelen mogen echter ook wor ­
den gebruikt in gecontroleerde omstandigheden maar indien aan een ander oplosmiddel dan fysiologische zoutoplossing de voorkeur wordt gegeven, dient dit te worden gemotiveerd.
 
26. Vloeibare teststoffen worden zodanig aangebracht op de cornea dat het 
gehele oppervlak van de cornea gelijk bedekt is met de teststof; het stan ­
daardvolume is 0,03 ml.  
27. Indien mogelijk, dienen de vaste stoffen zo fijn mogelijk gemalen te worden 
in een vijzel of een vergelijkbaar maalinstrument. Het poeder wordt zodanig op de cornea aangebracht dat het hele oppervlak gelijk bedekt is met de 
teststof; de standaardhoeveelheid is 0,03 g.
 
28. De testvloeistof (vloeibaar of vast) wordt gedurende 10 seconden toegediend 
en dan weggespoeld met isotone zoutoplossing (ongeveer 20 ml) op omge ­
vingstemperatuur. Het oog (in de houder) wordt daarna terug in het super ­
fusieapparaat geplaatst in de oorspronkelijke rechtopstaande positie.  
Controlestoffen  
29. In elk experiment moeten gelijktijdig gemeten negatieve controles of con ­
troles met oplosmiddel/medium en positieve controles worden opgenomen.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Bij het testen van vloeistoffen aan 100 % of vaste stoffen wordt fysiologi ­
sche zoutoplossing gebruikt als tegelijkertijd gemeten negatieve controle in 
de ICE-testmethode om niet-specifieke veranderingen in het testsysteem op te sporen en om te garanderen dat de onderzoeksomstandigheden niet on ­
gewenst leiden tot een irriterende respons.
 
31. Bij het testen van verdunde vloeistoffen wordt een tegelijkertijd gemeten 
controlegroep van oplosmiddelen/media opgenomen in de testmethode om niet-specifieke veranderingen in het testsysteem op te sporen en om te 
garanderen dat de onderzoeksomstandigheden niet ongewenst leiden tot 
een irriterende respons. Zoals gesteld in paragraaf 25, kunnen enkel oplosmiddelen/media worden gebruikt waarvan geweten is dat ze geen na ­
delig effect op het testsysteem hebben.
 
32. Een bekende voor de ogen irriterende stof wordt in elk experiment opge ­
nomen als gelijktijdige positieve controle om na te gaan of de juiste respons 
wordt opgewekt. Aangezien het ICE-onderzoek in deze testmethode wordt 
gebruikt om corrosieve en hevig irriterende stoffen te identificeren, is het best dat de positieve controle gebeurt met een referentiestof die een hevige respons opwekt in deze testmethode. Om te verzekeren dat de variabiliteit in 
de positieve-controlerespons doorheen de tijd kan worden beoordeeld, mag 
de grootte van de hevig irriterende respons echter niet buitensporig zijn. Voor de positieve controle dienen voldoende  in-vitro gegevens te worden 
gegenereerd zodat een statistisch gedefinieerde aanvaardbare reeks voor de 
positieve controle kan worden berekend. Indien voor een bepaalde positieve 
controle geen gepaste historische ICE-testmethodegegevens beschikbaar zijn, dan is het mogelijk dat onderzoek dient te worden verricht om deze gege ­
vens te verkrijgen.
 
33. Voorbeelden van positieve controles voor vloeibare teststoffen zijn 10 % 
azijnzuur of 5 % benzalkoniumchloride. Voorbeelden van positieve contro ­
les voor vaste teststoffen zijn natriumhydroxide of imidazool.  
34. IJkstoffen zijn nuttig voor de beoordeling van potentiële oogirritatie bij 
onbekende chemicaliën uit een specifieke chemische klasse of productklasse 
of voor de beoordeling van potentiële relatieve irritatie van een voor het oog 
irriterende stof binnen een reeks van irritatieresponsen.  
Gemeten eindpunten  
35. Behandelde cornea's worden beoordeeld vóór behandeling en op 30, 75, 
120, 180 en 240 minuten (± 5 minuten) na het uitwassen na behandeling. Deze punten in de tijd leveren een geschikt aantal metingen op over een 
behandelingsperiode van vier uur en laten toch voldoende tijd tussen twee 
metingen voor de vereiste waarnemingen voor alle ogen.
 
36. De eindpuntbeoordelingen zijn corneale troebelheid, zwelling, fluoresceïne- 
retentie en morfologische effecten (bv. kuilvorming of loskomen van de 
epitheellaag). Alle eindpunten, met uitzondering van de fluoresceïne-retentie (die enkel wordt bepaald bij de voorbehandeling en 30 minuten na bloot ­
stelling aan de teststof) worden bepaald op elk van de bovenvermelde tijd ­
stippen.
 
37. Het nemen van foto’s wordt aanbevolen als documentatie van corneale 
troebelheid, fluoresceïne-retentie, morfologische effecten en, indien uitge ­
voerd, histopathologie.  
38. Na het laatste onderzoek, na vier uur, worden gebruikers aangespoord om de 
ogen te bewaren in het gepaste fixeermiddel (d.w.z. neutrale gebufferde 
formaldehyde) voor eventueel histopathologisch onderzoek.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Corneale zwelling wordt bepaald aan de hand van de diktemetingen van de 
cornea met een optische pachymeter op een spleetlampmicroscoop. Zij 
wordt uitgedrukt als percentage en wordt berekend vanuit de corneale dik ­
temetingen volgens de volgende formule:  
" 
corneale dikte op tijdstip t  Ä corneale dikte op tijdstip  ¼ 0 
corneale dikte op tijdstip  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Het gemiddelde percentage van corneale zwelling voor alle testogen wordt 
berekend voor alle waarnemingstijdstippen. Op basis van de hoogste ge ­
middelde score voor corneale zwelling, zoals die op elk tijdstip is waar ­
genomen, wordt dan een algemene categoriescore toegekend aan elke test ­
stof. 
41. De score voor corneale troebelheid wordt berekend aan de hand van het 
gebied van de cornea waar de troebelheid het dichtst is. De gemiddelde waarde van de corneale troebelheid voor alle testogen wordt berekend 
voor alle waarnemingstijdstippen. Op basis van de hoogste gemiddelde 
score voor corneale troebelheid, zoals die op elk tijdstip is waargenomen, wordt dan een algemene categoriescore toegekend aan elke teststof (tabel 1).
 
Tabel 1  
Corneale troebelheidsscores  
Score Waarneming  
0 Geen troebelheid 
0,5 Zeer zwakke troebelheid 
1 Verspreide of diffuse gebieden; details van de iris zijn duidelijk zichtbaar 2 Gemakkelijk te onderscheiden doorschijnend gebied; details van de iris zijn 
enigszins vervaagd 
3 Ernstige corneale troebelheid; details van de iris niet zichtbaar; omvang van de 
pupil nauwelijks zichtbaar 
4 Volledige corneale troebelheid; iris onzichtbaar
 
42. De gemiddelde fluoresceïne-retentiewaarde voor alle testogen wordt enkel 
berekend op het tijdstip van de 30  e minuut dat gebruikt wordt voor de 
algemene score die aan elke teststof gegeven wordt (tabel 2).  
Tabel 2  
Fluoresceïne-retentiescores  
Score Waarneming  
0 Geen fluoresceïne-retentie 
0,5 Minieme enkelcellige verkleuring 
1 Enkelcellige verkleuring verspreid over het behandelde oppervlak van de cornea 
2 Geconcentreerde of samenvloeiende enkelcellige verkleuring 3 Samenvloeiende grotere oppervlakken van de cornea met fluoresceïne
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfologische effecten zijn bijvoorbeeld „kuilvorming” van de corneale 
epitheelcellen, „loskomen” van de epitheellaag, „ongelijkmatig worden” 
van het corneale oppervlak en „kleven” van de teststof aan de cornea. Deze bevindingen kunnen in hevigheid variëren en kunnen eveneens gelijk ­
tijdig voorkomen. De indeling van deze bevindingen is subjectief naargelang 
de interpretatie van de onderzoeker.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Evaluatie van de gegevens  
44. Resultaten van corneale troebelheid, zwelling en fluoresceïne-retentie dienen 
afzonderlijk te worden beoordeeld om een ICE-klasse te genereren voor elk 
eindpunt. De ICE-klassen voor elk eindpunt worden daarna gecombineerd 
om een irritatieklasse voor elke teststof te genereren.  
Beslissingscriteria  
45. Na beoordeling van elk eindpunt kunnen ICE-klassen worden toegekend op 
basis van een vooraf vastgestelde reeks. Interpretatie van corneale dikte 
(tabel 3), troebelheid (tabel 4) en fluoresceïne-retentie (tabel 5) aan de hand van vier ICE-klassen gebeurt volgens de volgende schalen:
 
Tabel 3  
ICE-indelingscriteria voor corneale dikte  
Gemiddelde corneale zwelling (%) (*) ICE-klasse  
0 tot en met 5 I 
> 5 tot en met 12 II > 12 tot en met 18 (> 75 minuten na 
behandeling) II 
> 12 tot en met 18 ( ≤ 75 minuten na 
behandeling) III 
> 18 tot en met 26 III 
> 26 tot en met 32 (> 75 minuten na 
behandeling) III 
> 26 tot en met 32 ( ≤ 75 minuten na 
behandeling) IV 
> 32 IV
 
(*) Scores voor corneale zwelling zijn enkel van toepassing indien de dikte gemeten wordt met een 
Haag-Streit BP900 spleetlampmicroscoop met een dieptemeetapparaat nr. I en spleetbreedte ingesteld 
op 9½ gelijk aan 0,095mm. Gebruikers dienen zich te realiseren dat spleetlampmicroscopen verschillende 
resultaten voor corneale dikte kunnen opleveren naargelang van de instelling van de breedte van de spleet.  
Tabel 4  
ICE-indelingscriteria voor troebelheid  
Gemiddelde maximumtroebelheidsscore (*) ICE-klasse  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Zie Tabel 1.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabel 5  
ICE-indelingscriteria voor gemiddelde fluoresceïne-retentie  
Gemiddelde fluoresceïne-retentiescore 30 minuten 
na de behandeling (*) ICE-klasse  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Zie Tabel 2.  
46. De algemene  in-vitro -irritatieclassificatie voor een teststof wordt beoordeeld 
door aflezing van de irritatieclassificatie die overeenstemt met de combinatie 
van de categorieën voor corneale zwelling, corneale troebelheid en fluores ­
ceïne-retentie en door toepassing van het in tabel 6 voorgestelde schema.  
Tabel 6  
Algemene  in-vitro -irritatieclassificatie  
Classificatie Combinaties van de 3 eindpunten  
Corrosief/hevig irriterend 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Corneale troebelheid ≥ 3 op 30 min (in ten 
minste 2 ogen) Corneale troebelheid = 4 op elk tijdstip (in ten minste 2 ogen) 
Ernstig loslaten van de epitheellaag (in ten min ­
ste 1 oog)
 
(*) Combinaties die zelden voorkomen.  
47. Zoals reeds in paragraaf 1 vermeld, dienen bijkomende testen te worden 
uitgevoerd om deze stof te kunnen indelen en etiketteren, indien de test ­
stof niet geïdentificeerd werd als corrosief of hevig irriterend voor de 
ogen. De ICE-testmethode heeft een algemene nauwkeurigheidsgraad van 83 % (120/144) tot 87 % (134/154), een percentage vals-positieve 
uitslagen van 6 % (7/122) tot 8 % (9/116) en een percentage 
vals-negatieve uitslagen van 41 % (13/32) tot 50 % (15/30) voor de identificatie van stoffen die corrosief of hevig irriterend zijn voor de ogen in vergelijking met de gegevens van de  in-vivo testmethode op ko ­
nijnenogen die ingedeeld zijn volgens de EPA- (1), EU- (2) of GHS- (3) 
classificatiesystemen. Als stoffen binnen bepaalde chemische klassen (d.w.z. alcoholen en oppervlakteactieve stoffen) en fysische klassen (d.w.z. vaste stoffen) uit de gegevensbank gesloten worden, dan varieert 
de nauwkeurigheid van ICE tussen de EU-, EPA- en 
GHS-classificatiesystemen van 91 % (72/82) tot 92 % (69/75), het per ­
centage vals-positieve uitslagen van 5 % (4/73) tot 6 % (4/70) en het percentage vals-negatieve uitslagen van 29 % (2/7) tot 33 % (3/9) (4).
 
48. Zelfs indien geen classificatie als voor de ogen corrosief en hevig irriterend 
verkregen wordt, dan nog kunnen ICE-gegevens nuttig zijn in combinatie 
met testgegevens van de  in-vivo test op konijnenogen of van een degelijk 
gevalideerde  in-vitro test voor verdere beoordeling van het nut en de beper ­
kingen van de ICE-testmethode voor de identificatie van niet-hevig irrite ­
rende en niet-irriterende stoffen (een richtsnoer over het gebruik van  in- 
vitro toxiciteitstestmethoden op ogen is in voorbereiding).  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Acceptatiecriteria van het onderzoek  
49. Een test wordt als aanvaardbaar beschouwd als de tegelijkertijd gemeten 
negatieve controles of controles met medium/oplosmiddel en de tegelijker ­
tijd gemeten positieve controles een irritatieclassificatie opleveren die valt binnen de klasse van de niet-irriterende stoffen respectievelijk de klasse van de hevig irriterende/corrosieve stoffen.
 
Testverslag  
50. Het testverslag dient de volgende informatie te bevatten, indien relevant 
voor het voeren van het onderzoek:  
Test- en controlestoffen  
Chemische benaming(en) zoals de gestructureerde benaming gebruikt door 
de Chemical Abstracts Service (CAS), gevolgd door andere benamingen indien bekend.
 
Het CAS-registratienummer (RN), indien bekend.  
Zuiverheid en samenstelling van de stof of het mengsel (in percentage(s) per 
gewicht) voor zover deze informatie beschikbaar is.  
Fysisch-chemische eigenschappen zoals de fysische staat, vluchtigheid, pH, 
stabiliteit, scheikundige klasse, oplosbaarheid in water, die van belang zijn voor het voeren van het onderzoek.
 
Behandeling van de test-/controlestoffen voorafgaand aan de testen, indien 
van toepassing (bv. opwarming, malen).  
Stabiliteit, indien bekend.  
Informatie met betrekking tot de opdrachtgever en de testinstallatie  
Naam en adres van de opdrachtgever, testinstallatie en de directeur van het 
onderzoek.  
Identificatie van de herkomst van de ogen (d.w.z. de plaats waar ze ver ­
zameld werden).  
Opslag- en transportomstandigheden van de ogen (bv. datum en tijdstip van 
de verzameling, tijdsinterval tot aan de aanvang van de testen).  
Indien beschikbaar, specifieke kenmerken van de dieren waarvan de ogen 
werden verzameld (bv. leeftijd, geslacht, gewicht van het donordier).  
Motivering van de gebruikte testmethode en het gebruikte protocol  
Integriteit van de testmethode  
De gebruikte procedure ter verzekering van de integriteit (d.w.z. nauwkeu ­
righeid en betrouwbaarheid) van de testmethode in de tijd (d.w.z. periodiek 
testen van stoffen voor bekwaamheidstoetsing, gebruik van historische ne ­
gatieve en positieve controlegegevens).  
Criteria voor aanvaardbare test  
Indien van toepassing, aanvaardbare tegelijkertijd gemeten referentiecontro ­
lebereiken gebaseerd op historische gegevens.  
Testomstandigheden  
Beschrijving van het gebruikte testsysteem.  
Gebruikte spleetlampmicroscoop (bv. model).  
De instellingen van de gebruikte spleetlampmicroscoop.  
Informatie over de gebruikte kippenogen, met inbegrip van mededelingen 
betreffende hun kwaliteit.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Gedetailleerde informatie over de gebruikte testprocedure.  
De gehanteerde concentratie(s) van de teststoffen.  
Beschrijving van enige wijziging van de testprocedure.  
Verwijzing naar historische gegevens van het model (bv. negatieve en po ­
sitieve controles, stoffen voor de bekwaamheidstoetsing, ijkstoffen).  
Beschrijving van de gebruikte beoordelingscriteria.  
Resultaten  
Beschrijving van andere waargenomen effecten.  
Indien van toepassing, foto’s van het oog.  
Bespreking van de resultaten  
Conclusies  
LITERATUUR  
0(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
0(2) Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de 
Raad van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de 
Richtlijnen 67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van 
Verordening (EG) nr. 1907/2006. PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1.
 
0(3) United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classi ­
fication and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, 
UN New York and Geneva, 2007. Beschikbaar op:  
[http: //www. unece. org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e. 
html].  
0(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Beschikbaar:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
0(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Beschik ­
baar:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
0(6) Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de 
Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor 
chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en 
houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 
93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie. PB L 396 van 
30.12.2006, blz. 1.
 
0(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Beschikbaar:  
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html].  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
0(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Beschikbaar:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].  
0(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye 
Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Beschikbaar:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm].  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enu ­
cleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31: 
69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Beschikbaar:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9: 871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion po ­
tential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34: 291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35: 23-37.
 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the He ­
althcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Gui ­
deline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings. Beschikbaar:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36: 106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet. - Toxicol.  - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Me ­
thod. Beschikbaar:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm].  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Beschikbaar:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm].  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Bijlage 1  
DEFINITIES  
Nauwkeurigheid:  de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met 
de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties 
van de testmethode en één aspect van „relevantie”. Deze term en de term „con ­
cordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt.
 
IJkstof:  een stof die gebruikt wordt als norm voor vergelijking met een teststof. 
Een ijkstof dient de volgende eigenschappen te hebben: (i) (een) constante en 
betrouwbare bron(nen); (ii) een structurele en functionele gelijkenis met de klasse stoffen die getest wordt; (iii) bekende fysische/chemische kenmerken; (iv) onder ­
steunende gegevens over bekende effecten en (v) een bekende werkzaamheid 
binnen het bereik van de gewenste respons.
 
Cornea:  het doorschijnende gedeelte van het voorste deel van de oogbal dat de 
iris en pupil bedekt en licht naar binnen toelaat.  
Corneale troebelheid:  meting van de mate van troebelheid van de cornea na 
blootstelling aan een teststof. Verhoogde corneale troebelheid is een aanwijzing voor schade aan de cornea.
 
Corneale zwelling:  een objectieve meting in de ICE-test van de mate van uit ­
zetting van de cornea na blootstelling aan een teststof. Dit wordt uitgedrukt als 
percentage en wordt berekend vanaf de referentiedikte van de cornea (vóór dosering) en de dikte opgetekend op regelmatige intervallen na blootstelling aan het testmateriaal in de ICE-test. De mate van corneale zwelling is een aan ­
wijzing voor schade aan de cornea.
 
EPA-klasse 1:  corrosieve (irreversibele afbraak van oogweefsel) of corneale 
aandoening of irritatie die gedurende meer dan 21 dagen aanhoudt (1).  
EU-klasse R41:  veroorzaking van weefselschade aan het oog of ernstige fysische 
gezichtsvermindering na aanbrenging van een teststof op de voorste ooglaag die niet volledig reversibel is binnen 21 dagen na de aanbrenging (2).
 
Percentage vals-negatieve uitslagen:  het percentage van alle positieve stoffen 
dat door de testmethode onterecht als negatief wordt geïdentificeerd. Het is één 
indicator van de prestaties van de testmethode.  
Percentage vals-positieve uitslagen:  het percentage van alle negatieve stoffen 
dat door een testmethode onterecht als positief wordt geïdentificeerd. Het is één indicator van de prestaties van de testmethode.
 
Fluoresceïne-retentie:  een subjectieve meting in de ICE-test van de hoeveelheid 
natriumfluoresceïne die wordt weerhouden door de epitheelcellen in de cornea na 
blootstelling aan een teststof. De mate van fluoresceïne-retentie is een aanwijzing 
voor schade aan de corneale epitheellaag.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Che ­
micals):  een systeem voor de indeling van chemische producten (stoffen en 
mengsels) op basis van gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van 
fysische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetref ­
fende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, ge ­
varenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waar ­
mee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar worden 
gemaakt teneinde mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, 
consumenten en spoedhulpverleners) en het milieu te beschermen (3).  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS-klasse 1:  veroorzaking van weefselschade aan het oog of ernstige fysische 
gezichtsvermindering na aanbrenging van een teststof op de voorste ooglaag die 
niet volledig reversibel is binnen 21 dagen na de aanbrenging (3).  
Gevaar:  inherente eigenschap van een agens of situatie die nadelige effecten kan 
veroorzaken als een organisme, systeem of (sub)populatie aan dit agens wordt blootgesteld.
 
Negatieve controle:  een onbehandeld monster dat alle bestanddelen van een 
testsysteem bevat. Dit monster wordt tezamen met de met de teststof behandelde monsters en andere controlemonsters verwerkt om te bepalen of het oplosmiddel 
interageert met het testsysteem.
 
Niet-irriterend:  een stof die niet is ingedeeld als voor de ogen irriterende stof 
van EPA-klasse I, II, of III, EU-klasse R41 of R36 of GHS-klasse 1, 2A, of 2B (1) (2) (3).
 
Voor de ogen corrosieve stof:  (a) een stof die irreversibele schade aan het 
oogweefsel veroorzaakt; (b) een stof die is ingedeeld als voor de ogen irriterende stof van GHS-klasse 1, EPA-klasse I of EU-klasse R41 (1) (2) (3).
 
Voor de ogen irriterende stof:  (a) een stof die een reversibele wijziging in het 
oog teweegbrengt na aanbrenging op het voorste oogoppervlak; (b) een stof die is 
ingedeeld als voor de ogen irriterende stof van EPA-klasse II of III, EU-klasse 
R36 of GHS-klasse 2A of 2B (1) (2) (3).  
Voor de ogen hevig irriterende stof:  (a) een stof die na aanbrenging op het 
voorste oogoppervlak weefselschade aan het oog veroorzaakt die niet reversibel is binnen 21 dagen na de aanbrenging of die ernstige fysische gezichtsvermin ­
dering teweegbrengt; b) een stof die is ingedeeld als voor de ogen irriterende stof 
van GHS-klasse 1, EPA-klasse I of EU-klasse R41 (1) (2) (3).
 
Positieve controle:  een monster met alle bestanddelen van een testsysteem dat 
met een stof behandeld werd waarvan bekend is dat deze een positieve respons opwekt. Om te verzekeren dat variabiliteit in de positieve-controlerespons door ­
heen de tijd kan worden beoordeeld, mag de grootte van de „hevige irritatie”- 
respons niet buitensporig zijn.
 
Betrouwbaarheid:  indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd 
volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouw ­
baarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumrepro ­
duceerbaarheid en intralaboratoriumherhaalbaarheid.
 
Spleetlampmicroscoop:  een instrument dat wordt gebruikt om het oog recht ­
streeks te onderzoeken met een binoculaire microscoop die een driedimensionaal, 
rechtopstaand beeld oplevert. In de ICE-testmethode wordt dit instrument ge ­
bruikt om de voorste structuren van het kippenoog te zien alsook om de corneale dikte objectief te kunnen meten met een aangehechte dieptemeter.
 
Controle met oplosmiddel/medium:  een onbehandeld monster dat alle com ­
ponenten bevat van een testsysteem, met inbegrip van het oplosmiddel of medi ­
um, dat tezamen met de met de teststof behandelde monsters en andere contro ­
lemonsters verwerkt wordt om de referentierespons voor de monsters die behan ­
deld werden met de in hetzelfde oplosmiddel of medium opgeloste teststof vast te stellen. Als dit monster getest wordt met een tegelijkertijd gemeten negatieve 
controle, toont het ook aan of het oplosmiddel of medium met het testsysteem 
interageert.
 ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Trapsgewijs testen:  een trapsgewijze teststrategie waarbij alle bestaande infor ­
matie over een teststof in een bepaalde volgorde wordt herbezien aan de hand 
van een proces op basis van bewijskracht op elke trap om te bepalen of er voldoende informatie beschikbaar is voor een beslissing tot gevarenclassificatie, vooraleer wordt overgegaan tot de volgende trap. Indien het irritatiepotentieel van 
een teststof kan worden bepaald op basis van de bestaande informatie, dan zijn 
bijkomende testen niet vereist. Indien het irritatiepotentieel van een teststof niet kan worden bepaald op basis van de bestaande informatie, dan wordt een traps ­
gewijze testprocedure op dieren uitgevoerd tot een ondubbelzinnige indeling 
mogelijk is.
 
Gevalideerde testmethode:  een testmethode waarvoor valideringsonderzoeken 
werden gedaan om de relevantie (inclusief nauwkeurigheid) en betrouwbaarheid voor een bepaald doel te bepalen. Er dient te worden opgemerkt dat een gevali ­
deerde testmethode niet per definitie voldoende nauwkeurig en betrouwbaar is 
om aanvaardbaar te worden bevonden voor het voorgestelde doel.
 
Bewijskracht:  het proces waarbij de sterke en zwakke punten van verschillende 
gegevens worden onderzocht bij het komen tot en ondersteunen van een con ­
clusie met betrekking tot het gevarenpotentieel van een stof.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Bijlage 2  
CHEMISCHE STOFFEN VOOR BEKWAAMHEIDSTOETSING VOOR DE 
ICE-TESTMETHODE  
Vooraleer over te gaan tot routinegebruik van een testmethode die samenhangt 
met deze testmethode, kan het zijn dat laboratoria de technische bekwaamheid wensen aan te tonen door een correcte identificatie van de indeling als corrosief 
voor de ogen van de 10 stoffen die in tabel 1 worden aangeraden. Deze stoffen 
werden geselecteerd om een reeks responsen te vertegenwoordigen voor plaatse ­
lijke oogirritatie/-corrosie die gebaseerd is op de resultaten van de  in-vivo -oog­
testen op konijnen (TG 405) (d.w.z. klassen 1, 2A, 2B of niet ingedeeld en 
geëtiketteerd volgens de UN GHS) (3) (7). Rekening houdend met het gevali ­
deerde nut van deze onderzoeken (d.w.z. enkel om voor de ogen corrosieve/hevig irriterende stoffen te identificeren), zijn er slechts twee testresultaten voor clas ­
sificatiedoeleinden (corrosief/hevig irriterend of niet-corrosief/niet-hevig irrite ­
rend) om bekwaamheid aan te tonen. Andere selectiecriteria zijn dat stoffen 
commercieel beschikbaar zijn, dat er  in-vivo referentiegegevens van zeer goede 
kwaliteit beschikbaar zijn, en dat er gegevens van zeer goede kwaliteit beschik ­
baar zijn van de twee  in-vitro methoden waarvoor op dit ogenblik testrichtsnoeren 
worden opgesteld. Om die reden werden irriterende stoffen geselecteerd van de ICCVAM-lijst van 122 aanbevolen ijkstoffen voor de validering van  in-vitro test­
methoden voor oogtoxiciteit (zie bijlage H: ICCVAM Recommended Reference 
Substances List) (4). Referentiegegevens zijn beschikbaar in de ICCVAM Back ­
ground Review Documents for the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and the Isolated Chicken Eye (ICE) test methods (18) (19).
 
Tabel 1  
Aanbevolen stoffen voor het aantonen van technische bekwaamheid met ICE  
Chemische stof CAS RN Chemische 
klasse (  1 ) Fysische vorm  In-vivo -classifica ­
tie (  2 ) In-vitro -classificatie (  3 ) 
Benzalkoniumchlo ­
ride (5 %) 8001-54-5 Onium-verbin ­
ding Vloeibaar Klasse 1 Corrosief/Hevig 
irriterend 
Chloorhexidine 55-56-1 Amine, amidine Vast Klasse 1 Corrosief/Hevig 
irriterend 
Dibenzoyl-L-wijn ­
steenzuur 2743-38-6 Carbonzuur, 
ester Vast Klasse 1 Corrosief/Hevig 
irriterend 
Imidazool 288-32-4 Heterocyclisch Vast Klasse 1 Corrosief/Hevig 
irriterend 
Trichloorazijn-zuur 
(30 %) 76-03-9 Carbonzuur Vloeibaar Klasse 1 Corrosief/Hevig 
irriterend 
2,6-Dichloor-ben ­
zoylchloride 4659-45-4 Acylhalogenide Vloeibaar Klasse 2A Niet-corrosief/Niet- 
hevig irriterend 
Ethyl-2-methylaceto- 
acetaat 609-14-3 Keton, ester Vloeibaar Klasse 2B Niet-corrosief/Niet- 
hevig irriterend 
Ammonium-nitraat 6484-52-2 Anorganisch 
zout Vast Klasse 2A Niet-corrosief/Niet- 
hevig irriterend  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Chemische stof CAS RN Chemische 
klasse (  1 ) Fysische vorm  In-vivo -classifica ­
tie (  2 ) In-vitro -classificatie (  3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alcohol Vloeibaar Niet ingedeeld Niet-corrosief/Niet- 
hevig irriterend 
n-Hexaan 110-54-3 Koolwaterstof 
(acyclisch) Vloeibaar Niet ingedeeld Niet-corrosief/Niet- 
hevig irriterend  
Afkortingen: CAS RN = Chemical Abstracts Service Registry Number 
( 1 ) Scheikundige klassen werden toegekend aan elke teststof aan de hand van een standaardclassificatieschema gebaseerd op het 
classificatiesysteem van de National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (beschikbaar op: http// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Gebaseerd op de resultaten van de  in-vivo -oogtest op konijnen (OESO TG 405) en aan de hand van de UN GHS (3)(7). 
( 3 ) Gebaseerd op resultaten in BCOP en ICE.  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Bijlage 3  
Diagrammen van het ICE-superfusieapparaat en de oogklemmen  
(Zie Burton et al. (17) voor een bijkomende generische beschrijving van 
superfusieapparaat en oogklem)
  ▼M2 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  IN-VITROMICRONUCLEUSTEST BIJ ZOOGDIERCELLEN  
INLEIDING  
1. De in-vitromicronucleusbepaling (MNvit) is een genotoxiciteitstest waar ­
mee micronuclei (MN) in het cytoplasma van interfasecellen worden opge ­
spoord. Micronuclei kunnen ontstaan uit acentrische chromosoomfragmen ­
ten (d.w.z. zonder centromeer) of volledige chromosomen die tijdens het anafasestadium van de celdeling niet naar de polen kunnen migreren. De bepaling spoort de activiteit van clastogene en aneugene chemische stoffen 
(stoffen en mengsels) (1) (2) op in cellen die tijdens of na blootstelling aan 
de teststof celdeling hebben ondergaan. Bij deze testmethode (TM) mogen protocollen met en zonder de actinepolymerisatieremmer cytochalasine B (cytoB) worden gebruikt. De toevoeging van cytoB alvorens de beoogde 
mitose plaatsvindt, maakt identificatie en selectieve analyse mogelijk van 
de micronucleusfrequentie in cellen die één mitose hebben voltooid, omdat dergelijke cellen binucleair zijn (3) (4). Met deze TM is het ook mogelijk 
protocollen zonder cytokineseblokkering te gebruiken op voorwaarde dat 
er bewijzen zijn dat de geanalyseerde celpopulatie mitose heeft ondergaan.
 
2. De MNvit-bepaling kan niet alleen worden gebruikt om chemische stoffen 
(stoffen en mengsels) te identificeren die micronuclei induceren, maar het gebruik van een cytokineseblokkering, de immunochemische labeling van 
kinetochoren of hybridisatie met centromere/telomere proben (fluorescentie  
in situ  hybridisatie (FISH)) kan ook informatie verstrekken over de me ­
chanismen van chromosoombeschadiging en de vorming van micronuclei (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). De labeling- en 
hybridisatieprocedures kunnen worden gebruikt wanneer sprake is van 
een toename van micronucleivorming en de onderzoeker wenst te bepalen of die toename het gevolg is van clastogene en/of aneugene gebeurtenis ­
sen.
 
3. Micronuclei vertonen schade die is doorgegeven aan dochtercellen, terwijl 
in metafasecellen gescoorde chromosoomafwijkingen mogelijk niet door ­
gegeven worden. Omdat micronuclei in interfasecellen op relatief objec ­
tieve wijze kunnen worden beoordeeld, hoeft het laboratoriumpersoneel 
alleen na te gaan of de cellen al dan niet deling hebben ondergaan en 
hoeveel cellen een micronucleus bevatten. Bijgevolg kunnen de preparaten vrij snel worden gescoord en kan de analyse worden geautomatiseerd. Zo wordt het in de praktijk mogelijk om niet honderden, maar duizenden 
cellen per behandeling te scoren, hetgeen de bepaling krachtiger maakt. 
Aangezien micronuclei kunnen ontstaan uit achtergebleven chromosomen, is het tot slot mogelijk om stoffen op te sporen die aneuploïdie induceren 
en die moeilijk onderzocht kunnen worden in conventionele tests op chro ­
mosoomafwijkingen, bv. OESO-testrichtlijn 473 (hoofdstuk B.10 van deze bijlage) (17). Aan de hand van de MNvit-bepaling is het zonder bijzondere technieken, zoals de in punt 2 beschreven FISH, echter niet mogelijk te 
differentiëren tussen stoffen die polyploïdie induceren en stoffen die clas ­
togeniciteit induceren.
 
4. De MNvit-bepaling is een in-vitromethode waarvoor meestal gekweekte 
menselijke cellen of cellen van knaagdieren worden gebruikt. Zij biedt een brede basis voor onderzoek van mogelijke in-vitrobeschadiging van chro ­
mosomen, omdat zowel aneugenen als clastogenen kunnen worden opge ­
spoord.
 
5. De MNvit-bepaling is robuust en effectief in verschillende celtypen en in 
de aanwezigheid of afwezigheid van cytoB. Er zijn uitgebreide gegevens 
die de validiteit van de MNvit-bepaling met behulp van diverse cellijnen 
van knaagdieren (CHO, V79, CHL/IU en L5178Y) en humane lymfocyten ondersteunen (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Hieronder zijn met name begrepen de internationale validerings ­
onderzoeken die zijn gecoördineerd door de Société Française de Toxico ­
logie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) en de verslagen van de International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). De beschikbare gegevens zijn ook opnieuw beoordeeld tijdens een retrospectief valide ­
ringsonderzoek naar het gewicht van de evidentie door het Europees 
Centrum voor de validering van alternatieve methoden (ECVAM) van
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
de Europese Commissie, en de testmethode is door het Raadgevend we ­
tenschappelijk comité van het ECVAM bekrachtigd als wetenschappelijk 
geldig (32) (33) (34). Het gebruik van de humane TK6 lymfoblastoïde cellijn (35), HepG2-cellen (36) (37) en primaire embryocellen van de Syrische hamster (38) is beschreven, hoewel ze niet zijn gebruikt in vali ­
deringsonderzoeken.
 
DEFINITIES  
6. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.  
TOELICHTING  
7. Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole ac ­
tiveringsbron worden gebruikt, tenzij de cellen qua metabolisme competent 
zijn met betrekking tot de geteste stoffen. Het exogene metabole active ­
ringssysteem kan de omstandigheden in vivo niet volledig nabootsen. Er moet ook goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot 
artefactuele positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke 
mutageniteit maar die worden veroorzaakt door veranderingen in factoren zoals opvallende wijzigingen in de pH of de osmolaliteit of door een 
sterke cytotoxiciteit, worden vermeden (39) (40) (41). Indien de teststof 
op het ogenblik van toevoeging een wijziging in de pH van het medium veroorzaakt, moet de pH worden aangepast, bij voorkeur door de stam ­
oplossing te bufferen zodat alle volumes van alle testconcentraties, en voor 
alle controles, dezelfde blijven.
 
8. Om de inductie van micronuclei te analyseren, is het van essentieel belang 
dat zowel in de behandelde als de onbehandelde culturen mitose heeft plaatsgevonden. Het meest informatieve stadium voor het scoren van mi ­
cronuclei is in cellen die één mitose voltooid hebben tijdens of na de 
behandeling met de teststof.
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
9. Culturen van humane cellen of zoogdiercellen worden blootgesteld aan de 
teststof met en zonder een exogene metabole activeringsbron tenzij cellen 
met een toereikende metaboliseringscapaciteit worden gebruikt. In elke test worden gelijktijdig controles met oplosmiddel/medium (VC) en positieve controles (PC) uitgevoerd.
 
10. Tijdens of na blootstelling aan de teststof worden de cellen gekweekt 
tijdens een periode die lang genoeg is om ervoor te zorgen dat chromosoom- of spoeldraadbeschadiging leidt tot de vorming van micro ­
nuclei in interfasecellen. Voor de inductie van aneuploïdie moet de teststof 
gewoon aanwezig zijn tijdens mitose. Geoogste en gekleurde interfasecel ­
len worden onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei. Idealiter mogen micronuclei alleen worden gescoord in de cellen die de mitose hebben voltooid tijdens blootstelling aan de teststof of tijdens de periode 
na de blootstelling, als een dergelijke periode wordt toegepast. In culturen 
die behandeld zijn met een cytokineseblokker wordt dit bereikt door uit ­
sluitend binucleaire cellen te scoren. Wanneer geen cytokineseblokker wordt gebruikt, is het belangrijk aan te tonen dat de onderzochte cellen 
wellicht celdeling hebben ondergaan tijdens of na de blootstelling aan de 
teststof. Het is belangrijk dat alle protocollen aantonen dat celproliferatie zich zowel in de controleculturen als de behandelde culturen heeft voor ­
gedaan, en de mate van door de teststof geïnduceerde cytoxiciteit of cy ­
tostase moet worden beoordeeld in de culturen of (in parallelle culturen) 
die voor micronuclei gescoord zijn.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
BESCHRIJVING VAN DE BEPALING  
Preparaten  
11. Primaire culturen van humane lymfocyten uit perifeer bloed (5) (19) (42) 
(43) en een aantal knaagdiercellijnen zoals CHO, V79, CHL/IU, en 
L5178Y mogen worden gebruikt (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Het gebruik van andere cellijnen en celtypen moet worden verantwoord op basis van hun aangetoonde prestaties in de bepaling, zoals 
beschreven in het hoofdstuk over aanvaardbaarheidscriteria. Omdat de 
achtergrondfrequentie van micronuclei van invloed zal zijn op de gevoe ­
ligheid van de bepaling, wordt aanbevolen dat celtypen met een lage, stabiele achtergrondfrequentie van micronucleusvorming worden gebruikt.
 
12. Humane lymfocyten uit perifeer bloed dienen te worden verkregen van 
gezonde, jonge mensen (ongeveer 18-35 jaar oud), niet-rokers die voor zover bekend onlangs niet zijn blootgesteld aan genotoxische stoffen of straling. Indien cellen van meer dan één donor voor gebruik worden 
gepoold, moet het aantal donors aangegeven worden. De micronucleus ­
frequentie neemt met de leeftijd toe en deze tendens is meer uitgesproken bij vrouwen dan bij mannen (44). Dit moet in aanmerking worden ge ­
nomen bij de selectie van te poolen donorcellen.
 
Media en cultuuromstandigheden  
13. Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstan ­
digheden (kweekvat, CO  2 -concentratie, temperatuur en vochtigheid) voor 
de culturen. Permanente cellijnen en stammen moeten geregeld worden 
gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal chromosomen stabiel 
is en er geen besmetting met mycoplasma heeft plaatsgevonden; indien er wel een besmetting heeft plaatsgevonden of indien het modale aantal chromosomen gewijzigd is, mogen ze niet worden gebruikt. De normale 
tijd voor de celcyclus bij de in het testlaboratorium gebruikte kweek ­
omstandigheden moet bekend zijn. Indien de methode met cytokineseblok ­
ker wordt toegepast, moet de concentratie van de cytokineseremmer wor ­
den geoptimaliseerd voor het welbepaalde celtype en moet deze aantoon ­
baar een goede opbrengst opleveren van binucleaire cellen die vervolgens 
kunnen worden gescoord.
 
Prepareren van de culturen  
14. Permanente cellijnen en stammen: cellen uit stamculturen worden met een 
zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de kolonies niet aan ­
eengroeien in een monolaagcultuur en dat de suspensieculturen voor het 
oogsten geen overmatige dichtheid bereiken, en bij 37 °C geïncubeerd.  
15. Lymfocyten: met een stollingsremmer (bv. heparine) behandeld volledig 
bloed of geïsoleerde lymfocyten worden gekweekt in aanwezigheid van 
een mitogeen (bv. fytohemagglutinine (PHA)), voordat ze aan de teststof 
en cytoB worden blootgesteld.  
Metabolische activering  
16. Exogene metabole activeringssystemen moeten worden gehanteerd bij het 
gebruik van cellen met ontoereikende endogene metabole capaciteit. Het 
meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met 
een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behan ­
deld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (45) (46) of een combinatie van fenobarbiton en β-naftoflavon (46) (47) (48) (49). De 
laatste combinatie druist niet in tegen het Verdrag van Stockholm inzake 
persistente organische verontreinigende stoffen (50) en Verordening (EG) nr. 850/2004 betreffende persistente organische verontreinigende stoffen (66). Bovendien is aangetoond dat zij even effectief is als Aroclor 1254 
voor de inducering van oxidasen met gemengde functie (46) (47) (48) 
(49). De S9-fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1- 10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn 
van de aard van de geteste chemische verbinding en het kan in sommige 
gevallen aangewezen zijn om meer dan een S9-concentratie te gebruiken.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Genetisch aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen van 
mensen of knaagdieren tot expressie komen, kunnen de behoefte aan een 
exogeen metabool activeringssysteem elimineren en mogen als testcellen worden gebruikt. In zulke gevallen moet voor de keuze van de gebruikte cellijnen een wetenschappelijke verantwoording worden gegeven (bv. aan 
de hand van de relevantie van de oxidasen met gemengde functie voor het 
metabolisme van de teststof (51), en hun reactievermogen op bekende clastogenen en aneugenen (zie afzonderlijk gedeelte over aanvaardbaar ­
heidscriteria). Er dient te worden erkend dat de geteste stof misschien 
niet wordt gemetaboliseerd door de tot expressie gekomen oxidase(n) 
met gemengde functie; in dit geval zouden negatieve resultaten er niet op wijzen dat de teststof geen micronuclei kan induceren.
 
Teststof/Bereiding  
18. Vaste stoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opge ­
lost en, eventueel, vóór de behandeling van de cellen worden verdund. Vloeibare stoffen kunnen rechtstreeks aan het testsysteem worden toe ­
gediend en/of vóór de behandeling worden verdund. Bij het testen van 
gassen of vluchtige stoffen moeten geschikte aanpassingen van de stan ­
daardprotocollen worden gevolgd, zoals de behandeling in gesloten vaten (52) (53). Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, 
moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt.
 
Testomstandigheden  
Oplosmiddelen/media  
19. Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof moeten 
uitgesloten zijn of het oplosmiddel/medium moet onverenigbaar zijn met het overleven van de cellen of het behoud van de S9-activiteit bij de gebruikte concentratie. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media 
(bv. water, celkweekmedium, dimethylsulfoxide) worden gebruikt, moeten 
gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze verenigbaar zijn met de teststof en dat zij geen genetische toxiciteit vertonen. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan 
worden gebruikt.
 
Gebruik van cytoB als cytokineseblokker  
20. Een van de belangrijkste overwegingen bij de uitvoering van de 
MNvit-bepaling is ervoor te zorgen dat de cellen die worden gescoord tijdens de behandeling of de incubatieperiode na de behandeling, als deze wordt toegepast, de mitose hebben voltooid. CytoB is de stof die 
het meest wordt gebruikt om cytokinese te blokkeren, omdat zij de samen ­
stelling van actine afremt en derhalve de scheiding van dochtercellen na mitose voorkomt, wat leidt tot de vorming van binucleaire cellen (5) (54) (55). Micronucleusscoring kan daarom worden beperkt tot cellen die tij ­
dens of na behandeling mitose hebben ondergaan. Tegelijkertijd kan het 
effect van de teststof op de celproliferatiekinetiek worden gemeten. CytoB dient als cytokineseblokker te worden gebruikt wanneer menselijke lym ­
focyten worden gebruikt omdat de tijden voor de celcyclus tussen de 
culturen en tussen de donors variabel zullen zijn en omdat niet alle lym ­
focyten op PHA zullen reageren. Andere methoden zijn gebruikt tijdens het testen van cellijnen om vast te stellen of de gescoorde cellen zich gedeeld hebben; deze worden hierna besproken (zie punt 26).
 
21. De geschikte cytoB-concentratie dient door het laboratorium voor elk 
celtype te worden bepaald om de optimale frequentie van binucleaire 
cellen te verkrijgen in de controleculturen van de oplosmiddelen/media. 
De geschikte cytoB-concentratie is doorgaans tussen 3 en 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Meting van celproliferatie en cytotoxiciteit en keuze van blootstellings ­
concentraties  
22. Bij de bepaling van de hoogste te testen concentratie van de teststof 
moeten concentraties worden vermeden die kunnen leiden tot artefactuele positieve reacties, zoals reacties die bovenmatige cytotoxiciteit voortbren ­
gen, neerslag in het cultuurmedium en uitgesproken wijzigingen in pH of 
osmolaliteit (39) (40) (41).
 
23. Metingen van celproliferatie worden verricht om er zeker van te zijn dat de 
behandelde cellen tijdens de bepaling mitose hebben ondergaan en dat de behandelingen worden uitgevoerd met de passende mate van cytotoxiciteit 
(zie punt 29). Cytotoxiciteit dient te worden bepaald met en zonder me ­
tabole activering in cellen die metabole activering nodig hebben met be ­
hulp van de relatieve toename van de celpopulatie (RICC) of de relatieve populatieverdubbeling (RPD) (zie aanhangsel 2 voor formules) tenzij cy ­
toB wordt gebruikt. Wanneer cytoB wordt gebruikt, kan de cytotoxiciteit 
worden bepaald met behulp van de replicatie-index (RI) (zie aanhangsel 2 voor formule).
 
24. De behandeling van culturen met cytoB en de meting van de relatieve 
frequenties van mononucleaire, binucleare en multinucleaire cellen in de 
cultuur verschaft een nauwkeurige methode om het effect van een behan ­
deling op de celproliferatie en de cytotoxische of cytostatische activiteit te kwantificeren (5) en zorgt ervoor dat alleen cellen worden gescoord die 
zich tijdens of na de behandeling hebben gedeeld.
 
25. In studies met cytoB kan cytostase/cytotoxiciteit worden gekwantificeerd 
met behulp van de cytokineseblokproliferatie-index (CBPI) (5) (26) (56) of kan deze worden afgeleid van de RI van minstens 500 cellen per cultuur 
(zie aanhangsel 2 voor formules). Wanneer cytoB wordt gebruikt om de 
celproliferatie te beoordelen, moet een CBPI of RI worden bepaald op basis van minstens 500 cellen per cultuur. Deze metingen kunnen onder meer worden gebruikt om de cytotoxiciteit te schatten door de waarden in 
de behandelde culturen en de controleculturen met elkaar te vergelijken. 
De beoordeling van andere cytotoxiciteitsmarkers (bv. aaneengroeien, aan ­
tal cellen, apoptose, necrose, metafasetelling) kan nuttige informatie op ­
leveren.
 
26. In studies zonder cytoB moet worden aangetoond dat de in de cultuur 
gescoorde cellen deling hebben ondergaan tijdens of na de behandeling van de teststof, anders kunnen er valsnegatieve reacties worden gegene ­
reerd. Methoden die gebruikt zijn om ervoor te zorgen dat gedeelde cellen 
worden gescoord zijn onder meer het inbrengen en vervolgens opsporen 
van broomdeoxyuridine (BrdU) om cellen met replicaat te identificeren (57), de vorming van klonen wanneer cellen van permanente cellijnen  in 
situ worden behandeld en gescoord op een voorwerpglaasje van een mi ­
croscoop (proliferatie-index (PI)) (25) (26) (27) (28), of de meting van de 
relatieve populatieverdubbeling (RPD) of relatieve toename van de celpopulatie (RICC) of andere beproefde methoden (16) (56) (58) (59) (zie aanhangsel 2 voor formules). De beoordeling van andere markers 
voor cytotoxiciteit of cytostase (bv. aaneengroeien, aantal cellen, apoptose, 
necrose, metafasetelling) kan nuttige informatie verschaffen.
 
27. Er moeten ten minste drie analyseerbare testconcentraties worden beoor ­
deeld. Om dit te bereiken, kan het nodig zijn om het experiment uit te 
voeren met een groter aantal dicht bij elkaar liggende concentraties en de 
micronucleusvorming te analyseren in die concentraties die het passende bereik van cytotoxiciteiten bieden. Een alternatieve strategie bestaat erin een voorafgaande cytoxiciteitstest uit te voeren om het bereik voor de 
definitieve test te beperken.
 
28. Bij de hoogste concentratie moet worden gestreefd naar 55 ± 5 % cyto ­
toxiciteit. Hogere niveaus kunnen leiden tot chromosoombeschadiging als neveneffect van cytotoxiciteit (60). Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, 
moeten de testconcentraties een interval van 55 ± 5 % cytotoxiciteit tot 
geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Als geen cytotoxiciteit of neerslag wordt waargenomen, moet de hoogste 
testconcentratie overeenstemmen 0,01 M, 5 mg/mL of 5 μl/mL (de laagste 
van deze drie). De voor analyse geselecteerde concentraties moeten in het algemeen van elkaar gescheiden zijn door een interval van niet meer dan 10. Voor teststoffen die een steile concentratie/responscurve vertonen, zal 
het wellicht nodig zijn om de intervallen van de teststofconcentraties 
dichter bij elkaar te leggen zodat ook de culturen in het matige en lage toxiciteitsbereik gescoord zullen worden.
 
30. Wanneer oplosbaarheid een beperkende factor is, moet de maximale con ­
centratie, indien niet beperkt door de cytotoxiciteit, de laagste concentratie 
zijn waarbij in de culturen een minimale neerslag zichtbaar is, op voor ­
waarde dat het scoren niet wordt verstoord. De neerslag moet worden beoordeeld aan de hand van methoden zoals onderzoek met de lichtmicro ­
scoop, waarbij neerslag wordt vastgesteld die aanhoudt of die verschijnt 
tijdens de cultuur (aan het einde van de behandeling).
 
Controle  
31. Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en oplosmiddel/medium- 
controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering.  
32. Positieve controles zijn nodig om aan te tonen dat de gebruikte cellen, en 
het testprotocol, clastogenen en aneugenen kunnen identificeren en om de metabole capaciteit van het S9-preparaat te bevestigen. Voor de positieve 
controle dienen bekende induceerders van micronucleusvorming te worden 
gebruikt in concentraties die naar verwachting kleine, maar reproduceer ­
bare stijgingen ten opzichte van het achtergrondniveau zullen geven en de gevoeligheid van het testsysteem aantonen. De concentraties van de po ­
sitieve controle moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk 
zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig her ­
kenbaar zijn.
 
33. Een clastogeen dat metabole activering nodig heeft (bv. cyclofosfamide; 
benzo[a]pyreen) dient te worden gebruikt om het metabole vermogen van 
het testsysteem aan te tonen en om aan te tonen dat het testsysteem in staat is om clastogenen te detecteren. Ook andere positieve controles mogen worden gebruikt, maar moeten worden gerechtvaardigd. Omdat sommige 
positieve controles waarvoor metabole activering nodig is in bepaalde 
behandelingsomstandigheden of in bepaalde cellijnen actief kunnen zijn zonder exogene metabole activering, moet in de geselecteerde cellijn en bij de geselecteerde concentraties worden getest of metabole activering 
noodzakelijk is en of het S9-preparaat actief is.
 
34. Op dit ogenblik zijn er geen aneugenen bekend die metabole activering 
nodig hebben voor hun genotoxische activiteit (16). Positieve controles die momenteel worden erkend voor aneugene activiteit zijn bijvoorbeeld col ­
chicine en vinblastine. Andere stoffen mogen worden gebruikt indien zij 
uitsluitend, of voornamelijk, door aneugene activiteit micronuclei induce ­
ren. Om te voorkomen dat er twee positieve controles (voor clastogenici ­
teit en aneugeniciteit) zonder metabole activering nodig zijn, kan de aneu ­
geniciteitscontrole dienen als positieve controle zonder S9, en kan de 
clastogeniciteitscontrole worden gebruikt om te testen of het gebruikte metabole activeringssysteem adequaat is. Positieve controles voor zowel clastogeniciteit als aneugeniciteit moeten worden gebruikt in cellen waar ­
voor geen S9 nodig is. De voorgestelde positieve controles zijn opge ­
nomen in aanhangsel 3.
 
35. Wanneer geschikte stoffen beschikbaar zijn, kan het gebruik van stoffen 
uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwo ­
gen. Alle aangewende positieve controles dienen geschikt te zijn voor het 
celtype en de activeringsomstandigheden.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Voor elk oogsttijdstip dienen oplosmiddel/medium-controles in het experi ­
ment te worden opgenomen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde ne ­
gatieve controles (zonder oplosmiddel/medium) worden gebruikt, tenzij in het verleden in het laboratorium of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen genotoxische of andere schadelijke effecten 
veroorzaakt.
 
UITVOERING VAN DE PROEF  
Behandelingsschema  
37. Voor een maximale kans op detectie van een aneugeen of clastogeen dat 
actief is in een specifiek stadium in de celcyclus, is het belangrijk dat voldoende aantallen cellen tijdens alle stadia van hun celcyclus met de 
teststof worden behandeld. Het behandelingsschema voor cellijnen en pri ­
maire celculturen kan daarom enigszins verschillen van dat voor lymfocy ­
ten die mitogene stimulering nodig hebben om hun celcyclus aan te vatten - deze worden besproken in punten 41-43 (16).
 
38. Theoretische overwegingen en gegevens uit de literatuur (18) wijzen erop 
dat de meeste aneugenen en clastogenen zullen worden gedetecteerd in een korte behandelingsperiode van 3 tot 6 uur in aanwezigheid en afwezigheid van S9, gevolgd door de verwijdering van de teststof en een groeiperiode 
van 1,5 - 2,0 celcycli (6). Cellen worden bemonsterd op een tijdstip dat 
overeenkomt met ongeveer 1,5 - 2,0 maal de normale (d.w.z. onbehan ­
delde) lengte van een celcyclus na het begin of aan het einde van de behandeling (zie tabel 1). De bemonsterings- of hersteltijden kunnen wor ­
den verlengd als bekend is of vermoed wordt dat de teststof de celcyclus ­
duur beïnvloedt (bv. bij het testen van nucleosideanalogen).
 
39. Omwille van de mogelijke cytotoxiciteit van S9-preparaten voor ge ­
kweekte zoogdiercellen, wordt een verlengde blootstellingsbehandeling van 1,5 - 2,0 normale celcycli alleen gebruikt zonder S9. Bij de verlengde 
behandeling worden keuzes geboden om de behandeling van de cellen met 
de teststof toe te staan met of zonder cytoB. Deze keuzes zijn bedoeld voor situaties waarin ongerustheid kan bestaan over mogelijke interacties tussen de teststof en cytoB.
 
40. De voorgestelde celbehandelingsschema's zijn weergegeven in tabel 1. 
Deze algemene behandelingsschema's kunnen worden gewijzigd afhanke ­
lijk van de stabiliteit of reactiviteit van de teststof of de bijzondere groei ­
kenmerken van de gebruikte cellen. Alle behandelingen dienen te beginnen 
en te eindigen terwijl de cellen exponentieel groeien. Deze schema's wor ­
den uitvoeriger besproken in punten 41-47.  
Tabel 1  
Celbehandeling en oogsttijdstippen voor de MNvit-bepaling  
Lymfocyten, primaire cellen en cellijnen be ­
handeld met cytoB + S9 3-6 uur behandelen in aanwezigheid van S9; 
de S9 en het behandelingsmedium verwijderen; 
vers medium en cytoB toevoegen; 
1,5 - 2,0 normale celcycli daarna oogsten. 
– S9 
Korte blootstelling 3-6 uur behandelen; 
het behandelingsmedium verwijderen; 
vers medium en cytoB toevoegen; 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna oogsten.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Verlengde 
blootstelling  Optie A:  Gedurende 1,5 - 2 normale celcycli 
behandelen in aanwezigheid van cytoB; 
oogsten aan het einde van de blootstellingsperi ­
ode. 
Optie B:  Gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli 
behandelen; 
de teststof verwijderen; vers medium en cytoB toevoegen; 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna oogsten. 
Cellijnen behandeld zonder cytoB 
(Identiek aan de hierboven geschetste behandelingsschema's met de uitzondering dat geen cytoB wordt toegevoegd)
 
Lymfocyten, primaire cellen en cellijnen met cytoB  
41. Wat lymfocyten betreft is de doeltreffendste aanpak de blootstelling aan de 
teststof 44-48 uur na de PHA-stimulering te starten, wanneer de cyclussyn ­
chronisatie verdwenen is (5). In de voorlopige bepaling worden cellen 
gedurende 3 tot 6 uur zowel met als zonder S9 met de teststof behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en vervangen door vers me ­
dium met cytoB, en de cellen worden 1,5 - 2,0 normale celcycli later 
geoogst.
 
42. Als beide voorlopige tests met de korte (3-6 uur) behandeling negatief of 
onduidelijk zijn, wordt een volgende behandeling met langere blootstel ­
ling, zonder S9 gebruikt. Er zijn twee behandelingskeuzes mogelijk die 
allebei aanvaardbaar zijn. Het kan echter passender zijn om voor optie A 
te kiezen voor gestimuleerde lymfocyten wanneer de exponentiële groei 96 uur na de stimulering mogelijk afneemt. De celculturen mogen ook niet samengevloeid zijn op het ogenblik dat in optie B het laatste monster 
wordt genomen.
 
— Optie A: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de 
teststof behandeld en aan het einde van de behandelingstijd geoogst.  
— Optie B: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de 
teststof behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en ver ­
vangen door vers medium, en de cellen worden na bijkomende 1,5 - 
2,0 normale celcycli geoogst.  
43. Primaire cellen en cellijnen dienen op een gelijkaardige wijze te worden 
behandeld als lymfocyten behalve dat het niet nodig is ze gedurende 44-48 
uur met PHA te stimuleren. Andere cellen dan lymfocyten dienen zo te 
worden blootgesteld dat de cellen zich op het ogenblik waarop de studie eindigt nog in log-fasegroei bevinden.
 
Cellijnen zonder cytoB  
44. Cellen dienen 3-6 uur zowel met als zonder S9 te worden behandeld. Het 
behandelingsmedium wordt verwijderd en vervangen door vers medium, 
en de cellen worden 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna geoogst.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Als beide voorlopige tests met de korte (3-6 uur) behandeling negatief of 
onduidelijk zijn, wordt een volgende behandeling met langere blootstelling 
(zonder S9) gebruikt. Er zijn twee behandelingskeuzes mogelijk die allebei even aanvaardbaar zijn:
 
— Optie A: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de 
teststof behandeld en aan het einde van de behandelingstijd geoogst.  
— Optie B: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de 
teststof behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en ver ­
vangen door vers medium, en de cellen worden na bijkomende 1,5 - 
2,0 normale celcycli geoogst.  
46. In monolagen kunnen aan het einde van de 3-6 uur durende behandeling 
mitotische cellen (herkenbaar aan hun ronde vorm en het feit dat ze los ­
laten van het oppervlak) aanwezig zijn. Omdat deze mitotische cellen 
gemakkelijk loskomen, kunnen ze verloren gaan wanneer het medium 
met de teststof wordt verwijderd. Daarom moeten deze cellen zorgvuldig worden verzameld wanneer de culturen worden gewassen, en vervolgens terug in de culturen gebracht, opdat er geen cellen in mitose, en die gevaar 
voor micronuclei lopen, op het oogsttijdstip verloren gaan.
 
Aantal culturen  
47. Voor elke concentratie van de teststof en voor culturen met het medium/de 
oplossing en culturen met negatieve controle moeten twee culturen worden gebruikt. Wanneer aan de hand van laboratoriumgegevens uit het verleden kan worden aangetoond dat de verschillen tussen duploculturen minimaal 
zijn, kan het gebruik van één cultuur voor elke concentratie aanvaardbaar 
zijn. Wanneer één cultuur wordt gebruikt, wordt aanbevolen om een hoger aantal concentraties te analyseren.
 
Oogsten van de cellen en bereiding van de objectglaasjes  
48. Elke cultuur wordt afzonderlijk geoogst en verwerkt. Het prepareren van 
de cellen kan een hypotone behandeling inhouden, maar deze stap is niet 
nodig als op een andere manier toereikende cellenspreiding wordt gerea ­
liseerd. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt bij de bereiding van de objectglaasjes op voorwaarde dat er voor het scoren hoogwaardige celpreparaten worden verkregen. Het celcytoplasma moet behouden blijven 
om de detectie van micronuclei en (in de methode met cytokineseblokker) 
betrouwbare identificatie van binucleaire cellen mogelijk te maken.
 
49. De objectglaasjes kunnen worden gekleurd met behulp van diverse me ­
thoden, zoals Giemsa of fluorescerende DNA-specifieke kleurstoffen (59). Door het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof (bv. acridine oranje 
(61) of Hoechst 33258 plus pyronine-Y (62)) kunnen sommige artefacten 
die zich bij het gebruik van niet voor DNA specifieke kleurstoffen kunnen voordoen, worden voorkomen. Antikinetochore antilichamen, FISH met pancentromere DNA-proben of geprepareerde  in situ  labeling met 
pancentromeer-specifieke primers, samen met de passende 
DNA-tegenkleuring, kunnen worden gebruikt om de inhoud (chromosoom/ chromosoomfragment) van micronuclei te identificeren indien de mecha ­
nistische informatie over hun vorming van belang is (15) (16). Andere 
methoden voor differentiatie tussen clastogenen en aneugenen kunnen 
worden gebruikt indien is aangetoond dat zij doeltreffend zijn.
 
Analyse  
50. Alle objectglaasjes, ook die van het oplosmiddel/medium en de controles, 
worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Volgens een alternatieve methode kunnen gecodeerde monsters worden geanaly ­
seerd met behulp van een gevalideerde automatische stromingscytometer 
of een beeldanalysesysteem.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. In met cytoB behandelde culturen moeten de micronucleusfrequenties wor ­
den geanalyseerd in ten minste 2 000 binucleaire cellen per concentratie 
(ten minste 1 000 binucleaire cellen per cultuur; twee culturen per con ­
centratie). Indien één cultuur wordt gebruikt, moeten ten minste 2 000 binucleaire cellen per concentratie van die cultuur worden gescoord. Als 
er in elke concentratie aanzienlijk minder dan 1 000 binucleaire cellen per 
cultuur, of 2 000 bij gebruik van één cultuur, beschikbaar zijn voor sco ­
ring, en als er geen aanzienlijke toename van micronuclei wordt gedetec ­
teerd, moet de test worden herhaald met behulp van meer cellen, of met 
minder toxische concentraties, naargelang het geval. Er moet gezorgd 
worden dat er geen binucleaire cellen met onregelmatige vorm worden gescoord of cellen waarvan de twee nuclei sterk in grootte verschillen; ook mogen binucleaire cellen niet worden verward met slecht verspreide 
multinucleaire cellen. Cellen die meer dan twee hoofdnuclei bevatten, 
mogen niet op micronuclei worden geanalyseerd, aangezien de basismicro ­
nucleusfrequentie in deze cellen hoger kan zijn (63) (64). Het scoren van mononucleaire cellen is aanvaardbaar indien is aangetoond dat de teststof 
de cytoB-activiteit stoort.
 
52. In cellijnen die zonder behandeling met cytoB worden bepaald, moeten 
micronuclei worden gescoord in ten minste 2 000 cellen per concentratie (ten minste 1 000 cellen per cultuur; twee culturen per concentratie). Wan ­
neer slechts één cultuur per concentratie wordt gebruikt, moeten ten minste 
2 000 cellen van die cultuur worden gescoord.
 
53. Wanneer cytoB wordt gebruikt, moet een CBPI of een RI worden vast ­
gesteld om de celproliferatie te beoordelen (zie aanhangsel 2) met behulp 
van ten minste 500 cellen per cultuur. Wanneer de behandelingen worden uitgevoerd zonder cytoB, is het essentieel dat er bewijs wordt geleverd dat de cellen die gescoord worden zich hebben voortgeplant, zoals besproken 
in punten 24-27.
 
Aanvaardbaarheidscriteria  
54. Een laboratorium dat voorstelt om de in deze testmethode beschreven 
MNvit-bepaling te gebruiken, dient aan te tonen dat het in staat is om op betrouwbare en nauwkeurige wijze stoffen met bekende aneugene en 
clastogene activiteit te detecteren, met en zonder metabole activering, 
evenals bekende negatieve stoffen, met behulp van de referentiestoffen in aanhangsel 3. Als bewijs van zijn vermogen om deze testmethode correct uit te voeren, dient het laboratorium bewijs te leveren dat de cellen 
die voor micronucleusvorming worden gescoord één kerndeling hebben 
voltooid indien de test wordt uitgevoerd zonder gebruik van cytoB.
 
55. De chemische stoffen in aanhangsel 3 worden aanbevolen voor gebruik als 
referentiestoffen. Vervangende of aanvullende stoffen kunnen worden op ­
genomen als hun activiteit bekend is en als ze micronuclei induceren met behulp van dezelfde actiemechanismen, en als wordt aangetoond dat zij relevant zijn voor de stoffen die met behulp van de MNvit-procedure 
zullen worden getest. De rechtvaardiging kan bestaan in een validerings ­
onderzoek dat gebruikmaakt van een brede keuze aan stoffen of dat gericht is op een smaller spectrum op basis van de chemische klasse van de teststof of het beschadigingsmechanisme dat wordt onderzocht.
 
56. Oplosmiddel/mediumcontrole en onbehandelde culturen dienen reprodu ­
ceerbaar lage en consistente micronuclei frequenties op te leveren (door ­
gaans 5-25 micronuclei/1 000 cellen voor de celtypen die zijn geïdentifi ­
ceerd in punt 11). Andere celtypen kunnen verschillende responsbereiken 
vertonen die moeten worden bepaald tijdens hun validering voor gebruik 
in de MNvit-bepaling. Gegevens van negatieve controle, oplosmiddelcon ­
trole en positieve controle moeten worden aangewend om historische con ­
trolebereiken vast te stellen. Deze gegevens moeten worden gebruikt om te 
beslissen over de geschiktheid van de gelijktijdig uitgevoerde negatieve/ 
positieve controles voor een experiment.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Indien voor de bepaling kleine wijzigingen aan het protocol (bv. gebruik 
van automatische in plaats van handmatige scoringstechnieken; gebruik 
van een nieuw celtype) worden voorgesteld, moet de doeltreffendheid van de wijziging worden aangetoond voordat het gewijzigde protocol aan ­
vaardbaar voor gebruik kan worden geacht. Aantonen dat het gewijzigde 
protocol doeltreffend is, omvat aantonen dat de belangrijkste mechanismen 
van chromosoombreuken en chromosoomwinst of -verlies kunnen worden gedetecteerd en dat passende positieve en negatieve resultaten kunnen worden bereikt voor de klasse van de individuele stof, of het brede bereik 
van de stoffen die getest moet(en) worden.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
58. Als de techniek met de cytokineseblokker wordt gebruikt, worden alleen 
de frequenties van binucleaire cellen met micronuclei (onafhankelijk van 
het aantal micronuclei per cel) gebruikt bij de evaluatie van micronucleu ­
sinductie. Het scoren van de aantallen cellen met één, twee of meer mi ­
cronuclei kan nuttige informatie opleveren, maar is niet verplicht.  
59. Gelijktijdige metingen van de cytotoxiciteit en/of cytostase voor alle be ­
handelde en oplosmiddel/medium controleculturen dienen te worden vast ­
gesteld (58). De CBPI of RI moeten worden berekend voor alle behan ­
delde en controleculturen als meting van celcyclusvertraging wanneer de methode met de cytokineseblokker wordt gebruikt. Als er geen cytoB 
wordt gebruikt, moeten de RPD of de RICC of PI worden gebruikt (zie 
aanhangsel 2).
 
60. De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast 
moet een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden gegeven.  
61. Stoffen die micronuclei in de MNvit-bepaling induceren, kunnen dit doen 
omdat ze chromosoombreuken, chromosoomverlies of een combinatie van beide induceren. Verdere analyse aan de hand van antikinetochore antili ­
chamen, centromeerspecifieke  in situ  proben of andere methoden mogen 
worden gebruikt om vast te stellen of het mechanisme van micronucleu ­
sinductie te wijten is aan clastogene en/of aneugene activiteit.
 
Evaluatie en interpretatie van de resultaten  
62. Een duidelijk positieve of negatieve reactie behoeft niet te worden beves ­
tigd door aanvullende tests. Onduidelijke resultaten kunnen worden opge ­
helderd door de analyse van nogmaals 1 000 cellen uit alle culturen om verlies van blindering te voorkomen. indien deze aanpak geen oplossing 
biedt voor het resultaat, moeten verdere testen worden verricht. Bij ver ­
volgexperimenten dient wijziging van parameters te worden overwogen om, indien nodig, de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen 
zijn bijvoorbeeld de testconcentratie-intervallen, de tijdstippen van behan ­
deling en oogst van de cellen en de omstandigheden bij metabole active ­
ring.
 
63. Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals 
een concentratieafhankelijke of een statistisch significante stijging van het 
aantal cellen met micronuclei. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. De overweging of de waar ­
genomen waarden binnen of buiten het historische controlebereik vallen, 
kan als leidraad dienen tijdens de beoordeling van de biologische rele ­
vantie van de respons. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresulta ­
ten kunnen passende statistische methoden worden gebruikt (65). De re ­
sultaten van statistische tests moeten echter worden beoordeeld met be ­
trekking tot de dosis-effectrelatie. Reproduceerbaarheid en gegevens uit het 
verleden moeten ook in aanmerking worden genomen.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten 
zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de 
teststof in sommige gevallen onmogelijk zijn. Deze onduidelijke of twijfel ­
achtige responsen kunnen zich blijven voordoen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald.
 
65. Positieve resultaten bij de MNvit-bepaling wijzen erop dat de teststof in 
gekweekte zoogdiercellen chromosoombreuk of chromosoomverlies indu ­
ceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandig ­
heden in gekweekte zoogdiercellen geen chromosoombreuken en/of chro ­
mosoomwinst of -verlies induceert.  
Testverslag  
66. Het testverslag dient ten minste de volgende informatie te bevatten, indien 
relevant voor het voeren van het onderzoek:  
Onderzochte stof:  
— identificatiegegevens, nummer bij de Chemical Abstracts 
Service (CAS) en EG-nummer;  
— fysische toestand en zuiverheid;  
— fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het onder ­
zoek relevant zijn;  
— reactiviteit van de teststof met het oplosmiddel/medium of de celcul ­
tuurmedia;  
Oplosmiddel/Medium:  
— motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium;  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium;  
Cellen:  
— type en bron van de gebruikte cellen;  
— bruikbaarheid van het gebruikte celtype;  
— afwezigheid van mycoplasma, indien van toepassing;  
— informatie over de lengte van de celcyclus, verdubbelingstijd of 
proliferatie-index;  
— wanneer er lymfocyten worden gebruikt, het geslacht, de leeftijd en het 
aantal bloeddonors, indien van toepassing;  
— indien lymfocyten worden gebruikt, of volledig bloed dan wel ge ­
ïsoleerde lymfocyten zijn blootgesteld;  
— aantal overentingen, indien van toepassing;  
— methoden om de celculturen in leven te houden, indien van toepassing;  
— modaal aantal chromosomen;  
— normale tijd voor de celcyclus (negatieve controle);  
Testomstandigheden:  
— naam van de cytokineseblokker (bv. cytoB), indien gebruikt, de con ­
centratie ervan en de blootstellingsduur;  
— achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal culturen, 
met inbegrip van gegevens over de cytotoxiciteit en beperkte oplos ­
baarheid, indien beschikbaar;  
— samenstelling van het medium en CO  2 -concentratie, indien van toepas ­
sing;  
— concentraties van de teststof;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— toegevoegde concentratie (en/of volume) van het medium en de test ­
stof; 
— incubatietemperatuur en -tijd;  
— duur van de behandeling;  
— oogsttijdstip na behandeling;  
— celdichtheid bij het enten, indien van toepassing;  
— aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met in ­
begrip van aanvaardbaarheidscriteria;  
— positieve controlestoffen en negatieve controles;  
— gebruikte methoden voor de bereiding van de objectglaasjes en kleu ­
ringstechniek.  
— criteria voor micronucleusidentificatie;  
— aantal geanalyseerde cellen;  
— methoden voor de meting van de cytotoxiciteit;  
— eventuele aanvullende gegevens met betrekking tot de cytotoxiciteit:  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk 
is; 
— toegepaste methode(n) van statistische analyse;  
— methoden, zoals het gebruik van een kinetochoor-antilichaam, om na te 
gaan of micronuclei volledige of gedeeltelijke chromosomen bevatten, 
indien van toepassing;  
Resultaten:  
— toegepaste meting van cytotoxiciteit, bv. CBPI of RI in het geval van 
de methode met cytokineseblokker; RICC, RPD of PI wanneer de 
methoden met cytokineseblokker niet worden toegepast; andere waar ­
nemingen wanneer van toepassing, bv. aaneengroei van cellen, apopto ­
se, necrose, metafasetelling, frequentie van binucleaire cellen;  
— neerslagverschijnselen;  
— gegevens over de pH en de osmolaliteit van het behandelingsmedium, 
indien bepaald;  
— definitie van aanvaardbare cellen voor analyse;  
— distributie van mono-, bi- en multinucleaire cellen indien een methode 
met cytokineseblokker wordt toegepast;  
— aantal cellen met micronuclei, afzonderlijk vermeld voor elke behan ­
delde en controlecultuur, en bepaling of deze behoren tot binucleaire of mononucleaire cellen, indien van toepassing;
 
— indien mogelijk het verband tussen concentratie en respons;  
— scheikundige gegevens (concentraties en oplosmiddelen) over tegelij ­
kertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve con ­
troles;  
— scheikundige gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve 
(oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van 
spreiding, gemiddelde, standaardafwijking en betrouwbaarheidsinterval (bv. 95 %);
 
— statistische analyse; eventuele p-waarden;  
Bespreking van de resultaten  
Conclusies  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
LITERATUUR  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1-4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3-15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233-246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167-172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus me ­
thod in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193-198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34-43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9-20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using Crest antibodies compared to  in situ  hybridization with bio ­
tinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297-302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329-334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205-213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519-525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hy ­
perdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes 
following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multico ­
lor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9-20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific cen ­
tromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 
372, 233-245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211-219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153-163.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13-36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37-60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61-87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobay ­
ashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and 
Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88-124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), 
SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125-152.  
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187-208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 45- 
59. 
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81-116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells - comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183-190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55-71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137-163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123-134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569-580.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1-152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16-17 november, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/in ­
dex.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Re ­
view, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, Summary 
and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/ 
index.htm]  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271-283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and So ­
funi, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105-115.
 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257-260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315-328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61-70.
 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under ex ­
treme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147-205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297- 
305. 
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789-886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lym ­
phocytes,  Mutation Res. , 147, 29-36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11-18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173-215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55-65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175-177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51-59.  
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http:// 
www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247-274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mu ­
tation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., 
Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. 
New York, Plenum, pp. 91-103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795-801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detai ­
led description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35-44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103-112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97-100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61-65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1-3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169-184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191-201.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241-247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269-275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation Res. , 
120, 241-247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65-75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467.  
(66) Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Coun ­
cil of 29 april 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEC, OJ L 229, 30.4.2004, p. 5.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Aanhangsel 1  
Definities  
Aneugeen:  elke stof die of elk proces dat leidt tot aneuploïdie in cellen of 
organismen door de wisselwerking met componenten van de mitose en meiose 
in de celdelingscyclus.  
Aneuploïdie:  elke afwijking van het normale diploïde (of haploïde) aantal chro ­
mosomen met één chromosoom of meer dan één chromosoom, maar niet met 
(een) volledige reeks(en) chromosomen (polyploïdie).  
Apoptose:  geprogrammeerde celdood, gekenmerkt door een reeks stappen die 
leiden tot de afbraak van cellen in door membraan samengehouden deeltjes die vervolgens worden geëlimineerd door fagocytose of door verwijdering.
 
Celproliferatie:  toename van het aantal cellen als gevolg van mitose.  
Centromeer:  DNA-plek van een chromosoom waar beide chromatiden worden 
samengehouden en waar beide kinetochoren zij aan zij zijn aangehecht.  
Clastogeen:  elke stof die of elk proces dat structurele chromosoomafwijkingen 
veroorzaakt in celpopulaties of organismen.  
Cytokinese:  deling van de cel onmiddellijk na de mitose, waarbij twee dochter ­
cellen worden gevormd die elk één nucleus bevatten.  
Cytokineseblokproliferatie-index (CBPI):  de verhouding cellen na tweede deling 
in de behandelde populatie ten opzichte van de onbehandelde controlegroep (zie 
aanhangsel 2 voor formule).  
Cytostase:  afremming van celgroei (zie aanhangsel 2 voor formule).  
Cytotoxiciteit:  schadelijke gevolgen voor de celstructuur of -functie die uiteinde ­
lijk celdood veroorzaken.  
Genotoxisch:  een algemene term die alle typen DNA- of chromosoombeschadi ­
ging omvat, waaronder breuken, adductherschikkingen, mutaties, chromosoom ­
afwijkingen en aneuploïdie. Niet alle soorten genotoxische effecten leiden tot 
mutaties of stabiele chromosoombeschadiging.  
Interfasecellen:  cellen die zich niet in het stadium van de mitose bevinden.  
Kinetochoor:  een hoofdzakelijk uit eiwitten bestaande structuur die zich assem ­
bleert nabij het centromeer van een chromosoom en waar tijdens de celdeling de spoeldraden aan vastzitten, zodat de verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de dochtercellen regelmatig kan verlopen.
 
Micronucleus:  kleine kern die buiten en naast de hoofdkern van cellen tijdens de 
telofase van de mitose of meiose ontstaat door achtergebleven chromosoomfrag ­
menten of volledige chromosomen.  
Mitose:  deling van de celkern die doorgaans wordt ingedeeld in profase, prome ­
tafase, metafase, anafase en telofase.  
Mitotische index:  de verhouding tussen het aantal cellen in de metafase en het 
totale aantal cellen in een populatie; deze index geeft een indicatie van de snelheid waarmee deze populatie groeit.
 
Mutageen:  produceert een erfelijke wijziging van DNA-basepaarsequentie(s) in 
genen of van de structuur van chromosomen (chromosoomafwijkingen).  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Non-disjunctie:  het feit dat de chromatiden niet uit elkaar gaan en niet afzon ­
derlijk overgaan in de dochtercellen in ontwikkeling, wat leidt tot dochtercellen 
met abnormale chromosoomaantallen.  
Polyploïdie:  afwijkingen in het aantal chromosomen in cellen of organismen 
waarbij (een) volledige reeks(en) van chromosomen betrokken is/zijn, in tegen ­
stelling tot een afzonderlijk chromosoom of afzonderlijke chromosomen (aneu ­
ploïdie).  
Proliferatie-index (PI):  methode voor cytotoxiciteitsmeting wanneer geen cytoB 
wordt gebruikt (zie aanhangsel 2 voor formule).  
Relatieve toename van de celpopulatie (RICC):  methode voor cytotoxiciteits ­
meting wanneer geen cytoB wordt gebruikt (zie aanhangsel 2 voor formule).  
Relatieve populatieverdubbeling (RPD):  methode voor cytotoxiciteitsmeting wan ­
neer geen cytoB wordt gebruikt (zie aanhangsel 2 voor formule).  
Replicatie-index (RI):  de verhouding tussen het aantal voltooide celdelingscycli 
in een behandelde cultuur en het aantal voltooide celdelingscyli in de onbehan ­
delde controlecultuur, tijdens de blootstellingsperiode en het herstel (zie aan ­
hangsel 2 voor formule).  
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze TM wordt getest.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Aanhangsel 2  
Formules voor beoordeling van de cytotoxiciteit  
1. Wanneer cytoB wordt gebruikt , moet de evaluatie van de cytotoxiciteit 
uitgaan van de cytokineseblokproliferatie-index (CBPI) of replicatie-index (RI) 
(16) (58). De CBPI geeft het gemiddelde aantal celcycli per cel aan tijdens de 
periode van blootstelling aan cytoB en kan worden gebruikt om de celproliferatie te berekenen. De RI geeft het relatieve aantal nuclei in behandelde culturen in vergelijking met de controleculturen aan en kan worden gebruikt om het % 
cytostase te berekenen:
 
% cytostase = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
en: 
T = cultuur behandeld met teststof  
C = controlecultuur behandeld met medium  
waarbij:  
CBPI ¼ ððAantal mononucleaire cellen Þ þ ð2 Ü aantal binucleaire cellen Þ þ ð3 Ü aantal multinucleaire cellen ÞÞ 
ðTotaal aantal cellen Þ 
Zo is een CBPI van 1 (alle cellen zijn mononucleair) gelijk aan 100 % cytostase.  
Cytostase = 100 – RI  
RI ¼ ððAantal binucleaire cellen Þ þ ð2 Ü aantal multinucleaire cellen ÞÞ ö ðtotaal aantal cellen Þ T 
ððAantal binucleaire cellen Þ þ ð2 Ü aantal multinucleaire cellen ÞÞ ö ðtotaal aantal cellen Þ C Ü 100 
T = behandelde culturen  
C = controleculturen  
2. Zo betekent een RI van 53 % dat, in vergelijking met het aantal cellen van 
de controlecultuur die zich gedeeld hebben om binucleaire en multinucleaire 
cellen te vormen, slechts 53 % van dit aantal in de behandelde cultuur zich heeft 
gedeeld, d.w.z. 47 % cytostase.  
3. Wanneer geen cytoB wordt gebruikt , wordt aanbevolen om de cytotoxiciteit 
te behoordelen op basis van de relatieve toename van de celpopulatie (RICC) of de relatieve populatieverdubbeling (RPD) (58) aangezien beide rekening houden met het percentage van de celpopulatie dat zich gedeeld heeft.
 
RICC ¼ ðToename aantal cellen in behandeldeculturen  ðeindsituatie – beginsituatie ÞÞ 
ðToename aantal cellen in controleculturen  ðeindsituatie – beginsituatie ÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðAantal populatieverdubbelingen in behandelde culturen Þ 
ðAantal populatieverdubbelingen in controleculturen Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
waarbij:  
Populatieverdubbeling = [log (aantal cellen na behandeling ÷ aanvankelijk aantal 
cellen)] ÷ log 2  
4. Zo geeft een RICC of een RPD van 53 % aan dat de cytotoxiciteit/cytostase 
47 % bedraagt.  
5. Met behulp van een proliferatie-index (PI) kan de cytotoxiciteit worden 
beoordeeld door het aantal klonen te tellen dat bestaat uit 1 cel (cl1), 2 cellen 
(cl2), 3 tot 4 cellen (cl4) en 5 tot 8 cellen (cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. De PI is ook toegepast als waardevolle en betrouwbare cytotoxiciteitspara ­
meter voor  in situ  gekweekte cellijnen in afwezigheid van cytoB (25) (26) (27) 
(28). ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Aanhangsel 3  
Aanbevolen referentiestoffen voor het beoordelen van de prestaties  ( 1 ) 
Categorie Chemische stof CAS-nr. EG-nr.  
1. Clastogenen werkzaam zonder metabolische activering 
Cytosine arabinoside 147-94-4 205-705-9 
Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 
2. Clastogenen waarvoor metabolische activering vereist is 
Benzo(a)pyreen 50-32-8 200-028-5 Cyclofosfamide 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugenen 
Colchicine 64-86-8 200-598-5 
Vinblastine 143-67-9 205-606-0 
4. Negatieve stoffen 
Di(2-ethylhexyl)ftalaat 117-81-7 204-211-0 Nalidixinezuur 389-08-2 206-864-7 Pyreen 129-00-0 204-927-3 Natriumchloride 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Het wordt aanbevolen om de referentiestoffen te gebruiken. Het is mogelijk om chemische stoffen op de lijst van referentiesto ffen 
te vervangen of toe te voegen als hun werkzaamheid gekend is en als zij via dezelfde werkwijze micronucleï doen ontstaan, en al s 
zij relevant blijken voor de chemische stoffen die tijdens de MNvit-procedure getest zullen worden. Afhankelijk van het doel ka n 
de rechtvaardiging ook bestaan in een valideringsonderzoek dat gebruikmaakt van een brede keuze aan stoffen of dat gericht is o p 
een smaller spectrum op basis van de chemische klasse van de teststof of het beschadigingsmechanisme dat wordt onderzocht.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: AA  
INLEIDING  
1. De OESO-richtlijnen inzake het testen van chemische stoffen (Guidelines 
for the Testing of Chemicals) en de daarop gebaseerde EU-testmethoden 
worden regelmatig herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruit ­
gang, zich wijzigende behoeften aan regelgeving en overwegingen met het 
oog op dierenwelzijn. De eerste testmethode (TM) (B.42) voor het bepalen 
van de huidsensibilisatie bij muizen, de lokale lymfkliertest (LLKT; OESO-testrichtlijn 429) is herzien (1). Er zijn publicaties verschenen met de gegevens over de validering van de LLKT en een overzicht van 
gerelateerd onderzoek (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). In de LLKT wordt 
radio-isotoop thymidine of jodium gebruikt om de proliferatie van de lymfocyten te meten en de test is daarom slechts beperkt bruikbaar indien de aankoop, het gebruik en de verwijdering van radioactief materiaal 
problematisch zijn. De LLKT: AA (afvoerend auriculair) (ontwikkeld 
door Daicel Chemical Industries, Ltd) is een niet-radioactieve aanpassing van de LLKT, waarin het adenosinetrifosfaat (ATP)-gehalte gemeten wordt via bioluminescentie, als indicator voor de proliferatie van lymfocyten. De 
LLKT: AA-testmethode werd door een internationaal panel voor collegiale 
toetsing gevalideerd, beoordeeld en aanbevolen als nuttig instrument om huidsensibiliserende en niet-huidsensibiliserende chemische stoffen op te sporen, binnen bepaalde beperkingen (10) (11) (12) (13). Deze TM werd 
ontworpen om de potentiële huidsensibilisatie door chemische stoffen 
(stoffen en mengsels) bij dieren te bepalen. In hoofdstuk B.6 van de bijlage en in OESO-testrichtlijn 406 worden proeven met cavia's gebruikt: de maximalisatietest en de Buehlertest (14). De LLKT (hoofdstuk B.42 
van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 429) en de twee niet-radioactieve 
aanpassingen, LLKT: AA (hoofdstuk B.50 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 442 A) en LLKT: BrdU-ELISA (hoofdstuk B.51 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 442 B), bieden allemaal een voordeel ten 
opzichte van de proeven met cavia's in B.6 en OESO-testrichtlijn 406 (14) 
ten aanzien van een beperking en verfijning van het gebruik van dieren.
 
2. NET zoals de LLKT, bestudeert het LLKT: AA-onderzoek de inductiefase 
van huidsensibilisatie en levert kwantitatieve gegevens die voor een dosis/ responsbepaling kunnen worden gebruikt. Bovendien neemt de mogelijk ­
heid om huidsensibiliserende stoffen op te sporen zonder gebruik te maken 
van isotopenmerking voor DNA het risico op beroepsmatige blootstelling aan radioactiviteit en de problemen met afvalverwijdering weg. Dat maakt het dan weer mogelijk om vaker muizen te gebruiken om huidsensibilise ­
rende stoffen op te sporen, waardoor het gebruik van cavia's in onderzoek 
naar huidsensibilisatie mogelijk beperkt kan worden ( i.e. B.6; 
OESO-testrichtlijn 406) (14).
 
DEFINITIES  
3. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.  
TOELICHTING EN BEPERKINGEN  
4. De LLKT: AA is een aangepaste LLKT-methode om potentiële huidsen ­
sibiliserende chemische stoffen op te sporen, binnen specifieke beperkin ­
gen. Dit houdt niet noodzakelijkerwijs in dat de LLKT: AA in alle geval ­
len in plaats van de LLKT of de proef met cavia's moet worden gebruikt, (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406) (14), maar veeleer dat de test gelijk ­
waardig is en als alternatief kan worden gebruikt, waarbij positieve en 
negatieve resultaten niet langer behoeven te worden bevestigd (10) (11). Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Die 
informatie zal de identiteit en de chemische structuur van de teststof 
bevatten; de fysisch-chemische eigenschappen ervan; de resultaten van
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
andere in vitro of in vivo toxiciteitsproeven op de teststof; en toxicologi ­
sche gegevens van chemische stoffen met een verwante structuur. Deze 
informatie moet in aanmerking genomen worden om te bepalen of de LLKT: AA geschikt is voor de teststof (gezien de incompatibiliteit van beperkte soorten chemische stoffen met de LLKT: AA [zie punt 5]) en om 
te helpen bij het bepalen van de dosis.
 
5. De LLKT: AA is een in-vivomethode en leidt er derhalve niet toe dat er 
bij de bepaling van allergische contactsensibilisatie geen dieren meer wor ­
den gebruikt. Deze methode kan het gebruik van dieren voor dit doel verminderen in vergelijking met de proeven met cavia's (B.6; 
OESO-testrichtlijn 406) (14). Bovendien wordt de manier waarop de die ­
ren gebruikt worden voor het testen van allergische contactsensibilisatie aanzienlijk verfijnd (minder pijn en leed), aangezien er bij de LLKT: AA, in tegenstelling tot de B.6 en OESO-testrichtlijn 406, geen door provocatie 
geïnduceerde overgevoeligheidsreacties van de huid hoeven te worden 
opgewekt. Ondanks de voordelen van de LLKT: AA ten opzichte van B.6 en OESO-testrichtlijn 406 (14), zijn er bepaalde beperkingen waardoor het gebruik van B.6 of OESO-testrichtlijn 406 (bv. het testen van bepaalde 
metalen, valspositieve resultaten met bepaalde stoffen die de huid irriteren 
(zoals bepaalde oppervlakteactieve stoffen) (6) (1 en hoofdstuk B.42 van deze bijlage), oplosbaarheid van de teststof) nodig kan zijn. Daarnaast kan 
in het geval van chemische klassen of stoffen die functionele groepen 
bevatten waarvan is aangetoond dat ze als potentiële stoorfactoren (16) werken, het gebruik van proeven met cavia's nodig zijn (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406 (14). Het is aanbevolen om de beperkingen die 
voor de LLKT (1, en hoofdstuk B.42 van deze bijlage) werden vastgesteld, 
ook toe te passen op de LLKT: AA (10). Daarnaast is het gebruik van de LLKT: AA mogelijk niet geschikt om stoffen te testen die de ATP-waarden beïnvloeden (bv. stoffen met een ATP-remmende werking) 
of die de correcte meting van intracellulair ATP kunnen verstoren (bv. 
aanwezigheid van enzymen die ATP afbreken, aanwezigheid van extracel ­
lulair ATP in de lymfklier). Buiten die vastgestelde beperkingen dient de LLKT: AA toegepast te worden voor het testen van alle stoffen, tenzij die 
stoffen eigenschappen hebben die de nauwkeurigheid van de LLKT: AA 
kunnen beïnvloeden. Bovendien moet er rekening gehouden worden met mogelijke positieve grensgevallen bij de resultaten wanneer er stimuleringsindex (SI)-waarden tussen 1,8 en 2,5 verkregen worden (zie 
punten 31-32). Dit is gebaseerd op de valideringsdatabank van 44 stoffen, 
waarbij een SI ≥ 1,8 gehanteerd werd (zie punt 6) waarvoor de LLKT: AA 
alle 32 LLKT-sensibiliserende stoffen correct geïdentificeerd heeft, maar drie van de 12 niet-sensibiliserende stoffen uit de LLKT met SI-waarden 
tussen 1,8 en 2,5 onjuist geïdentificeerd heeft (d.w.z. positief grensgeval) 
(10). Aangezien dezelfde gegevensreeks gebruikt werd om de SI-waarden te bepalen en de voorspellende eigenschappen van de test te berekenen, kunnen de vermelde resultaten de werkelijke voorspellende eigenschappen 
echter overschatten.
 
PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
6. Het beginsel dat aan de LLKT: AA ten grondslag ligt, is dat sensibilisa ­
toren induceren tot een proliferatie van lymfocyten in de lymfklieren die de afvoer verzorgen van de plaats waar de teststof wordt aangebracht. 
Deze proliferatie is evenredig met de dosis en de potentie van het aange ­
brachte allergeen en biedt een eenvoudige mogelijkheid om een kwantita ­
tieve meting van de sensibilisering uit te voeren. De proliferatie wordt gemeten door de gemiddelde proliferatie in elke testgroep te vergelijken 
met de proliferatie in de met medium behandelde controlegroep (VC). De 
verhouding tussen de gemiddelde proliferatie in elke behandelde groep en in de overeenkomstige medium-controlegroep wordt bepaald en deze z.g. SI moet ≥ 1,8 zijn voordat een teststof nader kan worden beoordeeld als 
potentiële huidsensibilisator. De hierin beschreven procedures zijn 
gebaseerd op een methode waarbij het ATP-gehalte gemeten wordt via
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
bioluminescentie (waarvan geweten is dat het verband houdt met het aantal 
levende cellen) (17) om een verhoogd aantal prolifererende cellen in de 
afvoerende auriculaire lymfklieren op te sporen (18) (19). De biolumines ­
centiemethode maakt gebruik van het luciferase-enzym als katalysator voor het opwekken van licht uit ATP en luciferine volgens de volgende reactie:
 
ATP + Luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + Light  
De intensiteit van het uitgezonden licht is lineair evenredig met het 
ATP-gehalte en wordt gemeten met een luminometer. De 
luciferine-luciferasetest is een gevoelige methode om ATP te meten die gebruikt wordt voor uiteenlopende toepassingen (20).
 
BESCHRIJVING VAN DE TEST  
Keuze van de diersoort  
7. Voor deze test worden bij voorkeur muizen gebruikt. Het validerings ­
onderzoek voor de LLKT: AA werd uitsluitend uitgevoerd met de CBA/J-stam, die daarom beschouwd wordt als de geprefereerde stam 
(12) (13). Er worden jonge volwassen vrouwtjesmuizen gebruikt, die 
nog geen jongen hebben gehad en niet drachtig zijn. Bij het begin van het onderzoek moeten de dieren 8-twaalf weken oud zijn, het gewichts ­
verschil tussen de dieren moet minimaal zijn en de afwijking mag niet 
groter zijn dan 20 % van het gemiddelde gewicht. Er mogen ook andere 
stammen of mannetjes worden gebruikt, wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn om aan te tonen dat er geen significante stam- en/of geslachtsspecifieke verschillen in de LLKT: AA-respons zijn.
 
Huisvesting en voeding  
8. De muizen moeten in groepjes worden ondergebracht (21), tenzij een 
individuele behuizing van de muizen naar behoren wetenschappelijk wordt 
gemotiveerd. De temperatuur van de proefdierruimte dient 22 ± 3 °C te 
zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % zijn en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik wor ­
den gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur 
donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.
 
Voorbereiding van de dieren  
9. De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te 
kunnen identificeren (maar niet door enigerlei vorm van oormerking) en vóór het begin van de toediening gedurende minimaal vijf dagen in hun 
kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten 
wennen. Vóór het begin van de behandeling worden alle dieren onderzocht om vast te stellen dat ze geen waarneembaar huidletsel hebben.
 
Bereiding van doseringsoplossingen  
10. Vaste chemische stoffen moeten in oplosmiddelen/media worden opgelost 
of gesuspendeerd en, indien nodig, verdund vóór aanbrenging op een oor van de muis. Vloeibare chemische stoffen kunnen onverdund worden toe ­
gediend of vóór de toediening worden verdund. Onoplosbare chemische 
stoffen, zoals die gewoonlijk voorkomen in medische apparaten, moeten 
worden onderworpen aan een maximale extractie in een geschikt oplos ­
middel om alle extraheerbare bestanddelen voor het testen vrij te maken vóór aanbrenging op een oor van de muis. Teststoffen moeten dagelijks 
worden geprepareerd, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aan ­
vaardbaar is.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Betrouwbaarheidscontrole  
11. Voor positieve controle gebruikte stoffen (PC's) worden gebruikt om aan 
te tonen dat de test correct werkt in de zin dat de test leidt tot een respons 
met voldoende en reproduceerbare gevoeligheid, waarbij de omvang van de respons goed gedocumenteerd is. Gelijktijdig gebruik van een PC wordt aanbevolen, omdat hiermee wordt aangetoond dat het laboratorium de 
competentie bezit om iedere test succesvol uit te voeren en omdat de 
intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en -overdraagbaarheid hier ­
mee kan worden beoordeeld. Sommige regelgevende autoriteiten vereisen ook een PC voor elk onderzoek en gebruikers worden daarom aangespoord 
om de relevante autoriteiten te raadplegen alvorens zij de LLKT: AA 
uitvoeren. Derhalve wordt het routinematige gelijktijdige gebruik van een PC aangemoedigd, zodat geen noodzaak bestaat om aanvullende dier ­
proeven uit te voeren om te voldoen aan dergelijke vereisten die kunnen 
voortkomen uit het gebruik van een periodieke PC (zie punt 12). De PC 
moet een positieve LLKT: AA-respons opleveren bij een blootstellings ­
niveau waarbij in vergelijking met de negatieve controlegroep een stijging van de SI met ≥ 1,8 wordt verwacht. De dosis van de PC moet zo worden 
gekozen dat de stof geen overmatige huidirritatie of systemische toxiciteit 
veroorzaakt en de inductie reproduceerbaar is, maar niet buitensporig (d.w.z. een SI > 10 zou buitensporig zijn). De PC die de voorkeur genieten zijn 25 % hexylcinnamaldehyde (Chemical Abstracts Service [CAS]-num ­
mer 101-86-0) en 25 % eugenol (CAS-nummer 97-53-0,) in aceton: olijf ­
olie (4:1, v/v). Onder bepaalde omstandigheden kunnen andere PC's wor ­
den gebruikt die aan bovengenoemde criteria voldoen, mits een afdoende motivering wordt gegeven.
 
12. Hoewel het gelijktijdige gebruik van een PC-groep aanbevolen wordt, 
kunnen er situaties zijn waarin periodiek testen (d.w.z. met intervallen ≤ 
zes maanden) van de PC toereikend kan zijn voor laboratoria die de 
LLKT: AA regelmatig uitvoeren (d.w.z. de LLKT-AA uitvoeren met een frequentie van niet minder dan eenmaal per maand) en die een historische PC-databank hebben die aantoont dat het laboratorium in staat is om 
reproduceerbare en nauwkeurige uitkomsten met PC's te verkrijgen. Toe ­
reikende ervaring met de LLKT: AA kan worden aangetoond door con ­
sequent positieve uitkomsten te genereren in ten minste tien onafhankelijke tests die binnen een redelijke tijdspanne (d.w.z. binnen één jaar) worden 
uitgevoerd.
 
13. Gelijktijdig gebruik van een PC-groep is verplicht in geval van een pro ­
cedurewijziging in de LLKT: AA (bv. wijziging van gekwalificeerd per ­
soneel, wijziging in de materialen en/of reagentia van de testmethode, 
wijziging van de testapparatuur, wijziging van de bron van proefdieren), en dergelijke wijzigingen moeten in laboratoriumverslagen worden gedo ­
cumenteerd. Het effect van dergelijke wijzigingen op de nauwkeurigheid 
van de eerder opgerichte historische databank moet in overweging worden 
genomen om te bepalen of het nodig is een nieuwe historische databank op te richten, teneinde consistentie in de documentatie van de PC-uitkomsten te waarborgen.
 
14. Onderzoekers dienen zich ervan bewust te zijn dat de beslissing om een 
PC-onderzoek op periodieke basis uit te voeren in plaats van gelijktijdig, consequenties heeft voor de nauwkeurigheid en aanvaardbaarheid van ne ­
gatieve onderzoeksuitkomsten die zijn gegenereerd zonder gelijktijdig ge ­
bruik van een PC tijdens het interval tussen opeenvolgende periodieke PC-onderzoeken. Indien bijvoorbeeld een valsnegatieve uitkomst is ver ­
kregen in het periodieke PC-onderzoek, kunnen negatieve resultaten voor 
teststoffen die zijn verkregen in het interval tussen het laatste aanvaardbare 
periodieke PC-onderzoek en het onaanvaardbare PC-onderzoek in twijfel worden getrokken. De implicaties van deze uitkomsten moeten zorgvuldig in overweging worden genomen om te bepalen of PC's gelijktijdig moeten 
worden gebruikt of dat alleen periodieke PC-onderzoeken moeten worden 
uitgevoerd. Tevens moet overwogen worden om minder dieren te gebrui ­
ken in de gelijktijdige PC-groep, indien dit wetenschappelijk gerechtvaar ­
digd is en indien het laboratorium aantoont, op basis van laboratoriums ­
pecifieke historische gegevens, dat minder muizen gebruikt kunnen wor ­
den (22).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Hoewel de PC moet worden getest in een medium waarvan bekend is dat 
het een consequente respons oplevert ( bv aceton: olijfolie; 4:1, v/v), kan de 
regelgeving in bepaalde gevallen vereisen dat de tests ook in een ongebrui ­
kelijk medium (een klinisch/chemisch relevante formulering) worden uit ­
gevoerd (23). Indien de gelijktijdig gebruikte PC in een ander medium 
wordt getest dan de teststof, moet een afzonderlijke met medium behan ­
delde groep voor de gelijktijdig gebruikte PC worden gebruikt.  
16. In gevallen waarin teststoffen van een specifieke chemische klasse of 
bereik van responsen worden geëvalueerd, kunnen referentiestoffen ook 
nuttig zijn om aan te tonen dat de testmethode correct functioneert voor 
het signaleren van het huidsensibilisatiepotentieel van deze soorten stoffen. Geschikte referentiestoffen moeten de volgende eigenschappen hebben:
 
— ze moeten structureel en functioneel vergelijkbaar zijn met de klasse 
van de teststof die wordt getest;  
— hun fysische/chemische kenmerken moeten bekend zijn;  
— uit de LLKT afkomstige gegevens ondersteunen; AA;  
— uit andere diermodellen en/of van mensen afkomstige gegevens onder ­
steunen.  
UITVOERING VAN DE PROEF  
Aantal dieren en hoogte van de doses  
17. Er worden minimaal vier dieren per dosisgroep gebruikt en ten minste drie 
concentraties van de teststof plus een negatieve controlegroep (NC-groep), 
die alleen met het medium voor de teststof wordt behandeld, en een PC 
(gelijktijdig of recentelijk uitgevoerd, op basis van het laboratoriumbeleid zoals beschreven in de punten 11-15). Het testen van meerdere doses van de PC moet overwogen worden, in het bijzonder wanneer de PC op 
periodieke basis wordt getest. Behalve dat de dieren in de controlegroepen 
niet met de teststof worden behandeld, worden ze verder op identieke wijze behandeld als de dieren in de behandelde groepen.
 
18. De keuze van de doses en het medium wordt gebaseerd op de aanbevelin ­
gen in referenties (2) en (24). Opeenvolgende doses worden doorgaans 
gekozen uit een geschikte concentratiereeks, zoals 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % enz. Aan de keuze van de gebruikte con ­
centratiereeks moet een toereikende wetenschappelijke motivering ten 
grondslag liggen. Bij de keuze van de drie opeenvolgende concentraties 
moet rekening worden gehouden met alle bestaande toxicologische gegevens (bv. met betrekking tot acute toxiciteit en huidirritatie), wanneer die beschik ­
baar zijn, zodat bij de hoogste concentratie de blootstelling maximaal is 
zonder dat dit tot systemische toxiciteit en bovenmatige lokale huidirritatie 
leidt (24) (25). Wanneer dergelijke informatie niet beschikbaar is, kan een initiële voorafgaande screeningtest nodig zijn (zie punten 21-24).
 
19. Het medium mag het testresultaat niet verstoren of er invloed op uitoefe ­
nen en moet worden gekozen met het oog op de hoogste mate van op ­
losbaarheid, zodat de hoogst mogelijke concentratie wordt verkregen, ter ­
wijl de oplossing/suspensie geschikt moet zijn om de teststof mee aan te brengen. Aanbevolen media zijn aceton: olijfolie (4:1 v/v), N,N-dimethyl ­
formamide, methylethylketon, propyleenglycol en dimethylsulfoxide (6), 
maar ook een ander medium mag worden gebruikt als daarvoor een af ­
doende wetenschappelijke motivering wordt gegeven. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn als extra controle een klinisch relevant oplosmiddel te 
gebruiken of de commerciële formulering waarin de teststof in de handel 
wordt gebracht. Er moet vooral voor worden gezorgd dat hydrofiele test ­
stoffen worden opgenomen in een medium dat de huid vochtig maakt en niet onmiddellijk wegloopt. Dit kan worden bereikt door geschikte oplos ­
baar makende stoffen (bv. 1 % Pluronic® L92) toe te voegen. Een volledig 
waterig medium moet derhalve worden vermeden.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Door de verwerking van lymfklieren van individuele muizen kan de sprei ­
ding over de dieren worden beoordeeld en kan een statistische vergelijking 
tussen de teststofmetingen en de metingen voor de met medium behan ­
delde controlegroep worden uitgevoerd (zie punt 33). Daarnaast kan door het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren de 
mogelijkheid onderzocht worden om het aantal muizen in de PC-groep 
te verminderen (22). Verder vereisen sommige regelgevende autoriteiten het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren. Het regelmatig vergaren van gegevens over individuele dieren brengt voor ­
delen met zich mee op het vlak van dierenwelzijn, door dubbele tests te 
vermijden, die nodig zouden zijn wanneer de resultaten voor de teststoffen die aanvankelijk op een bepaalde manier verkregen werden (bv. via ge ­
poolde gegevens over dieren) later door de regelgevende autoriteiten be ­
keken moeten worden volgens andere eisen (bv. gegevens over individuele 
dieren).
 
Voorafgaande screeningtest  
21. Wanneer er geen gegevens beschikbaar zijn om de hoogste te testen dosis 
te bepalen (zie punt 18), moet een voorafgaande screeningtest worden 
uitgevoerd om de juiste dosis te bepalen die getest moet worden in de LLKT: AA. Het doel van de voorafgaande screeningtest is om richtsnoe ­
ren te bieden voor het kiezen van de maximale dosis in het hoofdonder ­
zoek van de LLKT: AA, indien informatie over de concentratie die sys ­
temische toxiciteit induceert (zie punt 24) en/of bovenmatige huidirritatie (zie punt 23) niet beschikbaar is. De maximale dosis die wordt getest, moet 100 % zijn van de teststof voor vloeibare stoffen of de hoogst mo ­
gelijke concentratie voor vaste stoffen of suspensies.
 
22. De voorafgaande screeningtest wordt uitgevoerd onder omstandigheden die 
identiek zijn aan die van het hoofdonderzoek van de LLKT: AA, behalve 
dat er geen beoordeling is van de lymfklierproliferatie en er minder dieren 
per dosisgroep kunnen worden gebruikt. Aanbevolen wordt per dosisgroep een of twee dieren te gebruiken. Alle muizen worden dagelijks geobser ­
veerd op klinische verschijnselen van systemische toxiciteit of lokale irri ­
tatie op de plaats van aanbrengen. Het lichaamsgewicht van de dieren 
wordt geregistreerd voorafgaand aan de test en vóór de beëindiging van de test (dag 8). Beide oren van iedere muis worden onderzocht op ery ­
theem en de responsen worden ingeschaald met behulp van tabel 1 (25). 
De dikte van de oren wordt gemeten met behulp van een diktemeter (bv. een digitale micrometer of Peacock Dial-diktemeter) op dag 1 (vóór aan ­
brenging van de dosis), dag 3 (ongeveer 48 uur na de eerste dosis), dag 7 
(24 uur voor het doden) en dag 8. Daarnaast kan op dag 8 de dikte worden 
bepaald door oorperforatiemetingen, die uitgevoerd moeten worden nadat de dieren op humane wijze zijn gedood. Bovenmatige huidirritatie wordt aangegeven door een erytheemscore ≥ 3 en/of een toename van de oor ­
dikte ≥ 25 % op een of meer van de meetdagen (26) (27). De hoogste 
dosis die voor het hoofdonderzoek van de LLKT: AA wordt gekozen, is de volgende lagere dosis in de concentratiereeks van de voorafgaande screeningtest (zie punt 18) die geen systemische toxiciteit en/of boven ­
matige huidirritatie veroorzaakt.
 
Tabel 1  
Erytheemscores  
Waarneming Score  
Geen erytheem 0 
Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar) 1 Duidelijk gedefinieerd erytheem 2
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Waarneming Score  
Matig tot ernstig erytheem 3 
Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de inschaling van 
erytheem onmogelijk is 4 
23. Naast een toename van de oordikte met 25 % (26) (27), is een statistisch 
significante toename van de oordikte bij de behandelde muizen in ver ­
gelijking met de controlemuizen ook gebruikt om irriterende stoffen in de LLKT te signaleren (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Echter, hoewel 
statistisch significante toenamen kunnen voorkomen bij een toename van 
de oordikte met minder dan 25 %, worden ze niet specifiek met boven ­
matige huidirritatie in verband gebracht (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. De volgende klinische waarnemingen kunnen duiden op systemische toxi ­
citeit (35) wanneer gebruikt als onderdeel van een geïntegreerde beoor ­
deling en kunnen derhalve de maximale dosis aangeven die moet worden gebruikt in het hoofdonderzoek van de LLKT: AA: veranderingen in de werking van het zenuwstelsel (bv. pilo-erectie, ataxie, tremors en convul ­
sies); veranderingen in gedrag (bv. agressiviteit, verandering in lichaams ­
verzorging, duidelijke verandering in het activiteitsniveau); veranderingen in ademhalingspatronen (d.w.z. veranderingen in de frequentie en intensi ­
teit van het ademhalen, zoals kortademigheid, benauwdheid en gereutel) en 
veranderingen in de voedsel- en waterconsumptie. Daarnaast moet in de 
evaluatie rekening worden gehouden met tekenen van lethargie en/of ge ­
brek aan reactiviteit alsmede klinische tekenen van meer dan lichte of 
voorbijgaande pijn en leed of een vermindering van het lichaamsgewicht 
van meer dan 5 % tussen dag 1 en dag 8, evenals het sterftecijfer. Ster ­
vende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, moeten op humane wijze worden gedood (36).
 
Proefopzet hoofdonderzoek  
25. De proefopzet van het onderzoek is als volgt:  
— Dag 1:  Van elk dier apart wordt het gewicht en iedere klinische 
waarneming bepaald en vastgelegd. Vervolgens wordt een waterige 
oplossing van 1 % natriumlaurylsulfaat (NLS) op het dorsum van 
elk oor aangebracht met een borsteltje dat in de NLS ondergedompeld wordt om het volledige dorsum van elk oor met vier tot vijf streken te bedekken. Een uur na de behandeling met NLS, wordt 25 μL van de 
toepasselijke verdunning van de teststof, het medium zonder teststof of 
de PC (gelijktijdig of recent, in overeenstemming met het laboratori ­
umbeleid ten aanzien van punten 11-15) aangebracht op het dorsum van elk oor.
 
— Dagen 2, 3 en 7:  Herhaal de voorafgaande behandeling met de wate ­
rige oplossing van 1 % NLS en de procedure voor het aanbrengen van de teststof die op dag 1 werden toegepast.
 
— Dagen 4, 5 en 6:  Geen behandeling.  
— Dag 8:  Van elk dier worden het gewicht en iedere klinische waarne ­
ming vastgelegd. Ongeveer 24 tot 30 uur na het begin van het aan ­
brengen op dag 7, worden de dieren op humane wijze gedood. De 
afvoerende auriculaire lymfklieren van elke muis worden uitgeprepa ­
reerd en voor elk dier afzonderlijk behandeld in gebufferde fosfaatsaline (PBS). Referentie (22) bevat gedetailleerde informatie 
en diagrammen voor de identificatie en het uitprepareren van de 
lymfklieren. Om de lokale huidreacties in het hoofdonderzoek nader te onderzoeken, kunnen aanvullende parameters in het onderzoekspro ­
tocol worden opgenomen, zoals de inschaling van oorerytheem of 
oordiktemetingen (verkregen door gebruik van een diktemeter of 
door oorperforatiemetingen bij de necropsie).
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Bereiding van de celsuspensies  
26. Van elke muis wordt er een eencellige suspensie met 
lymfkliercellen (LKC) gemaakt die aan beide zijden werden uitgeprepa ­
reerd door de lymfklieren tussen twee objectglazen te klemmen en een lichte druk uit te oefenen om de lymfklieren te pletten. Nadat bevestigd is dat het weefsel zich in een dunne laag verspreid heeft, worden de twee 
glaasjes van elkaar gehaald. Het weefsel op beide objectglazen wordt 
gesuspendeerd in PBS door elk glaasje schuin boven het petrischaaltje te houden en het te spoelen met PBS en tegelijkertijd het weefsel van het glas te schrapen met een celschraper. De lymfklieren van NC-dieren zijn 
bovendien klein, men moet dus voorzichtig te werk gaan om kunstmatige 
beïnvloeding van de SI-waarden te voorkomen. Er dient een totaal volume van 1 ml PBS gebruikt te worden voor het spoelen van beide glaasjes. De LKC-suspensie in het petrischaaltje dient enigszins gehomogeniseerd te 
worden met de celschraper. Vervolgens wordt een aliquot van 20 μL 
van de LKC-suspensie verzameld met een micropipet, waarbij ervoor ge ­
zorgd wordt dat het membraan, dat niet zichtbaar is met het blote oog, niet wordt meegenomen, waarna de suspensie gemengd wordt met 1,98 ml 
PBS om een monster van 2 ml te verkrijgen. Vervolgens wordt er een 
tweede monster van 2 ml bereid via dezelfde procedure zodat er twee monsters gemaakt worden voor elk dier.
 
Bepaling van celproliferatie (meten van het ATP-gehalte van de lymfocyten)  
27. Toenames van het ATP-gehalte in de lymfklieren worden gemeten met de 
luciferine/luciferase-methode met behulp van een ATP-meetkit, die de bio ­
luminescentie meet in relatieve lichteenheden (Relative Luminescence 
Units - RLU). De bepalingstijd vanaf het moment waarop het dier gedood wordt tot de meting van het ATP-gehalte voor elk individueel dier moet gelijkmatig blijven, binnen ongeveer 30 minuten, omdat het ATP-gehalte 
geleidelijk aan afneemt na de dood van het dier (12). De reeks procedures 
vanaf het uitprepareren van de auriculaire lymfklieren tot de ATP-meting dient binnen 20 minuten te worden afgerond, volgens het vooraf vast ­
gelegde tijdspad, dat voor elk dier hetzelfde is. De ATP-luminescentie 
wordt gemeten voor elk monster van 2 ml, zodat in totaal twee 
ATP-metingen verkregen worden voor elk dier. Vervolgens wordt de ge ­
middelde ATP-luminescentie bepaald en gebruikt voor verdere berekenin ­
gen (zie punt 30).
 
WAARNEMINGEN  
Klinische waarnemingen  
28. Iedere muis wordt ten minste één keer per dag zorgvuldig geobserveerd op 
klinische verschijnselen van lokale irritatie op de plaats van aanbrengen of 
systemische toxiciteit. Alle waarnemingen worden systematisch geregis ­
treerd en van elke muis wordt een apart overzicht bijgehouden. Waarne ­
mingsschema's dienen criteria te omvatten om muizen die tekenen ver ­
tonen van systemische toxiciteit, overmatige lokale huidirritatie of huid ­
corrosie onmiddellijk aan te wijzen voor euthanasie (36).  
Lichaamsgewicht  
29. Zoals in punt 25 is vermeld, wordt aan het begin van de test en wanneer 
de dieren volgens schema op humane wijze worden gedood, van elk dier het lichaamsgewicht bepaald.
 
BEREKENING VAN RESULTATEN  
30. De resultaten voor iedere behandelingsgroep worden uitgedrukt als de 
stimuleringsindex (SI). De SI wordt berekend door de gemiddelde RLU/ muis van elke groep behandeld met teststof en de PC-groep, te delen door 
de gemiddelde RLU/muis voor de oplosmiddel/medium-controlegroep. De 
gemiddelde SI voor de VC's is dan één.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Binnen het beslissingsproces wordt een resultaat als positief beschouwd, 
indien SI ≥ 1,8 (10). Echter, de sterkte van de dosis/respons, de statistische 
significantie en de consistentie van de medium-controlegroep- en PC-responsen kunnen ook worden gebruikt om te bepalen of een resultaat dat een grensgeval is (d.w.z. SI-waarde tussen 1,8 en 2,5) positief wordt 
verklaard (2) (3) (37).
 
32. Voor een net positieve respons met een SI tussen 1,8 en 2,5 kan het nuttig 
zijn om naast de SI-waarden ook aanvullende informatie zoals het verband 
tussen de dosis en de respons, bewijs voor systemische toxiciteit of over ­
matige irritatie, en waar nodig, statistische significantie in aanmerking te nemen om die resultaten als positief aan te merken (10). Er moet ook gekeken worden naar verschillende eigenschappen van de teststof, bijvoor ­
beeld of deze qua structuur verwant is met bekende huidsensibilisatoren, of 
de stof overmatige huidirritatie veroorzaakt bij de muis en wat de aard van het waargenomen verband tussen de dosis en de reactie is. Deze en andere overwegingen worden elders gedetailleerd besproken (4).
 
33. Door gegevens te verzamelen op het niveau van de individuele muis, kan 
een statistische analyse worden uitgevoerd voor het bestaan van een dosis/ 
responsverhouding binnen de gegevens en de mate waarin deze verhou ­
ding voorkomt. Iedere statistische beoordeling kan een evaluatie omvatten van de dosis/responsverhouding evenals afdoende aangepaste vergelijkin ­
gen van testgroepen (bv. paarsgewijs gedoseerde groep tegenover vergelij ­
kingen van een oplossingsmiddel/medium-controlegroep). Statistische ana ­
lyses kunnen  bijvoorbeeld  lineaire regressie omvatten of de test van Wil ­
liam voor het beoordelen van dosis/responstrends, alsmede de test van Dunnett voor paarsgewijze vergelijkingen. Bij het kiezen van een ge ­
schikte statistische analysemethode moet de onderzoeker zich bewust blij ­
ven van mogelijke variantie-heterogeniteit en andere soortgelijke proble ­
men, die een gegevenstransformatie of een niet-parametrische statistische analyse noodzakelijk kunnen maken. In ieder geval kan het nodig zijn dat 
de onderzoeker SI-berekeningen en statistische analyses uitvoert met en 
zonder bepaalde gegevenspunten (soms „uitbijters” genoemd).
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
34. Gegevens dienen samengevat te worden in de vorm van een tabel waarin 
de RLU-waarden voor individuele dieren, de gemiddelde RLU/dier per groep, het bijbehorende residu (bv. SD, SEM) en de gemiddelde SI iedere 
dosisgroep in vergelijking met de gelijktijdig met oplossingsmiddel/me ­
dium behandelde controlegroep.
 
Testverslag  
35. In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:  
Test- en controlestoffen:  
— identificatiegegevens (bv. CAS-nummer en EG-nummer, indien be ­
schikbaar; bron; zuiverheid; bekende onzuiverheden; partijnummer);  
— de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de vluch ­
tigheid, de stabiliteit en de oplosbaarheid);  
— bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het pro ­
centuele gehalte;  
Oplosmiddel/medium:  
— identificatiegegevens (zuiverheid; concentratie, indien van toepassing; 
gebruikt volume);  
— motivering van de keuze van het medium;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Proefdieren:  
— bron van CBA-muizen;  
— microbiologische status van de dieren, indien bekend;  
— aantal en leeftijd van de dieren;  
— de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.;  
Testomstandigheden:  
— de bron, het partijnummer en de gegevens van de producent over de 
kwaliteitsgarantie/kwaliteitscontrole voor de ATP-kit;  
— gedetailleerde gegevens over de formulering en het aanbrengen van de 
teststof;  
— motivering voor dosiskeuze (met inbegrip van resultaten van voor ­
afgaande screeningtest, indien uitgevoerd);  
— gebruikte concentraties van medium en teststof en totale hoeveelheid 
teststof die is aangebracht;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water 
(waaronder de aard en de herkomst van het voer en de herkomst van het water);
 
— gedetailleerde gegevens met betrekking tot het behandelings- en be ­
monsteringsschema;  
— methoden voor de meting van de toxiciteit;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief of negatief is;  
— gedetailleerde gegevens met betrekking tot protocolafwijkingen en een 
uitleg van hoe de afwijking van invloed is op de opzet en resultaten 
van het onderzoek;  
Betrouwbaarheidscontrole:  
— overzicht van de resultaten van de meest recente betrouwbaarheids ­
controle met informatie over de teststof, de concentratie en het ge ­
bruikte medium;  
— tegelijkertijd en/of in het verleden bepaalde positieve en tegelijkertijd 
bepaalde negatieve (oplosmiddel/medium) controlegegevens voor het testlaboratorium;
 
— indien geen gelijktijdige PC is uitgevoerd, de datum en het laborato ­
riumverslag voor de meest recente periodieke PC en een verslag met 
de historische PC-gegevens voor het laboratorium waarin de beslissing 
om geen gelijktijdige PC uit te voeren, wordt gemotiveerd;  
Resultaten:  
— het gewicht van elke muis aan het begin van de test en wanneer deze 
volgens schema wordt gedood; evenals het gemiddelde bijbehorende residu (bv. SD, SEM) voor iedere behandelingsgroep;
 
— voor elk dier het tijdstip waarop de eventuele toxiciteitsverschijnselen 
zich voordoen, met inbegrip van huidirritatie op de toedieningsplaats, en het verloop daarvan;
 
— voor elk dier het tijdstip waarop het gedood werd en het tijdstip 
waarop de ATP-meting werd uitgevoerd;  
— een tabel met de RLU-waarden voor elke muis en de SI-waarden voor 
elke doseringsgroep;  
— gemiddeld bijbehorend residu (bv. SD, SEM) voor de RLU/muis voor 
elke behandelingsgroep en de resultaten van uitbijteranalyses voor elke 
behandelingsgroep;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— berekende SI en een geschikte meting van de variabiliteit die rekening 
houdt met de spreiding over de dieren in zowel de teststof- als de 
controlegroepen;  
— dosis/responsverhouding;  
— statistische analyses, indien van toepassing;  
Bespreking van de resultaten:  
— Een korte bespreking van de resultaten, de dosis/respons-analyse en de 
statistische analyses, indien van toepassing, met een conclusie ten aan ­
zien van de vraag of de teststof als huidsensibilisator moet worden 
beschouwd.  
LITERATUUR  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985-997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publi ­
cation No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Upda ­
ted validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1-10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11-26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896-1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Phar ­
macol ., 55, 90-96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81-88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127-132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Devel ­
opment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27-34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of bio ­
mass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346-370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71-89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13-31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].  
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195-206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  Toxi­
col. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and com ­
parison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60-68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Re ­
search Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sci ­
ences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]  
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53 563-79.  
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Paris. Available at: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Nauwkeurigheid:  de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met 
de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties 
van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „con ­
cordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (38).
 
IJkstof:  een sensibiliserende of niet-sensibiliserende stof die gebruikt wordt als 
norm voor vergelijking met een teststof. Een ijkstof moet de volgende eigen ­
schappen hebben: (i) consistente en betrouwbare bron(nen); (ii) in structureel en functioneel opzicht soortgelijk aan de geteste klasse stoffen; (iii) bekende 
fysisch-chemische eigenschappen; (iv) ondersteunende gegevens met betrekking 
tot bekende effecten, en (v) bekende potentie binnen het bereik van de gewenste respons.
 
Valsnegatief:  een teststof die door een testmethode ten onrechte als negatief of 
niet-actief wordt geïdentificeerd, terwijl de stof feitelijk positief of actief is.  
Valspositief:  een teststof die ten onrechte als positief of actief wordt geïdentifi ­
ceerd, terwijl de stof in feite negatief of niet-actief is.  
Gevaar:  het risico van een nadelig effect op de gezondheid of het milieu. Het 
nadelige effect doet zich alleen voor indien er voldoende blootstelling is.  
Interlaboratoriumreproduceerbaarheid:  een maatstaf voor de mate waarin ver ­
schillende gekwalificeerde laboratoria die gebruikmaken van hetzelfde protocol 
en die dezelfde teststoffen testen, in kwalitatief en kwantitatief opzicht vergelijk ­
bare resultaten kunnen produceren. De interlaboratoriumreproduceerbaarheid wordt bepaald tijdens de prevaliderings- en valideringsprocessen en geeft aan in hoeverre een test met succes tussen laboratoria kan worden overgedragen; 
dit wordt ook wel reproduceerbaarheid tussen laboratoria genoemd (38).
 
Intralaboratoriumreproduceerbaarheid:  een bepaling van de mate waarin gekwa ­
lificeerde mensen binnen hetzelfde laboratorium met succes resultaten kunnen repliceren met gebruikmaking van een specifiek protocol op verschillende tijd ­
stippen. Dit wordt ook reproduceerbaarheid binnen laboratoria genoemd (38).
 
Uitbijter:  een uitbijter is een waarneming die duidelijk afwijkt van andere waar ­
den binnen een willekeurige steekproef uit een populatie.  
Kwaliteitsborging:  een beheerproces waarbij de naleving van de testnormen, 
eisen en boekhoudingsprocedures voor laboratoria alsmede de nauwkeurigheid 
van de gegevensoverdracht worden beoordeeld door personen die onafhankelijk 
zijn van degenen die de tests uitvoeren.  
Betrouwbaarheid:  indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd 
volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden toegepast. De betrouw ­
baarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumrepro ­
duceerbaarheid (38).
 
Huidsensibilisatie:  een immunologisch proces dat ontstaat wanneer een vatbare 
persoon of proefdier plaatselijk wordt blootgesteld aan een inducerend chemisch allergeen, dat een immunologische huidreactie veroorzaakt die kan leiden tot de 
ontwikkeling van contactsensibilisatie.
 
Stimuleringsindex (SI):  een waarde die wordt berekend om het huidsensibilisa ­
tiepotentieel van een teststof te beoordelen en die gelijk is aan de verhouding van de proliferatie bij behandelde groepen ten opzichte van de proliferatie bij de 
gelijktijdig met medium behandelde controlegroep.
 
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze TM wordt getest.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: BrdU-ELISA  
INLEIDING  
1. De OESO-richtlijnen inzake het testen van chemische stoffen (Guidelines 
for the Testing of Chemicals) en de daarop gebaseerde EU-testmethoden 
worden regelmatig herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruit ­
gang, zich wijzigende behoeften aan regelgeving en overwegingen met het 
oog op dierenwelzijn. De eerste testmethode (TM) (B.42) voor het bepalen 
van de huidsensibilisatie bij muizen, de lokale lymfkliertest (LLKT; OESO-testrichtlijn 429) is herzien (1, en hoofdstuk B.42 van deze bijlage). Er zijn publicaties verschenen met de gegevens over de validatie van de 
LLKT en een overzicht van gerelateerd onderzoek (2) (3) (4) (5) (6) (7) 
(8) (9). In de LLKT wordt radio-isotoop thymidine of jodium gebruikt om de proliferatie van de lymfocyten te meten en de test is daarom slechts beperkt bruikbaar indien de aankoop, het gebruik en de verwijdering van 
radioactief materiaal problematisch zijn. De LLKT: BrdU-ELISA [enzyme- 
linked immunosorbent assay] is een niet-radioactieve aanpassing van de LLKT TM, waarbij gebruikgemaakt wordt van niet radioactief gemerkt 5- broom-2-deoxyuridine (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS] nr. 59- 
14-3) in een op ELISA gebaseerd testsysteem om de proliferatie van 
lymfocyten te meten. De LLKT: BrdU-ELISA werd door een onafhanke ­
lijk internationaal panel voor collegiale toetsing gevalideerd, beoordeeld en aanbevolen als nuttig instrument om huidsensibiliserende en 
niet-huidsensibiliserende chemische stoffen op te sporen, binnen bepaalde 
beperkingen (10) (11) (12). Deze TM werd ontworpen om de potentiële huidsensibilisatie door chemische stoffen (stoffen en mengsels) bij dieren te bepalen. In hoofdstuk B.6 van deze bijlage en in OESO-testrichtlijn 406 
worden proeven met cavia's gebruikt: de maximalisatietest en de Buehler ­
test (13). De LLKT (hoofdstuk B.42 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 429) en de twee niet-radioactieve aanpassingen, LLKT: BrdU-ELISA (hoofdstuk B.51 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 442 B) en LLKT: 
AA (hoofdstuk B.50 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 442 A), bieden 
allemaal een voordeel ten opzichte van de proeven met cavia's in B.6 en OESO-testrichtlijn 406 (13) ten aanzien van een beperking en verfijning van het gebruik van dieren.
 
2. NET zoals de LLKT, bestudeert de LLKT: BrdU-ELISA de inductiefase 
van huidsensibilisatie en levert kwantitatieve gegevens die voor een dosis/ responsbepaling kunnen worden gebruikt. Bovendien neemt de mogelijk ­
heid om huidsensibiliserende stoffen op te sporen zonder gebruik te maken 
van isotopenmerking voor DNA het risico op beroepsmatige blootstelling 
aan radioactiviteit en de problemen met afvalverwijdering weg. Dat maakt het dan weer mogelijk om vaker muizen te gebruiken om huidsensibilise ­
rende stoffen op te sporen, waardoor het gebruik van cavia's in onderzoek 
naar huidsensibilisatie mogelijk beperkt kan worden (d.w.z. B.6; 
OESO-testrichtlijn 406) (13).
 
DEFINITIES  
3. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1.  
TOELICHTING EN BEPERKINGEN  
4. De LLKT: BrdU-ELISA is een aangepaste LLKT-methode om potentiële 
huidsensibiliserende chemische stoffen op te sporen, binnen specifieke 
beperkingen. Dit houdt niet noodzakelijkerwijs in dat de LLKT: BrdU-ELISA in alle gevallen in plaats van de LLKT of de proef met cavia's moet worden gebruikt, (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406) (13), 
maar veeleer dat de test gelijkwaardig is en als alternatief kan worden 
gebruikt, waarbij positieve en negatieve resultaten niet langer behoeven te worden bevestigd (10) (11). Het testlaboratorium moet vóór de uitvoe ­
ring van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in 
overweging nemen. Die informatie zal de identiteit en de chemische struc ­
tuur van de teststof bevatten; de fysisch-chemische eigenschappen ervan;
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
de resultaten van andere in-vitro- of in-vivotoxiciteitsproeven op de test ­
stof; en toxicologische gegevens van chemische stoffen met een verwante 
structuur. Deze informatie moet in aanmerking genomen worden om te bepalen of de LLKT: BrdU-ELISA geschikt is voor de teststof (gezien de incompatibiliteit van beperkte soorten chemische stoffen met de LLKT: 
BrdU-ELISA (zie punt 5)) en om te helpen bij het bepalen van de dosis.
 
5. De LLKT: BrdU-ELISA is een in-vivomethode en leidt er derhalve niet 
toe dat er bij de bepaling van allergische contactsensibilisatie geen dieren meer worden gebruikt. Deze methode kan het gebruik van dieren voor dit 
doel verminderen in vergelijking met de proeven met cavia's (B.6; 
OESO-testrichtlijn 406) (13). Bovendien zorgt de LLKT: BrdU-ELISA voor een aanzienlijke verfijning van de manier waarop dieren voor het testen op contactsensibilisatie worden gebruikt, aangezien er bij de LLKT: 
BrdU-ELISA, in tegenstelling tot de B.6 en OESO-testrichtlijn 406, geen 
door provocatie geïnduceerde overgevoeligheidsreacties van de huid hoe ­
ven te worden opgewekt. Bovendien behoeft bij de LLKT: BrdU-ELISA geen adjuvans te worden gebruikt, hetgeen bij de maximalisatietest bij 
cavia's wel nodig is (hoofdstuk B.6 van deze bijlage, 13). Dit betekent 
dat de LLKT: BrdU-ELISA het ongerief voor dieren beperkt. Ondanks de voordelen van de LLKT: BrdU-ELISA ten opzichte van B.6 en 
OESO-testrichtlijn 406 (13), zijn er bepaalde beperkingen waardoor het 
gebruik van B.6 of OESO-testrichtlijn 406 (bv. het testen van bepaalde metalen, valspositieve resultaten met bepaalde stoffen die de huid irriteren (zoals bepaalde oppervlakteactieve stoffen) (6) (1 en hoofdstuk B.42 van 
deze bijlage), oplosbaarheid van de teststof) nodig kan zijn. Daarnaast kan 
in het geval van chemische klassen of stoffen die functionele groepen bevatten waarvan is aangetoond dat ze als potentiële stoorfactoren (15) werken, het gebruik van proeven met cavia's (d.w.z. B.6; 
OESO-testrichtlijn 406 (13)) nodig zijn. Aanbevolen wordt om de beper ­
kingen die voor de LLKT (1, en hoofdstuk B.42 van deze bijlage) werden vastgesteld, ook toe te passen op de LLKT: BrdU-ELISA (10). Buiten die vastgestelde beperkingen, dient de LLKT: BrdU-ELISA toegepast te wor ­
den voor het testen van alle stoffen, tenzij die stoffen eigenschappen 
hebben die de nauwkeurigheid van de LLKT: BrdU-ELISA kunnen beïn ­
vloeden. Bovendien moet er rekening gehouden worden met mogelijke positieve grensgevallen in de resultaten wanneer er 
stimuleringsindex (SI)-waarden tussen 1,6 en 1,9 verkregen worden (zie 
punten 31-32). Dit is gebaseerd op de valideringsdatabank van 43 stoffen, waarbij een SI ≥ 1,6 gehanteerd werd (zie punt 6) waarvoor de LLKT: 
BrdU-ELISA alle 32 LLKT-sensibiliserende stoffen correct geïdentificeerd 
heeft, maar twee van de 11 niet-sensibiliserende stoffen uit de LLKT met 
SI-waarden tussen 1,6 en 1,9 onjuist geïdentificeerd heeft (d.w.z. positief grensgeval) (10). Aangezien dezelfde gegevensreeks gebruikt werd om de SI-waarden te bepalen en de voorspellende eigenschappen van de test te 
berekenen, kunnen de vermelde resultaten de werkelijke voorspellende 
eigenschappen echter overschatten.
 
PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
6. Het beginsel dat aan de LLKT: BrdU-ELISA ten grondslag ligt, is dat 
sensibilisatoren induceren tot een proliferatie van lymfocyten in de 
lymfklier die de afvoer verzorgt van de plaats waar de teststof wordt aangebracht. Deze proliferatie is evenredig met de dosis en de potentie van het aangebrachte allergeen en biedt een eenvoudige mogelijkheid om 
een kwantitatieve meting van de sensibilisering uit te voeren. De prolife ­
ratie wordt gemeten door de gemiddelde proliferatie in elke testgroep te vergelijken met de proliferatie in de met medium behandelde controlegroep (VC). De verhouding tussen de gemiddelde proliferatie in 
elke behandelde groep en in de overeenkomstige medium-controlegroep 
wordt bepaald en deze z.g. SI moet ≥ 1,6 zijn voordat een teststof nader
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
kan worden beoordeeld als potentiële huidsensibilisator. De hierin beschre ­
ven procedures zijn gebaseerd op een methode waarbij het BrdU-gehalte 
gemeten wordt om een verhoogd aantal prolifererende cellen in de afvoe ­
rende auriculaire lymfklieren op te sporen. BrdU is een analogon van thymidine en wordt op een vergelijkbare manier opgenomen in het 
DNA van prolifererende cellen. De opname van BrdU wordt gemeten 
door ELISA, dat gebruikmaakt van een specifiek antilichaam voor BrdU dat ook gemerkt wordt met peroxidase. Wanneer de stof wordt toege ­
voegd, reageert de peroxidase met het substraat en vormt het zo een 
gekleurd product dat gekwantificeerd wordt bij een specifieke absorptie 
met behulp van een microtiterplaatlezer.
 
BESCHRIJVING VAN DE TEST  
Keuze van de diersoort  
7. Voor deze test worden bij voorkeur muizen gebruikt. Het validerings ­
onderzoek voor de LLKT: BrdU-ELISA werd uitsluitend uitgevoerd met 
de CBA/JN-stam, die daarom beschouwd wordt als de geprefereerde stam (10) (12). Er worden jonge volwassen vrouwtjesmuizen gebruikt, die nog geen jongen hebben gehad en niet drachtig zijn. Bij het begin van het 
onderzoek moeten de dieren 8-twaalf weken oud zijn, het gewichtsverschil 
tussen de dieren moet minimaal zijn en de afwijking mag niet groter zijn dan 20 % van het gemiddelde gewicht. Er mogen ook andere stammen of mannetjes worden gebruikt, wanneer er voldoende gegevens beschikbaar 
zijn om aan te tonen dat er geen significante stam- en/of geslachtsspeci ­
fieke verschillen in de LLKT: BrdU-ELISA-respons bestaan.
 
Huisvesting en voeding  
8. De muizen moeten in groepjes worden ondergebracht (16), tenzij een 
individuele behuizing van de muizen naar behoren wetenschappelijk wordt 
gemotiveerd. De temperatuur van de proefdierruimte dient 22 ± 3 °C te zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % zijn en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % 
zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik wor ­
den gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater.
 
Voorbereiding van de dieren  
9. De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te 
kunnen identificeren (maar niet door enigerlei vorm van oormerking) en vóór het begin van de toediening gedurende minimaal vijf dagen in hun 
kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten 
wennen. Vóór het begin van de behandeling worden alle dieren onderzocht om vast te stellen dat ze geen waarneembaar huidletsel hebben.
 
Bereiding van doseringsoplossingen  
10. Vaste chemische stoffen moeten in oplosmiddelen/media worden opgelost 
of gesuspendeerd en, indien nodig, verdund vóór aanbrenging op een oor van de muis. Vloeibare chemische stoffen kunnen onverdund worden toe ­
gediend of vóór de toediening worden verdund. Onoplosbare chemische 
stoffen, zoals die gewoonlijk voorkomen in medische apparaten, moeten 
worden onderworpen aan een maximale extractie in een geschikt oplos ­
middel om alle extraheerbare bestanddelen voor het testen vrij te maken vóór aanbrenging op een oor van de muis. Teststoffen moeten dagelijks 
worden geprepareerd, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aan ­
vaardbaar is.
 
Betrouwbaarheidscontrole  
11. Voor positieve controle gebruikte stoffen (PC's) worden gebruikt om aan 
te tonen dat de test correct werkt in de zin dat de test leidt tot een respons 
met voldoende en reproduceerbare gevoeligheid, waarbij de omvang van 
de respons goed gedocumenteerd is. Gelijktijdig gebruik van een PC wordt aanbevolen, omdat hiermee wordt aangetoond dat het laboratorium de competentie bezit om iedere test succesvol uit te voeren en omdat de 
intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en -overdraagbaarheid hier ­
mee kan worden beoordeeld. Sommige regelgevende autoriteiten vereisen
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
ook een PC voor elk onderzoek en gebruikers worden daarom aangespoord 
om de relevante autoriteiten te raadplegen alvorens zij de LLKT: 
BrdU-ELISA uitvoeren. Derhalve wordt het routinematige gelijktijdige gebruik van een PC aangemoedigd, zodat geen noodzaak bestaat om aan ­
vullende dierproeven uit te voeren om te voldoen aan dergelijke vereisten 
die kunnen voortkomen uit het gebruik van een periodieke PC (zie punt 
12). De PC moet een positieve LLKT: BrdU-ELISA-respons opleveren bij een blootstellingsniveau waarbij in vergelijking met de negatieve controlegroep (NC) een stijging van de stimuleringsindex (SI) met ≥ 1,6 
wordt verwacht. De dosis van de PC moet zo worden gekozen dat de stof 
geen overmatige huidirritatie of systemische toxiciteit veroorzaakt en de inductie reproduceerbaar is, maar niet buitensporig (bv. een SI > 14 zou buitensporig zijn). 25 % hexylcinnamaldehyde (CAS-nr. 101-86-0) en 
25 % eugenol (CAS-nr. 97-53-0) in aceton: olijfolie (4:1, v/v) verdienen 
de voorkeur als PC. Onder bepaalde omstandigheden kunnen andere PC's worden gebruikt die aan bovengenoemde criteria voldoen, mits een af ­
doende motivering wordt gegeven.
 
12. Hoewel het gelijktijdige gebruik van een PC-groep aanbevolen wordt, 
kunnen er situaties zijn waarin periodiek testen (d.w.z. met intervallen ≤ 
zes maanden) van de PC toereikend kan zijn voor laboratoria die de 
LLKT: BrdU-ELISA regelmatig uitvoeren (d.w.z. de LLKT: BrdU-ELISA uitvoeren met een frequentie van niet minder dan eenmaal per maand) en die een historische PC-databank hebben die aantoont dat 
het laboratorium in staat is om reproduceerbare en nauwkeurige uitkom ­
sten met PC's te verkrijgen. Toereikende ervaring met de LLKT: BrdU-ELISA kan worden aangetoond door consequent positieve uitkom ­
sten te genereren in ten minste tien onafhankelijke tests die binnen een 
redelijke tijdspanne (d.w.z. binnen één jaar) worden uitgevoerd.
 
13. Gelijktijdig gebruik van een PC-groep is verplicht in geval van een pro ­
cedurewijziging van de LLKT: BrdU-ELISA gewijzigd wordt (bv. wijzi ­
ging van gekwalificeerd personeel, wijziging in de materialen en/of rea ­
gentia van de testmethode, wijziging van de testapparatuur, wijziging van 
de bron van proefdieren), en dergelijke wijzigingen moeten in laboratori ­
umverslagen worden gedocumenteerd. Het effect van dergelijke wijzigin ­
gen op de nauwkeurigheid van de eerder opgerichte historische databank moet in overweging worden genomen om te bepalen of het nodig is een 
nieuwe historische databank op te richten, teneinde consistentie in de 
documentatie van de PC-uitkomsten te waarborgen.
 
14. Onderzoekers dienen zich ervan bewust te zijn dat de beslissing om een 
PC-onderzoek op periodieke basis uit te voeren in plaats van gelijktijdig, consequenties heeft voor de nauwkeurigheid en aanvaardbaarheid van ne ­
gatieve onderzoeksuitkomsten die zijn gegenereerd zonder gelijktijdig ge ­
bruik van een PC tijdens het interval tussen opeenvolgende periodieke 
PC-onderzoeken. Indien bijvoorbeeld een valsnegatieve uitkomst is ver ­
kregen in het periodieke PC-onderzoek, kunnen negatieve resultaten voor teststoffen die zijn verkregen in het interval tussen het laatste aanvaardbare 
periodieke PC-onderzoek en het onaanvaardbare PC-onderzoek in twijfel 
worden getrokken. De implicaties van deze uitkomsten moeten zorgvuldig in overweging worden genomen om te bepalen of PC's gelijktijdig moeten worden gebruikt of dat alleen periodieke PC-onderzoeken moeten worden 
uitgevoerd. Tevens moet overwogen worden om minder dieren te gebrui ­
ken in de gelijktijdige PC-groep, indien dit wetenschappelijk gerechtvaar ­
digd is en indien het laboratorium aantoont, op basis van laboratoriums ­
pecifieke historische gegevens, dat minder muizen gebruikt kunnen wor ­
den (17).
 
15. Hoewel de PC moet worden getest in een medium waarvan bekend is dat 
het een consequente respons oplevert (bv. aceton: olijfolie; 4:1, v/v), kan 
de regelgeving in bepaalde gevallen vereisen dat de tests ook in een ongebruikelijk medium (een klinisch/chemisch relevante formulering) wor ­
den uitgevoerd (18). Indien de gelijktijdig gebruikte PC in een ander 
medium wordt getest dan de teststof, moet een afzonderlijke met medium 
behandelde groep voor de gelijktijdig gebruikte PC worden gebruikt.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. In gevallen waarin teststoffen van een specifieke chemische klasse of 
bereik van responsen worden geëvalueerd, kunnen referentiestoffen ook 
nuttig zijn om aan te tonen dat de testmethode correct functioneert voor het signaleren van het huidsensibilisatiepotentieel van deze soorten stoffen. Geschikte referentiestoffen moeten de volgende eigenschappen hebben:
 
— ze moeten structureel en functioneel vergelijkbaar zijn met de klasse 
van de teststof die wordt getest;  
— hun fysische/chemische kenmerken moeten bekend zijn;  
— ondersteunende gegevens uit de LLKT: BrdU-ELISA;  
— uit andere diermodellen en/of van mensen afkomstige gegevens onder ­
steunen.  
UITVOERING VAN DE PROEF  
Aantal dieren en hoogte van de doses  
17. Er worden minimaal vier dieren per dosisgroep gebruikt en ten minste drie 
concentraties van de teststof plus een parallelle NC-groep, die alleen met het medium voor de teststof wordt behandeld, en een PC-groep (gelijk ­
tijdig of recent, volgens het laboratoriumbeleid ten aanzien van punten 11- 
15). Het testen van meerdere doses van de PC moet overwogen worden, in 
het bijzonder wanneer de PC op periodieke basis wordt getest. Behalve dat de dieren in de controlegroepen niet met de teststof worden behandeld, worden ze verder op identieke wijze behandeld als de dieren in de behan ­
delde groepen.
 
18. De keuze van de doses en het medium wordt gebaseerd op de aanbeve ­
lingen in referenties 2 en 19. Opeenvolgende doses worden doorgaans 
gekozen uit een geschikte concentratiereeks, zoals 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % enz. Aan de keuze van de gebruikte con ­
centratiereeks moet een toereikende wetenschappelijke motivering ten 
grondslag liggen. Bij de keuze van de drie opeenvolgende concentraties 
moet er rekening gehouden worden met alle bestaande toxicologische gegevens (bv. over de acute toxiciteit en huidirritatie) en structurele en fysiochemische gegevens over de desbetreffende teststof, wanneer die be ­
schikbaar zijn, zodat bij de hoogste concentratie de blootstelling maximaal 
is zonder dat dit tot systemische toxiciteit en/of overmatige lokale huidir ­
ritatie leidt (19)(20 en hoofdstuk B.4 van deze bijlage). Wanneer derge ­
lijke informatie niet beschikbaar is, kan een initiële voorafgaande screen ­
ingtest nodig zijn (zie punten 21-24).
 
19. Het medium mag het testresultaat niet verstoren of er invloed op uitoefe ­
nen en moet worden gekozen met het oog op de hoogste mate van op ­
losbaarheid, zodat de hoogst mogelijke concentratie wordt verkregen, ter ­
wijl de oplossing/suspensie geschikt moet zijn om de teststof mee aan te brengen. Aanbevolen media zijn aceton: olijfolie (4:1 v/v),  N,N -dimethyl ­
formamide, methylethylketon, propyleenglycol en dimethylsulfoxide (6), 
maar ook een ander medium mag worden gebruikt als daarvoor een af ­
doende wetenschappelijke motivering wordt gegeven. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn als extra controle een klinisch relevant oplosmiddel te 
gebruiken of de commerciële formulering waarin de teststof in de handel 
wordt gebracht. Er moet vooral voor worden gezorgd dat er hydrofiele stoffen worden opgenomen in een medium dat de huid vochtig maakt en niet onmiddellijk wegloopt, door geschikte oplosmiddelen op te nemen 
(bv. 1 % Pluronic® L92). Een volledig waterig medium moet derhalve 
worden vermeden.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Door de verwerking van lymfklieren van individuele muizen kan de sprei ­
ding over de dieren worden beoordeeld en kan een statistische vergelijking 
tussen de teststofmetingen en de metingen voor de met medium behan ­
delde controlegroep worden uitgevoerd (zie punt 33). Daarnaast kan door het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren de 
mogelijkheid onderzocht worden om het aantal muizen in de PC-groep 
te verminderen (17). Verder vereisen sommige regelgevende autoriteiten het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren. Het regelmatig vergaren van gegevens over individuele dieren brengt voor ­
delen met zich mee op het vlak van dierenwelzijn, door dubbele tests te 
vermijden, die nodig zouden zijn wanneer de resultaten voor de teststoffen die aanvankelijk op een bepaalde manier verkregen werden (bv. via ge ­
poolde gegevens over dieren) later door de regelgevende autoriteiten be ­
keken moeten worden volgens andere eisen (bv. gegevens over individuele 
dieren).
 
Voorafgaande screeningtest  
21. Wanneer er geen gegevens beschikbaar zijn om de hoogste te testen dosis 
te bepalen (zie punt 18), moet een voorafgaande screeningtest worden 
uitgevoerd om de juiste dosis te bepalen die in de LLKT: BrdU-ELISA 
getest moet worden. Het doel van de voorafgaande screeningtest is om richtsnoeren te bieden voor het kiezen van de maximale dosis in het hoofdonderzoek van de LLKT: BrdU-ELISA, indien informatie over de 
concentratie die systemische toxiciteit induceert (zie punt 24) en/of boven ­
matige lokale huidirritatie (zie punt 23) niet beschikbaar is. De maximale dosis die wordt getest, moet 100 % zijn van de teststof voor vloeibare stoffen of de hoogst mogelijke concentratie voor vaste stoffen of suspen ­
sies.
 
22. De voorafgaande screeningtest wordt uitgevoerd onder omstandigheden die 
identiek zijn aan die van het hoofdonderzoek van de LLKT: BrdU-ELISA, behalve dat er geen beoordeling is van de lymfklierproliferatie en er min ­
der dieren per dosisgroep kunnen worden gebruikt. Aanbevolen wordt per 
dosisgroep een of twee dieren te gebruiken. Alle muizen worden dagelijks 
geobserveerd op klinische verschijnselen van systemische toxiciteit of lo ­
kale irritatie op de plaats van aanbrengen. Het lichaamsgewicht van de dieren wordt geregistreerd voorafgaand aan de test en vóór de beëindiging 
van de test (dag 6). Beide oren van iedere muis worden onderzocht op 
erytheem en de responsen worden ingeschaald met behulp van tabel 1 (20, en hoofdstuk B.4 van deze bijlage). De dikte van de oren wordt gemeten met behulp van een diktemeter (bv. een digitale micrometer of Peacock 
Dial-diktemeter) op dag 1 (vóór aanbrenging van de dosis), dag 3 (onge ­
veer 48 uur na de eerste dosis) en dag 6. Daarnaast kan op dag 6 de dikte worden bepaald door oorperforatiemetingen, die uitgevoerd moeten wor ­
den nadat de dieren op humane wijze zijn gedood. Bovenmatige huidirri ­
tatie wordt aangegeven door een erytheemscore ≥ 3 en/of een toename van 
de oordikte ≥ 25 % op een of meer van de meetdagen (21) (22). De 
hoogste dosis die voor het hoofdonderzoek van de LLKT wordt gekozen, is de volgende lagere dosis in de concentratiereeks van de voorafgaande 
screeningtest (zie punt 18) die geen systemische toxiciteit en/of boven ­
matige huidirritatie veroorzaakt.
 
Tabel 1  
Erytheemscores  
Waarneming Score  
Geen erytheem 0 
Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar) 1 Duidelijk gedefinieerd erytheem 2
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Waarneming Score  
Matig tot ernstig erytheem 3 
Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de 
inschaling van erytheem onmogelijk is 4 
23. Naast een toename van de oordikte met 25 % (21) (22), is een statistisch 
significante toename van de oordikte bij de behandelde muizen in ver ­
gelijking met de controlemuizen ook gebruikt om irriterende stoffen in de LLKT te signaleren (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Echter, hoewel 
statistisch significante toenamen kunnen voorkomen bij een toename van 
de oordikte met minder dan 25 %, worden ze niet specifiek met boven ­
matige huidirritatie in verband gebracht (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. De volgende klinische waarnemingen kunnen duiden op systemische toxi ­
citeit (30) wanneer gebruikt als onderdeel van een geïntegreerde beoordeling 
en kunnen derhalve de maximale dosis aangeven die in het hoofdonderzoek van de LLKT moet worden gebruikt: BrdU-ELISA: veranderingen in de werking van het zenuwstelsel (bv. pilo-erectie, ataxie, tremors en convul ­
sies); veranderingen in gedrag (bv. agressiviteit, verandering in lichaams ­
verzorging, duidelijke verandering in het activiteitsniveau); veranderingen in ademhalingspatronen (d.w.z. veranderingen in de frequentie en intensiteit 
van het ademhalen, zoals kortademigheid, benauwdheid en gereutel) en 
veranderingen in de voedsel- en waterconsumptie. Daarnaast moet in de evaluatie rekening worden gehouden met tekenen van lethargie en/of gebrek aan reactiviteit alsmede klinische tekenen van meer dan lichte of voorbij ­
gaande pijn en leed of een vermindering van het lichaamsgewicht van meer 
dan 5 % tussen dag 1 en dag 6, evenals het sterftecijfer. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, moeten op humane wijze worden gedood (31).
 
Proefopzet hoofdonderzoek  
25. De proefopzet van het onderzoek is als volgt:  
— Dag 1:  Van elk dier apart wordt het gewicht en iedere klinische 
waarneming bepaald en vastgelegd. Er wordt 25 μL van de toepasse ­
lijke verdunning van de teststof, het medium zonder teststof of de PC 
(gelijktijdig of recent, in overeenstemming met het laboratoriumbeleid ten aanzien van punten 11-15) aangebracht op het dorsum van elk oor.
 
— Dagen 2 en 3:  Herhaal de aanbrengprocedure van dag 1.  
— Dag 4:  Geen behandeling.  
— Dag 5:  Injecteer intra-peritoneaal 0,5 ml (5 mg/muis) BrdU-oplossing 
(10 mg/ml).  
— Dag 6:  Van elk dier worden het gewicht en iedere klinische waarne ­
ming vastgelegd. Ongeveer 24 uur (24 u) na de BrdU-injectie, worden 
de dieren op humane wijze gedood. De afvoerende auriculaire 
lymfklieren van elke muis worden uitgeprepareerd en voor elk dier afzonderlijk behandeld in gebufferde fosfaatsaline (PBS). Referentie (17) bevat gedetailleerde informatie en diagrammen voor de identifi ­
catie en het uitprepareren van de lymfklieren. Om de lokale respons 
van de huid verder te controleren in het hoofdonderzoek, kunnen aan ­
vullende parameters, zoals het inschalen van oorerythemen of de me ­
tingen van de oordikte (verkregen met behulp van een diktemeter of 
een gewichtbepaling met een oorgatentang bij de necropsie) opge ­
nomen worden in het onderzoeksprotocol.
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Bereiding van de celsuspensies  
26. Er wordt voor elke muis een eencellige suspensie met 
lymfkliercellen (LKC) gemaakt die aan beide zijden werden uitgeprepa ­
reerd door de lymfklieren door het weefsel voorzichtig door een roestvrij stalen gaas met een maaswijdte van 200 μm te persen of gebruik te maken 
van een andere aanvaardbare techniek voor het maken van een eencellige 
suspensie (bv. gebruik van een plastic wegwerpstamper om de lymfklieren 
te pletten en ze daarna door een #70 nylon gaas te persen). De procedure voor het maken van de LKC-suspensie is van essentieel belang in deze test en elke operator moet deze vaardigheid daarom op voorhand verwerven. 
De lymfklieren van NC-dieren zijn bovendien klein, men moet dus voor ­
zichtig te werk gaan om kunstmatige beïnvloeding van de SI-waarden te voorkomen. Het doelvolume van de LKC-suspensie moet in elk geval aangepast worden aan een vastgelegd geoptimaliseerd volume (ongeveer 
15 ml). Het geoptimaliseerde volume is gestoeld op het bereiken van een 
gemiddelde absorptie bij de NC-groep tussen 0,1 - 0,2.
 
Bepaling van celproliferatie (meting van het BrdU-gehalte in het DNA van 
lymfocyten)  
27. BrdU wordt gemeten via ELISA met behulp van een in de handel ver ­
krijgbare kit (bv. Roche Applied Science, Mannheim, Germany, Catalo ­
gusnummer 11 647 229 001). 100 μL van de LKC-suspensie wordt snel in 
drievoud toegevoegd aan de putjes van een microtiterplaat met een vlakke bodem. Na de fixatie en denaturatie van de LKC worden anti-BrdU-anti ­
lichamen toegevoegd aan elk putje en wordt de reactie afgewacht. Ver ­
volgens wordt het anti-BrdU-antilichaam verwijderd door spoeling, waarna de substraatoplossing wordt toegevoegd en er chromogeen geproduceerd wordt. Dan wordt de absorptie op 370 nm met een referentiegolflengte van 
492 nm gemeten. In alle gevallen dienen de testomstandigheden voor de 
bepaling geoptimaliseerd te worden (zie punt 26).
 
WAARNEMINGEN  
Klinische waarnemingen  
28. Iedere muis wordt ten minste één keer per dag zorgvuldig geobserveerd op 
klinische verschijnselen van lokale irritatie op de plaats van aanbrengen of 
systemische toxiciteit. Alle waarnemingen worden systematisch geregis ­
treerd en van elke muis wordt een apart overzicht bijgehouden. Waarne ­
mingsschema's dienen criteria te omvatten om muizen die tekenen ver ­
tonen van systemische toxiciteit, overmatige lokale huidirritatie of huid ­
corrosie onmiddellijk aan te wijzen voor euthanasie (31).  
Lichaamsgewicht  
29. Zoals in punt 25 is vermeld, wordt aan het begin van de test en wanneer 
de dieren volgens schema op humane wijze worden gedood, van elk dier 
het lichaamsgewicht bepaald.  
BEREKENING VAN RESULTATEN  
30. De resultaten voor iedere behandelingsgroep worden uitgedrukt als de 
stimuleringsindex (SI). De SI wordt berekend door de gemiddelde BrdU 
merkingsindex/muis van elke groep behandeld met teststof en van de 
PC-groep, te delen door de gemiddelde BrdU merkingsindex/muis voor de oplosmiddel/medium-controlegroep. De gemiddelde SI voor de VC's is dan één.
 
De BrdU-merkingsindex wordt omschreven als:  
BrdU-merkingsindex = (ABS  em – ABS blanco  em ) – (ABS  ref – ABS blanco  ref ) 
Waarbij: em = emissiegolflengte; en ref = referentiegolflengte.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Binnen het beslissingsproces wordt een resultaat als positief beschouwd, 
indien SI ≥ 1,6 (10). De sterkte van het verband tussen de dosis en de 
respons, de statistische significantie en de consistentie van de respons op het medium en de PC kunnen echter ook gebruikt worden om te bepalen of een grensgeval ( i.e. SI-waarde tussen 1,6 en 1,9) positief verklaard 
wordt (3) (6) (32).
 
32. Voor een net positieve respons met een SI tussen 1,6 en 1,9 kan het nuttig 
zijn om naast de SI-waarden ook aanvullende informatie zoals het verband 
tussen de dosis en de respons, bewijs voor systemische toxiciteit of over ­
matige irritatie, en waar nodig, statistische significantie in aanmerking te nemen om die resultaten als positief aan te merken (10). Er moet ook 
gekeken worden naar verschillende eigenschappen van de teststof, bijvoor ­
beeld of deze qua structuur verwant is met bekende huidsensibilisatoren, of de stof overmatige huidirritatie veroorzaakt bij de muis en wat de aard van het waargenomen verband tussen de dosis en de respons is. Deze en 
andere overwegingen worden elders gedetailleerd besproken (4).
 
33. Door gegevens te verzamelen op het niveau van de individuele muis, kan 
een statistische analyse worden uitgevoerd voor het bestaan van een dosis/ responsverhouding binnen de gegevens en de mate waarin deze verhou ­
ding voorkomt. Elke statistische beoordeling kan een beoordeling van het 
verband tussen de dosis en de respons behelzen, alsmede gecorrigeerde 
vergelijkingen tussen testgroepen ( zoals.  vergelijkingen tussen een groep 
die de dosis paarsgewijs toegediend kreeg en een oplossingsmiddel/medi ­
um-controlegroep). Statistische analyses kunnen  bijvoorbeeld  een lineaire 
regressie of een William's test omvatten om de dosis-reactietendensen te 
beoordelen, en een Dunnett's test om paarsgewijze vergelijkingen te ma ­
ken. Bij het kiezen van een geschikte statistische analysemethode moet de onderzoeker zich bewust blijven van mogelijke variantie-heterogeniteit en 
andere soortgelijke problemen, die een gegevenstransformatie of een 
niet-parametrische statistische analyse noodzakelijk kunnen maken. In ie ­
der geval kan het nodig zijn dat de onderzoeker SI-berekeningen en sta ­
tistische analyses uitvoert met en zonder bepaalde gegevenspunten (soms 
„uitbijters” genoemd).
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
34. Gegevens dienen samengevat te worden in de vorm van een tabel waarin 
de individuele BrdU-merkingsindexwaarden voor de dieren, de gemiddelde BrdU-merkingsindex/dier voor de groep, het bijbehorende residu (bv. SD, SEM) en de gemiddelde SI voor elke doseringsgroep wordt weergegeven 
en vergeleken wordt met de parallelle oplossingsmiddel/medium-contro ­
legroep.
 
Testverslag  
35. In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen:  
Test- en controlestoffen:  
— identificatiegegevens (bv. CAS-nummer en EG-nummer, indien be ­
schikbaar; bron; zuiverheid; bekende onzuiverheden; partijnummer);  
— de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de vluch ­
tigheid, de stabiliteit en de oplosbaarheid);  
— bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het pro ­
centuele gehalte;  
Oplosmiddel/medium:  
— identificatiegegevens (zuiverheid; concentratie, indien van toepassing; 
gebruikt volume);  
— motivering van de keuze van het medium;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Proefdieren:  
— bron van CBA-muizen;  
— microbiologische status van de dieren, indien bekend;  
— aantal en leeftijd van de dieren;  
— de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.;  
Testomstandigheden:  
— de bron, het partijnummer en de gegevens van de producent over de 
kwaliteitsgarantie/kwaliteitscontrole (gevoeligheid van antilichamen en 
specifieke aard en beperkingen van de opsporing) voor de ELISA-kit;  
— gedetailleerde gegevens over de formulering en het aanbrengen van de 
teststof;  
— motivering voor dosiskeuze (met inbegrip van resultaten van voor ­
afgaande screeningtest, indien uitgevoerd);  
— gebruikte concentraties van medium en teststof en totale hoeveelheid 
teststof die is aangebracht;  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water 
(waaronder de aard en de herkomst van het voer en de herkomst van het water);
 
— gedetailleerde gegevens met betrekking tot het behandelings- en be ­
monsteringsschema;  
— methoden voor de meting van de toxiciteit;  
— criteria om te bepalen of het resultaat positief of negatief is;  
— gedetailleerde gegevens met betrekking tot protocolafwijkingen en een 
uitleg van hoe de afwijking van invloed is op de opzet en resultaten 
van het onderzoek;  
Betrouwbaarheidscontrole:  
— overzicht van de resultaten van de meest recente betrouwbaarheids ­
controle met informatie over de teststof, de concentratie en het ge ­
bruikte medium;  
— tegelijkertijd en/of in het verleden bepaalde positieve en tegelijkertijd 
bepaalde negatieve (oplosmiddel/medium) controlegegevens voor het testlaboratorium;
 
— indien geen gelijktijdige PC is uitgevoerd, de datum en het laborato ­
riumverslag voor de meest recente periodieke PC en een verslag met de historische PC-gegevens voor het laboratorium waarin de beslissing 
om geen gelijktijdige PC uit te voeren, wordt gemotiveerd;
 
Resultaten:  
— het gewicht van elke muis aan het begin van de test en wanneer ze 
volgens schema wordt gedood; alsmede het gemiddelde bijbehorende residu (bv. SD, SEM) voor elke behandelingsgroep;
 
— voor elk dier het tijdstip waarop de eventuele toxiciteitsverschijnselen 
zich voordoen, met inbegrip van huidirritatie op de toedieningsplaats, en het verloop daarvan;
 
— een tabel met de BrdU-merkingsindices voor elke muis en de 
SI-waarden voor elke doseringsgroep;  
— gemiddelde bijbehorende residu (bv. SD, SEM) voor 
BrdU-merkingsindex/muis voor elke behandelingsgroep en de resulta ­
ten van de uitbijteranalyse voor elke behandelingsgroep;  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— berekende SI en een geschikte meting van de variabiliteit die rekening 
houdt met de spreiding over de dieren in zowel de teststof- als de 
controlegroepen;  
— het verband tussen dosis en respons;  
— statistische analyses, indien van toepassing;  
Bespreking van de resultaten:  
— Een korte bespreking van de resultaten, de dosis/respons-analyse en de 
statistische analyses, indien van toepassing, met een conclusie ten aan ­
zien van de vraag of de teststof als huidsensibilisator moet worden beschouwd.
 
LITERATUUR  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Avai ­
lable at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.  
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins. Toxicol., 146, 49-59.  
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 34(3), 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Upda ­
ted validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by 
non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Phar ­
macol., 55, 90-96.  
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]  
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local 
lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.  
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.  
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.
 
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and com ­
parison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of 
alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. 
Toxicol., 212, 60-68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023-1028.  
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Re ­
search Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sci ­
ences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Nauwkeurigheid:  de mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met 
de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties 
van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „con ­
cordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt (33).
 
IJkstof:  een sensibiliserende of niet-sensibiliserende stof die gebruikt wordt als 
norm voor vergelijking met een teststof. Een ijkstof dient de volgende eigen ­
schappen te hebben: i) consistente en betrouwbare bron(nen); ii) in structureel en functioneel opzicht soortgelijk aan de geteste klasse stoffen; iii) bekende 
fysisch-chemische eigenschappen; iv) ondersteunende gegevens met betrekking 
tot bekende effecten; en v) bekende potentie binnen het bereik van de gewenste respons.
 
Valsnegatief:  een teststof die door een testmethode ten onrechte als negatief of 
niet-actief wordt geïdentificeerd, terwijl de stof feitelijk positief of actief is (33).  
Valspositief:  een teststof die ten onrechte als positief of actief wordt geïdentifi ­
ceerd, terwijl de stof in feite negatief of niet-actief is (33).  
Gevaar:  het risico van een nadelig effect op de gezondheid of het milieu. Het 
nadelige effect doet zich alleen voor indien er voldoende blootstelling is.  
Interlaboratoriumreproduceerbaarheid:  een maatstaf voor de mate waarin ver ­
schillende gekwalificeerde laboratoria die gebruikmaken van hetzelfde protocol 
en die dezelfde teststoffen testen, in kwalitatief en kwantitatief opzicht vergelijk ­
bare resultaten kunnen produceren. De interlaboratoriumreproduceerbaarheid wordt bepaald tijdens de prevaliderings- en valideringsprocessen en geeft aan in hoeverre een test met succes tussen laboratoria kan worden overgedragen; 
dit wordt ook wel reproduceerbaarheid tussen laboratoria genoemd (33).
 
Intralaboratoriumreproduceerbaarheid:  een bepaling van de mate waarin gekwa ­
lificeerde mensen binnen hetzelfde laboratorium met succes resultaten kunnen repliceren met gebruikmaking van een specifiek protocol op verschillende tijd ­
stippen. Dit wordt ook reproduceerbaarheid binnen laboratoria genoemd (33).
 
Uitbijter:  een uitbijter is een waarneming die duidelijk afwijkt van andere waar ­
den binnen een willekeurige steekproef uit een populatie.  
Kwaliteitsborging:  een beheerproces waarbij de naleving van de testnormen, 
eisen en boekhoudingsprocedures voor laboratoria alsmede de nauwkeurigheid 
van de gegevensoverdracht worden beoordeeld door personen die onafhankelijk 
zijn van degenen die de tests uitvoeren.  
Betrouwbaarheid:  indicatie van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd 
volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen laboratoria verspreid over de tijd kan worden toegepast. De betrouw ­
baarheid wordt beoordeeld door berekening van intra- en interlaboratoriumrepro ­
duceerbaarheid (33).
 
Huidsensibilisatie:  een immunologisch proces dat ontstaat wanneer een vatbare 
persoon of proefdier plaatselijk wordt blootgesteld aan een inducerend chemisch allergeen, dat een immunologische huidreactie veroorzaakt die kan leiden tot de 
ontwikkeling van contactsensibilisatie.
 
Stimuleringsindex (SI):  een waarde die wordt berekend om het huidsensibilisa ­
tiepotentieel van een teststof te beoordelen en die gelijk is aan de verhouding van de proliferatie bij behandelde groepen ten opzichte van de proliferatie bij de 
gelijktijdig met medium behandelde controlegroep.
 
Teststof:  dat met deze TM wordt getest/dat met deze TM wordt getest.  ▼M3 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  ACUTE INHALATIETOXICITEIT: METHODE TER BEPALING 
VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 436 (2009) van de OESO 
(TG 436). TG 403, de eerste testrichtlijn voor acute inhalatie, werd in 1981 
vastgesteld en is sindsdien aangepast (zie hoofdstuk B.2 van deze 
bijlage (1)). De ontwikkeling van een methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse (ATC) voor inhalatie (2)(3)(4) werd opportuun geacht na de vaststelling van de herziene ATC-methode voor orale toxiciteit 
(hoofdstuk B.1 ter van deze bijlage) (5). Een retrospectieve prestatiebeoor ­
deling van de ATC-testmethode voor acute inhalatietoxiciteit wees uit dat de methode geschikt is voor toepassing voor indelings- en etiketteringsdoel ­
einden (6). De ATC-testmethode voor inhalatie zal het mogelijk maken 
seriële stappen van vaste doelconcentraties toe te passen om te komen tot 
een toxiciteitsrangschikking van teststoffen. Sterfte wordt gebruikt als be ­
langrijkste eindpunt, maar als er sprake is van hevige pijn of angst of ophanden zijnde sterfte van dieren, worden deze dieren op humane wijze 
gedood om het lijden te beperken. OESO-leidraad nr. 19 (7) bevat richt ­
snoeren voor humane eindpunten.
 
2. Richtsnoeren voor de uitvoering en interpretatie van deze testmethode zijn 
opgenomen in leidraad nr. 39 betreffende tests op acute inhalatietoxiciteit 
(GD 39(8)).  
3. De in de context van deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen 
in aanhangsel 1 en in GD 39 (8).  
4. De testmethode levert informatie over de gevaarlijke eigenschappen op en 
maakt het mogelijk de teststof te rangschikken en in te delen overeenkom ­
stig Verordening (EG) nr. 1272/2008 voor de indeling van chemische stof ­
fen die acute toxiciteit veroorzaken (9). Als puntschattingen van de LC  50 - 
waarden of concentratie-responsanalysen vereist zijn, is de methode in hoofdstuk B.2 van deze bijlage (1) de aangewezen testmethode. Nadere richtsnoeren voor de keuze van testmethoden zijn opgenomen in GD 39 
(8). Deze testmethode is niet specifiek bedoeld voor het testen van speciale 
materialen, zoals slecht oplosbare isometrische materialen of vezelmaterialen of gefabriceerde nanomaterialen.
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
5. Alvorens te overwegen deze testmethode toe te passen, moet het testlabo ­
ratorium alle beschikbare informatie over de teststof, met inbegrip van be ­
staande studies waarvan de gegevens een argument vormen om geen aan ­
vullende tests uit te voeren, in aanmerking nemen teneinde het gebruik van dieren tot een minimum te beperken. Voor de keuze van de geschiktste soorten, stam, geslacht, wijze van blootstelling en testconcentraties kan 
onder meer gebruik worden gemaakt van informatie over de identiteit, che ­
mische structuur en fysisch-chemische eigenschappen van de teststof; de resultaten van eventuele in vitro of in vivo uitgevoerde toxiciteitstests; de voorgenomen toepassing(en) en de potentiële blootstelling van de mens; en 
de beschikbare (Q)SAR-gegevens en toxicologische gegevens over che ­
mische stoffen met een verwante structuur. Bij deze testmethode mogen geen concentraties worden gebruikt waarvan verwacht wordt dat zij door een bijtende (
 1 ) of sterk irriterende werking hevige pijn en angst opleveren 
(zie GD 39 (8)).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) De bijtende werking kan worden gebaseerd op het oordeel van deskundigen, met behulp 
van gegevens als: ervaring bij mens en dier, bestaande (in-vitro)gegevens, bv. de hoofd ­
stukken B.40 (10) en B.40 bis (11) van deze bijlage of TG 435 van de OESO (12), 
pH-waarden, informatie over soortgelijke chemische stoffen of andere relevante gege ­
vens.
 PRINCIPE VAN DE TEST  
6. Het principe van de test is dat tijdens een vier uur durende blootstelling 
stapsgewijs voldoende informatie over de acute inhalatietoxiciteit van de teststof wordt verkregen om indeling van de stof mogelijk te maken. 
Voor specifieke regelgevingsdoeleinden kan een andere blootstellingsduur 
vereist zijn. Bij elk van de gedefinieerde concentratiestappen worden drie dieren van elk geslacht getest. Afhankelijk van het aantal dode en/of ster ­
vende dieren kunnen twee stappen volstaan om een uitspraak over de acute 
toxiciteit van de teststof te kunnen doen. Als er aanwijzingen zijn dat het 
ene geslacht mogelijk gevoeliger is dan het andere, kan de test uitsluitend met dieren van het gevoeligste geslacht worden voortgezet. De uitkomst van 
de voorgaande stap is bepalend voor de volgende stap, waarbij er de vol ­
gende mogelijkheden zijn:
 
a) er zijn geen verdere tests nodig;  
b) er worden drie dieren per geslacht getest, of  
c) er worden uitsluitend zes dieren van het gevoeligste geslacht getest, 
d.w.z. dat de geschatte ondergrens van de toxiciteitsklasse wordt geba ­
seerd op zes dieren per testconcentratiegroep, ongeacht het geslacht.  
7. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevige 
en voortdurende angst vertonen, worden op humane wijze gedood en wor ­
den bij de interpretatie van de testresultaten op dezelfde manier behandeld als dieren die tijdens de test gestorven zijn. Leidraad nr. 19 inzake humane 
eindpunten (7) bevat criteria om te bepalen of stervende of hevig lijdende 
dieren moeten worden gedood en richtsnoeren om voorspelbare of ophanden zijnde sterfte te herkennen.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
8. Er worden gezonde jonge volwassen dieren van gangbare laboratoriums ­
tammen gebruikt. Er wordt de voorkeur gegeven aan ratten; het gebruik 
van andere soorten moet worden gemotiveerd.  
Voorbereiding van de dieren  
9. De vrouwtjes mogen nog geen jongen hebben gehad en mogen niet drachtig 
zijn. Op de dag van blootstelling moeten de jonge volwassen dieren acht tot 
twaalf weken oud zijn en een lichaamsgewicht hebben dat niet meer dan 20 % afwijkt van het gemiddelde gewicht voor elk geslacht van eerder blootgestelde dieren van dezelfde leeftijd. De dieren worden willekeurig 
gekozen en gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren. De 
dieren blijven voordat de test begint minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Vlak voor de test acclimatiseren de die ­
ren ook enige tijd in het testapparaat, aangezien hierdoor de stress als gevolg 
van de nieuwe omgeving zal afnemen.
 
Dierhouderij  
10. De temperatuur van de ruimte waar de proefdieren verblijven, moet 22 
± 3 °C zijn. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % 
gehouden, maar wanneer water als medium wordt gebruikt, zal dit niet altijd 
mogelijk zijn. Voor en na de blootstelling worden de dieren over het alge ­
meen groepsgewijs in kooien ondergebracht, waarbij zij naar geslacht en concentratie worden gescheiden; het aantal dieren per kooi mag echter niet 
zo groot zijn dat een duidelijke observatie van elk dier wordt gestoord en 
moet zodanig worden gekozen dat er zo min mogelijk dieren verloren gaan als gevolg van kannibalisme en gevechten. Wanneer de dieren uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan acclimatisatie voor de fixeerbuizen 
noodzakelijk zijn. De fixeerbuizen mogen geen onnodige lichamelijke, ther ­
mische of immobilisatiestress voor de dieren opleveren. De immobilisatie
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
kan van invloed zijn op fysiologische eindpunten zoals de lichaamstempe ­
ratuur (hyperthermie) en/of het ademminuutvolume. Als er generieke gege ­
vens beschikbaar zijn waaruit blijkt dat geen significante veranderingen als gevolg van de immobilisatie optreden, is geen voorafgaande gewenning aan de fixeerbuizen noodzakelijk. Dieren die met hun hele lijf aan een aerosol 
worden blootgesteld, worden tijdens de blootstelling individueel gehuisvest 
om te voorkomen dat zij het testaerosol filteren door de vacht van hun kooigenoten. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk en gecertifi ­
ceerd laboratoriumvoeder, behalve tijdens de blootstelling, met een onbe ­
perkte hoeveelheid drinkwater uit de waterleiding. Er wordt kunstlicht ge ­
bruikt met een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker.
 
Inhalatiekamers  
11. Bij de keuze van de inhalatiekamer wordt rekening gehouden met de aard 
van de teststof en het doel van de test. Blootstelling via de neus alleen heeft 
de voorkeur (hieronder vallen blootstelling via de kop alleen, blootstelling via de neus alleen en blootstelling via de snuit alleen). Blootstelling via de neus alleen heeft over het algemeen de voorkeur voor studies van vloeibare 
of vaste aerosolen en voor dampen die kunnen condenseren tot aerosolen. 
Speciale doelstellingen van de studie kunnen beter worden verwezenlijkt door blootstelling van het hele lijf, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd. Om bij gebruik van een kamer voor het hele lijf te zorgen voor 
een stabiele atmosfeer, mag het totale volume van de testdieren niet meer dan 
5 % van het volume van de kamer innemen. De technische principes voor blootstelling via de neus alleen en blootstelling van het hele lijf, alsook de specifieke voor- en nadelen ervan, zijn uiteengezet in GD 39 (8).
 
BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Toediening van concentraties  
12. Er wordt een vaste blootstellingsduur van vier uur, exclusief equilibratietijd, 
aanbevolen. In verband met specifieke eisen kan een andere duur nood ­
zakelijk zijn, maar dit moet in het studieverslag worden gemotiveerd (zie GD 39 (8)). Dieren die in een kamer voor het hele lijf worden blootgesteld, 
worden afzonderlijk gehuisvest om ingestie van de teststof door het ver ­
zorgen van kooigenoten te voorkomen. Tijdens de blootstellingsperiode krijgen de dieren geen voeder. Tijdens een blootstelling van het hele lijf kan de dieren water worden gegeven.
 
13. De dieren worden aan de teststof blootgesteld in de vorm van gas, damp, 
aerosol of een mengsel daarvan. De te testen fysische toestand hangt af van 
de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof, de gekozen concentra ­
tie en/of de meest waarschijnlijke fysische vorm waarin de teststof bij hantering en gebruik aanwezig is. Hygroscopische en chemisch reactieve 
teststoffen moeten worden getest in drogeluchtomstandigheden. Er dient 
op te worden gelet dat er geen explosieve concentraties optreden.
 
Deeltjesgrootteverdeling  
14. Voor alle aerosolen en voor dampen die tot aerosolen kunnen condenseren, 
wordt de deeltjesgrootte bepaald. Om blootstelling van alle relevante delen 
van de ademhalingswegen mogelijk te maken, worden aerosolen met een massamediaan van de aerodynamische diameter (MMAD) tussen 1 en 4 μm 
en een geometrische standaardafwijking ( σ
 g ) tussen 1,5 en 3,0 aanbevolen 
(8)(13)(14). Hoewel redelijkerwijs moet worden getracht deze normwaarden 
te halen, wordt het oordeel van een deskundige gegeven als dit niet mogelijk blijkt. Zo kunnen de deeltjes van metaaldampen kleiner zijn dan deze norm, terwijl geladen deeltjes, vezels en hygroscopische materialen (die in de 
vochtige omgeving van de ademhalingswegen opzwellen) de norm kunnen 
overschrijden.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Bereiding van de teststof in een medium  
15. Er kan een medium worden gebruikt om een passende concentratie en deel ­
tjesgrootte van de teststof in de atmosfeer te verkrijgen. Als algemene regel wordt de voorkeur gegeven aan water. Deeltjesmateriaal kan aan mecha ­
nische processen worden onderworpen om de gewenste deeltjesgroottever ­
deling te verkrijgen, waarbij er echter op moet worden gelet dat de teststof niet wordt ontbonden of gewijzigd. Als de samenstelling van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen (bv. als er bij overvloe ­
dig malen door wrijving een extreme temperatuur is ontstaan), wordt de 
samenstelling analytisch gecontroleerd. Er dient zorgvuldig op te worden gelet dat de teststof niet wordt verontreinigd. Niet-broze korrelige materialen 
die met opzet zo zijn samengesteld dat zij niet-inhaleerbaar zijn, hoeven niet 
te worden getest. Aan de hand van een slijtageproef moet worden aange ­
toond dat bij de hantering van het korrelige materiaal geen inhaleerbare deeltjes ontstaan. Als bij een slijtageproef inhaleerbare deeltjes ontstaan, 
wordt een test op inhalatietoxiciteit verricht.
 
Controledieren  
16. Er is geen parallelle negatieve controlegroep (lucht) noodzakelijk. Wanneer 
voor het verkrijgen van de testatmosfeer een ander medium dan water wordt gebruikt, moet alleen een controlegroep voor dat medium worden gebruikt wanneer er geen historische gegevens over de inhalatietoxiciteit beschikbaar 
zijn. Indien een toxiciteitsstudie van een in een medium bereide teststof 
uitwijst dat er geen toxiciteit optreedt, volgt hieruit dat het medium bij de geteste concentratie niet toxisch is; in dat geval is er geen mediumcontrole noodzakelijk.
 
CONTROLE VAN DE BLOOTSTELLINGSOMSTANDIGHEDEN  
Luchtdoorstroming in de kamer  
17. Tijdens elke blootstelling wordt de luchtdoorstroming in de kamer zorgvul ­
dig geregeld, voortdurend gecontroleerd en ten minste elk uur geregistreerd. 
De controle van de concentratie (of stabiliteit) van de testatmosfeer is een integrale meting van alle dynamische parameters waarbij indirect alle rele ­
vante dynamische parameters voor het verkrijgen van de atmosfeer kunnen 
worden geregeld. Wanneer kamers voor blootstelling via de neus alleen 
worden gebruikt, moet er in het bijzonder op worden gelet dat de uitgea ­
demde lucht niet opnieuw wordt ingeademd indien de luchtdoorstroming in het blootstellingssysteem ontoereikend is om een dynamische luchtdoorstro ­
ming van de teststofatmosfeer te verkrijgen. Er zijn voorgeschreven metho ­
den die kunnen worden toegepast om aan te tonen dat de uitgeademde lucht bij de gekozen operationele omstandigheden niet opnieuw wordt ingeademd (8)(15). Het zuurstofgehalte moet ten minste 19 % bedragen en het kool ­
dioxidegehalte niet meer dan 1 %. Als er redenen zijn om aan te nemen dat 
deze normwaarden niet kunnen worden gehaald, moet de zuurstof- en kool ­
dioxideconcentratie worden gemeten.
 
Temperatuur en relatieve vochtigheid in de kamer  
18. De temperatuur in de kamer moet op 22 ± 3 °C worden gehouden. Bij 
blootstelling via de neus alleen en bij blootstelling van het hele lijf wordt 
de relatieve vochtigheid in het ademhalingsgebied van de dieren gecontro ­
leerd en bij een blootstellingsduur tot vier uur ten minste drie keer en bij een kortere blootstelling ieder uur geregistreerd. De relatieve vochtigheid wordt idealiter tussen 30 en 70 % gehouden, al zal dit niet altijd haalbaar (bv. 
wanneer mengsels op waterbasis worden getest) of meetbaar zijn vanwege 
interferentie tussen de teststof en de testmethode.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Teststof: nominale concentratie  
19. Waar mogelijk wordt de nominale concentratie in de blootstellingskamer 
berekend en geregistreerd. De nominale concentratie is de massa van de gegenereerde teststof gedeeld door het totale luchtvolume dat door het ka ­
mersysteem wordt geleid. De nominale concentratie wordt niet gebruikt om 
de blootstelling van de dieren te karakteriseren, maar een vergelijking tussen de nominale en de feitelijke concentratie vormt een aanwijzing voor het rendement van het testsysteem en kan bijgevolg worden gebruikt om pro ­
blemen bij het genereren te ontdekken.
 
Teststof: feitelijke concentratie  
20. De feitelijke concentratie is de concentratie van de teststof in het ademha ­
lingsgebied van de dieren in een inhalatiekamer. De feitelijke concentraties 
kunnen worden verkregen door toepassing van specifieke methoden (bv. rechtstreekse bemonstering of op adsorptie of een chemische reactie geba ­
seerde methoden, gevolgd door analytische karakterisering) of 
niet-specifieke methoden, zoals gravimetrische filteranalyse. Gravimetrische 
analysen zijn alleen aanvaardbaar voor aerosolen van poeders met één com ­
ponent of aerosolen van vloeistoffen met een geringe vluchtigheid en moe ­
ten worden ondersteund met passende specifieke karakteriseringen van de 
teststof voorafgaand aan de studie. De concentratie van aerosolen van poe ­
ders met meerdere componenten kan ook door middel van gravimetrische analyse worden bepaald. In dat geval zijn echter analytische gegevens ver ­
eist die aantonen dat de samenstelling van het materiaal in de lucht ver ­
gelijkbaar is met die van het uitgangsmateriaal. Als deze informatie niet 
beschikbaar is, kan het nodig zijn in de loop van de studie op gezette tijden een nieuwe analyse van de teststof (idealiter in de toestand in de lucht) uit te voeren. Voor geaerosoliseerde stoffen die kunnen verdampen of sublimeren, 
moet worden aangetoond dat met de gekozen methoden alle fasen zijn 
verzameld. In het studieverslag worden de doelconcentratie, de nominale concentratie en de feitelijke concentratie vermeld, maar in statistische ana ­
lysen voor de berekening van de letale concentratiewaarden wordt uitslui ­
tend gebruikgemaakt van de feitelijke concentraties.
 
21. Er wordt zo mogelijk één partij van de teststof gebruikt en het testmonster 
wordt bewaard onder omstandigheden waarbij de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit behouden blijven. Voor aanvang van de studie worden de teststof, met inbegrip van de zuiverheid, en indien technisch mogelijk de 
identiteit en de hoeveelheden van vastgestelde verontreinigingen en onzui ­
verheden gekarakteriseerd. Dit kan onder meer met de volgende gegevens worden aangetoond: retentietijd en relatief piekoppervlak, moleculair ge ­
wicht op basis van massaspectroscopie of gaschromatografie, of andere 
schattingen. Hoewel het testlaboratorium niet verantwoordelijk is voor de 
identiteit van het testmonster, kan het raadzaam zijn dat het testlaboratorium de karakterisering van de opdrachtgever ten minste in beperkte mate beves ­
tigt (bv. kleur, fysische aard enz.).
 
22. De blootstellingsatmosfeer wordt zo constant mogelijk gehouden en, afhan ­
kelijk van de analysemethode, voortdurend en/of met tussenpozen gecontro ­
leerd. Wanneer met tussenpozen wordt bemonsterd, wordt in een studie van vier uur ten minste twee keer een monster van de kameratmosfeer genomen. Als dit vanwege de beperkte luchtdoorstroming of lage concentraties niet 
mogelijk is, kan één monster gedurende de volledige blootstellingsperiode 
worden verzameld. Indien significante fluctuaties tussen monsters optreden, worden bij de volgende geteste concentraties vier monsters per blootstelling genomen. Het verschil tussen individuele monsters van de kamerconcentra ­
tie en de gemiddelde kamerconcentratie mag bij gassen en dampen niet meer 
dan ± 10 % en bij vloeibare of vaste aerosolen niet meer dan ± 20 % bedragen. De equilibratietijd van de kamer (t
 95 ) wordt berekend en geregis ­
treerd. De blootstellingsduur omvat de tijd waarin de teststof wordt gege ­
nereerd en houdt rekening met de tijd die nodig is om t  95 te bereiken. In GD 
39 (8) zijn richtsnoeren voor het schatten van t  95 opgenomen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Voor zeer complexe mengsels bestaande uit dampen/gassen en aerosolen 
(bv. verbrandingsatmosferen en teststoffen die zijn ontleend aan doelgerichte 
eindproducten of apparaten), kan elke fase zich in een inhalatiekamer ver ­
schillend gedragen, zodat van elke fase (damp/gas en aerosol) ten minste één indicatorstof (analyt) moet worden gekozen, normaliter de voornaamste 
werkzame stof in het mengsel. Wanneer de teststof een mengsel is, wordt de 
analytische concentratie vermeld voor het totale mengsel, en niet slechts voor het werkzame bestanddeel of de component (analyt). Aanvullende informatie over feitelijke concentraties is opgenomen in GD 39 (8).
 
Teststof: deeltjesgrootteverdeling  
24. De deeltjesgrootteverdeling van aerosolen wordt tijdens elke blootstelling 
van vier uur ten minste twee keer bepaald met behulp van een cascade-impactor of een alternatief instrument, zoals een aerodynamische deeltjesgroottemeter. Indien kan worden aangetoond dat de met een 
cascade-impactor of een alternatief instrument verkregen resultaten gelijk ­
waardig zijn, mag het alternatieve instrument gedurende de hele studie worden gebruikt. Parallel aan het primaire instrument wordt een tweede instrument, zoals een gravimetrisch filter of een impinger/gas bubbler ge ­
bruikt om de doeltreffendheid van de verzameling met het primaire instru ­
ment te bevestigen. De door middel van deeltjesgrootteanalyse en filterana ­
lyse verkregen massaconcentraties moeten in redelijke mate overeenkomen (zie GD 39 (8)). Indien in een vroeg stadium van de studie de gelijkwaar ­
digheid kan worden aangetoond, zijn verdere bevestigende metingen niet 
nodig. Met het oog op het dierenwelzijn moeten maatregelen worden ge ­
nomen om zo veel mogelijk te voorkomen dat niet-overtuigende gegevens worden verkregen waardoor herhaling van de blootstelling noodzakelijk is. 
Voor dampen wordt de deeltjesgrootte bepaald indien de mogelijkheid be ­
staat dat de dampen condenseren waardoor aerosolvorming optreedt of in ­
dien in een dampatmosfeer deeltjes worden gedetecteerd waarbij gemengde fasen kunnen optreden (zie punt 14).
 
PROCEDURE  
Hoofdtest  
25. Voor elke stap wordt gebruikgemaakt van drie dieren van elk geslacht of zes 
dieren van het gevoeligste geslacht. Wanneer andere knaagdieren dat ratten uitsluitend via de neus worden blootgesteld, kan de maximale blootstellings ­
duur worden aangepast om soortspecifieke symptomen van angst te voor ­
komen. Van de vier vaste doses wordt er één als aanvangsconcentratie 
gekozen, namelijk die waarbij naar alle waarschijnlijkheid toxiciteit bij en ­
kele dieren zal optreden. De testschema’s voor gassen, dampen en aerosolen (opgenomen in de aanhangsels 2-4) vertegenwoordigen tests met de drem ­
pelwaarden van de CLP-categorieën 1-4 (9) voor gassen (100, 500, 2 500, 
20 000 ppm/4h) (aanhangsel 2), voor dampen (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (aan ­
hangsel 3) en voor aerosolen (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (aanhangsel 4). Categorie 5, die niet bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer 
wordt gelegd, betreft concentraties boven de desbetreffende limietconcentra ­
ties. Voor elke aanvangsconcentratie is het desbetreffende testschema van toepassing. De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode dieren, de procedure aan die moet worden gevolgd 
totdat indeling mogelijk is.
 
26. De tijdsduur tussen de blootstelling van de verschillende groepen wordt 
bepaald door de aanvang, de duur en de ernst van de toxiciteitsverschijnse ­
len. De blootstelling van dieren bij het volgende concentratieniveau wordt 
uitgesteld totdat een redelijk vertrouwen bestaat dat de eerder geteste dieren zullen overleven. Er wordt aanbevolen tussen de blootstellingen op elk con ­
centratieniveau een periode van drie of vier dagen in te lassen om observatie 
van vertraagde toxiciteit mogelijk te maken. Dit interval kan zo nodig 
worden aangepast, bijvoorbeeld bij onduidelijke reacties.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Limiettest  
27. De limiettest wordt toegepast indien bekend is of verwacht wordt dat de 
teststof praktisch niet-toxisch is, d.w.z. dat een toxische reactie alleen op ­
treedt boven de in de regelgeving bepaalde limietconcentratie. Informatie 
over de toxiciteit van de teststof kan afkomstig zijn van kennis omtrent 
vergelijkbare geteste stoffen of vergelijkbare mengsels, waarbij rekening wordt gehouden met de identiteit en het percentage van de bestanddelen waarvan bekend is dat zij in toxicologisch opzicht relevant zijn. Wanneer er 
weinig of geen informatie over de toxiciteit van de teststof is of wordt 
verwacht dat de teststof toxisch is, moet de hoofdtest worden uitgevoerd (verdere richtsnoeren staan in GD 39 (8)).
 
28. Als limiettest voor deze testmethode worden volgens de normale procedure 
drie dieren van elk geslacht of zes dieren van het gevoeligste geslacht blootgesteld aan concentraties van 20 000 ppm voor gassen, 20 mg/l voor 
dampen en 5 mg/l voor stof/nevels (indien haalbaar). Wanneer aerosolen 
worden getest, is het primaire doel een in te ademen deeltjesgrootte te ver ­
krijgen (d.w.z. een MMAD van 1-4 μm). Voor de meeste teststoffen is dit 
mogelijk bij een concentratie van 2 mg/l. Aerosolen mogen alleen bij een 
hogere concentratie dan 2 mg/l worden getest indien een in te ademen 
deeltjesgrootte kan worden verkregen (zie GD 39 (8)). Overeenkomstig het GHS (16) worden tests boven een limietconcentratie met het oog op het dierenwelzijn afgeraden. Tests in GHS-categorie 5 (16), die niet bij 
Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer wordt gelegd, moeten alleen 
worden overwogen wanneer het zeer waarschijnlijk is dat de resultaten van een dergelijke test rechtstreeks van belang zijn om de gezondheid van mensen te beschermen, en moeten in het studieverslag worden gemotiveerd. 
Als de teststof kan ontploffen, moet worden vermeden dat zich omstandig ­
heden voordoen waarin een explosie kan optreden. Om onnodig gebruik van dieren te voorkomen wordt de limiettest van tevoren één keer zonder dieren uitgevoerd om te waarborgen dat de kameromstandigheden voor een limiet ­
test kunnen worden bereikt.
 
OBSERVATIES  
29. De dieren worden tijdens de blootstellingsperiode veelvuldig klinisch geob ­
serveerd. Na de blootstelling worden op dezelfde dag nog ten minste twee klinische observaties verricht, of meer als de respons van de dieren op de 
behandeling daartoe aanleiding geeft, en vervolgens gedurende veertien da ­
gen ten minste één keer per dag. De duur van de observatieperiode staat niet vast, maar wordt bepaald op grond van de aard en het aanvangstijdstip van klinische symptomen en de duur van de herstelperiode. Het is belangrijk op 
welk tijdstip de toxiciteitsverschijnselen verschijnen en verdwijnen, vooral 
als er een neiging is tot vertraagde toxiciteitsverschijnselen. Alle observaties worden systematisch geregistreerd en van elk dier wordt een apart overzicht bijgehouden. Dieren die stervend worden aangetroffen en dieren die hevige 
pijn hebben en/of blijvende tekenen van hevige angst vertonen, worden met 
het oog op het dierenwelzijn op humane wijze gedood. Wanneer onderzoek wordt gedaan naar klinische toxiciteitsverschijnselen, moet erop worden gelet dat een aanvankelijk slecht uiterlijk aspect en voorbijgaande verande ­
ringen in de ademhaling als gevolg van de blootstellingsprocedure, niet 
worden aangezien voor aan de behandeling gerelateerde effecten. Er moet rekening worden gehouden met de beginselen en criteria in de leidraad voor humane eindpunten (7). Wanneer dieren om redenen van dierenwelzijn 
worden gedood of dood worden aangetroffen, wordt zo nauwkeurig moge ­
lijk geregistreerd op welk tijdstip ze zijn gestorven.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Bij externe observaties van de dieren in de kooien wordt gekeken naar 
veranderingen in de huid en de vacht, de ogen en de slijmvliezen, de 
ademhalingsorganen, de bloedsomloop, het autonome en centrale zenuw ­
stelsel, de somatomotorische activiteit en gedragspatronen. Waar mogelijk moet een onderscheid worden gemaakt tussen lokale en systemische effec ­
ten. Er moet worden gelet op de observatie van tremors, convulsies, speek ­
selafscheiding, diarree, lethargie, slaap en coma. Een meting van de rectale temperatuur kan ondersteunende gegevens opleveren voor met de behan ­
deling of opsluiting verband houdende reflectoire bradypneu of 
hypo-/hyperthermie.
 
Lichaamsgewicht  
31. Het gewicht van elk dier wordt tijdens de acclimatiseringsperiode één keer 
geregistreerd, op dag 0 (de dag van blootstelling) voorafgaand aan de bloot ­
stelling en ten minste op de dagen 1, 3 en 7 (en vervolgens iedere week), 
alsook op het moment waarop het dier sterft of wordt geëuthanaseerd als dit na dag 1 is. Het lichaamsgewicht is erkend als een kritische indicator van toxiciteit en dieren die een blijvende gewichtsafname van ≥ 20 % vertonen 
ten opzichte van de voor de studie geregistreerde waarde, moeten zorgvuldig 
worden gevolgd. Aan het einde van de periode na de blootstelling worden de dieren die nog leven, gewogen en op humane wijze gedood.
 
Pathologie  
32. Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of 
met het oog op het dierenwelzijn worden geëuthanaseerd en uit het onder ­
zoek worden genomen, wordt macroscopische obductie uitgevoerd. Als het niet mogelijk is onmiddellijk nadat een dood dier is aangetroffen een ob ­
ductie te verrichten, wordt het dier gekoeld (niet bevroren) bij temperaturen 
die laag genoeg zijn om de autolyse tot een minimum te beperken. De obductie wordt zo spoedig mogelijk verricht, normaliter binnen één of twee dagen. Alle met het blote oog waarneembare pathologische verande ­
ringen worden voor elk dier geregistreerd, met bijzondere aandacht voor 
veranderingen in de luchtwegen.
 
33. Om de interpretatieve waarde van de studie te vergroten, kan worden over ­
wogen aanvullend onderzoek te verrichten dat vooraf in de opzet is opge ­
nomen, zoals bepaling van het longgewicht van overlevende ratten en/of microscopisch onderzoek van de luchtwegen om aanwijzingen voor irritatie 
te vinden. Ook kunnen de organen worden onderzocht die tekenen van 
macroscopische pathologische veranderingen vertonen bij dieren die na 24 uur of langer nog leven, alsmede organen waarvan bekend is of verwacht wordt dat zij zijn aangetast. Microscopisch onderzoek van de volledige 
luchtwegen kan nuttige informatie opleveren voor teststoffen die met water 
reageren, zoals zuren en hygroscopische teststoffen.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
34. Voor elk dier worden de gegevens over het lichaamsgewicht en de obduc ­
tiebevindingen vermeld. Daarnaast worden de gegevens van de klinische 
observatie in tabelvorm samengevat met voor alle testgroepen vermelding 
van het gebruikte aantal dieren, het aantal dieren dat specifieke toxiciteits ­
verschijnselen vertoonde, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aange ­
troffen of om redenen van dierenwelzijn is gedood, het tijdstip waarop elk 
dier is gestorven, een beschrijving van de toxische effecten met het verloop 
en de omkeerbaarheid en de obductiebevindingen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Testverslag  
35. In het testverslag wordt indien van toepassing de volgende informatie opge ­
nomen:  
Proefdieren en dierhouderij:  
— beschrijving van de omstandigheden van de kooi, met inbegrip van: 
aantal (of verandering in het aantal) dieren per kooi, strooisel, omge ­
vingstemperatuur en relatieve vochtigheid, lichtregime en identificatie 
van de voeding;  
— gebruikte soort/stam en motivering voor het gebruik van een ander soort 
dan ratten;  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren;  
— randomiseringsmethode;  
— details van de voeder- en waterkwaliteit (waaronder aard en herkomst 
van het voeder en herkomst van het water);  
— beschrijving van de eventuele conditionering voorafgaand aan de test, 
met inbegrip van voeding, quarantaine en behandeling voor ziekte.  
Teststof:  
— fysische aard, zuiverheid en, indien relevant, fysisch-chemische eigen ­
schappen (met inbegrip van de isomeersamenstelling);  
— identificatiegegevens en, indien bekend, CAS-nummer (Chemical Ab ­
stracts Service).  
Medium:  
— motivatie voor het gebruik van het medium en voor de keuze ervan 
(indien een ander medium dan water wordt gebruikt);  
— historische of parallelle gegevens waaruit blijkt dat het medium niet 
interfereert met de uitkomst van de studie.  
Inhalatiekamer:  
— beschrijving van de inhalatiekamer met inbegrip van afmetingen en 
volume;  
— herkomst en beschrijving van de apparatuur die voor de blootstelling van 
dieren en het verkrijgen van de atmosfeer is gebruikt;  
— apparatuur voor het meten van de temperatuur, de vochtigheid, de deel ­
tjesgrootte en de feitelijke concentratie;  
— herkomst van de lucht, behandeling van de aangevoerde/geëxtraheerde 
lucht en systeem dat voor de conditionering is gebruikt;  
— toegepaste methoden voor de kalibratie van de apparatuur voor het ver ­
krijgen van een homogene testatmosfeer;  
— drukverschil (positief of negatief);  
— blootstellingspoorten per kamer (blootstelling via de neus alleen); locatie 
van de dieren in het systeem (blootstelling van het hele lijf);  
— homogeniteit/stabiliteit van de testatmosfeer in de tijd;  
— locatie van temperatuur- en vochtigheidssensoren en bemonstering van 
de testatmosfeer in de kamer;  
— luchtdebiet, luchtdebiet per blootstellingspoort (blootstelling via de neus 
alleen) of dierbelasting per kamer (blootstelling van het hele lijf);  
— informatie over de apparatuur die voor de zuurstof- en kooldioxideme ­
ting is gebruikt, indien van toepassing;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— equilibratietijd van de kamer (t  95 ); 
— aantal volumeveranderingen per uur;  
— meetapparaten (indien van toepassing).  
Blootstellingsgegevens:  
— motivering van de keuze van de doelconcentratie in de hoofdstudie;  
— nominale concentraties (totale massa van de in de inhalatiekamer geleide 
teststof, gedeeld door het door de kamer geleide luchtvolume);  
— feitelijke concentraties van de in het ademhalingsgebied van de dieren 
verzamelde teststof; voor testmengsels die heterogene fysische vormen 
produceren (gassen, dampen, aerosolen) kan elke vorm afzonderlijk wor ­
den geanalyseerd;  
— alle luchtconcentraties worden in massa-eenheden vermeld (bv. mg/l, 
mg/m  3 enz.); de volume-eenheden (bv. ppm, ppb) kunnen tevens tussen 
haakjes worden vermeld;  
— deeltjesgrootteverdeling, massamediaan van de aerodynamische 
diameter (MMAD) en geometrische standaardafwijking ( σ g ), onder ver ­
melding van de wijze waarop zij zijn berekend. De individuele deeltjes ­
grootteanalysen worden vermeld.  
Testomstandigheden:  
— details van de bereiding van de teststof, met inbegrip van details van de 
procedures die zijn gevolgd om de deeltjesgrootte van vaste stoffen te 
verlagen of oplossingen van de teststof te bereiden. Als de samenstelling 
van de teststof mogelijk is gewijzigd door mechanische processen, wor ­
den de resultaten opgenomen van de analysen die zijn verricht om de samenstelling van de teststof te controleren;
 
— een beschrijving (bij voorkeur met een schematische voorstelling) van de 
apparatuur die voor het verkrijgen van de testatmosfeer en de bloot ­
stelling van de dieren aan de testatmosfeer is gebruikt;  
— details van de toegepaste chemische analysemethode en de validering 
van die methode (met inbegrip van de efficiëntie van de recovery van de teststof uit het bemonsteringsmedium);
 
— motivering van de keuze van de testconcentraties.  
Resultaten:  
— een tabel met de temperatuur, vochtigheid en luchtdoorstroming van de 
kamer;  
— een tabel met de nominale en feitelijke concentratiegegevens van de 
kamer;  
— een tabel met de deeltjesgroottegegevens met inbegrip van gegevens 
over de verzameling van het analytisch monster, de deeltjesgroottever ­
deling en de berekening van de MMAD en σ g ; 
— een tabel met gegevens over de respons en het concentratieniveau voor 
elk dier (bv. dieren met toxiciteitsverschijnselen, met inbegrip van sterf ­
te, en de aard, hevigheid en duur van de effecten);  
— voor elk dier het op de dagen van de studie bepaalde gewicht en de 
datum en het tijdstip waarop zij zijn gestorven, indien vóór de geplande 
euthanasie; voor elk dier het aanvangstijdstip van de toxiciteitsverschijn ­
selen en of deze reversibel waren;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— voor elk dier de obductiebevindingen en de histopathologische bevin ­
dingen, indien beschikbaar;  
— de indeling in CLP-categorie en de LC  50 -drempelwaarde.  
Bespreking en interpretatie van de resultaten:  
— speciale aandacht wordt besteed aan de beschrijving van de methoden 
die zijn toegepast om te voldoen aan de criteria van deze testmethode, bv. de limietconcentratie of de deeltjesgrootte;
 
— er wordt aandacht besteed aan de inhaleerbaarheid van deeltjes in het 
licht van de algemene bevindingen, in het bijzonder als niet aan de 
deeltjesgroottecriteria kan worden voldaan;  
— in de algehele beoordeling van de studie wordt aandacht besteed aan de 
consistentie van de methoden die voor de bepalingen van de nominale en feitelijke concentratie zijn toegepast, alsmede aan het verband tussen de feitelijke en de nominale concentratie;
 
— er wordt aandacht besteed aan de waarschijnlijke doodsoorzaak en over ­
heersende werking (systemisch of plaatselijk);  
— er wordt een toelichting gegeven als dieren op humane wijze moesten 
worden gedood omdat zij pijn hadden of tekenen van hevige en voort ­
durende angst vertoonden, op basis van de criteria in de OESO-leidraad voor humane eindpunten (7).
 
LITERATUUR:  
(1) Hoofdstuk B.2 van deze bijlage, Acute inhalatietoxiciteit.  
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Bio ­
metric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  
Arch. Toxicol.  77: 243-254.  
(3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
(4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
(5) Hoofdstuk B.1 ter van deze bijlage, Acute orale toxiciteit: methode ter 
bepaling van de acute-toxiciteitsklasse.  
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 105, OECD, Paris. Beschikbaar op: http:// www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19. Beschikbaar op: http:// www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sessment No. 39, OECD, Paris. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines.  
(9) Verordening (EG) nr. 1272/2008 van het Europees Parlement en de Raad 
van 16 december 2008 betreffende de indeling, etikettering en verpakking van stoffen en mengsels tot wijziging en intrekking van de Richtlijnen 
67/548/EEG en 1999/45/EG en tot wijziging van Verordening (EG) 
nr. 1907/2006 (PB L 353 van 31.12.2008, blz. 1).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Hoofdstuk B.40 van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test op basis van de 
transcutane elektrische weerstand (TEW).  
(11) Hoofdstuk B.40 bis van deze bijlage, In-vitrohuidcorrosie: test met humaan 
huidmodel.  
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Beschik ­
baar op: http://www.oecd.org/env/testguidelines.  
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321-327.
 
(15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167.  
(16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Beschikbaar op: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_welcome_e.html.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIE  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Aanhangsel 2  
Procedure voor elke aanvangsconcentratie voor gassen (ppm/4h)  
Algemene opmerkingen (  1 ) 
In de stroomschema’s in dit aanhangsel wordt voor elke aanvangsconcentratie de 
te volgen procedure geschetst.  
Aanhangsel 2a: aanvangsconcentratie 100 ppm  
Aanhangsel 2b: aanvangsconcentratie 500 ppm  
Aanhangsel 2c: aanvangsconcentratie 2 500 ppm  
Aanhangsel 2d: aanvangsconcentratie 20 000 ppm  
De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode 
dieren, de te volgen procedure aan.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) In de volgende tabellen wordt verwezen naar het GHS (Globally Harmonised System for 
Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal geharmoniseerd classificatie- en 
etiketteringssysteem voor chemische stoffen). Het EU-equivalent hiervan is 
Verordening (EG) nr. 1272/2008. Categorie 5 voor acute inhalatietoxiciteit wordt niet 
bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer gelegd.
 Aanhangsel 2a  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 100 ppm/4h voor gassen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Aanhangsel 2b  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 500 ppm/4h voor gassen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Aanhangsel 2c  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 2 500 ppm/4h voor gassen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Aanhangsel 2d  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 20 000 ppm/4h voor gassen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Aanhangsel 3  
Procedure voor elke aanvangsconcentratie voor dampen (mg/l/4h)  
Algemene opmerkingen (  1 ) 
In de stroomschema’s in dit aanhangsel wordt voor elke aanvangsconcentratie de 
te volgen procedure geschetst.  
Aanhangsel 3a: aanvangsconcentratie 0,5 mg/l  
Aanhangsel 3b: aanvangsconcentratie 2,0 mg/l  
Aanhangsel 3c: aanvangsconcentratie 10 mg/l  
Aanhangsel 3d: aanvangsconcentratie 20 mg/l  
De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode 
dieren, de te volgen procedure aan.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) In de volgende tabellen wordt verwezen naar het GHS (Globally Harmonised System for 
Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal geharmoniseerd classificatie- en 
etiketteringssysteem voor chemische stoffen). Het EU-equivalent hiervan is 
Verordening (EG) nr. 1272/2008. Categorie 5 voor acute inhalatietoxiciteit wordt niet 
bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer gelegd.
 Aanhangsel 3a  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 0,5 mg/l/4h voor dampen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Aanhangsel 3b  
Acute Inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 2 mg/l/4h voor dampen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Aanhangsel 3c  
Acute Inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 10 mg/l/4h voor dampen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Aanhangsel 3d  
Acute Inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 20 mg/l/4h voor dampen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Aanhangsel 4  
Procedure voor elke aanvangsconcentratie voor aerosolen (mg/l/4h)  
Algemene opmerkingen (  1 ) 
In de stroomschema’s in dit aanhangsel wordt voor elke aanvangsconcentratie de 
te volgen procedure geschetst.  
Aanhangsel 4a: aanvangsconcentratie 0,05 mg/l  
Aanhangsel 4b: aanvangsconcentratie 0,5 mg/l  
Aanhangsel 4c: aanvangsconcentratie 1 mg/l  
Aanhangsel 4d: aanvangsconcentratie 5 mg/l  
De pijlen geven, afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze gedode 
dieren, de te volgen procedure aan.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) In de volgende tabellen wordt verwezen naar het GHS (Globally Harmonised System for 
Classification and Labelling of Chemicals, mondiaal geharmoniseerd classificatie- en 
etiketteringssysteem voor chemische stoffen). Het EU-equivalent hiervan is 
Verordening (EG) nr. 1272/2008. Categorie 5 voor acute inhalatietoxiciteit wordt niet 
bij Verordening (EG) nr. 1272/2008 (9) ten uitvoer gelegd.
 Aanhangsel 4a  
Acute Inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 0.05 mg/l/4h voor dampen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Aanhangsel 4b  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 0,5 mg/l/4h voor aerosolen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Aanhangsel 4c  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 1 mg/l/4h voor aerosolen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Aanhangsel 4d  
Acute inhalatietoxiciteit:  
Testprocedure bij een aanvangsconcentratie van 500 ppm/4h voor gassen
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  ONDERZOEK NAAR ONTWIKKELINGSNEUROTOXICITEIT  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 426 (2007) van de 
OESO. In juni 1995 boog een werkgroep inzake reproductie- en ontwikke ­
lingstoxiciteit van de OESO in Kopenhagen zich over de noodzaak om de 
bestaande OESO-testrichtlijnen voor reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit bij te werken en over de ontwikkeling van nieuwe richtsnoeren voor nog niet behandelde eindpunten (1). De werkgroep deed de aanbeveling een 
testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit te schrijven uitgaande van 
een Amerikaanse EPA-richtlijn, die inmiddels is herzien (2). In juni 1996 werd in Kopenhagen een tweede raadplegingsbijeenkomst gehouden om het Secretariaat een leidraad te bieden voor de opzet van een nieuwe testrichtlijn 
voor ontwikkelingsneurotoxiciteit, met inbegrip van de hoofdelementen, bv. 
details over de keuze van de diersoort, toedieningsperiode, testperiode, te beoordelen eindpunten en criteria voor de evaluatie van de resultaten. In 1998 werd een Amerikaanse richtlijn over risicobeoordeling van neurotoxi ­
citeit gepubliceerd (3). In oktober 2000 vonden back-to-back een 
OESO-raadplegingsbijeenkomst met deskundigen en een workshop van het Risk Science Institute van het ILSI plaats en in 2005 vond in Tokio een raadplegingsbijeenkomst met deskundigen plaats. Deze bijeenkomsten von ­
den plaats om de wetenschappelijke en technische problemen in verband 
met de huidige testrichtlijn te bespreken en de aanbevelingen van de bij ­
eenkomsten (4)(5)(6)(7) werden bij de ontwikkeling van deze testmethode in aanmerking genomen. Aanvullende informatie over de uitvoering, interpre ­
tatie en de voor deze testmethode gebruikte terminologie is te vinden in de 
OESO-leidraden nr. 43: ‘Reproductive Toxicity Testing and Assessment’ (8) en nr. 20: ‘Neurotoxicity Testing’ (9).
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
2. Van een aantal stoffen is bekend dat ze ontwikkelingsneurotoxische effecten 
bij de mens en andere soorten veroorzaken (10)(11)(12)(13). Voor het be ­
oordelen en evalueren van de toxische kenmerken van een stof kan het nodig zijn om de potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit te bepalen. Onder ­
zoeken naar ontwikkelingsneurotoxiciteit zijn bedoeld om gegevens, waar ­
onder dosis-responskarakteriseringen, te verkrijgen over de potentiële func ­
tionele en morfologische effecten op het ontwikkelende zenuwstelsel van de nakomelingen die kunnen ontstaan door blootstelling in utero en in het begin van hun leven.
 
3. Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit kan als een apart onder ­
zoek worden uitgevoerd, worden opgenomen in een onderzoek naar repro ­
ductietoxiciteit en/of neurotoxiciteit bij volwassenen (bv. testmethoden B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) of worden toegevoegd aan een onderzoek naar 
prenatale-ontwikkelingstoxiciteit (bv. testmethode B.31 (17)). Wanneer het 
onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit wordt opgenomen in of toege ­
voegd aan een ander onderzoek, is het absoluut noodzakelijk dat de inte ­
griteit van beide onderzoekstypen behouden blijft. Alle testen moeten vol ­
doen aan de toepasselijke wetgeving of richtlijnen van de overheid of de 
instelling voor het gebruik van proefdieren in onderzoek (bv. 18).
 
4. Het testlaboratorium moet vóór uitvoering van het onderzoek alle beschik ­
bare informatie over de teststof bestuderen. Deze informatie betreft de iden ­
titeit en structuur van de stof; de fysisch-chemische eigenschappen ervan; de 
resultaten van eventuele andere in-vitro- of in-vivotoxiciteitstesten met de 
stof; toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen, en het/de verwachte vorm(en) van gebruik van de stof. Deze informatie is noodzake ­
lijk om alle betrokkenen ervan te verzekeren dat de test relevant is voor de 
bescherming van de gezondheid van de mens en helpt bij het kiezen van een 
geschikte aanvangsdosis.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
5. De teststof wordt aan dieren toegediend tijdens de dracht en de zoogperiode. 
Om de effecten bij drachtige en zogende vrouwtjes te beoordelen, worden 
moederdieren getest. Dit kan ook vergelijkende informatie geven (moeder ­
dieren versus nakomelingen). Voor beoordeling van de neurotoxiciteit wor ­
den willekeurig nakomelingen uit nesten gekozen. De beoordeling bestaat 
uit observaties om macroscopische neurologische en gedragsafwijkingen te 
detecteren, waaronder de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling, ontogenie van het gedrag, motorische activiteit, motorische en sensorische functie, en het leervermogen en geheugen; alsmede de beoordeling van het 
hersengewicht en de neuropathologie tijdens de postnatale ontwikkeling en 
volwassenheid.
 
6. Als de testmethode wordt uitgevoerd als een apart onderzoek, kunnen aan ­
vullende beschikbare dieren in elke groep worden gebruikt voor specifieke 
neurogedrags-, neuropathologische, neurochemische of elektrofysiologische procedures die ter ondersteuning kunnen dienen van de gegevens die zijn verkregen van de door deze testmethode aanbevolen onderzoeken 
(16)(19)(20)(21). De aanvullende procedures kunnen vooral nuttig zijn als 
empirische waarnemingen, verwachte effecten of het werkingsmechanisme duiden op een bepaald type neurotoxiciteit. Deze aanvullende procedures kunnen zowel bij de moederdieren als bij de jongen worden gebruikt. Daar ­
naast kunnen ook ex-vivo- of in-vivoprocedures worden gebruikt, mits deze 
procedures niet de integriteit van de in-vivoprocedures doen veranderen.
 
VOORBEREIDINGEN VOOR DE TEST  
Keuze van de diersoort  
7. De testsoort die de voorkeur verdient is de rat; andere soorten kunnen in 
voorkomende gevallen worden gebruikt. Merk echter op dat de in deze testmethode vermelde dracht- en postnatale dagen specifiek zijn voor vaak gebruikte rattenstammen en dat er vergelijkbare dagen moeten worden ge ­
kozen als een andere soort of ongebruikelijke stam wordt gebruikt. Het 
gebruik van een andere soort moet worden gemotiveerd aan de hand van toxicologische, farmacokinetische en/of andere gegevens. In de motivering moet de beschikbaarheid van soortspecifieke postnatale neurogedrags- en 
neuropathologische beoordelingen aan de orde komen. Als een eerdere 
test aanleiding gaf tot bezorgdheid, moet de in die test gebruikte soort/stam worden overwogen. Omdat verschillende rattenstammen verschillende pres ­
tatiekenmerken vertonen, moeten er aanwijzingen zijn dat de vruchtbaarheid 
en het responsvermogen van de gekozen stam toereikend zijn. De betrouw ­
baarheid en gevoeligheid van andere soorten voor de detectie van ontwik ­
kelingsneurotoxiciteit moeten worden gedocumenteerd.
 
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
8. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de 
relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tij ­
dens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden ge ­
maakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Het 
is ook mogelijk de lichtcyclus vóór het paren en gedurende de duur van het onderzoek om te draaien, zodat de beoordelingen van functie- en gedrags ­
eindpunten tijdens de donkere periode (onder rood licht) kunnen worden 
uitgevoerd, d.w.z. als de dieren normaliter actief zijn (22). Veranderingen 
van de licht-donkercyclus dienen vergezeld te gaan van een passende ac ­
climatiseringstijd om de dieren aan de nieuwe cyclus te laten wennen. Als voeding mag het gewone proefdiervoer worden gebruikt met een onbeperkte 
hoeveelheid drinkwater. Het soort voeding en het soort water moeten wor ­
den gerapporteerd en beide moeten worden geanalyseerd op onzuiverheden.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. De dieren kunnen elk apart of in kleine groepen van hetzelfde geslacht 
worden ondergebracht. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor 
dat doel geschikt zijn. Na gebleken copulatie of niet later dan dag 15 van de dracht, moeten gedekte dieren afzonderlijk in kooien worden onder ­
gebracht, die zijn bestemd voor werpen of moederschap. De kooien worden 
zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot 
een minimum worden beperkt. Als het moment van werpen nadert, moeten de gedekte vrouwtjes worden voorzien van geschikt en gedefinieerd nest ­
materiaal. Het is algemeen bekend dat onjuiste behandeling of stress tijdens 
de dracht kan leiden tot ongunstige uitkomsten, zoals prenatale sterfte en 
afwijkende foetale en postnatale ontwikkeling. Om verlies van de foetus als gevolg van factoren die geen verband houden met de behandeling, te voor ­
komen, moeten de dieren tijdens de dracht voorzichtig worden behandeld en 
moet stress als gevolg van externe factoren, zoals overmatig geluid van 
buitenaf, worden vermeden.
 
Voorbereiding van de dieren  
10. Er moeten gezonde dieren worden gebruikt die aan de omstandigheden in 
het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd, tenzij het onderzoek is opgenomen in een ander onderzoek 
(zie punt 3). De kenmerken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, 
geslacht, gewicht en leeftijd worden vastgelegd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend, waarmee het gemarkeerd wordt. De dieren van alle testgroepen moeten zoveel mogelijk van gelijk 
gewicht en gelijke leeftijd zijn, en moeten tot de normale variëteiten van de 
onderzochte soort en stam behoren. Bij elk dosisniveau moeten jongvolwas ­
sen vrouwtjes worden gebruikt die nog geen jongen hebben gehad. Dekking door mannetjes met dezelfde ouders moet worden vermeden en daar moet 
op worden toegezien. Drachtdag (gestation day, GD) 0 is de dag waarop een 
vaginale prop en/of sperma worden waargenomen. Als bij een leverancier dieren zijn aangeschaft die op een bekend tijdstip zijn gedekt, moet een passende acclimatiseringstijd (bv. 2-3 dagen) in acht worden genomen. Ge ­
dekte vrouwtjes moeten op neutrale wijze worden toegewezen aan de 
controle- en behandelgroepen en zo gelijk mogelijk worden verdeeld over de groepen (er wordt bijvoorbeeld een gestratificeerde gerandomiseerde pro ­
cedure aanbevolen voor een gelijke verdeling over alle groepen, zoals wat 
betreft lichaamsgewicht). Vrouwtjes die door hetzelfde mannetje zijn geïn ­
semineerd, moeten gelijkelijk over de groepen worden verdeeld.
 
PROCEDURE  
Aantal en geslacht van de dieren  
11. Elke test- en controlegroep moet een voldoende aantal drachtige vrouwtjes 
bevatten die worden blootgesteld aan de teststof om ervoor te zorgen dat het aantal nakomelingen dat wordt geproduceerd toereikend is voor beoordeling 
van de neurotoxiciteit. Bij elk dosisniveau wordt aanbevolen in totaal 20 
nesten te gebruiken. Doseringsopzetten waarbij gebruik wordt gemaakt van duplo's en opeenvolgende groepen zijn toegestaan als het totaal aantal nesten per groep wordt bereikt en passende statistische modellen worden gebruikt 
om rekening te houden met duplo's.
 
12. Op of vóór postnatale dag (PND) 4 (dag van werpen is PND 0), moet de 
grootte van elk nest worden aangepast door eliminatie van extra jongen door 
willekeurige selectie tot alle nesten een gelijke nestgrootte hebben (23). De nestgrootte mag niet groter zijn dan de gemiddelde nestgrootte voor de gebruikte knaagdierstam (8-12). Het nest moet zoveel mogelijk bestaan uit 
gelijke aantallen mannelijke en vrouwelijke jongen. Er dient geen selectieve 
eliminatie van jongen, bv. op grond van lichaamsgewicht, plaats te vinden. Na standaardisatie van de nesten (ruimen) en voorafgaand aan verder testen van functie-eindpunten, krijgen individuele jongen waarmee testen vóór of 
na spening uitgevoerd gaan worden, een unieke identificatie met behulp van 
een geschikte humane methode voor identificatie van jongen (bv. 24).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Toewijzen van dieren aan functie- en gedragstesten, bepaling hersenge ­
wicht en neuropathologische beoordelingen  
13. Met deze testmethode kunnen dieren die in utero en via het zogen zijn 
blootgesteld, op verscheidene manieren worden toegekend aan functie- en gedragstesten, bepaling van geslachtsrijping en hersengewicht en neuro ­
pathologische beoordeling (25). Andere testen van de neurogedragsfunctie 
(bv. sociaal gedrag), neurochemie of neuropathologie kunnen per geval 
worden toegevoegd, mits de integriteit van de oorspronkelijke vereiste testen niet in het gedrang komt.
 
14. De jongen worden gekozen uit elke dosisgroep en toegewezen aan eind ­
puntsbeoordelingen op of na PND 4. De selectie van de jongen moet zo ­
danig gebeuren, dat in alle testen beide geslachten uit elk nest in elke 
dosisgroep zo veel mogelijk gelijk vertegenwoordigd zijn. Voor het testen van de motorische activiteit moet op alle leeftijden vóór spening hetzelfde paar van mannelijke en vrouwelijke jongen worden getest (zie punt 35). 
Voor alle andere testen kunnen hetzelfde paar of verschillende paren van 
mannelijke en vrouwelijke dieren worden toegewezen aan verschillende gedragstesten. Er moeten mogelijk verschillende jongen worden toegewezen aan testen van de cognitieve functie met gespeende dieren versus die met 
volwassen dieren om verstoring door de effecten van leeftijd en eerdere 
training in deze bepalingen te voorkomen (26)(27). Op het moment van spenen (PND 21) kunnen jongen die niet zijn geselecteerd voor onderzoek, 
op humane wijze worden afgevoerd. Eventuele veranderingen in toewijzing 
van jongen moeten worden gerapporteerd. De statistische meeteenheid moet het nest (of het moederdier) zijn en niet het jong.
 
15. De toewijzing van jongen aan de onderzoeken vóór en na spening, cogni ­
tieve testen, pathologische onderzoeken enz. kan op verschillende wijzen 
plaatsvinden (zie figuur 1 voor algemene opzet en aanhangsel 1 voor voor ­
beelden van toewijzingen). In elke dosisgroep voor onderzoeken vóór en na spening worden de volgende minimumaantallen van dieren aanbevolen: 
Klinische observaties en lichaamsgewicht Alle dieren 
Gedetailleerde klinische observaties 20/geslacht (1/geslacht/nest) Hersengewicht (na fixatie) PND 11-22 10/geslacht (1/nest) Hersengewicht (niet gefixeerd) ~ PND 70 10/geslacht (1/nest) Neuropathologie (immersie- of perfusiefixa ­
tie) PND 11-22 10/geslacht (1/nest) 
Neuropathologie (perfusiefixatie) PND ~70 10/geslacht (1/nest) 
Geslachtsrijping 20/geslacht (1/geslacht/nest) 
Andere ontwikkelingsmijlpalen (facultatief) Alle dieren 
Ontogenie van het gedrag 20/geslacht (1/geslacht/nest) Motorische activiteit 20/geslacht (1/geslacht/nest) Motorische en sensorische functie 20/geslacht (1/geslacht/nest) Leervermogen en geheugen 10/geslacht (
 a ) (1/nest)  
( a ) Afhankelijk van de gevoeligheid van de testen waarmee de cognitieve functie 
wordt gemeten, moet worden overwogen een groter aantal dieren te onderzoe ­
ken, bv. tot 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest (zie aanhangsel 1 voor het toe ­
wijzen van dieren) (nadere richtsnoeren over de steekproefgrootte staan in 
OESO-leidraad nr. 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dosering  
16. Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controlegroep 
gebruikt. De dosisniveaus moeten zodanig zijn verdeeld, dat een gradatie in 
toxische effecten wordt verkregen. Tenzij de fysisch-chemische aard of bio ­
logische eigenschappen van de stof dit beperken, moet het hoogste dosisni ­
veau zodanig worden gekozen dat enige maternale toxiciteit optreedt (bv. 
klinische symptomen, verminderde gewichtstoename (niet meer dan 10 %) 
en/of aanwijzingen voor dosisbeperkende toxiciteit in een doelorgaan). De hoge dosis kan worden beperkt tot 1 000 mg/kg/dag lichaamsgewicht, met enkele uitzonderingen. Zo kan de verwachte blootstelling voor mensen erop 
wijzen dat een hoger dosisniveau moet worden gebruikt. Een andere moge ­
lijkheid is verkennende onderzoeken of voorlopige bereikbepalingsonder ­
zoeken uit te voeren om de hoogste te gebruiken dosering te bepalen waarbij een minimale mate van maternale toxiciteit optreedt. Als gebleken is dat de 
teststof toxisch is voor de ontwikkeling, hetzij in een 
standaard-ontwikkelingstoxiciteitsonderzoek, hetzij in een verkennend on ­
derzoek, moet het hoogste dosisniveau de maximale dosis zijn die geen overmatige toxiciteit bij nakomelingen, of in utero dan wel neonatale sterfte 
of misvormingen induceert die voldoende is/zijn om een beletsel te vormen 
voor een betekenisvolle beoordeling van neurotoxiciteit. Het laagste dosi ­
sniveau moet erop gericht zijn geen aanwijzingen voor maternale of ont ­
wikkelingstoxiciteit, waaronder neurotoxiciteit, te produceren. Er moet een 
dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele dose ­
ringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) aan te tonen, of doses nabij de detectiegrens waarmee een benchmarkdosis kan 
worden bepaald. Intervallen van een factor twee tot vier zijn vaak optimaal 
voor het vaststellen van de dalende dosisniveaus en het is vaak beter een vierde dosisgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.
 
17. De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van alle bestaande 
toxiciteitsgegevens en aanvullende informatie over het metabolisme en de 
toxicokinetiek van de teststof of verwante stoffen. Aan de hand van deze 
informatie kan ook worden aangetoond of het doseringsschema adequaat is. Op grond van blootstellings- en farmacokinetische gegevens moet directe toediening aan jongen worden overwogen (28)(29). De voor- en nadelen 
moeten zorgvuldig worden overwogen alvorens onderzoeken met directe 
toediening uit te voeren (30).
 
18. De gelijktijdige controlegroep wordt met placebo of, als bij de toediening 
van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Alle 
dieren krijgen normaliter dezelfde hoeveelheid teststof of medium toe ­
gediend, op basis van lichaamsgewicht. Bij gebruik van een medium of een ander additief om toediening te vergemakkelijken, moet met de vol ­
gende factoren rekening worden gehouden: effecten op de absorptie, de 
distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen, en effecten op de voedsel- of waterconsumptie of de 
voedingsstatus van de dieren. Het medium mag geen effecten teweegbren ­
gen die de interpretatie van het onderzoek kunnen verstoren, noch mag het neurogedragstoxisch zijn of gevolgen hebben voor de voortplanting of ont ­
wikkeling. Voor nieuwe media moet naast een mediumcontrolegroep een 
placebocontrolegroep worden opgenomen. De dieren in de controlegroep(en) 
moeten op identieke wijze worden behandeld als de testgroepdieren.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Toediening van de doses  
19. De teststof of het medium moet worden toegediend via de weg die het meest 
relevant is voor mogelijke menselijke blootstelling en gebaseerd zijn op de 
beschikbare informatie betreffende metabolisme en distributie bij de proef ­
dieren. De toedieningsweg zal doorgaans oraal (bv. via maagsonde, voeding, drinkwater) zijn, maar andere wegen (bv. dermaal, inhalatie) kunnen ook 
worden gebruikt, naargelang van de kenmerken en verwachte of bekende 
blootstellingsroutes bij de mens (verdere richtsnoeren staan in leidraad nr. 43 (8)). De keuze voor een bepaalde toedieningsweg moet worden gemotiveerd. De teststof moet elke dag op ongeveer hetzelfde tijdstip wor ­
den toegediend.
 
20. De aan elk dier toegediende dosis moet normaliter gebaseerd zijn op het 
meest recente individuele lichaamsgewicht van het dier. Voorzichtigheid is echter geboden bij het aanpassen van de doses tijdens het laatste derde deel 
van de dracht. Als bij de behandelde moederdieren sprake is van overmatige 
toxiciteit, moeten die dieren op humane wijze worden gedood.
 
21. De teststof of het medium moet minimaal dagelijks worden toegediend aan 
gedekte vrouwtjes vanaf het moment van nidatie (GD 6) tot en met de zoogperiode (PND 21), zodat de jongen tijdens de pre- en postnatale neu ­
rologische ontwikkeling aan de teststof worden blootgesteld. De leeftijd 
waarop de toediening start, en de duur en frequentie van de toediening kunnen worden aangepast als er aanwijzingen zijn die een testopzet die relevanter is voor blootstellingen bij de mens, ondersteunen. De toedienings ­
duur moet voor andere soorten zodanig worden aangepast, dat de bloot ­
stelling plaatsvindt tijdens alle vroege perioden van de hersenontwikkeling (d.w.z. gelijkwaardig aan prenatale en vroeg-postnatale hersengroei bij de mens). De toediening kan beginnen vanaf de start van de dracht (GD 0), 
hoewel er rekening moet worden gehouden met mogelijk verlies van dieren 
vóór nidatie als gevolg van de teststof. Toediening vanaf GD 6 voorkomt dit risico, maar in dat geval worden de ontwikkelingsfasen tussen GD 0 en 6 niet behandeld. Als een laboratorium gebruikmaakt van aangeschafte dieren 
die op een bepaald tijdstip zijn gedekt, is het niet mogelijk om op GD 0 te 
starten met toedienen. GD 6 is dan een goede startdag. Het testlaboratorium moet het doseringsschema opstellen aan de hand van relevante informatie over de effecten van de teststof, eerdere ervaring en logistieke overwegin ­
gen. Dit kan verlenging van toediening na spening inhouden. Er mag niet 
worden toegediend op de dag waarop wordt geworpen bij de dieren die nog niet helemaal klaar zijn met werpen. In het algemeen wordt aangenomen dat 
blootstelling van de jongen plaatsvindt via de moedermelk. In gevallen 
waarin er onvoldoende aanwijzingen zijn voor voortdurende blootstelling van de nakomelingen, moet evenwel directe toediening aan jongen worden overwogen. Aanwijzingen voor voortdurende blootstelling kunnen bv. wor ­
den verkregen uit de farmacokinetiek, toxiciteit bij de nakomelingen of 
veranderingen in biomarkers (28).
 
OBSERVATIES  
Observaties bij moederdieren  
22. Alle moederdieren moeten ten minste eenmaal daags zorgvuldig geobser ­
veerd worden met betrekking tot de gezondheidstoestand, waaronder zieke ­
lijkheid en sterfte.  
23. Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten periodiek gedetail ­
leerdere klinische observaties worden verricht (ten minste twee maal tijdens de drachttoedieningsperiode en twee maal tijdens de zoogtoedieningsperio ­
de) met ten minste tien moederdieren per dosisniveau. De dieren moeten 
buiten hun kooi worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten 
welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan, met behulp van ge ­
standaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale stress bij de dieren en waarnemersvertekening, en maximale interobserver-betrouwbaarheid. In ­
dien mogelijk is het raadzaam de observaties in een bepaald onderzoek door 
dezelfde technicus te laten verrichten.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. De aanwezigheid van waargenomen verschijnselen moet worden geregis ­
treerd. Indien mogelijk moet de ernst van de waargenomen verschijnselen 
eveneens geregistreerd worden. Klinische observaties moeten onder meer (maar niet alleen) bestaan uit: veranderingen in huid, vacht, ogen, slijm ­
vliezen, optreden van uitscheiding, en onwillekeurige reacties (zoals traan ­
vorming, rechtop staan van het haar, pupilgrootte, een ongewoon ademha ­
lingspatroon en/of mondademhaling en eventuele ongewone symptomen van urineren of defecatie).
 
25. Alle ongewone responsen met betrekking tot lichaamspositie, activiteit (bv. 
meer of minder intensieve verkenning van het standaardgebied) en coördi ­
natie van bewegingen moeten ook worden genoteerd. Veranderingen in gang 
(bv. waggelen, ataxie), houding (bv. gebogen rug) en reactiviteit op vast ­
pakken, neerzetten of andere prikkels uit de omgeving, alsmede de aan ­
wezigheid van klonische of tonische bewegingen, convulsies, trillingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, ongewone kopbe ­
wegingen, herhaaldelijk ronddraaien), bizar gedrag (bv. bijten of overmatig 
likken, zelfverminking, achteruitlopen, geluiden maken) of agressie moeten worden opgetekend.
 
26. Symptomen van toxiciteit moeten worden opgetekend, met de dag waarop 
deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.  
27. De dieren moeten op het moment van toediening worden gewogen, en wel 
ten minste elke week gedurende het onderzoek, op of vlak na de dag van 
werpen en op PND 21 (spenen). Voor met een maagsonde uitgevoerde 
onderzoeken moeten de moederdieren ten minste tweemaal per week wor ­
den gewogen. Na elke bepaling van het lichaamsgewicht moeten de doses zo nodig worden aangepast. De voedselconsumptie moet tijdens de dracht 
en zoogperiode minimaal wekelijks worden bepaald. Indien de blootstelling 
via de watertoevoer verloopt, moet ten minste wekelijks de waterconsumptie worden bepaald.
 
Observaties bij nakomelingen  
28. Alle nakomelingen moeten ten minste dagelijks zorgvuldig geobserveerd 
worden op symptomen van toxiciteit en ziekelijkheid en sterfte.  
29. Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten gedetailleerdere kli ­
nische observaties van de nakomelingen worden verricht. De nakomelingen 
(ten minste één jong/geslacht/nest) moeten worden geobserveerd door ge ­
trainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor 
minimale vertekening en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien 
mogelijk is het raadzaam de observaties door dezelfde technicus te laten verrichten. Minimaal moeten de in punten 24 en 25 beschreven eindpunten worden gecontroleerd, al naargelang van toepassing voor de ontwikkelings ­
fase die geobserveerd wordt.
 
30. Alle symptomen van toxiciteit bij de nakomelingen moeten worden opge ­
tekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.  
Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen  
31. Veranderingen in ontwikkelingsmijlpalen vóór spening (zoals ontvouwen 
van de oorschelp, openen van de ogen, doorkomen van snijtanden) hangen nauw samen met het lichaamsgewicht (30)(31). Lichaamsgewicht is moge ­
lijk de beste indicator van lichamelijke ontwikkeling. De bepaling van ont ­
wikkelingsmijlpalen wordt daarom alleen aanbevolen als er al aanwijzingen 
zijn dat deze eindpunten aanvullende informatie zullen verschaffen. De tijd ­
stippen voor de beoordeling van deze parameters staan vermeld in tabel 1. Afhankelijk van de verwachte effecten en de resultaten van de eerste me ­
tingen kan het raadzaam zijn extra tijdstippen toe te voegen of de metingen 
in andere ontwikkelingsfasen te verrichten.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Het is raadzaam om bij de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling de 
postcoïtale leeftijd in plaats van de postnatale leeftijd te gebruiken (33). Als 
jongen worden getest op de dag van spening, wordt geadviseerd dit onder ­
zoek te doen vóór de feitelijke spening om de stress van het spenen, die een verstorend effect zou kunnen geven, te vermijden. Bovendien mogen met de 
jongen geen testen na spening worden gedaan gedurende de twee dagen na 
het spenen.
 
Tabel 1  
Tijdstippen van de beoordeling van lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen, en 
functie/gedragseindpunten  ( b ) 
Levensperiode 
Eindpunten Vóór spenen (  c ) Adolescentie (  c ) Jongvolwassen dieren (  c ) 
Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen  
Lichaamsgewicht en 
klinische observaties wekelijks (  d ) ten minste om de 
twee weken ten minste om de 
twee weken 
Hersengewicht PND 22 (  e ) aan einde onderzoek 
Neuropathologie PND 22 (  e ) aan einde onderzoek 
Geslachtsrijping — wanneer van toe ­
passing — 
Andere ontwikkelings ­
mijlpalen (  f ) wanneer van toepas ­
sing — —  
Functie/gedragseindpunten  
Ontogenie van het ge ­
drag Ten minste twee me ­
tingen 
Motorische activiteit 
(waaronder gewenning) 1-3 keer (  g ) — eenmaal 
Motorische en sensori ­
sche functie — eenmaal eenmaal 
Leervermogen en ge ­
heugen — eenmaal eenmaal  
( b ) In deze tabel staat het minimale aantal keren dat een meting moet worden uitgevoerd. Afhankelijk van 
de verwachte effecten en de resultaten van de eerste metingen kan het raadzaam zijn extra tijdstippen 
(bv. oudere dieren) toe te voegen of de metingen in andere ontwikkelingsfasen te verrichten. 
( c ) Het wordt aanbevolen geen jongen te testen tijdens de twee dagen na het spenen (zie punt 32). Aan ­
bevolen leeftijden voor adolescentietesten zijn: Leervermogen en geheugen = PND 25 ± 2; motorische 
en sensorische functie = PND 25 ± 2. Aanbevolen leeftijden voor het testen van jongvolwassen dieren is 
PND 60-70. 
( d ) Lichaamsgewichten moeten ten minste tweemaal per week worden bepaald bij directe toediening aan 
jongen in verband met aanpassing van de doses als er sprake is van snelle gewichtstoename. 
( e ) Hersengewichten en neuropathologie kunnen zo nodig op een eerder tijdstip worden bepaald (bv. PND 
11) (zie punt 39). 
( f ) Andere ontwikkelingsmijlpalen naast het lichaamsgewicht (bv. openen van de ogen) moeten geregis ­
treerd worden wanneer deze bereikt worden (zie punt 31). 
( g ) Zie punt 35.  
33. Levende jongen moeten worden geteld en gesekst, bv. door visuele inspectie 
of meting van de anogenitale afstand (34)(35) en elk jong in een nest moet 
afzonderlijk worden gewogen bij de geboorte of kort daarna, ten minste 
wekelijks tijdens de zoogperiode en ten minste eenmaal per twee weken daarna. Bij de beoordeling van de geslachtsrijping moeten, wanneer opening van de vagina (36) of loslaten van de voorhuid (37) optreedt, de leeftijd en 
het lichaamsgewicht van het dier worden bepaald voor ten minste één man ­
netje en één vrouwtje per nest.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Ontogenie van het gedrag  
34. De ontogenie van bepaald gedrag moet worden gemeten bij ten minste één 
jong/geslacht/nest tijdens de passende levensperiode, waarbij op alle test ­
dagen voor al het gedrag dat wordt beoordeeld, dezelfde jongen worden gebruikt. De meetdagen moeten gelijkelijk over die periode worden verdeeld om te bepalen of de verandering in ontogenie van dat gedrag normaal of 
behandelingsgerelateerd is (38). Voorbeelden van gedrag waarvan de onto ­
genie kan worden beoordeeld zijn: oprichtreflex, negatieve geotaxis en mo ­
torische activiteit (38)(39)(40).
 
Motorische activiteit  
35. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd (41)(42)(43)(44)(45) 
tijdens de levensperiode vóór spening en de volwassen levensperiode. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. De testsessie moet lang genoeg zijn om gewenning binnen een sessie voor niet-behandelde controles 
aan te tonen. Het wordt sterk aanbevolen ter beoordeling van de ontogenie 
van het gedrag de motorische activiteit te bepalen. Indien gebruikt als test voor ontogenie van het gedrag, moet het testen voor alle testsessies vóór spening met dezelfde dieren plaatsvinden. Er moet vaak genoeg worden 
getest om de ontogenie van gewenning binnen een sessie te kunnen beoor ­
delen (44). Hiervoor kunnen drie of meer tijdsperioden tot en met de dag van spening nodig zijn (bv. PND 13, 17, 21). Het testen van dezelfde dieren of nestgenoten moet ook plaatsvinden op volwassen leeftijd, tegen het einde 
van het onderzoek (bv. PND 60-70). Zo nodig kan op extra dagen getest 
worden. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd met een ge ­
automatiseerd activiteitsregistratieapparaat dat zowel toenamen als afnamen in activiteit moet kunnen detecteren (d.w.z. de door het apparaat gemeten 
activiteit op baseline moet niet zo laag zijn dat afnamen niet kunnen worden 
gedetecteerd en ook niet zo hoog dat toenamen van de activiteit niet kunnen worden gedetecteerd). Elk apparaat moet volgens standaardprocedures wor ­
den getest om de betrouwbaarheid van de werking van alle apparaten op alle 
dagen zo veel mogelijk te waarborgen. De behandelgroepen moeten zo 
evenwichtig mogelijk over de apparaten worden verdeeld. Elk dier moet apart worden getest. De behandelgroepen moeten evenwichtig worden ver ­
spreid over de testtijden om verstoring door circadiaanse activiteitritmen te 
vermijden. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de 
testomstandigheden minimaal zijn en niet systematisch samenhangen met de behandeling. Variabelen die van invloed kunnen zijn op veel maten van gedrag, waaronder motorische activiteit, zijn geluidsniveau, grootte en 
vorm van de testkooi, temperatuur, relatieve vochtigheid, lichtomstandighe ­
den, geuren, gebruik van verblijfskooi of nieuwe testkooi en afleiding uit de omgeving.
 
Motorische en sensorische functie  
36. De motorische en sensorische functie moet ten minste eenmaal in de ado ­
lescentieperiode en ten minste eenmaal in de jongvolwassenperiode (bv. PND 60-70) uitvoerig worden onderzocht. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Er moet voldoende worden getest om te zorgen voor 
een toereikende kwantitatieve sampling van de sensorische modaliteiten (bv. 
somatosensorisch, vestibulair) en motorische functies (bv. kracht, coördina ­
tie). Enkele voorbeelden van testen voor de motorische en sensorische functie zijn voetzoolreflex (46), oprichtreflex (47)(48), gewenning aan au ­
ditieve schrikreactie (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) en opgewekte potentialen 
(55).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Leervermogen- en geheugentesten  
37. Na het spenen (bv. 25 ± twee dagen) en bij jongvolwassen dieren (PND 60 
en ouder) moet een test van het associatieve leervermogen en geheugen 
worden uitgevoerd. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Voor deze twee ontwikkelingsfasen kunnen dezelfde test of aparte test(en) worden gebruikt. Enige flexibiliteit in de keuze van de test(en) voor leer ­
vermogen en geheugen bij gespeende en volwassen ratten is toegestaan. De 
test(en) moet(en) echter zodanig zijn opgezet dat wordt voldaan aan twee criteria. Ten eerste moet het leervermogen worden beoordeeld als een ver ­
andering over verschillende herhaalde leervermogenonderzoeken of -sessies, 
of, bij testen met één onderzoek, door te kijken naar een toestand die 
controleert op niet-associatieve effecten van de trainingservaring. Ten tweede moet(en) de test(en) naast het oorspronkelijke leervermogen (acqui ­
sitie) een maat voor het geheugen (kortetermijn- of langetermijngeheugen) 
omvatten, maar deze maat voor het geheugen kan niet gerapporteerd worden 
indien een met dezelfde test verkregen maat voor acquisitie ontbreekt. Als uit de test(en) voor het leervermogen en geheugen een effect van de teststof naar voren komt, kunnen aanvullende testen worden overwogen om alter ­
natieve interpretaties op grond van veranderingen in sensorische, motivatie- 
en/of motorische capaciteiten uit te sluiten. Naast de twee bovenstaande criteria wordt geadviseerd de test voor het leervermogen en geheugen te kiezen op grond van de aangetoonde gevoeligheid ervan voor de klasse van 
stoffen waartoe de teststof behoort, als dergelijke informatie in de literatuur 
beschikbaar is. Als dergelijke informatie ontbreekt, kunnen de volgende testen worden gedaan om te voldoen aan de bovenstaande criteria: passieve vermijding (43)(56)(57), ‘delayed-matching-to-position’ voor de volwassen 
rat (58) en voor de infantiele rat (59), olfactorische conditionering (43)(60), 
waterlabyrint van Morris (Morris water maze) (61)(62)(63), labyrint van Biel of Cincinnati (64)(65), stervormig labyrint (radial arm maze) (66), T-labyrint (43) en acquisitie en retentie van gedrag volgens een bepaald 
schema (schedule-controlled behaviour) (26)(67)(68). Aanvullende testen 
worden in de literatuur beschreven voor gespeende (26)(27) en volwassen ratten (19)(20).
 
Postmortaal onderzoek  
38. De moederdieren kunnen worden geëuthanaseerd nadat de nakomelingen 
zijn gespeend.  
39. Neuropathologische beoordeling van de nakomelingen wordt uitgevoerd met 
weefsels van dieren die om humane redenen zijn gedood op PND 22 of 
eerder, tussen PND 11 en PND 22, en aan het einde van het onderzoek. Van 
nakomelingen die op PND 22 of eerder worden gedood, moet het hersen ­
weefsel worden beoordeeld; van dieren die aan het einde worden gedood, 
moet weefsel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere 
zenuwstelsel (PZS) worden beoordeeld. Dieren die worden gedood op PND 22 of eerder, kunnen worden gefixeerd door immersie of perfusie. Dieren die aan het einde van het onderzoek worden gedood, moeten door 
perfusie worden gefixeerd. Bij alle aspecten van de preparatie van de weef ­
selmonsters, d.w.z. vanaf de persfusie van de dieren tot en met de dissectie van de weefselmonsters, weefselbewerking en kleuren van de glaasjes, moet evenwichtig te werk worden gegaan, zodat elke partij representatieve mon ­
sters van elke dosisgroep bevat. Nadere richtsnoeren over neuropathologie 
zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 20 (9), zie ook (103).
 
Bewerking van weefselmonsters  
40. Alle macroscopische afwijkingen die bij de obductie worden opgemerkt, 
moeten worden genoteerd. De weefselmonsters moeten afkomstig zijn van alle belangrijke gebieden van het zenuwstelsel. De weefselmonsters moeten worden bewaard in een geschikt fixatiemiddel en bewerkt volgens gestan ­
daardiseerde gepubliceerde histologische protocollen (69)(70)(71)(103). In ­
bedding in paraffine is acceptabel voor weefsels van het CZS en PZS, maar
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
wanneer een hogere mate van resolutie vereist is (bv. voor perifere zenuwen 
bij vermoeden van een perifere neuropathie en/of voor morfometrische ana ­
lyse van perifere zenuwen), kan het aangewezen zijn om bij postfixatie osmium te gebruiken samen met inbedden in epoxy. Voor morfometrische analyse verzameld hersenweefsel moet bij alle dosisniveaus op hetzelfde 
moment in geschikte media worden ingebed om artefacten als gevolg van 
krimp die kan optreden bij langdurig bewaren in fixatiemiddel, te voor ­
komen (6).
 
Neuropathologisch onderzoek  
41. Het kwalitatieve onderzoek heeft tot doel:  
i) identificeren van gebieden binnen het zenuwstelsel waarbij sprake is van 
aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen;  
ii) identificeren van typen neuropathologische veranderingen die het gevolg 
zijn van blootstelling aan de teststof, en  
iii) bepalen van de mate van ernst van de neuropathologische 
veranderingen.  
Representatieve histologische coupes van de weefselmonsters moeten door 
een goed opgeleide patholoog microscopisch worden onderzocht op aan ­
wijzingen voor neuropathologische veranderingen. Aan alle neuropathologi ­
sche veranderingen moet een subjectieve graad van ernst worden toegekend. Een hematoxyline- en eosinekleuring kan voldoende zijn voor de beoor ­
deling van hersencoupes van dieren die op PND 22 of eerder`om humane 
redenen zijn gedood. Voor coupes van CZS- en PZS-weefsels van dieren die zijn gedood aan het einde van het onderzoek wordt echter een myelinekleu ­
ring (bv. luxol fast blue/cresylviolet) en een zilverkleuring (bv. 
Bielschowsky- of Bodiankleuring) aanbevolen. Afhankelijk van het profes ­
sionele oordeel van de patholoog en de soort veranderingen dat wordt waar ­
genomen, kunnen andere kleuringen worden beschouwd als geschikt voor 
de identificatie en karakterisering van bepaalde typen veranderingen (bv. 
glia fibrillair zuur eiwit (glial fibrillary acidic protein, GFAP) of lectinehis ­
tochemie om veranderingen in het glia en microglia te beoordelen (72), fluoro-jade om necrose te detecteren (73)(74), of voor neurodegeneratie 
specifieke zilverkleuringen (75)).
 
42. Aangezien deze gegevens kunnen worden gebruikt bij de detectie van een 
behandelingsgerelateerd effect en waardevol zijn bij de interpretatie van 
behandelingsgerelateerde verschillen in hersengewicht of morfologie, moet morfometrische (kwantitatieve) beoordeling plaatsvinden (76)(77). Voor de morfometrische beoordeling moeten zenuwweefselmonsters worden ge ­
nomen en geprepareerd. Morfometrische beoordelingen kunnen bijvoorbeeld 
bestaan uit lineaire of oppervlaktemetingen van specifieke hersengebieden (78). Bij lineaire of oppervlaktemetingen moeten homologe coupes worden gebruikt die zorgvuldig zijn geselecteerd op grond van betrouwbare micro ­
scopische mijlpalen (6). Stereologie kan worden gebruikt om behandelings ­
gerelateerde effecten op parameters, zoals volume of aantal cellen voor specifieke neuroanatomische gebieden, te identificeren (79)(80)(81)(82)(83)(84).
 
43. De hersenen moeten worden onderzocht op aanwijzingen voor behan ­
delingsgerelateerde neuropathologische veranderingen en voor grondig on ­
derzoek moeten geschikte monsters worden genomen van alle belangrijke hersengebieden (bv. bulbus olfactorius, hersenschors, hippocampus, basale ganglia, thalamus, hypothalamus, middenhersenen (tectum, tegmentum en 
hersensteel), pons, verlengde merg, kleine hersenen). Het is van belang 
dat voor alle dieren de coupes in hetzelfde vlak worden genomen. Bij vol ­
wassen dieren die op humane wijze worden gedood aan het einde van het onderzoek, moeten representatieve coupes van het ruggenmerg en het PZS 
worden verzameld. De te onderzoeken gebieden zijn onder meer het oog 
met de oogzenuw en het netvlies, het ruggenmerg bij de cervicale en lum ­
bale zwellingen, de dorsale en ventrale wortelvezels, de proximale ischias ­
zenuw, de proximale scheenbeenzenuw (bij de knie) en de vertakkingen van 
de scheenbeenzenuw naar de kuitspier. De coupes van het ruggenmerg en de 
perifere zenuwen moeten uit zowel dwars- als lengtecoupes bestaan.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Neuropathologische beoordeling moet een onderzoek omvatten naar aanwij ­
zingen voor ontwikkelingsschade aan het zenuwstelsel 
(6)(85)(86)(87)(88)(89), naast de cellulaire veranderingen (bv. neuronale vacuolisatie, degeneratie, necrose) en weefselveranderingen (bv. gliose, in ­
filtratie van leukocyten, vorming van cysten). In dit opzicht is het van 
belang onderscheid te maken tussen behandelingsgerelateerde effecten en 
normale ontwikkelingen waarvan bekend is dat deze plaatsvinden tijdens de ontwikkelingsfase van het dier op het moment van doden (90). Belang ­
rijke veranderingen die een indicatie zijn van een aanval op de ontwikkeling 
zijn bijvoorbeeld (maar zijn niet daartoe beperkt):
 
— veranderingen in de macroscopische omvang of vorm van de bulbus 
olfactorius, de grote hersenen of de kleine hersenen,  
— veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene hersengebieden, 
waaronder afnamen of toenamen van de omvang van deze gebieden als gevolg van het verlies of persistentie van normaal tijdelijke populaties 
van cellen of axonale projecties (bv. uitwendige kiemlaag van de kleine 
hersenen, hersenbalk),
 
— veranderingen in proliferatie, migratie en differentiatie, zoals blijkt uit 
gebieden met overmatige apoptose of necrose, clusters of verspreide 
populaties van ectopische, gedesoriënteerde of misvormde neuronen of veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene lagen van de corticale structuren,
 
— veranderingen in myelinisatiepatronen, zoals een algemene afname van 
de omvang of gewijzigde kleuring van gemyeliniseerde structuren,  
— aanwijzingen voor hydrocefalus, met name vergroting van de ventrikels, 
stenose van het aquaduct van Sylvius en het dunner worden van de hersenhelften.
 
Analyse van de dosis-responsverhouding van neuropathologische ver ­
anderingen  
45. De volgende stapsgewijze procedure wordt aanbevolen voor de kwalitatieve 
en kwantitatieve neuropathologische analyses. Eerst worden coupes van de hogedosisgroep vergeleken met die van de controlegroep. Als er geen aan ­
wijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen bij die ­
ren van de hogedosisgroep, is verdere analyse niet nodig. Als er wel aan ­
wijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen in de hogedosisgroep, worden dieren van de middelhoge- en lagedosisgroepen 
onderzocht. Als onderzoek met de hogedosisgroep wordt stopgezet vanwege 
sterfgevallen of andere storende toxiciteit, moeten de hoge- en middelho ­
gedosisgroepen geanalyseerd worden op neuropathologische veranderingen. Als er aanwijzingen zijn voor neurotoxiciteit in de lagedosisgroepen, moet 
in die groepen neuropathologische analyse worden verricht. Als er onder ­
zoeksgerelateerde neuropathologische veranderingen worden gevonden in het kwalitatieve of kwantitatieve onderzoek, moet op grond van een beoor ­
deling van alle dieren uit alle dosigroepen de dosisafhankelijkheid van de 
incidentie, frequentie en graad van ernst van de letsels of van de morfo ­
metrische veranderingen worden bepaald. Alle gebieden van de hersenen met aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen moeten in deze 
beoordeling worden meegenomen. Voor elk type letsel moeten de kenmer ­
ken worden beschreven die zijn gebruikt om elke graad van ernst te defi ­
niëren, waarbij wordt aangegeven op basis waarvan elke mate van ernst zich onderscheidt. De frequentie van elk type letsel en de graad van ernst ervan 
moeten worden geregistreerd en een statistische analyse moet worden uit ­
gevoerd ter beoordeling van de dosis-responsverhoudingen. Het wordt aan ­
bevolen gecodeerde glaasjes te gebruiken (91).
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
46. Gegevens moeten afzonderlijk worden gerapporteerd en in tabelvorm wor ­
den samengevat, met voor elke testgroep de typen veranderingen en het aantal moederdieren, nakomelingen per geslacht en nesten waarbij ieder type verandering voorkomt. Bij directe postnatale blootstelling van de na ­
komelingen moet de weg, duur en periode van blootstelling gerapporteerd 
worden.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Beoordeling en interpretatie van resultaten  
47. Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit geeft informatie over de 
effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens de in-utero- en 
vroeg-postnatale ontwikkeling. Aangezien de nadruk wordt gelegd op zowel het eindpunt algemene toxiciteit als het eindpunt ontwikkelingsneurotoxici ­
teit, kan met de resultaten van het onderzoek onderscheid worden gemaakt 
tussen neuro-ontwikkelingseffecten die zich voordoen bij afwezigheid van 
algemene maternale toxiciteit, en neuro-ontwikkelingseffecten die alleen tot uitdrukking komen bij niveaus die ook toxisch zijn voor het moederdier. Vanwege de complexe onderlinge verbanden tussen onderzoeksopzet, statis ­
tische analyse en biologische significantie van de gegevens is voor een 
adequate interpretatie van ontwikkelingsneurotoxiciteitsgegevens het oordeel van een deskundige nodig (107)(109). Bij de interpretatie van de testresul ­
taten moet gebruik worden gemaakt van een op bewijskracht gebaseerde 
aanpak (20)(92)(93)(94). Patronen van gedrags- of morfologische bevindin ­
gen, indien aanwezig, en aanwijzingen voor dosisrespons moeten worden besproken. Bij deze karakterisering moeten gegevens van alle onderzoeken die relevant zijn voor de beoordeling van ontwikkelingsneurotoxiciteit, wor ­
den meegenomen, waaronder epidemiologische onderzoeken of casereports 
met mensen en onderzoeken met proefdieren (bv. toxicokinetische gegevens, structuur-activiteitinformatie, gegevens uit andere toxiciteitsonderzoeken). Daartoe behoort ook het verband tussen de doses van de teststof en de 
aan- of afwezigheid, incidentie en de mate van eventuele neurotoxische 
effecten voor elk geslacht (20)(95).
 
48. Bij de beoordeling van de gegevens moet zowel de biologische als de 
statistische significantie worden besproken. Statistische analyse moet wor ­
den gezien als een instrument dat een leidraad geeft voor de interpretatie van gegevens, zonder dat het bepalend daarvoor is. De conclusie dat er geen 
sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, mag niet louter gebaseerd 
zijn op het ontbreken van statistische significantie. Evenzo geldt dat de conclusie dat er wel sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, niet louter op statistische significantie gebaseerd mag zijn. Om mogelijke 
vals-negatieve bevindingen en de moeilijkheden die inherent zijn aan „aan ­
tonen van een negatieve” te voorkomen, moeten beschikbare positieve en historische controlegegevens worden besproken, met name als er geen be ­
handelingsgerelateerde effecten zijn (102)(106). De kans op vals-positieven 
moet worden besproken in het licht van de totale statistische beoordeling 
van de gegevens (96). De beoordeling moet het eventuele verband tussen waargenomen neuropathologische en gedragsveranderingen omvatten.
 
49. Alle resultaten worden geanalyseerd worden met behulp van voor de tes ­
topzet toepasselijke statistische modellen. De keuze voor een parametrische of een niet-parametrische analyse moet worden gemotiveerd aan de hand 
van factoren zoals de aard van de gegevens (al dan niet getransformeerd) en 
de verspreiding ervan, alsook de relatieve robuustheid van de gekozen sta ­
tistische analyse. Het doel en de opzet van het onderzoek moeten als lei ­
draad dienen voor de keuze van statistische analyses om type I (vals-po ­
sitieve) en type II (vals-negatieve) fouten tot het minimum te beperken 
(96)(97)(104)(105). Bij ontwikkelingsonderzoeken met multipara's in het geval dat meerdere jongen per nest worden getest, moet het nest in het statistische model worden opgenomen om opgeschroefde type 
I-foutenpercentages te voorkomen (98)(99)(100)(101). De statistische meet ­
eenheid moet het nest zijn en niet het jong. De experimenten moeten zoda ­
nig zijn opgezet, dat nestgenoten niet als onafhankelijke observaties worden behandeld. Eindpunten die herhaaldelijk worden gemeten bij hetzelfde 
proefdier, moeten geanalyseerd worden met statistische modellen die reke ­
ning houden met deze niet-onafhankelijke werkwijze.
 
Testverslag  
50. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken,  
— identificatiegegevens, waaronder de herkomst,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— zuiverheid van het preparaat en bekende en/of verwachte onzuiverheden.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering van de keuze van het medium, indien geen water of fysio ­
logische zoutoplossing wordt gebruikt.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort en stam, en een motivering voor het gebruik van een 
andere soort dan ratten,  
— leverancier van de proefdieren,  
— aantal, leeftijd bij aanvang en geslacht van de dieren,  
— herkomst, huisvesting, voeding, water enz.,  
— gewicht van elk dier bij aanvang van de test.  
Testomstandigheden:  
— motivering van de keuze van de dosisniveaus,  
— motivering van de toedieningsweg en tijdsduur,  
— specificaties van de toegediende doses, waaronder details van het medi ­
um, de hoeveelheid en de fysische vorm van de toegediende stof,  
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding 
van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van 
het preparaat,  
— gebruikte methode voor de unieke identificatie van moederdieren en 
nakomelingen,  
— gedetailleerde beschrijving van de gerandomiseerde procedures(s) voor 
het toewijzen van de moederdieren aan behandelgroepen, het ruimen van 
jongen en het toewijzen van jongen aan testgroepen,  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater of 
van de inhalatieteststof (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg li ­
chaamsgewicht/dag), indien van toepassing,  
— milieuomstandigheden,  
— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en water (bv. 
kraanwater, gedestilleerd water),  
— data van aanvang en einde onderzoek.  
Observaties en testprocedures:  
— een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte procedures voor de 
standaardisatie van observaties en procedures en operationele definities voor het scoren van observaties,
 
— een lijst van alle gebruikte testprocedures en een motivering van het 
gebruik ervan,  
— gedetailleerde gegevens over de gebruikte gedrags/functie-, pathologi ­
sche, neurochemische of elektrofysiologische procedures, waaronder in ­
formatie en details over geautomatiseerde apparatuur,  
— procedures om apparatuur te ijken en om de gelijkwaardigheid van 
apparatuur te waarborgen en om evenwichtige behandelgroepen te krij ­
gen bij het testen,  
— een korte motivering waarin beslissingen genomen op basis van profes ­
sioneel oordeel uiteengezet worden.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Resultaten (afzonderlijke en beknopte, waaronder gemiddelde en variantie 
indien van toepassing):  
— het aantal dieren bij aanvang van het onderzoek en het aantal aan het 
einde van het onderzoek,  
— het aantal dieren en nesten dat voor elke testmethode werd gebruikt,  
— het identificatienummer van elk dier en het nest waaruit het afkomstig 
was, 
— nestgrootte en gemiddeld geboortegewicht naar geslacht,  
— gegevens over lichaamsgewicht en verandering in lichaamsgewicht, 
waaronder eindlichaamsgewicht voor moederdieren en nakomelingen,  
— gegevens over voer- en waterconsumptie, indien van toepassing (bv. als 
de teststof via water wordt toegediend),  
— gegevens over toxische responsen naar geslacht en dosisniveau, met 
inbegrip van toxiciteitsverschijnselen of sterftecijfers, waaronder het tijd ­
stip en de oorzaak van overlijden, indien van toepassing,  
— aard, ernst, duur, dag van ontstaan, tijdstip en verdere verloop van de 
gedetailleerde klinische observaties,  
— score van elke ontwikkelingsmijlpaal (gewicht, geslachtsrijping en onto ­
genie van het gedrag) bij elke observatietijd,  
— een gedetailleerde beschrijving van alle gedrags-, functie-, neuropatho ­
logische, neurochemische, elektrofysiologische bevindingen naar ge ­
slacht, waaronder zowel toenamen als afnamen ten opzichte van de 
controles,  
— obductiebevindingen,  
— hersengewichten,  
— diagnoses gesteld op basis van neurologische verschijnselen en letsels, 
waaronder natuurlijk voorkomende ziekten of aandoeningen,  
— beelden van voorbeeldige bevindingen,  
— lageresolutiebeelden ter beoordeling van de homologie van coupes die 
zijn gebruikt voor morfometrie,  
— absorptie- en metabolismegegevens, waaronder complementaire gege ­
vens van een afzonderlijk toxicokinetisch onderzoek, indien beschikbaar,  
— statistische behandeling van resultaten, waaronder statistische modellen 
die zijn gebruikt voor analyse van de gegevens, en de resultaten, on ­
geacht de significantie ervan,  
— lijst van onderzoeksmedewerkers, inclusief beroepsopleiding.  
Bespreking van de resultaten:  
— informatie over dosisresponsen, naar geslacht en groep,  
— verband van eventuele andere toxische effecten met een conclusie over 
het neurotoxische potentieel van de teststof, naar geslacht en groep,  
— invloed van eventuele toxicokinetische informatie op de conclusies,  
— overeenkomsten van effecten met bekende neurotoxische stoffen,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— gegevens die de betrouwbaarheid en gevoeligheid van de testmethode 
ondersteunen (d.w.z. positieve en historische controlegegevens),  
— eventuele verbanden tussen neuropathologische en functie-effecten,  
— NOAEL- of benchmarkdosis voor moederdieren en nakomelingen, naar 
geslacht en groep.  
Conclusies  
— een discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond 
van de resultaten, waaronder een conclusie over het feit of de teststof 
ontwikkelingsneurotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.  
LITERATUUR  
1. OESO (1995). Draft Report of the OECD Ad HocWorking Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenhagen, Denemarken, 
13-14 juni 1995.  
2. US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Onderzoek naar ontwikkelingsneuro ­
toxiciteit. US EPA 712-C-98-239. Te vinden op: [http://www.epa.gov/ opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Se ­
ries/].
 
3. US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Te vinden op: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
4. Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.
 
5. Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., 
Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.
 
6. Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93-100.  
7. OESO (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on De ­
velopmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.
 
8. OESO (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OESO, Parijs, juli 2008. Te vinden op: [http://search.oecd.org/officialdocu ­
ments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].
 
9. OESO (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OESO, Parijs, september 2003. Te vinden op: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_ 
1916054_1_1_1_1,00.html].
 
10. Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.
 
11. Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
12. Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.  
13. Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neuro ­
toxicology, 1  st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
14. Hoofdstuk B.34 van deze bijlage, Reproductietoxiciteitsonderzoek over 
één generatie.  
15. Hoofdstuk B.35 van deze bijlage, Reproductietoxiciteitsonderzoek over 
twee generaties.  
16. Hoofdstuk B.43 van deze bijlage, Neurotoxiciteitsonderzoek bij 
knaagdieren.  
17. Hoofdstuk B.31 van deze bijlage, Onderzoek naar prenatale 
ontwikkelingstoxiciteit.  
18. Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 
22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor we ­
tenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
 
19. WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Te vinden op: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm].
 
20. WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Or ­
ganization Publications, Genève. Te vinden op: [http://www.intox.org/data ­
bank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
21. Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Me ­
thods, 1  st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
22. De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499-509.  
23. Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.  
24. Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112.  
25. Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a pri ­
mary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 
13:118-136.  
26. Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
27. Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Pe ­
rinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.
 
28. Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.
 
29. Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning ro ­
dents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.
 
30. Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.  
31. ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on 
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.  
32. Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical con ­
siderations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
33. Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.
 
34. Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Re ­
prod. Toxicol., 13:383-390.  
35. Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, bbp, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.
 
36. Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.
 
37. Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.
 
38. Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.  
39. Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.  
40. Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of 
Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.
 
41. Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.  
42. Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measure ­
ment of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 37-82.
 
43. Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuro ­
toxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.  
44. Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.  
45. Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor 
activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.
 
46. Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:1997. 405-411.  
47. Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phy ­
siol. Behav., 64:661-669.  
48. Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589-591.  
49. Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms 
of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287- 
351 
50. Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107- 
128. 
51. Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
52. Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199-211.  
53. Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25-30.
 
54. Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437-445.  
55. Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked po ­
tentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Se ­
ries: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. pp. 125-145.  
56. Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.
 
57. Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.
 
58. Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237-244.  
59. Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working me ­
mory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.  
60. Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465-479.  
61. Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.  
62. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.  
63. D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.  
64. Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.
 
65. Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.  
66. Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.  
67. Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342-352.  
68. Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term me ­
mory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338-341.  
69. Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122-131.  
70. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory 
Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, pp. 84-107.  
71. Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological 
Techniques, 5  th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
72. Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalu ­
ation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.
 
73. Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.  
74. Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365-372.  
75. De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and 
physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.  
76. De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) 
Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.
 
77. De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., 
O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmen ­
tal neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.
 
78. Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129-135.
 
79. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New 
York.  
80. Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practi ­
cal primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.  
81. Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total num ­
bers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an un ­
biased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.  
82. Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.  
83. West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51-61.  
84. Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813-831.  
85. Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.  
86. Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.
 
87. Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slik ­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.  
88. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70-74.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
89. Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.
 
90. Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
91. House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.
 
92. Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.  
93. US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A.  
94. US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322.  
95. Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
96. Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicolo ­
gy, 5:113-126.  
97. Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special em ­
phasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.  
98. Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental stu ­
dies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.  
99. Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165-172.  
100. Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221-228.  
101. Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.
 
102. Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in de ­
velopmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.  
103. Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc 
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. 
(2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in 
developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.
 
104. Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures ana ­
lysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.
 
105. Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 
41:295-301.  
106. Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental 
neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Sci ­
ence Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.
 
107. Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute ex ­
pert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology 
and Teratology, 30(4):288-325.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
108. Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.
 
109. Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figuur 1  
Algemeen testschema voor functie/gedragstesten, neuropathologische beoordeling en 
hersengewichten. Dit diagram is gebaseerd op de beschrijving in punten 13-15 (PND = 
postnatale dag). Voorbeelden van toewijzing van dieren staan in aanhangsel 1.
  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Aanhangsel 1  
1. Hieronder worden voorbeelden van mogelijke toewijzingen beschreven en 
in tabelvorm gepresenteerd. Deze voorbeelden dienen ter illustratie van een 
aantal verschillende manieren waarop onderzoeksdieren aan verscheidene testparadigma's kunnen worden toegewezen.
 
Voorbeeld 1  
2. Eén set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouw ­
tje per nest) wordt gebruikt voor het testen vóór spening van de ontogenie 
van het gedrag. Van deze dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau 
(d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) op humane wijze gedood op PND 22. De hersenen worden uitgenomen, gewogen en bewerkt voor hi ­
stopathologische beoordeling. Daarnaast worden hersengewichtgegevens 
verzameld met niet-gefixeerde hersenen van de resterende 10 mannetjes 
en 10 vrouwtjes per dosisniveau.
 
3. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje 
en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor functie/gedragstesten na spening (gedetailleerde klinische observaties, motorische activiteit, auditieve schrik ­
reactie en testen cognitieve functie bij adolescenten) en beoordeling van de 
leeftijd van geslachtsrijping. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/ 
dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) verdoofd en via perfusie gefixeerd aan het einde van het onderzoek (ongeveer PND 70). Na aanvullende in-situfixatie worden de hersenen uitgenomen en bewerkt 
voor neuropathologische beoordeling.
 
4. Voor het testen van de cognitieve functie bij jongvolwassen dieren (bv. 
PND 60-70) wordt een derde set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/groep (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) gedood aan het 
einde van het onderzoek en worden de hersenen uitgenomen en gewogen.
 
5. De resterende 20 dieren/geslacht/groep zijn reservedieren voor mogelijke 
aanvullende testen.  
Tabel 1  
Nr. jong (  a ) Aantal aan een test 
toegewezen jongen Onderzoek/test 
m v  
1 5 20 m + 20 v Ontogenie van het gedrag 
10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ 
morfometrie op PND 22 
10 m + 10 v Hersengewicht op PND 22 
2 6 20 m + 20 v Gedetailleerde klinische obser ­
vaties 
20 m + 20 v Motorische activiteit 
20 m + 20 v Geslachtsrijping 20 m + 20 v Motorische en sensorische func ­
tie 
20 m + 20 v Leervermogen- en geheugen 
(PND 25) 
10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ 
morfometrie van jongvolwassen 
dieren op ~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Nr. jong (  a ) 
Aantal aan een test 
toegewezen jongen Onderzoek/test 
m v  
3 7 20 m + 20 v Leervermogen en geheugen 
(jongvolwassen dieren) 
10 m + 10 v Hersengewicht van jongvolwas ­
sen dieren op ~ PND 70 
4 8 — Reservedieren voor vervangin ­
gen of aanvullende testen  
( a ) Voor dit voorbeeld worden nesten uitgedund tot 4 mannetjes + 4 vrouwtjes; man ­
nelijke jongen krijgen nr. 1-4, vrouwelijke jongen 5-8.  
Voorbeeld 2  
6. Eén set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouw ­
tje per nest) wordt gebruikt voor het testen vóór spening van de ontogenie van het gedrag. Van deze dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) op humane wijze gedood op PND 11. De 
hersenen worden uitgenomen, gewogen en bewerkt voor histopathologische 
beoordeling.
 
7. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (1 mannetje en 1 
vrouwtje per nest) gebruikt voor onderzoek na spening (gedetailleerde kli ­
nische observaties, motorische activiteit, beoordeling van leeftijd van ge ­
slachtsrijping en motorische en sensorische functie). Van deze dieren wor ­
den 10 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per 
nest) verdoofd en via perfusie gefixeerd aan het einde van het onderzoek 
(ongeveer PND 70). Na aanvullende in-situfixatie worden de hersenen uit ­
genomen, gewogen en bewerkt voor neuropathologische beoordeling.  
8. Voor het testen van de cognitieve functie bij adolescente en jongvolwassen 
dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) gebruikt. Voor het testen van de cognitieve functie op 
PND 23 en bij jongvolwassen dieren worden verschillende dieren gebruikt. 
Aan het einde worden de 10 dieren/geslacht/groep die als volwassen dieren werden getest, gedood, waarna de hersenen worden uitgenomen en gewogen.
 
9. De resterende 20 dieren/geslacht/groep die niet zijn geselecteerd voor de 
testen, worden bij het spenen gedood en afgevoerd.  
Tabel 2  
Nr. jong (  a ) Aantal aan een test 
toegewezen jongen Onderzoek/test 
m v  
1 5 20 m + 20 v Ontogenie van het gedrag 
10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ 
morfometrie op PND 11 
2 6 20 m + 20 v Gedetailleerde klinische obser ­
vaties 
20 m + 20 v Motorische activiteit 
20 m + 20 v Geslachtsrijping 
20 m + 20 v Motorische en sensorische func ­
tie 
10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ 
morfometrie van jongvolwassen dieren op ~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Nr. jong (  a ) 
Aantal aan een test 
toegewezen jongen Onderzoek/test 
m v  
3 7 10 m + 10 v (  b ) Leervermogen- en geheugen 
(PND 23) 
3 7 10 m + 10 v (  b ) Leervermogen en geheugen 
(jongvolwassen dieren) 
Hersengewicht van jongvolwas ­
sen dieren 
4 8 — Dieren gedood en afgevoerd op 
PND 21  
( a ) Voor dit voorbeeld worden nesten uitgedund tot 4 mannetjes + 4 vrouwtjes; man ­
nelijke jongen krijgen nr. 1-4, vrouwelijke jongen 5-8. 
( b ) Verschillende jongen worden gebruikt voor cognitieve testen op PND 23 en bij 
jongvolwassen dieren (bv. even/oneven nesten van in totaal 20).  
Voorbeeld 3  
10. Eén set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouw ­
tje per nest) wordt gebruikt voor bepaling van het hersengewicht en neuro ­
pathologische beoordeling op PND 11. Van deze dieren worden 10 jongen/ geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) op humane wijze gedood op PND 11, waarna de hersenen worden uitgenomen, gewo ­
gen en bewerkt voor histopathologische beoordeling. Daarnaast worden 
hersengewichtgegevens verzameld van niet-gefixeerde hersenen van de res ­
terende 10 mannetjes en 10 vrouwtjes per dosisniveau.
 
11. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje 
en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor ontogenie van het gedrag (motorische 
activiteit), onderzoek na spening (motorische activiteit en bepaling van leef ­
tijd van geslachtsrijping) en testen van de cognitieve functie bij adolescente 
dieren.  
12. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje 
en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor testen van de motorische en senso ­
rische functie (auditieve schrikreactie) en gedetailleerde klinische observa ­
ties. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 man ­
netje of 1 vrouwtje per nest) verdoofd en via perfusie gefixeerd aan het 
einde van het onderzoek (ongeveer PND 70). Na aanvullende in-situfixatie worden de hersenen uitgenomen, gewogen en bewerkt voor neuropatholo ­
gische beoordeling.
 
13. Voor het testen van de cognitieve functie bij jongvolwassen dieren wordt 
nog een set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/ 
groep (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) gedood aan het einde van 
het onderzoek en worden de hersenen uitgenomen en gewogen.
 
Tabel 3  
Nr. jong (  a ) Aantal aan een test toege ­
wezen jongen Onderzoek/test 
m v  
1 5 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ 
morfometrie op PND 11 
10 m + 10 v Hersengewicht op PND 11 
2 6 20 m + 20 v Ontogenie van het gedrag (mo ­
torische activiteit) 
20 m + 20 v Motorische activiteit 20 m + 20 v Geslachtsrijping 20 m + 20 v Leervermogen- en geheugen 
(PND 27)
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Nr. jong (  a ) Aantal aan een test toege ­
wezen jongen Onderzoek/test 
m v  
3 7 20 m + 20 v Auditieve schrikreactie (adoles ­
cente en jongvolwassen dieren) 
20 m + 20 v Gedetailleerde klinische obser ­
vaties 
10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ 
morfometrie op ~PND 70 
4 8 20 m + 20 v Leervermogen en geheugen 
(jongvolwassen dieren) 
10 m + 10 v Hersengewicht van jongvolwas ­
sen dieren  
( a ) Voor dit voorbeeld worden nesten uitgedund tot 4 mannetjes + 4 vrouwtjes; man ­
nelijke jongen krijgen nr. 1-4, vrouwelijke jongen 5-8.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Aanhangsel 2  
Definities  
Stof: een stof of mengsel.  
Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  UTEROTROFE BIOASSAY BIJ KNAAGDIEREN: EEN 
KORTLOPENDE SCREENINGSTEST OP OESTROGENE 
EIGENSCHAPPEN  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 440 (2007) van de 
OESO. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande richtlijnen te herzien en nieuwe richtlijnen te ontwikkelen voor het screenen op en testen 
van potentiële hormoonontregelaars (1), en heeft zij daaraan een hoge pri ­
oriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het ontwikkelen van een testrichtlijn voor de uterotrofe bioassay bij knaagdieren. De uterotrofe bioassay bij knaagdieren werd vervolgens onderworpen aan een uitgebreid 
valideringsprogramma dat onder meer bestond uit het opstellen van een 
gedetailleerd achtergronddocument (2)(3) en het uitvoeren van uitgebreide intra- en interlaboratoriumonderzoeken om de relevantie en reproduceer ­
baarheid aan te tonen van de bioassay met een krachtig 
referentie-oestrogeen, zwakke oestrogeenreceptoragonisten, een sterke oes ­
trogeenreceptorantagonist en een negatieve referentiestof (4)(5)(6)(7)(8)(9). Deze testmethode B.54 is het resultaat van de ervaring die is opgedaan 
tijdens het valideringstestprogramma en de daaruit verkregen resultaten 
met oestrogeenagonisten.
 
2. De uterotrofe bioassay bij knaagdieren is een kortlopende screeningstest die 
in de jaren 30 werd ontwikkeld (27)(28) en in 1962 voor het eerst werd gestandaardiseerd voor screening door een comité van deskundigen (32)(35). De test berust op de toename van het gewicht van de baarmoeder 
of de uterotrofe respons (zie 29 voor een overzichtsartikel). Beoordeeld 
wordt in welke mate een stof in staat is biologische activiteiten teweeg te brengen die overeenkomen met die van agonisten of antagonisten of na ­
tuurlijke oestrogenen (bv. 17b-estradiol); de test wordt echter veel minder 
vaak gebruikt voor de detectie van antagonisten dan voor de detectie van agonisten. De baarmoeder reageert op twee manieren op oestrogenen. In eerste instantie neemt het gewicht toe als gevolg van waterimbibitie. Deze 
respons wordt gevolgd door een gewichtstoename als gevolg van weefsel ­
groei (30). De responsen van de baarmoeder bij ratten en muizen zijn kwalitatief vergelijkbaar.
 
3. Deze bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest en de toepassing ervan 
moet worden gezien in samenhang met het „Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen” 
(aanhangsel 2). In dit conceptueel kader is de uterotrofe bioassay onder ­
gebracht in niveau 3 als een in-vivotest waarmee gegevens kunnen worden verkregen over een enkel hormoonmechanisme, d.w.z. oestrogene werking.
 
4. De bedoeling is dat de uterotrofe bioassay wordt opgenomen in een reeks 
in-vitro- en in-vivotesten voor de identificatie van stoffen die mogelijk 
interactie vertonen met het hormoonsysteem, op basis waarvan uiteindelijk 
beoordelingen van het risico voor de gezondheid van de mens of het milieu tot stand komen. Het valideringsprogramma van de OESO maakte gebruik van zowel sterke als zwakke oestrogeenagonisten bij de beoordeling van de 
prestatie van de test voor de identificatie van oestrogene stoffen 
(4)(5)(6)(7)(8). De gevoeligheid van de testprocedure voor oestrogeenago ­
nisten werd daarbij goed aangetoond, evenals een goede intra- en 
interlaboratoriumreproduceerbaarheid.
 
5. Wat betreft negatieve stoffen werd slechts één „negatieve” referentiestof, 
waarvan al gerapporteerd was dat deze negatief was volgens een uterotrofe 
test alsook in-vitroreceptorbindings- en receptortesten, opgenomen in het valideringsprogramma. Daarnaast zijn echter aanvullende testgegevens be ­
oordeeld die geen verband hielden met het OESO-valideringsprogramma, en 
hierdoor werd de specificiteit van de uterotrofe bioassay voor de screening 
van oesterogeenagonisten verder ondersteund (16).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN  
6. Oestrogeenagonisten en -antagonisten werken als liganden voor de oestro ­
geenreceptoren a en b en kunnen de transcriptiewerking van de receptoren 
respectievelijk activeren of remmen. Dit zou kunnen leiden tot schadelijke gevaren voor de gezondheid, waaronder effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. Er bestaat daarom behoefte aan een snelle methode om een 
stof te beoordelen en te evalueren als een mogelijke oestrogeenagonist of 
-antagonist. De affiniteit van een ligand voor een oestrogeenreceptor of transcriptieactivering van reportergenen in vitro is wel informatief, maar is slechts een van de verschillende determinanten van mogelijk gevaar. 
Mogelijke andere determinanten zijn onder meer metabole activering en 
deactivering nadat de stof het lichaam is binnengetreden, distributie naar doelweefsels en klaring uit het lichaam, en zijn ten minste deels afhankelijk van de toedieningsweg en de betreffende stof. Hierdoor bestaat de behoefte 
de mogelijke activiteit van een stof  in vivo  te screenen onder relevante 
omstandigheden, tenzij de kenmerken van de stof wat betreft absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie (ADME) al voldoende informatie opleveren. Baarmoederweefsels reageren met snelle en krachtige groei op 
stimulering door oestrogenen, met name bij proefknaagdieren, waarbij de 
oestruscyclus ongeveer vier dagen duurt. Knaagdiersoorten, in het bijzonder de rat, worden bovendien veel gebruikt in toxiciteitsonderzoeken naar ka ­
rakterisering van gevaren. De baarmoeder van knaagdieren is daarom een 
geschikt doelorgaan voor de in-vivoscreening van oestrogeenagonisten en 
-antagonisten.
 
7. Deze testmethode is gebaseerd op de in het OESO-valideringsonderzoek 
toegepaste protocollen die betrouwbaar en herhaalbaar zijn gebleken in intra- en interlaboratoriumonderzoeken (5)(7). Op dit moment zijn er twee 
methoden beschikbaar, namelijk de methode met volwassen vrouwtjes die 
ovariëctomie hebben ondergaan (ovx-volwassen-methode), en de methode met onvolgroeide vrouwtjes die geen ovariëctomie hebben ondergaan (on ­
volgroeid-methode). In het OESO-valderingstestprogramma is aangetoond 
dat beide methoden wat betreft gevoeligheid en reproduceerbaarheid ver ­
gelijkbaar zijn. Vanwege de intacte hypothalamus-hypofyse-gonadeas (HPG-as), is het onvolgroeide dier weliswaar enigszins minder specifiek, maar heeft het een grotere onderzoeksreikwijdte dan het dier dat ovariëcto ­
mie heeft ondergaan, omdat het kan reageren op stoffen die interactie ver ­
tonen met de HPG-as en niet alleen met de oestrogeenreceptor. De HGP-as van de rat is functioneel vanaf een leeftijd van ongeveer 15 dagen. Eerder kan de puberteit niet met behandelingen als GnRH worden versneld. Als de 
vrouwtjes richting de puberteit gaan, heeft het vrouwtje vóór de vaginale 
opening verscheidene stille cycli die niet leiden tot vaginale opening of ovulatie, maar waarbij er wel enige hormonale schommelingen zijn. Als een stof de HPG-as direct of indirect stimuleert, leidt dit tot vroegtijdige 
puberteit, vroege eisprong en versnelde vaginale opening. Dit treedt niet 
alleen op bij stoffen die inwerken op de HPG-as, maar ook bepaald voer met een hogere metaboliseerbare energiewaarde dan ander voer stimuleert 
de groei en versnelt de vaginale opening zonder een oestrogene werking te 
hebben. Dergelijke stoffen induceren geen uterotrofe respons bij volwassen ovx-dieren, omdat hun HPG-as niet werkt.
 
8. Met het oog op dierenwelzijn moet de voorkeur worden gegeven aan de 
methode met onvolgroeide ratten, zodat dat operatieve voorbehandeling van de dieren wordt voorkomen en ook wordt voorkomen dat de dieren met 
aanwijzingen dat deze in de oestrus komen, mogelijk niet worden gebruikt 
(zie punt 30).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. De uterotrofe respons is niet geheel van oestrogene oorsprong, d.w.z. andere 
stoffen dan agonisten of antagonisten van oestrogenen kunnen ook een 
respons geven. Zo kunnen relatief hoge doses progesteron, testosteron of verscheidene synthetische progestinen allemaal leiden tot een stimulerende respons (30). Elke respons kan histologisch geanalyseerd worden op kera ­
tinisatie en verhoorning van de vagina (30). Ongeacht de mogelijke bron 
van de respons moet bij een positieve uitkomst van een uterotrofe bioassay normaliter actie worden ondernomen om meer duidelijkheid te verschaffen. Aanvullende aanwijzingen voor oestrogene werking kunnen komen uit 
in-vitrotesten, zoals de ER-bindingtesten en transcriptieactiveringstesten of 
uit andere in-vivotesten zoals de test op de puberale ontwikkeling bij vrouwtjes (female pubertal assay).
 
10. Aangezien de uterotrofe bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest, 
diende de gekozen valideringsaanpak zowel de overwegingen met het oog op dierenwelzijn als een gefaseerde teststrategie. Daartoe lag de focus meer op grondige validering van de reproduceerbaarheid en gevoeligheid voor 
oestrogene werking — de belangrijkste bron van zorg voor veel stoffen — 
dan op het anti-oestrogene deel van de test. Omdat het aantal stoffen met een duidelijk anti-oestrogeen profiel (niet vertroebeld door enige oestrogene activiteit) zeer beperkt is, werd slechts één anti-oestrogeen met sterke ac ­
tiviteit onderzocht. Deze testmethode heeft dus betrekking op het oestrogene 
protocol; het protocol waarin de antagonistmodus van de test wordt be ­
schreven, is in een leidraad opgenomen (37). De reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de test voor stoffen met zuiver anti-oestrogene activiteit 
wordt later duidelijker gedefinieerd, nadat de testprocedure enige tijd rou ­
tinematig in gebruik is geweest en meer stoffen met dit type werking zijn geïdentificeerd.
 
11. Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de 
plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen. De beschrijvingen van verzorging en behandeling hieronder zijn minimale uit ­
voeringsnormen, die ondergeschikt zijn aan lokale regelgeving zoals Richt ­
lijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 
2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (38). De OESO heeft nadere richtsnoeren 
voor de humane behandeling van dieren opgesteld (25).
 
12. Net als met alle testen waarbij levende dieren worden gebruikt, is het van 
essentieel belang om vóór de start van de test zeker te stellen dat de 
gegevens echt noodzakelijk zijn. Twee situaties waarbij de gegevens nood ­
zakelijk kunnen zijn, zijn bijvoorbeeld:  
— hoge potentiële blootstelling (niveau 1 van het conceptueel kader, aan ­
hangsel 2) of aanwijzingen voor oestrogene werking (niveau 2), om te 
onderzoeken of dergelijke effecten kunnen plaatsvinden in vivo,  
— effecten die wijzen op oestrogene werking bij in-vivotesten van niveau 4 
of 5, om aan te tonen dat de effecten verband hielden met een oes ­
trogeen mechanisme dat niet kan worden opgehelderd met een in-vitrotest.
 
13. De bij deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in 
aanhangsel 1.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
14. De gevoeligheid van de uterotrofe bioassay berust op een testsysteem met 
proefdieren waarbij de hypothalamus-hypofyse-gonadeas niet functioneel is, 
wat lage endogene concentraties van circulerend oestrogeen geeft. Dit zorgt voor een laag basisgewicht van de baarmoedergewicht op baseline en een maximaal bereik van de respons op toegediende oestrogenen. Twee oes ­
trogeengevoelige toestanden van het vrouwelijke knaagdier voldoen aan 
deze eis:
 
i) onvolgroeide vrouwtjes na spening en vóór de puberteit, en  
ii) jongvolwassen vrouwtjes na ovariëctomie waarbij er voldoende tijd is 
voor regressie van baarmoederweefsels.  
15. De teststof wordt dagelijks toegediend via een orale maagsonde of subcu ­
tane injectie. De stof wordt in geleidelijk stijgende doses toegediend aan minimaal twee behandelgroepen (zie punt 33 voor richtsnoeren) van proef ­
dieren met één dosisniveau per groep en een toedieningsperiode van drie 
opeenvolgende dagen voor de onvolgroeid-methode en een minimale toe ­
dieningsperiode van drie opeenvolgende dagen voor de ovx-volwassen-me ­
thode. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de 
dieren. Voor oestrogeenagonisten wordt beoordeeld of het gemiddelde baar ­
moedergewicht van de groepen met behandelde dieren statistisch significant is toegenomen ten opzichte van dat van de mediumgroep. Een statistisch significante toename van het gemiddelde baarmoedergewicht van een test ­
groep wijst op een positieve respons in deze bioassay.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Keuze van de diersoort  
16. Voor de methode kunnen vaak gebruikte proefknaagdierstammen worden 
gebruikt. Tijdens de validering werden bijvoorbeeld de rattenstammen Sprague-Dawley en Wistar gebruikt. Stammen met baarmoeders waarvan bekend is of vermoed wordt dat het responsvermogen lager is, mogen niet 
worden gebruikt. Het laboratorium moet de gevoeligheid van de gebruikte 
stam aantonen, zoals beschreven in punten 26 en 27.
 
17. De rat en muis zijn al sinds de jaren 30 routinematig gebruikt voor de 
uterotrofe bioassay. De OESO-valideringsonderzoeken werden alleen met 
ratten verricht op grond van de aanname dat beide soorten naar verwachting gelijkwaardig zijn en dat één soort daarom voldoende moet zijn voor de wereldwijde validering, om zodoende te besparen op middelen en dieren. In 
de meeste onderzoeken naar reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit is de rat 
de aangewezen soort. In aanmerking genomen dat er voor muizen een enorme historische databank bestaat werd er, om de reikwijdte van de test ­
methode van de uterotrofe bioassay bij knaagdieren uit te breiden met het 
gebruik van muizen als testsoorten, een beperkt 
follow-upvalideringsonderzoek met muizen uitgevoerd (16). Er is gekozen voor een overbruggingsaanpak met een beperkt aantal teststoffen, deel ­
nemende laboratoria en zonder codering van monsters, in overeenstemming 
met de oorspronkelijke intentie om te besparen op middelen en dieren. Uit 
dit overbruggingsvalideringsonderzoek blijkt voor de uterotrofe bioassay bij jongvolwassen muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, dat de bij ratten en muizen verkregen gegevens kwalitatief en kwantitatief goed met elkaar 
overeenkomen. Dit maakt het mogelijk, in het geval de uterotrofe bioassay 
inleidend is voor een langdurig onderzoek, in beide onderzoeken dieren van dezelfde stam en afkomst te gebruiken. Omdat de overbruggingsaanpak werd beperkt tot ovx-muizen en in het verslag geen robuuste dataset staat 
die het onvolgroeid-model valideert, valt het onvolgroeid-model voor mui ­
zen niet onder de reikwijdte van de huidige testmethode.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. In bepaalde gevallen kunnen dus muizen in plaats van ratten worden ge ­
bruikt. De keuze voor deze soort moet worden gemotiveerd op basis van 
toxicologische, farmacokinetische en/of andere criteria. Het kan noodzake ­
lijk zijn om voor muizen van het protocol af te wijken. Zo is de voedsel ­
consumptie van muizen op basis van lichaamsgewicht hoger dan die van 
ratten en moet daarom het gehalte aan fyto-oestrogenen in het voer voor 
muizen lager zijn dan voor ratten (9)(20)(22).  
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
19. Alle procedures moeten verlopen conform de plaatselijke normen voor de 
verzorging van proefdieren. Deze beschrijvingen van de verzorging en be ­
handeling zijn minimumnormen, die ondergeschikt zijn aan lokale regelge ­
ving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (38). De temperatuur in de 
proefdierruimte dient 22 °C te zijn (met een spreiding van ± 3 °C). De 
relatieve vochtigheid moet minimaal 30 % zijn en bij voorkeur niet hoger dan maximaal 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte). Er moet worden gestreefd naar een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er moet 
gebruik worden gemaakt van kunstlicht, met een dagelijkse lichtcyclus 
van 12 uur licht en 12 uur donker.
 
20. Proefdiervoer en drinkwater moeten ad libitum worden verstrekt. Jongvol ­
wassen dieren kunnen elk apart of in groepjes van maximaal drie dieren 
worden ondergebracht. Vanwege de jonge leeftijd van de onvolgroeide 
dieren, wordt sociale groepshuisvesting aanbevolen.  
21. Het is bekend dat hoge gehaltes aan fyto-oestrogenen in proefdiervoer het 
baarmoedergewicht bij knaagdieren in zodanige mate verhogen, dat dit de uterotrofe bioassay verstoort (13)(14)(15). Hoge gehaltes aan 
fyto-oestrogenen en hoge metaboliseerbare energiewaarden in proefdiervoer 
kan bij gebruik van onvolgroeide dieren ook leiden tot vroegtijdige puber ­
tijd. De fyto-oestrogenen komen hoofdzakelijk uit soja- en luzerneproducten die in het proefdiervoer zijn verwerkt, en het is gebleken dat de concentratie 
fyto-oestrogenen in standaardproefdiervoer van partij tot partij varieert (23). 
Het lichaamsgewicht is een belangrijke variabele, omdat de hoeveelheid voedsel die ingenomen wordt, gerelateerd is aan het lichaamsgewicht. De feitelijke dosis fyto-oestrogenen die dieren via hetzelfde voer binnenkrijgen, 
kan daarom per soort en per leeftijd variëren (9). Voor onvolgroeide vrou ­
welijke ratten kan de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht ongeveer een factor twee groter zijn dan die voor jongvolwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan. Voor jongvolwassen muizen kan de 
voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht ongeveer een factor vier 
groter zijn dan die voor jongvolwassen vrouwelijke ratten die ovariëctomie hebben ondergaan.
 
22. Uit resultaten van uterotrofe testen (9)(17)(18)(19) blijkt echter dat beperkte 
hoeveelheden fyto-oestrogenen in voer aanvaardbaar zijn en de gevoeligheid 
van de bioassay niet verminderen. Als richtsnoer mogen de gehaltes aan fyto-oestrogenen in voer niet hoger zijn dan 350 μg genisteïne-equivalenten/ 
gram proefdiervoer voor onvolgroeide vrouwelijke Sprague Dawley- en 
Wistar-ratten (6)(9). Dergelijk voer moet eveneens aangewezen zijn bij 
het testen van jongvolwassen ratten die ovariëctomie hebben ondergaan, omdat de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht bij jongvolwas ­
sen dieren lager is dan bij onvolgroeide dieren. Als volwassen muizen die 
ovariëctomie hebben ondergaan, of ratten die gevoeliger zijn voor 
fyto-oestrogenen, gebruikt gaan worden, moet worden overwogen de gehal ­
tes aan fyto-oestrogenen in voer op evenredige wijze te verlagen (20). Bovendien kunnen de verschillen in de beschikbare metabole energie die 
verschillend voer levert, leiden tot verschuiving van het moment waarop de 
pubertijd begint (21)(22).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Voorafgaand aan het onderzoek moet zorgvuldig een voer zonder een ver ­
hoogd gehalte aan fyto-oestrogenen (zie (6)(9) voor richtsnoeren) of een 
verhoogde metaboliseerbare energiewaarde worden uitgekozen, omdat an ­
ders verstoring van de resultaten zou kunnen optreden (15)(17)(19)(22)(36). Erop toezien dat het door het laboratorium gebruikte testsysteem naar be ­
horen presteert, zoals beschreven in punten 26 en 27, vormt een belangrijke 
controle op beide factoren. Als voorzorgsmaatregel in overeenstemming met goede laboratoriumpraktijken (GLP) moet van elke partij voer die tijdens het onderzoek wordt toegediend, een representatief monster worden ge ­
nomen voor mogelijke analyse van het gehalte aan fyto-oestrogenen (bv. 
in het geval van een hoog controle-baarmoedergewicht ten opzichte van historische controles of een inadequate respons op het referentie-oesterogeen, 17-alfa-ethinylestradiol). Aliquots moeten als onder ­
deel van het onderzoek geanalyseerd worden of ingevroren worden bij – 
20 °C of op zodanige wijze bewaard worden dat afbraak van het monster vóór analyse wordt voorkomen.
 
24. Bepaald strooisel kan natuurlijk voorkomende oestrogene of anti-oestrogene 
stoffen bevatten (het is bv. bekend dat maïsspil de cyclus van ratten beïn ­
vloedt en een anti-oestrogene werking lijkt te hebben). Het gehalte aan 
fyto-oestrogenen in het gekozen strooisel moet minimaal zijn.  
Voorbereiding van de dieren  
25. Proefdieren zonder aanwijzingen voor ziekte of lichamelijke afwijkingen 
worden willekeurig toegewezen aan de controle- en behandelgroepen. De 
kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Aan de dieren moet een unieke code worden toegekend. Bij voorkeur moeten onvolgroeide dieren 
tijdens de acclimatisering tot de spening worden ondergebracht met moe ­
derdieren of pleegmoederdieren. De acclimatiseringsperiode vóór aanvang van het onderzoek moet ongeveer vijf dagen duren voor jongvolwassen dieren en voor de onvolgroeide dieren die zijn geleverd met moederdieren 
of pleegmoederdieren. Als de onvolgroeide dieren gespeende dieren zonder 
moederdieren zijn, kan het noodzakelijk worden de acclimatiseringsperiode te verkorten omdat de toediening direct na de spening moet beginnen (zie punt 29).
 
PROCEDURE  
Verificatie van de geschiktheid van laboratoria  
26. De geschiktheid van laboratoria kan op twee verschillende mogelijkheden 
geverifieerd worden:  
— periodieke verificatie op basis van een inleidend 
positieve-controleonderzoek op baseline (zie punt 27). Ten minste 
elke zes maanden en elke keer dat er sprake is van een verandering 
die van invloed kan zijn op de prestatie van de test (bv. een nieuwe formulering van het voer, andere medewerkers die de excisies verrich ­
ten, andere stam of leverancier van de dieren), moet het responsver ­
mogen van het testsysteem (diermodel) geverifieerd worden met een 
gepaste dosis (gebaseerd op het in punt 27 beschreven inleidende positieve-controleonderzoek op baseline) van een referentie-oestrogeen: 17a-ethinylestradiol (CAS-nr. 57-63-6) (EE);
 
— toepassing van gelijktijdige controles door opname van een groep die 
een gepaste dosis van het referentie-oestrogeen krijgt toegediend in elke 
test. 
Als het systeem niet reageert zoals verwacht, moeten de testomstandigheden 
worden onderzocht en dienovereenkomstig worden gewijzigd. De aanbevo ­
len dosis van het te gebruiken referentie-oestrogeen in beide aanpakken is 
ongeveer de ED 70 tot 80.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Positieve-controleonderzoek op baseline  — Voordat een laboratorium 
voor het eerst een onderzoek volgens deze testmethode uitvoert, moet eerst 
de geschiktheid van het laboratorium worden aangetoond door het respons ­
vermogen van het diermodel te testen door de dosisrespons van het referentie-oestrogeen 17a-ethinylestradiol (CAS-nr. 57-63-6) (EE) te bepalen 
met minimaal vier doses. De respons op het baarmoedergewicht wordt 
vergeleken met vastgestelde historische gegevens (zie referentie (5)). Als dit positieve-controleonderzoek op baseline niet de verwachte resultaten oplevert, moeten de testomstandigheden worden onderzocht en gewijzigd.
 
Aantal en toestand van de dieren  
28. De behandel- en controlegroepen moeten elk ten minste 6 dieren bevatten 
voor beide protocollen (methode met onvolgroeide dieren en methode met 
ovx-volwassen dieren).  
Leeftijd van onvolgroeide dieren  
29. Voor de uterotrofe bioassay met onvolgroeide dieren moet de geboorte ­
datum vermeld worden. De toediening moet vroeg genoeg beginnen opdat 
aan het einde van de toediening van de stof de met de pubertijd samen ­
hangende fysiologische stijging van endogene oestrogenen nog niet heeft plaatsgevonden. Anderzijds zijn er aanwijzingen dat zeer jonge dieren mo ­
gelijk minder gevoelig zijn. Voor het bepalen van de optimale leeftijd moet 
elk laboratorium rekening houden met de eigen achtergrondgegevens over rijping.
 
Als richtsnoer kan worden aangehouden dat de toediening bij ratten direct 
na vroegtijdig spening op postnatale dag 18 kan beginnen (waarbij de geboortedag postnatale dag 0 is). De toediening bij ratten moet bij voorkeur afgerond zijn op postnatale dag 21, maar in elk geval vóór postnatale dag 
25, omdat na deze leeftijd de hypothalamus-hypofyse-gonadeas functioneel 
wordt en de endogene oestrogeenspiegels kunnen gaan stijgen met een daarmee gepaard gaande toename in gemiddeld baarmoedergewicht op ba ­
seline en een toename in de groep-standaarddeviaties (2)(3)(10)(11)(12).
 
Procedure voor ovariëctomie  
30. Voor de vrouwelijke rat en muis die ovariëctomie hebben ondergaan (be ­
handel- en controlegroepen) moet de ovariëctomie plaatsvinden op een leef ­
tijd tussen 6 en acht weken. Voor ratten moet tussen de ovariëctomie en de 
eerste toedieningsdag een tussenpoos van minimaal 14 dagen worden aan ­
gehouden, zodat de baarmoeder kan terugkeren tot een minimale stabiele uitgangssituatie. Voor muizen moet tussen de ovariëctomie en de eerste 
toedieningsdag een tussenpoos van ten minste zeven dagen worden aange ­
houden. Omdat kleine stukjes eierstokweefsel voldoende zijn om signifi ­
cante circulerende oestrogeenspiegels te produceren (3), moeten de dieren 
vóór gebruik worden getest door observatie van epitheelcellen in een vagi ­
naal uitstrijkje op ten minste vijf opeenvolgende dagen (bv. op dag 10-14 na ovariëctomie voor ratten). Als er aanwijzingen zijn dat de dieren in de oestrus komen, mogen deze dieren niet worden gebruikt. Verder moeten bij 
de obductie de eierstokstompjes worden onderzocht op aanwijzingen voor 
aanwezig eierstokweefsel. Zo ja, dan mogen de gegevens van dit dier niet worden meegenomen in de berekeningen (3).
 
31. De ovariëctomie-ingreep begint met het dier in ventrale ligging te positio ­
neren, nadat het dier op correcte wijze onder narcose is gebracht. De incisie die de dorso-laterale buikwand opent moet ongeveer 1 cm in lengte zijn op het middelpunt tussen de inferiore ribgrens en de darmbeenkam (crista 
iliaca), en enkele millimeters lateraal aan de laterale marge van de lumbale 
spier. De eierstok moet uit de buikholte worden genomen en op een asep ­
tisch vlak worden geplaatst. De eierstok moet worden losgemaakt bij de verbinding van de eileider met het baarmoederlichaam. Nadat is vastgesteld 
dat er geen grote bloedingen zijn, moet de buikwand worden gesloten met 
een hechting en de huid worden gesloten met nietjes of geschikt hechtdraad. De punten van afbinding staan schematisch weergegeven in figuur 1. Er moet passende postoperatieve analgesie worden gegeven volgens de aan ­
bevelingen van een dierenarts met ervaring in de verzorging van 
knaagdieren.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Lichaamsgewicht  
32. Bij de ovx-volwassen-methode is er geen verband tussen het lichaams ­
gewicht en het baarmoedergewicht, omdat het baarmoedergewicht wordt 
beïnvloed door hormonen zoals oestrogenen en niet door de groeifactoren die de lichaamsgrootte reguleren. Bij het onvolgroeid-model hangt het li ­
chaamsgewicht daarentegen wel samen met het baarmoedergewicht tot vol ­
wassenheid is bereikt (34). Aan het begin van het onderzoek mag bij het 
onvolgroeid-model het gewicht van de gebruikte dieren daarom slechts minimaal en niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Dit betekent dat de nestgrootte door de fokker gestandaardiseerd moet 
worden om ervoor te zorgen dat nakomelingen van verschillende moeder ­
dieren ongeveer hetzelfde worden gevoerd. Dieren moeten worden toege ­
wezen aan (controle- en behandel-) groepen via gerandomiseerde gewichts ­
verdeling, zodat het gemiddelde lichaamsgewicht van elke groep niet sta ­
tistisch afwijkt van alle andere groepen. Er moet zoveel mogelijk getracht 
worden toewijzing van nestgenoten aan dezelfde behandelgroep te voor ­
komen zonder daarvoor het aantal nesten voor het onderzoek te moeten verhogen.
 
Dosering  
33. Om vast te stellen of een teststof oestrogene werking kan hebben in vivo, 
zijn twee dosisgroepen en een controlegroep normaal voldoende, en deze opzet verdient daarom de voorkeur met het oog op dierenwelzijn. Voor het 
opstellen van een dosis-responscurve of de extrapolatie naar lagere doses 
zijn ten minste 3 dosisgroepen nodig. Als meer informatie nodig is naast vaststelling van de oestrogene activiteit (zoals een schatting van de werk ­
zaamheid), moet een ander doseringsschema worden overwogen. Afgezien 
van de behandeling met de teststof moeten de dieren in de controlegroep op 
identieke wijze behandeld worden als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient 
de controlegroep dezelfde hoeveelheid medium te krijgen als voor de be ­
handelgroepen is gebruikt (of het hoogste volume dat in de testgroepen is gebruikt als er verschillen in zijn).
 
34. Het doel van de uterotrofe bioassay is het bepalen van doses waarbij over ­
leving van de dieren gewaarborgd is en er geen sprake is van significante 
toxiciteit of leed voor de dieren na drie opeenvolgende dagen van toedie ­
ning van de stof tot een maximumdosis van 1 000 mg/kg/dag. Alle dosi ­
sniveaus moeten worden voorgesteld en gekozen in het licht van de be ­
staande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof of ver ­
wante stoffen. Bij het bepalen van het hoogste dosisniveau moet eerst rekening worden gehouden met informatie over de LD50 en/of acute toxi ­
citeit om sterfte, ernstig lijden of ongerief bij de dieren te voorkomen 
(24)(25)(26). De hoogste dosis moet de maximaal verdraagbare dosis (maxi ­
mum tolerated dose, MTD) zijn; een onderzoek uitgevoerd bij een dosisni ­
veau dat een positieve uterotrofe respons induceerde, is ook aanvaardbaar. 
Als screening zijn grote intervallen (bv. eenheden van een halve log, over ­
eenkomend met een verhoging van de dosis met een factor 3,2, tot zelfs eenheden van één log) tussen doseringen doorgaans aanvaardbaar. Als er geen bruikbare gegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek 
worden uitgevoerd om de orde van grootte van de te gebruiken doses te 
helpen bepalen.
 
35. Een andere mogelijkheid is om, als de oestrogene werkzaamheid van een 
agonist in vitro (of in silico) bepaald kan worden, deze gegevens in aan ­
merking te nemen bij het kiezen van de dosis. Een schatting van de hoe ­
veelheid van de teststof die uterotrofe responsen zou produceren die equi ­
valent zijn aan die van de referentieagonist (ethinylestradiol), wordt bijvoor ­
beeld gemaakt uit de relatieve in-vitrowerkzaamheid ervan ten opzichte van 
ethinylestradiol. De hoogste testdosis krijgt men dan door deze equivalente 
dosis te vermenigvuldigen met de juiste factor, bv. 10 of 100.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Overwegingen voor bereikbepaling  
36. Zo nodig kan met enkele dieren een inleidend bereikbepalingsonderzoek 
worden uitgevoerd. Daarbij kan de OESO-leidraad nr. 19 (25) worden 
geraadpleegd voor definities van klinische verschijnselen die wijzen op toxiciteit of leed bij de dieren. Als het mogelijk is binnen dit bereikbepa ­
lingsonderzoek na drie dagen toediening, kunnen de baarmoeders ongeveer 
24 uur na de laatste dosis worden uitgesneden en gewogen. Deze gegevens 
kunnen vervolgens worden gebruikt bij het opzetten van het hoofdonder ­
zoek (keuze van aanvaardbare maximum- en lagere doses en een aanbeve ­
ling voor het aantal dosisgroepen).
 
Toediening van de doses  
37. De teststof wordt toegediend via een orale maagsonde of subcutane injectie. 
Bij het kiezen van de toedieningsweg moet rekening worden gehouden met 
zowel overwegingen met het oog op dierenwelzijn als toxicologische as ­
pecten, zoals de relevantie voor de weg van blootstelling van de mens aan de stof (bv. orale maagsonde t.o.v. inname volgens het model, subcutane injectie t.o.v. inhalatie of dermale adsorptie volgens het model), de 
fysisch-chemische eigenschappen van de teststof en met name bestaande 
toxicologische informatie en gegevens over metabolisme en kinetiek (bv. noodzaak om first-passmetabolisme te voorkomen, betere efficiëntie via een bepaalde weg).
 
38. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterige 
oplossing/suspensie te overwegen. Omdat de meeste oestrogeenliganden of de metabole voorlopers ervan vaak hydrofoob zijn, wordt echter doorgaans 
een oplossing/suspensie in olie gebruikt (bv. maïs-, pinda-, sesam- of olijf ­
olie). Deze oliën verschillen echter in caloriewaarde en vetgehalte, zodat het medium van invloed kan zijn op de totale inname van metaboliseerbare energie (ME), waardoor gemeten eindpunten zoals het baarmoedergewicht 
mogelijk veranderen, met name bij de onvolgroeid-methode (33). Voor ­
afgaand aan het onderzoek moet daarom elk te gebruiken medium worden getest tegen controles zonder media. De teststoffen kunnen worden opgelost 
in een minimale hoeveelheid 95 % ethanol of andere geschikte oplosmid ­
delen en verdund in het testmedium tot de eind-werkconcentraties. De toxische kenmerken van het oplosmiddel moeten bekend zijn en moeten worden getest in een aparte controlegroep met alleen oplosmiddel. Als de 
teststof als stabiel wordt beschouwd, kan het oplossen van de teststof wor ­
den bevorderd door voorzichtig verwarmen en krachtig mechanisch roeren. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald. Als de teststof stabiel is voor de duur van het onderzoek, kan van de teststof één 
startaliquot worden bereid, waaruit de gespecificeerde doseringsverdunnin ­
gen dagelijks worden bereid.
 
39. De toedieningstijdstippen hangen af van het gebruikte model (zie punt 29 
voor het onvolgroeid-model en punt 30 voor het ovx-volwassen-model). 
Onvolgroeide vrouwelijke ratten krijgen de teststof dagelijks toegediend, op drie opeenvolgende dagen. Een driedaagse behandeling wordt eveneens aanbevolen voor vrouwelijke ratten die ovariëctomie hebben ondergaan, 
maar langere blootstellingen zijn aanvaardbaar en kunnen de detectie van 
zwak actieve stoffen verbeteren. Met vrouwelijke muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, moet voor sterke oestrogeenagonisten een toedienings ­
duur van drie dagen voldoende zijn zonder dat verlenging tot zeven dagen 
significant voordeel oplevert. Dit verband werd echter niet aangetoond voor 
zwakke oestrogenen in het valideringsonderzoek (16), zodat de dosering moet worden verlengd tot 7 opeenvolgende dagen bij ovx-volwassen mui ­
zen. De dosis moet elke dag op hetzelfde tijdstip worden toegediend. Zo 
nodig moeten de doses worden aangepast om het dosisniveau per lichaams ­
gewicht van het dier constant te houden (bv. mg teststof per kg lichaams ­
gewicht per dag). Variatie van het testvolume op basis van lichaamsgewicht moet tot het minimum beperkt worden door de concentratie van de doseer ­
oplossing zodanig aan te passen, dat per lichaamsgewicht een constant 
volume wordt gegeven bij alle dosisniveaus en voor elke toedieningsweg.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Indien de teststof via een maagsonde wordt toegediend, moet dit in één 
enkele dosis dagelijks gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of 
een geschikte intubatiecanule. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. De plaatse ­
lijke richtlijnen voor dierverzorging moeten in acht worden genomen, maar 
het volume mag niet groter zijn dan 5 ml/kg lichaamsgewicht, tenzij het om 
een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 10 ml/kg lichaamsgewicht worden gebruikt.
 
41. Wordt de teststof toegediend via subcutane injectie, dan moet dit dagelijks 
gebeuren in een enkele dosis. Doses moeten met een steriele naald (bv. 23 of 25 gauge) en een tuberculinespuit worden toegediend in de 
dorso-scapulaire of lumbale regio. Eventueel kan de injectieplaats worden 
geschoren. Eventueel verlies, weglekken op de injectieplaats of onvolledige toediening moet worden opgetekend. Het totale volume dat per rat per dag wordt geïnjecteerd mag niet groter zijn dan 5 ml/kg lichaamsgewicht, ver ­
deeld over 2 injectieplaatsen, tenzij het om een waterige oplossing gaat: in 
dat geval mag 10 ml/kg lichaamsgewicht worden gebruikt.
 
Observaties  
Algemene en klinische observaties  
42. Algemene klinische observaties moeten ten minste eenmaal per dag worden 
verricht en vaker wanneer verschijnselen van toxiciteit worden waargeno ­
men. De observaties moeten bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip plaats ­
vinden en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten 
effecten na toediening. Alle dieren moeten worden geobserveerd op ziekte ­
verschijnselen, sterfte en algemene klinische verschijnselen zoals verande ­
ringen in gedrag, huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uit ­
scheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, recht opstaan van 
het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon 
ademhalingspatroon.  
Lichaamsgewicht en consumptie van voer  
43. Alle dieren moeten dagelijks worden gewogen op 0,1 g nauwkeurig, te 
beginnen vlak voor de behandeling start, d.w.z. wanneer de dieren over de groepen worden verdeeld. Eventueel kan de hoeveelheid voer die tijdens de behandelperiode geconsumeerd wordt, per kooi gemeten worden door de 
voerbak te wegen. De voerconsumptiegegevens moeten worden genoteerd 
in gram per rat per dag.
 
Excisie van de baarmoeder en gewichtsbepaling  
44. Vierentwintig uur na de laatste behandeling worden de ratten op humane 
wijze gedood. In het ideale geval wordt de volgorde van obductie gerando ­
miseerd over de groepen ter voorkoming van rechtstreeks verloop in de volgorde waarin de dosisgroepen afgegaan worden, wat de gegevens subtiel 
kan beïnvloeden. Doel van de bioassay is het meten van het gewicht van de 
natte en de drooggedepte baarmoeder. Onder het natte gewicht wordt het gewicht van de baarmoeder en het luminale vocht erin verstaan. Het droog ­
gedepte (‘blotted’) gewicht wordt gemeten nadat de luminale inhoud van de 
baarmoeder is uitgedrukt en verwijderd.
 
45. Vóór de excisie wordt bij onvolgroeide dieren onderzocht of de vagina 
geopend is. De excisie begint met het openen van de buikwand vanaf de 
symphysis pubica. Daarna worden de baarmoederhoorn en eierstokken, in ­
dien aanwezig, losgemaakt van de dorsale buikwand. De blaas en urine ­
leiders worden weggenomen van de ventrale en laterale zijde van de baar ­
moeder en de vagina. De vezelige hechting tussen de endeldarm en de 
vagina wordt losgemaakt tot de overgang van de vaginaopening naar de huid van het perineum kan worden geïdentificeerd. De baarmoeder en va ­
gina worden losgemaakt van het lichaam door insnijding van de vagina ­
wand net boven de overgang tussen de huid van het perineum, zie figuur 2. 
De baarmoeder moet losgemaakt worden van het lichaam door voorzichtig
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
doorsnijden van het baarmoedermesenterium bij het bevestigingspunt ervan 
over de volle lengte van de dorsolaterale zijde van elke baarmoederhoorn. 
Na uitname uit het lichaam moet de baarmoeder snel genoeg worden ver ­
werkt om uitdroging van de weefsels te voorkomen. Gewichtsverlies als gevolg van uitdroging wordt belangrijker bij kleinere weefsels zoals de 
baarmoeder (23). Indien eierstokken aanwezig zijn, worden deze verwijderd 
bij de eileider, waarbij moet worden voorkomen dat het luminale vocht uit de baarmoederhoorn lekt. Na ovariëctomie van het dier moeten de stompjes worden onderzocht op eventueel aanwezig eierstokweefsel. Overmatig vet 
en bindweefsel moeten worden weggesneden. De vagina wordt net onder de 
baarmoederhals verwijderd uit de baarmoeder, zodat de baarmoederhals bevestigd blijft aan het baarmoederlichaam, zie figuur 2.
 
46. Elke baarmoeder moet worden overgebracht in een gewogen houder met 
een unieke code (bv. een petrischaaltje of een kunststof weegschaaltje), 
waarbij er voortdurend op wordt gelet dat vóór het wegen geen uitdroging 
plaatsvindt (plaats bv. filterpapier dat enigszins is bevochtigd met zoutop ­
lossing in de houder). De baarmoeder met luminaal vocht wordt gewogen op 0,1 mg nauwkeurig (nat baarmoedergewicht).
 
47. Elke baarmoeder wordt daarna apart verwerkt om het luminale vocht te 
verwijderen. Beide baarmoederhoornen worden doorboord of in de leng ­
terichting ingesneden. De baarmoeder wordt op een licht bevochtigd fil ­
treerpapier geplaatst (bv. Whatman nr. 3) en voorzichtig uitgedrukt met een twee stuk licht bevochtigd filtreerpapier om het luminale vocht volledig te 
verwijderen. De baarmoeder zonder luminale inhoud wordt gewogen op 0,1 
mg nauwkeurig (gewicht van drooggedepte baarmoeder).
 
48. Het baarmoedergewicht aan het einde kan worden gebruikt om te contro ­
leren of de onvolgroeide intacte rat niet ouder was dan de passende leeftijd. 
De historische gegevens van de door het laboratorium gebruikte rattenstam 
zijn in dit opzicht echter doorslaggevend (zie punt 56 voor de interpretatie van de resultaten).
 
Facultatieve onderzoeken  
49. Na het wegen kan de baarmoeder gefixeerd worden in 10 % neutraal ge ­
bufferd formaline voor histopathologisch onderzoek na haematoxyline-eosine-kleuring (H&E-kleuring). De vagina kan dienovereen ­
komstig onderzocht worden (zie punt 9). Daarnaast kan ter kwantitatieve 
vergelijking morfometrische meting van het endometriumepitheel worden verricht.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Gegevens  
50. De onderzoeksgegevens moeten bestaan uit:  
— het aantal dieren bij aanvang van de test,  
— het aantal en de identiteit van de dieren die dood zijn aangetroffen 
tijdens de test of om humane redenen zijn gedood, samen met de datum 
en het tijdstip van sterfte of humane doding,  
— het aantal en de identiteit van de dieren met verschijnselen van toxiciteit 
en een beschrijving van de waargenomen verschijnselen van toxiciteit, waaronder het tijdstip van ontstaan en de ernst van eventuele toxische 
effecten, en
 
— het aantal en de identiteit van de dieren met letsel en een beschrijving 
van het type letsel.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Per dier moeten gegevens geregistreerd worden over het lichaamsgewicht en 
het gewicht van de natte en de drooggedepte baarmoeder. Er moet gebruik ­
gemaakt worden van eenzijdige statistische analyses voor agonisten om te bepalen of de toediening van een teststof resulteerde in een statistisch significante (p < 0,05) toename van het baarmoedergewicht. Om te testen 
op behandelingsgerelateerde veranderingen in gewicht van de natte en de 
drooggedepte baarmoeder moeten passende statistische analyses worden gedaan. De gegevens kunnen bijvoorbeeld worden beoordeeld door middel van een analyse van covariantie (Ancova) met lichaamsgewicht bij de ob ­
ductie als de covariabele. Voorafgaand aan de gegevensanalyse kan een 
variantie-stabiliserende logaritmische transformatie worden uitgevoerd met de baarmoedergegevens. De Dunnett- en Hsu-test zijn geschikt om van elke dosisgroep paarsgewijze vergelijkingen te maken met mediumcontroles en 
de betrouwbaarheidsintervallen te berekenen. Gestudentiseerde residuplots 
kunnen worden gebruikt om mogelijke uitschieters te detecteren en homo ­
geniteit van variantie te beoordelen. Deze procedures werden toegepast bij het OESO-valideringsprogramma, waarbij gebruik werd gemaakt van het 
PROC GLM in het statistische analysesysteem (SAS Institute, Cary, NC), 
versie 8 (6)(7).
 
52. Een eindverslag moet bestaan uit:  
Testinstelling:  
— de verantwoordelijke medewerkers en hun verantwoordelijkheden met 
betrekking tot het onderzoek,  
— gegevens van de positieve-controletest op baseline en gegevens van 
periodieke positieve controles (zie punten 26 en 27).  
Teststof:  
— karakterisering van teststoffen,  
— fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen,  
— methode en frequentie van de bereiding van verdunningen,  
— alle gegenereerde gegevens over stabiliteit,  
— alle analyses van doseeroplossingen.  
Medium:  
— karakterisering van testmedium (aard, leverancier en partij),  
— motivering van de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).  
Proefdieren:  
— soort en stam en motivering van de keuze ervan,  
— leverancier en specifieke instelling van de leverancier,  
— leeftijd bij levering met geboortedatum,  
— bij onvolgroeide dieren: of het dier geleverd is met moederdier of pleeg ­
moederdier en datum van spening,  
— gedetailleerde gegevens over wijze van acclimatisering van het dier,  
— aantal dieren per kooi,  
— gegevens en methode van identificatie van individuele dieren en 
groepen.  
Testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over randomiseringsproces (d.w.z. de gebruikte 
methode),  
— motivering van de keuze van de dosis,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereikte 
concentraties ervan, stabiliteit en homogeniteit,  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof en motivering 
van de keuze van de blootstellingsweg,  
— voer (naam, type, leverancier, samenstelling en, indien bekend, gehaltes 
aan fyto-oestrogenen),  
— herkomst water (bv. kraanwater of gefiltreerd water) en toevoer (via een 
slang uit een grote tank, in flessen enz.),  
— strooisel (naam, type, leverancier, samenstelling),  
— registratie van kooiomstandigheden, lichtcyclus, kamertemperatuur en 
vochtigheid; reiniging van de ruimte,  
— gedetailleerde beschrijving van obductie en procedures voor gewichts ­
bepaling van de baarmoeder,  
— beschrijving van statistische procedures.  
Resultaten  
Voor elk dier:  
— alle dagelijks gemeten individuele lichaamsgewichten (vanaf toewijzing 
aan groepen tot aan obductie) (op 0,1 g nauwkeurig),  
— leeftijd van elk dier (in dagen, met geboortedag als dag 0) vanaf toe ­
diening van teststof,  
— datum en tijdstip van elke toediening van een dosis,  
— berekend volume en toegediende dosering en observaties van eventuele 
dosisverliezen tijdens of na toediening,  
— dagelijkse registratie van de status van het dier, waaronder relevante 
symptomen en observaties,  
— vermoedelijke doodsoorzaak (indien tijdens het onderzoek stervend of 
dood aangetroffen),  
— datum en tijdstip van om humane redenen doden met tijdsduur tot 
laatste toediening,  
— gewicht van natte baarmoeder (op 0,1 mg nauwkeurig) en eventuele 
observaties van verlies van luminaal vocht tijdens excisie en voorberei ­
ding voor de gewichtsbepaling,  
— gewicht drooggedepte baarmoeder (op 0,1 mg nauwkeurig).  
Voor elke groep dieren:  
— gemiddelde dagelijks gemeten lichaamsgewichten (op 0,1 g nauwkeu ­
rig) en standaarddeviaties (vanaf toewijzing aan groepen tot aan obduc ­
tie), 
— gemiddelde gewichten van natte en van drooggedepte baarmoeder (op 
0,1 mg nauwkeurig) en standaarddeviaties,  
— dagelijkse voerconsumptie (berekend als per dier geconsumeerd gram 
voer), indien gemeten,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— de resultaten van statistische analyses waarbij het gewicht van natte en 
van drooggedepte baarmoeders van behandelde groepen wordt vergele ­
ken met die van de mediumcontrolegroepen, die verder op dezelfde wijze zijn behandeld,
 
— de resultaten van statistische analyse waarbij het totale lichaamsgewicht 
en de toename in lichaamsgewicht van behandelde groepen wordt ver ­
geleken met die van de mediumcontrolegroepen, die verder op dezelfde wijze zijn behandeld.
 
53. Samenvatting van belangrijke richtsnoeren van de testmethode  
Rat Muis  
Dieren  
Stam Vaak gebruikte proefknaagdierstam 
Aantal dieren Minimaal 6 dieren per dosisgroep Aantal groepen Minimaal 2 testgroepen (zie punt 33 voor richtsnoeren) en een 
negatieve-controlegroep 
Zie punten 26 en 27 voor richtsnoeren over 
positieve-controlegroepen  
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
Temp. in verblijfsruimte 22 °C ± 3 °C 
Relatieve vochtigheid 50-60 % en niet lager dan 30 % of hoger dan 70 % 
Dagelijkse lichtcyclus 12 uur licht, 12 uur donker Voer en drinkwater Ad libitum Huisvesting individueel of in groepen van maximaal drie dieren (voor onvol ­
groeide dieren wordt sociale groepshuisvesting aanbevolen) 
Voer en strooisel In voer en strooisel wordt een laag gehalte aan fyto-oestrogenen 
aanbevolen  
Protocol  
Methode Onvolgroeid-methode (d.w.z. 
geen ovariëctomie, verdient de voorkeur) 
Ovx-volwassen-methode (met 
vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan) Ovx-volwassen-methode (met 
vrouwtjes die ovariëctomie heb ­
ben ondergaan) 
Toedieningsleeftijd voor 
onvolgroeide dieren Op z'n vroegst op PND 18 
Toediening moet worden afge ­
rond vóór PND 25 Niet relevant in het kader van 
de huidige testmethode 
Leeftijd van ovariëctomie Tussen 6 en acht weken oud 
Toedieningsleeftijd voor 
dieren die ovariëctomie 
hebben ondergaan Tussen de ovariëctomie en de 
eerste toedieningsdag moet een 
tussenpoos van minimaal 14 dagen worden aangehouden. Tussen de ovariëctomie en de 
eerste toedieningsdag moet een 
tussenpoos van minimaal zeven dagen worden aangehouden. 
Lichaamsgewicht Het lichaamsgewicht mag slechts minimaal en niet meer dan 
± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Rat Muis  
Toediening  
Toedieningsweg Orale maagsonde of subcutane injectie 
Toedieningsfrequentie Dagelijks een enkele dosis Volume voor sonde en in ­
jectie ≤ 5 ml/kg lichaamsgewicht (of maximaal 10 ml/kg lichaams ­
gewicht in geval van waterige oplossingen) (in 2 injectieplaatsen 
voor de subcutane weg) 
Toedieningsduur 3 opeenvolgende dagen voor 
onvolgroeid-model 
Minimaal 3 opeenvolgende da ­
gen voor het ovx-model 7 opeenvolgende dagen voor 
het ovx-model 
Tijdstip van obductie Ongeveer 24 uur na de laatste dosis  
Resultaten  
Positieve respons Statistisch significante toename van het gemiddelde baarmoeder ­
gewicht (nat en/of drooggedept) 
Referentieoestrogeen 17 α-ethinylestradiol
 
RICHTSNOEREN VOOR DE INTERPRETATIE EN ACCEPTATIE VAN 
DE RESULTATEN  
54. In het algemeen moet een test op oestrogene werking worden beschouwd 
als positief als er ten minste bij het hoge dosisniveau een statistisch signi ­
ficante (p < 0,05) toename van het baarmoedergewicht is ten opzichte van 
de oplosmiddelcontrolegroep. Een positief resultaat wordt verder onder ­
steund door bewijs van een vanuit biologisch oogpunt aannemelijk verband tussen de dosis en de grootte van de respons, daarbij rekening houdend met 
het feit dat overlappende oestrogene en anti-oestrogene activiteiten van de 
teststof van invloed kunnen zijn op de vorm van de dosis-responscurve.
 
55. Om de gegevens op betekenisvolle wijze te kunnen interpreteren moet erop 
worden toegezien de maximaal aanvaardbare dosis niet te overschrijden. 
Afname van lichaamsgewicht, klinische verschijnselen en andere bevindin ­
gen moeten met het oog daarop grondig worden beoordeeld.  
56. Een belangrijke overweging voor de acceptatie van de gegevens van de 
uterotrofe bioassay zijn de baarmoedergewichten van de mediumcontro ­
legroep. Hoge controlewaarden kunnen het responsvermogen van de bio ­
assay en het vermogen om zeer zwakke oestrogeenagonisten te detecteren 
negatief beïnvloeden. Overzichtsartikelen en de gegevens die zijn verkregen 
tijdens de validering van de uterotrofe bioassay, wijzen erop dat gevallen van hoge controlegemiddelden niet spontaan optreden, in het bijzonder bij onvolgroeide dieren (2)(3)(6)(9). Omdat het baarmoedergewicht van onvol ­
groeide ratten afhankelijk is van veel variabelen, zoals stam of lichaams ­
gewicht, kan er geen beslissende bovengrens voor het baarmoedergewicht worden gegeven. Als richtsnoer moeten resultaten als verdacht worden be ­
schouwd als gewichten van drooggedepte baarmoeders bij onvolgroeide 
controleratten tussen 40 en 45 mg liggen, en baarmoedergewichten van 
meer dan 45 mg kunnen een reden zijn de test opnieuw te doen. Dit moet echter per geval worden bekeken (3)(6)(8). Als volwassen ratten worden getest waarbij onvolledige ovariëctomie heeft plaatsgevonden, blijft 
er eierstokweefsel achter dat endogeen oestrogeen kan produceren en de 
regressie van het baarmoedergewicht kan vertragen.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Gewichten van drooggedepte baarmoeders in een mediumcontrolegroep die 
minder dan 0,09 % van het lichaamsgewicht uitmaken voor onvolgroeide 
vrouwelijke ratten en minder dan 0,04 % voor jongvolwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan, lijken aanvaardbare resultaten te geven (zie tabel 31 (2)). Als de procentuele baarmoedergewichten in de controlegroep 
hoger zijn dan de bovengenoemde percentages, moeten verscheidene facto ­
ren nader onderzocht worden, waaronder de leeftijd van de dieren, correcte uitvoering van de ovariëctomie, fyto-oestrogenen in voer enz., en moet een negatief testresultaat (geen aanwijzingen voor oestrogene activiteit) met 
voorzichtigheid worden gebruikt.
 
58. Historische gegevens voor mediumcontrolegroepen moeten in het laborato ­
rium worden behouden. Historische gegevens voor responsen op positieve referentieoestrogenen, zoals 17a-ethinylestradiol, moeten eveneens in het 
laboratorium worden behouden. Laboratoria kunnen ook de respons op 
bekende zwakke oestrogeenagonisten testen. Al deze gegevens kunnen wor ­
den vergeleken met beschikbare gegevens (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) om te con ­
troleren of de door het laboratorium toegepaste methoden voldoende gevoe ­
lig zijn.
 
59. De gewichten van drooggedepte baarmoeders vertoonden minder variabili ­
teit in de loop van het OESO-valideringsonderzoek dan de gewichten van 
de natte baarmoeders (6)(7). Een significante respons in een van beide 
testen wijst er echter op dat de teststof positief is voor oestrogene activiteit.  
60. Hoewel de uterotrofe respons niet geheel van oestrogene oorsprong is, moet 
een positief resultaat van de uterotrofe bioassay doorgaans geïnterpreteerd 
worden als een aanwijzing voor mogelijke oestrogene activiteit in vivo en 
moet op basis hiervan actie worden ondernomen om meer duidelijkheid te verschaffen (zie punt 9 en het „Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen”, aanhangsel 2).
 
Figuur 1  
Schematisch diagram van de operatieve verwijdering van de 
eierstokken
  
De ingreep begint met het openen van de dorso-laterale buikwand op het 
middelpunt tussen de inferiore ribgrens en de darmbeenkam (crista iliaca), en enkele millimeters lateraal aan de laterale marge van de lumbale spier. 
De eierstokken bevinden zich in de buikholte. Op een aseptisch vlak wor ­
den de eierstokken vervolgens fysiek verwijderd uit de buikholte: er wordt een ligatuur geplaatst tussen de eierstok en de baarmoeder om bloedingen onder controle te houden en de eierstok wordt losgemaakt door middel van 
een incisie boven de ligatuur bij de verbinding van de eileider met elke 
baarmoederhoorn. Nadat is vastgesteld dat er geen grote bloedingen meer zijn, moet de buikwand worden gesloten met een hechting en de huid worden gesloten met bv. nietjes of hechtdraad. Men moet de dieren laten 
herstellen en het baarmoedergewicht gedurende minimaal 14 dagen vóór 
gebruik de tijd geven voor regressie.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figuur 2  
De verwijdering en voorbereiding van de baarmoederweefsels voor de 
gewichtsbepaling
  
De ingreep begint met het openen van de buikwand bij de symphysis pubica. 
Daarna worden elke eierstok, indien aanwezig, en de baarmoederhoorn losge ­
maakt van de dorsale buikwand. De blaas en urineleiders worden weggenomen 
van de ventrale en laterale zijde van de baarmoeder en de vagina. De vezelige hechting tussen de endeldarm en de vagina wordt losgemaakt tot de overgang van de vaginaopening naar de huid van het perineum kan worden geïdentificeerd. 
De baarmoeder en vagina worden losgemaakt van het lichaam door insnijding 
van de vaginawand net boven de overgang tussen de huid van het perineum, zie figuur. De baarmoeder moet losgemaakt worden van het lichaam door voorzich ­
tig doorsnijden van het baarmoedermesenterium bij het bevestigingspunt ervan 
over de volle lengte van de dorsolaterale zijde van elke baarmoederhoorn. Na 
uitname uit het lichaam wordt het overmatige vet en bindweefsel weggesneden. Indien eierstokken aanwezig zijn, worden deze verwijderd bij de eileider, waarbij moet worden voorkomen dat het luminale vocht uit de baarmoederhoorn lekt. Na 
ovariëctomie van het dier moeten de stompjes worden onderzocht op eventueel 
aanwezig eierstokweefsel. De vagina wordt net onder de baarmoederhals ver ­
wijderd uit de baarmoeder, zodat de baarmoederhals bevestigd blijft aan het baarmoederlichaam, zie figuur. De baarmoeder kan dan worden gewogen.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Anti-oestrogene werking  is het vermogen van een stof om in een zoogdier ­
organisme de werking van 17b-estradiol te onderdrukken.  
Stof betekent een stof of mengsel.  
Geboortedatum  is postnatale dag 0.  
Dosering  is een algemene term die de dosis, de frequentie en de duur van de 
toediening omvat.  
Dosis  isde toegediende hoeveelheid teststof. Voor de uterotrofe bioassay wordt 
de dosis uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van 
het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag).  
Maximaal verdraagbare dosis (MTD)  is de grootste hoeveelheid van een stof 
die bij inbrenging in het lichaam geen proefdieren doodt (aangeduid als LD  0 ) 
(IUPAC, 1993).  
Oestrogene werking  is het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme 
als 17b-estradiol te werken.  
Postnatale dag  x is de x'e levensdag na de geboortedag.  
Gevoeligheid  is het deel van alle positieve/werkzame stoffen dat door de test op 
correcte wijze wordt ingedeeld. Het is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categorale resultaten oplevert, en is een belangrijke overweging 
bij de beoordeling van de relevantie van een testmethode.
 
Specificiteit  is het deel van alle negatieve/niet-werkzame stoffen dat door de test 
op correcte wijze wordt ingedeeld. Het is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categorale resultaten oplevert, en is een belangrijke over ­
weging bij de beoordeling van de relevantie van een testmethode.
 
Teststof  betekentalle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.  
Uterotroof  is een term waarmee een positieve invloed op de groei van baar ­
moederweefsels wordt beschreven.  
Validering  is een wetenschappelijke methode die erop gericht is om de operati ­
onele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de be ­
trouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Aanhangsel 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 OPMERKINGEN BIJ HET KADER  
Opmerking 1:  het is mogelijk om op alle niveaus in- en uit te stappen. Dit 
hangt af van de soort informatie waaraan behoefte bestaat voor 
gevaar- en risicobeoordelingsdoeleinden.  
Opmerking 2:  in niveau 5 moet de ecotoxicologie eindpunten omvatten die 
duiden op mechanismen van schadelijke effecten en potentiële schade voor de populatie.
 
Opmerking 3:  als een multimodaal model enkele van de testen met een enkel 
eindpunt omvat, vervangt dat model het gebruik van deze testen met een enkel eindpunt.
 
Opmerking 4:  de beoordeling van elke stof moet per geval plaatsvinden, reke ­
ning houdend met alle beschikbare informatie en de functie van 
de niveaus van het kader.  
Opmerking 5:  het kader moet op dit moment niet worden beschouwd als alom ­
vattend. Op niveaus 3, 4 en 5 voorziet het kader in testen die al beschikbaar zijn of waarvan de validering nog loopt. De laatst ­
genoemde testen zijn daarom als voorlopig opgenomen. Na de 
ontwikkeling en validering ervan worden deze testen formeel toegevoegd aan het kader.
 
Opmerking 6:  niveau 5 moet niet worden beschouwd als een niveau dat alleen 
beslissende testen omvat. De in dat niveau opgenomen testen 
worden beschouwd als bij te dragen aan de algemene gevaar- 
en risicobeoordeling.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
LITERATUUR  
1. OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
2. OESO (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bio ­
assay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Tes ­
ting and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
3. Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Ute ­
rotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Pro ­
tocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.  
4. OESO (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental 
Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.
 
5. Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785-94.  
6. OESO (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
7. Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549
 
8. Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.
 
9. Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.  
10. Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolife ­
rative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology  113: 582-587.  
11. Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology  117: 2229-2237.
 
12. Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleisch ­
mann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens. SÖFW-J.  127: 10-15.  
13. Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science  118: 650-651.  
14. Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxi ­
col. 13:425-427.  
15. Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo res ­
ponses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec.  
106:369-373.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
16. OESO (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Ute ­
rotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
17. Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157.  
18. Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.
 
19. Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620.
 
20. Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, For ­
sythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485.  
21. Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347.  
22. Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381- 
393.
 
23. Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601.
 
24. OESO (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
25. OESO (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
26. OESO (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
27. Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320-333.  
28. Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33-41.  
29. Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fun ­
dam. Appl. Toxicol. 34: 288-305.  
30. Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284-291.  
31. OESO (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Parijs.  
32. Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Aca ­
demic Press.  
33. Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for en ­
docrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
34. Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184.  
35. Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808.  
36. Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Eva ­
luation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in 
vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.  
37. OESO (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Pro ­
cedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.
 
38. Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 
22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor we ­
tenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  HERSHBERGER-BIOASSAY BIJ RATTEN: EEN KORTLOPENDE 
SCREENINGSTEST OP (ANTI)ANDROGENE EIGENSCHAPPEN  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 441 (2009) van de 
OESO. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande richtlijnen te herzien en nieuwe richtlijnen te ontwikkelen voor het screenen op en testen van potentiële hormoonontregelaars (1), en heeft zij daaraan een hoge pri ­
oriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het ontwikkelen van 
een testrichtlijn voor de Hershberger-bioassay bij ratten. Na enkele decennia gebruik in de farmaceutische industrie werd deze assay voor het eerst in 1962 gestandaardiseerd door een officiële commissie van deskundigen als 
screening op androgene stoffen (2). Van 2001-2007 heeft de 
Hershberger-bioassay bij de rat een uitgebreid valideringsprogramma onder ­
gaan waaronder de samenstelling van een Background Review Document (23), samenstelling van een gedetailleerd document over methoden (3), 
ontwikkeling van een gids voor sectie (21) en de uitvoering van uitgebreide 
studies binnen en tussen laboratoria om de betrouwbaarheid en reproduceer ­
baarheid van de bioassay aan te tonen. Deze valideringsstudies werden 
verricht met een krachtig referentieandrogeen (testosteronpropionaat (TP)), 
twee krachtige synthetische androgenen (trenbolonacetaat en methyltestos ­
teron), een krachtig antiandrogeen farmaceuticum (flutamide), een krachtige remmer van de synthese (finasteride) van het natuurlijke androgeen (di ­
hydrotestosteron-DHT), verschillende zwak antiandrogene pesticiden (linu ­
ron, vinclozoline, procymidon, p,p' DDE), een krachtige 5 α-reductaserem ­
mer (finasteride) en twee bekende negatieve stoffen (dinitrofenol en nonyl ­
fenol) (4) (5) (6) (7) (8). Deze testmethode is het resultaat van de lang ­
durige ervaring met de bioassay en de ervaring die is opgedaan tijdens het 
valideringstestprogramma en de daarbij verkregen resultaten.
 
2. De Hershberger-bioassay is een kortlopende in-vivoscreeningstest op weef ­
sel van de mannelijke secundaire geslachtsorganen. De bepaling is oor ­
spronkelijk ontwikkeld in de jaren 1930; na aanpassing in de jaren 1940 
konden ook op androgenen reagerende spieren uit de mannelijke geslachts ­
organen worden gebruikt. (2) (9-15). In de jaren 1960 werden meer dan 700 mogelijke androgenen beoordeeld aan de hand van de gestandaardiseerde 
versie van het protocol (2) (14), en gebruik van de bepaling voor zowel 
androgenen als antiandrogenen werd in de jaren 1960 als standaard be ­
schouwd (2) (15). De huidige bioassay is gebaseerd op de veranderingen 
in gewicht van vijf androgeenafhankelijke weefsels bij de gecastreerde pe ­
ripuberale mannetjesrat. Aan de hand van de bepaling wordt het vermogen van de stof beoordeeld om biologische activiteiten teweeg te brengen die overeenkomen met androgeenagonisten, -antagonisten of 5 α-reductaserem ­
mers. De vijf androgeen-afhankelijke doelweefsels bij deze testmethode zijn 
ventrale prostaat (VP), zaadblaasje (seminal vesicle — SV) (plus vloeistof ­
fen en coagulans uitscheidende klieren), m.levator ani-bulbocavernosus (LABC), paarsgewijze Cowperse klieren (COW) en de glans penis (GP). 
Bij de gecastreerde peripuberale mannetjesrat reageren al deze vijf weefsels 
op androgenen met een toename in absoluut gewicht. Als deze zelfde weefsels gestimuleerd worden om zwaarder te worden door toediening van een krachtig referentieandrogeen, reageren deze vijf weefsels alle op 
antiandrogenen met een afname in absoluut gewicht. Het primaire model 
voor de Hershberger-bioassay is het chirurgisch gecastreerde peripuberale mannetjesdier, dat in fasen 1, 2 en 3 van het Hershberger-valideringspro ­
gramma gevalideerd is.
 
3. De Hershberger-bioassay dient als een mechanistische in-vivoscreeningstest 
voor androgeenagonisten, androgeenantagonisten en 5 α-reductaseremmers 
en de toepassing ervan moet worden gezien in de context van het „Con ­
ceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoon ­
ontregelende stoffen”, aanhangsel 2). In dit conceptuele kader bevindt de 
Hershberger-bioassay zich op niveau 3 als een in-vivobepalingdie gegevens  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
oplevert over één endocrien mechanisme, te weten (anti)androgeniteit. De 
bedoeling is dat de assay wordt opgenomen in een reeks in-vitro- en 
in-vivotesten voor de identificatie van stoffen die mogelijk interactie ver ­
tonen met het hormoonsysteem, op basis waarvan uiteindelijk beoordelingen van het gevaar en het risico voor de gezondheid van de mens of het milieu 
tot stand komen.
 
4. Vanwege zorgen om dierwelzijn bij de castratieprocedure werd gestreefd 
naar een alternatief model voor de Hershberger-bioassay met het intact 
(ongecastreerd) gestimuleerd, pas gespeend mannetjesdier om de castratie ­
stap te kunnen vermijden. De testmethode met het gestimuleerd pas ge ­
speend mannetjesdier werd gevalideerd (24); maar in de valideringsstudies leek de versie met het gespeende dier van de Hershberger-bioassay niet in 
staat te zijn om effecten van zwakke antiandrogenen op het gewicht van 
androgeenafhankelijke organen bij de onderzochte doses consistent te de ­
tecteren. Daarom is deze niet in deze testmethode opgenomen. Omdat de toepassing ervan echter niet alleen het dierwelzijn ten goede kan komen 
maar ook informatie kan opleveren over andere werkingsmechanismen, is 
deze beschikbaar in OESO-leidraad nr. 115 (25).
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN  
5. Androgeenagonisten en -antagonisten fungeren als liganden voor de androg ­
eenreceptor en kunnen de door de receptor gestuurde gentranscriptie acti ­
veren resp. remmen. Daarnaast remmen sommige stoffen in bepaalde an ­
drogene doelweefsels de omzetting van testosteron in het krachtigere na ­
tuurlijke androgeen dihydrotestosteron (5 α-reductaseremmers). Deze stoffen 
kunnen gevaar voor de gezondheid opleveren, waaronder effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. Er bestaat daarom behoefte aan een snelle methode om een stof te beoordelen en te evalueren als een mogelijke 
androgeenagonist of -antagonist of 5 α-reductaseremmer. Hoewel de affini ­
teit van een ligand voor een androgeenreceptor, gemeten door receptorbin ­
ding of transcriptionele activatie van reportergenen in vitro wel informatief is, is het niet de enige determinant van mogelijk gevaar. Andere determi ­
nanten zijn metabole activatie en deactivatie als het in het lichaam komt, 
chemische verdeling naar doelweefsels, en klaring uit het lichaam. Daarom moet de mogelijke activiteit van een stof in vivo onder relevante omstan ­
digheden en blootstelling worden gescreend. Beoordeling in vivo is minder 
essentieel als de kenmerken van de stof voor wat betreft absorptie, distri ­
butie, metabolisme en eliminatie (ADME) bekend zijn. Androgeenafhanke ­
lijke weefsels reageren op stimulering door androgenen met een snelle en krachtige groei, vooral bij gecastreerde peripuberale mannetjesratten. 
Knaagdiersoorten, in het bijzonder de rat, worden bovendien veel gebruikt 
in toxiciteitsonderzoeken naar karakterisering van gevaren. Daarom zijn de bepaling met de gecastreerde peripuberale rat en de vijf doelweefsels van deze bepaling geschikt voor de screening in vivoop androgeenagonisten en 
-antagonisten en 5 α-reductaseremmers.
 
6. Deze testmethode is gebaseerd op de protocols die in de 
OESO-valideringsstudie zijn gebruikt waarvan is aangetoond dat zij in stu ­
dies binnen en tussen laboratoria betrouwbaar en reproduceerbaaar zijn 
(4)(5)(6)(7)(8). In deze testmethode worden procedures voor zowel andro ­
genen als antiandrogenen gepresenteerd.  
7. Hoewel er tussen de verschillende laboratoria enige variatie was in de 
gebruikte dosis TP om antiandrogenen in het Hershberger Bioassay-valideringsprogramma van de OESO te detecteren (0,2 versus 0,4 mg/kg/d, subcutane injectie), was er weinig verschil tussen deze twee 
protocolvarianten in het vermogen om zwakke of sterke antiandrogene ac ­
tiviteit te detecteren. Het is evenwel duidelijk dat de dosis TP niet zo hoog mag zijn dat de effecten van zwakke androgeenreceptor (AR)-antagonisten worden geblokkeerd of zo laag dat de androgene weefsels een geringe 
groeirespons vertonen, zelfs zonder gelijktijdige toediening van 
antiandrogenen.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. De groeirespons van de individuele androgeenafhankelijke weefsels is niet 
geheel van androgene oorsprong; stoffen anders dan androgeenagonisten 
kunnen ook het gewicht van bepaalde weefsels veranderen. Maar de groei ­
respons van verschillende weefsels tegelijkertijd vormt bewijs voor een meer androgeenspecifiek mechanisme. Zo kunnen hoge doses van krachtige 
oestrogenen het gewicht van de zaadblaasjes verhogen, zonder dat de an ­
dere androgeenafhankelijke weefsels in de bepaling op soortgelijke wijze reageren. Antiandrogene stoffen kunnen als androgeenreceptorantagonist of 5α-reductaseremmer fungeren. 5 α-reductaseremmers hebben een variabel 
effect omdat de omzetting in het krachtigere dihydrotestosteron per weefsel 
verschilt. Antiandrogenen die 5 α reductase remmen, zoals finasteride, heb ­
ben een meer uitgesproken effect in de ventrale prostaat dan andere weef ­
sels in vergelijking met een krachtige AR-antagonist, zoals flutamide. Dit 
verschil in weefselrespons kan worden gebruikt om te differentiëren tussen 
door AR en 5 α — reductase gemedieerde werkingsmechanismen. Daarnaast 
is de androgeenreceptor evolutionair gerelateerd aan de receptor van andere steroïdhormonen; sommige andere hormonen kunnen zich bij toediening in 
hoge, suprafysiologische doseringen binden aan TP en de groeibevorde ­
rende effecten ervan antagoneren (13). Bovendien is het plausibel dat een verhoogd steroïdmetabolisme en een daaropvolgende verlaging van het se ­
rumtestosteron de groei van androgeenafhankelijke weefsels kan verminde ­
ren. Daarom moet een positief resultaat van de Hershberger-bioassay nor ­
maliter worden beoordeeld op basis van gewicht van bewijs, zoals uit bepalingen in vitro, zoals de AR- en estrogeenreceptor (ER)-bindingsassays en corresponderende transcriptionele activatieassays, of uit andere bepalin ­
gen in vivo die soortgelijke androgene doelweefsels onderzoeken, zoals de 
male pubertal assay, 15-day intact adult male assay, of 28-day of 90-day repeat dose studies.
 
9. De ervaring leert dat xenobiotische androgenen zeldzamer zijn dan xeno ­
biotische antiandrogenen. De verwachting is dan dat de Hershberger-bioassay het meest wordt gebruikt voor de screening op antian ­
drogenen. Niettemin kan de procedure om op androgenen te testen eventu ­
eel worden aanbevolen voor steroïde of steroïd-achtige stoffen of voor stoffen waarvoor een indicatie van een mogelijk androgeen effect verkregen is uit methoden in niveau 1 of 2 van het conceptuele kader (aanhangsel 2). 
Zo ook kunnen bij bepalingen in niveau 5 bijwerkingen in samenhang met 
(anti)androgene profielen worden waargenomen, waardoor het nodig is om te beoordelen of een stof via een endrocrien werkingsmechanisme werkt.
 
10. Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de 
plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen; de hieronder beschreven zorg en behandeling zijn minimale normen en zijn 
ondergeschikt aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het 
Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (26). De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behan ­
deling van dieren opgesteld (17).
 
11. Zoals geldt voor elke bioassay bij proefdieren, moet de noodzaak van de 
uitvoering van dit onderzoek zorgvuldig worden overwogen. In basis kun ­
nen er twee redenen voor een dergelijk besluit zijn:  
— hoge potentiële blootstelling (niveau 1 van het conceptueel kader) of 
aanwijzingen voor (anti)androgeniteit in bepalingen in vitro (niveau 2) die onderzoek rechtvaardigen of dergelijke effecten ook in vivo kunnen optreden,
 
— effecten die passen bij (anti)androgeniteit bij niveau 4- of 5-tests in vivo 
die onderzoek naar het specifieke werkingsmechanisme rechtvaardigen, 
bijvoorbeeld om vast te stellen of de effecten het gevolg waren van een 
(anti)androgeen mechanisme.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. De in deze testmethode gebruikte definities staan in aanhangsel 1.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
13. De Hershberger-bioassay verkrijgt haar gevoeligheid door mannetjesdieren 
te gebruiken met minimale androgeenproductie. Dit wordt bereikt door gebruik van gecastreerde mannetjesdieren mits voldoende tijd na castratie 
wordt gelaten zodat de doelweefsels kunnen afnemen naar een minimaal en 
uniform baselinegewicht. Als dan bij screening op mogelijke androgene activiteit er lage endogene concentraties circulerende androgenen zijn, wordt de hypothalamus-hypofyse-gonadeas weerhouden om te compenseren via 
een terugkoppelingsmechanisme, is het vermogen van de weefsels om te 
reageren maximaal, en is de variabiliteit in weefselgewicht bij aanvang minimaal. Bij screening op mogelijke antiandrogene activiteit kan een con ­
sistente toename in weefselgewicht worden bereikt als de weefsels worden 
gestimuleerd door een referentieandrogeen. Daarom vereist de 
Hershberger-bioassay slechts 6 dieren per dosisgroep terwijl andere bepa ­
lingen met intacte puberale of volwassen mannetjesdieren vaak 15 man ­
netjesdieren per dosisgroep gebruiken.
 
14. Castratie van peripuberale mannetjesratten moet op passende wijze plaats ­
vinden met goedgekeurde anesthetica en aseptische techniek. Gedurende de eerste paar dagen na chirurgie moeten pijnstillers worden toegediend om 
postchirurgische pijn te elimineren. Castratie verhoogt de precisie waarmee 
de bepaling zwakke androgenen en antiandrogenen detecteert door compen ­
satoire endocriene terugkoppelingsmechanismen te elimineren die in het intacte dier aanwezig zijn en die de effecten van toegediende androgenen 
en antiandrogenen kunnen afzwakken, en door de grote interindividuele 
variabiliteit in het serumtestosteron te elimineren. Daardoor wordt het aantal benodigde dieren voor screening op deze endocriene activiteiten door cas ­
tratie verminderd.
 
15. Bij screening op mogelijke androgene activiteit wordt de teststof dagelijks 
via een maagsonde of subcutane (sc) injectie toegediend gedurende een periode van tien opeenvolgende dagen. Teststoffen worden toegediend aan minimaal twee behandelingsgroepen met proefdieren met één doserings ­
niveau per groep. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie 
verricht op de dieren. Een statistisch significante verhoging in twee of meer doelorgaangewichten in de teststofgroep in vergelijking met de medi ­
umcontrolegroep wijst erop dat de teststof positief is voor mogelijk andro ­
gene activiteit (zie paragraaf 60). Androgenen zoals trenbolon waarbij 5 α- 
reductie niet kan plaatsvinden, hebben een meer uitgesproken effect op de LABC en GP dan TP, maar alle weefsels moeten meer groei vertonen.
 
16. Bij de screening op mogelijke antiandrogene activiteit wordt de teststof 
dagelijks toegediend via maagsonde of subcutane injectie gedurende een periode van tien opeenvolgende dagen samen met dagelijkse doses TP (0,2 of 0,4 mg/kg/d) per sc injectie. In het valideringsprogramma is vast ­
gesteld dat hetzij 0,2 hetzij 0,4 mg/kg/d TP gebruikt kan worden, omdat 
beide effectief waren voor het detecteren van antiandrogenen; daarom moet voor de bepaling slechts één dosis worden geselecteerd. Trapsgewijs stij ­
gende doses van de teststof worden toegediend aan minimaal drie behan ­
delingsgroepen met proefdieren met één dosisniveau per groep. Ongeveer 
24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Een sta ­
tistisch significante afname in twee of meer doelorgaangewichten in de groepen met de teststof en TP in vergelijking met de controlegroep met 
TP alleen wijst erop dat de teststof positief is voor mogelijke antiandrogene 
activiteit (zie paragraaf 61).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Selectie van diersoort en stam  
17. Sinds de jaren 1930 wordt de rat standaard gebruikt in de 
Hershberger-bioassay. Hoewel het biologisch plausibel is dat zowel de rat 
als de muis soortgelijke responsen zouden vertonen, is op basis van 70 jaar ervaring met het rattenmodel de rat de geprefereerde diersoort voor de Hershberger-bioassay. Daarnaast, omdat gegevens uit de 
Hershberger-bioassay aan de basis kunnen staan van een langdurig multi ­
generationeel onderzoek, is het op deze manier mogelijk om dieren uit dezelfde diersoort, stam en bron te gebruiken in beide studies.
 
18. In dit protocol kunnen laboratoria de in de bepaling te gebruiken rattenstam 
selecteren, welke over het algemeen de stam moet zijn die meestal door het deelnemende laboratorium wordt gebruikt. Veel in het laboratorium ge ­
bruikte rattenstammen kunnen worden gebruikt; maar stammen die aanmer ­
kelijk later dan na 42 dagen volwassen worden mogen niet worden gebruikt omdat bij castratie van deze mannetjesdieren op een leeftijd van 42 dagen mogelijk niet het gewicht van de glans penis gemeten kan worden, wat 
alleen kan worden gedaan nadat de voorhuid van de penisschacht terug ­
getrokken is. Daarom mogen stammen die zijn verkregen uit de Fisher 344- rat, niet worden gebruikt, behalve in uitzonderlijke gevallen. De Fisher 344- rat heeft een ander tijdsverloop van de seksuele ontwikkeling dan andere 
vaker gebruikte stammen zoals Sprague Dawley- of Wistar-stammen (16). 
Als een dergelijke stam gebruikt gaat worden, moet het laboratorium deze op iets hogere leeftijd castreren en de gevoeligheid van de te gebruiken stam kunnen aantonen. Het laboratorium moet een heldere motivering voor 
de keuze van de rattenstam kunnen geven. Waar de screeningstest vooraf 
kan gaan aan een onderzoek met herhaalde orale doses, een voortplantings- en ontwikkelingsonderzoek, of een langdurig onderzoek, moeten in alle onderzoeken bij voorkeur dieren uit dezelfde stam en bron worden gebruikt.
 
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
19. Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met alle plaatselijke nor ­
men voor de verzorging van proefdieren. Deze beschrijvingen van de ver ­
zorging en behandeling zijn minimumnormen, die ondergeschikt zijn aan striktere lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming 
van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (26). De 
temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C te zijn (met een spreiding van ± 3 °C). De relatieve luchtvochtigheid moet minimaal 30 % zijn en bij voorkeur niet hoger zijn dan 70 %, behalve bij reiniging van de ruimte. 
Er moet worden gestreefd naar een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er 
moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht, met een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.
 
20. De dieren samen onderbrengen is te verkiezen boven isolatie gezien de 
jonge leeftijd van de dieren en het feit dat de ratten sociale dieren zijn. Met twee of drie dieren per kooi wordt overbevolking en daarmee samen ­
hangende stress voorkomen die de hormonale controle van de ontwikkeling 
van de weefsels van de secundaire geslachtsorganen kan verstoren. De kooien worden grondig gereinigd om eventuele verontreinigingen te ver ­
wijderen en zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van 
de kooi tot een minimum worden beperkt. Met kooien van adequate om ­
vang (~2 000 vierkante centimeter) wordt overbevolking voorkomen.
 
21. Elk dier moet door middel van een humane methode individueel geïdenti ­
ficeerd worden (bv. oormerk of identificatieplaatje). De identificatiemethode 
moet worden vastgelegd.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Proefdiervoer en drinkwater moeten ad libitum worden verstrekt. Laborato ­
ria die de Hershberger-bioassay uitvoeren moeten het laboratoriumvoer ge ­
bruiken dat zij normaliter in hun onderzoek van stoffen gebruiken. In de valideringsstudies van de bioassay werden geen effecten of variabiliteit waargenomen die aan het voer waren toe te schrijven. Het gebruikte voer 
wordt vastgelegd en een monster van het laboratoriumvoer moet worden 
bewaard voor eventuele analyse in de toekomst.
 
Prestatiecriteria voor androgeenafhankelijk orgaangewicht  
23. Tijdens de valideringsstudie waren er geen aanwijzingen dat de afname van 
het lichaamsgewicht van invloed was op toename of afname van de groei 
van het gewicht van doelweefsels (d.w.z. die in dit onderzoek gewogen moeten worden)).
 
24. Bij de verschillende rattenstammen die met succes in het valideringspro ­
gramma zijn gebruikt, is het androgeenafhankelijke orgaangewicht bij de zwaardere rattenstammen hoger dan bij de lichtere stammen. Daarom wordt in de prestatiecriteria van de Hershberger-bioassay geen absoluut verwacht 
orgaangewicht genoemd voor positieve en negatieve controles.
 
25. Omdat het Variatiecoëfficiënt (CV) van een weefsel een omgekeerde even ­
redigheid vertoont met statistisch onderscheidingsvermogen, zijn de presta ­
tiecriteria voor de Hershberger-bioassay gebaseerd op maximale CV-waarden voor elk weefsel (tabel 1). De CV's zijn verkregen uit de OESO-valideringsstudies. In het geval van negatieve resultaten moeten la ­
boratoria de CV's voor de controlegroep en de met de hoge doses behan ­
delde groep onderzoeken om vast te stellen of de maximale CV-prestatiecriteria overschreden zijn.
 
26. Het onderzoek wordt herhaald als: 1) drie of meer van de tien mogelijke 
individuele CV's in de controlegroep en de met de hoge doses behandelde groep de maxima te boven gaan die voor agonisten- en antagonistenstudies zijn vastgesteld in tabel 1, en 2) minstens twee doelweefsels marginaal 
insignificant zijn, dat wil zeggen p-waarden tussen 0,05 en 0,10.
 
Tabel 1  
Maximaal toegestane CV's vastgesteld voor doelweefsels van secundaire 
geslachtsorganen voor het castraatmodel in de OESO- 
valideringsstudies  ( 1 ). 
Weefsel Antiandrogene effecten Androgene effecten  
Zaadblaasjes 40 % 40 % 
Ventrale prostaat 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowperse klieren 35 % 55 % 
Glans penis 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) De drempel-CV voor een gegeven weefsel werd vastgesteld op basis van de grafiek van 
CV-waarden — gerangschikt van laagste opeenvolgend naar hoogste — voor alle ge ­
middelden uit alle experimenten in de validering met gebruikmaking van een specifiek 
model (agonist of antagonist). De drempel-CV werd afgelezen vanaf het punt waarbij de 
tussenliggende stappen naar de volgende hoogste CV's in de serie aanzienlijk groter zijn 
dan de voorgaande paar CV's- het „breekpunt”. Hier zij opgemerkt dat, hoewel deze 
analyse relatief betrouwbare „breekpunten” identificeerde voor het antagonistmodel van 
de bepaling, CV-curves voor de agonistbepaling een uniformere toename te zien gaven, 
waardoor de identificatie van een drempel-CV met deze methode enigszins arbitrair is.
 PROCEDURE  
Naleving van de wet en laboratoriumverificatie  
27. In tegenstelling tot de Uterotrofe bepaling (hoofdstuk B.54 van deze bij ­
lage), hoeft de competentie van een laboratorium voor de Hershberger-assay 
niet voor aanvang van het onderzoek te worden aangetoond, omdat posi ­
tieve (testosteronpropionaat en flutamide) en negatieve controles tegelijker ­
tijd plaatsvinden als integraal onderdeel van de bepaling.  
Aantal en toestand van de dieren  
28. Elke behandelings- en controlegroep moet minimaal 6 dieren omvatten. Dit 
geldt voor zowel de androgene als de antiandrogene protocols.  
Castratie  
29. Na ontvangst van de dieren moet er een eerste acclimatisatieperiode van 
enkele dagen worden ingeruimd om er zeker van te zijn dat de dieren 
gezond zijn en gedijen. Omdat bij dieren die voor een leeftijd van 42 dagen of postnatale dag (pnd) 42 de voorhuid mogelijk niet is teruggetrokken, moeten dieren worden gecastreerd op pnd 42 of later, niet daarvoor. De 
dieren worden onder anesthesie gecastreerd door een incisie in het scrotum 
aan te brengen en beide testes en epididymides te verwijderen waarbij bloedvaten en zaadbuisjes worden afgebonden. Na bevestiging dat er geen bloeding optreedt, kan het scrotum met hechtingen of autoclips wor ­
den gesloten. Dieren moeten de eerste dagen na chirurgie met pijnstillers 
worden behandeld om postchirurgische pijn te verlichten. Als gecastreerde dieren van een dierleverancier worden betrokken, moeten de leeftijd van de dieren en het stadium van de seksuele rijping door de leverancier worden 
gegarandeerd.
 
Acclimatisatie na castratie  
30. Acclimatisatie van de dieren aan de laboratoriumomstandigheden moet wor ­
den voortgezet zodat het doelweefselgewicht minimaal zeven dagen na castratie kan afnemen. De dieren moeten dagelijks worden geobserveerd, en alle dieren met aanwijzingen van ziekte of lichamelijke afwijkingen 
moeten worden verwijderd. Behandeling en instelling van de toediening 
(in onderzoek) kan dus beginnen vanaf een leeftijd van pnd 49 dagen, maar niet later dan pnd 60. De leeftijd bij obductie mag niet hoger zijn dan pnd 70. Met deze flexibiliteit kan een laboratorium het werk aan het 
experiment efficiënt plannen.
 
Lichaamsgewicht en groeprandomisatie  
31. Verschillen in individueel lichaamsgewicht zijn een bron van variabiliteit in 
weefselgewicht zowel binnen als tussen groepen dieren. Toenemende vari ­
abiliteit in weefselgewicht leidt tot een hogere variatiecoëfficiënt (CV) en vermindert het statistisch onderscheidingsvermogen van de bepaling (soms de gevoeligheid van de bepaling genoemd). Daarom moeten variaties in 
lichaamsgewicht zowel experimenteel als statistisch gereguleerd worden.
 
32. Experimentele regulering houdt in het bereiken van geringe variaties in 
lichaamsgewicht binnen en tussen de onderzoeksgroepen. In de eerste plaats 
moeten ongebruikelijk kleine of grote dieren worden vermeden en niet in de onderzoekscohort worden opgenomen. Bij aanvang van het onderzoek moet de gewichtvariatie van de gebruikte dieren niet meer dan ± 20 % van het 
gemiddelde gewicht zijn (bv. 175 g ± 35 g voor gecastreerde peripuberale 
ratten). Ten tweede moeten dieren worden toegewezen aan (controle- en behandel-) groepen via gerandomiseerde gewichtsverdeling, zodat het ge ­
middelde lichaamsgewicht van elke groep niet statistisch afwijkt van alle 
andere groepen. De toegepaste blokrandomisatieprocedure moet worden 
vastgelegd.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Omdat toxiciteit het lichaamsgewicht van de behandelde groep ten opzichte 
van de controlegroep kan verminderen, moet het lichaamsgewicht op de 
eerste dag van de toediening van de teststof worden gebruikt als statistische covariabele, niet het lichaamsgewicht bij obductie.
 
Dosering  
34. Om vast te stellen of de teststof in vivo een androgene werking kan hebben, 
zijn twee dosisgroepen van de teststof plus positieve en medium (negatieve) 
controles (zie paragraaf 43) normaliter voldoende, en daarom geniet deze opzet de voorkeur uit het oogpunt van dierwelzijn. Als het doel is om een 
dosisresponscurve te verkrijgen of naar lagere doses te extrapoleren, zijn 
minstens 3 dosisgroepen nodig. Als informatie naast identificatie van an ­
drogene activiteit (zoals een schatting van de potentie) nodig is, moet een ander dosisregime worden overwogen. Om te testen op antiandrogenen 
wordt de teststof samen toegediend met een referentieandrogeenagonist. 
Er moeten minimaal 3 testgroepen met verschillende doses van de teststof en een positieve en negatieve controle worden gebruikt (zie paragraaf 44). Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de contro ­
legroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien 
bij de toediening van de teststof van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.
 
35. De dosisniveaus moeten worden voorgesteld en gekozen in het licht van de 
bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica van de teststof en verwante stoffen. Bij het hoogste dosisniveau moet in de eerste plaats rekening worden gehouden met de LD
 50 en/of informatie over acute toxi ­
citeit om overlijden, ernstig lijden of stress voor de dieren te voorkomen 
(17) (18) (19) (20) en, in de tweede plaats, met de beschikbare informatie over de doses die in de subchronische en chronische studies gebruikt zijn. In het algemeen zou de hoogste dosis geen verlaging van het uiteindelijke 
lichaamsgewicht van de dieren van meer dan 10 % van het controlegewicht 
moeten veroorzaken. De hoogste dosis moet zijn hetzij 1) de hoogste dosis die overleving van het dier waarborgt en die geen aanzienlijke toxiciteit of stress aan de dieren geeft na 10 opeenvolgende dagen van toediening tot 
een maximale dosis van 1 000 mg/kg/dag (zie paragraaf 36) of 2) een dosis 
die (anti)androgene effecten opwekt, afhankelijk van welke lager is. Bij screening zijn grote intervallen, bijvoorbeeld een half log eenheden (over ­
eenkomend met een dosisprogressie van 3,2) of zelfs één log eenheden, 
tussen toedieningen aanvaardbaar. Als er geen bruikbare gegevens beschik ­
baar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (zie para ­
graaf 37) om de te gebruiken doses te helpen bepalen.
 
Maximale dosis  
36. Als een test bij de maximale dosis van 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag en 
een lagere dosis met de voor dit onderzoek voorgeschreven procedures geen statistisch significante verandering in het gewicht van de geslachtsorganen geeft, dan kunnen overige dosisniveaus onnodig worden geacht. De maxi ­
male dosis is van toepassing, behalve wanneer op grond van gegevens over 
blootstelling bij de mens een hoger dosisniveau nodig wordt geacht.
 
Overwegingen voor bereikbepaling  
37. Waar nodig kan een preliminair bereikbepalingsonderzoek plaatsvinden met 
enkele dieren om de geschikte dosisgroepen te selecteren [aan de hand van 
methoden voor testen op acute toxiciteit (hoofdstukken B.1 bis, B.1 tris van deze bijlage (27), OESO TG 425 (19))]. De doelstelling in het geval van de Hershberger-bioassay is om doses te selecteren waarbij de dieren overleven 
en die geen aanmerkelijke toxiciteit of stress aan de dieren veroorzaken na 
tien opeenvolgende dagen van toediening van de stof tot een maximale
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
dosis van 1 000 mg/kg/d zoals opgemerkt in paragrafen 35 en 36. Hierbij 
kan een OESO-leidraad (17) worden gebruikt waarin de klinische tekenen 
worden gedefinieerd die wijzen op toxiciteit of stress voor de dieren. Waar mogelijk kunnen binnen dit bereikbepalingsonderzoek na tien dagen toedie ­
ning de doelweefsels worden uitgesneden en gewogen, ongeveer 24 uur na 
toediening van de laatste dosis. Deze gegevens kunnen dan worden gebruikt 
om te helpen bij het selecteren van de dosis in het hoofdonderzoek.
 
Referentiestoffen en medium  
38. De referentieandrogeenagonist moet zijn testosteronpropionaat (TP), CAS 
nr 57-82-5. De referentie-TP-dosering kan zijn hetzij 0,2 mg/kg-lg/d of 0,.4 mg/kg-lg/d. De referentieandrogeenantagonist moet zijn flutamide (FT), 
CAS nr 1311-84-7. De referentie-FT-dosering moet zijn 3 mg/kg-lg/d, en 
FT moet gelijktijdig worden toegediend met de referentie-TP-dosering.
 
39. Het wordt aanbevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig(e) 
oplosmiddel/suspensie te overwegen. Maar omdat veel androgeenliganden of hun metabole precursors over het algemeen hydrofoob zijn, is de meest gangbare benadering om een oplossing/suspensie in olie te gebruiken (bv. 
maïs-, pinda-, sesam- of olijfolie). Teststoffen kunnen worden opgelost in 
een minimale hoeveelheid 95 % ethanol of andere geschikte oplosmiddelen en verdund tot de uiteindelijke werkconcentraties in het testmedium. De toxische eigenschappen van het oplosmiddel moeten bekend zijn, en moeten 
in een aparte controlegroep met alleen oplosmiddel worden getest. Als de 
teststof stabiel wordt geacht, kan voorzichtige verwarming en krachtig schudden worden gebruikt om te helpen bij het oplossen van de teststof. De stabiliteit van de teststof in het medium moet worden bepaald. Als de 
teststof gedurende het onderzoek stabiel is, kan één beginaliquot van de 
teststof worden bereid, en kunnen de gespecificeerde oplossingen dagelijks worden bereid, waarbij vervuiling en morsen van de monsters wordt vermeden.
 
Toediening van de doses  
40. TP moet worden toegediend door subcutane injectie en FT via maagsonde.  
41. De teststof wordt toegediend via maagsonde of subcutane injectie. Bij het 
kiezen van de toedieningsroute moet rekening worden gehouden met dier ­
welzijn en de fysische/chemische eigenschappen van de teststof. Daarnaast moet rekening worden gehouden met toxicologische aspecten zoals de rele ­
vantie van de humane route van blootstelling aan de stof (bv. maagsonde 
voor modelingestie, subcutane injectie voor modelinhalatie of dermale ab ­
sorptie) en bestaande toxicologische informatie en gegevens over meta ­
blisme en kinetiek (bv. noodzaak om first-passmetabolisme te voorkomen, betere effectiviteit via een bepaalde route) voordat uitvoerige en langdurige 
tests worden gestart als positieve resultaten met injectie worden verkregen.
 
42. De dieren moeten gedurende tien opeenvolgende dagen met intervallen van 
ongeveer 24 uur op dezelfde manier en op hetzelfde tijdstip een dosis 
ontvangen. Het dosisniveau moet dagelijks worden aangepast op basis van gelijktijdig verrichte meting van het lichaamsgewicht. Het volume van de dosis en de tijd waarop deze is toegediend moet op elke bloot ­
stellingsdag worden vastgelegd. Er moet voor worden gezorgd dat de maxi ­
male dosis die in paragraaf 35 is beschreven niet wordt overschreven om zo een zinvolle interpretatie van de gegevens mogelijk te maken. Vermindering van lichaamsgewicht, klinische tekenen, en andere bevindingen moeten in 
dit opzicht grondig worden beoordeeld. Bij voeding via een orale maag ­
sonde moet een geschikte buis of intubatiecanule worden gebruikt. Het
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van 
de grootte van het dier. De lokale richtlijnen voor dierverzorging moeten 
worden gevolgd, maar het volume mag niet hoger zijn dan 5 ml/kg li ­
chaamsgewicht, behalve in het geval van oplossingen in water waarbij 10 ml/kg lichaamsgewicht aangehouden kan worden. Voor subcutane injecties 
moeten de doses worden toegediend in het dorsoscapulaire en of lumbale 
gebied via een steriele naald (bv. 23- of 25-gauge) en een tuberculinespuit. Het scheren van de injectieplaats is facultatief. Elk(e) verlies of lekkage op de injectieplaats of onvolledige toediening moet worden vastgelegd. Het 
totale per rat geïnjecteerde volume per dag mag niet hoger zijn dan 0,5 
ml/kg lichaamsgewicht.
 
Specifieke procedures voor androgeenagonisten  
43. Voor de androgeenagonisttest is het medium de negatieve controle, de met 
TP behandelde groep is de positieve controle. Biologische activiteit die past 
bij androgeenagonisten wordt getest door toediening van een teststof aan behandelingsgroepen in geselecteerde doses gedurende 10 opeenvolgende dagen. Het gewicht van de vijf weefsels van secundaire geslachtsorganen uit 
de teststofgroepen wordt vergeleken met de mediumgroep op statistisch 
significante gewichtstoenames.
 
Specifieke procedures voor androgeenantagonisten en 5 α-reductaserem ­
mers  
44. Voor de androgeenantagonisten- en 5 α-reductaseremmerstest is de met TP 
behandelde groep de negatieve controle, en de groep met gelijktijdige toe ­
diening van referentiedoses TP en FT de positieve controle. Er wordt getest op biologische activiteit die past bij androgeenantagonisten en 5 α-reducta­
seremmers door toediening van een referentiedosis TP en toediening van de 
teststof gedurende 10 opeenvolgende dagen. Het gewicht van de vijf weef ­
sels uit secundaire geslachtsorganen uit de groepen met TP en teststof worden vergeleken met de referentiegroep met alleen TP op statistisch 
significante gewichtsafnames.
 
WAARNEMINGEN  
Klinische waarnemingen  
45. Minstens eenmaal per dag, en vaker als er tekenen van toxiciteit worden 
waargenomen, moeten algemene klinische waarnemingen worden gedaan. 
De waarnemingen worden bij voorkeur elke dag op het/dezelfde tijd ­
stip(pen) verricht waarbij rekening wordt gehouden met de periode met verwachte piekeffecten na toediening. Alle dieren moeten worden geobser ­
veerd op mortaliteit, morbiditeit, en algemene klinische tekenen zoals ver ­
anderingen in gedrag, huid, vacht, ogen, slijmvliezen, uitscheidingen en 
afscheidingen en autonome activiteiten (zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, pupilgrootte, ongebruikelijk ademhalingspatroon).
 
46. Elk dood aangetroffen dier moet worden verwijderd en afgevoerd zonder 
verdere gegevensanalyse. Alle mortaliteit van dieren vóór obductie moet in 
het onderzoeksverslag worden opgenomen samen met een eventuele kenne ­
lijke reden voor de mortaliteit.. Stervende dieren moeten op humane wijze worden gedood. Alle stervende en gedode dieren moeten worden opge ­
nomen in het onderzoeksverslag met de kennelijke redenen voor de 
morbiditeit.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Lichaamsgewicht en consumptie van voer  
47. Alle dieren moeten dagelijks worden gewogen op 0,1 g nauwkeurig, te 
beginnen vlak voor de behandeling start, d.w.z. wanneer de dieren over 
de groepen worden verdeeld. Eventueel kan de hoeveelheid voer die tijdens de behandelperiode geconsumeerd wordt, per kooi gemeten worden door de voerbak te wegen. De voerconsumptiegegevens moeten worden genoteerd 
in gram per rat per dag.
 
Sectie en meting van weefsel- en orgaangewicht  
48. Ongeveer 24 uur na de laatste toediening van de teststof moeten de ratten 
worden gedood met aftappen van bloed volgens normale procedures van het uitvoerende laboratorium, en obductie worden verricht. De wijze van hu ­
maan doden moet in het laboratoriumrapport worden vermeld.
 
49. Idealiter moet de volgorde van obductie worden gerandomiseerd tussen de 
groepen om opeenvolgende stijgende of dalende doses te vermijden, wat de 
gegevens zou kunnen beïnvloeden. Alle bevindingen bij obductie, met name 
pathologische veranderingen/zichtbare laesies moeten worden opgemerkt en gerapporteerd.
 
50. De vijf androgeenafhankelijke weefsels (VP, SV, LABC, COW, GP) moe ­
ten worden gewogen. Deze weefsels moeten worden uitgesneden, waarbij 
aanliggend weefsel en vet zorgvuldig worden weggesneden, en hun verse 
(niet gefixeerde) gewicht wordt vastgesteld. Elk weefsel moet met grote zorg worden behandeld om verlies van vocht en uitdroging te voorkomen, wat aanmerkelijke fouten en variabiliteit kan veroorzaken doordat het vast ­
gelegde gewicht lager is. Verschillende weefsels kunnen heel klein of moei ­
lijk te ontleden zijn, en dit zal tot variabiliteit leiden. Daarom is het belang ­
rijk dat de personen die de sectie op de weefsels van de secundaire ge ­
slachtsorganen verrichten bekend zijn met de standaard sectieprocedures 
voor deze weefsels. Een standard operating procedure (SOP)-gids voor 
sectie is beschikbaar bij de OESO (21). Met zorgvuldige training volgens de SOP-gids wordt mogelijke variabiliteit in het onderzoek tot een mini ­
mum beperkt. Idealiter is steeds dezelfde prosector verantwoordelijk voor de 
sectie van een bepaald weefsel om interindividuele verschillen in de ver ­
werking van weefsels te elimineren. Als dat niet mogelijk is, moet de obductie zo worden ingericht dat elke prosector sectie verricht op een bepaald weefsel uit alle behandelingsgroepen in plaats van dat één persoon 
sectie verricht op alle weefsels uit een controlegroep, terwijl iemand anders 
verantwoordelijk is voor de behandelde groepen. Alle secundaire geslachts ­
weefsels moeten zonder droogdeppen worden gewogen, afgerond op 0,1 mg, en het gewicht wordt voor elk dier vastgelegd.
 
51. Sommige weefsels kunnen heel klein zijn waardoor sectie moeilijk te ver ­
richten is, en dit zal tot variabiliteit leiden. In het verleden is gebleken dat 
variatiecoëfficiënten (CV's) kunnen verschillen als gevolg van verschillen in vaardigheid van het laboratorium. In enkele gevallen zijn bij een bepaald laboratorium grote verschillen in het absolute gewicht van de weefsels zoals 
de VP en COWS waargenomen.
 
52. Meting van gewicht van lever, nieren paarsgewijs, en bijnieren paarsgewijs, 
is facultatief. Ook hier moeten weefsels worden ontdaan van aanliggend 
bindweefsel en vet. Het gewogen levergewicht moet worden vastgelegd, afgerond op 0,1 g, en de nieren en bijnieren moeten paarsgewijs worden gewogen en afgerond op 0,1 mg. De lever, nieren en bijnieren worden niet 
alleen door androgenen beïnvloed; ze leveren ook bruikbare indices op van 
systemische toxiciteit.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Meting van luteïniserend hormoon (LH), follikelstimulerend 
hormoon (FSH) en testosteron (T) in het serum is facultatief. Serum 
T-concentraties zijn nuttig voor het vaststellen of de teststof metabolisme van testosteron door de lever induceert waardoor de serumconcentraties dalen. Zonder de T-gegevens zou zo'n effect kunnen lijken plaats te vinden 
via een antiandrogeen mechanisme. De LH-concentraties geven informatie 
over het vermogen van een antiandrogeen om niet alleen het orgaangewicht te verminderen, maar ook de hypothalamus-hypofysefunctie te beïnvloeden, wat in langetermijnstudies testistumoren kan induceren. FSH is een belang ­
rijk hormoon voor de spermatogenese. Serum-T4 en -T3 zijn ook optionele 
metingen die nuttige aanvullende informatie kunnen geven over het ver ­
mogen om de homeostase van het thyroïdhormoon te verstoren. Als hor ­
moonmetingen gedaan worden, moeten de ratten vóór obductie onder nar ­
cose worden gebracht en wordt bloed met een hartpunctie afgenomen; de 
wijze van verdoving moet zorgvuldig worden gekozen zodat deze de hor ­
moonmeting niet beïnvloedt. De methode van serumbereiding, de herkomst van de radio-immunoassay of andere sets voor meting, de analystische 
procedures, en de resultaten moeten worden vastgelegd. LH-concentraties 
worden vermeld als ng per ml serum, en T moet ook worden vermeld als ng per ml serum.
 
54. Sectie op de weefsels wordt als volgt beschreven met een gedetailleerde 
sectiegids met foto's, gepubliceerd als aanvullend materiaal in het kader van 
het valideringsprogramma (21). Een sectievideo is ook beschikbaar op de 
webpagina van de Korea Food and Drug Administration (22).  
— Stel met de buikzijde van het dier omhoog vast of de voorhuid van de 
penis is losgekomen van de glans penis. Zo ja, trek de voorhuid dan terug en verwijder de glans penis, weeg deze (afronden op 0,1 mg), en 
noteer het gewicht.
 
— Open de buikhuid en -wand, waardoor de ingewanden worden blootge ­
legd. Als de optionele organen gewogen worden, verwijder de lever dan en weeg deze, rond af op 0,1 g, verwijder de maag en darmen, ver ­
wijder en weeg paarsgewijs de nieren en bijnieren, rond af op 0,1 mg. 
Met deze sectie wordt de blaas blootgelegd en kan worden begonnen 
met de sectie van de gewenste secundaire geslachtsweefsels.
 
— Voor sectie van de VP wordt de blaas van de ventrale spierlaag losge ­
maakt door het bindweefsel langs de middellijn door te snijden. Schuif de blaas in anterieure richting opzij naar de zaadblaasjes (SV), waardoor 
de linker- en rechterlobben van de ventrale prostaat (bedekt door een 
vetlaag) zichtbaar worden. Verwijder voorzichtig het vet van de rechter- en linkerlobben van de VP. Trek voorzichtig de rechter VP-lob van de urethra af en snijd de lob van de urethra los. Terwijl de rechter VP-lob 
nog wordt vastgehouden, wordt voorzichtig de linker VP-lob van de 
urethra afgetrokken en losgesneden; weeg en rond af op 0,1 mg en noteer het gewicht.
 
— Voor sectie van de SVCG wordt de blaas in caudale richting verscho ­
ven, waardoor de vas deferens en rechter- en linkerlobben van de zaad ­
blaasjes plus coagulans uitscheidende klieren (SVCG) zichtbaar worden. 
Voorkom lekkage van vocht door een hemostaatklem aan de basis van de SVCGs te plaatsen, waar de vas deferens samenkomt met de urethra. Snijd voorzichtig de SVCGs los, met de hemostaat op zijn plaats, ver ­
wijder vet en adnexa, leg in een getarreerde weger, verwijder de he ­
mostaat, weeg en rond af op 0,1 mg, en noteer het gewicht.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Voor sectie van de m. levator ani plus bulbocavernosus (LABC) worden 
de spieren en de basis van de penis blootgelegd. De LA-spieren liggen 
rond de colon, terwijl de anterieure LA- en BC-spieren aan de bulbus penis gehecht zijn. De huid en adnexa van het perianale gebied vanaf de basis van de penis tot het anterieure uiteinde van de anus worden ver ­
wijderd. De BC-spieren worden een voor een van de bulbus penis en 
weefsels losgemaakt. De colon wordt doorgesneden en de volledige LABC kan worden uitgesneden en verwijderd. De LABC moet worden ontdaan van vet en adnexa, gewogen met afronding op 0,1 mg, en het 
gewicht moet worden genoteerd.
 
— Na verwijdering van de LABC zijn de ronde Cowperse of 
bulbo-urethrale klieren (COW) zichtbaar aan de basis van, en enigszins dorsaal van, de bulbus penis. Zorgvuldige sectie is geboden om te voor ­
komen dat het dunne kapsel wordt doorgeprikt om zo vochtlekkage te 
vermijden. Weeg de COW paarsgewijs, rond af op 0,1 mg, en noteer het gewicht.
 
— Daarnaast moet eventueel verlies van vocht uit een klier tijdens obductie 
en sectie worden genoteerd.  
55. Als de beoordeling van elke stof de obductie van meer dieren vereist dan 
voor één dag redelijk is, kan het begin van het onderzoek over twee op ­
eenvolgende dagen worden verspreid, waardoor obductie en verwante werk ­
zaamheden ook over twee dagen worden verspreid. Als de werkzaamheden zo worden gespreid, moet per dag de helft van de dieren per behandelings ­
groep worden verwerkt.
 
56. Na obductie moeten de karkassen op passende wijze worden afgevoerd.  
RAPPORTAGE  
Gegevens  
57. Gegevens moeten individueel worden gemeld (te weten lichaamsgewicht, 
gewicht secundaire geslachtsweefsels, optionele metingen en andere respon ­
sen en waarnemingen) en voor elke groep dieren (gemiddelden en stan ­
daarddeviaties van alle verrichte metingen). De gegevens moeten in tabel ­
vorm worden samengevat. De gegevens moeten het aantal dieren laten zien 
aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met tekenen van toxiciteit, een omschrijving van de waar ­
genomen tekenen van toxiciteit, waaronder tijd van begin, duur en ernst.
 
58. Een eindrapport moet het volgende bevatten:  
Testinstelling:  
— naam instelling, locatie,  
— onderzoeksleider en andere medewerkers en hun verantwoordelijkheden 
met betrekking tot het onderzoek,  
— begin- en einddatum van het onderzoek, te weten de eerste dag van 
toediening van de teststof resp. laatste dag van obductie.  
Teststof:  
— herkomst, partij/chargenummer, identiteit, zuiverheid, volledig adres van 
leverancier en kenmerken van de teststof,  
— fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschappen,  
— opslagomstandigheden en methode en frequentie van bereiding van 
verdunning,  
— alle gegenereerde gegevens over stabiliteit,  
— alle analyses van doseeroplossingen/suspensies.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Medium:  
— kenmerken van het medium (identiteit, leverancier en partijnummer),  
— motivering van de keuze van het medium (wanneer dat geen water is).  
Procedures voor proefdieren en dierhouderij:  
— gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze,  
— herkomst of leverancier van dieren, inclusief volledig adres,  
— aantal en leeftijd van geleverde dieren,  
— huisvesting (temperatuur, verlichting enz.),  
— voer (naam, type, leverancier, partijnummer, inhoud en indien bekend, 
concentraties fyto-oestrogenen),  
— strooisel (naam, type, leverancier, samenstelling),  
— omstandigheden in de kooi en aantal dieren per kooi.  
Testomstandigheden:  
— leeftijd bij castratie en duur van acclimatisatie na castratie,  
— individueel gewicht van de dieren bij aanvang van het onderzoek (af ­
gerond op 0,1 g),  
— randomisatieproces en een vastlegging van de toewijzing aan medium, 
referentie, teststofgroepen, en kooien,  
— gemiddelde en standaarddeviatie van lichaamsgewicht voor elke groep 
voor elke weegdag in het onderzoek,  
— motivering van de keuze van de dosis,  
— Toedieningsroute van teststof en motivering van keuze van de 
blootstellingsweg,  
— indien een bepaling voor antiandrogeniteit, de TP-behandeling (dosis en 
volume),  
— behandeling met teststof (dosis en volume),  
— tijdstip van toediening,  
— obductieprocedures, inclusief wijze van aftappen van bloed en eventuele 
narcose,  
— Indien serumanalyses worden verricht, moeten details van de methode 
worden gegeven. Bijvoorbeeld, als RIA wordt gebruikt, moet de RIA-procedure, herkomst van RIA-sets, vervaldata van sets, procedure 
voor scintillatietelling, en standaardisatie worden vermeld.
 
Resultaten:  
— Dagelijkse observaties voor elk dier tijdens toediening, waaronder:  
— lichaamsgewicht (afgerond op 0,1 g),  
— klinische tekenen (indien aanwezig),  
— eventuele meting van of opmerking over voerconsumptie.  
— Observaties bij obductie voor elk dier, waaronder:  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— datum obductie,  
— behandelingsgroep van het dier,  
— dier-ID,  
— prosector,  
— tijdstip dat necropsie en sectie wordt verricht,  
— leeftijd dier,  
— uiteindelijk lichaamsgewicht bij obductie, met opmerking van eventuele 
statistisch significante toename of afname,  
— volgorde van aftappen van bloed en sectie bij obductie,  
— gewicht van de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels:  
— ventrale prostaat (afgerond op 0,1 mg),  
— zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren, inclusief vocht 
(paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),  
— m levator ani plus bulbocavernosuscomplex (afgerond op 0,1 mg),  
— Cowperse klieren (vers gewicht — paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),  
— glans penis (vers gewicht afgerond op 0,1 mg),  
— gewicht van optionele weefsels, indien verricht:  
— lever (afgerond op 0,1 g),  
— nieren (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),  
— bijnieren (paarsgewijs, afgerond op 0,1 mg),  
— algemene opmerkingen.  
— Analyses van serumhormonen, indien verricht:  
— serum-LH (facultatief — ng per ml serum), en  
— serum-T (facultatief — ng per ml serum), en  
— algemene opmerkingen.  
Samenvatting van gegevens  
Gegevens moeten worden samengevat in tabelvorm met steekproefgrootte 
voor elke groep, gemiddelde van de waarde, en de standaardfout of stan ­
daarddeviatie. Tabellen moeten lichaamsgewicht bij obductie, veranderingen 
in lichaamsgewicht vanaf begin van toediening tot obductie, gewicht secun ­
daire geslachtsdoelweefsels, en eventuele optionele orgaangewichten bevatten.
 
Bespreking van de resultaten.  
Analyse van resultaten  
59. Het lichaams- en orgaangewicht bij obductie moeten statistisch worden 
geanalyseerd op kenmerken zoals homogeniteit van variantie met passende datatransformaties waar nodig. Behandelingsgroepen moeten worden ver ­
geleken met een controlegroep aan de hand van technieken als ANOVA 
gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen (bv. eenzijdige Dunnett-test) en het criterium voor statistisch verschil, bijvoorbeeld p ≤ 0,05. Groepen die 
statistische significantie bereiken moeten worden geïdentificeerd. Maar „re ­
latief orgaangewicht” moet worden vermeden vanwege de ongeldige statis ­
tische aannamen die aan deze gegevensbewerking ten grondslag liggen.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Voor androgeenagonisme moet de controle de testgroep met alleen medium 
zijn. De kenmerken van het werkingsmechanisme van de teststof kunnen tot 
verschillende relatieve responsen in weefsels leiden, bijvoorbeeld trenbolon, waarbij 5 α-reductie niet mogelijk is, heeft een meer uitgesproken effect op 
het LABC en GP dan TP. Een statistisch significante verhoging (p ≤ 0,05) in 
het gewicht van twee of meer van de vijf androgeenafhankelijke doelweef ­
sels (VP, LABC, GP, CG en SVCG) moet worden beschouwd als een positief androgeenagonistresultaat, en alle doelweefsels moeten enige mate van groeitoename vertonen. Een gecombineerde beoordeling van de respons 
van de weefsels van alle secundaire geslachtsorganen (ASO) kan worden 
bereikt met passende multivariabele gegevensanalyse. Dit kan de analyse verbeteren, vooral in gevallen waar slechts één weefsel een statistisch sig ­
nificante respons vertoont.
 
61. Voor androgeenantagonisme moet de controle de testgroep met het refe ­
rentieandrogeen (alleen testosteronpropionaat) zijn. De kenmerken van het 
werkingsmechanisme van een teststof kunnen tot een verschillende relatieve 
respons in weefsels leiden; zo hebben 5 α-reductaseremmers als finasteride 
een meer uitgesproken effect op de ventrale prostaat dan andere weefsels in vergelijking met krachtige AR-antagonisten, zoals flutamide. Een statistisch 
significante verlaging (p ≤ 0,05) in het weefselgewicht van twee of meer van 
de vijf androgeenafhankelijke doelweefsels (VP, LABC, GP, CG en SVCG) wordt beschouwd als een positief androgeenantagonistresultaat, en alle doel ­
weefsels moeten enige mate van groeiafname vertonen. Een gecombineerde 
beoordeling van alle ASO-weefselresponsen kan worden bereikt met pas ­
sende multivariabele gegevensanalyse. Dit kan de analyse verbeteren, vooral in gevallen waar slechts één weefsel een statistisch significante respons 
vertoont.
 
62. De gegevens moeten worden samengevat in tabelvorm met gemiddelde, 
standaardfout (standaarddeviatie zou ook acceptabel zijn) en steekproef ­
grootte voor elke groep. Ook individuele datatabellen moet worden toege ­
voegd. De individuele waarden, gemiddelden, SE (SD) en CV-waarden voor de controlegegevens moeten worden geverifieerd om vast te stellen 
of ze aan aanvaardbare criteria voldoen voor consistentie met verwachte 
historische waarden. Aan de hand van CV's die de CV-waarden in tabel 1 (zie paragraaf 25 en 26) voor elk orgaangewicht te boven gaan, moeten worden vastgesteld of er fouten zijn in het vastleggen of invoeren van 
gegevens, dan wel of het laboratorium een accurate sectie van androgeen ­
afhankelijke weefsels nog niet beheerst en aanvullende training/oefening gerechtvaardigd is. Over het algemeen zijn CV's (de standaarddeviatie ge ­
deeld door het gemiddelde orgaangewicht) van lab tot lab en van onderzoek 
tot onderzoek reproduceerbaar. De gepresenteerde gegevens moeten ten 
minste bevatten: ventrale prostaat, zaadblaasje, m levator ani plus bulboca ­
vernosus, Cowperse klieren, glans penis, lever, en lichaamsgewicht en ver ­
andering in lichaamsgewicht vanaf begin van toediening tot obductie. Ge ­
gevens kunnen ook worden gepresenteerd na aanpassing voor covariantie 
voor lichaamsgewicht, maar dit moet niet in de plaats komen van het presenteren van de onaangepaste gegevens. Daarnaast, als het loskomen van de voorhuid (preputial separation — PPS) niet in een van de groepen 
optreedt, moet de incidentie van PPS worden vastgelegd en statistisch ver ­
geleken met de controlegroep aan de hand van de Fisher Exact test.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Bij controle op juistheid van de ingegeven computergegevens door ver ­
gelijking met de oorspronkelijke gegevensformulieren, moeten waarden 
voor orgaangewicht die niet biologisch plausibel zijn of met meer dan drie standaarddeviaties van het gemiddelde van die behandelingsgroep af ­
wijken, zorgvuldig worden onderzocht en mogelijk worden genegeerd, om ­
dat het waarschijnlijk fouten in de vastlegging zijn.
 
64. Vergelijking van onderzoeksresultaten met OESO-waarden (in tabel 1) is 
vaak een belangrijke stap in het interpreteren van de validiteit van de onderzoeksresultaten. In het laboratorium moeten historische gegevens voor mediumcontrolegroepen worden bijgehouden. Historische gegevens 
voor responsen op positieve referentiestoffen, zoals TP en FT, moeten even ­
eens in het laboratorium worden bijgehouden. Laboratoria kunnen ook pe ­
riodiek de respons op bekende zwakke androgeenagonisten en -antagonisten testen en deze gegevens bijhouden. Deze gegevens kunnen worden ver ­
geleken met beschikbare OESO-gegevens om ervoor te zorgen dat de me ­
thoden in het laboratorium voldoende statistisch(e) precisie en onderschei ­
dingvermogen opleveren.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Androgeen  is een term waarmee een positieve invloed op de groei van androg ­
eenafhankelijke weefsels wordt beschreven.  
Antiandrogeen  is het vermogen van een stof om in een zoogdierorganisme de 
werking van TP te onderdrukken.  
Stof betekent een stof of mengsel.  
Geboortedatum  is postnatale dag 0.  
Dosis : de toegediende hoeveelheid teststof. Voor de Hershberger-bioassay wordt 
de dosis uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van 
het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag).  
Dosering  is een algemene term die de dosis, de frequentie en de duur van de 
toediening omvat.  
Stervend  wil zeggen een dier dat op het punt van overlijden staat.  
Postnatale dag x  is de x'e levensdag na de geboortedag.  
Gevoeligheid  is het vermogen van de testmethode om correct stoffen te identi ­
ficeren die de eigenschap hebben waarop wordt getest.  
Specificiteit  is het vermogen van een testmethode om correct stoffen te identi ­
ficeren die niet de eigenschap hebben waarop wordt getest.  
Teststof  betekentalle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.  
Validering  is een wetenschappelijke methode die erop gericht is om de operati ­
onele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de be ­
trouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Aanhangsel 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 OPMERKINGEN BIJ HET KADER  
Opmerking 1:  het is mogelijk om op alle niveaus in- en uit te stappen. Dit 
hangt af van de soort informatie waaraan behoefte bestaat voor 
gevaar- en risicobeoordelingsdoeleinden.  
Opmerking 2:  in niveau 5 moet de ecotoxicologie eindpunten omvatten die 
duiden op mechanismen van schadelijke effecten en potentiële 
schade voor de populatie.  
Opmerking 3:  als een multimodaal model enkele van de testen met een enkel 
eindpunt omvat, vervangt dat model het gebruik van deze testen met een enkel eindpunt.
 
Opmerking 4:  de beoordeling van elke stof moet per geval plaatsvinden, reke ­
ning houdend met alle beschikbare informatie en de functie van de niveaus van het kader.
 
Opmerking 5:  het kader moet op dit moment niet worden beschouwd als alom ­
vattend. Op niveaus 3, 4 en 5 voorziet het kader in testen die al beschikbaar zijn of waarvan de validering nog loopt. De laatst ­
genoemde testen zijn daarom als voorlopig opgenomen. Na de 
ontwikkeling en validering ervan worden deze testen formeel 
toegevoegd aan het kader.
 
Opmerking 6:  niveau 5 moet niet worden beschouwd als een niveau dat alleen 
beslissende testen omvat. Tests die in dat niveau zijn opgenomen worden geacht aan de algehele beoordeling van gevaar en risico bij te dragen.
 
LITERATUUR  
1. OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10-11 maart 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
 
2. Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
3. Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antian ­
drogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in 
Toxicology 16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
4. OESO (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to tes ­
tosterone propionate and antiandrogenic effects of flutamide. Environmen ­
tal Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. ENV/JM/MONO(2006)30.  
5. OESO (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple La ­
boratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
6. OESO (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
7. Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized proto ­
col. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8. Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.
 
9. Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413-422.  
10. Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314.  
11. Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38-44.  
12. Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue res ­
piration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.
 
13. Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.  
14. Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
15. Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hor ­
mone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.
 
16. Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p 38.  
17. OESO (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
18. OESO (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
— Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Parijs.  
19. OESO (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
20. OESO (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
21. Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
22. Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershber ­
ger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda.go.kr/ endocrine/reference/education_fr.html.
 
23. OESO (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
24. OESO (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
25. OESO (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay 
in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. Series 
on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26 Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 
22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor we ­
tenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).
 
27. De volgende hoofdstukken van deze bijlage:  
B.1 bis, Acute orale toxiciteit — Procedure met vaste doses  
B.1 tris, Acute orale toxiciteit — Methode ter bepaling van de 
acute-toxiciteitsklasse.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  UITGEBREID ONDERZOEK NAAR REPRODUCTIETOXICITEIT 
OVER ÉÉN GENERATIE  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 443 (2012) van de OE ­
SO. De methode is gebaseerd op het voorstel van het Agricultural Chemical Safety Assessment (ACSA) Technical Committee van het International Life Science Institute (ILSI)-Health and Environmental Sciences Institute (HESI) 
voor een uitgebreid reproductieonderzoek over één generatie met betrekking 
tot levensfase F
 1 , zoals gepubliceerd in Cooper et al., 2006 (1). Er zijn 
verscheidene verbeteringen en verduidelijkingen aangebracht in de opzet van het onderzoek om de flexibiliteit te vergroten en te benadrukken dat 
het van belang is uit te gaan van bestaande kennis bij het gebruik van 
observaties bij levende dieren om de testen richting te geven en af te stemmen. Deze testmethode voorziet in een gedetailleerde beschrijving van de operationele uitvoering van een uitgebreid onderzoek naar reproduc ­
tietoxiciteit over één generatie. Hierin worden drie cohorten van F
 1 -dieren 
beschreven:  
cohort 1: beoordeelt reproductie/ontwikkelingseindpunten; deze cohort kan 
worden uitgebreid met een F  2 -generatie,  
cohort 2: beoordeelt de potentiële invloed van blootstelling aan stoffen op 
het ontwikkelende zenuwstelsel,  
cohort 3: beoordeelt de potentiële invloed van blootstelling aan stoffen op 
het immuunsysteem.  
2. Beslissingen over het al dan niet beoordelen van de tweede generatie en het 
achterwege laten van de ontwikkelingsneurotoxiciteitscohort en/of ontwik ­
kelingsimmunotoxiciteitscohort, moeten gebaseerd zijn op bestaande kennis 
over de te beoordelen stof alsook op de behoeften van verscheidene regel ­
gevende instanties. De testmethode heeft tot doel nadere gegevens te ver ­
strekken over de wijze waarop het onderzoek kan worden uitgevoerd en 
elke cohort moet worden beoordeeld.  
3. De procedure voor de beslissing over het intern triggeren van de productie 
van een tweede generatie wordt beschreven in OESO-leidraad nr. 117 (39) voor de regelgevende instanties die interne triggers toepassen.
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN DOELSTELLINGEN  
4. Het hoofddoel van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over 
één generatie is het beoordelen van specifieke levensfasen die niet in andere 
typen toxiciteitsonderzoeken aan de orde komen en het testen op effecten die kunnen optreden als gevolg van pre- en postnatale blootstelling aan een stof. Voor reproductie-eindpunten is het de bedoeling dat, als een eerste stap 
en indien beschikbaar, informatie van onderzoeken met herhaalde toedie ­
ning (zoals screeningsonderzoeken naar reproductietoxiciteit, bv. OESO TG 422 (32)) of kortlopende screeningstesten op hormoonontregelaars (bv. ute ­
rotrofe test — testmethode B.54 (36), en de Hershberger-test — test ­
methode B.55 (37)) wordt gebruikt om effecten op de geslachtsorganen 
bij mannetjes en vrouwtjes te detecteren. Dit kan onder meer spermatoge ­
nese (testiculaire histopathologie) voor mannetjes en oestruscycli, aantal follikels/eicelrijping en integriteit van de eierstokken (histopathologie) 
voor vrouwtjes omvatten. Het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxi ­
citeit over één generatie dient dan als een test voor reproductie-eindpunten waarvoor de interactie van mannetjes met vrouwtjes, vrouwtjes met een foetus en vrouwtjes met nakomelingen en de F
 1 -generatie tot na de ge ­
slachtsrijping nodig is (zie OESO-leidraad nr. 151 voor ondersteuning 
van deze testmethode (40)).  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. De testmethode is bedoeld om de pre- en postnatale effecten van stoffen op 
de ontwikkeling te beoordelen alsook de systemische toxiciteit bij drachtige 
en zogende vrouwtjes en jonge en volwassen nakomelingen grondig te beoordelen. Door gedetailleerd onderzoek van belangrijke ontwikkelings ­
eindpunten, zoals levensvatbaarheid van nakomelingen, neonatale gezond ­
heid, ontwikkelingsstatus bij de geboorte en de lichamelijke en functionele 
ontwikkeling tot volwassenheid kunnen naar verwachting specifieke doel ­
organen bij de nakomelingen worden vastgesteld. Daarnaast wordt door middel van het onderzoek informatie verkregen en/of bevestigd over de 
effecten van een teststof op de integriteit en werking van de voortplantings ­
systemen van volwassen mannetjes en vrouwtjes. Met name, maar niet aansluitend, komen daarbij de volgende parameters aan de orde: gonadale functie, de oestruscyclus, epididymalespermarijping, paringsgedrag, concep ­
tie, dracht, werpen en zogen. Verder worden met de informatie verkregen 
uit de beoordelingen van de ontwikkelingsneurotoxiciteit en ontwikkelings ­
immunotoxiciteit mogelijke effecten op deze systemen gekarakteriseerd. Met de uit deze testen verkregen gegevens kunnen bepalingen worden 
gedaan van het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld 
(no-observed-adverse-effect level, NOAEL), het laagste niveau waarbij een schadelijk effect werd vastgesteld (lowest-observed-adverse-effect level, LOAEL) en/of benchmarkdoses voor de verscheidene eindpunten en/of deze 
gegevens kunnen worden gebruikt om effecten te karakteriseren die naar 
voren zijn gekomen uit eerdere onderzoeken met herhaalde toediening en/of dienen als een richtsnoer voor latere testen.
 
6. In figuur 1 wordt het protocol schematisch weergegeven. De teststof wordt 
continu toegediend in geleidelijk stijgende doses aan diverse groepen van geslachtsrijpe mannetjes en vrouwtjes. Deze parentale (P) generatie krijgt de 
stof toegediend gedurende een gedefinieerde periode vóór paring (gekozen 
op grond van de beschikbare informatie voor de teststof, maar minimaal twee weken) en een twee weken durende paringsperiode. P-mannetjes wor ­
den ten minste verder behandeld tot spening van de F
 1 en moeten minimaal 
tien weken worden behandeld. Ze kunnen langer worden behandeld als 
effecten op de voortplanting helder gekregen moeten worden. De behan ­
deling van de P-vrouwtjes wordt voortgezet tijdens de dracht en zoogperi ­
ode tot het einde na de spening van hun nesten (d.w.z. 8-tien weken be ­
handeling). De F  1 -nakomelingen worden verder behandeld met de teststof 
vanaf de spening tot volwassenheid. Bij beoordeling van een tweede gene ­
ratie (zie OESO-leidraad nr. 117 (39)) blijven de F  1 -nakomelingen behan ­
deling krijgen tot spening van de F  2 of tot het einde van het onderzoek.  
7. Met alle dieren worden klinische observaties en pathologische onderzoeken 
gericht op verschijnselen van toxiciteit verricht, met speciale nadruk op de 
integriteit en werking van de mannelijke en vrouwelijke voortplantingssys ­
temen en de gezondheid, groei, ontwikkeling en functionering van de na ­
komelingen. Bij de spening worden geselecteerde nakomelingen toegewe ­
zen aan specifieke subgroepen (cohorten 1-3, zie punten 33 en 34 en figuur 
1) voor nader onderzoek, waaronder geslachtsrijping, integriteit en functie 
van de voortplantingsorganen, neurologische en gedragseindpunten en immuunfuncties.
 
8. Bij het uitvoeren van het onderzoek moeten de richtsnoeren en overwegin ­
gen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad nr. 19 over het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische verschijnselen 
als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen 
(34).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Als er voldoende onderzoeken beschikbaar zijn om vast te stellen wat de 
impact is van deze nieuwe onderzoeksopzet, wordt de testmethode beoor ­
deeld en indien nodig herzien in het licht van opgedane ervaring.  
Figuur 1  
Schema van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie
  
BESCHRIJVING VAN DE METHODE/VOORBEREIDINGEN VOOR DE 
TEST  
Dieren  
Keuze van diersoort en stam  
10. De keuze van de soort voor de reproductietoxiciteitstest moet zorgvuldig 
overwogen worden in het licht van alle beschikbare informatie. Vanwege de 
omvang van de achtergrondgegevens en de vergelijkbaarheid met algemene toxiciteitstesten, is de rat echter normaliter de voorkeurssoort en hebben de bij deze testmethode gegeven criteria en aanbevelingen betrekking op deze 
soort. Wordt een andere soort gebruikt, dan moet dit gemotiveerd worden 
en zijn passende aanpassingen van het protocol noodzakelijk. Stammen met een lage vruchtbaarheid of een algemeen bekende hoge incidentie van spontane afwijkingen in de ontwikkeling mogen niet worden gebruikt.
 
Leeftijd, lichaamsgewicht en inclusiecriteria  
11. Er worden gezonde P-dieren gebruikt waarop geen eerdere proeven zijn 
uitgevoerd. Zowel de mannetjes als de vrouwtjes worden onderzocht en 
de vrouwtjes moeten nullipara's zijn en niet drachtig zijn. De P-dieren moeten geslachtsrijp, bij aanvang van de toediening van gelijk gewicht (binnen hetzelfde geslacht) en bij het paren van gelijke leeftijd zijn (onge ­
veer 90 dagen), en het moeten representatieve exemplaren zijn van de soort 
en stam die worden onderzocht. De dieren moeten na levering ten minste vijf dagen acclimatiseren. De dieren worden willekeurig toegewezen aan de controle- en behandelgroepen. Dit moet zodanig gebeuren, dat dit vergelijk ­
bare waarden voor het gemiddelde lichaamsgewicht van de groepen geeft 
(d.w.z. ± 20 % van het gemiddelde).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
12. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. De relatieve 
vochtigheid moet tussen 30 en 70 % liggen, idealiter tussen 50 en 60 %. De cyclus van het kunstlicht moet worden ingesteld op 12 uur licht en 12 uur 
donker. Het gewone proefdiervoer mag worden gebruikt met een onbe ­
perkte hoeveelheid drinkwater. Er dient goed gelet te worden op het gehalte aan fyto-oestrogenen in het voer, aangezien een hoog gehalte van invloed kan zijn op bepaalde reproductie-eindpunten. Gestandaardiseerd voer zonder 
voorgeschreven samenstelling met een verlaagd gehalte aan oestrogene stof ­
fen wordt aanbevolen (2) (30). De keuze van het voer kan worden beïn ­
vloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de test ­
stof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. Het gehalte, 
de homogeniteit en de stabiliteit van de teststof in het voer moet gecontro ­
leerd worden. Het voer en drinkwater moeten regelmatig op onzuiverheden worden onderzocht. Van elke partij voer die tijdens het onderzoek wordt 
gebruikt moeten monsters onder de juiste omstandigheden worden bewaard 
(bv. ingevroren bij – 20 °C) tot het rapport afgerond is voor het geval de resultaten nadere analyse van de bestanddelen van het voer noodzakelijk maken.
 
13. De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht en dezelfde 
behandelgroep worden ondergebracht. Ze kunnen elk apart worden gehuis ­
vest om mogelijk letsel te voorkomen (bv. mannetjes na de paringsperiode). 
Het paren moet plaatsvinden in geschikte kooien. Na gebleken copulatie 
worden vrouwtjes die geacht worden drachtig te zijn elk apart gehuisvest in kooien die zijn bestemd voor werpen of moederschap, waar ze worden voorzien van geschikt en gedefinieerd nestmateriaal. Nesten worden tot 
de spening met hun moeders gehuisvest. F
 1 -dieren moeten vanaf de spening 
tot het einde in kleine groepen van hetzelfde geslacht en dezelfde behan ­
delgroep worden gehuisvest. Dieren kunnen elk apart worden gehuisvest als daarvoor een wetenschappelijke motivering wordt gegeven. Het gehalte aan 
fyto-oestrogenen in het gekozen strooisel moet minimaal zijn.
 
Aantal dieren en identificatie  
14. Normaal moet elke test- en controlegroep een voldoende aantal parings ­
koppels bevatten om ten minste 20 drachtige vrouwtjes per dosisgroep op te leveren. Het doel is voldoende drachten tot stand te brengen om een betekenisvolle evaluatie van de mogelijke invloed van de stof op de vrucht ­
baarheid, dracht en het moederlijke gedrag van de P-generatie en de groei 
en ontwikkeling van de F
 1 -nakomelingen, vanaf de conceptie tot de vol ­
wassenheid, mogelijk te maken. Wordt het gewenste aantal drachtige dieren niet gehaald, dan maakt dit het onderzoek niet noodzakelijkerwijs ongeldig 
en moet dit per geval worden geëvalueerd, rekening houdend met een 
mogelijk oorzakelijk verband met de teststof.
 
15. Aan elk P-dier wordt een uniek identificatienummer toegekend alvorens de 
toediening start. Als historische laboratoriumgegevens erop wijzen dat een 
aanzienlijk deel van de vrouwtjes mogelijk geen regelmatige oestruscyclus (van 4 of vijf dagen) vertoont, wordt aanbevolen de oestruscycli te beoor ­
delen vóór aanvang van de behandeling. Een andere mogelijkheid is de 
groepsgrootte te vergroten, zodat ten minste 20 vrouwtjes in elke groep 
bij aanvang van de behandeling regelmatige oestruscycli (van 4 of vijf dagen) hebben. Alle F
 1 -nakomelingen krijgen een unieke identificatie bij 
het eerste onderzoek als pasgeborene op postnatale dag (PND) 0 of 1. Van 
alle F  1 -dieren, en F  2 -dieren indien van toepassing, moeten de gegevens over 
het nest van herkomst het hele onderzoek worden bewaard.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Teststof  
Beschikbare informatie over de teststof  
16. Het is van belang om op basis van beoordeling van bestaande informatie 
beslissingen te nemen over de toedieningsweg, de keuze van het medium, 
de keuze van de diersoort, de keuze van doseringen en mogelijke aanpas ­
singen van het doseringsschema. Alle relevante beschikbare informatie over de teststof, d.w.z. fysisch-chemische, toxicokinetische (waaronder soortspe ­
cifiek metabolisme) en toxicodynamische eigenschappen, 
structuur-activiteitrelaties (SAR's), metabole processen in vitro, resultaten 
van eerdere toxiciteitsonderzoeken en relevante informatie over structuur ­
analoga, moet daarom in aanmerking worden genomen bij het plannen van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie. Ver ­
kennende informatie over absorptie, distributie, metabolisme en 
eliminatie (ADME) en bioaccumulatie kan worden verkregen uit de che ­
mische structuur, fysisch-chemische gegevens, mate van plasma-eiwitbinding of toxicokinetiekonderzoeken (TK-onderzoeken), ter ­
wijl resultaten van toxiciteitsonderzoeken aanvullende informatie geven, 
bv. over NOAEL, metabolisme of inductie van metabolisme.
 
Overweging van toxicokinetische gegevens  
17. Hoewel TK-gegevens van eerder uitgevoerde doseringsbereikonderzoeken 
of andere onderzoeken niet vereist zijn, zijn ze buitengewoon nuttig bij het opzetten van het onderzoek, de keuze van dosisniveaus en interpretatie 
van resultaten. Bijzonder nuttig zijn gegevens die: 1) de blootstelling van 
ontwikkelende foetussen en jongen aan de teststof beoordelen (of relevante metabolieten), 2) een schatting geven van interne dosimetrie, en 3) poten ­
tiële dosisafhankelijke verzadiging van kinetische processen evalueren. Aan ­
vullende TK-gegevens, zoals metabolietprofielen, concentratie-tijdcurves 
enz., moeten ook in aanmerking worden genomen, indien beschikbaar. Aan ­
vullende TK-gegevens kunnen ook worden verzameld tijdens het hoofd ­
onderzoek, mits dit niet de verzameling en interpretatie van de eindpunten 
voor het hoofdonderzoek verstoort.
 
Als algemeen richtsnoer is de volgende TK-dataset nuttig bij het plannen 
van het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie:  
— late dracht (bv. drachtdag 20) — bloed van moederdier en foetus,  
— halverwege zoogperiode (PND 10) — bloed van moederdier en jong 
en/of melk,  
— vlak na spening (bv. PND 28) — bloedmonsters van gespeende dieren.  
Bij het bepalen van de specifieke analyten (bv. moederstof en/of metabo ­
lieten) en/of het monsternameschema moet flexibel te werk worden gegaan. Zo is het aantal te nemen monsters en de tijdstippen ervan op een gegeven 
monsternamedag afhankelijk van de blootstellingsweg en eerder opgedane 
kennis van TK-eigenschappen bij niet-drachtige dieren. Voor onderzoeken met toediening via het voer is monstername op één vast tijdstip op elk van deze dagen voldoende, terwijl bij toediening via een maagsonde aanvul ­
lende monsternamepunten nodig kunnen zijn om een betere schatting te 
krijgen van de spreiding van de inwendige doses. Het is echter niet nood ­
zakelijk om op een van de monsternamedagen het volledig verloop van de concentratie in de tijd vast te leggen. Indien noodzakelijk kan bloed per 
geslacht binnen nesten worden samengevoegd voor foetale en neonatale 
analyses.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Toedieningsweg  
18. Bij het kiezen van de weg moet(en) de weg(en) worden betrokken die het 
relevantste is/zijn voor menselijke blootstelling. Hoewel het protocol be ­
doeld is voor toediening van de teststof via het voer, kan dit worden aange ­
past voor toediening via andere wegen (drinkwater, maagsonde, inhalatie, 
dermaal), afhankelijk van de kenmerken van de stof en de vereiste informatie.
 
Keuze van het medium  
19. Waar nodig wordt de teststof in een geschikt medium opgelost of gesuspen ­
deerd. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken en als dit niet kan een oplossing/suspensie 
in olie (bv. maïsolie) te overwegen. Wanneer een ander medium dan water 
wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Het gebruik van media met potentiële intrinsieke toxiciteit moet worden ver ­
meden (bv. aceton, DMSO). De stabiliteit van de teststof in het medium 
moet worden bepaald. Bij gebruik van een medium of een ander additief om toediening te vergemakkelijken, moet met de volgende factoren reke ­
ning worden gehouden: effecten op de absorptie, de distributie, het meta ­
bolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigen ­
schappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen ver ­
anderen, en effecten op de voedsel- of waterconsumptie of de voedings ­
status van de dieren.
 
Keuze van de dosis  
20. Normaliter moet het onderzoek ten minste drie dosisniveaus en een gelijk ­
tijdige controle omvatten. Bij het kiezen van de juiste dosisniveaus moet de 
onderzoeker rekening houden met alle beschikbare informatie, waaronder de 
toedieningsinformatie van eerdere onderzoeken, TK-gegevens van drachtige en niet-drachtige dieren, de mate van uitscheiding in de moedermelk en schattingen van de menselijke blootstelling. Als er TK-gegevens beschik ­
baar zijn die wijzen op dosisafhankelijke verzadiging van TK-processen, 
moet erop worden gelet hoge dosisniveaus die duidelijk verzadiging ver ­
tonen te vermijden, mits uiteraard menselijke blootstellingen naar verwach ­
ting ruim onder dat verzadigingspunt liggen. In dat geval moet het hoogste 
dosisniveau op of net boven het buigpunt voor overgang naar niet-lineair 
TK-gedrag liggen.
 
21. Bij afwezigheid van relevante TK-gegevens moeten de dosisniveaus geba ­
seerd zijn op toxische effecten, tenzij de fysisch-chemische aard van de teststof dit beperkt. Als de dosisniveaus gebaseerd zijn op toxiciteit, moet 
de hoogste dosis zodanig worden gekozen, dat enige systemische toxiciteit 
geïnduceerd wordt, maar geen sterfte of ernstig lijden van de dieren.
 
22. Er moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen om een eventueel 
dosisgerelateerd effect aan te kunnen tonen en NOAEL's of doses nabij de detectiegrens te kunnen bepalen waarmee een benchmarkdosis kan worden 
afgeleid voor het/de gevoeligste eindpunt(en). Om grote dosisintervallen 
tussen NOAEL's en LOAEL's te voorkomen, zijn intervallen van een factor twee tot vier vaak optimaal. Het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan een zeer groot interval (bv. meer dan een factor tien) tussen de 
doseringen te gebruiken.
 
23. Afgezien van de behandeling met de teststof worden de dieren in de con ­
trolegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Deze groep wordt niet behandeld of krijgt placebo of krijgt, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, medium toegediend. 
Indien van een medium gebruik wordt gemaakt, dient dit aan de contro ­
legroep in het hoogste gebruikte volume toegediend te worden.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Grenstest  
24. Als er bij een dosis van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag in 
onderzoeken met herhaalde toediening geen aanwijzingen zijn voor toxici ­
teit of als geen toxiciteit wordt verwacht op grond van gegevens van qua 
structuur en/of metabolisme verwante stoffen, die wijzen op vergelijkbare 
metabole eigenschappen in vivo/in vitro, is een onderzoek met verscheidene dosisniveaus wellicht niet noodzakelijk. In dat geval moet het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie worden uitgevoerd 
met een controlegroep en een enkele dosis van ten minste 1 000 mg/kg 
lichaamsgewicht/dag. Worden er bij deze grensdosis echter aanwijzingen gevonden voor reproductie- of ontwikkelingstoxiciteit, dan zijn verdere on ­
derzoeken bij lagere dosisniveaus noodzakelijk om een NOAEL vast te 
kunnen stellen. Deze overwegingen omtrent de grenstest zijn alleen van toepassing wanneer de menselijke blootstelling niet duidt op de noodzaak van een hoger dosisniveau.
 
PROCEDURES  
Blootstelling van nakomelingen  
25. Blootstelling via het voer is de toedieningsmethode die de voorkeur ver ­
dient. Bij onderzoeken met maagsondes moet worden opgemerkt dat de jongen normaliter de teststof alleen indirect binnenkrijgen, via de melk, 
totdat voor hen de directe toediening start vanaf de spening. In onderzoeken 
met toediening via voer of drinkwater krijgen de jongen daarnaast de test ­
stof direct binnen wanneer ze zelf gaan eten tijdens de laatste week van de 
zoogperiode. Het moet worden overwogen de onderzoeksopzet aan te pas ­
sen wanneer de mate van uitscheiding van de teststof in melk laag is en wanneer er onvoldoende aanwijzingen zijn voor continue blootstelling van de nakomelingen. In dat geval moet directe toediening van jongen tijdens de 
zoogperiode worden overwogen op grond van beschikbare TK-informatie, 
toxiciteit bij nakomelingen of veranderingen in biomarkers (3) (4). De voor- en nadelen moeten zorgvuldig overwogen worden alvorens onderzoeken uit te voeren met directe toediening aan jongen die worden gezoogd (5).
 
Doseringsschema en toediening van doses  
26. Uit eerdere toxiciteitsonderzoeken met herhaalde toediening met een toerei ­
kende duur kan bepaalde informatie over oestruscycli, histopathologie van het mannelijke en vrouwelijke voortplantingssysteem en testiculaire/epidi ­
dymale sperma-analyse beschikbaar zijn. De duur van de behandeling vóór 
paring in het uitgebreide onderzoek naar reproductietoxiciteit over één ge ­
neratie is er daarom op gericht effecten op functionele veranderingen te detecteren die kunnen interfereren met paringsgedrag en bevruchting. De 
behandeling vóór paring moet lang genoeg zijn om steady-state blootstel ­
lingsomstandigheden te bereiken bij P-mannetjes en -vrouwtjes. In de meeste gevallen wordt voor beide geslachten een twee weken durende be ­
handeling vóór paring toereikend geacht. Voor vrouwtjes beslaat dit 3-4 
volledige oestruscycli, wat voldoende moet zijn voor de detectie van even ­
tuele schadelijke effecten op de cyclus. Voor mannetjes is dit gelijkwaardig aan de tijd die nodig is voor epididymale doorvoer van rijpende spermato ­
zoa en kunnen hierin post-testiculaire effecten op sperma gedetecteerd wor ­
den (tijdens de eindfasen van spermiatie en epididymale spermarijping) bij 
de paring. Aan het einde van het onderzoek, wanneer testiculaire en epidi ­
dymale histopathologie en analyse van spermaparameters staan ingepland, zijn de P- en F
 1 -mannetjes blootgesteld geweest gedurende ten minste één 
volledig spermatogeneseproces ((6) (7) (8) (9) en OESO-leidraad nr. 151 
(40)).  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Blootstellingsscenario's vóór paring voor mannetjes kunnen worden aange ­
past indien in eerdere onderzoeken testiculaire toxiciteit (verstoorde sper ­
matogenese) of effecten op de integriteit en functie van sperma duidelijk zijn vastgesteld. Evenzo kunnen voor vrouwtjes bekende effecten van de teststof op de oestruscyclus en dus op de seksuele ontvankelijkheid verschil ­
lende blootstellingsscenario's vóór paring rechtvaardigen. In speciale geval ­
len kan het aanvaardbaar zijn de behandeling van de P-vrouwtjes pas te starten na een spermapositief uitstrijkje (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)).
 
28. Na vaststelling van de doseringsperiode vóór paring moeten de dieren con ­
tinu, zeven dagen per week tot aan de obductie, met de teststof worden behandeld. De toedieningsmethode moet voor alle dieren hetzelfde zijn. De 
toediening moet doorgaan tijdens de twee weken durende paringsperiode en 
voor P-vrouwtjes gedurende de dracht en zoogperiode tot de dag van het einde na spening. Mannetjes moeten op dezelfde manier worden behandeld tot het einde op het moment dat de F
 1 -dieren worden gespeend. Voor de 
obductie moet prioriteit moet worden gegeven aan vrouwtjes waarop op 
(ongeveer) dezelfde zoogdag obductie moet worden verricht. De obductie van mannetjes kan over een groter aantal dagen worden verspreid, afhan ­
kelijk van de laboratoriumfaciliteiten. Tenzij er al mee gestart is tijdens de 
zoogperiode, moet de directe toediening van de geselecteerde F
 1 -mannetjes 
en -vrouwtjes beginnen bij de spening en doorgaan tot de ingeplande ob ­
ductie, afhankelijk van de cohorttoewijzing.  
29. Wanneer stoffen via de voeding of het drinkwater worden toegediend, moet 
erop worden toegezien dat de hoeveelheden van de teststof niet interfereren 
met de normale voedings- of waterbalans. Wanneer de teststof via het voer 
wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van het dier worden gebruikt; de gekozen mogelijkheid moet gespecificeerd worden.
 
30. Wanneer de teststof via een maagsonde wordt toegediend, mag de in één 
keer toegediende hoeveelheid vloeistof normaliter niet meer zijn dan 1 
ml/100 g lichaamsgewicht (maximaal 0,4 ml/100 g lichaamsgewicht voor 
olie, bv. maïsolie). Behalve bij irriterende of bijtende stoffen, die normaliter bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschil ­
len tot een minimum worden beperkt door de concentratie aan te passen, 
zodat er bij alle dosisniveaus hetzelfde volume wordt toegediend. De be ­
handeling moet elke dag op hetzelfde tijdstip worden gegeven. De dosis voor elk dier moet gewoonlijk gebaseerd zijn op de meest recente indivi ­
duele lichaamsgewichtsbepaling en ten minste wekelijks worden aangepast 
bij volwassen mannetjes en volwassen niet-drachtige vrouwtjes en elke twee 
dagen bij drachtige vrouwtjes en F
 1 -dieren tijdens de toedieningsperiode 
vóór spening en de twee weken na spening. Als TK-gegevens wijzen op een lage overdracht van de teststof via de placenta, moet de dosis via de 
maagsonde tijdens de laatste week van de dracht mogelijk worden aange ­
past om te voorkomen dat het moederdier een te grote toxische dosis krijgt. De behandeling van vrouwtjes mag op de dag van werpen niet plaatsvinden via een maagsonde of een andere weg waarbij het dier moet worden be ­
handeld; het verdient de voorkeur toediening van de teststof die dag over te 
slaan om het geboorteproces niet te verstoren.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Paring  
31. Elk P-vrouwtje moet worden geplaatst met één willekeurig geselecteerd 
niet-verwant mannetje uit dezelfde dosisgroep (1:1-koppels) tot observatie 
van aanwijzingen voor copulatie of nadat twee weken zijn verstreken. Bij een ontoereikend aantal mannetjes, bijvoorbeeld als gevolg van sterfte van mannetjes vóór de koppeling, kan/kunnen (een) mannetje(s) die al gepaard 
heeft/hebben worden gekoppeld (1:1) met een tweede vrouwtje, zodat alle 
vrouwtjes gekoppeld worden. Dag 0 van de dracht wordt gedefinieerd als de dag waarop aanwijzingen voor paring worden bevestigd (observatie van een vaginale plug en/of sperma). De dieren moeten zo snel mogelijk worden 
gescheiden na observatie van aanwijzingen voor copulatie. Als na twee 
weken geen paring heeft plaatsgevonden, worden de dieren gescheiden zonder nog mogelijkheid te geven voor paring. Gegevens over paringskop ­
pels moeten duidelijk geregistreerd worden.
 
Nestgrootte  
32. Op dag 4 na de geboorte kan de grootte van de nesten worden aangepast 
door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie, zodat elk nest 
uiteindelijk zoveel mogelijk bestaat uit vijf mannetjes en vijf vrouwtjes. 
Selectieve eliminatie van jongen, bijvoorbeeld op grond van lichaams ­
gewicht, is niet gepast. Als het door het aantal mannelijke of vrouwelijke jongen niet mogelijk is om op vijf per geslacht per nest uit te komen, is 
gedeeltelijke aanpassing (bv. zes mannetjes en vier vrouwtjes) 
aanvaardbaar.
 
Selectie van jongen voor onderzoek na spening (zie figuur 1)  
33. Bij de spening (omstreeks PND 21) worden jongen van alle beschikbare 
nesten tot 20 per dosis- en controlegroep geselecteerd voor verdere onder ­
zoeken en aangehouden tot de geslachtsrijping (tenzij eerder testen nood ­
zakelijk is). De jongen worden willekeurig geselecteerd, behalve dat duide ­
lijk ondermaatse dieren (dieren met een lichaamsgewicht dat meer dan twee 
standaarddeviaties onder het gemiddelde gewicht van de jongen van het desbetreffende nest ligt) niet mogen worden opgenomen omdat dit geen representatieve exemplaren van de behandelgroep kunnen zijn.
 
Op PND 21 worden de geselecteerde F  1 -jongen als volgt willekeurig toe ­
gewezen aan een van drie dierencohorten:  
cohort 1 (1A en 1B) = testen op reproductie/ontwikkelingstoxiciteit,  
cohort 2 (2A en 2B) = testen op ontwikkelingsneurotoxiciteit,  
cohort 3 = testen op ontwikkelingsimmunotoxiciteit.  
Cohort 1A: één mannetje en één vrouwtje/nest/groep (20/geslacht/groep): 
voorkeursselectie voor primaire beoordeling van effecten op voortplantings ­
systemen en van algemene toxiciteit.  
Cohort 1B: één mannetje en één vrouwtje/nest/groep (20/geslacht/groep): 
voorkeursselectie voor follow-upbeoordeling van het voortplantingsver ­
mogen door F  1 -dieren te paren als deze beoordeeld zijn (zie 
OESO-leidraad nr. 117 (39)) en om aanvullende histopathologische gege ­
vens te verkrijgen in geval van stoffen die worden verdacht van toxiciteit 
voor de voortplanting of het hormoonsysteem, of wanneer de resultaten van cohort 1A onduidelijk zijn.
 
Cohort 2A: in totaal 20 jongen per groep (10 mannetjes en 10 vrouwtjes per 
groep; één mannetje of één vrouwtje per nest), toegewezen voor neuro ­
gedragstesten gevolgd door neurohistopathologische beoordeling als volwassenen.
 
Cohort 2B: in totaal 20 jongen per groep (10 mannetjes en 10 vrouwtjes per 
groep; één mannetje of één vrouwtje per nest), toegewezen voor neurohi ­
stopathologische beoordeling bij de spening (PND 21 of PND 22). Bij een 
ontoereikend aantal dieren verdient het de voorkeur dieren toe te wijzen aan 
cohort 2A.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Cohort 3: in totaal 20 jongen per groep (10 mannetjes en 10 vrouwtjes per 
groep; één per nest, waar mogelijk). Mogelijk zijn extra jongen uit de 
controlegroep nodig om te fungeren als positieve-controledieren in de T-cel-afhankelijke antilichaamresponstest (TDAR) op PND 56 ± 3.
 
34. Als het aantal jongen in een nest ontoereikend is om alle cohorten te 
kunnen vullen, heeft cohort 1 voorrang omdat deze cohort kan worden uitgebreid door productie van een F
 2 -generatie. In geval van een specifiek 
probleem, bv. als een stof wordt verdacht van neurotoxiciteit, immunotoxi ­
citeit of reproductietoxiciteit, kunnen aanvullende jongen worden toegewe ­
zen aan een van de cohorten. Deze jongen kunnen worden gebruikt voor onderzoeken op verschillende tijdspunten of voor de beoordeling van aan ­
vullende eindpunten. Jongen die niet aan cohorten zijn toegewezen, worden 
onderworpen aan klinisch biochemisch onderzoek (punt 55) en macrosco ­
pische obductie (punt 68).
 
Tweede paring van de P-dieren  
35. Voor de P-dieren wordt een tweede paring gewoonlijk niet aanbevolen 
omdat dit ten koste gaat van belangrijke informatie over het aantal inne ­
stelingsplaatsen (en dus ten koste van gegevens over postinnestelings- en perinatale verliezen, indicatoren van een mogelijk teratogeen potentieel) 
voor het eerste nest. Als het nodig is een effect bij blootgestelde vrouwtjes 
te verifiëren of te verhelderen, kan het onderzoek beter uitgebreid worden met een paring van de F
 1 -generatie. Een tweede paring van de P-mannetjes 
met onbehandelde vrouwtjes is echter altijd een mogelijkheid om onduide ­
lijke bevindingen te verhelderen of voor verdere karakterisering van bij de 
eerste paring waargenomen effecten op de vruchtbaarheid.  
OBSERVATIES BIJ LEVENDE DIEREN  
Klinische observaties  
36. Voor de P- en de geselecteerde F  1 -dieren wordt eenmaal daags een alge ­
mene klinische observatie verricht. In geval van toediening via een maag ­
sonde moeten de klinische observaties vóór en na toediening plaatsvinden 
(vanwege mogelijke verschijnselen van toxiciteit samenhangend met 
piek-plasmaconcentratie). Relevante gedragsveranderingen, verschijnselen van moeilijke of langdurige worp en alle verschijnselen van toxiciteit wor ­
den geregistreerd. Tweemaal daags, tijdens het weekend eenmaal daags, 
worden alle dieren geobserveerd op ernstige toxiciteit, ziekelijkheid en 
sterfte.
 
37. Daarnaast worden alle P- en F  1 -dieren wekelijks uitgebreider onderzocht (na 
spening). Het is handig dit te doen op het moment dat het dier wordt 
gewogen, om stress van vastpakken tot een minimum te beperken. De observaties moeten zorgvuldig worden verricht en geregistreerd met sco ­
ringssystemen die zijn gedefinieerd door het testlaboratorium. Er moet zo ­
veel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden mini ­
maal zijn. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan 
van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademha ­
lingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpak ­
ken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, ste ­
reotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraai ­
en) of bizar gedrag (bv. zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden 
opgetekend.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Lichaamsgewicht en consumptie van voedsel en water  
38. Op de eerste toedieningsdag en ten minste wekelijks daarna worden de 
P-dieren gewogen. Daarnaast worden P-vrouwtjes gewogen tijdens de zoog ­
periode op dezelfde dagen dat de jongen in hun nesten worden gewogen (zie punt 44). Alle F
 1 -dieren worden elk apart gewogen bij de spening 
(PND 21) en ten minste wekelijks daarna. Het lichaamsgewicht wordt 
ook geregistreerd op de dag dat ze in de pubertijd komen (volledige los ­
lating van de voorhuid of opening van de vagina). Alle dieren worden gewogen op het moment dat ze worden gedood.
 
39. Tijdens het onderzoek wordt de voedsel- en waterconsumptie (bij toedie ­
ning van de teststof via het drinkwater) ten minste wekelijks geregistreerd 
op dezelfde dagen als de lichaamsgewichten (behalve tijdens cohabitatie). 
De voedselconsumptie van elke kooi met F  1 -dieren wordt wekelijks geregis ­
treerd vanaf de selectie tot een bepaalde cohort.  
Oestruscycli  
40. Uit eerdere toxiciteitsonderzoeken met herhaalde toediening kan al voor ­
lopige informatie over teststof-gerelateerde effecten op de oestruscyclus 
beschikbaar zijn, die kan worden gebruikt bij het opzetten van een 
teststof-specifiek protocol voor het uitgebreide onderzoek naar reproductie ­
toxiciteit over één generatie. De beoordeling van de oestruscyclus (door 
vaginale cytologie) start gewoonlijk bij het begin van de behandelperiode 
en duurt tot paring bevestigd is of tot het einde van de twee weken durende paringsperiode. Als vrouwtjes zijn gescreend op normale oestruscycli vóór de behandeling, is het nuttig uitstrijkjes te blijven maken als de behandeling 
start, maar als er bezorgdheid bestaat over niet-specifieke effecten bij de 
start van de behandeling (zoals een initiële duidelijk verminderde voedsel ­
consumptie), kunnen de dieren gedurende maximaal twee weken vóór de start van de twee weken durende uitstrijkjesperiode voorafgaand aan de 
koppeling op behandeling worden gezet. Als de behandelperiode voor 
vrouwtjes op deze wijze wordt verlengd (d.w.z. tot een behandeling vóór paring van vier weken), moet worden overwogen jongere dieren aan te schaffen en de behandelperiode voor mannetjes vóór de koppeling te ver ­
lengen. Wanneer monsters van vaginale/cervicale cellen worden genomen, 
moet erop worden gelet verstoring van het slijmvlies en latere inductie van schijndracht te voorkomen (10) (11).
 
41. Vaginale uitstrijkjes moeten dagelijks onderzocht worden voor alle F  1 - 
vrouwtjes in cohort 1A na het optreden van vaginale opening tot het eerste 
uitstrijkje met verhoornde cellen is geregistreerd, zodat het tijdsinterval 
hiertussen kan worden bepaald. De oestruscycli voor alle F  1 -vrouwtjes in 
cohort 1A moeten eveneens gecontroleerd worden gedurende een periode van twee weken, vanaf ongeveer PND 75. Mocht paring van de F
 1 -gene­
ratie noodzakelijk zijn, dan moet daarnaast de vaginale cytologie in cohort 
1B worden gevolgd vanaf het moment van koppelen tot aanwijzingen voor paring zijn gedetecteerd.
 
Paring en dracht  
42. Naast de standaardeindpunten (bv. lichaamsgewicht, voedselconsumptie, 
klinische observaties zoals controles op sterfte en ziekelijkheid) worden 
de data van koppeling, de datum van inseminatie en de datum van werpen 
geregistreerd en het interval vóór coïtus (koppeling tot inseminatie) en de drachtduur (inseminatie tot bevalling) berekend. De P-vrouwtjes moeten op het verwachte moment van werpen zorgvuldig onderzocht worden op ver ­
schijnselen van dystokie. Eventuele afwijkingen in nestgedrag of zoogacti ­
viteit moeten geregistreerd worden.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. De dag van werpen is zoogdag 0 (lactation day 0, LD 0) voor het moe ­
derdier en postnatale dag 0 (PND 0) voor de nakomelingen. Een andere 
mogelijkheid is alle vergelijkingen te baseren op de tijd na coïtus om verstoring van postnatale ontwikkelingsgegevens door verschillen in dracht ­
duur te elimineren; de tijd ten opzichte van de worp moet echter ook 
geregistreerd worden. Dit is met name van belang als de teststof van in ­
vloed is op de drachtduur.
 
Parameters met betrekking tot de nakomelingen  
44. Elk nest moet zo snel mogelijk na de worp (PND 0 of 1) onderzocht 
worden om het aantal en geslacht van de jongen, doodgeborenen, levend ­
geborenen en de aanwezigheid van macroscopische afwijkingen (uitwendig 
zichtbare afwijkingen, zoals een gespleten gehemelte, onderhuidse bloedin ­
gen; afwijkende kleur of textuur van de huid, aanwezigheid van navel ­
streng; afwezigheid van melk in de maag; aanwezigheid van gedroogde 
afscheidingen) vast te stellen. Daarnaast moet het eerste klinische onderzoek 
van de neonaten een kwalitatieve beoordeling omvatten van de lichaams ­
temperatuur, activiteitstoestand en reactie op vastpakken. Jongen die dood zijn aangetroffen op PND 0 of op een later tijdstip moeten onderzocht 
worden op mogelijke afwijkingen en doodsoorzaak. Levende jongen wor ­
den geteld en elk apart gewogen op PND 0 of PND 1 en regelmatig daarna, bv. ten minste op PND 4, 7, 14 en 21. Klinische onderzoeken, zoals van toepassing voor de leeftijd van de dieren, moeten worden herhaald als de 
nakomelingen worden gewogen of vaker als bij de geboorte gevalspecifieke 
bevindingen zijn geconstateerd. Verschijnselen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): uitwendige afwijkingen, veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding en 
onwillekeurige reacties. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit 
op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische be ­
wegingen, stereotiep gedrag of bizar gedrag moeten worden opgetekend.
 
45. De anogenitale afstand (AGD) van elk jong moet ten minste één keer 
worden gemeten vanaf PND 0 tot en met PND 4. Het lichaamsgewicht van elk jong moet worden bepaald op de dag dat de AGD wordt gemeten en de AGD moet genormaliseerd worden tot een maat voor jonggrootte, bij 
voorkeur de derdemachtswortel van het lichaamsgewicht (12). De aanwezig ­
heid van tepels/tepelhof bij mannelijke jongen moet gecontroleerd worden op PND 12 of 13.
 
46. Alle geselecteerde F  1 -dieren worden dagelijks beoordeeld op loslaten van de 
voorhuid van de eikel of vaginale opening voor respectievelijk mannetjes/ 
vrouwtjes, te beginnen vóór de verwachte dag om deze eindpunten te ver ­
krijgen en aan de hand daarvan eventuele vroege geslachtsrijping te detec ­
teren. Alle afwijkingen van de geslachtsorganen, zoals aanhoudende vagi ­
nale thread, hypospadie of gespleten penis, moeten worden genoteerd. De 
geslachtsrijpheid van F  1 -dieren wordt vergeleken met de lichamelijke ont ­
wikkeling door bepaling van de leeftijd en het lichaamsgewicht bij het loslaten van de voorhuid van de eikel of de vaginale opening voor respec ­
tievelijk mannetjes/vrouwtjes (13).
 
Beoordeling van potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit (cohorten 2A en 
2B) 
47. Voor neurotoxiciteitsbeoordelingen worden van elke behandelgroep 10 
mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 2A en 10 mannelijke en 
10 vrouwelijke dieren in cohort 2B (voor elke cohort: 1 mannetje of 1 
vrouwtje per nest; alle nesten zijn met ten minste 1 jong vertegenwoordigd; willekeurig geselecteerd) gebruikt. Dieren in cohort 2A moeten worden onderworpen aan testen van de auditieve schrikreactie, ‘functional observa ­
tional battery’, motorische activiteit (zie punten 48-50) en neuropathologi ­
sche beoordelingen (zie punten 74-75). Er moet zoveel mogelijk worden
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
gezorgd dat variaties in alle testomstandigheden minimaal zijn en niet sys ­
tematisch samenhangen met de behandeling. Variabelen die van invloed 
kunnen zijn op gedrag zijn geluidsniveau (bv. intermitterend geluid), tem ­
peratuur, vochtigheid, verlichting, geuren, tijdstip van de dag en afleiding uit de omgeving. De resultaten van neurotoxiciteitstesten moeten geïnter ­
preteerd worden in samenhang met passende historische 
controle-normaalwaarden. Dieren in cohort 2B moeten worden gebruikt voor neuropathologische beoordeling op PND 21 of PND 22 (zie punten 74-75).
 
48. Met dieren in cohort 2A wordt een test van de auditieve schrikreactie 
gedaan op PND 24 (± één dag). De testdag moet evenwichtig worden verdeeld over de behandel- en controlegroepen. Elke sessie bestaat uit 50 onderzoeken. Bij de test van de auditieve schrikreactie moet de gemiddelde 
responsamplitude van elk blok van 10 onderzoeken (5 blokken van 10 
onderzoeken) worden bepaald, met testomstandigheden die geoptimaliseerd zijn om te komen tot gewenning binnen een sessie. Deze procedures moeten worden uitgevoerd conform testmethode B.53 (35).
 
49. Op een passend tijdstip tussen PND 63 en PND 75 worden de dieren in 
cohort 2A onderworpen aan een ‘functional observational battery’ en een geautomatiseerde test van de motorische activiteit. Deze procedures moeten 
worden uitgevoerd conform testmethoden B.43 (33) en B.53 (35). De ‘func ­
tional observational battery’ omvat een uitvoerige beschrijving van het ui ­
terlijk, het gedrag en de functionele integriteit van het proefdier. Dit wordt beoordeeld door observaties in de verblijfskooi, na verplaatsing naar een 
standaardarena voor observatie (open veld) waarbij het dier zich vrij be ­
weegt en door manipulatieve testen. De testen moeten worden gedaan in volgorde van minst naar meest interactieve test. In aanhangsel 1 staat een lijst met parameters. Alle dieren moeten zorgvuldig geobserveerd worden 
door getrainde observeerders die niet weten welke behandeling een gegeven 
dier krijgt met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale observer-variabiliteit. Waar mogelijk is het raadzaam een dier in een gegeven test door steeds dezelfde observeerder te laten beoordelen. Als 
dit niet mogelijk is, wordt bewijs van interobserver-betrouwbaarheid vereist. 
Voor elke parameter in de reeks gedragstesten moeten expliciet operationeel gedefinieerde schalen en scoringscriteria worden gebruikt. Indien mogelijk moeten objectieve kwantitatieve parameters worden ontwikkeld voor obser ­
vationele eindpunten, die subjectief zijn gerangschikt. Voor de motorische 
activiteit wordt elk dier apart getest. De testsessie moet lang genoeg duren om gewenning binnen een sessie voor controles aan te kunnen tonen. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd met een geautomatiseerd 
activiteitsregistratieapparaat dat zowel toenames als afnames in activiteit 
moet kunnen detecteren (d.w.z. de door het apparaat gemeten activiteit op baseline moet niet zo laag zijn dat afnames niet kunnen worden gedetec ­
teerd en ook niet zo hoog dat toenames in activiteit niet kunnen worden 
gedetecteerd). Elk apparaat moet volgens standaardprocedures worden ge ­
test om een betrouwbare werking van alle apparaten op alle dagen te waar ­
borgen, voor zover mogelijk. De behandelgroepen moeten zoveel mogelijk 
evenwichtig worden verdeeld over de apparaten. De behandelgroepen moe ­
ten evenwichtig worden verspreid over de testtijden om verstoring te ver ­
mijden door circadiaanse activiteitritmes.
 
50. Als uit bestaande informatie blijkt dat andere functietesten noodzakelijk zijn 
(bv. sensorisch, sociaal, cognitief), moet de integratie ervan plaatsvinden 
zonder dat dit ten koste gaat van de integriteit van de andere beoordelingen in het onderzoek. Als deze testen worden verricht bij dezelfde dieren als voor het testen van de standaard auditieve schrikreactie, ‘functional observa ­
tional battery’ en motorische activiteit, moeten verschillende testen worden 
ingepland om het risico dat dit ten koste gaat van de integriteit van deze testen tot een minimum te beperken. Aanvullende procedures kunnen vooral nuttig zijn als empirische waarnemingen, verwachte effecten of mechanis ­
tische effecten/het werkingsmechanisme duiden op een bepaalde 
neurotoxiciteit.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Beoordeling van potentiële ontwikkelingsimmunotoxiciteit (cohort 3)  
51. Op PND 56 (± drie dagen) moeten van elke behandelgroep 10 mannelijke 
en 10 vrouwelijke dieren in cohort 3 (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest; 
alle nesten zijn met ten minste 1 jong vertegenwoordigd; willekeurig gese ­
lecteerd) worden gebruikt in een test van de T-cel-afhankelijke antilichaam ­
respons, d.w.z. de primaire respons van IgM-antilichaam op een 
T-celafhankelijk antigeen, zoals Sheep Red Blood Cells (SRBC) of Keyhole 
Limpet Hemocyanin (KLH), conform de huidige procedures voor immuno ­
toxiciteittesten (14) (15). De respons kan worden beoordeeld door telling van specifieke plaquevormende cellen (PFC) in de milt of door bepaling 
van de titer van SRBC- of KLH-specifiek IgM-antilichaam in het serum 
door middel van ELISA op de piek van de respons. De piek van de respons treedt doorgaans vier (PFC-respons) of vijf (ELISA) dagen op na intrave ­
neuze immunisatie. Als de primaire antilichaamrespons wordt getest door 
telling van plaquevormende cellen is beoordeling van subgroepen van die ­
ren op afzonderlijke dagen toegestaan, mits: het tijdstip van immunisatie en doding van de subgroepen zo valt, dat PFC's worden geteld op de piek van de respons; de subgroepen een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke 
nakomelingen uit alle dosisgroepen bevatten, met inbegrip van controles, 
en de subgroepen worden beoordeeld op ongeveer dezelfde postnatale leef ­
tijd.Blootstelling aan de teststof duurt voort tot de dag vóór verzameling van milten voor de PFC-respons of serum voor de ELISA-test.
 
Follow-upbeoordeling van potentiële reproductietoxiciteit (cohort 1B)  
52. Indien nodig kunnen dieren in cohort 1B worden doorbehandeld na PND 90 
om er een F  2 -generatie mee te fokken. Mannetjes en vrouwtjes van dezelfde 
dosisgroep moeten samen worden ondergebracht (waarbij samenplaatsing 
van siblings wordt voorkomen) gedurende maximaal twee weken, en wel 
vanaf of na PND 90, maar niet tot na PND 120. De procedures moeten op vergelijkbare wijze verlopen als voor de P-dieren. Op grond van bewijs ­
kracht kan het echter volstaan de nesten te beëindigen op PND 4 in plaats 
van ze te volgen tot de spening of daarna.
 
OBSERVATIES AAN EINDE ONDERZOEK  
Biochemisch onderzoek/hematologie  
53. Bij de P-dieren moeten systemische effecten worden gecontroleerd. Aan het 
einde worden van 10 willekeurig geselecteerde nuchtere P-mannetjes en 
-vrouwtjes per dosisgroep bloedmonsters genomen van een gedefinieerde 
plaats, die onder de juiste omstandigheden worden bewaard en worden onderworpen aan gedeeltelijke of volledige hematologische en klinisch-biochemische bepalingen, T4- en TSH-test of andere onderzoeken 
die aangewezen zijn op basis van het bekende effectprofiel van de teststof 
(zie OESO-leidraad nr. 151 (40)). De volgende hematologische parameters moeten worden onderzocht: hematocriet, hemoglobinegehalte, aantal rode bloedcellen, totaal aantal en gedifferentieerde aantallen witte bloedcellen, 
aantal bloedplaatjes en bloedstollingstijd/vermogen. Onderzoeken van 
plasma of serum moeten bestaan uit: glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal eiwit, albumine en ten minste twee enzymen die indicatief zijn voor hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotranferase, aspartaat ­
aminotransferase, alkalisch fosfatase, gammaglutamyltranspeptidase en sor ­
bitoldehydrogenase). Bepaling van andere enzymen en galzuren kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven. Daarnaast kan bloed van andere dieren worden afgenomen en bewaard voor mogelijke analyse 
op een later moment om onduidelijke effecten te helpen verhelderen of om 
gegevens over inwendige blootstelling te verkrijgen. Als er geen tweede
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
paring van P-dieren gepland staat, worden de bloedmonsters genomen vlak 
vóór of als onderdeel van de procedure bij het ingeplande doden van dieren. 
In het geval dat de dieren behouden blijven, moeten enkele dagen vóór men de dieren voor de tweede keer laat paren bloedmonsters worden verzameld. Tenzij uit bestaande gegevens van onderzoeken met herhaalde toediening 
blijkt dat de parameter niet wordt beïnvloed door de teststof, moet vóór het 
einde urineonderzoek worden gedaan met beoordeling van de volgende parameters: uiterlijk, volume, osmolaliteit of soortelijk gewicht, pH, eiwit, glucose, bloed en bloedcellen, celdébris. Urine kan ook worden verzameld 
om de uitscheiding van de teststof en/of metaboliet(en) te controleren.
 
54. Systemische effecten moeten ook gecontroleerd worden bij de F  1 -dieren. 
Aan het einde worden van 10 willekeurig geselecteerde nuchtere mannetjes 
en vrouwtjes in cohort 1A per dosisgroep bloedmonsters genomen van een 
gedefinieerde plaats, die onder de juiste omstandigheden worden bewaard en worden onderworpen aan standaard klinisch-biochemische bepalingen, waaronder de beoordeling van serumspiegels van schildklierhormonen (T4 
en TSH), hematologie (totaal aantal en gedifferentieerde aantallen witte 
bloedcellen plus aantal rode bloedcellen) en urineonderzoek.
 
55. Op de overtollige jongen op PND 4 wordt macroscopische obductie verricht 
en bepaling van schildklierhormoon- (T4) concentraties in serum dient 
overwogen te worden. Indien nodig kan neonataal (PND 4) bloed per nest worden samengevoegd voor biochemische/schildklierhormoonanalyses. Er wordt ook bloed afgenomen voor T4-en TSH-analyse van gespeende 
dieren tot de macroscopische obductie op PND 22 (F
 1 -jongen die niet 
geselecteerd zijn voor cohorten).  
Spermaparameters  
56. Bij alle mannetjes van de P-generatie moeten de spermaparameters worden 
bepaald, tenzij uit bestaande gegevens blijkt dat de spermaparameters niet 
worden beïnvloed in een 90 dagen durend onderzoek. Het onderzoek van de spermaparameters moet worden verricht bij alle mannetjes in cohort 1A.
 
57. Aan het einde worden voor alle P- en F  1 -mannetjes (cohort 1A) de teelbal- 
en bijbalgewichten geregistreerd. Ten minste één teelbal en één bijbal wor ­
den gereserveerd voor histopathologisch onderzoek. De resterende bijbal wordt gebruikt voor de telling van spermareserves in de cauda epididymis 
(16) (17). Daarnaast wordt sperma verzameld uit de cauda epididymis (of 
zaadleider) via methoden waarbij schade voor beoordeling van de motiliteit en morfologie (18) van het sperma tot een minimum beperkt wordt.
 
58. De spermamotiliteit kan onmiddellijk na het doden beoordeeld worden of 
geregistreerd worden voor latere analyse. Het percentage progressief be ­
weeglijk sperma kan subjectief worden bepaald, of objectief door middel van geautomatiseerde bewegingsanalyse (19) (20) (21) (22) (23) (24). Voor 
de beoordeling van de morfologie van het sperma moet een monster van 
sperma uit de bijbal (of zaadleider) onderzocht worden als gefixeerde of natte preparaten (25) en moeten ten minste 200 spermatozoa per monster worden ingedeeld als normaal (zowel de kop als het middendeel/staart ziet 
er normaal uit) of abnormaal. Voorbeelden van morfologische 
sperma-afwijkingen zijn fusie, geïsoleerde koppen en misvormde koppen en/of staarten (26). Misvormde of grote spermakoppen kunnen wijzen op afwijkingen in de spermiatie.
 
59. Na invriezen van spermamonsters, fixatie van preparaten en registratie van 
beelden voor spermamotiliteitanalyse op het moment van obductie (27), kan latere analyse worden beperkt tot controle- en hogedosismannetjes. Indien 
echter behandelingsgerelateerde effecten worden waargenomen, moeten de 
lagedosisgroepen eveneens worden beoordeeld.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Macroscopische obductie  
60. Bij beëindiging van het onderzoek of na voortijdige sterfte wordt op alle P- 
en F  1 -dieren obductie verricht en worden ze macroscopisch onderzocht op 
structuurafwijkingen of pathologische veranderingen. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan de organen van het voortplantingssysteem. Jongen die om humane redenen in stervende toestand zijn gedood en dode 
jongen moeten geregistreerd en, wanneer er geen sprake is van maceratie, 
onderzocht op mogelijke afwijkingen en/of doodsoorzaak en geconserveerd worden.
 
61. Voor volwassen P- en F  1 -vrouwtjes wordt een vaginaal uitstrijkje onder ­
zocht op de dag van obductie om de fase van de oestruscyclus te bepalen en dit in verband te kunnen brengen met de histopathologie in de voortplan ­
tingsorganen. De baarmoeders van alle P-vrouwtjes (en F
 1 -vrouwtjes, indien 
van toepassing) worden onderzocht op de aanwezigheid van innestelings ­
plaatsen en het aantal ervan, en wel zodanig dat dit geen belemmering vormt voor histopathologische beoordeling.
 
Gewicht van organen en conservering van weefsels — volwassen P- en 
F 1 -dieren  
62. Aan het einde van het onderzoek worden van alle P-dieren en alle vol ­
wassen F  1 -dieren uit relevante cohorten (zoals hieronder vermeld) lichaams ­
gewichten en natte gewichten van de onderstaande organen bepaald. Dit dient zo snel mogelijk na excisie te gebeuren om uitdroging te voorkomen. 
Deze organen worden vervolgens onder passende omstandigheden gecon ­
serveerd. Tenzij anders vermeld kunnen dubbele organen afzonderlijk of samen worden gewogen, al naargelang van de gebruikelijke praktijk van het uitvoerende laboratorium.
 
— baarmoeder (met eileiders en baarmoederhals), eierstokken,  
— teelballen, bijballen (totaal en cauda epididymis voor de monsters voor 
spermatellingen),  
— prostaat (dorsolaterale en ventrale delen gecombineerd). Het prostaat ­
complex moet voorzichtig worden ontdaan van aanhechtend weefsel om 
te voorkomen dat de met vloeistof gevulde zaadblaasjes lek raken. In 
het geval van een behandelingsgerelateerd effect op het totale prostaat ­
gewicht, moeten de dorsolaterale en ventrale segmenten na fixatie voor ­
zichtig worden uitgesneden en apart worden gewogen,  
— zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren en het vocht erin (als 
één geheel),  
— hersenen, lever, nieren, hart, milt, thymus, hypofyse, schildklier (na 
fixatie), bijnieren en bekende doelorganen of -weefsels.  
63. Naast de bovenstaande organen moeten monsters van perifere zenuwen, 
spieren, ruggenmerg, ogen plus oogzenuw, maag-darmkanaal, blaas, long, 
luchtpijp (met schildklier en bijschildklier eraan bevestigd), beenmerg, zaad ­
leiders (mannetjes), borstklier (mannetjes en vrouwtjes) en de vagina ge ­
conserveerd worden onder passende omstandigheden.  
64. Van dieren in cohort 1A worden alle organen gewogen en geconserveerd 
voor histopathologie.  
65. Voor onderzoek van pre- en postnataal geïnduceerde immunotoxische ef ­
fecten wordt met 10 mannelijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 1A van 
elke behandelgroep (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest; alle nesten zijn met ten minste 1 jong vertegenwoordigd; willekeurig geselecteerd) aan het einde het volgende verricht:
 
— wegen van de lymfeklieren die verband houden met de blootstellings ­
weg en zich op afstand daarvan bevinden (naast de reeds uitgevoerde 
gewichtsbepaling van de bijnieren, de thymus en de milt bij alle dieren 
in cohort 1A),  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analyse van subpopulaties van miltlymfocyten (CD4+ en CD8+ 
T-lymfocyten, B-lymfocyten en naturalkillercellen), waarbij één helft 
van de milt wordt gebruikt en de andere helft van de milt wordt ge ­
conserveerd voor histopathologische beoordeling.  
Uit analyse van subpopulaties van miltlymfocyten bij niet-geïmmuniseerde 
(cohort 1A) dieren is te bepalen of de blootstelling gerelateerd is aan een 
verschuiving in de immunologische steady state distributie van ‘helper’- 
lymfocyten (CD4+) of cytotoxische (CD8+), van de thymus afkomstige lymfocyten of naturalkiller- (NK) cellen (snelle responsen op neoplastische cellen en pathogenen).
 
66. Van dieren in cohort 1B worden de volgende organen gewogen en de 
corresponderende weefsels ervan verwerkt tot blokken:  
— vagina (niet gewogen),  
— baarmoeder met baarmoederhals,  
— eierstokken,  
— teelballen (ten minste één),  
— epididymides,  
— zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren,  
— prostaat,  
— hypofyse,  
— vastgestelde doelorganen.  
Histopathologie in cohort 1B wordt verricht indien de resultaten van cohort 
1A twijfelachtig zijn of in geval van stoffen die worden verdacht van 
toxiciteit voor de voortplanting of het hormoonsysteem.  
67. Cohorten 2A en 2B: testen op ontwikkelingsneurotoxiciteit (PND 21 of 
PND 22 en volwassen nakomelingen). Dieren in cohort 2A worden afge ­
maakt na gedragstesten, met registratie van hersengewicht en volledige 
neurohistopathologie ten behoeve van neurotoxiciteitsbeoordeling. Dieren in cohort 2B worden afgemaakt op PND 21 of PND 22, met registratie van hersengewicht en microscopisch onderzoek van de hersenen ten be ­
hoeve van neurotoxiciteitsbeoordeling. Perfusiefixatie is vereist voor dieren 
in cohort 2A en eventueel voor dieren in cohort 2B, zie testmethode B.53 (35).
 
Gewicht van organen en conservering van weefsels — gespeende F  1 - 
dieren  
68. De jongen die niet geselecteerd zijn voor cohorten, met inbegrip van onder ­
maatse dieren, worden afgemaakt na spening, op PND 22, tenzij uit de 
resultaten blijkt dat verder onderzoek bij levende dieren noodzakelijk is. Op de afgemaakte jongen wordt macroscopische obductie verricht, waar ­
onder een beoordeling van de voortplantingsorganen, zoals beschreven in 
punten 62 en 63. Van maximaal 10 jongen per geslacht per groep uit zoveel 
mogelijk nesten moeten de hersenen, milt en thymus worden gewogen en onder de juiste omstandigheden worden bewaard. Daarnaast kan van deze mannelijke en vrouwelijke jongen borstweefsel geconserveerd worden voor 
nadere microscopische analyse (
 1 ) (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)). Macro ­
scopische afwijkingen en doelweefsels moeten worden bewaard voor mo ­
gelijk histologisch onderzoek.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Uit onderzoek is gebleken dat de borstklier, in het bijzonder in de vroege ontwikkeling 
van de borstklier, een gevoelig eindpunt is voor oestrogene werking. Het wordt aanbe ­
volen eindpunten betreffende de borstklieren van jongen van beide geslachten in deze 
testmethode op te nemen, indien gevalideerd.
 Histopathologie — P-dieren  
69. Voor alle hogedosis- en controle-P-dieren wordt volledige histopathologie 
van de in punten 62 en 63 vermelde organen verricht. Organen die behan ­
delingsgerelateerde veranderingen vertonen, moeten ook worden onderzocht bij alle dieren in de lagedosisgroepen om een NOAEL te helpen bepalen. Daarnaast moeten voortplantingsorganen van alle dieren bij wie vermoeden 
bestaat van verminderde vruchtbaarheid, bv. dieren die niet paarden of 
drachtig werden of geen nakomelingen verwekten of gezonde nakomelingen voortbrachten of waarvan de oestruscyclus of het aantal, de motiliteit of de morfologie van de spermatozoa negatief was beïnvloed, en alle macrosco ­
pische letsels worden onderworpen aan histopathologische evaluatie.
 
Histopathologie — F  1 -dieren  
Dieren in cohort 1  
70. Voor alle hogedosis- en volwassen controledieren in cohort 1A wordt een 
volledig histopathologisch onderzoek van de in punten 62 en 63 vermelde 
organen verricht. Alle nesten moeten met ten minste 1 jong per geslacht 
vertegenwoordigd zijn. Organen en weefsels die behandelingsgerelateerde veranderingen vertonen en alle macroscopische letsels moeten ook worden onderzocht bij alle dieren in de lagedosisgroepen om een NOAEL te helpen 
bepalen. Voor de beoordeling van pre- en postnataal geïnduceerde effecten 
op de lymfeorganen moet ook de histopathologie van de verzamelde lym ­
feklieren en het verzamelde beenmerg worden beoordeeld van 10 manne ­
lijke en 10 vrouwelijke dieren in cohort 1A, naast de reeds verrichte histop ­
athologische beoordeling van de thymus, milt en bijnieren bij alle dieren in 
cohort 1A.
 
71. Voortplantings- en hormonale weefsels van alle dieren in cohort 1B, ver ­
werkt tot blokken zoals beschreven in punt 66, moeten histopathologisch 
worden onderzocht in geval van stoffen die worden verdacht van toxiciteit voor de voortplanting of het hormoonsysteem. Cohort 1B moet ook histo ­
logisch onderzocht worden bij twijfelachtige resultaten van cohort 1A.
 
72. Eierstokken van volwassen vrouwtjes moeten primordiale en groeiende fol ­
likels alsook corpora lutea bevatten. Een histopathologisch onderzoek moet 
daarom gericht zijn op het vaststellen van een kwantitatieve beoordeling 
van primordiale en kleine groeiende follikels alsook corpora lutea bij F  1 - 
vrouwtjes; het aantal dieren, de keuze van de eierstokcoupe en de grootte van het coupemonster moeten statistisch passend zijn voor de gebruikte 
beoordelingsprocedure. De telling van follikels kan eerst worden uitgevoerd 
bij de controle- en hogedosisdieren en in het geval van een schadelijk effect bij de laatstgenoemde, moeten lagedosisdieren worden onderzocht. Het on ­
derzoek moet bestaan uit telling van het aantal primordiale follikels en kan 
worden gecombineerd met de telling van kleine groeiende follikels ter ver ­
gelijking van behandelde en controle-eierstokken (zie OESO-leidraad nr. 151 (40)). Beoordeling van de corpora lutea moet parallel aan het testen van de oestruscyclus worden uitgevoerd, zodat de cyclusfase in de beoor ­
deling kan worden meegenomen. Er wordt onderzocht of de eileiders, baar ­
moeder en vagina op de juiste, orgaantypische wijze zijn ontwikkeld.
 
73. Met de F  1 -mannetjes wordt gedetailleerd histopathologisch onderzoek van 
de teelballen verricht om behandelingsgerelateerde effecten op de teelbal ­
differentiatie en -ontwikkeling en op de spermatogenese vast te stellen (38). Indien mogelijk moeten coupes van de rete testis onderzocht worden. Er wordt onderzocht of de caput, corpus en cauda van de bijbal en de zaad ­
leiders op de juiste, orgaantypische wijze zijn ontwikkeld. Ook worden de 
parameters ervan onderzocht die voor de P-mannetjes vereist zijn.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Dieren in cohort 2  
74. Voor alle hogedosis- en controledieren in cohort 2A wordt per geslacht 
neurohistopathologisch onderzoek verricht na afronding van de gedragstes ­
ten (na PND 75, maar niet later dan PND 90). Per geslacht worden van alle 
hogedosis- en controledieren in cohort 2B de hersenen histopathologisch 
onderzocht op PND 21 of PND 22. Organen of weefsels die behandelings ­
gerelateerde veranderingen vertonen, moeten ook worden onderzocht voor de dieren in de lagedosisgroepen om een NOAEL te helpen bepalen. Voor 
dieren in cohort 2A en 2B wordt een aantal coupes van de hersenen onder ­
zocht voor onderzoek van bulbus olfactorius, hersenschors, hippocampus, basale ganglia, thalamus, hypothalamus, middenhersenen (tectum, tegmen ­
tum en hersensteel), hersenstam en kleine hersenen. Alleen voor cohort 2A 
worden de ogen (netvlies en oogzenuw) en monsters van de perifere zenu ­
wen, spieren en het ruggenmerg onderzocht. Alle neurohistologische pro ­
cedures moeten worden uitgevoerd conform testmethode B.53 (35).
 
75. Er moeten morfometrische (kwantitatieve) evaluaties worden verricht van 
representatieve gebieden van de hersenen (homologe coupes die zorgvuldig 
zijn geselecteerd op grond van betrouwbare microscopische mijlpalen) en 
dit kan bestaan uit lengte- en/of oppervlaktebepalingen van specifieke her ­
sengebieden. Bij elke mijlpaal (niveau) moeten ten minste drie opeenvol ­
gende coupes worden genomen, zodat de meest homologe en representa ­
tieve coupe voor het te beoordelen specifieke hersengebied geselecteerd kan 
worden. De neuropatholoog moet nauwkeurig nagaan of bepaalde voor de bepaling vervaardigde coupes homoloog zijn met andere coupes in de mon ­
sterset en daarmee geschikt zijn voor opname omdat vooral lengtebepalin ­
gen over een relatief korte afstand kunnen veranderen (28). Niet-homologe 
coupes mogen niet worden gebruikt. Beoogd wordt alle dieren die voor dit doel gereserveerd zijn te bemonsteren (10/geslacht/dosisniveau), maar klei ­
nere aantallen kunnen toch toereikend zijn. Het wordt voor de doeleinden 
van deze testmethode echter doorgaans niet voldoende geacht monsters te 
nemen van minder dan zes dieren/geslacht/dosisniveau. Stereologie kan worden gebruikt om behandelingsgerelateerde effecten op parameters, zoals volume of celaantallen voor specifieke neuroanatomische gebieden, te iden ­
tificeren. Bij alle aspecten van de preparatie van weefselmonsters, d.w.z. 
vanaf de weefselfixatie tot en met de dissectie van weefselmonsters, weef ­
selbewerking en kleuren van de glaasjes, moet evenwichtig te werk worden gegaan, zodat elke partij representatieve monsters van elke dosisgroep be ­
vat. Wanneer morfometrische of stereologische analyses moeten worden 
toegepast, moet hersenweefsel bij alle dosisniveaus op hetzelfde moment in geschikte media worden ingebed om artefacten als gevolg van krimp die 
kan optreden bij langdurig bewaren in fixatiemiddel te voorkomen.
 
RAPPORTAGE  
Gegevens  
76. Gegevens worden afzonderlijk gerapporteerd en in tabelvorm samengevat. 
Indien van toepassing moet voor elke testgroep en elke generatie het vol ­
gende gerapporteerd worden: aantal dieren bij aanvang van de test, aantal dieren dat dood is aangetroffen tijdens de test of is gedood om humane 
redenen, tijdstip van sterfte of humane doding, aantal vruchtbare dieren, 
aantal drachtige vrouwtjes, aantal vrouwtjes dat een nest heeft geworpen en aantal dieren met verschijnselen van toxiciteit. Er moet ook een beschrij ­
ving worden gegeven van de toxiciteit, waaronder tijdstip van aanvang, 
duur en ernst.
 
77. Numerieke resultaten moeten met behulp van een geschikte en erkende 
statistische methode worden geëvalueerd. De statistische methoden moeten 
worden gekozen als onderdeel van de onderzoeksopzet en op passende wijze niet-normale gegevens (bv. gegevens over aantallen), gecensureerde gegevens (bv. beperkte observatietijd), niet-onafhankelijkheid (bv. nesteffec ­
ten en herhaalde parameters) en ongelijke varianties behandelen. Gegenera ­
liseerde lineaire gemengde modellen en de dosis-responsmodellen omvatten
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
een brede klasse van analytische instrumenten die geschikt kunnen zijn voor 
de gegevens die met deze testmethode worden gegenereerd. Het verslag 
moet voldoende informatie over de analysemethode en het gebruikte com ­
puterprogramma bevatten, zodat een onafhankelijke evaluator/statisticus de analyse (opnieuw) kan evalueren.
 
Evaluatie van de resultaten  
78. De bevindingen moeten geëvalueerd worden aan de hand van de waargeno ­
men effecten, met inbegrip van obductie en microscopische bevindingen. 
De evaluatie omvat het verband, of het ontbreken daarvan, tussen de dosis en de aanwezigheid, incidentie en ernst van afwijkingen, waaronder macro ­
scopische letsels. Ook moeten doelorganen, vruchtbaarheid, klinische afwij ­
kingen, gegevens over voortplanting en nestproductie, veranderingen in lichaamsgewicht, sterfte en eventuele andere toxische effecten en effecten op de ontwikkeling worden beoordeeld. Bijzondere aandacht moet worden 
geschonken aan geslachtsspecifieke veranderingen. Bij beoordeling van de 
testresultaten moet rekening worden gehouden met de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof en, indien beschikbaar, TK-gegevens, zoals overdracht via de placenta en uitscheiding in de melk.
 
Testverslag  
79. In het testverslag moet de volgende informatie die in het onderhavige 
onderzoek is verkregen van P-, F  1 - en F  2 -dieren aan de orde komen (voor 
zover relevant):  
Teststof:  
— alle relevante beschikbare informatie over de stof, toxicokinetische en 
toxicodynamische eigenschappen van de teststof,  
— identificatiegegevens,  
— zuiverheid.  
Medium (indien van toepassing):  
— motivering voor de keuze van het medium, indien geen water wordt 
gebruikt.  
Proefdieren:  
— gebruikte soort/stam,  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren,  
— herkomst, huisvesting, voer, nestmateriaal enz.,  
— gewicht van elk dier aan het begin van de test,  
— gegevens over vaginale uitstrijkjes voor P-vrouwtjes vóór aanvang van 
de behandeling (indien daar op dat moment gegevens over zijn ver ­
zameld),  
— gegevens over koppeling van de P-generatie, met vermelding van de 
mannelijke en vrouwelijke partner van een paring en succes van de paring,
 
— gegevens over nest van herkomst voor volwassen dieren van de F  1 - 
generatie.  
Testomstandigheden:  
— motivering van de keuze van de dosisniveaus,  
— bijzonderheden over de formulering van de teststof, respectievelijk de 
samenstelling van het voer, verkregen concentraties,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— stabiliteit en homogeniteit van het preparaat in het medium of de drager 
(bv. voer, drinkwater), in het bloed en/of de melk onder de gebruiks ­
omstandigheden en opslag tussen de gebruiksmomenten,  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,  
— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater 
(in ppm) naar de verkregen dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), in ­
dien van toepassing,  
— gedetailleerde gegevens over het voedsel en de waterkwaliteit (waar ­
onder samenstelling voer, indien beschikbaar),  
— gedetailleerde beschrijving van de randomisatieprocedures voor de se ­
lectie van te ruimen jongen en de toewijzing van jongen aan 
testgroepen,  
— omgevingsomstandigheden,  
— lijst van onderzoeksmedewerkers, inclusief beroepsopleiding.  
Resultaten (beknopte en afzonderlijke gegevens naar geslacht en dosis):  
— voedselconsumptie, waterconsumptie indien beschikbaar, voedseleffi ­
ciëntie (lichaamsgewichttoename per gram geconsumeerd voedsel, be ­
halve gedurende de cohabitatie- en zoogperiode) en consumptie van teststof (voor toediening via het voer/drinkwater) voor P- en F
 1 -dieren,  
— absorptiegegevens (indien beschikbaar),  
— lichaamsgewichtgegevens voor P-dieren,  
— lichaamsgewichtgegevens voor de geselecteerde F  1 -dieren na spening,  
— tijdstip van sterfte tijdens het onderzoek en of de dieren overleefden tot 
het einde van het onderzoek,  
— aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische observaties,  
— gegevens over hematologie, urineonderzoek en klinische chemie, waar ­
onder TSH en T4,  
— fenotypische analyse van miltcellen (T-, B-, NK-cellen),  
— cellulariteit van het beenmerg,  
— gegevens over toxische responsen,  
— aantal P- en F  1 -vrouwtjes met een normale of abnormale oestruscyclus 
en cyclusduur van deze vrouwtjes,  
— tijd tot paring (interval vóór coïtus, het aantal dagen tussen koppeling en 
paring),  
— toxische of andere effecten op de voortplanting, waaronder aantallen en 
percentages van dieren die hebben gepaard, geworpen en gezoogd en 
drachtig zijn geraakt, van mannetjes die bij een vrouwtje dracht hebben 
bewerkstelligd, van vrouwtjes met verschijnselen van dystokie/lang ­
durige of moeilijke worp,  
— duur van de dracht en, indien beschikbaar, van de worp,  
— aantal innestelingen, nestgrootte en percentage mannelijke jongen,  
— aantal en percentage gestorven dieren na innesteling, levendgeborenen 
en doodgeborenen,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— gewichtsgegevens van de nesten en jongen (mannetjes, vrouwtjes en 
gecombineerd), het aantal ondermaatse dieren, indien bepaald,  
— aantal jongen met macroscopisch zichtbare afwijkingen,  
— toxische of andere effecten op nakomelingen, postnatale groei, levens ­
vatbaarheid enz.,  
— gegevens over lichamelijke mijlpalen bij jongen en andere gegevens 
over de postnatale ontwikkeling,  
— gegevens over de geslachtsrijping van F  1 -dieren,  
— gegevens over functionele observaties bij jongen en volwassenen, in 
voorkomende gevallen,  
— lichaamsgewicht bij doding en gegevens over het absolute en relatieve 
orgaangewicht voor de P-dieren en volwassen F  1 -dieren,  
— obductiebevindingen,  
— gedetailleerde beschrijving van alle histopathologische bevindingen,  
— totaal aantal spermatozoa in de cauda epididymis, percentage progressief 
beweeglijke spermatozoa, percentage morfologisch normale spermatozoa 
en percentage spermatozoa met elke vastgestelde afwijking voor P- en F
 1 -mannetjes,  
— aantallen en rijpingsstadia van follikels in de eierstokken van P- en F  1 - 
vrouwtjes, indien van toepassing,  
— telling van corpora lutea in de eierstokken van F  1 -vrouwtjes,  
— statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing.  
Parameters van cohort 2:  
— gedetailleerde beschrijving van de gebruikte procedures voor de stan ­
daardisatie van observaties en procedures en operationele definities voor het scoren van observaties,
 
— lijst van alle gebruikte testprocedures en een motivering van het gebruik 
ervan,  
— gedetailleerde gegevens over de gebruikte gedrags/functie-, neuropatho ­
logische en morfometrische procedures, waaronder informatie en details over geautomatiseerde apparatuur,
 
— procedures om apparatuur te ijken en om de gelijkwaardigheid van 
apparatuur te waarborgen en om evenwichtige behandelgroepen te krij ­
gen bij het testen,  
— korte motivering waarin beslissingen genomen op basis van professio ­
neel oordeel uiteengezet worden,  
— gedetailleerde beschrijving van alle gedrags/functie-, neuropathologische 
en morfometrische bevindingen naar geslacht en dosisgroep, met in ­
begrip van zowel toenames als afnames ten opzichte van controles,  
— hersengewicht,  
— diagnoses gesteld op basis van neurologische verschijnselen en letsels, 
waaronder natuurlijk voorkomende ziekten of aandoeningen,  
— beelden van voorbeeldige bevindingen,  
— lageresolutiebeelden ter beoordeling van de homologie van coupes die 
zijn gebruikt voor morfometrie,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— statistische behandeling van resultaten, met inbegrip van statistische 
modellen die zijn gebruikt voor analyse van de gegevens, en de resul ­
taten, ongeacht de significantie ervan,  
— verband van eventuele andere toxische effecten met een conclusie over 
het neurotoxische potentieel van de teststof, naar geslacht en dosisgroep,  
— invloed van eventuele toxicokinetische informatie op de conclusies,  
— gegevens die de betrouwbaarheid en gevoeligheid van de testmethode 
ondersteunen (d.w.z. positieve en historische controlegegevens),  
— eventuele verbanden tussen neuropathologische en functie-effecten,  
— NOAEL- of benchmarkdosis voor moederdieren en nakomelingen, naar 
geslacht en dosisgroep,  
— discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond van 
de resultaten, waaronder een conclusie over de vraag of de teststof al dan niet ontwikkelingsneurotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.
 
Parameters van cohort 3:  
— IgM-antilichaamtiters in serum (sensibilisatie voor SRBC of KLH) of 
IgM PFC-eenheden in de milt (sensibilisatie voor SRBC),  
— de prestatie van de TDAR-methode moet in het kader van optimalisatie 
worden bevestigd door de test voor het eerst door een laboratorium te laten opzetten en deze periodiek (bv. jaarlijks) door alle laboratoria te 
laten opzetten,
 
— discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond van 
de resultaten, waaronder een conclusie over het feit of de teststof ont ­
wikkelingsimmunotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.  
Bespreking van de resultaten:  
Conclusies, onder meer over NOAEL-waarden voor effecten op parentale 
generatie en nakomelingen  
Alle informatie die niet tijdens het onderzoek is verkregen, maar wel nuttig 
is voor de interpretatie van de resultaten (bv. overeenkomsten van effecten met bekende neurotoxische stoffen), moet ook worden verstrekt.
 
Interpretatie van de resultaten  
80. Een uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie geeft 
informatie over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens alle fasen van de voortplantingscyclus, zo nodig. Het onderzoek geeft met name informatie over het voortplantingssysteem en over de ontwikkeling, 
groei, overleving en functie-eindpunten van nakomelingen tot PND 90.
 
81. Bij de interpretatie van de resultaten van het onderzoek moet alle beschik ­
bare informatie over de stof, waaronder fysisch-chemische, toxicokinetische en toxicodynamische eigenschappen, beschikbare relevante informatie over 
structuuranaloga en resultaten van eerder uitgevoerde toxiciteitsonderzoeken 
met de teststof (bv. acute toxiciteit, toxiciteit na herhaalde blootstelling, mechanistische onderzoeken en onderzoeken waarin wordt beoordeeld of er tussen soorten aanzienlijke kwalitatieve en kwantitatieve verschillen be ­
staan in metabole eigenschappen in vivo of in vitro), in aanmerking worden 
genomen. Resultaten van macroscopische obductie en orgaangewichten moeten indien mogelijk worden beoordeeld in samenhang met observaties die zijn verricht in andere onderzoeken met herhaalde toediening. Afnames 
in groei van nakomelingen zouden in verband kunnen staan met een invloed 
van de teststof op de melksamenstelling (29).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Cohort 2 (ontwikkelingsneurotoxiciteit)  
82. Neurogedrags- en neuropathologische resultaten moeten in samenhang met 
alle bevindingen worden geïnterpreteerd, onder gebruikmaking van een op 
bewijskracht gebaseerde aanpak met oordeel van deskundigen. Patronen van gedrags- of morfologische bevindingen, indien aanwezig, en aanwijzingen voor dosisrespons moeten worden besproken. De beoordeling van ontwik ­
kelingsneurotoxiciteit, waaronder epidemiologische onderzoeken of case ­
reports met mensen en onderzoeken met proefdieren (bv. toxicokinetische gegevens, structuur-activiteitinformatie, gegevens uit andere toxiciteits ­
onderzoeken), moet bij deze karakterisering worden meegenomen. Bij de 
beoordeling van de gegevens moet zowel de biologische als de statistische 
significantie worden besproken. De beoordeling moet het eventuele verband tussen waargenomen neuropathologische en gedragsveranderingen omvat ­
ten. Zie voor richtsnoeren over de interpretatie van resultaten op het gebied 
van ontwikkelingsneurotoxiciteit testmethode B.53 (35) en Tyl et al., 2008 
(31).
 
Cohort 3 (ontwikkelingsimmunotoxiciteit)  
83. Onderdrukking of verbetering van de immuunfunctie die is vastgesteld met 
behulp van TDAR (T-cel-afhankelijke antilichaamrespons) moet worden 
beoordeeld in samenhang met alle verrichtte observaties. De significantie 
van de uitkomst van TDAR kan worden ondersteund door andere effecten op immunologisch gerelateerde indicatoren (bv. cellulariteit van het been ­
merg, gewicht en histopathologie van lymfeweefsels, distributie van 
lymfocyten-subgroepen). Door TDAR vastgestelde effecten kunnen minder 
betekenisvol zijn in het geval van andere toxiciteiten die bij lagere bloot ­
stellingsconcentraties zijn waargenomen.
 
84. OESO-leidraad nr. 43 dient te worden geraadpleegd voor hulp bij de inter ­
pretatie van resultaten op het gebied van toxiciteit en neurotoxiciteit.  
LITERATUUR  
1. Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. 
Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment’, Critical Reviews in Toxicolo ­
gy, 36, 69-98.
 
2. Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’, Lab. Anim. Sci., 49, 530- 536.
 
3. Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, 
Washington, DC.  
4. Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.
 
5. Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Re ­
search to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’, Toxicological 
Sciences, 49, 1-4.  
6. Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Re ­
production — a Literature Survey’, Journal of the American College of Toxicologists, 14, 293-327.
 
7. Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’, 
Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
8. Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.
 
9. Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.  
10. Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.
 
11. Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, 
Cambridge, New York.  
12. Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Rey ­
nolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in 
Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
 
13. Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Se ­
paration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’, 
Biological Reproduction, 17, 298-303.  
14. Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’, Methods, 41, 9-19.  
15. Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocy ­
anin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’, Toxicology, 197, 
23-35.  
16. Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.
 
17. Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’, Journal 
of Reproduction and Fertility, 54, 103-107.  
18. Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Fol ­
lowing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’. Reproduc ­
tive Toxicology, 5, 39-44.  
19. Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’, Reproductive Toxicology, 10, 237- 244.
 
20. Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.
 
21. Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration’, Journal of Andrology, 13, 409-421.
 
22. Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’, Reproductive Toxicology, 5, 
449-458.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
23. Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.
 
24. Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epi ­
chlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’, Journal of Andrology, 10, 401-415.
 
25. Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants’, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.
 
26. OESO (2008), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ JM/MONO(2008)16, OESO, Parijs.
 
27. Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic Ana ­
lysis of Rat Sperm Motility’, Journal of Andrology, 8, 330-337.  
28. Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A ‘Best Practices’ Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’, Toxicological Patho ­
logy, 34, 296-313.
 
29. Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.
 
30. Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’, Environ ­
mental health perspectives,  115( 12), 1717-1726.
 
31. Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. So ­
botka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neuro ­
toxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’, Neu ­
rotoxicology and Teratology, 30: 349-381.
 
32. OESO (1996), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Tes ­
ting of Chemicals, No. 422, OESO, Parijs.  
33. Hoofdstuk B.43 van deze bijlage, Neurotoxiciteitsonderzoek bij knaagdie ­
ren 
34. OESO (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OESO, Parijs.
 
35. Hoofdstuk B.53 van deze bijlage, Onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxi ­
citeit  
36. Hoofdstuk B.54 van deze bijlage, Uterotrofe bioassay bij knaagdieren: Een 
kortlopende screeningstest op oestrogene eigenschappen  
37. Hoofdstuk B.55 van deze bijlage, Hershberger-bioassay bij ratten: een 
kortlopende screeningstest op (anti)androgene eigenschappen  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
38. OESO (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OESO, Parijs.  
39. OESO (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OESO, Parijs.
 
40. OESO (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OESO, Parijs.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Aanhangsel 1  
Parameters en observaties opgenomen in de functional observational battery (cohort 2a)  
Verblijfskooi & open veld Manipulatief Fysiologisch  
Houding Verplaatsingsgemak Temperatuur 
Onwillekeurig klonisch & tonisch Hanteringsgemak Lichaamsgewicht 
Sluiting ooglid Spierspanning Pupilrespons Rechtopstaan van het haar Respons op benadering Pupilgrootte Speekselafscheiding Respons op aanraking Traanvorming Auditieve respons Geluiden maken Respons op kneep in staart Op achterpoten staan Oprichtrespons 
Afwijkingen in gang Spreiding poot bij landing 
Opwinding Grijpkracht voorpoot Stereotiep gedrag Grijpkracht achterpoot Bizar gedrag Vlekken Afwijkingen in ademhaling
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Aanhangsel 2  
DEFINITIES  
Stof: een stof of mengsel.  
Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R-STEROÏDOGENESETEST  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 456 (2011) van de 
OESO. In 1998 is de OESO met hoge prioriteit een actie gestart om be ­
staande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (1). Het Conceptueel kader van de OESO van 2000 voor het testen en beoordelen 
van hormoonontregelende stoffen omvat vijf niveaus, waarbij elk niveau 
correspondeert met een ander niveau van biologische complexiteit (1). De in deze testmethode beschreven H295R-steroïdogenesebepaling in vi ­
tro(H295R) maakt gebruik van een humane adrenocarcinoomcellijn (NCI- 
H295R-cellen) en is een „in-vitro-bepaling die mechanistische gegevens 
oplevert” op niveau 2, te gebruiken voor screening en prioritering. De ontwikkeling en standaardisatie van de test als screening voor chemische effecten op de steroïdogenese, met name de productie van 17 β-oestradiol 
(E2) en testosteron (T), is in een meerstappenproces verricht. De H295R- 
test is geoptimaliseerd en gevalideerd (2) (3) (4) (5).
 
2. Het doel van de H295R-steroïdogenesetest is stoffen te detecteren die van 
invloed zijn op de productie van E2 en T. De H295R-test is bedoeld om 
xenobiotica te identificeren die aangrijpen op de endogene componenten die de intracellulaire biochemische pathway vormen, te beginnen met de op ­
eenvolging van reacties van cholesterol tot de productie van E2 en/of T. De 
H295R-test is niet bedoeld om stoffen te identificeren die de steroïdogenese 
beïnvloeden via effecten op de hypothalamus-hypofyse-gonaden (HPG)-as. Het doel van de test is een JA/NEEN-antwoord te geven ten aanzien van het vermogen van een stof om de productie van T en E2 te induceren of 
remmen; maar in sommige gevallen kunnen kwantitatieve resultaten worden 
verkregen (zie punten 53 en 54). De resultaten van de test worden uit ­
gedrukt in relatieve veranderingen in hormoonproductie ten opzichte van de oplosmiddelcontroles (solvent controls — SC's). Het doel van de test is 
niet om specifieke mechanistische informatie op te leveren over de inter ­
actie van de teststof met het endocriene systeem. Onderzoek is verricht met de cellijn om effecten te identificeren op specifieke enzymen en tussenpro ­
ducten zoals progesteron (2).
 
3. De in deze testmethode gebruikte definities en afkortingen staan in het 
aanhangsel. Een gedetailleerd protocol met instructies voor de bereiding van oplossingen, het kweken van cellen en diverse aspecten van de test 
is beschikbaar als Aanhangsel I-III van het OESO-document ‘Multi-Labo ­
ratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modula ­
tors of Testosterone and Estradiol Production’ (4).
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN  
4. Bij de biosynthese van geslachtssteroïdhormonen zijn vijf verschillende 
enzymen betrokken die zes verschillende reacties katalyseren. Enzymatische omzetting van cholesterol in pregnenolon door het 
cytochroom-P450 (CYP)-enzym dat de zijketen van cholesterol splitst 
(CYP11A) is de eerste stap in een serie van biochemische reacties die leiden tot de synthese van steroïde eindproducten. Afhankelijk van de volg ­
orde van de volgende twee reacties splitst de steroïdogene pathway zich in 
twee routes, de Δ
 5 -hydroxysteroïd-pathway en Δ 4 -ketosteroïd-pathway, die 
bij de productie van androsteendion weer samenkomen (figuur 1).  
5. Androsteendion wordt in testosteron (T) omgezet door 17 β-hydroxysteroïd ­
dehydrogenase (17 β-HSD). Testosteron is zowel een tussenproduct als een 
eindhormoon. Bij mannen kan T in dihydrotestosteron (DHT) worden om ­
gezet door 5 α-reductase, dat wordt aangetroffen in de celmembranen, kern ­
omhulling, en het endoplasmatisch reticulum van doelweefsels met een androgene werking zoals de prostaat en de zaadblaasjes. DHT is een aan ­
zienlijk krachtiger androgeen dan T en wordt ook als een eindproducthor ­
moon beschouwd. De H295R-test meet geen DHT (zie punt 10).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Het enzym in de steroïdogene pathway dat androgene stoffen omzet in 
oestrogene stoffen is aromatase (CYP19). CYP19 zet T in 17 β-oestradiol 
(E2) en androsteendion in oestron om. E2 en T worden beschouwd als eindproducthormonen van de steroïdogene pathway.
 
7. De specificiteit van de lyaseactiviteit van CYP17 verschilt voor de tussen ­
productsubstraten tussen soorten. Bij de mens heeft het enzym een voorkeur 
voor substraten van de Δ 5 -hydroxysteroïd-pathway (pregnenolon), terwijl bij 
de rat substraten in de Δ 4 -ketosteroïd-pathway (progesteron) de voorkeur 
hebben (19). Dergelijke verschillen in de CYP17-lyaseactiviteit kunnen bepaalde soortafhankelijke verschillen verklaren in de reactie op stoffen 
die de steroïdogenese in vivo veranderen (6). De H295-cellen blijken de 
vorming van bijnierenzymen en patronen van de steroïdproductie (20) bij de mens het dichtst te benaderen, maar het is bekend dat ze enzymen vormen voor zowel de Δ
 5 -hydroxysteroïd- als de Δ 4 -ketosteroïd-pathways voor de 
androgeensynthese (7) (11) (13) (15).  
Figuur 1  
Steroïdogene pathway in H295R-cellen
  
NB: 
Enzymen staan cursief, hormonen vet en pijlen geven de syntheserichting 
aan. Grijze achtergrond betekent corticosteroïde pathways/producten. Ge ­
slachtssteroïdhormonen/producten staan omcirkeld. CYP = cytochroom-P450; HSD = hydroxysteroïddehydrogenase; DHEA = 
dehydro-epiandrosteron.
 
8. De humane H295R-adrenocarcinoomcellijn is een bruikbaar  in-vitro- model 
voor onderzoek naar de effecten op de steroïdhormoonsynthese (2) (7) (8) (9) (10). De H295R-cellijn vormt genen die coderen voor alle sleutelenzy ­
men voor de hierboven beschreven steroïdogenese (11) (15) (figuur 1). Dit 
is een unieke eigenschap omdat in-vivo-expressie van deze genen weefsel- 
en ontwikkelingsstadiumspecifiek is met meestal niet één weefsel of één ontwikkelingsstadium met expressie van alle bij de steroïdogenese betrok ­
ken genen (2). H295R-cellen hebben fysiologische eigenschappen van zo ­
naal ongedifferentieerde humane foetale adrenale cellen (11). De cellen 
vertegenwoordigen een uniek in-vitro-systeem omdat ze het vermogen heb ­
ben om alle steroïdhormonen te produceren die in de volwassen bijnier ­
schors en gonaden worden aangetroffen, waardoor kan worden getest op 
effecten op zowel corticosteroïdsynthese als de productie van geslachtsste ­
roïdhormonen zoals androgenen en oestrogenen, hoewel de test alleen ge ­
valideerd is om T en E2 te detecteren. Door het testsysteem vastgelegde veranderingen in de vorm van verandering van de productie van T en E2 
kunnen het resultaat zijn van tal van verschillende interacties tussen test ­
stoffen en steroïdogene functies die door de H295R-cellen worden verricht.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
Dat zijn onder meer modulatie van de expressie, synthese of functie van 
enzymen die betrokken zijn bij de productie, transformatie of eliminatie van 
steroïdhormonen (12) (13) (14). Remming van de hormoonproductie kan worden veroorzaakt door directe competitieve binding aan een enzym in de pathway, impact op cofactoren zoals NADPH (Nicotinamide Adenine Di ­
nucleotide Phosphate) en cAMP (cyclic Adenosine Monophosphate), en/of 
verhoging van het steroïdmetabolisme of onderdrukking van de genexpres ­
sie van bepaalde enzymen in de steroïdogenese-pathway. Hoewel remming een functie kan zijn van zowel directe als indirecte bij de hormoonproductie 
betrokken processen, is inductie meestal van indirecte aard, zoals door 
beïnvloeding van cofactoren zoals NADPH en cAMP (zoals in het geval van forskoline), vermindering van het steroïdmetabolisme (13), en of upre ­
gulatie van de steroïdogene genexpressie.
 
9. De H295R-test heeft verschillende voordelen:  
— de test maakt detectie mogelijk van zowel verhoging als verlaging van 
de productie van zowel T als E2,  
— hij maakt een directe beoordeling mogelijk van de potentiële impact van 
de stof op de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van cellen. Dit is een 
belangrijke eigenschap omdat daarmee onderscheid kan worden gemaakt tussen effecten die worden veroorzaakt door cytotoxiciteit en die welke worden veroorzaakt door directe interactie van stoffen met steroïdogene 
pathways, wat niet mogelijk is in weefselexplantatiesystemen die be ­
staan uit meerdere celtypes met wisselende sensitiviteit en functionaliteit,
 
— er hoeven geen dieren te worden gebruikt,  
— de H295R-cellijn is op de markt verkrijgbaar.  
10. De belangrijkste beperkingen van de test zijn de volgende:  
— de metabole capaciteit is onbekend maar waarschijnlijk vrij beperkt; 
daarom worden stoffen die metabool geactiveerd moeten worden waar ­
schijnlijk bij deze test gemist,  
— omdat de H295R uit bijnierweefsel verkregen is, bezit zij de enzymen 
die in staat zijn om de gluco- en mineraalcorticoïden en ook de ge ­
slachtshormonen te produceren; daarom kunnen effecten op de productie van gluco- en mineraalcorticoïden de in de test waargenomen concen ­
traties van T en E2 beïnvloeden,
 
— DHT wordt niet gemeten; daarom wordt niet verwacht dat stoffen ge ­
detecteerd kunnen worden die 5 α-reductase remmen; in dat geval kan de 
Hershberger-test (16) worden gebruikt,  
— de H295R-test detecteert geen stoffen die de steroïdogenese verstoren 
door beïnvloeding van de hypothalamus-hypofyse-gonaden (HPG)-as 
omdat dit alleen bij intacte dieren kan worden onderzocht.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
11. Het doel van de test is om stoffen te detecteren die de productie van T en 
E2 beïnvloeden. T is ook een tussenproduct in de pathway om E2 te 
produceren. De test kan stoffen detecteren die normaliter de enzymen van 
de steroïdogenese-pathway remmen of induceren.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. De test wordt meestal verricht onder standaard celkweekomstandigheden in 
24-wells kweekplaten. Ook andere plaatgroottes kunnen voor de test wor ­
den gebruikt; maar het zaaien en de experimentele omstandigheden moeten worden aangepast om aan de prestatiecriteria te kunnen blijven voldoen.
 
13. Na een acclimatisatieperiode van 24 uur in multiwellplaten worden de 
cellen 48 uur blootgesteld aan zeven concentraties van de teststof, minstens 
in drievoud. Oplosmiddel en een bekende remmer en inductor van de 
hormoonproductie worden gebruikt bij een vaste concentratie als negatieve en positieve controles. Aan het eind van de blootstellingsperiode wordt het medium uit elke well verwijderd. Direct na verwijdering van het medium 
wordt de levensvatbaarheid van cellen in elke well geanalyseerd. Concen ­
traties van hormonen in het medium kunnen worden gemeten met diverse methoden waaronder op de markt verkrijgbare hormoonmetingkits en/of 
instrumentele technieken zoals vloeistofchromatografie-massaspectrometrie 
(LC-MS). Gegevens worden uitgedrukt als x-voudige verandering ten op ­
zichte van oplosmiddelcontrole en de laagste concentratie die nog effect geeft (Lowest-Observed-Effect-Concentration — LOEC). Als de test nega ­
tief is, wordt de hoogste geteste concentratie gemeld als de No-Observed- 
Effect-Concentration (NOEC). Conclusies over het vermogen van een stof om de steroïdogenese te beïnvloeden moeten worden gebaseerd op minstens twee onafhankelijke reeksen van metingen. De eerste reeks kan als bereiks ­
bepaling dienen met daaropvolgende aanpassing van de concentraties voor 
reeksen 2 en 3, waar van toepassing, als problemen met oplosbaarheid of cytotoxiciteit worden ondervonden of de activiteit van de stof aan het einde van het bereik van de geteste concentraties lijkt te zijn.
 
KWEEKPROCEDURE  
Cellijn  
14. De NCI-H295R-cellen zijn op de markt verkrijgbaar bij American Type 
Culture Collections (ATCC) na ondertekening van een Material Transfer Agreement (MTA) (
 1 ). 
Inleiding  
15. Vanwege verandering in de E2-producerende capaciteit van de cellen bij 
toenemende leeftijd/passages (2), moeten cellen worden gekweekt volgens een specifiek protocol voordat ze worden gebruikt; het aantal passages sinds de cellen ontdooid zijn en ook het aantal passages waarbij de cellen werden 
ingevroren en in vloeibaar stikstof werden opgeslagen moeten worden vast ­
gelegd. Het eerste getal geeft het feitelijke aantal celpassages aan, het tweede getal beschrijft het aantal passages waarbij de cellen werden in ­
gevroren en opgeslagen. Zo zouden cellen die werden ingevroren na pas ­
sage 5 en ontdooid en dan driemaal gesplitst (4 passages waarbij de vers 
ontdooide cellen als passage 1 worden geteld) nadat ze opnieuw waren gekweekt, als passage 4.5 worden gelabeld. Een voorbeeld van de num ­
mering staat in aanhangsel I van het validatierapport (4).
 
16. Voorraadmedium wordt gebruikt als basis voor de verrijkte en vriesmedia. 
Verrijkt medium is een noodzakelijk bestanddeel bij celkweek. Vries ­
medium wordt speciaal ontwikkeld om impactvrij invriezen van cellen voor langdurige opslag mogelijk te maken. Vóór gebruik moet Nu-serum 
(of een vergelijkbaar serum met dezelfde eigenschappen waarvan is aange ­
toond dat het gegevens oplevert die voldoen aan de vereisten van de test en kwaliteitscontrole (QC)), dat een bestanddeel is van verrijkte media, worden geanalyseerd op achtergrond T- en E2-concentraties. De bereiding van deze 
oplossingen wordt beschreven in aanhangsel II van het validatierapport (4).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, (http://www.lgcstandards-atcc.org/).
 17. Na de start van een H295R-celkweek op basis van een originele 
ATCC-partij moeten cellen in vijf passages worden gekweekt (d.w.z. de 
cellen worden 4 keer gesplitst). Passage vijf-cellen worden dan in vloeibaar stikstof ingevroren voor opslag. Voor het invriezen van de cellen moet een metingreeks worden verricht met een monster van de voorgaande passage 
vier-cellen op een QC-plaat (zie punten 36 en 37) om vast te stellen of de 
basale productie van hormonen en de reactie op positieve controlestoffen voldoen aan de kwaliteitscontrolecriteria voor de test zoals gedefinieerd in tabel 5.
 
18. H295R-cellen moeten gekweekt, in vloeibaar stikstof ingevroren en opge ­
slagen worden om ervoor te zorgen dat er altijd cellen van de geschikte passage/leeftijd beschikbaar zijn voor kweek en gebruik. Het maximale aantal passages na het kweken van een nieuwe (
 1 ) of ingevroren (  2 ) partij 
cellen dat aanvaardbaar is voor gebruik in de H295R-test mag niet hoger 
zijn dan 10. Zo zouden aanvaardbare passages voor kweken van cellen uit een partij die bij passage 5 ingevroren zijn 4.5 tot 10.5 zijn. Voor cellen die uit deze ingevroren partijen worden gekweekt, moet de in punt 19 omschre ­
ven procedure worden gevolgd. Deze cellen moeten nog eens minstens vier 
(4) passages (passage 4.5) worden gekweekt voor ze in de test worden gebruikt.
 
Cellen uit de ingevroren voorraad kweken  
19. De procedure voor het kweken van cellen uit ingevroren voorraad moet 
worden gebruikt als een nieuwe partij cellen uit de opslag in vloeibaar stikstof wordt gehaald om te worden gebruikt bij het kweken en testen. 
Details over deze procedure staan in aanhangsel III van het validatierapport 
(4). Cellen worden uit opslag in vloeibaar stikstof gehaald, snel ontdooid, in verrijkt medium in een centrifugebuis geplaatst, bij kamertemperatuur ge ­
centrifugeerd, opnieuw gesuspendeerd in verrijkt medium, en overgebracht 
in een kweekfles. Het medium moet de daaropvolgende dag worden ver ­
vangen. De H295R-cellen worden in een incubator gekweekt bij 37 °C met 5 % CO
 2 in luchtatmosfeer en het medium wordt 2-3 keer per week ver ­
nieuwd. Als de cellen ongeveer 85-90 % confluent zijn, moeten deze wor ­
den gesplitst. Splitsen van de cellen is nodig om ervoor te zorgen dat de 
cellen gezond blijven en groeien en om cellen te houden om biologische tests op te verrichten. De cellen worden drie keer met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (phosphate-buffered saline — PBS, zonder Ca
 2+ Mg 2+. ) ge­
spoeld en van de kweekfles losgemaakt door toevoeging van een geschikt 
losmakingsenzym, bijvoorbeeld trypsine, in PBS (zonder Ca  2+ Mg 2+ ). Di­
rect nadat de cellen van de kweekfles zijn losgekomen, moet de enzymactie worden gestopt door toevoeging van verrijkt medium in een verhouding van 
3 × het voor de enzymbehandeling gebruikte volume. Cellen worden in een 
centrifugebuis geplaatst, bij kamertemperatuur gecentrifugeerd, het superna ­
tant wordt verwijderd en de pellet met cellen wordt opnieuw gesuspendeerd in verrijkt medium. Een geschikte hoeveelheid celoplossing wordt in de 
nieuwe kweekfles geplaatst. De hoeveelheid celoplossing moet worden aan ­
gepast zodat de cellen binnen 5-zeven dagen confluent zijn. De aanbevolen subkweekratio is 1:3 tot 1:4. De plaat moet zorgvuldig worden gelabeld. De cellen zijn nu klaar voor gebruik in de test en overgebleven cellen moeten 
in vloeibaar stikstof worden ingevroren zoals beschreven in punt 20.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Nieuwe partij” verwijst naar een verse partij cellen die van ATCC ontvangen is. 
( 2 ) „Bevroren partij” verwijst naar cellen die eerder gekweekt zijn en dan in een ander 
laboratorium dan ATCC zijn ingevroren.
 Invriezen van H295R-cellen (cellen klaarmaken voor opslag in vloei ­
baar stikstof)  
20. Om H295R-cellen klaar te maken voor invriezen moet de procedure die 
hierboven is omschreven voor het splitsen van cellen worden gevolgd tot de stap voor het opnieuw suspenderen van de pellet met cellen aan de onder ­
kant van de centrifugebuis. Hier wordt de pellet met cellen opnieuw gesus ­
pendeerd in een vriesmedium. De oplossing wordt overgebracht in een cry ­
ogene flacon, correct gelabeld, en 24 uur ingevroren bij – 80 °C waarna de cryogene flacon in vloeibaar stikstof wordt overgebracht voor opslag. Details voor deze procedures staan in aanhangsel III van het validatierapport (4).
 
Cellen op de plaat aanbrengen en preïncuberen voor testen  
21. Het aantal 24-wells platen, klaargemaakt zoals omschreven in punt 19, dat 
nodig zal zijn hangt af van het aantal te testen stoffen en de confluentie van 
de cellen in de kweekschalen. Als vuistregel geldt dat één kweekfles (75 cm
 2 ) van 80-90 % confluente cellen voldoende cellen zal leveren voor één 
tot 1,5 (24-wells) platen bij een doeldichtheid van 200 000 tot 300 000 
cellen per ml medium wat leidt tot ongeveer 50-60 % confluentie in de 
wells na 24 uur (figuur 2). Dit is meestal de optimale celdichtheid voor hormoonproductie in de test. Bij hogere dichtheden kan het productiepa ­
troon voor T en ook E2 veranderen. Voordat de test voor het eerst wordt 
verricht, wordt aanbevolen om verschillende dichtheden tussen 200 000 en 
300 000 cellen per ml te testen, en de dichtheid die na 24 uur leidt tot 50- 60 % confluentie in de well te kiezen voor verdere experimenten.
 
Figuur 2  
Fotomicrografie van H295R-cellen bij een zaaidichtheid van 50 % in een 24-wells 
kweekplaat na 24 uur, genomen aan de rand (A) en het midden (B) van een well
  
22. Het medium wordt uit de kweekfles gepipetteerd, en de cellen worden 3 
keer met steriel PBS (zonder Ca  2+ Mg 2+ ) gespoeld. Een enzymoplossing (in 
PBS) wordt toegevoegd om de cellen van de kweekfles los te maken. Na voldoende tijd voor losmaking van de cellen wordt de enzymreactie gestopt door toevoeging van verrijkt medium in een verhouding van 3 × het volume 
dat gebruikt is voor de enzymbehandeling. Cellen worden in een centrifu ­
gebuis geplaatst, bij kamertemperatuur gecentrifugeerd, het supernatant wordt verwijderd, en de pellet met cellen wordt opnieuw gesuspendeerd in verrijkt medium. De celdichtheid wordt berekend met bv. een hemocy ­
tometer of een celteller. De celoplossing moet worden verdund tot de voor 
het aanbrengen op de plaat gewenste dichtheid en grondig gemengd om een
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
homogene celdichtheid te verzekeren. De cellen moeten op de plaat worden 
aangebracht met 1 ml van de celoplossing/well en de platen en wells 
moeten worden gelabeld. De gezaaide platen worden geïncubeerd bij 37 °C bij 5 % CO
 2 in de luchtatmosfeer gedurende 24 uur om de cellen zich aan 
de wells te laten vasthechten.  
VEREISTEN VOOR KWALITEITSCONTROLE  
23. Het is essentieel dat exacte hoeveelheden oplossing en monster in de wells 
worden gedaan omdat deze hoeveelheden de concentraties bepalen die bij de berekeningen van de resultaten van de test worden gebruikt.
 
24. Voor de start van de celkweek en eventuele volgende tests moet elk labo ­
ratorium de sensitiviteit van haar hormoonmetingssysteem (punten 29-31) 
aantonen.  
25. Als op antilichamen gebaseerde hormoonmetingstesten gebruikt gaan wor ­
den, moeten voor de test wordt gestart de te testen stoffen worden geanaly ­
seerd op hun vermogen om een verstoring te geven van het meetsysteem dat 
wordt gebruikt om T en E2 te kwantificeren, volgens punt 32.  
26. DMSO is het aanbevolen oplosmiddel voor de test. Als een ander oplos ­
middel wordt gebruikt, moet het volgende worden vastgesteld:  
— de oplosbaarheid van de teststof, forskoline en prochloraz in het oplos ­
middel, en  
— de cytotoxiciteit als functie van de concentratie van het oplosmiddel.  
Aanbevolen wordt dat de maximaal toegestane concentratie oplosmiddel 
niet hoger mag zijn dan 10 × verdunning van de laagste cytotoxische con ­
centratie van het oplosmiddel.  
27. Voordat de test voor de eerste keer wordt verricht, moet het laboratorium 
een kwalificeringsexperiment verrichten om aan te tonen dat het laborato ­
rium in staat is om geschikte omstandigheden te bereiken en vast te houden 
voor celkweek en experimenten voor het testen van stoffen zoals beschre ­
ven in punten 33-35.  
28. Bij het starten van een test met een nieuwe partij moet een reeks metingen 
plaatsvinden met een controleplaat voordat een nieuwe partij cellen wordt 
gebruikt voor beoordeling van de prestaties van de cellen zoals omschreven 
in punten 36 en 37.  
Prestaties van het hormoonmetingssysteem  
Sensitiviteit, nauwkeurigheid, precisie van de methode en kruisreactiviteit 
met monstermatrix  
29. Elk laboratorium kan een hormoonmetingssysteem naar keuze gebruiken 
voor de analyse van de productie van T en E2 door H295R-cellen, zolang 
deze aan de prestatiecriteria voldoet, inclusief de kwantificeringslimiet (Li ­
mit of Quantification — LOQ). Nominaal zijn dit 100 pg/ml voor T en 10 pg/ml voor E2, die gebaseerd zijn op de in de validatieonderzoeken waar ­
genomen basale hormoonconcentraties. Maar hogere of lagere concentraties 
kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de in het verrichtende laboratorium bereikte basale hormoonconcentraties. Voor de start van de QC-plaat en testmetingen moet het laboratorium aantonen dat de te gebruiken hormoon ­
test hormoonconcentraties in verrijkt medium met voldoende nauwkeurig ­
heid en precisie kan meten om te voldoen aan de in tabellen 1 en 5 gespecificeerde QC-criteria door verrijkt medium te analyseren waaraan een interne hormooncontrolestof is toegevoegd. Aan verrijkt medium moe ­
ten minstens drie concentraties van elk hormoon worden toegevoegd (bv. 
100, 500 en 2 500 pg/ml T; 10, 50 en 250 pg/ml E2, of de laagst mogelijke
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
concentraties op basis van de detectielimieten van het gekozen hormoon ­
metingssysteem kan worden gebruikt voor de laagste concentraties toege ­
voegd T en E2) en geanalyseerd. De gemeten hormoonconcentraties van niet-geëxtraheerde monsters moeten binnen 30 % van de nominale concen ­
traties liggen, en variatie tussen herhaalde metingen van hetzelfde monster 
mag niet hoger zijn dan 25 % (zie ook tabel 8 voor aanvullende 
QC-criteria). Als aan deze QC-criteria wordt voldaan, wordt ervan uit ­
gegaan dat de gekozen hormoonmetingstest voldoende nauwkeurig en pre ­
cies is en geen kruisreactie vertoont met componenten in het medium (mon ­
stermatrix) in een mate die een aanmerkelijke invloed op het resultaat van 
de test te verwachten zou doen verwachten. In dat geval is geen extractie van monsters vóór meting van de hormonen vereist.
 
30. Als aan de QC-criteria in tabellen 1 en 8 niet wordt voldaan, kan dit komen 
door een aanmerkelijk matrixeffect, en moet een experiment met medium 
waaraan een extractie is toegevoegd worden verricht. Een voorbeeld van een extractieprocedure wordt beschreven in aanhangsel II van het validatie ­
rapport (4). Metingen van de hormoonconcentraties in de geëxtraheerde 
monsters moeten in drievoud worden verricht (
 1 ). Als kan worden aange ­
toond dat na extractie de componenten van het medium de hormoondetectie zoals gedefinieerd door de QC-criteria niet verstoren, worden alle volgende 
experimenten verricht met geëxtraheerde monsters. Als na extractie niet aan 
de QC-criteria kan worden voldaan, is het gebruikte hormoonmetingssys ­
teem ongeschikt voor het doel van de H295R-steroïdogenesetest, en moet een andere hormoondetectiemethode worden gebruikt.
 
Standaardcurve  
31. De hormoonconcentraties van de oplosmiddelcontroles (SC's) moeten bin ­
nen het lineaire deel van de standaardcurve vallen. Bij voorkeur liggen de SC-waarden dicht bij het midden van het lineaire deel om ervoor te zorgen 
dat inductie en remming van de hormoonsynthese gemeten kunnen worden. 
Verdunningen van te meten medium (of extracten) moeten dienovereenkom ­
stig worden geselecteerd. Het lineaire verband moet worden vastgesteld aan de hand van een passende statistische methode.
 
Stofinterferentietest  
32. Als op antilichamen gebaseerde testen zoals Enzyme-Linked Immunosor ­
bent Assays (ELISA's) en Radio-Immuno Assays (RIA's) gebruikt gaan worden om hormonen te meten, moet elke stof worden getest op mogelijke 
interferentie met het te gebruiken hormoonmetingssysteem voordat het fei ­
telijke testen van stoffen begint (aanhangsel III van het validatierapport (4)), want sommige stoffen kunnen deze tests verstoren (17). Als interferentie optreedt die ≥ 20 % is van de basale hormoonproductie voor T en/of E2 
zoals door hormoonanalyse vastgesteld, moet de Chemical Hormone Assay 
Interference Test (zoals beschreven in aanhangsel III van het validatierap ­
port (4) afdeling 5.0) worden verricht op alle verdunningen van voorraad ­
oplossing van de teststof om de drempelwaarde te vinden waarbij aanmer ­
kelijke (≥ 20 %) interferentie optreedt. Als de interferentie minder is dan 
30 %, mogen de resultaten voor de interferentie worden gecorrigeerd. Als de interferentie hoger is dan 30 %, zijn de gegevens ongeldig en moeten de
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) NB:  Als extractie vereist is, worden voor elk extract drie duplometingen verricht. Elk 
monster wordt maar 1 keer geëxtraheerd.
 gegevens bij deze concentraties worden genegeerd. Als aanmerkelijke inter ­
ferentie van een teststof met een hormoonmetingssysteem optreedt bij meer 
dan één niet-cytotoxische concentratie, moet een ander hormoonmetings ­
systeem worden gebruikt. Om interferentie van vervuilende stoffen te ver ­
mijden, wordt aanbevolen hormonen te extraheren uit het medium met een 
geschikt oplosmiddel; methoden daarvoor zijn te vinden in het validatie ­
rapport (4).  
Tabel 1  
Prestatiecriteria voor hormoonmetingssystemen  
Parameter Criterium  
Sensitiviteit meetmethode Kwantificeringslimiet (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Efficiëntie hormoonextractie (alleen 
als extractie nodig is) De gemiddelde teruggevonden hoe ­
veelheden (op basis van drievoudige metingen) van de toegevoegde hoe ­
veelheden hormoon mogen niet 
meer dan 30 % afwijken van de toe ­
gevoegde hoeveelheden. 
Interferentie met de stof (alleen 
systemen op basis van antilicha ­
men) Er mag geen aanmerkelijke ( ≥ 30 % 
van de basale hormoonproductie van het desbetreffende hormoon) kruis ­
reactiviteit optreden met één van de 
door de cellen geproduceerde 
hormonen (
 b ) ( c ). 
( a ) NB:  Meetmethodelimieten zijn gebaseerd op de waarden voor basale hormoon ­
productie in tabel 5, en berusten op prestatie. Als een hogere basale hormoon ­
productie kan worden bereikt, kan de limiet hoger liggen. 
( b ) Sommige T- en E2-antilichamen kunnen een hoger percentage kruisreactie ver ­
tonen met androsteendion resp. oestron. In dergelijke gevallen is het niet mogelijk 
om de effecten op 17 β-HSD nauwkeurig te bepalen. Maar de gegevens kunnen 
nog wel bruikbare informatie opleveren over de effecten op de oestrogeen- of 
androgeenproductie in het algemeen. In zulke gevallen moeten de gegevens wor ­
den uitgedrukt als androgeen/oestrogeenrespons in plaats van E2 en T. 
( c ) Dit zijn: cholesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoxycorticosteron, corticoste ­
ron, aldosteron, 17 α-pregnenolon, 17 α-progesteron, deoxycortisol, cortisol, 
DHEA, androsteendion, oestron.  
Vaardigheidstest laboratorium  
33. Voordat laboratoria onbekende stoffen testen, moeten zij aantonen dat zij in 
staat zijn om de geschikte omstandigheden voor celkweek en tests te be ­
reiken en in stand te houden die voor een goed verloop van de test vereist zijn, door een laboratoriumvaardigheidstest te doen. Omdat de prestatie van een test direct afhankelijk is van het laboratoriumpersoneel dat de test ver ­
richt, moeten deze procedures deels worden herhaald als er andere mede ­
werkers in het laboratorium komen.
 
34. Deze vaardigheidstest wordt verricht onder dezelfde omstandigheden die in 
punten 38-40 staan door cellen bloot te stellen aan 7 stijgende concentraties 
van sterke, matige en zwakke inductoren en remmers en aan een negatieve stof (zie tabel 2). Met name zijn de te testen stoffen de krachtige inductor forskoline (CAS-nr. 66575-29-9); de krachtige remmer prochloraz (CAS- 
nr. 67747-09-5); de matige inductor atrazine (CAS-nr. 1912-24-9); de ma ­
tige remmer aminoglutethimide (CAS-nr. 125-84-8); de zwakke inductor
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
(E2-productie) en zwakke remmer (T-productie) bisfenol A (CAS-nr. 80-05- 
7), en de negatieve stof humaan choriongonadotropine (HCG) (CAS- 
nr. 9002-61-3) zoals getoond in tabel 2. Metingen worden op afzonderlijke platen verricht voor alle stoffen aan de hand van de opzet in tabel 6. Bij elke dagelijkse reeks metingen moet een QC-plaat (tabel 4, punten 36-37) 
worden meegenomen voor de vaardigheidsstoffen.
 
Tabel 2  
Vaardigheidsstoffen en blootstellingsconcentraties  
Vaardigheidsstof Testconcentraties [ μM] 
Prochloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskoline 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Atrazine 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10 
Aminoglutethimide 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10 
HCG 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 30, 1, 3, 10  
( a ) Oplosmiddel (DMSO)-controle (0), 1 μl DMSO/well  
Blootstelling van H295R aan de vaardigheidsstoffen moet tijdens de labo ­
ratoriumvaardigheidstest in platen met 24 wells worden verricht. De dose ­
ring is in μM voor alle doses van de teststof. De doses moeten worden 
toegediend in DMSO bij 0,1 % v/v per well. Alle testconcentraties moeten 
in drie wells worden getest (tabel 6). Voor metingen van elke stof worden 
afzonderlijke platen gebruikt. Bij elke dagelijkse reeks metingen wordt één QC-plaat meegenomen.
 
35. Cellevensvatbaarheid- en hormoonanalyses moeten worden verricht zoals 
omschreven in punten 42-46. De drempelwaarde (concentratie bij laagst 
waargenomen effect, LOEC) en classificatiebeslissing moeten worden ge ­
meld en vergeleken met de waarde in tabel 3. De gegevens worden als acceptabel beschouwd als ze voldoen aan de LOEC en beslissingsclassifi ­
catie in tabel 3.
 
Tabel 3  
Drempelwaarden (LOEC's) en beslissingsclassificaties voor vaardigheidsstoffen  
CAS-nr. LOEC [μM] Beslissingsclassificatie 
T E2 T E2  
Prochloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a )(Remming) + (  v )(Remming) 
Forskoline 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Inductie) + (Inductie) 
Atrazine 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Inductie) + (Inductie) 
Aminoglutethi ­
mide 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (  v )(Remming) + (  v )(Remming)  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS-nr. LOEC [μM] Beslissingsclassificatie 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (  v )(Remming) + (Inductie) 
HCG 9002-61-3 n.v.t. n.v.t. Negatief Negatief  
( a ) +, positief 
n.v.t. niet van toepassing omdat geen veranderingen konden optreden na blootstelling aan niet-cytotoxische concentraties van negatieve controle.
 
Kwaliteitscontroleplaat  
36. De kwaliteitscontrole (QC)-plaat wordt gebruikt om de prestatie van de 
H295R-cellen te verifiëren onder standaard kweekomstandigheden en om een historische database op te zetten voor hormoonconcentraties in oplos ­
middelcontroles, positieve en negatieve controles, en ook andere 
QC-metingen in de tijd.
 
— De prestaties van de H295R-cellen moeten worden beoordeeld met een 
QC-plaat voor elke nieuwe ATCC-partij of na gebruik voor de eerste keer van een eerder ingevroren voorraad cellen, tenzij de laboratorium ­
vaardigheidstest (punten 32-34) met die partij cellen gedaan is.
 
— Een QC-plaat geeft een volledige beoordeling van de testomstandighe ­
den (zoals cellevensvatbaarheid, oplosmiddelcontrole, negatieve en po ­
sitieve controles, en ook variabiliteit binnen en tussen testen) bij het testen van stoffen en moet onderdeel zijn van elke reeks testmetingen.
 
37. De QC-test wordt verricht in een 24-wells plaat en volgt dezelfde procedu ­
res voor incubatie, dosering, cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteit, hormoon ­
extractie en hormoonanalyse die in de punten 38 tot en met 46 voor het 
testen van stoffen beschreven zijn. De QC-plaat bevat blanco's, oplosmid ­
delcontroles, en twee concentraties van een bekende inductor (forskoline, 1, 10 μM) en remmer (prochloraz, 0,1, 1 μM) van de E2- en T-synthese. 
Daarnaast wordt MeOH gebruikt in bepaalde wells als positieve controle 
voor de levensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest. Een gedetailleerde omschrij ­
ving van de plaatlayout is te vinden in tabel 4. De criteria waaraan de QC-plaat moet voldoen staan in tabel 5. De minimale basale hormoonpro ­
ductie voor T en E2 moet zowel in de oplosmiddelcontrole- als blanco wells 
worden bereikt.
 
Tabel 4  
Layout van de QC-plaat voor het testen van de prestaties van niet-blootgestelde H295R- 
cellen en cellen die zijn blootgesteld aan bekende remmers (PRO = prochloraz) en 
stimulators (FOR = forskoline) van de E2- en T-productie. Na beëindiging van het 
blootstellingsexperiment en verwijdering van het medium wordt een oplossing van 70 % methanol toegevoegd aan alle MeOH-wells om te dienen als positieve controle 
voor cytotoxiciteit (zie cytotoxiciteitstest in aanhangsel III van het validatierapport (4)).
 
1 2 3 4 5 6  
A Blanco (  w ) Blanco (  w ) Blanco (  w ) Blanco (  w ) 
MeOH (  x ) Blanco (  w ) 
MeOH (  x ) Blanco (  w ) 
MeOH (  x ) 
B DMSO (  y ) 
1 μl DMSO (  y ) 
1 μl DMSO (  y ) 
1 μl DMSO (  y ) 
1 μl 
(MeOH) (  x ) DMSO (  y ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  x ) DMSO (  y ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  x ) ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D. FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Cellen in blanco wells krijgen alleen medium (dus geen oplosmiddel). 
( b ) Methanol (MeOH) wordt toegevoegd  nadat  de blootstelling is beëindigd en het medium uit deze wells is 
verwijderd. 
( c ) DMSO oplosmiddelcontrole (1 μl/well).  
Tabel 5  
Prestatiecriteria voor de QC-plaat  
T E2  
Basale productie van 
hormoon in de oplosmiddelcontrole (SC) ≥ 5 keer de LOQ ≥ 2,5 keer de LOQ 
Inductie (10 μM fors­
koline) ≥ 1,5 keer de SC ≥ 7,5 keer de SC 
Remming (1 μM prochlo ­
raz) ≥ 0,5 keer de SC ≥ 0,5 keer de SC
 
PROCEDURE VOOR BLOOTSTELLING AAN EEN STOF  
38. De gepreïncubeerde cellen worden uit de incubator verwijderd (punt 21) en 
onder een microscoop gecontroleerd om er zeker van te zijn dat ze in goede staat verkeren (aanhechting, morfologie) vóór toediening.
 
39. De cellen worden in een bioveiligheidskast geplaatst en het verrijkte me ­
dium wordt verwijderd en vervangen door nieuw verrijkt medium (1 ml/ well). DMSO is het oplosmiddel dat voor deze testmethode bij voorkeur 
wordt gebruikt. Als er redenen zijn om andere oplosmiddelen te gebruiken 
moet de wetenschappelijke motivering daarvoor worden beschreven. Cellen worden aan de teststof blootgesteld door 1 μl van de geschikte stamoplos ­
sing in DMSO (zie aanhangsel II van het validatierapport (4)) per 1 ml 
verrijkt medium (vakvolume) toe te voegen. Dit leidt tot een uiteindelijke 
concentratie van 0,1 % DMSO in de wells. Om een goede menging te verzekeren wordt over het algemeen geprefereerd dat de desbetreffende stamoplossing van de teststof in DMSO wordt vermengd met verrijkt me ­
dium om voor elke dosis de gewenste uiteindelijke concentratie te verkrij ­
gen, en dat het mengsel direct na verwijdering van oud medium aan elke well wordt toegevoegd. Als deze optie wordt gebruikt, moet de concentratie DMSO (0,1 %) in alle wells gelijk blijven. De wells die de hoogste twee 
concentraties bevatten worden met een stereomicroscoop visueel beoordeeld 
op de vorming van precipitaat of troebelheid als indicatie van onvolledige oplosbaarheid van de teststof. Als dergelijke omstandigheden (troebelheid, vorming van precipitaat) worden waargenomen, worden de wells met de 
volgende lagere concentraties ook gecontroleerd (enzovoorts); de concen ­
traties die niet volledig zijn opgelost moeten van verdere beoordeling en analyse worden uitgesloten. De plaat wordt teruggezet in de incubator bij 37 °C onder 5 % CO
 2 in de luchtatmosfeer gedurende 48 uur. De layout 
van de teststofplaat staat in tabel 6. Stamoplossingen 1-7 tonen de plaatsing 
van toenemende doses van de teststof.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabel 6  
Dosisschema voor de blootstelling van H295R-cellen aan teststof in een 24-wells plaat  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Stamoplos ­
sing 4 Stamoplos ­
sing 4 Stamoplos ­
sing 4 
B Stamoplos ­
sing 1 Stamoplos ­
sing 1 Stamoplos ­
sing 1 Stamoplos ­
sing 5 Stamoplos ­
sing 5 Stamoplos ­
sing 5 
C Stamoplos ­
sing 2 Stamoplos ­
sing 2 Stamoplos ­
sing 2 Stamoplos ­
sing 6 Stamoplos ­
sing 6 Stamoplos ­
sing 6 
D Stamoplos ­
sing 3 Stamoplos ­
sing 3 Stamoplos ­
sing 3 Stamoplos ­
sing 7 Stamoplos ­
sing 7 Stamoplos ­
sing 7  
40. Na 48 uur worden de blootgestelde platen uit de incubator verwijderd en 
elke well wordt onder de microscoop gecontroleerd op celomstandigheden 
(aanhechting, morfologie, mate van confluentie) en tekenen van cytotoxici ­
teit. Het medium voor elke well wordt in twee gelijke hoeveelheden ge ­
splitst (ongeveer 490 μl elk) en in twee afzonderlijke en goed gelabelde 
flacons overgebracht (dat wil zeggen een aliquot om voor elke well een 
reservemonster te hebben). Om te voorkomen dat cellen uitdrogen wordt 
medium uit één rij of kolom tegelijk verwijderd en vervangen met medium voor de cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest. Als de levensvatbaarheid/ cytotoxiciteit van de cellen niet direct gemeten wordt, wordt 200 μl PBS 
met Ca
 2+ en Mg  2+ aan elke well toegevoegd. De media worden ingevroren 
bij – 80 °C tot verdere verwerking om de hormoonconcentraties te analy ­
seren (zie punten 44-46). Hoewel bij – 80 °C en in medium bewaard T en E2 over het algemeen minstens drie maanden stabiel zijn, moet de hor ­
moonstabiliteit tijdens de opslag in elk laboratorium worden vastgelegd.
 
41. Direct na verwijdering van het medium wordt voor elke blootstellingsplaat 
de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van de cellen bepaald.  
Bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen  
42. Er kan een cellevensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest naar keuze worden ge ­
bruikt om de mogelijke impact van de teststof op de levensvatbaarheid van 
de cellen te bepalen. De test moet een reële meting van het percentage levensvatbare cellen in een well kunnen geven, of aangetoond moet kunnen worden dat het direct vergelijkbaar is met (een lineaire functie van) de 
Live/Dead® Assay (zie aanhangsel III van het validatierapport (4)). Een 
andere test waarvan is aangetoond dat deze net zo goed werkt is de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide]-test (18). De beoordeling van de cellevensvatbaarheid met de bovenstaande methoden 
is een relatieve meting die niet noodzakelijkerwijs een lineair verband ver ­
toont met het absolute aantal cellen in een well. Daarom moet de analist een subjectieve parallelle visuele beoordeling van elke well verrichten, en er moeten digitale foto's van de SC's en de twee hoogste niet-cytotoxische 
concentraties worden genomen en bewaard zodat later de ware celdichtheid 
kan worden beoordeeld mocht dat nodig zijn. Als na visuele inspectie of op grond van de levensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest er een toename van het aantal cellen lijkt te zijn, moet de kennelijke toename worden geverifieerd. 
Als een hoger aantal cellen wordt geverifieerd, moet dit in het testrapport 
worden vermeld. De levensvatbaarheid van de cellen wordt uitgedrukt ten opzichte van de gemiddelde respons in de SC's, wat beschouwd wordt als 100 % levensvatbare cellen, en wordt op een voor de gebruikte cellevens ­
vatbaarheid/cytotoxiciteitstest passende wijze berekend. Voor de MTT-test 
kan de volgende formule worden gebruikt:
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% levensvatbare cellen =  (respons in well – gemiddelde respons in met 
MeOH behandelde [= 100 % dode] wells) ÷ (gemiddelde respons in 
SC-wells – gemiddelde respons in met MeOH behandelde [= 100 % dode] wells)
 
43. Wells met een levensvatbaarheid lager dan 80 % ten opzichte van de ge ­
middelde levensvatbaarheid in de SC's (= 100 % levensvatbaar), mogen niet in de uiteindelijke data-analyse worden meegenomen. Remming van de 
steroïdogenese die optreedt in aanwezigheid van bijna 20 % cytotoxiciteit 
moet zorgvuldig worden beoordeeld om er zeker van te zijn dat cytotoxi ­
citeit niet de oorzaak is van de remming.
 
Hormoonanalyse  
44. Elk laboratorium kan voor de analyse van T en E2 een hormoonmetings ­
systeem naar keuze gebruiken. Er kunnen reservealiquots van medium uit 
elke behandelingsgroep worden gebruikt voor het bereiden van oplossingen 
om de concentratie binnen het lineaire deel van de standaardcurve te bren ­
gen. Zoals opgemerkt in punt 29 moet elk laboratorium aantonen dat zijn hormoonmetingssysteem (bv.ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) aan de 
QC-criteria voldoet door verrijkt medium waaraan een interne hormooncon ­
trole is toegevoegd te analyseren voordat QC-metingen worden verricht of stoffen worden getest. Om ervoor te zorgen dat de componenten van het testsysteem de meting van hormonen niet verstoren, kan het nodig zijn de 
hormonen voor meting ervan uit de media te extraheren (zie punt 30 voor 
de omstandigheden waaronder een extractie al of niet vereist is). Aanbe ­
volen wordt om extractie te verrichten volgens de procedures in aanhangsel III van het validatierapport (4).
 
45. Als een op de markt verkrijgbare testkit wordt gebruikt om de hormoon ­
productie te meten, moet de hormoonanalyse worden verricht zoals om ­
schreven in de handleidingen van de fabrikant van de testkit. De meeste fabrikanten hebben een eigen procedure waarmee de hormoonanalyses wor ­
den verricht. Oplossingen van monsters moeten zodanig worden aangepast 
dat de verwachte hormoonconcentraties voor de oplosmiddelcontroles in het 
midden van het lineaire bereik van de standaardcurve voor de individuele test vallen (aanhangsel III van het validatierapport (4)). Waarden buiten het lineaire deel van de standaardcurve moeten worden verworpen.
 
46. Uiteindelijke hormoonconcentraties worden als volgt berekend:  
Voorbeeld: 
Geëxtraheerd: 450 μl medium 
Gereconstitueerd in: 250 μl testbuffer 
Oplossing in test: 1:10 (om het monster binnen het lineaire 
bereik van de standaardcurve te brengen) 
Hormoonconcentratie in test: 150 pg/ml (al aangepast aan concentratie 
per ml getest monster) 
Recovery: 89 % 
Uiteindelijke hormoonconcentra ­
tie = (Hormoonconcentratie (per ml) ÷ re ­
covery) (verdunningsfactor) 
Uiteindelijke hormoonconcentra ­
tie = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Selectie van testconcentraties  
47. Er moeten minimaal twee onafhankelijke metingreeksen van de test plaats ­
vinden. Tenzij eerdere informatie zoals informatie over oplosbaarheidslimie ­
ten of cytotoxiciteit een basis vormt voor selectie van testconcentraties, wordt aanbevolen dat de testconcentraties voor de eerste reeks met inter ­
vallen van log
 10 worden verricht, waarbij 10  –3 M de maximale concentratie 
is. Als de stof oplosbaar is, en bij geen van de geteste concentraties cyto ­
toxisch, en de eerste reeks was negatief voor alle concentraties, dan moet dit worden bevestigd in een extra reeks onder dezelfde omstandigheden als de eerste reeks (tabel 7). Als de resultaten van de eerste reeks ambigu zijn (dat 
wil zeggen de x-voudige verandering is statistisch significant t.o.v. de SC 
bij slechts één concentratie) of positief (dat wil zeggen de x-voudige ver ­
andering bij twee of meer opeenvolgende concentraties is statistisch signi ­
ficant), moet de test worden herhaald zoals aangegeven in tabel 7 door de 
geselecteerde testconcentraties te verfijnen. De testconcentraties in metingen 
twee en drie (waar van toepassing) moeten worden aangepast op de basis van de resultaten van uiterste concentraties van de eerste reeks metingen waarbij een effect optrad met concentratie-intervallen van 1/2-log (bv.als de 
oorspronkelijke reeks van 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM bij 1 en 10 
μM tot inductie leidde, moeten de bij de tweede reeks geteste concentraties 
0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM zijn), tenzij lagere concentraties gebruikt 
moeten worden om een LOEC te bereiken. In dat laatste geval moeten bij 
de tweede meting minstens vijf concentraties onder de laagste bij de eerste 
reeks geteste concentratie worden gebruikt aan de hand van een 1/2-log- schaal. Als de tweede reeks de eerste reeks niet bevestigt (d.w.z. statistische significantie treedt niet op bij de eerder positief geteste concentratie ± 1 
concentratiestap), moet een derde experiment verricht worden in de oor ­
spronkelijke testomstandigheden. Ambigue resultaten bij de eerste reeks worden als negatief beschouwd als het waargenomen effect bij geen van de twee volgende reeksen kan worden bevestigd. Ambigue resultaten wor ­
den als positieve respons (effect) beschouwd als de respons bij minstens één 
volgende meting kan worden bevestigd binnen een ± 1 concentratiestap (zie afdeling 55 voor de procedure voor interpretatie van gegevens).
 
Tabel 7  
Beslissingsmatrix voor mogelijke uitkomstscenario's  
Reeks 1 Reeks 2 Reeks 3 Beslissing 
Scenario Beslissing Scenario Beslissing Scenario Positief Negatief  
Negatief Bevestig (  a ) Negatief Stop X 
Negatief Bevestig (  a ) Positief Verfijn (  b ) Negatief X 
Ambigu (  c ) Verfijn (  b ) Negatief Bevestig (  a ) Negatief X 
Ambigu (  c ) Verfijn (  b ) Negatief Bevestig (  a ) Positief X 
Ambigu (  c ) Verfijn (  b ) Positief X 
Positief Verfijn (  b ) Negatief Bevestig (  a ) Positief X  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Reeks 1 Reeks 2 Reeks 3 Beslissing 
Scenario Beslissing Scenario Beslissing Scenario Positief Negatief  
Negatief Bevestig (  a ) Positief Verfijn (  b ) Positief X 
Positief Verfijn (  b ) Positief Stop X  
( a ) Bevestig eerdere reeks met dezelfde experimentele opzet. 
( b ) Herhaal test met concentratie-intervallen van 1/2-log (aan weerszijden van de concentratie die in het voorgaande experiment 
significant anders testte). 
( c ) X-voudige verandering bij een concentratie is statistisch significant verschillend van de SC.  
Kwaliteitscontrole van de testplaat  
48. Naast de criteria voor de QC-plaat moet ook worden voldaan aan andere 
kwaliteitscriteria met betrekking tot een acceptabele variatie tussen duplo ­
wells, duplo-experimenten, lineariteit en sensitiviteit van hormoonmetings ­
systemen, variabiliteit tussen duplohormoonmetingen van hetzelfde monster, 
en percentage recovery van hormoontoevoegingen na extractie van medium (waar van toepassing, zie punt 30 over extractievereisten); deze staan in tabel 8. Gegevens moeten binnen het acceptabele bereik vallen dat gedefi ­
nieerd is voor elke parameter dat voor nadere beoordeling wordt overwo ­
gen. Als aan deze criteria niet wordt voldaan, moet in de spreadsheet worden aangegeven dat voor het desbetreffende monster niet aan de QC-criteria is voldaan, en dat het monster opnieuw moet worden geanaly ­
seerd of uit de dataset moet worden verwijderd.
 
Tabel 8  
Acceptabel(e) bereik en/of variatie (%) van testplaatparameters voor H295R-test.  
(LOQ: Kwantificeringslimiet van hormoonmetingssysteem. CV: Variatiecoëfficiënt; SC: 
Oplosmiddelcontrole; DPM: Desintegraties per minuut.)  
Vergelijking tussen T E2  
Basale hormoonproductie 
in SC's X maal hoger dan LOQ ≥ 5 maal ≥ 2,5 maal 
Blootstellingsexperimenten 
— Binnen plaat-CV voor SC's (duplowells) Absolute concentraties ≤ 30 % ≤ 30 % 
Blootstellingsexperimenten 
— Tussen plaat-CV voor 
SC's (duplo-experimenten) X-voudige verandering ≤ 30 % ≤ 30 % 
Hormoonmetingsysteem — 
sensitiviteit Detecteerbare x-voudige 
afname t.o.v. SC ≥ 5 maal ≥ 2,5 maal 
Hormoonmetingssysteem 
— Duplometing CV voor SC's (
 a ) Absolute concentraties ≤ 25 % ≤ 25 % 
Mediumextractie — Re ­
covery van interne 3H- standaard (waar van toe ­
passing) DPM ≥ 65 % Nominaal
 
( a ) Verwijst naar duplometingen van hetzelfde monster  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
GEGEVENSANALYSE EN RAPPORTAGE  
Gegevensanalyse  
49. Om de relatieve toename/afname van de door de stof gewijzigde hormoon ­
productie te beoordelen, moeten de resultaten worden genormaliseerd naar 
de gemiddelde SC-waarde van elke testplaat, en de resultaten uitgedrukt in veranderingen ten opzichte van de SC in elke testplaat. Alle gegevens moeten worden uitgedrukt in gemiddeld ± 1 standaarddeviatie (SD).
 
50. Alleen hormoongegevens uit wells waarin de cytotoxiciteit minder dan 
20 % was moeten in de gegevensanalyse worden opgenomen. De relatieve veranderingen moeten als volgt worden berekend:
 
Relatieve verandering =  (Hormoonconcentratie in elke well) ÷ (Gemid ­
delde hormoonconcentratie in alle wells met oplosmiddelcontrole).  
51. Als door visuele inspectie van de well of op grond van de in punt 42 
beschreven levensvatbaarheid/cytotoxiciteitstest er een toename in aantal 
cellen lijkt te zijn, moet de kennelijke toename worden geverifieerd. Als een hoger aantal cellen wordt geverifieerd, moet dit in het testrapport wor ­
den vermeld.
 
52. Voordat statistische analyses worden verricht, moeten de aannames van 
normaliteit en homogeniteit van variantie worden beoordeeld. Normaliteit 
moet worden beoordeeld met standaard waarschijnlijkheidsplots of een an ­
dere geschikte statistische methode (bv. toets van Shapiro-Wilk). Als de gegevens (x-voudige veranderingen) niet normaal verdeeld zijn, moet trans ­
formatie van de gegevens worden geprobeerd om een normale verdeling zo 
goed mogelijk te benaderen. Als de gegevens normaal verdeeld zijn of een normale verdeling benaderen, moeten verschillen tussen de stofconcentra ­
tiegroepen en SC's worden geanalyseerd met een parametrische test (bv. 
toets van Dunnett) waarbij concentratie de onafhankelijke, en respons (x- 
voudige verandering) de afhankelijke variabele is. Als gegevens niet nor ­
maal verdeeld zijn, moet een passende niet-parametrische test worden ge ­
bruikt (bv. Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank test). Verschillen worden 
als significant beschouwd bij p ≤ 0,05. Statistische beoordelingen worden 
verricht op basis van gemiddelde waarden voor elke well die onafhankelijke duplogegevenspunten vertegenwoordigen. Verwacht wordt dat vanwege de 
grote dosisintervallen bij de eerste reeks (log
 10 -schaal), het in veel gevallen 
niet mogelijk zal zijn om een duidelijke concentratie-responsrelatie te be ­
schrijven waar de twee hoogste doses zich op het lineaire deel van de sigmoïde curve zullen bevinden. Daarom wordt voor de eerste reeks of 
enige andere dataset waar deze omstandigheid optreedt (bv. waar geen 
maximale effectiviteit kan worden geschat) een vaste-variabelestatistiek type I toegepast.
 
53. Als meer dan twee datapunten op het lineaire deel van de curve liggen en 
waar maximale effectiviteit kan worden berekend (wat wordt verwacht van 
enkele van de 2  nd reeksen die worden verricht met semi-log-intervallen van 
de blootstellingsconcentratie) moet een probit-, logit- of ander passend re ­
gressiemodel worden gebruikt om effectieve concentraties te berekenen (bv.EC50 en EC20).
 
54. De resultaten moeten zowel in grafiek (staafdiagram die gemiddelde +/– 1 
SD weergeeft) als in tabel (LOEC/NOEC, effectrichting, en sterkte van de 
maximale respons die deel uitmaakt van het dosis-responsdeel van de ge ­
gevens) worden weergegeven (zie figuur 3 voor een voorbeeld). De gege ­
vensbeoordeling wordt alleen als geldig beschouwd als deze is gebaseerd op 
minstens twee onafhankelijk verrichte reeksen. Een experiment of reeks 
wordt als onafhankelijk beschouwd als dit/deze verricht is op een andere datum met een nieuwe set oplossingen en controles. Het bij reeksen 2 en 3 (zo nodig) gebruikte concentratiebereik kan worden aangepast op basis van 
de resultaten van reeks 1 om het dosisresponsbereik dat de LOEC bevat 
beter te definiëren (zie punt 47).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Figuur 3  
Voorbeeld van de presentatie en beoordeling van gegevens die met de test verkregen zijn in grafiek en tabel.  
Een asterisk wijst op een statistisch significant verschil ten opzichte van oplosmiddelcontrole ( p< 0,05 ). LOEC: Laagst 
waargenomen effectieve concentratie; Max verandering: Maximale sterkte van de respons die bij elke concentratie is 
waargenomen ten opzichte van de gemiddelde SC-respons (= 1)
  
Stof LOEC Max. verandering  
Forskoline 0,01 0,15-voudig 
Letrozol 0,001 29-voudig  
Procedure voor gegevensinterpretatie  
55. Een teststof wordt positief geacht als de x-voudige inductie statistisch ver ­
schilt ( p ≤ 0,05) van de oplosmiddelcontrole bij twee opeenvolgende con ­
centraties in minstens twee onafhankelijke reeksen (tabel 7). Een teststof 
wordt negatief geacht na twee onafhankelijke negatieve reeksen, of bij drie reeksen, te weten twee negatieve reeksen en een ambigue of positieve reeks. Als de bij drie onafhankelijke experimenten verkregen gegevens niet vol ­
doen aan de beslissingscriteria in tabel 7, zijn de resultaten van het experi ­
ment niet interpreteerbaar. Resultaten bij concentraties die de oplosbaar ­
heidslimieten te boven gaan of bij cytotoxische concentraties mogen niet bij de interpretatie van de resultaten worden meegenomen.
 
Testverslag  
56. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Testfaciliteit:  
— naam faciliteit en locatie,  
— onderzoeksleider en andere medewerkers en hun verantwoordelijkheden 
in het onderzoek,  
— datums dat het onderzoek begon en stopte.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Teststof, reagens en controles:  
— identiteit (naam/CAS-nr. waar van toepassing), herkomst, partijnummer, 
zuiverheid, leverancier, en kenmerken van de teststof, reagens en 
controles,  
— fysische aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de 
teststof,  
— bewaarcondities en de methode en frequentie van bereiding van test ­
stoffen, reagens en controles,  
— stabiliteit van de teststof.  
Cellen:  
— herkomst en type van de cellen,  
— aantal celpassages (celpassage-identificator) van bij test gebruikte cellen,  
— omschrijving van procedures voor instandhouding van celkweken.  
Vereisten voorafgaande aan de test (waar van toepassing):  
— omschrijving en resultaten van test op interferentie 
teststof-/hormoontest,  
— omschrijving en resultaten van meting van efficiëntie van 
hormoonextractie,  
— standaarden en calibratiecurves voor alle te verrichten analytische testen,  
— detectielimieten voor de geselecteerde analytische testen.  
Testomstandigheden:  
— samenstelling van media,  
— concentratie van de teststof,  
— celdichtheid (geschatte of gemeten celconcentratie na 24 uur en 48 uur),  
— oplosbaarheid van de teststof (limiet van oplosbaarheid, indien bepaald),  
— incubatietijd en omstandigheden.  
Testresultaten:  
— onbewerkte gegevens voor elke well voor controles en teststoffen-elke 
duplometing in de vorm van de oorspronkelijke gegevens die zijn ge ­
leverd door het instrument dat is gebruikt om de hormoonproductie te meten (bv. OD, fluorescentie-eenheden, DPM enz.),
 
— validatie van normaliteit of verklaring van gegevenstransformatie,  
— gemiddelde respons +/– 1 SD voor elke gemeten well,  
— gegevens over cytotoxiciteit (testconcentraties die cytotoxiciteit veroor ­
zaakte),  
— bevestiging dat aan de QC-vereisten is voldaan,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— relatieve verandering t.o.v. oplosmiddelcontrole gecorrigeerd voor 
cytotoxiciteit,  
— een staafdiagram die de relatieve (x-voudige verandering) toont bij elke 
concentratie, SD en statistische significantie zoals omschreven in punten 
49-54.  
Gegevensinterpretatie:  
— pas de procedure voor gegevensinterpretatie toe op de resultaten en 
bespreek bevindingen.  
Bespreking:  
— zijn er indicaties uit het onderzoek over de mogelijkheid dat de T/E2- 
gegevens beïnvloed kunnen zijn door indirecte effecten op de gluco- en mineraalcorticoïden?
 
Conclusies  
LITERATUUR  
1. OESO (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assess ­
ment of Endocrine Disrupting Chemicals, in aanhangsel 2 van hoofdstuk 
B.54 van deze bijlage  
2. Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., 
Wu, R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells 
for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.
 
3. Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. 
Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23-30.
 
4. OESO (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Parijs. Te vinden op [http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html]
 
5. OESO (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Parijs. Te vinden op: [http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
6. Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Te vinden op: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf]  
7. Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. 
Sci., 81, 78-89.
 
8. Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.
 
9. Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrineactive chemicals: Model devel ­
opment for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118: 265-272.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
10. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.  
11. Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocorti ­
cal carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid bio ­
synthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.
 
12. He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the ste ­
roidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in 
the H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.  
13. Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, 
Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.
 
14. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 
17:1137-1148.
 
15. Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. 
Endocrinol. Metab., 77, 731-737.
 
16. Hoofdstuk B.55 van deze bijlage: Hershberger-bioassay bij ratten: een 
kortlopende screeningstest op (anti)androgene eigenschappen.  
17. Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.
 
18. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65, 55-63.
 
19. Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.  
20. Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484- 
492.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Aanhangsel  
DEFINITIES  
Confluentie  is de dekking of proliferatie die voor cellen is toegestaan op of door 
het kweekmedium.  
Stof betekent een substantie of mengsel.  
CV verwijst naar de variatiecoëfficiënt en wordt gedefinieerd als de verhouding 
van de standaarddeviatie van een verdeling tot haar rekenkundige gemiddelde.  
CYP  betekent cytochroom-P450-mono-oxygenases, een familie van genen en de 
enzymen die erdoor worden geproduceerd die betrokken zijn bij het katalyseren van een breed scala van biochemische reacties waaronder de synthese en het metabolisme van steroïdhormonen.
 
DPM  zijn desintegraties per minuut. Dit is het aantal atomen in een gegeven 
hoeveelheid radioactief materiaal waarvan wordt vastgesteld dat deze in een minuut zijn gedesintegreerd.
 
E2 is 17β-oestradiol, het belangrijkste oestrogeen in zoogdiersystemen.  
H295R -cellen zijn humane adrenocarcinoomcellen die de fysiologische eigen ­
schappen hebben van zonaal ongedifferentieerde humane foetale adrenale cellen 
en die alle enzymen van de steroïdogenese-pathway vormen. Ze zijn beschikbaar bij de ATCC.
 
Vriesmedium  wordt gebruikt om cellen in te vriezen en bewaren. Het bestaat uit 
voorraadmedium plus BD NuSerum en dimethylsulfoxide.  
Lineair bereik  is het bereik binnen de standaardcurve voor een hormoonme ­
tingssysteem waar de resultaten evenredig zijn met de concentratie van de in het monster aanwezige geanalyseerde stof.
 
LOQ  betekent "Limit of Quantification" of kwantificeringslimiet, en is de laagste 
hoeveelheid van een stof die kan worden onderscheiden van de afwezigheid van die stof (een blanco waarde) binnen een gestelde betrouwbaarheidslimiet. Voor het doel van deze methode wordt de LOQ normaliter gedefinieerd door de 
fabrikant van de testsystemen als deze niet anderszins gespecificeerd is.
 
LOEC  betekent Lowest Observed Effect Concentration, ofwel de laagste con ­
centratie waarbij de respons van de test statistisch verschillend is van die van de oplosmiddelcontrole.
 
NOEC  is de No Observed Effect Concentration, ofwel de hoogste geteste con ­
centratie als de test geen positieve respons geeft.  
Passage  is het aantal keren dat de cellen worden gesplitst na de start van een 
kweek op basis van ingevroren voorraad. De eerste passage die gestart is op basis 
van de ingevroren voorraad krijgt nummer één (1) toegewezen. Cellen die 1 keer 
gesplitst zijn worden gelabeld als passage 2 enz.  
PBS is phosphate-buffered saline ofwel fosfaatgebufferde zoutoplossing van Du ­
becco.  
Quality Control , afgekort QC of wel kwaliteitscontrole, verwijst naar de maat ­
regelen die nodig zijn om zeker te stellen dat gegevens valide zijn.  
QC-plaat  is een 24-wells plaat met twee concentraties van de positieve en 
negatieve controles om de prestaties te controleren van een nieuwe partij cellen of om de positieve controles te leveren voor de test als stoffen worden getest.
 
Metingreeks (run)  is een onafhankelijk experiment gekenmerkt door een nieuwe 
set oplossingen en controles.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Voorraadmedium  is de basis voor de bereiding van andere reagens. Het bevat 
een 1:1 mengsel van Dulbecco's Modified Eagle's Medium en Ham's F-12 Nu ­
trient mix (DMEM/F12) in een 15 mM HEPES-buffer zonder fenol rood of natriumbicarbonaat. Natriumbicarbonaat wordt als buffer toegepast, zie aanhang ­
sel II van het validatierapport (4).
 
Verrijkt medium  bestaat uit voorraadmedium plus BD Nu-Serum en ITS+ pre ­
mium mix, zie aanhangsel II van het validatierapport (4).  
Steroïdogenese  is de synthetische pathway die van cholesterol tot de vorming 
van diverse steroïdhormonen leidt. Verschillende tussenproducten in de steroïd ­
synthese-pathways zoals progesteron en testosteron zijn op zich belangrijke hor ­
monen maar dienen ook als precursors voor hormonen verderop in de syntheti ­
sche pathway.  
T betekent testosteron, een van de twee belangrijkste androgenen in 
zoogdiersystemen.  
Teststof  betekent alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  
Testplaat  is de plaat waarop H295R-cellen aan teststof worden blootgesteld. 
Testplaten bevatten de oplosmiddelcontrole en de teststof in zeven concentraties 
in drievoud.  
Trypsine 1X  is een verdunde oplossing van het enzym trypsine, een pancreas ­
serineprotease, die wordt gebruikt om cellen los te maken van een celkweekplaat, zie aanhangsel III van het validatierapport (4).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  GENMUTATIETESTEN MET SOMATISCHE CELLEN EN 
GESLACHTSCELLEN VAN TRANSGENE KNAAGDIEREN  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 488 (2013) van de 
OESO. Voor een grote verscheidenheid aan in-vitromutatietesten waarmee chromosomale en/of genmutaties kunnen worden gedetecteerd, zijn EU-testmethoden beschikbaar. Er bestaan testmethoden voor in-vivo-eind ­
punten (d.w.z. chromosoomaberraties en DNA-herstelsynthese). Hiermee 
worden echter geen genmutaties bepaald. Mutatietesten bij transgene knaag ­
dieren (transgenic rodent, TGR) voorzien in de behoefte aan praktische en algemeen beschikbare in-vivotesten voor genmutaties.
 
2. De TGR-mutatietesten zijn uitgebreid beoordeeld (24) (33). Er wordt ge ­
bruikgemaakt van transgene ratten en muizen die meerdere kopieën van 
chromosomaal geïntegreerde plasmide- of faag-shuttlevectoren bevatten. De transgenen bevatten reporter-genen voor de detectie van verscheidene typen mutaties die in vivo door chemische teststoffen zijn geïnduceerd.
 
3. De mutaties die ontstaan in een knaagdier worden bepaald door isolatie van 
het transgen en analyse van het fenotype van het reporter-gen in een bac ­
teriële gastheer waarin het reporter-gen ontbreekt. Door middel van TGR-genmutatietesten worden mutaties bepaald die zijn geïnduceerd in genetisch neutrale genen die zijn geïsoleerd uit vrijwel elk weefsel van 
het knaagdier. Met deze testen worden daarom veel van de bestaande be ­
perkingen omzeild die samenhangen met het onderzoek van in-vivogenmutatie in endogene genen (bv. beperkte weefsels die geschikt zijn voor analyse, negatieve/positieve selectie voor mutaties).
 
4. De bewijskracht wijst erop dat transgenen op vergelijkbare wijze reageren 
op mutagenen als op endogene genen, in het bijzonder met betrekking tot 
de detectie van basenpaarsubstituties, frameshift-mutaties en kleine deleties en inserties (24).
 
5. De International Workshops on Genotoxicity Testing (IWGT) hebben de 
opname van TGR-genmutatietesten voor in-vivodetectie van genmutaties 
gesteund en hebben een protocol aanbevolen voor de tenuitvoerlegging 
ervan (15) (29). Deze testmethode is gebaseerd op de aanbevelingen. Ver ­
dere analyse ter ondersteuning van het gebruik van dit protocol is te vinden in (16).
 
6. Naar verwachting is het in de toekomst wellicht mogelijk om een 
TGR-genmutatietest te combineren met een toxiciteitsonderzoek bij her ­
haalde toediening (hoofdstuk B.7 van deze bijlage). Er zijn echter gegevens noodzakelijk om te waarborgen dat de gevoeligheid van de TGR-genmutatietesten niet wordt beïnvloed door de kortere tijdsduur van 
één dag tussen het einde van de toedieningsperiode en het monstername ­
punt, zoals bij het toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening het geval is, vergeleken met de drie dagen als in de TGR-genmutatietesten. Bovendien zijn er gegevens noodzakelijk die erop wijzen dat de prestatie van de test bij 
herhaalde toediening niet negatief wordt beïnvloed door een transgene 
knaagdierstam te gebruiken en geen traditionele knaagdierstam. Zodra deze gegevens beschikbaar zijn, zal deze testmethode bijgewerkt worden.
 
7. De definities van kernbegrippen worden uiteengezet in het aanhangsel.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
8. Voor de volgende TGR-genmutatietesten zijn voldoende gegevens beschik ­
baar om het gebruik ervan bij deze testmethode te ondersteunen:  lacZ  
bacteriofaag muis (Muta™Mouse);  lacZ  plasmide muis;  gpt delta ( gpt en 
Spi – ) muis en rat;  lacI muis en rat (Big Blue®), uitgevoerd onder standaard ­
omstandigheden. Daarnaast kan de  cII-positieveselectietest worden gebruikt 
voor beoordeling van mutaties in de Big Blue®- en Muta™Mouse-model ­
len. Mutagenese in de TGR-modellen wordt doorgaans beoordeeld als mu ­
tantfrequentie; indien nodig kan echter moleculaire analyse van de mutaties aanvullende informatie geven (zie paragraaf 24).
 
9. Deze in-vivogenmutatietesten bij knaagdieren zijn met name in die zin 
relevant voor de beoordeling van het gevaar van mutagene effecten, dat de responsen van de testen afhangen van het in-vivometabolisme, de far ­
macokinetiek, de DNA-herstelsynthese en de translaesie-DNA-synthese, 
hoewel deze aspecten per soort, weefsel en type DNA-schade kunnen ver ­
schillen. Een in-vivotest voor genmutaties is nuttig voor nader onderzoek van een mutageen effect dat is gedetecteerd door een in-vitrosysteem en 
voor de follow-up van resultaten van testen waarbij gebruik wordt gemaakt 
van andere in-vivo-eindpunten (24). Naast het oorzakelijke verband ervan met de inductie van kanker, is genmutatie een relevant eindpunt voor de voorspelling van aan mutatie ten grondslag liggende niet-kankerziekten in 
somatische weefsels (12) (13) alsook ziekten die worden overgedragen via 
de kiembaan.
 
10. Indien er aanwijzingen bestaan dat de chemische teststof of een relevant 
metaboliet geen van de te onderzoeken weefsels zal bereiken, is uitvoering 
van een TGR-genmutatietest niet geschikt.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
11. In de in paragraaf 8 beschreven testen is het doelgen bacterieel of bacteri ­
ofaag van oorsprong en vindt isolatie uit het genomische knaagdier-DNA 
plaats door opname van het transgen in een λ-bacteriofaag- of 
plasmide-shuttlevector. De procedure behelst de extractie van genomisch DNA uit het te onderzoeken knaagdierweefsel, in-vitrobewerking van het 
genomische DNA (d.w.z. verpakking van λ-vectoren of ligatie en elektro ­
poratie van plasmiden om de shuttlevector te isoleren), en vervolgens de ­
tectie van mutaties in bacteriële gastheren onder geschikte omstandigheden. Bij de testen worden neutrale transgenen toegepast die gemakkelijk uit de 
meeste weefsels te isoleren zijn.
 
12. Het basis-TGR-genmutatie-experiment omvat behandeling van het knaag ­
dier met een chemische stof gedurende een bepaalde tijdsduur. Chemische 
stoffen kunnen worden toegediend via elke geschikte route, waaronder 
implantatie (bv. testen van medische hulpmiddelen). De totale periode waarin het dier de stoffen krijgt, wordt aangeduid als de toedieningsperiode. De toediening wordt gewoonlijk, vóór het doden van het dier, gevolgd door 
een tijdsperiode waarin de chemische stof niet wordt toegediend en waarin 
niet-gerepareerde DNA-laesies worden gefixeerd tot stabiele mutaties. In de literatuur worden voor deze periode verscheidene termen gebruikt, namelijk manifestatietijd, fixatietijd of expressietijd; het einde van deze periode is het 
monsternamepunt (15) (29). Nadat het dier is gedood, wordt genomisch 
DNA uit het/de te onderzoeken weefsel(s) geïsoleerd en gezuiverd.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. De gegevens voor één weefsel per dier van meerdere verpakkings/ligatiebe ­
werkingsstappen worden gewoonlijk bijeengevoegd en de mutantfrequentie 
wordt doorgaans beoordeeld met behulp van in totaal tussen 10  5 en 10  7 
plaquevormende of kolonievormende eenheden. Bij gebruik van positieve ­
selectiemethoden wordt het totaal aantal plaquevormende eenheden bepaald 
met een aparte set van niet-selectieve platen.  
14. Positieveselectiemethoden zijn ontwikkeld om de detectie van mutaties in 
zowel het  gpt-gen [ gpt delta muis en rat,  gpt  – -fenotype (20) (22) (28)] en 
het lacZ -gen [Muta™Mouse of  lacZ  plasmide muis (3) (10) (11) (30)] 
mogelijk te maken; terwijl  lacI -genmutaties in Big Blue®-dieren worden 
gedetecteerd door middel van een niet-selectieve methode waarmee mutan ­
ten worden geïdentificeerd door vorming van gekleurde (blauwe) plaques. Positieveselectiemethodologie dient tevens voor de detectie van puntmuta ­
ties die ontstaan in het  cII-gen van de λ-bacteriofaag-shuttlevector [Big 
Blue® muis of rat en Muta™Mouse (17)] en deletiemutaties in de λ-red- 
en gam -genen [Spi
 – -selectie in  gpt delta muis en rat (21) (22) (28)]. De 
mutantfrequentie wordt berekend door het aantal plaques/plasmiden die mutaties in het transgen bevatten te delen door het totaal aantal plaques/pla ­
smiden die uit hetzelfde DNA-monster zijn geïsoleerd. In 
TGR-genmutatieonderzoeken is de mutantfrequentie de gerapporteerde pa ­
rameter. Bovendien kan een mutantfrequentie worden bepaald als de fractie van cellen die onafhankelijke mutaties dragen; bij deze berekening is het 
noodzakelijk te corrigeren voor klonale expansie door sequencing van de 
geïsoleerde mutanten (24).
 
15. De mutaties die worden bepaald in de  lacI -, lacZ -, cII- en gpt-puntmutatie ­
testen bestaan hoofdzakelijk uit basenpaarsubstitutiemutaties, frameshift-mutaties en kleine inserties/deleties. Het relatieve aandeel van 
deze mutatietypen binnen spontane mutaties is vergelijkbaar met dat wat 
wordt gezien in het endogene  Hprt -gen. Grote deleties worden alleen ge ­
detecteerd met de Spi
 – -selectie en de  lacZ -plasmidetesten (24). De te onder ­
zoeken mutaties zijn in-vivomutaties die in de muis of rat ontstaan. In-vivo- 
en ex-vivomutaties, die kunnen ontstaan tijdens de faag/plasmide-isolatie, 
replicatie of herstel, zijn relatief zeldzaam en kunnen in sommige systemen specifiek worden geïdentificeerd of uitgesloten door het systeem van bac ­
teriële gastheer en positieve selectie .
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Voorbereidingen  
Keuze van de diersoort  
16. Er zijn momenteel diverse genmutatiedetectiemodellen met transgene mui ­
zen beschikbaar. Deze systemen zijn vaker toegepast dan modellen met 
transgene ratten. Als de rat duidelijk een geschikter model is dan de muis 
(bv. bij het onderzoeken van het mechanisme van carcinogenese voor een tumor die alleen bij ratten voorkomt, om de correlatie vast te stellen met 
een toxiciteitsonderzoek bij ratten of als bekend is dat het metabolisme van 
de rat representatiever is voor het metabolisme van de mens), dient het gebruik van modellen met transgene ratten te worden overwogen.
 
Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
17. De temperatuur in de proefdierruimte moet idealiter 22 °C (± 3 °C) zijn. 
Hoewel de relatieve vochtigheid ten minste 30 % en bij voorkeur niet hoger dan 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte) dient te zijn, moet worden gestreefd naar handhaving van een relatieve vochtigheid van 50- 
60 %. Er dient kunstlicht te worden gebruikt, met een dagelijkse opeen ­
volging van 12 uur licht, gevolgd door 12 uur donker. Als voeding mag het
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid 
drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak 
om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof via het voer wordt toegediend. De dieren moeten worden gehuisvest in kleine groepen (niet meer dan vijf) van hetzelfde geslacht indien geen 
agressief gedrag wordt verwacht. De dieren kunnen individueel worden 
gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is.
 
Voorbereiding van de dieren  
18. Gezonde jonge geslachtsrijpe volwassen dieren (8-twaalf weken oud bij 
aanvang van de behandeling) worden willekeurig toegewezen aan de con ­
trolegroep en de behandelgroep. De dieren krijgen een unieke code. De 
dieren krijgen ten minste vijf dagen de tijd om aan de omstandigheden in het laboratorium te wennen. De kooien worden zodanig geplaatst dat mo ­
gelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden 
beperkt. Per geslacht moet bij het begin van het onderzoek het gewichts ­
verschil tussen de dieren zo klein mogelijk zijn en mag dit niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht bedragen.
 
Voorbereiding van de doses  
19. Vaste chemische teststoffen moeten worden opgelost of gesuspendeerd in 
geschikte oplosmiddelen of media of worden vermengd met voedsel of drinkwater voordat dit aan de dieren wordt gegeven. Vloeibare chemische teststoffen kunnen direct worden gegeven of eerst worden verdund. Voor 
blootstelling via inhalatie kunnen teststoffen worden toegediend als gas, 
damp of een vaste/vloeibare aerosol, naargelang van de fysisch-chemische eigenschappen ervan. Er dienen verse preparaten van de teststof te worden toegepast, tenzij met stabiliteitsgegevens is aangetoond dat bewaren van het 
preparaat aanvaardbaar is.
 
Testomstandigheden  
Oplosmiddel/medium  
20. Het oplosmiddel/medium mag bij de gebruikte dosisvolumes geen toxische 
effecten veroorzaken en chemische reacties met de chemische teststof moe ­
ten uitgesloten zijn. Als andere oplosmiddelen/media worden gebruikt dan 
de algemeen bekende, moet het gebruik ervan worden ondersteund met referentiegegevens die wijzen op de verenigbaarheid ervan. Het wordt aan ­
bevolen waar mogelijk eerst het gebruik van een waterig oplosmiddel/me ­
dium te overwegen.
 
Positieve controles  
21. Gewoonlijk dienen met de dieren tegelijkertijd positieve controles te worden 
uitgevoerd. Voor laboratoria met aangetoonde bekwaamheid (zie paragraaf 23) die deze testen routinematig gebruiken, kan DNA van dieren waarmee 
eerder gelijktijdig positieve controles zijn uitgevoerd in elk onderzoek wor ­
den opgenomen om het succes van de methode te bevestigen. Dergelijk DNA van eerdere experimenten moet worden verkregen van dezelfde soort en te onderzoeken weefsels en moet op de juiste wijze worden bewaard (zie 
paragraaf 36). Wanneer gelijktijdig uitgevoerde positieve controles worden 
gebruikt, is het niet noodzakelijk dat de toedieningsroute dezelfde is als die van de teststof; het dient echter bekend te zijn dat de positieve controles mutaties induceren in een of meer weefsels die zullen worden onderzocht 
voor de chemische teststof. De doses van de voor positieve controle ge ­
bruikte chemische stoffen dienen zodanig te worden gekozen, dat zwakke of matige effecten worden geproduceerd waarmee de prestatie en gevoeligheid van de test kritisch worden beoordeeld. Voorbeelden van voor positieve 
controle gebruikte chemische stoffen en enkele van de doelweefsels ervan 
staan vermeld in tabel 1.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabel 1  
Voorbeelden van voor positieve controle gebruikte chemische stoffen en enkele van de doelweefsels ervan  
Voor positieve controle ge ­
bruikte chemische stof en 
CAS-nr. Einecs-naam en Einecs-nr. Kenmerken Mutatie-doelweefsel 
Rat Muis  
N-ethyl-N-nitroso-ureum 
[CAS-nr. 759-73-9] N-ethyl-N-nitroso-ureum 
[212-072-2] Direct werkend 
mutageen Lever, lon ­
gen Beenmerg, colon, 
colonepitheel, dar ­
men, lever, longen, milt, nier, ovarium- 
granulosacellen, 
mannelijke geslachtscellen 
Ethylcarbamaat (urethaan) 
[CAS-nr. 51-79-6] Urethaan 
[200-123-1] Mutageen, vereist 
metabolisatie maar produceert slechts 
zwakke effecten Beenmerg, voor ­
maag, dunne darm, lever, longen, milt 
2,4-Diaminotolueen 
[CAS-nr. 95-80-7] 4-Methyl-m-fenyleendia ­
mine 
[202-453-1] Mutageen, vereist 
metabolisatie, ook positief in de Spi
 – -test Lever Lever 
Benzo[a]pyreen 
[CAS-nr. 50-32-8] Benzo[def]chryseen 
[200-028-5] Mutageen, vereist 
metabolisatie Lever, 
omentum Beenmerg, borst, co ­
lon, voormaag, 
kliermaag, hart, le ­
ver, longen, manne ­
lijke geslachtscellen  
Negatieve controles  
22. Voor elk monsternamepunt dienen negatieve controles te worden meegeno ­
men die zijn behandeld met alleen oplosmiddel of medium en verder op dezelfde wijze zijn behandeld als de behandelgroepen. Bij het ontbreken 
van historische of gepubliceerde controlegegevens waaruit blijkt dat het 
gekozen oplosmiddel/medium geen schadelijke of mutagene effecten indu ­
ceert, dienen ook onbehandelde controles te worden meegenomen voor elk monsternamepunt om vast te stellen dat de mediumcontrole aanvaardbaar is.
 
Verificatie van de geschiktheid van laboratoria  
23. De bekwaamheid in deze testen dient te worden vastgesteld door te bewij ­
zen in staat te zijn verwachte resultaten uit gepubliceerde gegevens (24) te 
reproduceren voor: 1) mutantfrequenties met voor positieve controle ge ­
bruikte chemische stoffen (waaronder zwakke responsen) zoals die staan vermeld in tabel 1, niet-mutagenen en mediumcontroles, en 2) transgeniso ­
latie uit genomisch DNA (bv. verpakkingsefficiëntie).
 
Sequencing van mutanten  
24. Voor regelgevingstoepassingen is DNA-sequencing van mutanten niet ver ­
eist, in het bijzonder niet bij een duidelijk positief of negatief resultaat. Sequencinggegevens kunnen echter nuttig zijn als er sprake is van grote interindividuele variatie. In deze gevallen kan sequencing worden gebruikt 
om de mogelijkheid van jackpots of klonale voorvallen uit te sluiten door 
vaststelling van het aandeel van unieke mutanten in een bepaald weefsel. Sequencing van ongeveer 10 mutanten per weefsel per dier moet voldoende zijn om enkel te bepalen of klonale mutanten bijdragen aan de mutant ­
frequentie; sequencing van wel 25 mutanten kan noodzakelijk zijn om de 
mutantfrequentie wiskundig te corrigeren voor klonaliteit. Sequencing van
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
mutanten kan ook worden overwogen wanneer kleine toenames in de mu ­
tantfrequentie (d.w.z. net hoger dan de onbehandeldecontrolewaarden) zijn 
vastgesteld. Verschillen in het mutantspectrum tussen de mutantkoloniën van behandelde en onbehandelde dieren kunnen wijzen op een mutageen effect (29). Tevens kunnen mutatiespectra nuttig zijn voor het ontwikkelen 
van mechanistische hypotheses. Wanneer sequencing deel uit dient te ma ­
ken van het onderzoeksprotocol is voorzichtigheid geboden ten aanzien van de opzet van dergelijke onderzoeken, in het bijzonder met betrekking tot het aantal gesequencede mutanten per monster om voldoende onderscheidend 
vermogen, in overeenstemming met het gebruikte statistische model, te 
verkrijgen (zie paragraaf 43).
 
PROCEDURE  
Aantal en geslacht van de dieren  
25. Het aantal dieren per groep dat voldoende is om het onderscheidend ver ­
mogen te verkrijgen dat noodzakelijk is om ten minste een verdubbeling 
van de mutantfrequentie te kunnen detecteren, dient vooraf te worden be ­
paald. De groepsgrootte van de dieren zal minimaal vijf zijn. Als het onder ­
scheidend vermogen echter onvoldoende is, dient het aantal dieren in voor ­
komend geval te worden verhoogd. Doorgaans dienen mannelijke dieren te 
worden gebruikt. In bepaalde gevallen is testen met alleen vrouwelijke 
dieren gerechtvaardigd, bv. wanneer vrouwspecifieke geneesmiddelen voor menselijk gebruik worden getest of wanneer vrouwspecifiek metabolisme wordt onderzocht. Indien er significante verschillen bestaan tussen de ge ­
slachten wat betreft toxiciteit of metabolisme, zijn zowel mannelijke als 
vrouwelijke dieren noodzakelijk.
 
Toedieningsperiode  
26. Op grond van waarnemingen dat mutaties accumuleren met elke behan ­
deling, is een behandelschema van herhaalde doses noodzakelijk met dage ­
lijkse behandelingen gedurende een periode van 28 dagen. Dit wordt ge ­
woonlijk als aanvaardbaar beschouwd, zowel voor voldoende accumulatie 
van mutaties door zwakke mutagenen als voor een blootstellingstijd die toereikend is voor de detectie van mutaties in langzaam delende organen. 
Voor sommige beoordelingen kunnen alternatieve behandelschema's ge ­
schikt zijn en deze alternatieve toedieningsschema's dienen in het protocol wetenschappelijk onderbouwd te worden. Behandelingen dienen niet korter te zijn dan de tijd die nodig is voor de volledige inductie van alle relevante 
metaboliserende enzymen, en kortere behandelingen kunnen het noodzake ­
lijk maken meerdere monsternamepunten, die geschikt zijn voor organen met verschillende proliferatiesnelheden, te gebruiken. In ieder geval dient alle beschikbare informatie (bv. over algemene toxiciteit of metabolisme en 
farmacokinetiek) te worden gebruikt bij de onderbouwing van een protocol, 
in het bijzonder wanneer wordt afgeweken van de bovenstaande standaard ­
aanbevelingen. Vanwege mogelijke verhoging van de gevoeligheid dienen behandeltijden langer dan acht weken duidelijk te worden toegelicht en te 
worden onderbouwd, aangezien lange behandeltijden een duidelijke toe ­
name in de mutantfrequentie door klonale expansie kunnen bewerkstelligen (29).
 
Dosisniveaus  
27. Dosisniveaus moeten worden gebaseerd op de resultaten van een doserings ­
bereikstudie waarin de algehele toxiciteit wordt gemeten en die verricht is 
via dezelfde blootstellingsroute, of op de resultaten van eerder verrichte 
subacute toxiciteitsonderzoeken. Niet-transgene dieren van dezelfde knaag ­
dierstam kunnen worden gebruikt om het doseringsbereik vast te stellen. In de hoofdtest moet, om dosisresponsinformatie te krijgen, een volledig on ­
derzoek een negatieve controlegroep omvatten (zie paragraaf 22) en mini ­
maal drie dosisniveaus die voldoende ver uit elkaar liggen, behalve als de
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
limietdosis gebruikt is (paragraaf 28). De hoogste dosis moet de Maximale 
Verdragen Dosis (Maximum Tolerated Dose — MTD) zijn. De MTD wordt 
gedefinieerd als de dosis die tekenen van toxiciteit geeft waarbij hogere doses, op basis van hetzelfde doseringsschema, naar verwachting tot de dood zou leiden. Chemische stoffen met specifieke biologische activiteit 
bij lage niet-toxische doses (zoals hormonen en mitogenen) en chemische 
stoffen die verzadiging van toxicokinetische eigenschappen vertonen kun ­
nen uitzonderingen zijn op de doseringscriteria en moeten per geval worden beoordeeld. De gebruikte dosisniveaus moeten een bereik dekken van maxi ­
male tot weinig of geen toxiciteit.
 
Limiettest  
28. Als uit doseringsbereikstudies of bestaande gegevens bij gerelateerde knaag ­
dierstammen blijkt dat een behandelingsregime van minstens de limietdosis (zie onder) geen waarneembare toxische effecten geeft, en als genotoxiciteit op grond van gegevens bij structuurgerelateerde chemische stoffen naar 
verwachting geen genotoxiciteit geeft, dan is een volledig onderzoek met 
drie dosisniveaus mogelijk niet nodig. Voor een toedieningsperiode van 28 dagen (d.w.z. 28 dagelijkse behandelingen) is de limietdosis 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag. Voor een toedieningsperiode van 14 dagen of minder 
is de limietdosis 2 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag (doseringsschema's die 
afwijken van 28 dagelijkse behandelingen moeten in het protocol weten ­
schappelijk worden onderbouwd; zie paragraaf 26).
 
Toediening van de doses  
29. De teststof wordt meestal toegediend via een maagsonde of een geschikte 
intubatiecanule. Over het algemeen moet bij de opzet van een test rekening 
worden gehouden met de verwachte blootstellingsroute bij mensen. Daarom 
kunnen andere blootstellingsroutes (zoals drinkwater, subcutaan, intrave ­
neus, topicaal, inhalatie, intratracheaal, voeding of implantatie) aanvaard ­
baar zijn als deze onderbouwd kunnen worden. Intraperitoneale injectie 
wordt niet aanbevolen omdat deze bij mensen geen fysiologisch relevante 
blootstellingsroute is. Het maximale vloeistofvolume dat via sonde of in ­
jectie per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van het dier. Het volume mag niet hoger zijn dan 2 ml/100 g lichaamsgewicht. Hogere 
volumes dan dit moeten worden onderbouwd. Behalve bij irriterende of 
bijtende stoffen, die normaal gesproken bij hogere concentraties hevigere effecten hebben, moeten volumeverschillen tot een minimum worden be ­
perkt door de concentratie aan te passen, zodat er op alle dosisniveaus 
hetzelfde volume wordt toegediend.
 
Bemonsteringstijdstip  
Somatische cellen  
30. Het bemonsteringstijdstip is een kritische variabele omdat deze wordt be ­
paald door de periode die nodig is om mutaties te fixeren. Deze periode is 
weefselspecifiek en lijkt verband te houden met de vernieuwingstijd van de celpopulatie, waarbij beenmerg en darm snelle responders zijn en de lever veel langzamer is. Een geschikt compromis voor meting van mutatiefre ­
quenties bij zowel snel als langzaam prolifererende weefsels is 28 dagen 
opeenvolgende dagelijkse behandelingen (zoals beschreven in paragraaf 26) en monstername drie dagen na de laatste behandeling; maar de maximale mutatiefrequentie zal zich onder deze omstandigheden bij langzaam prolife ­
rerende weefsels mogelijk niet manifesteren. Als langzaam prolifererende 
weefsels van bijzonder belang zijn, dan kan een later bemonsteringstijdstip 28 dagen na de toedieningsperiode van 28 dagen geschikter zijn (16) (29). In dergelijke gevallen komt het latere bemonsteringstijdstip in de plaats van 
de bemonstering na drie dagen; dit zou wetenschappelijk onderbouwd moe ­
ten worden.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Geslachtscellen  
31. TGR-tests zijn goed geschikt voor onderzoek naar genmutatie-inductie bij 
mannelijke geslachtscellen (7) (8) (27), waarin de tijd en kinetiek van de spermatogenese goed gedefinieerd zijn (27). Omdat het aantal eicellen dat 
voor analyse beschikbaar is laag is, zelfs na superovulatie, en er geen 
DNA-synthese in de oöcyt plaatsvindt, kunnen mutaties in vrouwelijke geslachtscellen niet bepaald worden met transgene tests (31).
 
32. De bemonsteringstijdstippen voor mannelijke geslachtscellen moet zo wor ­
den gekozen dat alle blootgestelde celtypen gedurende de gehele geslachts ­
celontwikkeling worden bemonsterd en dat het doelstadium in de monster ­
name voldoende wordt blootgesteld. De tijd voor de progressie van ont ­
wikkelende geslachtscellen van spermatogoniale stamcellen tot rijp sperma 
dat de vas deferens/cauda epididymisbereikt is ~49 dagen voor de muis (36) 
en ~70 dagen voor de rat (34) (35). Na blootstelling van 28 dagen gevolgd door een monsterperiode van drie dagen, vertegenwoordigt geaccumuleerd 
sperma dat uit de vas deferens/cauda epididymis (7)(8) is verkregen een 
celpopulatie die gedurende ongeveer de tweede helft van de spermatogenese is blootgesteld, die de meiotische en postmeiotische periode omvat, maar niet de spermatogoniale of stamcelperiode. Om voldoende cellen in de vas 
deferens/cauda epididymis te bemonsteren die tijdens de blootstellingsperi ­
ode spermatogoniale stamcellen waren, is een later bemonsteringstijdstip minimaal zeven weken (muizen) of tien weken (ratten) na afloop van de behandeling nodig.
 
33. Cellen die geëxtrudeerd zijn uit de seminifereuze tubuli na behandeling van 
28 + drie dagen vormen een gemengde populatie die verrijkt is voor alle stadia van ontwikkelende geslachtscellen (7) (8). Het bemonsteren van deze cellen voor het detecteren van genmutaties geeft niet een even exacte be ­
oordeling van de stadia waarin de geslachtscelmutaties geïnduceerd worden 
als door het bemonsteren van spermatozoën uit de vas deferens/cauda epi ­
didymis (omdat er een verscheidenheid aan geslachtsceltypen uit de tubuli wordt bemonsterd en deze celpopulatie gecontamineerd wordt door enkele 
somatische cellen). Maar het bemonsteren van cellen uit de seminifereuze 
tubuli naast spermatozoën uit de vas deferens/cauda epididymis na een bemonsteringsregime van slechts 28 + drie dagen geeft enige dekking van cellen die zijn blootgesteld tijdens de meeste fasen van de geslachtscel ­
ontwikkeling, en kan bruikbaar zijn voor het detecteren van bepaalde 
geslachtscelmutagenen.
 
Observaties  
34. Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag 
plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming 
van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De ge ­
zondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. Alle dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziektever ­
schijnselen en sterfte. Alle dieren moeten ten minste eenmaal per week 
worden gewogen, en bij het doden. Ook het voedselverbruik moet ten 
minste wekelijks worden gemeten. Als de teststof met het drinkwater wordt toegediend, moet het waterverbruik bij elke verversing van water en ten minste wekelijks worden gemeten. Dieren die niet-letale indicatoren van 
excessieve toxiciteit vertonen moeten voor afloop van de testperiode wor ­
den gedood (23).
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Weefselverzameling  
35. De rationale voor weefselverzameling moet duidelijk worden gedefinieerd. 
Omdat mutatie-inductie in bijna alle weefsels onderzocht kan worden, moet 
de selectie van de te verzamelen weefsels worden gebaseerd op de reden voor uitvoering van het onderzoek en eventuele bestaande gegevens over mutageniteit, carcinogeniteit of toxiciteit voor de onderzochte chemische 
stof. Belangrijke factoren ter overweging moeten zijn de toedieningsroute 
(op basis van de waarschijnlijke blootstelling bij mensen), de voorspelde weefseldistributie, en het mogelijke werkingsmechanisme. Als er geen ach ­
tergrondinformatie beschikbaar is, moeten verschillende somatische weef ­
sels die van belang kunnen zijn, worden verzameld. Dit moeten snel pro ­
lifererende, langzaam prolifererende en contactplaatsweefsels zijn. Daarnaast moeten spermatozoën uit de vas deferens/cauda epididymis en zich ontwik ­
kelende geslachtscellen uit de seminifereuze tubuli (zoals beschreven in 
paragrafen 32 en 33) worden verzameld en opgeslagen voor het geval er 
in de toekomst op mutageniteit van de geslachtscellen moet worden ge ­
analyseerd. Het orgaangewicht moet worden gemeten, en voor grotere or ­
ganen moet uit alle dieren hetzelfde gebied worden verzameld.
 
Opslag van weefsels en DNA  
36. Weefsels (of weefselhomogenaten) moeten worden bewaard bij of onder – 
70 °C en binnen 5 jaar voor DNA-isolatie worden gebruikt. Geïsoleerd 
DNA, gekoeld bewaard bij 4 °C in een geschikte buffer, wordt idealiter binnen één jaar voor mutatieanalyse gebruikt.
 
Selectie van weefsels voor mutatieanalyse  
37. De keuze van weefsels moet worden gebaseerd op overwegingen zoals: 1) 
de toedieningsroute of de locatie van eerste contact (bv. glandulaire maag 
als toediening oraal is, long als toediening per inhalatie is, of huid als 
topicaal wordt aangebracht), en 2) farmacokinetische parameters die in algemene toxiciteitsonderzoeken zijn waargenomen en die iets zeggen over weefseldispositie, -retentie of -accumulatie, of doelorganen voor toxi ­
citeit. Als onderzoeken worden verricht als vervolg op carcinogeniteits ­
onderzoeken moeten doelweefsels voor carcinogeniteit worden overwogen. Weefsels voor analyse moeten zo worden gekozen dat chemische stoffen die direct werkende in vitro-mutagenen zijn, snel worden gemetaboliseerd, 
zeer reactief zijn of slecht worden geabsorbeerd, of die waarvoor het doel ­
weefsel door de toedieningsroute wordt bepaald, maximaal worden gede ­
tecteerd (6).
 
38. Als er geen achtergrondinformatie is, en rekening houdend met de contact ­
plaats als gevolg van de toedieningsroute, moeten de lever en minstens één sneldelend weefsel (bv. glandulaire maag, beenmerg) op mutageniteit wor ­
den beoordeeld. In de meeste gevallen kunnen de bovenstaande vereisten 
worden bereikt door analyse van twee zorgvuldig geselecteerde weefsels, maar in sommige gevallen zijn er drie of nog meer nodig. Als er redenen 
zijn om met name bezorgd te zijn over effecten op geslachtscellen, inclusief 
positieve reacties in somatische cellen, moeten de geslachtscelweefsels op mutaties worden beoordeeld.
 
Metingsmethoden  
39. Voor de aanbevolen transgene modellen zijn standaard laboratorium- of 
gepubliceerde methoden beschikbaar voor de detectie van mutaties:  lacZ  
lambda bacteriofaag en plasmide (30);  lacI  muis (2) (18);  gpt delta muis 
(22);  gpt delta rat (28);  cII (17). Modificaties moeten onderbouwd en goed 
gedocumenteerd worden. Gegevens uit meerdere verpakkingen kunnen wor ­
den samengevoegd en gebruikt om een voldoende aantal plaques of kolo ­
nies te bereiken. Maar het feit dat er een hoog aantal verpakkingsreacties 
nodig is om het gewenste aantal plaques te bereiken, kan wijzen op slechte 
DNA-kwaliteit. In zulke gevallen moeten de gegevens voorzichtig worden  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
geïnterpreteerd omdat ze mogelijk onbetrouwbaar zijn. Het optimale totale 
aantal plaques of kolonies per DNA-monster wordt bepaald door de statis ­
tische waarschijnlijkheid van het detecteren van voldoende aantallen muta ­
ties bij een gegeven spontane mutatiefrequentie. Over het algemeen zijn minimaal 125 000 tot 300 000 plaques nodig als de spontane mutatiefre ­
quentie in de orde van 3 × 10
 –5 (15) ligt. Voor de Big Blue®  lacI -test­
methode is het belangrijk om aan te tonen dat het hele bereik aan mutante kleurfenotypen gedetecteerd kan worden door de passende kleurcontroles bij elke plaat te includeren. Weefsels en de resulterende monsters (items) moe ­
ten volgens een blokopzet worden verwerkt en geanalyseerd, waarbij items 
uit de vehiculum/oplosmiddelcontrolegroep, de positieve controlegroep (in ­
dien gebruikt) of positieve controle-DNA (indien passend), en elke behan ­
delingsgroep samen verwerkt worden.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
40. Gegevens van individuele dieren moeten in tabelvorm worden gepresen ­
teerd. Het dier is de proefeenheid. Het verslag moet het totale aantal pla ­
quevormende eenheden (pfu) of kolonievormende eenheden (cfu) vermel ­
den, met het aantal mutanten, en de mutatiefrequentie voor elk weefsel uit 
elk dier. Als er meerdere verpakkings/rescue-reacties zijn, moet het aantal reacties per DNA-monster worden vermeld. Hoewel gegevens voor elke individuele reactie bewaard moeten worden, hoeft alleen de totale pfu of 
cfu gemeld te worden. Gegevens over toxiciteit en klinische tekenen moeten 
volgens paragraaf 34 worden gemeld. Alle sequentieresultaten moeten voor elke geanalyseerde mutant worden gepresenteerd, en de resulterende muta ­
tiefrequentieberekeningen voor elk dier en weefsel moeten worden getoond.
 
Statistische beoordeling en interpretatie van resultaten  
41. Er zijn verschillende criteria voor het vaststellen van een positief resultaat, 
zoals een dosisgerelateerde toename van de mutatiefrequentie, of een dui ­
delijke verhoging van de mutatiefrequentie in een dosisgroep vergeleken 
met de oplosmiddel/vehiculumcontrolegroep. Minstens drie behandelde do ­
sisgroepen moeten worden geanalyseerd om voldoende gegevens voor een dosisresponsanalyse te verkrijgen. Hoewel de biologische relevantie van de resultaten de primaire overweging moet zijn, kunnen passende statistische 
methoden worden toegepast als hulpmiddel bij beoordeling van de test ­
resultaten (4) (14) (15) (25) (26). De gebruikte statistische tests moeten het dier als de proefeenheid beschouwen.
 
42. Een teststof waarvoor de resultaten niet aan de bovenstaande criteria in enig 
weefsel voldoen wordt in deze bepaling als niet-mutageen beschouwd. Voor de biologische relevantie van een negatief resultaat moet de weefselbloot ­
stelling worden bevestigd.
 
43. Voor DNA-sequentieanalyses zijn diverse statistische benaderingen beschik ­
baar om te helpen bij de interpretatie van de resultaten (1) (5) (9) (19).  
44. Bij beoordeling van de biologische significantie van de respons kan het 
vaststellen of de waargenomen waarden binnen of buiten het historische 
controlebereik vallen een aanwijzing vormen (32).  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Testverslag  
45. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— identificatiegegevens en CAS-nr., indien bekend,  
— bron, partijnummer indien beschikbaar,  
— fysische aard en zuiverheid,  
— fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het onder ­
zoek relevant zijn,  
— stabiliteit van de teststof, indien bekend.  
Oplosmiddel/vehiculum:  
— onderbouwing van keuze vehiculum,  
— oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/vehicu ­
lum, indien bekend,  
— bereiding van toedieningsvormen voor voer, drinkwater of inhalatie,  
— analytische bepalingen op toedieningsvormen (zoals stabiliteit, homoge ­
niteit, nominale concentraties).  
Proefdieren:  
— gebruikte diersoort/stam en motivering van de keuze,  
— aantal, leeftijd en geslacht van de dieren,  
— de herkomst, de huisvesting, de voeding enz.,  
— individueel gewicht van de dieren bij de start van de test, waaronder 
bereik van het lichaamsgewicht, gemiddelde en standaarddeviatie voor 
elke groep.  
Testomstandigheden:  
— positieve en negatieve (vehiculum/oplosmiddel) controlegegevens,  
— gegevens uit het doseringsbereikonderzoek,  
— motivering voor de keuze van de dosisniveaus,  
— gedetailleerde gegevens over de bereiding van de teststof,  
— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,  
— motivering voor de toedieningsroute,  
— methoden voor meting van diertoxiciteit, waaronder, indien beschikbaar, 
histopathologische of hematologische analyses en frequentie waarmee het dier is geobserveerd en het lichaamsgewicht is gemeten,
 
— methoden om te verifiëren of de teststof het doelweefsel heeft bereikt, of 
de algemene circulatie, als negatieve resultaten verkregen zijn,  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— feitelijke dosis (mg/kg lichaamsgewicht/dag) berekend op basis van de 
teststofconcentratie in voer/drinkwater (ppm) en consumptie, indien van 
toepassing,  
— gegevens over de kwaliteit van het voer en het drinkwater,  
— gedetailleerde omschrijving van behandeling en bemonsteringsschema's 
en motivering van de keuzes,  
— wijze van doden,  
— procedures voor het isoleren en preserveren van weefsels,  
— methoden voor het isoleren van genoom-DNA van de knaagdieren, 
waarbij het transgen uit het genoom-DNA wordt verkregen en het transgen-DNA wordt overgebracht naar een bacteriële gastheer,
 
— bron en partijnummers van alle cellen, kits en reagentia (waar van 
toepassing),  
— methoden voor de telling van mutanten,  
— methoden voor moleculaire analyse van mutanten en gebruik bij correc ­
tie voor clonaliteit en/of berekening van de mutatiefrequenties, indien van toepassing.
 
Resultaten:  
— conditie van het dier voor en tijdens de testperiode, inclusief tekenen 
van toxiciteit,  
— lichaams- en orgaangewicht bij het doden van het dier,  
— voor elk weefsel/dier, het aantal mutanten, aantal beoordeelde plaques 
of kolonies, mutatiefrequentie,  
— voor elk(e) weefsel/diergroep, aantal verpakkingsreacties per 
DNA-monster, totaal aantal mutanten, gemiddelde mutatiefrequentie, 
standaarddeviatie,  
— dosisresponsrelatie, waar mogelijk,  
— voor elk weefsel/dier, het aantal onafhankelijke mutanten en gemiddelde 
mutatiefrequentie, indien moleculaire analyse van mutaties verricht is,  
— gelijktijdige en historische negatieve controlegegevens met bereiken, 
gemiddelden en standaarddeviaties,  
— gelijktijdige positieve controle (of niet-gelijktijdige DNA-positieve con ­
trole) gegevens,  
— analytische bepalingen, indien beschikbaar (bv. DNA-concentraties ge ­
bruikt in verpakking, DNA-sequentiegegevens),  
— gebruikte statistische analyses en methoden.  
Bespreking van de resultaten  
Conclusie  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITERATUUR  
1. Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987), ‘Statistical Testfor the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’, J. Mol. Biol., 194: 391-396.  
2. Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’, Mutation Res., 518: 107-112.  
3. Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo 
Mutations’ Nature, 377(6550): 657-659  
4. Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 
246-255.  
5. Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405-413.
 
6. Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens’, Mutagenesis, 14(1): 141-151.
 
7. Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper 
(1995), ‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced 
by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485-7489.
 
8. Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’, Mutation Res., 388(2-3): 197-212.
 
9. Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’, Genetics, 156: 1411-1418.  
10. Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg (1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971-7975.
 
11. Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive E. coli Host’, Biotechniques, 14(3): 326, 330.  
12. Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’, Mutation Res., 543: 125-136.  
13. Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’, Mutation Res ., 705: 96-106.  
14. Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of 
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’, Mutagenesis, 13(3): 249-255.
 
15. Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Dou ­
glas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Sko ­
pek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Transgenic Mutation Assays’, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253-259.
 
16. Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’, Environ. Mol. Mu ­
tagen., 41: 1-6.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
17. Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mu ­
tations in a Bacteriophage λ Transgene Target’, Proc. Natl. Acad. Sci.  
USA, 93(17): 9073-9078.  
18. Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mu ­
tagenicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212-218.  
19. Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.  
20. Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi  – 
and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465-470.  
21. Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’, 
Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9-15.  
22. Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’, Mutation Res., 455(1- 
2): 191-215.  
23. OESO (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OESO, Paris.  
24. OESO (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OESO, Paris.  
25. Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231-245.  
26. Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Stu ­
dy’, Mutation. Res., 388(2-3): 249-289.
 
27. Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193.
 
28. Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.
 
29. Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘In vivo Transgenic Mu ­
tation Assays’, Mutation Res., 540: 141-151.
 
30. Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid lacZ 
Transgenic Mice for studying Mutations in vivo’ in: G. Pfeifer (ed.), 
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Ple ­
num Press, New York, NY, USA, pp. 391-410.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
31. Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’, Mutation Res., 578(1-2): 117- 123.
 
32. Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Da ­
ta’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
33. OESO (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Gui ­
deline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation As ­
says, Series on Testing and Assessment, N  o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OESO, Parijs.  
34. Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals semini ­
ferous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198-236.
 
35. Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epididy ­
mis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, 
J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, 
the Netherlands, pp. 1071-1148.  
36. Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25-36.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Aanhangsel  
DEFINITIES  
Toedieningsperiode:  de totale periode waarin een dier een stof krijgt toegediend.  
Basepaarsubstitutie:  een type mutatie waardoor één DNA-nucleotidebase wordt 
vervangen door een andere DNA-nucleotidebase.  
Capside:  het eiwitomhulsel om een virusdeeltje.  
Stof:  een stof of mengsel.  
Klonale expansie:  de productie van veel cellen uit één (mutante) cel.  
Kolonievormende eenheid(cfu):  een maat voor het aantal levensvatbare bacte ­
riën. 
Concatameer:  een lang continu biomolecuul dat bestaat uit meerdere identieke 
kopieën die in serie gekoppeld zijn.  
Cos-site:  een segment enkelstrengig DNA met 12 nucleotiden dat zich aan beide 
uiteinden van het dubbelstrengig genoom van de bacteriofaag lambda bevindt.  
Deletie:  een mutatie waarin een of meer (sequentiële) nucleotiden van het ge ­
noom verloren gaan.  
Elektroporatie:  de toediening van elektrische pulsen om de permeabiliteit van 
celmembranen te verhogen.  
Endogeen gen:  een eigen gen van het genoom.  
Extrabinomiale variatie:  hogere variabiliteit bij herhaalde schattingen van een 
populatieproportie dan zou worden verwacht als de populatie een binomiale distributie had.
 
Frameshift-mutatie:  een genetische mutatie veroorzaakt door insertie of deletie 
van een aantal nucleotiden dat niet gelijkmatig deelbaar is door drie binnen een 
DNA-sequentie die voor een eiwit/peptide codeert.  
Insertie:  toevoeging van een of meer nucleotidebaseparen in een DNA- 
sequentie.  
Jackpot:  een groot aantal mutanten die zijn ontstaan door klonale expansie van 
één mutatie.  
Grote deleties:  deleties in DNA van meer dan enkele kilobases (die effectief 
gedetecteerd worden met de Spi  – selectie- en de lacZ-plasmide-testmethoden).  
Ligatie:  de covalente verbinding van twee uiteinden van DNA-moleculen met 
DNA-ligase.  
Mitogeen:  een stof die een cel aanzet om met celdeling te beginnen en mitose in 
gang te zetten (in feite celdeling).  
Neutraal gen:  een gen dat niet wordt beïnvloed door positieve of negatieve 
selectiedruk.  
Verpakking:  de synthese van infectieuze faagdeeltjes uit een bereiding van 
faagcapside en staarteiwitten en een concatameer van faag-DNA-moleculen. Veel gebruikt om op een lambdavector gekloond DNA te verpakken (gescheiden 
door cos-sites) in infectieuze lambdadeeltjes.
 
Verpakkingsefficiëntie:  de efficiëntie waarmee verpakte bacteriofagen uit gast ­
heerbacterieën worden verkregen.  ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Plaquevormende eenheid (pfu):  een maat voor aantal levensvatbare 
bacteriofagen.  
Puntmutatie:  een algemene term voor een mutatie in slechts een kleine sequentie 
van DNA waaronder kleine inserties, deleties en basepaarsubstituties.  
Positieve selectie:  een methode waardoor alleen mutanten kunnen overleven.  
Reporter-gen:  een gen waarvan het gemuteerde genproduct makkelijk detecteer ­
baar is.  
Bemonsteringstijdstip:  het einde van detijdperiode, voordat het dier wordt ge ­
dood, waarin de stof niet wordt toegediend en waarbij onverwerkte DNA-laesies 
in stabiele mutaties worden gefixeerd.  
Shuttlevector:  een vector die zo is geconstrueerd dat deze zich in twee verschil ­
lende gastheersoorten kan voortplanten; in een shuttlevector ingebracht DNA kan dus in twee verschillende celtypen of twee verschillende organismen worden 
getest of gemanipuleerd.
 
Teststof:  Alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  
Transgeen:  van, in verband met, of het zijn van een organisme waarvan het 
genoom veranderd is door de overdracht van een gen of genen uit een andere soort.
 ▼M5 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
DEEL C: METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE 
ECOTOXICITEIT  
INHOUD 
C.1. ACUTE TOXICITEIT VOOR VISSEN 
C.2. DAPHNIA  Sp. — ACUTE IMMOBILISATIETEST 
C.3. ZOETWATERALGEN EN CYANOBACTERIËN: GROEIREM ­
MINGSTEST 
C.4. BEPALING VAN DE „GEMAKKELIJKE” BIOLOGISCHE AF ­
BREEKBAARHEID 
DEEL I. ALGEMENE BESCHOUWINGEN 30 DEEL II. DOC-AFVLAKKINGSTEST (Methode C.4-A) DEEL III. GEWIJZIGDE OESO-SCREENING TEST (Methode C.4-B) 
DEEL IV. KOOLDIOXYDE CO
 2 -ONTWIKKELINGTEST (Methode C.4-C) 
DEEL V. MANOMETRISCHE RESPIROMETRIE TEST (Methode C.4-D) DEEL VI. GESLOTEN-FLESTEST (Methode C.4-E) 
DEEL VII. M.I.T.I.-TEST (Methode C.4-F) 
C.5. AFBRAAK — BIOCHEMISCH ZUURSTOFVERBRUIK C.6. AFBRAAK — CHEMISCH ZUURSTOFVERBRUIK C.7. AFBRAAK — NIET-BIOLOGISCHE AFBRAAK: HYDRO ­
LYSE IN AFHANKELIJKHEID VAN DE pH 
C.8. TOXICITEIT VOOR REGENWORMEN 
C.9. BIOLOGISCHE AFBRAAK — ZAHN-WELLENS TEST 
C.10. SIMULATIETEST AEROBE RIOOLWATERZUIVERING: 
C.10-A: ACTIEFSLIBINSTALLATIES — C.10-B: BIOFILMS 
C.11. BIOLOGISCHE AFBRAAK — ACTIEF SLIB: REMMING 
ADEMHALING 
C.12. BIOLOGISCHE AFBRAAK — GEWIJZIGDE SCAS-TEST C.13. BIOCONCENTRATIE: DOORSTROOMTEST MET VISSEN C.14. GROEITEST ONVOLWASSEN VISSEN 
C.15. VIS, KORTETERMIJN-TOXICITEITSTEST OP EMBRYO ­
NALE EN LARVESTADIA (SAC-FRY) 
C.16. HONINGBIJEN — ACUTE-TOXICITEITSTEST (ORAAL) 
C.17. HONINGBIJEN — ACUTE-TOXICITEITSTEST (CONTACT) C.l8. BEPALING VAN DE ADSORPTIE/DESORPTIE MET BEHULP 
VAN EEN BATCH-EVENWICHTSMETHODE
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. RAMING VAN DE ADSORPTIECOËFFICIËNT  (K OC ) AAN DE 
BODEM EN AAN RIOOLSLIB MET BEHULP VAN HO ­
GEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE(HPLC) 
C.20.  DAPHNIA MAGNA  VOORTPLANTINGSTEST 
C.21. MICRO-ORGANISMEN IN DE BODEM: BEPALING VAN DE 
OMZETTING VAN STIKSTOF 
C.22. MICRO-ORGANISMEN IN DE BODEM: BEPALING VAN DE 
OMZETTING VAN KOOLSTOF 
C.23. AEROBE EN ANAËROBE OMZETTING IN DE BODEM C.24. AEROBE EN ANAËROBE OMZETTING IN AQUATISCHE 
SEDIMENTSYSTEMEN 
C.25. AEROBE MINERALISATIE IN OPPERVLAKTEWATER — SI ­
MULATIETEST VOOR BIOLOGISCHE AFBRAAK 
C.26.  LEMNA  SP.: GROEIREMMINGSTEST
 
▼M4 
C.27. TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR  CHIRO­
NOMIDEA  IN SEDIMENT EN WATER M.B.V. VERRIJKT SE ­
DIMENT 
C.28. TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR  CHIRO­
NOMIDEA  IN SEDIMENT EN WATER M.BV VERRIJKT WA ­
TERR 
C.29. GEMAKKELIJKE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID — 
CO 2 IN GESLOTEN VATEN (GASRUIMTETEST) 
C.30. BIOACCUMULATIE IN TERRESTRISCHE  OLIGOCHAETAE  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. ACUTE TOXICITEIT VOOR VISSEN  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Het doel van deze test is het bepalen van de acute letale toxiciteit 
van een stof voor vissen in zoet water. Met het oog op de keuze van 
de testmethode (statisch, semi-statisch of doorstroming) die het meest geschikt is om concentraties van de teststof gedurende de testperiode voldoende constant te houden, is het wenselijk om, voor zover mo ­
gelijk, te beschikken over gegevens over de oplosbaarheid in water, 
dampspanning, chemische stabiliteit, dissociatieconstanten en bio ­
logische afbreekbaarheid van de teststof.
 
Zowel bij de voorbereiding van de test als bij de interpretatie van de 
resultaten moet rekening worden gehouden met aanvullende gege ­
vens (bijvoorbeeld structuurformule, zuiverheidsgraad, aard en per ­
centage van van belang zijnde verontreinigingen, aanwezigheid en hoeveelheden van additieven en de n-octanol/water-verdelingscoëffi ­
ciënt).
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Acute toxiciteit is het waarneembare schadelijke effect dat in een 
organisme wordt teweeggebracht binnen een korte tijd (dagen) van 
blootstelling aan een stof. In deze test wordt de acute toxiciteit uit ­
gedrukt als de mediaan letale concentratie (LC  50 ), dat wil zeggen de 
concentratie in water waardoor 50 % van een groep vissen in de proef wordt gedood binnen een continue blootstellingsperiode, die 
moet worden vermeld.
 
Alle concentraties van de teststof worden opgegeven in gewicht per 
volume (mg/l). Ze kunnen ook worden uitgedrukt als gewicht per 
gewicht (mg/kg–  1 ). 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Een referentiestof kan worden getest om aan te tonen dat de respons 
van geteste diersoorten onder laboratoriumomstandigheden niet in belangrijke mate is veranderd.
 
Voor deze test worden geen referentiestoffen gespecificeerd.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Er kan een limiettest met 100 mg per liter worden uitgevoerd, om 
aan te tonen dat de LC  50 groter is dan deze concentratie.  
De vissen worden gedurende 96 uur blootgesteld aan de teststof die 
in een reeks concentraties aan het water is toegevoegd. De sterfte wordt ten minste elke 24 uur genoteerd en de concentraties waarbij 50 % van de vissen sterft (LC
 50 ) wordt indien mogelijk berekend 
voor elke waarnemingstijd.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De kwaliteitscriteria zijn zowel op de limiettest als op de volledige 
test van toepassing.  
De sterfte in de controlegroepen mag aan het einde van de test niet 
hoger zijn dan 10 % (of één vis indien minder dan tien worden 
gebruikt).  
Het zuurstofgehalte moet gedurende de gehele test meer dan 60 % 
van de verzadigingswaarde voor lucht zijn geweest.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
De concentraties van de geteste stof dienen gedurende de gehele test 
binnen 80 % van de oorspronkelijke concentraties gehouden te wor ­
den. 
Bij stoffen die gemakkelijk oplossen in het testmedium en stabiele 
oplossingen geven en bijvoorbeeld niet in belangrijke mate vervluch ­
tigen of worden afgebroken, gehydrolyseerd of geadsorbeerd, mag de 
beginconcentratie als gelijk aan de nominale concentraties be ­
schouwd worden. Evenwel dient aangetoond te worden dat de con ­
centratie gedurende de gehele test gehandhaafd werden en dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.
 
Voor stoffen die:  
i) moeilijk oplosbaar zijn in het testmedium  
of 
ii) in staat zijn stabiele emulsies of dispersies te vormen  
of 
iii) niet stabiel zijn in waterige oplossingen,  
dient de bij het begin van de proef in de oplossing (of, indien dit 
technisch onmogelijk is, in de waterkolom) gemeten concentratie als de beginconcentratie te worden beschouwd. De concentratie moet na een equilibratieperiode maar voordat de proefvissen worden in ­
gebracht, worden bepaald.
 
In al deze gevallen dienen gedurende de test verdere metingen te 
worden uitgevoerd om de actuele blootstellingsconcentraties te be ­
vestigen of om te bevestigen dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan.  
De pH mag niet meer dan 1 eenheid variëren.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
Er kunnen drie verschillende procedures worden toegepast:  
Statische test:  
Toxiciteitstest waarbij de te onderzoeken oplossing niet stroomt. 
(Oplossingen blijven ongewijzigd gedurende de test.)  
Semi-statische test:  
Test waarbij de oplossing niet stroomt, maar de testoplossing perio ­
diek per bak wordt ververst na een langere periode (bijvoorbeeld 24 uur).
 
Doorstroomtest:  
Toxiciteitstest waarin het water voortdurend wordt ververst in de 
testbakken waarbij de te onderzoeken stof wordt meegevoerd met het water teneinde het testmedium te verversen.
 
1.6.1.  Reagentia  
1.6.1.1.  Oplossingen van de teststoffen  
Stamoplossingen van de gewenste sterkte worden bereid door de stof 
op te lossen in gedeïoniseerd water of water volgens 1.6.1.2.  
De gekozen testconcentraties worden bereid door verdunning van de 
stamoplossing. Indien hoge concentraties worden getest, kan de te 
onderzoeken stof rechtstreeks worden opgelost in het verdunnings ­
water.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
De stoffen moeten normaal gezien slechts worden getest tot aan de 
oplosbaarheidsgrens. Bij sommige stoffen (bijvoorbeeld stoffen met 
lage oplosbaarheid in water of een hoge P  OW , of stoffen die een 
stabiele dispersie vormen in plaats van een echte oplossing in water) is het aanvaardbaar een testconcentratie te onderzoeken boven de 
oplosbaarheidslimiet van de stof, om te verzekeren dat de maximaal 
oplosbare/stabiele concentratie werd bereikt. Het is echter belangrijk dat deze concentratie niet op andere wijze het testsysteem verstoort (bijvoorbeeld een vlies van de stof op het water waardoor de zuur ­
stofvoorziening van het water verhinderd wordt).
 
Ultrasone dispersie, organische oplosmiddelen, emulgatoren of dis ­
pergeermiddelen kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij het be ­
reiden van stamoplossingen van stoffen met een lage oplosbaarheid in water, of bij het dispergeren van deze stoffen in het testmedium. Indien dergelijke hulpstoffen worden gebruikt, moeten alle testcon ­
centraties dezelfde hoeveelheid hulpstof bevatten en moeten extra 
controlevissen worden blootgesteld aan dezelfde concentratie van de hulpstof als die welke is gebruikt in de testreeks. De concentratie van dergelijke hulpstoffen dient zo laag mogelijk gehouden te wor ­
den en mag in géén geval groter zijn dan 100 mg per liter test ­
medium.
 
De test dient te worden uitgevoerd zonder correctie van de pH. 
Indien er aanwijzingen zijn voor een duidelijke verandering van de pH, wordt geadviseerd om de test te herhalen met gecorrigeerde pH en de resultaten te vermelden. In dat geval dient de pH-waarde van 
de stamoplossing te worden aangepast aan de pH-waarde van het 
verdunningswater, tenzij er speciale redenen zijn om dit niet te doen. Voor dit doel verdienen HCl en NaOH de voorkeur. Deze pH-cor ­
rectie dient zodanig te geschieden dat de concentratie van de teststof 
in de stamoplossing niet in belangrijke mate wordt gewijzigd. Indien 
ten gevolge van de correctie een chemische reactie of fysische neer ­
slagvorming van de teststof mocht optreden, dan dient dit te worden vermeld in het rapport.
 
1.6.1.2.  Voorraad en verdunningswater  
Leidingwater (waarin geen chloor, zware metalen of andere stoffen 
in mogelijk schadelijke concentraties mogen voorkomen), goede 
kwaliteit natuurlijk water of synthetisch water (zie aanhangsel 1) 
kunnen worden gebruikt. Water met een totale hardheid van 10 tot 250 mg per liter (als CaCO
 3 ) en met een pH van 6,0 tot 8,5 verdient 
de voorkeur.  
1.6.2.  Apparatuur  
Alle apparatuur dient te zijn vervaardigd van chemisch inert materi ­
aal: 
— automatisch verdunningssysteem (voor doorstroomtest),  
— zuurstofmeter,  
— apparatuur voor de bepaling van de hardheid van water,  
— apparatuur voor de temperatuurbeheersing,  
— pH-meter.  
1.6.3.  Testvissen  
De vissen dienen gezond te zijn en vrij van elke waarneembare 
misvorming.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Het verdient aanbeveling de te gebruiken soorten te selecteren op 
basis van relevante praktische overwegingen, zoals goede beschik ­
baarheid gedurende het gehele jaar, goede houdbaarheid, geschikt ­
heid voor testdoeleinden, relatieve gevoeligheid voor chemische stof ­
fen, alsmede alle economische, biologische of ecologische factoren 
die van belang zijn. Tevens dient bij de keuze van de vissoort 
rekening gehouden te worden met de behoefte aan vergelijkbaarheid van de verkregen gegevens en met de bestaande internationale har ­
monisering (referentie 1).
 
Een lijst met voor de uitvoering van de onderhavige test aanbevolen 
vissoorten staat vermeld in aanhangsel 2; de zebravis en de regen ­
boogforel hebben de voorkeur.  
1.6.3.1.  Het houden van voorraad  
Testvissen dienen bij voorkeur afkomstig te zijn van één partij, met 
ongeveer dezelfde lengte en leeftijd. De vissen moeten ten minste 12 dagen onder de volgende omstandigheden worden bewaard:
 
Hoeveelheid vis per liter:  
aangepast aan het systeem (recirculatie of doorstroming) en de vis ­
soort;  
Water:  
zie 1.6.1.2;  
Licht:  
per dag een belichtingsperiode van 12 à 16 uur;  
Zuurstofgehalte:  
ten minste 80 % van de verzadigingswaarde voor lucht;  
Voeren:  
drie keer per week of dagelijks; dit wordt 24 uur voor het begin van 
de test stopgezet.  
1.6.3.2.  Sterfte  
Na een gewenningsperiode van 48 uur wordt de sterfte geregistreerd, 
waarbij de volgende criteria worden gehanteerd:  
— in 7 dagen meer dan 10 % van de populatie:  
de gehele partij wordt afgekeurd;  
— 5 tot 10 % van de populatie:  
de periode van het in voorraad houden wordt met nog 7 dagen 
verlengd.  
Indien geen nieuwe sterfgevallen optreden, wordt de partij goed ­
gekeurd. Anders dient deze te worden afgekeurd;  
— minder dan 5 % van de populatie:  
de partij wordt goedgekeurd.  
1.6.4.  Aanpassing  
Alle vissen moeten gedurende ten minste 7 dagen voor het gebruik 
worden blootgesteld aan water van de kwaliteit en de temperatuur 
zoals dat in de test zal worden gebruikt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Testprocedure  
Een definitieve test kan worden voorafgegaan door een test om het 
meetgebied vast te stellen. Deze verschaft gegevens over de voor de eigenlijke test te gebruiken reeks concentraties.
 
Naast de testreeks wordt een controlegroep zonder de teststof uitge ­
voerd en, indien van toepassing, ook een controlegroep met de hulp ­
stof. 
Afhankelijk van de fysische en chemische eigenschappen van de 
teststof kan gekozen worden voor een statische, semi-statische of 
doorstroomtest om aan de kwaliteitscriteria te voldoen.  
Vissen worden als volgt aan de stof blootgesteld:  
— tijdsduur: 96 uur;  
— aantal dieren: ten minste 7 per concentratie;  
— bakken: van een capaciteit die in overeenstemming is met de 
aanbevolen hoeveelheid vis per liter;  
— hoeveelheid vis per liter: een maximale bezettingsgraad van 1,0 g 
per liter voor statische en semi-statische tests wordt aanbevolen; 
voor doorstroomsystemen kan een grotere hoeveelheid vis per liter aanvaardbaar zijn;
 
— testconcentratie: ten minste vijf concentraties die verschillen met 
een constante welke niet groter is dan 2,2 en die zo mogelijk het gebied met een sterfte van 0 % tot 100 % bestrijken;
 
— water: zie 1.6.1.2;  
— licht: dagelijks een belichtingsperiode van 12 à 16 uur;  
— temperatuur: aangepast aan de soort (Aanhangsel 2); voor iedere 
afzonderlijke test moet de temperatuur evenwel constant blijven binnen ± 1
 o C; 
— zuurstofgehalte: ten minste 60 % van de verzadigingswaarde 
voor lucht bij de gekozen temperatuur;  
— voeren: achterwege laten.  
De vissen worden gecontroleerd na de eerste 2 tot 4 uur en ten 
minste elke 24 uur. Vissen worden geacht dood te zijn indien aan ­
raking van de staartwortel geen reactie teweeg brengt en geen adem ­
halingsbewegingen zichtbaar zijn. Dode vissen worden, zodra zij zijn opgemerkt, verwijderd en de sterfte wordt geregistreerd. Er wordt aantekening gemaakt van zichtbare afwijkingen (bijvoorbeeld even ­
wichtsverlies, veranderingen in zwemgedrag, ademhalingsfunctie, 
pigmentatie enzovoort).
 
De pH, zuurstofconcentratie en temperatuur moeten dagelijks worden 
gemeten.  
Limiettest  
Gebruikmakend van de procedure zoals beschreven in deze methode, 
kan een limiettest worden uitgevoerd met 100 mg per liter om aan te tonen dat de LC
 50 groter is dan deze concentratie.  
Indien de aard van de stof zodanig is dat een concentratie van 
100 mg per liter in het testwater niet bereikt kan worden, dient de proef te worden uitgevoerd met een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheid van de te onderzoeken stof (of de maximale concen ­
tratie die een stabiele dispersie vormt) in het gebruikte medium (zie 
ook punt 1.6.1.1).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
De limiettest dient te worden uitgevoerd met 7 à 10 vissen en een ­
zelfde aantal in de controlegroepen. (De binomiale theorie schrijft 
voor dat als bij gebruik van 10 vissen geen sterfte optreedt, de LC  50 
met een betrouwbaarheid van 99,9 % groter is dan de in de limiettest 
gebruikte concentratie. Met 7, 8 of 9 vissen geeft de afwezigheid van 
sterfte een betrouwbaarheid van ten minste 99 % dat de LC  50 groter 
is dan de gebruikte concentratie.)  
Indien sterfte optreedt, dient een volledige test te worden uitgevoerd. 
Indien subletale effecten worden waargenomen, dienen deze te wor ­
den vermeld.  
2. GEGEVENS EN EVALUATIE  
Zet voor elke aanbevolen blootstellingsperiode op logaritmisch-waar ­
schijnlijkheidspapier voor elk tijdstip waarop waarnemingen werden 
geregistreerd (24, 48, 72 en 96 uur) het sterftepercentage uit tegen de 
concentratie.  
De LC  50 en de betrouwbaarheidsintervallen (p = 0,05) dienen zo 
mogelijk voor iedere waarnemingsperiode geschat te worden met 
behulp van standaardprocedures; deze waarden moeten worden af ­
gerond tot op één, of ten hoogste twee significante cijfers (voor ­
beelden voor afronding op twee cijfers: 170 voor 173,5; 0,13 voor 
0,127; 1,2 voor 1,21).  
In die gevallen waarin de helling van de concentratie/respons-per ­
centage-kromme te steil is voor een berekening van de LC  50 -waarde, 
is een grafische schatting van deze waarde voldoende.  
Indien twee opeenvolgende concentraties met een onderlinge verhou ­
ding van 2,2 slechts een sterfte van 0 respectievelijk 100 % geven, 
dan zijn deze waarden voldoende om aan te geven in welk gebied de 
LC 50 ligt. 
Indien blijkt dat de stabiliteit of homogeniteit van de teststof niet kan 
worden gehandhaafd, dient dit te worden vermeld en dient voorzich ­
tigheid betracht te worden bij de interpretatie van de resultaten.  
3. RAPPORTAGE  
In het verslag moeten indien mogelijk de volgende gegevens worden 
opgenomen:  
— gegevens over de testvis (wetenschappelijke naam; stam; leveran ­
cier; eventuele voorbehandeling; afmeting en aantal dat voor elke 
testconcentratie gebruikt is);  
— herkomst van het verdunningswater alsmede belangrijkste che ­
mische kenmerken (pH, hardheid, temperatuur);  
— voor stoffen met een geringe oplosbaarheid in water, de methode 
voor de bereiding van de stam- en testoplossingen;  
— concentratie van eventuele hulpstoffen;  
— lijst van de gebruikte concentraties en alle beschikbare gegevens 
over de stabiliteit bij de concentraties van de teststof in de ge ­
bruikte oplossing;  
— als chemische analyses zijn uitgevoerd, dienen de toegepaste 
methoden en de verkregen resultaten te worden vermeld;  
— de resultaten van de limiettest, indien van toepassing;  
— redenen voor de keuze van de testprocedure alsmede verdere 
details (bijvoorbeeld statisch, semi-statisch, doseersnelheid, door ­
stroomsnelheid, of er belucht is, hoeveelheid vis per liter, enzo ­
voort);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— beschrijving van de testuitrusting;  
— lichtregime;  
— voor iedere 24 uur het zuurstofgehalte, de pH-waarde en de 
temperatuur van de testoplossingen;  
— gegevens om aan te tonen dat aan de kwaliteitscriteria is voldaan;  
— een tabel met de cumulatieve mortaliteit voor elke concentratie 
en voor de controlegroepen (en, zo nodig, voor de controlegroep 
met hulpstof) op elke aanbevolen waarnemingstijd;  
— grafiek van de concentratie/responspercentage-kromme aan het 
einde van de test;  
— zo mogelijk, de LC  50 -waarden op elk van de aanbevolen waar ­
nemingstijden (met de 95 % betrouwbaarheidsgrenzen);  
— statistische procedures voor de bepaling van de LC  50 -waarden;  
— als een referentiestof wordt gebruikt moeten ook hiervan de re ­
sultaten worden vermeld;  
— hoogste testconcentratie die binnen de testperiode geen sterfte 
veroorzaakte;  
— laagste testconcentratie die binnen de testperiode 100 % sterfte 
veroorzaakte.  
4. LITERATUUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 Final and updates.  
(2) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Brachydanio rerio  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-303 June 1985.  
(3) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Salmo gairdneri  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/1,/2 en/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan — Teleostei, Cyprinidae). 
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- 
through method.  
(5) Eidgenössisches Departement des Innern, Schweiz: Richtlinien 
für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungs ­
methoden — Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 L(l) und L(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata,  1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the Acute 
Toxicity Tests with Fish, Macroinvertebrates and Amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic 
Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 
1975.
 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental Monitoring 
and Support Laboratory, Office of Research and Development. 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency: Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard Methods for the Examination of Water and Waste ­
water, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities.Inter-laboratory test 
programme concerning the study of the ecotoxicity of a che ­
mical substance with respect to the fish. CEE Study D.8368, 
22 March 1979.  
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes rum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grund ­
lagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltche ­
mikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bio ­
assay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, 3-32.  
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. 
ASTM STP 634, 1977, 65-84.
 
(20) Stephan, C.E., Bush, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Aanhangsel 1  
Synthetisch water  
Voorbeeld van een geschikt verdunningswater  
Alle chemicaliën moeten van pro-analyse kwaliteit zijn.  
Het water moet gedistilleerd of gedeïoniseerd water van goede kwaliteit zijn met 
een geleidingsvermogen van minder dan 5 μScm  -1 . 
Het toestel voor de distillatie van water mag geen koperen onderdelen bevatten.  
Stamoplossingen  
CaCl  2 . 2H20 (calciumchloridedihydraat) 
Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter. 11,76 g 
MgSO  4 .7H20 (magnesiumsulfaatheptahydraat) 
Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter. 4,93 g 
NaHCO  3 (natriumwaterstofcarbonaat) 
Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter. 2,59 g 
KCl (kaliumchloride) 
Oplossen in water en aanvullen met water tot 1 liter. 0,23 g  
Synthetisch verdunningswater  
Meng 25 ml van elk van de vier stamoplossingen en vul met water aan tot 1 liter.  
Belucht tot het zuurstofgehalte overeenkomt met de verzadigingswaarde voor 
lucht.  
De pH moet 7,8 ± 0,2 bedragen.  
De pH zo nodig bijstellen met NaOH (natriumhydroxide) of HCl (zoutzuur).  
Het aldus verkregen verdunningswater wordt gedurende ongeveer 12 uur weg ­
gezet en behoeft niet verder te worden belucht.  
De som van de Ca- en Mg-ionen in deze oplossing bedraagt 2,5 mmol per liter. 
De verhouding van de Ca- en Mg-ionen is 4:1 en die van de Na- en K-ionen 10:1. De totale alkaliteit van deze oplossing is 0,8 mmol per liter.
 
Eventuele afwijkingen van de bereidingswijze van het verdunningswater mogen 
niet leiden tot een andere samenstelling of andere eigenschappen van het water.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Aanhangsel 2  
Voor tests aanbevolen vissoorten  
Aanbevolen soort Aanbevolen test ­
temperatuur (°C) Aanbevolen totale 
lengte van het 
proefdier (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamil-ton-Buchanan) Zebravis 20-24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafi-nesque) Modderkruiper 20-24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linnaeus 1758) Gewone karper 20-24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae) Cy ­
prinodonti-dae  (Tomminck et Schlegel 
1850) Japans rijstvisje 20-24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20-24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidaej  (Rafinesque Linnaeus 1758) Zonne ­
baars 20-24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Regenbogenforel 12-17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
neaus 1758) Goudwinde 20-24 6,0 ± 2,0  
Herkomst  
Bovengenoemde vissen laten zich gemakkelijk kweken en/of zijn het gehele jaar 
ruim verkrijgbaar. Zij kunnen worden geteeld en gekweekt in viskwekerijen of in 
het laboratorium onder omstandigheden waarbij ziektekiemen en parasieten onder 
controle gehouden worden, zodat de proefdieren gezond zijn en hun afkomst bekend is. Deze vissen zijn in veel delen van de wereld beschikbaar.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Aanhangsel 3  
Voorbeeld van een concentratie / sterftepercentage — kromme  
Voorbeeld van de bepaling van de LC  50 -waarde met logaritmisch-waarschijnlijk ­
heidspapier
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA  Sp. — ACUTE IMMOBILISATIETEST  
1. METHODE  
Deze testmethode voor acute immobilisatie komt overeen met OESO 
TG 202 (2004).  
1.1. INLEIDING  
In deze methode wordt een test voor acute toxiciteit beschreven om 
de effecten van chemische stoffen op daphniden te bepalen. Er is zo 
veel mogelijk gebruik gemaakt van bestaande testmethoden (1)(2)(3).  
1.2. DEFINITIES  
In de context van deze methode worden de volgende definities ge ­
bruikt:  
EC 50 : de concentratie waarbij wordt vastgesteld dat 50 % van de 
daphniden binnen een bepaalde blootstellingsperiode wordt geïmmo ­
biliseerd. Als er een andere definitie wordt gebruikt, moet dit worden gerapporteerd en moet er een referentie worden vermeld.
 
Immobilisatie:  dieren die niet in staat zijn binnen 15 seconden na 
voorzichtig schudden van het testvat te zwemmen, worden geacht 
te zijn geïmmobiliseerd (zelfs als ze hun antennes nog kunnen 
bewegen).  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Jonge daphniden, die aan het begin van de test nog geen 24 uur oud 
zijn, worden gedurende een periode van 48 uur aan een aantal con ­
centraties van de teststof blootgesteld. De immobilisatie wordt na 24 uur en 48 uur geregistreerd en met controlewaarden vergeleken. De 
resultaten worden geanalyseerd om de EC
 50 na 48 uur te bepalen 
(zie de definitie in punt 1.2). Bepaling van de EC  50 na 24 uur is 
facultatief.  
1.4. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
De oplosbaarheid in water en de dampdruk van de teststof dienen 
bekend te zijn en er moet een betrouwbare analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de stof in de testoplossingen met een 
gerapporteerde recovery-capaciteit en bepalingsgrens beschikbaar 
zijn. Bruikbare informatie is bijvoorbeeld: de structuurformule, de zuiverheid van de stof, de stabiliteit in water of onder invloed van licht, de P
 ow en resultaten van een test op gemakkelijke biologische 
afbreekbaarheid (zie methode C.4).  
NB: Richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch- 
chemische eigenschappen dat dit problemen oplevert, zijn opge ­
nomen in (4).  
1.5. REFERENTIESTOFFEN  
Er kan een EC  50 -test met een referentiestof worden uitgevoerd om te 
waarborgen dat de testomstandigheden betrouwbaar zijn. Voor dit doel worden toxische stoffen aanbevolen die in internationale ring ­
tests (1)(5) zijn gebruikt (
 1 ). Bij voorkeur eens per maand en ten 
minste twee keer per jaar moeten er een of meer tests met een referentiestof worden uitgevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) De resultaten van deze ringtests en een technisch corrigendum van ISO 6341 leveren 
voor kaliumdichromaat (K  2 Cr 2 O 7 ) een EC  50 na 24 uur tussen 0,6 en 1,7 mg/l op.
 1.6. KWALITEITSCRITERIA  
Voor een geldige test moet aan de volgende criteria worden voldaan:  
— in de controlegroepen, met inbegrip van de controlegroep met het 
ontsluitingsmiddel, mag niet meer dan 10 % van de daphniden 
zijn geïmmobiliseerd;  
— de concentratie opgeloste zuurstof aan het eind van de test moet 
zowel in de controlegroepen als in de testgroepen ≥ 3 mg/l zijn.  
NB: Voor het eerste criterium mag niet meer dan 10 % van de 
controle-daphniden immobilisatie of andere verschijnselen van ziekte 
of stress vertonen, bijvoorbeeld verkleuring of ongebruikelijk gedrag 
zoals permanent verblijf aan het wateroppervlak.  
1.7. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.7.1.  Apparatuur  
Testvaten en andere apparatuur die in contact met de testoplossingen 
komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materi ­
aal zijn gemaakt. Normaal gesproken worden glazen reageerbuizen 
of bekerglazen als testvat gebruikt; deze moeten vóór elk gebruik volgens standaardlaboratoriumprocedures worden gereinigd. De test ­
vaten moeten losjes worden afgedekt om verlies van water door 
verdamping te beperken en om te voorkomen dat er stof in de 
oplossingen terechtkomt. Vluchtige stoffen moeten worden getest in volledig gevulde gesloten vaten die groot genoeg zijn om te voor ­
komen dat de zuurstofconcentratie een beperkende factor wordt of te 
sterk daalt (zie punt 1.6 en de eerste alinea van punt 1.8.3).
 
Daarnaast wordt (een deel van) de volgende apparatuur gebruikt: een 
zuurstofmeter (met micro-elektrode of andere geschikte instrumenten om de concentratie opgeloste zuurstof in monsters met een klein volume te meten), een pH-meter, geschikte apparatuur voor tempe ­
ratuur-regulering, apparatuur voor de bepaling van de totale organi ­
sche koolstofconcentratie (TOC), apparatuur voor de bepaling van het chemisch zuurstofverbruik (CZV), apparatuur voor de bepaling van de hardheid van water enz.
 
1.7.2.  Testorganisme  
Als testsoort wordt de voorkeur gegeven aan  Daphnia magna Straus , 
maar voor deze test mogen ook andere geschikte  Daphnia -soorten 
worden gebruikt (b.v.  Daphnia pulex).  Aan het begin van de test 
mogen de dieren nog geen 24 uur oud zijn en om de variabiliteit te beperken wordt sterk aanbevolen dat ze geen eerste nakomelingen 
zijn. Ze moeten afkomstig zijn van een gezonde stam (d.w.z. zonder 
tekenen van stress zoals hoge mortaliteit, aanwezigheid van manne ­
lijke dieren en ephippia, vertraging bij het voortbrengen van het eerste broedsel, verkleurde dieren, enz.). Alle organismen die voor 
een bepaalde test worden gebruikt, moeten afkomstig zijn van cul ­
turen van dezelfde daphnidenstam. De stamdieren moeten onder ver ­
gelijkbare kweekomstandigheden (licht, temperatuur, medium) wor ­
den gehouden als tijdens de test worden gebruikt. Indien het tijdens 
de test te gebruiken daphniden-kweekmedium afwijkt van het me ­
dium voor de gangbare daphniden-cultuur, verdient het aanbeveling vóór de test een acclimatiseringsperiode in acht te nemen. Daartoe dienen broed-daphniden gedurende ten minste 48 uur vóór het begin 
van de test bij de testtemperatuur in verdunningswater te worden 
bewaard.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Medium- en verdunningswater  
Natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water of 
ontchloord kraanwater zijn aanvaardbaar als medium- en verdun ­
ningswater, als de daphniden daarin gedurende het kweken, de ac ­
climatisering en de test overleven zonder tekenen van stress te ver ­
tonen. Elk water dat voldoet aan de in bijlage 1 vermelde chemische kenmerken van aanvaardbaar verdunningswater, is geschikt om voor de test te worden gebruikt. Het moet gedurende de testperiode van 
constante kwaliteit te zijn. Synthetisch water kan worden vervaardigd 
door specifieke hoeveelheden reagentia aan gedeïoniseerd of gedes ­
tilleerd water toe te voegen. Voorbeelden van synthetisch water zijn 
te vinden in (1) en (6) en in bijlage 2. Er dient te worden opgemerkt 
dat media die bekende chelaatvormers bevatten, zoals de media M4 en M7 in bijlage 2, moeten worden vermeden voor teststoffen die metalen bevatten. De pH moet op het interval tussen 6 en 9 liggen. 
Een hardheid tussen 140 en 250 mg/l (als CaCO
 3 ) wordt aanbevolen 
voor Daphnia Magna,  terwijl voor andere  Daphnia-soorten  ook een 
lagere hardheid geschikt kan zijn. Vóór het gebruik voor de test kan lucht door het verdunningswater worden geleid, zodat de concentra ­
tie opgeloste zuurstof het verzadigingspunt heeft bereikt.
 
Als natuurlijk water wordt gebruikt, moeten de kwaliteitsparameters 
ten minste twee keer per jaar worden gemeten of zodra het vermoe ­
den bestaat dat deze kenmerken wellicht significant zijn veranderd (zie de vorige alinea en bijlage 1). Ook metingen van zware metalen 
(b.v. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd en Ni) moeten worden uitgevoerd. Als 
ontchloord kraanwater wordt gebruikt, is een dagelijkse analyse op chloor wenselijk. Als het verdunningswater afkomstig is van een oppervlaktewater- of grondwaterbron, moeten de geleidbaarheid en 
de totale hoeveelheid organische koolstof (TOC) of het chemisch 
zuurstofverbruik (CZV) worden gemeten.
 
1.7.4.  Testoplossingen  
De testoplossingen met de gekozen concentraties worden meestal 
bereid door verdunning van een stamoplossing. Stamoplossingen moeten bij voorkeur worden bereid door de teststof in het verdun ­
ningswater op te lossen. Het gebruik van oplosmiddelen, emulgato ­
ren of dispergeermiddelen moet zo veel mogelijk worden vermeden. 
In sommige gevallen kunnen dergelijke verbindingen echter nodig zijn om een stamoplossing te maken die geconcentreerd genoeg is. Richtsnoeren voor geschikte oplosmiddelen, emulgatoren en disper ­
geermiddelen zijn te vinden in (4). In elk geval mag de hoeveelheid 
teststof in de testoplossingen niet groter zijn dan de oplosbaarheids ­
grens in het verdunningswater.
 
De test moet zonder aanpassing van de pH worden uitgevoerd. Als 
de pH niet op het interval 6-9 blijft, moet een tweede test worden 
uitgevoerd waarbij de pH van de stamoplossing wordt aangepast aan 
die van het verdunningswater vóór de toevoeging van de teststof. De aanpassing van de pH moet zodanig gebeuren dat de concentratie van de stamoplossing niet in significante mate verandert en dat dit 
niet leidt tot een chemische reactie of neerslaan van de teststof. HCl 
en NaOH verdienen de voorkeur.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. PROCEDURE  
1.8.1.  Blootstellingsomstandigheden  
1.8.1.1.  Test-en controlegroepen  
De testvaten worden gevuld met de juiste volumes verdunningswater 
en teststof-oplossingen. De volumeverhouding lucht/water in het test ­
vat moet voor de test- en controlegroepen identiek zijn. Vervolgens worden de daphniden in de testvaten gebracht. Bij elke testconcen ­
tratie en voor de controlegroep moeten ten minste 20 dieren worden 
gebruikt, bij voorkeur verdeeld in vier groepen van elk vijf dieren. 
Per dier moet ten minste 2 ml testoplossing beschikbaar zijn (d.w.z. een volume van 10 ml voor vijf daphniden per testvat). De test kan 
worden uitgevoerd met semi-statische vervanging of een doorstroom ­
systeem wanneer de concentratie van de teststof niet stabiel is.
 
Naast de groepen met teststof moeten er één controlegroep met ver ­
dunningswater en indien van toepassing één controlegroep met het ontsluitingsmiddel in de test worden opgenomen.
 
1.8.1.2.  Testconcentraties  
Er kan een oriënterende test worden uitgevoerd om het concentra ­
tiebereik voor de definitieve test te bepalen, tenzij er informatie over de toxiciteit van de teststof beschikbaar is. Daartoe worden de 
daphniden blootgesteld aan een reeks concentraties van de teststof 
met een grote spreiding. Aan elke concentratie moeten gedurende 48 uur of korter vijf daphniden worden blootgesteld en er zijn geen duplo's nodig. De blootstellingsduur kan worden verkort (bv. 24 
uur of minder) als er in kortere tijd gegevens kunnen worden ver ­
kregen die voor de oriënterende test volstaan.
 
Er moeten ten minste vijf testconcentraties worden gebruikt. Deze 
moeten een meetkundige reeks vormen met een rede die bij voorkeur niet hoger is dan 2,2. Als er minder dan vijf concentraties worden 
gebruikt, moet daarvoor een motivering worden gegeven. De hoogste 
geteste concentratie moet bij voorkeur leiden tot 100 % immobilisa ­
tie en de laagste geteste concentratie mag bij voorkeur geen waar ­
neembaar effect veroorzaken.
 
1.8.1.3.  Incubatieomstandigheden  
De temperatuur moet binnen het interval tussen 18  o C en 22  o C 
liggen en moet voor elke afzonderlijke test binnen ± 1  o C stabiel 
zijn. Een cyclus met 16 uur licht en 8 uur donker wordt aanbevolen. 
Volledige duisternis is ook aanvaardbaar, vooral wanneer de teststof onder invloed van licht instabiel is.
 
De testvaten mogen tijdens de test niet worden belucht. De test 
wordt zonder aanpassing van de pH uitgevoerd. De daphniden mo ­
gen gedurende de test niet worden gevoerd.  
1.8.1.4.  Duur  
De test duurt 48 uur.  
1.8.2.  Observaties  
Elk testvat moet 24 en 48 uur na het begin van de test worden 
gecontroleerd op geïmmobiliseerde daphniden (zie punt 1.2 voor 
definities). Naast immobiliteit moet ook abnormaal gedrag of een 
afwijkend uiterlijk worden gerapporteerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analytische bepalingen  
Aan het begin en aan het eind van de test worden in de contro ­
legroep(en) en bij de hoogste concentratie van de teststof de con ­
centratie opgeloste zuurstof en de pH gemeten. De concentratie op ­
geloste zuurstof in de controlegroepen moet aan het geldigheidscri ­
terium voldoen (zie punt 1.6). De pH mag binnen één test normaal gesproken niet meer dan 1,5 eenheid variëren. De temperatuur wordt meestal in controlevaten of in de lucht gemeten en moet bij voorkeur 
continu gedurende de test of ten minste aan het begin en het eind 
van de test worden geregistreerd.
 
De concentratie van de teststof moet ten minste bij de hoogste en 
laagste testconcentratie aan het begin en het eind van de test worden gemeten (4). Het verdient aanbeveling de resultaten op basis van de gemeten concentraties te bepalen. Als er echter gegevens beschikbaar 
zijn waaruit blijkt dat de concentratie van de teststof gedurende de 
hele test voldoende stabiel binnen ± 20 % van de nominale of gemeten beginconcentratie is gebleven, kunnen de resultaten op basis van de nominale of gemeten beginconcentraties worden bepaald.
 
1.9. LIMIETTEST  
Er kan volgens de in deze methode beschreven procedures een li ­
miettest worden uitgevoerd bij 100 mg teststof/l of (indien dit lager 
is) de oplosbaarheidsgrens in het testmedium om aan te tonen dat de 
EC 50 hoger is dan deze concentratie. De limiettest moet met 20 
daphniden (bij voorkeur verdeeld in vier groepen van vijf) en het ­
zelfde aantal in de controlegroep(en) worden uitgevoerd. Als er 
sprake is van immobilisatie, moet er een volledig onderzoek worden 
uitgevoerd. Elk geobserveerd abnormaal gedrag moet worden ge ­
registreerd.  
2. GEGEVENS  
De gegevens moeten worden ingediend in de vorm van een tabel 
waarin voor elke behandelde en controlegroep wordt vermeld hoe ­
veel van de gebruikte daphniden op elk observatietijdstip waren geïmmobiliseerd. Het percentage geïmmobiliseerde daphniden na 
24 uur en 48 uur wordt uitgezet tegen de testconcentratie. De gege ­
vens worden met geschikte statistische methoden (zoals probit-ana ­
lyse) geanalyseerd om de helling van de curves en de EC
 50 met 
95 %-betrouwbaarheidsgrenzen (p = 0,05) te berekenen (7) (8).  
Wanneer de standaardmethodes voor de berekening van de EC  50 niet 
bruikbaar zijn voor de verkregen gegevens, worden de hoogste con ­
centratie die geen immobiliteit veroorzaakt en de laagste concentratie 
die 100 % immobiliteit veroorzaakt, als benadering voor de EC  50 
gebruikt (daarvoor wordt in dit geval het meetkundig gemiddelde 
van deze twee concentraties genomen).  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden 
opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— chemische identificatiegegevens, met inbegrip van de zuiverheid.  
Testsoort:  
— bron en species van de  Daphnia,  de leverancier van de bron 
(indien bekend) en de gebruikte cultuuromstandigheden (met in ­
begrip van bron, aard en hoeveelheid van het voer en de voer ­
frequentie).  
Testomstandigheden:  
— beschrijving van de testvaten: type, volume van de oplossing, 
aantal daphniden per testvat, aantal testvaten (duplo's) per con ­
centratie;  
— methoden voor de bereiding van de stam- en testoplossingen, met 
inbegrip van eventueel gebruikte oplosmiddelen of dispergeer ­
middelen en gebruikte concentraties;  
— nadere bijzonderheden over het verdunningswater: bron en kwali ­
teitskenmerken van het water (pH, hardheid, verhouding Ca/Mg, verhouding Na/K, alkaliniteit, geleidbaarheid enz.); samenstelling van synthetisch water, indien gebruikt;
 
— incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtintensiteit en -perio ­
diciteit, opgeloste zuurstof, pH enz.  
Resultaten:  
— het aantal en het percentage daphniden in elke behandelde en 
controlegroep dat op elk observatietijdstip was geïmmobiliseerd of blijk gaf van schadelijke effecten (met inbegrip van abnormaal gedrag) en een beschrijving van de aard van de geobserveerde 
effecten;
 
— de resultaten van de met een referentiestof uitgevoerde test en de 
datum waarop deze is uitgevoerd, indien beschikbaar;  
— de nominale testconcentraties en de resultaten van alle analyses 
om de concentratie van de teststof in de testvaten te bepalen; de 
recoverycapaciteit van de methode en de bepalingsgrens dienen 
ook te worden gerapporteerd;  
— alle tijdens de test uitgevoerde fysisch-chemische metingen van 
de temperatuur, de pH en de opgeloste zuurstof;  
— de EC  50 na 48 uur voor immobilisatie met betrouwbaarheids ­
intervallen en grafieken van het model dat voor de berekening 
daarvan is gebruikt, de hellingen van de dosis/respons-curves en 
de standaardafwijking daarvan; de voor de bepaling van de EC  50 
gebruikte statistische procedures; (wanneer deze gegevens ook 
voor immobilisatie na 24 uur zijn gemeten, dienen deze ook te 
worden gerapporteerd)  
— een verklaring voor eventuele afwijkingen van de testmethode en 
een toelichting of deze afwijkingen gevolgen hebben gehad voor 
de resultaten van de test.  
4. REFERENTIES  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality — Determination of the inhi ­
bition of the mobility of  Daphnia magna Straus  (Cladocera, 
Crustacea) — Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996). Biological test method. Acute Le ­
thality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000.
 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  
Daphnia.
 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In Aqua ­
tic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American Society for Tes ­
ting and Materials. Pp. 65-84.
 
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
Bijlage 1  
ENKELE CHEMISCHE KENMERKEN VAN AANVAARDBAAR 
VERDUNNINGSWATER  
Stof Concentratie  
Deeltjes < 20 mg/l 
Totale hoeveelheid organische koolstof < 2 mg/l 
Niet-geïoniseerde ammonium < 1 μg/l 
Chloorresiduen < 10 μg/l 
Totale hoeveelheid organofosfaat-bestrijdingsmiddelen < 50 ng/l Totale hoeveelheid organochloor-bestrijdingsmiddelen plus 
polychloorbifenylen < 50 ng/l 
Totale hoeveelheid organisch chloor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
Bijlage 2  
VOORBEELDEN VAN GESCHIKT SYNTHETISCH TESTWATER  
ISO-testwater (1)  
Stamoplossingen (één stof) Voor de bereiding van 
synthetisch water worden de 
volgende volumes 
stamoplossingen toegevoegd 
aan 1 liter water (*) Stof Aan 1 liter water (*) 
toegevoegde hoeveelheid  
Calciumchloride 
CaCl  2 .2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Magnesiumsulfaat 
MgSO  4 .7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Natriumbicarbonaat 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kaliumchloride 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Water met een geschikte zuiverheid, bijvoorbeeld gedeïoniseerd, gedestilleerd of gezui ­
verd door omgekeerde osmose, met een geleidbaarheid die bij voorkeur niet hoger is 
dan 10 μS.cm  -1 . 
Elendt-media M7 en M4  
Acclimatisering aan Elendt-media M7 en M4  
Sommige laboratoria hebben problemen ondervonden bij het rechtstreeks over ­
brengen van Daphnia in M4- en M7-media. Toch is er enig succes geboekt met geleidelijke acclimatisering, d.w.z. overgang van het eigen medium naar 30 % 
Elendt, vervolgens naar 60 % Elendt en tot slot naar 100 % Elendt. De vereiste 
acclimatiseringsperiode kan soms oplopen tot een hele maand.
 
Bereiding  
Spoorelementen  
Eerst worden afzonderlijke stamoplossingen (I) van individuele spoorelementen 
bereid in water met een geschikte zuiverheid, bijvoorbeeld gedeïoniseerd, gedes ­
tilleerd of gezuiverd door omgekeerde osmose. Uit deze verschillende stamoplos ­
singen (I) wordt één tweede stamoplossing (II) bereid die alle spoorelementen bevat (gecombineerde oplossing):
 
Stamoplossing(en) I (één stof) Aan water toegevoegde 
hoeveelheid (mg/l) Concentratie (in 
vergelijking met 
medium M4) Voor de bereiding van de gecombineerde 
stamoplossing II wordt de volgende hoeveelheid 
stamoplossing I toegevoegd aan water (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000-voudig 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000-voudig 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000-voudig 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Stamoplossing(en) I (één stof) Aan water toegevoegde 
hoeveelheid (mg/l) Concentratie (in 
vergelijking met 
medium M4) Voor de bereiding van de gecombineerde 
stamoplossing II wordt de volgende hoeveelheid 
stamoplossing I toegevoegd aan water (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000-voudig 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000-voudig 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000-voudig 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000-voudig 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000-voudig 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000-voudig 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000-voudig 1,0 1,0 
KI 65 20 000-voudig 1,0 1,0 Na
 2 Se0  3 43,8 20 000-voudig 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000-voudig 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000-voudig — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000-voudig — — 
Zowel de Na2EDTA- als de FeSO  4 -oplossing wordt apart bereid; vervolgens 
worden ze samengevoegd en onmiddellijk in een autoclaaf gesteriliseerd. 
Dit levert op: 
2 l Fe-EDTA-oplossing 1 000-voudig 20,0 5,0  
M4- en M7-media  
M4- en M7-media worden als volgt bereid met behulp van stamoplossing II, 
macronutriënten en vitamines:  
Aan water toegevoegde 
hoeveelheid (mg/l) Concentratie (in 
vergelijking met me ­
dium M4) Voor de bereiding van het medium toegevoegde 
hoeveelheid stamoplossing II (ml/l) 
M4 M7  
Stamoplossing II (gecom ­
bineerde spoorelementen) 20-voudig 50 50 
Stamoplossingen macronu ­
triënten (één stof) 
CaCl  2 2H 2 O 293 800 1 000-voudig 1,0 1,0 
MgSO  4 7H 2 O 246 600 2 000-voudig 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000-voudig 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000-voudig 1,0 1,0 
Na 2 Si0 3 .9H  2 O 50 000 5 000-voudig 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000-voudig 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000-voudig 0,1 0,1 
K 2 H PO  4 1 840 10 000-voudig 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Aan water toegevoegde 
hoeveelheid (mg/l) Concentratie (in 
vergelijking met me ­
dium M4) Voor de bereiding van het medium toegevoegde 
hoeveelheid stamoplossing II (ml/l) 
M4 M7  
Gecombineer de stam ­
oplossing met vitaminen — 10 000-voudig 0,1 0,1 
De gecombineerde stamoplossing met vitaminen wordt bereid door de volgende 
drie vitaminen als volgt aan 1 liter water toe te voegen: 
Thiaminehydrochloride 750 10 000-voudig 
Cyanocobalamine (B  12 ) 10 10 000-voudig 
Biotine 7,5 10 000-voudig  
De gecombineerde stamoplossing met vitaminen wordt in bevroren toestand in 
kleine porties bewaard. De vitaminen worden vlak vóór gebruik aan de media 
toegevoegd.  
NB: Om het neerslaan van zouten bij de bereiding van de volledige media te 
voorkomen worden de porties van de stamoplossingen toegevoegd aan ongeveer 500-800 ml gedeïoniseerd water en daarna aangevuld tot 1 liter.
 
NB: Zie voor de eerste publicatie over het M4-medium: Elendt, B.P. (1990). 
Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-33
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. ZOETWATERALGEN EN CYANOBACTERIËN: GROEIREM ­
MINGSTEST  
1. METHODE  
Deze methode komt overeen met OESO TG 201 (2006) (1).  
1.1. INLEIDING  
Testmethoden worden periodiek in het licht van de wetenschappe ­
lijke vorderingen getoetst en geactualiseerd. Testmethode C.3 moest worden herzien om er andere soorten in op te nemen en om te 
voldoen aan de eisen inzake vaststelling van de gevaren en indeling 
van chemische stoffen. De herziening is uitgevoerd op basis van uitgebreide praktische ervaring, vorderingen van de wetenschap op het gebied van toxiciteitsonderzoek bij algen en uitgebreid gebruik in 
het kader van regelgeving sinds de oorspronkelijke vaststelling.
 
1.2. DEFINITIES  
In de context van deze methode worden de volgende definities en 
afkortingen gebruikt:  
Biomassa : het drooggewicht van het levende materiaal in een popu ­
latie per volume-eenheid, bv. mg algen/liter testoplossing. Meestal wordt „biomassa” als massa gedefinieerd, maar in de context van deze test wordt de eenheid massa per volume gebruikt. Bovendien 
wordt de biomassa bij deze test meestal gemeten in vervangende 
eenheden, zoals aantal cellen of fluorescentie, en ook deze eenheden kunnen bij gebruik van de term „biomassa” worden bedoeld.
 
EC x : de concentratie van de in het testmedium opgeloste teststof die 
binnen een bepaalde blootstellingsperiode (die expliciet moet worden vermeld als deze afwijkt van de volledige of normale duur van de 
test) leidt tot een afname van de groei van het testorganisme met x% 
(bv. 50 %). Om ondubbelzinnig aan te geven of een EC-waarde gebaseerd is op de groeisnelheid of de opbrengst, worden respectie ­
velijk de symbolen „E
 s C” en „E  o C” gebruikt.  
Groeimedium : het volledige synthetische cultuurmedium waarin de 
algen gedurende de blootstelling aan de teststof groeien. De teststof 
wordt normaal gesproken in het medium opgelost.  
Groeisnelheid (gemiddelde specifieke groeisnelheid) : de logarit ­
mische toename van de biomassa gedurende de blootstellingsperiode.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste geteste 
concentratie waarbij wordt waargenomen dat de stof binnen een 
bepaalde blootstellingstijd in vergelijking met de controle tot een statistisch significante afname van de groei (p < 0,05) leidt. Alle testconcentraties boven de LOEC moeten echter een schadelijk effect 
hebben dat ten minste gelijk is aan het bij de LOEC waargenomen 
effect. Wanneer niet aan deze twee voorwaarden kan worden vol ­
daan, moet een volledige toelichting worden gegeven op de wijze waarop de LOEC (en dus de NOEC) is bepaald.
 
NOEC (No Observed Effect Concentration) : de testconcentratie 
die direct onder de LOEC ligt.  
Opbrengst : de waarde van een meetvariabele aan het eind van de 
blootstellingstijd, verminderd met de waarde van de meetvariabele 
aan het begin van de blootstellingstijd, waarmee de toename van de biomassa gedurende de test wordt uitgedrukt.
 
Responsvariabele : een variabele voor de bepaling van de toxiciteit, 
met uiteenlopende berekeningsmethoden afgeleid van de gemeten parameters voor de biomassa. Voor deze testmethode worden de responsvariabelen groeisnelheid en opbrengst afgeleid van de direct 
gemeten biomassa of een van de vermelde vervangende eenheden.
 
Specifieke groeisnelheid : een responsvariabele die wordt gedefini ­
eerd als het quotiënt van het verschil tussen de natuurlijke logaritmen 
van een observatie-parameter (in deze testmethode de biomassa) en 
de betrokken tijdsduur.  
Variatiecoëfficiënt : een dimensieloze maat voor de variabiliteit van een 
parameter, gedefinieerd als het quotiënt van standaardafwijking en ge ­
middelde. Dit quotiënt kan ook als percentage worden uitgedrukt. De 
gemiddelde variatiecoëfficiënt van de gemiddelde specifieke groeisnel ­
heid in controle-duplo's moet als volgt worden berekend:  
1. bereken de procentuele variatiecoëfficiënt van de gemiddelde spe ­
cifieke groeisnelheid uit de dagelijkse/partiële groeisnelheid in de verschillende duplo's;
 
2. bereken de gemiddelde waarde van alle onder punt 1 berekende 
waarden; dit levert de gemiddelde variatiecoëfficiënt van de dagelijkse/partiële specifieke groeisnelheid in controle-duplo's.
 
1.3. TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
Deze testmethode kan het gemakkelijkst worden toegepast op stoffen 
die oplosbaar zijn in water en waarvan kan worden verwacht dat ze 
onder de testomstandigheden in oplossing blijven. Voor het testen van stoffen die vluchtig zijn, sterk adsorberen, gekleurd zijn, slecht oplosbaar zijn in water of nadelige gevolgen kunnen hebben voor de 
beschikbaarheid van nutriënten of mineralen in het testmedium, kan 
het nodig zijn de beschreven procedure op bepaalde punten aan te passen (bv. een gesloten systeem of conditionering van de testvaten). In de referenties (2), (3) en (4) wordt een leidraad gegeven voor 
enkele geschikte aanpassingen.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TEST  
Met deze test wordt getracht de effecten van een stof op de groei van 
zoetwater-microalgen en/of cyanobacteriën te bepalen. Exponentieel 
groeiende testorganismen worden gedurende normaal gesproken 
72 uur in batchculturen aan de teststof blootgesteld. Ondanks de betrekkelijk korte duur van de test kunnen de effecten over verschil ­
lende generaties worden bepaald.
 
De respons van het systeem is de afname van de groei in een reeks 
algenculturen (testeenheden) die aan verschillende concentraties van een teststof worden blootgesteld. De respons wordt bepaald als functie van de blootstellingsconcentratie in vergelijking met de gemiddelde 
groei van een duploreeks van niet-blootgestelde controleculturen. Met 
het oog op een volledige expressie van de respons van het systeem op toxische effecten (optimale gevoeligheid) krijgen de culturen de gele ­
genheid om met voldoende nutriënten en continu licht onbeperkt expo ­
nentieel te groeien gedurende een periode die lang genoeg is om de 
afname van de specifieke groeisnelheid te kunnen meten.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
De groei en de remming van de groei worden kwantitatief bepaald 
door de biomassa van de algen als functie van de tijd te meten. De 
biomassa van de algen wordt gedefinieerd als het drooggewicht per volume-eenheid, bv. mg algen/liter testoplossing. Het drooggewicht is echter moeilijk te bepalen en daarom worden vaak vervangende 
parameters gebruikt. Telling van de cellen is de meest gangbare van 
deze parameters. Andere mogelijkheden zijn celvolume, fluorescen ­
tie, optische dichtheid enz. Er moeten omrekeningsfactoren bekend zijn tussen de gemeten vervangende parameter en de biomassa.
 
Het eindpunt van de test is groeiremming, uitgedrukt als de logarit ­
mische toename van de biomassa (gemiddelde specifieke groeisnel ­
heid) gedurende de blootstellingsperiode. Op basis van de gemid ­
delde specifieke groeisnelheden die in een reeks testoplossingen wor ­
den geregistreerd, wordt de concentratie bepaald die een specifiek percentage remming van de groeisnelheid (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de E
 s C x (bv. E  s C 50 ). 
Voor de toepassing van deze methode binnen het EU-regelgevings ­
kader moet de berekening van de resultaten om de onder punt 2.2 beschreven redenen worden gebaseerd op een gemiddelde specifieke 
groeisnelheid. Bij deze testmethode wordt ook de opbrengst als res ­
ponsvariabele gebruikt; deze kan in bepaalde landen nodig zijn om aan specifieke voorschriften in de regelgeving te voldoen. Deze wordt gedefinieerd als de biomassa aan het eind van de blootstel ­
lingsperiode verminderd met de biomassa aan het begin van de 
blootstellingsperiode. Op basis van de opbrengst die in een reeks testoplossingen wordt geregistreerd, wordt de concentratie bepaald die een specifiek percentage afname van de opbrengst (bv. 50 %) 
veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de E
 o C x (bv. E  o C 50 ). 
Daarnaast kunnen langs statistische weg de laagste concentratie met 
waargenomen effecten (LOEC) en de concentratie zonder waargeno ­
men effecten (NOEC) worden bepaald.  
1.5. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
De informatie over de teststof, die nuttig kan zijn om de testoms ­
tandigheden te bepalen, omvat bijvoorbeeld de structuurformule, de 
zuiverheid, de stabiliteit in licht, de stabiliteit onder de testomstan ­
digheden, de absorptie van licht, de pK  a en de resultaten van onder ­
zoek naar de omzetting van de stof, waaronder de biologische af ­
breekbaarheid in water.  
De oplosbaarheid in water, de verdelingscoëfficiënt octanol/water 
(P ow ) en de dampspanning van de teststof moeten bekend zijn en 
er moet een gevalideerde methode beschikbaar zijn voor de kwanti ­
tatieve bepaling van de stof in de testoplossingen met een gerappor ­
teerde recovery en detectiegrens.  
1.6. REFERENTIESTOF  
Er kunnen een of meer referentiestoffen worden getest, zoals 3,5- 
dichloorfenol dat bij de internationale rondzendproef is gebruikt (4), om de testprocedure te controleren. Kaliumdichromaat kan ook als referentiestof voor groene algen worden gebruikt. Het is wenselijk 
ten minste twee keer per jaar een referentiestof te testen.
 
1.7. GELDIGHEID VAN DE TEST  
Voor een geldige test moet aan de volgende criteria worden voldaan:  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— De biomassa in de controleculturen moet binnen de testperiode 
van 72 uur exponentieel met ten minste een factor 16 zijn toe ­
genomen. Dit komt overeen met een specifieke groeisnelheid van 0,92 dag
 –1 . Voor de meest gebruikte soorten is de groeisnelheid 
meestal aanzienlijk hoger (zie aanhangsel 1). Wanneer soorten 
worden gebruikt die trager groeien dan de in aanhangsel 1 ver ­
melde soorten, wordt wellicht niet aan dit criterium voldaan. In dat geval moet de testperiode worden verlengd, zodat in de con ­
troleculturen een groei met ten minste een factor 16 wordt ver ­
kregen, terwijl de groei gedurende de hele testperiode exponen ­
tieel moet zijn. De testperiode kan worden ingekort, maar moet ten minste 48 uur zijn, om gedurende de test een exponentiële groei te houden, zolang de vermenigvuldigingsfactor minimaal 
16 is.
 
— De gemiddelde variatiecoëfficiënt voor partiële specifieke groei ­
snelheden (voor tests van 72 uur dagen 0-1, 1-2 en 2-3) in de 
controleculturen (zie punt 1.2 onder „variatiecoëfficiënt”) mag niet hoger zijn dan 35 %. Zie de tweede alinea van punt 2.2.1 voor de berekening van de partiële specifieke groeisnelheid. Dit 
criterium geldt voor de gemiddelde waarde van variatiecoëffi ­
ciënten die voor duplo-controleculturen worden berekend.
 
— De variatiecoëfficiënt van gemiddelde specifieke groeisnelheden 
gedurende de hele testperiode in duplo-controleculturen mag bij tests met  Pseudokirchneriella subcapitata  en Desmodesmus sub ­
spicatus  niet hoger zijn dan 7 %. Voor andere minder vaak 
gebruikte soorten mag deze waarde niet hoger zijn dan 10 %.
 
1.8. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.8.1.  Apparatuur  
De testvaten en andere apparatuur die in aanraking komt met de 
testoplossingen, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal gemaakt zijn. Alle voorwerpen moeten grondig wor ­
den gewassen om ervoor te zorgen dat er geen organische of anorga ­
nische verontreinigingen zijn die invloed kunnen hebben op de groei van de algen of de samenstelling van de testoplossingen.
 
Als testvat zullen normaal gesproken glazen kolven worden gebruikt 
die zo groot zijn dat het volume van de cultuur groot genoeg is voor metingen tijdens de test en een afdoende massaoverdracht van CO
 2 
uit de lucht mogelijk is (zie de tweede alinea van punt 1.8.9). Let op 
dat het volume van de vloeistof groot genoeg moet zijn voor de analyses (zie de vijfde alinea van punt 1.8.11).
 
Daarnaast zal (een deel van) de volgende apparatuur nodig zijn:  
— Kweekapparatuur: aanbevolen wordt een kast of kamer waarin de 
gekozen incubatietemperatuur tot op ± 2 °C nauwkeurig kan worden gehouden.
 
— Instrumenten voor lichtmeting: er moet rekening mee worden 
gehouden dat de meetmethode voor de lichtintensiteit en met 
name de aard van de receptor (collector) de gemeten waarde 
beïnvloedt. De metingen moeten bij voorkeur worden uitgevoerd met een sferische (4 π)-receptor (die reageert op direct en gere ­
flecteerd licht uit alle hoeken boven en onder het meetvlak) of 
een 2π-receptor (die reageert op licht uit alle hoeken boven het 
meetvlak).
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Apparatuur om de biomassa van de algen te bepalen. De meest 
gebruikte vervangende parameter voor de biomassa van de algen 
is telling van de cellen en dit kan gebeuren met een elektronische deeltjesteller, een microscoop met een telkamer of een flow-cy ­
tometer. Andere vervangende biomassa-parameters kunnen wor ­
den gemeten met een flow-cytometer, een fluorimeter, een spec ­
trofotometer of een colorimeter. Er moet een omrekeningsfactor worden berekend voor het verband tussen celtelling en droogge ­
wicht. Om bij gebruik van een spectrofotometer bij lage biomas ­
sa-concentraties bruikbare metingen uit te kunnen voeren kan het 
nodig zijn cuvetten te gebruiken met een optische weglengte van ten minste 4 cm.
 
1.8.2.  Testorganismen  
Er kunnen verschillende soorten los groeiende microalgen en cyano ­
bacteriën worden gebruikt. Van de in aanhangsel 1 vermelde stam ­
men is aangetoond dat ze geschikt zijn voor de in deze testmethode 
beschreven testprocedure.  
Als andere soorten worden gebruikt, moeten de stam en/of de her ­
komst worden vermeld. Er moet worden bevestigd dat de gekozen algen onder de gebruikte omstandigheden gedurende de hele test ­
periode exponentieel kunnen blijven groeien.
 
1.8.3.  Groeimedium  
Er worden twee groeimedia aanbevolen: het OESO-medium en het 
AAP-medium. De samenstelling van deze media wordt in aanhangsel 2 vermeld. Let op dat de aanvankelijke pH-waarde en de buffercapaciteit (die de pH-stijging reguleert) voor deze media 
verschillen. Dit betekent dat de resultaten van de tests afhankelijk 
van het gebruikte medium kunnen verschillen, vooral wanneer iono ­
gene stoffen worden getest.
 
In bepaalde gevallen kan het nodig zijn de groeimedia te wijzigen, 
bijvoorbeeld wanneer metalen en chelaatvormers worden getest of 
wanneer bij andere pH-waarden wordt getest. Wanneer een gewij ­
zigd medium wordt gebruikt, moet dit gedetailleerd worden beschre ­
ven en moet een motivering worden gegeven (3)(4).  
1.8.4.  Aanvankelijke biomassa-concentratie  
De aanvankelijke hoeveelheid biomassa moet in alle testculturen 
even groot zijn en klein genoeg om zonder risico op een tekort 
aan nutriënten exponentiële groei in de hele incubatieperiode moge ­
lijk te maken. De aanvankelijke hoeveelheid biomassa mag niet groter zijn dan 0,5 mg/l als drooggewicht. De volgende aanvan ­
kelijke celconcentraties worden aanbevolen:  
Pseudokirchneriella subcapitata:  5 × 10
 3 -10 4 cellen/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 × 10  3 cellen/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 cellen/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 cellen/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 -10 5 cellen/ml  
1.8.5.  Concentraties van de teststof  
Op basis van de resultaten van een oriënterende test kan het con ­
centratiebereik worden bepaald waar effecten te verwachten zijn. 
Voor de definitieve tests moeten ten minste vijf concentraties worden 
gekozen die een meetkundige reeks vormen met een rede van ten hoogste 3,2. Voor teststoffen met een vlakke concentratie/ ­
responscurve moet wellicht een hogere rede worden gekozen. De 
concentratiereeks moet bij voorkeur het interval bestrijken waar 5- 
75 % remming van de groeisnelheid optreedt.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Duplo's en controles  
Elke testconcentratie moet in triplo worden getest. Als bepaling van 
de NOEC niet nodig is, mag het aantal concentraties worden ver ­
hoogd en het aantal duplo's per concentratie worden verlaagd. De 
controlebepaling moet ten minste in triplo worden uitgevoerd en het 
aantal controles moet liefst twee keer zo groot zijn als het aantal duplo's dat voor elke testconcentratie wordt gebruikt.
 
Voor de analyse van de teststof-concentraties kan een aparte reeks 
testoplossingen worden bereid (zie de vierde en de zesde alinea van 
punt 1.8.11).  
Wanneer een oplosmiddel wordt gebruikt om de teststof in oplossing 
te brengen, moeten in de testopzet extra controles worden opge ­
nomen met dezelfde concentratie oplosmiddel als in de testculturen.  
1.8.7.  Bereiding van de entcultuur  
Om de algen aan de testomstandigheden te laten wennen en ervoor te 
zorgen dat ze in de exponentiële groeifase zijn wanneer ze voor het beënten van de testoplossingen worden gebruikt, wordt 2-4 dagen vóór het begin van de tests een entcultuur in het testmedium ge ­
maakt. De hoeveelheid biomassa van de algen moet zo groot zijn dat 
exponentiële groei in de entcultuur tot het begin van de test mogelijk is. De entcultuur moet onder dezelfde omstandigheden worden geïn ­
cubeerd als de testculturen. Meet de toename van de biomassa in de 
entcultuur om na te gaan of de groei onder de kweekomstandigheden 
binnen het normale bereik voor de teststam ligt. In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld van de procedure voor het kweken van algen beschreven. Om synchrone celdelingen tijdens de test te voorkomen 
van een tweede voortplantingsstap van de entcultuur nodig zijn.
 
1.8.8.  Bereiding van de testoplossingen  
Alle testoplossingen moeten dezelfde concentratie groeimedium en 
dezelfde aanvankelijke hoeveelheid biomassa algen bevatten. De tes ­
toplossingen met de gekozen concentraties worden meestal bereid door een stamoplossing van de teststof met groeimedium en entcul ­
tuur te mengen. Stamoplossingen worden normaal gesproken bereid 
door de stof in testmedium op te lossen.
 
Om slecht in water oplosbare stoffen in het testmedium op te nemen 
kunnen oplosmiddelen zoals aceton, t-butylalcohol en dimethylfor ­
mamide als drager worden gebruikt (2)(3). De oplosmiddelconcen ­
tratie mag niet hoger zijn dan 100 μl/l en alle culturen (met inbegrip 
van de controles) in de testreeks moet dezelfde concentratie oplos ­
middel worden toegevoegd.  
1.8.9.  Incubatie  
De testvaten worden afgesloten met een lucht doorlatende stop. Ze 
worden geschud en in het kweekapparaat gezet. Tijdens de tests 
moeten de algen in suspensie worden gehouden en moet de over ­
dracht van CO  2 worden vergemakkelijkt. Daartoe moet voortdurend 
worden geschud of geroerd. De culturen moeten op een temperatuur 
tussen 21 °C en 24 °C worden gehouden, gereguleerd tot op ± 2 °C 
nauwkeurig. Voor andere soorten dan in aanhangsel 1 worden ver ­
meld, bijvoorbeeld tropische soorten, zijn hogere temperaturen wel ­
licht geschikt, mits aan de geldigheidscriteria kan worden voldaan. 
Er wordt aanbevolen de kolven een willekeurige plaats te geven en 
hun plaats in de incubator elke dag te veranderen.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
De pH van het controlemedium mag gedurende de test niet meer dan 
1,5 eenheden stijgen. Voor metalen en verbindingen die bij een pH 
in de buurt van de pH tijdens de test gedeeltelijk ioniseren, kan het nodig zijn de pH-verschuiving te beperken om reproduceerbare en goed gedefinieerde resultaten te verkrijgen. Een verschuiving van 
minder dan 0,5 pH-eenheid is technisch haalbaar en kan worden 
bereikt door te zorgen voor een afdoende massaoverdracht van CO
 2 vanuit de omgevingslucht naar de testoplossing, bijvoorbeeld 
door de schudsnelheid op te voeren. Het is ook mogelijk de behoefte 
aan CO  2 te verminderen door de aanvankelijke hoeveelheid biomassa 
of de duur van de test te verlagen.  
Het oppervlak waar de culturen worden geïncubeerd, moet continu 
worden verlicht met uniform fluorescerend licht, bijvoorbeeld van 
het type „cool white” of „daglicht”. De lichtvereisten zijn niet voor alle stammen algen en cyanobacteriën gelijk. De lichtintensi ­
teit moet zodanig worden gekozen dat deze geschikt is voor het 
gebruikte testorganisme. Voor de aanbevolen soorten groene algen 
moet de lichtintensiteit ter hoogte van de testoplossingen binnen het bereik 60-120 μE·m
 –2 ·s –1 liggen, wanneer deze met een ge ­
schikte receptor wordt gemeten binnen het voor fotosynthese ef ­
fectieve golflengtebereik van 400-700 nm. Sommige soorten, met 
name  Anabaena flos-aquae , groeien goed bij een lage lichtintensi ­
teit en kunnen bij een hoge intensiteit worden beschadigd. Voor deze soorten moet een gemiddelde lichtintensiteit binnen het bereik 
40-60 μE·m
 –2 ·s –1 worden gekozen. (Voor lichtmeetinstrumenten 
die in lux gekalibreerd zijn, komt een bereik van 4 440-8 880 lux voor „cool white” licht ongeveer overeen met de aanbevolen 
lichtintensiteit 60-120 μE·m
 –2 ·s –1 ). De lichtintensiteit mag niet 
meer dan ± 15 % afwijken van de over het incubatieoppervlak gemiddelde lichtintensiteit.
 
1.8.10.  Duur van de test  
De test duurt normaal gesproken 72 uur. De duur van de tests mag 
echter ook korter of langer zijn, mits aan alle geldigheidscriteria van punt 1.7 kan worden voldaan.
 
1.8.11.  Metingen en analyses  
De biomassa van de algen wordt in elke kolf gedurende de test ­
periode ten minste één keer per dag bepaald. Als de metingen wor ­
den uitgevoerd bij kleine volumes die met een pipet uit de testop ­
lossing worden gehaald, mogen deze niet worden vervangen.  
Meting van de biomassa gebeurt door handmatige celtelling met een 
microscoop of met een elektronische deeltjesteller (door telling van cellen en/of biovolume). Ook andere technieken kunnen worden ge ­
bruikt, zoals flow-cytometrie, in vitro of in vivo chlorofyl-fluores ­
centie (6)(7) of optische dichtheid, mits voor de hoeveelheden die bij de test worden gevonden een bevredigende correlatie met de bio ­
massa kan worden aangetoond.
 
De pH van de oplossingen wordt aan het begin en aan het eind van 
de test gemeten.  
Mits een analyseprocedure voor de bepaling van de teststof op het 
gebruikte concentratiebereik beschikbaar is, moeten de testoplossin ­
gen worden geanalyseerd om de aanvankelijke concentratie en het 
behoud van de concentratie bij de blootstelling tijdens de test te 
controleren.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Wanneer het waarschijnlijk is dat de blootstellingsconcentraties ge ­
durende de test minder dan 20 % van de nominale waarden zullen 
afwijken, kan een analyse van de concentratie van de teststof aan het begin en het eind van de test bij een lage en een hoge testconcen ­
tratie en een concentratie rond de verwachte EC
 50 voldoende zijn. 
Wanneer het onwaarschijnlijk is dat de concentraties binnen 80- 
120 % van de nominale waarde blijven, wordt een analyse van alle testconcentraties aan het begin en het eind van de test aanbe ­
volen. Bij vluchtige, instabiele of sterk adsorberende teststoffen 
wordt daarnaast aanbevolen gedurende de blootstellingsperiode om 
de 24 uur een monster te analyseren om beter te kunnen bepalen hoeveel teststof verloren gaat. Voor deze stoffen zullen er extra duplo's nodig zijn. In alle gevallen behoeft de concentratie van de 
teststof slechts bij één duplo van elke testconcentratie te worden 
bepaald (of bij de gecombineerde inhoud van de duplo-testvaten).
 
De specifiek voor de analyse van de blootstellingsconcentraties ge ­
durende de test bereide testmedia moeten net zo worden behandeld 
als die welke voor de test worden gebruikt, d.w.z. ze moeten met 
algen worden beënt en onder identieke omstandigheden worden geïn ­
cubeerd. Als de concentratie van de opgeloste teststof moet worden 
bepaald, kan het nodig zijn de algen van het medium te scheiden. De 
scheiding moet bij voorkeur gebeuren door centrifugeren met een laag toerental dat voldoende is om de algen te laten bezinken.
 
Als kan worden aangetoond dat de concentratie van de geteste stof 
de gehele test op afdoende wijze binnen ± 20 % van de nominale of 
gemeten aanvankelijke concentratie is gebleven, kan de analyse van de resultaten op basis van de nominale of gemeten aanvankelijke waarden worden uitgevoerd. Als de afwijking van de nominale of 
gemeten aanvankelijke concentratie groter is dan ± 20 %, moet de 
analyse van de resultaten worden uitgevoerd op basis van het meet ­
kundige gemiddelde van de concentratie gedurende de blootstelling of op basis van modellen waarmee de afname van de concentratie 
van de teststof wordt beschreven (3)(8).
 
De groeiremmingstest met algen is een dynamischer testsysteem dan 
de meeste andere tests op aquatische toxiciteit op korte termijn. Dit 
betekent dat de feitelijke blootstellingsconcentraties moeilijk te be ­
palen kunnen zijn, vooral voor adsorberende stoffen die bij lage concentraties worden getest. In die gevallen betekent het verdwijnen van de stof uit de oplossing door adsorptie aan de toenemende bio ­
massa van de algen niet dat deze uit het testsysteem verloren gaat. 
Wanneer het resultaat van de test wordt geanalyseerd, moet worden gecontroleerd of een daling van de concentratie van de teststof in de loop van de test gevolgd wordt door een daling van de groeirem ­
ming. Als dit het geval is, kan worden overwogen een geschikt 
model te gebruiken om de daling van de concentratie van de teststof te beschrijven (8). Als dit niet het geval is, zal het wellicht correct zijn om de analyse van de resultaten op basis van de aanvankelijke 
(nominale of gemeten) concentraties uit te voeren.
 
1.8.12.  Andere observaties  
Er moet een microscopische observatie worden uitgevoerd om na te 
gaan of de entcultuur een normaal en gezond uiterlijk heeft en om een eventueel abnormaal uiterlijk van de algen (wellicht veroorzaakt 
door de blootstelling aan de teststof) aan het eind van de test te 
detecteren.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Limiettest  
Onder bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld wanneer een oriënte ­
rende test erop wijst dat de teststof bij concentraties tot 100 mg·l  –1 
of tot de oplosbaarheidsgrens in het testmedium (als deze lager ligt) 
geen toxische effecten heeft, kan een limiettest worden uitgevoerd, 
waarbij de respons in een controlegroep en één dosisgroep (100 mg·l
 –1 of een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheids ­
grens) wordt vergeleken. Er wordt sterk aanbevolen dit te onder ­
steunen met een analyse van de blootstellingsconcentratie. Alle in 
het voorgaande beschreven testomstandigheden en geldigheidscriteria zijn ook van toepassing bij een limiettest, behalve de bepaling dat 
het aantal behandelde duplo's ten minste zes moet zijn. De respons ­
variabelen in de controlegroep en de dosisgroep kunnen worden geanalyseerd met behulp van een statistische toets om gemiddelden te vergelijken, bijvoorbeeld een t-toets van Student. Als de variantie 
in de twee groepen niet gelijk is, moet er een aangepaste t-toets voor 
ongelijke varianties worden uitgevoerd.
 
1.8.14.  Wijziging voor sterk gekleurde stoffen  
De bestraling (lichtintensiteit) moet in het hoogste segment van het 
in deze testmethode voorgeschreven bereik liggen: 120 μE m-2 s-1 of 
hoger.  
Het lichtpad moet worden verkort door het volume van de testop ­
lossingen te verlagen (in het interval 5-25 ml).  
Er moet voldoende worden geschud (bijvoorbeeld matig schudden) 
om een hoge blootstellingsfrequentie van de algen aan hoge bestra ­
ling aan het oppervlak van de cultuur te verkrijgen.  
2. GEGEVENS  
2.1. UITZETTING VAN DE GROEICURVES  
De biomassa in de testvaten kan worden uitgedrukt in eenheden van 
de voor de meting gebruikte vervangende parameter (bv. aantal cel ­
len of fluorescentie).  
Maak een tabel met de bepaalde biomassa-concentratie in de test ­
culturen en de controles en daarnaast de concentraties teststof en de meettijdstippen met een resolutie van ten minste hele uren om zo de groeicurves uit te kunnen zetten. Bij deze eerste stap kan zowel een 
logaritmische schaal als een lineaire schaal nuttig zijn, maar een 
logaritmische schaal is verplicht en levert meestal een betere presen ­
tatie op van de variaties in het groeipatroon gedurende de testperi ­
ode. Wanneer de exponentiële groei met een logaritmische schaal 
wordt uitgezet, levert dit een rechte lijn op met als helling de spe ­
cifieke groeisnelheid.
 
Ga met behulp van de curves na of de controleculturen gedurende de 
hele test met de verwachte snelheid exponentieel groeien. Kijk met 
een kritisch oog naar alle datapunten en de vorm van de grafieken en 
controleer de ruwe gegevens en procedures op mogelijke fouten. Controleer vooral punten waarvan de afwijking op een systematische fout lijkt. Als duidelijk is dat er sprake is van fouten in de procedu ­
res en/of deze zeer waarschijnlijk zijn, moet het desbetreffende punt 
als uitbijter worden beschouwd en niet in de verdere statistische analyses worden opgenomen. (Een algenconcentratie van nul in een van de twee of drie duplo's kan erop wijzen dat het testvat 
niet correct beënt is of niet goed schoongemaakt was.) In het verslag 
moet duidelijk worden vermeld om welke redenen een bepaald punt als uitbijter is beschouwd. Alleen (zeldzame) fouten in de procedures worden als reden geaccepteerd en dit geldt niet voor alleen een 
slechte precisie. Statistische procedures om te bepalen wat een uit ­
bijter is, zijn voor een probleem van dit type maar beperkt bruikbaar en kunnen niet als vervanging voor een deskundig oordeel worden gebruikt. Uitbijters (als zodanig gemarkeerd) moeten bij voorkeur 
niet worden verwijderd uit later weergegeven grafieken of tabellen 
met gegevens.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. RESPONSVARIABELEN  
De test is bedoeld om de effecten van de teststof op de groei van 
algen te bepalen. In deze testmethode worden twee responsvariabelen beschreven, aangezien de lidstaten niet alle dezelfde voorkeuren en 
behoeften qua regelgeving hebben. De testresultaten zijn alleen in 
alle lidstaten aanvaardbaar als de effecten met beide onderstaande responsvariabelen a) en b) worden bepaald:
 
a) de gemiddelde specifieke groeisnelheid: deze responsvariabele 
wordt berekend op basis van de logaritmische toename van de 
biomassa gedurende de testperiode, uitgedrukt per dag;  
b) de opbrengst: dit is de biomassa aan het eind van de test ver ­
minderd met de biomassa aan het begin.  
Voor de toepassing van deze methode binnen het EU-regelgevings ­
kader moet de berekening van de resultaten om de hier beschreven 
redenen worden gebaseerd op een gemiddelde specifieke groeisnel ­
heid. Er moet worden opgemerkt dat de met behulp van deze twee responsvariabelen berekende waarden voor de toxiciteit niet ver ­
gelijkbaar zijn en bij gebruik van de resultaten van de test moet 
met dit verschil rekening worden gehouden. Vanwege de mathema ­
tische grondslagen van de respectieve benaderingen zullen de EC
 x - 
waarden op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheid (E  s C x ) 
in het algemeen hoger zijn dan de resultaten op basis van de op ­
brengst (E  o C x ) als de testomstandigheden van deze testmethode wor ­
den aangehouden. Dit moet niet worden geïnterpreteerd als een ver ­
schil in gevoeligheid tussen de twee responsvariabelen, maar alleen 
als een mathematisch verschil tussen de waarden. Het begrip gemid ­
delde specifieke groeisnelheid is gebaseerd op het algemene expo ­
nentiële groeipatroon van algen in niet-beperkte culturen, waarbij de toxiciteit wordt bepaald op basis van de effecten op de groeisnelheid, 
zonder dat deze afhankelijk is van het absolute niveau van de spe ­
cifieke groeisnelheid van de controle, van de helling van de concentratie/responscurve of van de duur van de test. De resultaten 
op basis van de responsvariabele opbrengst zijn daarentegen afhan ­
kelijk van al deze andere variabelen. De E
 o C x is afhankelijk van de 
specifieke groeisnelheid van de bij elke test gebruikte algensoort en van de maximale specifieke groeisnelheid die van soort tot soort en 
zelfs van stam tot stam kan verschillen. Deze responsvariabele moet 
niet worden gebruikt voor een vergelijking tussen algensoorten of zelfs verschillende stammen qua gevoeligheid voor toxische stoffen. De wetenschap geeft weliswaar de voorkeur aan het gebruik van de 
gemiddelde specifieke groeisnelheid om de toxiciteit te bepalen, 
maar in deze testmethode wordt ook de bepaling van de toxiciteit op basis van de opbrengst opgenomen om te voldoen aan de ver ­
eisten in de huidige regelgeving in bepaalde landen.
 
2.2.1.  Gemiddelde groeisnelheid  
De gemiddelde specifieke groeisnelheid voor een bepaalde periode 
wordt voor elk testvat (controle of behandeld) met de volgende ver ­
gelijking berekend als de logaritmische toename van de biomassa:  
μ i-j ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (dag  –1 ) 
Hierbij is:  
μ i-j de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip  i tot 
tijdstip  j; 
X i de biomassa op tijdstip  i; 
X j de biomassa op tijdstip  j. ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Voor elke dosisgroep en controlegroep wordt een gemiddelde waarde 
voor de groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie.  
Bereken de gemiddelde specifieke groeisnelheid over de hele duur 
van de test (normaal gesproken dagen 0-3) met de nominaal geënte biomassa als startwaarde en niet een gemeten startwaarde, omdat op deze manier meestal een grotere precisie wordt bereikt. Als de voor 
de meting van de biomassa gebruikte apparatuur een voldoende 
precieze bepaling van de geringe biomassa in het inoculum mogelijk maakt (bv. een flow-cytometer), kan de gemeten aanvankelijke con ­
centratie biomassa worden gebruikt. Bepaal tevens de partiële groei ­
snelheid, berekend als de specifieke groeisnelheden voor elke dag 
gedurende de test (dagen 0-1, 1-2 en 2-3) en ga na of de controle- groeisnelheid constant blijft (zie de geldigheidscriteria onder punt 1.7). Wanneer de specifieke groeisnelheid op dag 1 significant 
lager is dan de totale gemiddelde specifieke groeisnelheid, wijst dit 
op een lag-fase. Een lag-fase kan in controleculturen worden beperkt en vrijwel geëlimineerd door een juiste vermeerdering van de voor ­
cultuur, maar een lag-fase bij behandelde culturen kan wijzen op 
herstel na aanvankelijke toxische stress of een verminderde bloot ­
stelling door verlies van de teststof (bv. door sorptie aan de algen- biomassa) na de aanvankelijke blootstelling. Dit betekent dat de 
partiële groeisnelheid kan worden bepaald om de effecten van de 
teststof gedurende de blootstellingsperiode te evalueren. Aanzienlijke verschillen tussen de partiële groeisnelheid en de gemiddelde groei ­
snelheid wijzen erop dat de groei niet voortdurend exponentieel is en 
dat de groeicurves grondig moeten worden bestudeerd.
 
De procentuele remming van de groeisnelheid wordt voor elke be ­
handelde duplo berekend met de volgende vergelijking:  
%I s ¼ μ C – μ D 
μ C Ü 100  
Hierbij is:  
%I s procentuele remming van de gemiddelde specifieke groeisnel ­
heid;  
μ C gemiddelde waarde van de gemiddelde specifieke groeisnel ­
heid (μ) in de controlegroep;  
μ D gemiddelde specifieke groeisnelheid in de dosisgroep.  
Wanneer oplosmiddelen worden gebruikt om de teststof in oplossing 
te brengen, moeten bij de berekening van de procentuele remming niet de controles zonder oplosmiddel maar de oplosmiddelcontroles worden gebruikt.
 
2.2.2.  Opbrengst  
De opbrengst wordt voor elk testvat van de dosis- en controlegroe ­
pen berekend als de biomassa aan het eind van de test verminderd 
met de biomassa aan het begin. Voor elke testconcentratie en con ­
trole wordt een gemiddelde waarde voor de opbrengst berekend en een waarde voor de variantie. De procentuele remming van de op ­
brengst (%I
 o ) kan voor elke behandelde duplo als volgt worden 
berekend:  
%I o ¼ ðO C – O D Þ 
O C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
Hierbij is:  
% I  o procentuele remming van de opbrengst;  
O C gemiddelde waarde van de opbrengst in de controlegroep;  
O D waarde voor de opbrengst in de dosisgroep.  
2.3. UITZETTING VAN DE CONCENTRATIE/RESPONSCURVE  
De procentuele remming wordt uitgezet tegen de logaritme van de 
concentratie van de teststof en de curve wordt zorgvuldig bestudeerd, waarbij elk punt dat in de eerste fase als uitbijter is beschouwd, niet wordt gebruikt. Trek op het oog of met behulp van computer-inter ­
polatie een vloeiende lijn door de punten om een eerste indruk te 
krijgen van het verband tussen concentratie en respons en gebruik daarna een gedetailleerdere methode, bij voorkeur een gecomputeri ­
seerde statistische methode. Afhankelijk van het beoogde gebruik 
van de gegevens, de kwaliteit (precisie) van de gegevens en de 
hoeveelheid gegevens alsmede de beschikbaarheid van instrumenten voor gegevensanalyse kan worden besloten (soms volledig terecht) de gegevensanalyse in deze fase te beëindigen en de kerncijfers EC
 50 
en EC  10 (en/of EC  20 ) simpelweg uit de op het oog getrokken curve 
af te lezen (zie ook de onderstaande tekst over stimulerende effec ­
ten). Geldige redenen om niet gebruik te maken van een statistische 
methode kunnen bijvoorbeeld zijn:  
— de gegevens zijn niet geschikt voor gecomputeriseerde methoden 
om betrouwbaarder resultaten te verkrijgen dan op grond van een 
deskundig oordeel mogelijk is — in dergelijke situaties is het mogelijk dat sommige computerprogramma's zelfs geen betrouw ­
bare oplossing opleveren (iteraties die wellicht niet convergeren 
enz.);
 
— een respons waarbij de groei wordt gestimuleerd, kan met de 
beschikbare computerprogramma's niet afdoende worden ver ­
werkt (zie hieronder).  
2.4. STATISTISCHE PROCEDURES  
Het is de bedoeling met behulp van regressieanalyse een kwantitatief 
verband tussen concentratie en respons te verkrijgen. Het is mogelijk een gewogen lineaire regressie te gebruiken nadat op de respons ­
gegevens een linearisering-transformatie is uitgevoerd, bijvoorbeeld 
naar probit-, logit- of Weibull-eenheden (9), maar de voorkeur wordt 
gegeven aan niet-lineaire regressieprocedures, die beter omgaan met onvermijdelijke onregelmatigheden in gegevens en afwijkingen van regelmatige distributies. In de buurt van het nulpunt of totale rem ­
ming kunnen dergelijke onregelmatigheden door de transformatie 
worden uitvergroot en kunnen ze de analyse storen (9). Er moet worden opgemerkt dat standaardmethoden voor analyses met behulp van probit-, logit- of Weibull-transformaties bedoeld zijn voor ge ­
bruik bij een binaire respons (bv. sterfte of overleven) en moeten 
worden aangepast om voor groei- of biomassa-data te kunnen wor ­
den gebruikt. Specifieke procedures voor de bepaling van EC
 x -waar­
den uit continue gegevens zijn te vinden in (10), (11) en (12). Het 
gebruik van niet-lineaire regressieanalyse wordt in aanhangsel 4 na ­
der beschreven.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Voor elke te analyseren responsvariabele wordt het verband tussen 
concentratie en respons gebruikt voor de berekening van puntschat ­
tingen van EC  x -waarden. Waar mogelijk moeten voor elke schatting 
de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden bepaald. De kwaliteit van de fitting van de responsgegevens op het regressiemodel moet gra ­
fisch of statistisch worden bepaald. De regressieanalyse moet met de 
individuele duplo-respons worden uitgevoerd en niet met gemiddel ­
den van dosisgroepen. Als niet-lineaire fitting van de curve echter moeilijk is of niet lukt vanwege een te grote spreiding in de gege ­
vens, kan het probleem worden omzeild door de regressie uit te 
voeren op groepsgemiddelden om zo op praktische wijze de invloed van vermoedelijke uitbijters te beperken. Wanneer deze mogelijkheid wordt gebruikt, moet dit in het testverslag worden vermeld als een 
afwijking van de normale procedure, omdat fitting van de curve met 
individuele duplo's geen goede resultaten opleverde.
 
Als de beschikbare regressiemodellen/methoden niet geschikt zijn 
voor de gegevens, kunnen de EC  50 en de betrouwbaarheidsgrenzen 
ook worden bepaald met behulp van lineaire interpolatie met boot ­
strapping (13).  
Voor de bepaling van de LOEC en daaruit de NOEC en voor de 
effecten van de teststof op de groeisnelheid moeten de gemiddelden 
van de dosisgroepen worden vergeleken met behulp van variantie ­
analyse-technieken (ANOVA). Het gemiddelde voor elke concentra ­
tie moet dan worden vergeleken met het gemiddelde van de contro ­
legroep met behulp van een geschikte methode voor meervoudige 
vergelijking of trendtoets. Hiervoor kan de Dunnett- of Williams- 
toets geschikt zijn (14)(15)(16)(17)(18). Er moet worden bepaald of de ANOVA-aanname van homogeniteit van variantie opgaat. Deze bepaling kan grafisch worden uitgevoerd of met een formele 
toets (18). Hiervoor kan de Levene- of Bartlett-toets worden ge ­
bruikt. Wanneer de aanname van homogeniteit van variantie niet opgaat, kan dit soms worden gecorrigeerd door logaritmische trans ­
formatie van de gegevens. Als de heterogeniteit van variantie ex ­
treem is en niet door transformatie kan worden gecorrigeerd, moet 
een analyse met methoden als de stap-omlaag-trendtoets van Jonck ­
heere worden overwogen. Aanvullende richtsnoeren voor de bepaling van de NOEC zijn te vinden in (12).
 
Recente wetenschappelijke ontwikkelingen hebben geleid tot een 
aanbeveling om het begrip NOEC niet langer te gebruiken en te vervangen door op regressie gebaseerde puntschattingen van EC
 x . 
Voor deze algentest is geen geschikte waarde voor x vastgesteld. 
Een interval van 10 tot 20 % lijkt geschikt (afhankelijk van de 
gekozen responsvariabele) en bij voorkeur moeten zowel de EC  10 
als de EC  20 worden gerapporteerd.  
2.5. GROEISTIMULERING  
Soms wordt bij lage concentraties groeistimulering (negatieve rem ­
ming) waargenomen. Dit kan een gevolg zijn van hormese („toxische 
stimulering”) of van de toevoeging van stimulerende groeifactoren 
met het testmateriaal aan het gebruikte minimale medium. De toe ­
voeging van anorganische nutriënten zou geen directe effecten mo ­
gen hebben, omdat het testmedium gedurende de hele test een over ­
schot aan nutriënten zou moeten bevatten. Stimulering bij lage dosis 
kan bij EC  50 -berekeningen meestal worden genegeerd, tenzij deze 
stimulering extreem is. Als de stimulering extreem is of als een EC
 x -waarde voor een lage x moet worden berekend, kunnen echter 
speciale procedures nodig zijn. Schrapping van een respons met 
stimulering uit de gegevensanalyse moet indien mogelijk worden vermeden en als de beschikbare software voor fitting van de curve een lichte stimulering niet accepteert, kan lineaire interpolatie met 
bootstrapping worden gebruikt. Als de stimulering extreem is, kan 
gebruik van een hormese-model worden overwogen (19).
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. NIET-TOXISCHE GROEIREMMING  
Wanneer het testmateriaal licht absorbeert, kan dit tot een verlaging 
van de groeisnelheid leiden omdat schaduwwerking de beschikbare hoeveelheid licht vermindert. Dergelijke fysische effecten moeten 
door aanpassing van de testomstandigheden van toxische effecten 
worden gescheiden en apart worden gerapporteerd. Een leidraad hier ­
voor is te vinden in (2) en (3).
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen, 
waaronder de oplosbaarheidsgrens in water;  
— chemische identificatiegegevens, waaronder de zuiverheid.  
Geteste soort:  
— stam, leverancier of herkomst en gebruikte cultuuromstandighe ­
den. 
Testomstandigheden:  
— begindatum en duur van de test;  
— beschrijving van de testopzet: testvaten, cultuurvolumes, dicht ­
heid van de biomassa aan het begin van de test;  
— samenstelling van het medium;  
— testconcentraties en duplo's (bv. aantal duplo's, aantal testconcen ­
traties en rede van de gebruikte meetkundige reeks);  
— beschrijving van de bereiding van testoplossingen, met vermel ­
ding van het gebruik van oplosmiddelen enz.;  
— kweekapparatuur;  
— intensiteit en eigenschappen van het licht (bron, homogeniteit);  
— temperatuur;  
— geteste concentraties: de nominale testconcentraties en eventuele 
resultaten van analyses om de concentratie van de teststof in de 
testvaten te bepalen. De recovery van de methode en de bepa ­
lingsgrens in de testmatrix moeten worden gerapporteerd;  
— alle afwijkingen van deze testmethode;  
— de methode voor de bepaling van de biomassa en bewijsmateriaal 
voor de correlatie tussen de gemeten parameter en het droogge ­
wicht.  
Resultaten:  
— de pH aan het begin en het eind van de test voor alle dosis ­
groepen;  
— de biomassa voor elke kolf bij elk meetpunt en de methode voor 
het meten van de biomassa;  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— de groeicurves (biomassa uitgezet tegen de tijd);  
— de berekende responsvariabelen voor elke behandelde duplo met 
het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt voor de duplo's;  
— een grafische weergave van het verband tussen concentratie en 
effect;  
— de bepaalde toxiciteit voor responsvariabelen, zoals EC  50 , EC  10 
en EC  20 , en de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen. De 
LOEC en de NOEC, indien deze zijn berekend, en de voor de bepaling daarvan gebruikte statistische methoden;
 
— als ANOVA is gebruikt, de grootte van het effect dat kan worden 
gedetecteerd (bv. het minst significante verschil);  
— een eventuele stimulering van de groei, als deze bij een behan ­
deling is geconstateerd;  
— andere waargenomen effecten, zoals morfologische veranderin ­
gen van de algen;  
— bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele 
beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.
 
4. LITERATUUR  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test  
(2) ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhibi ­
tion tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442
 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.  
(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16.  
(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 
8692  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.
 
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanogra ­
phy 22,5 (1977), pp.919-925  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bio ­
assay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079.  
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494.
 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50: 1096-1121  
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103-117.  
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Aanhangsel 1  
Stammen waarvan is aangetoond dat ze geschikt zijn voor de test  
Groene algen  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (voorheen bekend als  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (voorheen bekend als  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Diatomeeën  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cyanobacteriën  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Bronnen van stammen  
De aanbevolen stammen zijn in culturen met één algensoort verkrijgbaar bij de 
volgende collecties (in alfabetische volgorde):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
Sammlung von Algenkulturen  
Albrecht-von-Haller-Institut  
Universität Göttingen  
Nikolausberger Weg 18  
37073 Göttingen  
GERMANY  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Uiterlijk en kenmerken van de aanbevolen soorten  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Uiterlijk Gekromde, 
gedraaide 
losse cellen Ovale, 
meestal losse 
cellen Staafjes Ketens van 
ovale cellen Staafjes 
Grootte (L × W) in μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Celvolume ( μm 3 /cel) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Drooggewicht cel (mg/cel) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Groeisnelheid (  3 ) (dag  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Gemeten met elektronische deeltjesteller. 
( 2 ) Berekend op grond van grootte. 
( 3 ) Meest frequent waargenomen groeisnelheid in OESO-medium bij een lichtintensiteit van ongeveer 70 μE·m  –2 ·s –1 en 21 °C.  
Specifieke aanbevelingen voor het kweken en behandelen van de voor de test 
aanbevolen soorten  
Pseudokirchneriella subcapitata en Desmodesmus subspicatus  
Deze groene algen zijn in het algemeen gemakkelijk in verschillende cultuur ­
media te bewaren. Bij de cultuurcollecties is informatie verkrijgbaar over ge ­
schikte media. De cellen zijn normaal gesproken solitair en de celdichtheid 
kan gemakkelijk worden gemeten met behulp van een elektronische deeltjesteller of een microscoop.
 
Anabaena flos-aquae  
Voor het bewaren van een stamcultuur kunnen verschillende groeimedia worden 
gebruikt. Het is vooral belangrijk te voorkomen dat de groei in de log-fase 
voorbij is voordat de batchcultuur wordt overgezet, omdat herstel op dit punt 
moeilijk is.  
Anabaena flos-aquae  ontwikkelt klonten met geneste ketens van cellen. De om ­
vang van deze klonten is afhankelijk van de cultuuromstandigheden. Het kan nodig zijn deze klonten in stukken te breken wanneer voor de bepaling van 
biomassa telling met een microscoop of een elektronische deeltjesteller wordt 
gebruikt.
 
Ultrasoonbehandeling van submonsters kan worden gebruikt om ketens in stuk ­
ken te breken teneinde de variabiliteit bij het tellen te verminderen. Als deze 
behandeling langer duurt dan nodig is om de ketens in stukken te breken, kunnen de cellen uiteenvallen. De intensiteit en de duur van de behandeling moeten voor elke dosisgroep identiek zijn.
 
Tel genoeg velden op de hemocytometer (ten minste 400 cellen) om de variabi ­
liteit te compenseren. Dit zal de betrouwbaarheid van bepaling van de dichtheid 
met een microscoop verhogen.  
Voor de bepaling van het totale celvolume van Anabaena kan, nadat de celketens 
door voorzichtig ultrasoon behandelen in stukken zijn gebroken, een elektro ­
nische deeltjesteller worden gebruikt. De ultrasoon-energie moet worden aange ­
past om uiteenvallen van de cellen te voorkomen.  
Gebruik een vortex-mixer of soortgelijke geschikte methoden om ervoor te zor ­
gen dat de voor het beënten van de testvaten gebruikte algensuspensie goed 
gemengd en homogeen is.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
De testvaten worden op een schudtafel (draaiend of heen-en-weer-gaand) met 
ongeveer 150 bewegingen per minuut geplaatst. Ook periodiek schudden kan 
worden gebruikt om de neiging van Anabaena om samen te klonteren tegen te gaan. Als er klonten ontstaan, moet erop worden gelet dat de monsters voor de meting van de biomassa representatief zijn. Krachtig schudden vóór de bemon ­
stering kan nodig zijn om klonten met algen uiteen te laten vallen.
 
Synechococcus leopoliensis  
Voor het bewaren van een stamcultuur kunnen verschillende groeimedia worden 
gebruikt. Bij de cultuurcollecties is informatie verkrijgbaar over geschikte media.  
Synechococcus leopoliensis  groeit als solitaire staafvormige cellen. De cellen zijn 
heel klein en dit compliceert het gebruik van een microscoop voor celtellingen om de biomassa te meten. Elektronische deeltjestellers die geschikt zijn voor het tellen van deeltjes vanaf een grootte van ongeveer 1 μm, zijn nuttig. Ook in vitro 
fluorimetrische bepaling is bruikbaar.
 
Navicula pelliculosa  
Voor het bewaren van een stamcultuur kunnen verschillende groeimedia worden 
gebruikt. Bij de cultuurcollecties is informatie verkrijgbaar over geschikte media. 
Let op dat het medium silicaat moet bevatten.  
Navicula pelliculosa  kan onder bepaalde groeiomstandigheden klonten vormen. 
Door de vorming van lipiden hebben de algencellen soms de neiging zich in de oppervlaktelaag op te hopen. Onder deze omstandigheden moeten er bij het 
nemen van submonsters voor de bepaling van de biomassa speciale maatregelen 
worden genomen om representatieve monsters te krijgen. Krachtig schudden, bijvoorbeeld met een vortex-mixer, kan nodig zijn.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Aanhangsel 2  
Groeimedia  
Een van de volgende twee groeimedia kan worden gebruikt:  
OESO-medium: oorspronkelijk medium van OESO TG 201, tevens overeenkom ­
stig ISO 8692  
US. EPA-medium AAP, tevens overeenkomstig ASTM.  
Bij de bereiding van deze media moeten p.a. reagentia en gedeïoniseerd water 
worden gebruikt.  
Samenstelling van het AAP-medium (US. EPA) en het OESO-medium van TG 201  
Component EPA OESO 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) De molaire verhouding EDTA/ijzer is iets hoger dan 1. Dit voorkomt dat ijzer neerslaat en beperkt tevens 
chelaatvorming van ionen van zware metalen tot een minimum.  
In de test met het diatomee Navicula pelliculosa moeten beide media worden 
aangevuld met Na  2 SiO  3 ·9H  2 0 tot een concentratie van 1,4 mg Si/l.  
De pH van het medium wordt verkregen bij evenwicht tussen het carbonaatsys ­
teem van het medium en de partiële druk van CO  2 in de lucht. Een bruikbare 
relatie tussen de pH bij 25 °C en de molaire bicarbonaat-concentratie is:  
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Bij 15 mg/l NaHCO  3 is pH  eq = 7,5 (US. EPA-medium) en bij 50 mg/l NaHCO  3 
is pH  eq = 8,1 (OESO-medium).  
Samenstelling in elementen van de testmedia  
Element EPA OESO 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Bereiding van het OESO-medium  
Nutriënt Concentratie in de stamoplossing 
Stamoplossing 1: macronutriënten  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Stamoplossing 2: ijzer  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Stamoplossing 3: spoorelementen  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Stamoplossing 4: bicarbonaat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Steriliseer de stamoplossingen door membraanfiltratie (gemiddelde poriediameter 
0,2 μm) of in de autoclaaf (120 °C, 15 min). Bewaar de oplossingen in het 
donker bij 4 °C.  
Stamoplossingen 2 en 4 mogen niet in de autoclaaf worden gesteriliseerd, maar 
alleen door membraanfiltratie.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Bereid een groeimedium door toevoeging van de benodigde volumes van stam ­
oplossingen 1-4 aan water:  
Voeg aan 500 ml gesteriliseerd water toe:  
— 10 ml stamoplossing 1  
— 1 ml stamoplossing 2  
— 1 ml stamoplossing 3  
— 1 ml stamoplossing 4  
Vul met gesteriliseerd water aan tot 1 000 ml.  
Laat het medium lang genoeg staan om het evenwicht met CO  2 in de lucht zich 
te laten instellen, indien nodig door enkele uren steriele gefilterde lucht door te 
leiden.  
Bereiding van het AAP-medium  
A1.1. Voeg 1 ml van elke stamoplossing in A1.2.1–A1.2.7 toe aan ongeveer 
900 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water en vul aan tot 1 liter.  
A1.2. De macronutriënt-stamoplossingen worden bereid door de volgende 
reagentia op te lossen in 500 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water. 
De reagentia A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 en A1.2.4 kunnen in één stam ­
oplossing worden gecombineerd.  
A1.2.1.  NaNO  3 – 12,750 g.  
A1.2.2.  MgCl  2 · 6H 2 O – 6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O – 2,205 g.  
A1.2.4.  Micronutriënt-stamoplossing  — (zie A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 – 0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 – 7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O — Zie opmerking A1.1.  
Opmerking A1.1: Alleen voor diatomeeën-testsoorten gebruiken. Kan 
rechtstreeks worden toegevoegd (202,4 mg) of als stamoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg Si/l in het medium.
 
A1.3. De micronutriënt-stamoplossing wordt bereid door de volgende reagen ­
tia op te lossen in 500 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 – 92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O – 207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 – 1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O – 79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O – 0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O – 3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O – 0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O – 150,000 mg.  
[dinatrium(ethyleendinitrilo)tetraacetaat].  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O – 0,005 mg — Zie opmerking A1.2.  
Opmerking A1.2: Alleen in medium voor stamculturen van dia ­
tomeeënsoorten gebruiken  
A1.4. Breng de pH op 7,5 ± 0,1 met 0,1  N of 1,0  N NaOH of HCl.  
A1.5. Filtreer de media in een steriele fles over een 0,22 μm membraanfilter 
(als een deeltjesteller wordt gebruikt) of een 0,45 μm membraanfilter 
(als er geen deeltjesteller wordt gebruikt).  
A1.6. Bewaar het medium in het donker bij ongeveer 4 °C tot het wordt 
gebruikt.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Aanhangsel 3  
Voorbeeld van een procedure voor het kweken van algen  
Algemene opmerkingen  
Het doel van het kweken op basis van de volgende procedure is het verkrijgen 
van algenculturen voor toxiciteitstesten.  
Er moeten geschikte methoden worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de 
algenculturen niet met bacteriën worden besmet. Axenische culturen zijn wense ­
lijk, maar er moeten culturen met één algensoort worden gemaakt en gebruikt.  
Alle handelingen dienen onder steriele omstandigheden te worden uitgevoerd om 
besmetting met bacteriën of andere algen te voorkomen.  
Apparatuur en materialen  
Zie in de testmethode onder „Apparatuur”.  
Procedures voor het verkrijgen van algenculturen  
Bereiding van de nutriëntoplossingen (media):  
Alle nutriëntzouten van het medium worden bereid als geconcentreerde stam ­
oplossing en koel en in het donker bewaard. Deze oplossingen worden door 
filtratie of in een autoclaaf gesteriliseerd.  
Het medium wordt bereid door de juiste hoeveelheid stamoplossing aan steriel 
gedestilleerd water toe te voegen, waarbij moet worden opgelet dat besmetting 
wordt voorkomen. Voor vast medium wordt 0,8 % agar toegevoegd.  
Stamcultuur:  
Stamculturen zijn kleine algenculturen die regelmatig op vers medium worden 
overgezet om zo als nieuw uitgangsmateriaal voor tests te dienen. Als de culturen 
niet regelmatig worden gebruikt, worden zij uitgestreken in schuine agarbuizen. 
Deze worden ten minste éénmaal per twee maanden overgezet op vers medium.  
De stamculturen worden gekweekt in erlenmeyers met het geschikte medium 
(volume ongeveer 100 ml). Wanneer de algen bij 20 °C met continue verlichting worden geïncubeerd, is wekelijks overzetten vereist.
 
Bij het overzetten wordt een hoeveelheid „oude” cultuur met steriele pipetten 
zodanig overgebracht naar een kolf met vers medium dat de beginconcentratie van de snel groeiende soort ongeveer 100 maal kleiner is dan in de oude cultuur.
 
De groeisnelheid van een soort kan uit de groeicurve worden bepaald. Indien 
deze bekend is, is het mogelijk de dichtheid te schatten waarbij de cultuur naar 
nieuw medium moet worden overgezet. Dit moet gebeuren voordat de cultuur in 
de afstervingsfase komt.  
Voorcultuur:  
De voorcultuur is bedoeld om een aantal algen te krijgen dat geschikt is voor het 
beënten van de testculturen. De voorcultuur wordt geïncubeerd onder de testoms ­
tandigheden en wordt gebruikt terwijl deze nog exponentieel groeit, normaal gesproken na een incubatieperiode van 2 tot 4 dagen. Wanneer de algenculturen misvormde of abnormale cellen bevatten, moeten ze worden afgekeurd.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Aanhangsel 4  
Gegevensanalyse door niet-lineaire regressie  
Algemene overwegingen  
De respons bij tests met algen en andere groeitests met micro-organismen (groei 
van biomassa) is van nature een continue of metrische variabele — een proces ­
snelheid als de groeisnelheid wordt gebruikt en de integraal over tijd als voor de 
hoeveelheid biomassa wordt gekozen. Beide worden vergeleken met de corres ­
ponderende gemiddelde respons van niet-blootgestelde controles waar de respons voor de gebruikte omstandigheden maximaal is, waarbij licht en temperatuur in 
de algentest de primaire bepalende factoren zijn. Het systeem is gedistribueerd of 
homogeen en de biomassa kan als een continuüm worden beschouwd zonder naar individuele cellen te kijken. De variantieverdeling van het type respons voor een dergelijk systeem houdt uitsluitend verband met experimentele factoren 
(meestal beschreven als lognormale of normale foutverdeling). Bij een karakte ­
ristieke binaire bioassay-respons wordt de tolerantie (meestal binomiaal verdeeld) van individuele organismen daarentegen vaak als de belangrijkste variantie-com ­
ponent beschouwd. In dit geval is de controlerespons nul of het achtergrond ­
niveau.
 
In de ongecompliceerde situatie neemt de genormaliseerde of relatieve respons r 
monotoon af van 1 (geen remming) tot 0 (100 % remming). Hierbij dient te worden opgemerkt dat elke respons een bijbehorende fout heeft en dat een schijnbare negatieve remming uitsluitend ten gevolge van een toevalsfout kan 
worden berekend.
 
Regressieanalyse  
Modellen  
Een regressieanalyse is gericht op een kwantitatieve beschrijving van de 
concentratie/responscurve in de vorm van een mathematische regressiefunctie 
Y = f (C) of in de meeste gevallen F (Z) waarbij Z = log C. Met de inverse 
C = f  –1 (Y) kunnen EC  x -waarden, zoals de EC  50 , de EC  10 en de EC  20 , en hun 
95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden berekend. Van verschillende eenvoudige mathematische functionele vormen is gebleken dat ze met succes kunnen worden 
gebruikt voor de beschrijving van het verband tussen concentratie en respons bij 
groeiremmingstests met algen. Hierbij gaat het bijvoorbeeld om de logistische vergelijking, de asymmetrische Weibull-vergelijking en de lognormale ver ­
delingsfunctie; dit zijn allemaal sigmoïde curves die asymptotisch tot 1 naderen 
voor C → 0 en tot 0 voor C → ∞.
 
Het gebruik van continue drempelfunctiemodellen (bv. het model van Kooijman 
voor remming van de populatiegroei, Kooijman et al., 1996) is recent voorgesteld als alternatief voor asymptotische modellen. Dit model gaat uit van het ontbreken van effecten bij concentraties beneden een bepaald drempelwaarde, EC0+, die 
wordt bepaald door extrapolatie van de concentratie/responscurve tot de concen ­
tratie-as met behulp van een eenvoudige continue functie die in het beginpunt niet differentieerbaar is.
 
Er moet worden opgemerkt dat de analyse een eenvoudige minimumbepaling van 
residuele kwadratensommen kan zijn (uitgaande van constante variantie) of van 
gewogen kwadratensommen als heterogeniteit van de variantie wordt gecompen ­
seerd.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Procedure  
De procedure kan als volgt worden geschetst: kies een geschikte functionele 
vergelijking Y = f (C) en fit deze met behulp van niet-lineaire regressie op de gegevens. Gebruik bij voorkeur de metingen van elke kolf afzonderlijk en niet de gemiddelden van de duplo's om zo veel mogelijk informatie uit de gegevens te 
kunnen halen. Anderzijds heeft de praktijk geleerd dat als de variantie hoog is, de 
gemiddelde waarden van de duplo's wellicht een robuustere mathematische be ­
paling opleveren, die minder wordt beïnvloed door toevallige fouten in de gege ­
vens, dan wanneer elk datapunt afzonderlijk wordt gebruikt.
 
Teken de gefitte curve en de gemeten gegevens en kijk of de fitting van de curve 
geschikt is. Analyse van de residuen kan hiervoor een zeer geschikt instrument zijn. Als het gekozen functionele verband om de concentratie/responscurve te fitten niet de hele curve beschrijft of een bepaald essentieel deel niet goed 
beschrijft, zoals de respons bij lage concentraties, moet in plaats van een sym ­
metrische een andere optie voor fitting van de curve worden gekozen, bijvoor ­
beeld een asymmetrische curve zoals de Weibull-functie. Negatieve remming kan problemen opleveren bij bijvoorbeeld de lognormale verdelingsfunctie en ook in 
dat geval is een andere regressiefunctie nodig. Er wordt niet aanbevolen aan 
dergelijke negatieve waarden de waarde 0 of een kleine positieve waarde toe te kennen, omdat dit de foutverdeling verstoort. Het kan nuttig zijn een aparte fitting van de curve voor bepaalde delen van de curve te maken, bijvoorbeeld het 
deel met een geringe remming voor de bepaling van EC
 lage x  -waarden. Bereken 
uit de gefitte vergelijking — door „inverse bepaling”, C = f  –1 (Y) — karakte ­
ristieke puntramingen EC  x en rapporteer minimaal de EC  50 en een of twee EC  lage 
x -waarden. De praktijk heeft geleerd dat de precisie van de algentest normaal 
gesproken een redelijk nauwkeurige bepaling bij 10 % remming mogelijk maakt 
als de datapunten volstaan, tenzij stimulering bij lage concentraties als storende factor optreedt. De precisie van een EC
 20 -waarde is vaak aanzienlijk beter dan 
die van een EC  10 , omdat de EC  20 meestal op het ongeveer lineaire deel van de 
centrale concentratie/responscurve ligt. Soms kan de EC  10 vanwege groeistimu ­
lering moeilijk te interpreteren zijn. Dit betekent dat de EC  10 weliswaar normaal 
gesproken met een afdoende nauwkeurigheid te bepalen is, maar dat toch wordt aanbevolen altijd ook de EC
 20 te rapporteren.  
Wegingsfactoren  
De toevallige variantie is in het algemeen niet constant en heeft meestal een 
evenredige component, zodat het de voorkeur verdient standaard een gewogen 
regressie uit te voeren. Meestal wordt aangenomen dat de wegingsfactoren voor 
een dergelijke analyse omgekeerd evenredig zijn met de variantie:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Veel regressieprogramma's bieden de mogelijkheid om een gewogen regressie ­
analyse uit te voeren, waarbij de wegingsfactoren in een tabel worden opge ­
nomen. Wegingsfactoren moeten liefst worden genormaliseerd door ze met n/ ∑ w i 
te vermenigvuldigen (n is het aantal datapunten), zodat de som gelijk aan 1 is.  
Normalisering van de respons  
Normalisering met de gemiddelde controlerespons levert bepaalde principepro ­
blemen op en leidt tot een nogal gecompliceerde variantiestructuur. Door de respons te delen door de gemiddelde controlerespons om de procentuele remming 
te berekenen wordt een extra fout geïntroduceerd, die wordt veroorzaakt door de 
fout in het controlegemiddelde. Tenzij deze fout te verwaarlozen is, moeten de wegingsfactoren in de regressie en betrouwbaarheidsgrenzen worden gecorrigeerd voor de covariantie met de controle (17). Er moet worden opgemerkt dat een 
hoge precisie bij de bepaalde gemiddelde controlerespons belangrijk is om de 
algehele variantie voor de relatieve respons tot een minimum te beperken.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
Deze variantie is (subscript i verwijst naar concentratie i en subscript 0 naar de 
controles):  
Y i = Relatieve respons = r  i /r 0 = 1 — I = f (C  i ) 
met variantie:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
Aangezien  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 and (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
wordt met een normale datadistributie en m  i en m  0 duplo's:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
de totale variantie van de relatieve respons Y  i : 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
De fout in het controlegemiddelde is omgekeerd evenredig met de vierkants ­
wortel van het gemiddelde aantal controleduplo's en soms kan het gerechtvaar ­
digd zijn om historische gegevens mee te nemen en zo de fout sterk te verlagen. 
Het is ook mogelijk de gegevens niet te normaliseren en de absolute respons, inclusief de controlerespons, te fitten maar de controlerespons als extra parameter 
te introduceren voor de fitting met niet-lineaire regressie. Bij een gebruikelijke 
regressievergelijking met twee parameters moeten met deze methode drie para ­
meters worden gefit, zodat er meer datapunten nodig zijn dan bij niet-lineaire regressie met gegevens die met een vooraf bepaalde controlerespons worden 
genormaliseerd.
 
Inverse betrouwbaarheidsintervallen  
De berekening van betrouwbaarheidsintervallen voor niet-lineaire regressie met 
behulp van inverse bepaling is vrij gecompliceerd en meestal niet als standaard ­
optie beschikbaar in normale statistische computerprogrammapakketten. Bena ­
derde betrouwbaarheidsgrenzen kunnen worden verkregen met behulp van stan ­
daardprogramma's voor niet-lineaire regressie met herparametrisering (Bruce en Versteeg, 1992), hetgeen inhoudt dat de mathematische vergelijking moet worden 
herschreven met de gewenste puntbepalingen, bijvoorbeeld de EC
 10 en de EC  50 
als de te bepalen parameters. (Neem als functie I = f ( α, β, concentratie) en 
gebruik de definitierelaties f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 en f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 om f ( α, β, 
concentratie) te vervangen door een gelijkwaardige functie g (EC  10 , EC  50 , con­
centratie).  
Een directere berekening (Andersen et al, 1998) wordt uitgevoerd door de oor ­
spronkelijke vergelijking te houden en een Taylor-expansie rond het gemiddelde van r
 i en r  0 te gebruiken.  
De laatste tijd zijn „bootstrap-methoden” populair geworden. Deze methoden 
gebruiken de gemeten gegevens en een door een aselecte getallengenerator be ­
paalde frequent herhaalde steekproeftrekking voor de bepaling van een empiri ­
sche variantieverdeling.  
Literatuur  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. BEPALING VAN DE GEMAKKELIJKE BIOLOGISCHE 
AFBREEKBAARHEID  
DEEL I.  ALGEMENE BESCHOUWINGEN  
1.1. INLEIDING  
Voor het testen van de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid 
van chemische stoffen in een aëroob watermedium worden zes test ­
methoden beschreven:  
a) DOC (opgeloste organische koolstof) Afvlakkingstest (Methode 
C.4-A)  
b) Gewijzigde OESO-Screening test — Afvlakking DOC (Methode 
C.4-B)  
c) Kooldioxyde (CO  2 ) Ontwikkelingstest (Gewijzigde Sturm-test) 
(Methode C.4-C)  
d) Manometrische respirometrie (Methode C.4-D)  
e) Gesloten-flestest (Methode C.4-E)  
f) MITI (Ministerie voor Internationale Handel en Industrie — Ja ­
pan) (Methode C.4-F)  
In deel I van de methode worden zowel de algemene aanwijzingen 
als de op alle zes tests betrekking hebbende aanwijzingen gegeven. In de Delen II tot en met VII worden bijzonderheden over de afzon ­
derlijke methoden vermeld. De bijlagen bevatten definities, formules 
en nadere toelichting.
 
Bij een vergelijkend onderzoek tussen laboratoria in OESO-verband 
in 1988 bleek dat de methoden overeenstemmende resultaten geven. Afhankelijk van de fysische kenmerken van de te onderzoeken stof kan echter de voorkeur naar de ene of de andere methode gaan.
 
1.2. KEUZE VAN DE GESCHIKTE METHODE  
Voor een keuze van de meest in aanmerking komende methode is 
informatie over de oplosbaarheid, de dampdruk en de adsorptie-ei ­
genschappen van de stof van wezenlijk belang. Voor het berekenen 
van theoretische waarden en/of het controleren van gemeten waarden voor parameters, bv. ThOD, ThCO
 2 , DOC, TOC, COD (zie 
Bijlagen I en II) moet de scheikundige structuur of de brutoformule 
bekend zijn.  
Teststoffen die tot ten minste 100 mg/l in water oplosbaar zijn 
kunnen met alle methoden worden bepaald, mits ze niet-vluchtig 
en niet-adsorberend zijn. Voor stoffen die slecht in water oplosbaar, vluchtig of adsorberend zijn, worden in Tabel 1 geschikte methoden aangegeven. De wijze waarop slecht in water oplosbare stoffen en 
vluchtige stoffen kunnen worden behandeld wordt beschreven in 
Bijlage III. Matig vluchtige stoffen kunnen worden onderzocht met behulp van de DOC-afvlakkingsmethode, indien er voldoende gas ­
ruimte in de proefvaten is (deze zouden goed afgesloten moeten 
worden). In dat geval dient een niet-biologische controle te worden 
toegepast voor het verdisconteren van een eventueel fysisch verlies.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabel 1  
Bruikbaarheid van testmethoden  
Test Analytische methode Geschiktheid voor de volgende stoffen: 
Slecht 
absorberend Vluchtig Oplosbaar  
DOC Afvlakking Opgeloste organische kool ­
stof — — +/– 
Gew. OESO Afvlakking Opgeloste organische kool ­
stof — — +/– 
Ontwikkeling CO  2 Respirometrie: CO  2 -ontwik­
keling + — + 
Manometrische respirometrie Manometrische respiro ­
metrie: zuurstofverbruik + +/– + 
Gesloten fles Respirometrie: opgeloste 
zuurstof +/- + + 
MITI Respirometrie: zuurstofver ­
bruik + +/- +  
Informatie over de zuiverheid of de relatieve hoeveelheden van be ­
langrijke componenten van het testmateriaal is nodig voor een inter ­
pretatie van de verkregen resultaten, vooral wanneer de uitkomsten 
gering of marginaal zijn.  
Informatie over de giftigheid van de teststof voor bacteriën 
(Bijlage IV) kan zeer nuttig zijn voor het kiezen van de juiste test ­
concentraties en kan essentieel zijn voor een juiste interpretatie van 
een geringe waarde voor de biologische afbraak.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Voor een controle op de procedure worden referentiestoffen die aan 
de criteria voor gemakkelijke biologische afbreekbaarheid voldoen, 
onderzocht door een geschikte proefvolume referentiestof parallel met de gewone testuitvoeringen te behandelen.
 
Geschikte chemische stoffen zijn aniline (vers gedistilleerd), natriu ­
macetaat en natriumbenzoaat. Deze referentiestoffen worden bij de onderhavige methoden alle afgebroken, zelfs wanneer niet bewust 
entmateriaal wordt toegevoegd.
 
Voorgesteld is een referentiestof te zoeken die wel gemakkelijk bio ­
logisch afbreekbaar is maar de toevoeging van een entmateriaal ver ­
eist. Daartoe is kaliumwaterstoftalaat voorgesteld, maar de geschikt ­
heid moet nog worden aangetoond voordat deze stof als referentie ­
stof aangenomen kan worden.  
In de respirometrische testen kunnen stikstof bevattende verbindin ­
gen als gevolg van nitrificatie van invloed zijn op de opgenomen hoeveelheid zuurstof (zie Bijlagen II en V).
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODEN  
Een oplossing of suspensie van de teststof in een anorganisch me ­
dium wordt geënt en onder aërobe omstandigheden in het donker of in gedempt licht bebroed. De hoeveelheid DOC in de testoplossing 
die het gevolg is van het entmateriaal dient zo laag mogelijk te zijn 
in vergelijking met de hoeveelheid DOC tengevolge van de teststof.
 
Voor de endogene activiteit van het entmateriaal wordt een correctie 
aangebracht door middel van parallelle blanco proeven met entma ­
teriaal maar zonder teststof, ofschoon de endogene activiteit van cellen in aanwezigheid van een teststof niet volledig overeenstemt met die van de endogene controle. De werking van de procedures 
wordt gecontroleerd door een parallelle test met een referentiestof uit 
te voeren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
In het algemeen wordt de afbraak gevolgd door de bepaling van 
parameters, zoals DOC, CO  2 -produktie en opgenomen zuurstof en 
worden op voldoende frequente tijdstippen metingen gedaan om het begin en het einde van de biologische afbraak vast te stellen. Bij automatische respirometers is de meting continu. Soms wordt de 
DOC gemeten naast een andere parameter, maar gewoonlijk wordt 
dit slechts bij het begin en bij de afloop van de test gedaan. Voor het bepalen van de primaire afbraak van de teststof en voor het bepalen van de concentratie van eventuele gevormde tussenproducten (ver ­
plicht bij de MITI-test) kan ook een specifieke chemische analyse 
worden uitgevoerd.
 
Gewoonlijk duurt de test 28 dagen. De proeven kunnen echter ook 
eerder dan na 28 dagen, en wel zodra de kromme voor de biologi ­
sche afbraak gedurende ten minste 3 bepalingen een plateau ver ­
toont, worden beëindigd. De proeven kunnen ook langer dan 28 dagen worden voortgezet, wanneer uit de kromme blijkt dat de bio ­
logische afbraak wel begonnen is, maar dat op dag 28 nog geen 
plateau is bereikt.
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
1.5.1.  Reproduceerbaarheid  
In verband met de aard van de biologische afbraak en van de als 
entmateriaal gebruikte gemengde bacteriepopulaties dienen bepalin ­
gen ten minste in tweevoud te worden uitgevoerd.  
De ervaring leert in het algemeen dat hoe hoger de aanvankelijk aan 
het testmedium toegevoegde concentratie micro-organismen is, hoe 
geringer de afwijking tussen herhaalde bepalingen is. Uit ringtests is 
ook gebleken dat er tussen de resultaten van verschillende laboratoria grote verschillen kunnen zijn, maar gewoonlijk wordt met gemakke ­
lijk biologische afbreekbare stoffen een goede overeenstemming ver ­
kregen.
 
1.5.2.  Geldigheid van de test  
Een test wordt geldig beschouwd indien het verschil tussen de ui ­
terste waarden van de in de test meermalen uitgevoerde metingen van de verwijdering van teststof op het plateauniveau, aan het einde 
van de test of aan het einde van het venster van 10 dagen, minder is 
dan 20 % en indien het percentage afbraak van de referentiestof na 14 dagen het niveau voor gemakkelijke biologische afbreekbaarheid 
heeft bereikt. Indien aan een van deze voorwaarden niet is voldaan, 
dient de test te worden herhaald. Wegens de strengheid van de methoden behoeven lage waarden nog niet te betekenen dat de test ­
stof onder milieu-omstandigheden niet biologisch afbreekbaar is, 
maar wel dat meer onderzoek nodig is om de biologische afbreek ­
baarheid vast te stellen.
 
Indien in een toxiciteitstest waarbij zowel de teststof als een refe ­
rentiestof aanwezig is, in 14 dagen minder dan 35 % afbraak (geba ­
seerd op DOC) of minder dan 25 % afbraak (gebaseerd op ThOD of 
ThCO  2 ) is opgetreden, kan worden aangenomen dat de teststoffen 
remmend werken (zie ook Bijlage IV). De testreeks dient dan te worden herhaald, zo mogelijk met een lagere concentratie teststof 
en/of een hogere concentratie entmateriaal, maar niet meer dan 
30 mg vaste stof per liter.
 
1.6. ALGEMENE WERKWIJZEN EN BEREIDINGEN  
Algemene omstandigheden die van toepassing zijn op de test zijn in 
Tabel 2 samengevat. Apparatuur en overige experimentele omstan ­
digheden die op afzonderlijke tests betrekking hebben worden ver ­
derop in het hoofdstuk voor die test beschreven.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 982
Tabel 2  
Testomstandigheden  
Test DOC 
Afvlakking CO 2 -ontwikke ­
ling Manometrische 
respirometrie Gewijzigde 
OECD-test Gesloten fles MITI (I)  
Concentratie 
teststof als 
in mg/l 100 2-10 100 mg DOC/1 10-40 10-20 10-40 
mg ThOD/1 50-100 5-10 
Concentratie 
entmateriaal (in cellen/l, bij benade ­
ring) ≤ 30 mg/l SS 
of ≤ 100 ml effluent/l 
(10
 7 - 10  8 ) 0,5 ml se ­
cundair ef ­
fluent/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml ef­
fluent/l 
(10 4 -10 6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 -10 8 ) 
Concentratie 
elementen in 
anorganisch 
medium (in mg/l): 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 bij voorkeur 
7,0 
Temperatuur 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = opgeloste organische koolstof ThOD = theoretisch zuur ­
stofverbruik SS = gesuspendeerde 
vaste stof  
1.6.1.  Verdunningswater  
Gedeïoniseerd of gedistilleerd water, dat vrij is van remmende concen ­
traties giftige stoffen (bv. Cu  ++ -ionen) wordt gebruikt. Het mag niet meer 
dan 10 % van de hoeveelheid organische koolstof die met het restmate ­
riaal wordt geïntroduceerd bevatten. De grote zuiverheid van het test ­
water is nodig om hoge waarden van de blanco-proeven te vermijden. 
Besmetting kan het gevolg zijn van aanwezige verontreinigingen en ook van de ionenuitwisselende harsen en van de lysis van bacteriën en algen. Voor elke reeks tests dient slechts gebruik te worden gemaakt van een 
enkele voorraad water, die vooraf door middel van DOC-analyse is 
gecontroleerd. Zo'n controle is niet nodig voor de gesloten flestest, maar het zuurstofverbruik van het water moet laag blijven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
1.6.2.  Voorraadoplossingen van anorganische componenten  
Voor het bereiden van testoplossingen worden voorraadoplossingen 
met geschikte concentraties van anorganische componenten aange ­
maakt. Voor de methoden DOC-afvlakking, gewijzigde OESO-test, 
CO 2 -ontwikkeling, manometrische respirometrie en gesloten fles 
kunnen de onderstaande voorraadoplossingen worden gebruikt (met verschillende verdunningsfactoren).
 
De verdunningsfactoren en, voor de MITI-test, de specifieke berei ­
ding van het anorganische medium, worden in de hoofdstukken van de afzonderlijke tests beschreven.
 
Voorraadoplossingen:  
De onderstaande voorraadoplossingen worden bereid met gebruikma ­
king van reagentia van analytische kwaliteit. 
a) Monokaliumdiwaterstoforthosfaat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliummonowaterstoforthofosfaat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriummonowaterstoforthofosfaat-dihydraat, 
Na 2 HPO  4 . 2 H  2 O 33,40 g 
Ammoniumchloride, NH  4 Cl 0,50 g 
Oplossen in water en tot 1 liter aanvullen. De pH 
van de oplossing moet 7,4 zijn. 
b) Calciumchloride, watervrij, CaCl  2 of 27,50 g 
Calciumchloride-dihydraat, CaCl  2 . 2 H  2 O 36,40 g 
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen 
c) Magnesiumsulfaat-heptahydraat, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen 
d) IJzer(III)chloride-hexahydraat, FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen  
Opmerking:  Teneinde deze oplossing d) niet onmiddellijk voor ge ­
bruik te behoeven te bereiden, wordt één druppel geconcentreerde HCl of 0,4 g ethyleendiaminetetra-azijnzuur-dinatriumzout (EDTA) 
per liter toegevoegd.
 
1.6.3.  Voorraadoplossingen van chemicaliën  
Indien de oplosbaarheid meer dan 1 g/l bedraagt, wordt bijvoorbeeld 
1-10 g, zoals toepasselijk is, aan teststof of referentiestof in gedeï ­
oniseerd water opgelost en tot 1 liter aangevuld. In andere gevallen 
worden voorraadoplossingen in het anorganische medium bereid of wordt de stof rechtstreeks aan het anorganische medium toegevoegd. Voor het bewerken van minder goed oplosbare stoffen wordt ver ­
wezen naar Bijlage III, maar in de MITI-test (Methode C.4-F) dienen 
noch oplosmiddelen noch emulgatoren te worden gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
1.6.4.  Entmateriaal  
Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, 
(chloorvrij) behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan. Indien bij de DOC-afvlakking, de CO
 2 -ontwikke ­
ling en de manometrische respirometrie actief slib wordt gebruikt, 
dient dit te worden onttrokken aan een behandelingsinstallatie of installatie op laboratoriumschaal die hoofdzakelijk huishoudelijk af ­
valwater verwerkt. Gebleken is dat entmateriaal van andere bronnen 
een grotere spreiding van resultaten geeft. Voor de gewijzigde OE ­
SO-test en de gesloten-flestest is een meer verdund entmateriaal zonder slibvlokken nodig en bij voorkeur wordt dan als bron een 
secundair effluent van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of van een 
laboratoriuminstallatie met huishoudelijk afvalwater genomen. Voor de MITI-test is het entmateriaal afkomstig van een mengsel van bronnen. Het wordt in het hoofdstuk van die test beschreven.
 
1.6.4.1.  Entmateriaal uit actief slib  
Uit de beluchtingstank van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of een 
laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afval ver ­
werkt, wordt een vers monster actief slib verzameld. Grove deeltjes worden zo nodig door filtratie door een fijne zeef verwijderd; daarna 
wordt het slib aëroob gehouden.
 
In plaats daarvan kan na verwijdering van eventuele grove deeltjes 
worden bezonken of gecentrifugeerd (bv. 10 min bij 1 100 g). De bovenstaande vloeistof wordt weggeworpen. Het geconcentreerde 
slib kan in het mineraal medium gewassen worden; daarna wordt 
het in anorganisch medium gesuspendeerd tot een concentratie van 3-5 g gesuspendeerde vaste stof/l en belucht tot het tijdstip van gebruik.
 
Slib moet afkomstig zijn van een correct werkend zuiveringsstation. 
Als slib afkomstig is van een installatie met hoge omloopsnelheid, of geacht wordt remmers te bevatten, dient het te worden gewassen. Het opnieuw gesuspendeerde slib wordt na grondig mengen bezonken of 
gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof wordt weggeworpen en 
het gewassen slib wordt in een volgend volume anorganisch medium opnieuw gesuspendeerd. Deze procedure wordt herhaald totdat het 
slib geacht wordt vrij te zijn van overmaat substraat of remmer.
 
Nadat het slib volledig opnieuw is gesuspendeerd, of bij niet-behan ­
deld slib direct, wordt vlak voor gebruik een monster getrokken voor de bepaling van het droog gewicht aan gesuspendeerde vaste stoffen.
 
Een andere mogelijkheid is het homogeniseren van actief slib (3-5 g 
gesuspendeerde vaste stof per l). Het slib wordt 2 min bij matige snelheid in een mechanische menger behandeld. Het gemengde slib wordt gedurende 30 min of zoveel langer als nodig bezonken en de 
vloeistof wordt afgeschonken en gebruikt als entmateriaal in een 
hoeveelheid van 10 ml anorganisch medium.
 
1.6.4.2.  Andere bronnen van entmateriaal  
Dit kan worden betrokken van het secundaire effluent van een zui ­
veringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk 
huishoudelijk afvalwater ontvangt. Er wordt een vers monster ver ­
zameld en dit wordt tijdens transport aëroob gehouden. Na 1 uur bezinken of filtreren door een grof filterpapier wordt het afgeschon ­
ken effluent of het filtraat aëroob gehouden zolang als nodig is. Tot 
100 ml van dit soort entmateriaal per liter mineraal medium kan 
gebruikt worden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Een verdere bron van entmateriaal is oppervlaktewater. In dit geval 
wordt een monster van een geschikt oppervlaktewater, bv. rivieren, 
plassen, verzameld en aëroob gehouden tot het nodig is. Zonodig wordt het entmateriaal door filtreren of centrifugeren geconcentreerd.
 
1.6.5.  Preconditionering van entmateriaal  
Entmateriaal kan op de proefomstandigheden worden gepreconditio ­
neerd, maar mag niet vooraf aan de teststof worden aangepast. Pre ­
conditionering bestaat uit het beluchten van actief slib gedurende 5-7 
dagen in anorganisch medium of secundaire effluent bij de testtem ­
peratuur. Door preconditionering wordt de nauwkeurigheid van de testmethode soms verbeterd doordat de blancowaarden worden ver ­
laagd. Het wordt niet nodig geacht het entmateriaal voor de MITI- 
test te preconditioneren.
 
1.6.6.  Niet-biologische controles  
Zonodig wordt gecontroleerd op mogelijke niet-biologische afbraak 
van de teststof door het bepalen van de verwijdering van DOC, de 
zuurstofopname of de kooldioxyde-ontwikkeling in steriele controles 
die geen entmateriaal bevatten. Het testmateriaal wordt gesteriliseerd door filtratie door een membraan (0,2 - 0,45 micrometer) of door toevoeging van een geschikte giftige stof met een geschikte concen ­
tratie. Indien gebruik gemaakt wordt van membraanfiltratie, moeten 
de monsters aseptisch verzameld worden, om de steriliteit ervan te behouden. De adsorptie van de teststof moet op voorhand uitgesloten worden. Is dit niet het geval, en is het entmateriaal uit actief slib 
afkomstig, moeten tests waarbij de biologische afbreekbaarheid als 
DOC-verwijdering bepaald wordt, een abiotische controle bevatten, die geënt en vergiftigd wordt.
 
1.6.7.  Aantal kolven  
Het aantal kolven in een doorsnee proef wordt in de betreffende 
hoofdstukken voor elke test beschreven.  
Kolven van het volgende soort kunnen gebruikt worden:  
— testsuspensie: met teststof en entmateriaal;  
— entmateriaalblanco: met entmateriaal alleen;  
— procedurecontrole: met referentiestof en entmateriaal;  
— abiotische steriele controle: met teststof — steriel (zie 1.6.6.);  
— adsorptiecontrole: met teststof, entmateriaal en steriliserend 
middel;  
— toxiciteitscontrole: met teststof, referentiestof en entmateriaal.  
Het is beslist nodig de bepalingen in de testsuspensie en entmateri ­
aalblanco parallel uit te voeren. Het is raadzaam de bepalingen in de 
andere kolf parallel te volgen.  
Dit is echter wellicht niet altijd mogelijk. Men dient zich er van te 
vergewissen dat er voldoende monsters worden genomen of afgele ­
zen om een bepaling van het percentage verwijdering in het venster 
van 10 dagen mogelijk te maken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
1.7. GEGEVENS EN EVALUATIE  
Bij de berekening van D  t , percentage afbraak, worden de gemiddelde 
waarden van duplometingen van de parameter zowel in de testvaten als van de entmateriaalblanco gebruikt. De formules daarvoor zijn 
vermeld in de onderstaande hoofdstukken die op de afzonderlijke 
tests betrekking hebben. Het verloop van de afbraak wordt grafisch weergegeven en het 10-dagenvenster wordt aangegeven. Het percen ­
tage verwijdering dat na afloop van het 10-dagenvenster is bereikt en 
de waarde van het plateau of, indien van toepassing, aan het eind 
van de test, worden berekend en gerapporteerd.
 
Bij de respirometrische tests kunnen stikstof bevattende verbindingen 
door nitrificatie van invloed zijn op de opgenomen hoeveelheid zuur ­
stof (zie Bijlagen II en V).  
1.7.1.  Afbraak gemeten door middel van DOC-bepaling  
Op elk tijdstip van monsterneming moet het percentage afbraak (D  t ) 
voor de kolven met teststof apart, aan de hand van gemiddelden van in duplo gemeten DOC-waarden, berekend worden; het doel hiervan 
is, de validiteit van de test te bevestigen (zie 1.5.2). Het percentage 
afbraak wordt met de volgende formule berekend:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100 
waarin:  
D t = % afbraak op tijdstip t,  
C o = gemiddelde beginconcentratie van DOC in het geënte 
kweekmedium dat de teststof bevat (mg DOC/1),  
C t = gemiddelde concentratie DOC in het geënte kweekmedium 
dat de teststof bevat op tijdstip t (mg DOC/l),  
C bo = gemiddelde beginconcentratie van DOC in het blanco 
geënte anorganische medium (mg DOC/1),  
C bt = gemiddelde concentratie van DOC in het blanco geënte 
anorganische medium op tijdstip t (mg DOC/1).  
Alle concentraties worden experimenteel gemeten.  
1.7.2.  Afbraak gemeten door middel van specifieke analyse  
Wanneer de specifieke analytische gegevens beschikbaar zijn, wordt 
de primaire biologische afbraak berekend:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
waarin:  
D t = % afbraak op tijdstip t, gewoonlijk 28 dagen,  
S a = overblijvende hoeveelheid teststof in het entmedium aan het 
eind van de test (mg),  
S b = overblijvende hoeveelheid teststof in de blanco test met 
water/medium waaraan alleen de teststof was toegevoegd 
(mg).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
1.7.3.  Niet-biologische afbraak  
Indien gebruik wordt gemaakt van een abiotische steriele controle, 
wordt het percentage niet-biologische afbraak berekend:  
% niet Ä biologischeafbraak  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
waarin:  
C s(o) = DOC concentratie in de steriele controle op dag 0  
C s(t) = DOC concentratie in de steriele controle op dag t  
1.8. RAPPORTAGE  
Het testrapport bevat, voorzover mogelijk, de volgende gegevens:  
— teststof en referentiestof en zuiverheid daarvan;  
— testomstandigheden;  
— entmateriaal: aard en plaats(en) van bemonstering, concentratie 
en eventuele preconditionering;  
— indien bekend, hoeveelheid en aard van industrieel afval dat in 
rioolwater aanwezig is;  
— testduur en testtemperatuur;  
— in geval van slecht oplosbare teststoffen, de uitgevoerde behan ­
deling;  
— toegepaste testmethode; voor elke wijziging van de procedure 
dienen wetenschappelijke gronden en een toelichting te worden gegeven;
 
— gegevensformulier;  
— alle eventueel waargenomen remmingsverschijnselen;  
— eventueel waargenomen niet-biologische afbraak;  
— specifieke analytisch-chemische gegevens, indien beschikbaar;  
— analytische gegevens over tussenproducten, indien beschikbaar;  
— de grafiek van het percentage afbraak tegen de tijd voor de test ­
stof en de referentiestof; de aanloopfase, de afbraakfase, het 10- 
dagenvenster en de helling dienen duidelijk te zijn aangegeven (Bijlage I); indien de test aan de validiteitscriteria heeft voldaan, kan het gemiddelde van de percentages afbraak van de teststof 
bevattende kolven voor de grafiek gebruikt worden.
 
— percentage verwijdering na het 10-dagenvenster, alsmede op het 
plateau of aan het eind van de test.  
DEEL II.  DOC-AFVLAKKINGSTEST  (Methode C.4-A)  
II.1. PRINCIPE VAN DE METHODE  
Een gemeten volume aan geënt anorganisch medium dat een be ­
kende concentratie van de teststof (10-40 mg DOC/1) als de enige 
nominale bron van organische koolstof bevat wordt bij 22 ± 2  o C in 
het donker of in gedempt licht belucht.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
De afbraak wordt door middel van DOC-analyse met regelmatige 
tussenpozen gedurende 28 dagen gevolgd. De mate van biologische 
afbraak wordt berekend doordat de concentratie aan verwijderde DOC (gecorrigeerd voor de DOC in de blanco-entmateriaalcontrole) als percentage van de aanvankelijk aanwezige concentratie wordt 
uitgedrukt. De mate van primaire biologische afbraak kan ook wor ­
den berekend uit een aanvullende chemische analyse die bij het begin en het eind van de incubatie wordt uitgevoerd.
 
II.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
II.2.1.  Apparatuur  
a) Erlenmeyerkolven, bv. 250 ml tot 2 l, afhankelijk van het voor 
DOC-analyse benodigde volume;  
b) Schudmachine geschikt voor de erlenmeyers, hetzij met automa ­
tische temperatuurregeling, hetzij gebruikt in een kamer met con ­
stante temperatuur, en met een voldoende vermogen voor het in stand houden van aërobe omstandigheden in alle kolven;
 
c) Filtratie-apparatuur met geschikte membranen;  
d) DOC-analyse-apparaat;  
e) Apparatuur voor het bepalen van opgeloste zuurstof;  
f) Centrifuge.  
II.2.2.  Bereiding van anorganisch medium  
Zie voor de bereiding van de voorraadoplossing 1.6.2.  
10 ml oplossing a) wordt gemengd met 800 ml verdunningswater, 
daaraan wordt 1 ml van de oplossingen b) t/m d) toegevoegd en het 
geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.  
II.2.3.  Bereiding en preconditionering van entmateriaal  
Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, 
behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan.  
Zie 1.6.4, 1.6.4.1, 1.6.4.2 en 1.6.5.  
II.2.4.  Bereiding van de proefoplossingen  
Bij wijze van voorbeeld worden porties van 800 ml anorganisch 
medium in erlenmeyers van 2 liter gebracht en wordt in afzonderlijke kolven telkens een zodanig volume aan voorraadoplossingen van 
teststof en referentiestof gebracht dat een concentratie met een che ­
misch equivalent aan 10-40 mg DOC/l wordt verkregen. De pH wordt gecontroleerd en, zonodig, op 7,4 bijgesteld. De kolven wor ­
den geënt met actief slib of een andere bron van entmateriaal (zie 
1.6.4) tot een uiteindelijke concentratie van niet meer dan 30 mg 
gesuspendeerde vaste stof per liter wordt verkregen. Tevens worden controles van entmateriaal in anorganisch medium, maar zonder test- of referentiestof, bereid.
 
Zo nodig wordt één kolf gebruikt om de eventuele remmende wer ­
king van een teststof te controleren door het enten van een oplossing die in het anorganische medium vergelijkbare concentraties van zo ­
wel de teststof als de referentiestof bevat.
 
Tevens wordt, indien nodig, een volgende steriele kolf ingericht voor 
de controle op de eventuele niet-biologische afbraak van de teststof 
door toepassing van een niet-geënte oplossing van de stof (zie 1.6.6).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Indien het vermoeden bestaat dat de teststof in belangrijke mate op 
glas, slib o.i.d. wordt geadsorbeerd, wordt bovendien in een voor ­
afgaand onderzoek de waarschijnlijke mate van adsorptie en daarmee de geschiktheid van de test voor de desbetreffende stof bepaald (zie Tabel 1). Hiertoe wordt een kolf met de teststof, het entmateriaal en 
het steriliserend middel bereid.
 
In alle kolven wordt het volume met anorganisch medium tot 1 l 
aangevuld en na mengen wordt uit elke kolf een monster genomen ter bepaling van de beginconcentratie aan DOC (zie 
Bijlage II.4). De openingen van de kolven worden afgedekt, bij 
voorbeeld met aluminiumfolie, zodanig dat er een ongehinderde uit ­
wisseling van lucht tussen de kolf en de omgevende atmosfeer kan plaatsvinden. Vervolgens worden de kolven op de schudmachine 
geplaatst en kan de test beginnen.
 
II.2.5.  Aantal kolven in een doorsneeproef  
Kolven 1 en 2: testsuspensie  
Kolven 3 en 4: entmateriaalblanco  
Kolf 5: procedurecontrole  
bij voorkeur en zo nodig:  
Kolf 6: abiotische steriele controle  
Kolf 7: adsorptiecontrole  
Kolf 8: toxiciteitscontrole  
Zie ook I.6.7.  
II.2.6.  Uitvoering van de test  
Gedurende de test worden met bepaalde tussenpozen de concentra ­
ties aan DOC in elke kolf in duplo bepaald, en wel zo vaak dat het 
begin van het 10-dagenvenster en het percentage verwijdering aan het eind van het 10-dagenvenster kunnen worden bepaald. Er wordt geen groter volume aan testsuspensie genomen dan voor elke bepa ­
ling nodig is.
 
Voordat een monster wordt genomen worden zo nodig verliezen 
door verdamping uit de kolven aangevuld door toevoeging van ver ­
dunningswater (1.6.1) in de vereiste hoeveelheid. Voordat een mon ­
ster wordt onttrokken, wordt het kweekmedium grondig vermengd 
en wordt er zorg voor gedragen dat aan de wanden van de kolf hechtend materiaal wordt opgelost of gesuspendeerd.
 
Onmiddellijk nadat het monster is genomen wordt het met een mem ­
braan gefiltreerd of gecentrifugeerd (zie Bijlage II.4). De afgefil ­
treerde of gecentrifugeerde monsters worden op dezelfde dag ge ­
analyseerd dan wel gedurende maximaal 48 uur bij 2-4  o C of langere 
tijd beneden - 18  o C bewaard.  
II.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
II.3.1.  Verwerking van resultaten  
Het percentage afbraak op tijdstip t wordt berekend zoals aange ­
geven bij 1.7.1 (DOC-bepaling) en, eventueel, bij 1.7.2 (specifieke analyse).
 
Alle resultaten worden op de daartoe bestemde gegevensformulieren 
ingevuld.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Geldigheid van de resultaten  
Zie I.5.2.  
II.3.3.  Rapportage  
Zie I.8.  
II.4. GEGEVENSFORMULIER  
Hieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier.  
DOC-AFVLAKKINGSTEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST  
3. TESTSTOF  
Naam:  
Concentratie voorraadoplossing: … mg/l als teststof  
Beginconcentratie in het milieu, t  0 : … mg/l als teststof  
4. ENTMATERIAAL  
Herkomst:  
Uitgevoerde behandeling:  
Preconditionering, indien van toepassing:  
Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: 
mg/l 
5. KOOLSTOFBEPALINGEN  
Koolstofanalyse-apparaat:  
Kolf nr. DOC na n dagen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Teststof plus ent ­
materiaal 
1 a 1 
a 2 
a, gem. C  a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, gem. C  b(t) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Kolf nr. DOC na n dagen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Blanco entmateri ­
aal, zonder teststof 
3 c 1 
c 2 
c, gem. C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, gem. C  d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALUATIE VAN VERKREGEN GEGEVENS  
Kolf nr. % afbraak na n dagen 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Gem. (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Indien D  1 en D  2 te veel van elkaar verschillen, moet het gemiddelde niet berekend worden.  
Opmerking:  soortgelijke formules kunnen worden gebruikt voor de 
referentiestof en toxiciteitscontroles.  
7. NIET-BIOLOGISCHE CONTROLE  (facultatief)  
Tijd (dagen) 
0 t  
DOC.conc. (mg/l) in steriele controle C s(o) C s(t) 
% Niet Ä biologische afbraak  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFIEKE SCHEIKUNDIGE ANALYSE  (facultatief)  
resthoeveelheid teststof aan her 
einde van de test (mg/l) % primaire afbraak  
Steriele controle S  b ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
resthoeveelheid teststof aan her 
einde van de test (mg/l) % primaire afbraak  
Geënt testmedium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
DEEL III.  GEWIJZIGDE OESO-SCREENING TEST  
(Methode C.4-B)  
III.1. PRINCIPE VAN DE METHODE  
Een gemeten volume anorganisch medium dat een bekende concen ­
tratie teststof (10-40 mg DOC/1) als enige nominale bron van orga ­
nische koolstof bevat wordt geënt met 0,5 ml effluent per liter me ­
dium. Het mengsel wordt in het donker of in gedempt licht bij 22 ± 2
 o C belucht.  
De afbraak wordt gedurende 28 dagen met regelmatige tussenpozen 
gevolgd door middel van DOC-analyse. De mate van biologische afbraak wordt berekend doordat de concentratie verwijderde DOC (gecorrigeerd voor de waarde in de blanco-entmateriaalcontrole) 
wordt uitgedrukt als percentage van de aanvankelijk aanwezige con ­
centratie. De mate van primaire biologische afbraak kan ook worden berekend aan de hand van een aanvullende chemische analyse die aan het begin en aan het eind van de incubatie wordt uitgevoerd.
 
III.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
III.2.1. Apparatuur  
a) Erlenmeyerkolven, bv. 250 ml tot 2 l, afhankelijk van het voor 
DOC-analyse benodigde volume;  
b) Schudmachine — geschikt voor de erlenmeyers, hetzij met een 
automatische temperatuurregeling, hetzij gebruikt in een kamer met constante temperatuur, en met een zodanig vermogen dat 
in alle kolven aërobe omstandigheden kunnen worden gehand ­
haafd;
 
c) Filtratie-apparatuur met geschikte membranen;  
d) DOC-analyse-apparaat;  
e) Apparatuur voor het bepalen van opgeloste zuurstof;  
f) Centrifuge.  
III.2.2.  Bereiding van anorganisch medium  
Zie voor de bereiding van de voorraadoplossing I.6.2.  
10 ml van oplossing a) wordt gemengd met 800 ml verdunnings ­
water, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen b) t/m d) toegevoegd en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.
 
Bij deze methode wordt slechts 0,5 ml effluent/liter als entmateriaal 
gebruikt en daarom kan het nodig zijn het medium te versterken met spoorelementen en groeifactoren. Dit geschiedt door toevoeging van 
1 ml van elk van de onderstaande oplossingen per liter uiteindelijk 
medium:
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Spoorelementoplossing: 
Mangaansulfaat-tetrahydraat, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Boorzuur, H  3 BO 3 57,2 mg 
Zinksulfaat-heptahydraat, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Ammoniumheptamolybdaat, (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Fe-chelaat (FeCl  3 -ethyleendiaminetetraazijnzuur) 100,0 mg 
Deze stoffen worden opgelost in verdunningswater en 
de oplossing wordt tot 1 000 ml met verdunnings ­
water aangevuld. 
Vitamine-oplossing: Gistextract 15,0 mg
 
Het gistextract wordt opgelost in 100 ml verdunningswater De op ­
lossing wordt gesteriliseerd door filtratie door een membraan van 0,2 
micron of vers bereid.  
III.2.3.  Bereiding en preconditionering van entmateriaal  
Het entmateriaal is afkomstig van het secundaire effluent van een 
zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Zie I.6.4.2 en I.6.5.
 
Hiervan wordt 0,5 ml per liter mineraal medium gebruikt.  
III.2.4.  Bereiding van de proefoplossingen  
Bij wijze van voorbeeld worden porties van 800 ml anorganisch 
medium in erlenmeyers van 2 liter gebracht en wordt in de afzon ­
derlijke kolven telkens een zodanig volume aan voorraadoplossingen van teststof en referentiestof toegevoegd dat een concentratie met een chemisch equivalent van 10-40 mg DOC/1 wordt verkregen. De pH- 
waarden worden gecontroleerd en, zonodig, op 7,4 bijgesteld. De 
kolven worden geënt met rioolwaterzuiveringseffluent in een hoe ­
veelheid van 0,5 ml/liter (zie I.6.4.2). Tevens worden controles voor entmateriaal in het anorganische medium bereid zonder test- 
of referentiestof.
 
Zo nodig wordt één kolf gebruikt om de eventuele remmende wer ­
king van een teststof te controleren door het enten van een oplossing 
die in het anorganische medium vergelijkbare concentraties van zo ­
wel de teststof als de referentiestof bevat.  
Tevens wordt, indien nodig, een volgende steriele kolf ingericht voor 
de controle op de eventuele niet-biologische afbraak van de teststof 
door toepassing van een niet-geënte oplossing van de stof (zie I.6.6).  
Indien het vermoeden bestaat dat de teststof in belangrijke mate op 
glas, slib o.i.d. wordt geadsorbeerd, wordt bovendien in een voor ­
afgaand onderzoek de waarschijnlijke mate van adsorptie en daarmee de geschiktheid van de test voor de desbetreffende stof bepaald (zie Tabel 1). Hiertoe wordt een kolf met de teststof, het entmateriaal en 
het steriliserend middel bereid.
 
In alle kolven wordt het volume met anorganisch medium tot 1 l 
aangevuld en na mengen wordt uit elke kolf een monster 
genomen ter bepaling van de beginconcentratie aan DOC (zie 
Bijlage II.4). De openingen van de kolven worden afgedekt, bijvoor ­
beeld met aluminiumfolie, zodanig dat er een ongehinderde uitwis ­
seling van lucht tussen de kolf en de omgevende atmosfeer kan 
plaatsvinden. Vervolgens worden de kolven op de schudmachine 
geplaatst en kan de test beginnen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Aantal kolven in een doorsneeproef  
Kolven 1 en 2: testsuspensie  
Kolven 3 en 4: entmateriaalblanco  
Kolf 5: procedurecontrole  
en bij voorkeur en zo nodig:  
Kolf 6: abiotische steriele controle  
Kolf 7: adsorptiecontrole  
Kolf 8: toxiciteitscontrole  
Zie ook I.6.7.  
III.2.6.  Uitvoering van de test  
Gedurende de test worden met bepaalde tussenpozen de concentra ­
ties aan DOC in elke kolf in duplo bepaald, en wel zo vaak dat het begin van het 10-dagenvenster en het percentage verwijdering aan het eind van het 10-dagenvenster kunnen worden bepaald. Er wordt 
geen groter volume aan testsuspensie genomen dan voor elke bepa ­
ling nodig is.
 
Voordat een monster wordt genomen worden zo nodig verliezen 
door verdamping uit de kolven aangevuld door toevoeging van ver ­
dunningswater (I.6.1) in de vereiste hoeveelheid. Voordat een mon ­
ster wordt onttrokken wordt het kweekmedium grondig vermengd en wordt er zorg voor gedragen dat aan de wanden van de kolf hech ­
tend materiaal wordt opgelost of gesuspendeerd. Onmiddellijk nadat 
het monster is genomen wordt het met een membraan gefiltreerd of gecentrifugeerd (zie Bijlage II.4). De afgefiltreerde of gecentrifu ­
geerde monsters worden op dezelfde dag geanalyseerd dan wel ge ­
durende maximaal 48 uur bij 2-4
 o C of langere tijd beneden - 18  o C 
bewaard.  
III.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
III.3.1.  Verwerking van de resultaten  
Het percentage afbraak op tijdstip t wordt berekend zoals aange ­
geven bij I.7.1 (DOC-bepaling) en, eventueel, bij I.7.2. (specifieke 
analyse).  
Alle resultaten worden op de daartoe bestemde gegevensformulieren 
ingevuld.  
III.3.2. Geldigheid van de resultaten  
Zie I.5.2.  
III.3.3. Rapportage  
Zie I.8.  
III.4. GEGEVENSFORMULIER  
Hieronder wordt een voorbeeld van een gegevensformulier gegeven.  
GEWIJZIGDE OESO-SCREENING TEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. TESTSTOF  
Naam:  
Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststof  
Beginconcentratie in het milieu, t  0 : mg/l als teststof  
4. ENTMATERIAAL  
Herkomst:  
Uitgevoerde behandeling:  
Preconditionering, indien van toepassing:  
Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: 
mg/l 
5. KOOLSTOFBEPALINGEN  
Koolstofanalyse-apparaat:  
Kolf nr. DOC na n dagen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Teststof plus ent ­
materiaal 
1 a 1 
a 2 
a, gem. 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, gem. 
C b(t) 
Blanco entmateri ­
aal, zonder teststof 
3 c 1 
c 2 
c, gem. C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, gem. 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALUATIE VAN VERKREGEN GEGEVENS  
Kolf nr. % afbraak na n dagen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Kolf nr. % afbraak na n dagen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Gem. (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Indien D  1 en D  2 te veel van elkaar verschillen, moet het gemiddelde niet berekend worden.  
Opmerking:  soortgelijke formules kunnen worden gebruikt voor de 
referentiestof en toxiciteitscontroles.  
7. NIET-BIOLOGISCHE CONTROLE  (facultatief)  
Tijd (dagen) 
0 t  
DOC-conc. (mg/l) in steriele controle C s(o) C s(t) 
% niet Ä biologische afbraak  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPECIFIEKE SCHEIKUNDIGE ANALYSE  (facultatief)  
resthoeveelheid teststof aan her 
einde van de test (mg/l) % primaire afbraak  
Steriele controle S  b 
Geënt testmedium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
DEEL IV. KOOLDIOXYDE CO  2 -ONTWIKKELINGTEST. 
(Methode C.4-C)  
IV.1. PRINCIPE VAN DE METHODE  
Een gemeten volume geënt anorganisch medium dat een bekende 
concentratie teststof (10-20 mg DOC of TOC/l) als enige nominale bron van organische koolstof bevat wordt belucht door doorleiden van kooldioxydevrije lucht met een geregelde snelheid, in het donker 
of in gedempt licht. De afbraak wordt gedurende 28 dagen gevolgd 
door bepaling van het geproduceerde kooldioxyde dat in barium- of natriumhydroxyde wordt afgevangen en door titratie van het reste ­
rende hydroxyde of als anorganische koolstof wordt gemeten. De 
hoeveelheid geproduceerd kooldioxyde uit de teststof (gecorrigeerd 
voor datgene dat afkomstig is van het blanco entmateriaal) wordt uitgedrukt als een percentage van ThCO
 2 . De mate van biologische 
afbraak kan ook worden berekend aan de hand van een aanvullende 
DOC-analyse die aan het begin en aan het eind van de incubatie 
wordt uitgevoerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
IV.2.1.  Apparatuur  
a) Kolven, inhoud 2-5 liter, elk voorzien van een beluchtingsbuis 
die tot onder in de kolf reikt en een uitgang;  
b) Magneetroerders, indien slecht oplosbare stoffen worden bepaald;  
c) Gas-absorptieflessen;  
d) Inrichting voor het regelen en meten van de luchtstroom;  
e) Apparatuur voor het uitwassen van kooldioxyde, voor het berei ­
den van lucht die vrij is van kooldioxyde; in plaats daarvan kan 
een mengsel van CO  2 -vrije zuurstof en CO  2 -vrije stikstof uit 
gascilinders in de juiste verhouding (20 % O  2 : 80 % N  2 ) worden 
gebruikt;  
f) Inrichting voor het bepalen van kooldioxyde, hetzij titrimetrisch 
hetzij met behulp van een of ander analyse-apparaat voor anorga ­
nische koolstof;  
g) Inrichting voor membraanfiltratie (facultatief);  
h) DOC-analyse-apparaat (facultatief).  
IV.2.2.  Bereiding van anorganisch medium  
Zie voor de bereiding van de voorraadoplossingen, I.6.2.  
10 ml van oplossing a) wordt gemengd met 800 ml verdunnings ­
water, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen b) t/m d) toegevoegd en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 l aangevuld.
 
IV.2.3.  Bereiding en preconditionering van entmateriaal  
Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, 
behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan.  
Zie I.6.4,I.6.4.1, I.6.4.2 en I.6.5.  
IV.2.4.  Bereiding van de proefoplossingen  
Bij wijze van voorbeeld geven de onderstaande volumes en gewich ­
ten de waarden aan voor 5-literkolven die 3 1 suspensie bevatten. 
Indien kleinere volumes worden gebruikt, worden de waarden dien ­
overeenkomstig aangepast, maar er dient op te worden toegezien dat het gevormde kooldioxyde nauwkeurig kan worden gemeten.
 
In elke 5-literkolf wordt 2 400 ml anorganisch medium gebracht. 
Daaraan wordt een zodanig volume van het bereide actieve slib 
(zie I.6.4.1 en I.6.5) toegevoegd dat een concentratie aan gesuspen ­
deerde deeltjes van niet meer dan 30 mg/l in het uiteindelijke 3 1 geënt mengsel wordt verkregen. In plaats daarvan kan eerst het bereide slib worden verdund tot een suspensie van 500-1 000 mg/l 
in het anorganische medium voordat een berekende hoeveelheid 
daarvan aan de 2 400 ml anorganisch medium in de 5-literkolf wordt toegevoegd om een concentratie van 30 mg/l in het uiteindelijke 3 1 proefvolume te verkrijgen. Dit gaat gepaard met een grotere nauw ­
keurigheid. Ook andere bronnen van entmateriaal kunnen worden 
gebruikt (zie I.6.4.2).
 
De geënte mengsels worden gedurende een nacht belucht met 
CO 2 -vrije lucht zodat kooldioxyde uit het systeem wordt verwijderd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
In telkens een aantal gelijke kolven worden afzonderlijk testmateriaal 
en referentiestof als gekende volumes voorraadoplossingen toege ­
voegd tot concentraties als gevolg van de toegevoegde stoffen van 10 tot 20 mg DOC of TOC/1; enkele kolven blijven zonder toevoe ­
ging van chemicaliën en dienen als controle op het entmateriaal. 
Slecht oplosbare teststoffen worden rechtstreeks in de kolven ge ­
bracht op basis van gewicht of volume of worden behandeld als beschreven in Bijlage III.
 
Zo nodig wordt één kolf gebruikt voor de controle op het eventuele 
remmende effect van de teststof waarbij zowel de teststof als de 
referentiestof in dezelfde concentraties als in de andere kolven wor ­
den toegevoegd.  
Tevens wordt indien nodig een steriele kolf gebruikt voor de con ­
trole op de eventuele niet-biologische afbraak van de teststof, waarbij 
een niet-geënte oplossing van de stof wordt gebruikt (zie I.6.6). Steriliseren door toevoeging van een giftige stof met de geschikte concentratie.
 
Het volume van de suspensies wordt in alle kolven aangevuld tot 3 1 
door toevoeging van anorganisch medium dat vooraf met CO  2 -vrije 
lucht is belucht. Eventueel kunnen monsters worden getrokken voor 
analyse van DOC (zie Bijlage II.4) en/of specifieke analyse. De 
absorptieflessen worden aangesloten op de luchtuitgangen van de kolven.
 
Indien bariumhydroxyde wordt gebruikt, worden drie absorptiekol ­
ven, die elk 100 ml 0,0125 M bariumhydroxyde-oplossing bevatten, 
in serie op elke 5-literkolf aangesloten. De oplossing moet vrij van neergeslagen sulfaat en carbonaat zijn en de concentratie moet vlak voor gebruik worden bepaald. Indien natriumhydroxyde wordt ge ­
bruikt, worden twee vallen aangesloten, waarbij de tweede dient als 
controle om aan te tonen dat alle kooldioxyde in de eerste is ge ­
absorbeerd. Bruikbaar zijn absorptiekolven die zijn voorzien van sluitingen voor serumflessen. In elke kolf wordt 200 ml 0,05 M 
natriumhydroxyde gebracht, welke hoeveelheid voldoende is voor 
het absorberen van de totale hoeveelheid kooldioxyde die bij vol ­
ledige afbraak van de teststof wordt ontwikkeld. De natriumhydroxy ­
de-oplossing zal echter, zelfs indien deze vers is bereid, sporen 
carbonaten bevatten; dit wordt gecorrigeerd door aftrek van het car ­
bonaat in de blanco.
 
IV.2.5.  Aantal kolven in een doorsneeproef  
Kolven 1 en 2: testsuspensie  
Kolven 3 en 4: entmateriaalblanco  
Kolf 5: procedurecontrole  
en bij voorkeur en zo nodig:  
Kolf 6: abiotische steriele controle  
Kolf 7: toxiciteitscontrole  
Zie ook I.6.7.  
IV.2.6.  Uitvoering van de test  
De test wordt gestart doordat CO  2 -vrije lucht met een snelheid van 
30-100 ml/min door de suspensies wordt geborreld. Van tijd tot tijd 
worden monsters van het kooldioxyde absorberende materiaal ge ­
nomen voor analyse van het CO  2 -gehalte. Tijdens de eerste tien 
dagen verdient het aanbeveling elke tweede of derde dag analyses 
uit te voeren en vervolgens elke vijfde dag tot de 28stc dag zodat het 
10-dagenvenster kan worden vastgesteld.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Op de 28ste dag worden (indien van toepassing) monsters getrokken 
voor DOC-analyse en/of specifieke analyse, wordt de pH van de 
suspensies gemeten en wordt aan elke kolf 1 ml geconcentreerd zoutzuur toegevoegd; de kolven worden gedurende een nacht belucht teneinde het in de testsuspensies aanwezige kooldioxyde te verdrij ­
ven. Op dag 29 wordt de laatste analyse van vrijgekomen kooldi ­
oxyde gemaakt.
 
Op de dagen van CO  2 -meting wordt de absorptiefles voor barium ­
hydroxyde die het dichtst bij de kolf staat, losgekoppeld en wordt de 
hydroxyde-oplossing getitreerd met 0,05 M HC1 met fenolftaleïne 
als indicator. De overige absorptieflessen worden een plaats dichter bij de kolf gebracht en er wordt een nieuwe absorptiefles met daarin 100 ml vers 0,0125 M bariumhydroxyde aan het eind van de reeks 
geplaatst. De titraties worden uitgevoerd wanneer dat nodig is, bij ­
voorbeeld wanneer in de eerste val een aanzienlijke hoeveelheid neerslag wordt waargenomen en voordat er in de tweede val een duidelijke neerslag is, of ten minste wekelijks. In het andere geval 
wordt, wanneer NaOH absorptiemiddel is, met een spuit een klein 
monster (afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte koolstof- analysator) van de natriumhydroxyde-oplossing in de absorptiefles die het dichtst bij de kolf staat, getrokken. Het monster wordt in 
het IC-gedeelte van het koolstofanalyse-apparaat gespoten en recht ­
streeks geanalyseerd op ontwikkelde kooldioxyde.
 
De inhoud van de tweede val wordt alleen aan het eind van de test 
geanalyseerd ter correctie van eventuele overdracht van kooldioxyde.  
IV.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
IV.3.1.  Verwerking van de resultaten  
De hoeveelheid in een absorptiefles afgevangen CO  2 die wordt 
getitreerd komt overeen met:  
mg CO  2 = (100 × C  B –0,5 × V × C  A ) × 44  
waarin:  
V = volume HCl dat is gebruikt voor het titreren van de 100 ml 
in de absorptiefles (ml),  
C B = concentratie bariumhydroxyde-oplossing (M),  
C A = concentratie zoutzuuroplossing (M),  
en, indien C  B 0,0125 M en C  A 0,05 M is, is de getitreerde hoeveel ­
heid voor 100 ml bariumhydroxyde 50 ml en wordt het gewicht aan CO
 2 gegeven door:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCl getitreerd  ¼ 1; 1 Ü ml HCl  
In dit geval bedraagt dus de factor voor het herleiden van het ge ­
titreerde volume HCl tot geproduceerde mg CO  2 1,1. 
Het CO  2 -gewicht dat afkomstig is uit alleen het entmateriaal en dat 
wat afkomstig is van het entmateriaal plus de teststof worden bere ­
kend met de desbetreffende titratiewaarden en het verschil is het gewicht aan CO
 2 dat alleen door de teststof is geproduceerd.  
Indien bijvoorbeeld het entmateriaal alleen een titratie van 48 ml en 
het entmateriaal plus teststof 45 ml geeft, dan geldt:  
CO 2 uit entmateriaal = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 uit entmateriaal plus teststof = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg  
en derhalve bedraagt het gewicht aan CO  2 dat door teststof is pro ­
duceerd 3,3 mg.  
Het percentage biologische afbraak wordt berekend uit:  
% afbraak ¼ mg CO  2 geproduceerd Ü 100 
ThCO  2 Ü mg toegevoegde teststof  
of, 
% afbraak ¼ mg CO  2 geproduceerd Ü 100 
mg TOC toegevoegd in test  Ü 3; 67 
waarbij 3,67 de omrekeningsfactor (44/12) van koolstof naar kool ­
dioxyde is.  
Het percentage afbraak na elk tijdsinterval wordt verkregen door 
optellen van het percentage van ThCO  2 -waarden dat voor elk van 
de dagen, tot het tijdstip waarop het is gemeten, is berekend.  
Voor natriumhydroxyde-absorptieflessen wordt de hoeveelheid ge ­
produceerd kooldioxyde berekend en uitgedrukt als IC (mg) door vermenigvuldiging van de concentratie IC in het absorptiemiddel met het volume van het absorptiemiddel.
 
Het percentage afbraak wordt berekend uit:  
% of ThCO  2 ¼ mg IC uit testkolf  Ä mg IC uit blanco 
MG TOC toegevoegd als teststof  Ü 100 
De verwijdering van DOC (indien van toepassing) wordt berekend 
zoals beschreven onder 1.7. Deze en alle andere resultaten worden 
op het beschikbare gegevensformulier vermeld.  
IV.3.2.  Geldigheid van de resultaten  
Het IC-gehalte van de suspensie van teststof in het anorganische 
medium aan het begin van de test moet minder dan 5 % bedragen 
van de TC en de totale CO  2 -ontwikkeling in de entmateriaal-blanco 
aan het eind van de test mag doorgaans niet meer dan 40 mg/l medium bedragen. Indien waarden van meer dan 70 mg CO
 2 /1 wor­
den verkregen, dienen de gegevens en de proefopzet kritisch te 
worden onderzocht.  
Zie ook I.5.2.  
IV.3.3.  Rapportage  
Zie I.8.  
IV.4. GEGEVENSFORMULIER  
Hieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier.  
KOOLDIOXYDE (CO  2 ) -ONTWIKKELINGTEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST  
3. TESTSTOF  
Naam:  
Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststof  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Beginconcentratie in het milieu: mg/l als teststof  
Totale C aan kolf toegevoegd: mg C  
ThCO  2 : mg CO  2 
4. ENTMATERIAAL  
Herkomst:  
Uitgevoerde behandeling:  
Preconditionering, indien van toepassing:  
Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: 
mg/l 
5. KOOLDIOXYDEPRODUKTIE EN AFBREEKBAAR ­
HEID:  
Methode: Ba(OH)  2 /NaOH/andere  
Tijd 
(dag) Gevormde CO  2 
test (mg) Gevormde CO  2 
blanco (mg) Gevormde CO  2 
cumulatief (mg) 
(test minus blanco 
gem.) % ThCO  2 
CumulatiefCO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 gem 3 
4 gem. 1 2 1 2 gem.  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Opmerking:  soortgelijke schema's kunnen worden gebruikt voor de 
referentiestof en voor toxiciteitscontroles.  
6. KOOLSTOFANALYSE  (facultatief)  
Koolstofanalyse-apparaat:  
Tijd (dag) Blanco mg/l Teststof mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) of aan het eind van de incubatie  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% DOC verwijderd  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. NIET-BIOLOGISCHE AFBRAAK  (facultatief) 
% niet Ä biologische afbraak  ¼ CO  2 vorming in steriele kolf na 28 dagen  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
DEEL V.  MANOMETRISCHE RESPIROMETRIETEST  
(Methode C.4-D)  
V.1. PRINCIPE VAN DE METHODE  
Een gemeten volume geënt anorganisch medium dat een bekende 
concentratie teststof (100 mg/l teststof die ten minste 50-100 mg ThOD/l geeft) als enige nominale bron van organische koolstof be ­
vat, wordt gedurende ten hoogste 28 dagen in een gesloten kolf bij 
een constante temperatuur (± 1
 o C of minder) geroerd. Het gebruik 
aan zuurstof wordt bepaald hetzij door meten van hoeveelheid zuur ­
stof (elektrolytisch geproduceerd) die nodig is om in de respirome ­
terkolf een constant gasvolume te behouden, hetzij op grond van de 
verandering van het volume of van de druk (of een combinatie daar ­
van) in de apparatuur. Ontwikkelde kooldioxyde wordt geabsorbeerd in een oplossing van kaliumhydroxyde of een ander geschikt absorp ­
tiemiddel. De hoeveelheid door de teststof opgenomen zuurstof (ge ­
corrigeerd voor opneming door de parallel behandelde blanco-ent ­
stof) wordt uitgedrukt als percentage ThOD of COD. Facultatief kan de primaire biologische afbraak worden berekend uit de aanvullende specifieke analyse die aan het begin en aan het einde van de incu ­
batie wordt uitgevoerd, en de totale afbraak door DOC-analyse.
 
V.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
V.2.1.  Apparatuur  
a) geschikte respirometer;  
b) temperatuurregeling, constant op ± 1  o C of beter;  
c) membraan-filtratie-inrichting (facultatief);  
d) koolstof analyse-apparaat (facultatief).  
V.2.2.  Bereiding van anorganisch medium  
Zie voor de bereiding van de voorraadoplossingen I.6.2.  
10 ml van oplossing a) wordt gemengd met 800 ml verdunnings ­
water, daaraan wordt 1 ml van de oplossingen b) t/m d) toegevoegd 
en het geheel wordt met verdunningswater tot 1 1 aangevuld.  
V.2.3.  Bereiding en preconditionering van entmateriaal  
Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib, 
behandeld water, oppervlaktewater en grond of een mengsel daarvan.  
Zie I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. en I.6.5.  
V.2.4.  Bereiding van de proefoplossingen  
Oplossingen van de teststof en referentiestof worden afzonderlijk in 
anorganisch medium, uitgaande van voorraadoplossingen, bereid in een hoeveelheid die doorgaans overeenkomt met een concentratie 
van 100 mg chemische stof/l (overeenkomend met ten minste 50- 
100 mg ThOD/1),
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Het ThOD wordt berekend op basis van de vorming van ammoni ­
umzouten, tenzij nitrificatie moet worden verwacht, in welk geval de 
berekening moeten worden gebaseerd op nitraatvorming (zie Bijlage II.2).
 
De pH-waarden worden bepaald en zonodig bijgesteld op 7,4 ± 0,2.  
Slecht oplosbare stoffen dienen pas in een later stadium te worden 
toegevoegd (zie hieronder).  
Indien de giftigheid van de teststof moet worden bepaald, wordt nog 
een oplossing in anorganisch medium bereid welke zowel de teststof 
als de referentiestof in dezelfde concentraties als in de afzonderlijke oplossingen bevat.
 
Indien meting van de fysisch-chemische zuurstofopname nodig is, 
wordt een oplossing van de teststof die door toevoeging van een 
geschikte giftige stof gesteriliseerd is (zie I.6.6) in een hoeveelheid van gewoonlijk 100 mg ThOD/1 bereid.
 
Het benodigde volume van oplossingen van de teststof en de refe ­
rentiestof wordt ten minste in duplo in kolven gebracht. In volgende 
kolven wordt alleen anorganisch medium gebracht (voor entstof con ­
troles) en, zo nodig, de gemengde oplossing van teststof en refe ­
rentiestof en de steriele oplossing.  
Indien de teststof slecht oplosbaar is wordt deze in dit stadium recht ­
streeks toegevoegd op basis van gewicht of volume of wordt deze 
behandeld als beschreven in Bijlage III. Aan de compartimenten van 
het CO  2 -absorptie-apparaat worden kaliumhydroxyde, natronkalkpil ­
len of een ander absorptiemiddel toegevoegd.  
V.2.5.  Aantal kolven in een doorsnee-proef  
Kolven 1 en 2: testsuspensie  
Kolven 3 en 4: entmateriaalblanco  
Kolf 5: procedurecontrole  
bij voorkeur en zo nodig:  
Kolf 6: steriele controle  
Kolf 7: toxiciteitscontrole  
Zie I.6.7.  
V.2.6.  Uitvoering van de test  
De kolven worden op de gewenste temperatuur gebracht en de daar ­
toe bestemde kolven worden geënt met bereid actief slib of een 
andere bron van entmateriaal tot een concentratie aan gesuspen ­
deerde vaste stof van niet meer dan 30 mg/l. De apparatuur wordt in gereedheid gebracht, de roerder wordt aangezet, het geheel wordt 
gecontroleerd op luchtdichtheid en de meting van de zuurstofopname 
wordt gestart. Gewoonlijk is dan geen verdere aandacht nodig be ­
halve voor de nodige aflezingen en voor de dagelijkse controle op de juiste temperatuur en het juiste roeren.
 
De zuurstofopname wordt met behulp van de door de fabrikant van 
de apparatuur verstrekte methoden berekend uit de met regelmatige 
tussenpozen verrichte aflezingen. Aan het eind van de incubatie, gewoonlijk na 28 dagen, wordt de pH van de inhoud van de kolven gemeten, in het bijzonder indien de opgenomen hoeveelheid zuurstof 
lager is danwel hoger is dan ThOD
 NH4 (voor stikstof bevattende 
verbindingen).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Indien nodig worden aan het begin en aan het eind monsters uit de 
respirometerkolven genomen voor analyse van DOC of specifieke 
chemische stof (zie Bijlage II.4). Bij monsterneming aan het begin dient er voor te worden gezorgd dat het volume van de in de kolf achterblijvende testsuspensie bekend is. Wanneer door een N-bevat ­
tende teststof zuurstof wordt opgenomen, wordt de toename van de 
concentratie nitriet en nitraat in 28 dagen bepaald en wordt de cor ­
rectie voor de door nitrificatie verbruikte zuurstof berekend (Bijlage V).
 
V.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
V.3.1.  Verwerking van de resultaten  
De opgenomen hoeveelheid zuurstof (mg) van de teststof na een be ­
paalde tijd (die is gecorrigeerd voor de blanco entstofcontrole na de ­
zelfde tijd) wordt gedeeld door het gewicht van de onderzochte teststof. Dit geeft het BOD die is uitgedrukt als mg zuurstof/mg teststof, d.w.z.
 
BOD ¼ ðmg O  2 opname door teststof  Ä mg O  2 opname door blanco Þ 
ðmg teststof in kolf  Þ 
= mg O  2 per mg teststof.  
Het percentage biologische afbraak wordt berekend hetzij uit:  
% biologische afbraak  ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg stof Þ 
ThODðmg O  2 stof Þ Ü 100 
hetzij uit  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg stof Þ 
CODðmg O  2 stof Þ Ü 100 
Opgemerkt dient te worden dat deze twee methoden niet noodzake ­
lijk dezelfde waarde geven; bij voorkeur wordt de eerstgenoemde methode gebruikt.
 
Voor teststoffen die stikstof bevatten wordt het geschikte ThOD 
(NH  4 of NO  3 ) gebruikt, afhankelijk van hetgeen bekend is of ver ­
wacht wordt omtrent het optreden van nitrificatie (Bijlage II.2). In ­
dien nitrificatie optreedt maar niet volledig is, wordt uit de verande ­
ring in concentraties nitriet en nitraat een correctie berekend voor de 
door de nitrificatie verbruikte zuurstof (Bijlage V).  
Wanneer facultatieve bepalingen van organische koolstof en/of spe ­
cifieke chemische stof worden uitgevoerd, wordt het percentage af ­
braak berekend zoals beschreven is onder I.7.  
Alle resultaten worden op de bijgevoegde gegevensformulieren ver ­
meld.  
V.3.2.  Geldigheid van de resultaten  
De hoeveelheid opgenomen zuurstof van de entmateriaalblanco be ­
draagt normaal 20-30 mg O  2 /l en mag in 28 dagen niet groter zijn 
dan 60 mg/l. Waarden hoger dan 60 mg/l nopen tot een kritisch 
onderzoek van de gegevens en de experimentele technieken. Indien de pH-waarde buiten het gebied 6-8,5 ligt en het zuurstofverbruik door de reststof minder dan 60 % bedraagt, dient de test te worden 
herhaald met een lagere concentratie teststof.
 
Zie ook I.5.2.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Rapportage  
Zie I.8.  
V.4. GEGEVENSFORMULIER  
Hieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier.  
MANOMETRISCHE RESPIROMETRIETEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST  
3. TESTSTOF  
Naam:  
Concentratie voorraadoplossing: … mg/l  
Beginconcentratie in het milieu, C  o : … mg/l  
Volume in de testkolf (V): … ml  
ThOD stof/COD stof: … mg O  2 /mg (NH  4 , NO  3 ) 
4. ENTMATERIAAL  
Herkomst:  
Uitgevoerde behandeling:  
Preconditionering, indien van toepassing:  
Concentratie van gesuspendeerde vaste stof in reactiemengsel: 
mg/l 
5. ZUURSTOFOPNAME: BIOLOGISCHE AFBREEKBAAR ­
HEID  
Zeit (Tage) 
0 7 14 21 28  
O 2 opname 
(mg) teststof 1 
2 
a, gem. 
O 2 opname 
(mg) blanco 3 
4 
b, gem. 
Gecorrigeerde 
BOD (mg) (a 1 — b  m ) 
(a 2 — b  m ) 
BOD per mg 
teststof ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Zeit (Tage) 
0 7 14 21 28  
% afbraak  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
gem. (*)  
V = volume medium in testkolf. 
(*) Indien D  1 en D  2 te veel van elkaar verschillen, moet het gemiddelde niet berekend worden.  
N.B.: Soortgelijke schema's kunnen worden gebruikt voor de refe ­
rentiestof en de toxiciteitscontroles.  
6. CORRECTIE VOOR NITRIFICATIE  (zie Bijlage V)  
Dag 0 28 Verschil  
(i) Concentratie nitraat (mg N/l) (N) 
(ii) Zuurstofequivalent (4,57 × N × V) (mg) — — (iii) Concentratie nitriet (mg N/l) (N) 
(iv) Zuurstofequivalent (3,43 × N × V) (mg) — — 
(ii + iv) Totaal zuurstofequivalent — —
 
7. KOOLSTOFANALYSE  (facultatief)  
Koolstofanalyseapparaat:  
Tijd (dag) Blanco mg/l Teststof mg/1  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) of aan het eind van de incubatie  
% DOC verwijderd  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100 
8. SPECIFIEKE CHEMISCHE ANALYSE  (facultatief)  
S b = concentratie in fysisch-chemische (steriele) controle na 28 
dagen.  
S a = concentratie in de geënte kolf na 28 dagen.  
% biologische afbraak  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. NIET-BIOLOGISCHE AFBRAAK  (facultatief)  
a = zuurstofverbruik in steriele kolven na 28 dagen, (mg)  
Zuurstofverbruik per mg teststof  ¼ a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(zie afdelingen 1 en 3)  
% niet Ä biologische afbraak  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
DEEL VI.  GESLOTEN-FLESTEST  (Methode C.4-E)  
VI.1. PRINCIPE VAN DE METHODE  
De oplossing van de teststof in anorganisch medium, doorgaans met 
een concentratie van 2-5 mg/l, wordt geënt met een betrekkelijk 
gering aantal micro-organismen uit een gemengde populatie en wordt 
bij constante temperatuur in het donker in volledig gevulde, afgeslo ­
ten flessen gehouden. De afbraak wordt gevolgd door analyse van opgeloste zuurstof gedurende 28 dagen. De door de teststof opge ­
nomen hoeveelheid zuurstof, die wordt gecorrigeerd voor de opname 
door de parallel onderzochte blanco voor het entmateriaal, wordt uitgedrukt als percentage ThOD of COD.
 
VI.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
VI.2.1.  Apparatuur  
a) BOD-flessen met glazen stoppen, bv. 250-350 ml;  
b) Waterbad of broedapparaat, voor het op constante temperatuur 
(± 1  o C of beter) houden van de flessen, met uitsluiting van licht;  
c) Grote glazen flessen (2-5 l) voor de bereiding van medium en 
voor het aanvullen van de BOD-flessen;  
d) Zuurstofelektrode en meter, of apparatuur en reagentia voor Win ­
kler-titratie.  
VI.2.2.  Bereiding van anorganisch medium  
Zie voor de bereiding van de voorraadoplossing I.6.2.  
1 (een) ml van oplossingen a) t/m d) wordt gemengd en het mengsel 
wordt met verdunningswater tot 11 aangevuld.  
VI.2.3.  Bereiding van het entmateriaal  
Het entmateriaal is normaal afkomstig van het secundaire effluent 
van een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofd ­
zakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Een alternatieve bron van 
entmateriaal is oppervlaktewater. Gewoonlijk wordt één druppel 
(0,05 ml) tot 5 ml filtraat per liter medium gebruikt; voorafgaan ­
delijke proeven kunnen nodig zijn om het optimaal volume voor een gegeven effluent te bepalen (zie I.6.4.2 en I.6.5).
 
VI.2.4.  Bereiding van de proefoplossingen  
Anorganisch medium wordt gedurende ten minste 20 min krachtig 
belucht. Elke testreeks wordt met uit dezelfde voorraad afkomstig 
mineraal medium uitgevoerd. In het algemeen is het medium na 20 
uur staan bij de testtemperatuur voor gebruik gereed. Ter controle wordt de concentratie opgeloste zuurstof bepaald; de waarde dient bij 20
 o C ongeveer 9 mg/l te zijn. Alle overbreng- en aanvulhandelingen 
van het met lucht verzadigde medium dienen zonder bellen, bijvoor ­
beeld door gebruik van hevels, te worden uitgevoerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Voor de bepaling van de teststof en referentiestof in gelijktijdige 
proefseries worden parallelle groepen van BOD-flessen bereid. Een 
voldoende aantal BOD-flessen, waaronder entmateriaalblanco's wor ­
den gereed gemaakt zodat op de gewenste tijdstippen, bijvoorbeeld na 0, 7, 14, 21 en 28 dagen, ten minste duplo-metingen van het 
zuurstofgebruik kunnen worden gedaan. Om het 10-dagen venster 
met zekerheid te kunnen vaststellen kunnen meer flessen nodig zijn.
 
In grote flessen wordt volledig belucht anorganisch medium ge ­
bracht, zodanig dat de flessen voor ongeveer een derde gevuld zijn. 
Vervolgens wordt in afzonderlijke grote flessen zoveel van de voor ­
raadoplossingen van de teststof en referentiestof gebracht dat de uiteindelijke concentratie van de stoffen niet meer dan ongeveer 10 mg/l is. Aan het blancocontrolemedium dat in een andere grote 
fles aanwezig is, wordt geen chemische stof toegevoegd.
 
Teneinde zekerheid te geven dat de activiteit van het entmateriaal 
niet beperkend is, mag de concentratie opgeloste zuurstof in de BOD-flessen niet lager dan 0,5 mg/l zijn. Dit beperkt de concentratie 
van de teststof tot ongeveer 2 mg/l. Van slecht afbreekbare teststof ­
fen en van teststoffen met een lage ThOD kan echter 5-10 mg/l worden gebruikt. In sommige gevallen kan het raadzaam zijn twee parallelle reeksen van de teststof bij twee verschillende concentraties, 
bijvoorbeeld 2 en 5 mg/l uit te voeren. Als regel wordt de ThOD op 
grond van de vorming van ammoniumzouten berekend, maar indien verwacht wordt of bekend is dat nitrificatie optreedt, wordt de be ­
rekening uitgevoerd op basis van de vorming van nitraat (ThOD
 NO3 : 
zie Bijlage II.2). Indien nitrificatie evenwel niet volledig is of niet 
optreedt, wordt gecorrigeerd voor de veranderingen in concentratie nitriet en nitraat, zoals door analyse is vastgesteld (zie Bijlage V).
 
Indien de toxiciteit van de teststof moet worden onderzocht (bijvoor ­
beeld in het geval dat eerder een lage waarde voor de biologische afbreekbaarheid is gevonden) is een volgende reeks flessen nodig.
 
Een volgende grote fles wordt gevuld met belucht anorganisch me ­
dium (tot ongeveer een derde van het volume) plus teststof en refe ­
rentiestof met uiteindelijke concentraties die als regel dezelfde zijn als die in de andere grote flessen.
 
De oplossingen in de grote flessen worden met secundair effluent 
(een druppel of ongeveer 0,05 ml, tot 5 ml/l) of met een andere bron, 
zoals rivierwater geënt (zie I.6.4.2). Tenslotte worden de oplossingen met belucht anorganisch medium tot het eindvolume aangevuld met behulp van een hevel die met het oog op een voldoende menging tot 
op de bodem van de fles reikt.
 
VI.2.5.  Aantal kolven in een doorsneeproef  
In een doorsneebepaling worden de volgende flessen gebruikt:  
— ten minste 10 die teststof en entmateriaal bevatten (testsuspensie),  
— ten minste 10 met alleen entmateriaal (entmateriaalblanco),  
— ten minste 10 met referentiestof en entmateriaal (procedurecon ­
trole),  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— en, zonodig 6 flessen met teststof, referentiestof en entmateriaal 
(toxiciteitscontrole). Om zekerheid te geven dat het 10-dagen 
venster kan worden vastgesteld zal ongeveer het dubbele aantal flessen nodig zijn.
 
VI.2.6. Uitvoering van de test  
Elke bereide oplossing wordt met behulp van een hevel uit het 
onderste kwart (niet de bodem) van de desbetreffende grote fles onmiddellijk in de bijbehorende groep BOD-flessen overgebracht, zodat alle BOD-flessen volledig gevuld zijn. Er wordt zachtjes op 
de kolven geklopt om eventuele luchtbellen te verwijderen. De fles ­
sen van het tijdstip nul worden onmiddellijk op opgeloste zuurstof onderzocht met behulp van de Winkler-methode of met elektrode ­
methoden. De inhoud van de flessen kan met het oog op latere 
analyse via de Winkler-methode worden bewaard door toevoeging 
van mangaan(II)sulfaat en natriumhydroxyde (het eerste Winkler-rea ­
gens). De zorgvuldig afgesloten flessen die de zuurstof als bruin gehydrateerd mangaan(III)oxyde gefixeerd bevatten, worden gedu ­
rende niet langer dan 24 uur bij 10-20
 o C in het donker bewaard, 
voordat de overige stappen van de Winkler-methode worden uitge ­
voerd. De overige herhalingsflessen worden afgesloten zodanig dat er geen luchtbellen worden opgesloten en worden in het donker bij 
20
 o C geïncubeerd. Elke reeks moet vergezeld gaan van een vol ­
ledige parallelreeks voor de bepaling van het geënte blanco-medium. Voor analyse van opgelost zuurstof op gezette tijden (ten minste wekelijks) gedurende de bebroeding van 28 dagen wordt van elke 
reeks ten minste één duplofles genomen.
 
Wekelijkse monsterneming is voldoende voor de bepaling van het 
percentage verwijdering in een 14-dagenvenster, terwijl een bemon ­
stering om de 3-4 dagen het vaststellen van een 10-dagenvenster mogelijk maakt, waarbij ongeveer tweemaal zoveel flessen nodig zijn.
 
Voor stikstof bevattende teststoffen moeten correcties voor de door 
eventueel optredende nitrificatie veroorzaakte zuurstofopname wor ­
den uitgevoerd. Hiertoe wordt de methode met de O  2 -elektrode toe ­
gepast voor de bepaling van de concentratie opgeloste zuurstof, waarna uit de BOD-fles een monster wordt genomen voor analyse van nitriet en nitraat. Uit de toename van de concentratie nitriet en 
nitraat wordt de gebruikte hoeveelheid zuurstof berekend (zie 
Bijlage V).
 
VI.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
VI.3.1.  Verwerking van de resultaten  
Allereerst wordt het BOD dat na elk tijdstip is opgetreden berekend 
door aftrekken van de zuurstofafname (mg O  2 /l) van de entmateriaal- 
blanco van de afname als gevolg van de teststof. Deze gecorrigeerde afname wordt gedeeld door de concentratie (mg/l) van de teststof 
waarbij het specifieke BOD als mg zuurstof per mg teststof wordt 
verkregen. Het percentage biologische afbreekbaarheid wordt bere ­
kend door het specifieke BOD door het specifieke ThOD (dat is berekend volgens Bijlage II.2) of COD (door analyse bepaald, zie 
Bijlage II.3) te delen, dus:
 
BOD ¼ ðmg O  2 opname door teststof  Ä mg O  2 opname door blanco Þ 
ðmg teststof in kolf  Þ ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 per mg teststof.  
% afbraak ¼ BOD ðmg O  2=mg teststof Þ 
ThODðmg O  2=mg teststof Þ Ü 100 
ofwel  
% afbraak ¼ BOD ðmg O  2=mg teststof Þ 
CODðmg O  2=mg teststof Þ Ü 100 
Opgemerkt dient te worden dat deze twee methoden niet dezelfde 
uitkomst behoeven te geven; het gebruik van de eerste methode heeft de voorkeur.
 
Voor teststoffen die stikstof bevatten wordt het geschikte ThOD 
(NH  4 of NO  3 ) gebruikt, afhankelijk van hetgeen bekend is of ver ­
wacht wordt omtrent het optreden van nitrificatie (Bijlage II.2). In ­
dien nitrificatie optreedt maar niet volledig is, wordt uit de verande ­
ring in concentraties nitriet en nitraat een correctie berekend voor de door nitrificatie verbruikte zuurstof (zie Bijlage V).
 
VI.3.2.  Geldigheid van de resultaten  
De afname van de hoeveelheid zuurstof in de entmateriaal-blanco 
mag na 28 dagen niet meer dan 1,5 mg opgeloste zuurstof/l bedra ­
gen. Bij hogere waarden dan deze moeten de experimentele technie ­
ken worden doorgelicht. De restconcentratie zuurstof in de testflessen mag nooit minder dan 0,5 mg/l worden. Dergelijke lage zuurstof ­
concentraties zijn slechts geldig, indien met de methode waarmee 
opgeloste zuurstof wordt bepaald dergelijke concentraties nauwkeu ­
rig kunnen worden gemeten.
 
Zie ook I.5.2.  
VI.3.3.  Rapportage  
Zie I.8.  
VI.4. GEGEVENSFORMULIER  
Hieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier  
GESLOTEN-FLESTEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST  
3. TESTSTOF  
Naam:  
Concentratie voorraadoplossing: … mg/l  
Beginconcentratie in de fles: … mg/l  
ThOD/COD: … mg O  2 /mg teststof  
4. ENTMATERIAAL  
Herkomst:  
Uitgevoerde behandeling:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Preconditionering, indien van toepassing:  
Concentratie in reactiemengsel: ml/l  
5. DO-BEPALING  
Methode: Winkler/elektrode  
Analyses kolven  
Duur van incubatie (d) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Blanco (zonder stof) 1 C  1 
2 C  2 
Gem. 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Teststof 1 a  1 
2 a  2 
Gem. 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
N.B.:  Soortgelijke schema's kunnen worden gebruikt voor de refe ­
rentie-stof en de toxiciteitscontroles.  
6. CORRECTIE VOOR NITRIFICATIE  (zie Bijlage V)  
Duur van incubatie (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Concentratie nitraat (mg N/I) 
(ii) Verandering in nitraatconcentr. (mg N/l) — (iii) Zuurstofequivalent (mg/l) — 
(iv) Concentratie nitriet (mg N/l) 
(v) Verandering in nitrietconcentr. (mg N/l) — (vi) Zuurstofequivalent (mg/l) — (iii + vi) Totaal zuurstofequivalent (mg/l) —
 
7. DO-AFNAME: % AFBRAAK  
Afname na n dagen (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
FLES 1: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) 
FLES 2: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Afname na n dagen (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
FLES 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : test Ü ThOD stof 
FLES 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâñ100 
conc : test Ü ThOD stof 
% D gem. (*) =  D 1 þ D 2 
2 
(*) Indien D  1 en D  2 te veel van elkaar verschillen, moet het gemiddelde niet berekend worden.  
m to = waarde in de testkolf op tijdstip 0  
m tX = waarde in de testkolf op tijdstip x  
m bo = gem. blanco waarde op tijdstip 0  
m bx = gem. blanco waarde op tijdstip x  
Ook de correctie voor nitrificatie uit iii + vi in afdeling 6 dient te 
worden toegepast.  
8. BLANCO DO — AFNAME  
Zuurstofverbruik door blanco: (m  bo — m  b28 ) mg/l. Dit verbruik 
is van belang voor de geldigheid van de test. Het dient minder 
dan 1,5 mg/l te zijn.  
DEEL VII.  M.I.T.I.-TEST  (Methode C.4-F)  
VII.1. PRINCIPE VAN DE METHODE  
De zuurstofopname door een geroerde oplossing of suspensie van de 
teststof in een anorganisch medium dat met speciaal gekweekte, niet- 
aangepaste micro-organismen is geënt, wordt automatisch gedurende 
28 dagen bij 25 ± 1  o C in een verduisterde, afgesloten respirometer 
automatisch gemeten. Het vrijkomende kooldioxyde wordt door na ­
tronkalk geabsorbeerd. De biologische afbreekbaarheid wordt uit ­
gedrukt als het percentage zuurstofopname (gecorrigeerd voor op ­
name door de blanco) van de theoretische opname (ThOD). Het percentage primaire biologische afbreekbaarheid wordt ook berekend uit een aanvullende specifieke chemische analyse die aan het begin 
en aan het eind van de incubatie wordt uitgevoerd en verder, naar 
keuze, door middel van DOC-analyse.
 
VII.2. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
VII.2.1.  Apparatuur  
a) Automatische elektrolytische BOD-meter of respirometer, door ­
gaans uitgerust met 6 flessen, met elk 300 ml en voorzien van 
kommetjes die het absorptiemiddel voor CO  2 bevatten;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Kamer met constante temperatuur en/of waterbad van 25  o C ± 
1 o C of beter;  
c) Membraanfiltratie-eenheid (facultatief);  
d) Koolstof-analysator (facultatief).  
VII.2.2.  Bereiding van anorganisch medium  
De volgende voorraadoplossingen worden uitgaande van reagentia 
van analytische kwaliteit en water (I.6.1) bereid: 
a) Monokaliumdiwaterstoforthofosfaat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliummonowaterstoforthofosfaat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriummonowaterstoforthofosfaat-dodeca ­
hydraat Na  2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Ammoniumchloride, NH  4 Cl 1,70 g 
Deze stoffen worden in water opgelost en de op ­
lossingwordt tot 1 liter aangevuld. 
De pH-waarde van de oplossing dient 7,2 te zijn. 
b) Magnesiumsulfaat-heptahydraat, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
wordt in water opgelost en tot 1 liter aangevuld. 
c) Calciumchloride, watervrij, CaCl  2 27,50 g 
wordt in water opgelost en tot 1 liter aangevuld 
d) IJzer(III)chloride-hexahydraat, FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
wordt in water opgelost en tot 1 liter aangevuld  
Van elke oplossing a), b), c) en d) wordt 3 ml genomen en er wordt 
tot 1 liter aangevuld.  
VII.2.3.  Bereiding van entmateriaal  
Verse monsters worden verzameld op niet minder dan 10 locaties, 
voornamelijk in gebieden waar uiteenlopende chemicaliën worden gebruikt en geloosd. Van plaatsen zoals rioolwaterzuiveringsinstalla ­
ties, behandelingsinstallaties voor industrieel afvalwater, rivieren, 
plassen en zeeën worden monsters van 1 liter slib, oppervlakte ­
bodem, water e.d. verzameld en grondig dooreen gemengd. Na ver ­
wijdering van drijvend materiaal en bezinking wordt de boven ­
staande vloeistof met nutriumhydroxyde of fosforzuur op pH 7 ± 1 
gebracht.
 
Van de gefiltreerde bovenstaande vloeistof wordt een voldoende 
volume genomen voor het vullen van een actief-slibtank van het 
vul-en-loop-type en de vloeistof wordt ongeveer 23,5 uur belucht. Dertig minuten na beëindigen van de beluchting wordt ongeveer eenderde van het gehele volume van de bovenstaande vloeistof ver ­
wijderd en wordt een gelijk volume van een oplossing (pH 7) die 
telkens 0,1 % glucose, pepton en monokaliumorthofosfaat bevat aan het bezonken materiaal toegevoegd waarna de beluchting wordt her ­
vat. Deze procedure wordt eenmaal per dag herhaald. De slibeenheid 
dient volgens een verantwoorde praktijk te worden gebruikt: efflu ­
enten moeten helder zijn, de temperatuur bedraagt 25 ± 2
 o C, de pH 
7 ± 1, slib bezinkt goed, er is voldoende beluchting om het mengsel te allen tijde aëroob te houden, er zijn protozoën aanwezig en de 
activiteit van het slib wordt ten minste elke drie maanden ten op ­
zichte van een referentiestof getest. Het slib wordt niet eerder als entmateriaal gebruikt dan na een werking van ten minste één maand, maar ook niet meer dan na vier maanden. Daarna wordt op gezette 
tijden, elke drie maanden, een monster van ten minste 10 locaties 
genomen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Teneinde vers en oud slib op dezelfde activiteit te houden wordt de 
gefiltreerde bovenstaande vloeistof van een in gebruik zijnd actief 
slib gemengd met een gelijk volume van de gefiltreerde boven ­
staande vloeistof van een vers uit tien bronnen verzameld mengsel en wordt de verenigde vloeistof als boven gekweekt. 18-24 uur nadat 
de eenheid is gevoed wordt slib als entmateriaal genomen.
 
VII.2.4.  Bereiding van de proefoplossingen  
De volgende zes kolven worden bereid:  
Nr. 1: teststof in verdunningswater, 100 mg/l  
Nr. 2, 3 en 4: teststof in anorganisch medium, 100 mg/l  
Nr. 5: referentiestof (bv. aniline) in anorganisch medium, 100 mg/l  
Nr. 6: alleen anorganisch medium  
Slecht oplosbare teststoffen worden rechtstreeks op basis van ge ­
wicht of volume toegevoegd of behandeld als beschreven in Bijlage III, met dien verstande dat er geen oplosmiddelen of emul ­
geermiddelen worden gebruikt. In alle kolven wordt in daarvoor 
bestemde kommetjes absorptiemiddel voor CO
 2 gebracht. De pH 
in de kolven nrs. 2, 3 en 4 wordt op 7,0 ingesteld.  
VII.2.5.  Uitvoering van de test  
De kolven nrs. 2, 3 en 4 (testsuspensies), nr. 5 (activiteitscontrole) en 
nr. 6 (entmateriaal-blanco) worden geënt met een klein volume ent ­
materiaal tot een concentratie van 30 mg/l gesuspendeerde vaste stof. Aan de kolf 1, die dient als niet-biologische controle, wordt geen entmateriaal toegevoegd. De apparatuur wordt gemonteerd, de lucht ­
dichtheid wordt gecontroleerd, de roerders worden aangezet en de 
meting van de zuurstofopname in het donker wordt begonnen. De temperatuur, de roerder en het coulometrische registratieapparaat voor zuurstofopname worden dagelijks gecontroleerd en eventuele 
kleurverandering van de inhoud van de kolven wordt genoteerd. 
De opgenomen hoeveelheid zuurstof voor de zes kolven wordt recht ­
streeks, met een geschikte methode afgelezen, bv. van het zespunt ­
spapierregistratieapparaat, waaruit een BOD-kromme voortkomt. Aan 
het eind van de incubatie, gewoonlijk 28 dagen, wordt de pH van de 
inhoud van de kolven gemeten en worden de concentraties van de resterende teststof en van eventueel tussenproduct en, in geval van wateroplosbare teststof, de concentratie DOC bepaald (Bijlage II.4). 
In geval van vluchtige stoffen wordt bijzondere zorgvuldigheid be ­
tracht. Indien nitrificatie wordt verwacht, worden zo mogelijk de nitraat- en nitrietconcentratie bepaald.
 
VII.3. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
VII.3.1.  Verwerking van de resultaten  
De door de teststof na een gegeven tijdsduur opgenomen hoeveel ­
heid zuurstof (mg), die is gecorrigeerd voor de door de blancocon ­
trole van het entmateriaal in dezelfde tijd opgenomen hoeveelheid, wordt gedeeld door het gewicht van de gebruikte teststof. Dit geeft 
het BOD, uitgedrukt als mg zuurstof/mg teststof, d.w.z.:
 
BOD ¼ ðmg O  2 opname door teststof  Ä mg O  2 opname door blanco Þ 
ðmg teststof in kolf  Þ 
= mg O  2 /mg teststof  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Het percentage biologische afbraak wordt dan verkregen uit:  
% biologische afbraak  ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg stof Þ 
ThOD ðmg O  2=mg stof Þ Ü 100 
Voor mengsels wordt het ThOD berekend uit elementairanalyse, net 
als voor een eenvoudige verbinding. Al naar gelang nitrificatie af ­
wezig dan wel volledig is (Bijlage II.2) wordt het bijbehorende ThOD (ThOD
 NH4 of ThOD  NO3 ) gebruikt. Indien echter nitrificatie 
optreedt maar niet volledig is, wordt een correctie aangebracht voor 
de door nitrificatie verbruikte hoeveelheid zuurstof die is berekend 
uit de veranderingen in concentraties nitriet en nitraat (Bijlage V).  
Het percentage primaire biologische afbraak wordt berekend uit het 
verlies aan specifieke (moeder)stof (zie I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100%  
Indien er in kolf nr. 1, waar fysisch-chemische verwijdering wordt 
gemeten, een verlies aan teststof is geweest, wordt dit gerapporteerd en wordt de concentratie teststof (S
 b ) na 28 dagen in deze kolf 
gebruikt voor het berekenen van het percentage biologische afbraak.  
Wanneer bepalingen van de DOC worden uitgevoerd (naar keuze), 
wordt het percentage uiteindelijke biologische afbraak berekend uit:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100%  
zoals beschreven onder punt I.7.1. Als er verlies aan DOC in kolf 
nr. 1, waarin fysisch-chemische verwijdering wordt gemeten, is ge ­
weest, wordt de DOC-concentratie in deze kolf gebruikt voor het 
berekenen van het percentage biologische afbraak.  
Alle resultaten worden op de bijgaande gegevensformulieren geregis ­
treerd.  
VII.3.2.  Geldigheid van de resultaten  
De zuurstofopname door de entmateriaal-blanco bedraagt normaal 
20-30 mg O  2 /l en mag over 28 dagen niet meer zijn dan 60 mg/l. 
Hogere waarden dan 60 mg/l betekenen dat de gegevens en experi ­
mentele technieken moeten worden getoetst. Indien de pH-waarde 
buiten het gebied van een 6-8,5 ligt en het zuurstofverbruik door 
de teststof minder dan 60 % bedraagt, dient de test met een lagere concentratie teststof te worden herhaald.
 
Zie ook I.5.2.  
Indien het percentage afbraak van aniline dat is berekend uit het 
zuurstofgebruik na 7 dagen niet meer dan 40 % en na 14 dagen niet meer dan 65 % bedraagt, wordt de test als ongeldig beschouwd.
 
VII.3.3.  Rapportage  
Zie I.8.  
VII.4. GEGEVENSFORMULIER  
Hieronder volgt een voorbeeld van een gegevensformulier  
MITI (I) TEST  
1. LABORATORIUM  
2. DATUM AAN HET BEGIN VAN DE TEST  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. TESTSTOF  
Naam:  
Concentratie voorraadoplossing: mg/l als teststof  
Beginconcentratie in het milieu, C  o : mg/l als teststof  
Volume reactiemengsel, V: ml  
ThOD: ... mg O  2 /l 
4. ENTMATERIAAL  
Verzamelingsplaatsen van slib: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 
3) … 8) … 4) … 9) … 5) … 10) …
 
Concentratie gesuspendeerde vaste stof in actief slib na accli ­
matisering met synthetisch rioolwater = ... mg/l  
Volume actief slib per liter eindmedium = ...ml  
Concentratie slib in eindmedium = ... mg/l  
5. ZUURSTOFOPNAME: BIOLOGISCHE AFBREEKBAAR ­
HEID  
Gebruikt type respirometer:  
Tijd (dagen) 
0 7 14 21 28  
O 2 opname (mg) 
teststof a 1 
a 2 
a 3 
O 2 opname (mg) 
blanco b 
Gecorrigeerde O  2 
opname (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
BOD per mg test ­
stof ða Ä bÞ 
C o V Kolf 1 
Kolf 2 Kolf 3 
% afbraak
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 
3 
Gem. (*)  
(*) Indien D  1 en D  2 te veel van elkaar verschillen, moet het gemiddelde niet berekend worden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
N.B.:  Soortgelijke schema's kunnen worden gebruikt voor de refe ­
rentiestof en de toxiciteitscontroles.  
6. KOOLSTOFANALYSE  (facultatief)  
Koolstofanalyseapparaat:  
Kolf DOC 
% DOC verwijd. Gemiddelde 
Gemeten Gecorrig  
Water + teststof a — — 
Slib + teststof b  1 b l - c 
Slib + teststof b  2 b 2 - c 
Slib + teststof b  3 b 3 - c 
Blancocontrole c — — —  
% DOC verwijderd :  a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. GEGEVENS UIT DE SPECIFIEKE CHEMISCHE ANALYSE  
Resthoeveelheid teststof bij einde test % afbraak  
blancotest met water S  b 
geënt medium S a1 
S a2 
S a3 
%afbraak ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Berekend wordt het % afbraak, respectievelijk voor kolven a  1 , 
a 2 en a  3 . 
8. OPMERKING  
De kromme van het BOD tegen de tijd wordt, indien beschik ­
baar, bijgevoegd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
Bijlage I  
AFKORTINGEN EN DEFINITIES  
DO: Opgeloste zuurstof (mg/l) is de concentratie zuurstof die is opgelost in 
een waterig medium.  
BOD: (BZV), biochemisch zuurstofverbruik (g) is de hoeveelheid zuurstof die 
door micro-organismen wordt verbruikt bij het metaboliseren van een testverbinding; wordt ook uitgedrukt als g zuurstofopname per g test ­
verbinding (zie methode C.5).
 
COD: (CZV), chemisch zuurstofverbruik (g) is de hoeveelheid zuurstof die 
tijdens oxydatie van een tesrverbinding met warm, zuur dichromaat wordt verbruikt; het biedt een maat van de aanwezige hoeveelheid 
oxydeerbaar materiaal; wordt ook uitgedrukt als g zuurstof verbruikt 
per g testverbinding (zie methode C.6).
 
DOC: Opgeloste organische koolstof is de organische koolstof die in de op ­
lossing aanwezig is of die of door een filter van 0,45 micrometer gaat of 
na centrifugeren bij 40 000 m.s  -2 (± 4 000 g) gedurende 15 min in de 
vloeistof blijft.  
ThOD: Theoretisch zuurstofverbruik (mg) is de totale hoeveelheid zuurstof die 
nodig is om een chemische stof volledig te oxyderen; het wordt bere ­
kend op basis van de molecuulformule (zie Bijlage II.2) en wordt ook uitgedrukt als mg zuurstof die nodig is per mg testverbinding.
 
ThCO  2 : Theoretische hoeveelheid kooldioxyde (mg) is de hoeveelheid kooldi ­
oxyde die volgens berekening uit het bekende of gemeten koolstofge ­
halte van de testverbinding wordt geproduceerd, wanneer deze volledig wordt gemineraliseerd; wordt ook uitgedrukt als mg kooldioxyde ont ­
wikkeld per mg testverbinding.
 
TOC: Totale organische koolstof van een monster is de som van de hoeveel ­
heid organische koolstof in oplossing en in suspensie.  
IC: Anorganische koolstof.  
TC: Totale koolstof is de som van de in een monster aanwezige organische 
en anorganische koolstof.  
Primaire biologische afbraak:  
is de wijziging in de chemische structuur van een stof als gevolg van een bio ­
logisch proces, hetgeen leidt tot verlies van een bepaalde eigenschap van de stof.  
Uiteindelijke biologische afbraak (aëroob):  
is de mate van afbraak die wordt verkregen wanneer de testverbinding volledig 
door micro-organismen wordt omgezet tot kooldioxyde, water, anorganische zou ­
ten en nieuwe microbiële celbestanddelen (biomassa).  
Gemakkelijk biologisch afbreekbaar:  
een arbitraire indeling van chemische stoffen die bepaalde schiftingsproeven op 
uiteindelijke biologische afbreekbaarheid hebben doorstaan; deze proeven zijn zo 
streng dat geacht wordt dat dergelijke verbindingen in aquatisch milieu onder 
aërobe omstandigheden snel en volledig biologisch worden afgebroken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Inherent biologisch afbreekbaar:  
een indeling van chemische stoffen waarvoor welke erkende proef op biologische 
afbreekbaarheid dat ook een ondubbelzinnig bewijs van biologische afbraak (pri ­
mair of uiteindelijk) levert.  
Behandelbaarheid:  
is de geschiktheid van verbindingen tot verwijdering gedurende biologische af ­
valwaterbehandeling zonder nadelige invloed op de normale werking van de behandelingsprocessen. In het algemeen zijn gemakkelijk biologische afbreekbare verbindingen behandelbaar, maar geldt dat niet voor alle inherent biologisch 
afbreekbare verbindingen. Niet-biologische processen kunnen ook optreden.
 
Aanlooptijd  
is de duur vanaf de enting in een afvlakkingstest, totdat het percentage afbraak 
tot ten minste 10 % is gestegen. De aanlooptijd is vaak sterk variabel en slecht 
reproduceerbaar.  
Afbraaktijd  
is de tijd van het eind van de aanlooptijd tot het tijdstip dat 90 % van de 
maximale afbraak is bereikt.  
10-dagenvenster  
is de periode van 10 dagen onmiddellijk na het bereiken van 10 % afbraak.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
Bijlage II  
BEREKENING EN BEPALING VAN GESCHIKTE TOTAAL 
PARAMETERS  
Afhankelijk van de gekozen methode zijn bepaalde totaalparameters nodig. In dit 
gedeelte wordt de herleiding van deze waarden beschreven. Het gebruik van deze 
parameters wordt bij de afzonderlijke methoden beschreven.  
1. Koolstofgehalte  
Het koolstofgehalte wordt berekend uit de bekende elementaire samenstel ­
ling of bepaald aan de hand van elementair analyse van de teststof.  
2. Theoretisch zuurstofverbruik (ThOD)  
Het theoretische zuurstofverbruik (ThOD) kan worden berekend indien de 
elementaire samenstelling bekend is of door elementair analyse is bepaald. 
Voor de verbinding met samenstelling:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
is dit zonder nitrificatie,  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
of net nitrificatie,  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Chemisch zuurstofverbruik (COD)  
Het chemisch zuurstofverbruik (COD) wordt bepaald volgens methode C.6.  
4. Opgeloste organische koolstof (DOC)  
Opgeloste organische koolstof (DOC) is per definitie de organische kool ­
stof van een chemische stof of een mengsel in water dat door een filter van 0,45 micrometer gaat.
 
Uit de testvaten worden monsters getrokken en deze worden onmiddellijk met 
een geschikt membraanfilter in het filtreerapparaat gefiltreerd. De eerste 20 ml (bij gebruik van kleine filters kan deze hoeveelheid worden verminderd) van het 
filtraat wordt verwijderd. Hoeveelheden van 10-20 ml, of minder in geval van 
injectie (volume afhankelijk van de voor de koolstof analysator benodigde hoeveelheid), worden apart gehouden voor koolstofanalyse. De DOC-concen ­
tratie wordt bepaald met behulp van een analyseapparaat voor organische kool ­
stof, waarmee een koolstofconcentratie die overeenkomt met of kleiner is dan 10 % van de oorspronkelijke, in de test gebruikte DOC-concentratie nauwkeu ­
rig kan worden gemeten.
 
Gefiltreerde monsters die niet op dezelfde werkdag kunnen worden ge ­
analyseerd kunnen worden bewaard, gedurende 48 uur in een koelkast 
bij 2-4  o C, of gedurende langere tijden beneden –18  o C. 
Opmerkingen:  
Membraanfilters  zijn met het oog op hydrofilisering vaak geïmpregneerd met 
oppervlakteactieve stoffen. Een dergelijk filter kan derhalve enkele mg oplos ­
bare organische koolstof bevatten die kunnen storen bij de bepalingen van de 
biologische afbreekbaarheid. Oppervlakteactieve stoffen en andere oplosbare 
organische verbindingen worden uit de filters verwijderd doordat deze driemaal telkens een uur in gedeïoniseerd water worden uitgekookt. De filters kunnen dan gedurende een week in water worden bewaard. Indien er eenmalige filter ­
patronen worden gebruikt, moet elke partij worden gecontroleerd op het niet- 
afgeven van oplosbare organische koolstof.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Afhankelijk van het type membraanfilter kan de teststof door adsorptie 
worden vastgehouden. Het kan daarom raadzaam zijn na te gaan dat de 
teststof niet door het filter wordt vastgehouden.  
Centrifugeren  bij 40 000 m.sec  -2 (4 000 g) gedurende 15 min kan worden 
toegepast in plaats van filtratie, voor het onderscheid tussen TOC en DOC. 
Bij een beginconcentratie van < 10 mg DOC/l is in deze methode niet 
betrouwbaar, omdat dan niet alle bacteriën worden verwijderd of koolstof als deel van het bacteriële plasma opnieuw in oplossing gaat.
 
LITERATUUR  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen De ­
mand, 1965, p. 65.  
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, Vol 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 — Deutsche Einheitsverfahren zur Was ­
ser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- 
und Stoffkenngro βen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauer ­
stoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu β Wasserwesen (NAW) in 
DIN Deutsches Institut für Normung e.V.  
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1984, Vol 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Bijlage III  
BEOORDELING VAN DE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID VAN 
SLECHT OPLOSBARE STOFFEN  
Bij tests op de biologische afbreekbaarheid van slecht oplosbare stoffen dient aan 
de volgende aspecten bijzondere aandacht te worden geschonken.  
Terwijl homogene vloeistoffen zelden bemonsteringsproblemen opleveren, ver ­
dient het aanbeveling dat vaste stoffen op geschikte wijze worden gehomogeni ­
seerd opdat fouten als gevolg van het niet-homogeen zijn worden voorkomen. Bijzondere nauwkeurigheid moet worden betracht wanneer representatieve mon ­
sters van een aantal milligrammen uit mengsels van chemicaliën of stoffen met 
grote hoeveelheden verontreinigingen nodig zijn.
 
Tijdens de tests kunnen uiteenlopende vormen van dooreenmenging worden 
toegepast. Er moet op worden gelet dat er slechts voldoende wordt geroerd om de stof gedispergeerd te houden, en dat er geen oververhitting, overmatige schuimvorming of overmatige afschuifkrachten optreden.
 
Er kan een emulgator worden gebruikt die een stabiele dispersie van de stof 
geeft. Deze dient niet giftig te zijn voor bacteriën en mag niet biologisch worden afgebroken of onder de testomstandigheden schuimvorming veroorzaken.
 
Dezelfde criteria zijn zowel op oplosmiddelen als op de emulgatoren van toe ­
passing.  
Het gebruik van vaste dragers wordt voor vaste teststoffen niet aanbevolen, maar 
zij kunnen wel geschikt zijn voor olieachtige stoffen.  
Wanneer hulpstoffen zoals emulgatoren, oplosmiddelen en dragers worden ge ­
bruikt, dient een blancoproef waarin de hulpstof aanwezig is te worden uitge ­
voerd.  
De drie respirometrische tests CO  2 , BOD en MITI kunnen alle worden gebruikt 
voor het bestuderen van de biologische afbreekbaarheid van slecht oplosbare 
verbindingen.  
LITERATUUR  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol 16, 833.  
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds, 
Chemosphere, 1984, Vol 13, 169.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Bijlage IV  
BEOORDELING VAN DE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID VAN 
STOFFEN DIE VAN GIFTIGHEID VOOR HET ENTMATERIAAL 
WORDEN VERDACHT  
Wanneer een chemische stof wordt onderworpen aan onderzoek op gemakkelijke 
biologische afbreekbaarheid en niet biologisch afbreekbaar blijkt te zijn, wordt de 
volgende procedure aanbevolen indien onderscheid tussen remming en inertheid wordt gewenst (Reynolds et al., 1987).
 
Voor de toxiciteitsproef en de biologische afbraakproef moet hetzelfde of een 
soortgelijk entmateriaal worden gebruikt.  
Voor het bepalen van de toxiciteit van chemicaliën die in tests op de gemakke ­
lijke biologische afbreekbaarheid worden onderzocht komt de toepassing van de 
remming van de slibademhalingssnelheid (test op de remming van de ademhaling van actief slib — Richtlijn 87/302/EEG), BOD en/of groeiremming of een com ­
binatie daarvan in aanmerking.
 
Indien remming als gevolg van giftigheid moet worden voorkomen, kan het 
aanbeveling verdienen dat de concentraties teststof die in het onderzoek op de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid worden gebruikt minder dan 1/10 van de EC
 50 -waarden (of minder dan de EC  20 -waarden) die zijn verkregen bij de 
toxiciteitstest bedragen. Verbindingen met een EC  50 -waarde van meer dan 
300 mg/l hebben waarschijnlijk geen toxische effecten bij het onderzoek op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid.
 
EC 50 -waarden van minder dan 20 mg/l geven waarschijnlijk wel ernstige proble ­
men bij het navolgende onderzoek. Er dienen dan lage testconcentraties te wor ­
den toegepast en gebruik dient dan te worden gemaakt van de strenge en gevoe ­
lige gesloten-flesproef of van met  14 C gemerkt materiaal. Anderzijds kunnen met 
een geacclimatiseerd entmateriaal hogere concentraties teststof worden gebruikt. In het laatste geval gaat echter het specifieke criterium van de test op de ge ­
makkelijke biologische afbreekbaarheid verloren.
 
LITERATUUR  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Bijlage V  
CORRECTIE VAN ZUURSTOFOPNAME VOOR HET OPTREDEN VAN 
NITRIFICATIE  
Fouten die het gevolg zijn van het niet in aanmerking nemen van nitrificatie bij 
de bepaling door middel van de zuurstofopname van de biologische afbreekbaar ­
heid van teststoffen die geen stikstof bevatten zijn zeer gering (niet meer dan 
5 %), zelfs indien oxydatie van de ammonium-N in het medium ongeregeld voorkomt tussen test- en blancovaten. Bij teststoffen die stikstof bevatten kunnen echter aanzienlijke fouten ontstaan.
 
Indien nitrificatie is opgetreden maar niet volledig is, kan de waargenomen 
zuurstofopname door het reactiemengsel worden gecorrigeerd voor de hoeveel ­
heid zuurstof die is gebruikt voor het oxyderen van ammonium tot nitriet en nitraat, indien de veranderingen in de concentratie tijdens incubatie van nitriet en nitraat worden bepaald met inachtneming van de volgende vergelijkingen: 
2 NH
 4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Totaal: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Uit vergelijking (1) volgt dat de zuurstofopname door 28 g stikstof in ammoni ­
umchloride (NH  4 Cl) die wordt geoxydeerd tot nitriet 96 g bedraagt, d.w.z. een 
factor van 3,43 (96/28). Op dezelfde wijze volgt uit vergelijking (3) dat de 
zuurstofopname door 28 g stikstof bij oxydatie tot nitraat 128 g bedraagt, d.w.z. 
een factor 4,57 (128/28).  
Aangezien de reacties na elkaar verlopen, en worden bewerkstelligd door afzon ­
derlijke en verschillende bacteriesoorten, is het mogelijk dat de concentratie 
nitriet toeneemt of afneemt, in het laatste geval zal een overeenkomstige con ­
centratie nitraat worden gevormd. De bij de vorming van nitraat verbruikte hoe ­
veelheid zuurstof bedraagt dus 4,57 maal.de toename van de nitraatconcentratie, terwijl de hoeveelheid zuurstof die samenhangt met de vorming van nitriet 3,43 
maal de toename van de nitrietconcentratie is of bij afname van de concentratie 
het zuurstofverlies - 3,43 is maal de afname in de concentratie.
 
Dus: 
O 2 verbruikt bij nitraatvorming = 4,57 × toename N-nitraatcon ­
centratie (4) 
en 
O 2 verbruikt bij nitrietvorming = 3,43 × toename N-nitrietcon ­
centratie (5) 
en 
O 2 verloren bij verdwijning nitriet = - 3,43 × afname N-nitriet ­
concentratie (6) 
zodat 
O 2 -opname als gevolg van nitrificatie = ± 3,43 × wijziging in N- 
nitrietconcentratie + 4,57 × toename N-nitraatconcentratie (7) 
en dus 
O 2 -opname als gevolg van C-oxydatie = totaal waargenomen 
opname — opname als gevolg van nitrificatie (8) 
Anderzijds kan, indien alleen totaal geoxydeerde N wordt bepaald, de zuurstof ­
opname als gevolg van nitrificatie in eerste benadering worden gesteld op 4,57 × 
toename van geoxydeerde N.  
De correctiewaarde voor zuurstofverbruik als gevolg van C-oxydatie wordt ver ­
volgens vergeleken met ThOD  NH4 , zoals berekend in Bijlage II.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. AFBRAAK — BIOCHEMISCH ZUURSTOFVERBRUIK  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Het doel van de proef is de meting van het biochemisch zuurstof ­
verbruik (BZV) van vaste of vloeibare organische stoffen.  
De gegevens die in deze test zijn verwerkt, hebben betrekking op in 
water oplosbare verbindingen; vluchtige verbindingen en verbindin ­
gen die slechts in geringe mate in water oplosbaar zijn, kunnen 
echter in principe ook worden getest.  
De methode is alleen van toepassing op die organische teststoffen 
die bij de in de test gebruikte concentratie niet remmend werken op bacteriën. Als de teststof niet oplosbaar is bij de te onderzoeken concentratie, kunnen speciale maatregelen zoals de toepassing van 
ultrasone dispersie nodig zijn om de teststof goed te dispergeren.
 
Gegevens over de toxiciteit van de stof kunnen van nut zijn bij de 
interpretatie van lage gevonden waarden en bij de keuze van ge ­
schikte concentraties.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Het BZV is gedefinieerd als de massa opgeloste zuurstof die onder 
voorgeschreven omstandigheden nodig is voor de biochemische oxy ­
datie van een bepaald volume van een oplossing van de stof.  
De resultaten worden weergegeven als g BZV per g geteste stof.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Het gebruik van referentiestoffen om de activiteit van het inoculum 
te controleren, is wenselijk.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Een van tevoren bepaalde hoeveelheid van de stof wordt opgelost of 
gedispergeerd in een geschikt, goed belucht medium, geënt met mi ­
cro-organismen en bij een constante vastgestelde omgevingstempe ­
ratuur in het donker geïncubeerd.  
Het BZV wordt bepaald door het verschil in de hoeveelheid opge ­
loste zuurstof bij het begin en bij het einde van de test. De testduur 
mag niet minder dan 5 dagen en niet meer dan 28 dagen bedragen.  
Parallel wordt een blanco proef uitgevoerd zonder teststof.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De bepaling van het BZV geldt niet zonder meer als bepaling van de 
biologische afbreekbaarheid van de stof. Deze test is alleen te be ­
schouwen als oriënterende proef.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
Eerst wordt een oplossing of dispersie van de stof bereid om een 
BZV-concentratie te verkrijgen die verenigbaar is met de gebruikte 
methode. Vervolgens wordt het BZV bepaald volgens een geschikte 
nationaal of internationaal genormaliseerde methode.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. GEGEVENS EN EVALUATIE  
Het BZV van de oplossing wordt berekend volgens de gekozen 
genormaliseerde methode en herleid naar gram BZV per gram test ­
stof. 
3. RAPPORTAGE  
De gebruikte methode moet worden vermeld.  
Het biochemisch zuurstofverbruik moet het gemiddelde zijn van ten 
minste drie geldige metingen.  
Alle informatie en opmerkingen die van belang kunnen zijn voor de 
interpretatie van de resultaten moeten worden vermeld, vooral wat betreft verontreinigingen, fysische toestand, toxische effecten en de 
oorspronkelijke samenstelling van de stof welke van invloed zouden 
kunnen zijn op de resultaten.
 
Indien een stof is toegevoegd om de biologische nitrificatie te rem ­
men, moet dit worden vermeld.  
4. LITERATUUR  
Lijst van genormaliseerde methoden, bij voorbeeld:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, Lon ­
don. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. AFBRAAK — CHEMISCH ZUURSTOFVERBRUIK  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Het doel van de methode is de meting van het chemisch zuurstof ­
verbruik (CZV) van vaste en vloeibare organische stoffen onder 
vaste laboratoriumomstandigheden op een genormaliseerde manier, die identiek is voor alle organische stoffen.
 
Informatie betreffende de formule van de stof is nuttig voor de 
uitvoering van deze test en de interpretatie van de resultaten (bij ­
voorbeeld halogeenzouten, ijzer(II)zouten van organische verbindin ­
gen, organochloorverbindingen).  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Het chemisch zuurstofverbruik is een maat voor de oxydeerbaarheid 
van een stof, uitgedrukt als de door de stof onder vaste laboratori ­
umomstandigheden verbruikte equivalente hoeveelheid zuurstof van 
een oxyderend reagens.  
Het resultaat wordt uitgedrukt in gram CZV per gram geteste stof.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Het is niet altijd nodig om bij het onderzoek van een nieuwe stof 
referentiestoffen te gebruiken. Deze zijn in de eerste plaats bedoeld om zo nu en dan de methode te ijken en om de resultaten te kunnen vergelijken als een andere methode wordt gebruikt.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Een bekende in water opgeloste of gedispergeerde hoeveelheid van 
de stof wordt geoxydeerd met kaliumdichromaat in sterk zwavelzuur met zilversulfaat als katalysator; deze laat men gedurende 2 uur „refluxen”. Het resterende dichromaat wordt bepaald door titratie 
met gestandaardiseerd ijzer(II) ammoniumsulfaat.
 
Bij chloorhoudende stoffen wordt kwik(II)sulfaat (  1 ) toegevoegd om 
de storing door chloride te verminderen.  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
Aangezien de bepaling identiek is voor alle organische stoffen, is de 
CZV-waarde een „oxydeerbaarheidsindicator” en wordt als zodanig gebruikt als een practische methode om de hoeveelheid organische 
stof te meten.
 
Deze test kan worden gestoord door chloride; ook kan de CZV- 
bepaling worden gestoord door anorganische reducerende of oxyde ­
rende agentia.  
Enkele cyclische verbindingen en vele vluchtige stoffen (bijvoor ­
beeld lagere vetzuren) worden niet volledig geoxydeerd in deze test.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
Allereerst wordt een oplossing of dispersie van de stof bereid met 
een CZV tussen 250 en 600 mg/l.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Na gebruik dienen oplossingendie kwikzouten bevatten te worden nabehandeld om ver ­
spreiding van kwik in het milieu te voorkomen.
 „Opmerkingen”:  
Van slecht oplosbare en niet-dispergeerbare stoffen kan een hoeveel ­
heid fijn verpulverde stof of een hoeveelheid vloeistof worden afge ­
wogen die overeenkomt met ongeveer 5 mg CZV. Dit wordt met water in de opstelling voor het experiment gebracht.
 
Het CZV wordt vaak, en speciaal bij moeilijk oplosbare stoffen, 
beter bepaald met een variant van de methode, bij voorbeeld in 
een gesloten systeem met drukregulator (H. Kelkenberg, 1975). 
Met deze wijziging kunnen stoffen die met de conventionele me ­
thode slechts moeizaam bepaald kunnen worden — bij voorbeeld azijnzuur — vaak met succes worden gemeten. Ook deze methode 
faalt echter met pyridine. Indien de kaliumdichromaatconcentratie, 
zoals beschreven in referentie (1) wordt verhoogd tot 0,25 N (0,0416 M), kan het directe afwegen van 5 tot 10 mg stof vereenvoudigd worden, hetgeen essentieel is voor de CZV-bepaling van slecht in 
water oplosbare stoffen (referentie (2)).
 
Anders wordt vervolgens het CZV bepaald aan de hand van een 
geschikte nationaal of internationaal genormaliseerde methode.  
2. GEGEVENS EN EVALUATIE  
Het CZV van de inhoud van het testvat wordt berekend aan de hand 
van de gekozen genormaliseerde methode en omgerekend tot gram 
CZV per gram geteste stof.  
3. RAPPORTAGE  
De gehanteerde referentiemethode moet worden vermeld.  
Het chemisch zuurstofverbruik moet een gemiddelde van ten minste 
drie metingen zijn. Alle informatie en opmerkingen die van belang zijn voor de inrerpretatie van de resultaten moeten worden vermeld, met name wat betreft verontreinigingen, fysische toestand en de oor ­
spronkelijke samenstelling van de stof (indien bekend) die van in ­
vloed kunnen zijn op de resultaten.
 
Het gebruik van kwik(II)sulfaat om de storing door chloride te ver ­
minderen, moet worden vermeld.  
4. LITERATUUR  
(1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146,  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Enkele gestandaardiseerde methoden:  
NBN T 91-201: Determination of the Chemical Oxygen De ­
mand.  
ISBN 0 11 7512454: Chemical Oxygen Demand (Dichromate 
Value) of Polluted and Waste Waters — 1977.  
NF T 90-101: Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = Water analysis. Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41: Determination of the chemical oxygen de ­
mand (COD) within the range above 15mg/l.  
NEN 3235 5.3: Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO DP 6060: Water quality: Chemical Oxygen Demand — 
Dichromate Methods.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. AFBRAAK — NIET-BIOLOGISCHE AFBRAAK: Hydrolyse in 
AFHANKELIJKHEID VAN DE pH  
1. METHODE  
Deze testmethode komt overeen met OESO TG 111 (2004).  
1.1. INLEIDING  
Chemische stoffen kunnen bijvoorbeeld rechtstreeks, door over ­
waaien bij het spuiten, door afspoeling, door drainage, door afval ­
verwijdering, in industrieel, huishoudelijk of agrarisch afvalwater of door depositie uit de lucht in oppervlaktewateren terechtkomen en in 
die wateren via chemische (bijvoorbeeld hydrolyse of oxidatie), foto ­
chemische en/of microbiologische processen worden omgezet. In deze testmethode wordt een laboratoriumprocedure beschreven voor de bepaling van de niet-biologische hydrolytische omzetting van 
chemische stoffen in aquatische systemen bij pH-waarden die nor ­
maal gesproken in het milieu worden aangetroffen (pH 4-9), die op bestaande richtsnoeren is gebaseerd (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
 
De experimenten worden uitgevoerd ter bepaling van i) de hydroly ­
sesnelheid van de teststof in afhankelijkheid van de pH en ii) de 
identiteit of aard en vormings- en afbraaksnelheid van de hydroly ­
seproducten waaraan organismen kunnen worden blootgesteld. Dit onderzoek kan nodig zijn voor chemische stoffen die rechtstreeks 
in het water terechtkomen of die wellicht via de andere boven ­
genoemde routes in het milieu terecht kunnen komen.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Zie bijlage 2.  
1.3. TOEPASBAARHEID VAN DE METHODE  
De methode kan in het algemeen worden gebruikt voor (al dan niet 
gelabelde) chemische stoffen waarvoor een analysemethode met een 
afdoende nauwkeurigheid en gevoeligheid beschikbaar is. Enigszins 
vluchtige en niet-vluchtige verbindingen met een afdoende oplos ­
baarheid in water kunnen worden getest. De test mag niet worden 
gebruikt voor chemische stoffen die vanuit water zeer vluchtig zijn 
(bv. fumigatiemiddelen of organische oplosmiddelen) die daardoor onder de experimentele omstandigheden tijdens deze test niet in oplossing kunnen worden gehouden. De test kan moeilijk uitvoerbaar 
zijn voor stoffen met een minimale oplosbaarheid in water (8).
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De teststof wordt toegevoegd aan steriele bufferoplossingen in water 
met verschillende pH-waarden (pH 4, 7 en 9), die vervolgens in het donker onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (bij con ­
stante temperatuur) worden geïncubeerd. Op geschikte tijdstippen 
worden de bufferoplossingen geanalyseerd op de teststof en op hy ­
drolyseproducten. Voor een (bijvoorbeeld met
 14 C) gelabelde teststof 
kan er gemakkelijker een massabalans worden bepaald.  
Deze testmethode heeft een gefaseerde aanpak die in bijlage 1 wordt 
vermeld en verklaard. Elke fase wordt geïnitieerd door de resultaten 
van de fase daarvoor.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
Voor de meting van de hydrolysesnelheid kan een al dan niet gela ­
belde teststof worden gebruikt. In het algemeen wordt voor de be ­
studering van de hydrolyseroute en de bepaling van de massabalans 
de voorkeur gegeven aan gelabeld materiaal; in bijzondere gevallen 
zal labeling echter wellicht niet absoluut noodzakelijk zijn. Labeling met
 14 C wordt aanbevolen, maar ook het gebruik van andere isoto ­
pen zoals  13 C, 15 N of  3 H kan nuttig zijn. Het label moet zo veel 
mogelijk in het meest stabiele gedeelte of de meest stabiele gedeelten 
van het molecuul worden aangebracht. Als de teststof bijvoorbeeld één ring bevat, is labeling aan deze ring vereist; als de teststof twee 
of meer ringen bevat, kan er apart onderzoek nodig zijn om te 
beoordelen wat er met elke gelabelde ring gebeurt en om bruikbare informatie over de vorming van hydrolyseproducten te krijgen. De zuiverheid van de teststof moet ten minste 95 % zijn.
 
Vóór de uitvoering van een hydrolysetest moet de volgende infor ­
matie over de teststof beschikbaar zijn:  
a) de oplosbaarheid in water [testmethode A.6];  
b) de oplosbaarheid in organische oplosmiddelen;  
c) de dampspanning [testmethode A.4] en/of de constante van de 
wet van Henry;  
d) de verdelingscoëfficiënt n-octanol/water [testmethode A.8];  
e) de dissociatieconstante (pK  a ) [OESO-richtsnoer 112] (9);  
f) eventueel de directe en indirecte fotochemische omzettingssnel ­
heid in water.  
Er moeten analysemethoden beschikbaar zijn voor de kwantitatieve 
bepaling van de teststof en indien van toepassing voor de kwalita ­
tieve en kwantitatieve bepaling van de hydrolyseproducten in wate ­
rige oplossing (zie ook punt 1.7.2).  
1.6. REFERENTIESTOFFEN  
Waar mogelijk moeten referentiestoffen worden gebruikt voor de 
kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de hydrolyseproducten 
met behulp van spectroscopische en chromatografische methoden of andere voldoende gevoelige methoden.
 
1.7. KWALITEITSCRITERIA  
1.7.1.  Recovery  
Door onmiddellijk na de toevoeging van de teststof de bufferoplos ­
singen of de extracten daarvan ten minste in duplo te analyseren 
wordt een eerste indicatie verkregen van de herhaalbaarheid van de analysemethode en de uniformiteit van de procedure voor het toe ­
voegen van de teststof. In latere fasen van de experimenten wordt de 
recovery bepaald aan de hand van de respectieve massabalansen 
(wanneer gelabeld materiaal wordt gebruikt). Voor gelabelde en on ­
gelabelde stoffen moet de recovery tussen 90 % en 110 % liggen (7). Wanneer het bereiken van dit interval technische problemen oplevert, 
is een recovery van 70 % voor ongelabelde chemische stoffen aan ­
vaardbaar, maar moet er wel een motivering worden gegeven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Herhaalbaarheid en gevoeligheid van de analysemethode  
De herhaalbaarheid van de analysemethode(n) voor de kwantitatieve 
bepaling van de teststof en de hydrolyseproducten op latere tijdstip ­
pen kan worden gecontroleerd door dezelfde bufferoplossingen (of 
de extracten daarvan) in duplo te analyseren, nadat er voldoende 
hoeveelheden hydrolyseproducten zijn gevormd voor een kwantita ­
tieve bepaling.  
De analysemethode moet gevoelig genoeg zijn om concentraties van 
de teststof tot 10 % of minder van de aanvankelijke concentratie 
kwantitatief te bepalen. Indien van toepassing, moeten de analyse ­
methoden ook gevoelig genoeg zijn om een hydrolyseproduct dat (op enig tijdstip gedurende de test) overeenkomt met 10 % of meer van de toegevoegde hoeveelheid teststof, tot 25 % of minder van de 
piekconcentratie kwantitatief te bepalen.
 
1.7.3.  Betrouwbaarheidsintervallen voor kinetische gegevens over de 
hydrolyse  
Voor alle regressiecoëfficiënten, snelheidsconstanten, halveringstij ­
den en andere kinetische parameters (bijvoorbeeld de DT  50 ) moeten 
de betrouwbaarheidsintervallen worden berekend en vermeld.  
1.8. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.8.1.  Uitrusting en apparatuur  
Het onderzoek moet in glazen houders (bijvoorbeeld reageerbuizen 
of flesjes) in het donker en indien nodig in steriele omstandigheden 
worden uitgevoerd, tenzij informatie vooraf (zoals de verdelingscoëf ­
ficiënt n-octanol/water) erop wijst dat de teststof zich aan glas kan hechten. In dat geval moet wellicht worden overwogen een ander 
materiaal (zoals Teflon) te gebruiken. Hechting aan glas kan wellicht 
ook met behulp van een of meer van de volgende methoden worden beperkt:
 
— bepaling van de massa van de aan het reactievat gesorbeerde 
teststof en hydrolyseproducten;  
— gebruik van een ultrasoon bad;  
— al het glaswerk op elk bemonsteringstijdstip met oplosmiddel 
spoelen;  
— gebruik van geformuleerde producten;  
— een grotere hoeveelheid co-oplosmiddel gebruiken om de teststof 
aan het systeem toe te voegen; als er een co-oplosmiddel wordt 
gebruikt, mag dit geen hydrolyse van de teststof veroorzaken.  
Normaal gesproken zijn er waterbadschudapparaten met temperatuur ­
regulering of incubators met thermostaatregulering voor de incubatie 
van de verschillende testoplossingen nodig.  
Verder is er standaard-laboratoriumapparatuur nodig, zoals met na ­
me: 
— een pH-meter;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analyse-apparatuur zoals GC-, HPLC- en TLC-apparatuur, met 
inbegrip van de nodige detectiesystemen voor de analyse van 
al dan niet radioactief gelabelde stoffen of de inverse isotoop ­
verdunningsmethode;  
— instrumenten voor kwalitatieve analyse (MS, GC-MS, HPLC- 
MS, NMR enz.);  
— een vloeistofscintillatieteller;  
— scheitrechters voor vloeistof/vloeistof-extractie;  
— instrumenten voor de concentratie van oplossingen en extracten 
(bijvoorbeeld een rotatie verdamper);  
— een instrument voor temperatuur-regulering (bijvoorbeeld een 
waterbad).  
Als chemicaliën worden onder andere gebruikt:  
— organische oplosmiddelen, p.a., zoals hexaan en dichloor ­
methaan;  
— scintillatievloeistof;  
— bufferoplossingen (zie punt 1.8.3 voor nadere bijzonderheden).  
Al het glaswerk, water (p.a.) en bufferoplossingen die bij de hydro ­
lysetests worden gebruikt, moeten worden gesteriliseerd.  
1.8.2.  Toevoeging van de teststof  
De teststof moet als waterige oplossing aan de verschillende buffer ­
oplossingen (zie bijlage 3) worden toegevoegd. Als dit nodig is om de teststof goed op te kunnen lossen, mogen kleine hoeveelheden 
met water mengbare oplosmiddelen (zoals acetonitril, aceton of etha ­
nol) voor de toevoeging en verdeling van de teststof worden ge ­
bruikt, maar deze hoeveelheden mogen normaal gesproken niet gro ­
ter zijn dan 1 % (v/v). Wanneer een hogere concentratie oplosmid ­
delen wordt overwogen (bijvoorbeeld bij een slecht oplosbare test ­
stof), kan dit alleen worden toegestaan wanneer kan worden aange ­
toond dat het oplosmiddel geen effect heeft op de hydrolyse van de teststof.
 
Het gebruik van geformuleerde producten wordt normaal gesproken 
afgeraden, aangezien niet kan worden uitgesloten dat de bestandde ­
len van de formulering het hydrolyseproces kunnen beïnvloeden. Voor slecht in water oplosbare teststoffen of voor stoffen die zich aan glas hechten (zie punt 1.8.1), kan het gebruik van geformuleerd 
materiaal echter een geschikt alternatief zijn.
 
Er moet één concentratie van de teststof worden gebruikt; deze mag 
niet hoger zijn dan 0,01 M of de helft van de verzadigingsconcen ­
tratie (zie bijlage 1).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Bufferoplossingen  
De hydrolysetest moet bij de pH-waarden 4, 7 en 9 worden uitge ­
voerd. Daartoe moeten er met behulp van p.a. chemicaliën en water bufferoplossingen worden bereid. In bijlage 3 worden enkele ge ­
schikte buffersystemen beschreven. Er dient te worden opgemerkt 
dat het gebruikte buffersysteem de hydrolysesnelheid kan beïnvloe ­
den en wanneer dit wordt geconstateerd, moet er een ander buffer ­
systeem worden gebruikt (
 1 ). 
De pH van elke bufferoplossing moet met een gekalibreerde pH- 
meter tot op ten minste 0,1 nauwkeurig bij de juiste temperatuur worden gecontroleerd.
 
1.8.4.  Testomstandigheden  
1.8.4.1.  Temperatuur  
De hydrolyse-experimenten moeten bij constante temperatuur wor ­
den uitgevoerd. Met het oog op extrapolatie is het belangrijk de temperatuur tot op ten minste ± 0,5
 o C nauwkeurig te houden.  
Als het hydrolysegedrag van de teststof onbekend is, wordt er een 
oriënterende test (fase 1) bij een temperatuur van 50  o C uitgevoerd. 
Kinetische tests in latere fasen moeten bij ten minste drie tempera ­
turen worden uitgevoerd (met inbegrip van de test bij 50  o C), tenzij 
bij de test van fase 1 is vastgesteld dat de teststof ongevoelig voor 
hydrolyse is. Als temperatuurinterval wordt 10-70  o C aanbevolen 
(waarvan bij voorkeur ten minste één temperatuur beneden 25  o C 
wordt gebruikt); de rapportagetemperatuur (25  o C) en de meeste 
temperaturen die men in de praktijk tegenkomt, liggen binnen dit 
interval.  
1.8.4.2.  Licht en zuurstof  
Alle hydrolysetests moeten worden uitgevoerd met een geschikte 
methode om fotolyse-effecten te voorkomen. Alle nodige maatrege ­
len moeten worden genomen om zuurstof uit te sluiten (bijvoorbeeld 
door vóór het bereiden van de oplossing gedurende 5 minuten heli ­
um, stikstof of argon door te leiden).  
1.8.4.3.  Duur van de test  
De oriënterende test wordt gedurende 5 dagen uitgevoerd, terwijl de 
tests van de latere fasen gedurende 30 dagen worden uitgevoerd of, 
indien dit vóór die tijd het geval is, totdat 90 % van de teststof is gehydrolyseerd.
 
1.8.5.  Uitvoering van de test  
1.8.5.1.  Oriënterende test (fase 1)  
De oriënterende test wordt uitgevoerd bij 50 ± 0,5  o C en pH 4,0, 7,0 
and 9,0. Als er na vijf dagen minder dan 10 % hydrolyse wordt waargenomen (t
 0,5 (25 o C) > 1 jaar), wordt de teststof als ongevoelig 
voor hydrolyse beschouwd en behoeven er normaal gesproken geen 
aanvullende tests te worden uitgevoerd. Als bekend is dat de teststof 
bij in het milieu relevante temperaturen instabiel is (  2 ), behoeft de 
oriënterende test niet te worden uitgevoerd. De analysemethode moet nauwkeurig en gevoelig genoeg zijn om een daling van de aanvan ­
kelijke concentratie met 10 % te detecteren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey and Mill bevelen het gebruik van boraat- of acetaat- in plaats van fosfaatbuffers 
aan (11). 
( 2 ) Deze informatie kan uit andere bronnen afkomstig zijn, zoals gegevens over de hydrolyse 
van qua structuur vergelijkbare verbindingen uit de literatuur of uit andere oriënterende 
semi-kwantitatieve tests met de teststof tijdens een eerdere ontwikkelingsfase.
 1.8.5.2.  Hydrolyse van instabiele stoffen (fase 2)  
De latere (geavanceerde) test moet worden uitgevoerd bij de pH- 
waarden waarbij is geconstateerd dat de teststof instabiel is, zoals gedefinieerd in bovenstaande oriënterende test. De gebufferde oplos ­
singen van de teststof wordt met een thermostaat op de geselecteerde 
temperaturen gehouden. Om te testen of de reactie zich als eerste orde gedraagt, wordt elke reactie-oplossing geanalyseerd met inter ­
vallen die ten minste zes gespreide datapunten opleveren die normaal 
gesproken tussen 10 % en 90 % hydrolyse van de teststof liggen. Er 
wordt steeds meer dan een testmonster genomen (ten minste twee monsters in afzonderlijke reactievaten) en de inhoud wordt op elk 
van de ten minste zes bemonsteringstijdstippen geanalyseerd (het ­
geen ten minste twaalf duplodatapunten oplevert). Het gebruik van één monster waaruit op elk bemonsteringstijdstip steeds aparte hoe ­
veelheden van de testoplossing worden genomen, wordt onjuist ge ­
acht aangezien daarbij geen analyse van de variabiliteit van de ge ­
gevens mogelijk is en er problemen kunnen ontstaan met verontrei ­
niging van de testoplossing. Aan het eind van de test van de tweede fase (d.w.z. bij 90 % hydrolyse of na 30 dagen) moeten tests ter 
bevestiging van de steriliteit worden uitgevoerd. Als er echter geen 
afbraak (d.w.z. omzetting) wordt waargenomen, wordt een test op steriliteit niet nodig geacht.
 
1.8.5.3.  Identificatie van de hydrolyseproducten (fase 3)  
Alle belangrijke hydrolyseproducten en ten minste degene die over ­
eenkomen met > 10 % van de toegevoegde hoeveelheid teststof, 
moeten met geschikte analysemethoden worden geïdentificeerd.  
1.8.5.4.  Facultatieve tests  
Bij een voor hydrolyse gevoelige teststof kunnen aanvullende tests 
bij andere pH-waarden dan 4, 7 en 9 nodig zijn. Voor fysiologische doeleinden kan bijvoorbeeld een test in een zuurder milieu (bijvoor ­
beeld pH 1,2) nodig zijn, waarbij één fysiologisch relevante tempe ­
ratuur (37
 o C) wordt gebruikt.  
2. GEGEVENS  
De hoeveelheden teststof en eventueel hydrolyseproducten moeten 
voor elk bemonsteringstijdstip en voor elke pH en temperatuur als percentage van de aanvankelijke concentratie teststof en, indien van 
toepassing, in mg/l worden vermeld. Daarnaast moet er, als er een 
gelabelde teststof is gebruikt, een massabalans in percentages van de aanvankelijke concentratie teststof worden vermeld.
 
Er dient een grafische weergave van de logaritmisch omgezette ge ­
gevens van de concentraties van de teststof, uitgezet tegen de tijd, te 
worden gerapporteerd. Alle belangrijke hydrolyseproducten en ten 
minste degene die overeenkomen met ≥10 % van de toegevoegde 
hoeveelheid teststof, moeten worden geïdentificeerd en hun logarit ­
misch omgezette concentraties moeten op dezelfde wijze als voor de 
oorspronkelijke stof worden uitgezet om de vormings- en afbraak ­
snelheid aan te geven.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Met behulp van de benodigde kinetische modelberekeningen moeten 
nauwkeurigere bepalingen van halveringstijden of DT  50 -waarden 
worden verkregen. De halveringstijden en/of DT  50 -waarden (met in ­
begrip van de betrouwbaarheidsgrenzen) moeten samen met een be ­
schrijving van het gebruikte model, de orde van de kinetiek en de correlatiecoëfficiënt (r
 2 ) voor elke pH en temperatuur worden gerap ­
porteerd. Indien van toepassing moeten de berekeningen ook op de 
hydrolyseproducten worden toegepast.  
Wanneer het snelheidsonderzoek bij verschillende temperaturen 
wordt uitgevoerd, moeten de hydrolysesnelheidsconstantes van 
pseudo eerste orde (k  obs ) als functie van de temperatuur worden 
beschreven. De berekening moet worden gebaseerd op zowel de scheiding van k
 obs in snelheidsconstanten voor zuur-gekatalyseerde, 
neutrale en base-gekatalyseerde hydrolyse (respectievelijk k  H , k neutral  
en k  OH ) en de Arrhenius-vergelijking:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
Hierbij zijn A  i en B  i regressieconstanten van respectievelijk intercept 
en helling van de optimaal passende lijnen die afkomstig zijn van de 
lineaire regressie van ln k  i tegen de reciproque waarde van de ab ­
solute temperatuur in Kelvin (T). Via de Arrhenius-relaties voor zuur-gekatalyseerde, neutrale en base-gekatalyseerde hydrolyse kun ­
nen snelheidsconstanten voor pseudo eerste orde en derhalve hal ­
veringstijden worden berekend voor andere temperaturen, waarbij 
een directe experimentele bepaling van een snelheidsconstante niet uitvoerbaar is (10).
 
2.2. EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De meeste hydrolysereacties hebben een pseudo eerste orde reactie ­
snelheid, zodat de halveringstijd onafhankelijk van de concentratie is (zie vergelijking 4 in bijlage 2). Dit houdt in dat het meestal moge ­
lijk is bij 10
 -2 tot 10  -3 M in het laboratorium bepaalde resultaten toe 
te passen op milieuomstandigheden ( ≤ 10 -6 M) (10). Mabey en Mill 
hebben voor uiteenlopende chemische stoffen verschillende voor ­
beelden gerapporteerd van een goede overeenstemming tussen de in zuiver en natuurlijk water gemeten hydrolysesnelheden (11), 
mits zowel de pH als de temperatuur was gemeten.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden 
opgenomen:  
Teststof:  
— de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de 
structuurformule (met vermelding van de plaats van het label als radioactief gelabeld materiaal wordt gebruikt) en relevante 
fysisch-chemische eigenschappen (zie punt 1.5);
 
— de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof;  
— de radiochemische zuiverheid van een gelabelde stof en de mo ­
laire activiteit (indien van toepassing).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Bufferoplossingen:  
— datum van en gegevens over de bereiding;  
— gebruikte buffers en gebruikt water;  
— molariteit en pH van de bufferoplossingen.  
Testomstandigheden:  
— data waarop het onderzoek is uitgevoerd;  
— toegevoegde hoeveelheid teststof;  
— methode en oplosmiddelen (type en hoeveelheid) voor de toevoe ­
ging van de teststof;  
— geïncubeerd volume van de gebufferde teststofoplossingen;  
— beschrijving van het gebruikte incubatiesysteem;  
— pH en temperatuur tijdens het onderzoek;  
— bemonsteringstijdstippen;  
— extractiemethode(s);  
— methoden voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de 
teststof en de hydrolyseproducten in de bufferoplossingen;  
— aantal duplo-bepalingen.  
Resultaten:  
— de herhaalbaarheid en gevoeligheid van de gebruikte analyse ­
methoden;  
— de recovery (in punt 1.7.1 wordt vermeld welke percentages voor 
een geldig onderzoek gehaald moeten worden);  
— duplo-gegevens en gemiddelden in de vorm van een tabel;  
— de massabalans gedurende en aan het eind van het onderzoek 
(wanneer een gelabelde teststof wordt gebruikt);  
— de resultaten van de oriënterende test;  
— een bespreking en interpretatie van de resultaten;  
— alle oorspronkelijke gegevens en figuren.  
De volgende informatie is alleen vereist wanneer de hydrolysesnel ­
heid wordt bepaald:  
— figuren waarin voor de teststof en eventueel de hydrolyseproduc ­
ten bij elke pH en temperatuur de concentraties tegen de tijd 
worden uitgezet;  
— tabellen met de resultaten van de Arrhenius-vergelijking voor 
20 o C/25  o C, met pH, snelheidsconstante [h  -1 of dag  -1 ], hal­
veringstijd of DT  50 , temperaturen [  o C] met betrouwbaarheids ­
grenzen en correlatiecoëfficiënten (r  2 ) of vergelijkbare informatie;  
— voorgestelde hydrolyseroutes.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. REFERENTIES  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Gui ­
deline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.
 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 EC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.
 
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) Europese Unie (EU) (1995). Richtlijn 95/36/EG van de Com ­
missie tot wijziging van Richtlijn 91/414/EEG van de Raad betreffende het op de markt brengen van gewasbeschermings ­
middelen. Bijlage II: Gedrag en lotgevallen in het milieu.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (Octo ­
ber 1980).  
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr. 23.  
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 — 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, Novem ­
ber 1993).  
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental conditi ­
ons. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Bijlage 1  
Gefaseerd testschema voor hydrolyse
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Bijlage 2  
Definities en eenheden  
In alle gevallen moeten eenheden van het  Internationale Eenhedenstelsel (SI- 
eenheden)  worden gebruikt.  
Teststof : een stof, hetzij de oorspronkelijke verbinding, hetzij relevante omzet ­
tingsproducten.  
Omzettingsproducten : alle stoffen die bij biotische en abiotische omzettings ­
reacties van de teststof ontstaan.  
Hydrolyseproducten : alle stoffen die bij hydrolytische omzettingsreacties van de 
teststof ontstaan.  
Hydrolyse : een reactie van een teststof RX met water, met als nettoresultaat de 
uitwisseling van de groep X met OH in het reactiecentrum: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Afhankelijk van de snelheidsbepalende stap wordt de snelheid waarmee de con ­
centratie van RX bij dit vereenvoudigde proces afneemt, gegeven door: 
snelheid = k [H  2 O] [RX] tweede orde reactie 
of 
snelheid = k [RX] eerste orde reactie  
Omdat water in vergelijking met de teststof in grote overmaat aanwezig is, wordt 
dit reactietype meestal beschreven als pseudo eerste orde reactie waarin de waar ­
genomen snelheidsconstante wordt gegeven door: 
k obs = k [H  2 O] [2]  
en kan worden bepaald volgens de vergelijking (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
waarbij t = tijd  
en C  o en C  t = concentraties van RX op de tijdstippen 0 en t.  
Deze constante heeft als dimensie (tijd)  -1 en de halveringstijd van de reactie (tijd 
die nodig is om 50 % van RX te laten reageren) wordt gegeven door:  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Halveringstijd  (t 0,5 ): de tijd die nodig is voor hydrolyse van 50 % van een 
hoeveelheid teststof, wanneer de omzetting kan worden beschreven door kinetiek 
van de eerste orde; deze is onafhankelijk van de aanvankelijke concentratie.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Als uitzetting van de logaritmisch omgezette gegevens tegen de tijd geen lineaire functie 
oplevert (die overeenkomt met een eerste orde reactiesnelheid), kan vergelijking [3] niet 
worden gebruikt om de hydrolyse-snelheidsconstante van de teststof te bepalen.
 DT 50 (Disappearance Time 50) : de tijd waarin de aanvankelijke concentratie 
van de teststof met 50 % daalt; deze verschilt van de halveringstijd t  0,5 wanneer 
de reactie niet volgens kinetiek van de eerste orde verloopt.  
Bepaling van k bij een andere temperatuur  
Wanneer de reactieconstante voor twee temperaturen bekend is, kan deze met 
behulp van de Arrhenius-vergelijking voor andere temperaturen worden bere ­
kend:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T of ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Wanneer ln k wordt uitgezet tegen 1/T, levert dit een rechte lijn op met helling 
-E/R.  
Hierbij is:  
k = snelheidsconstante, gemeten bij verschillende temperaturen;  
E = activeringsenergie [kJ/mol];  
T = absolute temperatuur [K];  
R = gasconstante [8,314 J/mol.K].  
De activeringsenergie wordt berekend met behulp van regressieanalyse of de 
volgende vergelijking:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 Í 1 
T 1 Ä 1 
T 2 Î 
waarbij T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Bijlage 3  
Buffersystemen  
A. CLARK EN LUBS:  
Buffermengsels van CLARK en LUBS  (*) 
Samenstelling pH  
0,2 N HCl + 0,2 N KCl bij 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 1,0 
32,25 ml HC1 + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 1,2 
20,75 ml HC1 + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 1,4 13,15 ml HC1 + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 1,6 
8,3 ml HC1 + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 1,8 5,3 ml HC1 + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 2,0 
3,35 ml HC1 + 25 ml KC1 verdunnen tot 100 ml 2,2  
0,1 M kaliumbiftalaat + 0,1  N HC1 bij  20
 o C 
46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 3,0 14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 3,4 5,97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalaat tot 100 ml 3,8  
0,1 M kaliumbiftalaat + 0,1 N NaOH bij  20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) De in deze tabellen gerapporteerde pH-waarden zijn uit de potentiaalmetingen berekend met behulp van de 
standaardvergelijkingen van Sörensen (1909). De corresponderende pH-waarden zijn 0,04 eenheden hoger 
dan de waarden in de tabel.
 Samenstelling pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalaat tot 100 ml 6,0
 
Buffermengsels van CLARK en LUBS (vervolg)  
0,1 M monokaliumfosfaat + 0,1 N NaOH bij 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfaat tot 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 BO  3 in 0,1 M KC1 + 0,1 N NaOH bij 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boorzuur tot 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF EN VLEESCHHOUWER:  
Citraatbuffers van KOLTHOFF en VLEESCHHOUWER  
Samenstelling pH  
0,1 M monokaliumcitraat en 0,1 N HC1 bij 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 2,4 36,8 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 2,6 
30,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citraat tot 100 ml 3,6 
0,1 M monokaliumcitraat en 0,1 N NaOH bij 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 4,4 
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 4,6 39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 5,6 74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citraat tot 100 ml 6,0
 
_____________ 
(*) Voeg een klein kristal thymol of een vergelijkbare stof toe om de groei van schimmels te voorkomen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1044
 
C. SÖRENSEN:  
Boraatmengsels van SÖRENSEN  
Samenstelling Sörensen 
18 o C Walbum, pH bij 
ml borax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax + 0,1 N HC1  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 
8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 
8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Fosfaatmengsels van SÖRENSEN  
Samenstelling pH  
0,0667 M monokaliumfosfaat + 0,0667 M dinatriumfosfaat bij  20 o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOXICITEIT VOOR REGENWORMEN  
TEST MET KUNSTMATIGE GROND  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
In deze laboratoriumtests wordt de te onderzoeken stof toegevoegd 
aan kunstmatige grond waarin gedurende veertien dagen regenwor ­
men worden geplaatst. Na deze veertien dagen (en naar keuze ook al na zeven dagen) wordt het letale effect van de stof op de regenwor ­
men onderzocht. Met deze test kan betrekkelijk snel een indruk 
worden verkregen van het effect van chemicaliën op regenwormen bij opname via de huid en via het voedsel.
 
1.2. DEFINITIE EN EENHEID  
LC 50 : De geschatte concentratie van een stof die de dood van 50 % 
van de proefdieren gedurende de testperiode tot gevolg heeft.  
1.3. REFERENTIESTOF  
Op gezette tijden wordt een referentiestof getoetst om aan te tonen 
dat de gevoeligheid van het testsysteem niet wezenlijk is veranderd.  
Als referentiestof wordt aanbevolen chlooraceetamide van analyti ­
sche kwaliteit.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TEST  
Grond is een variabel medium en daarom wordt voor deze proef een 
nauwkeurig gedefinieerde kunstmatige leemgrond gebruikt. Volwas ­
sen regenwormen van de soort  Eisenia foetida  (zie de opmerking in 
het aanhangsel) worden gehouden in deze kunstmatige grond, die is behandeld met verschillende concentraties van de te onderzoeken stof. De kunstgrond wordt na veertien dagen (en naar keuze ook 
na zeven dagen) vanaf het begin van de proef op een schaal uit ­
gespreid en het aantal overlevende regenwormen bij elke concentra ­
tie wordt geteld.
 
1.5. KWALITEITSNORMEN  
De opzet is zodanig dat de test ten aanzien van het testsubstraat en 
het organisme zo reproduceerbaar mogelijk is. Indien de sterfte in de 
controles aan het eind van de proef hoger is dan 10 %, is de test 
ongeldig.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.6.1.  Materiaal  
1.6.1.1. T e s t s u b s t r a a t  
Als basistestsubstraat wordt goed gedefinieerde kunstmatige grond 
gebruikt.  
a) Basissubstraat (percentages aangegeven in droog gewicht)  
— 10 % veenmosturf (zo dicht mogelijk bij pH 5,5 — 6,0, 
zonder zichtbare plantenresten en fijngemalen);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolienklei met zo mogelijk meer dan 50 % kaoliniet;  
— ongeveer 69 % industrieel kwartszand (overwegend fijn zand 
met meer dan 50 % deeltjesgrootte 0,05 — 0,2 mm). Indien de stof onvoldoende dispergeerbaar is in water, wordt per 
testpot 10 g zand achtergehouden om later met de reststof 
te kunnen worden gemengd;
 
— ongeveer 1 % calciumcarbonaat (CaCO  3 ), poedervormig, che ­
misch zuiver, dat wordt toegevoegd om de pH op 6,0 ± 0,5 te 
brengen.  
b) Testsubstraat  
Het testsubstraat bevat het basissubstraat, de teststof en gedeï ­
oniseerd water.  
Het vochtgehalte bedraagt 25 tot 42 % van het drooggewicht van 
het basissubstraat. Het vochtgehalte van het substraat wordt be ­
paald door een monster bij 105  o C tot constant gewicht te drogen. 
De kunstmatige grond moet zover nat worden gemaakt dat er net 
geen water op blijft staan. Er moet zorgvuldig worden gemengd, 
zodat een gelijkmatige verdeling van de te onderzoeken stof over het substraat wordt verkregen. Aangegeven moet worden op welke wijze de te onderzoeken stof door het substraat is ge ­
mengd.
 
c) Controlesubstraat  
Het controlesubstraat bevat het basissubstraat en water. Indien 
een hulpstof is gebruikt, moet een extra controle worden gedaan met daarin dezelfde hoeveelheid van de hulpstof.
 
1.6.1.2. T e s t p o t t e n  
Er wordt gebruik gemaakt van glazen potten met een inhoud van 
ongeveer 1 liter (afgesloten met plastic deksels, schotels of plastic folie met luchtgaten), die worden gevuld met een hoeveelheid nat test- of controlesubstraat die overeenkomt met 500 g droog substraat.
 
1.6.2.  Testomstandigheden  
De potten worden geplaatst in klimaatkamers bij een temperatuur 
van 20 ± 2  o C onder continu licht. De lichtintensiteit dient 400 tot 
800 lux te bedragen.  
De testduur bedraagt veertien dagen maar de sterfte kan indien ge ­
wenst ook at na zeven dagen worden bepaald.  
1.6.3.  Werkwijze  
T e s t c o n c e n t r a t i e s  
De concentraties van de te onderzoeken stof worden uitgedrukt als 
gewicht van de stof per drooggewicht basissubstraat (mg/kg).  
O r i ë n t e r e n d e t o e t s  
Het concentratiegebied dat leidt tot een sterfte tussen 0 tot 100 % 
kan worden bepaald in een oriënterende toets met behulp waarvan de 
reeks concentraties voor de definitieve test kan worden vastgesteld.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
In de oriënterende toets wordt de te onderzoeken stof getest bij de 
volgende concentraties: 1 000, 100, 10, 1 en 0,1 mg stof per kg 
testsubstraat (drooggewicht).  
Als er een volledige definitieve toets wordt uitgevoerd, kan voor de 
oriënterende toets worden volstaan met uitvoering in enkelvoud, dat 
wil zeggen met één pot per concentratie en één voor de controle zonder de te onderzoeken stof, elk met tien wormen.
 
D e f i n i t i e v e t o e t s  
De resultaten van de oriënterende toets worden gebruikt voor het 
kiezen van ten minste vijf concentraties in een meetkundige reeks 
die juist het gebied tussen 0 en 100 % sterfte bestrijken en onderling 
met een constante factor van ten hoogste 1,8 verschillen.  
Door middel van de toets met deze reeks concentraties moeten de 
LC 50 -waarde en de bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen zo nauw ­
keurig mogelijk kunnen worden geschat.  
In de definitieve toets worden ten minste vier potten per concentratie 
en vier controles zonder de te onderzoeken stof, elk met tien wor ­
men, onderzocht. De resultaten van deze parallelle toetsen worden gegeven als een gemiddelde met een standaarddeviatie.
 
Wanneer twee opeenvolgende concentraties, met een onderlinge ver ­
houding van 1,8 slechts respectievelijk 0 en 100 % sterfte geven, zijn deze twee waarden voldoende om het gebied aan te geven waar ­
binnen de LC
 50 ligt. 
M e n g e n v a n h e t b a s i s s u b s t r a a t e n d e t e s t s t o f  
Het testsubstraat wordt zoveel mogelijk bereid zonder andere hulp ­
stoffen dan water. Vlak voor het begin van de test wordt een op ­
lossing, emulsie of dispersie van de te onderzoeken stof in gedeï ­
oniseerd water of een ander oplosmiddel met het basissubstraat ge ­
mengd of daarover gelijkmatig verdeeld met een fijne chroma to 
grafische of soortgelijke sproeier.  
Indien de te onderzoeken stof onoplosbaar is in water, kan deze 
worden opgelost in een zo klein mogelijk volume van een geschikt 
organisch oplosmiddel (bijvoorbeeld hexaan, aceton of chloroform).  
Alleen gemakkelijk verdampende oplosmiddelen mogen worden ge ­
bruikt voor het oplossen, dispergeren of emulgeren van de te onder ­
zoeken stof. Het testsubstraat wordt voor het gebruik geventileerd. De hoeveelheid verdampt water wordt daarna weer aangevuld.
 
De controle moet van elke hulpstof dezelfde hoeveelheid bevatten. 
Indien de te onderzoeken stof niet oplosbaar, dispergeerbaar of emul ­
geerbaar is in organische oplosmiddelen, wordt 10 g van een meng ­
sel van fijn gemalen kwartszand en een hoeveelheid van de te onder ­
zoeken stof die nodig is voor de behandeling van 500 g droog 
gewicht aan kunstmatige grond gemengd met 490 g droog gewicht aan basissubstraat.
 
Voor elke testportie wordt een hoeveelheid nat testsubstraat die over ­
eenkomt met 500 g droog gewicht in een glazen pot gebracht en worden tien regenwormen, die 24 uur in een soortgelijk nat basis ­
substraat zijn geconditioneerd en voor gebruik snel zijn gewassen en 
met filtreerpapier van overtollig water zijn ontdaan, bovenop het 
testsubstraat geplaatst.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
De potten worden afgedekt met geperforeerde plastic deksels, scha ­
len of folie om uitdrogen van het substraat te voorkomen en worden 
vervolgens veertien dagen onder de testomstandigheden gehouden.  
De bepalingen worden gedaan veertien dagen (en eventueel zeven 
dagen) na het begin van de test. Het substraat wordt uitgespreid op een plaat van glas of roestvrij staal. De regenwormen worden onder ­
zocht en het aantal overlevende wormen wordt bepaald. Regenwor ­
men worden als dood aangemerkt indien zij niet reageren op een zachte mechanische prikkel op de kop.
 
Indien onderzoek na zeven dagen plaatsvindt, wordt het substraat 
terug in de pot gedaan en worden de overlevende regenwormen 
weer bovenop het testsubstraat geplaatst.  
1.6.4.  Testorganismen  
De testorganismen zijn volwassen  Eisenia foetida  (zie opmerking in 
de bijlage), ten minste twee maanden oud met clitellum, nat gewicht 300-600 mg (voor kweekmethode zie aanhangsel).
 
2. GEGEVENS  
2.1. VERWERKING VAN DE RESULTATEN  
De concentraties van de onderzochte stof worden vermeld-in samen ­
hang met de bijbehorende percentages dode regen wormen.  
Wanneer de gegevens zich daartoe lenen, worden de LC  50 -waarde en 
de betrouwbaarheidsgrenzen (p = 0,05) bepaald volgens standaard ­
methoden (Litchfield en Wilcoxon, 1949 of gelijkwaardige methode). De LC
 50 wordt weergegeven in mg te onderzoeken stof per kg test ­
substraat (droog gewicht).  
Indien de helling van de concentratiecurve te steil ïs voor de be ­
rekening van de LC  50 , is een grafische schatting van deze waarde 
voldoende.  
Wanneer twee opeenvolgende concentraties met een onderlinge ver ­
houding van 1,8 slechts respectievelijk 0 % en 100 % sterfte geven, 
zijn deze waarden voldoende voor het aangeven van het gebied 
waarbinnen de LC  50 ligt. 
3. VERSLAGGEVING  
3.1. TESTRAPPORT  
Het testrapport moet, indien mogelijk, bevatten:  
— een verklaring dat de test is uitgevoerd overeenkomstig de bo ­
venvermelde kwaliteitsnormen;  
— uitgevoerde toetsen (oriënterende toets en/of definitieve toets);  
— nauwkeurige beschrijving van de testomstandigheden of verkla ­
ring dat de test is uitgevoerd overeenkomstig deze methode; alle afwijkingen worden vermeld;
 
— nauwkeurige beschrijving van de wijze waarop de te onderzoe ­
ken stof door het basissubstraat is gemengd;  
— gegevens over de testorganismen (soort, leeftijd, gemiddeld ge ­
wicht en variatie in gewicht, houd- en kweekomstandigheden, 
leverancier);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— gebruikte methode voor de bepaling van de LC  50 ; 
— testresultaten met inbegrip van alle gebruikte gegevens;  
— beschrijving van waargenomen symptomen of wijzigingen in het 
gedrag van de testorganismen;  
— sterfte in de controleproeven;  
— LC  50 of hoogste geteste concentratie zonder sterfte dan wel laag ­
ste geteste concentratie met een sterfte van 100 %, veertien da ­
gen (en eventueel zeven dagen) na de start van de test;  
— grafiek van de concentratie-responscurve;  
— resultaten verkregen met de referentiestof, in samenhang met de 
onderhavige test dan wel uit eerdere kwaliteitsborging.  
4. REFERENTIES  
(1) OESO, Parijs, 1981,  Testrichtlijn 207,  Besluit C(81) 30 def. van 
de Raad.  
(2) Edwards, C. A., en Lofty, J. R., 1977,  Biology of Earthworms,  
Chapman and Hall, London, 331 blz.  
(3) Bouche, M. B., 1972,  Lombriciens de France, Écologie et Sys ­
tématique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 671 
blz. 
(4) Litchfield, J. T., en Wilcoxon, F., A simplified method of eva ­
luating dose-effect experiments,  Journal of Pharmacology and 
Experimental Therapeutics 96,  1949, blz. 99.  
(5) Commission of the European Communities,  Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms,  Report EUR 8714 EN, 
1983.
 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitäts ­
test am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden”, in: Rudolph/Boje:  ökotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Aanhangsel  
Kweken en houden van de wormen vóór de test  
Voor het kweken worden 30 tot 50 volwassen wormen in een kweekbak met vers 
substraat gebracht en na veertien dagen daaruit verwijderd. Deze dieren kunnen worden gebruikt voor verder kweken. De uit de cocons gekomen regenwormen 
worden voor het onderzoek gebruikt wanneer ze volwassen zijn (onder de voor ­
geschreven omstandigheden na twee tot drie maanden).
 
Houd- en kweekomstandigheden  
Klimaatkamer: temperatuur 20 ± 2  o C, zo mogelijk met continu licht (intensiteit 
400 — 800 lux).  
Kweekbakken: geschikte ondiepe bakken met een inhoud van 10 tot 20 l.  
Substraat:  Eisenia foetida  kan worden gekweekt in verschillende dierlijke 
uitwerpselen. Aanbevolen als kweekmedium wordt een mengsel van 50 volumeprocent turf en 50 % koemest of paardemest. Het 
medium moet een pH hebben van 6 tot 7 (bij te stellen met 
calciumcarbonaat) en een lage-ionengeleiding (lager dan 6 mmho's of 0,5 % zoutconcentratie). Het substraat dient voch ­
tig maar niet te nat te zijn.
 
Naast de aangegeven methode kunnen ook andere procedures 
die goede resultaten geven worden gebruikt.  
Opmerking : Eisenia foetida  bestaat in twee ondersoorten die door sommige taxo ­
nomen als soorten worden aangemerkt (Bouche, 1972). Deze zijn morfologisch overeenkomstig, maar de ene,  Eisenia foetida foetida , heeft kenmerkende dwarse 
strepen of banden op de segmenten terwijl de andere,  Eisenia foetida andrei , 
deze niet heeft en een onregelmatige roodachtige kleur heeft. Zo mogelijk dient  
Eisenia foetida andrei  te worden gebruikt. Andere soorten kunnen worden ge ­
bruikt indien de benodigde methodiek beschikbaar is.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIOLOGISCHE AFBRAAK  
ZAHN-WELLENS TEST  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Het doel van deze methode is de bepaling van de uiteindelijke bio ­
logische afbreekbaarheid van in water oplosbare, niet-vluchtige or ­
ganische stoffen, wanneer deze in een statische proef aan betrekke ­
lijk hoge concentraties micro-organismen worden onderworpen.  
Aan de gesuspendeerde vaste stoffen kan fysisch-chemische adsorp ­
tie plaatsvinden en hiermee moet bij het interpreteren van de resul ­
taten rekening worden gehouden (zie 3.2).  
De te onderzoeken stoffen worden gebruikt in concentraties, die 
overeenkomen met DOC-waarden tussen 50 en 400 mg/liter of 
COD-waarden tussen 100 en 1 000 mg/liter (DOC = opgeloste or ­
ganische koolstof; COD = chemisch zuurstofverbruik). Deze betrek ­
kelijk hoge concentraties hebben het voordeel dat ze analytisch be ­
trouwbaar zijn, Verbindingen met toxische eigenschappen kunnen 
het afbraakproces vertragen of verhinderen.  
In deze methode wordt door middel van meting van de concentratie 
opgeloste organische koolstof of het chemisch zuurstofverbruik de 
uiteindelijke biologische afbraak van de teststof bepaald.  
Het gelijktijdig toepassen van een specifieke analytische methode 
biedt de mogelijkheid de primaire biologische afbraak van de stof 
(verdwijning van de oorspronkelijke chemische structuur) te bepalen.  
Deze methode is alleen toepasbaar op die organische stoffen die bij 
de in de test gebruikte concentratie:  
— onder de testomstandigheden in water oplosbaar zijn,  
— onder de testomstandigheden een verwaarloosbare dampspanning 
hebben,  
— geen remmende werking op bacteriën hebben,  
— slechts in beperkte mate worden geadsorbeerd aan de testappara ­
tuur, 
— niet door schuimvorming uit de testoplossing verdwijnen.  
Gegevens over de onderlinge verhoudingen van de belangrijkste 
componenten van het testmateriaal kunnen van nut zijn bij het inter ­
preteren van de resultaten, vooral wanneer deze laag of marginaal 
zijn. 
Gegevens aangaande de toxiciteit van de stof ten opzichte van mi ­
cro-organismen zijn gewenst voor de interpretatie van lage resultaten 
en voor de keuze van de geschikte testconcentraties.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
De aan het eind van de proef verkregen mate van afbraak wordt 
opgegeven als de „biologische afbreekbaarheid in de Zahn-Wellens test”:
 
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
waarin:  
D T = biologische afbraak ( %) op tijd T,  
C A = DOC- of COD-waarden in het testmengsel, zoals gemeten 
drie uur na het begin van de test (mg/l) (DOC = opgeloste organische koolstof, COD = chemisch zuurstofverbruik),
 
C T = DOC- of COD-waarden in het testmengsel op het tijdstip 
van monsterneming (mg/L),  
C B = DOC- of COD-waarden van de blanco op het tijdstip van 
monsterneming (mg/l),  
C BA = DOC- of COD-waarden van de blanco, zoals gemeten drie 
uur na het begin van de test (mg/l).  
De mate van afbraak wordt op het dichtstbijzijnde hele procent 
afgerond.  
Het percentage afbraak wordt bepaald als zijnde het percentage 
DOC- of COD-verwijdering van de onderzochte stof.  
Het verschil tussen de waarde gemeten na drie uur en de berekende 
of bij voorkeur gemeten oorspronkelijke waarde kan nuttige infor ­
matie verschaffen over de verwijdering van de stof (zie 3.2: Inter ­
pretatie van de resultaten).  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Bij het onderzoeken van nieuwe stoffen kunnen referentiestoffen 
soms van nut zijn; er kunnen echter nog geen specifieke referentie ­
stoffen worden aanbevolen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
In een glazen vat van 1 tot 4 liter inhoud, uitgerust met een roer ­
toestel en een beluchtingsapparaat, worden actief slib, minerale voe ­
dingsstoffen en het testmateriaal als enige koolstofbron in water bij 
elkaar gebracht. Het mengsel wordt gedurende hooguit 28 dagen onder diffuus licht of in een donkere ruimte bij 20 tot 25
 o C geroerd 
en belucht. Het verloop van het afbraakproces wordt gevolgd door 
het dagelijks of op andere geschikte gezette tijden bepalen van de 
DOC- of COD-waarden in de gefiltreerde oplossing. De verhouding tussen de verdwenen hoeveelheid DOC (of COD) bij elke meettijd en de hoeveelheid drie uur na het begin wordt uitgedrukt als het 
percentage biologische afbraak en dient voor het bepalen van de 
mate van afbraak op dat tijdstip.
 
Het resultaat wordt uitgezet tegen de tijd en geeft aldus de kromme 
van de biologische afbraak.  
Wanneer een specifieke analytische methode wordt toegepast, kun ­
nen de veranderingen in de concentratie van de uitgangsmolecule als 
gevolg van de biologische afbraak worden gemeten (primaire bio ­
logische afbreekbaarheid).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De reproduceerbaarheid van deze test is in een ringtest voldoende 
gebleken.  
De gevoeligheid van de methode wordt grotendeels bepaald door de 
veranderlijkheid van de blanco en, in mindere mate, door de nauw ­
keurigheid van de bepaling van opgeloste organische koolstof en van 
de concentratie von de testverbinding in de vloeistof.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Preparaten  
1.6.1.1. R e a g e n t i a  
Water: drinkwater met een organisch-koolstofgehalte kleiner dan 
5 mg/1. De totale concentratie van calcium- en magnesiumionen te zamen mag 2,7 mmol/1 niet overschrijden; zonodig moet met gedeï ­
oniseerd of gedestilleerd water worden verdund. 
Zwavelzuur, analytisch reagens (AR): 50 g/l 
Natriumhydroxideoplossing AR: 40 g/l Minerale nutriëntoplossingen: hiervoor wordt in 1 liter 
gedeïoniseerd water opgelost: 
ammoniumchloride, NH
 4 Cl, AR: 38,5 g 
natriumdiwaterstoffosfaat, NaH  2 PO 4 2 H  2 O, AR: 33,4 g 
kaliumdiwaterstoffosfaat, KH  2 PO 4 , AR: 8,5 g 
di-kaliumwaterstoffosfaat, K  2 HPO  4 , AR: 21,75 g  
Dit mengsel dient tegelijkertijd als voedingsstof maar ook als buffe ­
raplossing.  
1.6.1.2. A p p a r a t u u r  
Glazen vaten met inhoud van 1 tot 4 liter (bij voorbeeld cilindervor ­
mige recipiënten).  
Roerapparaat met glazen of metalen roerblad op een geschikte 
schacht. (De roerder moet 5 tot 10 cm boven de bodem van het vat ronddraaien.) Een magneetroerder met een roerstaaf van 7 tot 
10 cm kan eveneens gebruikt worden.
 
Glazen buis met een inwendige diameter van 2 tot 4 mm voor het 
inleiden van lucht. De opening van de buis moet zich ongeveer 1 cm 
boven de bodem van het vat bevinden.  
Centrifuge (ongeveer 3 550 g).  
pH-meter.  
Apparaat voor het meten van de opgeloste zuurstof.  
Papieren filters.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Membraanfiltreerapparaat.  
Membraanfilters, mazen van 0,45 μm. Membraanfilters zijn geschikt 
als vaststaat dat zij geen koolstof afgeven en bij het filtreren de stof 
niet absorberen.  
Analyseapparatuur voor het bepalen van het organisch koolstofge ­
halte en het chemisch zuurstofverbruik.  
1.6.1.3. B e r e i d i n g v a n h e t i n o c u l u m  
Actief slib uit een biologische zuiveringsinstallatie wordt gewassen 
door (herhaald) centrifugeren of bezinken in het water dat gebruikt 
wordt voor de test (zie boven).  
Het actief slib moet de juiste kenmerken hebben. Dergelijk slib kan 
worden betrokken van een goed werkende waterzuiveringsinstallatie. Om zoveel mogelijk verschillende soorten en stammen van bacteriën te verkrijgen kan het de voorkeur verdienen inocula van verschil ­
lende bronnen (bij voorbeeld verschillende zuiveringsinstallaties, bo ­
demextracten, rivierwater en dergelijke) te mengen. Het mengsel moet dan worden behandeld als hierboven beschreven.
 
Voor het controleren van de activiteit van het actief slib, zie 1.6.2, 
onder „Functionele controle”.  
1.6.1.4. B e r e i d i n g v a n d e t e s t o p l o s s i n g e n  
In het testvat worden gebracht: 500 ml testwater, 2,5 ml/l minerale 
nutriëntoplossing en een hoeveelheid actief slib die overeenkomt met 0,2-1,0 g/l droge stof in het uiteindelijke mengsel. Hieraan wordt een 
voldoende hoeveelheid van een voorraadoplossing van de te onder ­
zoeken stof toegevoegd, zodanig dat Het DOC-gehalte in het uit ­
eindelijke mengsel 50-400 mg/l bedraagt. De overeenkomstige COD- waarden zijn 100-1 000 mg/l. Het volume wordt met testwater op 
een totaal van 1 tot 4 liter gebracht. De keuze van het volume wordt 
bepaald door het aantal monsters voor de DOC- of COD-bepaling en door de voor de analytische procedure benodigde volumes.
 
Doorgaans wordt een volume van 2 liter als voldoende beschouwd. 
Er wordt ten minste één blanco controlevat bereid dat parallel met elke testreeks wordt behandeld; het bevat alleen actief slib en mine ­
rale nutriëntoplossing, aangevuld met testwater tot hetzelfde totale 
volume als in de testvaten.
 
1.6.2.  Uitvoering van de test  
De testvaten worden geroerd met magneetroerders of schroefbladen 
onder gedempt licht of in het donker bij 20 tot 25  o C. Beluchting 
vindt plaats door middel van perslucht die met een wattenfilter en eventueel een wasfles wordt gereinigd. Er dient voor gezorgd te 
worden dat het slib niet bezinkt en de zuurstofconcentratie niet be ­
neden de 2 mg/l daalt.
 
De pH-waarde wordt op gezette tijden (bij voorbeeld dagelijks) ge ­
meten en zonodig bijgesteld tot pH 7 à 8.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Verliezen ten gevolge van verdamping worden vlak voor de mon ­
sterneming aangevuld met gedeïoniseerd of gedestilleerd water in de 
vereiste hoeveelheden. Een goede methode bestaat erin, het vloei ­
stofniveau voor het begin van de proef aan te duiden op het vat. Na elke monsterneming worden, bij uitgeschakelde beluchting en beroe ­
ring, nieuwe aanduidingen aangebracht. De eerste monsters worden 
steeds drie uur na het begin van de test genomen, teneinde adsorptie van testmateriaal aan het actief slib te kunnen ontdekken.
 
De verwijdering van het testmateriaal wordt gevolgd aan de hand 
van DOC- of COD-bepalingen, welke dagelijks of op andere gezette tijden worden uitgevoerd. De monsters uit het testvat en de blanco's 
worden gefiltreerd door een zorgvuldig gewassen papieren filter. De 
eerste 5 ml filtraat van de testoplossing worden niet gebruikt. Moei ­
lijk filtreerbaar slib kan worden afgescheiden door voorafgaand cen ­
trifugeren gedurende tien minuten. DOC- en COD-bepalingen wor ­
den ten minste in duplo uitgevoerd. De test duurt maximaal 28 
dagen.
 
Opmerking:  Monsters die troebel blijven, worden gefiltreerd door 
membraanfilters. De membraanfilters mogen geen organisch materi ­
aal afgeven of adsorberen.  
F u n c t i o n e l e c o n t r o l e v a n h e t a c t i e v e s l i b  
Parallel met elke testreeks wordt een vat met een bekende stof onder ­
zocht teneinde de functionele capaciteit van het actieve slib te con ­
troleren. Diëthyleenglycol is voor dit doel bruikbaar gebleken.  
A d a p t a t i e  
Indien de analyses met betrekkelijk korte intervallen worden uitge ­
voerd (bij voorbeeld dagelijks), komt het adaptatiefenomeen duide ­
lijk tot uiting in de afbraakkromme (zie figuur 2). Om deze reden 
wordt de test niet vlak voor het weekeinde gestart.  
Indien adaptatie in de laatste dagen van de test optreedt, kan de test 
worden verlengd tot de afbraak is beëindigd.  
Opmerking:  Indien een grondiger kennis van het gedrag van het 
geadapteerde slib nodig is, wordt hetzelfde actief slib nogmaals met hetzelfde testmateriaal in contact gebracht volgens de volgende procedure:
 
De roermotor en het beluchtingsapparaat worden uitgeschakeld en 
men laat het actief slib bezinken. De bovendrijvende vloeistof wordt 
verwijderd, het volume wordt met water op 2 liter gebracht, ver ­
volgens wordt er vijftien minuten geroerd, waarna men het slib weer laat bezinken. Nadat de bovendrijvende vloeistof weer is ver ­
wijderd, wordt het resterende slib gebruikt om de test met hetzelfde 
materiaal volgens 1.6.1.4 en 1.6.2 te herhalen. Het actief slib kan 
ook door centrifugeren in plaats van door bezinken worden afgezon ­
derd.
 
Het geadapteerde slib kan met vers slib worden gemengd tot een 
totale hoeveelheid van 0,2-1 g droog gewicht per liter.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l y s e  
Doorgaans worden de monsters gefiltreerd door een grondig gewas ­
sen papieren filter (voor het wassen wordt gedeïoniseerd water ge ­
bruikt).  
Monsters die troebel blijven, worden door membraanfilters gefil ­
treerd (0,45 μm). 
De DOC-concentratie in de filtraten van het monster (eerste 5 ml 
worden niet gebruikt) wordt, in duplo, bepaald met behulp van het DOC-instrument. Als analyse van de filtraten op dezelfde dag niet 
mogelijk is, worden deze tot de volgende dag in de koelkast be ­
waard. Langer bewaren wordt niet aanbevolen.
 
De COD-concentratie in de nitraten van het monster wordt bepaald 
met een COD-analyseapparaat volgens de procedure beschreven in 
referentie (2).  
2. RESULTATEN  
De DOC-en COD-concentraties in de monsters worden ten minste in 
duplo bepaald volgens 1.6.2. Het percentage afbraak op tijdstip T wordt berekend volgens de bij 1.2 gegeven formule (met definities).
 
De mate van afbraak wordt naar het dichtstbijzijnde geheel percent 
afgerond. De mate van afbraak die aan het eind van de test is ver ­
kregen, wordt opgegeven als de „biologische afbreekbaarheid in de 
Zahn-Wellens test”.  
Opmerking:  Indien volledige afbraak bereikt wordt voor het einde 
van de testduur en dit resultaat door een tweede analyse op de volgende dag wordt bevestigd, kan de test worden beëindigd.
 
3. VERSLAG  
3.1. TESTVERSLAG  
Het testrapport moet, indien mogelijk, bevatten:  
— de beginconcentratie van de teststof,  
— alle andere gegevens en experimentele resultaten betreffende de 
onderzochte stof, de referentiestof, indien gebruikt, en de blanco,  
— de concentratie na drie uur,  
— de biologische afbraakkromme met een toelichting,  
— datum en plaats van monsterneming van het inoculum, adaptatie ­
toestand, gebruikte concentratie, enz.,  
— wetenschappelijke verantwoording voor eventuele wijzigingen in 
de testprocedure.  
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Geleidelijke verwijdering van DOC of COD in de loop van dagen of 
weken betekent dat de teststof biologisch wordt afgebroken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Fysisch-chemische adsorptie kan echter in sommige gevallen een rol 
spelen en dit wordt aangetoond door een gehele of gedeeltelijke 
verwijdering van de teststof gedurende de eerste drie uur en door het onverwacht klem blijven van het verschil tussen de resultaten bekomen met de controlevloeistof en de bovendrijvende vloeistof.
 
Als er onderscheid moet worden gemaakt tussen de biologische 
afbraak (of gedeeltelijke biologische afbraak) en adsorptie, zijn aan ­
vullende proeven nodig.  
Dit kan op een aantal manieren geschieden, waarvan de meest ge ­
schikte erin bestaat de bovendrijvende vloeistof als inoculum te ge ­
bruiken in een test van het basisniveau (bij voorkeur een respiro ­
metrische test).  
Stoffen die in deze test een grote mate van niet door adsorptie ver ­
oorzaakte verwijdering van DOC (COD) te zien geven, dienen te worden beschouwd als potentieel biologisch afbreekbaar. Een ge ­
deeltelijke, niet door adsorptie veroorzaakte verwijdering duidt 
erop dat de stof ten minste in enige mate biologisch afbreekbaar is. Een geringe of ontbrekende verwijdering van DOC (COD) kan het gevolg zijn van remming van micro-organismen door de teststof 
en dit kan ook aan het licht komen door lysis en verlies van slib, 
hetgeen leidt tot troebele bovendrijvende vloeistoffen. In een derge ­
lijk geval moet de test worden herhaald met een lagere concentratie van teststof.
 
Door toepassing van een voor een verbinding specifieke analytische 
methode of van een met  I4 C gemerkte teststof kan een grotere ge ­
voeligheid worden bereikt. Bij onderzoek van een  14 C-verbinding 
vormt het terugvinden van  14 CO 2 de bevestiging dat biologische 
afbraak heeft plaatsgevonden.  
Wanneer resultaten worden uitgedrukt in termen van primaire bio ­
logische afbraak dient er, zo mogelijk, een verklaring gegeven te worden over de wijziging van de chemische structuur die leidt tot een vermindering van de respons van de oorspronkelijke teststof.
 
De validatie van de analytische methode moet opgegeven worden te 
zamen met de respons die gevonden werd met het blanco-testmedium.  
4. REFERENTIES  
(1) OESO, Parijs, 1981,  Testrichtlijn 302  B, Besluit C(81) 30 def. 
van de Raad.  
(2) Bijlage V, C.9 Degradatie: Chemisch zuurstofverbruik, Richtlijn 
84/449/EEG van de Commissie,  Publicatieblad van de Europese 
Gemeenschappen  nr. L 25 van 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Aanhangsel  
VOORBEELD VAN EEN VERSLAG 
Organische verbinding: 4-Ethoxybenzoczuur 
Theoretische testconcentratie: 600 mg/l Theoretische DOC: 390 mg/l 
Entmateriaal: Waterzuiveringsinstallatie van . . . 
Concentratie: 1 g droge stof per liter Adaptatietoestand: niet geadapteerd Analyse: DOC-bepaling 
Monstervolume: 3 ml 
Controlestof: Diëthyleenglycol Toxiciteit van de verbinding: Geen toxische effecten beneden 1 000 mg/l 
Gebruikte test: fermentatie/buizentest
 
Testtijd Controlestof Teststof 
Blanco 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l Netto DOC 
mg/l Afbraak 
% DOC (  1 ) 
mg/l Netto DOC 
mg/l Afbraak 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3, uur 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
l dag 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 dagen 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dagen 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 dagen 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 dagen 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dagen 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dagen 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dagen 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Gemiddelde waarden van bepalingen in triplo.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figuur 1  
Voorbeelden van krommen van de biologische afbraak
  
Figuur 2  
Voorbeelden van adaptatie van slib
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10. SIMULATIETEST AEROBE RIOOLWATERZUIVERING: C.10-A: 
ACTIEFSLIBINSTALLATIES — C.10-B: BIOFILMS  
C.10-A: Actiefslibinstallaties  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 303 (2001) van de OESO 
(TG 303). In de jaren 1950 bleek dat de nieuwe oppervlakteactieve stoffen die in het milieu werden gebracht, leidden tot overmatige schuimvorming in rioolwaterzuiveringsinstallaties en rivieren. Bij de aerobe zuivering werden 
deze stoffen niet volledig verwijderd en in sommige gevallen verhinderden 
zij de verwijdering van ander organisch materiaal. Daarom werd veel onder ­
zoek gedaan naar de mogelijkheden om oppervlakteactieve stoffen uit riool ­
water te verwijderen en naar de vraag of nieuwe stoffen die door de che ­
mische industrie werden geproduceerd, geschikt waren voor rioolwaterzui ­
vering. Hierbij werd gebruikgemaakt van modelinstallaties voor de twee voornaamste soorten aerobe biologische rioolwaterbehandeling (actief slib 
en filtering door percolatie of druppelfilters). Verspreiding en monitoring 
van elke nieuwe chemische stof in grootschalige rioolwaterzuiveringen zou, zelfs op plaatselijk niveau, onpraktisch en zeer kostbaar zijn geweest.
 
INLEIDENDE OVERWEGINGEN  
Actiefslibinstallaties  
2. Er zijn modellen van actiefslibinstallaties beschreven met een omvang tus ­
sen 300 ml en ongeveer 2 000 ml. Sommige waren een realistische imitatie van installaties op ware grootte, met bezinkingsvijvers waaruit het bezonken slib werd teruggepompt in de beluchtingstank, terwijl andere, zoals die van 
Swisher (1), geen bezinkingsvoorziening hadden. De omvang van de ap ­
paratuur is een compromis: enerzijds moet de apparatuur groot genoeg zijn om de mechanische bewerking met succes te kunnen uitvoeren en een toereikende hoeveelheid monsters te kunnen leveren zonder de bewerking 
te verstoren, terwijl de apparatuur anderzijds niet te veel plaats mag innemen 
en niet te veel materialen mag vergen.
 
3. Twee soorten apparatuur die veelvuldig en naar tevredenheid zijn gebruikt, 
zijn de installatie van Husmann (2) en de „poreuze pot” (3)(4), voor het 
eerst gebruikt bij de bestudering van oppervlakteactieve stoffen; zij worden 
in deze testmethode beschreven. Ook andere apparaten zijn naar tevreden ­
heid gebruikt, bv. de installatie van Eckenfelder (5). Omdat de uitvoering van die simulatietest relatief hoge kosten en grote inspanningen vergt, werd 
tegelijkertijd onderzoek gedaan naar eenvoudigere en goedkopere screening ­
tests, die inmiddels zijn opgenomen in hoofdstuk C.4 A-F van deze bijlage (6). De ervaring met vele oppervlakteactieve en andere stoffen heeft uitgewezen dat stoffen die de screeningtests doorstonden (en dus gemakke ­
lijk biologisch afbreekbaar waren) ook afbreekbaar bleken bij de simulatie ­
test. Sommige stoffen die de screeningtests niet doorstonden, doorstonden wel de tests op inherente biologische afbreekbaarheid (hoofdstukken C.12 (7) en C.19 (8) van deze bijlage), maar van deze laatste groep bleken er 
slechts enkele afbreekbaar in de simulatietest, terwijl de stoffen die de test 
op inherente biologische afbreekbaarheid niet doorstonden, ook niet afbreek ­
baar bleken in de simulatietests (9)(10)(11).
 
4. Voor sommige doeleinden volstaan simulatietests die onder één reeks be ­
drijfsomstandigheden worden uitgevoerd; de resultaten worden uitgedrukt 
als het percentage verwijderde teststof of opgeloste organische 
koolstof (DOC). In deze testmethode wordt een beschrijving van een der ­
gelijke test gegeven. In tegenstelling tot de eerdere versie van dit hoofdstuk, waarin slechts één soort apparatuur werd beschreven die kunstmatig afval ­
water behandelde met gekoppelde eenheden volgens een vrij grove slib ­
afvoermethode, biedt deze tekst echter een aantal varianten. Er worden
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
alternatieven beschreven voor het soort apparatuur, de werkwijze, het afval ­
water en de slibafvoer. De tekst sluit nauw aan bij die van ISO 11733 (12), 
die tijdens de voorbereiding zorgvuldig is onderzocht, hoewel de methode niet aan een ringonderzoek is onderworpen.
 
5. Voor andere doeleinden moet de concentratie van de teststof in het effluent 
nauwkeuriger bekend zijn en is een uitgebreidere methode vereist. Daarbij moet bijvoorbeeld gedurende de testperiode elke dag het percentage afge ­
voerd slib preciezer worden gecontroleerd en moeten de installaties bij een 
aantal afvoerpercentages functioneren. Bij de meest uitgebreide methode 
moeten tests bij twee of drie verschillende temperaturen worden verricht: een dergelijke methode is beschreven door Birch (13)(14) en samengevat in aanhangsel 6. De huidige kennis is echter ontoereikend om te kunnen be ­
slissen welke van de kinetische modellen van toepassing zijn op de bio ­
logische afbreekbaarheid van stoffen in een rioolwaterzuiveringsinstallatie en in het aquatisch milieu in het algemeen. Het model van Monod, dat bij wijze van voorbeeld in aanhangsel 6 wordt gegeven, is alleen geldig 
voor stoffen die in een concentratie van 1 mg/l of meer aanwezig zijn, maar 
volgens sommigen moet ook dit nog worden onderbouwd. In aanhangsel 7 worden tests vermeld die kunnen worden uitgevoerd bij concentraties die meer overeenstemmen met de in de praktijk in rioolwater aangetroffen 
niveaus, maar zij zijn, evenals die in aanhangsel 6, opgenomen in aanhang ­
sels en worden niet als afzonderlijke testmethoden verstrekt.
 
Filters  
6. Modellen met percolatiefilters hebben veel minder aandacht gekregen, mo ­
gelijk omdat zij omslachtiger en minder compact zijn dan modellen van 
actiefslibinstallaties. Gerike  et al.  hebben druppelfilterinstallaties ontwikkeld 
en toegepast met gekoppelde eenheden (15). Die filters waren relatief groot (2 m hoog; volume 60 l) en elk filter had een zuiveringscapaciteit van slechts 2 l/h. Baumann  et al.  (16) hebben druppelfilters gesimuleerd door 
strips van polyester („fleece”) in 1 m lange buizen (binnendiameter 14 mm) 
te plaatsen nadat zij gedurende 30 minuten in geconcentreerd actief slib waren ondergedompeld. De teststof werd, als enige koolstofbron in een oplossing van minerale zouten, van de bovenzijde door de verticale buis 
geleid en de biologische afbreekbaarheid werd beoordeeld door in het ef ­
fluent de DOC te meten en in het ontsnappende gas de CO
 2 . 
7. Biofilters zijn op een andere manier gesimuleerd (15): naar het binnenopper ­
vlak van roterende buizen, die een kleine hoek met het horizontale vlak maakten, werd afvalwater (ongeveer 250 ml/h) met en zonder teststof geleid; de verzamelde effluenten werden op DOC en/of de specifieke teststof ge ­
analyseerd.
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
8. Deze methode is ontworpen om in een continu werkend testsysteem dat het 
actiefslibproces nabootst de eliminatie en de primaire en/of totale biologi ­
sche afbraak van in water oplosbare organische stoffen door aerobe 
micro-organismen te bepalen. Als koolstof- en energiebronnen voor de 
micro-organismen worden een gemakkelijk biologisch afbreekbaar organisch medium en de organische teststof gebruikt.
 
9. Er vinden parallelle bepalingen, onder identieke omstandigheden, plaats met 
twee continu werkende testinstallaties (actiefslibinstallaties of poreuze pot ­
ten) die geschikt worden geacht voor de doeleinden van de test. Normaliter bedraagt de gemiddelde hydraulische retentietijd zes uur en de gemiddelde 
slibleeftijd (slibretentietijd) zes tot tien dagen. Het slib wordt afgevoerd met 
een van beide methoden; de teststof wordt normaliter in een concentratie tussen 10 mg/l opgeloste organische koolstof (DOC) en 20 mg/l DOC toegevoegd aan het influent (organisch medium) van slechts een van de 
installaties. De tweede installatie wordt gebruikt als controle-installatie om 
de biologische afbreekbaarheid van het organische medium te bepalen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. In frequent genomen monsters van beide effluenten wordt bij voorkeur de 
DOC bepaald, of anders het chemisch zuurstofverbruik (CZV), en in het 
effluent van de installatie waarin de teststof is geleid, wordt de concentratie van de teststof (indien vereist) door middel van een specifieke analyse bepaald. Het verschil tussen de DOC- of CZV-concentraties in het effluent 
van de testinstallatie en de controle-installatie wordt toegeschreven aan de 
teststof of de organische metabolieten ervan. Dit verschil wordt met de aan de toegevoegde teststof toegeschreven DOC- of CZV-concentratie van het influent vergeleken om de eliminatie van de teststof te bepalen.
 
11. De biologische afbraak kan normaliter van de biologische adsorptie worden 
onderscheiden door zorgvuldige bestudering van de eliminatie-tijdcurve en kan doorgaans worden bevestigd door de uitvoering van een test op gemak ­
kelijke biologische afbreekbaarheid met behulp van een geacclimatiseerd 
entmateriaal uit de installatie waarin de teststof is geleid.
 
INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
12. De zuiverheid, oplosbaarheid in water, vluchtigheid en 
adsorptie-eigenschappen van de teststof moeten bekend zijn om de resulta ­
ten goed te kunnen interpreteren. Normaliter kunnen vluchtige en onoplos ­
bare stoffen niet worden getest, tenzij er speciale voorzorgsmaatregelen 
worden genomen (zie aanhangsel 5). Ook de chemische structuur, of ten 
minste de molecuulformule, moet bekend zijn om theoretische waarden te kunnen berekenen en/of de gemeten waarden van parameters te kunnen controleren (bv. theoretisch zuurstofverbruik (ThOD), opgeloste organische 
koolstof (DOC) en chemisch zuurstofverbruik (CZV)).
 
13. Informatie over de giftigheid van de teststof voor micro-organismen (zie 
aanhangsel 4) kan nuttig zijn voor het kiezen van de juiste testconcentraties en kan essentieel zijn voor een juiste interpretatie van lage waarden voor de 
biologische afbraak.
 
NIVEAUS WAARBIJ DE TEST WORDT DOORSTAAN  
14. Bij de eerste uitvoering van deze (bevestigende) simulatietest ter bepaling 
van de primaire biologische afbreekbaarheid van oppervlakteactieve stoffen, moet meer dan 80 % van de specifieke stof worden verwijderd om de oppervlakteactieve stof te mogen verhandelen. Als de waarde van 80 % 
niet wordt gehaald, kan deze (bevestigende) simulatietest worden uitgevoerd 
en mag de oppervlakteactieve stof alleen worden verhandeld als meer dan 90 % van de specifieke stof wordt verwijderd. Voor stoffen in het algemeen is er geen sprake van dat de test al dan niet kan worden doorstaan en kan 
het verkregen verwijderingspercentage worden gebruikt in berekeningen 
voor de schatting van de waarschijnlijke milieuconcentratie die voor de beoordeling van de gevaren van stoffen wordt gebruikt. Bij de resultaten is het vaak „alles of niets”. In een aantal studies van zuivere stoffen die een 
significante mate van biologische afbreekbaarheid vertoonden, bedroeg het 
gevonden DOC-verwijderingspercentage voor meer dan drie kwart van de stoffen > 90 % en voor meer dan 90 % van de stoffen > 80 %.
 
15. Relatief weinig stoffen (bv. oppervlakteactieve stoffen) zijn in de bij deze 
test gebruikte concentraties (ongeveer 10 mg C/l) in het afvalwater aan ­
wezig. Sommige stoffen kunnen bij deze concentraties een inhibitoire wer ­
king hebben, terwijl de kinetiek van de verwijdering van andere stoffen bij lage concentraties anders kan zijn. Een nauwkeurigere beoordeling van de 
afbraak kan worden verkregen door gewijzigde methoden toe te passen, 
waarbij realistische lage concentraties van de teststof worden gebruikt, en de verzamelde gegevens kunnen worden gebruikt om kinetische constanten te berekenen. De benodigde experimentele technieken zijn echter nog niet 
volledig gevalideerd en de kinetische modellen die de reacties van de bio ­
logische afbraak beschrijven, zijn nog niet vastgesteld (zie aanhangsel 7).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFERENTIESTOFFEN  
16. Om te waarborgen dat de experimentele procedure correct wordt uitgevoerd, 
kan het soms nuttig zijn gelijktijdig met de onderzochte teststof andere stoffen te testen waarvan het gedrag bekend is. Daarbij kan het gaan om 
stoffen als adipinezuur, 2-fenylfenol, 1-naftol, difenylzuur en 1-naftoëzuur 
(9)(10)(11).
 
REPRODUCEERBAARHEID VAN TESTRESULTATEN  
17. Er zijn veel minder studieverslagen over simulatietests dan over tests op 
gemakkelijke biologische afbreekbaarheid. De reproduceerbaarheid tussen 
(gelijktijdige) duplo’s is goed (binnen 10-15 %) voor teststoffen die voor 
ten minste 80 % afbraken, maar voor minder goed afgebroken stoffen is de variabiliteit groter. Ook voor sommige stoffen die een grensgeval zijn, wer ­
den tijdens de negen weken dat de test mag duren, bij verschillende gele ­
genheden zeer uiteenlopende resultaten (bv. 10 % en 90 %) geregistreerd.
 
18. De resultaten met de twee soorten apparatuur ontliepen elkaar niet veel, 
maar sommige stoffen braken in huishoudelijk afvalwater beter en consis ­
tenter af dan in kunstmatig OESO-afvalwater.  
BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
Apparatuur  
Testsysteem  
19. Het testsysteem voor één teststof bestaat uit een testinstallatie en een 
controle-installatie; wanneer echter uitsluitend specifieke analysen worden 
verricht (primaire biologische afbreekbaarheid), volstaat een testinstallatie. Een controle-installatie kan worden gebruikt voor verscheidene testinstalla ­
ties met dezelfde of verschillende teststoffen. Als testeenheden worden ge ­
koppeld (aanhangsel 3), moet elke testinstallatie haar eigen controle-installatie hebben. Het testsysteem kan hetzij een actiefslibmodel volgens Husmann (aanhangsel 1, figuur 1), hetzij een poreuze pot (aan ­
hangsel 1, figuur 2) zijn. In beide gevallen zijn opslagtanks van voldoende 
omvang voor het influent en het effluent vereist, evenals pompen voor de dosering van het influent (al dan niet gemengd met de oplossing van de teststof).
 
20. Elke actiefslibinstallatie bestaat uit een beluchtingsvat met een bekende 
capaciteit van ongeveer 3 liter actief slib en een nabezinkvat (secundaire zuivering) met een inhoud van ongeveer 1,5 liter; de volumes kunnen enigs ­
zins worden gewijzigd door de hoogte van het nabezinkvat aan te passen. 
Vaten van een andere omvang zijn toegestaan als deze onder een vergelijk ­
bare hydraulische belasting worden gebruikt. Als de temperatuur in de test ­
kamer niet binnen het gewenste bereik kan worden gehouden, wordt aan ­
bevolen watermantelvaten met regelbare watertemperatuur te gebruiken. Om 
het actief slib uit het nabezinkvat terug te leiden naar het beluchtingsvat, wordt een continu of niet-continu functionerende persluchtpomp of doseer ­
pomp gebruikt.
 
21. Het poreuzepotsysteem bestaat uit een poreuze binnencilinder met een ke ­
gelvormige bodem, geplaatst in een iets groter vat met dezelfde vorm, dat echter uit ondoordringbare kunststof bestaat. Een geschikt materiaal voor het 
poreuze vat is poreus polyethyleen met een maximale poriegrootte van 90 
μm en een dikte van 2 mm. Het slib wordt van het behandelde organische 
medium gescheiden door differentiële passage door de poreuze wand. Het effluent wordt verzameld in de ringvormige ruimte, waaruit het overloopt in 
het opvangvat. Aangezien er geen bezinking plaatsvindt, wordt het slib niet 
teruggeleid. Het hele systeem kan worden gemonteerd in een waterbad met
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
temperatuurregeling. In het begin kunnen poreuze potten verstopt raken en 
overstromen. In dat geval wordt de poreuze voering door een schone voe ­
ring vervangen, waarbij eerst het slib uit de pot in een schone emmer wordt overgeheveld. Na de ondoordringbare buitencilinder te hebben schoonge ­
veegd, wordt een schone voering aangebracht en wordt het slib weer in 
de pot overgebracht. Ook slib dat aan de verstopte voering is blijven plak ­
ken, wordt zorgvuldig afgeschraapt en overgebracht. Reinig verstopte potten eerst door met een fijne waterstraal het achterblijvende slib te verwijderen en de pot te dompelen in een verdunde oplossing van natriumhypochloriet 
en vervolgens in water, gevolgd door grondig spoelen met water.
 
22. Voor het beluchten van het slib in de beluchtingsvaten van beide systemen 
moeten geschikte technieken worden toegepast, bijvoorbeeld poreus materi ­
aal (beluchtingsstenen) en perslucht. De lucht moet zo nodig door een geschikt filter worden gezuiverd en gereinigd. Er moet voldoende lucht 
door het systeem gaan om op ieder moment van de test aerobe omstandig ­
heden te behouden en slibvlokken in suspensie te houden.
 
Filtreerapparaat of centrifuge  
23. Apparaat voor het filtreren van monsters over membraanfilters met een 
geschikte porositeit (nominale openingsdiameter 0,45 μm) die oplosbare or ­
ganische stoffen adsorberen en zo min mogelijk organische koolstof vrij laten komen. Als filters worden gebruikt die organische koolstof vrij laten 
komen, worden de filters zorgvuldig met warm water gewassen om uitloog ­
bare organische koolstof te verwijderen. Bij wijze van alternatief kan een centrifuge worden gebruikt die een versnelling van 40 000 m/s
 2 kan produ ­
ceren.  
Analyseapparatuur  
24. Apparatuur die nodig is voor de bepaling van:  
— DOC (opgeloste organische koolstof) en TOC (totale hoeveelheid orga ­
nische koolstof) of CZV (chemisch zuurstofverbruik);  
— de specifieke stof, indien nodig;  
— gesuspendeerde vaste stoffen, pH, zuurstofconcentratie in water;  
— temperatuur, zuurgraad en alkaliteit;  
— ammonium, nitriet en nitraat, als de test wordt uitgevoerd onder om ­
standigheden waarin nitrificatie mogelijk is.  
Water  
25. Kraanwater met een DOC-gehalte van minder dan 3 mg/l. Bepaal de alka ­
liteit, tenzij deze al bekend is.  
26. Gedeïoniseerd water met een DOC-gehalte van minder dan 2 mg/l.  
Organisch medium  
27. Als organisch medium is kunstmatig afvalwater, huishoudelijk afvalwater of 
een mengsel van beide soorten afvalwater toegestaan. Gebleken is (11)(14) 
dat het gebruik van huishoudelijk afvalwater alleen veelal een hoger per ­
centage DOC-verwijdering oplevert en dat daarin zelfs bepaalde stoffen verwijderd en biologisch afgebroken kunnen worden die bij gebruik van kunstmatig OESO-afvalwater niet afbreken. Bovendien wordt het actief 
slib vaak gestabiliseerd wanneer continu of met tussenpozen huishoudelijk 
afvalwater wordt toegevoegd, waardoor de cruciale goede bezinking kan plaatsvinden. Daarom wordt het gebruik van huishoudelijk afvalwater aan ­
bevolen. Meet de DOC- of CZV-concentratie van elke nieuwe partij van het 
organische medium. De zuurgraad of alkaliteit van het organische medium 
moet bekend zijn. Als het organische medium een lage zuurgraad of alka ­
liteit heeft, kan het nodig zijn een geschikte bufferoplossing (natriumwater ­
stofcarbonaat of kaliumdiwaterstoffosfaat) toe te voegen om tijdens de test 
in het beluchtingsvat een pH-waarde van ongeveer 7,5 ± 0,5 te behouden. In 
elk afzonderlijk geval moet worden besloten hoeveel en op welk moment een bufferoplossing wordt toegevoegd. Wanneer voortdurend en/of met tus ­
senpozen mengsels worden gebruikt, moet de DOC- (of CZV-)waarde van 
het mengsel ongeveer constant worden gehouden, bijvoorbeeld door ver ­
dunning met water.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Kunstmatig afvalwater  
28. Per liter leidingwater worden opgelost: pepton, 160 mg; vleesextract, 110 
mg; ureum, 30 mg; watervrij dikaliumwaterstoffosfaat (K  2 HPO  4 ), 28 mg; 
natriumchloride (NaCl), 7 mg; calciumchloridedihydraat (CaCl  2 .2H  2 O), 4 
mg; magnesiumsulfaatheptahydraat (Mg  2 SO 4 .7H  2 O), 2 mg. Dit kunstmatig 
OESO-afvalwater is een voorbeeld en geeft een gemiddelde DOC-concentratie in het influent van ongeveer 100 mg/l. Bij wijze van alternatief mogen ook andere samenstellingen worden gebruikt die ongeveer 
dezelfde DOC-concentratie opleveren en het feitelijke afvalwater beter be ­
naderen. Als een minder geconcentreerd influent vereist is, wordt het kunst ­
matige afvalwater met kraanwater verdund, bijvoorbeeld in een verhouding 
van 1:1 om een concentratie van ongeveer 50 mg/l te bereiken. Een derge ­
lijk minder geconcentreerd influent bevordert de groei van nitrificerende organismen en moet worden gebruikt wanneer nitrificerende rioolwaterzui ­
veringsinstallaties moeten worden gesimuleerd. Dit kunstmatige afvalwater 
mag in geconcentreerde vorm van gedistilleerd water worden bereid en ten 
hoogste één week worden bewaard bij ongeveer 1 °C. Zo nodig wordt het met kraanwater verdund. (Dit medium is onbevredigend, bijvoorbeeld omdat het stikstofgehalte zeer hoog is en het koolstofgehalte relatief laag, maar er 
is nog geen beter voorstel gedaan, afgezien van de toevoeging van meer 
fosfaat als buffer en extra pepton).
 
Huishoudelijk afvalwater  
29. Gebruik vers bezonken rioolwater dat dagelijks wordt verzameld uit een 
rioolwaterzuiveringsinstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater 
ontvangt. Het wordt voorafgaand aan de primaire bezinking verzameld uit 
het overloopkanaal van de primaire bezinkingstank of uit de inlaat van de actiefslibinstallatie en moet grotendeels vrij zijn van grove deeltjes. Het 
rioolwater kan worden gebruikt na enige dagen (gewoonlijk niet meer dan 
zeven) bij ongeveer 4 °C te zijn bewaard, mits aangetoond wordt dat tijdens de opslag de DOC- (of CZV-)waarde niet significant (met minder dan 20 %) is gedaald. Om verstoringen van het systeem te voorkomen, moet de DOC 
(of het CZV) van elke nieuwe partij voor gebruik op een passende constante 
waarde worden gebracht, bijvoorbeeld door verdunning met kraanwater.
 
Actief slib  
30. Verzamel actief slib voor het enten uit de beluchtingstank van een goed 
functionerende rioolwaterzuiveringsinstallatie of uit een actiefslibinstallatie 
op laboratoriumschaal, die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater verwerkt.  
Stamoplossingen van de teststof  
31. Bereid voor stoffen die voldoende oplosbaar zijn, stamoplossingen in een 
geschikte concentratie (bv. 1 tot 5 g/l) in gedeïoniseerd water of in de 
minerale fractie van het kunstmatig afvalwater (zie aanhangsel 5 voor on ­
oplosbare en vluchtige stoffen). Bepaal de DOC en de totale hoeveelheid organische koolstof (TOC) van de stamoplossing en herhaal de metingen voor elke nieuwe partij. Controleer, als het verschil tussen de DOC en de 
TOC groter is dan 20 %, de oplosbaarheid in water van de teststof. Ver ­
gelijk de DOC of de met een specifieke analyse van de stamoplossing bepaalde concentratie van de teststof met de nominale waarde om vast te stellen of de recovery toereikend is (normaliter kan een waarde van > 90 % 
worden verwacht). Bepaal, in het bijzonder voor dispersies, of al dan niet 
gebruik kan worden gemaakt van de DOC als analytische parameter, dan wel of alleen een specifieke analysetechniek voor de teststof kan worden gebruikt. Monsters van dispersies moeten worden gecentrifugeerd. Voor elke 
nieuwe partij wordt de DOC of het CZV gemeten, dan wel de teststof met 
een specifieke analyse.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Bepaal de pH van de stamoplossing. Extreme waarden wijzen erop dat de 
toevoeging van de stof van invloed kan zijn op de pH van het actief slib in 
het testsysteem. Neutraliseer in dat geval de stamoplossing met kleine hoe ­
veelheden van een anorganisch zuur of een anorganische base om een pH van 7 ± 0,5 te verkrijgen, maar let erop dat de teststof niet neerslaat.
 
PROCEDURE  
33. De procedure wordt beschreven voor de actiefslibinstallaties; voor het po ­
reuzepotsysteem zijn enige aanpassingen nodig.  
Bereiding van het entmateriaal  
34. Aan het begin van de test wordt het testsysteem geënt met actief slib of een 
entmateriaal met een lage concentratie micro-organismen. Bewaar het ent ­
materiaal voorafgaand aan het gebruik in beluchte toestand bij kamertem ­
peratuur en gebruik het binnen 24 uur. Neem in het eerste geval een monster van het actief slib uit de beluchtingstank van een goed functionerende bio ­
logische rioolwaterzuiveringsinstallatie of een laboratoriumzuiveringsinstal ­
latie, die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Als omstandig ­
heden moeten worden gesimuleerd waarin nitrificatie mogelijk is, wordt slib genomen van een nitrificerende rioolwaterzuiveringsinstallatie. Bepaal de concentratie gesuspendeerde vaste stoffen en concentreer het slib zo nodig 
door middel van bezinking, zodat zo min mogelijk volume aan het test ­
systeem wordt toegevoegd. Zorg voor een aanvangsconcentratie droge stof van ongeveer 2,5 g/l.
 
35. Gebruik in het tweede geval 2 tot 10 ml/l van het effluent van een bio ­
logische zuiveringsinstallatie voor huishoudelijk rioolwater als entmateriaal. Om zo veel mogelijk verschillende soorten bacteriën te krijgen, kan het 
nuttig zijn entmateriaal uit diverse andere bronnen toe te voegen, bijvoor ­
beeld uit het oppervlaktewater. In dat geval zal het actief slib zich in het testsysteem ontwikkelen en groeien.
 
Dosering van het organische medium  
36. Zorg ervoor dat de houders voor het influent en het effluent en de slangen 
vanuit de influentvaten en naar de effluentvaten grondig zijn gereinigd om 
microbiële groei voorafgaand en gedurende de test te voorkomen. Monteer de testsystemen in een kamer met temperatuurregeling (normaliter tussen 20 
en 25 °C) of gebruik testeenheden met watermantel. Bereid een toereikende 
hoeveelheid van het vereiste organisch medium (punten 27-29). Vul eerst het beluchtingsvat en het nabezinkvat met het organische medium en voeg daaraan het entmateriaal (punten 34 en 35) toe. Start de beluchting op 
zodanige wijze dat het slib in suspensie en in aerobe toestand wordt gehou ­
den en begin met de dosering van het influent en de terugvoer van het bezonken slib. Pomp het organische medium uit opslagvaten in de beluch ­
tingsvaten (punten 20 en 21) van de test- en controle-installatie en verzamel 
de respectieve effluenten in soortgelijke opslagvaten. Om de normale hy ­
draulische retentietijd van 6 uur te verkrijgen, wordt het organische medium met 0,5 l/h in de vaten gepompt. Meet, om deze snelheid te controleren, de dagelijks ingebrachte hoeveelheid organisch medium door de afname van de 
hoeveelheid van het medium in de opslagvaten te noteren. Om de effecten 
van onderbroken afgifte van en schoksgewijze belasting met chemische stoffen te kunnen bepalen, zijn andere wijzen van dosering vereist.
 
37. Als het organische medium bereid wordt om gedurende meer dan één dag te 
worden gebruikt, moet het bij ongeveer 4 °C worden gekoeld of moet een andere conserveermethode worden toegepast om microbiële groei en bio ­
logische afbraak buiten de testinstallaties tegen te gaan (punt 29). Als kunst ­
matig afvalwater wordt gebruikt, kan een geconcentreerde stamoplossing 
(bv. tien keer de normale concentratie, punt 28) worden bereid en bij on ­
geveer 4 °C worden bewaard. Deze stamoplossing kan voor gebruik goed worden vermengd met een passende hoeveelheid kraanwater; een andere 
mogelijkheid is om de stamoplossing rechtstreeks in de vaten te pompen 
en afzonderlijk de juiste hoeveelheid kraanwater toe te voegen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dosering van de teststof  
38 Voeg een passende hoeveelheid van de stamoplossing van de teststof (punt 
31) toe aan het opslagvat van het influent of pomp deze hoeveelheid met een afzonderlijke pomp rechtstreeks in het beluchtingsvat. De normale ge ­
middelde testconcentratie in het influent bedraagt 10 tot 20 mg/l DOC, met 
een hoogste concentratie van 50 mg/l. Als de teststof slecht oplosbaar is in water of toxische effecten worden verwacht, wordt de concentratie verlaagd naar 5 mg/l DOC of nog lager, maar alleen als er een geschikte specifieke 
analysemethode beschikbaar is en wordt toegepast (gedispergeerde teststof ­
fen die slecht oplosbaar zijn in water, kunnen met speciale doseertechnieken worden toegevoegd; zie aanhangsel 5).
 
39. Begin, nadat het systeem is gestabiliseerd en efficiënt DOC uit het organi ­
sche medium verwijderd (ongeveer 80 %), met het toevoegen van de test ­
stof. Het is belangrijk dat vóór het toevoegen van de teststof wordt gecon ­
troleerd of alle installaties even efficiënt functioneren; als dit niet het geval 
is, helpt het gewoonlijk om het afzonderlijke slib te mengen en gelijke hoeveelheden over de afzonderlijke installaties te herverdelen. Wanneer ge ­
bruik wordt gemaakt van een entmateriaal van (ongeveer) 2,5 g/l actief slib 
(drooggewicht), kan de teststof vanaf het begin van de test worden toege ­
voegd, aangezien de directe toevoeging vanaf het begin van toenemende hoeveelheden als voordeel heeft dat het actief slib zich beter aan de teststof kan aanpassen. Ongeacht de wijze waarop de teststof wordt toegevoegd, 
wordt aanbevolen met regelmatige intervallen de relevante stroomsnelheid 
en/of de volumes in het opslagvat of de opslagvaten te meten.
 
Behandeling van actief slib  
40. Ongeacht het gebruikte entmateriaal stabiliseert de concentratie van het 
actief slib gewoonlijk tijdens de test op een waarde tussen 1 en 3 g/l 
(drooggewicht), afhankelijk van de kwaliteit en de concentratie van het 
organische medium, de bedrijfsomstandigheden, de aard van de aanwezige micro-organismen en de invloed van de teststof.
 
41. Bepaal hetzij ten minste wekelijks de gesuspendeerde vaste stoffen in de 
beluchtingsvaten en voer de overmaat slib af om de concentratie tussen 1 en 3 g/l (drooggewicht) te houden, of houd de gemiddelde slibleeftijd op een constante waarde, gewoonlijk tussen zes en tien dagen. Als bijvoorbeeld een 
slibretentietijd van acht dagen wordt gekozen, wordt dagelijks 1/8 van het 
volume van het actief slib in het beluchtingsvat verwijderd en afgevoerd. Herhaal dit dagelijks of laat dit, bij voorkeur, uitvoeren door een automa ­
tische niet-continu functionerende pomp. Door de concentratie van de ge ­
suspendeerde vaste stoffen constant, of binnen strikte grenswaarden, te hou ­
den, wordt niet gezorgd voor een constante slibretentietijd (SRT); dit is echter de operationele variabele die de waarde van de concentratie van de teststof in het effluent bepaalt.
 
42. Verwijder gedurende de test ten minste dagelijks het slib dat aan de wanden 
van het beluchtingsvat en het nabezinkvat plakt, zodat dit weer in suspensie wordt gebracht. Controleer en reinig regelmatig alle buizen en slangen om 
biofilmgroei te voorkomen. Voer het bezonken slib uit het nabezinkvat terug 
naar het beluchtingsvat, bij voorkeur door met onderbrekingen te pompen. In het poreuzepotsysteem vindt geen terugvoer plaats; zorg ervoor dat er schone binnenpotten zijn geplaatst voordat het volume in het vat significant 
toeneemt (punt 21).
 
43. In installaties van Husmann kan een slechte bezinking en verlies van slib 
optreden. Dit kan worden gecorrigeerd door in de test- en controle-installatie 
tegelijkertijd één of meer van de onderstaande acties te verrichten:  
— met regelmatige intervallen, bijvoorbeeld wekelijks, kan vers slib of 
flocculant (bv. per vat 2 ml FeCl  3 van 50 g/l) worden toegevoegd, 
waarbij erop moet worden gelet dat de toevoeging van FeCl  3 geen 
reactie of neerslag van de teststof induceert;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— de persluchtpomp kan worden vervangen door een peristaltische pomp, 
waardoor een slibrecirculatiestroom op gang kan worden gebracht die 
ongeveer gelijk is aan de vereiste influentstroom en de ontwikkeling van een anaerobe zone in het bezonken slib kan ontstaan (door de configu ­
ratie van de persluchtpomp kan de stroomsnelheid van het teruggevoerde 
slib niet lager zijn dan 12 keer de stroomsnelheid van het influent);
 
— er kan met onderbrekingen slib uit het nabezinkvat in het beluch ­
tingsvat worden gepompt (bv. 5 minuten inschakeltijd per 2,5 uur 
om 1 tot 1,5 l/h terug te voeren);  
— om verlies door schuimvorming te voorkomen, kan een minimale 
concentratie niet-toxisch antischuimmiddel worden gebruikt (bv. si ­
liconenolie);  
— het slib kan in het nabezinkvat kortstondig schoksgewijs worden 
belucht (bv. gedurende 10 s per uur);  
— het organische medium kan met intervallen in het beluchtingsvat 
worden ingebracht (bv. gedurende 3 tot 10 minuten per uur).  
Bemonstering en analyse  
44. Meet met regelmatige tussenpozen het gehalte aan opgeloste zuurstof, de 
temperatuur en de pH-waarde van het actief slib in de beluchtingsvaten. 
Zorg ervoor dat er steeds voldoende zuurstof beschikbaar is (> 2 mg/l) en 
dat de temperatuur binnen het voorgeschreven bereik blijft (normaliter 20 tot 25 °C). Houd de pH-waarde op 7,5 ± 0,5 door kleine hoeveelheden van een anorganische base of een anorganisch zuur aan het beluchtingsvat of het 
influent toe te voegen of door de buffercapaciteit van het organische me ­
dium te vergroten (zie punt 27). Indien nitrificatie optreedt, wordt zuur geproduceerd, waarbij de oxidatie van 1 mg N het equivalent van ongeveer 7 mg CO
 3 – oplevert. De meetfrequentie hangt af van de te meten parameter 
en de stabiliteit van het systeem, en kan variëren van één keer per dag tot 
één keer per week.  
45. Meet de DOC of het CZV in de influenten van de controle- en testvaten. 
Meet de concentratie van de teststof in het testinfluent door een specifieke analyse te verrichten of schat deze aan de hand van de concentratie in de 
stamoplossing (punt 31), het gebruikte volume en de in de testinstallatie 
ingebrachte hoeveelheid afvalwater. Om de variabiliteit van de concentra ­
tiegegevens te beperken, wordt aanbevolen de concentratie van de teststof te berekenen.
 
46. Neem passende monsters van het verzamelde effluent (bv. composietmon ­
sters voor 24 uur) en filtreer de monsters over een membraan met porie ­
grootte 0,45 μm of centrifugeer ze gedurende ongeveer 15 minuten bij 
ongeveer 40 000 m/s  2 . Als filtratie moeilijk is, moet worden gecentrifugeerd. 
Bepaal de DOC of het CZV ten minste in duplo om de totale biologische afbraak te meten en bepaal zo nodig de primaire biologische afbraak door 
een specifieke analyse voor de teststof uit te voeren.
 
47. Het gebruik van de COD kan bij lage concentraties analytische problemen 
opleveren en wordt daarom alleen aangeraden bij een voldoende hoge test ­
concentratie (ongeveer 30 mg/l). Voor sterk adsorberende stoffen wordt bovendien aanbevolen de in het slib geadsorbeerde hoeveelheid te meten 
met een op de teststof afgestemde specifieke analysetechniek.
 
48. De bemonsteringsfrequentie hangt af van de verwachte duur van de test. Een 
frequentie van drie keer per week wordt aanbevolen. Wacht nadat de in ­
stallaties efficiënt functioneren, na inbrenging van de teststof één tot maxi ­
maal zes weken om het actief slib zich te laten aanpassen en een stationaire toestand te bereiken. Er moeten bij voorkeur ten minste 15 geldige waarden 
worden verkregen in de plateaufase (punt 59), die normaliter 3 weken duurt, 
om het testresultaat te evalueren. De test kan worden beëindigd als een toereikend eliminatiepercentage (bv. > 90 %) is bereikt en deze 15 waarden beschikbaar zijn, die afkomstig zijn van analysen die gedurende drie weken 
elke werkdag zijn verricht. De test mag normaliter na toevoeging van de 
teststof niet langer dan twaalf weken duren.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Als in het slib nitrificatie plaatsvindt en bestudeerd moet worden welke 
invloed de teststof daarop heeft, worden ten minste één keer per week 
monsters van het effluent van de test- en controle-installatie geanalyseerd op ammonium en/of nitriet plus nitraat.
 
50. Alle analysen, en met name de stikstofbepalingen, worden zo spoedig mo ­
gelijk verricht. Als analysen moeten worden uitgesteld, worden de monsters in het donker bij ongeveer 4 °C bewaard in volle, goed afgesloten flessen. Als de monsters langer dan 48 uur moeten worden bewaard, worden zij 
geconserveerd door invriezen, zuurbehandeling (bv. 10 ml/l van een zwa ­
velzuuroplossing van 400 g/l) of toevoeging van een geschikte toxische stof (bv. 20 ml/l van een kwik(II)chloride-oplossing van 10 g/l). De conserveer ­
techniek mag de resultaten van de analyse niet beïnvloeden.
 
Koppeling van testinstallaties  
51. Als gebruik moet worden gemaakt van gekoppelde installaties (aanhangsel 
3), wordt dagelijks dezelfde hoeveelheid actief slib (150 tot 1 500 ml voor beluchtingsvaten die 3 liter vloeistof bevatten) uitgewisseld tussen de be ­
luchtingsvaten van de testinstallatie en de controle-installatie daarvan. Als de 
teststof sterk aan het slib adsorbeert, wordt alleen het supernatans van de 
nabezinkvaten uitgewisseld. Gebruik in beide gevallen een correctiefactor om de testresultaten te berekenen (punt 55).
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
52. Bereken met de volgende vergelijking de procentuele DOC- of 
CZV-eliminatie van de teststof voor elk beoordelingsmoment:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
waarbij  
D t = % DOC- of CZV-eliminatie op tijdstip t;  
C s = aan de teststof toegeschreven DOC of CZV in het influent, bij voor ­
keur geschat aan de hand van de stamoplossing (mg/l);  
E = gemeten DOC- of CZV-waarde in het testeffluent op tijdstip t (mg/l);  
E o = gemeten DOC- of CZV-waarde in het controle-effluent op tijdstip t 
(mg/l).  
53. De mate van DOC- of CZV-eliminatie van het organische medium in de 
controle-installatie is informatie die nuttig is voor de beoordeling van de biologische afbraakactiviteit van het actief slib tijdens de test. Bereken de 
procentuele eliminatie met de volgende vergelijking:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
waarbij  
D B = % DOC- of CZV-eliminatie van het organische medium in de 
controle-installatie op tijdstip t;  
C M = DOC of CZV van het organische medium in het controle-influent 
(mg/l).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Desgewenst kan de procentuele DOC- of CZV-eliminatie als gevolg van het 
organische medium plus de teststof in de testinstallatie worden berekend met 
de volgende vergelijking:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
waarbij  
D T = % DOC- of CZV-eliminatie van het totale testinfluent;  
C T = DOC of CZV van het totale testinfluent of berekend aan de hand van 
de stamoplossingen (mg/l);  
54. Bereken, als met een specifieke analysemethode de teststof wordt gemeten, 
voor elk meettijdstip de verwijdering van de teststof met de volgende ver ­
gelijking:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
waarbij  
D ST = % primaire eliminatie van teststof op tijdstip t;  
S i = gemeten of geschatte concentratie van de teststof in het testinfluent 
(mg/l);  
S e = gemeten concentratie van de teststof in het testeffluent op tijdstip t 
(mg/l).  
55. Als gewerkt is met gekoppelde eenheden, wordt de verdunning van de 
teststof in het beluchtingsvat als gevolg van de uitwisseling van het slib gecompenseerd door een correctiefactor toe te passen (zie aanhangsel 3). Als de gemiddelde hydraulische retentietijd 6 uur bedraagt en de helft van het 
volume van het actief slib in het beluchtingsvat is uitgewisseld, moeten de 
bepaalde dagelijkse eliminatiewaarden (D
 t , punt 52) met de volgende ver ­
gelijking worden gecorrigeerd om de feitelijke mate van eliminatie van de teststof D
 tc te verkrijgen:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Uitdrukking van de testresultaten  
56. Zet de procentuele eliminatie D  t (of D  tc ) en D  st , indien beschikbaar, uit 
tegen de tijd (zie aanhangsel 2). Uit de vorm van de eliminatiecurve van de teststof (als zodanig of als DOC) kunnen enkele conclusies over het 
verwijderingsproces worden afgeleid.
 
Adsorptie  
57. Als vanaf het begin van de test een grote mate van DOC-eliminatie van de 
teststof wordt waargenomen, wordt de teststof waarschijnlijk geëlimineerd 
door adsorptie aan de vaste stoffen van het actief slib. Dit kan worden aangetoond door met een specifieke analyse de geadsorbeerde teststof te bepalen. Het is niet gebruikelijk dat gedurende de hele test een hoge mate 
van DOC-eliminatie van adsorbeerbare stoffen plaatsvindt; normaliter is de 
mate van verwijdering in eerste instantie groot, waarna geleidelijk een even ­
wichtswaarde wordt bereikt. Als de adsorbeerbare teststof echter op de een of andere manier kan zorgen voor acclimatisering van de microbiële popu ­
latie, neemt de DOC-eliminatie van de teststof vervolgens toe en wordt een 
hoge plateauwaarde bereikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Aanloopfase  
58. Net als in statische screeningtests hebben veel teststoffen een aanloopfase 
nodig voordat volledige biologische afbraak plaatsvindt. In de aanloopfase vindt acclimatisering of aanpassing van de afbraakbacteriën plaats en wordt 
de teststof nagenoeg niet verwijderd; vervolgens gaan deze bacteriën groei ­
en. Deze fase duurt totdat ongeveer 10 % van de initiële hoeveelheid teststof is verwijderd (nadat eventuele adsorptie heeft kunnen plaatsvinden); op dat moment begint de afbraakfase. De aanloopfase is vaak zeer variabel en 
slecht reproduceerbaar.
 
Plateaufase  
59. In een continue test is de plateaufase van een eliminatiecurve de fase waarin 
de maximale afbraak plaatsvindt. De plateaufase moet ten minste drie weken duren en omvat ongeveer 15 geldige gemeten waarden.
 
Gemiddeld eliminatiepercentage van de teststof  
60. Bereken het gemiddelde van de eliminatiewaarden (D  t ) van de teststof in de 
plateaufase. Rond de gevonden waarde af op het dichtstbijzijnde gehele 
getal (1 %); dit is het eliminatiepercentage van de teststof. Aanbevolen 
wordt tevens het 95 %-betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelde waarde te berekenen.
 
Eliminatie van het organische medium  
61. Zet de procentuele eliminatie van de DOC of het CZV van het organische 
medium in de controle-installatie (D  B ) uit tegen de tijd. Geef het gemiddelde 
eliminatiepercentage op dezelfde wijze aan als voor de teststof (punt 60).  
Aanduiding van biologische afbraak  
62. Als de teststof niet significant aan het actief slib adsorbeert en de elimina ­
tiecurve een vorm heeft die typerend is voor biologische afbraak met aan ­
loopfase, afbraakfase en plateaufase (punten 58 en 59), kan de gemeten eliminatie zonder meer aan biologische afbraak worden toegeschreven. Als een grote mate van initiële verwijdering heeft plaatsgevonden, kan in de 
simulatietest geen onderscheid worden gemaakt tussen biologische en 
niet-biologische eliminatieprocessen. In dergelijke gevallen, alsook in andere gevallen waarin getwijfeld wordt over de biologische afbraak (bv. als wordt gestript), moeten de geadsorbeerde teststoffen worden geanalyseerd of aan ­
vullende statische biologischeafbraaktests worden verricht voor parameters 
die duidelijk op biologische processen wijzen. Dergelijke tests zijn de me ­
thoden voor zuurstofopname (hoofdstukken C.4 D, E en F van deze bijlage (6)), een test waarbij de productie van kooldioxide wordt gemeten 
(hoofdstuk C.4 C van deze bijlage (6)) en de ISO-gasruimteproef (18), 
waarvoor van tevoren blootgesteld entmateriaal uit de simulatietest wordt gebruikt. Als de verwijdering van zowel de DOC als de specifieke stof is gemeten, wijzen significante verschillen tussen beide verwijderingspercenta ­
ges (waarbij het eerste lager is dan het tweede) op de aanwezigheid van 
organische tussenproducten in de effluenten, die moeilijker afbreekbaar kun ­
nen zijn dan de oorspronkelijke stof.
 
Geldigheid van testresultaten  
63. Als het eliminatiepercentage van het organische medium (punt 53) in de 
controle-installatie is bepaald, is er informatie over het normale biologische afbraakgedrag van het entmateriaal. De test wordt geldig geacht als de mate 
van DOC- of CZV-eliminatie in de controle-installatie(s) na twee weken > 
80 % is en geen ongebruikelijke waarnemingen zijn gedaan.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Als een gemakkelijk biologisch afbreekbare (referentie)stof is gebruikt, moet 
de mate van biologische afbraak (D  t , punt 52) > 90 % zijn.  
65. Als de test is uitgevoerd onder omstandigheden waarin nitrificatie mogelijk 
is, moeten de gemiddelde concentraties aan ammoniumstikstof en nitriets ­
tikstof in de effluenten respectievelijk < 1 mg/l en < 2 mg/l zijn.  
66. Als niet aan deze criteria (punten 63-65) wordt voldaan, wordt de test her ­
haald met een entmateriaal uit een andere bron, wordt een referentiestof 
getest en worden alle procedures van de proef opnieuw bekeken.  
Testverslag  
67. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opge ­
nomen:  
Teststof:  
— identificatiegegevens;  
— fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken.  
Testomstandigheden:  
— soort testsysteem; eventuele aanpassingen voor het testen van onoplos ­
bare en vluchtige stoffen;  
— soort organisch medium;  
— indien bekend, percentage en aard van industrieel afvalwater dat in het 
rioolwater aanwezig is;  
— entmateriaal, aard en plaats(en) van bemonstering, concentratie en even ­
tuele prebehandeling;  
— stamoplossing van de teststof: DOC- en TOC-gehalte; bij suspensies: 
wijze van bereiding; gebruikte testconcentratie; indien afwijkend van het bereik van 10 tot 20 mg/l DOC, motivering; toevoegingsmethode; datum van eerste toevoeging; eventuele wijzigingen;
 
— gemiddelde slibleeftijd en gemiddelde hydraulische retentietijd; methode 
van slibafvoer; methoden om bulking, verlies van slib enz. tegen te gaan;
 
— toegepaste analysetechnieken;  
— testtemperatuur;  
— kwaliteit van de slibbulking, slibvolume-index (SVI), concentratie gesus ­
pendeerde vaste stoffen in het mengsel (MLSS);  
— eventuele afwijkingen van de standaardprocedures en omstandigheden 
die de resultaten kunnen hebben beïnvloed.  
Testresultaten:  
— alle gemeten gegevens van DOC, CZV, specifieke analysen, pH, tem ­
peratuur, zuurstofgehalte, gesuspendeerde vaste stoffen, stikstofverbin ­
dingen, indien relevant;  
— alle berekende waarden van D  t (of D  tc ), D  B en D  St in de vorm van 
tabellen en eliminatiecurven;  
— informatie over de aanloop- en plateaufase, de duur van de test, het 
eliminatiepercentage van de teststof en van het organische medium in de controle-installatie, met statistische informatie en verklaringen betref ­
fende de biologische afbraak en de geldigheid van de test;
 
— een bespreking van de resultaten.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LITERATUUR:  
(1) Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp.  
(2) Duitse Bondsregering (1962). Verordnung über die Abbaubarkeit von De ­
tergenzien in Wasch- und Reinigungsmitteln. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 
698-706.  
(3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Med ­
menham, UK.  
(4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
 
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologi ­
sche afbreekbaarheid.  
(7) Hoofdstuk C.12 van deze bijlage, Biologische afbraak — gewijzigde 
SCAS-test.  
(8) Hoofdstuk C.19 van deze bijlage, Raming van de adsorptiecoëfficiënt ( K OC ) 
aan de bodem en aan rioolslib met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).
 
(9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 
3:157-173.  
(10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and con ­
clusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
(11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113-138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
(12) ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and bio ­
degradability of organic substances in an aqueous medium — Activated 
sludge simulation test.  
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340-343.  
(15) Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
 
(16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Um ­
weltchem. Ökotox. 10: 214-220.  
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91- 98 ISBN 011 751661 9.
 
(18) ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Aanhangsel 1  
Figuur 1  
Apparatuur voor de beoordeling van biologische afbreekbaarheid  
Installatie van Husmann
  
A. Opslagvat  
B. Doseerpomp  
C. Beluchtingsvat (inhoud 3 l)  
D. Nabezinkvat  E. Persluchtpomp  
F. Verzamelvat  
G. Beluchter  
H. Luchtstroommeter  
Figuur 2  
Apparatuur voor de beoordeling van biologische afbreekbaarheid  
Poreuze pot
  
A. Opslagvat  
B. Doseerpomp  
C. Poreus beluchtingsvat  
D. Ondoordringbaar buitenvat  E. Verzamelvat  
F. Diffusor  
G. Luchtstroommeter  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figuur 3  
Maten van poreus beluchtingsvat van 3 liter
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Aanhangsel 2  
Voorbeeld van een eliminatiecurve
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Aanhangsel 3  
[TER INFORMATIE]  
KOPPELING VAN TESTINSTALLATIES  
Om een evenwicht tot stand te trachten te brengen tussen de microbiële popula ­
ties in het slib van een testinstallatie, die zowel afvalwater als teststof ontvangt, 
en een controle-installatie, die uitsluitend afvalwater ontvangt, is overgegaan tot een dagelijkse slibuitwisseling (1). Deze procedure werd „koppeling” genoemd en de methode staat bekend als „gekoppelde eenheden”. Aanvankelijk werd 
koppeling toegepast bij actiefslibinstallaties volgens Husmann, maar later ook 
bij poreuzepotinstallaties (2)(3). Aangezien noch bij installaties van het Hus ­
manntype, noch bij poreuzepotinstallaties significante verschillen tussen de resul ­
taten van niet-gekoppelde en gekoppelde installaties werden gevonden, levert de 
investering van extra tijd en energie in het koppelen van de eenheden geen 
voordelen op.
 
Omdat bij de slibuitwisseling een deel van de teststof wordt overgeheveld en de 
teststofconcentraties in het test- en controle-effluent nagenoeg gelijk kunnen zijn, 
kan het lijken alsof er een aanzienlijke verwijdering plaatsvindt. Daarom moeten 
correctiefactoren worden toegepast, die afhangen van het uitgewisselde deel van het slib en de gemiddelde hydraulische retentietijd. De berekening is uitvoerig beschreven in de literatuur (1).
 
Bereken de gecorrigeerde DOC- of CZV-eliminatie met de algemene formule:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
waarbij  
D tc = gecorrigeerd % DOC- of CZV-eliminatie;  
D t = bepaald % DOC- of CZV-eliminatie;  
a = uitgewisseld deel van het volume van de actiefslibinstallaties;  
r = gemiddelde hydraulische retentietijd (h).  
Als bijvoorbeeld de helft van het volume van de beluchtingstank wordt uitge ­
wisseld (a = 0,5) en de gemiddelde hydraulische retentietijd 6 uur bedraagt, is de 
correctieformule:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITERATUUR:  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled 
Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.  
(2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Ac ­
tivated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simu ­
lation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Aanhangsel 4  
EVALUATIE VAN DE INHIBITIE VAN HET ACTIEF SLIB  
Inhibitie door teststoffen  
1. Het is mogelijk dat een stof (of afvalwater) in de simulatietest niet wordt 
afgebroken of verwijderd en zelfs een inhibitoir effect heeft op de 
micro-organismen in het slib. Andere stoffen zijn bij lage concentraties bio ­
logisch afbreekbaar, maar bij hogere concentraties inhibitoir (hormese). Inhi ­
bitoire effecten kunnen in een eerder stadium zijn vastgesteld of kunnen zijn 
vastgesteld door de uitvoering van een toxiciteitstest waarvoor hetzelfde of 
soortgelijk entmateriaal is gebruikt als in de simulatietest (1). Dergelijke methoden zijn de inhibitie van de zuurstofopname (hoofdstuk C.11 van deze bijlage (2) en ISO 8192 (3)) en de inhibitie van de groei van slib ­
organismen (ISO 15522 (4)).
 
2. Bij de simulatietest manifesteert inhibitie zich doordat het verschil in opge ­
loste organische koolstof (DOC) of chemisch zuurstofverbruik (CZV) tussen het effluent van het testvat en dat van het controlevat groter is dan de als teststof toegevoegde DOC. Met andere woorden, het percentage verwijderde 
DOC (en biochemisch zuurstofverbruik (BZV), chemisch 
zuurstofverbruik (CZV) en/of NH
 + 4 ) van het organische medium neemt af 
door de aanwezigheid van de teststof. Als dit het geval is, moet de test worden herhaald waarbij de concentratie van de teststof wordt verlaagd totdat 
een niveau wordt bereikt waarbij geen inhibitie optreedt; de concentratie kan 
mogelijk nog verder worden verlaagd totdat de teststof biologisch wordt afgebroken. Als de teststof (of het afvalwater) echter bij alle geteste con ­
centraties nadelige effecten op het proces heeft, zijn er aanwijzingen dat het 
moeilijk, zo niet onmogelijk, is om de stof biologisch te behandelen; het kan 
evenwel zinvol zijn de test te herhalen met actief slib uit een andere bron en/of het slib geleidelijker te laten acclimatiseren.
 
3. Als de teststof daarentegen bij de eerste uitvoering van de simulatietest bio ­
logisch wordt geëlimineerd, moet de concentratie worden verhoogd als er behoefte is aan kennis over de mogelijke inhibitoire werking van de stof.
 
4. Bij de bepaling van de inhibitiegraad dient men zich te realiseren dat de 
populatie van het actief slib kan veranderen en dat de micro-organismen na 
verloop van tijd een tolerantie kunnen ontwikkelen voor een inhibitoire stof.  
5. Berekening van de inhibitiegraad:  
Het totale percentage verwijdering van BZV, DOC, CZV enz. (R  o ) voor de 
test- en controle-installatie kan als volgt worden berekend:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
waarbij:  
I = concentratie van BZV, DOC, CZV enz. in het influent van het test- of 
controlevat (mg/l);  
E = desbetreffende concentratie in het effluent (mg/l).  
Voor de testinstallaties moeten I en E worden gecorrigeerd voor de DOC als 
gevolg van de teststof, omdat anders de berekening van de procentuele 
inhibitie onjuist is.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
De inhibitiegraad als gevolg van de aanwezigheid van de teststof kan als 
volgt worden berekend:  
% inhibitie ¼ 100ðR c Ä R t Þ=R c 
waarbij:  
R c = procentuele verwijdering in de controlevaten;  
R t = procentuele verwijdering in de testvaten.  
LITERATUUR:  
(1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) Hoofdstuk C.11 van deze bijlage, Biologische afbraak — Actief slib: rem ­
ming ademhaling.  
(3) ISO 8192 (2007) Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality — Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Aanhangsel 5  
Slecht in water oplosbare teststoffen — Vluchtige stoffen  
Slecht in water oplosbare stoffen  
Er lijken weinig rapporten te zijn gepubliceerd over de uitvoering van simulatie ­
tests voor rioolwaterzuivering op slecht in water oplosbare en onoplosbare stoffen 
(1)(2)(3).  
Er is geen enkele dispergeermethode die bruikbaar is voor alle onoplosbare 
teststoffen. Van de vier soorten methoden die in ISO 10634 (4) zijn beschreven, lijken er twee geschikt te zijn om te proberen teststoffen te dispergeren met het 
oog op de uitvoering van een simulatietest, namelijk het gebruik van emulgeer ­
middelen en/of ultrasone energie. De stabiliteit van de dispersie moet gedurende een periode van ten minste 24 uur worden onderzocht. Dispersies die op ge ­
schikte wijze zijn gestabiliseerd en onder constant roeren in een reservoir zijn 
bewaard (punt 38), worden vervolgens, gescheiden van het huishoudelijke (of 
kunstmatige) afvalwater, in de beluchtingstank ingebracht.
 
Onderzoek, als de dispersies stabiel zijn, hoe de teststof in gedispergeerde vorm 
kan worden bepaald. Het is onwaarschijnlijk dat DOC geschikt is, zodat een specifieke analysemethode voor de teststof moet worden vastgesteld die kan 
worden toegepast op de effluenten, de vaste deeltjes in de effluenten en het 
actief slib. Vervolgens worden de lotgevallen van de teststof in de simulatie van het actiefslibproces bepaald in de vloeibare en de vaste fase. Aldus wordt een „massabalans” vastgesteld om te bepalen of de teststof biologisch is afge ­
broken. Hieruit blijkt echter alleen de primaire biologische afbreekbaarheid. Om 
te trachten de totale biologische afbreekbaarheid aan te tonen, moet een respiro ­
metrische test op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (hoofdstuk C.4 van deze bijlage (5) C, F of D) worden uitgevoerd waarbij als entmateriaal slib wordt 
gebruikt dat in de simulatietest aan de teststof is blootgesteld.
 
Vluchtige stoffen  
De uitvoering van rioolwaterzuiveringssimulaties op vluchtige stoffen is zowel 
controversieel als problematisch. Net als over slecht in water oplosbare teststof ­
fen lijken er zeer weinig rapporten over simulatietests met vluchtige stoffen te zijn gepubliceerd. Een gebruikelijk type apparaat met volledige menging wordt aangepast door de beluchtings- en nabezinktanks af te sluiten, de luchtdoorstro ­
ming met debietmeters te meten en te regelen en het uitgaande gas door vallen te 
leiden om vluchtig organisch materiaal te verzamelen. In sommige gevallen wordt een vacuümpomp gebruikt om het uitgaande gas naar een „koude” val of een  purgeand-trap -systeem met Tenax- en silicagelfilters te zuigen om gas ­
chromatografische analysen te verrichten. De in de val aanwezige teststof kan 
analytisch worden bepaald.
 
De test wordt in twee delen uitgevoerd. Eerst functioneren de installaties zonder 
slib, terwijl het kunstmatige afvalwater en de teststof in de beluchtingstank worden gepompt. Gedurende enkele dagen worden monsters van het influent, 
het effluent en het uitgaande gas verzameld en geanalyseerd. Op basis van de 
verzamelde gegevens kan het uit het systeem gestripte percentage (R
 vs ) van de 
teststof worden berekend.  
Vervolgens wordt de normale biologische test (met slib) uitgevoerd onder be ­
drijfsomstandigheden die identiek zijn aan die van de strippingstudie. Er worden ook DOC- en CZV-metingen verricht om te controleren of de installaties efficiënt 
functioneren. Incidenteel worden analysen verricht om in het eerste deel van de 
test de teststof in het influent, het effluent en het uitgaande gas te bepalen; na acclimatisering worden frequenter analysen verricht. Opnieuw kan, op basis van de gegevens in de stationaire toestand, het percentage van de teststof worden 
berekend dat door alle processen (fysisch en biologisch) uit de vloeibare fase is 
verwijderd (R
 T ), alsook het uit het systeem gestripte deel (R  V ). ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Berekening:  
a) in de niet-biologische test kan het uit het systeem gestripte percentage (R  VP ) 
van de teststof als volgt worden berekend:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
waarbij  
R VP = verwijdering van de teststof door vervluchtiging (%);  
S VP = in de val verzamelde teststof, uitgedrukt als equivalente concentratie 
in de vloeibare fase (mg/l);  
S IP = concentratie van de teststof in het influent (mg/l);  
b) in de biologische test kan het uit het systeem gestripte percentage (R  V ) van de 
teststof als volgt worden berekend:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
waarbij  
R V = verwijdering van de teststof door vervluchtiging in de biologische test 
(%); 
S V = in de biologische test in de val verzamelde teststof, uitgedrukt als 
equivalente concentratie in het vloeibare influent (mg/l);  
S I = concentratie van de teststof in het influent (mg/l);  
c) in de biologische test wordt het percentage (R  T ) van de teststof dat door alle 
processen is verwijderd als volgt berekend:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
waarbij  
S E = concentratie van de teststof in het (vloeibare) effluent (mg/l);  
d) vervolgens kan het door biologische afbraak en adsorptie verwijderde percen ­
tage (R  BA ) als volgt worden berekend:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Er moeten afzonderlijke tests worden verricht om te bepalen of de teststof is 
geadsorbeerd; als dit het geval is, kan een nadere correctie worden toegepast;  
e) een vergelijking tussen het gestripte deel van de teststof in de biologische test 
(R V ) en de niet-biologische test (R  VP ) geeft een aanwijzing voor het totale 
effect dat de biologische behandeling heeft op de emissie van de teststof in de atmosfeer.
 
Voorbeeld:  Benzeen  
Slibretentietijd = vier dagen  
Een kunstmatig afvalwater; retentietijd = 8 uur  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Hieruit volgt:  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % en R  BA = 85 %.  
Benzeen werd geacht niet aan het slib te adsorberen.  
LITERATUUR:  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Water Quality — Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalu ­
ation of their biodegradability in an aqueous medium.  
(5) Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologische 
afbreekbaarheid.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Aanhangsel 6  
Effecten van de slibretentietijd (SRT) op de behandelbaarheid van 
stoffen  
INLEIDING  
1. De in de hoofdtekst beschreven methode is ontworpen om te bepalen of de 
teststoffen (waarvan gewoonlijk bekend is dat zij inherent, maar niet ge ­
makkelijk, biologisch afbreekbaar zijn) biologisch afbreekbaar zijn binnen de grenzen die door rioolwaterzuiveringsinstallaties worden gesteld. De re ­
sultaten worden uitgedrukt als procentuele verwijdering en procentuele bio ­
logische afbraak. De bedrijfsomstandigheden van de actiefslibinstallaties en de keuze van het influent maken een vrij uiteenlopende variatie in de con ­
centratie van de teststof in het effluent mogelijk. Er worden tests verricht bij 
slechts één nominale concentratie van vaste stoffen van het actief slib of één 
nominale slibretentietijd (SRT) en de beschreven slibafvoerregelingen kun ­
nen ertoe leiden dat de SRT-waarde tijdens de test aanzienlijk varieert, zowel van dag tot dag als in de loop van een dag.
 
2. Bij deze variant (1)(2) wordt de SRT gedurende elke periode van 24 uur 
binnen veel nauwere grenzen geregeld (zoals ook op de grote schaal ge ­
beurt), waardoor de concentratie in de effluenten constanter is. Huishoude ­
lijk afvalwater wordt aanbevolen, omdat dit een consistenter en hoger ver ­
wijderingpercentage oplevert. Bovendien worden de effecten van een aantal SRT-waarden onderzocht en in een gedetailleerdere studie kunnen de effec ­
ten van een reeks van temperaturen op de effluentconcentratie worden be ­
paald.
 
3. Er bestaat nog geen algemene overeenstemming over de vraag welke kine ­
tische modellen van toepassing zijn op de biologische afbraak van stoffen onder rioolwaterzuiveringsomstandigheden. Het model van Monod voor 
bacteriële groei en substraatgebruik werd gekozen (1)(2) voor toepassing 
op de verzamelde gegevens, aangezien de methode uitsluitend bedoeld was voor stoffen die in grote hoeveelheden worden geproduceerd, waardoor concentraties van meer dan 1 mg/l in het rioolwater optreden. De geldigheid 
van het vereenvoudigde model en de gemaakte aannamen is vastgesteld aan 
de hand van een reeks alcoholethoxylaten met een uiteenlopende mate van primaire biologische afbreekbaarheid (2)(3).
 
Opmerking:  Deze variant van de methode volgt grotendeels de tekst van 
testmethode C.10-A; hierna worden alleen de details vermeld die afwijken.
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
4. De poreuzepotinstallaties voor actief slib, die zijn ontworpen om te zorgen 
voor (bijna) continue afvoer van gemengde vloeistof waarbij de slibretentie ­
tijd (SRT of θ s ) zeer nauwkeurig kan worden geregeld, worden in 
niet-gekoppelde modus gebruikt bij een reeks SRT’s, en facultatief ook 
bij een reeks temperaturen. De retentietijd bedraagt gewoonlijk twee tot 
tien dagen en de temperatuur ligt tussen 5 en 20 °C. Het (bij voorkeur huishoudelijke) afvalwater en de oplossing van de teststof worden afzon ­
derlijk in de installaties gebracht in een dosering die de gewenste slibreten ­
tietijd (3 tot 6 uur) en concentratie van de teststof in het influent oplevert. 
De controle-installaties die geen teststof ontvangen, worden ter vergelijking parallel gebruikt.
 
5. Er kan gebruik worden gemaakt van andere soorten apparatuur, waarbij er 
echter zorgvuldig op dient te worden gelet dat de SRT goed wordt geregeld. 
Als bijvoorbeeld installaties met een bezinker worden gebruikt, kan het nodig zijn een correctie toe te passen voor het verlies van vaste stoffen via het effluent van de installatie. Bovendien moeten bijzondere voorzorgs ­
maatregelen worden genomen om fouten als gevolg van de variatie van de 
hoeveelheid slib in de bezinker te voorkomen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. De installaties worden bij een geselecteerde reeks omstandigheden gebruikt; 
nadat een evenwichtstoestand is bereikt, worden in de effluenten in statio ­
naire toestand gedurende een periode van ongeveer drie weken de gemid ­
delde concentraties van de teststof, en eventueel de DOC, bepaald. Naast de beoordeling van de procentuele verwijdering van de teststof, en eventueel 
DOC, wordt het verband tussen de bedrijfsomstandigheden van de installatie 
en de concentratie in het effluent grafisch weergegeven. Op grond hiervan kunnen tentatieve kinetische constanten worden berekend en kan een voor ­
spelling worden gedaan over de omstandigheden waaronder de teststof kan 
worden behandeld.
 
INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
7. Hoofdstuk C.10-A, punten 12 en 13, is van toepassing.  
NIVEAUS WAARBIJ DE TEST WORDT DOORSTAAN  
8. Hoofdstuk C.10-A, punten 14 en 15, is van toepassing.  
REFERENTIETESTSTOF  
9. Hoofdstuk C.10-A, punt 16, is van toepassing.  
REPRODUCEERBAARHEID VAN TESTRESULTATEN  
10. Hoofdstuk C.10-A, punten 17 en 18, is van toepassing.  
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Apparatuur  
11. Het gewijzigde poreuzepotsysteem (aanhangsel 6.1) is een geschikte instal ­
latie. Dit bestaat uit een binnenvat (voering) van poreus polypropyleen met 
een dikte van 3,2 mm, een poriegrootte van ongeveer 90 μm en stompge ­
laste naden (hierdoor is de installatie steviger dan die welke beschreven is in punt 21 van dit hoofdstuk C.10-A). De voering wordt bevestigd in een 
ondoordringbaar buitenvat van polyethyleen, dat uit twee delen bestaat: 
een ronde bodem waarin gaten voor twee luchtleidingen en een slibafvoer ­
leiding zijn geboord, waarop met schroeven een cilinder met een uitlaat is bevestigd, zodat het poreuzepotvat een bekende inhoud (3 l) heeft. Op een 
van de luchtleidingen wordt een beluchtingssteen gemonteerd en de andere 
heeft een open uiteinde en wordt loodrecht op de steen in de pot geplaatst. Dit systeem produceert voldoende werveling om de inhoud van de pot volledig te mengen en te zorgen voor een concentratie opgeloste zuurstof 
die hoger is dan 2 mg/l.
 
12. Het vereiste aantal installaties wordt, in waterbaden of kamers met constante 
temperatuur, op een geregelde temperatuur gehouden binnen het bereik 5 tot 20 °C (± 1 °C). Er zijn pompen nodig om de oplossing van de teststof en het bezonken rioolwater met het vereiste debiet (respectievelijk 0-1,0 ml/min 
en 0-25 ml/min) in de beluchtingsvaten te leiden en er is een derde pomp 
nodig om het afvoerslib uit de beluchtingsvaten te verwijderen. Het zeer lage debiet waarmee het slib moet worden afgevoerd, wordt verkregen door 
gebruik te maken van een op een hoger debiet afgestelde pomp die op een 
tijdschakelaar is aangesloten, zodat de pomp met tussenpozen functioneert; zo levert bijvoorbeeld 10 s inschakeltijd per minuut bij een pompdebiet van 3 ml/min een afvoerdebiet van 0,5 ml/min op.
 
Filtreerapparaat of centrifuge  
13. Hoofdstuk C.10-A, punt 23, is van toepassing.  
Analyseapparatuur  
14. Hoofdstuk C.10-A, punt 24, is van toepassing.  
Water  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Hoofdstuk C.10-A, punten 25 en 26, is van toepassing.  
Organisch medium  
16. Hoofdstuk C.10-A, punt 27, is van toepassing.  
Kunstmatig afvalwater  
17. Hoofdstuk C.10-A, punt 28, is van toepassing.  
Huishoudelijk afvalwater  
18. Hoofdstuk C.10-A, punt 29, is van toepassing.  
Actief slib  
19. Hoofdstuk C.10-A, punt 30, is van toepassing.  
Stamoplossingen van de teststof  
20. Hoofdstuk C.10-A, punten 31 en 32, is van toepassing.  
PROCEDURE  
Bereiding van het entmateriaal  
21. Alleen punt 34 van hoofdstuk C.10-A is van toepassing — gebruik actief 
slib (ongeveer 2,5 g/l).  
Aantal testinstallaties  
22. Voor een eenvoudige test, waarbij alleen de procentuele verwijdering wordt 
gemeten, is slechts één SRT vereist; om de voor de berekening van tenta ­
tieve kinetische constanten benodigde gegevens te verkrijgen, zijn daarente ­
gen 4 of 5 SRT’s vereist. Gewoonlijk worden waarden tussen twee en tien 
dagen gekozen. In de praktijk is het handig om bij één temperatuur gelijk ­
tijdig een test uit te voeren met 4 of 5 SRT’s; bij uitgebreide studies worden dezelfde SRT-waarden, of misschien een andere reeks waarden, gebruikt bij andere temperaturen binnen het bereik 5-20 °C. Voor primaire biologische 
afbreekbaarheid (het belangrijkste gebruik) is normaliter slechts één instal ­
latie per reeks omstandigheden vereist. Voor totale biologische afbreekbaar ­
heid is echter, voor elke reeks omstandigheden, een controle-installatie no ­
dig, die wel afvalwater maar geen teststof ontvangt. Als vermoed wordt dat 
de teststof in het gebruikte afvalwater aanwezig is, moeten bij de beoor ­
deling van primaire biologische afbreekbaarheid controle-installaties worden gebruikt en moet op de berekeningen een correctiefactor worden toegepast.
 
Dosering van het organische medium en de teststof  
23. Hoofdstuk C.10-A, punten 36 tot en met 39, is van toepassing, met dien 
verstande dat de teststofoplossing apart wordt ingebracht en dat verschil ­
lende slibafvoerdebieten worden toegepast. Bovendien moeten de debieten 
van de influenten, effluenten en de slibafvoer frequent, bijvoorbeeld twee keer per dag, worden gecontroleerd en zo nodig worden aangepast. Als het gebruik van huishoudelijk afvalwater moeilijkheden voor de analysemetho ­
den oplevert, wordt de test uitgevoerd met kunstmatig afvalwater, waarbij 
echter moet worden gewaarborgd dat de verschillende media vergelijkbare kinetische gegevens opleveren.
 
Behandeling van actiefslibinstallaties  
24. Hoofdstuk C.10-A, punten 40 tot en met 43, is van toepassing, maar de SRT 
moet uitsluitend worden geregeld door „constante” slibafvoer.  
Bemonstering en analyse  
25. Hoofdstuk C.10-A, punten 44 tot en met 50, is van toepassing, maar de 
concentratie van de teststof moet worden bepaald en de DOC wordt facul ­
tatief bepaald; er mag geen gebruik worden gemaakt van het CZV.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
26. Hoofdstuk C.10-A, punten 52 tot en met 54, is van toepassing.  
Uitdrukking van de testresultaten  
27. Hoofdstuk C.10-A, punten 56 tot en met 62, is van toepassing.  
Berekening van kinetische constanten  
28. Het is realistischer om de gemiddelde concentratie van de teststof in het 
effluent in stationaire toestand te vermelden en te beschrijven hoe deze varieert afhankelijk van de bedrijfsomstandigheden van de installatie, dan 
om de procentuele primaire biologische afbreekbaarheid te vermelden. Dit 
kan worden gedaan met behulp van vergelijking (6) in aanhangsel 6.2, die waarden kan geven voor K
 S , μ m en θ SC , de kritische slibretentietijd.  
(Bij wijze van alternatief kunnen benaderingen voor K  S en μ m worden ver ­
kregen met een eenvoudig computerprogramma waarmee de met vergelij ­
king [2] (aanhangsel 6.2) berekende theoretische curve wordt aangepast aan de experimenteel verkregen waarden. Hoewel een bepaalde oplossing niet 
uniek zal zijn, kan een redelijke benadering van K
 S en μ m worden ver ­
kregen.)  
Variabiliteit van de resultaten  
29. De ervaring leert dat variabele waarden worden verkregen voor de kineti ­
sche parameters van individuele stoffen. Verondersteld wordt dat de om ­
standigheden waaronder het slib is gegroeid en de omstandigheden waar ­
onder de test is verricht (zoals in punt 5 en in andere tests) grote invloed hebben op de uitkomsten. Een aspect van deze variabiliteit is besproken door Grady e.a. (4), die hebben geopperd dat de begrippen „extant” en 
„intrinsic” moeten worden gebruikt voor de twee extreme omstandigheden 
die de grenzen vormen van de fysiologische toestand die een kweek tijdens een kinetisch experiment kan bereiken. Als de toestand tijdens de test niet mag veranderen, geven de waarden van de kinetische parameter de omstan ­
digheden weer van het milieu waaruit de micro-organismen afkomstig zijn; 
deze waarden worden „extant” of momenteel bestaand genoemd. Als de omstandigheden in de test zodanig zijn dat het eiwitsynthesesysteem zich optimaal ontwikkelt en een zo groot mogelijke groeisnelheid wordt gehaald, 
worden de verkregen kinetische parameters „intrinsiek” genoemd en hangen 
zij uitsluitend af van de aard van het substraat en het type bacteriën in de kweek. Als richtsnoer worden de extante waarden verkregen wanneer een lage verhouding tussen de concentratie substraat en werkzame 
micro-organismen (S
 o /X o ) wordt aangehouden, bv. 0,025, en de intrinsieke 
waarden wanneer deze verhouding hoog is, bv. ten minste 20. In beide gevallen moet S
 o ten minste gelijk zijn aan de overeenkomstige waarde 
van K  S , de halfverzadigingsconstante.  
30. De variabiliteit en andere facetten van de biologischeafbraakkinetiek zijn 
besproken tijdens een recente SETAC-workshop (5). Dergelijke, gerappor ­
teerde en geplande, studies moeten een duidelijker beeld opleveren van de 
kinetische processen in rioolwaterzuiveringsinstallaties, zodat bestaande ge ­
gevens beter kunnen worden geïnterpreteerd en de opzet van toekomstige testmethoden kan worden geoptimaliseerd.
 
LITERATUUR:  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343.  
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742-748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC — Europe, Brus ­
sels.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Aanhangsel 6.1  
Poreuze pot met SRT-regeling
  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Aanhangsel 6.2  
Berekening van kinetische constanten  
1. Aannemende dat het kinetische model van Monod van toepassing is, en 
uitgaande van een massabalans van actieve vaste stoffen en substraat in het hele actiefslibsysteem (1), gelden de volgende expressies voor de sta ­
tionaire toestand:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
of 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
waarbij  
S 1 = concentratie van het substraat in het effluent (mg/l);  
K S = halfverzadigingsconstante, de concentratie waarbij geldt: μ = μ m /2 
(mg/l);  
μ = specifieke groeisnelheid (d  –1 ); 
μ m = maximumwaarde van μ (d –1 ); 
K d = specifieke afnamesnelheid van vaste stoffen (d  –1 ); 
θ S = gemiddelde slibretentietijd, SRT (d).  
Bestudering van deze vergelijking leidt tot de volgende conclusies:  
i) de concentratie in het effluent is onafhankelijk van de concentratie in het 
influent (S  0 ); dit betekent dat de procentuele biologische afbraak varieert 
naargelang van de concentratie in het influent (S  0 ); 
ii) de enige regelparameter van de installatie die van invloed is op S  1 , is de 
slibretentietijd ( θ S ); 
iii) voor een gegeven concentratie in het influent S  0 zal er een kritische 
slibretentietijd zijn, zodanig dat:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
waarbij  
θ SC = kritische slibretentietijd; bij een kortere SRT worden de werk ­
zame micro-organismen uit de installatie gespoeld;  
iv) aangezien de andere parameters in vergelijking [2] verband houden met 
groeikinetiek, zal de temperatuur waarschijnlijk het substraatniveau in 
het effluent en de kritische slibleeftijd beïnvloeden, d.w.z. dat de slibre ­
tentietijd die nodig is om een bepaalde zuiveringsgraad te verkrijgen toeneemt naarmate de temperatuur daalt.
 
2. Uitgaande van een massabalans van vaste stoffen in het poreuzepotsysteem, 
en aannemende dat de concentratie van vaste stoffen in het effluent van de installatie (X
 2 ) laag is in vergelijking met de concentratie in het beluchtings ­
vat (X  1 ), geldt voor de slibretentietijd:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
en 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
waarbij  
V = volume van het beluchtingsvat (l);  
X 1 = concentratie van vaste stoffen in het beluchtingsvat (mg/l);  
X 2 = concentratie van vaste stoffen in het effluent (mg/l);  
Q 0 = influentdebiet (l/d);  
Q 1 = slibafvoerdebiet (l/d).  
Dit betekent dat de slibretentietijd op elke vooraf gekozen waarde kan 
worden geregeld door aanpassing van het slibafvoerdebiet (Q  1 ). 
Conclusies:  
3. Hoofddoel van de test is de effluentconcentratie, en dus de niveaus van de 
teststof in de ontvangende wateren, te voorspellen.  
4. In sommige gevallen kan de kritische slibretentietijd ( θ SC ) gemakkelijk 
worden bepaald door S  1 uit te zetten tegen θ S , bijvoorbeeld bij curve 3 in 
figuur 1. Wanneer dit niet mogelijk is, kan θ SC , met benaderingen voor μ m 
en K  S , worden berekend door S  1 uit te zetten tegen S  1 ·θ S . 
Een herschikking van vergelijking [1] geeft:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Als K  d klein is, geldt: 1 + θ s · K d ~ 1 en wordt [5]:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Dit levert een rechte lijn op (zie figuur 2) waarvan de richtingscoëfficiënt 
1/μ m is en het snijpunt met de y-as K  S /μ m ; bovendien geldt: θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figuur 1  
Drie temperaturen; vijf SRT’s
  
Figuur 2  
Regressielijn van SRT · S 1 versus S  1 bij T = 5 °C
  
Legenda:  
effluentconcentratie  
curve.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Aanhangsel 7  
TEST BIJ LAAG CONCENTRATIEBEREIK ( μg/l) 
1. In het aquatisch milieu, en zelfs in afvalwater, zijn veel stoffen normaliter in 
zeer lage concentraties ( μg/l) aanwezig. Bij die concentraties fungeren zij 
waarschijnlijk niet als primaire substraten die in groei resulteren, maar is het waarschijnlijker dat zij afbreken tot geen groei veroorzakende secundaire 
substraten, samen met uiteenlopende koolstoffen die van nature voorkomen. 
Daarom is het model van aanhangsel 6 niet geschikt voor de afbreekbaar ­
heid van dergelijke stoffen. Er zijn vele modellen die zouden kunnen wor ­
den toegepast en onder de omstandigheden die in rioolwaterzuiveringssys ­
temen heersen, kunnen verscheidene modellen tegelijkertijd werkzaam zijn. 
Om dit probleem te kunnen oplossen is veel meer onderzoek noodzakelijk.
 
2. Tot die tijd kan, uitsluitend voor primaire biologische afbreekbaarheid, de 
procedure in de hoofdtekst (hoofdstuk C.10-A) worden gevolgd, waarbij gebruik moet worden gemaakt van passende lage concentraties (< 100 μg/l) 
en een gevalideerde analyseprocedure. De procentuele biologische afbraak 
kan worden berekend (zie punt 54 van de testmethode), mits rekening wordt gehouden met niet-biologische processen (adsorptie, vluchtigheid enz.). Een voorbeeld is de studie van Nyholm e.a. (1)(2), waarbij in een vul-en-aftap ­
systeem een cyclus van 4 uur is toegepast. Zij rapporteerden 
pseudo-eersteordeconstanten voor vijf stoffen die in een concentratie van 5 tot 100 μg/l aan kunstmatig afvalwater werden toegevoegd. (Voor totale 
biologische afbreekbaarheid kunnen
 14 C-gemerkte teststoffen worden ge ­
bruikt. Een beschrijving daarvan valt buiten het bestek van deze testmetho ­
de, omdat er vooralsnog geen overeengekomen procedures bestaan, al bevat een voorgestelde methode voor ISO 14592 (3) richtsnoeren voor het gebruik van
 14 C-gemerkte stoffen.)  
SCAS-test  
3. Later is een eenvoudigere tweefasentest voorgesteld (4)(5)(6), waarbij de 
semicontinue actiefslibmethode (SCAS) wordt gevolgd door kortstondige 
kinetische tests op monsters uit de SCAS-installaties. Bij het 
SCAS-systeem worden (anders dan bij de oorspronkelijke testmethode C.12) bekende slibafvoerdebieten toegepast en wordt gemodificeerd kunstmatig OESO-afvalwater of huishoudelijk afvalwater gebruikt. Het kunstmatige af ­
valwater werd gemodificeerd (om de pH-waarde en de slechte bezinkings ­
eigenschappen te wijzigen) door toevoeging van fosfaat als buffer, gist ­
extract, ijzer(III)chloride en zouten van spoorelementen, en het CZV werd tot ongeveer 750 mg/l verhoogd door verhoging van de concentratie pepton 
en vleesextract. De installaties werkten met een cyclus van 24 uur: 23 uur 
beluchten, afvoer van slib, bezinking, verwijdering van het supernatans (effluent) gevolgd door toevoeging van kunstmatig afvalwater plus teststof in een concentratie tot 100 μg/l (d.w.z. ongeveer dezelfde concentratie als in 
de kortetermijntest). Eén keer per week werd 10 % van het totale slib ver ­
vangen door vers slib, om een evenwichtige microbiële populatie te behou ­
den.
 
4. De concentraties van de teststof worden van tevoren en aan het eind van de 
beluchting gemeten en de test wordt voortgezet totdat een constante ver ­
wijdering van de teststof is bereikt; dit kan variëren van één week tot 
verscheidene maanden.  
Kortetermijntest  
5. Er wordt een korte test (van bv. 8 uur) verricht om de (pseudo-)eersteor ­
deconstante van de kinetische snelheid te bepalen voor de afname van de 
teststof in actief slib met bekende, maar uiteenlopende oorsprongen en achtergronden. In het bijzonder worden tijdens een acclimatisatieproef, aan het eind van een beluchtingsperiode wanneer de concentratie organisch sub ­
straat laag is, slibmonsters uit de SCAS-reactoren genomen (punten 3 en 4). 
Ter vergelijking kan ook slib worden afgenomen uit een parallelle
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
SCAS-installatie waarin de teststof niet is toegevoegd. Mengsels van het slib 
en de daaraan in twee of meer concentraties tussen 1 en 50 μg/l toegevoegde 
teststof worden belucht, zonder toevoeging van kunstmatig afvalwater of ander organisch substraat. Gedurende maximaal 24 uur wordt met regelma ­
tige intervallen, afhankelijk van de afbreekbaarheid van de stof, de in de 
oplossing achterblijvende teststof bepaald (bijvoorbeeld ieder uur). De mon ­
sters worden gecentrifugeerd en vervolgens op geschikte wijze geanalyseerd.
 
Berekeningen  
6. De gegevens over de SCAS-installaties worden gebruikt voor de berekening 
van de procentuele verwijdering van de teststof (punt 54). Bovendien kan 
met de volgende formule een gemiddelde snelheidsconstante K  1 worden 
berekend (genormaliseerd voor de concentratie gesuspendeerde vaste stof ­
fen):  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
waarbij  
t = beluchtingstijd (23 uur);  
C e = concentratie aan eind van beluchtingsperiode ( μg/l); 
C i = concentratie bij begin beluchting ( μg/l); 
SS = concentratie van vaste stoffen in het actief slib (g/l).  
7. Bij de kortetermijntest wordt de resterende procentuele concentratie op lo ­
garitmische schaal uitgezet tegen de tijd en komt de richtingscoëfficiënt van 
het begindeel (10-50 % afbraak) van de curve overeen met K  1 , de (pseudo- 
)eersteordeconstante. De constante wordt voor de concentratie vaste stoffen 
van het slib genormaliseerd door de richtingscoëfficiënt te delen door die 
concentratie. Het verslag over de resultaten moet ook gegevens bevatten over de initiële concentraties van de teststof en de gesuspendeerde vaste stoffen, de slibretentietijd, de slibbelasting en de bron, alsook over de even ­
tuele voorafgaande blootstelling aan de teststof.
 
Variabiliteit van de resultaten  
8. De variabiliteit en andere facetten van de biologischeafbraakkinetiek zijn 
besproken tijdens een recente SETAC-workshop (7). Dergelijke, gerappor ­
teerde en geplande, studies moeten een duidelijker beeld opleveren van de 
kinetische processen in rioolwaterzuiveringsinstallaties, zodat bestaande ge ­
gevens beter kunnen worden geïnterpreteerd en de opzet van toekomstige testmethoden kan worden geoptimaliseerd.
 
LITERATUUR:  
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and 
Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge 
reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.  
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.  
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality — Eva ­
luation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low con ­
centrations in water.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in ac ­
tivated sludge waste water treatment plants using short-term batch experi ­
ments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.  
(5) Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.  
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6  th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilms  
INLEIDING  
1. Simulatietests worden normaliter gebruikt voor stoffen die een screeningtest 
op gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (hoofdstukken C.4 A tot en met F van deze bijlage (9)) niet doorstonden, maar wel een test op inherente biologische afbreekbaarheid. In uitzonderlijke gevallen worden simulatietests 
ook gebruikt voor stoffen waarover meer informatie nodig is, in het bij ­
zonder stoffen die in grote hoeveelheden worden geproduceerd; doorgaans wordt de actiefslibtest (C.10-A) uitgevoerd. In bepaalde omstandigheden is echter specifieke informatie vereist over het gedrag van een stof bij riool ­
waterzuiveringsmethoden waarbij gebruik wordt gemaakt van biofilms, na ­
melijk percolatie- of druppelfilters, roterende biologische contactoren en wervelbedden. Er zijn verschillende installaties ontwikkeld om in deze be ­
hoefte te voorzien.
 
2. Gerike  et al.  (1) hebben gebruikgemaakt van grote druppelfilters op schaal, 
met gekoppelde eenheden. Die filters vergden veel ruimte en relatief grote 
hoeveelheden afvalwater of kunstmatig afvalwater. Truesdale  et al.  (2) be­
schreven kleinere filters (6 ft, diameter 6 inch), waarover surfactantvrij natuurlijk afvalwater werd geleid, maar ook daarvoor waren nog vrij grote volumes nodig. Het duurde maar liefst 14 weken voordat een „rijpe” biofilm 
was ontstaan en nadat de testsurfactant voor het eerst was toegevoegd, 
duurde het nog eens vier-acht weken voordat de acclimatisering was vol ­
tooid.
 
3. Baumann  et al.  (3) ontwikkelden een veel kleiner filter met strips van 
polyester („fleece”) die vooraf in actief slib waren ondergedompeld als inert medium dat de biofilm ondersteunde. De teststof werd als enige koolstof ­
bron gebruikt en de biologische afbraak werd beoordeeld door meting van 
de opgeloste organische koolstof (DOC) in het influent en het effluent en op 
grond van de hoeveelheid CO
 2 in het uitgaande gas.  
4. Een tamelijk verschillende aanpak volgden Gloyna  et al.  (4), die de rote ­
rende buisreactor uitvonden. Op het bekende binnenoppervlak van de rote ­
rende buis liet men een biofilm ontstaan door het influent van de bovenzijde in de buis te leiden, die een kleine hoek met het horizontale vlak maakte. De 
reactor is gebruikt om de biologische afbreekbaarheid van oppervlakte ­
actieve stoffen te bestuderen (5) en om de optimale dikte van de biofilm en de diffusie door de film te onderzoeken (6). De auteurs hebben de reactor verder ontwikkeld en onder meer geschikt gemaakt voor de bepaling van 
CO
 2 in het uitgaande gas.  
5. De roterende buisreactor is door het Standing Committee of Analysts (Ver ­
enigd Koninkrijk) als standaardmethode overgenomen voor de beoordeling 
van zowel de biologische afbreekbaarheid van stoffen (7) als de behandel ­
baarheid en toxiciteit van afvalwater (8). De voordelen van de hier beschre ­
ven methode zijn gelegen in de eenvoud, compactheid, reproduceerbaarheid en het relatief kleine volume organisch medium dat nodig is.
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
6. Op het binnenoppervlak van een traag roterende hellende buis wordt, ver ­
mengd of afzonderlijk, kunstmatig of huishoudelijk afvalwater en teststof aangebracht. Op het binnenoppervlak groeit een laag micro-organismen die lijkt op de laag die aanwezig is op biofiltermedia. De bedrijfsomstandighe ­
den van de reactor worden zodanig gekozen dat voldoende eliminatie van 
organisch materiaal en, zo nodig, oxidatie van ammonium plaatsvinden.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Het effluent uit de buis wordt verzameld en bezonken en/of gefiltreerd 
alvorens te worden geanalyseerd op opgeloste organische koolstof (DOC) 
en/of de teststof met een specifieke methode. De controle-installaties die geen teststof ontvangen, worden ter vergelijking parallel gebruikt onder dezelfde omstandigheden. Het verschil tussen de DOC-concentraties in het 
effluent van de testinstallatie en de controle-installatie wordt toegeschreven 
aan de teststof en de organische metabolieten ervan. Dit verschil wordt met de concentratie van de toegevoegde teststof (als DOC) vergeleken om de eliminatie van de teststof te berekenen.
 
8. De biologische afbraak kan normaliter van de biologische adsorptie worden 
onderscheiden door zorgvuldige bestudering van de eliminatie-tijdcurve. 
Bevestiging kan gewoonlijk worden verkregen door een test op gemakke ­
lijke afbreekbaarheid (zuurstofopname of kooldioxideproductie) te verrichten op geacclimatiseerd entmateriaal dat aan het eind van de test wordt genomen uit de reactoren waarin de teststof is ingebracht.
 
INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
9. De zuiverheid, oplosbaarheid in water, vluchtigheid en 
adsorptie-eigenschappen van de teststof moeten bekend zijn om de resulta ­
ten goed te kunnen interpreteren.  
10. Normaliter kunnen vluchtige en slecht oplosbare stoffen niet worden getest, 
tenzij er speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen (zie aanhangsel 5 
van hoofdstuk C.10-A). Ook de chemische structuur, of ten minste de molecuulformule, moet bekend zijn om theoretische waarden te kunnen berekenen en/of de gemeten waarden van parameters te kunnen controleren 
(bv. theoretisch zuurstofverbruik (ThOD) en DOC).
 
11. Informatie over de giftigheid van de teststof voor micro-organismen (zie 
aanhangsel 4 van hoofdstuk C.10-A) kan nuttig zijn voor het kiezen van 
de juiste testconcentraties en kan essentieel zijn voor een juiste interpretatie van lage waarden voor de biologische afbraak.
 
NIVEAUS WAARBIJ DE TEST WORDT DOORSTAAN  
12. Aanvankelijk moest de primaire biologische afbraak van oppervlakteactieve 
stoffen ten minste 80 % bedragen om de stof in de handel te mogen bren ­
gen. Als de waarde van 80 % niet wordt gehaald, kan deze (bevestigende) 
simulatietest worden uitgevoerd en mag de oppervlakteactieve stof alleen 
worden verhandeld als meer dan 90 % van de specifieke stof wordt ver ­
wijderd. Voor stoffen in het algemeen is er geen sprake van een niveau waarbij de test al dan wordt doorstaan en kan het verwijderingspercentage 
worden gebruikt in berekeningen voor de schatting van de waarschijnlijke 
milieuconcentratie die voor de beoordeling van de gevaren van stoffen wordt gebruikt. In een aantal studies van zuivere stoffen die een significante mate van biologische afbreekbaarheid vertoonden, bedroeg het gevonden 
DOC-verwijderingspercentage voor meer dan drie kwart van de stoffen > 
90 % en voor meer dan 90 % van de stoffen > 80 %.
 
REFERENTIESTOFFEN  
13. Om te waarborgen dat de experimentele procedure correct wordt uitgevoerd, 
kan het soms nuttig zijn referentiestoffen te testen waarvan het gedrag 
bekend is. Daarbij kan het gaan om stoffen als adipinezuur, 2-fenylfenol, 1-naftol, difenylzuur en 1-naftoëzuur.
 
REPRODUCEERBAARHEID VAN TESTRESULTATEN  
14. Door een laboratorium in het Verenigd Koninkrijk is de relatieve standaard ­
afwijking binnen tests vastgesteld op 3,5 % en die tussen tests op 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Apparatuur  
Roterende buisreactoren  
15. De apparatuur bestaat uit een metalen draagconstructie met een rij buizen 
van acryl met een lengte van 30,5 cm en een binnendiameter van 5 cm, 
rustend op met rubber beklede wieltjes (zie de figuren 1 en 2 in aanhangsel 8). Elke buis heeft aan de buitenzijde een ongeveer 0,5 cm diepe inkeping om haar op de wieltjes te houden en een met grove staalwol 
geruwd binnenoppervlak waarin aan de bovenzijde (inlaat) een 0,5 cm diepe 
flens is aangebracht om de ingebrachte vloeistof tegen te houden. De buizen maken een hoek van ongeveer 1 graad met het horizontale vlak teneinde de vereiste contacttijd te verkrijgen bij aanbrenging van het testmedium in een 
schone buis. De met rubber beklede wieltjes worden aangedreven door een 
langzaam draaiende motor met variabel toerental. De temperatuur van de buizen wordt geregeld door de apparatuur in een kamer met constante temperatuur te plaatsen.
 
16. Het uitgaande CO  2 -gas kan, om later te worden gemeten, in een alkalische 
oplossing worden opgevangen door elke buisreactor in een iets grotere, afgesloten buis te plaatsen en te zorgen voor gasdichte verbindingen (6).
 
17. Voor elke buis wordt in een opslagvat (A) van 20 l voldoende organisch 
medium, waaraan zo nodig teststof is toegevoegd, voor 24 uur aangebracht 
(zie figuur 2). Zo nodig kan de teststofoplossing afzonderlijk worden in ­
gebracht. Nabij de bodem van elk opslagvat bevindt zich een uitlaat die met geschikte leidingen (bv. van siliconenrubber) via een peristaltische pomp (B) verbonden is met een toevoerbuis van glas of acryl, die 2-4 cm in de 
bovenzijde (inlaat) van de hellende buis (C) steekt. Het effluent druppelt 
uit de onderzijde van de hellende buis en wordt opgevangen in een ander opslagvat (D). Het effluent wordt vóór analyse bezonken of gefiltreerd.
 
Filtreerapparaat of centrifuge  
18. Apparaat voor het filtreren van monsters over membraanfilters met een 
geschikte porositeit (nominale openingsdiameter 0,45 μm) die organische 
stoffen adsorberen of zo min mogelijk organische koolstof vrij laten komen. Als filters worden gebruikt die organische koolstof vrij laten komen, worden zij zorgvuldig met warm water gewassen om uitloogbare organische kool ­
stof te verwijderen. Bij wijze van alternatief kan een centrifuge worden 
gebruikt die een versnelling van 40 000 m/s
 2 kan produceren.  
19. Analyseapparatuur voor het bepalen van:  
— DOC/totale organische koolstof (TOC), of chemisch 
zuurstofverbruik (CZV);  
— de specifieke stof, zo nodig (HPLC, GC enz.);  
— pH, temperatuur, zuurgraad en alkaliteit;  
— ammonium, nitriet en nitraat, als de tests worden uitgevoerd onder om ­
standigheden waarin nitrificatie mogelijk is.  
Water  
20. Kraanwater met een DOC-gehalte van minder dan 3 mg/l.  
21. Gedestilleerd of gedeïoniseerd water met een DOC-gehalte van minder dan 
2 mg/l.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organisch medium  
22. Als organisch medium mag kunstmatig afvalwater, huishoudelijk afvalwater 
of een mengsel van beide soorten afvalwater worden gebruikt. Gebleken is dat het gebruik van huishoudelijk afvalwater alleen veelal een hoger per ­
centage DOC-verwijdering oplevert (in actiefslibinstallaties) en dat daarin 
zelfs bepaalde stoffen biologisch afgebroken kunnen worden die bij gebruik van kunstmatig OESO-afvalwater niet afbreken. Daarom wordt het gebruik van huishoudelijk afvalwater aanbevolen. Meet de DOC- (of 
CZV-)concentratie in elke nieuwe partij van het organische medium. De 
zuurgraad of alkaliteit van het organische medium moet bekend zijn. Als het medium een lage zuurgraad of alkaliteit heeft, kan het nodig zijn een 
geschikte bufferoplossing (natriumwaterstofcarbonaat of kaliumwaterstoffos ­
faat) toe te voegen om tijdens de test in de reactor een pH-waarde van ongeveer 7,5 ± 0,5 te behouden. In elk afzonderlijk geval moet worden besloten hoeveel en op welk moment een bufferoplossing wordt toegevoegd.
 
Kunstmatig afvalwater  
23. Per liter leidingwater worden opgelost: pepton, 160 mg; vleesextract, 110 
mg; ureum, 30 mg; watervrij dikaliumwaterstoffosfaat (K  2 HPO  4 ), 28 mg; 
natriumchloride (NaCl), 7 mg; calciumchloridedihydraat (CaCl  2 .2H  2 O), 4 
mg; magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO  4 .7H  2 O), 2 mg. Dit kunstmatig 
OESO-afvalwater is een voorbeeld en geeft een gemiddelde 
DOC-concentratie in het influent van ongeveer 100 mg/l. Bij wijze van 
alternatief mogen ook andere samenstellingen worden gebruikt die ongeveer dezelfde DOC-concentraties opleveren en het feitelijke afvalwater beter be ­
naderen. Dit kunstmatige afvalwater mag in geconcentreerde vorm van ge ­
distilleerd water worden bereid en ten hoogste één week worden bewaard bij 
ongeveer 1 °C. Zo nodig wordt het met kraanwater verdund. (Dit medium is onbevredigend, bijvoorbeeld omdat het stikstofgehalte zeer hoog is en het koolstofgehalte relatief laag, maar er is nog geen beter voorstel gedaan, 
afgezien van de toevoeging van meer fosfaat als buffer en extra pepton).
 
Huishoudelijk afvalwater  
24. Gebruik vers bezonken rioolwater dat dagelijks wordt verzameld uit een 
rioolwaterzuiveringsinstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater ontvangt. Het wordt verzameld uit het overloopkanaal van de primaire be ­
zinkingstank of uit de inlaat van de actiefslibinstallatie en moet grotendeels 
vrij zijn van grove deeltjes. Het rioolwater kan worden gebruikt na enige 
dagen bij ongeveer 4 °C te zijn bewaard, mits aangetoond wordt dat tijdens de opslag de DOC- (of CZV-)waarde niet significant (met minder dan 20 %) is gedaald. Om verstoringen van het systeem te voorkomen, moet de DOC 
(of het CZV) van elke nieuwe partij voor gebruik op een passende constante 
waarde worden gebracht, bijvoorbeeld door verdunning met kraanwater.
 
Smeermiddel  
25. De rollen van de peristaltische pomp kunnen worden gesmeerd met glycerol 
of olijfolie: beide smeermiddelen zijn geschikt voor gebruik bij leidingen van siliconenrubber.
 
Stamoplossingen van de teststof  
26. Bereid voor stoffen die voldoende oplosbaar zijn, stamoplossingen in een 
geschikte concentratie (bv. 1 tot 5 g/l) in gedeïoniseerd water of in de 
minerale fractie van het kunstmatig afvalwater. Zie aanhangsel 5 van 
hoofdstuk C.10-A voor onoplosbare stoffen. Zonder modificatie van de buisreactoren (punt 16) is deze methode niet geschikt voor vluchtige stoffen. Bepaal de DOC en TOC van de stamoplossing en herhaal de metingen voor 
elke nieuwe partij. Controleer, als het verschil tussen de DOC en de TOC 
groter is dan 20 %, de oplosbaarheid in water van de teststof. Vergelijk de
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
DOC of de met een specifieke analyse van de stamoplossing bepaalde con ­
centratie van de teststof met de nominale waarde om vast te stellen of de 
recovery toereikend is (normaliter kan een waarde van > 90 % worden verwacht). Bepaal, in het bijzonder voor dispersies, of al dan niet gebruik kan worden gemaakt van de DOC als analytische parameter, dan wel of 
alleen een specifieke analysetechniek voor de teststof kan worden gebruikt. 
Monsters van dispersies moeten worden gecentrifugeerd. Voor elke nieuwe partij wordt de DOC of het CZV gemeten, dan wel de teststof met een specifieke analyse.
 
27. Bepaal de pH van de stamoplossing. Extreme waarden wijzen erop dat de 
toevoeging van de stof van invloed kan zijn op de pH van het actief slib in 
het testsysteem. Neutraliseer in dat geval de stamoplossing met kleine hoe ­
veelheden van een anorganisch zuur of een anorganische base om een pH van 7 ± 0,5 te verkrijgen, maar let erop dat de teststof niet neerslaat.
 
PROCEDURE  
Bereiding van het organische medium voor dosering  
28. Zorg ervoor dat alle houders voor het influent en het effluent en de slangen 
vanuit de influentvaten en naar de effluentvaten grondig zijn gereinigd om microbiële groei voorafgaand en gedurende de test te voorkomen.
 
29. Bereid het kunstmatige afvalwater (punt 23) elke dag vers uit de vaste 
stoffen of uit de geconcentreerde stamoplossing door voldoende verdunning 
met kraanwater. Meet in een cilinder de vereiste hoeveelheid af en voeg deze toe aan een schoon influentvat. Voeg zo nodig vóór verdunning tevens de vereiste hoeveelheid stamoplossing van de teststof of referentiestof aan 
het kunstmatige afvalwater toe. Bereid, als dit praktischer is of noodzakelijk 
is om verlies van de teststof te vermijden, een afzonderlijke verdunde op ­
lossing van de teststof in een afzonderlijk reservoir en leid deze via een andere doseerpomp in de hellende buizen.
 
30. Als alternatief (en bij voorkeur) kan ook bezonken huishoudelijk afvalwater 
(punt 24) worden gebruikt, dat zo mogelijk elke dag vers wordt verzameld.  
Werking van roterende buisreactoren  
31. Voor de beoordeling van één teststof zijn twee identieke buisreactoren no ­
dig, die in een kamer met constante temperatuur (gewoonlijk 22 ± 2 °C) zijn 
geplaatst.  
32. Stel de peristaltische pompen zo in dat per uur 250 ± 25 ml organisch 
medium (zonder teststof) wordt ingebracht in de hellende buizen, die met 18 ± 2 tpm ronddraaien. Breng het smeermiddel (punt 25) van tevoren en 
tijdens de test periodiek op de leidingen van de pomp aan om de pomp goed 
te laten werken en de levensduur van de leidingen te verlengen.
 
33. Stel de hellingshoek van de buizen zo in dat de verblijfsduur van de in ­
gebrachte vloeistof in een schone buis 125 ± 12,5 s bedraagt. Schat de retentietijd door een niet-biologische markerstof (bv. NaCl, inerte kleurstof) 
aan de ingebrachte vloeistof toe te voegen; de tijd die nodig is voor het 
bereiken van de piekconcentratie in het effluent geldt als de gemiddelde retentietijd (wanneer de maximale film aanwezig is, kan de retentietijd tot ongeveer 30 minuten toenemen).
 
34. Gebleken is dat bij deze snelheden, toerentallen en tijdsduren voldoende 
DOC- (of CZV-)eliminatie plaatsvindt en genitrificeerde effluenten worden 
geproduceerd. Als onvoldoende eliminatie plaatsvindt of als de prestaties van een bepaalde zuiveringsinstallatie moeten worden nagebootst, moet het debiet worden aangepast. In het laatste geval wordt de doseersnelheid van 
het organische medium aangepast totdat de prestaties van de reactor over ­
eenkomen met die van de zuiveringsinstallatie.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Enten  
35. Wanneer kunstmatig afvalwater wordt gebruikt, kan beënting via de lucht 
volstaan om de groei van micro-organismen op gang te brengen; zo niet, voeg dan gedurende drie dagen per liter 1 ml bezonken slib toe aan de 
ingebrachte vloeistof.
 
Metingen  
36. Controleer met regelmatige intervallen of de doseer- en omwentelingssnel ­
heden binnen het voorgeschreven bereik liggen. Meet ook de pH van het effluent, zeker wanneer nitrificatie wordt verwacht.
 
Bemonstering en analyse  
37. De methode, het patroon en de frequentie van de bemonstering worden op 
het doel van de test afgestemd. Neem bijvoorbeeld steek- of grijpmonsters van het influent en het effluent, of verzamel monsters over een langere periode, bv. 3-6 uur. Neem in de eerste periode, zonder teststof, twee 
keer per week monsters. Filtreer de monsters over membranen of centrifu ­
geer de monsters gedurende circa 15 minuten bij 40 000 m/s
 2 (punt 18). Het 
kan noodzakelijk zijn de monsters vóór membraanfiltratie te laten bezinken en/of over een grof filter te leiden. Bepaal de DOC (of het CZV) ten minste 
in duplo en zo nodig het BZV, ammonium en nitriet/nitraat.
 
38. Alle analysen moeten zo spoedig mogelijk na verzameling en bereiding van 
de monsters worden verricht. Als analysen moeten worden uitgesteld, wor ­
den de monsters in het donker bij ongeveer 4 °C bewaard in volle, goed 
afgesloten flessen. Als de monsters langer dan 48 uur moeten worden be ­
waard, worden zij geconserveerd door invriezen, zuurbehandeling of toevoe ­
ging van een geschikte toxische stof (bv. 20 ml/l van een kwik(II)chloride- 
oplossing van 10 g/l). De conserveertechniek mag de resultaten van de 
analyse niet beïnvloeden.  
Aanloopperiode  
39. In deze periode groeit de biofilm aan het oppervlak tot een optimale dikte; 
dit duurt doorgaans ongeveer twee weken en mag niet langer dan zes weken 
duren. De DOC- (of CZV-)verwijdering (punt 44) neemt toe en bereikt een 
plateauwaarde. Wanneer in beide buizen het plateau is bereikt bij een ver ­
gelijkbare waarde, wordt een van de buizen gekozen om als controlereactor te fungeren gedurende de rest van de test, waarbij de prestaties van beide 
buizen consistent moeten blijven.
 
Inbrengen van de teststof  
40. Voeg in dit stadium de teststof in de vereiste concentratie (gewoonlijk 10-20 
mg C/l) toe aan de andere reactor. De controlereactor ontvangt alleen het organische medium.
 
Acclimatiseringsperiode  
41. Zet de DOC- (of CZV-)analysen twee keer per week voort en meet als de 
primaire biologische afbreekbaarheid moet worden beoordeeld tevens de 
concentratie van de teststof met een specifieke analyse. Laat nadat de test ­
stof voor het eerst is ingebracht acclimatisatie optreden in één tot zes weken (of in bijzondere omstandigheden langer). Wanneer de procentuele verwij ­
dering (punten 43-45) een maximale waarde heeft bereikt, moeten in de 
plateaufase binnen ongeveer drie weken 12-15 geldige waarden worden verkregen om de gemiddelde procentuele verwijdering te bepalen. De test wordt geacht te zijn voltooid als een voldoende hoog eliminatiepercentage is 
bereikt. De test mag normaliter na de eerste toevoeging van de teststof niet 
langer dan twaalf weken duren.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Loslatende film  
42. Met betrekkelijk regelmatige intervallen laten plotseling grote hoeveelheden 
overtollige film los in de buizen. Om te zorgen voor vergelijkbare resultaten, moeten de tests ten minste twee volledige cycli omvatten waarbij de film 
groeit en loslaat.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
43. Bereken met de volgende vergelijking de procentuele DOC- of (CZV-)eli ­
minatie van de teststof voor elk beoordelingsmoment:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
waarbij  
D t = procentuele DOC- (of CZV)-eliminatie op tijdstip t;  
C s = aan de teststof toegeschreven concentratie DOC (of CZV) in het 
influent, bij voorkeur geschat aan de hand van de concentratie in 
en het toegevoegde volume van de stamoplossing (mg/l);  
E = gemeten DOC of (CZV) in het testeffluent op tijdstip t (mg/l);  
E o = gemeten DOC of (CZV) in het controle-effluent op tijdstip t (mg/l).  
Herhaal de berekening voor de referentiestof, indien getest.  
Prestaties van de controlereactor  
44. De mate van DOC- (of CZV-)eliminatie (D  B ) van het organische medium in 
de controlereactoren is informatie die nuttig is voor de beoordeling van de biologische afbraakactiviteit van de biofilm tijdens de test. Bereken de pro ­
centuele eliminatie met de volgende vergelijking:
 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
waarbij  
C m = DOC (of CZV) van het organische medium in het controle-influent 
(mg/l).  
45. Bereken, als de teststof met een specifieke analysemethode wordt gemeten, 
voor elk meettijdstip de verwijdering (D  ST ) van de teststof met de volgende 
vergelijking:  
D ST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
waarbij  
S i = gemeten of, bij voorkeur, geschatte concentratie van de teststof in het 
testinfluent (mg/l);  
S e = gemeten concentratie van de teststof in het testeffluent op tijdstip t 
(mg/l).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Bereken, als de analysemethode een positieve waarde in ongewijzigd afval ­
water oplevert die overeenkomt met S  c mg/l, de procentuele verwijdering 
(D SC ) als volgt:  
D SC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Uitdrukking van de testresultaten  
46. Zet de procentuele eliminatie D  t en D  ST (of D  SC ), indien beschikbaar, uit 
tegen de tijd (zie aanhangsel 2 van hoofdstuk C.10-A). Neem het gemid ­
delde (afgerond op het dichtstbijzijnde gehele getal) en de standaardafwij ­
king van de in de plateaufase verkregen 12-15 waarden voor D  T (en D  ST , 
indien beschikbaar) als de procentuele verwijdering van de teststof. Uit de vorm van de eliminatiecurve kunnen enkele conclusies over het eliminatie ­
proces worden afgeleid.
 
Adsorptie  
47. Als aan het begin van de test een grote mate van DOC-eliminatie van de 
teststof wordt waargenomen, wordt de teststof waarschijnlijk geëlimineerd 
door adsorptie aan de biofilm. Dit kan worden aangetoond door de geadsor ­
beerde teststof te bepalen in de vaste stoffen die van de film zijn losgeko ­
men. Het is niet gebruikelijk dat gedurende de hele test een hoge mate van DOC-eliminatie van adsorbeerbare stoffen plaatsvindt; normaliter is de mate 
van verwijdering in eerste instantie groot, waarna geleidelijk een even ­
wichtswaarde wordt bereikt. Als de geadsorbeerde teststof echter kan zorgen voor acclimatisering van de microbiële populatie, neemt de DOC-eliminatie van de teststof vervolgens toe en wordt een hoge plateauwaarde bereikt.
 
Aanloopfase  
48. Net als in statische screeningtests hebben veel teststoffen een aanloopfase 
nodig voordat volledige biologische afbraak plaatsvindt. In de aanloopfase 
vindt acclimatisering (of aanpassing) van de werkzame bacteriën plaats en wordt de teststof nagenoeg niet verwijderd; vervolgens gaan deze bacteriën groeien. Het einde van deze fase is arbitrair vastgesteld op het moment 
waarop ongeveer 10 % van de initiële hoeveelheid teststof is verwijderd 
(nadat eventuele adsorptie heeft kunnen plaatsvinden); op dat moment be ­
gint de afbraakfase. De aanloopfase is vaak zeer variabel en slecht repro ­
duceerbaar.
 
Plateaufase  
49. In een continue test is de plateaufase van een eliminatiecurve de fase waarin 
de maximale afbraak plaatsvindt. Deze fase moet ten minste drie weken 
duren en omvat ongeveer 12-15 geldige gemeten waarden.  
Gemiddeld eliminatiepercentage van de teststof  
50. Bereken het gemiddelde van de eliminatiewaarden D  t (en D  ST , indien be ­
schikbaar) van de teststof in de plateaufase. Rond de gevonden waarde af op 
het dichtstbijzijnde gehele getal (1 %); dit is het eliminatiepercentage van de teststof. Aanbevolen wordt tevens het 95 %-betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelde waarde te berekenen. Bereken op soortgelijke wijze het gemid ­
delde eliminatiepercentage (D
 B ) van het organische medium in het contro ­
levat.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Aanduiding van biologische afbraak  
51. Als de teststof niet significant aan de biofilm adsorbeert en de eliminatie ­
curve een vorm heeft die typerend is voor biologische afbraak met aan ­
loopfase, afbraakfase en plateaufase (punten 48 en 49), kan de gemeten 
eliminatie zonder meer aan biologische afbraak worden toegeschreven. Als 
een grote mate van initiële verwijdering heeft plaatsgevonden, kan in de simulatietest geen onderscheid worden gemaakt tussen biologische en niet-biologische eliminatieprocessen. In dergelijke gevallen, alsook in andere 
gevallen waarin getwijfeld wordt over de biologische afbraak (bv. als wordt 
gestript), moeten monsters van de film op de geadsorbeerde teststof worden geanalyseerd of aanvullende statische (screening)tests op biologische af ­
breekbaarheid worden verricht voor parameters die duidelijk op biologische 
processen wijzen. Dergelijke tests zijn de methoden voor zuurstofopname (hoofdstuk C.4 van deze bijlage D, E en F) (9) en een test die de CO
 2 - 
productie meet (hoofdstuk C.4-C van deze bijlage of de gasruimteproef) 
(10); gebruik als entmateriaal van tevoren blootgestelde biofilm uit de juiste 
reactor.  
52. Als de verwijdering van zowel de DOC als de specifieke stof is gemeten, 
wijzen significante verschillen tussen beide verwijderingspercentages (waar ­
bij het eerste lager is dan het tweede) op de aanwezigheid van organische tussenproducten in de effluenten, die moeilijker afbreekbaar kunnen zijn; deze moeten worden onderzocht.
 
Geldigheid van testresultaten  
53. De test wordt geldig geacht als de mate van DOC- (of CZV-)eliminatie (D  B ) 
in de controle-installaties na twee weken bedrijfstijd > 80 % is en geen ongebruikelijke waarnemingen zijn gedaan.
 
54. Als een gemakkelijk afbreekbare (referentie)stof is getest, moet de mate van 
biologische afbraak > 90 % zijn en mag het verschil tussen duplowaarden niet meer dan 5 % bedragen. Als niet aan deze twee criteria wordt voldaan, 
moeten de procedures van de proef opnieuw worden bekeken en/of moet 
huishoudelijk afvalwater uit een andere bron worden verkregen.
 
55. Indien een teststof in duplo-installaties wordt behandeld, mag ook het ver ­
schil tussen de waarden voor biologische afbraak van die installaties niet 
meer dan 5 % bedragen. Als niet aan dit criterium wordt voldaan, maar de verwijdering hoog is, wordt de analyse gedurende nog eens drie weken voortgezet. Als de verwijdering laag is, worden de inhibitoire effecten van 
de teststof onderzocht (indien niet bekend) en wordt de test indien mogelijk 
herhaald met een lagere concentratie teststof.
 
Testverslag  
56. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opge ­
nomen:  
Teststof:  
— identificatiegegevens;  
— fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken.  
Testomstandigheden:  
— eventuele wijzigingen van het testsysteem, in het bijzonder indien on ­
oplosbare of vluchtige stoffen worden getest;  
— soort organisch medium;  
— indien gebruikt en indien bekend, percentage en aard van industrieel 
afvalwater dat in het rioolwater aanwezig is;  
— beëntingsmethode;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— stamoplossing van de teststof — gehalte aan DOC (opgeloste organische 
koolstof) en TOC (totale organische koolstof); bij suspensies: wijze van 
bereiding; gebruikte testconcentratie(s), met motivering indien afwijkend van het bereik 10-20 mg/l DOC; toevoegingsmethode; datum van eerste toevoeging; eventuele wijzigingen van de concentratie;
 
— gemiddelde hydraulische retentietijd (zonder groei); omwentelingssnel ­
heid van de buis; benadering van de hellingshoek, indien mogelijk;  
— gegevens over loslaten film; tijd en intensiteit;  
— testtemperatuur en bereik;  
— toegepaste analysetechnieken.  
Testresultaten:  
— alle gemeten gegevens van DOC, CZV, specifieke analysen, pH, tem ­
peratuur, stikstofverbindingen, indien relevant;  
— alle berekende gegevens van D  t (of D  tc ), D  B en D  s in de vorm van 
tabellen en eliminatiecurven;  
— informatie over de aanloop- en plateaufase, de duur van de test, het 
eliminatiepercentage van de teststof en de referentiestof (indien getest) en van het organische medium (in de controle-installatie), met statisti ­
sche informatie en verklaringen betreffende de biologische afbraak en de 
geldigheid van de test;
 
— een bespreking van de resultaten.  
LITERATUUR:  
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753-758.  
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable 
material. Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.  
(3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Um ­
weltchem. Ökotox. 10: 214-220.  
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional tric ­
kling filter. JAOCS 43: 92-94.  
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
 
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London.
 
(9) Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologi ­
sche afbreekbaarheid A-F.  
(10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Aanhangsel 8  
Figuur 1  
Roterende buizen
  
Legenda:  
Bovenaanzicht  
Aanzicht A/B  
Aangedreven wieltjes  
Niet-aangedreven wieltjes  
Aandrijfmotor  
Vertragingsmechanisme  
Binnenflens  
Hellingsmechanisme  
Kegelwielendrijfwerk  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figuur 2  
Stroomdiagram
  
A: Opslagvat  
B: Peristaltische pomp  
C: Roterende buis  
D: Opslagvat effluent  
DEFINITIES:  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  
(Chemische) stof:  „Er zij op gewezen dat het begrip „(chemische) stof” in de 
UNCED-overeenkomsten en nadere documenten een ruime betekenis heeft en 
betrekking heeft op zowel stoffen, producten, mengsels, preparaten als andere begrippen waarmee de betrokken stoffen in de bestaande systemen kunnen wor ­
den aangeduid.”
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIOLOGISCHE AFBRAAK  
ACTIEF SLIB: REMMING ADEMHALING  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
In de hier beschreven methode wordt de invloed van een teststof op 
micro-organismen bepaald doordat de ademhalingssnelheid onder gedefinieerde omstandigheden wordt gemeten in aanwezigheid van verschillende concentraties van de teststof.
 
Deze methode is een snelle test, waarmee stoffen die de werking van 
aerobe microbiële zuiveringsinstallaties kunnen schaden, kunnen 
worden geïdentificeerd. Ook dient de test om een aanwijzing te 
krijgen van niet-remmende concentraties van stoffen waarvan de biologische afbreekbaarheid moet worden onderzocht.
 
De definitieve test kan worden voorafgegaan door een oriënterende 
proef. Deze levert informatie op over het concentratiegebied dat in 
de definitieve test dient te worden onderzocht.  
De test bevat verder twee controles zonder reststof, welke respectie ­
velijk aan het begin en aan het eind van de test worden ingezet. 
Bovendien wordt elke partij actief slib met behulp van een referen ­
tiestof gecontroleerd.  
Deze methode verloopt het gemakkelijkst met stoffen die door de 
goede oplosbaarheid in water in de geringe vluchtigheid waarschijn ­
lijk in het water blijven.  
Voor stoffen met beperkte oplosbaarheid in het testmedium is het 
niet altijd mogelijk de EC  50 te bepalen.  
Resultaten gebaseerd op zuurstofopname kunnen tot onjuiste conclu ­
sies leiden, indien de teststof de neiging heeft de oxidatieve fosfo ­
rylering te ontkoppelen.  
Voor de uitvoering van de test is de volgende informatie over de 
teststof van nut:  
— oplosbaarheid in water,  
— dampdruk,  
— structuurformule,  
— zuiverheid.  
Aanbeveling  
Actief slib kan potentieel ziekteverwekkende organismen bevatten en 
dient daarom met voorzichtigheid te worden behandeld.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Onder ademhalingssnelheid wordt verstaan het zuurstofverbruik van 
actief slib van micro-organismen in afvalwater. Dit wordt doorgaans 
uitgedrukt in mg O  2 per mg actief slib (droge stof) per uur.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Voor de berekening van het remmende effect van een bepaalde con ­
centratie van de teststof wordt de ademhalingssnelheid uitgedrukt als 
percentage van het gemiddelde van de ademhalingssnelheden van de twee controles:
 
Í 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Î 
Ü 100 ¼ percentage remming  
waarin:  
R s = ademhalingssnelheid bij de geteste concentratie van de test ­
stof, 
RC 1 = ademhalingssnelheid van de eerste controle,  
RC 2 = ademhalingssnelheid van de tweede controle.  
De EC  50 in deze methode is de concentratie van de teststof waarbij 
de ademhalingssnelheid 50 % bedraagt van die in de controle onder 
de in deze methode beschreven omstandigheden.  
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Aanbevolen wordt 3,5-dichloorfenol, dat een bekende remmer van de 
ademhaling is, te gebruiken als referentiestof en hiervan de EC  50 te 
testen ter controle van de gevoeligheid van het slib.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De ademhalingssnelheid van actief slib waaraan een standaardhoe ­
veelheid kunstmatig afvalwater wordt toegevoegd, wordt gemeten na een contacttijd van 30 minuten of drie uur of beide. Ook wordt de 
ademhalingssnelheid van hetzelfde actief slib gemeten in aanwezig ­
heid van verschillende concentraties van de teststof onder overigens identieke omstandigheden. De remmende werking van de teststof bij 
een bepaalde concentratie wordt weergegeven als percentage van de 
gemiddelde ademhalingssnelheden van twee controles. Een EC
 50 - 
waarde wordt berekend op grond van bepalingen bij verschillende concentraties.
 
1.5. KWALITEITSNORMEN  
De testresultaten zijn geldig indien:  
— de ademhalingssnelheden van de twee controles onderling minder 
dan 15 % verschillen;  
— de EC  50 (30 minuten en/of drie uur) van 3,5-dichloorfenol 5 tot 
30 mg/l bedraagt.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Reagentid  
1.6.1.1. O p l o s s i n g e n v a n d e t e s t s t o f  
De benodigde oplossingen van de teststof worden bij de aanvang van 
het onderzoek vers uit een voorraadoplossing bereid. Voor de voor ­
raadoplossing kan, indien de onderstaande aanbevolen werkwijze 
wordt gevolgd, een concentratie van 0,5 g/l worden aangehouden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. O p l o s s i n g v a n d e r e f e r e n t i e s t o f  
Een oplossing van 3,5-dichloorfenol kan bijvoorbeeld worden bereid 
door 0,5 g 3,5-dichloorfenol op te lossen in 10 ml 1M NaOH, dan tot ongeveer 30 ml met gedestilleerd water te verdunnen, vervolgens 
onder roeren 0,5 M H
 2 SO 4 toe te voegen tot er een neerslag begint te 
ontstaan — hiervoor zal ongeveer 8 ml 0,5 M H  2 SO 4 nodig zijn — 
en ten slotte het mengsel met gedistilleerd water tot 1 liter te ver ­
dunnen. De pH moet dan liggen tussen 7 en 8.  
1.6.1.3. K u n s t m a t i g a f v a l w a t e r  
Kunstmatig afvalwater wordt bereid door de volgende hoeveelheden 
stoffen op te lossen in 1 liter water:  
— 16 g pepton,  
— 11 g vleesextract,  
— 3 g ureum,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 ,.2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Opmerking 1:  Dit kunstmatige afvalwater is 100 maal zo geconcen ­
treerd als hetgeen is beschreven in het technisch rapport van de OESO „Proposed method for the determination of the biodegradabi ­
lity of surfactants used in synthetic detergents” van 11 juni 
1976. Bovendien is er dikaliumwaterstoffosfaat toegevoegd.
 
Opmerking 2:  Indien het kunstmatige afvalwater niet onmiddellijk 
wordt gebruikt, moet het in het donker bij 0 tot 4  o C bewaard 
worden gedurende maximaal één week, zodanig dat verandering in 
samenstelling vermeden wordt. Het kunstmatige afvalwater kan 
eventueel gesteriliseerd worden voor opslag of de pepton en het vleesextract kunnen kort voor de uitvoering van de test toegevoegd worden. Vóór het gebruik moet de oplossing goed worden gemengd 
en de pH worden bijgesteld.
 
1.6.2.  Apparatuur  
Meetapparaat: De precieze maten zijn niet van wezenlijk belang. Er 
moet echter geen vrije ruimte bovenin zijn en de elektrode moet 
goed zijn ingeklemd in de hals van het meetvat.  
Benodigde apparatuur:  
— meetapparaat (zie figuur 1),  
— beluchtingstoestel,  
— pH-elektrode en meetapparatuur,  
— O  2 -elektrode.  
1.6.3.  Bereiding van het entmateriaal  
Als microbieel entmateriaal voor de test wordt doorgaans actief slib 
uit een zuiveringsinstallatie gebruikt die hoofdzakelijk huishoudelijk afvalwater behandelt.
 
Indien nodig kunnen de grotere deeltjes door bezinking, gedurende 
bijvoorbeeld vijftien minuten, en door decanteren van de bovenlaag met fijnere deeltjes voor het gebruik afgescheiden worden. Een al ­
ternatieve methode is het gedurende enkele seconden homogeniseren 
van het slib met behulp van een mixer.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Wanneer er reden is te veronderstellen dat er toxische componenten 
aanwezig zijn, moet het slib gewassen worden met leidingwater of 
een isotone oplossing. Na centrifugeren wordt het supernatant gede ­
canteerd (deze procedure moet drie keer herhaald worden).  
Een klein gedeelte van het slib wordt gewogen en gedroogd. Aan de 
hand van dit resultaat kan de hoeveelheid nat slib berekend worden die in water gesuspendeerd dient te worden teneinde een actief slib te 
verkrijgen met een droge-stofgehalte tussen 2 en 4 g/l. Dit niveau 
correspondeert met een concentratie tussen 0,8 en 1,6 g/l in het testmedium, wanneer de hieronder aanbevolen procedure wordt ge ­
volgd.
 
Indien het slib niet kan worden gebruikt op de dag dat het is ver ­
zameld, wordt aan elke liter actief slib die op bovenstaande wijze is 
bereid, 50 ml kunstmatig afvalwater per liter slib toegevoegd; dit 
mengsel wordt dan 's nachts belucht bij 20 ± 2  o C. Ook gedurende 
de dag wordt dit belucht. Voor gebruik wordt de pH gecontroleerd en indien nodig tussen 6 en 8 gebracht. Het gehalte aan gesuspen ­
deerde vaste stof wordt bepaald als beschreven in de voorgaande 
alinea.
 
Indien dezelfde partij slib nodig is voor proeven op opeenvolgende 
dagen (ten hoogste vier dagen) wordt aan het eind van elke werkdag steeds 50 ml kunstmatig afvalwater toegevoegd.
 
1.6.4.  Uitvoering van de test  
Duur/contacttijd: 30 minuten en/of drie uur, gedurende 
welke tijd wordt belucht. 
Water: Drinkwater (zo nodig chloorvrij ge ­
maakt). 
Luchttoevoer: Schone lucht, vrij van olie. Stroomsnel ­
heid 0,5 tot 1 liter/minuut. 
Meetapparaat: Platbodemkolf, bijvoorbeeld een BOD- 
kolf (zie figuur 1). 
Zuurstofmeter: Een geschikte zuurstofelektrode met een 
recorder. 
Voedingsoplossing: Kunstmatig afvalwater (zie boven). 
Teststof: De testoplossing wordt vers bereid bij 
de aanvang van de test. 
Referentiestof: bijvoorbeeld 3,5-dichloorfenol (ten min ­
ste drie concentraties). 
Controle: Geënt monster zonder teststof. Temperatuur: 20 ± 2
 o C. 
Voor zowel de teststof als de referentiestof kan voor de drie uur 
contactperiode de volgende werkwijze worden gevolgd:  
Er worden verschillende vaten (bijvoorbeeld bekerglazen van 1 1) 
gebruikt.  
Er worden ten minste vijf concentraties gebruikt die onderling steeds 
met dezelfde factor (bij voorkeur kleiner dan 3,2) verschillen.  
Op tijdstip „0” wordt 16 ml kunstmatig afvalwater aangevuld met 
water tot 300 ml. Hieraan wordt 200 ml microbieel entmateriaal 
toegevoegd en het totale mengsel (500 ml) wordt in het eerste vat 
gegoten (eerste controle C  1 ). ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
De testvaten moeten continu belucht worden om er zeker van te zijn 
dat het gehalte aan opgelost O  2 niet lager wordt dan 2,5 mg/l en dat 
vlak voor de meting van de ademhalingssnelheid de O  2 -concentratie 
ten minste 6,5 mg/l bedraagt.  
Op tijdstip „vijftien minuten” (vijftien minuten is een willekeurige 
maar geschikte tijd) wordt bovenstaande procedure herhaald, behalve 
dat eerst aan de 16 ml kunstmatig afvalwater 100 ml voorraadoplos ­
sing van de teststof wordt toegevoegd voordat met water tot 300 ml en daarna met microbieel entmateriaal tot 500 ml wordt aangevuld. Dit mengsel wordt dan in een tweede vat gegoten en als boven 
belucht. Dit proces wordt met tussenpozen van vijftien minuten her ­
haald met verschillende volumes van de voorraadoplossing van de teststof, zodat een reeks vaten ontstaat met verschillende concentra ­
ties van de teststof. Ten slotte wordt een tweede controle bereid (C
 2 ). 
Na drie uur wordt de pH gemeten, wordt een goed homogeen mon ­
ster van de inhoud van het eerste vat in het meetapparaat gegoten en 
wordt de ademhalingssnelheid gedurende maximaal tien minuten ge ­
meten.  
Deze bepaling wordt om de vijftien minuten herhaald met steeds een 
volgend vat, zodanig dat de contacttijd per vat drie uur is.  
Met elke partij microbieel entmateriaal wordt de referentiestof op 
dezelfde wijze getest.  
Wanneer er metingen na 30 minuten contact nodig zijn, moet een 
andere procedure worden gekozen (bijvoorbeeld meer dan één zuur ­
stofmeter).  
Indien meting van het chemisch zuurstofverbruik nodig is, worden 
nog meer vaten bereid met teststof, kunstmatig afvalwater en water, 
maar zonder actief slib. Het zuurstofverbruik wordt gemeten en ge ­
registreerd na een beluchtingstijd van 30 minuten en/of drie uur (contacttijd).
 
2. GEGEVENS EN UITWERKING  
De ademhalingssnelheid wordt berekend uit de recorderuitslag in mg 
O 2 /l tussen ongeveer 6,5 mg O  2 /l en 2,5 mg O  2 /l of over een periode 
van tien minuten indien de ademhalingssnelheid laag is. Het gedeelte 
van de ademhalingscurve waarover de ademhalingssnelheid wordt 
gemeten moet rechtlijnig zijn.  
Indien de ademhalingssnelheden van de twee controles niet binnen 
15 % van elkaar liggen of de EC  50 (30 minuten en/of drie uur) van 
de referentiestof niet in het aanvaardbare gebied (5 tof 30 mg/l voor 
3,5-dichloorfenol) ligt, is de test niet geldig en moet deze worden 
herhaald.  
Het percentage remming wordt bij elke testconcentratie berekend (zie 
1.2). Het percentage remming wordt uitgezet tegen de concentratie op log-normaal- of log-waarschijnlijkheidspapier en daaruit wordt de 
EC
 50 -waarde herleid.  
De 95 % betrouwbaarheidsgrenzen voor de EC  50 -waarden kunnen 
volgens standaardprocedures worden bepaald.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. VERSLAGGEVING  
3.1. TESTRAPPORT  
Het testrapport moet, indien mogelijk, bevatten:  
— teststof: scheikundige gegevens ter identificatie;  
— testsysteem: herkomst, concentratie en eventuele voorbehandeling 
van het actief slib;  
— testomstandigheden:  
— de pH van het reactiemengsel voor de respiratiemeting,  
— testtemperatuur,  
— testduur,  
— referentiestof en de gemeten EC  50 daarvan,  
— abiotische zuurstofopname (indien plaatsvindend);  
— resultaten:  
— alle meetgegevens,  
— remmingscurve en methode ter bepaling van EC  50 , 
— EC  50 en zo mogelijk 95 % betrouwbaarheidsgrenzen, EC  20 
en EC  80 , 
— alle waarnemingen en alle afwijkingen van deze testmethode 
die van invloed kunnen zijn op de resultaten.  
3.2. INTERPRETATIE VAN DE GEGEVENS  
De EC  50 -waarde dient te worden beschouwd als niet meer dan een 
aanwijzing voor de waarschijnlijke toxiciteit van de teststof, hetzij 
voor de afvalwaterbehandeling met actief slib, hetzij voor micro- 
organismen in afvalwater, omdat de in het milieu optredende inge ­
wikkelde interacties in een laboratoriumproef niet voldoende kunnen worden nagebootst. Bovendien kunnen teststoffen die mogelijk rem ­
mend werken op de ammonia-oxydatie eveneens atypische inhibitie ­
curven opleveren. Dergelijke curven dient men met gepaste terug ­
houdendheid te interpreteren.
 
4. REFERENTIES  
(1) International Standard ISO 8192-1986.  
(2) Broecker, B., en Zahn, R.,  Water Research  11, 1977, blz. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., en Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 1981, 
blz. 245.  
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommended Method No 103,  also 
described by:  
(5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, 1976, blz. 80.  
(6) Schefer, W.,  Textilveredlung 6,  1977, blz. 247.  
(7) OESO, Parijs, 1981,  Testrichtlijn 209,  Besluit C(81) 30 def. van 
de Raad.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIOLOGISCHE AFBRAAK  
GEWIJZIGDE SCAS-TEST  
1. METHODE  
1.1. INLEIDING  
Doel van de methode is te bepalen in hoeverre in water oplosbare, 
niet-vluchtige organische verbindingen uiteindelijk biologisch af ­
breekbaar zijn, wanneer zij gedurende lange tijd worden blootgesteld aan relatief hoge concentraties micro-organismen. De micro-organis ­
men worden gedurende deze tijd in leven gehouden door dagelijkse 
toevoeging van voorbezonken rioolwater. (Voor gebruik tijdens het weekend kan het rioolwater bij 4
 o C worden bewaard. Tevens kan 
het synthetisch rioolwater van de OESO-bevestigende test worden 
gebruikt.)  
Er kan fysisch-chemische adsorptie aan de gesuspendeerde deeltjes 
plaatsvinden; hiermee moet bij de interpretatie van de resultaten rekening worden gehouden (zie 3.2).
 
Vanwege de lange verblijftijd van de vloeibare fase (36 uur) en de 
tussentijdse toevoeging van nutriënten worden bij de test niet de 
omstandigheden in een rioolwaterzuiveringsinstallatie gesimuleerd. 
De resultaten met verschillende verbindingen wijzen erop dat de potentiële biologische afbraak bij de test hoog is.
 
De testomstandigheden zijn zeer gunstig voor de selectie en/of adap ­
tatie van micro-organismen die de te testen verbinding kunnen 
afbreken. (De procedure kan ook worden gebruikt voor het verkrij ­
gen van geadapteerde inocula voor andere tests).  
Bij deze methode wordt de uiteindelijke biologische afbreekbaarheid 
van de te testen verbindingen beoordeeld door meting van de con ­
centratie opgelost organisch koolstof (Concentration Dissolved Or ­
ganic Carbon = DOC concentration). Het verdient de voorkeur de 
DOC-concentratie na aanzuren en zuiveren te bepalen en niet als het 
verschil van C  totaal — C  anorg . 
Wanneer tegelijkertijd een specifieke analysemethode wordt ge ­
bruikt, kan tevens worden nagegaan in hoeverre primaire afbraak van de verbinding plaatsvindt (verdwijning van de oorspronkelijke 
chemische structuur).
 
De methode kan alleen worden toegepast bij die organische verbin ­
dingen die bij de in de test gebruikte concentratie:  
— in water oplosbaar zijn (ten minste 20 mg opgelost organisch 
koolstof per liter),  
— een verwaarloosbare dampspanning hebben,  
— niet remmend werken op bacteriën,  
— binnen het testsysteem niet in belangrijke mate worden geadsor ­
beerd,  
— niet door schuimvorming uit de oplossing verdwijnen.  
Het gehalte aan organisch koolstof van het testmateriaal moet wor ­
den bepaald.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Gegevens over de onderlinge verhoudingen van de belangrijkste 
bestanddelen van het testmateriaal zijn nuttig voor de interpretatie 
van de verkregen resultaten, met name als de gevonden waarden laag of zeer laag zijn.
 
Gegevens over de toxiciteit van de stof voor micro-organismen kun ­
nen nuttig zijn voor de interpretatie van lage waarden en voor de 
keuze van geschikte testconcentraties.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
C T = concentratie van de testverbinding uitgedrukt in organisch 
koolstof, zoals deze aan het begin van de beluchtingsperiode in het bezonken rioolwater aanwezig is of daaraan wordt toe ­
gevoegd (mg/l),
 
C t = concentratie opgelost organisch koolstof in het supernatans 
van het testmengsel aan het eind van de beluchtingsperiode (mg/l),
 
C c = concentratie opgelost organisch koolstof in het supernatans 
van het controlemengsel aan het eind van de beluchtingsperi ­
ode (mg/l).  
Bij deze methode wordt biologische afbraak gedefinieerd als het 
verdwijnen van organisch koolstof. De biologische afbraak kan wor ­
den uitgedrukt als:  
1. De verdwenen hoeveelheid als percentage van de per dag toege ­
voegde hoeveelheid verbinding (D  da ): 
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C T Ü 100 [1]  
D da = afbraak/dagelijks toegevoegd („degradation/daily addi ­
non”).  
2. De verdwenen hoeveelheid als percentage van de aan het begin 
van elke dag aanwezige hoeveelheid verbinding  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2 a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2 b)]  
D ssd = afbraak/begin dag aanwezig („degradation/substance 
start of day”),  
de indexen i en (i + 1) verwijzen naar de dag van meting.  
Vergelijking 2 a) wordt aanbevolen wanneer de DOC-concentratie 
in het effluent van dag tot dag verschilt, terwijl vergelijking 2 b) 
kan worden gebruikt wanneer de DOC-concentratie in het effluent 
van dag tot dag relatief constant blijft.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. REFERENTIEVERBINDINGEN  
In sommige gevallen kan bij het onderzoek van een nieuwe ver ­
binding het gebruik van referentieverbindingen nuttig zijn; hier wor ­
den echter geen specifieke referentieverbindingen aanbevolen.  
Er worden gegevens verschaft over een aantal verbindingen waar ­
voor een ringonderzoek is uitgevoerd (zie aanhangsel 1), voorname ­
lijk om de methode zo nu en dan te kunnen ijken en om bij gebruik van een andere methode de resultaten te kunnen vergelijken.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Actief slib uit een rioolwaterzuiveringsinstallatie wordt in een semi- 
continue actief-slibinstallatie (SCAS) gebracht. De te testen verbin ­
ding en voorbezonken rioolwater, worden toegevoegd en het meng ­
sel wordt gedurende 23 uur belucht. Vervolgens wordt de beluchting gestopt, laat men het slib bezinken en wordt het supernatans ver ­
wijderd.
 
Het in de beluchtingskamer achtergebleven slib wordt vervolgens 
vermengd met een nieuwe hoeveelheid van de te testen verbinding en rioolwater en de cyclus wordt herhaald.
 
De biologische afbraak wordt gemeten door bepaling van de hoe ­
veelheid opgelost organisch koolstof in het supernatans. Deze waarde 
wordt vergeleken met de waarde die wordt verkregen voor het su ­
pernatans van controleslib, waaraan alleen voorbezonken rioolwater is toegevoegd.
 
Wanneer een specifieke analysemethode wordt gebruikt, kunnen ook 
veranderingen in de concentratie van de uitgangsstof ten gevolge van 
biologische afbraak worden gemeten (primaire biologische afbreek ­
baarheid).  
1.5. KWALITEITSCRITERIA  
De reproduceerbaarheid van deze methode, gebaseerd op het ver ­
dwijnen van opgelost organisch koolstof, is nog niet aangetoond. (Wanneer rekening wordt gehouden met primaire biologische af ­
braak, worden zeer nauwkeurige gegevens verkregen voor materiaal 
dat in hoge mate afbreekbaar is.)
 
De gevoeligheid van de methode wordt grotendeels bepaald door de 
variatie in de blancobepaling en in mindere mate door de nauwkeu ­
righeid van de bepaling van opgelost organisch koolstof en de con ­
centratie van de te testen verbinding in de vloeistof aan het begin 
van elke cyclus.  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTPROCEDURE  
1.6.1.  Voorbereidingen  
Voor elke te testen verbinding en voor de blancobepalingen moet 
een voldoende aantal schone beluchtingskamers (de oorspronkelijke 
SCAS-testopstelling van 1,5 1 kan tevens worden gebruikt) worden 
opgesteld, voorzien van luchtinlaatbuizen (figuur 1). De perslucht voor de testopstelling wordt gefiltreerd door een grof filter met wat ­
ten, mag geen organisch koolstof bevatten en moet vooraf worden 
verzadigd met water om verliezen door verdamping zoveel mogelijk 
te voorkomen.
 
Uit een actief-slibinstallatie, waar voornamelijk huishoudelijk afval ­
water wordt gereinigd, wordt een monster actief-slibsuspensie ge ­
nomen, dat 1 tot 4 g gesuspendeerde stoffen/l bevat. Voor elke 
beluchtingskamer is ongeveer 150 ml van de gemengde vloeistof 
nodig.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Er worden voorraadoplossingen van de te testen verbinding in ge ­
distilleerd water gemaakt; onder normale omstandigheden is een con ­
centratie van 400 mg/l berekend als organisch koolstof nodig, zodat de concentratie van de te testen verbinding, als er geen biologische afbraak optreedt, aan het begin van elke beluchtingscyclus 20 mg 
koolstof/l is.
 
Hogere concentraties zijn mogelijk als de toxiciteit voor micro-or ­
ganismen dit toelaat.  
De concentratie organisch koolstof in de voorraadoplossingen wordt 
gemeten.  
1.6.2.  Testomstandigheden  
De test dient te worden uitgevoerd bij 20 tot 25  o C. 
Er wordt een hoge concentratie aerobe micro-organismen gebruikt (1 
tot 4 % gesuspendeerd materiaal per liter) en de effectieve verblijfs ­
tijd is 36 uur. Het koolstofhoudend materiaal in het rioolwater wordt 
in hoge mate geoxideerd, onder normale omstandigheden binnen acht uur na het begin van elke beluchtingscyclus. Daarna is de ademhaling in het slib gedurende de rest van de beluchtingsperiode 
endogeen; gedurende deze periode is de te testen verbinding het 
enige beschikbare substraat, tenzij ook deze snel wordt gemetaboli ­
seerd. Deze kenmerken, alsmede het feit dat het testmengsel bij gebruik van huishoudelijk afvalwater als medium elke dag opnieuw 
wordt geënt, leveren zeer gunstige omstandigheden op voor zowel 
adaptatie als een hoge mate van biologische afbraak.
 
1.6.3.  Uitvoering van de test  
Uit een actief-slibinstallatie voor in hoofdzaak huishoudelijk afval ­
water of een laboratoriuminstallatie wordt een gemengd vloeistof ­
monster genomen en tot gebruik in het laboratorium aeroob bewaard. 
Elke beluchtingskamer (ook die voor de blancobepaling) wordt ge ­
vuld met 150 ml van de gemengde vloeistof (wanneer de oorspron ­
kelijke SCAS-testapparatuur wordt gebruikt, moeten de genoemde volumes met 10 worden vermenigvuldigd) en de beluchting wordt 
gestart. Na 23 uur wordt de beluchting gestopt en laat men het slib 
gedurende 45 minuten bezinken. De kraan wordt opengedraaid en uit elke beluchtingskamer tapt men 100 ml van het supernatans af. Vlak voor gebruik wordt een hoeveelheid voorbezonken rioolwater ge ­
nomen; 100 ml daarvan wordt toegevoegd aan het in elke beluch ­
tingskamer achtergebleven slib. De beluchting wordt opnieuw ge ­
start. In deze fase wordt geen testmateriaal toegevoegd; elke dag wordt uitsluitend huishoudelijk afvalwater in de beluchtingskamer 
gebracht, tot er na bezinken een helder supernatans wordt verkregen. 
Dit duurt meestal maximaal twee weken; de hoeveelheid opgelost organisch koolstof in het supernatans aan het eind van elke beluch ­
tingscyclus benadert dan een constante waarde.
 
Aan het eind van deze periode wordt het bezonken slib uit de ver ­
schillende kamers gemengd en wordt in elke kamer 50 ml van dit gemengde slib gebracht.
 
In het testvat voor de blanco-bepaling worden 95 ml voorbezonken 
rioolwater en 5 ml water gebracht. In de overige testvaten wordt 
95 ml voorbezonken rioolwater en 5 ml van de voorraadoplossing 
(400 mg/l) van de te testen verbinding gebracht. De beluchting wordt opnieuw gestart en 23 uur later stopgezet. Vervolgens laat men het slib 45 minuten bezinken; het supernatans wordt afgetapt en de hoe ­
veelheid opgeloste organische koolstof wordt bepaald.
 
Deze vul- en aftapprocedure wordt gedurende de hele test elke dag 
herhaald.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Het is wellicht nodig vóór het bezinken de wanden van de kamers 
schoon te maken, om te voorkomen dat zich hierop boven het vloei ­
stofniveau vaste deeltjes gaan afzetten. Om onderlinge verontreini ­
ging te voorkomen wordt voor elke kamer een afzonderlijke schraper of borstel gebruikt.
 
De hoeveelheid opgelost organisch koolstof in het supernatans wordt 
bij voorkeur elke dag bepaald, hoewel het toelaatbaar is de analyse minder vaak uit te voeren. Vóór analyse wordt de vloeistof gefil ­
treerd door gewassen membraanfilters van 0,45 μm of gecentrifu ­
geerd. Membraanfilters kunnen worden gebruikt, als vaststaat dat 
deze tijdens de filtratie geen koolstof afgeven en ook de testverbin ­
ding niet adsorberen. De temperatuur van het monster mag in de centrifuge niet hoger zijn dan 40
 o C. 
Er zijn geen vaste regels voor de tijdsduur van de test voor ver ­
bindingen die niet of nauwelijks biologisch worden afgebroken, maar de ervaring leert dat deze in het algemeen minimaal 12 weken en 
maximaal 26 weken moet zijn.
 
2. GEGEVENS EN EVALUATIE  
De hoeveelheid opgelost organisch koolstof in het supernatans bij de 
testbepalingen en de blancobepalingen worden tegen de tijd uitgezet.  
Naarmate de biologische afbraak ten einde loopt, zullen de waarden 
voor de testbepalingen in de buurt komen te liggen van de blanco ­
waarden. Wanneer het verschil tussen de twee waarden bij drie op ­
eenvolgende metingen constant blijft, worden er nog zoveel metin ­
gen uitgevoerd dat statistische behandeling van de gegevens moge ­
lijk is en wordt het percentage van de te testen verbinding dat bio ­
logisch wordt afgebroken berekend (D  da of D  ssd , zie 1.2).  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTRAPPORT  
Het testrapport moet, indien mogelijk, bevatten:  
— alle gegevens over de aard van het rioolwater en de gebruikte 
proefopstelling en de resultaten van de bepalingen met de te testen verbinding en met de eventueel gebruikte referentieverbin ­
ding en de resultaten van de blancobepalingen,
 
— de temperatuur,  
— de afbraakcurve met een beschrijving en de berekeningswijze (zie 
1.2), 
— datum en plaats van monsterneming van het actief slib en het 
rioolwater en gegevens over adaptatie daarvan, concentratie, enz.,  
— wetenschappelijke motivering voor veranderingen in de testpro ­
cedure,  
— handtekening en datum.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Aangezien de via deze methode te testen verbinding niet gemakkelijk 
biologisch afbreekbaar zal zijn, zal een verlaging van de DOC-con ­
centratie uitsluitend ten gevolge van biologische afbraak onder nor ­
male omstandigheden geleidelijk plaatsvinden in de loop van dagen 
of weken, behalve in gevallen waar een plotselinge adaptatie op ­
treedt, hetgeen blijkt uit een abrupte concentratieverlaging na enkele weken.
 
Fysisch-chemische adsorptie kan echter soms een belangrijke rol 
spelen; in dat geval verdwijnt het toegevoegde DOC reeds in het begin volledig of gedeeltelijk. Wat er vervolgens gebeurt, is afhan ­
kelijk van factoren als de mate van adsorptie en de concentratie van 
gesuspendeerde deeltjes in het afgetapte effluent. Meestal is het ver ­
schil in DOC-concentratie in het supernatans tussen de blancobepa ­
ling en de testbepaling aanvankelijk gering en neemt dit geleidelijk toe tot een nieuwe waarde die gedurende de rest van het experiment 
constant blijft, tenzij adaptatie optreedt.
 
Om onderscheid te kunnen maken tussen biologische afbraak (of 
gedeeltelijke biologische afbraak) en adsorptie moeten andere tests worden uitgevoerd. Dit kan op een aantal manieren gebeuren, maar het meest ondubbelzinnig is het supernatans of het slib als inoculum 
te gebruiken bij een elementair (bij voorkeur respirometrisch) experi ­
ment.
 
Testverbindingen, waarbij in dit experiment een grote verlaging van 
de DOC-concentratie optreedt, welke verlaging niet wordt veroor ­
zaakt door adsorptie, moeten worden beschouwd als eventueel bio ­
logisch afbreekbaar. Een gedeeltelijke, niet door adsorptie veroor ­
zaakte verlaging wijst erop dat de verbinding althans enigermate biologisch wordt afgebroken.
 
Een geringe of in het geheel geen verlaging van de DOC-concen ­
tratie kan worden veroorzaakt door inhibitie van de micro-organis ­
men door de te testen verbinding; dit kan ook blijken uit afbraak en verlies van slib, waarbij een troebel supernatans ontstaat. In dit geval moet de test worden herhaald met een lagere concentratie van de te 
testen verbinding.
 
Door het gebruik van specifieke analysemethoden of van met  14 C 
gelabelde testverbindingen kan een grotere gevoeligheid worden be ­
reikt. In het geval van  14 C-testverbindingen wordt de biologische 
afbraak aangetoond door het ontstaan van  14 C0 2 . 
Wanneer er bij de resultaten ook gegevens worden vermeld over 
primaire biologische afbraak, moet, indien mogelijk, worden ver ­
klaard door welke verandering in de chemische structuur een gerin ­
gere hoeveelheid van de oorspronkelijke testverbinding wordt aange ­
troffen.  
De bruikbaarheid van de analysemethode moet worden aangetoond 
en de resultaten van de blancobepaling moeten worden vermeld.  
4. REFERENTIES  
(1) OESO, Parijs, 1981,  Testrichtlijn 302 A,  Besluit C(81) 30 def. 
van de Raad.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Aanhangsel 1  
SCAS-test: voorbeeld van resultaten  
Chemische stof C t 
(mg/l) C t — C  c 
(mg/l) Percentage 
biodegradatie, 
D da Testduur 
(dagen)  
4-acetyl aminobenzeen sulfonaat 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropyleenbenzeen sulfonaat 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 Diëthyleenglycol 16,5 0,2 98,8 40 Aniline 16,9 1,7 95,9 40 
Cyclopentaan tetracarboxylaat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Aanhangsel 2  
Voorbeeld van testopstelling  
Figure 1
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOCONCENTRATIE: DOORSTROOMTEST MET VISSEN  
1. METHODE  
Deze methode voor het meten van de bioconcentratie stemt overeen 
met OESO-methode TG 305 (1996).  
1.1. INLEIDING  
Deze methode betreft een procedure voor de bepaling van het bio ­
concentratiegedrag van stoffen in vissen in een „flow-through”-situ ­
atie (doorstromend water). Hoewel een doorstroomtest veruit te ver ­
kiezen is, mag eventueel ook in semistatische omstandigheden wor ­
den gewerkt voorzover aan de validiteitscriteria wordt voldaan.  
De beschrijving van de methode omvat alle bijzonderheden die no ­
dig zijn om de test te kunnen uitvoeren; er blijft voldoende ruimte om de proefopzet aan te passen aan de omstandigheden in het be ­
trokken laboratorium en de specifieke karakteristieken van de test ­
stof. De methode is bij uitstek geschikt voor stabiele organische verbindingen met een log P
 ow -waarde tussen 1,5 en 6,0 (1), maar 
mag niettemin ook worden toegepast op superlipofiele stoffen (met 
een log P  ow > 6,0). De voorlopige (a priori) schatting van de bio ­
concentratiefactor („BCF” of ook wel „K  B ”) zal voor dergelijke 
superlipofiele stoffen meestal hoger zijn dan de met behulp van laboratoriumexperimenten bepaalde bioconcentratiefactor in de sta ­
tionaire situatie (BCF
 SS ). Een preliminaire schatting van de biocon ­
centratiefactor van organische stoffen met een log P  ow -waarde die 
9,0 of minder bedraagt, kan worden verkregen door toepassing van de vergelijking van Bintein et al. (2). De parameters die het bio ­
concentratiegedrag karakteriseren, omvatten de opnamesnelheidscon ­
stante (k
 1 ), de depuratiesnelheidsconstante (k  2 ) en de BCF  SS . 
Het gebruik van radioactief gemerkte teststoffen kan de analyse van 
de water- en vismonsters vergemakkelijken en laat ook toe te bepa ­
len of het noodzakelijk is eventuele afbraakstoffen te identificeren en te kwantificeren. Indien de totale hoeveelheid radioactieve residu's 
wordt gemeten (bijvoorbeeld door verbranding of weefselsolubilisa ­
tie), heeft de gemeten BCF betrekking op de oorspronkelijke ver ­
binding, de eventueel achterblijvende metabolieten daarvan en de geassimileerde koolstof. BCF-waarden die worden bepaald op basis 
van de totale hoeveelheid radioactieve residu's zijn derhalve niet 
zonder meer vergelijkbaar met BCF-waarden die worden verkregen door een specifieke chemische bepaling van (uitsluitend) de oor ­
spronkelijke verbinding.
 
In studies met radioactieve merkers kan eventueel door toepassing 
van zuiveringstechnieken de BCF-waarde voor de oorspronkelijke 
verbinding worden bepaald; desgewenst kunnen de belangrijkste me ­
tabolieten worden gekarakteriseerd. Ook kan door analyse en iden ­
tificatie van de residuen in de weefsels een studie van het metabo ­
lisme van de vissen met een bioconcentratieonderzoek worden ge ­
combineerd.  
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Bioconcentratie/bioaccumulatie  is de toename van de concentratie 
van de teststof in of op een organisme (of bepaalde weefsels daar ­
van) ten opzichte van de concentratie van die stof in het omringende medium.
 
De bioconcentratiefactor  (BCF of K  B ) op enig moment van de op ­
namefase van deze accumulatietest, is de verhouding van de con ­
centratie van de teststof in of op de vis of bepaalde weefsels daarvan 
(C f in μg/g (ppm)) en de concentratie van die stof in het omringende 
medium (C  w in μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
De bioconcentratiefactor in stationaire situatie  (BCF  SS of K  B ) on­
dergaat gedurende langere tijd geen significante wijzigingen als de 
concentratie van de teststof in het omringende medium constant blijft.
 
Een plateau (stationaire toestand)  wordt bereikt wanneer in een 
grafiek van de concentratie van de teststof in de vissen (C  f ) als 
functie van de tijd de curve evenwijdig gaat lopen met de tijdas en drie opeenvolgende bepalingen van C
 f op monsters die met tus ­
senpozen van ten minste twee dagen worden genomen, niet meer dan 
20 % van elkaar verschillen en er bovendien geen significant verschil 
bestaat tussen de waarden verkregen op de drie bemonsteringstijd ­
stippen. Wanneer de analyse op samengevoegde monsters wordt 
uitgevoerd, zijn ten minste vier opeenvolgende bepalingen vereist. 
Voor teststoffen die langzaam worden opgenomen, verdient het de voorkeur om intervallen van zeven dagen te gebruiken.
 
Een bioconcentratiefactor  die rechtstreeks uit de snelheidsconstanten 
(k 1 /k 2 ) wordt berekend, wordt kinetische bioconcentratiefactor 
(BCF  k ) genoemd.  
De octanol-water-partitiecoëfficiënt  (P ow of K  ow ) is de verhouding 
van de oplosbaarheid van een stof in n-octanol en in water bij 
evenwicht (methode A.8). De logaritme van P  ow is een indicator 
van de neiging tot bioconcentratie van een chemische stof in aqua ­
tische organismen.  
De blootstellings- of opnamefase  is de periode gedurende welke de 
vissen aan de teststof worden blootgesteld.  
De opnamesnelheidsconstante  (k 1 ) is het cijfer dat aangeeft hoe snel 
de concentratie van de teststof in of op de proefdieren (of bepaalde weefsels daarvan) toeneemt wanneer de vissen aan die stof worden blootgesteld (k
 1 wordt uitgedrukt in dag  -1 ). 
De op de blootstellingsfase volgende depuratiefase (eliminatiefase)  is 
de periode die begint op het moment dat de proefdieren van een medium dat de teststof bevat, worden overgebracht naar een medium 
dat die stof niet bevat, en gedurende welke de depuratie (of netto 
eliminatie) van de teststof uit de vis (of bepaalde weefsels daarvan) wordt bestudeerd.
 
De depuratie- (of eliminatie-)snelheidsconstante  (k 2 ) is het cijfer dat 
aangeeft hoe snel de concentratie van de teststof in het proefdier (of 
bepaalde weefsels daarvan) afneemt nadat de vis is overgebracht van een medium dat de teststof bevat naar een medium dat die stof niet bevat (k
 2 wordt uitgedrukt in dag  -1 ). 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De test omvat twee fasen: de blootstellingsfase (opnamefase) en de 
daaropvolgende depuratiefase. Gedurende de opnamefase worden af ­
zonderlijke groepen vissen van dezelfde soort blootgesteld aan ten minste twee concentraties van de teststof. Met de overbrenging van 
de vissen naar een medium dat de teststof niet bevat, wordt de 
depuratiefase ingeluid. Een depuratiefase is altijd noodzakelijk, tenzij er zich tijdens de blootstellingsfase nauwelijks enige opname van de stof heeft voorgedaan (d.w.z. als de BCF minder dan 10 bedraagt). 
De concentratie van de teststof in of op de vissen (of bepaalde 
weefsels daarvan) wordt systematisch gedocumenteerd gedurende de beide fasen van de test. Naast de groepen vissen die aan de twee testconcentraties worden blootgesteld, wordt ook een contro ­
legroep vissen gehouden onder — afgezien van de afwezigheid van 
de teststof — identieke omstandigheden. Op die manier kunnen de schadelijke effecten die eventueel in de bioconcentratietest worden waargenomen, worden gerelateerd aan waarnemingen op een pas ­
sende controlegroep en kan een „nuleffectbepaling” van de concen ­
traties van de teststof worden uitgevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
De opnamefase duurt 28 dagen tenzij wordt aangetoond dat de 
evenwichtstoestand eerder wordt bereikt. Een raming van de duur 
van de opnamefase en de tijd die nodig is om de stationaire toestand (dynamisch evenwicht) te bereiken, kan worden verkregen met be ­
hulp van de vergelijking in aanhangsel 3. Vervolgens wordt de de ­
puratiefase aangevat: de vissen worden overgebracht naar een nieu ­
we, schone bak die hetzelfde medium, maar zonder de teststof, bevat. Zo mogelijk wordt de bioconcentratiefactor op twee manieren bere ­
kend: als bioconcentratiefactor in stationaire situatie (BCF
 SS ), d.w.z. 
als de verhouding van de concentratie in de vissen (C  f ) en in het 
water (C  w ) bij kennelijk dynamisch evenwicht, en als kinetische 
bioconcentratiefactor (BCF  k ), d.w.z. als de verhouding van de snel ­
heidsconstanten k  1 (opname) en k  2 ), uitgaande van een eersteordeki ­
netiek. Als duidelijk is dat het proces niet door een eersteordekine ­
tiek kan worden beschreven, moet een complexer model worden gebruikt (zie aanhangsel 5).
 
Indien na 28 dagen nog geen stationaire toestand (dynamisch even ­
wicht) is bereikt, dient de opnamefase te worden verlengd met 60 dagen, tenzij de stationaire toestand eerder wordt bereikt; dan wordt de depuratiefase aangevat.
 
De opnamesnelheidsconstante, de depuratie- (eliminatie-)snelheids ­
constante (of -constanten, indien een complexer model vereist is), de bioconcentratiefactor en, zo mogelijk, een betrouwbaarheidsinter ­
val voor elk van deze parameters worden berekend aan de hand van 
het model dat de gemeten concentraties van de teststof in de vissen en het water het beste beschrijft.
 
De BCF wordt berekend aan de hand van het totale versgewicht van de 
vis. Voor bepaalde doeleinden mogen evenwel ook specifieke weefsels of organen (bijvoorbeeld spieren, lever) worden gebruikt als de vissen groot genoeg zijn of als zij kunnen worden opgedeeld in een eetbaar 
(„filet”) en een niet-eetbaar („ingewanden”) gedeelte. Aangezien er 
voor veel organische stoffen een duidelijk verband bestaat tussen nei ­
ging tot bioconcentratie en lipofilie, bestaat er een overeenkomstig verband tussen het vetgehalte van de in de proeven gebruikte vissen 
en de waargenomen bioconcentratie van die stoffen. Om deze bron van 
variatie in de testresultaten voor stoffen met een goede oplosbaarheid in vetten (d.w.z. met log P
 ow >3) te verkleinen, dient de mate van bio ­
concentratie niet alleen te worden berekend op basis van de totale 
lichaamsmassa maar ook op basis van de vetfractie.  
Het vetgehalte dient, voorzover mogelijk, te worden bepaald op 
hetzelfde biologisch materiaal waarop ook de concentratie van de 
teststof wordt bepaald.  
1.4. GEGEVENS BETREFFENDE DE TESTSTOF  
Alvorens met de bioconcentratietest wordt begonnen, moeten de 
volgende gegevens over de teststof bekend zijn:  
— oplosbaarheid in water;  
— octanol-water-partitiecoëfficiënt (deze wordt met P  ow of ook wel 
met K  ow aangegeven en wordt bepaald met de HPLC-methode 
overeenkomstig A.8);  
— hydrolyse;  
— fotochemische omzetting in water onder invloed van natuurlijk of 
gesimuleerd zonlicht alsmede in de belichtingsomstandigheden 
waaronder ook de bioconcentratietest zal worden uitgevoerd (3);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— oppervlaktespanning (namelijk voor stoffen waarbij log P  ow niet 
kan worden bepaald);  
— dampspanning;  
— biologische afbreekbaarheid (voorzover relevant).  
Eveneens vereist zijn gegevens over de toxiciteit van de teststof voor 
de in de test gebruikte vissoort, bij voorkeur in de vorm van de 
asymptotische (tijdonafhankelijke) LC  50 Er dient een passende ana ­
lytische methode, met bekende nauwkeurigheid, precisie en gevoe ­
ligheid, voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in de testop ­
lossingen en in het biologisch materiaal beschikbaar te zijn, evenals 
een protocol voor de toebereiding en de opslag van de monsters. De 
analytische aantoonbaarheidsgrens van de teststof, zowel in water als in visweefsel, dient eveneens bekend te zijn. Wanneer een met
 14 C 
gemerkte teststof wordt gebruikt, moet bekend zijn welk percentage 
van de radioactiviteit met onzuiverheden is geassocieerd.  
1.5. GELDIGHEID VAN DE TEST  
Voor een valide test moet aan de volgende voorwaarden worden 
voldaan:  
— de temperatuurschommelingen dienen kleiner te zijn dan ± 2  o C; 
— de concentratie van de opgeloste zuurstof mag nooit minder 
bedragen dan 60 % van het verzadigingsniveau;  
— de concentratie van de teststof in de bakken is gedurende de 
opnamefase nooit meer dan 20 % hoger of lager dan het gemid ­
delde van de gemeten waarden;  
— de sterfte en de incidentie van andere ongunstige factoren (ziek ­
te) dienen aan het einde van de test zowel in de behandelde groep als in de controlegroep minder dan 10 % te bedragen; indien de test gedurende verscheidene weken of maanden wordt 
voortgezet, mogen de sterfte en de incidentie van andere ongun ­
stige factoren in elk van beide groepen vissen niet meer bedragen dan 5 % per maand en 30 % in het totaal.
 
1.6. REFERENTIESTOFFEN  
Het gebruik van referentiestoffen waarvan het bioconcentratiegedrag 
bekend is, kan in sommige gevallen nuttig zijn om de experimentele procedure te toetsen. Vooralsnog kunnen evenwel geen specifieke 
stoffen worden aanbevolen.
 
1.7. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.7.1.  Apparatuur  
Voor alle onderdelen van de installatie moet het gebruik van mate ­
rialen die oplossen of sorberen, waardoor stoffen in het water wor ­
den vrijgegeven of waardoor enig ander schadelijk effect op de vissen kan worden veroorzaakt, zoveel mogelijk worden vermeden. 
Er kunnen normale, uit een chemisch inert materiaal vervaardigde 
rechthoekige of cilindervormige bakken worden gebruikt die vol ­
doende ruimte bieden, gegeven de beoogde populatiedichtheid (aan ­
tal vissen per liter water). Het gebruik van slangen uit zacht plastic 
moet zoveel mogelijk worden vermeden. Bij voorkeur dienen ver ­
bindingsbuizen van teflon ®, roestvrij staal en/of glas te worden gebruikt. De ervaring wijst uit dat het voor stoffen met een hoge adsorptiecoëfficiënt, zoals synthetische pyretroïden, noodzakelijk kan 
zijn gesilaniseerd glas te gebruiken. In een dergelijk geval moet de 
apparatuur na gebruik worden verwijderd (geen hergebruik).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Water  
Voor de test wordt normaliter water van natuurlijke oorsprong ge ­
bruikt dat wordt verkregen uit een niet-verontreinigde bron van uni ­
forme kwaliteit. Het voor de verdunningen gebruikte water moet 
zodanig zijn dat de gekozen vissoort daarin gedurende de acclimati ­
satie en de looptijd van de test kan overleven zonder dat de speci ­
mens een abnormaal aspect of gedrag gaan vertonen. In het ideale geval wordt aangetoond dat de gekozen vissoort in het verdunnings ­
water kan overleven, groeien en zich voortplanten (bijvoorbeeld in 
een laboratoriumkweek of in een toxiciteitstest die de hele levens ­
cyclus omvat). Van het water moeten ten minste de pH, de hardheid, 
het totaalgehalte aan vaste stof en het totaalgehalte aan organische 
koolstof worden bepaald, alsmede, zo mogelijk, het ammonium- en nitrietgehalte en de alkaliniteit en, voor mariene soorten, het zoutge ­
halte. De parameters die belangrijk zijn voor het optimale welzijn 
van de vissen zijn genoegzaam bekend; niettemin worden in aan ­
hangsel 1 aanbevelingen gedaan wat betreft de maximumconcentratie van een aantal stoffen in het voor de tests gebruikte zoet en zee ­
water.
 
Het water dient gedurende de test een constante kwaliteit te ver ­
tonen. De pH-waarde dient in het interval 6,0-8,5 te liggen en 
mag bovendien in de loop van de test met niet meer dan ± 0,5 pH-eenheden schommelen. Om te garanderen dat het verdunnings ­
water de testresultaten niet noemenswaardig beïnvloedt (bijvoorbeeld 
door complexatie van de teststof) en geen ongunstige invloed heeft 
op de conditie van de vissen, moeten regelmatig monsters worden genomen en geanalyseerd. Zware metalen (bijvoorbeeld Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), de belangrijkste anionen en kationen (bijvoorbeeld Ca, 
Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), bestrijdingsmiddelen (bijvoorbeeld totaalge ­
halte aan organofosforpesticiden en totaalgehalte aan organochloor ­
pesticiden) en het totaalgehalte aan organische koolstof en zwevende deeltjes moeten bijvoorbeeld om de drie maanden worden bepaald 
als van het verdunningswater bekend is dat het een relatief constante 
kwaliteit heeft. Indien is aangetoond dat de waterkwaliteit op een schaal van ten minste één jaar constant blijft, zijn minder frequente bepalingen en langere intervallen (bijvoorbeeld zes maanden) toelaat ­
baar.
 
Het natuurlijke gehalte aan zwevende deeltjes en het totaalgehalte 
aan organische koolstof (TOC) van het verdunningswater dienen zo laag mogelijk te zijn om te vermijden dat de teststof aan het orga ­
nisch materiaal adsorbeert waardoor de biologische beschikbaarheid 
ervan zou afnemen (4). De maximale toelaatbare concentraties be ­
dragen 5 mg/l voor deeltjes (droge stof, achterblijvend op een 0,45 μm filter) en 2 mg/l voor het totaal aan organische koolstof 
(zie aanhangsel 1). Desnoods moet het water vóór gebruik worden 
gefilterd. De bijdrage van de proefdieren zelf (excrementen) en van 
de voedselresiduen aan de hoeveelheid organische koolstof in het water dient zo klein mogelijk te worden gehouden. Gedurende de 
hele duur van de test mag het gehalte aan organische koolstof in de 
proefbakken, afgezien van de koolstof in de teststof zelf en, in voor ­
komend geval, het agens dat de oplosbaarheid daarvan dient te ver ­
hogen, niet meer bedragen dan 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3.  Testoplossingen  
Er wordt een stockoplossing met een passende concentratie van de 
teststof klaargemaakt. De stockoplossing wordt bij voorkeur bereid 
door eenvoudig mengen en schudden van de teststof in het verdun ­
ningswater. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen (oplosbaarheidsbevorderende agentia) verdient geen aanbeveling; niettemin kan dit in bepaalde gevallen nodig zijn om een stockoplos ­
sing van een passende concentratie te verkrijgen. Als oplosmiddelen 
mogen ethanol, methanol, ethyleenglycol-monomethylether, ethy ­
leenglycol-dimethylether, demithylformamide en triëthyleenglycol worden gebruikt. Als dispergeermiddelen mogen Cremophor RH40, 
Tween 80, 0,01 % methylcellulose en HCO-40 worden gebruikt. 
Wanneer biologisch gemakkelijk afbreekbare stoffen worden ge ­
bruikt, moet in het bijzonder worden gewaakt voor problemen die zich als gevolg van bacteriegroei in het doorstroomsysteem kunnen 
voordoen. De teststof mag radioactief worden gemerkt en dient de 
hoogste zuiverheidsgraad (bij voorkeur meer dan 98 %) te bezitten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Voor doorstroomtests is een systeem vereist dat de stockoplossing 
van de teststof continu verdeelt en verdunt en ervoor zorgt dat in de 
bakken met de proefdieren de gewenste testconcentratie wordt ge ­
handhaafd (bijvoorbeeld doseerpomp, mechanisme voor evenredige verdunning, saturatorsysteem). Een verversingssnelheid van ten min ­
ste vijf bakvolumes per dag voor iedere proefbak is wenselijk. Het 
gebruik van een doorstroomsysteem is verkieslijk, maar als dit niet mogelijk is (bijvoorbeeld omdat de gebruikte proefdieren daarvan schade ondervinden) mag een semistatisch systeem worden gebruikt 
op voorwaarde dat aan de validiteitscriteria wordt voldaan. De 
stroomsnelheid van de stockoplossingen en het verdunningswater moet 48 uur vóór het begin van de rest en vervolgens (gedurende de test) ten minste eenmaal per dag worden gecontroleerd. Deze 
controle omvat eveneens de bepaling van de stroomsnelheid door 
iedere proefbak afzonderlijk: er moet op worden toegezien dat de verschillen, zowel per bak als tussen de bakken onderling, niet meer dan 20 % bedragen.
 
1.7.4.  Keuze van de vissoort  
Belangrijke criteria bij de keuze van de soort zijn dat zij gemakkelijk 
verkrijgbaar is, dat exemplaren van de geschikte grootte beschikbaar 
zijn en dat de soort op een bevredigende manier in het laboratorium 
kan worden gehouden. Andere keuzecriteria zijn het recreatieve, commerciële of ecologische belang van de soort alsmede haar rela ­
tieve gevoeligheid, het succes waarmee zij in het verleden is gebruikt 
enz.
 
In aanhangsel 2 wordt een aantal aanbevolen soorten opgesomd. Ook 
ander soorten mogen worden gebruikt, maar in dat geval kan het nodig zijn de testprocedure aan te passen om geschikte proefomstan ­
digheden te creëren. In dit geval moeten de reden waarom de soort 
werd gekozen en de bijzonderheden van de proefopzet worden ge ­
rapporteerd.
 
1.7.5.  Leefomstandigheden van de vissen  
Laat het visbestand gedurende ten minste twee weken acclimatiseren 
in water dat de temperatuur heeft waarbij de test zal worden uitge ­
voerd; verschaf continu voldoende voedsel van hetzelfde type als 
datgene dat bij de test zal worden gebruikt.  
Na een aanpassingsperiode van 48 uur wordt de sterfte geregistreerd 
en worden de volgende criteria toegepast:  
— sterfte groter dan 10 % van de populatie in zeven dagen: de hele 
partij wordt afgekeurd;  
— de sterfte bedraagt 5 tot 10 % van de populatie in zeven dagen: 
verdere acclimatisatie gedurende zeven dagen;  
— de sterfte bedraagt minder dan 5 % van de populatie in zeven 
dagen: de partij wordt geaccepteerd, maar achteraf alsnog afge ­
keurd indien gedurende de volgende periode van zeven dagen meer dan 5 % sterfte optreedt.
 
Zie erop toe dat de voor de test gebruikte vissen geen zichtbare 
ziektetekenen of abnormaliteiten vertonen. Verwijder alle zieke vis ­
sen. De vissen mogen niet tegen ziekten worden behandeld gedu ­
rende de test of gedurende de twee weken die daaraan voorafgaan.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. UITVOERING VAN DE TEST  
1.8.1.  Verkennende test  
Het verdient aanbeveling een verkennende proef uit te voeren om de 
proefomstandigheden bij de definitieve test (bijvoorbeeld teststofcon ­
centraties, duur van de opname- en de depuratiefase) te optimalise ­
ren. 
1.8.2.  Blootstellingsomstandigheden  
1.8.2.1. D u u r v a n d e o p n a m e f a s e  
De duur van de opnamefase kan worden geschat op basis van be ­
staande praktijkervaring (bijvoorbeeld gegevens uit een eerdere stu ­
die of kennis van de accumulatiesnelheid van een verwante che ­
mische stof) of op basis van bepaalde empirische relaties, stoelend op gegevens betreffende de oplosbaarheid in water of de octanol- water-partitiecoëfficiënt van de teststof (zie aanhangsel 3).
 
De opnamefase dient 28 dagen te duren, tenzij kan worden aange ­
toond dat reeds eerder een evenwicht wordt bereikt. Indien de sta ­
tionaire toestand (dynamisch evenwicht) na 28 dagen nog niet is 
bereikt, moet de opnamefase met 60 dagen worden verlengd, tenzij de stationaire toestand eerder wordt bereikt; gedurende de hele voort ­
zetting van de opnamefase worden ook de metingen voortgezet.
 
1.8.2.2. D u u r v a n d e d e p u r a t i e f a s e  
Een tijd die half zo lang is als de opnamefase is meestal voldoende 
voor een adequate reductie (bijvoorbeeld met 95 %) van de li ­
chaamsconcentratie van de teststof (zie aanhangsel 3 voor een ver ­
klaring van deze raming). Indien de tijd die nodig is voor een ver ­
mindering met 95 % in de praktijk te lang is (bijvoorbeeld indien de depuratiefase dan meer dan twee keer zo lang als de normale duur 
van de opnamefase, dus meer dan 56 dagen, zou duren) mag een 
kortere periode worden gebruikt (bijvoorbeeld tot de concentratie van de teststof minder dan 10 % van de concentratie in de stationaire 
toestand bedraagt). Voor stoffen met een ingewikkelder opname- en 
depuratiepatroon dan kan worden beschreven met een ééncomparti ­
mentmodel dat een eersteordekinetiek vertoont, moet evenwel toch in een langere depuratiefase worden voorzien met het oog op de bepa ­
ling van de eliminatiesnelheidsconstanten. De duur van de depura ­
tiefase kan in voorkomend geval overigens mee worden beperkt door de tijd dat de concentratie van de teststof in de vissen boven de analytische aantoonbaarheids-grens blijft.
 
1.8.2.3. A a n t a l p r o e f d i e r e n  
Kies het aantal vissen per testconcentratie zo dat bij iedere bemon ­
stering ten minste vier vissen per monster beschikbaar zijn. Indien 
een groter statistisch onderscheidingsvermogen is vereist, dienen 
meer vissen per monster te worden gebruikt.  
Als volwassen vissen worden gebruikt, moet worden gerapporteerd 
of mannelijke of vrouwelijke exemplaren, dan wel beide, werden gebruikt. In dit laatste geval moet voor het begin van de blootstelling worden aangetoond dat er tussen beide geslachten qua vetgehalte 
geen significant verschil bestaat. Het kan noodzakelijk zijn alle man ­
nelijke en alle vrouwelijke exemplaren samen te voegen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Voor elke test moeten vissen met een min of meer uniform lichaams ­
gewicht worden gebruikt: het gewicht van de kleinste vis mag niet 
minder bedragen dan twee derde van dat van de grootste. Alle vissen moeten tot dezelfde jaarklasse behoren en dezelfde oorsprong heb ­
ben. Aangezien het gewicht en de leeftijd van een vis soms een 
significant effect op de BCF lijken te hebben (1), moeten deze 
gegevens nauwkeurig worden geregistreerd. Het verdient aanbeveling vóór de test een steekproef uit het vissenbestand te wegen om een schatting van het gemiddelde gewicht te verkrijgen.
 
1.8.2.4. A a n t a l v i s s e n p e r l i t e r  
Gebruik een grote water/visverhouding om de vermindering van C  w 
door de introductie van de vissen bij het begin van de test zo klein 
mogelijk te houden en een afname van het gehalte aan opgeloste 
zuurstof te vermijden. Van belang is ook dat de dichtheid van de 
vissen op de biologische kenmerken van de gekozen soort wordt afgestemd. De aanbevolen dichtheid bedraagt normaliter 0,1-1,0 
gram vis (versgewicht) per liter water per dag. Een grotere dichtheid 
is toelaatbaar als wordt aangetoond dat de schommelingen van de concentratie van de teststof de ± 20 %-grenzen niet overschrijden en het gehalte aan opgeloste zuurstof nooit minder bedraagt dan 60 % 
van het verzadigingspunt.
 
Bij de keuze van de geschikte vissendichtheid dient rekening te 
worden gehouden met de normale biotoop van de betrokken vissoort. 
Zo kunnen demersale vissen bij eenzelfde watervolume in het aqua ­
rium een grotere bodemoppervlakte verlangen dan pelagische soor ­
ten. 
1.8.2.5. V o e d e r i n g  
Gedurende de acclimatisatie- en de testperiode wordt de vissen ge ­
schikt voer met een bekend vet- en totaal eiwitgehalte verstrekt in 
een voldoende hoeveelheid om ze gezond te houden en hun li ­
chaamsgewicht op peil te houden. De vissen krijgen gedurende de acclimatisatie- en de testperiode dagelijks ongeveer 1 à 2 % van hun lichaamsgewicht te eten; bij een dergelijk regime blijft het vetgehalte 
bij de meeste vissoorten min of meer constant gedurende de test. De 
hoeveelheid voer moet bijvoorbeeld eens per week worden herbere ­
kend teneinde het lichaamsgewicht en het vetgehalte constant te houden. Voor die berekening kan het gewicht van de in iedere test ­
bak overblijvende vissen worden geschat aan de hand van het ge ­
wicht van de vissen in de laatste uit die testbak getrokken steekproef. Het gewicht van de achterblijvende vissen zelf wordt niet bepaald.
 
Niet opgegeten voer en uitwerpselen worden dagelijks, korte tijd 
(30 minuten tot 1 uur) na de voedering, met behulp van een hevel uit de testbakken verwijderd. Die bakken worden in de loop van de 
test zo schoon mogelijk gehouden om de concentratie van organische 
stoffen zo laag mogelijk te houden, aangezien de aanwezigheid van organische koolstof de biologische beschikbaarheid van de teststof negatief kan beïnvloeden (1).
 
Aangezien vele visvoeders uit vismeel worden vervaardigd, moet het 
voeder op de aanwezigheid van de teststof worden onderzocht. Het 
verdient ook aanbeveling het voeder op de aanwezigheid van bestrij ­
dingsmiddelen en zware metalen te onderzoeken.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. L i c h t e n t e m p e r a t u u r  
De belichtingsperiode beloopt meestal 12 à 16 uur en de temperatuur 
(±2 o C) dient geschikt te zijn voor de gebruikte vissoort (zie aan ­
hangsel 2). Het type belichting en de karakteristieken daarvan dienen 
bekend te zijn. Er dient rekening te worden gehouden met de mo ­
gelijkheid dat de teststof bij de gebruikte belichting fotochemisch in andere stoffen wordt omgezet. Door een passende belichting moet worden vermeden dat de vissen aan onnatuurlijke fotochemische 
omzettingsproducten worden blootgesteld. In bepaalde gevallen kan 
het nodig zijn de UV-straling met een golflengte van minder dan 290 nm weg te filteren.
 
1.8.2.7. T e s t c o n c e n t r a t i e s  
Er worden vissen blootgesteld aan ten minste twee concentraties van 
de teststof in doorstromend water. Normaliter wordt de hoogste con ­
centratie van teststof zo gekozen dat zij ongeveer 1 % bedraagt van de acute asymptotische LC
 50 en ten minste tien keer zo hoog is als 
de aantoonbaarheidsgrens van de stof in water voor de gebruikte 
analysemethode.  
De hoogste testconcentratie kan ook worden bepaald door de acute 
96h-LC  50 te delen door een passende omzettingscoëfficiënt (de ver ­
houding tussen de acuut letale en de chronisch letale concentratie, 
die voor diverse chemische stoffen kan variëren tussen ongeveer 3 en 
100). Kies zo mogelijk de andere concentratie(s) zo dat zij een factor tien van elkaar verschillen. Indien dit in het licht van de andere criteria („1 % van LC
 50 ” en „boven de analytische aantoonbaarheids ­
grens”) niet mogelijk is, kan een kleinere meetkundige reden worden 
gekozen of kan het gebruik van een met  14 C gemerkte teststof wor ­
den overwogen. Gebruik geen concentraties die hoger zijn dan die van de verzadigde oplossing.
 
Wanneer een oplosbaarheidsbevorderend agens wordt gebruikt, mag 
de concentratie daarvan niet meer bedragen dan 0,1 ml per liter en dient deze dezelfde te zijn in alle testbakken. De bijdrage van agens en teststof samen aan het totale organischekoolstofgehalte in het 
water in de testbakken moet bekend zijn. Het gebruik van dergelijke 
agentia moet hoe dan ook tot elke prijs worden vermeden.
 
1.8.2.8. C o n t r o l e s  
Naast de experimentele reeksen dient een controlegroep te worden 
behandeld met het verdunningswater of, in voorkomend geval, met 
dat water en het oplosbaarheidsbevorderend agens, voorzover vast ­
staat dat dat agens geen effect heeft op de vissen. Zoniet zijn beide controlebehandelingen noodzakelijk.
 
1.8.3.  Frequentie van de metingen van de waterkwaliteit  
In de loop van de test moeten het gehalte aan opgeloste zuurstof, 
TOC, pH en temperatuur in alle bakken worden gemeten. De totale 
hardheid en, voorzover relevant, het zoutgehalte moeten worden ge ­
meten in de bakken met de controlegroepen en in een bak met de hoogste teststofconcentratie. De zuurstofconcentratie en, voorzover relevant, het zoutgehalte moeten ten minste drie keer worden geme ­
ten tijdens de opnamefase — aan het begin, omstreeks het midden en 
aan het einde van die fase — en vervolgens om de week gedurende de depuratiefase. De TOC moet worden bepaald bij het begin van de opnamefase (24 uur en 48 uur vóór de vissen in de bakken worden 
geïntroduceerd) en vervolgens ten minste wekelijks, zowel gedu ­
rende de opname- als gedurende de depuratiefase. De temperatuur moet dagelijks worden gemeten, de pH aan het begin en aan het einde van elke periode en de hardheid eenmaal in de loop van de 
test. Het is wenselijk de temperatuur in ten minste één bak continu te 
registreren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Bemonstering en analyse van de vissen en het water  
1.8.4.1. B e m o n s t e r i n g s s c h e m a v o o r v i s s e n e n w a t e r  
Met het oog op de bepaling van de teststofconcentratie wordt het 
water in de testbakken bemonsterd vóór de vissen worden geïntro ­
duceerd en voorts zowel gedurende de opname- als gedurende de 
depuratiefase. Het water moet ten minste even vaak als en tegelijk met de vissen worden bemonsterd, en wel vóór de voedering. Ge ­
durende de opnamefase wordt de concentratie van de teststof bepaald 
om te controleren of aan de validiteitscriteria wordt voldaan.
 
De vissen worden ten minste vijfmaal in de loop van de opnamefase 
en ten minste viermaal in de loop van de depuratiefase bemonsterd. Omdat het in bepaalde gevallen moeilijk is op basis van dit aantal 
monsters een voldoende precieze schatting van de BCF-waarde te 
berekenen, met name wanneer er aanwijzingen bestaan dat een an ­
dere dan een simpele eersteordedepuratiekinetiek wordt gevolgd, is het raadzaam gedurende beide periodes een hogere bemonsterings ­
frequentie aan te houden (zie aanhangsel 4). De extra monsters wor ­
den bewaard en worden slechts geanalyseerd indien de resultaten van de eerste reeks analyses niet blijken te volstaan om de BCF met de gewenste precisie te berekenen.
 
Aanhangsel 4 bevat een voorbeeld van een goed bemonsteringssche ­
ma. Uitgaande van andere hypothetische P  ow -waarden ter bepaling 
van de blootstellingstijd die nodig is voor 95 % opname, kunnen probleemloos andere bemonsteringsschema's worden doorgerekend.
 
De bemonstering wordt tijdens de opnamefase voortgezet. Die fase 
duurt 28 dagen, tenzij zich eerder een stationaire toestand instelt. 
Indien na 28 dagen nog geen stationaire toestand is bereikt, wordt 
de bemonstering gedurende 60 dagen voortgezet tenzij zich eerder een stationaire toestand instelt. Voor de start van de depuratiefase worden de vissen naar schone bakken overgebracht.
 
1.8.4.2. M o n s t e r n e m i n g e n t o e b e r e i d i n g v a n d e m o n s t e r s  
De te analyseren watermonsters worden bijvoorbeeld verkregen door 
afheveling uit het midden van de testbak met behulp van een slang 
uit inert materiaal. Aangezien kennelijk noch filtratie, noch centrifu ­
gatie in alle omstandigheden een volledige scheiding van de bio ­
logisch beschikbare en de biologisch niet-beschikbare fractie van de teststof garanderen (met name niet voor superlipofiele stoffen, 
d.w.z. stoffen met een log P
 ok > 5) (1) (5), dienen deze bewerkingen 
niet op de monsters te worden toegepast.  
In plaats daarvan moeten maatregelen worden getroffen om de bak ­
ken zo schoon mogelijk te houden en moet het TOC-gehalte zowel gedurende de opnamefase als gedurende de depuratiefase bestendig 
worden gecontroleerd.
 
Bij iedere bemonstering wordt een adequaat aantal vissen (meestal 
ten minste vier) uit de testbakken verwijderd, kortstondig met water gespoeld, door afbetten „gedroogd”, onverwijld op de meest ge ­
schikte en humane manier gedood en gewogen.
 
Het verdient de voorkeur de vissen en het water onmiddellijk na de 
monsterneming te analyseren om afbraakprocessen en andere ver ­
liezen te vermijden. Bovendien kunnen op deze wijze naargelang de test vordert een benaderde opname- en depuratiesnelheid worden berekend. Indien de analyse meteen wordt uitgevoerd, wordt ook 
vermeden dat te veel tijd voorbijgaat alvorens het bereiken van het 
plateau wordt geconstateerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Indien de analyse niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, worden de 
monsters in geschikte omstandigheden opgeslagen. In dit geval moe ­
ten, vooraleer de studie wordt aangevat, gegevens worden vergaard over de geschikte wijze van bewaring voor de teststof in kwestie — bijvoorbeeld diepvriezen of bewaren bij 4
 o C, duur van de opslag, 
wijze van extractie enz.  
1.8.4.3. K w a l i t e i t v a n d e a n a l y s e m e t h o d e  
Aangezien de nauwkeurigheid, de precisie en de gevoeligheid van de 
analysemethode ten aanzien van de teststof bepalend zijn voor de kwa ­
liteit van de hele procedure, moet experimenteel worden gecontroleerd of de precisie en de reproduceerbaarheid van de chemische analyse alsmede 
de terugvinding van de teststof in de water- en vismonsters bevredigend 
zijn voor de gekozen methode. Vergewis u eveneens van het feit dat geen teststof aantoonbaar is in het verdunningswater.
 
Zo nodig worden bij de test gemeten  C w — en C  f -waarden gecorri ­
geerd aan de hand van de terugvinding en de nuleffectmetingen bij 
de controlegroep(en). De vis- en watermonsters worden consequent behandeld op zodanige wijze dat contaminatie en verliezen (bijvoor ­
beeld als gevolg aan adsorptie aan de bemonsteringsapparatuur) zo ­
veel mogelijk wordt vermeden.
 
1.8.4.4. A n a l y s e v a n d e v i s m o n s t e r s  
Indien in de test radioactief gemerkt materiaal wordt gebruikt, kan 
hetzij de totale hoeveelheid radioactiviteit (d.w.z. in de oorspronke ­
lijke stof én de metabolieten daarvan) worden gedoseerd, hetzij een zuivering worden uitgevoerd waardoor de oorspronkelijke stof afzon ­
derlijk kan worden geanalyseerd. Ook kunnen de belangrijkste me ­
tabolieten worden gekarakteriseerd wanneer de stationaire toestand is bereikt c.q. aan het einde van de opnamefase (al naar gelang van wat zich het eerst voordoet). Indien de BCF, gemeten op basis van de 
totale hoeveelheid radioactief gemerkte residuen, > 1 000 % is, is het 
raadzaam — en voor bepaalde categorieën chemische stoffen zoals bestrijdingsmiddelen ten stelligste aan te bevelen — de afbraakpro ­
ducten die in de stationaire toestand > 10 % van de totale hoeveel ­
heid residuen in het visweefsel vertegenwoordigen, te identificeren 
en te kwantificeren. Indien de afbraakproducten die 10 % of meer van de totale hoeveelheid radioactief gemerkte residuen in het vis ­
weefsel vertegenwoordigen, worden geïdentificeerd en gekwantifi ­
ceerd, verdient het aanbeveling de afbraakproducten in de geanaly ­
seerde watermonsters op dezelfde wijze uit te splitsen.
 
De concentratie van de teststof dient normaliter voor iedere gewogen 
vis afzonderlijk te worden bepaald. Als zulks niet mogelijk is, mo ­
gen de gelijktijdig genomen vismonsters worden samengevoegd, 
maar een dergelijke samenvoeging houdt restricties in voor de sta ­
tistische procedures die op de gegevens kunnen worden toegepast. Indien het belangrijk is dat een specifieke statistische procedure kan 
worden toegepast of een bepaald statistisch onderscheidingsver ­
mogen wordt gehaald, moet de test, rekening houdend met die sa ­
menvoegingsprocedure en dat onderscheidingsvermogen, met een adequaat aantal proefdieren worden uitgevoerd (6) (7).
 
De BCF moet worden berekend in relatie tot het totale versgewicht 
en, voor zeer lipofiele stoffen, ook in relatie tot de vetfractie. Het vetgehalte van de vissen wordt zo mogelijk bij iedere bemonstering bepaald. Voor de bepaling van het vetgehalte moeten passende me ­
thoden worden gebruikt (zie de referenties 8 en 2 van aanhangsel 3). 
De chloroform/methanol-extractietechniek kan als standaardmethode worden aanbevolen (9). De verschillende methoden geven verschil ­
lende resultaten (10). Derhalve is het van belang dat bijzonderheden 
over de gebruikte methode worden verstrekt. De bepaling van het vet 
moet, als het kan, worden uitgevoerd op hetzelfde extract als datgene dat voor de bepaling van de teststof wordt gebruikt — de vetten moeten immers meestal toch worden verwijderd alvorens het extract 
chromatografisch kan worden geanalyseerd. Het vetgehalte van de 
vissen (in mg per kg versgewicht) behoort aan het einde van het experiment niet meer dan 25 % meer of minder te bedragen dan bij het begin. Het drogestofgehalte van het weefsel (in %) moet ook 
worden gerapporteerd met het oog op een mogelijke omrekening van 
het vetgehalte in termen van vers- respectievelijk drooggewicht.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. GEGEVENS  
2.1. VERWERKING VAN DE RESULTATEN  
De opnamecurve van de teststof wordt verkregen door de concen ­
tratie in/op de vissen (of bepaalde weefsels daarvan) in de opname ­
fase uit te zetten tegen de tijd in een lineair coördinatenstelsel. Als 
de curve een plateau bereikt, d.w.z. asymptotisch evenwijdig gaat lopen met de tijdas, wordt BCF
 SS berekend als:  
C f in stationaire toestand  ðgemiddeldÞ 
C w in stationaire toestand  ðgemiddeldÞ 
Als geen stationaire situatie wordt bereikt, kan niettemin BCF  SS met 
een voor de risico-evaluatie afdoende precisie worden berekend uit een benaderde „stationaire toestand” bij 80 % (1,6/k
 2 ) of 95 % (3,0/ ­
k 2 ) van de evenwichtswaarde.  
De kinetische concentratiefactor BCF  k wordt berekend als de ver ­
houding k  1 /k 2 van de twee eersteordesnelheidsconstanten. De depu ­
ratiesnelheidsconstante (k  2 wordt meestal bepaald op de depuratie ­
curve, dit is de grafiek van de afname van de teststofconcentratie in de vissen in de loop van de tijd. De opnamesnelheidsconstante (k
 1 ) 
wordt dan berekend uit k  2 en een waarde voor C  f die wordt gehaald 
uit de opnamecurve (zie ook aanhangsel 5). Het verdient de voorkeur KCF
 k en de snelheidsconstanten k  1 en k  2 te berekenen met behulp 
van een gecomputeriseerde niet-lineaire parameterschattingstechniek 
(11). Is dit onmogelijk, dan kunnen k  1 en k  2 grafisch worden be ­
paald. Indien de depuratiecurve duidelijk geen eersteordekinetiek vertoont, moeten complexere modellen worden gebruikt (zie de refe ­
renties in aanhangsel 3) en moet het advies van een biostatisticus 
worden ingewonnen.
 
2.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De resultaten moeten met de nodige omzichtigheid worden geïnter ­
preteerd als de gemeten concentraties van de teststofoplossingen in de buurt liggen van de analytische aantoonbaarheidsgrens.
 
Bioconcentratiegegevens van goede kwaliteit resulteren in scherp 
afgetekende opname- en eliminatiecurven. Het verschil tussen de 
waarden voor de opname- respectievelijk de depuratieconstante als 
bepaald voor de twee testconcentraties behoort niet meer te bedragen dan 20 %. Indien tussen de gemeten waarden van de opname c.q. de 
depuratiesnelheidsconstante voor de twee gebruikte testconcentraties 
een significant verschil bestaat, moet dit worden genoteerd en moe ­
ten mogelijk verklaringen worden gesuggereerd. Bij goed opgezette studies is het betrouwbaarheidsinterval voor de BCF in het algemeen 
niet veel ruimer dan (puntschatting) ± 20 %.
 
3. RAPPORTAGE  
In het verslag over de test moeten de volgende gegevens worden 
opgenomen:  
3.1. TESTSTOF:  
— voorkomen en, indien relevant, fysisch-chemische eigenschap ­
pen; 
— chemische karakteristieken (eventueel met inbegrip van het or ­
ganischekoolstofgehalte);  
— indien radioactief gemerkt materiaal wordt gebruikt, de precieze 
positie van het radioactieve atoom (de radioactieve atomen) en 
het percentage van de radioactiviteit dat met onzuiverheden is 
geassocieerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. PROEFDIERSOORT:  
— wetenschappelijke naam, stam, oorsprong, eventuele voor ­
afgaande behandeling, acclimatisatie, leeftijd, grootte-interval enz.
 
3.3. PROEFOMSTANDIGHEDEN:  
— gebruikte testprocedure (bijvoorbeeld doorstroomsysteem of se ­
mistatisch systeem);  
— aard en kenmerken van de gebruikte verlichting en lichtregime 
(L:D);  
— proefopzet (bijvoorbeeld aantal en grootte van de testbakken, 
verversingssnelheid van het water, aantal replicaties, aantal vis ­
sen per replicatie, aantal testconcentraties, duur van de opname- 
en de depuratiefase, frequentie van de bemonstering van vissen 
en water);  
— wijze waarop de stockoplossingen worden bereid en vervangings ­
frequentie (indien een oplosbaarheidsbevorderend agens wordt gebruikt, moeten de aard, de concentratie en de bijdrage daarvan 
tot het organischekoolstofgehalte van het water in de testbakken 
worden vermeld);
 
— de nominale testconcentraties, de gemiddelden en standaardafwij ­
kingen van de desbetreffende in de testbakken gemeten waarden en de methode waarmee zij zijn bepaald;
 
— de oorsprong van het verdunningswater, een beschrijving van de 
eventuele voorafgaande behandeling daarvan, de resultaten van 
eventuele proeven betreffende het vermogen van de proefdieren 
om in dat water te overleven en de kenmerken van dat water: pH, hardheid, temperatuur, gehalte aan opgeloste zuurstof, residueel chloorgehalte (indien bepaald), totale hoeveelheid organische 
koolstof (TOC) en zwevende deeltjes, zoutgehalte van het proef ­
medium (voorzover relevant), alsmede de resultaten van eventu ­
ele andere bepalingen;
 
— waterkwaliteit in de testbakken, pH, hardheid, TOC, temperatuur 
en gehalte aan opgeloste zuurstof;  
— nadere gegevens over het voer (bijvoorbeeld aard, herkomst, 
samenstelling — zo mogelijk ten minste het vet- en het eiwitge ­
halte —, voederfrequentie en -hoeveelheid);  
— gegevens over de behandeling van de vis- en watermonsters, met 
inbegrip van bijzonderheden over de voorbereiding, de opslag, de extractie en de procedures (met inbegrip van de precisie daarvan) 
voor de analytische bepaling van de teststof en, in voorkomend 
geval, het vetgehalte.
 
3.4. RESULTATEN:  
— resultaten van eventuele voorbereidende experimenten;  
— sterfte van de vissen in de controlegroep(en) en de vissen in 
iedere proefbak, alsmede eventuele waarnemingen van abnormaal gedrag;
 
— het vetgehalte van de vissen (indien dit ter gelegenheid van de 
bemonstering werd bepaald);  
— grafieken van het verloop van de opname (inclusief het bereiken 
van de stationaire toestand) en de depuratie van de teststof door 
de vissen (met een weergave van alle meetwaarden);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f en C  w (met standaardafwijking en, desgewenst, bereik) voor 
ieder bemonsteringstijdstip. C  f wordt uitgedrukt in μg per gram 
versgewicht (ppm) van het lichaam als geheel of van bepaalde weefsels, bijvoorbeeld het vetweefsel, en C
 w in μg per ml (ppm). 
De C  w -waarden voor de controlegroepen en de nuleffectmetingen 
dienen eveneens te worden gerapporteerd;  
— de bioconcentratiefactor in stationaire situatie (BCF  SS ) en/of de 
kinetische bioconcentratiefactor (BCF  k ) alsmede, in voorkomend 
geval, de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen voor de opname- en de depuratie-(eliminatie-)snelheidsconstante, alle berekend in relatie 
tot het totale lichaamsgewicht c.q. de totale vetfractie (in voor ­
komend geval) van het dier of van nader omschreven weefsels. Voor iedere beproefde concentratie van de teststof moeten de gemiddelden, betrouwbaarheidsintervallen en standaardafwijkin ­
gen (voorzover bekend) worden gerapporteerd. Geef aan welke 
gegevensverwerkings- en rekenmethoden werden gebruikt;
 
— indien radioactief gemerkt materiaal werd gebruikt en voorzover 
daartoe aanleiding bestaat: gegevens over de eventuele accumu ­
latie van metabolieten;  
— alle ongewone verschijnselen die zich in de loop van de test 
hebben voorgedaan, alle afwijkingen van voornoemde procedures 
en alle andere relevante gegevens.  
Aangezien metingen die resulteren in de conclusie „niet aantoonbaar 
bij de gegeven aantoonbaar-heidsgrens” onbruikbaar zijn voor het berekenen van de snelheidsconstanten, moet door aanpassingen van 
de proefopzet in het licht van de gegevens van voorbereidende ex ­
perimenten dat type uitkomst zoveel mogelijk worden vermeden.
 
4. REFERENTIES  
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.
 
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 
1, 29-390.  
(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testine and Assessment of Chemicals. No 3.  
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM tes ­
ting methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Ini ­
tiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine 
Bioaccumulation Factors. July 1994.  
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
 
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or Ani ­
mal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Hu ­
man and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Re ­
search Triangle Park, N.C. 27711.  
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 
2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, The 
Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al. (1995). Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105.  
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Chem. 10, pp. 1431-1436.  
(11) CEC. Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984- 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and 
N. Nyholm.
 
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Aanhangsel 1  
Chemische karakteristieken van aanvaardbaar verdunningswater  
Stof Drempelconcentratie  
1 Deeltjes 5 mg/l 
2 Totaal organische koolstof 2 mg/l 3 Niet-geïoniseerde ammoniak 1 μg/l 
4 Residueel chloor 10 μg/l 
5 Totaal organofosforpesticiden 50 ng/l 6 Totaal organochloorpesticiden plus polychloorbifenylen 50 ng/1 
7 Totaal organische chloorverbindingen 25 ng/1 
8 Aluminium 1 μg/1 
9 Arseen 1 μg/l 
10 Chroom 1 μg/l 
11 Kobalt 1 ng/1 12 Koper 1 ug/1 
13 IJzer 1 μg/l 
14 Lood 1 μg/l 
15 Nikkel 1 μg/l 
16 Zink 1 μg/l 
17 Cadmium 100 ng/1 18 Kwik 100 ng/1 
19 Zilver 100 ng/1
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Aanhangsel 2  
Voor de tests geschikte vissoorten  
Aanbevolen soort Aanbevolen 
temperatuurbereik 
( o C) Aanbevolen 
grootteklasse 
(totale 
lichaamslengte 
in cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) Zebravis 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) „Fathead minnow” 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
Karper 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel) Japans rijstvisje 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
Guppy 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) „Bluegill” — Zonnebaars 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) Regenboogforel 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) Driedoornige stekelbaars 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993), Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231  
In diverse landen zijn ook verschillende estuanene en mariene soorten gebruikt, bijvoorbeeld  
Leiostomus xanthurus  (Puntombervis)  
Cyprinodon variegatus  (Edelsteentandkarper)  
Menidia beryllina  („Silverside”)  
Cymatogaster aggregata  („Shiner perch”)  
Parophrys vetulus  („English sole”)  
Leptocottus armatus  („Staghorn sculpin”)  
Gasteroteus aculeatus  (Driedoornige stekelbaars)  
Dicentrarcus labrax  (Zeebaars)  
Alburnus alburnus  (Alver)  
Herkomst  
De in de tabel genoemde zoetwatervissen zijn gemakkelijk te kweken en/of het hele jaar door vlot 
verkrijgbaar, de beschikbaarheid van de mariene en estuariene soorten verschilt van land tot land. 
De genoemde soorten kunnen in viskwekerijen of in het laboratorium vrij van ziekten en parasieten 
worden opgekweekt en tot voortplanting gebracht, zodat voor de test gezonde dieren van bekende afstamming kunnen worden gebruikt. Dergelijke vissen zijn in vele delen van de wereld verkrijg ­
baar.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Aanhangsel 3  
Voorspelling van de duur van de opname- en de depuratiefase  
1. Voorspelling van de duur van de opnamefase  
Alvorens de test wordt uitgevoerd, kan een schatting van k  2 en derhalve 
van de tijd die nodig is om de stationaire toestand te bereiken, worden 
verkregen uit het empirische verband dat is aangetoond tussen k  2 en de n- 
octanol-water-partitiecoëfficiënt (P  ow ) en tussen k  2 en de oplosbaarheid in 
water(s).  
Een schatting van k  2 (dag-  1 ) kan bijvoorbeeld worden verkregen uit het 
volgende empirische verband (1): 
log 10 k 2 = - 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (vergelijking 1)  
Voor andere verbanden, zie referentie (2).  
Indien de waarde van de partitiecoëfficiënt (P  ow ) niet bekend is, kan een 
schatting worden verkregen (3) uit de oplosbaarheid van de stof in water 
(S), aan, de hand van: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (vergelijking 2)  
waarin  
s = oplosbaarheid (mol/l): (n = 36).  
Deze verbanden zijn alleen geldig voor stoffen waarvoor de waarde van log 
P ow ligt tussen 2 en 6,5 (4).  
De tijd die nodig is om een bepaald percentage van de stationaire con ­
centratie te bereiken, kan worden geraamd met behulp van de schatting van 
k 2 en de algemene vergelijking die de opname- en depuratiekinetiek be ­
schrijft (eerstordekinetiek):  
dC f 
dt ¼ k 1 ·C w Ä k 2 ·C f 
of, indien C constant is:  
C f ¼ k 1 
k 2 ·C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (vergelijking 3)  
Bij het naderen van de stationaire toestand (t → ∞), kan vergelijking 3 
worden vereenvoudigd (5) (6) tot:  
C f ¼ k 1 
k 2:C w of C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
De grootheid (k  1 /k 2 ) . C  w is dan een benadering van de concentratie van de 
stof in de vissen in de stationaire toestand (C  f, s ). 
Vergelijking 3 kan dan worden herschreven als:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ of C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (vergelijking 4)  
Door toepassing van de vergelijking 4 kan de tijd worden geschat die nodig 
is om een bepaald percentage van de stationaire concentratie te bereiken 
voorzover een voorlopige schatting van k  2 op basis van vergelijking 1 of 
vergelijking 2 beschikbaar is.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Als vuistregel geldt dat de optimale duur van de opnamefase voor het 
verkrijgen van statistisch aanvaardbare gegevens wat betreft BCF  k over­
eenstemt met de tijd die nodig is opdat de concentratie van de teststof in de vissen, uitgezet tegen de niet-getransformeerde tijd, ten minste het middel ­
punt 1,6/k
 2 bereikt, oftewel 80 % van de stationaire concentratie, maar niet 
meer dan 3,0/k  2 of 95 % van de stationaire concentratie (7).  
De tijd die nodig is om 80 % van de stationaire concentratie te bereiken, 
bedraagt (vergelijking 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 of t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (vergelijking 5)  
Op dezelfde wijze kan worden berekend dat 95 % van de stationaire con ­
centratie wordt bereikt na:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (vergelijking 6)  
Bijvoorbeeld bedraagt de duur van de opnamefase (t  op ) voor een teststof 
met log P  ow = 4 bij benadering (op basis van de vergelijkingen 1, 5 en 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 d  -1 
t op = t 80 = 1,6/0,652, d.w.z. 2,45 d (59 h)  
of t  op = t 95 = 3,0/0,652, d.w.z. 4,60 d (110 h)  
Op analoge wijze kan voor een teststof waarvoor s = 10  -5 mol/l log(s) = - 
5,0) de duur van de opnamefase met behulp van de vergelijkingen 1, 2, 5 en 6 als volgt worden berekend:
 
log 10 (P ow ) = 0,862 . (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 K 2 = 0,414 . (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 d  -1 
t op = t 80 = 1,6/0,246, d.w.z. 6,5 d (156 h)  
of t  op = t 95 = 3,0/0,246, d.w.z. 12,2 d (293 h)  
Als alternatief kan de uitdrukking  
t eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 h  
worden gebruikt om de tijd te berekenen die nodig is voor het daadwer ­
kelijk bereiken van de stationaire situatie (4).  
2. Voorspelling van de duur van de depuratiefase  
Een schatting van de tijd die nodig is om de lichaamsconcentratie van een stof 
tot een bepaald percentage van de aanvankelijke concentratie terug te brengen, kan eveneens worden verkregen aan de hand van de algemene vergelijking van 
de opname- en depuratiekinetiek (eersteordekinetiek) (1) (8).
 
Voor de depuratiefase wordt C  w gelijkgesteld aan 0. De vergelijking wordt 
dan gereduceerd tot  
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f of C f ¼ C f;o ·e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
waarin C  f.o de concentratie is bij het begin van depuratiefase. 50 % depu ­
ratie wordt verkregen na t  50 , die als volgt wordt berekend:  
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 of t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Zo ook wordt 95 % depuratie bereikt na  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Als de opnamefase wordt afgesloten wanneer 80 % van de stationaire 
concentratie is bereikt (1,6/k  2 ) en de depuratiefase wanneer de eliminatie 
95 % beloopt (3,0/k  2 ), bedraagt de duur van de depuratiefase ongeveer het 
dubbele van de duur van de opnamefase.  
Het is belangrijk hierbij op te merken dat al deze schattingen gebaseerd zijn 
op de onderstelling dat het opname- en het depuratieproces kunnen worden beschreven door een eersteordekinetiek. Als duidelijk is dat een eersteorde ­
kinetiek niet van toepassing is, dienen complexere modellen te worden ge ­
bruikt (zie bijvoorbeeld referentie (1)).
 
Referenties  (ad aanhangsel 3)  
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982). Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 
1, pp 309-320.  
(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration is fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality 
Institute.  
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10.
 
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coeffi ­
cient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.  
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.  
(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by 
Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd, N.Y.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. 
Eng. 55, pp 614-622.  
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by Guppies. Che ­
mosphere, 9, pp 3-19.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
Aanhangsel 4  
Theoretisch voorbeeld van een bemonsteringsschema voor een bioconcentratietest met een stofwaarvoor 
log P  ow = 4 
Bemonstering vissen Bemonsteringsschema 
Aantal watermonsters Aantal vissen per monster Minimale bemonstering: 
tijdstip (in dagen) Extra monsternemingen  
Opnamefase -1 
0 2 (*) 
2 Introductie van 45-80 
vissen 
1e 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2e 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3e 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4e 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5e 4,7 2 6 
Depuratiefase Vissen overbrengen 
naar water zonder de 
teststof 
6e 5,0 5,3 4 
(4) 
7e 5,9 7,0 4 
(4) 
8e 9,3 11,2 4 
(4) 
9e 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Bemonster het water nadat ten minste reeds drie bakvolumes zijn doorgestroomd. 
De cijfers tussen haakjes zijn de aantallen extra monsters (van het water en de vissen) die worden genomen ingeval voor een aan vullende 
bemonstering werd geopteerd.  
NB: De preliminaire, aan de test voorafgaande schatting van k. op basis van log P  ow = 4,0 bedraagt 0,652 dag  -1 . De totale duur van het 
experiment wordt gelijkgesteld aan 3 × t  op = 3 × 4,6 dagen, d.w.z. 14 dagen. Voor de schatting van P  ow , zie aanhangsel 3.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Aanhangsel 5  
Keuze van een model  
Er is van uitgegaan dat de meeste bioconcentratieprocessen op een „acceptabele” 
manier worden beschreven door een simpel twee-compartiment/twee-parameter ­
model, wat zich vertaalt in een lineair verband wanneer de concentratie van de 
stof in de vissen tijdens de depuratiefase op semi-logaritmisch papier tegen de 
tijd wordt uitgezet. Wanneer de trend in de desbetreffende gegevens niet door een rechte kan worden beschreven, dient een complexer model te worden ge ­
bruikt. Zie daarvoor bijvoorbeeld de publicatie van Spacie en Hamelink (refe ­
rentie 1 in aanhangsel 3).
 
Grafische methode voor de bepaling van de depuratie-(eliminatie- 
)snelheidsconstante k  2 
Zet de concentratie van de teststof in ieder vismonster op semi-logaritmisch 
papier uit tegen het bemonsteringstijdstip. De richtingscoëfficiënt van de trendlijn is k
 2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Houd er rekening mee dat afwijkingen van een lineair verband tussen log C  f en t 
een aanwijzing kunnen vormen voor een complex depuratiepatroon dat niet door een eersteordekinetiek kan worden beschreven. Om depuratiepatronen door te 
rekenen die niet door een eersteordekinetiek worden gekenmerkt, kunnen even ­
eens grafische methoden worden gebruikt.
 
Grafische methode voor de bepaling van de opnamesnelheidsconstante k  1 
Als k  2 bekend is, kan k  1 als volgt worden berekend:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (vergelijking 1)  
De waarde van C  f wordt afgelezen op de helft van de hoogte van de geëffende 
opnamecurve die wordt verkregen wanneer de concentratie van de stof in de 
vissen (op logaritmische schaal) wordt uitgezet tegen die tijd (op lineaire schaal).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Computermethode voor de berekening van de opname- en de depuratie- 
(eliminatie-)snelheidsconstante  
Voor de berekening van de bioconcentratiefactor en de snelheidsconstanten k  1 en 
k 2 verdient het de voorkeur gebruik te maken van gecomputeriseerde niet-lineaire 
parameterschattingstechnieken. Deze programma's berekenen een waarde voor k  1 
en k  2 op basis van de aan de tijd gerelateerde concentratiegegevens en het model:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü Ê 
1 Ä e Äk 2 t Ì 
0 < t < t  c (vergelijking 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü Ê 
e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ì 
t < t  c (vergelijking 3)  
waarin t  c = het moment waarop de opnamefase wordt afgebroken.  
Met deze techniek wordt ook een schatting van de standaardafwijking van k  1 en 
k 2 verkregen.  
Aangezien k  2 in de meeste gevallen met een vrij grote precisie uit de depuratie ­
curve kan worden geschat, en aangezien er tussen de parameters k  2 en k  2 een 
sterke correlatie bestaat als zij gelijktijdig worden geschat, kan het wenselijk zijn 
eerst, en uitsluitend aan de hand van de depuratiegegevens, k  2 te berekenen en 
vervolgens k  1 uit de opnamegegevens te schatten door middel van niet-lineaire 
regressie.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  GROEITEST ONVOLWASSEN VISSEN  
1. METHODE  
Deze groei-toxiciteitstest is overgenomen van OESO TG 215 (2000).  
1.1. INLEIDING  
Het doel van deze test is het beoordelen van de effecten van een 
langdurige blootstelling aan chemische stoffen op de groei van onvol ­
wassen vissen. De test is gebaseerd op een methode, die binnen de Europese Unie is ontwikkeld en getest met de rondzendproef (1) (3), voor het beoordelen van de effecten van chemische stoffen op de 
groei van onvolwassen regenboogforel  (Oncorynchus mykiss)  in een 
doorstroomprocedure. Voor deze test mogen ook andere goed gedocu ­
menteerde vissoorten worden gebruikt. In het verleden zijn bijvoor ­
beeld al eens groeitests uitgevoerd met zebravissen  (Danio rerio)  (
 1 ) 
(2) (4) (5) en rijstvissen (medaka,  Oryzias latipes)  (6) (7) (8).  
Zie ook Algemene inleiding, deel C.  
1.2. DEFINITIES  
Lowest observed effect concentration (LOEC):  de laagste geteste 
concentratie van een teststof waarbij de stof een significant effect (p < 0,05) heeft vergeleken met de controlegroep. Alle testconcen ­
traties boven de LOEC moeten een schadelijk effect hebben dat 
gelijk is aan of groter is dan de LOEC.
 
No observed effect concentration (NOEC):  de testconcentratie di ­
rect onder de LOEC.  
EC X : bij deze testmethode wordt de concentratie van de teststof die 
x % variatie in de groeisnelheid van de vissen veroorzaakt vergele ­
ken met de controlegroepen.  
Densiteit:  het natte gewicht van de vissen per volume water.  
Bezettingsgraad:  het aantal vissen per volume water.  
Specifieke groeisnelheid van de afzonderlijke vissen:  de groeisnel ­
heid van één afzonderlijke vis met als uitgangspunt het begin ­
gewicht.  
Gemiddelde specifieke groeisnelheid per bak:  de gemiddelde 
groeisnelheid van een bakpopulatie bij een bepaalde concentratie.  
Pseudo-specifieke groeisnelheid:  de afzonderlijke groeisnelheid van 
de vissen vergeleken met het gemiddelde begingewicht van de bak ­
populatie.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio Rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the compara ­
tive method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Onvolwassen vissen in exponentiële groeifasen worden, nadat ze zijn 
gewogen, in testkamers geplaatst en blootgesteld aan een reeks su ­
bletale concentraties van de teststof die is opgelost in water. Hierbij 
moet bij voorkeur de doorstroomprocedure worden gebruikt. Als dit 
niet mogelijk is, moet een geschikte semistatische procedure (sta ­
tisch-verversing) worden gebruikt. De test duurt 28 dagen. De vissen worden dagelijks gevoerd. Het voedselrantsoen is afhankelijk van het 
begingewicht van de vissen en kan indien gewenst na 14 dagen 
opnieuw worden berekend. Na afloop van de test worden de vissen opnieuw gewogen. De effecten op de groeisnelheid worden geanaly ­
seerd met een regressiemodel, zodat kan worden geraamd welke 
concentratie x % variatie in de groeisnelheid kan veroorzaken, d.w.z. EC
 X (bijvoorbeeld EC  10 , EC  2 of EC  30 ). De gegevens kunnen ook 
worden vergeleken met de controlewaarden, zodat de LOEC en 
NOEC kunnen worden bepaald.  
1.4. GEGEVENS OVER DE TESTSTOF  
Resultaten van een acute toxiciteitstest (zie methode C.1), bij voor ­
keur met dezelfde vissoort als in deze test is gebruikt, moeten be ­
schikbaar zijn. Dit betekent dat de oplosbaarheid in water en de dampspanning van de teststof bekend moeten zijn en dat er een 
betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde 
nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar is voor de kwantita ­
tieve bepaling van de stof in de testoplossingen.
 
Nuttige gegevens over de teststof zijn de structuurformule, de zui ­
verheid van de stof, de stabiliteit van de stof in water en licht, pK  a , 
P ow en de resultaten van een onderzoek naar de mate van gemakke ­
lijke biologische afbreekbaarheid (zie methode C.4).  
1.5. GELDIGHEID VAN DE TEST  
De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt 
voldaan:  
— het sterftecijfer in de controlegroep(en) mag aan het eind van de 
test niet hoger zijn dan 10 %;  
— het gemiddelde gewicht van vissen in de controlegroep(en) moet 
zodanig zijn toegenomen dat de minimumvariatie in groeisnel ­
heid die als significant wordt beschouwd, kan worden gedetec ­
teerd. Een rondzendproef (3) heeft aangetoond dat bij regenboog ­
forel het gemiddelde gewicht van vissen in de controlegroepen 
binnen 28 dagen met minimaal de helft (d.w.z. 50 %) van hun 
gemiddelde begingewicht moet zijn toegenomen. Bijvoorbeeld: begingewicht 1 g/vis (= 100 %), eindgewicht na 28 dagen: ≥ 
1,5 g/vis ( ≥ 150 %);
 
— het gehalte aan opgeloste zuurstof moet gedurende de gehele test 
minimaal 60 % van de verzadigingswaarde van lucht zijn ge ­
weest;  
— het verschil in watertemperatuur tussen de testkamers mag op 
geen enkel moment van de test groter zijn dan ± 1  o C. Tevens 
mag de watertemperatuur niet meer dan 2  o C hoger of lager zijn 
dan het temperatuurbereik dat voor de vissoort wordt gespecifi ­
ceerd (aanhangsel 1).  
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
Standaardlaboratoriumapparatuur, met name:  
a) zuurstof- en pH-meters;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
b) apparatuur voor het bepalen van de hardheid en alkaliteit van 
water;  
c) geschikte apparatuur voor de temperatuurregeling en bij voorkeur 
ook voor continue bewaking;  
d) bakken van chemisch inert materiaal met een inhoud die geschikt 
is voor de aanbevolen densiteit en bezettingsgraad (zie punt 1.8.5 
en aanhangsel 1);  
e) weegschaal met een toereikende nauwkeurigheid (d.w.z. nauw ­
keurig tot op ± 0,5 %).  
1.6.2.  Water  
Water waarin de gekozen testsoort langdurig kan overleven en 
groeien is geschikt als testwater. Gedurende de test moet de water ­
kwaliteit constant zijn. De pH-waarde moet binnen een bereik van 6,5 en 8,5 blijven, maar tijdens een test mag deze niet meer dan 
± 0,5 pH-eenheden schommelen. De aanbevolen hardheid is 140 mg/l 
(CaCO
 3 ) of hoger. Om ervoor te zorgen dat het verdunningswater de 
testresultaten niet noemenswaardig beïnvloedt (bijvoorbeeld door complexvorming met de teststof), moeten regelmatig monsters wor ­
den genomen en geanalyseerd. Zware metalen (bijvoorbeeld Cu, Pb, 
Zn, Hg, Cd en Ni), de belangrijkste anionen en kationen (bijvoor ­
beeld Ca, Mg, Na, K, Cl en SO
 4 ), bestrijdingsmiddelen (bijvoorbeeld 
totaalgehalte aan organofosfor-pes-ticiden en totaalgehalte aan orga ­
nochloor-pesticiden) en het totaalgehalte aan organische koolstof en 
zwevende deeltjes moeten bijvoorbeeld om de drie maanden worden bepaald als van het verdunningswater bekend is dat het een relatief constante kwaliteit heeft. Indien is aangetoond dat de waterkwaliteit 
gedurende ten minste één jaar constant blijft, zijn minder frequente 
bepalingen en langere intervallen (bijvoorbeeld zes maanden) toelaat ­
baar. In aanhangsel 2 worden enkele chemische kenmerken van geschikt verdunningswater genoemd.
 
1.6.3.  Testoplossingen  
De testoplossingen met de gekozen concentraties worden bereid door 
verdunning van een stamoplossing.  
De stamoplossing wordt bij voorkeur bereid door eenvoudig mengen 
en schudden van de teststof in het verdunningswater met mecha ­
nische middelen (bijvoorbeeld door te roeren of met ultrasone tril ­
lingen). Voor het maken van een stamoplossing van een passende concentratie kunnen verzadigingskolommen (oplosbaarheidskolom ­
men) worden gebruikt.
 
Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen (ontsluitings ­
middelen) kan in bepaalde gevallen nodig zijn om een stamoplossing van een passende concentratie te verkrijgen. Voorbeelden van pas ­
sende oplosmiddelen zijn aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxi ­
de, dimethylformamide en triethyleenglycol. Voorbeelden van pas ­
sende dispergeermiddelen zijn Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose en HCO-40. Als gemakkelijk biologisch afbreekbare agentia (bijvoorbeeld aceton) en/of zeer vluchtige stoffen worden 
gebruikt, moet worden gewaakt voor problemen die zich als gevolg 
van bacteriegroei in de doorstroomtests kunnen voordoen. Indien wordt gebruikgemaakt van een ontsluitingsmiddel, mag dit geen grote invloed hebben op de groei en geen zichtbaar negatief effect 
hebben op de onvolwassen vissen, hetgeen blijkt uit de controlegroep 
met uitsluitend oplosmiddel.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Voor doorstroomtests is een systeem vereist dat de stamoplossing 
van de teststof continu verdeelt en verdunt en ervoor zorgt dat de 
testkamers de juiste testconcentratie krijgen toegediend (bijvoorbeeld met een doseerpomp, mechanisme voor evenredige verdunning of saturatorsysteem). De stroomsnelheid van de stamoplossingen en 
het verdunningswater moet regelmatig, bij voorkeur dagelijks, wor ­
den gecontroleerd en mag gedurende de gehele test hooguit 10 % afwijken. Met een rondzendproef (3) is aangetoond dat, bij regen ­
boogforel, een verversingsfrequentie tijdens de test van 6 liter/g vis 
per dag acceptabel is (zie punt 1.8.2.2).
 
Bij semistatische (verversings)tests hangt de verversingsfrequentie af 
van de stabiliteit van de teststof, maar dagelijks verversen van water wordt aanbevolen. Als uit eerdere stabiliteitstests (zie punt 1.4) blijkt 
dat de concentratie van de teststof gedurende de verversingsperiode 
niet stabiel blijft (d.w.z. buiten 80-120 % van de nominale concen ­
tratie valt of onder 80 % van de gemeten oorspronkelijke concen ­
tratie), moet worden overwogen om over te gaan op een doorstroom ­
test.
 
1.6.4.  Keuze van de vissoort  
Voor deze test wordt de regenboogforel  (Oncorhynchus mykiss)  aan­
bevolen omdat hiermee met de rondzendproef de meeste ervaring is opgedaan (1) (2). Andere goed gedocumenteerde vissoorten mogen 
ook worden gebruikt, maar de testprocedure moet wellicht worden 
aangepast teneinde passende testomstandigheden te creëren. In het verleden is bijvoorbeeld ook ervaring opgedaan met zebravissen  
(Danio rerio)  (3) (4) en rijstvissen (medaka,  Oryzias latipes)  (5) 
(6) (7). Als er wordt gekozen voor een andere vissoort, moet worden 
aangegeven waarom er voor deze soort is gekozen en tevens worden gerapporteerd welke experimentele methode wordt toegepast.
 
1.6.5.  Leefomstandigheden van de vis  
De testvissen worden geselecteerd uit een populatie van één stam, bij 
voorkeur van hetzelfde broedsel, dat bij het begin van de test mini ­
maal twee weken oud is en in leven gehouden is onder omstandig ­
heden die qua waterkwaliteit en verlichting overeenkomen met die tijdens de test. Voor de gehele duur van hun verblijf en van de test 
moeten ze per dag een rantsoen van minimaal 2 % en bij voorkeur 
4 % van hun lichaamsgewicht toegediend krijgen.
 
Na een gewenningsperiode van 48 uur wordt het sterftecijfer geregis ­
treerd en worden de volgende criteria toegepast:  
— sterftecijfer van meer dan 10 % van de populatie binnen zeven 
dagen: de gehele partij afkeuren;  
— sterftecijfer tussen 5 % en 10 % van de populatie: zeven dagen 
extra voor de aanpassing; als het sterftecijfer gedurende deze 
zeven dagen hoger dan 5 % is, de gehele partij afkeuren;  
— sterftecijfer van minder dan 5 % van de populatie binnen zeven 
dagen: de gehele partij accepteren.  
De vissen mogen in de twee weken voorafgaande aan de test of 
tijdens de test niet worden behandeld voor ziekten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. TESTOPZET  
De „testopzet” heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de 
factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal bakken per con ­
centratieniveau en het aantal vissen per bak. Idealiter moet bij de 
keuze van de testopzet rekening worden gehouden met:  
a) het doel van het onderzoek;  
b) de methode van statistische analyse die wordt toegepast;  
c) de beschikbaarheid en kosten van experimentele middelen.  
De omschrijving van het doel van het onderzoek moet, indien mo ­
gelijk, de statistische power specificeren waarbij een bepaald verschil 
(bijvoorbeeld in groeisnelheid) moet worden gedetecteerd, of de 
nauwkeurigheid specificeren waarmee de EC  x (bijvoorbeeld met x 
= 10, 20 of 30, en bij voorkeur niet minder dan 10) moet worden 
geraamd. Zonder deze gegevens kan geen goede omschrijving wor ­
den gegeven van de omvang van het onderzoek.  
Het is belangrijk om te onderkennen dat een opzet die optimaal is 
(optimaal gebruik van de middelen) voor toepassing bij één methode voor statistische analyse, niet per definitie ook optimaal is voor een andere. De aanbevolen opzet voor de raming van een LOEC/NOEC 
is daardoor niet dezelfde als de opzet die wordt aanbevolen voor 
regressieanalyse.
 
In de meeste gevallen verdient regressieanalyse de voorkeur boven 
de variantieanalyse. De redenen daarvoor worden uiteengezet door Stephan en Rogers (9). Als er echter geen geschikt regressiemodel 
wordt gevonden (r
 2 < 0,9), moet NOEC/LOEC worden gebruikt.  
1.7.1.  Opzet voor regressieanalyse  
De belangrijke overwegingen bij het opzetten van een test die door 
middel van regressie wordt geanalyseerd, zijn:  
a) de effectconcentratie (bijvoorbeeld EC  10,20,30  ) en het concentra ­
tiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is, 
moeten altijd begrepen zijn onder de concentraties die in de test worden gebruikt. De nauwkeurigheid waarmee de effectcon ­
centraties kunnen worden geraamd, is optimaal wanneer de effect ­
concentratie zich in het midden bevindt van het bereik van geteste 
concentraties. Een voorbereidende test voor het vaststellen van het bereik kan nuttig zijn bij het selecteren van de juiste test ­
concentraties;
 
b) teneinde een goed statistisch model te verkrijgen, moet de test 
minimaal één bak met een controlegroep omvatten en vijf extra 
bakken met verschillende concentraties. Wanneer gebruik wordt gemaakt van een ontsluitingsmiddel, moet er naast de testreeks een controlegroep worden behandeld met de hoogste testconcen ­
tratie ontsluitingsmiddel (zie punt 1.8.3 en 1.8.4);
 
c) er mag worden gebruikgemaakt van een geschikte geometrische 
reeks of logaritmische reeks (10) (zie aanhangsel 3). De verdeling 
van de testconcentraties moet bij voorkeur logaritmisch zijn;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
d) als er meer dan zes bakken beschikbaar zijn, moeten de extra 
bakken worden gebruikt als replicaatbakken of worden verdeeld 
over de reeks concentraties om zodoende een kleiner verschil tussen de niveaus te creëren. Beide mogelijkheden zijn even goed.
 
1.7.2.  Opzet voor de raming van een NOEC/LOEC met behulp van 
ANOVA (variantieanalyse)  
Het is wenselijk om voor elke concentratie een replicaatbak te heb ­
ben. De statistische analyse moet op bakniveau worden uitgevoerd 
(11). Zonder replicaatbakken kan, behalve met de variabiliteit die 
verband houdt met de afzonderlijke vissen, geen rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen de bakken. Bij eerdere onder ­
zoeken is echter gebleken (12) dat de variabiliteit tussen de bakken 
in een dergelijke test erg klein is vergeleken met de variabiliteit in de 
bakken (d.w.z. tussen de vissen). Als relatief aanvaardbaar alternatief kan de statistische analyse daarom op het niveau van de afzonder ­
lijke vissen worden uitgevoerd.
 
Normaliter worden er minimaal vijf testconcentraties in een geo ­
metrische reeks met een factor van bij voorkeur ten hoogste 3,2 
gebruikt.  
Wanneer tests worden uitgevoerd met replicaatbakken, moet het aan ­
tal replicaatbakken voor controlegroepen en dus het aantal vissen over het algemeen het dubbele zijn van het aantal in elk van de testconcentraties, die van gelijke omvang moeten zijn (13)(14)(15). 
Als er geen replicaatbakken zijn, moet het aantal vissen in de con ­
trolegroep gelijk zijn aan dat in elke testconcentratie.
 
Als de ANOVA wordt gebaseerd op bakken in plaats van afzon ­
derlijke vissen (wat zou betekenen dat elke vis afzonderlijk moet worden gemerkt of dat moet worden gebruikgemaakt van pseudo ­
specifieke groeisnelheden (zie punt 2.1.2)), moeten er voldoende 
replicaatbakken aanwezig zijn om de standaardafwijking van „bak ­
ken met concentraties” te kunnen bepalen. Dit betekent dat de ni ­
veaus van fouttolerantie in de variantieanalyse minimaal 5 moeten zijn (11). Als er alleen replicaten worden gemaakt van de contro ­
legroepen, bestaat het risico dat de foutvariabiliteit onzuiver is. Deze 
kan dan namelijk toenemen met de gemiddelde waarde van de groei ­
snelheid in kwestie. Omdat de groeisnelheid waarschijnlijk zal afne ­
men naarmate de concentratie hoger wordt, is het mogelijk dat de 
variabiliteit wordt overschat.
 
1.8. PROCEDURE  
1.8.1.  Selectie en weging van de testvissen  
Het is belangrijk om de variatie in het gewicht van de vissen aan het 
begin van de test zoveel mogelijk te beperken. In aanhangsel 1 worden geschikte gewichtbereiken aangegeven voor de verschillende vissoorten die worden aanbevolen voor deze test. Voor de gehele 
partij vissen die in deze test wordt gebruikt, geldt dat het bereik van 
het afzonderlijke gewicht van de vissen aan het begin van de test idealiter binnen ± 10 %, maar maximaal binnen 25 %, van het rekenkundig gemiddelde blijft. Het verdient aanbeveling om voor ­
afgaande aan de test een steekproef te nemen om het gemiddelde 
gewicht te bepalen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
De stampopulatie mag vanaf 24 uur voor het begin van de test niet 
worden gevoerd. De vissen moeten vervolgens willekeurig worden 
geselecteerd. De vissen krijgen een verdovingsmiddel toegediend (bijvoorbeeld een oplossing in water van 100 mg/l tricaïne-methaan ­
sulfonaat (MS 222) geneutraliseerd met twee delen natrium-bicarbo ­
naat per deel MS 222) en worden afzonderlijk in natte toestand 
gewogen (drooggedept) zoals beschreven in aanhangsel 1. De vissen met een gewicht binnen het juiste bereik, moeten worden behouden en vervolgens willekeurig over de testbakken worden verdeeld. Het 
totale natte gewicht van alle vissen in een bak moet worden geregis ­
treerd. Het gebruik van verdovingsmiddelen en het behandelen van de vissen (inclusief droogdeppen en wegen) kan stress en verwon ­
dingen veroorzaken bij de onvolwassen dieren, met name bij kleine 
soorten. Onvolwassen vissen moeten daarom uiterst voorzichtig wor ­
den behandeld om stress en verwondingen bij deze dieren te voor ­
komen.
 
Op dag 28 van de test worden de vissen opnieuw gewogen (zie punt 
1.8.6). Als het echter noodzakelijk wordt geacht het rantsoen op ­
nieuw te berekenen, mogen de vissen ook op dag 14 van de test 
opnieuw worden gewogen (zie punt 1.8.2.3). Er zijn ook andere 
methoden, zoals de fotografische methode, voor het vaststellen van veranderingen in de visgrootte aan de hand waarvan de rantsoenen kunnen worden aangepast.
 
1.8.2.  Blootstellingsomstandigheden  
1.8.2.1.  Duur  
De test duurt ≥ 28 dagen.  
1.8.2.2.  Densiteit en bezettingsgraad  
Het is belangrijk dat de densiteit en bezettingsgraad worden afge ­
stemd op de gebruikte vissoort (zie aanhangsel 1). Als de bezettings ­
graad te hoog is, zullen de vissen gestrest raken en daardoor minder 
hard groeien of zelfs ziek worden. Als de bezettingsgraad te laag is, 
kan territoriumgedrag ontstaan, dat de groei eveneens kan beïnvloe ­
den. In elk geval moet de densiteit zo laag zijn dat het gehalte aan opgeloste zuurstof van minimaal 60 % van de luchtverzadigings ­
waarde zonder beluchting in stand kan worden gehouden. Een rond ­
zendproef (3) heeft aangetoond dat bij regenboogforel een densiteit van 16 vissen van 3-5 g in een volume van 40 liter acceptabel is. De aanbevolen waterverversingsfrequentie tijdens de test is 6 liter/g vis 
per dag.
 
1.8.2.3.  Voeding  
De vissen moeten geschikt voedsel toegediend krijgen (aanhangsel 1) 
in zodanige hoeveelheden dat een acceptabele groeisnelheid wordt 
bereikt. Bacteriegroei en troebelheid van het water moeten zoveel 
mogelijk worden voorkomen. Bij regenboogforel wordt waarschijn ­
lijk aan deze voorwaarden voldaan als zij een rantsoen van 4 % van hun lichaamsgewicht per dag krijgen (3) (16) (17) (18). Het dage ­
lijkse rantsoen kan worden verdeeld over twee gelijke porties met 
een tussenpoos van minimaal 5 uur. Het rantsoen is gebaseerd op het totale gewicht van de vissen in een testbak aan het begin van de test. Als de vissen op dag 14 opnieuw worden gewogen, moet het rant ­
soen opnieuw worden berekend. De vissen mogen vanaf 24 uur 
voordat ze worden gewogen, geen voedsel krijgen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Niet gegeten voedsel en fecaal materiaal moeten dagelijks uit de 
testbakken worden verwijderd door de bodem van de bakken zorg ­
vuldig schoon te maken met een zuiger.  
1.8.2.4.  Licht en temperatuur  
De fotoperiode en watertemperatuur moeten worden afgestemd op de 
gekozen vissoort (aanhangsel 1).  
1.8.3.  Testconcentraties  
Normaliter zijn er vijf concentraties van de teststof nodig, ongeacht 
de testopzet (zie punt 1.7.2). Eerder opgedane kennis over de toxi ­
citeit van de teststof (bijvoorbeeld n.a.v. een acute test en/of onder ­
zoeken voor het vaststellen van het bereik) helpt bij het kiezen van de juiste testconcentraties. Als minder dan vijf concentraties worden 
gebruikt, moet hiervoor een geldige reden worden gegeven. De 
hoogste geteste concentratie mag de oplosbaarheidsgrens van de test ­
stof in water niet overschrijden.
 
Als een ontsluitingsmiddel wordt gebruikt bij het maken van stam ­
oplossingen, mag de uiteindelijke concentratie hiervan niet groter 
zijn dan 0,1 ml/l en moet de concentratie bij voorkeur in alle bakken gelijk zijn (zie punt 1.6.3). Het gebruik van deze middelen moet echter te allen tijde zoveel mogelijk worden vermeden.
 
1.8.4.  Controlegroepen  
Het aantal controlegroepen dat wordt behandeld met verdunnings ­
water hangt af van de testopzet (zie punten 1.7-1.7.2). Als er een ontsluitingsmiddel wordt gebruikt, moet er een aantal controlegroe ­
pen met water waaraan een ontsluitingsmiddel is toegevoegd, worden 
opgenomen in de test. Dit aantal moet gelijk zijn aan het aantal 
controlegroepen dat wordt behandeld met verdunningswater.
 
1.8.5.  Frequentie van de analytische bepalingen en metingen  
Tijdens de test worden de concentraties van de teststoffen regelmatig 
gemeten (zie hieronder).  
Bij doorstroomtests moet de stroomsnelheid van het verdunnings ­
water en de toxische stamoplossing regelmatig worden gecontro ­
leerd, bij voorkeur dagelijks, en mag deze gedurende de gehele test hooguit 10 % afwijken. Als wordt verwacht dat de concentratie 
van de teststof binnen ± 20 % van de nominale waarden blijft (d.w.z. 
binnen het interval van 80-120 %; zie punt 1.6.2 en 1.6.3), is het raadzaam om in elk geval de hoogste en laagste testconcentraties te analyseren. Doe dit aan het begin van de test en daarna eens per 
week. Bij tests waarbij niet wordt verwacht dat de concentratie van 
de teststof binnen ± 20 % van de nominale concentratie blijft (op basis van stabiliteitsgegevens van de teststof), moeten alle testcon ­
centraties worden geanalyseerd. Hierbij moet dezelfde procedure 
worden gevolgd als hierboven.
 
Bij semistatische (verversings)tests waarbij wordt verwacht dat de 
concentratie van de teststof binnen ± 20 % van de nominale waarden blijft, is het raadzaam om in elk geval de hoogste en laagste test ­
concentraties te analyseren. Doe dit vlak na het bereiden van de 
oplossing en vlak vóór het verversen, bij het begin van de test en vervolgens eens per week. Bij tests waarbij niet wordt verwacht dat de concentratie van de teststof binnen ± 20 % van de nominale 
concentratie blijft, moeten alle testconcentraties worden geanalyseerd 
volgens dezelfde procedure als voor de stabielere stoffen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Het is wenselijk de resultaten te baseren op gemeten concentraties. 
Als echter kan worden aangetoond dat de concentratie van de teststof 
in de oplossing gedurende de gehele test binnen ± 20 % van de nominale of de gemeten oorspronkelijke concentratie is gebleven, mogen de resultaten worden gebaseerd op de nominale of gemeten 
waarden.
 
Monsters moeten mogelijk worden gefilterd (bijvoorbeeld met een 
0,45 μm poriëngrootte) of gecentrifugeerd. Centrifugatie verdient de 
voorkeur. Als het testmateriaal echter niet aan filters adsorbeert, is filtratie mogelijk een geschikt alternatief.
 
In de loop van de test moet het gehalte aan opgeloste zuurstof, de 
pH en de temperatuur in alle testbakken worden gemeten. De totale hardheid, alkaliteit en (voorzover relevant) het zoutgehalte moeten worden gemeten in de bakken met de controlegroepen en in één bak 
met de hoogste concentratie teststof. Het zuurstofgehalte en (voor ­
zover relevant) het zoutgehalte moeten tijdens de test ten minste drie keer worden gemeten (aan het begin, omstreeks het midden en aan het eind). Bij semistatische tests is het raadzaam het opgeloste zuur ­
stofgehalte vaker te meten, bij voorkeur voor en na elke waterver ­
versing of minimaal één keer per week. De pH moet bij semistati ­
sche (verversings)tests voor en na elke waterverversing worden ge ­
meten en bij doorstroomtests minimaal één keer per week. De hard ­
heid en alkaliteit moeten per test eenmaal worden gemeten. De tem ­
peratuur moet bij voorkeur in ten minste één testbak continu worden gecontroleerd.
 
1.8.6.  Waarnemingen  
Gewicht: aan het eind van de test moet van alle overlevende vissen 
het natte gewicht (drooggedept) worden gewogen, hetzij per testbak 
of afzonderlijk. Het gezamenlijk wegen van alle vissen in een testbak 
verdient de voorkeur boven het afzonderlijk wegen van de vissen waarbij elke vis eerst moet worden gemerkt. Wanneer elke vis apart wordt gewogen om de specifieke groeisnelheid van de afzonderlijke 
vissen te kunnen bepalen, mag de toegepaste merkmethode geen 
stress veroorzaken bij de vissen (alternatieven voor koudmerken kunnen wenselijk zijn, bijvoorbeeld het gebruik van een fijne, ge ­
kleurde vislijn).
 
De vissen moeten gedurende de test dagelijks worden onderzocht. 
Als er een externe afwijking (zoals bloedingen of ontkleuring) of 
afwijkend gedrag wordt geconstateerd, moet dit worden genoteerd. Ook de sterfte moet worden geregistreerd en de dode vissen moeten zo snel mogelijk worden verwijderd. Dode vissen worden niet ver ­
vangen. Als de aanbevolen densiteit en bezettingsgraad worden aan ­
gehouden, wordt namelijk voorkomen dat veranderingen in het aan ­
tal vissen per bak de groei beïnvloeden. Het rantsoen moet echter wel worden aangepast.
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. BEWERKING VAN DE RESULTATEN  
Het is wenselijk om bij de opzet en analyse van de test een statis ­
ticus te betrekken omdat de methode een aanzienlijke variatie in de opzet van het experiment toelaat, bijvoorbeeld in het aantal test ­
kamers, het aantal testconcentraties, het aantal vissen, enz. Gezien 
de beschikbare opties in de opzet van de test, worden hier geen 
richtlijnen voor de statistische procedures gegeven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Als het sterftecijfer in een testbak hoger is dan 10 %, mag voor deze 
bak geen groeisnelheid worden berekend. Wel moet worden gerap ­
porteerd wat het sterftecijfer per testconcentratie is.  
Het belangrijkste concept van deze test is het bepalen van de speci ­
fieke groeisnelheid r tussen tijdstip t  1 en tijdstip t  2 , ongeacht de 
methode die wordt toegepast om de gegevens te analyseren. Deze snelheid kan op verschillende manieren worden gedefinieerd, afhan ­
kelijk van het feit of de vissen afzonderlijk gemarkeerd zijn dan wel 
of er een bakgemiddelde vereist is.
 
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
waarbij  
r 1 = specifieke groeisnelheid van een afzonderlijke vis  
r 2 = gemiddelde specifieke groeisnelheid per bak  
r 3 = pseudo-specifieke groeisnelheid  
W 1 , W  2 = gewicht van een bepaalde vis op het tijdstip t  1 respec­
tievelijk t  2 
log e W 1 = logaritme van het gewicht van een afzonderlijke vis 
aan het begin van de onderzoeksperiode  
log e w 2 = logaritme van het gewicht van een afzonderlijke vis 
aan het eind van de onderzoeksperiode  
log e W 1 = gemiddelde van de logaritmen van de waarden W  1 
voor de vissen in de bak aan het begin van de onder ­
zoeksperiode  
log e W 2 = gemiddelde van de logaritmen van de waarden w  2 voor 
de vissen in de bak aan het eind van de onderzoeks ­
periode  
t 1 , t 2 = tijd (dag) bij het begin en eind van de onderzoeks ­
periode  
r 1 , r 2 , r 3 kunnen voor de periode van dag 0-28 worden berekend en, 
indien van toepassing (d.w.z. als op dag 14 metingen zijn uitge ­
voerd), voor de periode van dag 0-14 en dag 14-28.  
2.1.1.  Analyse van de resultaten met de regressiemethode (concentratie- 
reactie-model)  
Met deze analysemethode wordt een nuttig rekenkundig verband 
gelegd tussen de specifieke groeisnelheid en de concentratie, waar ­
door het mogelijk is de „EC  X ” te ramen, d.w.z. elke willekeurige 
EC-waarde. Deze analysemethode maakt de berekening van r voor afzonderlijke vissen (r
 1 ) overbodig. In plaats daarvan kan de analyse 
worden gebaseerd op de gemiddelde waarde van r per bak (r  2 ). De 
voorkeur gaat uit naar de laatste methode, mede omdat deze geschik ­
ter is voor kleine vissoorten.  
De gemiddelde specifieke groeisnelheden per bak (r  2 ) moeten gra ­
fisch worden uitgezet tegen de concentratie, zodat de concentratie- 
reactie-relatie tot uitdrukking komt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Voor het uitdrukken van de relatie tussen r  2 en de concentratie moet 
een geschikt model worden gekozen. De keuze moet worden beargu ­
menteerd.  
Als elke bak een oneven aantal vissen bevat, moet de passingspro ­
cedure, hetzij eenvoudig of niet-lineair, worden gewogen zodat re ­
kening wordt gehouden met de oneven aantallen.  
Met behulp van de passingsmethode voor het model moet een ra ­
ming gemaakt kunnen worden van bijvoorbeeld de EC  20 en van de 
bijbehorende dispersie (hetzij standaardafwijking of betrouwbaar ­
heidsinterval). De grafiek van het gepaste model moet worden weer ­
gegeven in relatie tot de gegevens zodat de mate waarin het model 
past, zichtbaar wordt (8) (18) (19) (20).  
2.1.2.  Analyse van de resultaten voor de raming van de LOEC  
Als bij de test gebruik is gemaakt van replicaatbakken voor alle 
concentratieniveaus, kan de LOEC worden geraamd aan de hand 
van een variantieanalyse (ANOVA) van de gemiddelde specifieke 
groeisnelheid per bak (zie punt 2.1), gevolgd door een geschikte methode (bijvoorbeeld de test van Dunnet of Williams (12) (13) (14) (21)) voor het vergelijken van de gemiddelde r voor elke con ­
centratie met de gemiddelde r van de controlegroepen om de laagste 
concentratie vast te stellen waarbij dit verschil bij een waarschijn ­
lijkheidsgrens van 0,05 significant is. Als niet wordt voldaan aan de vereiste voorwaarden voor parametermethoden — niet-normale ver ­
deling (bijvoorbeeld de test van Shapiro-Wilk) of heterogene varian ­
tie (test van Barlett) — moet worden overwogen om de gegevens te transformeren om varianties te homogeniseren alvorens de ANOVA of een gewogen ANOVA uit te voeren.
 
Als bij de test niet voor elke concentratie een replicaatbak is ge ­
bruikt, zal een ANOVA gebaseerd op bakken ongevoelig of zelfs onmogelijk zijn. In dat geval kan er als tussenoplossing voor worden gekozen de ANOVA te baseren op de pseudo-specifieke groeisnel ­
heid r
 3 van afzonderlijke vissen.  
De gemiddelde r  3 voor elke testconcentratie kan vervolgens worden 
vergeleken met de gemiddelde r  3 van de controlegroepen. Vervol ­
gens kan de LOEC op dezelfde manier worden vastgesteld als hier ­
boven is beschreven. Het is belangrijk dat wordt onderkend dat deze 
methode geen rekening houdt met, of bescherming biedt tegen, va ­
riabiliteit tussen de bakken, behalve die welke wordt veroorzaakt door de variabiliteit tussen de afzonderlijke vissen. Bij eerdere on ­
derzoeken is echter gebleken (9) dat de variabiliteit tussen de bakken 
erg klein is vergeleken met de variabiliteit in de bakken (d.w.z. tussen de vissen onderling). Als de vissen niet afzonderlijk worden geanalyseerd, moet de methode voor het vaststellen van de uitbijter 
worden vermeld samen met de reden waarom deze methode wordt 
gebruikt.
 
2.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De resultaten moeten met de nodige omzichtigheid worden geïnter ­
preteerd als de gemeten toxische concentraties in de testoplossingen in de buurt liggen van de detectiegrens van de analysemethode, of, 
bij semistatische tests, als de concentratie van de teststof afneemt in 
de periode na het bereiden van de oplossing en vóór het verversen.
 
2.3. TESTRAPPORT  
In het testrapport moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Teststof:  
— fysiek voorkomen en relevante fysisch-chemische kenmerken,  
— chemische identificatiegegevens, voorzover relevant met inbegrip 
van de zuiverheid en de analysemethode voor het bepalen van de teststof.
 
2.3.2.  Diersoort:  
— wetenschappelijke naam, eventueel  
— stam, grootte, leverancier, eventuele voorbehandelingen, enz.  
2.3.3.  Testomstandigheden:  
— toegepaste testprocedure (bijvoorbeeld semistatisch/verversing, 
doorstroom, densiteit, bezettingsgraad, enz.),  
— testopzet (bijvoorbeeld het aantal testbakken, testconcentraties en 
replicaten, en het aantal vissen per bak,  
— wijze waarop de stamoplossingen werden bereid en verversings ­
frequentie (indien een ontsluitingsmiddel is gebruikt, moet de 
concentratie daarvan worden vermeld),  
— de nominale testconcentraties, de gemiddelden van de in de test ­
bakken gemeten waarden en de standaardafwijkingen, de me ­
thode waarmee zij zijn bepaald, en gegevens waaruit blijkt dat de resultaten van de metingen betrekking hebben op de concen ­
traties van de teststof in de oplossing,
 
— kenmerken van het verdunningswater: pH, hardheid, alkaliteit, 
temperatuur, gehalte aan opgeloste zuurstof, residueel chloorge ­
halte (indien gemeten), totale hoeveelheid organische koolstof, 
zwevende deeltjes, zoutgehalte van het testmedium (indien ge ­
meten), alsmede de resultaten van eventuele andere metingen,  
— waterkwaliteit in de testbakken: pH, hardheid, temperatuur en 
gehalte aan opgeloste zuurstof,  
— gedetailleerde gegevens over de voeding (bijvoorbeeld het type 
voedsel, de leverancier, het rantsoen en de frequentie).  
2.3.4.  Resultaten:  
— gegevens waaruit blijkt dat de controlegroepen voldeden aan het 
validiteitscriterium voor overleving, en gegevens over de sterfte 
bij de verschillende testconcentraties,  
— toegepaste technieken voor statistische analyse, statistieken geba ­
seerd op replicaten of vissen, verwerking van de gegevens en 
beweegredenen voor het gebruik van deze technieken,  
— tabelgegevens over het afzonderlijke gewicht en het gemiddelde 
gewicht van de vissen op dag 0, 14 (indien gemeten) en 28, waarden met betrekking tot de gemiddelde of pseudo-specifieke groeisnelheid (afhankelijk van wat van toepassing is) per bak 
voor de periode van dag 0-28 of eventueel dag 0-14 en 14-28,
 
— resultaten van de statistische analyse (d.w.z. regressieanalyse of 
ANOVA), bij voorkeur in grafische en tabelvorm weergegeven 
en de LOEC (p = 0,05) en NOEC of EC  x met, indien mogelijk, 
de bijbehorende standaardafwijkingen,  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— gevallen van abnormale reacties bij de vissen en zichtbare effec ­
ten die werden veroorzaakt door de test stof.  
3. REFERENTIES  
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2.  
(2) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J., (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(3) Crossland N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855-1870.  
(4) Nagel R. Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Bra ­
chydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Eco ­
tox. Environ, Safety, 21, pp, 157-164.
 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biologi ­
cal field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Pu ­
blish, Tokio, Japan.  
(6) Holcombe, G. W,, Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leo ­
nard, E. N. and Johnson, R, D, (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias  
latipes).  Arch, Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287-297.
 
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G, W, and Spehar, R, L, (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka  [Oryzias latipes).  Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
 
(8) Stephan C.E. and Rogers J.W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposi ­
um, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328-338.
 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS l/RM/28, 81 pp.
 
(10) Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
(11) Pack S., (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12 December 1991.
 
(12) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T. (1994). A techni ­
que using sequential feedings of different coloured food to de ­
termine food intake by individual rainbow trout,  Oncorhynchus 
mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 123-133.  
(16) Quinton, J.C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynfhus mykiss.  Journal of Fish Bio ­
logy, 37, pp. 33-41,
 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
 
(18) Bruce, R.D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. 
Chem. 11, pp. 1485-1494.  
(19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. and Mclntyre, D.O. (1989). Preci ­
sion of EPA seven-day fathead minnow larval survival and 
growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 
(American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
 
(20) Norbert-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota, 
Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988, 12 pp.
 
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510-531.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Aanhangsel 1  
AANBEVOLEN VISSOORTEN VOOR DE TEST EN GESCHIKTE TESTOMSTANDIGHEDEN  
Vissoort Aanbevolen bereik 
van de 
testtemperatuur (  o C) Fotoperiode 
(uren) Aanbevolen bereik 
voor begingewicht 
van de vissen 
(g) Aanbevolen 
meetnauwkeurigheid Densiteit 
(g/l) Bezettingsgraad 
(per liter) Voedsel Testduur 
(dagen)  
Aanbevolen vissoorten:  
Oncorhynchus mykiss  
Regenboogforel 12,5-16,0 12-16 1-5 tot op 100 mg 1,2-2,0 4 Droog merkvoer van zalmach ­
tig broedsel ≥ 28 
Andere goed gedocumenteerde 
vissoorten:  
Danio rerio  
Zebravis 21-25 12-16 0,050-0,100 tot op 1 mg 0,2-1,0 5-10 Levend voedsel  (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28 
Oryzias latipes  
Rijstvis (Medaka) 21-25 12-16 0,050-0,100 tot op 1 mg 0,2-1,0 5-20 Levend voedsel  (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28
Aanhangsel 2  
ENKELE CHEMISCHE KENMERKEN VAN GESCHIKT VERDUN ­
NINGSWATER  
Stof Concentraties  
Vaste deeltjes < 20 mg/l 
Totaalgehalte aan organische koolstof < 2 mg/l 
Niet-geïoniseerde ammonia < 1 μg/l 
Restchloorgehalte < 10 μg/1 
Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden < 50 ng/l Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en poly ­
chloorbifenylen < 50 ng/l 
Totaalgehalte aan organisch chloor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
Aanhangsel 3  
Logaritmische reeks concentraties die geschikt zijn voor de toxiciteitstest (9)  
Kolom (aantal concentraties tussen 100 en 10 of tussen 10 en 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Uit de kolom kan een reeks van vijf (of meer) opeenvolgende concentraties worden gekozen. De klassemiddenwaarden tussen de 
concentraties in kolom (x) worden verkregen uit kolom (2x + 1). De waarden in de tabel staan voor concentraties uitgedrukt in 
percentage per volume of in gewicht (mg/l of μg/1). De waarden kunnen waar nodig worden vermenigvuldigd met of gedeeld door 
elke tiende macht. Kolom 1 kan worden gebruikt als er veel onduidelijkheid bestaat over het toxiciteitsniveau.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  VIS, KORTETERMIJN-TOXICITEITSTEST OP EMBRYO ­
NALE EN LARVESTADIA (SAC-FRY)  
1. METHODE  
Deze kortetermijn-toxiciteitstest is overgenomen van OESO TG 212 
(1998).  
1.1. INLEIDING  
Deze kortetermijn-toxiciteitstest op de embryonale en larvestadia van 
de vis is een kortetermijntest waaraan de levensstadia vanaf het pas ­
bevruchte ei tot en met de larvetijd worden blootgesteld. Tijdens de 
test wordt er geen voedsel toegediend. De test moet daarom worden 
beëindigd terwijl de larve zich nog voedt aan de dooierzak.  
Het doel van de test is het bepalen van letale en, tot op zekere 
hoogte, subletale effecten van chemicaliën op de specifieke stadia van de geteste diersoort. De test kan nuttige informatie bieden omdat 
deze a) een brug kan vormen tussen letale en subletale tests, b) kan 
dienen als screeningtest voor een volledige test over de eerste levens ­
fase of voor een chronische-toxiciteitstest en c) kan worden gebruikt voor het testen van vissoorten waarbij de normale technieken die 
worden gebruikt niet voldoende geavanceerd zijn voor het testen 
van de overgangsperiode van endogene tot exogene voeding.
 
Het is belangrijk om te weten dat alleen tests die alle stadia van de 
levenscyclus van een vis omvatten een betrouwbare schatting kunnen 
geven van de chronische toxiciteit van chemicaliën bij vissen. Te ­
vens moet men zich realiseren dat een test die niet alle stadia omvat minder gevoelig is en dat daarmee ook de chronische toxiciteit kan worden onderschat. Daarom wordt verwacht dat de embryo- en lar ­
vetest minder gevoelig is dan een volledige test over de eerste le ­
vensfase, met name ten opzichte van zeer lipofiele chemicaliën (log P
 ow > 4) en chemicaliën met een bepaalde toxische werking. Klei ­
nere verschillen in de gevoeligheid tussen de twee tests zijn echter te 
verwachten bij chemicaliën met een niet-specifieke, narcotische wer ­
king (1).  
Vóór de publicatie van deze test is de meeste ervaring met deze 
embryo- en larvetest opgedaan met de zoetwatervis  Danio rerio  
Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae — algemene naam: ze ­
bravis). Meer gedetailleerde informatie over het uitvoeren van tests met deze vissoort is te vinden in aanhangsel 1. Het gebruik van andere vissoorten waarmee ook ervaring is opgedaan, is echter ook 
toegestaan (tabel 1A en 1B).
 
1.2. DEFINITIES  
Lowest Observed Effect Concentration (LOEC):  de laagste ge ­
teste concentratie van een teststof waarbij de stof een significant effect (p < 0,05) heeft vergeleken met de controlegroep. Alle test ­
concentraties boven de LOEC moeten een schadelijk effect hebben 
dat gelijk is aan of groter is dan de LOEC.
 
No Observed Effect Concentration (NOEC):  de testconcentratie 
direct onder de LOEC.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TEST  
De embryonale en larvestadia van de vis worden blootgesteld aan 
een reeks concentraties van de in water opgeloste teststof. Binnen het protocol kan men kiezen tussen een semi-statische procedure en een 
doorstroomprocedure. De keuze hangt af van het type teststof. De 
test begint met het plaatsen van de bevruchte eitjes in de testkamers en eindigt vlak voordat de dooierzak van welke larve dan ook in een van de testkamers volledig is verbruikt of voordat er sterfte optreedt 
door verhongering in de controlegroep. Vervolgens worden de letale 
of subletale effecten vastgesteld en vergeleken met de controlewaar ­
den zodat de LOEC en NOEC kunnen worden vastgesteld. De ef ­
fecten kunnen ook worden geanalyseerd met een regressiemodel, 
zodat kan worden ingeschat wat de concentratie is die een gegeven procentueel effect kan opleveren (d.w.z. LC/EC
 X , waarbij x een 
bepaald % effect is).  
1.4. GEGEVENS OVER DE TESTSTOF  
Resultaten van een acute toxiciteitstest (zie methode C.1), bij voor ­
keur met dezelfde vissoort als in deze test is gebruikt, moeten be ­
schikbaar zijn. De resultaten kunnen van pas komen bij het selecte ­
ren van de juiste reeks testconcentraties in de test die betrekking heeft op de eerste levensfase. De oplosbaarheid in water (inclusief de oplosbaarheid in testwater) en de dampspanning van de teststof 
moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare, analytische methode, 
met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de stof in de testoplossingen.
 
De gegevens over de teststof die nuttig zijn bij het bepalen van de 
testomstandigheden zijn de structuurformule, de zuiverheid van de 
stof, de stabiliteit van de stof in licht, de stabiliteit onder de test ­
condities, pKa, P  ow en de resultaten van een onderzoek naar de mate 
van gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (zie methode C.4).  
1.5. GELDIGHEID VAN DE TEST  
Een test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt 
voldaan:  
— het totale percentage bevruchte eitjes in de controlegroep en 
eventueel in de bakken met alleen het oplosmiddel dat de test overleeft, moet groter of gelijk zijn aan de minimale percentages in aanhangsel 2 en 3,
 
— het gehalte aan opgeloste zuurstof moet gedurende de gehele test 
tussen 60 % en 100 % van de verzadigingswaarde van lucht 
liggen,  
— het verschil in watertemperatuur tussen de testkamers en tussen 
de opeenvolgende dagen mag op geen enkel moment van de test groter zijn dan ± 1,5
 o C. Tevens mag de watertemperatuur niet 
hoger of lager zijn dan het temperatuurbereik dat voor de vis ­
soort wordt gespecificeerd (aanhangsel 2 en 3).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Testkamers  
Voor de test mogen glazen bakken en bakken van ander chemisch 
inert materiaal worden gebruikt. De grootte van de bakken moet 
geschikt zijn voor de beoogde densiteit (zie punt 1.7.1.2). Het is 
aan te bevelen de testkamers willekeurig in het testgebied te plaatsen. Als er systematische effecten in het laboratorium optreden die kun ­
nen worden beheerst door het gebruik van blokken, verdient een 
willekeurig blokontwerp waarbij in elk blok alle behandelingen 
plaatsvinden de voorkeur boven een compleet willekeurig ontwerp. Als er wordt gebruikgemaakt van blokken, moet hier bij de gege ­
vensanalyse rekening mee worden gehouden. De testkamers moeten 
worden beschermd tegen ongewenste invloeden van buitenaf.
 
1.6.2.  Keuze van de vissoort  
In tabel 1A staan de aanbevolen vissoorten. Dit sluit het gebruik van 
andere vissoorten niet uit (voorbeelden in tabel 1B), maar de test ­
procedure moet wellicht worden aangepast teneinde passende tes ­
tomstandigheden te creëren. Als er wordt gekozen voor een andere vissoort, moet worden aangegeven waarom er voor deze soort is gekozen en tevens worden gerapporteerd welke experimentele me ­
thode wordt toegepast.
 
1.6.3.  Leefomstandigheden van de broedvis  
Meer informatie over de relatief beste leefomstandigheden voor de 
broedvissen vindt u in OESO TG 210 (  1 ) en in de referenties (2)(3) ­
(4)(5)(6).  
1.6.4.  Omgaan met embryo's en larven  
Embryo's en larven kunnen binnen de hoofdbak worden onderver ­
deeld in kleinere bakken die zijn voorzien van gaaswanden waardoor de testoplossing vrij door de hoofdbak kan stromen. Een niet-turbu ­
lente stroming in deze kleine bakken kan worden verkregen door 
deze aan een arm te hangen die ze op en neer beweegt en tegelijker ­
tijd de organismen onder water houdt. Ook kan worden gebruikge ­
maakt van een sifonspoelsysteem. Bevruchte eitjes van zalmachtigen kunnen op een rek of gaas worden gelegd met gaten die zo groot zijn 
dat de larven, nadat ze zijn uitgekomen, er doorheen kunnen vallen. 
In semi-statische tests waarbij de organismen dagelijks moeten wor ­
den overgeplaatst, kan bij het verwijderen van embryo's en larven het best gebruik worden gemaakt van pasteurpipetten (zie paragraaf 
1.6.6).
 
Indien er eihouders, roosters of gaaswerken zijn gebruikt om de 
eitjes in de hoofdbak op hun plaats te houden, moeten deze worden verwijderd zodra de larven uitkomen (
 1 ). Stukken gaas die voor ­
komen dat vissen ontsnappen, mogen niet worden verwijderd. Als 
larven moeten worden overgeplaatst, mogen ze niet worden bloot ­
gesteld aan lucht en mogen er geen netten worden gebruikt om de 
vissen uit de eihouders te halen (deze waarschuwing is mogelijk niet 
van toepassing op sommige minder fragiele vissoorten, zoals de karper). Het moment van overplaatsing is afhankelijk van de vis ­
soort. Soms is overplaatsing niet nodig. Voor de semistatische tech ­
niek mogen bekers of lage bakjes worden gebruikt. Indien nodig 
worden de bekers vlak boven de bodem voorzien van een stukje gaas. Als het volume van deze bakjes voldoet aan de densiteitver ­
eisten (zie 1.7.1.2), is het overplaatsen van de embryo's of larven 
mogelijk niet nodig.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.
 1.6.5.  Water  
Water dat voldoet aan de chemische kenmerken van geschikt ver ­
dunningswater zoals vermeld in aanhangsel 4 en waarin de gekozen vissoort minstens zo goed kan overleven als in het water dat wordt 
beschreven in de aanhangsels 2 en 3, is geschikt als testwater. Ge ­
durende de testperiode moet de waterkwaliteit constant zijn. De pH- waarde mag niet meer dan ± 0,5 pH-eenheden schommelen. Om ervoor te zorgen dat het verdunningswater de testresultaten niet noe ­
menswaardig beïnvloedt (bijvoorbeeld door complexvorming met de 
teststof) en geen ongunstige invloed heeft op de conditie van de broedvissen, moeten regelmatig monsters worden genomen en ge ­
analyseerd. Zware metalen (bijvoorbeeld Cu, Pb, Zn, Hg, Cd en 
Ni), de belangrijkste anionen en kationen (bijvoorbeeld Ca, Mg, Na, K, Cl en SO
 4 ), bestrijdingsmiddelen (bijvoorbeeld totaalgehalte 
aan organo-fosfor-pesticiden en totaalgehalte aan organochloor-pes ­
ticiden) en het totaalgehalte aan organische koolstof en zwevende 
deeltjes moeten bijvoorbeeld om de drie maanden worden bepaald als van het verdunningswater bekend is dat het een relatief constante kwaliteit heeft. Indien is aangetoond dat de waterkwaliteit gedurende 
ten minste één jaar constant blijft, zijn minder frequente bepalingen 
en langere intervallen (bijvoorbeeld zes maanden) toelaatbaar.
 
1.6.6.  Testoplossingen  
De testoplossingen met de gekozen concentraties worden bereid door 
verdunning van een stamoplossing.  
De stamoplossing wordt bij voorkeur bereid door eenvoudig mengen 
en schudden van de teststof in het verdunningswater met mecha ­
nische middelen (bijvoorbeeld door te roeren of met ultrasone tril ­
lingen). Voor het maken van een stamoplossing van een passende 
concentratie kunnen verzadigingskolommen (oplosbaarheidskolom ­
men) worden gebruikt. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeer ­
middelen (ontsluitingsmiddelen) verdient geen aanbeveling; niette ­
min kan dit in bepaalde gevallen nodig zijn om een stamoplossing 
van een passende concentratie te verkrijgen. Voorbeelden van pas ­
sende oplosmiddelen zijn ethanol, methanol, dimethyl-formamide en triethyleenglycol. Voorbeelden van passende dispergeermiddelen zijn Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose en HCO- 
40. Als gemakkelijk biologisch afbreekbare agentia (bijvoorbeeld 
aceton) en/of zeer vluchtige stoffen worden gebruikt, moet worden gewaakt voor problemen die zich als gevolg van bacteriegroei in de 
doorstroomtests kunnen voordoen. Indien wordt gebruikgemaakt van 
een ontsluitingsmiddel, mag dit geen grote invloed hebben op de overlevingskansen en geen zichtbaar negatief effect hebben op de vroege levensstadia, hetgeen blijkt uit de controle met uitsluitend 
oplosmiddel. Het gebruik van deze stoffen moet echter te allen tijde 
zoveel mogelijk worden vermeden.
 
Voor de semistatische techniek kunnen twee verschillende verver ­
singsprocedures worden toegepast; i) er worden nieuwe testoplossin ­
gen bereid in schone bakken en levende eitjes en larven worden in 
een kleine hoeveelheid oude oplossing voorzichtig naar de nieuwe schone bakken overgeplaatst waarbij blootstelling aan lucht moet worden vermeden, of ii) de organismen blijven in de bakken terwijl 
een deel van het testwater (minimaal driekwart) wordt ververst. De 
verversingsfrequentie hangt af van de stabiliteit van de teststof, maar dagelijks verversen van water wordt aanbevolen. Als uit eerdere stabiliteitstests (zie punt 1.4) blijkt dat de concentratie van de teststof 
gedurende de verversingsperiode niet stabiel blijft (d.w.z. buiten 80- 
120 % van de nominale concentratie valt of onder 80 % van de gemeten oorspronkelijke concentratie), moet worden overwogen om over te gaan op een doorstroomtest. In elk geval moet erop worden 
toegezien dat de larven tijdens de verversingsprocedure geen stress 
ondervinden.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Voor doorstroomtests is een systeem vereist dat de stamoplossing 
van de teststof continu verdeelt en verdunt en ervoor zorgt dat de 
testkamers de juiste testconcentratie krijgen toegediend (bijvoorbeeld met een doseerpomp, mechanisme voor evenredige verdunning of saturatorsysteem). De stroomsnelheid van de stamoplossingen en 
het verdunningswater moet regelmatig, bij voorkeur dagelijks, wor ­
den gecontroleerd en mag gedurende de gehele test hooguit 10 % afwijken. Een stroomsnelheid die overeenkomt met ten minste vijf testkamervolumes per 24 uur is wenselijk (2).
 
1.7. PROCEDURE  
Voor informatie over de resultaten van de toxiciteitstest met visem ­
bryo's en -larven kunt u de bestaande literatuur raadplegen. De lite ­
ratuurlijst van deze tekst bevat enkele voorbeelden (7) (8) (9).  
1.7.1.  Blootstellingsomstandigheden  
1.7.1.1.  Duur  
De test moet bij voorkeur worden gestart binnen 30 minuten na de 
bevruchting van de eitjes. De embryo's worden in de testoplossing geplaatst vóór, of zo snel mogelijk na, het begin van het blastodis ­
cus-stadium en altijd vóór het begin van het gastrulastadium. Als de 
eitjes afkomstig zijn van een commerciële leverancier, is het niet altijd mogelijk de test direct na de bevruchting te starten. Omdat de gevoeligheid van de test sterk kan worden beïnvloed door het 
uitstellen van de start, moet de test binnen 8 uur na de bevruchting 
worden gestart. Omdat de larven gedurende de periode van bloot ­
stelling niet worden gevoederd, moet de test worden beëindigd voor ­
dat een van de larven, ongeacht in welke testkamer, de dooierzak 
volledig heeft verbruikt of voordat er sterfte door verhongering op ­
treedt binnen de controlegroep. De duur hangt af van de vissoort die wordt gebruikt. In aanhangsel 2 en 3 wordt voor een aantal vissoor ­
ten de aanbevolen testduur biologisch vermeld.
 
1.7.1.2.  Densiteit  
Het aantal bevruchte eitjes aan het begin van de test moet toereikend 
zijn om te kunnen voldoen aan de statistische vereisten. De eitjes 
moeten willekeurig worden verdeeld over de verschillende behan ­
delingen. Daarbij moeten minimaal 30 bevruchte eitjes, gelijk of 
zo gelijk mogelijk (bij bepaalde vissoorten is het namelijk moeilijk 
om een gelijk aantal per groep te verkrijgen) over ten minste drie replicaattestkamers verdeeld, per concentratie worden gebruikt. De densiteit (biomassa per volume testoplossing) moet zo laag zijn dat 
het gehalte aan opgeloste zuurstof van minimaal 60 % van de lucht ­
verzadigingswaarde zonder beluchting in stand kan worden gehou ­
den. Bij doorstroomtests wordt een densiteit van maximaal 0,5 g/l per 24 uur en maximaal 5 g/l oplossing op een willekeurig moment 
(2) aanbevolen.
 
1.7.1.3.  Licht en temperatuur  
De fotoperiode en testwatertemperatuur moeten worden afgestemd 
op de gekozen vissoort (aanhangsel 2 en 3). Gebruik voor het con ­
troleren van de temperatuur desgewenst een extra testbak.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Testconcentraties  
Normaliter zijn er vijf concentraties van de teststof nodig die een 
constante factor van maximaal 3,2 van elkaar verschillen. Bij het selecteren van de reeks concentraties moet rekening worden gehou ­
den met de curve van LC
 50 tegen blootstellingsperiode tijdens het 
acute toxiciteitsonderzoek. In bepaalde situaties mogen minder dan vijf concentraties worden gebruikt, bijvoorbeeld bij een limiettest, en kan het interval tussen de concentraties worden verkort. Als er min ­
der dan vijf concentraties worden gebruikt, moet hiervoor een gel ­
dige reden worden gegeven. Er mogen geen concentraties van de stof worden gebruikt die hoger zijn dan de LC
 50 over 96 uur of, indien 
dit lager is, 100 mg/l. Tevens mogen stoffen niet boven hun oplos ­
baarheidsgrens in het testwater worden getest.  
Als een ontsluitingsmiddel wordt gebruikt bij het maken van testop ­
lossingen (zie punt 1.6.6), mag de uiteindelijke concentratie hiervan in de testbakken niet groter zijn dan 0,1 ml/l en moet de concentratie 
in alle bakken gelijk zijn.
 
1.7.3.  Controles  
Naast de testreeks moet er een controlegroep worden behandeld met 
alleen het verdunningswater (eventueel met replicaat) en, indien van toepassing, een controlegreep met water waaraan het ontsluitings ­
middel is toegevoegd (eventueel met replicaat).
 
1.7.4.  Frequentie van de analytische bepalingen en metingen  
Tijdens de test worden de concentraties van de teststoffen regelmatig 
gemeten.  
In semistatische tests waarbij wordt verwacht dat de concentratie van 
de teststof binnen ± 20 % van de nominale concentratie blijft (d.w.z. binnen het interval van 80-120 %; zie punt 1.4 en 1.6.6), is het 
raadzaam om in elk geval de hoogste en laagste testconcentraties 
te analyseren. Doe dit vlak na het bereiden van de oplossing en vlak vóór het verversen, en ten minste drie keer, verspreid over de test (d.w.z. dat monsters van dezelfde oplossing moeten worden 
geanalyseerd — vlak na het bereiden van de oplossing en vlak 
vóór het verversen).
 
Bij tests waarbij niet wordt verwacht dat de concentratie van de 
teststof binnen ± 20 % van de nominale concentratie blijft (op basis 
van stabiliteitsgegevens van de stof), moeten alle testconcentraties 
worden geanalyseerd. Doe dit vlak na het bereiden en vlak vóór het verversen en volgens dezelfde procedure als hierboven (d.w.z. ten minste drie keer, verspreid over de test). Deze bepaling van de 
concentratie van de teststof vóór het verversen van de oplossing 
hoeft voor elke testconcentratie slechts bij de oplossing van één replicaatbak te gebeuren. Het interval tussen deze metingen mag niet meer dan zeven dagen bedragen. Het is wenselijk de resultaten 
te baseren op gemeten concentraties. Als echter kan worden aange ­
toond dat de concentratie van de teststof in de oplossing gedurende de gehele test binnen ± 20 % van de nominale of de gemeten oor ­
spronkelijke concentratie is gebleven, mogen de resultaten worden 
gebaseerd op de nominale of gemeten oorspronkelijke waarden.
 
Bij doorstroomtests is een soortgelijke procedure als hierboven van 
toepassing (maar de meting van „oude” oplossingen is niet van toepassing). Als de testduur echter langer is dan zeven dagen, is het mogelijk verstandig het aantal monsternemingen tijdens de eerste 
week te verhogen (bijvoorbeeld drie meetreeksen), zodat men zeker 
weet dat de testconcentraties stabiel blijven.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Monsters moeten mogelijk worden gecentrifugeerd of gefilterd (bij ­
voorbeeld met een 0,45 μm poriëngrootte). Omdat echter kennelijk 
noch centrifugatie noch filtratie een volledige scheiding van de bio ­
logisch beschikbare en de biologisch niet-beschikbare fractie van de teststof garandeert, kunnen deze behandelingen wellicht niet altijd op 
de monsters worden toegepast.
 
In de loop van de test moet het gehalte aan opgeloste zuurstof, de 
pH en de temperatuur in alle testbakken worden gemeten. De totale hardheid en (voorzover relevant) het zoutgehalte moeten worden gemeten in de bakken met de controlegroepen en in één bak met 
de hoogste concentratie teststof. Het zuurstofgehalte en (voorzover 
relevant) het zoutgehalte moeten tijdens de test ten minste drie keer worden gemeten (aan het begin, omstreeks het midden en aan het eind). Bij semi-statische tests is het raadzaam het opgeloste zuur ­
stofgehalte vaker te meten, bij voorkeur voor en na elke waterver ­
versing of minimaal één keer per week. De pH moet bij semistati ­
sche tests voor en na elke waterverversing worden gemeten en bij 
doorstroomtests minimaal één keer per week. De hardheid moet 
gedurende de test eenmaal worden gemeten. De temperatuur moet dagelijks worden gemeten en bij voorkeur in één testbak continu worden gecontroleerd.
 
1.7.5.  Waarnemingen  
1.7.5.1.  Stadium van embryonale ontwikkeling  
Het embryonale stadium (d.w.z. het gastrulastadium) bij het begin 
van de blootstelling aan de teststof moet zo nauwkeurig mogelijk worden vastgesteld. Hiervoor kan een representatief monster van eitjes worden gebruikt die afdoende zijn gefixeerd en geklaard. 
Voor een beschrijving en afbeeldingen van de embryonale stadia 
kan ook de literatuur worden geraadpleegd (2) (5) (10) (11).
 
1.7.5.2.  Uitkomen en overleven  
Minimaal één keer per dag moet uitkomen en overleven worden 
geobserveerd en de aantallen geregistreerd. Het is mogelijk wenselijk om aan het begin van de test vaker te kijken (bijvoorbeeld elke 
30 minuten gedurende de eerste drie uur), omdat in sommige geval ­
len de overlevingstijden relevanter zijn dan het aantal dode diertjes (bijvoorbeeld als er sprake is van acute toxische effecten). Dode embryo's en larven moeten direct nadat ze worden opgemerkt, wor ­
den verwijderd, omdat ze snel kunnen ontbinden. Het verwijderen 
van dode organismen moet zeer voorzichtig gebeuren om aanstoten en beschadigen van naastgelegen eitjes/larven te voorkomen. Deze zijn namelijk uitermate fragiel en gevoelig. De criteria voor „dood” 
variëren per stadium:
 
— eitjes:  met name in de eerste stadia duidelijk minder doorzichtig 
en een verandering van kleur als gevolg van coagulatie en/of precipitatie van proteïne, hetgeen resulteert in een wit ondoor ­
schijnend uiterlijk;
 
— embryo's:  geen embryonale beweging en/of geen hartslag en/of 
ontkleuring en afname van doorzichtigheid bij soorten die als embryo gewoonlijk doorzichtig zijn;
 
— larven:  onbeweeglijkheid en/of geen ademhaling en/of geen hart ­
slag en/of witte ondoorschijnende kleur van het centrale zenuw ­
stelsel en/of geen reactie op een mechanische prikkel.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Afwijkend uiterlijk  
Het aantal larven met een afwijkende lichaamsvorm en/of pigmen ­
tatie en de fase van het verbruik van de dooierzak moeten regelma ­
tig, afhankelijk van de duur van de test en de aard van de afwijking, 
worden gerapporteerd. Embryo's en larven met een afwijking kunnen 
van nature voorkomen en bij sommige vissoorten kan het aantal oplopen tot enkele procenten van de controlegroep(en). Dieren met een afwijking mogen alleen uit de testbakken worden verwijderd als 
ze dood zijn.
 
1.7.5.4.  Afwijkend gedrag  
Afwijkingen, zoals hyperventilatie, ongecoördineerd zwemmen en 
atypische onbeweeglijkheid, moeten regelmatig, afhankelijk van de 
duur van de test, worden gerapporteerd. Hoewel het moeilijk is deze effecten te kwantificeren, kunnen ze (indien waargenomen) helpen bij de interpretatie van de sterftecijfers doordat ze informatie geven 
over de toxische werking van de teststof.
 
1.7.5.5.  Lengte  
Het is wenselijk om aan het eind van de test de lengte van elk 
organisme te meten. Hierbij kunnen de standaardlengte, de vork ­
lengte en de totale lengte worden gemeten. Als er echter vinrot in 
de staart of vinerosie is opgetreden, moet de standaardlengte worden gemeten. Over het algemeen moet de variatiecoëfficiënt voor de lengte van replicaatorganismen in de controlegroepen van een goed 
uitgevoerde test ≤ 20 % zijn.
 
1.7.5.6.  Gewicht  
Aan het eind van de test kan van elk organisme het gewicht worden 
gemeten; het droge gewicht (24 uur bij 60  o C) heeft de voorkeur 
boven het natte gewicht (drooggedept). Over het algemeen moet de 
variatiecoëfficiënt voor het gewicht van replicaatorganismen in de controlegroepen van een goed uitgevoerde test ≤ 20 % zijn.
 
Deze waarnemingen resulteren in de volgende gegevens die alle voor 
een deel kunnen worden gebruikt voor een statistische analyse:  
— cumulatieve sterfte,  
— aantal gezonde larven aan het eind van de test,  
— tijd van begin uitkomen eitjes tot eind uitkomen eitjes (d.w.z. 
90 % van de eitjes in elke replicaatbak),  
— aantal larven dat per dag uitkomt,  
— lengte (en gewicht) van overlevende organismen aan eind van de 
test, 
— aantal larven dat misvormd is of een afwijking vertoont.  
— aantal larven dat afwijkend gedrag vertoont.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. BEWERKING VAN DE RESULTATEN  
Het is wenselijk om bij de opzet en analyse van de test een statis ­
ticus te betrekken omdat de methode een aanzienlijke variatie in de 
opzet van het experiment toelaat, bijvoorbeeld in het aantal test ­
kamers, het aantal testconcentraties, het oorspronkelijk aantal be ­
vruchte eitjes en de gemeten parameters. Gezien de beschikbare opties in de opzet van de test, worden hier geen richtlijnen voor 
de statistische procedures gegeven.
 
Als de LOEC/NOEC wordt bepaald, moet de variatie binnen elke set 
replicaatbakken worden geanalyseerd met behulp van ANOVA (va ­
riantie-analyse) of kruistabellen. Bij het maken van een meervoudige vergelijking tussen de resultaten van de afzonderlijke concentraties en de resultaten van de controlegroepen, komt de methode van 
Dunnett mogelijk goed van pas (12) (13). Er zijn ook andere bruik ­
bare methoden beschikbaar (14) (15). De omvang van het effect dat met ANOVA of een andere methode kan worden wordt vastgesteld, (d.w.z. het onderscheidingsvermogen van de test) moet worden be ­
rekend en gerapporteerd. Overigens zijn niet alle waarnemingen die 
worden vermeld in punt 1.7.5.6 geschikt voor statistische analyse met ANOVA. De cumulatieve sterfte en het aantal gezonde larven aan het eind van de test kunnen bijvoorbeeld worden geanalyseerd 
met probitmethoden.
 
Als de LC/EC  x wordt bepaald, moet er een geschikte curve (of 
meerdere curven), zoals de logistische curve, worden bepaald voor 
de gegevens met behulp van een statistische methode, zoals de 
kleinste kwadratenmethode of de niet-lineaire kleinste kwadraten ­
methode. De curven moeten worden geparametriseerd zodat LC/EC  x 
en de standaardafwijking direct kunnen worden bepaald. Hierdoor 
wordt het berekenen van de betrouwbaarheidsgrenzen van de LC/ ­
EC x een stuk eenvoudiger. Tenzij er goede redenen zijn om andere 
betrouwbaarheidsniveaus te hanteren, moet een betrouwbaarheid van 
95 % aan beide zijden worden aangehouden. De passingsprocedure 
moet bij voorkeur een middel bieden waarmee de significantie van de mate waarin de curve niet past, kan worden berekend. Voor het maken van de curven kunnen grafische methoden worden gebruikt. 
Regressieanalyse is geschikt voor alle waarnemingen in punt 1.7.5.6.
 
2.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
De resultaten moeten met de nodige omzichtigheid worden geïnter ­
preteerd als de gemeten toxische concentraties in de testoplossingen in de buurt liggen van de detectie van de analysemethode. De resul ­
taten voor concentraties die de oplosbaarheidsgrens van de teststof in 
water overschrijden, moeten ook voorzichtig worden geïnterpreteerd.
 
2.3. TESTRAPPORT  
In het testrapport moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
2.3.1.  Teststof:  
— fysiek voorkomen en relevante fysisch-chemische kenmerken,  
— chemische identificatiegegevens, voorzover relevant met inbegrip 
van de zuiverheid en de analysemethode voor het bepalen van de 
hoeveelheid van de teststof.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Diersoort:  
— wetenschappelijke naam, stam, aantal moedervissen (d.w.z. het 
aantal vrouwtjes dat werd gebruikt voor het produceren van het benodigde aantal eitjes in de test), herkomst en de methode 
waarop de bevruchte eitjes werden verzameld en vervolgens wer ­
den behandeld.
 
2.3.3.  Testomstandigheden  
— toegepaste testprocedure (bijvoorbeeld semi-statische test of 
doorstroomtest, tijdsduur vanaf bevruchting tot start van de test, 
densiteit, enz.),  
— fotoperiode(n),  
— testopzet (bijvoorbeeld het aantal testkamers en replicaten, het 
aantal embryo's per replicaat),  
— wijze waarop de stamoplossingen werden bereid en verversings ­
frequentie (indien een ontsluitingsmiddel is gebruikt, moeten de aard en de concentratie daarvan worden vermeld),
 
— de nominale testconcentraties, de in de testbakken gemeten waar ­
den met gemiddelden en standaardafwijkingen en de methode 
waarmee zij zijn bepaald, en, indien de teststof bij een lagere concentratie dan in de testsituatie oplosbaar is in water, moet worden aangetoond dat de metingen betrekking hebben op de 
concentraties van de stof in de testoplossing,
 
— kenmerken van het verdunningswater; pH, hardheid, temperatuur, 
gehalte aan opgeloste zuurstof, residueel chloorgehalte (indien gemeten), totale hoeveelheid organische koolstof (TOC), zwe ­
vende deeltjes, zoutgehalte van het testmedium (indien gemeten), 
alsmede de resultaten van eventuele andere metingen,
 
— waterkwaliteit in de testbakken: pH, hardheid, temperatuur en 
gehalte aan opgeloste zuurstof.  
2.3.4.  Resultaten:  
— resultaten van eventuele voorbereidende onderzoeken naar de 
stabiliteit van de teststof,  
— gegevens waaruit blijkt dat de totale overleving in de contro ­
legroepen voldeed aan de aanvaardbaarheidsnorm voor het ge ­
bruikte proefdier (aanhangsel 2 en 3),  
— gegevens over de sterfte/overleving tijdens de embryonale en 
larvestadia en de totale sterfte/overleving,  
— aantal dagen waarbinnen de eitjes zijn uitgekomen en aantal uit ­
gekomen eitjes,  
— gegevens over lengte (en gewicht),  
— gevallen en beschrijving van morfologische afwijkingen (indien 
aanwezig),  
— gevallen en beschrijving van effecten op het gedrag (indien aan ­
wezig),  
— statistische analyse en verwerking van de gegevens,  
— bij tests die zijn geanalyseerd met ANOVA, de LOEC bij p = 
0,05 en de NOEC voor elke reactie die is vastgesteld, met in ­
begrip van een beschrijving van de statistische procedures die 
zijn gebruikt en een indicatie van de omvang van het waar te 
nemen effect,  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— bij tests die zijn geanalyseerd met regressietechnieken, de LC/ ­
EC X en betrouwbaarheidsintervallen, en een grafiek van het aan ­
gepaste model dat werd gebruikt voor de berekening,  
— beweegredenen voor eventuele afwijkingen van deze testmethode.  
3. REFERENTIES  
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, 60 pp. June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
 
(3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and Cul ­
ture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Chan ­
nel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
 
(4) Brungs W.A. and Jones B.R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological 
Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.  
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  
(Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature Re ­
view. J. Biol. 10, pp. 121-173.  
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.  
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxi ­
city Test with Zebrafish  (Brachydanio rerio)  Using Chromium 
and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Che ­
mistry, 6, pp. 61-71.  
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining 
the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807-821.
 
(9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Com ­
pounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout  (Salmo 
gairdneri).  J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.  
(10) Kirchen R.V. and W.R. West (1969). Teleostean Development. 
Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Com ­
pany.  
(11) Kirchen R.V. and W.R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Com ­
pany, North Carolina. 36 pp.  
(12) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G. (1980). Statis ­
tical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings 
of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 
1/RM/28, December 1992, 81 pp.
 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, pp. 126-134.  
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogene ­
tic position of the Zebrafish  (Danio rerio),  a model system in 
developmental biology — an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 
231-236.
 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and En ­
vironmental Safety 32, pp. 19-28.
 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Meda ­
ka, Oryzias latipes.  EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, 
EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka,  (Oryzias latipes).  EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre D.O., Poccocic T.L, 
Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D. (1991). Vali ­
dity in the performance of the seven-day Fathead minnow  
(Pimephales promelas)  larval survival and growth test: an in ­
tra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 
1189-1203.  
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.  
(24) Balon E.K. (1985). Early life history of fishes: New devel ­
opmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
 
(25) Blaxter J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W.S. Hoar and D.J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academie press, pp. 1-58.
 
Tabel 1A  
Aanbevolen vissoorten voor de test  
Zoetwatervissen  
Oncorhynchus mykiss  
Regenboogforel (9) (16)  
Danio rerio  
Zebravis (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Karper (8) (19)  
Oryzias latipes  
Japanse rijstvis/Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
„Fathead minnow” (8) (22)  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabel 1B  
Voorbeelden van andere goed gedocumenteerde vissoorten die al eens zijn gebruikt  
Zoetwatervissen Zoutwatervissen  
Carassius auratus  
Goudvis (8)  Menidia peninsulae  
„Tidewater silverside” (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
Zonnebaars (8)  Clupea harengus  
Haring (24) (25)  
Gadus morhua  
Kabeljauw (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
Edelsteen tandkarper (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
Aanhangsel 1  
RICHTLIJNEN BIJ HET UITVOEREN VAN EEN TOXICITEITSTEST 
MET EMBRYO'S EN LARVEN (SAC-FRY) VAN DE ZEBRAVIS  
(BRACHYDANIO RERIO)  
INLEIDING  
De zebravis komt oorspronkelijk voor in de snelstromende rivieren in het gebied 
van de kust van Coromandel in India. De vis wordt vaak gebruikt in aquaria en behoort tot de karperachtigen. Voor informatie over het kweken en verzorgen van zebravissen kunnen de standaardnaslagwerken over tropische vissen worden ge ­
raadpleegd. De biologie van de vis en zijn gebruik in visserijonderzoek is bestu ­
deerd door Laale (1).
 
De vis wordt zelden langer dan 45 mm. De romp is cilindrisch en heeft 7-9 
donkerblauwe, horizontale, zilverachtige strepen. Deze strepen lopen tot aan de anale en staartvinnen. De rug is olijfgroen. De mannetjes zijn dunner dan de 
vrouwtjes. De vrouwtjes zijn zilveriger en hebben een opgezwollen buik, met 
name vlak voor het kuitschieten.
 
De volwassen vissen zijn bestand tegen grote schommelingen in de temperatuur, 
pH en hardheid. Om de vissen echter gezond te houden, zodat de eitjes die worden geproduceerd van goede kwaliteit zijn, moeten optimale omstandigheden 
worden gecreëerd.
 
Bij het kuitschieten wordt het vrouwtje door het mannetje achtervolgd en aange ­
stoten. Zodra de eitjes worden uitgestoten, worden ze bevrucht. De eitjes, die doorzichtig en niet-klevend zijn, vallen op de bodem, waar ze soms door de ouders worden opgegeten. Het kuitschieten wordt beïnvloed door licht. Als er 's 
ochtends voldoende licht is, vindt het kuitschieten gewoonlijk in de eerste uren 
na zonsopgang plaats.
 
Een vrouwtje kan met tussenpozen van een week wel honderden eitjes per keer 
produceren.  
LEEFOMSTANDIGHEDEN VAN DE OUDERVISSEN, REPRODUCTIE EN 
VROEGE LEVENSSTADIA  
Selecteer een geschikt aantal gezonde vissen en plaats deze ten minste twee 
weken voor het geplande kuitschieten in het juiste water (zie aanhangsel 4). De vissen moeten zich minimaal eenmaal hebben voortgeplant voordat ze de eitjes produceren die voor de test worden gebruikt. De dichtheid van de vissen 
mag in deze periode niet groter zijn dan 1 gram vis per liter. Als het water 
regelmatig wordt ververst of er wordt gebruikgemaakt van zuiveringssystemen, is het mogelijk de dichtheid te verhogen. In de bakken moet een temperatuur van 25 ± 2
 o C worden gehandhaafd. De vissen moeten gevarieerd voedsel krijgen, 
bijvoorbeeld geschikt commercieel verkrijgbaar droogvoer, pas uitgekomen art ­
hemia, chironomiden, daphnia en enchytreeën.  
Hieronder worden twee procedures beschreven. In het verleden hebben deze 
geleid tot een groep gezonde bevruchte eitjes, die groot genoeg was om er een test mee uit te voeren.
 
i) Acht vrouwtjes en zestien mannetjes worden in een aquarium met 50 liter 
verdunningswater geplaatst. Ze worden afgeschermd van direct licht en mini ­
maal 48 uur zo min mogelijk gestoord. Op de middag vóór de dag dat de test van start gaat, wordt onderin het aquarium een kuitbak geplaatst. Deze bestaat uit een frame (plexiglas of ander geschikt materiaal) van 5-7 cm hoog met een 
grof net van 2-5 mm bovenin en een fijn net van 10-30 μg onderin. Aan het 
grove net van het frame wordt een aantal „kuitbomen” bevestigd. Deze zijn gemaakt van uit nylon touw dat is losgedraaid. Nadat de vissen 12 uur in het donker hebben doorgebracht, wordt er een zwak licht aangedaan waarna het 
kuitschieten op gang komt. Twee tot vier uur na het kuitschieten, wordt de 
kuitbak verwijderd en worden de eitjes verzameld. De kuitbak zorgt ervoor dat de vissen de eitjes niet kunnen opeten en dat de eitjes gemakkelijk kunnen worden verzameld. De groep vissen moet zich al minimaal eenmaal hebben 
voortgeplant voordat de eitjes worden geproduceerd die voor de test worden 
gebruikt.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Vijf tot tien vrouwtjes- en mannetjesvissen worden minimaal twee weken 
voor het geplande kuitschieten in aparte bakken ondergebracht. Na 5-10 
dagen zijn de buikjes van de vrouwtjes opgezwollen en zijn hun genitale papillen zichtbaar. Bij mannetjesvissen ontbreken deze. Het kuitschieten vindt plaats in een speciaal aquarium dat onderin is voorzien van een gaaswerk (zie 
boven). Het aquarium wordt tot 5-10 cm boven dit gaaswerk gevuld met 
verdunningswater. Op de dag voordat het kuitschieten moet plaatsvinden, worden er één vrouwtje en twee mannetjes in geplaatst. De watertemperatuur wordt geleidelijk verhoogd totdat het water één graad warmer is dan de 
acclimatiseringstemperatuur. Het licht wordt gedoofd en het aquarium moet 
vervolgens zoveel mogelijk met rust worden gelaten. 's Ochtends wordt er een zwak licht aangedaan waarna het kuitschieten op gang komt. Na 2-4 uur worden de vissen verwijderd en de eitjes verzameld. Als er meer eitjes nodig 
zijn dan het aantal dat één vrouwtje kan produceren, kunnen er meerdere 
aquaria tegelijk worden gebruikt. Als vóór de test wordt vastgelegd wat de voortplantingsresultaten van de afzonderlijk vrouwtjes zijn (aantal eitjes en kwaliteit), kunnen de vrouwtjes die het hoogst scoren, worden gebruikt voor 
het kuitschieten.
 
De eitjes moeten in glazen zuigbuisjes (inwendige diameter minimaal 4 mm) met 
een flexibele ballon worden overgeplaatst naar de testbakken. De hoeveelheid water waarin de eitjes worden vervoerd moet zo klein mogelijk zijn. De eitjes 
zijn zwaarder dan water en zakken uit het buisje. Zorg ervoor dat de eitjes (en 
larven) niet in contact komen met lucht. Om er zeker van te zijn dat er zich in de eerste ontwikkelingsstadia geen onregelmatigheden voordoen, moet er een micro ­
scopisch onderzoek worden verricht op een monster (of meerdere monsters) van 
de eitjes. De eitjes mogen niet worden gedesinfecteerd.
 
Het sterftecijfer onder de eitjes is het hoogst binnen 24 uur na de bevruchting. In 
deze periode is een sterfte van 5-40 % niet uitzonderlijk. Eitjes sterven af door een mislukte bevruchting of door stoornissen in de ontwikkeling. De kwaliteit van de eitjes lijkt afhankelijk te zijn van de vrouwtjesvis die ze heeft geprodu ­
ceerd. Sommige vrouwtjes produceren namelijk altijd eitjes van een goede kwa ­
liteit en andere nooit. Ook het ontwikkelingstempo en de snelheid waarmee de eitjes uitkomen, verschillen per groep eitjes. De eitjes die met succes zijn be ­
vrucht en de larven hebben hoge overlevingskansen, gewoonlijk 90 % of hoger. 
Bij 25
 o C komen de eitjes 3-5 dagen na de bevruchting uit. De dooierzak is 
ongeveer 13 dagen na de bevruchting volledig verbruikt.  
De ontwikkeling van het embryo is goed beschreven door Hisaoka en Battle (2). 
Doordat de eitjes en de uitgekomen larven doorzichtig zijn, kan de ontwikkeling 
van de vis worden gevolgd en kunnen misvormingen worden waargenomen. 
Ongeveer 4 uur na kuitschieten, kunnen de niet-bevruchte eitjes worden onder ­
scheiden van de bevruchte eitjes (3). Om dit te kunnen zien, worden de eitjes en larven in een kleine testbak geplaatst en bestudeerd onder een microscoop.
 
De testomstandigheden voor de vroege levensstadia worden genoemd in aan ­
hangsel 2. De optimale waarden voor de pH en de hardheid van het verdunnings ­
water zijn respectievelijk 7,8 en 250 mg CaCO  3 /l. 
BEREKENINGEN EN STATISTIEKEN  
Hiervoor wordt een tweefasige aanpak aanbevolen. Eerst worden de gegevens 
over sterfte, abnormale ontwikkeling en de duur van het uitkomen van de eitjes statistisch geanalyseerd. Vervolgens wordt in concentraties waarbij geen nega ­
tieve effecten op een van deze parameters werd geconstateerd, de lengte van de 
visjes statistisch bepaald. Deze aanpak wordt aanbevolen omdat de stof selectief 
kleinere visjes kan doden, de duur van het uitkomen kan vertragen en zware misvormingen kan veroorzaken, waardoor de lengtemetingen een vertekend beeld kunnen geven. Bovendien wordt er per behandeling ongeveer hetzelfde aantal 
vissen gemeten en kan zodoende de betrouwbaarheid van de teststatistieken 
worden gegarandeerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
BEPALEN VAN LC  50 EN EC  50 
Het percentage overlevende eitjes en larven wordt berekend en gecorrigeerd voor 
de sterfte in de controlegroepen volgens de formule van Abbott (4):  
P ¼ 100 Ä Í C Ä P 0 
C Ü 100 Î 
waarbij  
P = gecorrigeerd % overleving  
P' = % overleving waargenomen bij testconcentratie  
C = % overleving in controlegroep  
Indien mogelijk wordt aan het eind van de test met een passende methode de 
LC 50 bepaald.  
Als het wenselijk is ook de morfologische afwijkingen in de statistische EC  50 op 
te nemen, kan hiervoor Stephan (5) worden geraadpleegd.  
VASTSTELLEN VAN DE LOEC EN NOEC  
Eén doel van een embryo- en larvetest is de testgroepen te vergelijken met de 
controlegroep, d.w.z. het bepalen van de LOEC. Hiertoe moeten verschillende vergelijkingsprocedures worden toegepast (6) (7) (8) (9) (10).
 
REFERENTIES  
(1) Laale H.W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121- 
173. 
(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, pp. 173-181.  
(4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1-333.  
(5) Stephan C.E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 
766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, pp. 69-81.  
(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096- 1121.
 
(7) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Con ­
trol. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(8) Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Bio ­
metrics, 27, pp. 103-117.  
(9) Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.  
(10) Sokal R.R. and Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Aanhangsel 2  
TESTOMSTANDIGHEDEN, DUUR EN OVERLEVINGSCRITERIA VOOR AANBEVOLEN VISSOORTEN  
Vissoort Temperatuur 
( o C) Zoutgehalte 
(0/00) Fotoperiode 
(in uren) Duur van de stadia 
(in dagen) 
Normale duur van test Overleving binnen controlegroep 
(minimum %) 
Embryo Larve Uitkomen eitjes Na uitkomen 
eitjes 
ZOETWATER  
Brachydanio rerio  
Zebravis 25 ± 1 — 12-16 3-5 8-10 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 5 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (8-10 dagen) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Regenboogforel 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  3 ) 30-35 25-30 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 20 dagen na het uit ­
komen van de eitjes (50-55 dagen) 66 70  
Cyprinus carpio  
Karper 21-25 — 12-16 5 > 4 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 4 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (8-9 dagen) 80 75  
Oryzias latipes  
Japanse rijstvis/Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 5 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (13-16 dagen) 80 80  
Pimephales promelas  
Fathead minnow 25 + 2 — 16 4-5 5 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 4 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (8-9 dagen) 60 70  
( 1 ) Voor embryo's. 
( 2 ) Voor larven. 
( 3 ) Duisternis voor embryo's en larven tot een week nadat de eitjes zijn uitgekomen, behalve wanneer ze worden geïnspecteerd. Daa rna zwak licht tot het eind van de test.
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
Aanhangsel 3  
Testomstandigheden, duur en overlevingscriteria voor andere goed gedocumenteerde vissoorten  
Vissoort Temperatuur 
( o C) Zoutgehalte 
(0/00) Fotoperiode (in 
uren) Duur van de stadia (in dagen) 
Normale duur van embryo en larvetest Overleving binnen controlegroep 
(minimum %) 
Embryo Larve Uitkomen eitjes Na uitkomen 
eitjes 
ZOETWATER  
Carassius auratus  
Goudvis 24 ± 1 — — 3-4 > 4 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 4 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (7 dagen) — 80  
Leopomis macrochirus  
Zonnebaars 21 ± 1 — 16 3 > 4 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 4 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (7 dagen) — 75 
ZOUTWATER  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside 22-25 15-22 12 1,5 10 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 5 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (6-7 dagen) 80 60  
Clupea harengus  
Haring 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 3 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (23-27 dagen) 60 80  
Gadus morhua  
Kabeljauw 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 3 dagen na het uitko ­
men van de eitjes (18 dagen) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Edelsteentandkarper 25 ± 1 15-30 12 — — Zo snel mogelijk na de bevruchting (vroeg 
gastrula-stadium) tot 4/7 dagen na het uit ­
komen van de eitjes (28 dagen) > 75 80
Aanhangsel 4  
ENKELE CHEMISCHE KENMERKEN VAN GESCHIKT 
VERDUNNINGSWATER  
Stof Concentratie  
Vaste deeltjes < 20 mg/l 
Totaalgehalte aan organische koolstof < 2 mg/l 
Niet-geïoniseerde ammonia < 1 μg/l 
Restchloorgehalte < 10 μg/1 
Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden < 50 ng/l Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en poly ­
chloorbifenylen < 50 ng/l 
Totaalgehalte aan organisch chloor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  HONINGBIJEN — ACUTE-TOXICITEITSTEST (ORAAL)  
1. METHODE  
De methode die voor deze acute-toxiciteitstest wordt gebruikt, is een 
kopie van de OECD TG 213 (1998).  
1.1. INLEIDING  
Deze toxiciteitstest is een laboratoriummethode die bedoeld is voor 
de bepaling van de acute orale toxiciteit van gewasbeschermings ­
producten en andere chemische stoffen voor volgroeide werkbijen.  
Bij de vaststelling en evaluatie van de toxische eigenschappen van 
stoffen kan het nodig zijn de acute orale toxiciteit in honingbijen te bepalen, bv. wanneer het waarschijnlijk is dat bijen aan een bepaalde 
chemische stof worden blootgesteld. Het onderzoek naar de acute 
orale toxiciteit wordt uitgevoerd om de inherente toxiciteit van pes ­
ticiden en andere chemische stoffen voor bijen te bepalen. De resul ­
taten van deze test moeten gebruikt worden om te bepalen of verdere 
evaluatie nodig is. Deze methode kan met name worden gebruikt bij 
stapsgewijze programma's om de gevaren van pesticiden voor bijen te evalueren, waarbij in de loop van het onderzoek wordt overgegaan van toxiciteitstests in laboratoria naar semiveld- en veldexperimenten 
(1). Pesticiden kunnen worden getest als actieve stof (a.s.) of als 
kant-en-klare producten.
 
Er moet een toxische standaard worden gebruikt om de gevoeligheid 
van bijen en de nauwkeurigheid van de testprocedure te verifiëren.  
1.2. DEFINITIES  
Acute orale toxiciteit:  omvat de schadelijke effecten die binnen een 
maximale periode van 96 uur na de orale toediening van een enkel ­
voudige dosis van de teststof optreden.  
Dosis:  is de hoeveelheid toegediende teststof. De dosis wordt uit ­
gedrukt in het gewicht ( μg) van de teststof per proefdier ( μg/bij). De 
werkelijke dosis voor elke bij kan niet worden berekend, omdat de 
bijen gezamenlijk worden gevoerd, maar een schatting van de ge ­
middelde dosis is wel mogelijk (totaal verbruikte teststof/aantal proefbijen in één korf).
 
LD 50 (mediaan letale dosis) oraal:  is een statistisch vastgestelde 
enkelvoudige dosis van een stof, waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de dieren die de dosis oraal hebben ontvangen, de dood 
intreedt. De LD
 50 -waarde wordt uitgedrukt in μg teststof per bij. Bij 
pesticiden kan de teststof een actieve stof (a.s.) of een kant-en-klaar product zijn dat een of meer actieve stoffen bevat.
 
Sterfte:  een dier wordt als dood geregistreerd als het volledig im ­
mobiel is.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Volgroeide werkbijen  (Apis mellifera)  worden blootgesteld aan een 
aantal doses van de teststof gedispergeerd in een sacharoseoplossing. 
Vervolgens wordt aan de bijen hetzelfde voer toegediend, zonder de teststof. Gedurende ten minste 48 uur wordt de sterfte dagelijks geregistreerd en vergeleken met de controlewaarden. Indien het sterf ­
tepercentage tussen 24 uur en 48 uur stijgt, terwijl de sterfte in de 
controlegroep op een aanvaardbaar niveau blijft, d.w.z. < 10 %, is het gepast de duur van de test tot maximaal 96 uur te verlengen. De resultaten worden geanalyseerd om de LD
 50 bij 24 uur en 48 uur te 
berekenen en, wanneer het onderzoek wordt verlengd, bij 72 uur en 
96 uur.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDITEIT VAN DE TEST  
Een test is uitsluitend onder de volgende voorwaarden geldig:  
— aan het einde van de test mag de gemiddelde sterfte voor het 
totale aantal bijen in de controlegroepen niet meer dan 10 % bedragen;
 
— de LD  50 van de toxische standaard ligt binnen het gespecifi ­
ceerde bereik.  
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Verzameling van de bijen  
Voor de test worden jonge, volgroeide werkbijen van hetzelfde ras 
gebruikt, d.w.z. bijen met dezelfde leeftijd, voedingsstatus enz. De 
bijen moeten afkomstig zijn van voldoende gevoede, gezonde, zoveel 
mogelijk ziektevrije en van een goede koningin voorziene volken met een bekende geschiedenis en fysiologische status. Ze kunnen op de ochtend van het gebruik of de avond vóór de test worden 
gevangen en tot de volgende dag onder dezelfde omstandigheden als 
tijdens de proef worden gehouden. Bijen uit korven zonder broedsel zijn geschikt. Het is af te raden bijen vroeg in de lente of laat in de 
herfst te vangen, omdat ze in die periode een andere fysiologie 
hebben. Wanneer proeven vroeg in de lente of laat in de herfst uitgevoerd moeten worden, kunnen de bijen in een incubator worden gehouden en gedurende één week met „bijenbrood” (stuifmeel dat uit 
de honingraat is verzameld) en een sacharoseoplossing worden 
grootgebracht. Bijen die met chemische stoffen zijn behandeld, bv. met antibiotica of antivarroaproducten, mogen gedurende vier weken na beëindiging van de laatste behandeling niet voor toxiciteitstests 
worden gebruikt.
 
1.5.2.  Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
De gebruikte korven moeten gemakkelijk te reinigen en goed geven ­
tileerd zijn. Elk geschikt materiaal kan worden gebruikt, bv. roestvrij 
staal, gaas, kunststof of wegwerphout. Groepen van tien bijen per 
korf verdienen de voorkeur. De grootte van de korven moet geschikt zijn voor het aantal bijen, d.w.z. ze moeten voldoende ruimte bieden.
 
De bijen moeten in een laboratoriumruimte onder donkere omstan ­
digheden en bij een temperatuur van 25 ± 2  o C worden gehouden. 
De relatieve vochtigheid, normaliter ca. 50-70 %, moet gedurende de 
test geregistreerd worden. Alle handelingen, waaronder behandeling en waarnemingen, kunnen bij (dag)licht worden verricht. Als voedsel wordt een sacharoseoplossing in water met een eindconcentratie van 
500 g/l (50 % g/v) gebruikt. Na de toediening van de testdoses moet  
ad libitum  voedsel worden verstrekt. Het voedselsysteem moet regis ­
tratie van het voedselverbruik voor elke korf mogelijk maken (zie 1.6.3.1). Er kan een glazen buis (ca. 50 mm lang en 10 mm breed 
met aan het open uiteinde een versmalling van de diameter tot 
2 mm) worden gebruikt.
 
1.5.3.  Voorbereiding van de bijen  
De verzamelde bijen worden willekeurig in de testkorven ingedeeld, 
die op hun beurt willekeurig in de laboratoriumruimte worden ge ­
plaatst.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
De bijen mag maximaal 2 uur vóór aanvang van de proef voedsel 
worden onthouden. Het wordt aanbevolen de bijen vóór de behan ­
deling voedsel te onthouden, zodat alle bijen qua darminhoud aan het begin van de proef aan elkaar gelijk zijn. Stervende bijen moeten voor aanvang van de proef worden vervangen door gezonde exem ­
plaren.
 
1.5.4.  Voorbereiding van de doses  
Wanneer de teststof met water kan worden gemengd, kan deze direct 
in een 50 % sacharoseoplossing worden gedispergeerd. Bij tech ­
nische producten en stoffen met een geringe oplosbaarheid in water kunnen media zoals organische oplosmiddelen, emulgators of dis ­
pergeermiddelen die een laag toxisch effect op bijen hebben (bv. 
aceton, dimethylformamide, dimethylsulfoxide), worden gebruikt. De concentratie van het medium is afhankelijk van de oplosbaarheid van de teststof en moet gelijk zijn voor alle onderzochte concentra ­
ties. Een mediumconcentratie van 1 % is algemeen geschikt en mag 
niet worden overschreden.
 
Er moeten geschikte controleoplossingen worden voorbereid, d.w.z. 
oplossingen waarbij een oplos- of dispergeermiddel wordt gebruikt 
om de teststof oplosbaar te maken. Er moeten twee aparte contro ­
legroepen worden gebruikt: een oplossing in water en een sacharose ­
oplossing waarbij het oplosmiddel/de drager de bij de dosering van 
de oplossing gebruikte concentratie heeft.  
1.6. PROCEDURE  
1.6.1.  Test- en controlegroepen  
Het aantal geteste doses en replicaties moet voldoen aan de statisti ­
sche vereisten voor de bepaling van de LD  50 met de 95 % betrouw ­
baarheidsgrenzen. Normaliter zijn voor de test vijf doses nodig in 
een geometrische reeks, met een factor van ten hoogste 2,2, die alle 
waarden voor de LD  50 omvatten. Toch moeten de verdunningsfactor 
en het aantal concentraties voor dosering worden bepaald ten op ­
zichte van de helling van de toxiciteitscurve (dosis/sterfte-curve), 
waarbij rekening moet worden gehouden met de statistische methode 
die voor de analyse van de resultaten is gekozen. Aan de hand van een verkennende proef kunnen de juiste concentraties voor de dose ­
ring worden gekozen.
 
Een dosis van elke testconcentratie wordt toegediend aan minimaal 
drie gelijke testgroepen, elk bestaande uit tien bijen. Naast de test ­
groep moeten ten minste drie controlegroepen, elk bestaande uit tien 
bijen, worden gebruikt. Ook bij de gebruikte oplosmiddelen/dragers 
moet gebruik worden gemaakt van controlegroepen (zie 1.5.4).  
1.6.2.  Toxische standaard  
Bij de testreeks moet een toxische standaard worden toegepast. Er 
moeten ten minste drie doses worden gekozen om de verwachte LD
 50 -waarde te dekken. Voor elke testdosis worden ten minste 
drie gelijke korven met elk tien bijen gebruikt. Als toxische stan ­
daard kan het best dimethoaat worden gebruikt, waarvan de geregis ­
treerde orale LD  50 -24 uur tussen 0,10 en 0,35 μg a.s./bij ligt (2). 
Andere toxische standaarden zijn echter ook aanvaardbaar, voorzover 
voldoende gegevens verstrekt kunnen worden om de verwachte do ­
sisrespons te kunnen verifiëren (bv. parathion).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Blootstelling  
1.6.3.1.  Toediening van de doses  
Aan elke testgroep bijen moet een dosis van 100-200 μl van een 
50 % sacharoseoplossing in water worden toegediend met de juiste 
concentratie van de teststof. Bij producten met een geringe oplos ­
baarheid, lage toxiciteit of lage concentratie in de samenstelling moeten grotere hoeveelheden worden gebruikt, omdat in de sacha ­
roseoplossing hogere verhoudingen gebruikt moeten worden. Er 
moet worden bijgehouden hoeveel behandeld voedsel elke groep 
verbruikt. Zodra het voedsel is verbruikt (meestal binnen 3-4 uur), moet de voedselhouder uit de korf worden verwijderd en vervangen 
worden door een houder met uitsluitend de sacharoseoplossing. De 
sacharoseoplossingen worden dan  ad libitum  verstrekt. Voor som ­
mige mengsels, bij hogere concentraties, kan een weigering van de testdosis ertoe leiden dat weinig of geen voedsel wordt verbruikt. Na 
uiterlijk 6 uur moet het niet-verbruikte behandelde voedsel worden 
vervangen door uitsluitend de sacharoseoplossing. De verbruikte hoeveelheid behandeld voedsel wordt bepaald (bv. meting van volume/gewicht van het resterende behandelde voedsel).
 
1.6.3.2.  Duur  
De proef duurt bij voorkeur 48 uur, te beginnen nadat de testop ­
lossing is vervangen door uitsluitend de sacharoseoplossing. Indien 
de sterfte na de eerste 24 uur met meer dan 10 % blijft stijgen, moet 
de proef tot maximaal 96 uur worden verlengd, mits de sterfte in de controlegroep niet meer dan 10 % bedraagt.
 
1.6.4.  Waarnemingen  
De sterfte wordt 4 uur na aanvang van de test en vervolgens na 24 
uur en 48 uur (d.w.z. na de toediening van de dosis) geregistreerd. Wanneer de observatieperiode moet worden verlengd, moeten om de 
24 uur, tot een maximum van 96 uur, verdere bepalingen worden 
uitgevoerd, mits de sterfte in de controlegroep niet hoger is dan 10 %.
 
De verbruikte hoeveelheid voedsel per groep moet worden geschat. 
Een vergelijking van de verbruikte hoeveelheden behandeld en onbe ­
handeld voedsel binnen de genoemde 6 uur kan informatie opleveren 
over de smakelijkheid van het behandelde voedsel.  
Alle abnormale gedragseffecten die in de proefperiode worden waar ­
genomen, moeten geregistreerd worden.  
1.6.5.  limiettest  
In sommige gevallen (bv. wanneer verwacht wordt dat een bepaalde 
teststof een lage toxiciteit heeft) kan een limiettest worden uitge ­
voerd met 100 μg a.s./bij, om aan te tonen dat de LD  50 hoger is 
dan deze waarde. Dezelfde procedure moet worden toegepast, inclu ­
sief drie gelijke testgroepen, voor de testdosis, de relevante contro ­
legroepen, de bepaling van de verbruikte hoeveelheid behandeld voedsel en het gebruik van de toxische standaard. Indien sterfte optreedt, dient een volledige studie te worden uitgevoerd. Indien 
subletale effecten worden waargenomen (zie 1.6.4), dienen deze te 
worden vermeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
De gegevens moeten worden samengevat in tabellen die voor iedere 
behandelingsgroep alsmede voor de controlegroep en de groep met 
de toxische standaard laten zien: het aantal gebruikte bijen, de sterfte 
op elk observatietijdstip en het aantal bijen dat abnormaal gedrag vertoont. De sterftecijfers worden met geschikte statistische metho ­
den geanalyseerd (bv. probitmethode, voortschrijdend gemiddelde, 
binomiale waarschijnlijkheid) (3) (4). Maak dosis/respons-curven 
op elk aanbevolen observatietijdstip en bereken de hellingen van de curven en de mediaan letale dosis (LD
 50 ) met de 95 %-betrouw ­
baarheidsgrenzen. Correcties voor de sterfte in de controlegroep zijn 
mogelijk met de correctie van Abbott (4) (5). Wanneer het behan ­
delde voedsel niet volledig wordt verbruikt, moet per groep worden bepaald welke dosis van de teststof is verbruikt. De LD
 50 wordt 
uitgedrukt in μg teststof per bij.  
2.2. VERSLAG VAN HET ONDERZOEK  
In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
2.2.1.  Teststof:  
— fysieke aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen (bv. 
stabiliteit in water, dampspanning),  
— chemische identificatiegegevens, waaronder structuurformule, 
zuiverheid (d.w.z. voor pesticiden de identiteit en concentratie 
van de actieve stof(fen)).  
2.2.2.  Diersoort:  
— wetenschappelijke naam, stam, bij benadering de leeftijd (in we ­
ken), verzamelingsmethode, gegevens over de verzameling,  
— informatie over de volken die gebruikt zijn voor de verzameling 
van de testbijen, inclusief gezondheid, ziekten bij volgroeide 
bijen, voorbehandeling enz.  
2.2.3.  Proefomstandigheden:  
— temperatuur en relatieve vochtigheid van de laboratoriumruimte,  
— huisvestingsomstandigheden, inclusief soort, grootte en materiaal 
van de korven,  
— methoden voor de bereiding van de stam- en testoplossingen 
(wanneer gebruikt moet zowel het oplosmiddel als de concen ­
tratie daarvan worden vermeld),  
— proefopzet, bv. aantal en gebruikte testconcentraties, aantal con ­
trolegroepen; voor elke testconcentratie en controlegroep het aan ­
tal gelijke korven en het aantal bijen per korf,  
— datum van de proef.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Resultaten:  
— wanneer uitgevoerd de resultaten van een verkennend onderzoek,  
— ruwe gegevens: sterfte bij elke geteste dosis op elk observatie ­
tijdstip,  
— grafiek van de dosis/respons-curven aan het einde van de test,  
— LD  50 -waarden met de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen, op elk van 
de aanbevolen observatietijdstippen, voor de teststof en de toxi ­
sche standaard,  
— statistische methoden die gebruikt zijn voor de bepaling van de 
LD 50 , 
— sterfte in de controlegroepen,  
— andere waargenomen of gemeten biologische effecten, bv. abnor ­
maal gedrag van de bijen (inclusief weigering van de testdosis), hoeveelheid verbruikt voedsel in behandelde en onbehandelde groepen,
 
— elke afwijking van de hier beschreven testmethoden alsook elke 
andere relevante informatie.  
3. REFERENTIES  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H.J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees  (Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, pp. 119-125.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  HONINGBIJEN — ACUTE-TOXICITEITSTEST (CONTACT)  
1. METHODE  
De methode die voor deze acute-toxiciteitstest wordt gebruikt, is een 
kopie van de OECD TG 214 (1998).  
1.1. INLEIDING  
Deze toxiciteitstest is een laboratoriummethode die bedoeld is voor 
de bepaling van de acute contacttoxiciteit van gewasbeschermings ­
producten en andere chemische stoffen voor volgroeide werkbijen.  
Bij de vaststelling en evaluatie van de toxische eigenschappen van 
stoffen kan het nodig zijn de acute contacttoxiciteit in honingbijen te 
bepalen, bv. wanneer het waarschijnlijk is dat bijen aan een bepaalde chemische stof worden blootgesteld. Het onderzoek naar de acute contacttoxiciteit wordt uitgevoerd om de inherente toxiciteit van 
pesticiden en andere chemische stoffen voor bijen te bepalen. De 
resultaten van deze test moeten gebruikt worden om te bepalen of verdere evaluatie nodig is. Deze methode kan met name worden 
gebruikt bij stapsgewijze programma's om de gevaren van pesticiden 
voor bijen te evalueren, waarbij in de loop van het onderzoek wordt overgegaan van toxiciteitstests in laboratoria naar semiveld- en veld ­
experimenten (1). Pesticiden kunnen worden getest als actieve stof 
(a.s.) of als kant-en-klare producten.
 
Er moet een toxische standaard worden gebruikt om de gevoeligheid 
van bijen en de nauwkeurigheid van de testprocedure te verifiëren.  
1.2. DEFINITIES  
Acute contacttoxiciteit:  omvat de schadelijke effecten die binnen 
een maximale periode van 96 uur na de lokale toediening van een 
enkelvoudige dosis van de teststof optreden.  
Dosis:  is de hoeveelheid toegediende teststof. De dosis wordt uit ­
gedrukt in het gewicht ( μg) van de teststof per proefdier ( μg/bij).  
LD 50 (mediaan letale dosis) contact:  is een statistisch vastgestelde 
enkelvoudige dosis van een stof, waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de dieren die de dosis door contact hebben ontvangen, de dood intreedt. De LD
 50 -waarde wordt uitgedrukt in μg teststof per 
bij. Bij pesticiden kan de teststof een actieve stof (a.s.) of een kant- 
en-klaar product zijn dat een of meer actieve stoffen bevat.  
Sterfte:  een dier wordt als dood geregistreerd als het volledig im ­
mobiel is.  
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Volgroeide werkbijen  (Apis mellifera)  worden blootgesteld aan een 
aantal doses van de teststof opgelost in een geschikte drager, door rechtstreekse toediening aan de thorax (druppeltjes). De test duurt 48 uur. Indien het sterftepercentage tussen 24 uur en 48 uur stijgt, 
terwijl de sterfte in de controlegroep op een aanvaardbaar niveau 
blijft, d.w.z. < 10 %, is het gepast de duur van de test tot maximaal 96 uur te verlengen. De sterfte wordt dagelijks geregistreerd en met de controlewaarden vergeleken. De resultaten worden geanalyseerd 
om de LD
 50 bij 24 uur en 48 uur te berekenen en, wanneer de studie 
wordt verlengd, bij 72 uur en 96 uur.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDITEIT VAN DE TEST  
Een test is uitsluitend onder de volgende voorwaarden geldig:  
— aan het einde van de test mag de gemiddelde sterfte voor het totale 
aantal bijen in de controlegroepen niet meer dan 10 % bedragen:  
— de LD  50 van de toxische standaard ligt binnen het gespecifi ­
ceerde bereik.  
1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.5.1.  Verzameling van de bijen  
Voor de test worden jonge, volgroeide werkbijen gebruikt, d.w.z. 
bijen met dezelfde leeftijd, voedingsstatus, stam enz. De bijen moe ­
ten afkomstig zijn van voldoende gevoede, gezonde, zoveel mogelijk ziektevrije en van een goede koningin voorziene volken met een 
bekende geschiedenis en fysiologische status. Ze kunnen op de och ­
tend van het gebruik of de avond voor de test worden gevangen en tot de volgende dag onder dezelfde omstandigheden als tijdens de proef worden gehouden. Bijen uit korven zonder broedsel zijn ge ­
schikt. Het is af te raden bijen vroeg in de lente of laat in de herfst te 
vangen, omdat ze in die periode een andere fysiologie hebben. Wan ­
neer proeven vroeg in de lente of laat in de herfst uitgevoerd moeten worden, kunnen de bijen in een incubator worden gehouden en 
gedurende één week met „bijenbrood” (stuifmeel dat uit de honing ­
raat is verzameld) en een sacharoseoplossing worden grootgebracht. Bijen die met chemische stoffen zijn behandeld, bv. met antibiotica of antivarroaproducten, mogen gedurende vier weken na beëindiging 
van de laatste behandeling niet voor toxiciteitstests worden gebruikt.
 
1.5.2.  Huisvestings- en voedingsomstandigheden  
De gebruikte korven moeten gemakkelijk te reinigen en goed geventi ­
leerd zijn. Elk geschikt materiaal kan worden gebruikt, bv. roestvrij staal, 
gaas, kunststof of wegwerphout. De grootte van de korven moet geschikt 
zijn voor het aantal bijen, d.w.z. ze moeten voldoende ruimte bieden. Groepen van tien bijen per korf verdienen de voorkeur.
 
De bijen moeten in een laboratoriumruimte onder donkere omstan ­
digheden en bij een temperatuur van 25 ± 2  o C. worden gehouden. 
De relatieve vochtigheid, normaliter ca. 50-70 %, moet gedurende de 
test geregistreerd worden. Alle handelingen, waaronder behandeling 
en waarnemingen, kunnen bij (dag)licht worden verricht. Als voedsel wordt een sacharoseoplossing in water met een eindconcentratie van 500 g/l 50 % g/v) gebruikt, dat gedurende de testperiode met behulp 
van een voedselhouder  ad libitum  wordt verstrekt. Er kan een glazen 
buis (ca. 50 mm lang en 10 mm breed met aan het open uiteinde een versmalling van de diameter tot 2 mm) worden gebruikt.
 
1.5.3.  Voorbereiding van de bijen  
Voor de toediening van de teststof kunnen de verzamelde bijen met 
kooldioxide of stikstof worden verdoofd. De hoeveelheid gebruikt anesteticum en de blootstellingsduur moeten zo gering mogelijk zijn. Stervende bijen moeten voor aanvang van de proef worden vervan ­
gen door gezonde exemplaren.
 
1.5.4.  Voorbereiding van de doses  
De teststof moet als oplossing in een drager worden toegediend, 
d.w.z. een organisch oplosmiddel of een oplossing in water met 
een bevochtigingsmiddel. Als organisch oplosmiddel verdient aceton 
de voorkeur, maar er kunnen ook andere organische oplosmiddelen met een lage toxiciteit voor bijen worden gebruikt (bv. dimethylfor ­
mamide, dimethylsulfoxide). Voor kant-en-klare producten die in 
water gedispergeerd zijn en voor hoogpolaire organische stoffen 
die niet oplosbaar zijn in dragers van organische oplosmiddelen, kunnen oplossingen wellicht gemakkelijker worden toegediend wan ­
neer ze worden voorbereid in een zwakke oplossing van een in de 
handel verkrijgbaar bevochtigingsmiddel (bv. Agral, Cittowett, Lu ­
brol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Er moeten geschikte controleoplossingen worden voorbereid, d.w.z. 
waarbij een oplos- of dispergeermiddel wordt gebruikt om de teststof 
oplosbaar te maken. Er worden twee aparte controlegroepen gebruikt, één behandeld met water en één behandeld met het oplos-/ ­
dispergeermiddel.
 
1.6. PROCEDURE  
1.6.1.  Test- en controlegroepen  
Het aantal geteste doses en replicaties moet voldoen aan de statisti ­
sche vereisten voor de bepaling van de LD  50 met de 95- % betrouw ­
baarheidsgrenzen. Normaliter zijn voor de test vijf doses nodig in een geometrische reeks, met een factor van ten hoogste 2,2, die alle 
waarden voor de LD
 50 omvatten. Toch moet het aantal doses worden 
bepaald ten opzichte van de helling van de toxiciteitscurve (dosis/ ­
sterfte-curve), waarbij rekening moet worden gehouden met de sta ­
tistische methode die voor de analyse van de resultaten is gekozen. 
Aan de hand van een verkennende proef kunnen de juiste doses 
worden gekozen.  
Een dosis van elke testconcentratie wordt toegediend aan minimaal 
drie gelijke restgroepen, elk bestaande uit tien bijen.  
Naast de testgroep moeten ten minste drie controlegroepen, elk be ­
staande uit tien bijen, worden gebruikt. Indien een organisch oplos ­
middel of een bevochtigingsmiddel wordt gebruikt, moeten drie extra controlegroepen van elk tien bijen voor het oplos- of bevochtigings ­
middel worden opgenomen.
 
1.6.2.  Toxische standaard  
Bij de testreeks moet een toxische standaard worden toegepast. Er 
moeten ten minste drie doses worden gekozen om de verwachte LD
 50 -waarde te dekken. Voor elke testdosis worden ten minste 
drie gelijke korven met elk tien bijen gebruikt. Ais toxische stan ­
daard kan het best dimethoaat worden gebruikt, waarvan de geregis ­
treerde orale LD  50 -24 uur tussen 0,10 en 0,30 μg a.s./bij ligt (2). 
Andere toxische standaarden zijn echter ook aanvaardbaar, voorzover 
voldoende gegevens verstrekt kunnen worden om de verwachte do ­
sisrespons te kunnen verifiëren (bv. parathior).  
1.6.3.  Blootstelling  
1.6.3.1.  Toediening van de doses  
De verdoofde bijen worden individueel met de teststof behandeld 
(lokale toediening). De bijen worden willekeurig in de verschillende 
testdosis- en controlegroepen ingedeeld. Met een microapplicator wordt 1 μl van een oplossing met de teststof en de juiste concentratie 
in de dorsale zijde van de thorax van elke bij ingebracht. Ook andere 
volumes mogen gebruikt worden, maar moeten gerechtvaardigd wor ­
den. Na de toediening van de oplossing worden de bijen in de test ­
korven ingedeeld en voorzien van sacharoseoplossingen.
 
1.6.3.2.  Duur  
De proef duurt bij voorkeur 48 uur. Indien de sterfte in de periode 
van 24 uur tot 48 uur meer dan 10 % stijgt, moet de proef tot 
maximaal 96 uur worden verlengd, mits de sterfte in de contro ­
legroep niet meer dan 10 % bedraagt.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Waarnemingen  
De sterfte wordt 4 uur na de toediening van de dosis en vervolgens 
na 24 uur en 48 uur geregistreerd. Wanneer de observatieperiode moet worden verlengd, moeten om de 24 uur, tot een maximum 
van 96 uur, verdere bepalingen worden uitgevoerd, mits de sterfte 
in de controlegroep niet hoger is dan 10 %.
 
Alle abnormale gedragseffecten die in de proefperiode worden waar ­
genomen, moeten geregistreerd worden.  
1.6.5.  Limiettest  
In sommige gevallen (bv. wanneer verwacht wordt dat een bepaalde 
teststof een lage toxiciteit heeft) kan een limiettest worden uitge ­
voerd met 100 μg a.s./bij, om aan te tonen dat de LD  50 hoger is 
dan deze waarde. Dezelfde procedure moet worden toegepast, inclu ­
sief drie gelijke testgroepen, voor de testdosis, de relevante contro ­
legroepen, de bepaling van de verbruikte hoeveelheid behandeld voedsel en het gebruik van de toxische standaard. Indien sterfte 
optreedt, dient een volledige studie te worden uitgevoerd. Indien 
subletale effecten worden waargenomen (zie 1.6.4), dienen deze te worden vermeld.
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. GEGEVENS  
De gegevens moeten worden samengevat in tabellen die voor iedere 
behandelingsgroep alsmede voor de controlegroep en de groep met de toxische standaard laten zien: het aantal gebruikte bijen, de sterfte 
op elk observatietijdstip en het aantal bijen dat abnormaal gedrag 
vertoont. De sterftecijfers worden met geschikte statistische metho ­
den geanalyseerd (bv. probitmethode, voortschrijdend gemiddelde, binomiale waarschijnlijkheid) (3) (4). Maak dosis/respons-curven 
op elk aanbevolen observatietijdstip (d.w.z. 24 uur, 48 uur en, wan ­
neer van toepassing, 72 uur en 96 uur) en bereken de hellingen van de curven en de mediaan letale dosis (LD
 50 ) met de 95 %-betrouw ­
baarheidsgrenzen. Correcties voor de sterfte in de controlegroep zijn 
mogelijk met de correctie van Abbott (4) (5). De LD  50 wordt uit ­
gedrukt in μg teststof per bij.  
2.2. VERSLAG VAN HET ONDERZOEK  
In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
2.2.1.  Teststof:  
— fysieke aard en fysisch-chemische eigenschappen (bv. stabiliteit 
in water, dampspanning),  
— chemische identificatiegegevens, waaronder structuurformule, 
zuiverheid (d.w.z. voor pesticiden de identiteit en concentratie 
van de actieve stoffen)).  
2.2.2.  Diersoort:  
— wetenschappelijke naam. stam, bij benadering de leeftijd dn we ­
ken), verzamelingsmethode, gegevens over de verzameling.  
— informatie over tic volken die gebruikt zijn voor de verzameling 
van de testbijen, inclusief gezondheid, ziekten bij volgroeide 
bijen, voorbehandeling enz.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Proefomstandigheden:  
— temperatuur en relatieve vochtigheid van de laboratoriumruimte,  
— huisvestingsomstandigheden, inclusief soort, grootte en materiaal 
van de korven,  
— methoden voor de toediening van de teststof, bv. gebruikte dra ­
ger, gebruikt volume van de testoplossing en het gebruikte anes ­
teticum,  
— proefopzet, bv. aantal en gebruikte testdoses, aantal controlegroe ­
pen; voor elke testdosis en controlegroep het aantal gelijke kor ­
ven en het aantal bijen per korf,  
— datum van de proef.  
2.2.4.  Resultaten:  
— wanneer uitgevoerd de resultaten van een verkennend onderzoek,  
— ruwe gegevens: sterfte bij elke geteste concentratie op elk obser ­
vatietijdstip,  
— grafiek van de dosis/respons-curven aan het einde van de test,  
— LD  50 -waarden, met de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen, op elk 
van de aanbevolen observatietijdstippen, voor de teststof en de 
toxische standaard,  
— statistische methoden die gebruikt zijn voor de bepaling van de 
LD 50 , 
— sterfte in de controlegroepen.  
— andere waargenomen of gemeten biologische effecten en elke 
abnormale respons van de bijen,  
— elke afwijking van de hier beschreven testmethoden alsook elke 
andere relevante informatie.  
3. REFERENTIES  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., Mclndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees  (Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119-125.
 
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  BEPALING VAN DE ADSORPTIE/DESORPTIE MET BEHULP 
VAN EEN BATCH-EVENWICHTSMETHODE  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 106 van de OESO: bepaling 
van de adsorptie/desorptie met behulp van een batch-evenwichts ­
methode (2000).  
1.1. INLEIDING  
In de methode is rekening gehouden met een rondzendproef en een 
workshop voor bodemselectie voor de ontwikkeling van een adsorp ­
tietest (1) (2) (3) (4) en met bestaande richtsnoeren op nationaal niveau (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
 
Adsorptie/desorptieonderzoek is nuttig om essentiële informatie te 
verkrijgen over de mobiliteit van chemische stoffen en hun verdeling in de compartimenten bodem, water en lucht van de biosfeer (12) 
(13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). De informatie kan 
worden gebruikt bij de prognose of raming van bijvoorbeeld de beschikbaarheid van een stof voor afbraak (22) (23), omzetting en 
opname door organismen (24); uitloging door het bodemprofiel (16) 
(18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); vluchtigheid vanuit de bodem (21) (29) (30); afspoeling van het landoppervlak naar natuurlijke wateren (18) (31) (32). Adsorptiegegevens kunnen worden gebruikt voor ver ­
gelijkende en modelberekeningen (19) (33) (34) (35).
 
De verdeling van een chemische stof tussen bodem- en waterfase is 
een complex proces dat wordt bepaald door verschillende factoren: 
de chemische aard van de stof (12) (36) (37) (38) (39) (40), de 
kenmerken van de bodem (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) en klimaatfactoren zoals regenval, tempera ­
tuur, zonlicht en wind. De talloze verschijnselen en mechanismen die 
een rol spelen bij de adsorptie van een stof door de bodem kunnen 
dan ook niet volledig worden opgenomen in een eenvoudig labora ­
toriummodel zoals de hier beschreven methode. Ook al is deze me ­
thode een benadering waarin niet alle mogelijkheden in het milieu 
worden bestreken, toch levert zij voldoende informatie op over de relevantie van de adsorptie van een stof vanuit milieuoogpunt.
 
Zie ook de algemene inleiding.  
1.2. TOEPASSINGSGEBIED  
Met deze methode wordt getracht een raming van het adsorptie/ ­
desorptiegedrag van een stof ten opzichte van de bodem te bepalen. 
Het is de bedoeling een sorptiewaarde te verkrijgen die kan worden 
gebruikt om een prognose te doen omtrent de verdeling onder een scala van milieuomstandigheden; daartoe wordt de adsorp-tiecoëffi ­
ciënt bij evenwicht voor een chemische stof bij verschillende bodem ­
types bepaald als functie van de bodemkenmerken (gehalte aan or ­
ganische koolstof, kleigehalte en bodemtextuur, pH enz.). Er moeten verschillende bodemtypes worden gebruikt om de interactie van een 
bepaalde stof met in de natuur voorkomende bodemtypes zo breed 
mogelijk te kunnen bestrijken.
 
Bij deze methode wordt onder adsorptie het bindingsproces van che ­
mische stoffen aan het bodemoppervlak verstaan; er wordt geen 
onderscheid gemaakt tussen verschillende adsorptieprocessen (fysi ­
sche en chemische adsorptie) en bijvoorbeeld oppervlak-gekataly ­
seerde afbraak, bulkadsorptie of chemische reacties. Er wordt geen 
rekening gehouden met de adsorptie aan colloïddeeltjes (diameter < 
0,2 μm) die uit het bodemmonster ontstaan.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Als belangrijkste bodemparameters voor de adsorptie worden be ­
schouwd: het gehalte aan organische koolstof (3) (4) (12) (13) (14) 
(41) (43) (44) (45) (46) (47) (48); het gehalte aan klei en de bodem ­
textuur (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) en de pH voor ioniseerbare verbindingen (3) (4) (42). Ook de effectieve capaciteit 
voor kationuitwisseling, het gehalte aan amorf ijzer en alumini ­
umoxides, met name voor vulkanische en tropische bodemtypes (4) en het specifieke oppervlak (49) kunnen een rol spelen.
 
De test is bedoeld om de adsorptie van een chemische stof aan 
verschillende bodemtypes met een uiteenlopend gehalte aan organi ­
sche koolstof, kleigehalte en bodemtextuur en pH te bepalen en 
bestaat uit drie fasen:  
Fase  1: Voorbereidend onderzoek voor de bepaling van:  
— de verhouding bodemmonster/oplossing:  
— de voor de instelling van het adsorptie-evenwicht beno ­
digde tijd en de hoeveelheid geadsorbeerde stof bij 
evenwicht:  
— de adsorptie van de teststof aan het oppervlak van de 
gebruikte buizen of potten en de stabiliteit van de test ­
stof gedurende de uitvoering van de test.  
Fase  2: Screening: de adsorptie wordt bij vijf verschillende bodem ­
types onderzocht aan de hand van de adsorptiekinetiek bij één concentratie en de bepaling van de verdelingscoëfficiënt K
 d en K  oc . 
Fase 3:  Bepaling van de adsorptie-isothermen volgens Freundlich 
om na te gaan wat de invloed van de concentratie op de 
mate van adsorptie aan de bodem is.  
Onderzoek van de desorptie aan de hand van de 
desorptiekinetiek/desorptie-isothermen volgens Freundlich 
(zie aanhangsel).  
1.3. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Symbool Definitie Eenheid  
A t i adsorptiepercentage op het tijdstip t  i % 
A eq adsorptiepercentage bij het adsorptie-evenwicht %  
m s ads ðt i Þ massa van de aan het bodemmonster geadsorbeerde teststof 
op het tijdstip t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ massa van de aan het bodemmonster geadsorbeerde teststof 
gedurende het tijdsinterval Δt i μg 
m s ads ðeqÞ aan het bodemmonster geadsorbeerde massa teststof bij het 
adsorptie-evenwicht μg 
m 0 massa van de teststof in de proefbuis aan het begin van de 
adsorptietest μg 
m m ads ðt i Þ massa van de teststof, gemeten in een monster ( v a A ) op het 
tijdstip t  i μg 
m aq ads ðeqÞ massa van de teststof in de oplossing bij het adsorptie- 
evenwicht μg 
m soil hoeveelheid van het bodemmonster, uitgedrukt in droge 
massa g ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Symbool Definitie Eenheid  
C st massaconcentratie van de stockoplossing van de stof μg cm  -3 
C o massaconcentratie van de testoplossing in contact met het 
bodemmonster op het tijdstip t = 0 μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ massaconcentratie van de stof in de waterfase op het tijd ­
stip t  i waarop de analyse wordt uitgevoerd μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ gehalte aan de aan het bodemmonster geadsorbeerde stof 
bij het adsorptie-evenwicht μg g -1 
C aq ads ðeqÞ massaconcentratie van de stof in de waterfase bij het ad ­
sorptie-even-wicht μg cm  -3 
V o volume van de waterfase die tijdens de adsorptietest in 
contact met het bodemmonster is, op het tijdstip t = 0 cm 3 
v a A volume van het monster waarin de teststof wordt bepaald cm  3 
K d verdelingscoefficiënt voor adsorptie cm  3 g -1 
K oc genormaliseerde adsorptiecoëfiiciënt voor organische 
koolstof cm 3 g -1 
K om genormaliseerde verdelingscoëfficiënt voor organisch ma ­
teriaal cm 3 g -1 
K F ads adsorptiecoëfficiënt volgens Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlich-exponent  
D t i desorptiepercentage op het tijdstip t  i % 
D Δt i desorptiepercentage gedurende het tijdsinterval Δt i % 
K des schijnbare desorptiecoëfficiënt cm  3 g -1 
K F des desorptiecoëfficiënt volgens Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ massa van de uit het bodemmonster gedesorbeerde teststof 
op het tijdstip t  i μg 
m m des ðΔt i Þ massa van de uit het bodemmonster gedesorbeerde teststof 
gedurende het tijdsinterval Δt i μg 
m m des ðeqÞ ! analytisch bepaalde massa van de stof in de waterfase bij 
het desorptie-evenwicht μg 
m aq des ðeqÞ totale massa van de gedesorbeerde teststof bij het desorp ­
tie-evenwicht μg 
m s des ðΔt i Þ massa van de stof die na het tijdsinterval Δt i aan het 
bodemmonster geadsorbeerd blijft μg 
m aq A massa van de stof die door onvolledige vervanging van het 
volume overblijft van het adsorptie-evenwicht μg 
C s des ðeqÞ gehalte aan de stof die bij het desorptie-evenwicht aan het 
bodemmonster geadsorbeerd blijft μg g -1 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Symbool Definitie Eenheid  
C aq des ðeqÞ massaconcentratie van de teststof in de waterfase bij het 
desorptie-evenwicht μg cm  -3 
v T totaalvolume van de waterfase die tijdens het volgens de 
seriële methode uitgevoerde desorptiekinetiek-experiment in contact met het bodemmonster is cm
 3 
V r volume van het supernatans dat na het bereiken van het 
adsorptie-evenwicht uit de buis verwijderd is en is ver ­
vangen door een gelijk volume CaCl  2 -oplossing (0,01 M) cm 3 
v a D volume van het monster dat op het tijdstip t  i tijdens het 
volgens de seriële methode uitgevoerde desorptiekinetiek- experiment voor analysedoeleinden wordt genomen cm
 3 
V r i volume van de oplossing die bij het desorptiekinetiek-ex ­
periment (parallelle methode) voor de bepaling van de 
teststof uit buis (i) is genomen cm 3 
V r F volume van de oplossing die voor de bepaling van de 
teststof bij het desorptie-evenwicht uit de buis is genomen cm 3 
MB massabalans % 
m E totale massa van de teststof die in twee stappen uit het 
bodemmonster en de wanden van de proefbuis is geëx ­
traheerd μg 
V rec volume van het supernatans dat na het adsorptie-evenwicht 
wordt verwijderd cm 3 
P ow verdelingscoëfficiënt octanol/water 
pKa dissociatieconstante 
S w oplosbaarheid in water g l  -1 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Bekende volumes van oplossingen van de teststof, al dan niet radio ­
actief gelabeld, met een bekende concentratie in 0,01 M CaCl  2 wor­
den toegevoegd aan bodemmonsters met een bekend drooggewicht die vooraf zijn geëquilibreerd in 0,01 M CaCl
 2 . Het mengsel wordt 
gedurende een geschikte tijd geschud. De bodemsuspensie wordt 
vervolgens door centrifugeren en desgewenst filtreren gescheiden en de waterfase wordt geanalyseerd. De hoeveelheid aan het bodem ­
monster geadsorbeerde teststof wordt berekend als het verschil tussen 
de hoeveelheid aanvankelijk in de oplossing aanwezige teststof en de 
hoeveelheid die aan het eind van het experiment is overgebleven (indirecte methode).
 
Het is ook mogelijk de hoeveelheid geadsorbeerde teststof recht ­
streeks door bodemanalyse te bepalen (directe methode). Deze pro ­
cedure, waarbij de bodemfractie stapsgewijs wordt geëxtraheerd met een geschikt oplosmiddel, wordt aanbevolen voor gevallen waarin 
het verschil in de concentratie van de stof in de oplossing niet 
nauwkeurig kan worden bepaald. Voorbeelden van dergelijke geval ­
len zijn: adsorptie van de teststof aan de wanden van het proefvat, instabiliteit van de teststof binnen de tijdschaal van het experiment, 
een geringe adsorptie die slechts kleine concentratieveranderingen in 
de oplossing veroorzaakt en een sterke adsorptie die leidt tot een zo lage concentratie dat deze niet nauwkeurig kan worden bepaald. Als een radioactief gelabelde stof wordt gebruikt, kan in plaats van bo ­
demextractie worden gekozen voor bodemanalyse door verbranding 
en vloeistofscintillatietelling. Vloeistofscintillatietelling is echter een aspecifieke techniek waarbij geen onderscheid kan worden gemaakt tussen de oorspronkelijke stof en omzettingsproducten; deze techniek 
mag dan ook alleen worden gebruikt als de teststof gedurende het 
hele onderzoek stabiel is.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
De gebruikte reagentia moeten chemisch zuiver (p.a.) zijn. Aanbe ­
volen wordt ongelabelde teststoffen met een bekende samenstelling en bij voorkeur een zuiverheid van minimaal 95 % of radioactief 
gelabelde teststoffen met een bekende samenstelling en radioactieve 
zuiverheid te gebruiken. Wanneer tracers met een korte halveringstijd worden gebruikt, moet een vervalcorrectie worden uitgevoerd.
 
Voordat een adsorptie/desorptietest wordt uitgevoerd, moet de vol ­
gende informatie over de teststof beschikbaar zijn:  
a) de oplosbaarheid in water (A.6.):  
b) de dampspanning (A.4.) en/of de constante van de wet van Hen ­
ry; 
c) de niet-biologische afbraak: hydrolyse in afhankelijkheid van de 
pH (C.7.);  
d) de verdelingscoëfficiënt (A.8.);  
e) de „gemakkelijke” biologische afbreekbaarheid (C.4) of de aerobe 
en anaerobe omzetting in de bodem;  
f) de pKa van ioniseerbare stoffen;  
g) de directe fotolyse in water (d.w.z. het UV/Vis-absorptiespectrum 
in water, kwantumopbrengst) en de fotodegradatie op de bodem.  
1.6. TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
De test kan worden gebruikt voor chemische stoffen waarvoor een 
analysemethode met een afdoende nauwkeurigheid beschikbaar is. 
Een belangrijke parameter die de betrouwbaarheid van de resultaten 
kan beïnvloeden, met name wanneer de indirecte methode wordt gebruikt, is de stabiliteit van de teststof binnen de tijdschaal van de test. Een eerste vereiste is dan ook dat de stabiliteit tijdens een 
voorbereidend onderzoek wordt gecontroleerd; als er binnen de tijd ­
schaal van de test een omzetting wordt waargenomen, wordt aanbe ­
volen bij het hoofdonderzoek zowel de bodem- als de waterfase te analyseren.
 
Bij de uitvoering van deze test kunnen er problemen ontstaan met 
stoffen die slecht oplosbaar zijn in water (S  w < 10  -4 g l -1 ) en met 
stoffen met een hoge lading, aangezien de concentratie in de water ­
fase in dat geval niet met een voldoende nauwkeurigheid analytisch kan worden bepaald. In deze gevallen moeten er aanvullende maat ­
regelen worden genomen. In de desbetreffende hoofdstukken van 
deze beschrijving wordt aangegeven hoe deze problemen kunnen worden aangepakt.
 
Bij het testen van vluchtige stoffen moet ervoor worden gezorgd dat 
verliezen tijdens de behandeling worden voorkomen.  
1.7. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.7.1.  Apparatuur en reagentia  
Standaardlaboratoriumapparatuur, met name:  
a) buizen of potten voor de uitvoering var. de experimenten. Het is 
belangrijk dat deze buizen of potten  
— direct in de centrifuge passen om fouten bij de behandeling en 
de overbrenging tot een minimum te beperken;  
— van een inert materiaal zijn vervaardigd, zodat de adsorptie 
van de teststof aan het oppervlak tot een minimum wordt 
beperkt;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) schudapparaat: overhead-schudder of gelijkwaardige apparatuur: 
het schudapparaat moet het bodemmonster tijdens het schudden 
in suspensie houden;  
c) centrifuge: bij voorkeur met hoge snelheid, bijvoorbeeld > 
3 000 g, instelbare temperatuur, in staat om deeltjes met een 
diameter van meer dan 0,2 μm uit een waterige oplossing neer 
te slaan. De houders moeten tijdens het schudden en centrifuge ­
ren worden afgesloten om damp- en waterverlies te voorkomen; om adsorptie aan de dop tot een minimum te beperken moeten 
gedeactiveerde doppen worden gebruikt, zoals schroefdoppen met 
teflonbekleding;
 
d) facultatief: filtreerapparatuur; steriele wegwerpfilters met een po ­
rositeit van 0,2 μm. Bij de keuze van het filtermateriaal moet 
goed worden opgelet, zodat verliezen van de teststof aan dit 
materiaal worden voorkomen; voor slecht oplosbare teststoffen wordt organisch filtermateriaal afgeraden;
 
e) analyse-instrumentarium dat geschikt is om de concentratie van 
de teststof te meten;  
f) laboratoriumoven die kan worden ingesteld op een temperatuur 
van 103  o C tot 110  o C. 
1.7.2.  Karakterisering en selectie van de bodem  
De bodem moet worden gekarakteriseerd aan de hand van drie pa ­
rameters die worden geacht grotendeels bepalend voor de adsorptie ­
capaciteit te zijn: gehalte aan organische koolstof, kleigehalte en bodemtextuur en pH. Zoals reeds is vermeld (zie „Toepassings ­
gebied”), kunnen ook andere fysisch-chemische eigenschappen van 
de bodem invloed hebben op de adsorptie/desorptie van een bepaalde stof en daarmee moet in die gevallen rekening worden gehouden.
 
De voor de karakterisering van de bodem gebruikte methoden zijn 
heel belangrijk en kunnen een significante invloed op de resultaten 
hebben. Daarom wordt aanbevolen de pH van de bodem in een 0,01 M CaCl
 2 -oplossing (de oplossing die bij de adsorptie/desorptietest 
wordt gebruikt) volgens de desbetreffende ISO-methode (ISO 10390- 
1) te bepalen. Tevens wordt aanbevolen de andere relevante bodem ­
eigenschappen volgens de standaardmethoden (ISO-handboek voor bodemanalyse) te bepalen; in dat geval kunnen de sorptiegegevens 
op basis van algeheel gestandaardiseerde bodemparameters worden 
geanalyseerd. In de referenties (50-52) worden enige richtsnoeren gegeven voor bestaande standaardmethoden voor bodemanalyse en -karakterisering. Voor de kalibratie van bodemtestmethoden wordt 
het gebruik van referentiebodem aanbevolen.
 
Tabel 1 bevat richtsnoeren voor de selectie van bodemtypes voor 
adsorptie/desorptie-experimenten. De zeven vermelde bodemtypes bestrijken het scala dat in gematigde geografische zones voorkomt. 
Voor ioniseerbare teststoffen moeten de geselecteerde bodemtypes 
een breed pH-bereik beslaan om de adsorptie van de stof in geï ­
oniseerde en niet-geïoniseerde vorm te kunnen bepalen. Onder punt 1.9 „Uitvoering van de test”, worden richtsnoeren gegeven voor het 
aantal verschillende bodemtypes dat in de verschillende fasen van de 
test moet worden gebruikt.
 
Als de voorkeur wordt gegeven aan andere bodemtypes, moeten deze 
aan de hand van dezelfde parameters worden gekarakteriseerd en 
moet de spreiding van de eigenschappen vergelijkbaar zijn met die 
van tabel 1, ook al voldoen ze niet exact aan de criteria.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabel 1  
Richtsnoeren voor de selectie van bodemmonsters voor adsorptie/desorptie  
Bodemtype pH-bereik (in 0,01 M 
CaCl  2 ) Organisch 
koolstofgehalte ( %) Kleigehalte (%) Bodemtextuur (  1 ) 
1 4,5-5,5 1,0-2,0 65-80 klei 
2 > 7,5 3,5-5,0 20-40 kleileem 
3 5,5-7,0 1,5-3,0 15-25 siltleem 4 4,0-5,5 3,0-4,0 15-30 leem 5 < 4,0-6,0 (
 2 ) < 0,5-1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) lemig zand 
6 > 7,0 < 0,5-1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 kleileem/klei 
— < 4,5 > 10 < 10 zand/lemig zand  
( 1 ) Volgens het systeem van de FAO en de VS (85). 
( 2 ) De waarde van deze variabelen moet bij voorkeur binnen het vermeide bereik vallen. Als het echter moeilijk is 
geschikt bodemmateriaal te vinden, is ook een waarde beneden het vermelde minimum aanvaardbaar. 
( 3 ) Bodem met minder dan 0,3 % organische koolstof kan de correlatie tussen het gehalte aan organisch materiaal en de 
adsorptie verstoren. Het verdient dan ook aanbeveling bodem met minimaal 0,3 % organische koolstof te gebruiken.  
1.7.3.  Monsterneming en opslag van bodemmonsters  
1.7.3.1.  Monsterneming  
Er worden geen specifieke technieken of gereedschappen voor mon ­
sterneming aanbevolen; de monsternemingstechniek is afhankelijk 
van het doel van het onderzoek (53) (54) (55) (56) (57) (58).  
Er moet rekening worden gehouden met de volgende overwegingen:  
a) er moet gedetailleerde achtergrondinformatie over de veldlocatie 
zijn; daarbij gaat het bijvoorbeeld om de ligging, de vegetatie, behandelingen met pesticiden en/of kunstmest, biologische toe ­
voegingen of onopzettelijke verontreiniging. De aanbevelingen 
van de ISO-norm voor bodembemonstering (ISO 10381-6) moe ­
ten bij de beschrijving van de bemonsteringslocatie in acht wor ­
den genomen;
 
b) de bemonsteringslocatie moet worden gespecificeerd met UTM 
(Universele Transversale Mercatorprojectie/European Horizontal 
Datum) of geografische coördinaten; daardoor kan een bepaalde 
bodem in de toekomst opnieuw worden bemonsterd of kan een betere specificatie van de bodem worden gegeven binnen de uit ­
eenlopende classificatiesystemen die in de verschillende landen 
worden gebruikt. Tevens mogen monsters alleen in een A-hori ­
zont tot maximaal 20 cm diep worden genomen. Met name bij bodemtype nr. 7 moet een O
 h -horizont, als deze in de bodem 
aanwezig is, in het monster worden opgenomen.  
De houders waarin en de temperatuur waarbij de bodemmonsters 
worden vervoerd, moeten zodanig zijn dat significante wijzigingen 
in de aanvankelijke bodemeigenschappen uitgesloten zijn.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Opslag  
Het gebruik van verse bodemmonsters verdient de voorkeur. Alleen 
als dit niet mogelijk is, moeten de monsters bij kamertemperatuur en luchtdroog worden bewaard. Er is geen aanbevolen houdbaarheids ­
termijn, maar monsters die meer dan drie jaar zijn bewaard moeten 
vóór gebruik opnieuw worden geanalyseerd op hun gehalte aan or ­
ganische koolstof. pH en capaciteit voor kationuitwisseling.
 
1.7.3.3.  Behandeling en voorbereiding van bodemmonsters voor de test  
De bodemmonsters worden bij kamertemperatuur (bij voorkeur 20- 
25 o C) aan de lucht gedroogd. Bij het losmaken moet zo weinig 
mogelijk kracht worden gebruikt om de oorspronkelijke textuur van de bodem zo veel mogelijk intact te houden. De monsters wor ­
den gezeefd tot een deeltjesgrootte ≤ 2 mm; bij het zeven moeten de 
aanbevelingen van de ISO-norm voor bodembemonstering (ISO 10381-6) worden opgevolgd. Een zorgvuldige homogenisering wordt 
aanbevolen, aangezien de reproduceerbaarheid van de resultaten 
daardoor wordt bevorderd. Het vochtgehalte van de bodem wordt bij drie monsters bepaald door verhitting op 105
 o C tot constant 
gewicht (ongeveer 12 uur). Bij alle berekeningen wordt onder de 
massa van het bodemmonster het drooggewicht verstaan, d.w.z. de 
voor het vochtgehalte gecorrigeerde massa.  
1.7.4.  Voorbereiding van de teststof voor de toevoeging aan de 
bodemmonsters  
De teststof wordt opgelost in 0,01 M CaCl  2 in gedestilleerd of ge ­
deïoniseerd water; de CaCl  2 -oplossing wordt als waterfase gebruikt 
om het centrifugeren te vergemakkelijken en de kationuitwisseling tot een minimum te beperken. De concentratie van de stockoplossing 
moet bij voorkeur drie ordes van grootte hoger zijn dan de detectie ­
grens van de gebruikte analysemethode. Deze drempel vormt een waarborg voor nauwkeurige metingen bij de hier gevolgde methode; daarnaast moet de concentratie van de stockoplossing lager zijn dan 
de oplosbaarheid van de teststof in water.
 
De stockoplossing moet bij voorkeur vlak voor de toevoeging aan 
het bodemmonster worden bereid en moet afgesloten in het donker 
bij 4  o C worden bewaard. De houdbaarheidstermijn is afhankelijk 
van de stabiliteit van de teststof en de concentratie in de oplossing.  
Alleen bij slecht oplosbare stoffen (S  w < l0  -4 g l -1 ) kan, als het 
moeilijk is de teststof op te lossen, een solubilisator nodig zijn. Deze solubilisator: a) moet mengbaar zijn met water, zoals methanol of acetonitril; b) mag niet in een hogere concentratie dan 1 % van 
het totale volume van de stockoplossing aanwezig zijn en de con ­
centratie in de oplossing van de teststof die met het bodemmonster in contact komt moet lager zijn (bij voorkeur lager dan 0,1 %); en c) mag geen oppervlakteactieve stof zijn en geen solvolysereactie met 
de teststof aangaan. Het gebruik van een solubilisator moet bij de 
rapportage van de gegevens worden vermeld en gemotiveerd.
 
Slecht oplosbare stollen kunnen ook door „spiking” aan het testsys ­
teem worden toegevoegd: de teststof wordt opgelost in een organisch 
oplosmiddel en een hoeveelheid daarvan wordt toegevoegd aan het systeem met het bodemmonster en de 0,01 M CaCl
 2 -eplossing in 
gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Het gehalte van de waterfase 
aan organisch oplosmiddel moet zo laag mogelijk worden gehouden, 
normaal gesproken maximaal 0,1 %. „Spiking” uit een organisch oplosmiddel kan als nadeel hebben dat de reproduceerbaarheid qua volume slecht is. Dit betekent dat er sprake is van een extra fout 
aangezien de concentratie van de teststof en het co-oplosmiddel niet 
bij alle tests gelijk is.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. VOORWAARDEN WAARAAN DE UITVOERING VAN DE 
ADSORPTIE/DESORPTIETEST MOET VOLDOEN  
1.8.1.  De analysemethode  
De belangrijkste parameters die de nauwkeurigheid van de sorptie ­
metingen kunnen beïnvloeden zijn: de nauwkeurigheid van de ana ­
lysemethode voor zowel de opgeloste als de geadsorbeerde fase, de stabiliteit en zuiverheid van de teststof, het bereiken van het sorptie- evenwicht, de omvang van de concentratieverandering in de oplos ­
sing, de verhouding bodemmonster/oplossing en de veranderingen in 
de bodemstructuur tijdens de instelling van het evenwicht (35) (59- 62). Aanhangsel 2 bevat enkele voorbeelden die relevant zijn voor de 
nauwkeurigheid.
 
De betrouwbaarheid van de gebruikte analysemethode moet worden 
gecontroleerd op het concentratiebereik dat bij de test wordt ver ­
wacht. Het staat de experimentator volledig vrij een geschikte me ­
thode te ontwikkelen waarvan de nauwkeurigheid, de precisie, de reproduceerbaarheid, de detectiegrenzen en de recovery aan de eisen 
voldoen. In het volgende experiment worden richtsnoeren voor de 
uitvoering van een dergelijke test gegeven.
 
Een geschikt volume 0,01 M CaCl  2 bijvoorbeeld 100 cm  3 , wordt 
gedurende 4 uur geschud met een hoeveelheid, bijvoorbeeld 20 g, van een sterk adsorberend bodemtype, d.w.z. met een hoog gehalte 
aan organische koolstof en klei; het gebruikte gewicht en volume 
kan aan de behoefte worden aangepast, maar een verhouding bodemmonster/oplossing van 1:5 is een goed uitgangspunt. Het mengsel wordt gecentrifugeerd en de waterfase kan worden gefil ­
treerd. Aan deze fase wordt een bekend volume van de stockoplos ­
sing met de teststof toegevoegd om te zorgen dat de nominale con ­
centratie binnen het bereik ligt dat bij de test wordt verwacht. Om de aard van de oplossing zo weinig mogelijk te veranderen mag dit 
volume niet groter zijn dan 10 % van het uiteindelijke volume van 
de waterfase. De oplossing wordt geanalyseerd.
 
Om artefacten in de analysemethode en matrixeffecten van de bodem 
op te sporen moet één blancobepaling met bodemmonster + CaCl  2 - 
oplossing (zonder teststof) worden uitgevoerd.  
Voor sorptiemetingen kunnen bijvoorbeeld de volgende analysemetho ­
den worden gebruikt: gaschromatografie (GLC), hogedrukvloeistofchro ­
matografie (HPLC), spectrometrie (bv. GC/massaspectrometrie of HPLC/massaspectrometrie) en vloeistofscintillatietelling (voor radio ­
actief gelabelde stoffen). Onafhankelijk van de gebruikte analyse ­
methode wordt deze geschikt geacht als de recovery tussen 90 % en 
110 % van de nominale waarde ligt. Om detectie en evaluatie na de faseverdeling mogelijk te maken moeten de detectiegrenzen van de ana ­
lysemethode ten minste twee ordes van grootte onder de nominale con ­
centratie liggen.
 
De kenmerken en detectiegrenzen van de beschikbare analyse ­
methode voor het adsorptieonderzoek spelen een belangrijke rol bij 
de bepaling van de testomstandigheden en de hele praktische uitvoe ­
ring van de test. In de hier gegeven beschrijving wordt een algemene route vermeld en worden aanbevelingen en richtsnoeren gegeven 
voor andere oplossingen wanneer de analysemethode en de omstan ­
digheden in het laboratorium beperkingen opleggen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  De keuze van een optimale verhouding bodemmonster/oplossing  
De keuze van een geschikte verhouding bodemmonster/oplossing 
voor het sorptieonderzoek wordt bepaald door de verdelingscoëffi ­
ciënt K  d en de gewenste relatieve adsorptie. De verandering van de 
concentratie van de stof in de oplossing bepaalt de statistische nauw ­
keurigheid van de meting op basis van de vorm van de adsorptie ­
vergelijking en de beperkingen van de analysemethode bij de bepa ­
ling van de concentratie van de stof. Daarom is het meestal verstan ­
dig een aantal vaste verhoudingen te kiezen waarbij de adsorptie 
hoger is dan 20 % en liefst hoger dan 50 % (62). terwijl erop moet worden gelet dat de concentratie van de teststof in de waterfase 
hoog genoeg blijft om nauwkeurig te kunnen worden gemeten. Dit is 
vooral belangrijk bij hoge adsorptiepercentages.
 
Een geschikte manier om de juiste verhouding bodemmonster/ ­
waterfase te kiezen is op basis van een raming van de K  d -waarde 
door voorbereidend onderzoek of erkende schattingstechnieken (zie aanhangsel 3). Vervolgens kan een geschikte verhouding worden 
gekozen op basis van een grafiek waarin de verhouding 
bodemmonster/oplossing bij vaste adsorptiepercentages is uitgezet tegen de K
 d (zie figuur 1). In deze grafiek wordt uitgegaan van 
een lineaire adsorptievergeliiking (  1 ). Het verband wordt verkregen 
door vergelijking 4 voor de K  d te herschikken tot vergelijking 1:  
V 0 
m soil ¼ Í m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
of in de logaritmische vorm, uitgaande van R = m  soil /V 0 en A eq %/100 
= m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Figuur 1:  Verband tussen de verhouding bodemmonster/oplossing 
en K  d bij verschillende adsorptiepercentages  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K d ·C aq ads ðeqÞ:
 Figuur 1 geeft een overzicht van de vereiste verhouding 
bodemmonster/oplossing als functie van K  d bij verschillende adsorp ­
tiepercentages. Zo wordt bij een verhouding 1:5 en een K  d van 20 
ongeveer 80 % van de teststof geadsorbeerd. Om bij dezelfde K  d een 
adsorptie van 50 % te krijgen moet een verhouding van 1:25 worden 
gebruikt. Als de geschikte verhouding bodemmonster/oplossing op 
deze manier wordt gekozen, geeft dit de nodige flexibiliteit om aan de experimentele behoeften te voldoen.
 
De gevallen waarin de chemische stof sterk of nauwelijks wordt 
geadsorbeerd, leveren meer problemen op. Bij een geringe adsorptie 
wordt een verhouding bodemmonster/oplossing van 1:1 aanbevolen, 
hoewel bij sommige zeer organische bodemtypes een lagere verhou ­
ding nodig kan zijn om een suspensie te verkrijgen. Bij de meting van kleine veranderingen in de concentratie in de oplossing moet 
zorgvuldig naar de analysemethode worden gekeken om te voor ­
komen dat de adsorptiemeting onnauwkeurig wordt. Anderzijds kan bij een zeer hoge verdelingscoëfficiënt K
 d de verhouding 
bodemmonster/oplossing worden opgevoerd tot wel 1:100 om ervoor 
te zorgen dat er een significante hoeveelheid van de stof in de 
oplossing achterblijft. Er moet echter voor een goede menging wor ­
den gezorgd en het systeem moet voldoende tijd krijgen voor de instelling van het evenwicht. Een andere aanpak is schatting van 
de K
 d -waarde met behulp van ramingstechnieken op basis van bij ­
voorbeeld de P  ow -waarde (zie aanhangsel 3). Dit kan met name 
nuttig zijn bij slecht geadsorbeerde/polaire stoffen met een P  ow < 
20 en lipofiele/sterk geadsorbeerde stoffen met een P  ow > 10  4 . 
1.9. UITVOERING VAN DE TEST  
1.9.1.  Testomstandigheden  
Alle experimenten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en in ­
dien mogelijk bij een constante temperatuur tussen 20  o C en 25  o C. 
Bij het centrifugeren moeten de omstandigheden zodanig zijn dat 
deeltjes groter dan 0,2 μm uit de oplossing kunnen worden verwij ­
derd. Dit zijn de kleinste deeltjes die als vaste deeltjes worden be ­
schouwd; beneden deze grenswaarde vallen ze in de categorie col ­
loïddeeltjes. Aanhangsel 4 bevat richtsnoeren om de centrifugeer ­
omstandigheden te bepalen.  
Als het centrifugeren niet zodanig kan gebeuren dat de verwijdering 
van grotere deeltjes dan 0,2 μm wordt gewaarborgd, moet een com ­
binatie van centrifugeren en filtreren met filters van 0,2 μm worden 
gebruikt. Deze filters moeten van een geschikt inert materiaal zijn 
vervaardigd om verliezen van de teststof daaraan te voorkomen. In elk geval moet worden aangetoond dat er bij het filtreren geen test ­
stof verloren gaat.
 
1.9.2.  Fase 1: Voorbereidend onderzoek  
Het doel van de uitvoering van een voorbereidend onderzoek is al in 
het hoofdstuk „Toepassingsgebied” beschreven. In onderstaande be ­
schrijving worden richtsnoeren gegeven voor de wijze waarop een 
dergelijk experiment kan worden opgezet.  
1.9.2.1.  Selectie van de optimale verhouding bodemmonster/oplossing  
Er worden twee bodemtypes en drie verhoudingen bodemmonster/ ­
oplossing gebruikt (zes experimenten). Eén bodemtype heeft een hoog gehalte aan organische koolstof en een laag kleigehalte en 
het andere een laag gehalte aan organische koolstof en een hoog 
kleigehalte. De volgende verhoudingen worden aangeraden:
 
— 50 g bodemmonster en 50 cm  3 oplossing van de teststof in water 
(verhouding 1:1),  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g bodemmonster en 50 cm  3 oplossing van de teststof in water 
(verhouding 1:5),  
— 2 g bodemmonster en 50 cm  5 oplossing van de teststof in water 
(verhouding 1:25).  
De minimale hoeveelheid bodemmonster waarmee het experiment 
kan worden uitgevoerd, is afhankelijk van de mogelijkheden van 
het laboratorium en de gebruikte analysemethode. Om betrouwbare 
resultaten te krijgen wordt echter aangeraden minimaal 1 g en bij voorkeur 2 g te gebruiken.
 
Eén controlemonster met uitsluitend de teststof in 0,01 M CaCl  2 - 
oplossing (zonder bodemmonster) wordt aan exact dezelfde behan ­
deling onderworpen als de testsystemen om de stabiliteit van de teststof in de CaCl
 2 -op-lossing en de mogelijke adsorptie aan de 
wanden van het proefvat te controleren.  
Voor elk bodemtype wordt één blancobepaling met dezelfde hoe ­
veelheid bodemmonster en een totaalvolume van 50 cm  3 0,01 M 
CaCl  2 -oplossing (zonder teststof) op dezelfde wijze behandeld. 
Deze bepaling fungeert als achtergrond tijdens de analyse om sto ­
rende stoffen of verontreinigde bodem te kunnen signaleren.  
Alle experimenten, ook de controle- en blancobepalingen, moeten 
minimaal in duplo worden uitgevoerd. Het totale aantal monsters dat voor het onderzoek nodig is kan aan de hand van de gevolgde 
methode worden bepaald.
 
In het algemeen worden voor het voorbereidend onderzoek en het 
hoofdonderzoek dezelfde methoden gebruikt. Uitzonderingen op deze regel worden waar nodig vermeld.
 
De aan de lucht gedroogde bodemmonsters worden geëquilibreerd 
door de nacht vóór de dag van het experiment (gedurende 12 uur) te 
schudden met een minimaal volume van 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 -op­
lossing. Vervolgens wordt een bepaald volume van de stockoplos ­
sing met de teststof toegevoegd om het uiteindelijke volume op 
50 cm  3 te brengen. Dit toegevoegde volume stockoplossing: a) 
mag niet groter zijn dan 10 % van het uiteindelijke volume van de waterfase van 50 cm
 3 om de aard van de oplossing vóór equilibreren 
zo weinig mogelijk te veranderen en b) moet bij voorkeur leiden tot 
een beginconcentratie van de teststof in contact met het bodemmon ­
ster (C  o ) die ten minste twee ordes van grootte hoger ligt dan de 
detectiegrens van de analysemethode: deze drempelwaarde waarborgt 
dat er ook bij een hoge adsorptie (> 90 %) nauwkeurige metingen 
kunnen worden uitgevoerd en dat later de adsorptie-isothermen kun ­
nen worden bepaald. Tevens wordt indien mogelijk een lagere begin ­
concentratie van de stof (C  o ) dan de helft van de oplosbaarheidsgrens 
aanbevolen.  
De concentratie van de stockoplossing (C  st ) kan analoog aan het 
volgende voorbeeld worden berekend. Uitgaande van een detectie ­
grens van 0,01 μg cm  -3 van 90 % en een adsorptie van 90 % moet 
de beginconcentratie van de teststof in contact met het bodemmon ­
ster bij voorkeur 1 μg cm  -3 zijn (twee ordes van grootte hoger dan de 
detectiegrens). Wanneer het maximale aanbevolen volume van de stockoplossing wordt toegevoegd, d.w.z. 5 cm
 3 aan 45 cm  3 geëqui­
libreerde 0,01 M CaCl  2 -oplossing (=10 % van de stockoplossing 
t.o.v. het totaalvolume van de waterfase van 50 cm  3 ), moet de con ­
centratie van de stockoplossing 10 μg cm  -3 zijn: dit is drie ordes van 
grootte hoger dan de detectiegrens van de analysemethode.  
De pH van de waterfase moet voor en na het contact met het bodem ­
monster worden gemeten, aangezien deze een belangrijke rol bij het 
hele adsorptieproces speelt, met name bij ioniseerbare stoffen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Het mengsel wordt geschud totdat het adsorptie-evenwicht zich heeft 
ingesteld. De daarvoor benodigde tijd varieert sterk, afhankelijk van 
de stof en het bodemmonster: meestal volstaat een periode van 24 uur (77). Aanbevolen wordt tijdens het voorbereidend onderzoek gedurende een schudperiode van 48 uur achtereenvolgens verschil ­
lende monsters te nemen (bv. na 4, 8, 24 en 48 uur). De analyse ­
tijdstippen moeten echter gelet op het werkschema in het laborato ­
rium flexibel worden gehanteerd.
 
Er zijn twee mogelijkheden voor de analyse van de teststof in de 
waterige oplossing: a) de parallelle methode en b) de seriële metho ­
de. Met nadruk moet worden gesteld dat de parallelle methode wel ­
iswaar experimenteel omslachtiger is, maar dat de mathematische 
behandeling van de resultaten eenvoudiger is (zie aanhangsel 5). 
De keuze van de gevolgde methode wordt echter aan de experimen ­
tator overgelaten, die rekening moet houden met de beschikbare laboratoriumfaciliteiten en middelen.
 
a) Parallelle methode: per tijdsinterval waarvoor de adsorptiekinetiek 
wordt onderzocht, wordt een mengsel met dezelfde verhouding 
bodemmonster/oplossing bereid. Na bijvoorbeeld 4 uur wordt de 
waterfase na centrifugeren en desgewenst filtreren zo volledig mogelijk uit de eerste buis verwijderd en vervolgens gemeten; na bijvoorbeeld 8 uur gebeurt dit voor de tweede buis, na 24 
uur voor de derde buis enz.
 
b) Seriële methode: voor elke verhouding bodemmonster/oplossing 
wordt slechts één mengsel in duplo bereid. Op vooraf bepaalde 
tijdstippen wordt het mengsel gecentrifugeerd om de fasen te scheiden. In een kleine hoeveelheid van de waterfase wordt de teststof onmiddellijk geanalyseerd; vervolgens gaat het experi ­
ment verder met het oorspronkelijke mengsel. Als na het centri ­
fugeren wordt gefiltreerd, moet filtratie van kleine hoeveelheden waterige oplossing in het laboratorium mogelijk zijn. Om te zor ­
gen dat de verhouding bodemmonster/oplossing niet significant 
verandert en de voor adsorptie beschikbare hoeveelheid oplossing 
tijdens de test niet afneemt, wordt aanbevolen in totaal niet meer dan 1 % van het totale volume van de oplossing voor de analyses te gebruiken.
 
Het adsorptiepercentage  A t i wordt op elk tijdstip t  i berekend op basis 
van de nominale beginconcentratie en de gemeten concentratie op het 
bemonsteringstijdstip t  i en gecorrigeerd voor de waarde van de blan ­
co-bepaling. De  A t i . wordt uitgezet tegen de tijd (zie figuur 1 in 
aanhangsel 5) om te bepalen wanneer het evenwicht wordt bereikt (  1 ). 
Tevens wordt de K  d -waarde bij evenwicht berekend. Op basis van 
deze K  d -waarde worden geschikte verhoudingen bodemmonster/ ­
oplossing uit figuur 1 gekozen, zodat het adsorptiepercentage hoger dan 20 % en bij voorkeur hoger dan 50 % is (61). Alle vergelijkingen en beginselen voor het tekenen van de curve worden vermeld in het 
hoofdstuk over gegevens en rapportage en in aanhangsel 5.
 
1.9.2.2.  Bepaling van de equilibratietijd voor adsorptie en de bij evenwicht 
geadsorbeerde hoeveelheid teststof  
Zoals reeds is vermeld, kan aan de hand van curves waarin  A t i of 
C aq ads tegen de tijd wordt uitgezet, worden bepaald wanneer het ad ­
sorptie-evenwicht zich heeft ingesteld en hoeveel teststof bij even ­
wicht is geadsorbeerd. De figuren 1 en 2 in aanhangsel 5 zijn voor ­
beelden van dergelijke curves. De equilibratietijd is de tijd die het 
systeem nodig heeft om stationair te worden.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Curves waarin de concentratie van de teststof wordt uitgezet tegen de tijd, kunnen ook 
worden gebruikt om te bepalen wanneer het evenwicht  ðC aq ads Þ wordt bereikt (zie figuur 2 
in aanhangsel 5).
 Indien bij een bepaald bodemmonster de curve niet horizontaal gaat 
lopen maar blijft stijgen, kan dit worden veroorzaakt door compli ­
cerende factoren zoals biologische afbraak of trage diffusie. Biologi ­
sche afbraak kan worden aangetoond door het experiment te herhalen met een gesteriliseerd bodemmonster. Als zich ook in dat geval geen 
evenwicht instelt, moet er worden gezocht naar andere verschijnselen 
die zich in dat specifieke geval kunnen voordoen; dit kan gebeuren door de experimentele omstandigheden (temperatuur, schudtijd, ver ­
houding bodemmonster/oplossing) te wijzigen. De experimentator 
moet zelf bepalen of het zinvol is de testprocedure verder uit te 
voeren, ook al zal zich wellicht geen evenwicht instellen.
 
1.9.2.3.  Adsorptie aan het oppervlak van hei proefvat en stabiliteit van de 
teststof  
Enige informatie over de adsorptie van de teststof aan het oppervlak 
van de proefvaten en over de stabiliteit van de stof kan uit een analyse van de controlemonsters worden afgeleid. Als er meer stof verdwijnt dan de standaardafwijking van de analysemethode, kan er 
sprake zijn van niet-biologische afbraak en/of adsorptie aan het op ­
pervlak van het proefvat. Deze verschijnselen kunnen van elkaar worden onderscheiden door de wanden van het proefvat grondig te 
wassen met een bekend volume van een geschikt oplosmiddel en de 
wasvloeistof op de teststof te analyseren. Als er geen adsorptie aan het oppervlak van het proefvat wordt waargenomen, wijst het ver ­
dwijnen van de teststof op niet-biologische afbraak. Als er wel ad ­
sorptie wordt geconstateerd, moeten er proefvaten van een ander 
materiaal worden gebruikt. De bij dit experiment verkregen gegevens over de adsorptie aan het oppervlak van de proefvaten kunnen echter niet rechtstreeks naar het experiment met bodemmonster/oplossing 
worden geëxtrapoleerd, aangezien deze adsorptie door de aanwezig ­
heid van het bodemmonster wordt beïnvloed.
 
Aanvullende informatie over de stabiliteit van de teststof kan worden 
verkregen door de bepaling van de massabalans van de teststof in de loop van de tijd. Dit betekent dat de waterfase, bodemextracten en de wanden van het proefvat op de teststof worden geanalyseerd. Het 
verschil tussen de toegevoegde massa en de som van de hoeveelhe ­
den die in de waterfase en bodemextracten en aan de wanden van het proefvat worden teruggevonden, is gelijk aan de afgebroken en; of verdampte en/of niet-geëxtraheerde hoeveelheid. Om een massaba ­
lans te kunnen bepalen moet net adsorptie-evenwicht zich binnen de 
periode waarin het experiment wordt uitgevoerd, hebber, ingesteld.
 
De massabalans wordt bepaald voor beide bodemtypes en één ver ­
houding bodemmonster/oplossing per bodemtype waarbij de depletie bij evenwicht hoger is dar, 20 % en bij voorkeur hoger dan 50 %. Wanneer het experiment om de verhouding te bepalen wordt afge ­
rond met de analyse van het laatste monster van de waterfase na 48 
uur, worden de fasen door centrifugeren en desgewenst filtreren gescheiden. De waterfase wordt zo volledig mogelijk verwijderd en aan de bodemfase wordt een geschikt oplosmiddel (een extractie ­
coëfficiënt van minimaal 95 %) toegevoegd om de reststof te extra ­
heren. Aanbevolen wordt deze extractie ten minste twee maal na elkaar uit te voeren. De hoeveelheid teststof in het bodem- en het proefvatextract wordt gemeten en de massabalans wordt bepaald (zie 
vergelijking 10 in het hoofdstuk Gegevens en rapportage). Als de 
massabalans lager is dan 90 %, wordt de reststof geacht binnen de tijdschaal van de test instabiel te zijn. Het onderzoek kan dan wel worden voortgezet, mits echter rekening wordt gehouden met de 
instabiliteit van de teststof; in dit geval wordt: aanbevolen in het 
hoofdonderzoek beide fasen te analyseren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  Fase 2: Adsorptiekinetiek hij één concentratie van de teststof  
Er worden vijf bodemtypes gebruikt, die uit tabel 1 worden gekozen. 
Indien mogelijk verdient het aanbeveling enkele of alle bodemtypes uit het voorbereidende onderzoek te gebruiken, omdat in dat geval 
fase 2 voor deze bodemtypes niet behoeft te worden herhaald.
 
Op basis van de resultaten van het voorbereidend onderzoek worden 
de equilibratietijd, de verhouding bodemmonster/oplossing, het ge ­
wicht van het bodemmonster, het volume van de waterfase in contact met het bodemmonster en de concentratie van de teststof in de oplossing gekozen. Analyse moet bij voorkeur gebeuren na ongeveer 
2, 4, 6, 8 (indien mogelijk ook 10} en 24 uur contacttijd; de schud ­
tijd kan tot maximaal 48 uur worden verlengd, wanneer is gebleken dat een stof een langere equilibratietijd vergt. De analysetijdstippen kunnen echter met enige flexibiliteit worden bepaald.
 
Elk experiment (één bodemmonster en één oplossing) wordt ten 
minste in duplo uitgevoerd om de spreiding van de resultaten te kunnen bepalen. In elk experiment wordt één blancobepaling opge ­
nomen. Daarbij worden dezelfde massa bodemmonster en hetzelfde 
volume 0,01 M CaCl
 2 -oplossing (zonder teststof) als bij het experi ­
ment gebruikt. Een controlemonster met alleen de teststof in 0,01 M Ca Cl
 2 -op lossing (zonder bodemmonster) wordt aan dezelfde behan ­
deling onderworpen om onverwachte afwijkingen te kunnen consta ­
teren.  
Het adsorptiepercentage wordt op elk tijdstip ( A t i ) en/of over elk 
tijdsinterval ( A Δt i ) berekend (al naar behoefte) en tegen de tijd uit ­
gezet. Tevens worden de verdelingscoëfficiënt K  d bij evenwicht en 
de genormaliseerde adsorptiecoëfficiënt voor organische koolstof 
K or . (voor apolaire organische stoffen) berekend.  
Resultaten van de bepaling van de adsorptiekinetiek  
De lineaire K  d -waarde is meestal een nauwkeurige beschrijving van 
het sorptiegedrag in de bodem (35)(78) en geeft de inherente mobi ­
liteit van chemische stoffen in de bodem aan. Zo worden chemische stoffen met een K
 d ≤ 1 cm  3 g -1 in het algemeen als mobiel be ­
schouwd. Ook op basis van de K  oc -waarden is een indelingssysteem 
voor de mobiliteit opgezet door MacCall et al. (16). Daarnaast zijn er indelingssytemen voor de uitloging op basis van een verband tussen K
 oc en DT-50 (  1 ) (32) (79).  
Op basis van ten foutenanalyse (61) is geconcludeerd dat K  d -waar­
den lager dan 0,3 cm  3 g -1 niet nauwkeurig kunnen worden bepaald 
aan de hand van een afname van de concentratie in de waterfase, 
zelfs als de (met het oog op de nauwkeurigheid) gunstigste verhou ­
ding bodemmonster/oplossing, d.w.z. 1:1 wordt gebruikt. In dit geval wordt een analyse van beide fasen, zowel bodem als oplossing, 
aanbevolen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50 tijd waarin 50 1/2 van de teststof wordt afgebroken.
 Gelet op bovenstaande opmerkingen wordt aanbevolen het onder ­
zoek naar het adsorptiegedrag van een chemische stof in de bodem 
en zijn potentiële mobiliteit uit te breiden met een bepaling van de adsorptie-isothermen volgens Freundlich, wanneer een nauwkeurige bepaling van K
 d met het hier beschreven experimentele protocol 
mogelijk is. Een nauwkeurige bepaling is mogelijk als vermenigvul ­
diging van K  d met de verhouding bodemmonster/oplossing een getal 
groter dan 0,3 opleven wanneer de daling van de concentratie in de waterfase wordt gemeten (indirecte methode) of een getal groter dan 
0,1 wanneer beide fasen worden geanalyseerd (directe methode) (61).
 
1.9.2.5.  Fase 3: Adsorptie-isothermen en desorptiekinetiek/desorptie-isother ­
men 
1.9.2.5.1. A d s o r p t i e - i s o t h e r m e n  
Er worden vijf concentraties van de teststof gebruikt, die bij voor ­
keur twee ordes van grootte beslaan: bij de keuze van deze con ­
centraties moet rekening worden gehouden met de oplosbaarheid in water en de resulterende evenwichtsconcentraties in de waterfase. Per bodemmonster moet in het hele onderzoek dezelfde verhouding 
bodem/oplossing worden gebruikt. De adsorptietest wordt volgens 
bovenstaande methode uitgevoerd, met als enige verschil dat de waterfase slechts éénmaal wordt geanalyseerd op het tijdstip waarop het evenwicht zich heeft ingesteld zoals bepaald tijdens fase 2. De 
evenwichtsconcentraties in de oplossing worden bepaald en de ge ­
adsorbeerde hoeveelheid wordt aan de hand van de afname van de hoeveelheid teststof in de oplossing berekend of met de directe methode bepaald. De geadsorbeerde massa teststof per massaeenheid 
bodemmonster wordt uitgezet tegen de evenwichtsconcentratie van 
de teststof (zie het hoofdstuk Gegevens en rapportage).
 
Resultaten van de bepaling van de adsorptie-isotherm  
Van de tot op heden gesuggereerde mathematische modellen voor de 
adsorptie wordt voor de beschrijving van het adsorptieproces meestal 
de Freundlich-isotherm gebruikt. Gedetailleerdere informatie over de 
interpretatie en relevantie van adsorptiemodellen is te vinden in de referenties (41) (45) (80) (83) (82).
 
NB: Er dient te worden opgemerkt dat een vergelijking van de 
waarde van K  F (adsorptiecoëffïciënt volgens Freundlich) voor ver ­
schillende stoffen alleen mogelijk is als deze K  1 -waarden in dezelfde 
eenheden worden uitgedrukt (83).  
1.9.2.5.2. D e s o r p t i e k i n e t i e k  
Dit experiment is bedoeld om na te gaan of een chemische stof 
reversibel of irreversibel aan de bodem wordt geadsorbeerd. Deze 
informatie is belangrijk, aangezien het desorptieproces ook bij het gedrag van een stof in de praktijksituatie een belangrijke rol speelt. Bovendien kunnen desorptiegegevens goed worden gebruikt bij com ­
putermodellen voor uitloging en de simulering van de afspoeling van 
opgeloste stoffen. Als een desorptie-onderzoek gewenst wordt, wordt aanbevolen de hier beschreven methode te volgen voor elk systeem waarvoor een nauwkeurige bepaling van K
 d bij de reeds beschreven 
methode ter bepaling van de adsorptiekinetiek mogelijk was.  
Net als voor de bepaling van de adsorptiekinetiek zijn er twee mo ­
gelijkheden voor de uitvoering van het desorptiekinetiekexperiment: a) de parallelle methode en b) de seriële methode. De keuze van de gevolgde methode wordt aan de experimentator overgelaten, die re ­
kening moet houden met de beschikbare laboratoriumfaciliteiten en 
middelen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Parallelle methode: voor elk bodemmonster waarvoor het desorp ­
tieonderzoek wordt uitgevoerd, wordt per tijdsinterval waarvoor 
de desorptiekinetiek wordt onderzocht, een mengsel met dezelfde verhouding bodemmonster/oplossing bereid. Bij voorkeur dienen dezelfde tijdsintervallen als bij het adsorptiekinetiekexperiment te 
worden gebruikt; het totale tijdsinterval kan echter waar nodig 
worden verlengd om te zorgen dat het desorptie-evenwicht zich kan instellen. Voor elk experiment (één bodemmonster, één op ­
lossing) wordt één blancobepaling uitgevoerd met dezelfde hoe ­
veelheid bodemmonster en 0,01 M CaCl
 2 -oplossing (zonder test ­
stof) als bij bet experiment. Een controlemonster met de teststof in 0,01 M CaCl
 2 -oplossing (zonder bodemmonster) wordt aan 
dezelfde behandeling onderworpen. Alle mengsels van bodem ­
monster met oplossing worden geschud totdat het adsorptie-even ­
wicht (zoals bepaald tijdens fase 2) zich instelt. Vervolgens wor ­
den de fasen door centrifugeren gescheiden en wordt de waterfase zo volledig mogelijk verwijderd. De verwijderde oplossing wordt 
vervangen door een gelijk volume 0,01 M CaCl
 2 -oplossing zon ­
der teststof en het nieuwe mengsel wordt opnieuw geschud. De waterfase van de eerste buis wordt na bijvoorbeeld 2 uur zo volledig mogelijk verwijderd en gemeten, van de tweede buis 
na 4 uur, van de derde buis na 6 uur, enz., totdat het desorp ­
tie-evenwicht wordt bereikt.
 
b) Seriële methode: na het adsorptiekinetiekexperiment wordt het 
mengsel gecentrifugeerd en wordt de waterfase zo volledig mo ­
gelijk verwijderd. De verwijderde oplossing wordt vervangen 
door een gelijk volume 0,01 M CaCl  2 - oplossing zonder teststof. 
Het nieuwe mengsel wordt geschud totdat het desorptie-even ­
wicht zich heeft ingesteld. Tijdens deze periode wordt het meng ­
sel op vooraf bepaalde tijdstippen gecentrifugeerd om de fasen te 
scheiden. In een kleine hoeveelheid van de waterfase wordt de teststof onmiddellijk geanalyseerd: vervolgens gaat het experi ­
ment verder met het oorspronkelijke mengsel. Het volume van 
elk monster voor de analyse mag niet groter zijn dan 1 % van het totale volume. Om te zorgen dat de verhouding bodemmonster/ ­
oplossing niet verandert, wordt het mengsel aangevuld met het ­
zelfde volume verse 0,01 M CaCl
 2 -oplossing en vervolgens wordt 
het schudden hervat tot het volgende analysetijdstip.  
Het desorptiepercentage wordt op elk tijdstip ( ðD t i Þ) over elk tijds ­
interval (ðD Δt i Þ) berekend (al naar behoefte) en tegen de tijd uitgezet. 
Tevens wordt de desorptiecoëfficiënt K  des bij evenwicht berekend. 
Alle benodigde vergelijkingen zijn vermeld in het hoofdstuk Gege ­
vens en rapportage en aanhangsel 5.  
Resultaten van het desorptiekinetiekietiekexperiment  
Door het desorptiepercentage  D t i en het adsorptiepercentage  A t i in 
één figuur tegen de tijd uit te zetten, kan de omkeerbaarheid van het adsorptieproces worden bepaald. Als het desorptie-evenwicht zich 
binnen uiterlijk tweemaal de equilibratietijd voor de adsorptie instelt 
en in totaal meer dan 95 % van de geadsorbeerde hoeveelheid wordt gedesorbeerd, wordt de adsorptie als reversibel beschouwd.
 
1.9.2.5.3. D e s o r p t i e - i s o t h e r m e n  
Desorptie-isothermen volgens Freundlich worden bepaald voor de 
bodemmonsters waarvoor ook de adsorptie-isothermen zijn bepaald. De uitvoering van het experiment gebeurt net als bij de bepaling van de desorptiekinetiek met als enige verschil dat de waterfase slechts 
éénmaal, bij het desorptie-evenwicht, wordt geanalyseerd. De gede ­
sorbeerde hoeveelheid reststof wordt berekend. De hoeveelheid test ­
stof die bij het desorptie-evenwicht aan het bodemmonster geadsor ­
beerd blijft, wordt uitgezet tegen de evenwichtsconcentratie van de 
teststof in de oplossing (zie het hoofdstuk Gegevens en rapportage 
en aanhangsel 5).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
De analysegegevens worden in de vorm van tabellen weergegeven 
(zie aanhangsel 6). De afzonderlijke metingen er de berekende ge ­
middelden worden vermeld. De adsorptie-isothermen worden gra ­
fisch weergegeven. De berekeningen worden volgens onderstaande 
voorschriften uitgevoerd.  
In dit verband wordt ervan uitgegaan dat 1 cm  3 waterige oplossing 
1 g weegt. De verhouding bodemmonster/oplossing kan in eenheden g/g of g/vol met hetzelfde getal worden weergegeven.
 
2.1. ADSORPTIE  
De adsorptie ( A t i ) wordt gedefinieerd als het percentage van de aan 
het begin van de test aanwezige stof dat onder de testomstandighe ­
den aan het bodemmonster wordt geadsorbeerd. Als de teststof sta ­
biel is en niet in significante mate aan de wanden van het vat wordt 
geadsorbeerd, wordt  A t i op elk tijdstip t  i , als volgt berekend:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
Hierbij is:  
A t i = adsorptiepercentage op het tijdstip t  i ( %);  
m s ads ðt i Þ = massa van de op het tijdstip t  i aan bet bodemmonster 
geadsorbeerde teststof ( μg); 
m 0 = massa van de teststof in de proefbuis aan het begin van 
de test (μg). 
Aanhangsel 5 bevat gedetailleerde informatie over de wijze waarop 
het adsorptiepercentage  A t i , voor de parallelle en seriële methode 
wordt berekend.  
De verdelingscoëfficiënt K  d is de verhouding tussen het gehalte van 
de bodemfase aan de slof en de massaconcentratie van de stof in de waterige oplossing onder de testomstandigheden nadat het adsorptie- evenwicht is bereikt.
 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
Hierbij is:  
C s ads ðeqÞ = gehalte aan de geadsorbeerde stof in het bodem ­
monster bij het adsorptie-evenwicht ( μg g-  1 ) 
C aq ads ðeqÞ = massaconcentratie van de stof in de waterfase bij 
adsorptie-evenwicht ( μg cm  -3 ). Deze concentratie 
wordt door analyse bepaald waarbij rekening wordt 
gehouden met het resultaat van de blancobepaling  
m s ads ðeqÞ = bij adsorptie-evenwicht aan het bodemmonster ge ­
adsorbeerde massa teststof ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = massa van de stof in de oplossing bij adsorptie- 
evenwicht ( μg) 
m soil = hoeveelheid van het bodemmonster, uitgedrukt in 
droge massa (g);  
V 0 = volume van de waterfase die aan het begin van de 
test in contact met het bodemmonster is (cm  -3 ). 
Het verband tussen A  eq en K  d is: 
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
Hierbij is:  
A eq = adsorptiepercentage bij adsorptie-evenwicht in %.  
De genormaliseerde adsorptiecoëfficiënt voor organische koolstof 
K oc geeft het verband aan tussen de verdelingscoëfficiënt K  d en 
het gehalte van het bodemmonster aan organische koolstof:  
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
Hierbij is:  
% OC = percentage organische koolstof in het bodemmonster (g g  -1 ). 
K oc is een coëfficiënt die vooral kenmerkend is voor de verdeling 
van apolaire organische stoffen over de organische koolstof in de 
bodem of het sediment en water. De adsorptie van deze stoffen is gecorreleerd aan het gehalte van de sorberende vaste stof aan orga ­
nisch materiaal (7); K
 oc is derhalve afhankelijk van de specifieke 
kenmerken van de humusfracties die door verschillen in onder an ­
dere herkomst en ontstaanswijze aanzienlijke verschillen in sorptie ­
capaciteit vertonen.  
2.1.1.  Adsorptie-isothermen  
De vergelijking voor de adsorptie-isothermen volgens Freundlich 
geeft het verband aan tussen de geadsorbeerde hoeveelheid teststof en de concentratie van de teststof in oplossing bij evenwicht (ver ­
gelijking 8).
 
De gegevens worden behandeld als onder „Adsorptie” en voor elke 
proefbuis wordt het gehalte aan de aan het bodemmonster geadsor ­
beerde teststof na de adsorptietest  C s ads ðeqÞ, elders aangegeven als 
x/m) berekend. Aangenomen wordt dat het evenwicht zich heeft in ­
gesteld en dat  C s ads ðeqÞ de waarde bij evenwicht vertegenwoordigt:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ C 0 Ä C aq ads ðeqÞ h i
:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
De adsorptievergelijking volgens Freundlich is:  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) 
(8) 
of in de lineaire vorm:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ 
(9) 
Hierbij is:  
K F ads = de adsorptiecoëfficiënt volgens Freundlich; de dimensie is 
uitsluitend cm  3 g -1 als l/n = 1; in alle andere gevallen wordt 
de helling 1/n geïntroduceerd in de dimensie van  K F ads (μg 1- 
1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ); 
n = de regressieconstante; 1/n ligt meestal tussen 0,7 en 1,0 
hetgeen aangeeft dat de sorptiegegevens vaak enigszins niet-lineair zijn.
 
De vergelijkingen 8 en 9 worden uitgezet en de waarden van  K F ads 
en 1/n worden berekend door regressieanalyse met behulp van ver ­
gelijking 9. De correlatiecoëfficiënt r  2 van de log-vergelijking wordt 
ook berekend. Figuur 2 bevat een voorbeeld van dergelijke curves.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Figuur 2:  Freundlich-adsorptiecurves, normaal en lineair.  
2.1.2.  Massabalans  
De massabalans (MB) wordt gedefinieerd als het percentage van een 
stof dat na een adsorptietest door analyse wordt teruggevonden in vergelijking met de nominale hoeveelheid stof aan het begin van de test.
 
De behandeling van de gegevens verschilt voor oplosmiddelen die al 
dan niet volledig mengbaar zijn met water. Voor met water meng ­
bare oplosmiddelen kan de onder „Desorptie” beschreven behan ­
deling van de gegevens worden gebruikt om de door oplosmiddel ­
extractie teruggevonden hoeveelheid stof te bepalen. Als het oplos ­
middel minder goed mengbaar is met water, moet de teruggevonden hoeveelheid apart worden bepaald.
 
De massabalans MB voor de adsorptie wordt als volgt berekend 
(aangenomen wordt dat de term (m  E ) overeenkomt met de totale 
hoeveelheid teststof die met een organisch oplosmiddel uit het bo ­
demmonster en de wanden van het proefvat wordt geëxtraheerd):  
MB ¼ Í 
V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Î 
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
Hierbij is:  
MB = massabalans ( %);  
m E = totale hoeveelheid teststof die in twee stappen uit het bo ­
demmonster en de wanden van het proefvat wordt geëx ­
traheerd ( μg); 
C o = massaconcentratie van de testoplossing in contact met het 
bodemmonster op het tijdstip t = 0 ( μg cm  -3 ): 
V rec = volume van het supernatans dat na het adsorptie-evenwicht 
wordt verwijderd (cm  -3 ), 
2.2. DESORPTIE  
De desorptie (D) wordt gedefinieerd als het percentage van de test ­
stof dat onder de testomstandigheden wordt gedesorbeerd in vergelij ­
king met de hoeveelheid stof die daarvoor was geadsorbeerd:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
Hierbij is:  
D t i = desorptiepercentage op het tijdstip t  i ( %);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = massa van de uit het bodemmonster gedesorbeerde 
teststof op het tijdstip t  i (μg); 
m s ads ðeqÞ = massa van de bij adsorptie-evenwicht aan het bodem ­
monster geadsorbeerde teststof ( μg). 
Aanhangsel 5 bevat gedetailleerde informatie over de wijze waarop 
het desorptiepercentage  D 
t i voor de parallelle en de seriële methode 
wordt berekend.  
De schijnbare desorptiecoëfficiënt (K  des ) is de verhouding tussen het 
resterende gehalte van de bodemfase aan de stof en de massacon ­
centratie van de gedesorbeerde stof in de waterige oplossing onder 
de testomstandigheden nadat het desorptie-evenwicht is bereikt:  
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
Hierbij is:  
K des = desorptiecoëfficiënt (cm  3 g -1 ) 
m aq des ðeqÞ = totale massa van de bij dessorptie-evenwicht uit het 
bodemmonster gedesorbeerde teststof ( μg); 
V T = totaalvolume van de waterfase die tijdens de desorp ­
tiekinetiektest in contact met het bodemmonster is (cm
 -3 ) 
In aanhangsel 5 worden in het hoofdstuk „Desorptie” richtsnoeren 
gegeven voor de berekening van  m aq des ðeqÞ. 
Opmerking  
Als de adsorptietest volgens de parallelle methode werd uitgevoerd, 
wordt het volume V  T in vergelijking 12 gelijkgesteld aan V  o . 
2.2.1.  Desorptie-isothermen  
De vergelijking voor de desorptie-isothermen volgens Freundlich 
geeft het verband aan tussen de hoeveelheid teststof die aan het 
bodemmonster geadsorbeerd blijft en de concentratie van de teststof 
in oplossing bij het desorptie-evenwicht (vergelijking 16).  
Voor elke proefbuis wordt de hoeveelheid teststof die bij het desorp ­
tie-evenwicht aan het bodemmonster geadsorbeerd blijft, als volgt berekend:
 
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ wordt gedefinieerd als:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
Hierbij is:  
C s des ðeqÞ = gehalte aan de teststof dat bij het desorptie-evenwicht 
aan het bodemmonster geadsorbeerd blijft ( μg g-  1 ): 
m m des ðeqÞ = analytisch bepaalde massa van de stof in de waterfase 
bij desorptie-evenwicht ( μg); ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = massa van de stof die door onvolledige vervanging 
van het volume overblijft van het adsorptie- even ­
wicht (μg); 
m aq des ðeqÞ = massa van de stof in de oplossing bij het adsorptie- 
evenwicht ( μg); 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· Í V 0 Ä V R 
V 0 Î (15) 
V r F = volume van de oplossing dat voor de bepaling van de test ­
stof bij het desorptie-evenwicht uit de buis is genomen (cm
 3 ); 
V R = volume van het supernatans dat na het bereiken van het 
adsorptie-evenwicht uit de buis is verwijderd en is vervan ­
gen door een gelijk volume 0,01 M CaCl  2 -oplossing (cm  3 ); 
De desorptievergelijking volgens Freundlich is:  
C s des ðeqÞ ¼ K F des ·C aq des ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
of in de lineaire vorm:  
logC  s des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  aq des ðeqÞ (17) 
Hierbij is:  
K F des = de desorptiecoëfficiënt volgens Freundlich;  
n = de regressieconstante;  
C aq des ðeqÞ = de massaconcentratie van de stof in de waterfase bij 
desorptie-evenwicht ( μg cm  -1 ). 
De vergelijkingen 16 en 17 kunnen worden uitgezet en en  K F des en 
1/n worden berekend door regressie-analyse met behulp van vergelijking 17.
 
Opmerking  
Als de adsorptie- of desorptie-exponent volgens Freundlich (1/n) 
gelijk is aan 1, is de adsorptie- of desorptie-coëfficiënt volgens 
Freundlich  K F ads respectievelijk  K F des ) gelijk aan de adsorptie- of 
desorptie-evenwichtsconstante (K  d respectievelijk K  des en is de curve 
van C  s tegen C  aq lineair. Als de exponent niet gelijk is aan 1, is de 
curve van C  s tegen C  aq niet lineair en varieert de adsorptie- en 
desorptieconstante over de isotherm.  
2.2.2.  Testverslag  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
— Volledige identificatie van de gebruikte bodemmonsters met ver ­
melding van:  
— geografische gegevens van de locatie (lengte en breedte),  
— datum van monsterneming,  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— gebruikspatroon (landbouw, bosbouw, enz.),  
— diepte van monsterneming,  
— zand/silt/kleigehalte,  
— pH-waarden (in 0,01 M CaCl  2 ), 
— gehalte aan organische koolstof,  
— gehalte aan organisch materiaal,  
— stikstofgehalte,  
— C/N-verhouding,  
— kationuitwisselingscapaciteit (mmol/kg),  
— alle informatie over het verzamelen en de opslag van bodem ­
monsters,  
— indien van toepassing, alle relevante informatie voor de inter ­
pretatie van de adsorptie/desorptie van de teststof,  
— referentie van de methoden die voor de bepaling van de verschil ­
lende parameters zijn gebruikt;  
— informatie over de teststof, indien van toepassing;  
— temperatuur van de experimenten;  
— omstandigheden bij het centrifugeren;  
— analysemethode die voor de bepaling van de teststof is gebruikt;  
— motivering voor een eventueel gebruik van een solubilisator bij 
de bereiding van de stockoplossing van de teststof;  
— verklaring voor correcties bij de berekeningen, indien van toe ­
passing;  
— gegevens aan de hand van het formulier daarvoor (aanhangsel 6) 
en grafische afbeeldingen;  
— alle informatie en opmerkingen die nuttig kunnen zijn voor de 
interpretatie van de testresultaten.  
3. REFERENTIES  
(1) Kukowski H. and Brümmer G.. (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.
 
(2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L. (1987). Selection of Re ­
presentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 
02 045, Part I.  
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No l.94.60. Joint Research Centre. European Commission, IS ­
PRA, December 1994.  
(4) OECD Test Guidelines Programme. Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments. Beligirate. Italy. 18-20 january 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Gui ­
delines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 
163-1. Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Adden ­
dum 6 on Data Reporting, 540 09-88-096. Date: l 1988.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines. Series 
83 5-rate. Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048. April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Gui ­
delines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.  
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dan ­
gerous to health or especially harmful to the environment.  
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Pro ­
tection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
 
(12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Me ­
thodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena” in In ­
teractions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.
 
(14) Hasset J.)., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of non ­
polar organics by soils and sediments” in Reactions and Move ­
ment of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
 
(15) van Genuchten M.Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous me ­
dia”. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29-35.
 
(16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L, and Dishburger H.J., 
(1981), „Measurement of sorption coefficients of organic che ­
micals and their use, in environmental fate analysis”, in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. 
Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.  
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R.H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. 
Weeds, 13, pp. IS5-190.  
(18) Rhodes R.C, Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determina ­
tion of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524-528.  
(19) Russell M. H., (199 5), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd.  
(20) Esser H. O., Hemingway R.J., Klein W, Sharp D.B., Vonk J.W. 
and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the eva ­
luation of the environmental behavior of pesticides”, IUPAC 
Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, pp. 901-932.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experimen ­
tal models for studying the persistence of pesticides in soils”. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Her ­
bicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.  
(22) Furminge C. G. L., and O.sgerbybv J. M., (1967), „Persistence 
of herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269-273.  
(23) Burkhard N., and Guth J. A.. (1981), „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45-52.
 
(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961-971.
 
(25) Osgerby J. M., (1973). „Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.  
(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass.-Bo ­
den-Lufthyg. Berlin-Dahlem. Heft 37. pp. 143-154.  
(27) Hamaker I.W. (1975). „The interpretation of soil leaching ex ­
periments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed.), pp. 13 5-172, Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C.S. (1971). „Pesticide mobility in soils”. Soil Soc. 
Soc. Amer. Proc., 35, pp. 732-210.  
(29) Hamaker I. W. (1972). „Diffusion and volatilization” in Orga ­
nic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. 
Hamaker eds). Vol. l. pp. 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
 
(31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movementin soils”. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340-3 50.  
(34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxidation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11. pp. 389-395.
 
(35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling fed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80-101.
 
(36) Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572-576.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between chemi ­
cal structure and the sorption of some herbicides by soils”. J. 
Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.  
(38) Briggs G.G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
 
(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.  
(41) Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29-92.
 
(42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32: pp. 222-234.
 
(43) Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, pp. 1-17.  
(45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in 
organic chemicals' in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I, and Hamaker J.W.. eds), Vol 1 and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972. pp. 49-143.”
 
(46) Deli J., and Warren G F., 19 71, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 67-69.  
(47) Chu-Huang Wu. Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
 
(48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson I.M. (1968), „Ad ­
sorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations” in 
isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, Internatio ­
nal. Atomic Energy Agency, Vienna.  
(49) Pionke H.B., and Deangelis R.J. (l980), „Methods for distribu ­
ting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for Che ­
micals, Run-off and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19. Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality — Ge ­
neral aspects: chemical and physical methods of analysis bio ­
logical methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtsschabel, Lekrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
(52) Black, Evans D.D., White J, L., Ensminger L.E. and Clark 
F.E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Pan 1: Gui ­
dance on the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Pan 2: Gui ­
dance on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Gui ­
dance on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Gui ­
dance on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Gui ­
dance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Gui ­
dance on the collection, handling and storage of soil for the 
assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970), „Precision in pes ­
ticide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc, 34, 
pp. 3 5 3-3 54.  
(60) Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of 
soil to water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109-138.
 
(61) Boesten, J.J.T.I., „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990. 30, pp. 31-41.  
(62) Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD gui ­
deline 106”. Proceedings of 5th international workshop on en ­
vironmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980), „Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure 
chimique”. Weed Res. 21, pp. 227-231.  
(64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), pp. 382-386.  
(65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Par ­
tition equilibria of non-ionic organic compounds between soil 
organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), pp. 
227-231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U. (1984),„Sorption of organic sub ­
stances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.
 
(67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C, (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
 
(68) Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Handbook 
of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Be ­
haviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E.E. and Goring C.A.I. (1980). „Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic 
Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 
707. Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C.T., Peters L.J. and Freed Y. H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic com ­
pounds”. Science, Vol. 206, pp. 831-832.  
(71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G. and Means J.C. (1981), 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrorophobic. sorption”. Soil Sci. Soc. Am.). 45, pp. 38-42.
 
(72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. 
Chemosphere, Vol. 10iS), pp. 833-846.  
(73) Moreale A., van Bladel R. (1981). „Adsorption de 13 herbici ­
des et insecticides par le sol. Relation solubilité-reactivité”. 
Revue de l'Agric, 34-14). pp. 319-322.  
(74) Müller M., Kördel W. (1996). „Comparison of screening me ­
thods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil”. Chemosphere, 32(12). pp. 2493-2504.
 
(75) Kördel W., Kotthoff G.. Müller M. (1995). „HPLC — scree ­
ning method for the determination of the adsorption coefricien: 
on soil — results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1373-1384.
 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC — screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil — comparison of different stationary phases”. Chemos ­
phere 27 (12), pp. 2341-2352.  
(77) Hance, R.J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed Re ­
search. Vol. 7, pp. 29-36.  
(78) Koskinen W.O and Harper S.S., (1990), „The retention proces ­
ses: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Pro ­
cesses, impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsei R.F., and Enfield C.G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C.H., (1970). „Interpretation and use of sorption iso ­
therms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
 
(81) Giles, C. H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D. 
(1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides sur ­
face areas of soils”. J. Chem. Soc, pp. 3973-93.  
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C. (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de 1'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
(84) Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint Internatio ­
nal Symposium, Physicochemical Properties and their Role in 
Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.  
(85) Soil Texture Classification (US and 1AO systems): Weed Sci ­
ence, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:505 (1962).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
Aanhangsel 1  
Testschema
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Aanhangsel 2  
INVLOED VAN DE NAUWKEURIGHEID VAN DE ANALYSE ­
METHODE EN DE CONCENTRATIEVERANDERING OP DE NAUW ­
KEURIGHEID VAN DE ADSORPTIERESULTATEN  
Uit onderstaande tabel (84) blijkt duidelijk dat wanneer het verschil tussen de 
aanvankelijke massa (m  0 =110 μg) en de evenwichtsmassa m m aq ads ðeqÞ (eq) = 100 
μg) van de teststof in de oplossing heel klein is, een fout van 5 % in de meting 
van de evenwichtsconcentratie leidt tot een fout van 50 % bij de berekening van het gehalte aan de stof dat aan het bodemmonster is geadsorbeerd (
m s ads ðeqÞ) en 
van 52,4 % bij de berekening van K  d . 
Hoeveelheid bodemmonster: m  soil = 10 g 
Volume van de oplossing: V  o = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg -1 ) R‡ K  d * R‡  
VOOR A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg of 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 Ware 
waarde 10 1,00 Ware 
waarde 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
VOOR A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg of 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 Ware 
waarde 60,0 6,00 Ware 
waarde 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 
55,0 0,5 50 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
VOOR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg of 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 Ware 
waarde 108,9 10,89 Ware 
waarde 990 
1,111 0,0111 1 % 108,88 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ " 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ # 
V 0 
m soil:Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = waarin: massa van de teststof in de bodemfase bij evenwicht ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = massa van de teststof in, de waterfase bij evenwicht ( μg) 
C s ads ðeqÞ = gehalte van de bodemfase aan de teststof bij evenwicht ( μg g -1 ; 
C aq ads ðeqÞ = massaconcentratie van de teststot in de waterfase bij evenwicht μg (cm  -3 ; 
R = analysefout in de bepaling van  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = fout in berekening ten gevolge van de analysefout R.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
Aanhangsel 3  
SCHATTINGSTECHNIEKEN VOOR K  d 
1. Schattingstechnieken maken een prognose van K  d mogelijk op basis van 
een correlatie met bijvoorbeeld P  ow -waarden (12) (39) (63-68), gegevens 
over de oplosbaarheid in water (12) (19) (21) (39) (68-73), of polariteits ­
gegevens die door HPLC bij omgekeerde fase zijn verkregen (74-76). K  oc 
of K  om wordt berekend met behulp van de vergelijkingen in de tabellen 1 
en 2 en vervolgens wordt K  d berekend uit de vergelijkingen:  
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Deze correlaties zijn gebaseerd op twee uitgangspunten: (1.) de adsorptie 
van een stof wordt vooral bepaald door het organisch materiaal in de 
bodem en (2.) de interacties daarbij zijn voornamelijk niet-polair. Dit be ­
tekent dat deze correlaties: (1) niet of slechts tot op zekere hoogte gelden voor polaire stoffen en (2.) niet kunnen worden gebruikt wanneer het gehalte van de bodem aan organisch materiaal zeer laag is (12). Bovendien 
is de correlatie tussen P
 ow en de adsorptie wel bevredigend gebleken (19), 
maar kan dit niet worden gezegd voor het verband tussen de oplosbaarheid in water en de adsorptie (19) (21); tot op heden zijn de resultaten van de studies zeer tegenstrijdig.
 
3. In de tabellen 1 en 2 worden enkele voorbeelden gegeven van de correlatie 
tussen de adsorptiecoëfficiënt en respectievelijk de verdelingscoëfficiënt 
octanol/water en de oplosbaarheid in water.  
Tabel 1  
Voorbeelden van de correlatie tussen de adsorptiecoëfficiënt en de verdelingscoëfficiënt octanol/water; zie 
voor andere voorbeelden (12) en (68)  
Stoffen Correlaties Auteurs  
Gesubstitueerde ureumver ­
bin-dingen log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Gechloreerde aromaten log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou et al (1983) (65) 
Uiteenlopende pesticiden log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl en Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatische koolwaterstof ­
fen log K  oc = - 2,5 3 + 1,15 log P  ow Vowles en Mantoura (1987) (67)  
Tabel 2  
Voorbeelden van de correlatie tussen de adsorptiecoëfficiënt en de oplosbaarheid in water; zie voor andere 
voorbeelden (68) en (69).  
Verbindingen Correlaties Auteurs  
Uiteenlopende pesticiden log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl en Mingelgrin (1984) (66) 
Gechloreerde alifaten en aro ­
maten log K  om = (4,040 +/- 0,038) -(0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou et al. (1979) (70) 
a-Naftol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Cyclische alifaten en aroma ­
ten log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Uiteenlopende stoffen log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Aanhangsel 4  
BEREKENINGEN VOOR DE BEPALING VAN DE CENTRIFUGEER ­
OMSTANDIGHEDEN  
1. Voor de centrifugeertijd geldt, uitgaande van ronde deeltjes, de volgende 
formule:  
t ¼ 9 
2 " 
η 
ω 2 rp 2 ðρ s Ä ρ aq Þ # 
lnðR b=R t Þ (1) 
Ter vereenvoudiging worden alle parameters in niet-Sl-eenheden (g, cm) 
beschreven.  
Hierbij is:  
ω = rotatiesnelheid (= 2 π rpm/60) in rad s-  1 
rpm = aantal omwentelingen per minuut  
η = viscositeit van de oplossing in g s-  1 cm-  1 
r p = straal van de deeltjes in cm  
ρ s = dichtheid van het bodemmonster in g cm-  3 
ρ aq = dichtheid van de oplossing in g cm-  3 
R t = afstand tussen het middelpunt van de centrifugerotor en het 
vloeistofoppervlak in de centrifugebuis in cm  
R b = afstand tussen het middelpunt van de centrifugerotor en de bo ­
dem van de centrifugebuis in cm  
R b -R t = hoogte van het mengsel bodemmonster/oplossing in de centrifu ­
gebuis in cm.  
Om een volledige scheiding te waarborgen moet in het algemeen het dub ­
bele van de berekende tijd worden gebruikt.  
2. Vergelijking (1) kan verder worden vereenvoudigd als we ervan uitgaan dat de 
viscositeit ( η) en de dichtheid ( ρ aq ) van de oplossing gelijk zijn aan de vis ­
cositeit en de dichtheid van water bij 25  o C, d.w.z. η = 8,95 x 10-  3 g s-  1 cm-  1 
en ρ aq = 1,0 g.cm-  3 . 
In dat geval geldt voor de centrifugeertijd:  
t ¼ 3:7 
ðrpmÞ 2:r p 2 ðρ s Ä lÞ ln R b 
R t (2) 
3. Uit vergelijking (2) blijkt dat voor een scheiding van deeltjes met een 
specifieke grootte (in ons geval een straal van 0,1 μm) twee parameters 
belangrijk zijn bij de bepaling van de centrifugeeromstandigheden (tijd en snelheid): 1. de dichtheid van het bodemmonster en 2. de hoogte van het 
mengsel in de centrifugebuis (R
 b -R t ), d.w.z. de afstand die een bodem ­
deeltje van het vloeistofoppervlak van de oplossing naar de bodem van de buis moet afleggen; bij een vast volume wordt de hoogte van het mengsel in de buis uiteraard bepaald door het kwadraat van de straal van 
de buis.
 
4. Figuur 1 geeft het verband tussen centrifugeertijd (t) en -snelheid (rpm) bij 
uiteenlopende bodemdichtheid ( ρ s ) (figuur la) en uiteenlopende hoogte van 
het mengsel in de centrifugebuis (figuur 1b). Uit figuur la blijkt duidelijk 
wat de invloed van de bodemdichtheid is: bij een gangbare centrifugeer ­
snelheid van 3 000 rpm is de centrifugeertijd ongeveer 240 minuten bij een bodemdichtheid van 1,2 g cm
 3 en slechts 50 minuten bij 2,0 g cm  3 . Figuur 
lb levert voor een gangbare centrifugeersnelheid van 3 000 rpm ongeveer 
50 minuten op bij een hoogte van het mengsel van 10 cm en slechts zeven minuten bij een hoogte van 1 cm. Het is echter belangrijk dat er een optimaal compromis wordt gevonden tussen zo kort mogelijk centrifugeren 
en optimaal gebruiksgemak bij de scheiding van de fasen na het centrifu ­
geren.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Bovendien moet bij de bepaling van de experimentele omstandigheden bij 
het scheiden van bodemfase en oplossing worden bedacht dat er een derde 
„pseudofase” kan ontstaan: colloïden. Deze deeltjes met een grootte van minder dan 0,2 μm kunnen een belangrijke rol spelen bij het hele adsorp ­
tiemechanisme van een stof in een bodemsuspensie. Wanneer wordt gecen ­
trifugeerd zoals hierboven is beschreven, blijven de colloïden in de water ­
fase en worden ze tegelijk met de waterfase geanalyseerd. Dit betekent dat de informatie over het effect van deze deeltjes verloren gaat.
 
Als het laboratorium beschikt over ultracentrifuges of ultrafiltratiefacilitei ­
ten, kan de adsorptie/desorptie van een stof in de bodem diepgaander 
worden onderzocht en kan ook informatie worden verkregen over de ad ­
sorptie van de stof aan colloïden. In dit geval moet ultracentrifugatie bij 60 000 rpm of ultrafiltratie met een porositeit van 100 000 Dalton worden gebruikt voor een scheiding van de drie fasen bodem, colloïden en oplos ­
sing. Het testprotocol moet ook dienovereenkomstig worden gewijzigd, 
zodat de analyse van de stof bij alle drie fasen wordt uitgevoerd.
 
Figuur la: Verband tussen centrifugeertijd (t) en centrifugeersnelheid (rpm) 
bij uiteenlopende bodemdichtheid ( ρ 5 ). R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, η = 
8,95 × 10-  3 g s-  1 cm-  1 en ρ aq = 1,0 g cm-  3 bij 25  o C.
 
Figuur 1b: Verband tussen centiïiugeertijd (t) en centrifugeersnelheid (rpm) 
bij uiteenlopende hoogte van het meng sel in de centrifugebuis (R  b -R t ) = L; 
R t = 10 cm, η = 8,9 5 x 10-  3 g s-  1 cm-  1 , ρ aq = 1,0 g cm-  3 bij 25  o C en ρ s = 
2,0 g cm-  3 . ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
Aanhangsel 5  
BEREKENING VAN DE ADSORPTIE A ( %) EN DESORPTIE D ( %)  
Het tijdschema voor de procedure is:
  
Voor alle berekeningen wordt ervan uitgegaan dat de teststof stabiel is en niet in 
significante mate aan de wanden van het proefvat wordt geadsorbeerd.  
ADSORPTIE A (%)  
a) Parallelle methode  
Het adsorptiepercentage wordt voor elke proefbuis (i) op elk tijdstip t  i 
berekend volgens de vergelijking:  ( 1 ) 
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 (%) ( 1 ) 
De factoren in deze vergelijking worden als volgt berekend: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m 0 Ä C aq ads ðt i Þ·V 0 (μg) (3) 
Hierbij is:  
A t i = adsorptiepercentage (%) op het tijdstip t  i 
m s ads ðt i Þ = massa van de aan het bodemmonster geadsorbeerde teststof 
op het tijdstip t  i waarop de analyse wordt uitgevoerd ( μg) 
m 0 = massa van de teststof in de proefbuis aan het begin van de 
test (μg) 
C o = massaconcentratie van de testoplossing in contact met het 
bodemmonster op het tijdstip t = 0 ( μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1226  
( 1 ) Deze vergelijkingen gelden voor zowel de directe als de indirecte methode. Alle andere 
vergelijkingen gelden alleen voor de indirecte methode.
 C aq ads ðt i Þ = massaconcentratie van de stof in de waterfase op het tijdstip t  i 
waarop de analyse wordt uitgevoerd ( μg cm  -3 ): deze concen ­
tratie wordt door analyse bepaald, rekening houdend met de resultaten van de blancobepaling
 
V O = volume van de testoplossing in contact met het bodemmon ­
ster op het tijdstip t = 0 (cm  3 ). 
Het adsorptiepercentage  A t i of C aq ads ðt i Þ wordt uitgezet tegen de tijd en 
vervolgens wordt het tijdstip bepaald waarop het sorptie-evenwicht zich heeft ingesteldt de figuren 1 en 2 bevatten voorbeelden van dergelijke 
curves.
 
Figuur 1  
Adsorptie-evenwichtscurve
  
Figuur 2  
Massaconcentratie van de teststof in de waterfase (C  aq ) uitgezet 
tegen de tijd  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Seriële methode  
In de volgende vergelijkingen wordt er rekening mee gehouden dat de 
adsorptieprocedure wordt uitgevoerd door meting van de teststof in kleine porties van de waterfase na specifieke tijdsintervallen.
 
— De hoeveelheid van de stof die gedurende elk tijdsinterval aan het 
bodemmonster wordt geadsorbeerd, wordt als volgt berekend:  
— voor het eerste tijdsinterval Δt 1 = t 1 - t o 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ· Í V 0 
v a A Î 
(4) 
— voor het tweede tijdsinterval Δt2 = t2- t1  
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m m ads ðt 1 Þ· Í V 0 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 2 Þ· Í V 0 Ä v a A 
v a A Î 
(5) 
— voor het derde tijdsinterval Δt 3 = t 3 — t  2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ· Í V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 3 Þ· Í V 0 Ä 2·v a A 
v a A Î 
(6) 
— voor het n  e tijdsinterval Δt n = t n — t  n-1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m m ads ðt nÄ1 Þ· Í V 0 Ä ðn Ä 2Þ·v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ· Í ðV 0 Ä ðn Ä 1Þ·v a A Þ 
v a A Î 
(7) 
— Het adsorptiepercentage over elk tijdsinterval ( A Δt i ) wordt berekend met 
behulp van de volgende vergelijking:  ( 1 ) 
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 ·100ð%Þ (8) (  1 ) 
terwijl het adsorptiepercentage op het tijdstip t  i (A t i ) wordt berekend 
met de vergelijking:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) (  1 ) 
Het adsorptiepercentage  A t i of A Δt i (afhankelijk van de eisen van de 
studie) wordt uitgezet tegen de tijd en vervolgens wordt het tijdstip bepaald waarop het sorptie-evenwicht zich heeft ingesteld.
 
— Op het evenwichtstijdstip t  eq : 
— is de massa van de aan het bodemmonster geadsorbeerde teststof:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) (  1 ) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1228  
( 1 ) Deze vergelijkingen gelden voor zowel de directe als de indirecte methode. Alle andere 
vergelijkingen gelden alleen voor de indirecte methode.
 — is de massa van de teststof in de oplossing:  ( 1 ) 
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) (  1 ) 
— en is het adsorptiepercentage bij evenwicht:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) (  1 ) 
De hier gebruikte parameters worden gedefinieerd als:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = massa van de aan het bodemmon ­
ster geadsorbeerde teststof gedu ­
rende de tijdsintervallen Δt 1 , Δt 2 
… Δt n (μg) 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = massa van de stof, gemeten in een 
monster op het tijdstip  v a A op het 
tijdstip t  1 , t 2 ,t n (μg); 
m s ads ðeqÞ = massa van de aan het bodemmon ­
ster geadsorbeerde teststof bij het adsorptie-evenwicht f( μg)
 
m aq ads ðeqÞ = massa van de stof in de oplossing 
bij het adsorptie-evenwicht ( μg) 
v a A = volume van het monster waarin de 
teststof wordt bepaald (cm  3 ) 
A Δt i = adsorptiepercentage dat overeen ­
komt met een tijdsinterval At  i (%) 
A eq = adsorptiepercentage bij het adsorp ­
tie-evenwicht (%).  
DESORPTIE D ( %)  
Als het tijdstip t  0 waarop het desorptie-experiment begint, wordt het moment 
beschouwd waarop het maximale volume van de oplossing met teststof (nadat 
het adsorptie-evenwicht zich heeft ingesteld) wordt verwijderd en vervangen door 
een gelijk volume 0,01 M CaCl  2 -oplossing.  
a) Parallelle methode  
Op een tijdstip t  i wordt de massa van de teststof gemeten in de waterfase 
die uit buis i is verwijderd ( V i 
r ) en wordt de gedesorbeerde massa bere ­
kend met behulp van de vergelijking:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ· Í V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Bij het desorptie-evenwicht is t  i = t eq en derhalve  m aq des ðt i Þ= m aq des ðeqÞ 
De massa van de gedurende een tijdsinterval ( Δt i ) gedesorbeerde teststof is:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Het desorptiepercentage wordt berekend:  
op een tijdstip t  i met de vergelijking:  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1229  
( 1 ) Deze vergelijkingen gelden voor zowel de directe als de indirecte methode. Alle andere 
vergelijkingen gelden alleen voor de indirecte methode.
 D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (15) 
en gedurende een tijdsinterval ( Δt i ) met de vergelijking:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (16) 
Hierbij is:  
D t i = desorptiepercentage op een tijdstip t  i (%) 
D Δt i = desorptiepercentage over een tijdsinterval Δt i (%) 
m aq des ðt 1 Þ = massa van de op een tijdstip t  i gedesorbeerde teststof ( μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ = massa van de gedurende een tijdsinterval Δt i gedesorbeerde 
teststof (μg) 
m m des ðt i Þ = analytisch bepaalde massa van de teststof in een op een 
tijdstip t; voor analyse genomen volume-oplossing ( μg).V r i 
m aq A = massa van de teststof die door onvolledige vervanging van 
het volume overblijft van het adsorp-tie-evenwicht ( μg). 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· Í V 0 Ä V R 
V 0 Î 
(17) 
m aq ads ðeqÞ = massa van de teststof in de oplossing bij het adsorptie-even ­
wicht (μg) 
V R = volume van het supematans dat na het bereiken van het 
adsorptie-evenwicht uit de buis verwijderd is en is vervan ­
gen door een gelijk volume 0,01 M CaCl  2 -oplossing (cm  3 ) 
V r i = volume van de oplossing die bij het desorptiekinetiek-expe ­
riment voor de bepaling van de teststof uit buis (i) is ge ­
nomen (cm  3 ) 
Het desorptiepercentage  D t i of D Δt i (afhankelijk van de eisen van de studie) 
wordt uitgezet tegen de tijd en vervolgens wordt het tijdstip bepaald waarop 
het desorptie-evenwicht zich heeft ingesteld.  
b) Seriële methode  
In de volgende vergelijkingen wordt er rekening mee gehouden dat de 
adsorptieprocedure is uitgevoerd door meting van de teststof in kleine 
porties ðv A 
a Þ van de waterfase (de seriële methode in punt 1.9: „Uitvoering 
van de test”). Aangenomen wordt dat a) het na het adsorptiekinetiek-experi ­
ment uit de buis verwijderde supernatans is vervangen door een gelijk 
volume 0,01 M CaCl  2 -oplossing (V  R ) en b) het totale volume van de 
waterfase in contact met het bodemmonster (V  T ) gedurende het desorptie ­
kinetiek-experiment constant blijft en wordt gegeven door de vergelijking:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Op een tijdstip t  i : 
— De massa van de teststof in een kleine hoeveelheid oplossing ( ðv a D Þ ) 
wordt bepaald en de gedesorbeerde massa wordt berekend met behulp van de vergelijking:
 
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Bij het desorptie-evenwicht is t  i = t eq en derhalve  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
— Het desorptie-percentage  D t i wordt berekend met behulp van de ver ­
gelijking:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Over een tijdsinterval ( Δt i ): 
Over elk tijdsinterval wordt de hoeveelheid gedesorbeerde stof als volgt 
berekend:  
— voor het eerste tijdsinterval Δt 1 = t 1 -t o 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m m des ðt 1 Þ· Í V T 
v a D Î 
Ä m aq A and m s des ðt 1 Þ ¼ m s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— voor het tweede tijdsinterval Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m m des ðt 2 Þ· Í V T 
v a D Î 
Ä m aq des ðΔt 1 Þ· Í ðV T Ä v a D Þ 
V T Î 
Ä m aq A · Í ðV T Ä v a D Þ 
V T Î 
en 
m s des ðt 2 Þ ¼ m s ads ðeqÞ Ä " 
m aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ # (22) 
— voor het n  e tijdsinterval Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ " 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
en 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Ten slotte wordt het desorptiepercentage over elk tijdsinterval  D Δt i bere­
kend met behulp van de vergelijking:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (24) 
terwijl het desorptiepercentage op het tijdstip t  i (D t i ) wordt berekend met de 
vergelijking:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
De hier gebruikte parameters worden gedefinieerd als:  
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = massa van de teststof die 
aan het bodemmonster blijft geadsorbeerd na de tijdsintervallen Δt
 1 , Δt 2 , 
..., Δt n (μg) 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = massa van de teststof die 
wordt gedesorbeerd gedu ­
rende de tijdsintervallen At,, Δt
 2 , ..., Δt n (μg) 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = massa van de teststof die 
in een hoeveelheid oplos ­
sing (ðv D 
a Þ) wordt geme ­
ten op de tijdstippen t  1 , 
t 2 , ..., t  n (μg) 
V T = totaalvolume van de wa ­
terfase die tijdens het vol ­
gens de seriële methode uitgevoerde desorptieki ­
netiek-experiment in con ­
tact met het bodemmon ­
ster is (cm
 3 ) 
m A 
aq = massa van de teststof die 
door onvolledige vervan ­
ging van het volume overblijft van het adsorp ­
tie-evenwicht ( μg)
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = volume van het superna ­
tans dat na het bereiken 
van het adsorptie-even ­
wicht uit de buis verwij ­
derd is en is vervangen door een gelijk volume 
0,01 M CaCl
 2 -oplossing 
(cm  3 ) 
v D 
a = volume van het monster 
dat tijdens het volgens de seriële methode uitge ­
voerde desorptiekinetiek- 
experiment voor analyse ­
doeleinden uit buis (i) wordt genomen (cm
 3 ). 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
Aanhangsel 6  
ADSORPTIE/DESORPTIE IN DE BODEM: RAPPORTAGEFORMULIEREN  
Geteste stof:  
Getest bodemmonster:  
Gehalte van het bodemmonster aan droge massa (105  o C, 12 uur): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Geschiktheid van de analysemethode  
Gewicht bodemmonster g 
Droge massa in bodemmonster g Volume CaCl
 2 -oplossing cm  3 
Nominale concentratie eindoplossing μg cm-  3 
Concentratie eindoplossing bij analyse μg cm-  3 
Principe van de gebruikte analysemethode:  
Kalibratie van de analysemethode:  
Geteste stof:  
Getest bodemmonster:  
Gehalte van het bodemmonster aan droge massa (105  o C, 12 uur): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Gevolgde analysemethodologie Indirect  □ Parallel  □ Serieel  □ 
Direct □ 
Adsorptietest: testmonsters  
Symbool Eenheid Equilibratietijd Equilibratietijd Equilibratietijd Equilibratietjjd  
Buis nr. 
Gewicht bodemmonster — g Droge massa bodemmonster m
 soil g 
Volume water in afgewogen 
bodemmonster (berekend) V ws cm 3 
Volume 0,01 M CaCl  2 -oplos­
sing voor equilibratie bodem ­
monster cm 3 
Volume stockoplossing cm  3 
Totaal volume waterfase in 
contact met bodemmonster V O cm 3 
Beginconcentratie testoplossing C  0 μg cm  -3 
Massa teststof aan begin van de 
test m 0 μg ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Symbool Eenheid Equilibratietijd Equilibratietijd Equilibratietijd Equilibratietjjd  
Na schudden en centrifugeren  
INDIRECTE METHODE 
Parallelle methode 
Concentratie teststof in water ­
fase na correctie blanco  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Seriële methode 
Gemeten massa teststof in het 
analysemonster VV  a A m m ads ðt i Þ μg 
DIRECTE METHODE 
Massa aan het bodemmonster 
geadsorbeerde teststof  m s ads ðt i Þ μg 
Berekening van de adsorptie 
Adsorptie  A  t i % 
A Δt i % 
Gemiddelde 
Adsorptie K  d cm 3 g -1 
Gemiddelde 
Adsorptie K  oc cm 3 g -1 
Gemiddelde  
Geteste stof:  
Getest bodemmonster:  
Gehalte van het bodemmonster aan droge massa (105  o C, 12 uur):............................................................................... %  
Temperatuur: ................................................................... .............................................. ............................................ ..........  o C 
Adsorptietest: blanco- en controlebepalingen  
Symbool Eenheid Blanco Blanco Controle  
Buis nr. 
Gewicht bodemmonster g 0 0 
Volume water in afgewogen bodem ­
monster (berekend) cm 3 — — 
Toegevoegd volume 0,01 M CaCl  2 - 
oplossing cm 3 
Toegevoegd volume stockoplossing 
met teststof cm 3 0 0 
Totaal volume waterfase (berekend) cm  3 — —  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Symbool Eenheid Blanco Blanco Controle  
Beginconcentratie van de teststof in de 
waterfase μg cm  -3 
Na schudden en centrifugeren  
Concentratie in waterfase μg cm  -3 
NB: Indien nodig kolommen toevoegen.  
Geteste stof:  
Getest bodemmonster:  
Gehalte van het bodemmonster aan droge massa (105  o C, 1 2 uur): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Massabalans  
Symbool Eenheid  
Buis nr. 
Gewicht bodemmonster — g Droge massa bodemmonster m
 soil g 
Volume water in afgewogen bodem ­
monster (berekend) V ws ml 
Volume 0,01 M CaCl  2 -oplossing voor 
equili-bratie bodemmonster ml 
Volume stockoplossing cm  3 
Totaal volume waterfase in contact met 
bodemmonster V 0 cm 3 
Beginconcentratie testoplossing C  0 μg cm  -3 
Equilibratietijd — uur  
Na schudden en centrifugeren  
Concentratie teststof in waterfase bij ad ­
sorptie-evenwicht na correctie blanco  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Equilibratietijd t  eq uur 
Eerste verdunning met oplosmiddel 
Volume verwijderde waterfase V  rec cm 3 
Volume toegevoegd oplosmiddel ΔV cm  3 
Eerste extractie met oplosmiddel 
Signaal geanalyseerd in oplosmiddel S  E1 var. 
Concentratie teststof in oplosmiddel C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Symbool Eenheid  
Massa van uit bodemmonster en wanden 
proefvat geëxtraheerde teststof m E1 μg 
Tweede verdunning met oplosmiddel 
Volume verwijderd oplosmiddel ΔV s cm 3 
Volume toegevoegd oplosmiddel ΔV' cm  3 
Tweede extractie met oplosmiddel 
Signaal geanalyseerd in oplosmiddel S  E2 var. 
Concentratie teststof in oplosmiddel C  E2 μg cm  -3 
Massa van uit bodemmonster en wanden 
proefvat geëxtraheerde teststof m E2 μg 
Totale massa in twee stappen geëxtra ­
heerde teststof m E μg 
Massabalans MB %  
Geteste stof:  
Getest bodemmonster:  
Gehalte van het bodemmonster aan droge massa (105  o C, 12 uur): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptie-isothermen  
Symbool Eenheid  
Buis nr. 
Gewicht bodemmonster — g 
Droge massa bodemmonster E g 
Volume water in afgewogen 
bodemmonster (berekend) V ws cm 3 
Volume 0,01 Μ CaCl  2 -oplos­
sing voor equilibratie bodem ­
monster cm 3 
Volume toegevoegde stocko ­
plossing cm 3 
Totaal volume waterfase in 
contact met bodemmonster (be ­
rekend) V 0 cm 3 
Concentratie oplossing C  0 μg cm  -3 
Equilibratietijd — uur  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Symbool Eenheid  
Na schudden en centrifugeren  
Concentratie teststof in water ­
fase na correctie blanco  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatuur  o C 
Massa geadsorbeerde teststof per 
eenheid bodemmonster  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regressie-analyse:  
Waarde van: K  F ads : 
Waarde van l/n:  
Regressiecoëfficiënt r  2 : 
Geteste stof:  
Getest bodemmonster:  
Gehalte van het bodemmonster aan droge massa (105  o C, 12 uur): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatuur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Gevolgde analysemethodologie: Indirect  □ Parallel  □ Serieel  □ 
Desorptietest  
Symbool Eenheid Tijdsinter ­
val Tijdsinter ­
val Tijdsinter ­
val Tijdsinter ­
val 
Buis nr. uit adsorptiestap 
Massa aan het bodemmonster geadsor ­
beerde stof bij adsorptie-evenwicht  m s ads ðeqÞ μg 
Verwijderd volume waterfase, vervangen 
door 0,01 Μ CaCl  2 V R cm 3 
Totaal volume waterfase 
in contact met bodem PM V  o cm 3 
SM V  T cm 3 
Massa stof die door onvolledige vervan ­
ging van het volume overblijft van het adsorptie-evenwicht
 m aq A μg 
Desorptiekinetiek  
Gemeten massa van de op het tijdstip t  j 
uit het bodemmonster gedesorbeerde stof  m m des ðt i Þ μg 
Volume van de oplossing 
die voor de meting van de teststof uit buis (i) is ge ­
nomen PM V
 r i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Massa van de op het tijdstip t  i uit het 
bodemmonster gedesorbeerde teststof 
(berekend)  m aq des ðt i Þ μg 
Massa van de gedurende het tijdsinterval 
Δt i uit het bodemmonster gedesorbeerde 
teststof (berekend)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Symbool Eenheid Tijdsinter ­
val Tijdsinter ­
val Tijdsinter ­
val Tijdsinter ­
val 
Desorptiepercentage  
Desorptie op het tijdstip t  i D ti % 
Desorptie gedurende het tijdsinterval Δt i D Δt i % 
Schijnbare desorptiecoëfficiënt K  des 
PM: Parallelle methode  
SM: Seriële methode  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  RAMING VAN DE ADSORPTIECOËFFICIËNT (K  oc ) AAN DE 
BODEM EN AAN RIOOLSLIB MET BEHULP VAN 
HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC)  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van OESO TG 121 (2001).  
1.1. INLEIDING  
Het sorptiegedrag van stoffen ten opzichte van de bodem en van 
rioolslib kan worden beschreven aan de hand van parameters die langs experimentele weg worden bepaald met behulp van test ­
methode C.18. Een belangrijke parameter is de adsorptiecoëfficiënt, 
die wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de concentratie van 
de stof in de bodem/het rioolslib en de concentratie van de stof in de waterfase bij het adsorptie-evenwicht. De genormaliseerde adsorptie ­
coëfficiënt voor het organische-koolstofgehalte van de bodem K
 oc is 
een bruikbare indicator van de bindingscapaciteit van een chemische 
stof aan organisch bodemmateriaal en rioolslib en maakt vergelijkin ­
gen mogelijk tussen verschillende chemische stoffen. Deze parameter kan worden geraamd door middel van correlaties met de oplosbaar ­
heid in water en de verdelingscoëfficiënt n-octanol/water (1) (2) (3) 
(4) (5) (6) (7).
 
Bij de in deze test beschreven onderzoeksmethode wordt gebruikge ­
maakt van HPLC voor de raming van de adsorptiecoëfficiënt K  oc aan 
de bodem en aan rioolslib (8). De ramingen zijn betrouwbaarder dan die op basis van KSAR-berekeningen (9). Aangezien deze onder ­
zoeksmethode gebaseerd is op ramingen, kan zij de bij testmethode 
C.18 gebruikte batch-evenwichtsexperimenten niet volledig vervan ­
gen. Toch kan de geraamde K
 oc van nut zijn bij de keuze van 
geschikte testparameters voor adsorptie-/desorptieonderzoeken vol ­
gens testmethode C.18 door de berekening van K  d (verdelingscoëf ­
ficiënt) of K  f (adsorptiecoëfficiënt volgens Freundlich) volgens ver ­
gelijking 3 (zie punt 1.2).  
1.2. DEFINITIES  
K d : De verdelingscoëfficiënt wordt gedefinieerd als de verhouding 
van evenwichtsconcentraties C van een opgeloste teststof in een 
tweefasensysteem dat bestaat uit een sorptiemiddel (bodem of riool ­
slib) en een waterfase; deze coëfficiënt is een waarde zonder dimen ­
sies wanneer de concentraties in beide fasen worden uitgedrukt in gewicht/gewicht. Indien de concentratie in de waterfase wordt uit ­
gedrukt in gewicht/volume, zijn de eenheden ml.g
 -1 . K d kan variëren 
naar gelang van de sorptiemiddeleigenschappen en concentratie ­
afhankelijk zijn.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
Hierbij is:  
C soil = concentratie van de teststof in de bodem bij evenwicht 
(μg . g  M ) 
C sludge  = concentratie van de teststof in slib bij evenwicht ( μg . g  -1 ) 
C aq = concentratie van de teststof in de waterfase bij evenwicht 
(μg . g  -1 , μg . ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : De adsorptiecoëfficiënt volgens Freundlich wordt gedefinieerd 
als de concentratie van de teststof in de bodem of in rioolslib (x/m) 
wanneer de evenwichtsconcentratie C  aq in de waterfase gelijk is aan 
één; de eenheden zijn μg . g  -1 sorptiemiddel. De waarde kan variëren 
naar gelang van de sorptiemiddeleigenschappen.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
Hierbij is:  
x/m = hoeveelheid testof x ( μg) die is geadsorbeerd aan de hoe ­
veelheid sorptiemiddel m (g) bij evenwicht  
l/n = helling van de adsorptie-isotherm volgens Freundlich  
C aq = concentratie van de teststof in de waterfase bij evenwicht 
(μg . ml  -1 ) 
BijC aq ¼ 1; logK  f ¼ log  x 
m 
K oc : De verdelingscoëfficiënt (K  d ) of adsorptiecoëfficiënt volgens 
Freundlich (K  f ) genormaliseerd voor het organische-koolstofgehalte 
(f oc ) van een sorptiemiddel; deze coëfficiënt is met name voor niet- 
geïoniseerde chemische stoffen een tamelijk nauwkeurige indicator 
voor de mate van adsorptie van een stof aan het sorptiemiddel en maakt vergelijkingen mogelijk tussen verschillende chemische stof ­
fen. Afhankelijk van de dimensies van K
 d en K  f kan K  oc dimensie­
loos zijn of de eenheden ml . g  -1 of μg . g  -1 organisch materiaal 
hebben.  
Koc ¼ Kd 
foc dimensieloos of ml ·g Ä1 of Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ Î Í (3) 
Het verband tussen K  oc en K  d is niet altijd lineair; K  oc -waarden 
kunnen dan ook verschillen van bodemtype tot bodemtype, hoewel zij nauwelijks uiteenlopen vergeleken met K
 d -of K  f -waarden.  
De adsorptiecoëfficiënt (K  oc ) wordt afgeleid uit de capaciteitsfactor 
(k') aan de hand van een ijkcurve van log k' versus log K  oc van de 
geselecteerde referentieverbindingen.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
Hierbij is:  
t R = HPLC-retentietijd van test- en referentiestof (minuten)  
t 0 = dode tijd HPLC (minuten) (zie punt 1.8.2).  
P ow : De verdelingscoëfficiënt octanol/water wordt gedefinieerd als 
de verhouding van de concentraties van opgeloste stof in n-octanol 
en water; dit is een dimensieloze waarde  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Voordat de methode wordt gebruikt, moeten de structuurformule, de 
zuiverheid en de dissociatieconstante (indien van toepassing) bekend zijn. Gegevens over de oplosbaarheid in water en organische oplosmid ­
delen, de verdelingscoëfficiënt octanol/water en de hvdrolysekenmerken 
zijn nuttig.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Om de gemeten HPLC-retentiegegevens van een teststof te correle ­
ren aan de adsorptiecoëfficiënt K  oc van die stof, moet een ijkgrafiek 
van log K  oc versus log k' worden getekend. Er moet gebruik worden 
gemaakt van minimaal zes referentiepunten, waarvan ten minste één boven en ten minste één onder de verwachte teststofwaarde dient te 
liggen. De methode zal veel nauwkeuriger zijn als er referentiestof ­
fen worden gebruikt die qua structuur verwant zijn aan de teststof. Indien dergelijke gegevens niet beschikbaar zijn, dient de gebruiker zelf geschikte ijkstoffen te kiezen. In dat geval moet een meer alge ­
mene reeks van qua structuur heterogene stoffen worden gekozen. 
Voor rioolslib zijn toegestane stoffen en K
 oc -waarden opgenomen in 
tabel 1, voor de bodem in tabel 3 (zie aanhangsel). De eventuele keuze van andere ijkstoffen moet worden onderbouwd.
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Er wordt gebruikgemaakt van analvtische HPLC-kolommen die zijn 
gevuld met een in de handel verkrijgbare vaste cyaanpropvifase die lipofiele en polaire bestanddelen bevat. Verder wordt een op een 
silicamatrix gebaseerde gematigd polaire stationaire fase gebruikt: 
— 0 — Si — CH
 2 — CH  2 — CH  2 — CN 
Silica Arolaire spacer Polair bestanddeel  
Het principe van de testmethode is hetzelfde als dat van testmethode A.8 
(verdelingscoëfficiënt, HPLC-methode). Op het moment dat de teststof samen met de mobiele fase door de kolom stroomt, gaat die stof een 
interactie aan met de stationaire fase. De teststof wordt vertraagd als 
gevolg van de verdeling tussen mobiele en stationaire fasen. De twee ­
ledige samenstelling van de stationaire fase — polaire en apolaire loca ­
ties — maakt dezelfde soort interactie tussen polaire en apolaire groepen 
van een molecuul mogelijk als bij organisch materiaal in bodem- of 
rioolslibmatrices. Op basis hiervan kan er een verband worden gelegd tussen de retentietijd in de kolom en de adsorptiecoëfficiënt aan orga ­
nisch materiaal.
 
Met name bij polaire stoffen heeft de pH een belangrijke invloed op 
het sorptiegedrag. Bij landbouwgrond en reservoirs van rioolwater ­
zuiveringsinstallaties schommelt de pH gewoonlijk tussen 5,5 en 7,5. 
Voor ioniseerbare stoffen moeten er twee tests worden verricht met zowel geïoniseerde als niet-geioniseerde vormen in geschikte buffer ­
oplossingen, doch alleen in gevallen waarin ten minste 10 % van de 
testverbinding uiteen zal vallen binnen pH 5,5 tot 7,5.
 
Aangezien de evaluatie uitsluitend plaatsvindt op basis van het verband 
tussen de retentie in de HPLC-kolom en de adsorptiecoëfficiënt, is er 
geen kwantitatieve analysemethode nodig en behoeft slechts de retentie ­
tijd te worden bepaald. Indien er een geschikte reeks referentiestoffen beschikbaar is en de methode benut wordt onder standaard experimen ­
tele omstandigheden, vormt die methode een snelle en efficiënte manier 
om de adsorptiecoëfficiënt K
 oc te ramen.  
1.5. TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
De HPLC-methode kan worden gebruikt voor chemische stoffen (al 
dan niet gelabeld) waarvoor een geschikt detectiesysteem (bijv. spec ­
trofotometer, radioactiviteitsdctector) beschikbaar is en die voldoende 
stabiel zijn gedurende het experiment. De methode kan zeer bruik ­
baar zijn voor chemische stoffen die moeilijk op een andere manier experimenteel te onderzoeken zijn (zoals vluchtige stoffen; stoffen 
die niet in water oplosbaar zijn in een concentratie die analyseerbaar 
is; stoffen met een sterke affiniteit tot het oppervlak van incubatie- systemen). De methode kan worden gebruikt voor mengsels die niet- opgeloste elutiebanden opleveren. In dat geval moeten de onder- en 
bovengrenzen van de log K
 oc -waarden van de verbindingen van het 
testmengsel worden vermeld.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Hoewel onzuiverheden soms problemen kunnen opleveren voor de 
interpretatie van HPLC-resultaten, zijn zij van ondergeschikt belang 
zolang de teststof duidelijk langs analytische weg kan worden ge ­
ïdentificeerd en van de onzuiverheden kan worden gescheiden.  
De methode is geldig verklaard voor de stoffen die zijn opgenomen 
in tabel 1 van het aanhangsel en is tevens gebruikt voor een aantal 
andere chemische stoffen, die behoren tot de volgende chemische categorieën:
 
— aromatische aminen (bijv. trifluralin, 4-chlooraniline, 3,5-dinitro ­
aniline, 4-methylaniline, N-methylaniline, 1-naftylamine);  
— aromatische carbonzure esters (bijv. benzoëzure methylester, 3,5- 
dinitrobenzoëzure ethylester);  
— aromatische koolwaterstoften (bijv. tolueen, xyleen, ethylben ­
zeen, nitrobenzeen);  
— aryloxyfenoxypropionzure esters (bijv. diclofop-methyl, fenoxa ­
prop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl);  
— schimmelwerende middelen, benzimidazol en imidazol (bijv. car ­
bendazim, fuberidazol, triazoxide);  
— carbonzure amiden (bv. 2-chloorbenzamide. N.N-dimethylbenza ­
mide, 3,5-dinitrobenzamide, N-methyl-benzamide, 2-nitrobenza ­
mide. 3-nitrobenzamide);  
— chloorkoolwaterstoffen (bv. endosulfan, DDT, hexachloorben ­
zeen, quintozeen, 1,2,3-trichloorbenzeen);  
— organofosfor-insecticiden (bv. azinfos-methyl, disulfoton, fenami ­
fos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos);  
— fenolen (bijv. fenol. 2-nitrofenol. 4-nitrofenol. pentachloorfenol. 
2,4,6-trichloorfenol, 1-naftol);  
— fenylureumderivaten (bv. isoproturon monolinuron, pencycuron);  
— igmentkleurstoffen (bv. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81);  
— polyaromatische koolwaterstoffen (bv. acenafteen, naftaleen);  
— 1,3,5-triazine-herbiciden (bv. prometryn, propazin, simazin, ter ­
butryn);  
— triazoolderivaten (bv. tebuconazol, triadimefon, triadimenol, tria ­
pentenol).  
De methode kan niet worden gebruikt voor stoffen die met het eluent 
of de stationaire fase reageren, en ook niet voor stoffen die een specifieke interactie aangaan met anorganische bestanddelen (bv. vorming van clustercomplexen met kleimineralen). Het is mogelijk 
dat de methode niet werkt bij oppervlakteactieve stoffen, anorga ­
nische verbindingen en matige of sterke organische zuren en basen. Er kunnen log K
 oc -waarden van 1,5 tot 5,0 worden bepaald. Ioni ­
seerbare stoffen moeten worden gemeten met behulp van een gebuf ­
ferde mobiele fase, waarbij er wel op moet worden gelet dat preci ­
pitatie van bufferbestanddelen of van de teststof wordt voorkomen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KWALITEITSCRITERIA  
1.6.1.  Nauwkeurigheid  
Normaliter kan de adsorptiecoëfficiënt van een teststof worden ge ­
raamd tot binnen ± 0,5 log eenheid van de waarde die is bepaald met 
behulp van de batch-evenwichtsmethode (zie tabel 1 van het aan ­
hangsel). Een hogere nauwkeurigheid is haalbaar als de gebruikte referentiestoffen qua structuur verwant zijn aan de teststof.
 
1.6.2.  Herhaalbaarheid  
De bepalingen moeten ten minste in duplo worden uitgevoerd. De uit 
afzonderlijke metingen afgeleide waarden van log K  OC moeten bin ­
nen een bereik van 0,25 log eenheid vallen.  
1.6.3.  Reproduceerbaarheid  
De ervaring die tot nu toe met de methode is opgedaan, ondersteunt 
de geldigheid ervan. Uit een onderzoek naar de HPLC-methode, 
waarbij gebruik werd gemaakt van 48 stoffen (merendeels pestici ­
den) waarvoor betrouwbare gegevens over K  oc in de bodem beschik ­
baar waren, kwam een correlatiecoëfficiënt van R = 0,95 naar voren 
(10) (11).  
Er is een vergelijkingstest onder elf laboratoria gehouden ter ver ­
betering en validatie van de methode (12). De resultaten zijn vermeld 
in tabel 2 van het aanhangsel  
1.7. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.7.1.  Voorbereidende raming van de adsorptiecoëfficiënt  
Daar de verdelingscoëfficiënt octanol/water P  ow (= K  ow ) en, in ze ­
kere mate, de oplosbaarheid in water met name bij niet-geïoniseerde 
stoffen kunnen worden gebruikt als indicatoren van de mate van adsorptie, kunnen zij tevens worden benut voor voorbereidende be ­
reikbepaling. Er is een aantal bruikbare correlaties gepubliceerd voor 
verschillende groepen chemische stoffen (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Apparatuur  
Vereist is een vloeistofchromatograaf met een pulsloze pomp en een 
geschikt detectieapparaat. Het gebruik van een injectieklep met inicc ­
tielus wordt aanbevolen. Er moet gebruik worden gemaakt van in de 
handel verkrijgbare chemisch gebonden cyaanpropylharsen op silica ­
basis (bv. Hypersil en Zorbax CN). Er mag een voorkolom van hetzelfde materiaal tussen het injectiesysteem en de analysekolom worden geplaatst. Kolommen van verschillende leveranciers kunnen 
aanzienlijk uiteenlopen qua scheidingsefficiëntie. Als richtsnoer moe ­
ten de volgende capaciteitsfactoren k' worden gehaald: log k' > 0,0 voor log K
 OK = 3,0 en log k' > 0,4 voor log K  oc = 2,0 bij gebruik 
van methanol water 55/45 % als mobiele fase.  
1.7.3.  Mobiele fasen  
Van de diverse geteste mobile rasen worden de twee volgende aan ­
bevolen:  
— methanol/water (55/45 % v/v);  
— methanol/0,01 M citraatbuffer pH 6,0 (55/45 % v/v).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Er wordt gebruikgemaakt van een combinatie van methanol van 
HPLC-kwaliteit met gedestilleerd water of citraatbuffer voor de be ­
reiding van het uitspoeloplosmiddel. Het mengsel wordt vóór ge ­
bruik ontgast. Er moet isocratische elutie worden toegepast. Als methanol/water-mengsels niet geschikt zijn kunnen ook andere orga ­
nisch-oplosmiddel/water-mengsels worden uitgeprobeerd, zoals 
ethanol/water- of acetonitril/water-mengsels. Voor ioniseerbare ver ­
bindingen wordt het gebruik van een bufferoplossing aanbevolen om de pH te stabiliseren. Zoutprecipitatie en achteruitgang van de ko ­
lom, verschijnselen die zich kunnen voordoen bij sommige organi ­
sche fase/buffer-mengsels, moeten worden voorkomen.
 
Er mogen geen additieven zoals ionenpaarreagentia worden gebruikt, 
omdat die van invloed kunnen zijn op de sorptie-eigenschappen van 
de stationaire fase. Dergelijke veranderingen van de stationaire fase 
kunnen onomkeerbaar zijn. Daarom moeten experimenten waarbij additieven worden gebruikt, uitgevoerd worden op gescheiden ko ­
lommen.
 
1.7.4.  Oplossingen  
De test- en referentiestoffen moeten worden opgelost in de mobiele 
fase. 
1.8. UITVOERING VAN DE TEST  
1.8.1.  Testomstandigheden  
De temperatuur tijdens de metingen moet worden geregistreerd. 
Temperatuurregeling van het kolomcompartiment wordt sterk aanbe ­
volen teneinde constante omstandigheden te garanderen tijdens het ijken en ramen en het meten van de teststof.
 
1.8.2.  Bepaling van de dode tijd t  0 
Voor deze bepaling kunnen twee methoden worden gebruikt (zie ook 
punt 1.2).  
1.8.2.1.  Bepaling van de dode tijd t  0 door middel van een homologe reeks  
Gebleken is dat deze procedure betrouwbare en gestandaardiseerde 
t o -waarden oplevert. Zie voor nadere bijzonderheden testmethode 
A.8, Verdelingscoëfficiënt (n-octanol/water), HPLC-methode.  
1.8.2.2.  Bepaling van de dode tijd t  0 door middel van inerte stoffen waarvan 
geen retentie door de kolom plaatsvindt  
Deze techniek is gebaseerd op de injectie van oplossingen van for ­
mamide, ureum of natriumnitraat. De metingen moeten ten minste in 
duplo worden verricht.  
1.8.3.  Bepaling van de retentietijden t  R 
De referentiestoffen moeten worden gekozen zoals beschreven in 
punt 1.3. Ze mogen als gemengde standaard worden geïnjecteerd om hun retentietijden te bepalen, mits aangetoond is dat de retentie ­
tijd van elke referentiestandaard niet wordt beïnvloed door de aan ­
wezigheid van de andere referentiestandaarden. Er dient regelmatig en in ieder geval tweemaal per dag te worden geijkt teneinde reke ­
ning te kunnen houden met onvoorziene veranderingen in de pres ­
taties van de kolom. Het verdient de voorkeur de ijkinjecties uit te 
voeren vóór en na de injecties van de testsrof om er zeker van te zijn dat de retentietijden niet zijn gewijzigd. De teststoffen worden af ­
zonderlijk in zo klein mogelijke hoeveelheden geïnjecteerd (om over ­
lading van de kolom te voorkomen) en de retentietijden ervan u- 
orden bepaald.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Om het vertrouwen in de meting te vergroten moeten de bepalingen 
ten minste in duplo worden verricht. De uit afzonderlijke metingen 
afgeleide waarden van log K  oc moeten binnen een bereik van 0,25 
log eenheid vallen.  
1.8.4.  Evaluatie  
Uit de dode tijd t  0 en de retentietijden t  R van de gekozen referen ­
tiestoffen worden de capaciteitsfactoren k' berekend volgens vergelij ­
king 4 (zie punt 1.2). Daarna worden de log k'-gegevens van de 
referentiestoffen uitgezet tegen hun in de labellen 1 en 3 van het 
aanhangsel vermelde log K  oc -waarden die zijn verkregen bij batch- 
evenwichtsexperimenten. Aan de hand van deze curve wordt ver ­
volgens de log k'-waarde van een teststof gebruikt om de log K  oc 
-waarde van die stofte bepalen. Als uit de actuele resultaten blijkt dat 
de log K  oc van de teststof buiten het ijkbereik valt moet de test 
worden herhaald met andere, geschiktere referentiestoffen.  
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
In het rapport moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
— identiteit van test- en referentiestoffen en hun zuiverheid, als ­
mede pK  a -waarden voorzover relevant;  
— beschrijving van apparatuur en bedrijfsomstandigheden, bv. type 
en maat van analysekolom en voorkolom, detectieapparaat, mo ­
biele fase (verhouding tussen bestanddelen en pH), temperatuur ­
bereik tijdens de metingen;  
— dode tijd en methode die wordt gebruikt voor de bepaling daar ­
van; 
— in de kolom gebrachte hoeveelheden test- en referentiestoffen;  
— retentietijden van referentieverbindingen die voor ijkdoeleinden 
worden gebruikt;  
— nadere gegevens over de aangebrachte regressielijn (log k' vs. log 
K oc ) en een grafiek van die lijn;  
— gemiddelde retentiegegevens en geraamde log K  oc -waarde van de 
testverbinding;  
— chromatogrammen.  
3. REFERENTIES  
(1) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the ad ­
sorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1 67.  
(3) G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1039.
 
(4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil orga ­
nic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.  
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substan ­
ces by soils and sediment.]. Environm. Sci, Health, B19, pp. 
297-312.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V.H. Freed (1979). A physical con ­
cept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, 
Science, 106, pp. S31-832.  
(7) S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121-128.  
(9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening me ­
thods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kördel. J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphe ­
re, 27(12), pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 28 5-304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient or, soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Aanhangsel  
Tabel 1  
Vergelijking van K  oc -waarden voor bodem en rioolslib en volgens de HPLC-screeningmethode  ( 1 ) ( 2 ) berekende 
waarden  
Stof CAS-nr. Log K  o; ri­
oolslib Log K  oc 
HPLC Δ Log K  oc 
bodem Log K  oc 
HPLC Δ 
Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 1 50-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantreen S5-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 
Benzoëzure fenylester 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzamide 5 5-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-nitrobenzamide 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Aceetanilide 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Aniline 6 2-5 3-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-dichlooraniline 9 5-S2-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), blz. 121-1 28. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), blz. 107-119.  
Tabel 2  
Resultaten van een vergelijkende laboratoriumtest (elf laboratoria) verricht ter verbetering en validatie van de 
HPLC-methode  ( 1 ) 
Stof CAS-nr. Log K  oc K oc Log K  oc 
(OESO 106) (HPLC-methode)  
Atrazin 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 3 30-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fenthion 5 5-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test, Chemosphere. 30(7)  -blz.  1373-1384.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabel 3  
Aanbevolen referentiestoffen voor de HPLC-screeningmethode op basis van bodemadsorptiegegevens  
Referentiestof CAS-nr. Gemiddelde log 
K ow -waarden 
van 
batchevenwicht Aantal K  oc - 
gegevens Log S.D. Bron  
Aceetanilide 103-S4-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamide 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimethylbenzamide 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Methylbenzamide 619-5 5-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Methylbenzoaat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamide 64 5-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Aniline 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamide 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxide 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 2401 7-47-S 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 3 30-5 5-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftaleen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Methiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichloorbenzeen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fenthion 5 5-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-1 1-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop-methyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantreen 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (mix) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No. 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen. W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemoshere 22. blz. 285-304. 
( c ) Door de bedrijfstak verstrekte gegevens.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  DAPHNIA MAGNA VOORTPLANTINGSTEST  
1. METHODE  
Deze methode voor het testen van de voortplantingstoxiciteit neemt 
OESO TG 211 (1998) integraal over.  
1.1. INLEIDING  
Het doel van de test is in de eerste plaats het beoordelen van het 
effect van chemicaliën op het voortplan-tingsresultaat van Daphnia magna.
 
1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN  
Moederdieren:  de vrouwelijke Daphnia die aanwezig zijn bij aan ­
vang van de test en voorwerp zijn van de studie naar het voort ­
plantingsresultaat.  
Nakomelingen:  de jonge Daphnia die tijdens de test worden voort ­
gebracht door de moederdieren.  
Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) (concentratie 
waarbij het laagste effect wordt waargenomen):  de laagste test ­
concentratie van de stof waarbij een effect is waargenomen dat sta ­
tistisch significant is voor de voortplanting en de mortaliteit van moederdieren (bij p < 0,05) in vergelijking met de controle, binnen 
een aangegeven blootstellingsperiode. Alle testconcentraties boven 
de LOEC moeten echter een schadelijk effect hebben dat gelijk is aan of groter dan de effecten die worden waargenomen bij de LOEC. Indien niet aan deze beide voorwaarden kan worden voldaan, moet 
uitgebreid worden toegelicht hoe de LOEC (en daarmee de NOEC) 
is geselecteerd.
 
No Observed Effect Concentration (NOEC) (concentratie waar ­
bij geen effect wordt waargenomen):  de testconcentratie direct 
onder de LOEC, die in vergelijking met de controle geen statistisch 
significant effect heeft (p < 0,05) binnen een aangegeven blootstel ­
lingsperiode.  
EC X : de concentratie van de in water opgeloste teststof die resulteert 
in een x %-vermindering van de voortplanting van Daphnia magna 
binnen een aangegeven blootstellingsperiode.  
Intrinsieke groeisnelheid:  een maat voor de groei van de populatie 
waarbij wordt uitgegaan van het voortplantingsresultaat en de leef ­
tijdspecifieke mortaliteit (20) (21) (22). Bij stabiele populaties is die 
snelheid nul. Bij toenemende populaties is zij positief en bij afne ­
mende populaties negatief. De laatstgenoemde populaties zijn uiter ­
aard niet levensvatbaar en zullen uiteindelijk uitsterven.  
Detectiegrens:  de laagste concentratie die wel kan worden gedetec ­
teerd doch niet gekwantificeerd.  
Bepalingsgrens:  de laagste concentratie die kwantitatief meetbaar is.  
Mortaliteit:  een dier wordt geregistreerd als gestorven als het im ­
mobiel is, d.w.z. als het niet tot zwemmen in staat is of als er geen beweging van aanhangsels of het postabdomen wordt waargenomen 
binnen 15 seconden na zachtjes bewegen van het testvat. (Gebruik 
van een andere definitie moet met bronvermelding worden vermeld.)
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Jonge vrouwelijke Daphnia (de moederdieren), die bij aanvang van 
de test nog geen 24 uur oud zijn, worden blootgesteld aan de teststof die aan het water is toegevoegd in een aantal uiteenlopende con ­
centraties. De test-duur is 21 dagen. Aan het eind van de test wordt 
het totale aantal voortgebrachte levende nakomelingen per moeder ­
dier dat aan het eind van de test nog in leven is, geteld. Dit houdt in dat nakomelingen die zijn voortgebracht door volwassen dieren die 
tijdens de test sterven, niet worden meegeteld. Het voortplantings ­
resultaat van de moederdieren kan ook op andere manieren worden uitgedrukt (bijvoorbeeld in het aantal levende nakomelingen dat per 
dag en per dier is voortgebracht vanaf de eerste dag dat er nakome ­
lingen werden waargenomen), maar die moeten dan wel worden vermeld naast het totale aantal nakomelingen dat per moederdier dat nog in leven was aan het eind van de test, werd voortgebracht. 
Het voortplantingsresultaat van de aan de teststof blootgestelde die ­
ren wordt vergeleken met dat van de controlegroep(en) teneinde de Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) en daarmee ook de No Observed Effect Concentration (NOEC) te bepalen. Daarnaast 
vindt waar mogelijk data-analyse plaats met behulp van een regres ­
siemodel om de concentratie te schatten die zou leiden tot een x %- vermindering van het voortplantingsresultaat (d.w.z. EC
 50 , EC  20 of 
EC 10 ). 
Het aantal overlevende moederdieren en de tijd die nodig was voor 
het voortbrengen van het eerste broedsel, moeten eveneens worden vermeld. Ook andere stofgerelateerde effecten op parameters als groei (bijvoorbeeld lengte) en mogelijke intrinsieke groeisnelheid 
kunnen voorwerp van onderzoek zijn.
 
1.4. GEGEVENS OVER DE TESTSTOF  
Er moeten resultaten van een met Daphnia magna verrichte acute ­
toxiciteitstest (zie methode C.2, deel I) beschikbaar zijn. Deze kun ­
nen bruikbaar zijn bij de selectie van een geschikt aantal uiteen ­
lopende testconcen-traties voor de voortplantingstests. De oplosbaar ­
heid in water en de dampspanning van de teststof moeten bekend zijn; tevens moet er een betrouwbare analysemethode beschikbaar 
zijn voor de kwantificering van de stof in de testoplossingen met 
vermelding van de herstelcapaciteit en de bepalingsgrens.
 
Voorbeelden van gegevens over de teststof die bruikbaar kunnen zijn 
bij de vaststelling van de testvoorwaar-den zijn de structuurformule, 
de zuiverheidsgraad van de stof, de stabiliteit bij licht, de stabiliteit 
onder de testvoorwaarden, pKa, P  ow en resultaten van de test betref ­
fende gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (zie methode C.4).  
1.5. GELDIGHEID VAN DE TEST  
Wil de test geldig zijn, dan moet in de controlegroep(en) aan de 
volgende prestatiecriteria worden voldaan:  
— de mortaliteit van de moederdieren (vrouwelijke Daphnia) mag 
aan het eind van de test niet hoger zijn dan 20 %;  
— het gemiddelde aantal levende nakomelingen dat is voortgebracht 
per moederdier dat aan het eind van de test nog in leven is, is ≥ 60.
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
Testvaten en andere apparaten die in aanraking komen met de tes ­
toplossingen, mogen alleen uit glas of een ander chemisch inert materiaal bestaan. Normaal gesproken zijn de testvaten glazen be ­
kers.
 
Daarnaast zijn alle of sommige van de volgende apparaten vereist:  
— zuurstofmeter (met micro-elektrode of andere geschikte voorzie ­
ningen voor de meting van opgeloste zuurstof in monsters met 
een klein volume);  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— adequate apparatuur voor de temperatuurbeheersing;  
— pH-meter;  
— uitrusting voor de bepaling van de hardheid van water;  
— uitrusting voor de bepaling van de totale organische koolstofcon ­
centratie (TOC) van water of uitrusting voor de bepaling van het chemisch zuurstofverbruik (COD);
 
— adequate apparatuur voor de regeling van het lichtregime en de 
meting van de lichtintensiteit.  
1.6.2.  Testorganisme  
De testsoort is Daphnia magna Strauss. Andere Daphnia-soorten zijn 
eveneens toegestaan, mits ze aan de toepasselijke geldigheidscriteria 
voldoen (het geldigheidscriterium met betrekking tot het voortplan ­
tingsresultaat bij de controlegroepen moet relevant zijn voor de Daphnia-soort). Indien andere Daphnia-soorten worden gebruikt, 
moeten die duidelijk worden vermeld en dient dat gebruik te worden 
onderbouwd.
 
De kloon moet bij voorkeur zijn geïdentificeerd door middel van 
bepaling van het genotype. Uit onderzoek (1) is gebleken dat de 
voortplantingsprestatie van kloon A (die afkomstig is van IRCHA in Frankrijk) (3) consequent voldoet aan het geldigheidscriterium van een gemiddelde van ≥ 60 nakomelingen per overlevend moederdier 
indien gekweekt onder de in deze methode beschreven voorwaarden. 
Desalniettemin zijn andere klonen aanvaard mits de Daphnia-cultuur aantoonbaar voldoet aan de geldigheidscriteria voor een test.
 
Bij aanvang van de test mogen de dieren nog geen 24 uur oud zijn; 
ze mogen geen eerste nakomelingen zijn. Ze moeten afkomstig zijn van een gezonde stam (d.w.z. geen tekenen van stress vertonen, zoals hoge mortaliteit, aanwezigheid van mannelijke dieren en ephip ­
pia, vertraging in het voortbrengen van het eerste broedsel, ver ­
kleurde dieren, enz. De stamdieren moeten onder soortgelijke kweek ­
omstandigheden (licht, temperatuur, medium, voeding en aantal die ­
ren per eenheid worden gehouden als die welke van toepassing zijn 
tijdens de test. Indien het tijdens de test te gebruiken Daphnia- 
kweekmedium afwijkt van het medium voor de gangbare Daphnia- cultuur, verdient het aanbeveling een aan de test voorafgaande ac ­
climatiseringsperiode van normaliter circa drie weken (d.w.z. één 
generatie aan te houden om stress bij de moederdieren te voorkomen.
 
1.6.3.  Testmedium  
Het verdient aanbeveling om bij deze test gebruik te maken van een 
volledig beschreven medium. Op die manier kan het gebruik van additieven vermeden worden (zoals zeewier, grondextract, enz.), 
die moeilijk te typeren zijn, en kan er beter gestandaardiseerd wor ­
den tussen laboratoria. De media Elendt M4 (4) en M7 (zie aan ­
hangsel 1) zijn hiertoe geschikt gebleken. Desalniettemin zijn andere media (bijvoorbeeld (5) en (6)) aanvaardbaar mits de prestaties van 
de Daphnia-cultuur aantoonbaar voldoen aan de geldigheidscriteria 
voor de test.
 
Indien gebruik wordt gemaakt van media met niet-beschreven addi ­
tieven, moeten die additieven niet alleen duidelijk worden gespeci ­
ficeerd, maar moeten er ook gegevens in het testrapport worden opgenomen over de samenstelling, in het bijzonder met betrekking tot het koolstofgehalte, aangezien dit een bijdrage kan leveren aan de 
voeding. Het verdient aanbeveling de totale organische koolstof 
(TOC) en/of het chemisch zuurstofverbruik (COD) van het stampre ­
paraat van het organische additief te bepalen en een schatting te maken van de resulterende bijdrage aan TOC/COD in het testmedi ­
um. De TOC-niveaus in het medium (d.w.z. vóór toevoeging van de 
algen) zijn bij voorkeur lager dan 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
In geval van teststoffen met metalen moet worden onderkend dat de 
eigenschappen van het testmedium (bijvoorbeeld hardheid, chelaat ­
vormend vermogen) van invloed kunnen zijn op de toxiciteit van de teststof. Een volledig beschreven medium is dan ook wenselijk. Op dit moment zijn er echter slechts twee volledig beschreven media 
waarvan bekend is dat ze geschikt zijn voor langetermijnkweek van 
Daphnia magna: Elendt M4 en M7. Beide media bevatten de che ­
laatvormer EDTA. Uit werkzaamheden is naar voren gekomen (2) dat de „klaarblijkelijke toxiciteit” van cadmium in de regel lager is 
wanneer de voortplantingstest wordt uitgevoerd in M4- en M7-media 
dan bij uitvoering in media die geen EDTA bevatten. M4 en M7 worden derhalve niet aanbevolen voor metaalhoudende teststoffen, terwijl ook het gebruik van andere media die bekende chelaatvor- 
mers bevatten, vermeden dient te worden. Het kan raadzaam zijn om 
voor metaalhoudende stoffen een ander medium te gebruiken, zoals volgens ASTM geregenereerd hard schoon water (7), dat geen EDTA bevat, met toevoeging van zeewierextract (8). Deze combina ­
tie van volgens ASTM geregenereerd hard schoon water en zeewier ­
extract is ook geschikt voor langetermijnkweek en het testen van Daphnia magna (2), hoewel die combinatie nog altijd een licht che ­
laatvormende werking heeft vanwege de organische component in 
het toegevoegde zeewierextract.
 
Bij aanvang en tijdens de test moet de concentratie opgeloste zuur ­
stof boven 3 mg/l liggen. De pH moet liggen tussen 6-9 en norma ­
liter mag er geen variatie van meer dan 1,5 eenheid optreden bij 
welke test dan ook. Een hardheid van meer dan 140 mg/l (als Ca ­
CO 3 ) wordt aanbevolen. Uit tests op dit niveau en de hierboven 
beschreven tests is naar voren gekomen dat de voortplantingspresta ­
tie voldoet aan de geldigheidscriteria (9) (10).  
1.6.4.  Testoplossingen  
Testoplossingen van de gekozen concentraties worden in de regel 
bereid middels verdunning van een stam-oplossing. Stamoplossingen 
moeten bij voorkeur worden bereid door oplossing van de stof in het testmedium.
 
In sommige gevallen kan het gebruik van organische oplosmiddelen 
of dispergeermiddelen nodig zijn om een voldoende geconcentreerde stamoplossing te maken, maar het gebruik van dergelijke middelen moet waar mogelijk worden voorkomen. Voorbeelden van geschikte 
oplosmiddelen zijn aceton, ethanol, methanol, dime-thylformamide 
en triëthyleenglycol. Voorbeelden van geschikte dispergeermiddelen zijn Cremophor RH40, methylcellulose 0,01 % en HCO-40. De test ­
stof in de testoplossingen mag in geen geval de grens van de op ­
losbaarheid in het testmedium overschrijden.
 
Oplosmiddelen worden gebruikt voor de productie van een stam ­
oplossing die nauwkeurig in water kan worden gedoseerd. Bij de 
aanbevolen oplosmiddelconcentratie in het uiteindelijke testmedium (d.w.z. ≤ 0,1 ml/l) zijn bovengenoemde oplosmiddelen niet toxisch 
en leiden ze niet tot een hogere oplosbaarheid in water van een stof.
 
Dispergeermiddelen kunnen een goed hulpmiddel zijn bij een nauw ­
keurige dosering en dispersie. Bij de aanbevolen concentratie in het uiteindelijke testmedium ( ≤ 0,1 ml/l) zijn bovengenoemde disper ­
geermiddelen niet toxisch en leiden ze niet tot een hogere oplosbaar ­
heid in water van een stof.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. TESTOPZET  
De behandelingen moeten alle plaatsvinden in een speciaal voor de 
desbetreffende behandeling bestemd testvat en de testvaten moeten daarna op willekeurige wijze worden behandeld. Het nalaten hiervan 
kan een vertekend beeld geven dat uitgelegd zou kunnen worden als 
een concentratie-effect. In het bijzonder moet hierbij gedacht worden aan de mogelijkheid dat, wanneer met experimentele units wordt omgegaan in volgorde van behandeling of concentratie, bepaalde 
met tijd verband houdende effecten, zoals vermoeidheid bij de uit ­
voerder van het experiment of andere fouten, kunnen leiden tot het vaststellen van grotere effecten bij de hogere concentraties. Boven ­
dien zou overwogen moeten worden de test af te breken als de 
testresultaten beïnvloed kunnen worden door een conditie waarvan reeds sprake was bij aanvang van de test of door een omgevings ­
conditie, zoals de plaats in het laboratorium.
 
1.8. PROCEDURE  
1.8.1.  Blootstellingsomstandigheden  
1.8.1.1.  Duur  
De test duurt 21 dagen.  
1.8.1.2.  Kwantiteit  
De moederdieren worden afzonderlijk, d.w.z. één per testvat, in de 
vaten ondergebracht met 50-100 ml medium in elk vat.  
Soms kunnen grotere volumes nodig zijn om te voldoen aan de eisen 
van de analytische procedure die wordt gebruikt voor de bepaling van de teststofconcentratie, hoewel het bundelen van replicatieonder ­
zoeken voor chemische analyse ook is toegestaan. Bij gebruik van 
volumes van meer dan 100 ml dient de hoeveelheid voer die aan de Daphnia wordt gegeven, eventueel te worden verhoogd om ervoor te zorgen dat er voldoende voer aanwezig is en dat wordt voldaan aan 
de geldigheidscriteria. Bij doorstroomtests mag om technische rede ­
nen voor een andere opzet worden gekozen (bijvoorbeeld vier groe ­
pen van tien dieren in een groter test-volume), mits eventuele wij ­
zigingen in de testopzet in het testrapport worden vermeld.
 
1.8.1.3.  Aantal dieren  
Bij semistatische tests ten minste tien dieren afzonderlijk gehouden 
bij elke testconcentratie en ten minste tien dieren afzonderlijk gehou ­
den in de controlereeks.  
Wat doorstroomtests betreft is gebleken dat een aantal van 40, in vier 
groepen van tien verdeelde dieren bij elke testconcentratie geschikt is 
(1). Een kleiner aantal testorganismen is toegestaan; een minimum van 20 dieren per concentratie verdeeld over twee of meer replicatie ­
onderzoeken met een gelijk aantal dieren (bijvoorbeeld vier replica ­
tieonderzoeken met elk vijf watervlooien) wordt aanbevolen. Opge ­
merkt dient te worden dat het bij tests waar dieren in groepen wor ­
den gehouden, niet mogelijk is het voortplantingsresultaat uit te drukken in het totale aantal levende nakomelingen per moederdier 
dat aan het eind van de test nog in leven is, als er moederdieren 
sterven. In die gevallen moet dat resultaat worden uitgedrukt in het „totale aantal levende nakomelingen per moederdier dat bij aanvang van de test aanwezig was”.
 
1.8.1.4.  Voeding  
Bij semistatische tests moet er bij voorkeur dagelijks worden ge ­
voerd, doch in ieder geval driemaal per week (d.w.z. naargelang van de verandering van medium). Indien hiervan wordt afgeweken 
(bijvoorbeeld bij doorstroomtests), moet dat in het testrapport wor ­
den vermeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Tijdens de test moet de voeding van de moederdieren bij voorkeur 
bestaan uit levende algencellen of ten minste een van de volgende 
bestanddelen: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (tegenwoor ­
dig Pseudokirch-neriella subcapitata (11)) en Scenedesmus subspica ­
tus. Uitgangspunt bij de voeding moet de aan elk moederdier toe ­
gediende hoeveelheid organische koolstof (C) zijn. Uit onderzoek 
(12) is gebleken dat een hoeveelheid van 0,1 à 0,2 mg C/Daphnia/ ­
dag voor Daphnia magna voldoende is om een zodanig aantal nako ­
melingen te krijgen dat wordt voldaan aan de geldigheidscriteria 
voor de test. De voeding kan worden gegeven in een gelijkmatige, 
over de gehele testperiode uitgesmeerde hoeveelheid of desgewenst in een lagere hoeveelheid bij aanvang van de test, die daarna wordt opgevoerd teneinde rekening te houden met de groei van de moe ­
derdieren. Ook in dat geval moet de hoeveelheid echter altijd binnen 
de aanbevolen hoeveelheid van 0,1-0,2 mg C/Daphnia/dag blijven.
 
Indien er gebruik moet worden gemaakt van alternatieve middelen, 
zoals algencelaantal of lichtabsorptie, om aan de vereiste hoeveelheid 
voeding te komen (d.w.z. gemakshalve, aangezien de meting van het 
koolstofgehalte tijdrovend is), moet elk laboratorium zijn eigen no ­
mografie opstellen waarin het alternatieve middel wordt gerelateerd aan het koolstofgehalte van de algencultuur (zie aanhangsel 2 voor 
suggesties inzake het opstellen van een nomografie). Nomografieën 
moeten ten minste eenmaal per jaar worden gecontroleerd, doch vaker als de algencultuuromstandigheden zijn gewijzigd. Gebleken 
is dat lichtabsorptie een beter alternatief voor het koolstofgehalte is 
dan het celaantal (13).
 
Er dient een geconcentreerde algensuspensie te worden toegediend 
aan de Daphnia om de hoeveelheid algen-kweekmedium die in de 
testvaten wordt overgebracht, zoveel mogelijk te beperken. De algen 
kunnen worden geconcentreerd door middel van centrifugeren, ge ­
volgd door hersuspensie in gedistilleerd water, gedeïoniseerd water of Daphnia-kweekmedium.
 
1.8.1.5.  Licht  
16 uren licht met een intensiteit van ten hoogste 15-20 μE . m  -2 . s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatuur  
De temperatuur van de testmedia moet liggen tussen 18-22  o C. Waar 
mogelijk moet de temperatuur echter bij geen enkele test met meer dan 2
 o C variëren binnen dit bereik (bijvoorbeeld 18-20, 19-21 of 
20-22  o C). Voor de controle van de temperatuur kan het dienstig zijn 
een extra testvat te gebruiken.  
1.8.1.7.  Beluchting  
De testvaten mogen niet worden belucht tijdens de test.  
1.8.2.  Testconcentratie  
Normaliter moeten er ten minste vijf testconcentraties worden bereid 
in een meetkundige reeks met een scheidingsfactor die bij voorkeur 
niet hoger is dan 3.2, en moet voor elke testconcentratie het juiste aantal replica-tieonderzoeken worden uitgevoerd (zie punt 1.8.1.3). Het eventuele gebruik van minder dan vijf concentraties moet wor ­
den beargumenteerd. Stoffen mogen niet worden getest boven de 
grens van hun oplosbaarheid in het testmedium.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Bij de vaststelling van het concentratiebereik moet aandacht worden 
geschonken aan het volgende:  
i) Als het de bedoeling is de LOEC/NOEC vast te stellen, moet de 
laagste testconcentratie zo laag zijn dat de vruchtbaarheid bij die concentratie niet significant lager is dan die van de contro ­
legroep. Als dat niet het geval is, moet de test worden herhaald 
met een lagere laagste concentratie.
 
ii) Als het de bedoeling is de LOEC/NOEC vast te stellen, moet de 
hoogste testconcentratie zo hoog zijn dat de vruchtbaarheid bij 
die concentratie significant lager is dan die van de controlegroep. 
Als dat niet het geval is, moet de test worden herhaald met een hogere hoogste concentratie.
 
iii) Indien een schatting wordt gemaakt van de EC  X betreffende 
effecten op de voortplanting, is het raadzaam om een dusdanig 
aantal concentraties te gebruiken dat de EC  X met voldoende 
zekerheid kan worden bepaald. Indien een schatting wordt ge ­
maakt van de EC  50 betreffende effecten op de voortplanting, is 
het raadzaam dat de hoogste testconcentratie groter is dan deze 
EC 50 . Als niet op deze wijze te werk wordt gegaan zal — 
hoewel de EC  50 nog steeds geschat kan worden — het betrouw ­
baarheidsinterval van de EC  50 erg breed worden, en is wellicht 
ook niet goed te beoordelen of het model wel voldoet.  
iv) Het testconcentratiebereik moet bij voorkeur geen concentraties 
omvatten die statistisch gezien een significant effect hebben op overleving van volwassen dieren, aangezien de aard van de test 
daarmee zou veranderen van een eenvoudige voortplantingstest 
in een gecombineerde voortplantings- en mortaliteitstest, die een veel complexere statistische analyse vergt.
 
Voorafgaande kennis over de toxiciteit van de teststof (bijvoorbeeld 
op basis van een acute test en/of op verdeling gerichte studies) kan een goed hulpmiddel zijn bij de selectie van de juiste testconcentra ­
ties.
 
Indien een oplosmiddel of dispergeermiddel wordt gebruikt bij de 
bereiding van testoplossingen (zie punt 1.6.4), mag de uiteindelijke concentratie in de testvaten niet hoger zijn dan 0,1 ml/l en moet die bovendien in alle testvaten dezelfde zijn.
 
1.8.3.  Controles  
Ter aanvulling op de testreeks moet of één testmediumcontrolereeks 
en, indien relevant, één controlereeks met het oplosmiddel of het 
dispergeermiddel worden uitgevoerd. Indien gebruikt moet de oplos ­
middel- of dis-pergeermiddelconcentratie dezelfde zijn als in de va ­
ten met de teststof. Het juiste aantal replicatieonderzoeken moet 
worden verricht (zie punt 1.8.1.3).  
Bij een goed uitgevoerde test moet de coëfficiënt van de variatie 
rond het gemiddelde aantal levende nakomelingen per moederdier 
in de controlegroep(en) in de regel ≤ 25 % zijn; dit moet worden 
vermeld voor elke testopzet waarbij gebruik wordt gemaakt van afzonderlijk gehouden dieren.
 
1.8.4.  Verversing van het testmedium  
De frequentie waarmee het medium wordt ververst, hangt af van de 
stabiliteit van de teststof, maar moet ten minste driemaal per week 
zijn. Indien, uit voorafgaande stabiliteitstests (zie punt 1.4) blijkt dat 
de teststofconcentratie niet stabiel is (d.w.z. buiten het bereik van 80- 120 % van de nominale concentratie of dalend tot onder 80 % van de gemeten beginconcentratie) gedurende de maximale verversings ­
periode (d.w.z. drie dagen), moet worden overwogen het medium 
vaker te verversen of gebruik te maken van een doorstroomtest.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Wanneer het medium wordt ververst in semistatische tests, wordt een 
tweede reeks testvaten bereid waarin de moederdieren worden over ­
gebracht door middel van bijvoorbeeld een glazen pipet met een geschikte diameter. De hoeveelheid met de Daphnia overgebracht medium moet zo klein mogelijk zijn.
 
1.8.5.  Observaties  
De resultaten van de observaties gedurende de test moeten worden 
vermeld op informatiebladen (zie de voorbeelden in de aanhangsels 3 
en 4). Indien er nog andere metingen gedaan moeten worden (zie de punten 1.3 en 1.8.8), zijn er mogelijk meer observaties nodig.
 
1.8.6.  Nakomelingen  
De door elk moederdier voortgebrachte nakomelingen moeten bij 
voorkeur dagelijks worden verwijderd en geteld vanaf het moment 
dat het eerste broedsel verschijnt, teneinde te voorkomen dat ze voer 
opeten dat voor de volwassen dieren is bestemd. Hoewel in het kader van deze methode alleen het aantal levende nakomelingen moet worden geteld, moet ook de aanwezigheid van niet-uitgekomen eitjes 
of dode nakomelingen worden vermeld.
 
1.8.7.  Mortaliteit  
De mortaliteit onder de moederdieren moet bij voorkeur dagelijks 
worden geregistreerd en ten minste op dezelfde tijdstippen als de telling van de nakomelingen.
 
1.8.8.  Andere parameters  
Hoewel deze methode voornamelijk bedoeld is voor de beoordeling 
van de effecten op de voortplanting, kunnen er mogelijk ook andere 
effecten in zodanige mate worden gekwantificeerd dat statistische analyse mogelijk is. Groeimetingen zijn zeer wenselijk aangezien zij informatie verschaffen over mogelijke subletale effecten, welke 
gegevens soms bruikbaarder zijn dan voortplantingsmetingen alleen; 
de meting van de lengte van de moederdieren (d.w.z. de lichaams ­
lengte met uitzondering van het anale uiteinde) aan het eind van de test wordt aanbevolen. Andere te meten of te berekenen parameters 
zijn de tijd die nodig is om het eerste broedsel (en de daaropvol ­
gende broedsels) voort te brengen, aantal en omvang van de nako ­
melingen per dier, aantal niet-uitgekomen eitjes, aanwezigheid van mannelijke dieren of ephippia en de intrinsieke groeisnelheid van de 
populatie.
 
1.8.9.  Frequentie van analytische bepalingen en metingen  
De zuurstofconcentratie, temperatuur, hardheid en pH-waarden moe ­
ten ten minste eenmaal per week worden gemeten, in verse en oude media, in de controle(s) en in de hoogste teststofconcentratie.
 
Tijdens de test worden de concentraties van de teststof regelmatig 
bepaald.  
Bij semistatische tests waarbij de concentratie van de teststof naar 
verwachting binnen ± 20 % van de nominale waarde zal blijven (d.w.z. binnen het bereik van 80-120 %, zie de punten 1.4 en 1.8.4), 
verdient het aanbeveling de hoogste en laagste testconcentraties in 
ieder geval te analyseren bij de verse bereiding ervan alsmede een ­
maal bij verversing in de eerste week van de test (d.w.z. analyses moeten worden verricht op een monster van een en dezelfde oplos ­
sing — bij verse bereiding en bij verversing). Daarna moeten deze 
bepalingen in ieder geval wekelijks worden herhaald.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Bij tests waarbij de concentratie van de teststof naar verwachting niet 
binnen ± 20 % van de nominale waarde zal blijven, moeten alle 
testconcentraties zowel bij de verse bereiding als bij verversing wor ­
den geanalyseerd. Bij tests echter waarbij de gemeten beginconcen ­
tratie van de teststof weliswaar niet binnen ± 20 % van de nominale 
waarde ligt. maar wel naar tevredenheid kan worden aangetoond dat 
de beginconcentraties herhaalbaar en stabiel zijn (d.w.z. binnen het bereik van 80-120 % van de beginconcentraties), kunnen de che ­
mische bepalingen in de weken 2 en 3 van de test worden beperkt 
tot de hoogste en laagste testconcentraties. In alle gevallen hoeft de 
bepaling van teststofconcentraties vóór de verversing slechts op één replicatieonderzoekvat bij elke testconcentratie te worden uitgevoerd.
 
Bij doorstroomtests is een gelijksoortige monstermethode van toe ­
passing als bij semistatische tests (met dien verstande dat de meting 
van oplossingen hier niet van toepassing is). Desalniettemin kan het raadzaam zijn meer monsters te nemen in de eerste week (bijvoor ­
beeld via drie reeksen metingen) om te bewerkstelligen dat de test ­
concentraties stabiel blijven. Bij dit soort testen moet de doorstro ­
mingssnelheid van het oplosmiddel en de teststof dagelijks worden gecontroleerd.
 
Als er voldoende aanwijzingen zijn dat de concentratie van de te 
testen stof gedurende de gehele test en naar tevredenheid binnen ± 
20 % van de nominale of gemeten beginconcentratie is gebleven, mogen de resultaten worden gebaseerd op nominale of gemeten beginwaarden. Indien de afwijking van de nominale of gemeten 
beginconcentratie groter is dan ± 20 %, moeten de resultaten worden 
uitgedrukt in tijdgewogen gemiddelde (zie aanhangsel 5).
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. VERWERKING VAN DE RESULTATEN  
Het doel van de test is het bepalen van het effect van de teststof op 
het totale aantal levende nakomelingen per moederdier dat aan het 
eind van de test nog in leven is. Het totale aantal nakomelingen per moederdier moet per testvat worden berekend (d.w.z. via replicatie ­
onderzoek). Als bij een replicatieonderzoek het moederdier sterft 
tijdens de test of als het blijkt te gaan om een mannelijk dier, wordt 
dat replicatieonderzoek niet meegenomen in de analyse. De analyse zal in dat geval worden gebaseerd op een lager aantal replicatie ­
onderzoeken.
 
Voor de schatting van de LOEC — en daarmee de NOEC — met 
betrekking tot de effecten van de chemische stof op het voortplan ­
tingsresultaat moet het gemiddelde voortplantingsresultaat van alle replicatieonderzoeken bij elke concentratie en de gebundelde rest ­
standaardafwijking worden berekend aan de hand van variantie-ana ­
lyse (ANOVA). Vervolgens moet per concentratie het gemiddelde worden vergeleken met het controlegemiddelde aan de hand van een geschikte meervoudigevergelijkingsmethode. Geschikt zijn de Dun ­
nett- of Williams-test (14) (15) (16) (17). Gecontroleerd moet wor ­
den of de binnen de ANOVA gehanteerde aanname betreffende de variantiehomogeniteit standhoudt. Dit kan beter langs grafische weg worden gedaan dan middels een formele significantietest (18); een 
Bartlett-test is een geschikt alternatief. Als de aanname geen stand 
houdt moet transformatie van gegevens worden overwogen om de varianties vóór de ANOVA te homogeniseren of om een gewogen ANOVA uit te voeren. De omvang van het met behulp van ANOVA 
waarneembare effect (d.w.z. het geringste significante verschil) moet 
worden berekend en vermeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Voor de schatting van de concentratie die zou leiden tot een achter ­
uitgang met 50 % van het voortplantingsresultaat (d.w.z. de EC  50 ), 
moet voor de gegevens een geschikte kromme — bijvoorbeeld een logistieke kromme — worden uitgezet met behulp van een statisti ­
sche methode zoals die van de kleinste kwadraten. De parameters 
van de kromme kunnen zo worden gekozen dat de EC
 50 en de 
standaardafwijking daarvan direct kunnen worden geschat, waarmee de berekening van de betrouwbaarheidsgrenzen betreffende de EC
 50 
aanzienlijk kan worden vergemakkelijkt. Tenzij er goede redenen 
zijn om de voorkeur te geven aan verschillende betrouwbaarheids ­
niveaus, moeten tweezijdig 95 % betrouwbaarheidsgrenzen worden vermeld. De procedure moet bij voorkeur voorzien in een methode voor de beoordeling van de significantie van het gebrek aan „fit”. Dit 
kan langs grafische weg geschieden, of door middel van verdeling 
van de restsom van de kwadraten in „gebrek aan fit” en „zuivere afwijkingscomponenten” en uitvoering van een significantietest in ­
zake dat „gebrek aan fit”. Aangezien behandelingen die leiden tot 
een hoge vruchtbaarheid waarschijnlijk een grotere variante in het 
aantal voortgebrachte nakomelingen hebben dan behandelingen die leiden tot een lage vruchtbaarheid, moet weging van de vastgestelde waarden om de verschillende varianties in de verschillende behan ­
delingsgroepen tot uitdrukking te brengen, in overweging worden 
genomen (zie voor achtergrondinformatie referentie 18).
 
Bij de analyse van de gegevens van de eindringtest (2) is een logis ­
tieke kromme uitgezet aan de hand van het volgende model, waarbij moet worden aangetekend dat ook andere geschikte modellen ge ­
bruikt mogen worden:
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
waarin:  
Y = het totale aantal nakomelingen per moederdier dat aan het 
eind van de test nog in leven was (berekend per vat);  
x = de stofconcentratie;  
c = het verwachte aantal nakomelingen wanneer x = 0;  
x 0 = de EC  50 in de populatie;  
b = de hellingsparameter.  
In de meeste situaties zal dit model naar alle waarschijnlijkheid vol ­
doen, maar er zijn ook tests waar dat niet opgaat. De geldigheid van 
het hierboven voorgestelde model moet worden gecontroleerd. In sommige gevallen kan een hormesismodel waarin lage concentraties sterkere effecten sorteren, uitkomst bieden (19).
 
Ook concentraties betreffende andere effecten zoals de EC  10 of EC  20 
kunnen worden geschat, zij het dat het wellicht beter is andere 
parameters voor het model te kiezen dan die welke worden gebruikt bij de schatting van de EC
 50 . 
2.2. TESTRAPPORT  
Het testrapport moet het volgende omvatten:  
2.2.1.  Teststof  
— Fysische kenmerken en relevante fysisch-chemische eigenschap ­
pen. ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— Chemische identificatiegegevens, waaronder de zuiverheid.  
2.2.2.  Testsoort  
— De kloon (ongeacht of die genetisch getypeerd is), leverancier of 
bron (voor zover bekend) en de toegepaste cultuuromstandighe ­
den. Als gebruik wordt gemaakt van een andere soort dan 
Daphnia magna, moet dit worden gerapporteerd en beargumen ­
teerd.  
2.2.3.  Testomstandigheden  
— Toegepaste testprocedure (bijvoorbeeld semistatisch of door ­
stroom, volume, hoeveelheid Daphnia per liter).  
— Fotoperiode en lichtintensiteit.  
— Testopzet (bijvoorbeeld aantal replicatieonderzoeken, aantal moe ­
derdieren per replicatieonderzoek).  
— Bijzonderheden over het gebruikte kweekmedium.  
— Voor zover gebruikt, toevoegingen van organisch materiaal, met 
inbegrip van de samenstelling, bron. bereidingsmethode, TOC/ ­
COD van stamoplossingen, schatting van de resulterende TOC/ ­
COD in het test- medium.  
— Gedetailleerde informatie over voeding, waaronder de hoeveel ­
heid (in mg C/Daphnia/dag) en het schema (bijvoorbeeld soort voer, met inbegrip van de specifieke naam (soort) wat de algen betreft en, voor zover bekend, de stam en de kweekomstandig ­
heden).
 
— Bereidingsmethode van stamoplossingen en frequentie van de 
verversing (indien gebruikt, moeten het oplosmiddel en het dis ­
pergeermiddel alsmede de concentratie ervan worden vermeld).  
2.2.4.  Resultaten  
— Resultaten van eventuele voorafgaande studies naar de stabiliteit 
van de teststof.  
— De nominale testconcentraties en de resultaten van alle 
analyses ter bepaling van de concentratie van de teststof in de testvaten (zie voorbeeld informatiebladen in aanhangsel 4); de herstelcapaciteit van de methode en de bepalingsgrens moeten 
ook worden gerapporteerd.
 
— Waterkwaliteit in de testvaten (d.w.z. pH, temperatuur en opge ­
loste-zuurstofconcentratie, en TOC en/of COD en hardheid waar 
van toepassing) (zie voorbeeld informatieblad in aanhangsel 3).  
— De volledige gegevens over de levende nakomelingen per moe ­
derdier (zie voorbeeld informatieblad in aanhangsel 3).  
— Sterftecijfer onder de moederdieren en de dag (en) waarop de sterfte 
plaatsvond (zie voorbeeld informatie blad in aanhangsel 3).  
— De variatiecoëfficiënt van de vruchtbaarheid in de controlegroep 
(gebaseerd op het totale aantal levende nakomelingen per moe ­
derdier dat aan het eind van de test nog in leven was).  
— Grafische voorstelling van het totale aantal levende nakomelin ­
gen per moederdier (voor elk replicatieonderzoek) dat nog in leven was aan het eind van de test afgezet tegen de concentratie 
van de teststof.
 
— De Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) voor de 
voortplanting, inclusief een beschrijving van de toegepaste sta ­
tistische procedures en een indicatie van de omvang van het effect dat zou kunnen worden waargenomen, alsmede de No Observed Effect Concentration (NOEC) voor de voortplan ­
ting; waar van toepassing moet ook de LOEC/NOEC betreffende 
de moraliteit van de moederdieren worden vermeld.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— Voor zover van toepassing, de EC  X betreffende de voortplanting 
en betrouwbaarheidsintervallen en een grafiek van het het voor 
de berekening daarvan gehanteerde model de helling van de dosis-responscurve en de standaardafwijking daarvan.
 
— Andere waargenomen biologische effecten of metingen: vermel ­
ding van eventuele andere biologische effecten die werden waar ­
genomen of gemeten (bijvoorbeeld groei van moederdieren), met 
inbegrip van eventuele passende onderbouwing.  
— Een toelichting op eventuele afwijkingen van de testmethode.  
3. REFERENTIES  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 maart 1993.
 
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, blz. 257-265.
 
(4) Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna 
Straus. Protoplasma, 154, blz. 25-33.  
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Or ­
ganisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), 
USEPA, Cincinnati, Ohio.  
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, blz. 775-782.
 
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 blz.  
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; pro ­
blems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Con ­
ference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), blz. 144-148.
 
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. 
Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, blz. 1-8.  
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), blz. 185-196.
 
(11) Korshikov (1990).  Pseudohrchnericlla subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
dard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, blz. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, blz. 459-466.
 
(14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, blz. 1096-1121.  
(15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, blz. 482-491.  
(16) Williams D. A. (1971). A test lor differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, blz. 103-117.  
(17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, blz. 510-531.  
(18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, blz. 93-96.  
(20) Wilson E.O. and Bossen, W. H. (1971). A Primer of Popula ­
tion Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York. 
blz. 532.  
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L.L. and Bovce M.S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, blz. 1156- 
1166.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Aanhangsel 1  
BEREIDING VAN VOLLEDIG BESCHREVEN MEDIA ELENDT M7 
EN M4  
Acclimatisering aan Elendt M7- en Elendt M4-media  
Sommige laboratoria hebben problemen ondervonden bij het rechtstreeks over ­
brengen van  Daphnia  in M4- (1) en M7-media. Toch is er enig succes geboekt 
met geleidelijke acclimatisering, d.w.z. overgang van het eigen medium naar 30 % Elendt, vervolgens naar 60 % Elendt en tot slot naar 100 % Elendt. Soms is een acclimatiseringsperiode van een volle maand nodig.
 
BEREIDING  
Spoorelementen  
Afzonderlijke stamoplossingen (I) van individuele spoorelementen worden eerst 
bereid in water met een geschikte zuiverheid, d.w.z. gedeïoniseerd, gedistilleerd 
of omgekeerde osmose. Uit deze verschillende stamoplossingen (I) wordt een 
enkelvoudige stamoplossing (II) bereid, die alle spoorelementen bevat (gecom ­
bineerde oplossing), te weten:  
Stamoplossingen I 
(enkelvoudige stof) Aan water 
toegevoegde 
hoeveelheid 
(mg/l) Concentratie (in 
relatie tot medium 
M4) 
(-voudig) Ter bereiding van de 
gecombineerde stamoplossing II de 
volgende hoeveelheid stamoplossing I 
aan water toevoegen 
(ml/l) 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 – — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Zowel de Na  2 EDTA- als de FeSO  4 -oplossingen worden enkelvoudig bereid, samengebracht en onmiddellijk met een 
autoclaaf gesteriliseerd. Hiermee wordt verkregen: 
21 Fe-EDTA-oplossing 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4- en M7-media  
M4- en M7-media worden als volgt bereid met behulp van stamoplossing II, 
macronutriënten en vitamines:  
Aan water 
toegevoegde hoe ­
veelheid 
(mg/l) Concentratie (in 
relatie tot medium 
M4) 
(-voudig) Toegevoegde hoeveelheid 
stamoplossing ter bereiding van medium 
(ml/l) 
M 4 M 7  
Stamoplossing II gecombineerde spoorele ­
menten 20 50 50 
Macronutriëntstamoplossingen 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Gecombineerde vitaminestamoplossing — 10 000 0,1 0,1 De gecombineerde vitaminestamoplossing wordt bereid door toevoeging van de 
3 vitamines aan 1 liter water, zoals hieronder weergegeven: 
Thiaminehydrochloride 750 10 000 — — 
Cyanocobalamine (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotine 7,5 10 000 — —  
De gecombineerde vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand bewaard in kleine fracties. De vitamines worden kort vóór geb ruik 
aan de media toegevoegd.  
NB: Voeg, ter voorkoming van zoutneerslag bij de bereiding van de volledige media, de fracties van de stamoplossingen toe aan circ a 
500-800 ml gedeïoniseerd water en vul daarna aan tot 1 liter. 
Zie voor de eerste publicatie betreffende het M4-medium Elendt. B.P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructur al 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Strauss. Protoplasma, 154, blz. 25-33.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Aanhangsel 2  
TOTALE ORGANISCHE KOOLSTOF (TOC) ANALYSE EN 
OPSTELLING VAN EEN NOMOGRAFIE VOOR TOC-GEHALTE VAN 
ALGENVOEDING  
Normaal gesproken wordt het koolstofgehalte van de algenvoeding niet recht ­
streeks gemeten, maar afgeleid uit correlaties (d.w.z. nomografieën) met alterna ­
tieve middelen zoals algencelaantal of lichtabsorptie.  
De TOC moet worden gemeten via hogetemperatuuroxidatie en niet met metho ­
den op basis van uv of persulfaat. (Zie: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Hol-born, Londen WC1V 6HB.)
 
Voor het opstellen van nomografieën moeten algen middels centrifugeren worden 
gescheiden van het groeimedium, gevolgd door hersuspensie in gedistilleerd water. De surrogaatparameter en de TOC-concentratie moet in elk monster drie ­
maal worden gemeten. Blanco's van gedistilleerd water moeten worden geanaly ­
seerd; de TOC-concentratie moet worden afgeleid uit die van het algenmonster.
 
De nomografie moet lineair zijn over het vereiste koolstofconcentratiebereik. 
Voorbeelden zijn hieronder weergegeven.  
NB: Deze grafieken mogen niet worden gebruikt voor conversiedoeleinden; het is 
van wezenlijk belang dat laboratoria hun eigen nomografieën opstellen.
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
Aanhangsel 3  
VOORBEELD INFORMATIEBLAD VOOR REGISTRATIE VAN MEDIUMVERVERSING, FYSISCH-CHEMISCHE CONTROLEGEGEVENS, VOEDING, DAPHNIA- 
VOORTPLANTING EN MORTALITEIT VOLWASSEN DIEREN  
Experiment nr: Begin gegevens: Kloon: Medium: Type voeding: Teststof: Nominale concentratie: 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Renov. medio (mar- 
car) 
pH (  1 ) Nieuw 
Oud 
O 2 mg/l (  1 ) Nieuw 
Oud 
Temp (  o C) (  1 ) Nieuw 
Oud 
Voeding gegeven 
Aantal levende 
nakomelingen (  2 ) Totaal 
Vat 1 
2 
3 4 5
 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Experiment nr: Begin gegevens: Kloon: Medium: Type voeding: Teststof: Nominale concentratie: 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Totaal 
Cumulatieve mortaliteit 
volwassen dieren (
 3 ) 
( 1 ) Aangeven welk vat voor het experiment werd gebruikt. 
( 2 ) Niet-uitgekomen eitjes aangeven als „AB” in het desbetreffend vakje 
( 3 ) Eventuele mortaliteit van volwassen dieren aangeven als „M” in het desbetreffend vakje.
 Aanhangsel 4  
VOORBEELD INFORMATIEBLAD VOOR REGISTRATIE VAN RESULTATEN CHEMISCHE ANALYSE  
a) Gemeten concentraties  
Nominale 
concentratie Monster week 1 Monster week 2 Monster week 3 
Vers Oud Vers Oud Vers Oud  
b) Gemeten concentraties als percentage van nominale concentratie  
Nominale 
concentratie Monster week 1 Monster week 2 Monster week 3 
Vers Oud Vers Oud Vers Oud  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Aanhangsel 5  
BEREKENING TIJDGEWOGEN GEMIDDELDE  
Tijdgewogen gemiddelde  
Daar de concentratie van de teststof in de periode tussen de mediumverversingen 
kan afnemen, moet goed worden bekeken welke concentratie moet worden ge ­
kozen als representatief voor het concentratiebereik dat wordt ondergaan door de 
Daphnia-moederdieren. Deze keuze moet gebaseerd zijn op biologische én sta ­
tistische overwegingen. Als bijvoorbeeld wordt aangenomen dat de voortplanting vóór alles wordt beïnvloed door de piekconcentratie, moet de maximumconcen ­
tratie worden gebruikt. Wanneer men er daarentegen van uitgaat dat het geaccu ­
muleerde of langeretermijn-effect van de toxische stof belangrijker is, is een gemiddelde concentratie relevanter. In dat geval is de tijdgewogen gemiddelde concentratie geschikt, aangezien daarbij rekening wordt gehouden met de variatie 
van de momentane concentratie over een bepaalde tijdsperiode.
 
Figuur 1:  
Voorbeeld van tijdgewogen gemiddelde
  
Figuur 1 laat een voorbeeld zien van een (vereenvoudigde) test over zeven dagen 
met mediumverversing op dag 0, 2 en 4.  
De dunne zigzaglijn geeft de concentratie op enig tijdstip weer. Als vooronder ­
stelling geldt dat de concentratie daalt volgens een exponentieel achteruitgangs ­
proces.  
De zes vierkantjes geven de waargenomen concentraties weer zoals gemeten aan 
het begin en het einde van elke verversingsperiode.  
De dikke, ononderbroken lijn geeft het tijdgewogen gemiddelde weer.  
Het tijdgewogen gemiddelde wordt zo berekend dat het oppervlak onder dat 
gemiddelde gelijk is aan het oppervlak onder de concentratiekromme. Zie onder ­
staande tabel 1 voor de berekening van dit voorbeeld.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabel 1:  
Berekening van het tijdgewogen gemiddelde  
Verversing nr. Dagen Conc0 Concl Ln(Conc0) Ln(Concl) Oppervlak  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Totaal dagen: 7 Totaal 
oppervlak 50,091 
Tijdgewogen 
gemiddelde 7,156
 
Dagen:  het aantal dagen in de verversingsperiode.  
Conc0:  de gemeten concentratie aan het begin van elke verversingsperiode.  
Conc1:  de gemeten concentratie aan het einde van elke verversingsperiode.  
Ln(Conc0):  de natuurlijke logaritme van Conc0.  
Ln(Conc1):  de natuurlijke logaritme van Conc1.  
Oppervlak:  het oppervlak onder de exponentiele kromme voor elke verversingsperiode. Het 
wordt berekend aan de hand van de volgende formule:  
Area ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Days  
Het „Tijdgewogen gemiddelde” is het „Totaal oppervlak” gedeeld door het „To ­
taal dagen”.  
Voor de toepasbaarheid op de Daphnia-voortplantingstest zou de tabel uiteraard 
moeten worden uitgebreid en betrekking moeten hebben op een periode van 21 dagen.
 
Het is duidelijk dat niet bevestigd kan worden dat het achteruitgangsproces 
inderdaad exponentieel is als de waarnemingen alleen plaatsvinden aan het begin 
en einde van elke verversingsperiode. Een andere kromme zou resulteren in een andere berekening van het „Oppervlak”. Hoe dan ook, het is alleszins plausibel uit te gaan van een exponentieel achteruitgangsproces en de weergegeven 
kromme is waarschijnlijk het beste alternatief bij gebrek aan andere gegevens.
 
Toch is de nodige voorzichtigheid geboden als geen enkele stof wordt aange ­
troffen bij de chemische analyse aan het eind van de verversingsperiode. Als niet ingeschat kan worden hoe snel de stof uit de oplossing verdwenen is, kan er ook geen realistisch oppervlak onder de kromme worden vastgesteld, en dus ook geen 
aannemelijk tijdgewogen gemiddelde.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MICRO-ORGANISMEN IN DE BODEM: BEPALING VAN DE 
OMZETTING VAN STIKSTOF  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 216 (2000) van de OESO.  
1.1. INLEIDING  
In deze testmethode wordt een laboratoriumtest beschreven om te 
onderzoeken welke effecten chemische stoffen na één blootstelling op lange termijn hebben op de omzetting van stikstof door micro- organismen in de bodem. De test is in eerste instantie gebaseerd op 
aanbevelingen van de Organisatie voor de bescherming van planten in 
Europa en het Middellandse Zeegebied (1). Er is echter ook rekening gehouden met andere richtsnoeren, bijvoorbeeld van de Biologische 
Bundesanstalt in Duitsland (2), het Environmental Protection Agency 
in de VS (3) de SETAC (4) en de Internationale Organisatie voor Normalisatie (5). Tijdens een workshop van de OESO over de selectie van bodem/sediment in Belgirate in Italië in 1995 (6) is overeenstem ­
ming bereikt over het aantal en de aard van de in deze test te ge ­
bruiken bodemmonsters. De aanbevelingen voor het verzamelen, be ­
handelen en bewaren van de bodemmonsters zijn gebaseerd op ISO- richtsnoeren (7) en aanbevelingen van de workshop in Belgirate. Bij 
de beoordeling en evaluatie van toxische kenmerken van teststoffen 
kan het nodig zijn de effecten op de microbiële activiteit van de bodem te bepalen, bijvoorbeeld wanneer er gegevens over de poten ­
tiële neveneffecten van gewasbeschermingsmiddelen op de microflora 
van de bodem nodig zijn of wanneer wordt verwacht dat de micro- 
organismen in de bodem aan andere chemische stoffen dan gewasbe ­
schermingsmiddelen worden blootgesteld. De bepaling van de omzet ­
ting van stikstof wordt uitgevoerd om de effecten van deze chemische 
stoffen op de microflora van de bodem te bepalen. Als er landbouw ­
chemicaliën (b.v. gewasbeschermingsmiddelen, kunstmest of bos ­
bouwchemicaliën) worden getest, worden zowel de bepaling van de omzetting van stikstof als de bepaling van de omzetting van koolstof 
uitgevoerd. Als er andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden 
getest, volstaat de bepaling van de omzetting van stikstof. Als de EC
 50 
bij de bepaling van de omzetting van stikstof voor dergelijke stoffen 
echter binnen het bereik valt van de waarde die voor in de handel 
verkrijgbare nitrificatieremmers (zoals nitrapyrin) wordt gevonden, kan 
een bepaling van de omzetting van koolstof worden uitgevoerd om nadere informatie te verkrijgen.
 
De bodem bestaat uit levende en niet-levende componenten die com ­
plexe en heterogene mengsels kunnen vormen. Micro-organismen spe ­
len een belangrijke rol bij de afbraak en omzetting van organisch materiaal in vruchtbare bodem en veel soorten dragen bij tot verschil ­
lende aspecten van de vruchtbaarheid van de bodem. Een verstoring 
van deze biochemische processen op lange termijn kan mogelijkerwijs de cycli van nutriënten verstoren en verandering brengen in de vrucht ­
baarheid van de bodem. Omzetting van koolstof en stikstof vindt in 
elke vruchtbare bodem plaats. Hoewel de voor deze processen ver ­
antwoordelijke microbiële levensgemeenschappen van bodem tot bo ­
dem verschillen, zijn de omzettingsroutes in grote lijnen gelijk.
 
De hier beschreven testmethode is bedoeld om te detecteren welke 
schadelijke effecten een stof op lange termijn op het omzettingspro ­
ces van stikstof in een aërobe bodem aan het oppervlak kan hebben. Met de testmethode kunnen ook de effecten van stoffen op de om ­
zetting van koolstof door de microflora in de bodem worden bepaald. 
De vorming van nitraat vindt plaats na het verbreken van de 
koolstof/stikstof-binding. Als er in de behandelde en de controlebo ­
dem een even hoge nitraatproductie wordt gemeten, is het daarom zeer waarschijnlijk dat de belangrijkste afbraakroutes voor koolstof 
intact zijn en functioneren. Het voor de test gekozen substraat (ver ­
poederd luzememeel) heeft een gunstige koolstof/stikstof-verhouding (meestal tussen 12/1 en 16/1). Daardoor is er tijdens de test een geringer koolstoftekort en kunnen microbiële levensgemeenschappen, 
als ze door een chemische stof worden aangetast, zich binnen 100 
dagen weer herstellen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Deze testmethode is ontwikkeld uit tests die in eerste instantie be ­
doeld waren voor stoffen waarvoor kan worden geraamd welke hoe ­
veelheid de bodem bereikt. Dit geldt bijvoorbeeld voor gewasbe ­
schermingsmiddelen die in bekende hoeveelheden op het veld wor ­
den gebracht. Voor landbouwchemicaliën is het voldoende twee do ­
ses te testen die relevant zijn voor de opgebrachte hoeveelheid die 
wordt verwacht of geraamd. Landbouwchemicaliën kunnen als werk ­
zame stof of als geformuleerd product worden getest. De test kan echter ook voor andere stoffen worden gebruikt. Door zowel de op 
de bodem gebrachte hoeveelheid teststof als de manier waarop de 
gegevens worden geëvalueerd, te veranderen, kan de test ook worden gebruikt voor chemische stoffen waarvoor niet bekend is hoeveel er naar verwachting in de bodem terecht zal komen. Daarom worden 
voor andere stoffen dan landbouwchemicaliën de effecten van een 
reeks concentraties op de omzetting van stikstof bepaald. De gege ­
vens uit deze tests worden gebruikt om een dosis/respons-curve sa ­
men te stellen en EC
 x -waarden te berekenen, waarbij x het procen ­
tuele effect aangeeft.  
1.2. DEFINITIES  
Omzetting van stikstof:  de uiteindelijke afbraak van stikstofhou ­
dend organisch materiaal door micro-organismen via ammonificatie en nitrificatie tot het anorganische eindproduct nitraat.
 
EC x (effectieve concentratie):  de concentratie van de teststof in de 
bodem die leidt tot een remming van de omzetting van stikstof in nitraat met x procent.
 
EC 50 (mediaan van de effectieve concentratie):  de concentratie van 
de teststof in de bodem die leidt tot een remming van de omzetting van stikstof in nitraat met 50 procent (50 %).
 
1.3. REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  
1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Gezeefde bodem wordt verbeterd met verpoederd plantenmeel en 
hetzij behandeld met de teststof, hetzij niet behandeld (controle). 
Als er landbouwchemicaliën worden getest, wordt aanbevolen mini ­
maal twee concentraties te testen die moeten worden gekozen op grond van de hoogste concentratie die op het veld wordt verwacht. 
Na 0, 7, 14 en 28 dagen incubatie worden monsters van de behan ­
delde en de controlebodem geëxtraheerd met een geschikt oplosmid ­
del en wordt de hoeveelheid nitraat in de extracten bepaald. De nitraatvorming in de behandelde monsters wordt vergeleken met de 
controlemonsters en de procentuele afwijking van de behandelde ten 
opzichte van de controlemonsters wordt berekend. Alle tests duren ten minste 28 dagen. Als op dag 28 het verschil tussen de behan ­
delde en de controlebodem 25 % of groter is, worden de metingen 
voortgezet tot maximaal 100 dagen. Als er andere stoffen dan land ­
bouwchemicaliën worden getest, wordt de teststof in een reeks con ­
centraties aan de bodemmonsters toegevoegd en wordt na 28 dagen incubatie de hoeveelheid nitraat in de behandelde en de controlemon ­
sters bepaald. De resultaten van tests met verschillende concentraties 
worden aan regressieanalyse onderworpen en de EC
 x -waarden 
(d.w.z. de EC  50 , de EC  25 en/of de EC  10 ) worden berekend. Zie 
ook de definities.  
1.5. GELDIGHEID VAN DE TEST  
Bij landbouwchemicaliën wordt de evaluatie van de testresultaten 
gebaseerd op betrekkelijk kleine verschillen (gemiddeld ± 25 %) tussen de nitraatconcentratie in de behandelde en de controlemon ­
sters en grote verschillen in de controles kunnen dan ook tot onjuiste 
resultaten leiden. Het verschil tussen replicaat-controlemonsters moet 
derhalve kleiner zijn dan ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1.  Apparatuur  
Er worden testbakken van chemisch inert materiaal gebruikt. Het 
volume moet geschikt zijn voor de procedure die voor de incubatie 
van de bodem wordt gebruikt, d.w.z. incubatie in één keer of als een 
reeks afzonderlijke bodemmonsters (zie punt 1.7.1.2). Het waterver ­
lies moet tot een minimum worden beperkt maar gasuitwisseling moet tijdens de test mogelijk zijn (de testbakken kunnen bijvoor ­
beeld met geperforeerde polyetheenfolie worden afgedekt). Wanneer 
vluchtige stoffen worden getest, moeten er afsluitbare gasdichte bak ­
ken worden gebruikt. Deze moeten zo groot zijn dat het bodemmon ­
ster ongeveer een kwart van hun volume beslaat.
 
Er wordt standaardlaboratoriumapparatuur gebruikt, waaronder:  
— een schudapparaat: een mechanische schudmachine of gelijk ­
waardige apparatuur;  
— een centrifuge (3 000 g) of filtreerapparaat (met nitraatvrij fil ­
treerpapier);  
— een instrument voor nitraatanalyse met een afdoende gevoelig ­
heid en reproduceerbaarheid.  
1.6.2.  Selectie en aantal bodemsoorten  
Er wordt één bodemsoort gebruikt. De aanbevolen kenmerken van de 
bodem zijn:  
— zandgehalte: minimaal 50 % en maximaal 75 %;  
— pH: 5,5-7,5;  
— organisch koolstofgehalte: 0,5-1,5 %;  
— de microbiële biomassa moet worden gemeten (8)(9) en het kool ­
stofgehalte daarvan moet minimaal 1 % van het totale organische koolstofgehalte van de bodem zijn.
 
In de meeste gevallen levert een bodem met deze kenmerken de 
ongunstigste situatie op, aangezien de adsorptie van de teststof mini ­
maal is en de beschikbaarheid voor de flora maximaal. Een test met 
andere bodemsoorten is dan ook meestal niet nodig. In bepaalde gevallen, bijvoorbeeld wanneer de teststof naar verwachting vooral bij bepaalde bodemsoorten zoals zure bosgrond zal worden gebruikt 
of bij elektrostatisch geladen chemische stoffen, kan het echter nodig 
zijn nog een andere bodemsoort te gebruiken.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Verzameling en opslag van de bodemmonsters  
1.6.3.1.  Verzameling  
Er moet gedetailleerde informatie beschikbaar zijn over de geschie ­
denis van de locatie waar de testbodem wordt verzameld, zoals de 
exacte ligging, de vegetatie, de data van behandelingen met gewas ­
beschermingsmiddelen, behandelingen met organische en anorga ­
nische mest, toevoegingen van biologisch materiaal en onopzettelijke verontreinigingen. De voor de verzameling van de bodem gekozen 
locatie moet op lange termijn kunnen worden gebruikt. Permanente 
weidegrond en velden met eenjarige graangewassen (behalve maïs) of dicht ingezaaide groenbemestingsgewassen zijn geschikt. De ge ­
kozen monsternemingsplaats mag gedurende ten minste één jaar vóór 
de monsterneming niet met gewasbeschermingsmiddelen zijn behan ­
deld. Ook mag er gedurende ten minste zes maanden geen organi ­
sche mest zijn opgebracht. Het gebruik van anorganische mest is 
alleen aanvaardbaar wanneer dit in overeenstemming met de eisen 
van het gewas is en er mogen gedurende ten minste drie maanden na de opbrenging van de mest geen monsters worden genomen. Het gebruik van grond die is behandeld met meststoffen waarvan bekend 
is dat ze biocide-effecten hebben (b.v. calciumcyaanamide) moet 
worden vermeden.
 
Gedurende of vlak na lange perioden (meer dan 30 dagen) van 
droogte of doordrenking van de bodem mogen er geen monsters worden genomen. Bij een omgeploegde bodem moeten de monsters 
van een diepte van 0 tot 20 cm worden genomen. Bij grasland 
(weidegrond) of andere bodemsoorten waar gedurende lange perio ­
den (ten minste één teeltseizoen) niet geploegd wordt, kan de maxi ­
male monsterdiepte iets groter dan 20 cm (b.v. maximaal 25 cm) 
zijn.
 
De bakken waarin en de temperatuur waarbij de bodemmonsters 
worden vervoerd, moeten zodanig zijn dat de oorspronkelijke eigen ­
schappen van de bodem niet significant veranderen.  
1.6.3.2.  Opslag  
Het gebruik van grond die net van het veld komt, verdient de voor ­
keur. Als opslag in het laboratorium niet kan worden vermeden, kan 
de grond gedurende maximaal drie maanden in het donker bij 4±2
 o C worden bewaard. Tijdens de opslag van grond moet er 
voor aërobe omstandigheden worden gezorgd. Als de grond wordt 
verzameld in gebieden waar deze gedurende ten minste drie maanden 
per jaar bevriest, is opslag gedurende zes maanden bij - 18  o C tot 
- 22  o C mogelijk. Vóór elk experiment wordt de microbiële biomassa 
van opgeslagen grond gemeten; het koolstofgehalte van de biomassa 
moet minimaal 1 % van het totale organische koolstofgehalte van de 
bodem zijn (zie punt 1.6.2).  
1.6.4.  Behandeling en voorbereiding van de grond voor de test  
1.6.4.1.  Pre-incubatie  
Als de grond opgeslagen was (zie punt 1.6.3.2), wordt pre-incubatie 
gedurende 2 tot 28 dagen aanbevolen. De temperatuur en het vocht ­
gehalte van de bodem tijdens de pre-incubatie moeten vergelijkbaar 
zijn met die tijdens de test (zie de punten 1.6.4.2 en 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Fysisch-chemische kenmerken  
De grond wordt met de hand ontdaan van grote voorwerpen (stenen, 
delen van planten enz.) en zonder overmatig drogen vochtig gezeefd tot een deeltjesgrootte van maximaal 2 mm. Het vochtgehalte van het 
bodemmonster moet met gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden 
aangepast tot 40-60 % van het maximale watergehalte.
 
1.6.4.3.  Verbetering met organisch substraat  
De bodem wordt verbeterd met een geschikt organisch substraat, 
zoals verpoederd luzerne/grasmeel (hoofdbestanddeel  Medicago sati ­
va) met een C/N-verhouding tussen 12/1 en 16/1. De aanbevolen 
luzerne/bodem-verhouding is 5 gram luzerne per kg bodem (droog ­
gewicht).  
1.6.5.  Voorbehandeling van de teststof voordat deze op de bodem 
wordt gebracht  
De teststof wordt normaal gesproken met behulp van een draagstof 
opgebracht. Dit kan water zijn (voor in water oplosbare stoffen) of 
een inerte vaste stof zoals fijn kwartszand (deeltjesgrootte 0,1- 0,5 mm). Andere vloeibare draagstoffen dan water (b.v. organische oplosmiddelen zoals aceton of chloroform) moeten worden vermeden 
omdat deze de microflora kunnen aantasten. Als zand als draagstof 
wordt gebruikt, kan deze worden gecoat met de in een geschikt oplosmiddel opgeloste of gesuspendeerde teststof. In dat geval moet het oplosmiddel vóór het mengen met de bodem door verdam ­
ping worden verwijderd. Voor een optimale verdeling van de teststof 
in de bodem wordt een verhouding van 10 g zand per kg grond (drooggewicht) aanbevolen. De controlemonsters worden behandeld met uitsluitend een even grote hoeveelheid water en/of kwartszand.
 
Bij het testen van vluchtige stoffen moeten verliezen tijdens de be ­
handeling zoveel mogelijk worden voorkomen en moet er naar een 
homogene verdeling in de bodem worden gestreefd (de teststof kan 
bijvoorbeeld op verschillende plaatsen in de bodem worden geïnjec ­
teerd).  
1.6.6.  Testconcentraties  
Als er landbouwchemicaliën worden getest, moeten er ten minste 
twee concentraties worden gebruikt. De laagste concentratie moet ten minste overeenkomen met de maximale hoeveelheid die naar verwachting in de praktijk in de bodem terecht zal komen, terwijl 
de hoogste concentratie een veelvoud van de laagste concentratie 
moet zijn. Bij de berekening van de concentratie van de aan de bodem toegevoegde teststof wordt uitgegaan van een uniforme ver ­
menging in de bodem tot een diepte van 5 cm en een dichtheid van 
de droge grond van 1,5. Voor landbouwchemicaliën die rechtstreeks 
op de bodem worden gebracht en voor chemische stoffen waarvoor de hoeveelheid die op de bodem terechtkomt voorspelbaar is, worden als testconcentratie de maximale PEC (predicted environmental con ­
centration) en het vijfvoud van deze concentratie aanbevolen. Stoffen 
die naar verwachting meer dan één keer per seizoen op de bodem worden gebracht, moeten worden getest bij concentraties die worden berekend door de PEC te vermenigvuldigen met het aantal keren dat 
dit naar verwachting maximaal gebeurt. De hoogste geteste concen ­
tratie mag echter niet hoger zijn dan tien keer de maximale per keer opgebrachte hoeveelheid. Als andere stoffen dan landbouwchemica ­
liën worden getest, wordt een meetkundige reeks van ten minste vijf 
concentraties gebruikt. De geteste concentraties moeten het interval 
bestrijken dat voor de bepaling van de EC
 x -waarden nodig is.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. UITVOERING VAN DE TEST  
1.7.1.  Blootstellingsomstandigheden  
1.7.1.1.  Behandeling en controle  
Als er landbouwchemicaliën worden getest, wordt de grond in drie 
even zware porties verdeeld. Twee porties worden gemengd met de 
draagstof die de teststof bevat en de andere portie met de draagstof zonder teststof (controle). Voor zowel de behandelde als de contro ­
legrond wordt minimaal een bepaling in triplo aanbevolen. Als er 
andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, wordt de 
grond in zes even zware porties verdeeld. Vijf porties worden ge ­
mengd met de draagstof die de teststof bevat en de andere portie met 
de draagstof zonder teststof. Voor zowel de behandelde als de con ­
trolegrond wordt een bepaling in triplo aanbevolen. Er moet worden gezorgd voor een homogene verdeling van de teststof in de behan ­
delde bodemmonsters. Bij het mengen moeten comprimering en 
kluitvorming van de grond worden voorkomen.
 
1.7.1.2.  Incubatie van de bodemmonsters  
Incubatie van de bodemmonsters kan op twee manieren gebeuren: als 
één monster voor elke behandelde en onbehandelde bodem of als een 
reeks aparte even grote submonsters voor elke behandelde en onbe ­
handelde bodem. Wanneer vluchtige stoffen worden getest, mag de 
test echter uitsluitend met een reeks aparte submonsters worden uit ­
gevoerd. Wanneer de grond als één monster wordt geïncubeerd, worden grote hoeveelheden van elke behandelde en onbehandelde bodem geïncubeerd en worden tijdens de test waar nodig submon ­
sters voor analyse genomen. De hoeveelheid die aanvankelijk voor 
elke behandelde en onbehandelde bodem wordt geïncubeerd, is af ­
hankelijk van de grootte van de submonsters, het aantal replicaatbe ­
palingen dat voor de analyse wordt gebruikt en het verwachte maxi ­
male aantal monsternemingstijdstippen. Grond die als één monster 
wordt geïncubeerd, moet vóór het nemen van submonsters grondig worden gemengd. Wanneer de bodem als een reeks aparte bodem ­
monsters wordt geïncubeerd, wordt elke portie behandelde en onbe ­
handelde grond in het vereiste aantal submonsters verdeeld, die wor ­
den gebruikt wanneer ze nodig zijn. Wanneer bij een experiment meer dan twee monstememingstijdstippen kunnen worden verwacht, moeten er voldoende submonsters voor alle replicaatbepalingen en 
alle monsternemingstijdstippen worden gemaakt. Ten minste drie 
replicaatmonsters van de testbodem worden onder aërobe omstandig ­
heden geïncubeerd (zie punt 1.7.1.1). Tijdens alle tests moeten er geschikte bakken worden gebruikt met voldoende ruimte boven de 
grond om te voorkomen dat er anaërobe omstandigheden ontstaan. 
Wanneer er vluchtige stoffen worden getest, mag de test uitsluitend met een reeks aparte submonsters worden uitgevoerd.
 
1.7.1.3.  Testomstandigheden en duur van de test  
De test wordt in het donker bij kamertemperatuur (20±2  o C) uitge­
voerd. Het vochtgehalte van de bodemmonsters moet gedurende de 
test op 40-60 % van het maximale watergehalte van de bodem 
worden gehouden (zie punt 1.6.4.2) met een bereik van ±5 %. Indien nodig kan gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden toegevoegd.
 
De minimale duur van een test is 28 dagen. Als er landbouwchemi ­
caliën worden getest, wordt de nitraatvorming in behandelde en con ­
trolemonsters vergeleken. Als op dag 28 het verschil groter dan 
25 % is, wordt de test voortgezet tot het verschil 25 % of minder is maar maximaal gedurende 100 dagen. Voor andere stoffen dan landbouwchemicaliën wordt de test na 28 dagen beëindigd. Op dag 
28 wordt de hoeveelheid nitraat in de behandelde en de controlemon ­
sters bepaald en worden de EC
 x -waarden berekend.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Monsterneming en analyse van de grond  
1.7.2.1.  Schema voor de monsterneming  
Als er landbouwchemicaliën worden getest, worden de bodemmon ­
sters op de dagen 0, 7, 14 en 28 op nitraat geanalyseerd. Als er een 
langere test nodig is, wordt na dag 28 om de 14 dagen een analyse 
uitgevoerd.  
Als er andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, wor ­
den er ten minste vijf testconcentraties gebruikt en worden de bo ­
demmonsters aan het begin (dag 0) en aan het eind van de bloot ­
stellingsperiode (dag 28) op nitraat geanalyseerd. Als dit nodig wordt geacht, kan er bijvoorbeeld op dag 7 een tussentijdse meting worden gedaan. De op dag 28 verkregen gegevens worden gebruikt om de 
EC
 x -waarde voor de chemische stof te bepalen. Als dat gewenst is, 
kunnen de gegevens van de controlemonsters op dag 0 worden ge ­
bruikt om de oorspronkelijke hoeveelheid nitraat in de bodem te bepalen.
 
1.7.2.2.  Analyse van de bodemmonsters  
Op elk monsternemingstijdstip wordt in elk replicaatmonster (behan ­
deld en controle) de gevormde hoeveelheid nitraat bepaald. Het ni ­
traat wordt uit de bodem geëxtraheerd door de monsters met een geschikte extractievloeistof, bijvoorbeeld een 0,1 M kaliumchloride ­
oplossing, te schudden. Een hoeveelheid van 5 ml KCl-oplossing per 
gram grond (drooggewicht) wordt aanbevolen. Om de extractie te optimaliseren, mogen de bakken met grond en extractievloeistof ten hoogste halfvol zijn. De mengsels worden gedurende 60 minuten bij 
150 rpm geschud. De mengsels worden gecentrifugeerd of gefiltreerd 
en de vloeistoffase wordt op nitraat geanalyseerd. Deeltjesvrije vloei ­
bare extracten kunnen vóór analyse maximaal zes maanden bij - 20±5
 o C worden bewaard.  
2. GEGEVENS  
2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Als de test met landbouwchemicaliën wordt uitgevoerd, wordt de 
gevormde hoeveelheid nitraat in elk replicaat-bodemmonster geregis ­
treerd en worden de gemiddelde waarden van alle replicaatbepalin ­
gen in tabelvorm vermeld. De omzetting van stikstof wordt met 
adequate en algemeen erkende statistische methoden (b.v. een F-test, 
niveau met 5 % significantie) bepaald. De gevormde hoeveelheid nitraat wordt uitgedrukt in mg nitraat/kg drooggewicht bodem/dag. De nitraatvorming bij elke behandelde bodem wordt vergeleken met 
de controle en de procentuele afwijking van de controle wordt be ­
rekend.
 
Als de test met andere stoffen dan landbouwchemicaliën wordt uit ­
gevoerd, wordt de gevormde hoeveelheid nitraat in elk replicaat- 
bodemmonster bepaald en wordt er een dosis/respons-curve samen ­
gesteld om de EC  X -waarden te bepalen. De hoeveelheid nitraat (in 
mg nitraat/kg drooggewicht bodem) die na 28 dagen in de behan ­
delde monsters wordt gevonden, wordt vergeleken met de controle. 
Uit deze gegevens wordt de procentuele remming voor elke testcon ­
centratie berekend. Deze percentages worden uitgezet tegen de con ­
centratie en met behulp van statistische procedures worden de EC  x - 
waarden berekend. Met behulp van standaardprocedures worden ook 
de betrouwbaarheidsgrenzen (p = 0,95) voor de berekende EC  X be­
paald (10)(ll)(12).  
Teststoffen die grote hoeveelheden stikstof bevatten, kunnen bijdra ­
gen tot de tijdens de test gevormde hoeveelheid nitraat. Als deze 
stoffen bij een hoge concentratie worden getest (b.v. stoffen waarvan 
wordt aangenomen dat ze herhaaldelijk worden opgebracht), moeten er afdoende controles in de test worden opgenomen (d.w.z. bodem met teststof maar zonder plantenmeel). Bij de berekening van de 
EC
 X moet dan rekening worden gehouden met de gegevens van 
deze controles.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Wanneer de resultaten van tests met landbouwchemicaliën worden 
geëvalueerd en het verschil in de nitraatvorming tussen de laagste concentratie (d.w.z. de maximale verwachte concentratie) en de con ­
trole op enig monsternemingstijdstip na dag 28 niet groter dan 25 % 
is, kan worden geconcludeerd dat het product op lange termijn geen invloed op de omzetting van stikstof in de bodem heeft. Wanneer de resultaten van tests met andere stoffen dan landbouwchemicaliën 
worden geëvalueerd, worden de EC
 50 , de EC  25 en/of de EC  10 ge­
bruikt.  
3. RAPPORTAGE  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Een volledige specificatie van de gebruikte bodem met vermelding 
van o.a.:  
— de geografische kenmerken van de locatie (lengte en breedte);  
— informatie over het verleden van de locatie (d.w.z. vegetatie, 
behandelingen met gewasbeschermingsmiddelen, behandelingen met meststoffen, onopzettelijke verontreinigingen enz.);
 
— het gebruikspatroon (d.w.z. landbouwgrond, bos enz.);  
— de monsternemingsdiepte (in cm);  
— het gehalte aan zand/slib/klei (in % drooggewicht);  
— de pH (in water);  
— het gehalte aan organische koolstof (in % drooggewicht);  
— het stikstofgehalte (in % drooggewicht);  
— de aanvankelijke nitraatconcentratie (in mg nitraat/kg droogge ­
wicht);  
— de kation-uitwisselingscapaciteit (in mmol/kg);  
— de microbiële biomassa in percentage totale organische koolstof;  
— de referentie van de voor de bepaling van elke parameter ge ­
bruikte methode;  
— alle informatie over de verzameling en opslag van de bodem ­
monsters;  
— een gedetailleerde beschrijving van de eventuele pre-incubatie 
van de grond.  
De teststof:  
— de fysische aard en indien relevant de fysisch-chemische eigen ­
schappen;  
— de chemische identificatiegegevens, indien relevant, met inbegrip 
van de structuurformule, de zuiverheid (d.w.z. het percentage 
werkzaam bestanddeel voor gewasbeschermingsmiddelen) en 
het stikstofgehalte.  
Het substraat:  
— de herkomst van het substraat;  
— de samenstelling (d.w.z. luzernemeel, luzerne/grasmeel);  
— koolstof- en stikstofgehalte (in % drooggewicht);  
— maaswijdte van de zeef (in mm).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
De testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de verbetering van de bodem met 
organisch substraat;  
— het aantal concentraties van de teststof en, indien van toepassing, 
een motivering voor de keuze van de concentraties;  
— gedetailleerde gegevens over de manier waarop de teststof op de 
bodem wordt gebracht;  
— de incubatietemperatuur;  
— het vochtgehalte van de bodem aan het begin van en tijdens de 
test; 
— de gebruikte incubatiemethode (d.w.z. in één portie of als een 
reeks aparte submonsters);  
— het aantal replicaatbepalingen;  
— de monsternemingstijdstippen;  
— de voor de extractie van nitraat uit de bodem gebruikte methode.  
De resultaten:  
— de voor de nitraatanalyse gebruikte analyseprocedure en -appara ­
tuur;  
— de resultaten van de nitraatanalyse, met vermelding van de af ­
zonderlijke en gemiddelde waarden, in tabelvorm;  
— de verschillen tussen de replicaatbepalingen bij de behandelde en 
de controlemonsters;  
— een verklaring voor correcties in de berekeningen, indien van 
toepassing;  
— het procentuele verschil in de nitraatvorming op elk monsterne ­
mingstijdstip of, indien van toepassing, de EC  50 -waarde met het 
95 %-betrouwbaarheidsinterval, andere EC  x -waarden (d.w.z. 
EC 25 of EC  10 ) met betrouwbaarheidsintervallen en een grafische 
voorstelling van de dosis/respons- curve;  
— de statistische behandeling van de resultaten;  
— alle informatie en opmerkingen die nuttig kunnen zijn voor de 
interpretatie van de resultaten.  
4. REFERENTIES  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. September 28, 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Ni ­
trogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
1SO/TC 190/SC 4: Soil Quality — Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 
1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration me ­
thod.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MICRO-ORGANISMEN IN DE BODEM: BEPALING VAN DE 
OMZETTING VAN KOOLSTOF  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 217 (2000) van de OESO.  
1.1 INLEIDING  
In deze testmethode wordt een laboratoriumtest beschreven om te 
onderzoeken welke effecten gewasbeschermingsmiddelen en wellicht 
andere chemische stoffen na één blootstelling op lange termijn kun ­
nen hebben op de omzetting van koolstof door micro-organismen in de bodem. De test is in eerste instantie gebaseerd op aanbevelingen van de Organisatie voor de bescherming van planten in Europa en 
het Middellandse-Zeegebied (1). Er is echter ook rekening gehouden 
met andere richtsnoeren, bijvoorbeeld van de Biologische Bunde ­
sanstalt in Duitsland (2), het Environmental Protection Agency in de VS (3) en de SET AC (4). Tijdens een workshop van de 
OESO over de selectie van bodem/sediment in Belgirate in Italië 
in 1995 (5) is overeenstemming bereikt over het aantal en de aard van de in deze test te gebruiken bodemmonsters. De aanbevelingen voor het verzamelen, behandelen en bewaren van de bodemmonsters 
zijn gebaseerd op ISO-richtsnoeren (6) en aanbevelingen van de 
workshop in Belgirate.
 
Bij de beoordeling en evaluatie van toxische kenmerken van test ­
stoffen kan het nodig zijn de effecten op de microbiële activiteit van de bodem te bepalen, bijvoorbeeld wanneer er gegevens over de 
potentiële neveneffecten van gewasbeschermingsmiddelen op de mi ­
croflora van de bodem nodig zijn of wanneer wordt verwacht dat de micro-organismen in de bodem aan andere chemische stoffen dan gewasbeschermingsmiddelen worden blootgesteld. De bepaling van 
de omzetting van koolstof wordt uitgevoerd om de effecten van deze 
chemische stoffen op de microflora van de bodem te bepalen. Als er landbouwchemicaliën (b.v. gewasbeschermingsmiddelen, kunstmest of bosbouwchemicaliën) worden getest, worden zowel de bepaling 
van de omzetting van koolstof als de bepaling van de omzetting van 
stikstof uitgevoerd. Als er andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, volstaat de bepaling van de omzetting van stikstof. Als de EC
 50 bij de bepaling van de omzetting van stikstof voor 
dergelijke stoffen echter binnen het bereik valt van de waarde die 
voor in de handel verkrijgbare nitrificatieremmers (zoals nitrapyrin) wordt gevonden, kan een bepaling van de omzetting van koolstof worden uitgevoerd om nadere informatie te verkrijgen.
 
De bodem bestaat uit levende en niet-levende componenten die com ­
plexe en heterogene mengsels kunnen vormen. Micro-organismen 
spelen een belangrijke rol bij de afbraak en omzetting van organisch 
materiaal in vruchtbare bodem en veel soorten dragen bij tot ver ­
schillende aspecten van de vruchtbaarheid van de bodem. Een ver ­
storing van deze biochemische processen op lange termijn kan mo ­
gelijkerwijs de cycli van nutriënten verstoren en verandering brengen 
in de vruchtbaarheid van de bodem. Omzetting van koolstof en stikstof vindt in elke vruchtbare bodem plaats. Hoewel de voor deze processen verantwoordelijke microbiële levensgemeenschappen 
van bodem tot bodem verschillen, zijn de omzettingsroutes in grote 
lijnen gelijk.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Deze testmethode is bedoeld om te detecteren welke schadelijke 
effecten een stof op lange termijn op het omzettingsproces van kool ­
stof in aërobe bodem aan het oppervlak kan hebben. De test is gevoelig voor veranderingen in de grootte en activiteit van de mi ­
crobiële levensgemeenschappen die verantwoordelijk zijn voor de 
omzetting van koolstof, aangezien deze gemeenschappen daarbij zo ­
wel chemische stress als een koolstoftekort ondervinden. Er wordt een zandige bodem met weinig organisch materiaal gebruikt. Deze bodem wordt met de teststof behandeld en geïncubeerd onder om ­
standigheden die een snel microbieel metabolisme mogelijk maken. 
Onder deze omstandigheden raken de bronnen van gemakkelijk be ­
schikbare koolstof in de bodem snel uitgeput. Dit leidt tot een kool ­
stoftekort waardoor microbiële cellen enerzijds afsterven en ander ­
zijds aangezet worden tot latentie en/of sporenvorming. Als de test 
meer dan 28 dagen duurt, kan de som van deze reacties in controles (onbehandelde bodem) worden gemeten als een geleidelijk verlies van metabool actieve microbiële biomassa (7). Als de biomassa in 
bodem met koolstof-stress onder de testomstandigheden door de aan ­
wezigheid van een chemische stof wordt aangetast, komt deze wel ­
licht niet op hetzelfde niveau terug als in de controles. Dit betekent dat een verstoring door de teststof, ongeacht op welk moment tijdens 
de test dit gebeurt, vaak tot het einde van de test aanhoudt.
 
Deze testmethode is ontwikkeld uit tests die in eerste instantie be ­
doeld waren voor stoffen waarvoor kan worden geraamd welke hoe ­
veelheid de bodem bereikt. Dit geldt bijvoorbeeld voor gewasbe ­
schermingsmiddelen die in bekende hoeveelheden op het veld wor ­
den gebracht. Voor landbouwchemicaliën is het voldoende twee do ­
ses te testen die relevant zijn voor de opgebrachte hoeveelheid die 
wordt verwacht of geraamd. Landbouwchemicaliën kunnen als werk ­
zame stof of als geformuleerd product worden getest. Het gebruik van de test blijft echter niet beperkt tot stoffen met een voorspelbare 
milieuconcentratie. Door zowel de op de bodem gebrachte hoeveel ­
heid teststof als de manier waarop de gegevens worden geëvalueerd, te veranderen, kan de test ook worden gebruikt voor chemische stoffen waarvoor niet bekend is hoeveel er naar verwachting in de 
bodem terecht zal komen. Daarom worden voor andere stoffen dan 
landbouwchemicaliën de effecten van een reeks concentraties op de omzetting van koolstof bepaald. De gegevens uit deze tests worden gebruikt om een dosis/respons-curve samen te stellen en EC
 x -waar­
den te berekenen, waarbij x het procentuele effect aangeeft.  
1.2 DEFINITIES  
Omzetting van koolstof:  de afbraak van organisch materiaal door 
micro-organismen tot het anorganische eindproduct kooldioxide.  
EC x (effectieve concentratie):  de concentratie van de teststof in de 
bodem die leidt tot een remming van de omzetting van koolstof in 
kooldioxide met x procent.  
EC 50 (mediaan van de effectieve concentratie):  de concentratie van 
de teststof in de bodem die leidt tot een remming van de omzetting van koolstof in kooldioxide met 50 procent.
 
1.3 REFERENTIESTOFFEN  
Geen.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4 PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Gezeefde bodem wordt hetzij behandeld met de teststof, hetzij niet 
behandeld (controle). Als er landbouwchemicaliën worden getest, wordt aanbevolen minimaal twee concentraties te testen die moeten 
worden gekozen op grond van de hoogste concentratie die op het 
veld wordt verwacht. Na 0, 7, 14 en 28 dagen incubatie worden monsters van de behandelde en de controlebodem met glucose ge ­
mengd en wordt de door glucose geïnduceerde ademhaling gedu ­
rende twaalf uur gemeten. De ademhaling wordt uitgedrukt in vrij ­
gekomen kooldioxide (in mg kooldioxide/kg droge bodem/uur) of verbruikte zuurstof (in mg zuurstof/kg bodem/uur). De gemiddelde 
ademhaling in de behandelde bodemmonsters wordt vergeleken met 
de controlemonsters en de procentuele afwijking van de behandelde ten opzichte van de controlemonsters wordt berekend. Alle tests duren ten minste 28 dagen. Als op dag 28 het verschil tussen de 
behandelde en de controlebodem 25 % of groter is, worden de 
metingen om de veertien dagen voortgezet tot maximaal 100 dagen. Als er andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, wordt de teststof in een reeks concentraties aan de bodemmonsters toege ­
voegd en wordt na 28 dagen de door glucose geïnduceerde adem ­
haling (d.w.z. de gemiddelde hoeveelheid gevormd kooldioxide of verbruikte zuurstof). De resultaten van tests met een reeks concen ­
traties worden aan regressieanalyse onderworpen en de EC
 x -waarden 
(d.w.z. de EC  50 , de EC  25 en/of de EC  10 ) worden berekend. Zie ook 
de definities.  
1.5 GELDIGHEID VAN DE TEST  
Bij landbouwchemicaliën wordt de evaluatie van de testresultaten 
gebaseerd op betrekkelijk kleine verschillen (gemiddeld ± 25 %) 
tussen het vrijgekomen kooldioxide of de verbruikte zuurstof in (of door) de behandelde en de controlemonsters en grote verschillen in de controles kunnen dan ook tot onjuiste resultaten leiden. Het ver ­
schil tussen replicaat-controlemonsters moet derhalve kleiner zijn dan 
± 15 %.
 
1.6 BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.6.1  Apparatuur  
Er worden testbakken van chemisch inert materiaal gebruikt. Het 
volume moet geschikt zijn voor de procedure die voor de incubatie van de bodem wordt gebruikt, d.w.z. incubatie in één keer of als een reeks afzonderlijke bodemmonsters (zie punt 1.7.1.2). Het waterver ­
lies moet tot een minimum worden beperkt maar gasuitwisseling 
moet tijdens de test mogelijk zijn (de testbakken kunnen bijvoor ­
beeld met geperforeerde polyetheenfolie worden afgedekt). Wanneer vluchtige stoffen worden getest, moeten er afsluitbare gasdichte bak ­
ken worden gebruikt. Deze moeten zo groot zijn dat het bodemmon ­
ster ongeveer een kwart van hun volume beslaat.
 
Voor de bepaling van de door glucose geïnduceerde ademhaling zijn 
incubatiesystemen en instrumenten voor de meting van het gevormde kooldioxide of de verbruikte zuurstof nodig. Voor voorbeelden van dergelijke systemen en instrumenten wordt naar de literatuur ver ­
wezen (8) (9) (10) (11).
 
1.6.2  Selectie en aantal bodemsoorten  
Er wordt één bodemsoort gebruikt. De aanbevolen kenmerken van de 
bodem zijn:  
— zandgehalte: minimaal 50 % en maximaal 75 %;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5-7,5;  
— organisch koolstofgehalte: 0,5-1,5 %;  
— de microbiële biomassa moet worden gemeten (12)(13) en het 
koolstofgehalte daarvan moet minimaal 1 % van het totale orga ­
nische koolstofgehalte van de bodem zijn.  
In de meeste gevallen levert een bodem met deze kenmerken de 
ongunstigste situatie op, aangezien de adsorptie van de teststof tot 
een minimum wordt beperkt en de beschikbaarheid van de stof voor 
de flora maximaal is. Een test met andere bodemsoorten is dan ook meestal niet nodig. In bepaalde gevallen, bijvoorbeeld wanneer de teststof naar verwachting vooral bij bepaalde bodemsoorten zoals 
zure bosgrond zal worden gebruikt of bij elektrostatisch geladen 
chemische stoffen, kan het echter nodig zijn een andere bodemsoort te gebruiken.
 
1.6.3  Verzameling en opslag van de bodemmonsters  
1.6.3.1  Verzameling  
Er moet gedetailleerde informatie beschikbaar zijn over de geschie ­
denis van de locatie waar de testbodem wordt verzameld, zoals de 
exacte ligging, de vegetatie, de data van behandelingen met gewas ­
beschermingsmiddelen, behandelingen met organische en anorga ­
nische mest, toevoegingen van biologisch materiaal en onopzettelijke 
verontreinigingen. De voor de verzameling van de bodem gekozen 
locatie moet op lange termijn kunnen worden gebruikt. Permanente weidegrond en velden met eenjarige graangewassen (behalve maïs) of dicht ingezaaide groenbemestingsgewassen zijn geschikt. De ge ­
kozen monstememingsplaats mag gedurende ten minste één jaar vóór 
de monsterneming niet met gewasbeschermingsmiddelen zijn behan ­
deld. Ook mag er gedurende ten minste zes maanden geen organi ­
sche mest zijn opgebracht. Het gebruik van anorganische mest is 
alleen aanvaardbaar wanneer dit in overeenstemming met de eisen 
van het gewas is en er mogen gedurende ten minste drie maanden na de opbrenging van de mest geen monsters worden genomen. Het 
gebruik van grond die is behandeld met meststoffen waarvan bekend 
is dat ze biocide-effecten hebben (b.v. calciumcyaanamide) moet worden vermeden.
 
Gedurende of vlak na lange perioden (meer dan 30 dagen) van 
droogte of doordrenking van de bodem mogen er geen monsters 
worden genomen. Bij een omgeploegde bodem moeten de monsters 
van een diepte van 0 tot 20 cm worden genomen. Bij grasland (weidegrond) of andere bodemsoorten waar gedurende lange perio ­
den (ten minste één teeltseizoen) niet geploegd wordt, kan de maxi ­
male monsterdiepte iets groter dan 20 cm (b.v. maximaal 25 cm) 
zijn. De bakken waarin en de temperatuur waarbij de bodemmonsters worden vervoerd, moeten zodanig zijn dat de oorspronkelijke eigen ­
schappen van de bodem niet significant veranderen.
 
1.63.2  Opslag  
Het gebruik van grond die net van het veld komt, verdient de voor ­
keur. Als opslag in het laboratorium niet kan worden vermeden, kan 
de grond gedurende maximaal drie maanden in het donker bij 4 ± 2
 o C worden bewaard. Tijdens de opslag van grond moet er voor 
aërobe omstandigheden worden gezorgd. Als de grond wordt ver ­
zameld in gebieden waar deze gedurende ten minste drie maanden 
per jaar bevriest, is opslag gedurende zes maanden bij - 18  o C mo­
gelijk. Vóór elk experiment wordt de microbiële biomassa van opge ­
slagen grond gemeten; het koolstofgehalte van de biomassa moet 
minimaal 1 % van het totale organische koolstofgehalte van de bo ­
dem zijn (zie punt 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4  Behandeling en voorbereiding van de grond voor de test  
1.6.4.1  Pre-incubatie  
Als de grond opgeslagen was (zie de punten 1.6.4.2 en 1.7.1.3), 
wordt pre-incubatie gedurende 2 tot 28 dagen aanbevolen. De tem ­
peratuur en het vochtgehalte van de bodem tijdens de pre-incubatie 
moeten vergelijkbaar zijn met die tijdens de test (zie de punten 1.6.4.2 en 1.7.1.3).
 
1.6.4.2  Fysisch-chemische kenmerken  
De grond wordt met de hand ontdaan van grote voorwerpen (stenen, 
delen van planten enz.) en zonder overmatig drogen vochtig gezeefd 
tot een deeltjesgrootte van maximaal 2 mm. Het vochtgehalte van het 
bodemmonster moet met gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden aangepast tot 40-60 % van het maximale watergehalte.
 
1.6.5  Voorbehandeling van de teststof voordat deze op de bodem 
wordt gebracht  
De teststof wordt normaal gesproken met behulp van een draagstof 
opgebracht. Dit kan water zijn (voor in water oplosbare stoffen) of 
een inerte vaste stof zoals fijn kwartszand (deeltjesgrootte 0,1- 0,5 mm). Andere vloeibare draagstoffen dan water (b.v. organische oplosmiddelen zoals aceton of chloroform) moeten worden vermeden 
omdat deze de microflora kunnen aantasten. Als zand als draagstof 
wordt gebruikt, kan deze worden gecoat met de in een geschikt oplosmiddel opgeloste of gesuspendeerde teststof. In dat geval moet het oplosmiddel vóór het mengen met de bodem door verdam ­
ping worden verwijderd. Voor een optimale verdeling van de teststof 
in de bodem wordt een verhouding van 10 g zand per kg grond (drooggewicht) aanbevolen. De controlemonsters worden behandeld met uitsluitend dezelfde hoeveelheid water en/of kwartszand.
 
Bij het testen van vluchtige stoffen moeten verliezen tijdens de be ­
handeling worden voorkomen en moet er naar een homogene ver ­
deling in de bodem worden gestreefd (de teststof kan bijvoorbeeld op verschillende plaatsen in de bodem worden geïnjecteerd).
 
1.6.6  Testconcentraties  
Als er gewasbeschermingsmiddelen of andere chemische stoffen met 
een voorspelbare milieuconcentratie worden getest, moeten er ten 
minste twee concentraties worden gebruikt. De laagste concentratie moet ten minste overeenkomen met de maximale hoeveelheid die naar verwachting in de praktijk in de bodem terecht zal komen, 
terwijl de hoogste concentratie een veelvoud van de laagste concen ­
tratie moet zijn. Bij de berekening van de concentratie van de aan de bodem toegevoegde teststof wordt uitgegaan van een uniforme ver ­
menging in de bodem tot een diepte van 5 cm en een dichtheid van 
de droge grond van 1,5. Voor landbouwchemicaliën die rechtstreeks 
op de bodem worden gebracht en voor chemische stoffen waarvoor de hoeveelheid die in de bodem terechtkomt voorspelbaar is, worden als testconcentratie de voorspelbare milieuconcentratie (PEC — pre ­
dictable environmental concentration) en het vijfvoud van deze con ­
centratie aanbevolen. Stoffen die naar verwachting meer dan een keer per seizoen op de bodem worden gebracht, moeten worden getest bij concentraties die worden berekend door de PEC te ver ­
menigvuldigen met het aantal keren dat dit naar verwachting maxi ­
maal gebeurt. De hoogste geteste concentratie mag echter niet hoger zijn dan tien keer de maximale per keer opgebrachte hoeveelheid.
 
Als andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, wordt 
een meetkundige reeks van ten minste vijf concentraties gebruikt. De 
geteste concentraties moeten het interval bestrijken dat voor de be ­
paling van de EC  x -waarden nodig is.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7 UITVOERING VAN DE TEST  
1.7.1  Hlootstellingsomstandigheden  
1.7.1.1  Behandeling en controle  
Als er landbouwchemicaliën worden getest, wordt de grond in drie 
even zware porties verdeeld. Twee porties worden gemengd met de 
draagstof die de teststof bevat en de andere portie met de draagstof zonder teststof (controle). Voor zowel de behandelde als de contro ­
legrond wordt minimaal een bepaling in triplo aanbevolen. Als er 
andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, wordt de 
grond in zes even zware porties verdeeld. Vijf porties worden ge ­
mengd met de draagstof die de teststof bevat en de andere portie met 
de draagstof zonder teststof. Voor zowel de behandelde als de con ­
trolegrond wordt een bepaling in triplo aanbevolen. Er moet worden gezorgd voor een homogene verdeling van de teststof in de behan ­
delde bodemmonsters. Bij het mengen moeten comprimering en 
kluitvorming van de grond worden voorkomen.
 
1.7.1.2  Incubatie van de bodemmonsters  
Incubatie van de bodemmonsters kan op twee manieren gebeuren: als 
één monster voor elke behandelde en onbehandelde bodem of als een 
reeks aparte even grote submonsters voor elke behandelde en onbe ­
handelde bodem. Wanneer vluchtige stoffen worden getest, mag de test echter uitsluitend met een reeks aparte submonsters worden uit ­
gevoerd. Wanneer de grond als één monster wordt geïncubeerd, 
worden grote hoeveelheden van elke behandelde en onbehandelde bodem geïncubeerd en worden tijdens de test waar nodig submon ­
sters voor analyse genomen. De hoeveelheid die aanvankelijk voor 
elke behandelde en onbehandelde bodem wordt geïncubeerd, is af ­
hankelijk van de grootte van de submonsters, het aantal replicaatbe ­
palingen dat voor de analyse wordt gebruikt en het verwachte maxi ­
male aantal monsternemingstijdstippen. Grond die als één monster 
wordt geïncubeerd, moet vóór het nemen van submonsters grondig 
worden gemengd. Wanneer de bodem als een reeks aparte bodem ­
monsters wordt geïncubeerd, wordt elke portie behandelde en onbe ­
handelde grond in het vereiste aantal submonsters verdeeld, die wor ­
den gebruikt wanneer ze nodig zijn. Wanneer bij een experiment 
meer dan twee monstememingstijdstippen kunnen worden verwacht, moeten er voldoende submonsters voor alle replicaatbepalingen en alle monsternemingstijdstippen worden gemaakt. Ten minste drie 
replicaatmonsters van de testbodem worden onder aërobe omstandig ­
heden geïncubeerd (zie punt 1.7.1.1). Tijdens alle tests moeten er geschikte bakken worden gebruikt met voldoende ruimte boven de grond om te voorkomen dat er anaërobe omstandigheden ontstaan. 
Wanneer er vluchtige stoffen worden getest, mag de test uitsluitend 
met een reeks aparte submonsters worden uitgevoerd.
 
1.7.1.3  Testomstandigheden en duur van de test  
De test wordt in het donker bij kamertemperatuur (20 ± 2  o C) uit­
gevoerd. Het vochtgehalte van de bodemmonsters moet gedurende de test op 40-60 % van het maximale watergehalte van de bodem worden gehouden (zie punt 1.6.4.2) met een bereik van ± 5 %. 
Indien nodig kan gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden toege ­
voegd.
 
De minimale duur van een test is 28 dagen. Als er landbouwchemi ­
caliën worden getest, worden de hoeveelheden vrijgekomen kool ­
dioxide of verbruikte zuurstof in de behandelde en de controlemon ­
sters vergeleken. Als op dag 28 het verschil groter dan 25 % is, 
wordt de test voortgezet tot het verschil 25 % of minder is maar 
maximaal gedurende 100 dagen. Als er andere stoffen dan land ­
bouwchemicaliën worden getest, wordt de test na 28 dagen beëin ­
digd. Op dag 28 worden de hoeveelheden vrijgekomen kooldioxide 
of verbruikte zuurstof in de behandelde en de controlemonsters be ­
paald en worden de EC  x -waarden berekend.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2  Monsterneming en analyse van de grond  
1.7.2.1  Schema voor de monsterneming  
Als er landbouwchemicaliën worden getest, wordt de door glucose 
geïnduceerde ademhaling van de bodemmonsters op de dagen 0, 7, 
14 en 28 bepaald. Als er een langere test nodig is, wordt na dag 28 
om de 14 dagen een analyse uitgevoerd.  
Als er andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden getest, wor ­
den er ten minste vijf testconcentraties gebruikt en wordt de door 
glucose geïnduceerde ademhaling van de bodemmonsters aan het 
begin (dag 0) en aan het eind van de blootstellingsperiode (dag 28) bepaald. Als dit nodig wordt geacht, kan er bijvoorbeeld op dag 7 een tussentijdse meting worden gedaan. De op dag 28 ver ­
kregen gegevens worden gebruikt om de EC
 x -waarde voor de che ­
mische stof te bepalen. Als dat gewenst is, kunnen de gegevens van de controlemonsters op dag 0 worden gebruikt om de oorspronke ­
lijke hoeveelheid metabool actieve microbiële biomassa in de bodem 
te bepalen (12).
 
1.7.2.2  Meling van de door glucose geïnduceerde ademhaling  
Op elk monsternemingstijdstip wordt in elk replicaatmonster (behan ­
deld en controle) de door glucose geïnduceerde ademhaling bepaald. De bodemmonsters worden gemengd met een zodanige hoeveelheid 
glucose dat er onmiddellijk een maximale ademhalingsreactie op ­
treedt. De hoeveelheid glucose die bij een bepaalde bodem nodig is om een maximale ademhalingsreactie te veroorzaken, kan bij een vooronderzoek met een reeks glucoseconcentraties worden bepaald 
(14). Voor een zandige bodem met 0,5-1,5 % organische koolstof is 
2 000 tot 4 000 mg glucose per kg drooggewicht bodem echter meestal voldoende. De glucose kan met schoon kwartszand (10 g zand/kg drooggewicht bodem) tot poeder worden vermalen en homo ­
geen met de bodem worden vermengd.
 
De met glucose verrijkte bodemmonsters worden geïncubeerd in 
geschikte apparatuur om de ademhaling continu, om het uur of om de twee uur bij 20 ± 2
 o C te meten (zie punt 1.6.1). Het vrijgekomen 
kooldioxide of de verbruikte zuurstof wordt gedurende twaalf uur 
gemeten en de metingen dienen zo spoedig mogelijk te beginnen, d.w.z. binnen 1 tot 2 uur na de toevoeging van de glucose. De totale hoeveelheid gedurende de twaalf uur vrijgekomen kooldioxide of 
verbruikte zuurstof wordt gemeten en de gemiddelde ademhaling 
wordt bepaald.
 
2. GEGEVENS  
2.1 BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Als er landbouwchemicaliën worden getest, wordt de hoeveelheid 
vrijgekomen kooldioxide of verbruikte zuurstof in elk replicaat-bo ­
demmonster geregistreerd en worden de gemiddelde waarden van 
alle replicaatbepalingen in tabelvorm vermeld. De resultaten worden met adequate en algemeen erkende statistische methoden (b.v. een F- test, niveau met 5 % significantie) geëvalueerd. De door glucose 
geïnduceerde ademhaling wordt uitgedrukt in mg kooldioxide/kg 
drooggewicht bodem/uur of mg zuurstof/kg drooggewicht bodem/ ­
uur. De gemiddelde vorming van kooldioxide of het gemiddelde verbruik van zuurstof bij elke behandelde bodem wordt vergeleken 
met de controle en de procentuele afwijking van de controle wordt 
berekend.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Als de test met andere stoffen dan landbouwchemicaliën wordt uit ­
gevoerd, wordt de hoeveelheid vrijgekomen kooldioxide of ver ­
bruikte zuurstof in elk replicaat-bodemmonster bepaald en wordt er een dosis/respons-curve samengesteld om de EC
 x -waarden te bepa ­
len. De door glucose geïnduceerde ademhaling (d.w.z. mg 
kooldioxide/kg drooggewicht bodem/uur of mg zuurstof/kg droogge ­
wicht bodem/uur) die na 28 dagen in de behandelde monsters wordt bepaald, wordt vergeleken met de controle. Uit deze gegevens wordt de procentuele remming voor elke testconcentratie berekend. Deze 
percentages worden uitgezet tegen de concentratie en met behulp van 
statistische procedures worden de EC
 x -waarden berekend. Met be ­
hulp van standaardprocedures worden ook de betrouwbaarheidsgren ­
zen (p = 0,95) voor de berekende EC  x bepaald (15)(16)(17).  
2.2 INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Wanneer de resultaten van tests met landbouwchemicaliën worden 
geëvalueerd en het verschil in de ademhaling tussen de laagste con ­
centratie (d.w.z. de maximale verwachte concentratie) en de controle op enig monsternemingstijdstip na dag 28 niet groter dan 25 % is, kan worden geconcludeerd dat het product op lange termijn geen 
invloed op de omzetting van koolstof in de bodem heeft. Wanneer 
de resultaten van tests met andere stoffen dan landbouwchemicaliën worden geëvalueerd, worden de EC
 50 , de EC  25 en/of de EC  10 ge­
bruikt.  
3. RAPPORTAGE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Een volledige specificatie van de gebruikte bodem met vermelding 
van o.a.:  
— de geografische kenmerken van de locatie (lengte en breedte);  
— informatie over het verleden van de locatie (d.w.z. vegetatie, 
behandelingen met gewasbeschermingsmiddelen, behandelingen 
met meststoffen, onopzettelijke verontreinigingen enz.);  
— het gebruikspatroon (d.w.z. landbouwgrond, bos enz.);  
— de monsternemingsdiepte (in cm);  
— het gehalte aan zand/slib/klei (in % drooggewicht);  
— de pH (in water);  
— het gehalte aan organische koolstof (in % drooggewicht);  
— het stikstofgehalte (in % drooggewicht);  
— de kation-uitwisselingscapaciteit (in mmol/kg);  
— de oorspronkelijke microbiële biomassa in percentage totale or ­
ganische koolstof;  
— de referentie van de voor de bepaling van elke parameter ge ­
bruikte methode;  
— alle informatie over de verzameling en opslag van de bodem ­
monsters;  
— een gedetailleerde beschrijving van de eventuele pre-incubatie 
van de grond.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
De teststof:  
— de fysische aard en indien relevant de fysisch-chemische eigen ­
schappen;  
— de chemische identificatiegegevens, indien relevant, met inbegrip 
van de structuurformule, de zuiverheid (d.w.z. het percentage 
werkzaam bestanddeel voor gewasbeschermingsmiddelen) en het stikstofgehalte.
 
De testomstandigheden:  
— gedetailleerde gegevens over de verbetering van de bodem met 
organisch substraat;  
— het aantal concentraties van de teststof en, indien van toepassing, 
een motivering voor de keuze van de concentraties;  
— gedetailleerde gegevens over de manier waarop de teststof op de 
bodem wordt gebracht;  
— de incubatietemperatuur;  
— het vochtgehalte van de bodem aan het begin van en tijdens de 
test; 
— de gebruikte incubatiemethode (d.w.z. in één portie of als een 
reeks aparte submonsters);  
— het aantal replicaatbepalingen;  
— de monsternemingstijdstippen.  
De resultaten:  
— de voor de meting van de ademhaling gebruikte methode en 
apparatuur;  
— de hoeveelheden kooldioxide of zuurstof, met vermelding van de 
afzonderlijke en gemiddelde waarden, in tabelvorm;  
— de verschillen tussen de replicaatbepalingen bij de behandelde en 
de controlemonsters:  
— een verklaring voor correcties in de berekeningen, indien van 
toepassing;  
— het procentuele verschil in de door glucose geïnduceerde adem ­
haling op elk monsternemingstijdstip of, indien van toepassing, 
de EC  50 met het 95 %-betrouwbaarheidsinterval, andere EC  x - 
waarden (d.w.z. EC  25 of EC  10 ) met betrouwbaarheidsintervallen 
en een grafische voorstelling van de dosis/respons-curve;  
— de statistische behandeling van de resultaten, indien van toepas ­
sing;  
— alle informatie en opmerkingen die nuttig kunnen zijn voor de 
interpretatie van de resultaten.  
4. REFERENTIES  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. Agronomy Monograph N
 o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831-871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration me ­
thod.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation- extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influ ­
ence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as 
an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braun ­
schweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New-York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AEROBE EN ANAEROBE OMZETTING IN DE BODEM  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 307 (2002) van de OESO.  
1.1 INLEIDING  
Deze testmethode is gebaseerd op bestaande richtsnoeren (1)(2)(3) ­
(4)(5)(6)(7)(8)(9). De hier beschreven methode is bedoeld om de 
aërobe en anaërobe omzetting van chemische stoffen in de bodem te evalueren. De experimenten zijn bedoeld om te bepalen i) wat de omzettingssnelheid van de teststof is en ii) wat de aard en de vor ­
mings- en afbraaksnelheid is van omzettingsproducten waaraan plan ­
ten en bodemorganismen kunnen worden blootgesteld. Dergelijke onderzoeken zijn nodig voor chemische stoffen die rechtstreeks op de bodem worden gebracht of waarvan het aannemelijk is dat ze in 
het bodemmilieu terecht zullen komen. De resultaten van dit labora ­
toriumonderzoek kunnen ook worden gebruikt voor de ontwikkeling van monsternemings- en analyseprotocollen voor verwant veldonder ­
zoek.
 
Aëroob en anaëroob onderzoek met één bodemtype is meestal vol ­
doende voor de evaluatie van omzettingsroutes (8)(10)(ll). De om ­
zettingssnelheid moet daarnaast in ten minste drie bodemtypes wor ­
den bepaald (8)(10).  
In Belgirate (Italië) is in 1995 een OESO-workshop over bodem- en 
sedimentselectie gehouden (10), waar met name overeenstemming is bereikt over het aantal bodemtypes dat voor deze test moet worden gebruikt. De geteste bodemtypes moeten representatief zijn voor de 
milieusituatie op de plaats waar de stoffen worden gebruikt of vrij ­
komen. Zo moeten chemische stoffen die in een subtropisch of tro ­
pisch klimaat vrijkomen, met Ferrasols of Nitosols (FAO-systeem) worden getest. De workshop heeft op basis van de ISO-richtsnoeren 
(15) ook aanbevelingen gedaan voor het verzamelen, behandelen en 
bewaren van bodemmonsters. Het gebruik van paddy(rijst)-bodem komt in deze methode ook aan de orde.
 
1.2 DEFINITIES  
Teststof:  een stof, hetzij de oorspronkelijke verbinding, hetzij rele ­
vante omzettingsproducten.  
Omzettingsproducten:  alle stoffen die ontstaan bij biotische of abi ­
otische omzettingsreacties van de teststof, met inbegrip van CO  2 en 
producten in gebonden residuen.  
Gebonden residuen:  verbindingen in de bodem, in planten of in 
dieren die na extractie in de vorm van de oorspronkelijke verbinding of de metabolieten/omzettingsproducten daarvan in de matrix achter ­
blijven. De extractiemethode mag de verbindingen zelf of de struc ­
tuur van de matrix niet significant wijzigen. De aard van de binding 
kan gedeeltelijk worden opgehelderd door extractiemethoden die de matrix wijzigen of door verfijnde analysetechnieken. Tot op heden zijn op deze manier bijvoorbeeld covalente, ionische en sorptiebin ­
dingen en insluitingen gesignaleerd. In het algemeen heeft de vor ­
ming van gebonden residuen tot gevolg dat de biologische toegan ­
kelijkheid en de biologische beschikbaarheid significant afnemen (12) [gewijzigd overgenomen uit IUPAC 1984 (13)].
 
Aërobe omzetting:  reacties die in aanwezigheid van moleculaire 
zuurstof verlopen (14).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaërobe omzetting:  reacties die bij uitsluiting van moleculaire 
zuurstof verlopen (14).  
Bodem:  een mengsel van anorganische en organische chemische 
bestanddelen, in het laatste geval bestaande uit verbindingen met een hoog koolstof- en stikstofgehalte en een hoog molecuulgewicht, dat kleine (meestal micro-)organismen bevat. Bodem kan in twee 
toestanden worden verwerkt:
 
(a) onverstoord, zoals in de loop der tijd ontwikkeld, met kenmer ­
kende lagen van verschillende bodemtypes;  
(b) verstoord, zoals meestal aangetroffen in bouwland of wanneer bij 
deze test gebruikte monsters door graven worden genomen (14).  
Mineralisatie:  de volledige afbraak van een organische verbinding 
tot CO  2 en H  2 O onder aërobe omstandigheden en CH  4 , CO  2 en H  2 O 
onder anaërobe omstandigheden. In de context van de/e testmethode 
betekent mineralisatie, wanneer met  14 C gelabelde verbindingen wor ­
den gebruikt, een volledige afbraak waarbij een gelabeld koolstof ­
atoom wordt geoxideerd en een equivalente hoeveelheid  14 CO 2 vrij­
komt (14).  
Halveringstijd (t  0,5 ): de tijd die nodig is om 50 % van een hoe ­
veelheid teststof om te zetten, wanneer de omzetting kan worden beschreven door kinetiek van de eerste orde; deze is onafhankelijk van de concentratie.
 
DT 50 (Disappearance Time 50):  de tijd waarin de concentratie van 
de teststof met 50 % daalt; deze verschilt van de halveringstijd t  0,5 
wanneer de omzetting niet volgens kinetiek van de eerste orde 
plaatsvindt.  
DT 75 (Disappearance Time 75):  de tijd waarin de concentratie van 
de teststof met 75 % daalt.  
DT 90 (Disappearance Time 90):  de tijd waarin de concentratie van 
de teststof met 90 % daalt.  
1.3 REFERENT1ESTOFFEN  
Voor de karakterisering en/of identificatie van omzettingsproducten 
met behulp van spectroscopische en chromatografische methoden moeten reterentiestoffen worden gebruikt.
 
1.4 TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
De methode kan worden gebruikt voor alle chemische stoffen (al dan 
niet radioactief gelabeld) waarvoor een analysemethode met een af ­
doende nauwkeurigheid en gevoeligheid beschikbaar is. Enigszins 
vluchtige, niet-vluchtige, in water oplosbare en niet in water oplos ­
bare stoffen kunnen worden getest. De test mag niet worden gebruikt voor chemische stoffen met een grote vluchtigheid vanuit de bodem (b.v. fumigatiemiddelen of organische oplosmiddelen) die onder de 
experimentele omstandigheden tijdens deze test uit de bodem ver ­
dwijnen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5 INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
Voor de meting van de omzettingssnelheid kan een al dan niet 
gelabelde teststof worden gebruikt. Voor de bestudering van de om ­
zettingsroute en voor de bepaling van een massabalans is gelabeld 
materiaal nodig. Labeling met  14 C wordt aanbevolen, maar ook het 
gebruik van andere isotopen zoals  13 C, 15 N, 3 H of  32 P kan nuttig 
zijn. Het label moet zo veel mogelijk in het meest stabiele gedeelte van het molecuul worden aangebracht (
 1 ). De zuiverheid van de test ­
stof moet ten minste 95 % zijn.  
Vóór de uitvoering van een test om de aërobe en anaërobe omzetting 
in de bodem te bepalen moet de volgende informatie over de teststof 
beschikbaar zijn:  
(a) de oplosbaarheid in water (methode A.6);  
(b) de oplosbaarheid in organische oplosmiddelen;  
(c) de dampspanning (methode A.4) en de constante van de wet van 
Henry;  
(d) de verdelingscoëfficiënt n-octanol/water (methode A.8);  
(e) de chemische stabiliteit in het donker (hydrolyse) (methode C.7);  
(f) de pK  a als een molecuul protonering of deprotonering kan onder ­
gaan [OESO-richtsnoer 112] (16).  
Ook informatie over de toxiciteit van de teststof voor micro-organis ­
men in de bodem kan nuttig zijn [testmethoden C.21 en C.22] (16).  
Er moeten analysemethoden (met inbegrip van methoden voor ex ­
tractie en clean-up) beschikbaar zijn voor de kwalitatieve en kwan ­
titatieve bepaling van de teststof en de omzettingsproducten daarvan.  
1.6 PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
De bodemmonsters worden met de teststof behandeld en worden 
onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (bij constante temperatuur en met een constant vochtgehalte van de bodem) in het donker geïncubeerd in kolven van het biometer-type of in door ­
stroomsystemen. Nadat voldoende tijd is verstreken, worden de bo ­
demmonsters geëxtraheerd en op de oorspronkelijke stof en de om ­
zettingsproducten daarvan geanalyseerd. Ook vluchtige producten worden met geschikte absorptie-apparatuur opgevangen om te wor ­
den geanalyseerd. Door met
 14 C gelabeld materiaal te gebruiken 
kunnen de verschillende mineralisatiesnelheden worden gemeten door het ontstane
 14 CO 2 weg te vangen en kan de massabalans, 
met inbegrip van de vorming van aan de bodem gebonden residuen, 
worden bepaald.  
1.7 KWALITEITSCRITERIA  
1.7.1  Recovery  
Door onmiddellijk na de toevoeging van de teststof bodemmonsters 
ten minste in duplo te extraheren en te analyseren wordt een eerste 
indicatie verkregen van de herhaalbaarheid van de analysemethode en de uniformiteit van de procedure voor het opbrengen van de teststof. In latere fasen van de experimenten wordt de recovery be ­
paald aan de hand van de respectieve massabalansen. Voor gelabelde 
stoffen moet de recovery tussen 90 % en 110 % liggen (8) en voor ongelabelde stoffen tussen 70 % en 110 % (3).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Als de teststof bijvoorbeeld één ring bevat, moet deze ring worden gelabeld; als de 
teststof twee of meer ringen bevat, kan er apart onderzoek nodig zijn om te bekijken 
wat er met elke gelabelde ring gebeurt en om bruikbare informatie over de vorming van 
omzettingsproducten te verkrijgen.
 1.7.2  Herhaalbaarheid en gevoeligheid van de analysemethode  
De herhaalbaarheid van de analysemethode (exclusief de efficiëntie 
van de extractie in het begin) voor de kwantitatieve bepaling van de teststof en de omzettingsproducten kan worden gecontroleerd door 
één extract van een bodemmonster, dat lang genoeg is geïncubeerd 
voor de vorming van om/ettingsproducten, in duplo te analyseren.
 
De aantoonbaarheidsgrens van de analysemethode voor de teststof en 
voor de omzettingsproducten mag niet hoger zijn dan 0,01 mg.kg  -1 
bodem (als teststof) of, indien dit lager is, 1 % van de opgebrachte 
dosis. De bepaalbaarheidsgrens moet ook worden gespecificeerd.  
1.7.3  Nauwkeurigheid van de omzettingsgegevens  
Een regressieanalyse van de concentratie van de teststof als functie 
van de tijd levert de vereiste informatie op over de betrouwbaarheid 
van de omzettingscurve en maakt het mogelijk de betrouwbaarheids ­
grenzen te berekenen voor de halveringstijd (bij kinetiek van de pseudo-eerste orde) of de DT
 50 en, indien van toepassing, de DT  75 
en de DT  90 . 
1.8 BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.8.1  Apparatuur en chemicaliën  
Incubatiesystemen bestaan in de vorm van statische gesloten syste ­
men of geschikte doorstroomsystemen (7)(17). In de figuren 1 en 2 worden voorbeelden gegeven van respectievelijk een geschikt door ­
stroomapparaat voor bodemincubatie en een kolf van het biometer- 
type. Beiden soorten incubatiesystemen hebben hun voordelen en beperkingen (7)(17).
 
Er is standaard-laboratoriumapparatuur nodig, met name:  
— analyse-instrumenten voor bijvoorbeeld GLC, HPLC en TLC, 
met inbegrip van de nodige detectiesystemen voor de analyse van al dan niet radioactief gelabelde stoffen, of voor de inverse 
isotoopverdunningsmethode;
 
— instrumenten voor identificatie (b.v. MS, GC-MS, HPLC-MS of 
NMR);  
— een vloeistofscintillatieteller;  
— een oxidator voor de verbranding van radioactief materiaal;  
— een centrifuge;  
— extractieapparatuur (b.v. centrifugebuizen voor koude extractie en 
een Soxhlet-apparaat voor continue extractie met reflux);  
— instrumenten voor de concentratie van oplossingen en extracten 
(b.v. een rotatieverdamper);  
— een waterbad;  
— een mechanisch mengapparaat (b.v. een kneedmachine of een 
roermotor).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
De volgende chemicaliën worden onder andere gebruikt:  
— NaOH p.a., 2 mol.dm  -3 , of een andere geschikte base (b.v. KOH 
of ethanolamine);  
— H  2 SO 4 p.a., 0,05 mol.dm  -3 ; 
— ethyleenglycol p.a.;  
— vast absorptiemateriaal zoals natronkalk en polyurethaanproppen:  
— organische oplosmiddelen p.a., zoals aceton of methanol;  
— scintillatievloeistof.  
1.8.2  Het opbrengen van de teststof  
Om de teststof aan de bodem toe te voegen en daarin te verdelen kan 
deze worden opgelost in water (gedeïoniseerd of gedestilleerd) of indien nodig in minimale hoeveelheden aceton of andere organische 
oplosmiddelen (6) waarin de teststof voldoende oplosbaar en stabiel 
is. Het gekozen oplosmiddel mag in de gebruikte hoeveelheid echter geen significante invloed op de microbiële activiteit van de bodem hebben (zie de punten 1.5 en 1.9.2-1.9.3). Het gebruik van oplos ­
middelen die de microbiële activiteit remmen, zoals chloroform, di ­
chloormethaan en andere gehalogeneerde oplosmiddelen, moet wor ­
den vermeden.
 
De teststof kan ook als vaste stof worden toegevoegd, bijvoorbeeld 
gemengd met kwartszand (6) of een klein submonster van de test ­
bodem dat aan de lucht gedroogd en gesteriliseerd is. Als de teststof met behulp van een oplosmiddel wordt toegevoegd, moet het oplos ­
middel eerst verdampen voordat het submonster met de teststof aan 
het oorspronkelijke niet-steriele bodemmonster wordt toegevoegd.
 
Bij algemene chemische stoffen, die voornamelijk via zuiveringsslib/ ­
gebruik in de landbouw in de bodem terechtkomen, moet de teststof 
eerst aan het slib worden toegevoegd, dat dan vervolgens in het bo ­
demmonster wordt gebracht (zie de punten 1.9.2 en 1.9.3).  
Het gebruik van geformuleerde producten wordt in de regel niet 
aanbevolen. Bijvoorbeeld bij slecht oplosbare teststoffen kan het 
gebruik van geformuleerd materiaal echter een geschikt alternatief 
zijn. 
1.8.3  Bodem  
1.8.3.1  Selectie van de bodem  
Om de omzettingsroute te bepalen kan een representatief bodemtype 
worden gebruikt: zandig leem, siltig leem, leem of lemig zand [vol ­
gens de FAO- en USDA-indeling (18)] met een pH van 5,5-8,0, een organisch koolstofgehalte van 0,5-2,5 % en een microbiële biomassa van ten minste 1 % van het totale organische koolstofgehalte wordt 
aanbevolen (10).
 
Voor het onderzoek naar de omzettingssnelheid moeten ten minste 
drie aanvullende bodemtypes worden gebruikt die een scala van relevante bodemtypes vormen. Het organisch koolstofgehalte, de 
pH, het kleigehalte en de microbiële biomassa van de bodemtypes 
moeten uiteenlopen (10).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Van alle bodemtypes moeten in elk geval de textuur ( % zand, % silt 
en % klei) [volgens de FAO- en USDA-indeling (18)|, de pH, de 
kation-uitwisselingscapaciteit, het organisch koolstofgehalte, de dicht ­
heid van de droge grond, de waterretentie-kenmerken (  1 ) en de micro ­
biële biomassa (uitsluitend voor aëroob onderzoek) worden bepaald. 
Aanvullende informatie over de eigenschappen van de bodem kan 
nuttig zijn bij de interpretatie van de resultaten. Voor de bepaling van de bodemkenmerken kunnen de in de referenties (19)(20)(21)(22) ­
(23) aanbevolen methoden worden gebruikt. De microbiële biomassa 
dient met de SIR-methode (substraat-geïnduceerde ademhaling) (25) ­
(26) of met andere methoden (20) te worden bepaald.
 
1.8.3.2  Verzameling, behandeling en opslag van de bodemmonsters  
Er moet gedetailleerde informatie beschikbaar zijn over de geschie ­
denis van de locatie waar de testbodem wordt verzameld, zoals de 
exacte ligging, de vegetatie, behandelingen met chemische stoffen, behandelingen met organische en anorganische mest, toevoegingen van biologisch materiaal of andere verontreinigingen. Als de bodem 
in de loop van de voorgaande vier jaar met de teststof of structureel 
analoge verbindingen daarvan is behandeld, mag deze niet voor het omzettingsonderzoek worden gebruikt (10)(15).
 
De grond moet vers van het veld (van de A-horizont of de toplaag 
van 20 cm) worden verzameld met een bodemwatergehalte dat zeven gemakkelijker maakt. Voor andere bodem dan paddy-velden moet monsterneming niet gedurende of vlak na lange perioden (>30 da ­
gen) van droogte, vorst of overstroming gebeuren (14). De monsters 
moeten zodanig worden vervoerd dat veranderingen in het bodem ­
watergehalte tot een minimum worden beperkt, en zo veel mogelijk in het donker worden bewaard op een plaats waar er lucht bij kan 
komen. Een losjes dichtgeknoopte polyetheen zak is hier in het alge ­
meen geschikt voor.
 
De grond moet zo spoedig mogelijk na monsterneming worden ver ­
werkt. Vegetatie, groot formaat bodemfauna en stenen moeten wor ­
den verwijderd voordat de grond door een zeef van 2 mm wordt gezeefd om kleine stenen en resten van planten en dieren te ver ­
wijderen. Voordat de grond wordt gezeefd, mag deze niet te veel 
worden gedroogd en platgedrukt (15).
 
Wanneer het in de winter moeilijk is om in het veld monsters te 
nemen (bevroren bodem of een laag sneeuw), kunnen deze worden 
genomen van een partij grond die in een kas, bedekt door vegetatie (bijvoorbeeld gras of een gras/klaver-mengsel), wordt bewaard. Er is een duidelijke voorkeur voor onderzoek met vers van het veld ge ­
haalde grond, maar als de verzamelde en bewerkte grond vóór het 
begin van het onderzoek moet worden opgeslagen, moeten de om ­
standigheden adequaat zijn en mag dit slechts een beperkte tijd gebeuren (4 ± 2
 o C gedurende maximaal drie maanden) om de 
microbiële activiteit op peil te houden (  2 ). Voor gedetailleerde in ­
structies voor de verzameling, behandeling en opslag van grond die voor biotransformatie-experimenten moet worden gebruikt, wordt verwezen naar (8)(10)(15)(26)(27).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) De waterretentiekenmerken van een bodemtype kunnen worden gemeten als de veldca ­
paciteit, het waterhoudend vermogen of de waterspanning (pF). Zie bijlage I voor een 
uitleg. In het testverslag moet worden vermeld of de waterretentiekenmerken en de 
dichtheid van de droge grond in onverstoorde of verstoorde (bewerkte) veldmonsters 
zijn bepaald. 
( 2 ) Recente onderzoekresultaten wijzen erop dat ook grond uit gematigde zones zonder een 
significant verlies van microbiële activiteit gedurende meer dan drie maanden bij - 20  o C 
kan worden bewaard (28)(29).
 Voordat de bewerkte grond voor de test wordt gebruikt, wordt deze 
gepre-incubeerd om ontkieming en de verwijdering van zaden mo ­
gelijk te maken en om het evenwicht van het microbiële metabolisme na de overgang van de monsternemings- en opslagomstandigheden naar de incubatie-omstandigheden te herstellen. Een pre-incubatiepe ­
riode van 2 tot 28 dagen met bij benadering de temperatuur en de 
vochtomstandigheden van de echte test volstaat in het algemeen (15). De opslag en de pre-incubatie mogen samen niet langer dan drie maanden duren.
 
1.9 UITVOERING VAN DE TEST  
1.9.1  Testomstandigheden  
1.9.1.1  Testtemperatuur  
Gedurende de hele testperiode moet de grond in het donker wor ­
den geïncubeerd bij een constante temperatuur die representatief is 
voor de klimaatomstandigheden waar de teststof zal worden ge ­
bruikt of zal vrijkomen. Voor alle teststoffen die in een gematigd klimaat in de bodem terecht kunnen komen, wordt een tempera ­
tuur van 20 ± 2
 o C aanbevolen. De temperatuur moet worden 
gemonitord.  
Voor chemische stoffen die in een kouder klimaat worden gebruikt 
of vrijkomen (bijvoorbeeld in noordelijke landen of in de herfst of de winter), moeten daarnaast ook bodemmonsters bij een lagere tempe ­
ratuur (bijvoorbeeld 10 ± 2
 o C) worden geïncubeerd.  
1.9.1.2  Vochtgehalte  
Voor omzettingsproeven onder aërobe omstandigheden moet het 
vochtgehalte van de bodem (  1 ) op een pF tussen 2,0 en 2,5 worden 
gebracht en gehouden (3). Het vochtgehalte van de bodem wordt 
uitgedrukt als massa water per massa droge grond en moet periodiek 
worden gecontroleerd (bijvoorbeeld om de twee weken) door de incubatiekolven te wegen en waterverliezen moeten worden gecom ­
penseerd door water toe te voegen (bij voorkeur steriel gefilterd 
kraanwater). Er moet op worden gelet dat bij het toevoegen van 
vocht (eventuele) verliezen van de teststof en/of omzettingsproducten door vervluchtiging en/of afbraak onder invloed van licht worden 
voorkomen of tot een minimum worden beperkt.
 
Voor omzettingsproeven onder anaërobe of paddy-omstandigheden 
wordt de grond onder water gezet om deze met water te verzadigen.  
1.9.1.3  Aërobe incubatie-omstandigheden  
In de doorstroomsystemen worden de omstandigheden aëroob gehou ­
den door periodiek met bevochtigde lucht te spoelen of daar continu 
mee te ventileren. In de biometerkolven vindt de uitwisseling van lucht door diffusie plaats.
 
1.9.1.4  Steriele aërobe omstandigheden  
Om informatie te krijgen over de relevantie van de abiotische om ­
zetting van een teststof kunnen bodemmonsters worden gesteriliseerd 
(zie de referenties 16 en 29 voor sterilisatiemethoden), behandeld met steriele teststof (bijvoorbeeld door de oplossing via een steriele filter toe te voegen) en belucht met bevochtigde steriele lucht zoals
 
beschreven onder punt 1.9.1.3. Voor paddy-bodem moeten grond en 
water worden gesteriliseerd en moet de incubatie volgens punt 1.9.1.6 worden uitgevoerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) De grond mag niet te nat en niet te droog zijn om een afdoende beluchting en voeding 
van de microflora in de bodem te waarborgen. Als vochtgehalte voor een optimale 
microbiële groei wordt een waterhoudend vermogen (WHV) van 40-60 % en een water ­
spanning van 0,1-0,33 bar aanbevolen (6). Dit laatste interval komt overeen met een pF 
van 2,0-2,5. In bijlage 2 wordt voor verschillende bodemtypes het karakteristieke vocht ­
gehalte vermeld.
 1.9.1.5  Anaërobe incubatie-omslandigheden  
Om anaërobe omstandigheden te krijgen en te houden wordt de met 
de teststof behandelde grond gedurende 30 dagen of, indien dit korter is, één halveringstijd of DT
 50 , onder aërobe omstandigheden 
geïncubeerd en vervolgens met water doordrenkt (waterlaag van 1- 
3 cm) en wordt het incubatiesysteem met een inert gas (bijvoorbeeld stikstof of argon) doorgespoeld (
 1 ). Het testsysteem moet mogelijk ­
heden bieden voor de meting van bijvoorbeeld de pH, de zuurstof ­
concentratie en de redoxpotentiaal en apparatuur bevatten voor het 
wegvangen van vluchtige producten. Het systeem van het biometer- type moet gesloten zijn om te voorkomen dat door diffusie lucht 
binnendringt.
 
1.9.1.6  Paddy-incubatieomstandigheden  
Om de omzetting in paddy-rijstbodem te onderzoeken wordt de bo ­
dem onder water gezet met een waterlaag van ongeveer 1-5 cm en 
wordt de teststof aan de waterfase toegevoegd (9). Een bodemdiepte van ten minste 5 cm wordt aanbevolen. Het systeem wordt net als onder aërobe omstandigheden met lucht geventileerd. De pH, de 
zuurstofconcentratie en de redoxpotentiaal van de waterlaag worden 
gemonitord en gerapporteerd. Voordat de omzettingsproef wordt be ­
gonnen, is een pre-incubatieperiode van minimaal twee weken nodig 
(zie punt 1.8.3.2).
 
1.9.1.7  Duur van de test  
Het onderzoek naar snelheid en route mag normaal gesproken niet 
langer duren dan 120 dagen (  2 ) (3)(6)(8), omdat daarna in een kunst ­
matig laboratoriumsysteem, dat van natuurlijke aanvulling afgesloten is, in de loop der tijd een daling van de microbiële activiteit van de bodem kan worden verwacht. Wanneer dit nodig is om de afbraak 
van de teststof en de vorming en afbraak van belangrijke omzettings ­
producten te karakteriseren, kan het onderzoek gedurende langere tijd (bijvoorbeeld 6 of 12 maanden) worden voortgezet (8). Voor 
langere incubatieperioden moet in het testverslag een motivering 
worden gegeven en in dat geval moet gedurende en aan het eind van deze perioden de biomassa worden gemeten.
 
1.9.2  Uitvoering van de test  
In elke incubatiekolf (zie de figuren 1 en 2 in bijlage 3) wordt 
ongeveer 50 tot 200 g grond (drooggewicht) gebracht, die volgens een van de onder punt 1.8.2 beschreven methoden met de teststof 
wordt behandeld. Wanneer er voor de toevoeging van de teststof 
organische oplosmiddelen worden gebruikt, moeten deze door ver ­
damping uit de grond worden verwijderd. Vervolgens wordt de 
grond met een spatel en/of door de kolf te schudden grondig ge ­
mengd. Als het onderzoek onder paddy-omstandigheden wordt uit ­
gevoerd, worden de grond en het water na de toevoeging van de teststof grondig gemengd. Kleine porties (bijvoorbeeld 1 g) van de 
behandelde grond worden op de teststof geanalyseerd om te contro ­
leren of deze uniform verdeeld is. Alternatieve methoden komen later aan de orde.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aan het bodemoppervlak en zelfs daaronder heersen meestal aërobe omstandigheden, 
zoals is gebleken uit een onderzoekproject in opdracht van de EU [K. Takagi et al. (1992): Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal varia ­
tion in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. 
Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 augustus 1992, Sigtuna, Zweden|. Anaë ­
robe omstandigheden komen slechts sporadisch voor wanneer de bodem na zware re ­
genval doordrenkt is of wanneer in rijstvelden paddy-omstandigheden heersen. 
(
 2 ) Aëroob onderzoek kan al lang vóór de 120 dagen worden beëindigd, mits de uiteinde ­
lijke omzettingsroute en de uiteindelijke mineralisatie op dat moment duidelijk bereikt 
zijn. Beëindiging van de test is mogelijk na 120 dagen of wanneer ten minste 90 % van 
de teststof is omgezet, maar alleen als ten minste 5 % CO  2 is gevormd.
 De toegevoegde hoeveelheid moet overeenkomen met de grootste 
hoeveelheid van een gewasbeschermingsmiddel die in de gebruiks ­
aanwijzing voor opbrenging wordt aanbevolen en een uniforme ver ­
menging tot een adequate diepte op het veld (bijvoorbeeld de bo ­
venste laag van 10 cm van de bodem (  1 ). Voor chemische stoffen die 
bijvoorbeeld op het blad of zonder vermenging op de bodem worden 
opgebracht, moet bij de berekening van de hoeveelheid die aan elke kolf moet worden toegevoegd, worden uitgegaan van een diepte van 2,5 cm. Voor chemische stoffen die met de grond worden vermengd, 
is de adequate diepte de in de gebruiksaanwijzing vermelde vermen ­
gingsdiepte. Voor algemene chemische stoffen wordt de opgebrachte hoeveelheid bepaald op basis van de meest relevante aanvoerroute; als bijvoorbeeld zuiveringsslib de belangrijkste route voor de toevoer 
naar de bodem is, moet de chemische stof aan het slib worden 
toegevoegd in een concentratie die overeenkomt met de verwachte concentratie in het slib en moet de hoeveelheid aan de grond toege ­
voegd slib overeenkomen met de normale hoeveelheid op landbouw ­
grond gebruikt slib. Als deze concentratie niet hoog genoeg is om 
belangrijke omzettingsproducten te bepalen, kan incubatie van aparte bodemmonsters met grotere hoeveelheden nuttig zijn, maar te grote hoeveelheden die de microbiële functies van de bodem beïnvloeden, 
moeten worden vermeden (zie de punten 1.5 en 1.8.2).
 
Ook kan een grotere hoeveelheid (d.w.z. 1 tot 2 kg) grond met de 
teststof worden behandeld, zorgvuldig in een geschikt mengapparaat 
worden gemengd en vervolgens in kleine porties van 50 tot 200 g in 
de incubatiekolven worden overgebracht (bijvoorbeeld met behulp van monsterverdelers). Kleine porties (bijvoorbeeld 1 g) van de be ­
handelde grond worden op de teststof geanalyseerd om te controleren 
of deze uniform verdeeld is. Een dergelijk procedure verdient de 
voorkeur aangezien daarmee een uniformere verdeling van de teststof in de bodem mogelijk is.
 
Ook onbehandelde bodemmonsters worden onder dezelfde (aërobe) 
omstandigheden als de met de teststof behandelde monsters geïncu ­
beerd. Deze monsters worden gebruikt voor de meting van de bio ­
massa gedurende en aan het eind van het onderzoek.  
Wanneer de teststof voor de toevoeging aan de bodem in een of 
meer organische oplosmiddelen wordt opgelost, worden met de/elfde hoeveelheid oplosmiddel(en) behandelde bodemmonsters worden on ­
der dezelfde (aërobe) omstandigheden als de met de teststof behan ­
delde monsters geïncubeerd. Deze monsters worden gebruikt voor de meting van de biomassa aan het begin, gedurende en aan het eind van het onderzoek om na te gaan welke effecten de organische 
oplosmiddelen op de microbiële biomassa hebben.
 
De kolven met de behandelde bodemmonsters worden aan het in 
figuur 1 beschreven doorstroomsysteem bevestigd of met de in fi ­
guur 2 afgebeelde absorptiekolom afgesloten (zie bijlage 3).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) De aanvankelijke concentratie op basis van het oppervlak wordt als volgt berekend:  
C bodem  mg =kg bodem ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d½kg bodem =m 3 â 
C bodem  = aanvankelijke concentratie in de bodem [mg-kg  -1 ]. 
A = opgebrachte hoeveelheid [kg.ha  -1 ]; 1 = dikte van de bodemlaag [m]; d = dichtheid 
van de droge bodem [kg.m  -3 ]. 
Als vuistregel geldt dat een opgebrachte hoeveelheid van 1 kg.ha  -1 tot een bodemcon ­
centratie van ongeveer 1 mg.kg  -1 in een laag van 10 cm leidt (uitgaande van een dicht ­
heid van de droge bodem van 1 g cm  -3 ).
 1.9.3  Monsterneming en meting  
Op geschikte tijdstippen worden incubatiekolven in duplo verwijderd 
en worden de bodemmonsters met geschikte oplosmiddelen met een verschillende polariteit geëxtraheerd en op de teststof en/of omzet ­
tingsproducten geanalyseerd. In een goed opgezet onderzoek zijn er 
voldoende kolven om op elk monsternemingstijdstip twee kolven te kunnen gebruiken. Ook de absorptieoplossingen of het vaste absorp ­
tiemateriaal worden op verschillende tijdstippen (gedurende de eerste 
maand om de 7 dagen en daarna om de 17 dagen) gedurende en aan 
het eind van de incubatie van elk bodemmonster verwijderd en op vluchtige producten geanalyseerd. Naast een bodemmonster dat di ­
rect na de toevoeging wordt genomen (dag 0), worden nog ten 
minste 5 andere monstememingspunten gekozen. De tijdstippen wor ­
den zodanig gekozen dat het verloop van de afbraak van de teststof en van de vorming en afbraak van de omzettingsproducten kan 
worden bepaald (bijvoorbeeld na 0, 1, 3 en 7 dagen, na 2 en 3 
weken, na 1, 2 en 3 maanden enz.).
 
Wanneer een met C gelabelde teststof wordt gebruikt, wordt de niet- 
extraheerbare radioactiviteit door verbranding kwantitatief bepaald en wordt er voor elk monsternemingstijdstip een massabalans bepaald.
 
Bij anaërobe en paddy-incubatie worden de bodem- en de waterfase 
gezamenlijk op de teststof en de omzettingsproducten geanalyseerd 
of vóór extractie en analyse door filtratie of centrifugeren geschei ­
den. 
1.9.4  Facultatieve tests  
Aërobe niet-steriele proeven bij andere temperaturen en vochtgehal ­
tes van de bodem kunnen nuttig zijn om de invloed van de tempe ­
ratuur en het vochtgehalte van de bodem op de omzettingssnelheid 
van een teststof en/of de omzettingsproducten daarvan in de bodem te bepalen.
 
Met behulp van bijvoorbeeld superkritische vloeistofextractie kan 
worden getracht de niet-extraheerbare radioactiviteit nader te karak ­
teriseren.  
2. GEGEVENS  
2.1 BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Voor elk monsternemingstijdstip wordt de hoeveelheid teststof, om ­
zettingsproducten, vluchtige stoffen (uitsluitend in %) en niet-extra ­
heerbaar materiaal als percentage van de oorspronkelijk toegevoegde 
concentratie en eventueel als mg.kg  -1 bodem (op basis van het 
drooggewicht) vermeld. Voor elk monsternemingstijdstip dient er een massabalans te worden gegeven als percentage van de oorspron ­
kelijk toegevoegde concentratie. Door in een grafiek de concentratie 
van de teststof uit te zetten tegen de tijd kan de halveringstijd of de DT
 50 worden bepaald. Belangrijke omzettingsproducten moeten wor ­
den geïdentificeerd en ook hun concentratie moet tegen de tijd wor ­
den uitgezet om hun vormings- en afbraaksnelheid aan te geven. Een 
belangrijk omzettingsproduct is een product dat op enig moment tijdens het onderzoek in een grotere hoeveelheid dan 10 % van de toegevoegde dosis aanwezig is.
 
De weggevangen vluchtige producten geven een indicatie van het 
vervluchtigingsvermogen van een teststof en de omzettingsproducten 
daarvan vanuit de bodem.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Er moet een nauwkeuriger bepaling van de halveringstijd of de DT  50 
en eventueel de DT  75 en de DT  90 worden verkregen door de nodige 
kinetische modelberekeningen uit te voeren. Naast de halveringstijd en de DT
 50 wordt er ook een beschrijving van het gebruikte model 
gegeven met vermelding van de orde van de kinetiek en de deter ­
minatiecoëfficiënt (r). Kinetiek van de eerste orde krijgt de voorkeur, 
tenzij r < 0,7. Eventueel moeten de berekeningen ook worden toe ­
gepast op de belangrijke omzettingsproducten. Voorbeelden van ge ­
schikte modellen worden beschreven in de referenties 31 tot en 
met 35.  
Wanneer onderzoek bij verschillende temperaturen wordt uitgevoerd, 
wordt de omzettingssnelheid binnen het experimentele temperatuur ­
traject als functie van de temperatuur beschreven met behulp van de vergelijking van Arrhenius:
 
k ¼ A·e ÄB=T of lnk ¼ 1nA Ä B 
T . 
waarbij ln A en B regressiecontanten zijn van respectievelijk het 
intercept en de helling van een best passende rechte die voortkomt uit een lineaire regressie van ln k tegen l/T, k de snelheidsconstantie bij temperatuur T is en T de temperatuur in Kelvin is. Er moet goed 
worden gelet op het beperkte temperatuurtraject waarop de vergelij ­
king van Arrhenius geldig is wanneer de omzetting door de micro ­
biële activiteit wordt bepaald.
 
2.2 EVALUATIE EN INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Hoewel het onderzoek in een kunstmatig laboratoriumsysteem wordt 
uitgevoerd, kan aan de hand van de resultaten een raming worden gemaakt van de omzettingssnelheid van de teststof en de vormings- en afbraaksnelheid van de omzettingsproducten onder veldomstan ­
digheden (36)(37).
 
Een onderzoek naar de omzettingsroute van een teststof levert infor ­
matie op over de manier waarop de structuur van de gebruikte stof in 
de bodem onder invloed van chemische en microbiële reacties ver ­
andert.  
3. RAPPORTACE  
TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
De teststof:  
— de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de 
structuurformule (waarin de plaats van het label wordt aange ­
geven als radioactief gelabeld materiaal wordt gebruikt) en rele ­
vante fysisch-chemische eigenschappen (zie punt 1.5);  
— de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof;  
— de radiochemische zuiverheid van een radioactief gelabelde stof 
en de specifieke activiteit (indien van toepassing).  
Referentiestoffen:  
— de chemische naam en de structuur van referentiestoffen die voor 
de karakterisering en/of de identificatie van omzettingsproducten 
worden gebruikt.  
De gebruikte bodem:  
— gegevens over de plaats waar de monsters zijn verzameld;  
— de datum van monsterneming en de gevolgde procedure;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— eigenschappen van de bodem zoals de pH, het organische kool ­
stofgehalte, de textuur ( % zand, % silt, % klei), de kation- 
uitwisselingscapaciteit, de dichtheid van de droge bodem, de waterretentie-kenmerken en de microbiële biomassa;
 
— de periode gedurende welke en de omstandigheden waaronder de 
monsters zijn opgeslagen (als ze zijn opgeslagen).  
De testomstandigheden:  
— de data waarop het onderzoek is uitgevoerd;  
— de gebruikte hoeveelheid teststof;  
— de gebruikte oplosmiddelen en de manier waarop de teststof is 
opgebracht;  
— het gewicht van de oorspronkelijk behandelde bodem waaruit op 
elk analysetijdstip een monster is genomen;  
— een beschrijving van het gebruikte incubatiesysteem;  
— de stroomsnelheid van de lucht (alleen voor doorstroomsyste ­
men);  
— de temperatuur van de proefopstelling;  
— het vochtgehalte van de bodem tijdens de incubatie:  
— de microbiële biomassa aan het begin, gedurende en aan het eind 
van het aërobe onderzoek;  
— de pH, de zuurstofconcentratie en de redoxpotentiaal aan het 
begin, gedurende en aan het eind van het anaërobe en paddy- onderzoek;
 
— de extractiemethode(n);  
— de methoden voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van 
de teststof en de belangrijke omzettingsproducten in de bodem en het absorptiemateriaal;
 
— het aantal replicaat-bepalingen en het aantal controlebepalingen.  
De resultaten:  
— de resultaten van de bepaling van de microbiële activiteit;  
— de herhaalbaarheid en gevoeligheid van de gebruikte analyse ­
methoden;  
— de recovery (onder punt 1.7.1 wordt vermeld welke percentages 
voor een geldig onderzoek gehaald moeten worden);  
— tabellen met de resultaten, uitgedrukt als percentage van de ge ­
bruikte aanvankelijke dosis en eventueel in mg.kg  -1 bodem 
(drooggewicht);  
— de massabalans gedurende en aan het eind van het onderzoek;  
— de karakterisering van de niet-extraheerbare (gebonden) radioacti ­
viteit of residuen in de bodem;  
— een kwantificering van het vrijgekomen CO  2 en andere vluchtige 
verbindingen;  
— curves waarin voor de teststof en eventueel de belangrijke om ­
zettingsproducten de bodemconcentratie tegen de tijd wordt uit ­
gezet;  
— de halveringstijd of de DT  50 , DT  75 en DT  90 voor de teststof en 
eventueel de belangrijke omzettingsproducten, met vermelding 
van de betrouwbaarheidsgrenzen;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— een raming van de abiotische afbraaksnelheid onder steriele om ­
standigheden;  
— een evaluatie van de omzettingskinetiek voor de teststof en even ­
tueel de belangrijke omzettingsproducten;  
— de voorgestelde omzettingsroutes, indien van toepassing;  
— een bespreking en interpretatie van de resultaten;  
— de onbewerkte gegevens (d.w.z. voorbeelden van chromatogram ­
men en van berekeningen van de omzettingssnelheid en de mid ­
delen die voor de identificatie van de omzettingsproducten zijn gebruikt).
 
4. REFERENTIES  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide As ­
sessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental 
Fate.  
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) Europese Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC con ­
cerning the placing of plant protection products on the market. 
Annex 11, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in 
the Environment.  
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air.  
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzen ­
schutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden — Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil — Part 1: Aerobic conditions.
 
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality — Laboratory incubation sys ­
tems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil — Aerobic metabolism study in soil 
under paddy field conditions (flooded).  
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH (1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)  
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981)  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality — Sampling — Part 6: Gui ­
dance on the collection, handling and storage of soil for the 
assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(16) Annex V to Dir. 67/548/EEC  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Sci ­
ence, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
— General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological me ­
thod for the quantitative measurement of microbial biomass in 
soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.  
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality — Determination of 
soil microbial biomass — Part 1: Substrate- induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method.  
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. 
L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.  
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio- transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16’ Sympo ­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).  
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold 
storage of soil on microbial activities and biomass. In Pestici ­
des, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Euro ­
pe). 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical cha ­
racteristics. Plant and Soil 102, 197-200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Bo ­
den. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
 
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environ ­
mental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. Freed, 
Eds., 135- 172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 
39, 188-204.
 
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 33, 47- 
60. 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dis ­
sipation in soil; a new model based on spatial variability. En ­
vironm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.  
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
Bijlage 1  
WATERDRUK, VELDCAPACITEIT (VC) EN WATERHOUDEND VERMOGEN (WHV) ( 1 ) 
Hoogte van de waterkolom 
[cm| pF (  a ) bar (  b ) Opmerkingen  
10 7 7 10  4 Droge bodem 
1,6.10  4 4,2 16 Verwelkingspunt 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6.10  2 2,8 0,6 
3,3.10  2 2,5 0,33 (  c ) 
Bereik van de 
veldcapaciteit (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHV (bij benadering) 1 0 0,001 Met water verzadigde bodem
 
( a ) pF = log hoogte waterkolom in cm. 
( b ) 1 bar= 10  5 Pa. 
( c ) Komt overeen met een watergehalte van ongeveer 10 % in zand, 35 % in leem en 45 % in klei. 
( d ) De veldcapaciteit is niet constant maar varieert van bodemtype tot bodemtype tussen pF 1,5 en 2,5.  
De waterdruk wordt als hoogte van de waterkolom in cm of in bar gemeten. Vanwege het grote 
bereik van de zuigspanning wordt eenvoudigheidshalve de pF-waarde gebruikt, de logaritme van de hoogte van de waterkolom in cm.
 
De veldcapacileil wordt gedefinieerd als de hoeveelheid water die door een natuurlijke bodem twee 
dagen na een langdurige regenperiode of afdoende irrigatie tegen de zwaartekracht in kan worden 
vastgehouden. Deze grootheid wordt in situ op het veld in onverstoorde grond bepaald. De meting is dus niet van toepassing op laboratorium-bodemmonsters die wel verstoord zijn. De in verstoorde grond bepaalde VC-waarde kan een sterke systematische variatie vertonen.
 
Het waterhoudend vermogen (WHV) wordt in het laboratorium met verstoorde en onverstoorde 
grond bepaald door een bodemkolom via capillair transport met water te verzadigen. Het WHV is vooral voor verstoorde grond nuttig en kan wel 30 % hoger liggen dan de veldcapaciteit (1). Het WHV is experimenteel ook gemakkelijker te bepalen dan een betrouwbare VC-waarde.
 
Noten  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mine ­
ralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
Bijlage 2  
VOCHTGEHALTE VAN DE BODEM (in g water per 100 g droge grond) VAN 
VERSCHILLENDE BODEMSOORTEN UIT VERSCHILLENDE LANDEN  
Vochtgehalte van de bodem bij 
Bodemtype Land 
WHV (  1 ) pF= 1,8 pF = 2,5  
Zand Duitsland 28,7 8,8 3,9 
Lemig zand Duitsland 50,4 17,9 12,1 
Lemig zand Zwitserland 44,0 35,3 9,2 
Siltig leem Zwitserland 72,8 56,6 28,4 Kleileem Brazilië 69,7 38,4 27,3 Kleileem Japan 74,4 57,8 31,4 Zandig leem Japan 82,4 59,2 36,0 Siltig leem VS 47,2 33,2 18,8 Zandig leem VS 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Waterhoudend vermogen  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
Bijlage 3  
Figuur 1  
Voorbeeld van een doorstroomapparaat voor de bestudering van de omzetting van chemische 
stoffen in de bodem  ( 1 ) ( 2 )
 
Figuur 2  
Voorbeeld van een kolf van het biometer-type voor de bestudering van de omzetting van 
chemische stoffen in de bodem  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  AËROBE EN ANAËROBE OMZETTING IN AQUA TISCHE 
SEDIMENTSYSTEMEN  
1. METHODE  
Deze methode is overgenomen van TG 308 (2002) van de OESO.  
1.1 INLEIDING  
Chemische stoffen kunnen bijvoorbeeld rechtstreeks, door over ­
waaien bij het spuiten, door afspoeling, door drainage, door afval ­
verwijdering, in industrieel, huishoudelijk of agrarisch afvalwater of 
door depositie uit de lucht in ondiepe of diepe oppervlaktewateren 
terechtkomen. In deze testmethode wordt een laboratoriumprocedure beschreven voor de bepaling van de aërobe en anaërobe omzetting van organische stoffen in aquatische sedimentsystemen. De methode 
is gebaseerd op bestaande richtsnoeren (1)(2)(3)(4)(5)(6). In Belgi ­
rate (Italië) is in 1995 een OESO-workshop over bodem- en sedi ­
mentselectie gehouden (7), waar met name overeenstemming is be ­
reikt over het aantal sedimenttypes dat voor de/e test moet worden 
gebruikt. De workshop heeft op basis van de ISO-richtsnoeren (8) 
ook aanbevelingen gedaan voor het verzamelen, behandelen en be ­
waren van sedimentmonsters. Dergelijke onderzoeken zijn nodig voor chemische stoffen die direct aan water worden toegevoegd of 
waarvan het aannemelijk is dat ze via bovengenoemde routes in het 
aquatisch milieu terecht zullen komen.
 
De omstandigheden in natuurlijke aquatische sedimentsystemen 
zijn in de bovenstaande waterfase vaak aëroob. De bovenste 
laag van het sediment kan aëroob of anaëroob zijn, terwijl het diepere sediment meestal anaëroob is. Om al deze mogelijkheden te omvatten worden in dit document zowel aërobe als anaërobe 
tests beschreven. Bij de aërobe test wordt een aërobe water ­
kolom boven een aërobe sedimentlaag met daaronder een anaë ­
robe gradiënt gesimuleerd. Bij de anaërobe test wordt een vol ­
ledig anaëroob water/sedimentsysteem gesimuleerd. Als de om ­
standigheden erop wijzen dat er significant van deze aanbevelin ­
gen moet worden afgeweken, bijvoorbeeld door een intacte sedi ­
mentkern te gebruiken of sediment dat aan de teststof bloot ­
gesteld kan zijn, zijn daarvoor andere methoden beschikbaar (9).
 
1.2 DEFINITIES  
In alle gevallen moeten eenheden van het Internationale Eenheden ­
stelsel (SI) worden gebruikt.  
Teststof:  een stof, hetzij de oorspronkelijke verbinding, hetzij rele ­
vante omzettingsproducten.  
Omzettingsproducten:  alle stoffen die ontstaan bij biotische en abi ­
otische omzettingsreacties van de teststof, met inbegrip van CO  2 en 
gebonden residuen.  
Gebonden residuen:  verbindingen in de bodem, in planten of in 
dieren die na extractie in de vorm van de oorspronkelijke verbinding 
of de metabolieten daarvan in de matrix achterblijven. De extractie ­
methode mag de verbindingen zelf of de structuur van de matrix niet significant wijzigen. De aard van de binding kan gedeeltelijk worden opgehelderd door extractiemethoden die de matrix wijzigen of door 
verfijnde analysetechnieken. Tot op heden zijn op deze manier bij ­
voorbeeld covalente, ionische en sorptiebindingen en insluitingen gesignaleerd. In het algemeen heeft de vorming van gebonden resi ­
duen tot gevolg dat de biologische toegankelijkheid en de biologi ­
sche beschikbaarheid significant afnemen (10) [gewijzigd overgeno ­
men uit IUPAC 1984 (11)].
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aërobe omzetting  (oxiderend): reacties die in aanwezigheid van 
moleculaire zuurstof verlopen (12).  
Anaërobe omzetting  (reducerend): reacties die bij uitsluiting van 
moleculaire zuurstof verlopen (12).  
Natuurlijk water:  oppervlaktewater dat uit bijvoorbeeld een meer of 
een rivier wordt verkregen.  
Sediment:  een mengsel van anorganische en organische chemische 
bestanddelen, in het laatste geval bestaande uit verbindingen met een 
hoog koolstof- en stikstofgehalte en een hoog molecuulgewicht. Het wordt afgezet door natuurlijk water en vormt een grensvlak met dat water.
 
Mineralisatie:  de volledige afbraak van een organische verbinding 
tot CO  2 en H  2 O onder aërobe omstandigheden en CH  4 , CO  2 en H  2 O 
onder anaërobe omstandigheden. In de context van de/e testmethode 
betekent mineralisatie, wanneer radioactief gelabelde verbindingen worden gebruikt, een volledige afbraak van een molecuul waarbij een gelabeld koolstofatoom volledig wordt geoxideerd of geredu ­
ceerd en een equivalente hoeveelheid respectievelijk CO
 2 of CH  4 
vrijkomt.  
Halveringstijd (t  0,5 ): de tijd die nodig is om 50 % van een hoe ­
veelheid teststof om te zetten, wanneer de omzetting kan worden beschreven door kinetiek van de eerste orde; deze is onafhankelijk 
van de aanvankelijke concentratie.
 
DT 50 (Disappearance Time 50):  de tijd waarin de aanvankelijke 
concentratie van de teststof met 50 % daalt.  
DT 75 (Disappearance Time 75):  de tijd waarin de aanvankelijke 
concentratie van de teststof met 75 % daalt.  
DT 90 (Disappearance Time 90):  de tijd waarin de aanvankelijke 
concentratie van de teststof met 90 % daalt.  
1.3 REFERENTIESTOFFEN  
Voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van omzettingspro ­
ducten met behulp van spectroscopische en chromatografische me ­
thoden moeten referentiestoffen worden gebruikt.  
1.4 INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
Voor de meting van de omzettingssnelheid kan een al dan niet met 
een isotoop gelabelde teststof worden gebruikt, hoewel de voorkeur 
wordt gegeven aan gelabeld materiaal. Voor de bestudering van de omzettingsroute en voor de bepaling van een massabalans is gelabeld materiaal nodig. Labeling met C wordt aanbevolen, maar ook het 
gebruik van andere isotopen zoals
 13 C, 15 N, 3 H of  32 P kan nuttig 
zijn. Het label moet zo veel mogelijk in het meest stabiele gedeelte van het molecuul worden aangebracht (
 1 ). De chemische en/of radio ­
chemische zuiverheid van de teststof moet ten minste 95 % zijn.  
Vóór de uitvoering van een test moet de volgende informatie over de 
teststof beschikbaar zijn:  
(a) de oplosbaarheid in water (methode A.6);  
(b) de oplosbaarheid in organische oplosmiddelen;  
(c) de dampspanning (methode A.4) en de constante van de wet van 
Henry;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Als de teststof bijvoorbeeld één ring bevat, moet deze ring worden gelabeld; als de 
teststof twee of meer ringen bevat, kan er apart onderzoek nodig zijn om te bekijken 
wat er met elke gelabelde ring gebeurt en om bruikbare informatie over de vorming van 
omzettingsproducten te verkrijgen.
 (d) de verdelingscoëfficiënt n-octanol/water (methode A.8);  
(e) de adsorptiecoëfficiënt (K  d , K f of K  oc ) (Methode C.18);  
(f) de hydrolyse (methode C.7);  
(g) de dissociatieconstante (pK  a ) [OESO-richtsnoer 112] (13);  
(h) de chemische structuur van de teststof en eventueel de plaats van 
het (de) isotopenlabel(s).  
NB: De temperatuur waarbij deze metingen zijn uitgevoerd, moet 
worden gerapporteerd.  
Ook informatie over de toxiciteit van de teststof voor micro-organis ­
men, over de gemakkelijke en/of intrinsieke biologische atbreekbaar ­
heid en over de aërobe en anaërobe omzetting in de bodem kan 
nuttig zijn.  
Er moeten analysemethoden (met inbegrip van methoden voor ex ­
tractie en clean-up) beschikbaar zijn voor de kwalitatieve en kwan ­
titatieve bepaling van de teststof en de omzettingsproducten daarvan 
in water en in sediment (zie punt 1.7.2).  
1.5 PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE  
Bij deze testmethode worden een aëroob en een anaëroob aquatisch 
sedimentsysteem gebruikt (zie bijlage 1) dat het mogelijk maakt:  
(i) de omzettingssnelheid van de teststof in een water/ ­
sedimentsysteem te meten;  
(ii) de omzettingssnelheid van de teststof in het sediment te meten;  
(iii) de mineralisatiesnelheid van de teststof en/of de omzettingspro ­
ducten daarvan te meten (wanneer een met C gelabelde teststof 
wordt gebruikt);  
(iv) de omzettingsproducten in de water- en de sedimentfase kwali ­
tatief en kwantitatief te bepalen en een massabalans op te stellen (wanneer een gelabelde teststof wordt gebruikt);
 
(v) de verdeling van de teststof en de omzettingsproducten daarvan 
over de twee fasen gedurende een incubatieperiode in het don ­
ker (om bijvoorbeeld algenbloei te voorkomen) bij constante temperatuur te meten. Wanneer dit met het oog op de gegevens verantwoord is, worden de halveringstijd, de DT
 50 , de DT  75 en 
de DT  90 bepaald, maar deze mogen niet veel verder dan de duur 
van het experiment worden geëxtrapoleerd (zie punt 1.2)  
Voor zowel de aërobe als de anaërobe test moeten ten minste twee 
sedimenten met het bijbehorende water worden gebruikt (7). Er kunnen echter gevallen zijn waarin er meer dan twee aquatische sedimenten moeten worden gebruikt, bijvoorbeeld wanneer het gaat 
om een chemische stof die zowel in zoet water als in het mariene 
milieu kan voorkomen.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6 TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
De methode kan in het algemeen worden gebruikt voor alle che ­
mische stoffen (al dan niet gelabeld) waarvoor een analysemethode met een afdoende nauwkeurigheid en gevoeligheid beschikbaar is. 
Enigszins vluchtige, niet-vluchtige, in water oplosbare en slecht in 
water oplosbare stoffen kunnen worden getest. De test mag niet worden gebruikt voor chemische stoffen met een grote vluchtigheid vanuit water (b.v. fumigatiemiddelen of organische oplosmiddelen) 
die daardoor onder de experimentele omstandigheden tijdens deze 
test uit het water en/of het sediment verdwijnen.
 
De methode is tot op heden toegepast op het onderzoek van de 
omzetting van chemische stoffen in zoet water en sedimenten daar ­
van, maar kan in beginsel ook voor estuariene/mariene systemen 
worden gebruikt. Zij is niet geschikt voor een simulatie van de omstandigheden in stromend water (zoals rivieren) of in open zee.
 
1.7 KWALITEITSCRITERIA  
1.7.1  Recovery  
Door onmiddellijk na de toevoeging van de teststof water- en sedi ­
mentmonsters ten minste in duplo te extraheren en te analyseren 
wordt een eerste indicatie verkregen van de herhaalbaarheid van de analysemethode en de uniformiteit van de procedure voor het toe ­
voegen van de teststof. In latere fasen van de experimenten wordt de 
recovery bepaald aan de hand van de respectieve massabalansen 
(wanneer gelabeld materiaal wordt gebruikt). Voor gelabelde stoffen moet de recovery tussen 90 % en 110 % liggen (6) en voor onge ­
labelde stoffen tussen 70 % en 110 %.
 
1.7.2  Herhaalbaarheid en gevoeligheid van de analysemethode  
De herhaalbaarheid van de analysemethode (exclusief de efficiëntie 
van de extractie in het begin) voor de kwantitatieve bepaling van de 
teststof en de omzettingsproducten kan worden gecontroleerd door één extract van een water- of sedimentmonster, dat lang genoeg is geïncubeerd voor de vorming van omzettingsproducten, in duplo te 
analyseren.
 
De aantoonbaarheidsgrens van de analysemethode voor de teststof en 
voor de omzettingsproducten mag niet hoger zijn dan 0,01 mg.kg  -1 
water of sediment (als teststof) of, indien dit lager is, 1 % van de 
aanvankelijk aan een testsysteem toegevoegde hoeveelheid. De be ­
paalbaarheidsgrens moet ook worden gespecificeerd.  
1.7.3  Nauwkeurigheid van de omzettingsgegevens  
Een regressieanalyse van de concentratie van de teststof als functie 
van de tijd levert de vereiste informatie op over de nauwkeurigheid van de omzettingscurve en maakt het mogelijk de betrouwbaarheids ­
grenzen te berekenen voor de halveringstijd (bij kinetiek van de 
pseudo-eerste orde) of de DT
 50 en eventueel de DT  75 en de DT  90 . 
1.8 BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.8.1  Testsysteem en apparatuur  
Het onderzoek moet in glazen houders (bijvoorbeeld flessen of cen ­
trifugebuizen) worden uitgevoerd, tenzij informatie vooraf (zoals de 
verdelingscoëfficiënt n-octanol/water of sorptiegegevens) erop wijst 
dat de teststof zich aan glas kan hechten; in dat geval moet wellicht worden overwogen een ander materiaal (zoals Teflon) te gebruiken. Wanneer bekend is dat de teststof zich aan glas hecht, kan dit 
probleem met behulp van een of meer van de volgende methoden 
worden beperkt:
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— de massa van de aan het glas gesorbeerde teststof en omzettings ­
producten bepalen;  
— al het glaswerk aan het eind van de test met oplosmiddel spoelen:  
— geformuleerde producten gebruiken (zie ook punt 1.9.2);  
— een grotere hoeveelheid co-oplosmiddel gebruiken om de teststof 
aan het systeem toe te voegen; als een co-oplosmiddel wordt 
gebruikt, mag dit geen solvolyse van de teststof veroorzaken.  
In de bijlagen 2 en 3 worden voorbeelden gegeven van karakteris ­
tieke testapparaten, namelijk respectievelijk een doorstroomsysteem en een systeem van het biometer-type (14). In referentie (15) worden 
andere geschikte incubatiesystemen beschreven. De experimentele 
apparatuur moet de uitwisseling van lucht of stikstof en het weg ­
vangen van vluchtige producten mogelijk maken. De afmetingen van de apparatuur moeten zodanig zijn dat aan de eisen van de test wordt 
voldaan (zie punt 1.9.1). Ventilatie kan gebeuren door zachtjes door ­
borrelen of door lucht of stikstof over het wateroppervlak te leiden. In het laatste geval kan het nuttig zijn het water van boven zachtjes te roeren om de zuurstof of stikstof beter in het water te verdelen. Er 
mag geen CO
 2 -vrije lucht worden gebruikt omdat daardoor de pH 
van het water kan stijgen. Verstoring van het sediment is in elk geval onwenselijk en moet zo veel mogelijk worden voorkomen. Enigszins vluchtige chemische stoffen moeten in een systeem van het bio ­
meter-type bij licht roeren van het wateroppervlak worden getest. 
Er kunnen ook gesloten systemen met lucht of stikstof boven de vloeistof en interne flacons voor het wegvangen van vluchtige pro ­
ducten worden gebruikt (16). Bij de aërobe test is een periodieke 
verversing van het gas boven de vloeistof nodig om het zuurstof ­
verbruik door de biomassa te compenseren.
 
Voor het wegvangen van vluchtige omzettingsproducten kunnen bij ­
voorbeeld worden gebruikt: kaliumhydroxide- of natriumhydroxide- oplossingen van 1 mol.dm
 -3 voor kooldioxide (  1 ) en ethyleenglycol, 
ethanolamine of 2 % paraffine in xyleen voor organische verbindin ­
gen. Vluchtige stoffen die onder anaërobe omstandigheden ontstaan, zoals methaan, kunnen bijvoorbeeld met een moleculaire zeef worden opgevangen. Deze vluchtige stoffen kunnen bijvoorbeeld tot CO
 2 
worden verbrand door het gas bij een temperatuur van 900  o C door 
een met CuO gevulde kwartsbuis te leiden en het gevormde CO  2 in 
een alkalische absorptieoplossing weg te vangen (17).  
Er is laboratoriumapparatuur voor de chemische analyse van de 
teststof en de omzettingsproducten nodig (gaschromatografie 
(GLC), hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), dunnelaagchro ­
matografie (TLC), massaspectroscopie (MS), gaschromatograt'ie- massaspectrometrie (GC/MS), vloeistofchromatografie-massaspectro ­
metrie (LC/MS), kernspinresonantie (NMR) enz.) met inbegrip van 
detectiesystemen voor al dan niet radioactief gelabelde chemische 
stoffen. Wanneer radioactief gelabeld materiaal wordt gebruikt, zijn ook een vloeistofscintillatieteller en een verbrandingsoxidator (voor de verbranding van sedimentmonsters vóór de analyse van de 
radioactiviteit) nodig.
 
Daarnaast zijn eventueel ook andere standaard-laboratoriumappara ­
tuur voor fysisch-chemische en biologische bepalingen (zie tabel 1 onder punt 1.8.2.2), glaswerk, chemicaliën en reagentia nodig.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Aangezien deze alkalische absorptie-oplossingen ook kooldioxide uit de ventilatielucht 
absorberen en kooldioxide die bij aërobe experimenten door ademhaling ontstaat, moeten 
ze geregeld worden ververst om verzadiging en zodoende verlies van hun absorptiever ­
mogen te voorkomen.
 1.8.2  Selectie van aquatische sedimenten en aantal sedimenten  
De monstememingsplaatsen moeten aan de hand van het doel van de 
test in een bepaalde situatie worden gekozen. Bij de keuze van de monstememingsplaatsen moet rekening worden gehouden met stof ­
fen die wellicht in het verleden door landbouw, industrie of huis ­
houdens in het stroomgebied en het water stroomopwaarts terecht zijn gekomen. Als het sediment in de loop van de voorgaande vier jaar met de teststof of structureel analoge verbindingen is verontrei ­
nigd, mag het niet worden gebruikt.
 
1.8.2.1  Selectie van het sediment  
Voor het aërobe onderzoek worden normaal gesproken twee sedi ­
menten gebruikt (7). Het organische koolstofgehalte en de textuur 
van de gekozen sedimenten moeten verschillen. Eén sediment moet een hoog organisch koolstofgehalte (2,5-7,5 %) en een fijne textuur hebben en het andere sediment een laag organisch koolstofgehalte 
(0,5-2,5 %) en een grove textuur. Het verschil in organisch kool ­
stofgehalte moet normaal gesproken ten minste 2 % zijn. Een „fijne textuur” wordt gedefinieerd als een gehalte aan [klei + silt] (
 1 ) van 
> 50 % en een „grove textuur” wordt gedefinieerd als een gehalte 
aan [klei + silt] van < 50 %. Het verschil in gehalte aan [klei + silt 1 
voor de twee sedimenten moet normaal gesproken ten minste 20 % zijn. Wanneer een chemische stof ook in het zeewater terecht kan komen, moet ten minste een van de water/sedimentsystemen van 
mariene herkomst zijn.
 
Voor het strikt anaërobe onderzoek moeten monsters van twee sedi ­
menten (met het bijbehorende water) uit de anaërobe zones van 
oppervlaktewateren worden genomen (7). Zowel het sediment als de waterfase moeten voorzichtig worden behandeld en vervoerd zo ­
dat er geen zuurstof bij kan komen.
 
Ook andere parameters kunnen belangrijk zijn bij de keuze van sedi ­
menten en moeten van geval tot geval worden bezien. Zo zal het pH- 
bereik van sedimenten belangrijk zijn wanneer chemische stoffen worden getest waarvan de omzetting en/of sorptie pH-afhankelijk kunnen zijn. Een pH-afhankelijkheid van sorptie kan gevolgen heb ­
ben voor de pK
 a van de teststof.  
1.8.2.2  Karakterisering van de water/sedimentmonsters  
In onderstaande tabel wordt een overzicht gegeven van de sleutel ­
parameters die voor zowel water als sediment moeten worden ge ­
meten en gerapporteerd (met vermelding van de gebruikte methode) 
en de fase van de test waarin deze parameters moeten worden be ­
paald. Ter informatie: methoden voor de bepaling van deze parame ­
ters worden vermeld in de referenties (18)(19)(20)(21).  
Daarnaast kan het van geval tot geval nodig zijn andere parameters 
te meten en te rapporteren (bijvoorbeeld voor zoet water: deeltjes, 
alkaliniteit, hardheid, geleidingsvermogen en NO  3 /PO  4 (verhouding 
en elk apart); voor sedimenten: kation-uitwisselingscapaciteit, water ­
houdend vermogen, carbonaat en stikstof en fosfor totaal; voor ma ­
riene systemen: zoutgehalte). Een analyse van sedimenten en water 
op nitraat, sulfaat, biologisch beschikbaar ijzer en wellicht andere elektronenacceptoren kan ook nuttig zijn bij de beoordeling van redox-omstandigheden, vooral wanneer het gaat om anaërobe omzet ­
ting.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Klei + silt] is de minerale fractie van het sediment met een deeltjesgrootte < 50 urn.
 Meting van parameters voor de karakterisering van water/sedimentmonsters (7)(22)(23)  
Parameter Fase van de testprocedure 
Monster 
neming Nabewer­
king Begin accli ­
matisering Begin test Gedurende 
test Einde test  
Water  
Herkomst/bron X 
Temperatuur X pH X X X X X TOC X X X O
 2 -concentratie* X X X X X 
Redoxpotentiaal* X X X X  
Sediment  
Herkomst/bron X Laagdiepte X pH X X X X X Deeltjesgrootte-verdeling X TOC X X X X 
Microbiële biomassa (*) X X X 
Redoxpotentiaal (**) Observa ­
tie 
(kleur/ 
geur) X X X X
 
(*) De methode met de microbiële ademhalingssnelheid (26), de fumigatiemethode (27) of de telplaatmethode (bijvoor ­
beeld bacteriën, actinomyceten, fungi en totaal aantal kolonies) voor aëroob onderzoek en de vormingssnelheid van 
methaan voor anaëroob onderzoek. 
(**) Uit recent onderzoek is gebleken dat metingen van de zuurstofconcentratie van water en van redoxpotentialengeen 
mechanistische of voorspellende waarde hebben voor de groei en ontwikkeling van microbiële populaties in op ­
pervlaktewateren (24)(25). De bepaling van het biochemische zuurstofverbruik (BZV, bij de monsterneming en aan 
het begin en aan het einde van de test) en van de concentratie van de micro/macronutriënten Ca, Mg en Mn (aan het 
begin en aan het einde van de test) in water en de meting van de totale hoeveelheid N en P in sedimenten (bij de 
monsterneming en aan het einde van de test) zijn wellicht betere instrumenten voor de interpretatie en evaluatie van 
de aërobe biotransformatiesnelheid en -route.  
1.8.3  Verzameling, behandeling en opslag  
1.8.3.1  Verzameling  
Voor de monsterneming van sediment moeten de ontwerprichtsnoe ­
ren van de ISO voor de monsterneming van bodemsediment (8) 
worden gevolgd. Sedimentmonsters worden genomen van de hele 
bovenste sedimentlaag van 5 tot 10 cm. Het bijbehorende water moet op dezelfde plaats en op hetzelfde tijdstip als het sediment worden verzameld. Voor het anaërobe onderzoek moet het monster 
van het sediment en het bijbehorende water worden genomen en 
vervoerd zonder dat er zuurstof bij kan komen (28) (zie punt 1.8.2.1). In de literatuur worden enkele monsternemingsapparaten beschreven (8)(23).
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2  Behandeling  
Het sediment wordt door filtratie van het water gescheiden en het 
sediment wordt met behulp van extra water van de locatie, dat ver ­
volgens wordt weggegooid, nat gezeefd over een zeef van 2 mm. 
Vervolgens worden bekende hoeveelheden sediment en water in de 
gewenste verhouding (zie punt 1.9.1) in incubatiekolven gemengd en voorbehandeld voor de acclimatiseringsperiode (zie punt 1.8.4). Voor het anaërobe onderzoek moeten alle bewerkingen worden uitgevoerd 
zonder dat er zuurstof bij kan komen (29)(30)(31)(32)(33).
 
1.8.3.3  Opslag  
Het gebruik van verse monsters sediment en water wordt ten zeerste 
aanbevolen, maar als opslag nodig is, moeten sediment en water volgens bovenstaande beschrijving worden gezeefd en samen in een laag water (6-10 cm) in het donker bij 4 ± 2
 o C (  1 ) gedurende 
maximaal 4 weken worden opgeslagen (7)(8)(23). Monsters die voor 
aëroob onderzoek worden gebruikt, moeten zodanig worden bewaard dat er gemakkelijk lucht bij kan komen (bijvoorbeeld in open bak ­
ken), terwijl monsters voor anaëroob onderzoek zodanig moeten 
worden bewaard dat er geen zuurstof bij kan komen. Bevriezing 
van sediment en water en uitdroging van het sediment tijdens het vervoer en de opslag moeten worden voorkomen.
 
1.8.4  Voorbehandeling van de sediment/watermonsters voor de test  
Voordat de teststof wordt toegevoegd, wordt elk sediment/watermonster 
geacclimatiseerd. Daartoe worden de monsters onder precies dezelfde omstandigheden als die van de incubatie tijdens de test in het incubatie ­
apparaat gebracht dat bij de test zal worden gebruikt (zie punt 1.9.1). De 
acclimatiseringsperiode is de tijd die het systeem nodig heeft om redelijk stabiel te worden, zoals dit tot uiting komt in de pH, de zuurstofconcen ­
tratie in het water, de redoxpotentiaal van het sediment en het water en de 
macroscopische scheiding van de fasen. De acclimatiseringsperiode duurt normaal gesproken een tot twee weken en mag niet meer dan vier weken duren. De resultaten van de tijdens deze periode uitgevoerde 
bepalingen moeten worden gerapporteerd.
 
1.9 UITVOERING VAN DE TEST  
1.9.1  Testomstandigheden  
De test wordt in het incubatieapparaat (zie punt 1.8.1) uitgevoerd 
met een volumeverhouding water/sediment tussen 3:1 en 4:1 en een sedimentlaag van 2,5 cm (± 0,5 cm). Een minimum hoeveelheid van 50 g sediment (droog gewicht) per incubatie tijdens wordt.
 
De test wordt in het donker bij een constante temperatuur tussen 
10 o C en 30  o C uitgevoerd. Een temperatuur van 20 ± 2  o C is 
geschikt. Daarnaast kan waar nodig, afhankelijk van de informatie die de test moet opleveren, van geval tot geval ook een lagere temperatuur (bijvoorbeeld 10
 o C) worden overwogen. De incubatie ­
temperatuur worden gemonitord en gerapporteerd.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Uit recent onderzoek is gebleken dat opslag bij 4  o C tot een afname van het organisch 
koolstofgehalte van het sediment kan leiden, hetgeen mogelijkerwijs tot gevolg kan 
hebben dat de microbiële activiteit afneemt (34).
 1.9.2  Behandeling en toevoeging van de teststof  
Er wordt één concentratie van de teststof gebruikt. Voor gewasbe ­
schermingsmiddelen die rechtstreeks in wateren worden gebracht, moet de op de etikettering vermelde maximale dosering als de maxi ­
maal toe te dienen hoeveelheid worden gebruikt (
 1 ), berekend op 
basis van het oppervlak van het water in de houder. In alle andere gevallen wordt de te gebruiken concentratie afgeleid van de ge ­
raamde emissie in het milieu. Er moet voor worden gezorgd dat 
de concentratie van de teststof voldoende is om de omzettingsroute 
en de vorming en afbraak van de omzettingsproducten te kunnen karakteriseren. Het kan nodig zijn hogere doses te gebruiken (bij ­
voorbeeld een factor 10 hoger), wanneer de concentraties van de 
teststof aan het begin van de test dicht bij de aantoonbaarheidsgrens liggen en/of wanneer belangrijke omzettingsproducten niet gemakke ­
lijk kunnen worden aangetoond wanneer hun concentratie 10 % van 
de oorspronkelijk gebruikte hoeveelheid teststof bedraagt. Als er 
echter hogere testconcentraties worden gebruikt, mogen deze geen significante schadelijke effecten hebben op de microbiële activiteit van het water/sedimentsysteem. Om voor een constante concentratie 
van de teststof in houders met verschillende afmetingen te zorgen, 
kan het nodig zijn de hoeveelheid toe te voegen materiaal aan te passen op basis van de verhouding tussen de diepte van de water ­
kolom in de houder en de waterdiepte in het veld (er wordt uitgegaan 
van een diepte van 100 cm, maar ook een andere diepte kan worden 
gebruikt). Voor een voorbeeld van een dergelijke berekening wordt verwezen naar bijlage 4.
 
In het ideale geval wordt de teststof als waterige oplossing aan de 
waterfase van het testsysteem toegevoegd. Als dit onvermijdelijk is, 
mogen kleine hoeveelheden met water mengbare oplosmiddelen (zo ­
als aceton of ethanol) voor de toevoeging en verdeling van de test ­
stof worden gebruikt, maar deze hoeveelheden mogen niet groter zijn 
dan 1 % (v/v) en geen schadelijke effecten op de microbiële activiteit 
van het testsysteem hebben. De bereiding van de waterige oplossing van de teststof moet voorzichtig gebeuren — het gebruik van een generatorkolom of menging vooraf kan nodig zijn om voor een vol ­
ledige homogeniteit te zorgen. Na de toevoeging van de waterige 
oplossing aan het testsysteem wordt aanbevolen de waterfase voor ­
zichtig te mengen, waarbij het sediment zo min mogelijk wordt verstoord.
 
Het gebruik van geformuleerde producten wordt normaal gesproken 
afgeraden, aangezien de bestanddelen van de formulering de ver ­
deling van de teststof en/of de omzettingsproducten over de water- 
en sedimentfase kunnen beïnvloeden. Voor slecht in water oplosbare 
stoffen kan het gebruik van geformuleerd materiaal echter een ge ­
schikt alternatief zijn.  
Het aantal incubatiehouders is afhankelijk van het aantal monsterne ­
mingstijdstippen (zie punt 1.9.3). Er moeten zo veel testsystemen 
beschikbaar zijn dat er op elk monsternemingstijdstip twee systemen uit de proef kunnen worden genomen. Wanneer er controle-opstel ­
lingen voor elk aquatisch sedimentsysteem worden gebruikt, mogen 
deze niet met de teststof worden behandeld. De controle-opstellingen 
kunnen worden gebruikt om aan het eind van het onderzoek de microbiële biomassa van het sediment en de totale hoeveelheid or ­
ganische koolstof in het water en het sediment te bepalen. Twee 
controle-opstellingen (d.w.z. één voor elk aquatisch sediment) kun ­
nen worden gebruikt voor de monitoring van de vereiste parameters in het sediment en het water gedurende de acclimatiseringsperiode (zie de tabel onder punt 1.8.2.2). Wanneer de teststof met behulp van 
een oplosmiddel wordt toegevoegd, zijn twee extra controle-opstel ­
lingen nodig om de schadelijke effecten daarvan op de microbiële activiteit van het testsysteem te meten.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Een test met een tweede concentratie kan nuttig zijn voor chemische stoffen die langs 
verschillende routes in het oppervlaktewater terechtkomen en waarbij dit tot significant 
verschillende concentraties leidt, zolang de laagste concentratie met een afdoende nauw ­
keurigheid kan worden geanalyseerd.
 1.9.3  Duur van de test en monsterneming  
Het experiment mag normaal gesproken niet langer duren dan 100 
dagen (6) en moet worden voortgezet totdat de afbraakroute en het verdelingspatroon sediment/water vaststaan of 90 % van de teststof 
door omzetting en/of vervluchtiging is verdwenen. Er moeten ten 
minste zes monsternemingstijdstippen zijn (inclusief het beginpunt) en een facultatief vooronderzoek (zie punt 1.9.4) kan worden ge ­
bruikt om een adequaat monsternemingsschema vast te stellen en 
de duur van de test te bepalen, tenzij er uit eerder onderzoek vol ­
doende gegevens over de teststof beschikbaar zijn. Voor hydrofobe teststoffen kunnen extra monsternemingspunten tijdens de beginfase 
van het onderzoek nodig zijn om de snelheid van de verdeling over 
de sediment- en de waterfase te bepalen.
 
Op geschikte monsternemingstijdstippen worden hele incubatiehou ­
ders (in duplo) voor analyse uit de test genomen. Het sediment en het bovenstaande water worden apart geanalyseerd (
 1 ). Hert boven ­
staande water wordt voorzichtig verwijderd, waarbij het sediment zo 
min mogelijk wordt verstoord. Bij de extractie en karakterisering van de teststof en de omzettingsproducten worden adequate analysepro ­
cedures gevolgd. Er moet op worden gelet dat ook materiaal dat aan 
de incubatiehouder of aan de verbindingsbuizen voor het wegvangen 
van vluchtige stoffen is geadsorbeerd, wordt verwijderd.
 
1.9.4  Facultatief vooronderzoek  
Als de duur en het monsternemingsschema niet aan de hand van 
ander relevant onderzoek aan de teststof kunnen worden bepaald, kan een facultatief vooronderzoek nuttig zijn, dat onder dezelfde 
testomstandigheden wordt uitgevoerd als het definitieve onderzoek. 
Als er een vooronderzoek wordt uitgevoerd, moeten de relevante experimentele omstandigheden en resultaten daarvan kort worden gerapporteerd.
 
1.9.5  Metingen en analyse  
Voor elk monsternemingstijdstip wordt de concentratie van de test ­
stof en de omzettingsproducten in het water en het sediment gemeten 
en gerapporteerd (als concentratie en als percentage van de toege ­
voegde hoeveelheid). In het algemeen moeten omzettingsproducten die op enig monsternemingstijdstip in grotere hoeveelheden dan 
10 % van de toegevoegde radioactiviteit in het hele water/ ­
sedimentsysteem worden bepaald, worden geïdentificeerd tenzij er een redelijke motivering is om dit niet te doen. Ook voor omzettings ­
producten waarvan de concentratie gedurende het onderzoek voort ­
durend stijgt, moet identificatie worden overwogen, zelfs als hun 
concentratie niet hoger wordt dan bovengenoemde grenswaarde, aan ­
gezien dit op persistentie kan wijzen. Deze aspecten moeten van geval tot geval worden bekeken en in het verslag moet een moti ­
vering van de conclusies worden opgenomen.
 
Voor elk monsternemingstijdstip worden ook de resultaten van sys ­
temen voor het wegvangen van gassen en vluchtige stoffen (CO  2 en 
bijvoorbeeld vluchtige organische verbindingen) gerapporteerd. Ook 
de mineralisatiesnelheden worden gerapporteerd. Voor elk monster ­
nemingstijdstip worden de niet-extraheerbare (gebonden) residuen in sediment gerapporteerd.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Wanneer een snelle heroxidatie van anaërobe omzettingsproducten aannemelijk is, moe ­
ten ook bij de monsterneming en analyse anaërobe omstandigheden worden gehandhaafd.
 2. GEGEVENS  
2.1 BEHANDELING VAN DE RESULTATEN  
Voor elk monsternemingstijdstip wordt de totale massabalans of de 
recovery (zie punt 1.7.1) van de toegevoegde radioactiviteit bere ­
kend. De resultaten worden als percentage van de toegevoegde radio ­
activiteit gerapporteerd. De verdeling van de radioactiviteit tussen water en sediment wordt voor elk monsternemingstijdstip als con ­
centratie en als percentage gerapporteerd.
 
De halveringstijd, de DT  50 en eventueel de DT  75 en de DT  90 van de 
teststof worden samen met hun betrouwbaarheidsgrenzen (zie punt 
1.7.3) berekend. Informatie over de snelheid waarmee de teststof uit het water en het sediment verdwijnt, kan met behulp van geschikte 
evaluatiehulpmiddelen worden verkregen. Deze kunnen variëren van 
het gebruik van kinetiek van de pseudo-eerste orde en empirische technieken voor de bepaling van de optimale curve waarbij grafische of numerieke oplossingen worden toegepast, tot complexere evalua ­
ties met behulp van bijvoorbeeld modellen met een of meer com ­
partimenten. Voor nadere bijzonderheden wordt verwezen naar de desbetreffende gepubliceerde literatuur (35)(36)(37).
 
Alle benaderingen hebben hun sterke en zwakke punten en lopen 
qua complexiteit sterk uiteen. Wanneer wordt uitgegaan van kinetiek 
van de eerste orde, worden de afbraak- en distributieprocessen wel ­
licht te zeer vereenvoudigd, maar wanneer dit mogelijk is levert dit een parameter op (de snelheidsconstante of halveringstijd) die ge ­
makkelijk te begrijpen is en bruikbaar is voor simulatiemodellen en 
de berekening van geraamde milieuconcentraties. Empirische bena ­
deringen of lineaire transformaties kunnen leiden tot curves die beter bij de gegevens aansluiten en maken derhalve een betere bepaling van de halveringstijd, de DT
 50 en eventueel de DT  75 en de DT  90 
mogelijk. Het nut van de afgeleide constanten is echter beperkt. 
Compartimentmodellen kunnen een aantal nuttige constanten voor een risicobeoordeling opleveren, die de afbraaksnelheid in verschil ­
lende compartimenten en de verdeling van de chemische stof be ­
schrijven. Ze moeten ook worden gebruikt voor de bepaling van 
de snelheidsconstanten voor de vorming en afbraak van belangrijke omzettingsproducten. In alle gevallen moet er een motivering voor de keuze van de methode worden gegeven en moet degene die het 
experiment uitvoert grafisch en/of statistisch aantonen hoe goed de 
curve en de gegevens bij elkaar aansluiten.
 
3. RAPPORTAGE  
3.1 TESTVERSLAG  
In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
De teststof:  
— de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de 
structuurformule (waarin de plaats van het label of de labels wordt aangegeven als radioactief gelabeld materiaal wordt ge ­
bruikt) en relevante fysisch-chemische eigenschappen;
 
— de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof;  
— de radiochemische zuiverheid van een gelabelde stof en de mo ­
laire activiteit (indien van toepassing).  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referentiestoffen:  
— de chemische naam en de structuur van referentiestoffen die voor 
de karakterisering en/of de identificatie van omzettingsproducten 
worden gebruikt.  
Voor de test gebruikte sedimenten en wateren:  
— de locatie en een beschrijving van de monsternemingsplaats(en) 
voor het aquatische sediment met indien mogelijk een vermel ­
ding van de verontreiniging in het verleden:  
— alle informatie over de verzameling, de opslag (als ze zijn opge ­
slagen) en de acclimatisering van water/sedimentsystemen:  
— de kenmerken van de sediment/watermonsters, zoals vermeld in 
de tabel onder punt 1.8.2.2.  
De testomstandigheden:  
— het gebruikte testsysteem (bijvoorbeeld doorstroomsysteem, bio ­
meter-type, wijze van ventilatie, roermethode, watervolume, sedi ­
mentmassa, dikte van de water- en de sedimentlaag, afmetingen van de testhouders enz.);
 
— de toevoeging van de teststof aan het systeem: gebruikte con ­
centratie bij de test, aantal replicaat- bepalingen en controlebepa ­
lingen en de wijze waarop de teststof is toegevoegd (bijvoorbeeld 
een eventueel gebruik van een oplosmiddel) enz.;  
— de incubatietemperatuur:  
— de monstememingstijdstippen:  
— de extractiemethoden met de efficiëntie en de analysemethoden 
met de aantoonbaarheidsgrens;  
— de methoden voor de karakterisering/identificatie van de omzet ­
tingsproducten:  
— afwijkingen van het testprotocol of de testomstandigheden tijdens 
het onderzoek.  
De resultaten:  
— onbewerkte gegevens van representatieve analyses (alle onbe ­
werkte gegevens moeten in het GLP-archief worden bewaard);  
— de herhaalbaarheid en gevoeligheid van de gebruikte analyse ­
methoden;  
— de recovery (onder punt 1.7.1 wordt vermeld welke percentages 
voor een geldig onderzoek gehaald moeten worden);  
— tabellen met de resultaten, uitgedrukt als percentage van de ge ­
bruikte dosis en in mg.kg  -1 in het water, het sediment en het 
totale systeem (alleen percentage), voor de teststof en eventueel de omzettingsproducten en de niet-extraheerbare radioactiviteit;
 
— de massabalans gedurende en aan het eind van het onderzoek:  
— een grafische voorstelling van de omzetting in het water, in het 
sediment en in het totale systeem (met inbegrip van de minera ­
lisatie);  
— de mineralisatiesnelheid;  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— de halveringstijd, de DT  50 en eventueel de DT  75 en de DT  90 voor 
de teststof en eventueel de belangrijke omzettingsproducten, met 
vermelding van de betrouwbaarheidsgrenzen, in het water, in het sediment en in het totale systeem;
 
— een evaluatie van de omzettingskinetiek van de teststof en even ­
tueel de belangrijke omzettingsproducten;  
— de voorgestelde omzettingsroute, indien van toepassing;  
— een bespreking van de resultaten.  
4. REFERENTIES  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Ger ­
many.  
(2) Commission for registration of pesticides: Application for re ­
gistration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 
(a). The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary gui ­
deline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in 
natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) — Anaerobic and aerobic. Canada, pp 35-37.
 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Che ­
mistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic 
aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.  
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 
12: Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC — Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C-la­
belled model surfactants. Water Research 21, 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Mo ­
nograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17  th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollu ­
tion Control Federation, Washington D.C.  
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential mea ­
surements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on tes ­
ting procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity As ­
sessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. 
Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide bio ­
transformation in surface waters: multivariate analyses of en ­
vironmental factors at field sites. Water Research 31, 2858- 
2868.  
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol., 329-338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation- extraction method.  
(28) Beelen, P. van and F. van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
 
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597- 3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic che ­
micals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.
 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues 11. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues 1. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 33, 47- 60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference — Pest and Diseases, pp 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
Bijlage 1  
RICHTSNOEREN VOOR HET AËROBE EN HET ANAËROBE 
TESTSYSTEEM  
Het aërobe testsysteem  
Het in deze testmethode beschreven aërobe testsysteem bestaat uit een aërobe 
waterlaag (met een zuurstofconcentratie die normaal tussen 7 en 10 mg.l  -1 ligt) 
en een sedimentlaag die aan het oppervlak aëroob en onder het oppervlak anaë ­
roob is (met een gemiddelde redoxpotentiaal (E  h ) in het anaërobe gedeelte van 
het sediment die normaal tussen - 80 en - 190 mV ligt). In elke incubatie- 
opstelling wordt vochtige lucht over het wateroppervlak geleid om voor vol ­
doende zuurstof in de ruimte boven het water te zorgen.  
Het anaërobe testsysteem  
Voor het anaërobe testsysteem is de testprocedure in grote lijnen gelijk aan de 
voor het aërobe systeem geschetste procedure, behalve dat in elke incubatie- 
opstelling vochtige stikstof over het wateroppervlak wordt geleid om voor vol ­
doende stikstof in de ruimte boven het water te zorgen. Het sediment en het water worden als anaëroob beschouwd zodra de redoxpotentiaal (E
 h ) lager dan 
- 100 mV is.  
Bij de anaërobe test wordt voor de bepaling van de mineralisatie ook het vrij ­
gekomen kooldioxide en methaan gemeten.  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
Bijlage 2  
VOORBEELD VAN EEN DOORSTROOMOPSTELLING
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
Bijlage 3  
VOORBEELD VAN EEN BIOMETERAPPARAAT
  ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
Bijlage 4  
VOORBEELD VOOR DE BEREKENING VAN DE HOEVEELHEID 
TESTSTOF DIE AAN EEN TESTHOUDER WORDT TOEGEVOEGD  
Inwendige diameter van de cylinder: = 8 cm 
Diepte waterkolom zonder sediment: = 12 cm Oppervlak waterspiegel: 3,142 × 42 = 50,3 cm
 2 
Toe te voegen hoeveelheid: 500 g teststof/ha 
komt overeen met 5 ug/cm  2 
Totaal in μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Aanpassing van de hoeveelheid op basis van 
een diepte van 100 cm: 
12 x 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Volume van de waterkolom: 50,3 × 12 = 603 ml Concentratie in water: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml of 50 μg/l
 ▼B 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROBE MINERALISATIE IN OPPERVLAKTEWATER — 
SIMULATIETEST VOOR BIOLOGISCHE AFBRAAK  
1. METHODE  
Deze methode is gelijkwaardig aan OESO TG 309 (2004) (1)  
1.1. INLEIDING  
Deze test is bedoeld om de tijdsduur te meten voor de bio ­
logische afbraak van een teststof in lage concentratie in aeroob natuurlijk water en de waarnemingen te kwantificeren in de 
vorm van kinetische snelheidsweergaven. De simulatietest is 
een laboratorium-schudkolfstest om de snelheden te bepalen voor de aerobe biologische afbraak van organische stoffen in 
monsters van natuurlijk oppervlaktewater (zoet, brak of zout). 
De test is gebaseerd op ISO/DIS 14592-1 (2) en bevat ook elementen van de testmethoden C.23 en C.24 (3)(4). Eventueel kan bij lange testduren een semicontinue in plaats van een 
ladingsgewijze procedure worden gevolgd, teneinde achteruit ­
gang van de testmicrokosmos te vermijden. Het doel van de simulatietest is in de eerste plaats het bepalen van de mine ­
ralisatie van de teststof in oppervlaktewater, en mineralisatie 
vormt de basis voor de weergave van de afbraakkinetiek. 
Een optioneel tweede doel van de test is het verkrijgen van gegevens over de primaire afbraak en de vorming van belang ­
rijke omzettingsproducten. Het aantonen van de omzettingspro ­
ducten en zo mogelijk het bepalen van de concentraties daar ­
van is met name van belang voor stoffen die zeer langzaam gemineraliseerd worden (bv. bij halveringstijden van de totale resthoeveelheid
 14 C van meer dan 60 dagen). Vanwege analy ­
segrenzen moeten voor het aantonen en bepalen van belang ­
rijke omzettingsproducten normaal gesproken hogere concentra ­
ties van de teststof (bv. > 100 μg/l) worden gebruikt.  
Een lage concentratie in deze test betekent een concentratie 
(bv. minder dan 1 μg/l tot 100 μg/l) die laag genoeg is 
om zeker te zijn dat de biologische afbraakkinetiek die uit 
de test komt overeenkomt met de verwachte kinetiek in het 
milieu. Vergeleken met de totale hoeveelheid biologisch af ­
breekbare koolstofsubstraten in het voor de test gebruikte wa ­
ter, zal de in lage concentratie aanwezige teststof optreden als 
secundair substraat. Dit betekent een verwachte biologische af ­
braakkinetiek van de eerste orde („non-growth” kinetiek) en een mogelijke afbraak van de teststof door „cometabolisme”. Eerste-ordekinetiek houdt in dat de afbraaksnelheid (mg/l/dag) 
evenredig is met de gaandeweg afnemende substraatconcentratie. 
Bij echte eerste-ordekinetiek is de specifieke afbraaksnelheids ­
constante k onafhankelijk van de tijd en de concentratie. Dat wil zeggen: k verandert niet merkbaar in de loop van een 
experiment en evenmin met de concentratieverhoging tussen de 
experimenten. De specifieke afbraaksnelheidsconstante is per definitie gelijk aan de relatieve concentratieverandering per tijdseenheid: k = (1/C) · (dC/dt). Hoewel onder de voor ­
geschreven omstandigheden normaal gesproken eerste-ordekine ­
tiek te verwachten valt, kunnen er bepaalde situaties zijn waarin een andere kinetiek moet worden toegepast. Afwijkin ­
gen van eerste-ordekinetiek kunnen bijvoorbeeld worden waar ­
genomen als overdrachtsverschijnselen zoals de diffusiesnelheid, 
in plaats van de biologische reactiesnelheid, de beperkende factor zijn voor de biologische afbraaksnelheid. De gegevens kunnen echter zo goed als altijd worden beschreven door 
pseudo-eerste-ordekinetiek met een concentratie-afhankelijke snel ­
heidsconstante.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Voorafgaand aan de test dient informatie beschikbaar te zijn over de 
biologische afbreekbaarheid van de teststof bij hogere concentraties 
(bv. uit standaard screeningtests) en over de niet-biologische afbreek ­
baarheid, omzettingsproducten en relevante fysisch-chemische eigen ­
schappen, zodat deze kunnen worden gebruikt bij het opzetten van 
het experiment en het interpreteren van de resultaten. Met behulp 
van met  14 C gemerkte teststoffen en de bepaling van de fasever ­
deling van  14 C aan het einde van de test kan de totale biologische 
afbreekbaarheid worden bepaald. Bij gebruik van een ongemerkte 
teststof kan de totale biologische afbreekbaarheid alleen worden ge ­
schat indien een hogere concentratie is getest en alle belangrijke omzettingsproducten bekend zijn.
 
1.2. DEFINITIES  
Primaire biologische afbraak : De structurele verandering (omzet ­
ting) van een chemische verbinding door micro-organismen die leidt 
tot het verlies van chemische identiteit.  
Functionele biologische afbraak : De structurele verandering (om ­
zetting) van een chemische verbinding door micro-organismen die leidt tot het verlies van een bepaalde eigenschap.
 
Totale aerobe biologische afbraak : De afbraak van een chemische 
verbinding door micro-organismen, in aanwezigheid van zuurstof, tot kooldioxide, water en anorganische zouten van alle andere aan ­
wezige elementen (mineralisatie) en de productie van nieuwe bio ­
massa en organische microbiële biosyntheseproducten.
 
Mineralisatie : De afbraak van een chemische verbinding of orga ­
nisch materiaal door micro-organismen, in aanwezigheid van zuur ­
stof, tot kooldioxide, water en anorganische zouten van alle andere 
aanwezige elementen.  
Aanlooptijd : De tijdsduur vanaf de aanvang van de test, totdat 
adaptatie van de afbrekende micro-organismen heeft plaatsgevonden 
en de biologische afbraak van een chemische verbinding of orga ­
nisch materiaal tot een detecteerbaar niveau is gestegen (bv. 10 % van de theoretische maximale afbraak, of lager, afhankelijk van de gevoeligheid van de meettechniek).
 
Maximale biologische afbraak : Het percentage biologische afbraak 
van een chemische verbinding of organisch materiaal in een test waarboven geen verdere biologische afbraak plaatsvindt tijdens de test.
 
Primair substraat : Een verzameling natuurlijke koolstof- en ener ­
giebronnen die zorgen voor de groei en de instandhouding van de microbiële biomassa.
 
Secundair substraat : Een substraatcomponent die in een dermate 
lage concentratie aanwezig is dat de afbraak ervan slechts verwaar ­
loosbare hoeveelheden koolstof en energie levert aan de werkzame micro-organismen in verhouding tot de hoeveelheden koolstof en energie die worden geleverd door de belangrijkste substraatcom ­
ponenten (het primaire substraat).
 
Afbraaksnelheidsconstante : Een eerste-orde of pseudo-eerste-orde 
kinetische snelheidsconstante, k (d  –1 ), die de snelheid van het af ­
braakproces weergeeft. Voor een ladingsgewijs experiment wordt k 
geschat aan de hand van het begindeel van de afbraakcurve die 
wordt verkregen na afloop van de aanlooptijd.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Halveringstijd, t  1/2 (d): Term die wordt gebruikt om de snelheid van 
een eerste-ordereactie aan te geven. Het is het tijdsinterval dat over ­
eenkomt met een afname van de concentratie met een factor 2. Het verband tussen de halveringstijd en de afbraaksnelheidsconstante wordt gegeven door de vergelijking t
 1/2 = ln2/k.  
Disappearance Time 50, DT  50 (d): Term die wordt gebruikt om de 
uitkomst van biologische-afbraaktests te kwantificeren. De DT  50 is 
het tijdsinterval, met inbegrip van de aanlooptijd, dat nodig is om 
een afbraak van 50 procent te bereiken.  
Aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens : De aantoon ­
baarheidsgrens is de laagste concentratie van een stof waarbij de 
identiteit van de stof nog kan worden onderscheiden van analytische artefacten. De bepaalbaarheidsgrens is de laagste concentratie van een stof waarbij de concentratie nog met aanvaardbare nauwkeurig ­
heid kan worden bepaald.
 
Opgeloste organische koolstof (DOC) : Dat deel van de organische 
koolstof in een watermonster dat niet door een bepaalde faseschei ­
ding kan worden verwijderd (bv. centrifugering bij 40 000 ms  –2 
gedurende 15 min of membraanfiltratie met membranen met een 
poriediameter van 0,2 μm-0,45 μm). 
Totale organische  14 C-activiteit (TOA) : De totale  14 C-activiteit die 
is toe te schrijven aan organische koolstof.  
Opgeloste organische  14 C-activiteit (DOA) : De totale  14 C-activiteit 
die is toe te schrijven aan de opgeloste organische koolstof.  
Deeltjesvormige organische  14 C-activiteit (POA) : De totale  
14 C-activiteit die is toe te schrijven aan organische koolstofdeeltjes.  
1.3. TOEPASBAARHEID VAN DE TEST  
Deze simulatietest is toepasbaar op niet-vluchtige of licht vluchtige 
organische stoffen, in lage concentraties. Bij gebruik van niet-lucht ­
dichte kolven (bv. afgesloten met watten), kunnen stoffen met een constante van de wet van Henry van minder dan ongeveer 1 Pa·m
 3 /­
mol (zo’n 10  –5 atm·m  3 /mol) worden beschouwd als in de praktijk 
niet-vluchtig. Bij gebruik van afgesloten kolven met gasruimte is het mogelijk om licht vluchtige stoffen te testen (met een constante van de wet van Henry < 100 Pa·m
 3 /mol of < 10  –3 atm·m  3 /mol) zonder 
dat er verliezen optreden uit het testsysteem. Als niet de juiste voor ­
zorgsmaatregelen worden genomen kan verlies van met  14 C ge­
merkte stoffen optreden wanneer de CO  2 wordt verwijderd. In der ­
gelijke situaties kan het noodzakelijk zijn de CO  2 weg te vangen in 
een extern CO  2 -absorbtiesysteem (voor directe  14 CO 2 -bepaling; zie 
aanhangsel 3). Voor de bepaling van de biologische afbraakkinetiek moeten de teststofconcentraties lager zijn dan de oplosbaarheid van de teststof in water. Er zij evenwel gewezen dat de literatuurwaarden 
voor de oplosbaarheid in water aanzienlijk hoger kunnen zijn dan de 
oplosbaarheid van de teststof in natuurlijk water. Eventueel kan de oplosbaarheid van bijzonder slecht in water oplosbare teststoffen worden vastgesteld met gebruik van het te testen natuurlijke water.
 
De methode kan worden gebruikt voor het simuleren van de bio ­
logische afbraak in oppervlaktewater dat vrij is van grove deeltjes („pelagische test”) of in troebel oppervlaktewater dat bv. afkomstig 
kan zijn van een water/sediment-grensvlak („gesuspendeerd-sedi ­
menttest”).
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. PRINCIPE VAN DE TEST  
De test wordt ladingsgewijs uitgevoerd door de teststof te incuberen 
met hetzij alleen oppervlaktewater („pelagische test”) of oppervlakte ­
water dat is aangevuld met 0,01 g drooggewicht/l gesuspendeerde 
vaste stof/sediment („gesuspendeerd-sedimenttest”) ter simulatie van 
een waterlichaam met gesuspendeerde vaste stof of geresuspendeerd sediment. De concentratie gesuspendeerde vaste stof/sediment in de lagere regionen van dit interval is kenmerkend voor het meeste 
oppervlaktewater. De testkolven worden in het donker, bij omge ­
vingstemperatuur, onder aerobe omstandigheden en onder roeren geïncubeerd. Om de afbraakkinetiek te bepalen moeten ten minste 
twee verschillende teststofconcentraties worden gebruikt, die met een 
factor 5 tot 10 van elkaar verschillen en het verwachte concentra ­
tiebereik in het milieu vertegenwoordigen. De maximale teststofcon ­
centratie mag niet boven 100 μg/l liggen, maar maximale testcon ­
centraties van 10 μg/l of lager verdienen de voorkeur, opdat de 
biologische afbraak volgens eerste-ordekinetiek verloopt. De laagste concentratie mag niet hoger zijn dan 10 μg/Al, maar laagste test ­
concentraties van 1-2 μg/l of lager verdienen de voorkeur. Normaal 
gesproken kan een adequate analyse van zulke lage concentraties 
worden bereikt met behulp van in de handel verkrijgbare met
 14 C 
gemerkte stoffen. Vanwege analytische grenzen is het dikwijls on ­
mogelijk de teststofconcentratie met de vereiste nauwkeurigheid te 
meten indien met een teststof concentratie ≤ 100 μg/l wordt gewerkt 
(zie de tweede alinea van paragraaf 1.7.2). Hogere teststofconcentra ­
ties (> 100 μg/l en soms > 1 mg/l) kunnen worden gebruikt voor het 
aantonen en bepalen van belangrijke omzettingsproducten of als een 
specifieke analysemethode met een lage aantoonbaarheidsgrens niet 
beschikbaar is. Als getest wordt met hoge teststofconcentraties, kan het zijn dat de resultaten niet kunnen worden gebruikt voor het schatten van de eerste-orde afbraakconstante en halveringstijd, daar 
de afbraak waarschijnlijk niet volgens eerste-ordekinetiek verloopt.
 
De afbraak wordt gevolgd met gewenste tijdsintervallen, door hetzij 
de resthoeveelheid  14 C te meten, hetzij de restconcentratie van de 
teststof, bij gebruik van een specifieke chemische analyse. Door het meest stabiele deel van het molecuul te merken met
 14 C kan de 
totale mineralisatie worden bepaald, terwijl door een minder stabiel 
deel van het molecuul met  14 C te merken, en door specifieke analyse 
te gebruiken, enkel de primaire biologische afbraak kan worden bepaald. Het meest stabiele deel bevat echter niet noodzakelijkerwijs 
het relevante functionele gedeelte van het molecuul (het gedeelte dat 
in verband gebracht kan worden met een specifieke eigenschap zoals toxiciteit, bioaccumulatie, etc.). Als dit het geval is kan het wenselijk zijn een teststof te gebruiken die met
 14 C gemerkt is in het functi ­
onele deel, teneinde de eliminatie van de specifieke eigenschap te 
volgen.  
1.5. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
In deze test kunnen zowel radioactief gemerkte teststoffen als onge ­
merkte teststoffen worden gebruikt.  14 C-merking wordt aanbevolen 
en normaal gesproken moet het meest stabiele deel/moeten de meest stabiele delen van het molecuul worden gemerkt (zie ook 
paragraaf 1.4). Voor stoffen die meer dan een aromatische ring be ­
vatten worden bij voorkeur in elke ring een of meerdere koolstofa ­
tomen met
 14 C gemerkt. Bovendien moeten bij voorkeur aan weers ­
zijden van gemakkelijk afbreekbare bindingen een of meer koolsto ­
fatomen met  14 C worden gemerkt. De chemische en/of radioche ­
mische zuiverheid van de teststof moet > 95 % zijn. De specifieke activiteit bij radioactief gemerkte stoffen is bij voorkeur ongeveer 50 μCi/mg (1,85 MBq) of meer, ten behoeve van de
 14 C-metingen 
in tests met lage beginconcentraties. Over de teststof moeten de 
volgende gegevens beschikbaar zijn:  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— de oplosbaarheid in water [Methode A.6];  
— de oplosbaarheid in organisch(e) oplosmiddel(en) (voor stoffen 
die met een oplosmiddel worden toegevoegd of met een lage 
oplosbaarheid in water);  
— de dissociatieconstante (pKa) als de stof onderhevig is aan pro ­
tonering of deprotonering [OECD TG 112] (5);  
— de dampspanning [Methode A.4] en de constante van de wet van 
Henry;  
— de chemische stabiliteit in water en in het donker (hydrolyse) 
[Methode C.7].  
Bij het testen van slecht in water oplosbare stoffen in zeewater kan 
het ook nuttig zijn om de uitzoutingsconstante (of „constante van 
Setsjenov”) K  s te weten, die wordt gedefinieerd als log (S/S’) = K  s 
C m , waarin S en S’ staan voor de oplosbaarheid van de stof in 
respectievelijk zoet water en zout water, en C  m voor de molaire 
zoutconcentratie.  
Als de test wordt uitgevoerd als „gesuspendeerd-sedimenttest” moe ­
ten de volgende gegevens beschikbaar zijn:  
— de verdelingscoëfficiënt n-octanol/water [Methode A.8];  
— de adsorptiecoëfficiënt [Methode C.18];  
Andere gegevens die van pas kunnen komen zijn o.a.:  
— de concentratie in het milieu, indien bekend of geschat;  
— de toxiciteit van de teststof voor micro-organismen [Methode 
C.11];  
— de „gemakkelijke” en/of inherente biologische afbreekbaarheid 
[Methoden C.4 A-F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5)];  
— de aerobe en anaerobe biologische afbreekbaarheid in de bodem 
en de omzetting in aquatische sedimentsystemen [Methoden C.23, C.24].
 
1.6. REFERENTIESTOF  
Als referentiestof moet een stof worden gebruikt die normaal gespro ­
ken onder aerobe omstandigheden gemakkelijk wordt afgebroken 
(bv. aniline of natriumbenzoaat). Het verwachte tijdsinterval voor 
de afbraak van aniline en natriumbenzoaat is over het algemeen minder dan 2 weken. Met de referentiestoffen kan men zich ervan vergewissen dat de microbiële activiteit van het testwater zich binnen 
bepaalde grenzen bevindt, d.w.z. dat het water een actieve microbiële 
populatie bevat.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KWALITEITSCRITERIA  
1.7.1.  Recovery  
Onmiddellijk na de toevoeging van de teststof moet de aanvankelijke 
testconcentratie worden gecontroleerd door meting van de  14 C-acti­
viteit of door chemische analysemethoden in geval van ongemerkte 
stoffen, en dit dient ten minste in duplo te gebeuren. Dit verschaft informatie over de toepasbaarheid en de herhaalbaarheid van de analysemethode en over de homogeniteit van de teststofverdeling. 
Normaal gesproken wordt in de verdere analysen van gegevens de 
gemeten aanvankelijke
 14 C-activiteit of teststofconcentratie gebruikt 
in plaats van de nominale concentratie, aangezien verliezen door 
sorptie of doseringsfouten daarmee worden opgevangen. Bij een 
met  14 C gemerkte teststof wordt de recovery aan het einde van het 
experiment gegeven door de massabalans (zie de laatste alinea van paragraaf 1.8.9.4). Idealiter moet de massabalans voor radioactief 
gemerkte stoffen tussen 90 % en 110 % liggen, terwijl de nauwkeu ­
righeid van de analyse een aanvankelijke recovery tussen 70 % en 110 % moet opleveren voor ongemerkte teststoffen. Deze berei ­
ken moeten worden opgevat als streefcijfers en moeten niet worden 
gebruikt als criteria voor de aanvaardbaarheid van de test. Eventueel 
kan de nauwkeurigheid van de analyse worden bepaald voor de teststof bij een lagere concentratie dan de beginconcentratie en voor belangrijke omzettingsproducten.
 
1.7.2.  Herhaalbaarheid en gevoeligheid van de analysemethode  
De herhaalbaarheid van de analysemethode (inclusief de efficiëntie 
van de extractie in het begin) voor de kwantitatieve bepaling van de 
teststof, en indien van toepassing de omzettingsproducten, moet wor ­
den gecontroleerd aan de hand van een analyse in vijfvoud van individuele extracties van het wateroppervlak.
 
De aantoonbaarheidsgrens van de analysemethode voor de teststof en 
voor de omzettingsproducten moet mogelijkerwijs zodanig zijn dat ten minste 1 % van de aanvankelijk aan het testsysteem toegevoegde 
hoeveelheid kan worden aangetoond. De bepaalbaarheidsgrens mag 
niet hoger zijn dan 10 % van de toegevoegde concentratie. Omwille van de chemische analyse van veel organische stoffen en hun om ­
zettingsproducten is het dikwijls noodzakelijk dat de teststof in een 
betrekkelijk hoge concentratie wordt toegevoegd, d.w.z. > 100 μg/l.
 
1.8. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE  
1.8.1.  Apparatuur  
De test kan worden uitgevoerd in conische of cilindervormige kolven 
met de vereiste inhoud (bv. 0,5 of 1,0 liter), die worden afgesloten met een siliconen of rubberen stop, of in CO
 2 -dichte serumflessen 
(bv. met butylrubberen septum). Een andere optie is de test uit te 
voeren met behulp van meerdere kolven en bij elk monsterinterval een hele kolf te nemen, ten minste in tweevoud (zie de laatste alinea van paragraaf 1.8.9.1). Voor niet-vluchtige, ongemerkte teststoffen is 
gasdichte afsluiting niet nodig; een losse prop watten ter voorkoming 
van verontreiniging vanuit de lucht is afdoende (zie tweede alinea van paragraaf 1.8.9.1). Licht vluchtige stoffen moeten worden getest in een biometersysteem, waarbij het wateroppervlak zachtjes wordt 
geroerd. Om bacteriële verontreiniging uit te sluiten, kunnen de va ­
ten eventueel worden gesteriliseerd door ze voor gebruik te verhitten of te autoclaveren. Daarnaast wordt de volgende standaard-labora ­
toriumapparatuur gebruikt:
 
— een schudtafel of magneetroerders om de testkolven voortdurend 
in beweging te houden;  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— een centrifuge;  
— een pH-meter;  
— een troebelheidsmeter voor nephelometrische troebelheidsmetin ­
gen; 
— een oven of magnetronoven voor drooggewichtbepalingen;  
— membraanfiltratieapparaat;  
— autoclaaf of oven voor hittesterilisatie van het glaswerk;  
— voorzieningen om met  14 C gemerkte stoffen te werken;  
— apparatuur om de  14 C-activiteit te bepalen in CO  2 -absorptieoplos ­
singen en indien nodig in sedimentmonsters;  
— analyseapparatuur voor de bepaling van de teststof (en referen ­
tiestoffen), bij gebruik van specifieke chemische analyse (bv. gaschromatografie of hogedrukvloeistofchromatografie).
 
1.8.2.  Stockoplossingen van de teststof  
Voor de bereiding van de stockoplossingen van de teststof en de 
referentiestoffen wordt gedeïoniseerd water gebruikt (zie de eerste 
alinea van paragraaf 1.8.7). Het gedeïoniseerde water mag geen 
stoffen bevatten die toxisch zijn voor micro-organismen, en de hoe ­
veelheid opgeloste organische koolstof (DOC) mag niet hoger zijn 
dan 1 mg/l (6).  
1.8.3.  Verzameling en vervoer van het oppervlaktewater  
De monsternemingsplaats voor het verzamelen van het oppervlakte ­
water moet in iedere gegeven situatie worden uitgekozen in over ­
eenstemming met het doel van de test. Bij het kiezen van monster ­
nemingsplaatsen moet rekening gehouden worden met stoffen die wellicht in het verleden vanuit de landbouw, industrie of huishou ­
dens op die plaats zijn terechtgekomen. Als bekend is dat een aqua ­
tisch milieu in de voorgaande vier jaar verontreinigd is met de test ­
stof of structureel analoge verbindingen, moet het niet worden ge ­
bruikt voor het verzamelen van testwater, tenzij men juist onderzoek 
wil doen naar de afbraaksnelheden op eerder blootgestelde locaties. 
De pH en de temperatuur van het water moeten op de monsterne ­
mingsplaats worden gemeten. Bovendien moeten de monsterne ­
mingsdiepte en het uiterlijk van het watermonster (bv. de kleur en 
de troebelheid) worden opgeschreven (zie paragraaf 3). Om aerobe 
omstandigheden aan te tonen moet de zuurstofconcentratie en/of de redoxpotentiaal in het water en in de bovenste sedimentlaag worden gemeten, tenzij dit vanzelf spreekt op grond van het uiterlijk en 
ervaringen met de plaats uit het verleden. Het oppervlaktewater 
moet worden vervoerd in een grondig gereinigde bak. Tijdens het vervoer mag de temperatuur van het monster de testtemperatuur niet significant overschrijden. Indien het vervoer langer duurt dan 2 tot 
3 uur wordt aanbevolen het monster te koelen tot 4 °C. Het water ­
monster mag niet worden bevroren.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Opslag en behandeling van het oppervlaktewater  
De test moet bij voorkeur binnen één dag na de monsterneming 
worden gestart. Als opslag van het water nodig is moet de opslag ­
periode zoveel mogelijk worden beperkt en in geen geval meer dan 4 
weken duren. Het watermonster moet tot gebruik op 4 °C worden 
gehouden met beluchting. Voor gebruik moeten de grove deeltjes worden verwijderd, bv. door filtratie met een nylonfilter met een maaswijdte van ca. 100 μm, met een grof papierfilter, of door be ­
zinking.
 
1.8.5.  Behandeling van water aangevuld met sediment (optioneel)  
Voor de gesuspendeerd-sedimenttest wordt sediment uit de boven ­
ste sedimentlaag toegevoegd aan de kolven met natuurlijk water (dat is gefilterd ter verwijdering van grove deeltjes, zoals beschre ­
ven in paragraaf 1.8.4), zodat een suspensie wordt verkregen; de 
concentratie van gesuspendeerde vaste stof moet tussen 0,01 en 1 g/l 
liggen. Dit oppervlaktesediment moet afkomstig zijn van dezelfde monsternemingsplaats als het watermonster. Afhankelijk van het specifieke aquatische milieu kan het oppervlaktesediment geken ­
merkt worden door een hoog organisch koolstofgehalte (2,5- 
7,5 %) en een fijne textuur of door een laag organisch koolstofge ­
halte (0,5-2,5 %) en een grove textuur (3). Het oppervlaktesediment moet als volgt worden behandeld: steek meerdere sedimentkernen 
met behulp van een buisje van doorzichtig plastic, verwijder on ­
middellijk na de monsterneming de bovenste aerobe lagen (van het oppervlak tot een diepte van maximaal 5 mm) en voeg de sedi ­
mentkernen samen. Het resulterende sedimentmonster moet worden 
vervoerd in een bak met een grote luchtruimte om het sediment 
onder aerobe omstandigheden te houden (als het vervoer langer duurt dan 2-3 uur moet gekoeld worden tot 4 °C). Het sediment ­
monster moet in het testwater worden gesuspendeerd in een ver ­
houding van 1:10 en op 4 °C worden gehouden met beluchting tot 
gebruik. Als opslag van het sediment nodig is moet de opslagperi ­
ode zoveel mogelijk worden beperkt en in geen geval meer dan 4 weken duren.
 
1.8.6.  Semicontinue procedure (optioneel)  
Bij een lange aanlooptijd voordat een significante afbraak van de 
teststof kan worden gemeten kan een langdurige incubatie (van 
meerdere maanden) noodzakelijk zijn. Indien dit bekend is van eer ­
dere testen met een bepaalde stof, kan de test worden gestart door middel van een semicontinue procedure, waarbij een deel van het testwater of de testsuspensie periodiek kan worden vernieuwd (zie 
aanhangsel 2). Een tweede mogelijkheid is dat de normale ladings ­
gewijze test kan worden veranderd in een semicontinue test, indien er gedurende een testperiode van ongeveer 60 dagen met de ladings ­
gewijze procedure geen afbraak van de teststof is bereikt (zie de 
tweede alinea van paragraaf 1.8.8.3).
 
1.8.7.  Toevoeging van de teststof (of referentiestof)  
Van stoffen met een hoge oplosbaarheid in water (> 1 mg/l) en een 
lage vluchtigheid (constante van de wet van Henry < 1 Pa·m  3 /mol of 
< 10  –5 atm·m  3 /mol) kan een stockoplossing worden bereid in ge ­
deïsoniseerd water (zie paragraaf 1.8.2); het vereiste volume van de stockoplossing wordt aan de testvaten toegevoegd om de gewenste 
concentratie te bereiken. Het volume aan toegevoegde stockoplossing 
moet tot een praktisch minimum worden beperkt (< 10 % van het uiteindelijke vloeistofvolume, indien mogelijk). Een andere pro ­
cedure is om de teststof in een groter volume testwater op te lossen, 
dat kan worden beschouwd als alternatief voor het gebruik van or ­
ganische oplosmiddelen.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Indien noodzakelijk kunnen stockoplossingen van niet-vluchtige 
stoffen met een lage oplosbaarheid in water worden bereid met 
behulp van een vluchtig organisch oplosmiddel, maar de aan het testsysteem toegevoegde hoeveelheid oplosmiddel mag niet hoger zijn dan 1 % v/v en mag geen nadelige effecten hebben op de 
microbiële activiteit. Het oplosmiddel mag de stabiliteit van de 
teststof in water niet beïnvloeden. Het oplosmiddel moet tot een uiterst kleine hoeveelheid worden beperkt, zodat het de DOC-con ­
centratie van het testwater of de testsuspensie niet significant ver ­
hoogt. Dit moet worden gecontroleerd door middel van een stof ­
specifieke analyse of, indien mogelijk, een DOC-analyse (6). Ge ­
zorgd moet worden dat de overgebrachte hoeveelheid oplosmiddel tot het strikt noodzakelijke wordt beperkt, en dat de hoeveelheid 
teststof in het uiteindelijke volume testwater kan oplossen. Andere 
technieken om de teststof aan de testvaten toe te voegen kunnen worden gebruikt zoals beschreven in (7) en (8). Wanneer voor de toevoeging van de teststof een organisch oplosmiddel wordt ge ­
bruikt, dient een oplosmiddelcontrolegroep met testwater zonder 
toevoegingen en testwater met toegevoegde referentiestof op gelijke wijze te worden behandeld als de actieve testvaten waaraan teststof in oplosmiddel is toegevoegd. Het doel van deze oplosmiddelcon ­
trolegroep is om mogelijke negatieve effecten van het oplosmiddel 
op de microbiële populatie te onderzoeken aan de hand van de afbraak van de referentiestof.
 
1.8.8.  Testomstandigheden  
1.8.8.1.  Testtemperatuur  
De incubatie dient in het donker plaats te vinden (bij voorkeur) of in 
diffuus licht, en bij gecontroleerde temperatuur (± 2 °C), hetzij de temperatuur in het veld, hetzij een standaardtemperatuur van 20- 
25 °C. De temperatuur in het veld kan de daadwerkelijke monster ­
temperatuur zijn op het monsternemingstijdstip of de gemiddelde temperatuur op de monsternemingsplaats.
 
1.8.8.2.  Schudden/roeren  
Om de deeltjes en micro-organismen in suspensie te houden moet 
continu worden geschud of geroerd. Dit bevordert eveneens de zuur ­
stofoverdracht uit de luchtruimte naar de vloeistof voor een adequate handhaving van de aerobe omstandigheden. Plaats de kolven op een 
schudtafel (schudsnelheid ongeveer 100 omwentelingen/min) of ge ­
bruik magneetroerders. Het schudden/roeren moet continu zijn, maar niet harder dan noodzakelijk om de suspensie homogeen te houden.
 
1.8.8.3.  Testduur  
De test mag normaal gesproken niet langer duren dan 60 dagen, 
tenzij de semicontinue procedure met periodieke vernieuwing van 
de testoplossing wordt toegepast (zie paragraaf 1.8.6 en aanhangsel 2). De testduur voor de ladingsgewijze test kan echter worden verlengd tot maximaal 90 dagen, indien de afbraak van de 
teststof binnen de eerste 60 dagen is begonnen. De afbraak wordt 
met geschikte tijdsintervallen gemonitord door bepaling van de res ­
terende
 14 C-activiteit of van de  14 CO 2 -ontwikkeling (zie 
paragraaf 1.8.9.4), en/of door chemische analyse 
(paragraaf 1.8.9.5). De incubatietijd moet lang genoeg zijn om het 
afbraakproces te kunnen berekenen. De mate van afbraak moet bij voorkeur de 50 % overschrijden, en voor langzaam afbreekbare stoffen moet de mate van afbraak afdoende zijn (normaal gesproken 
groter dan 20 % afbraak) om het schatten van een kinetische afbraak ­
snelheidsconstante mogelijk te maken.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Op gezette tijden moeten de pH en de zuurstofconcentratie in het 
testsysteem worden gemeten, tenzij eerdere ervaringen met soortge ­
lijke tests met water- en sedimentmonsters van dezelfde monsterne ­
mingsplaats dergelijke metingen overbodig maken. Onder sommige omstandigheden kan de metabolisering van primaire substraten bij 
veel hogere concentraties in het water of het sediment mogelijk 
leiden tot een zodanige CO
 2 -ontwikkeling en zuurstofdepletie dat 
de experimentele omstandigheden gedurende de test significant wor ­
den gewijzigd.  
1.8.9.  Procedure  
1.8.9.1.  Bereiding van de kolven voor de pelagische test  
Vul de testkolven met een geschikt volume van het testwater, ten 
hoogste ongeveer een derde van het kolfvolume en ten minste zo’n 
100 ml. Bij gebruik van meerdere kolven (zodat bij iedere mon ­
sterneming een hele kolf kan worden genomen) is het geschikte testwatervolume eveneens zo’n 100 ml, aangezien kleine monster ­
volumes invloed kunnen hebben op de lengte van de aanlooptijd. De 
teststof wordt toegevoegd vanuit een stockoplossing, zoals beschre ­
ven in de paragrafen 1.8.2 en 1.8.7. Voor de bepaling van de af ­
braakkinetiek en de berekening van de afbraaksnelheidsconstante moeten ten minste twee verschillende teststofconcentraties worden 
gebruikt die een factor 5 tot 10 van elkaar verschillen. Beide geko ­
zen concentraties moeten lager zijn dan 100 μg/l en bij voorkeur in 
het bereik liggen van < 1-10 μg/l.
 
Sluit de kolven af met lucht- en CO  2 -dichte stoppen of deksels. Voor 
niet  –14 C-gemerkte niet-vluchtige testverbindingen zijn losse propjes 
watten ter voorkoming van verontreiniging vanuit de lucht afdoende 
(zie paragraaf 1.8.1), mits van alle belangrijke afbraakproducten be ­
kend is dat ze niet vluchtig zijn en bij gebruik van indirecte CO  2 - 
bepaling (zie aanhangsel 3).  
Incubeer de kolven bij de gekozen temperatuur (zie 
paragraaf 1.8.8.1). Monsters voor chemische analyse en  14 C-metin­
gen moeten worden genomen bij het begin van de test (d.w.z. voor ­
dat de afbraak begint; zie paragraaf 1.7.1) en vervolgens met ge ­
schikte tijdsintervallen in de loop van de test. De monsterneming kan worden uitgevoerd door submonsters af te nemen (bv. aliquots van 
5 ml) uit elke replicaat-kolf, of bij elke monsterneming een hele kolf 
te nemen. De mineralisatie van de teststof kan zowel indirect als direct worden bepaald (zie aanhangsel 3). Over het algemeen zijn gedurende de afbraakfase (d.w.z. na de aanlooptijd) minimaal vijf 
monsternemingen vereist voor een betrouwbare schatting van de 
snelheidsconstante, tenzij voor snel afbreekbare stoffen kan worden verantwoord dat drie monsternemingen voldoende zijn. Omdat bij stoffen die minder snel worden afgebroken gemakkelijk meer metin ­
gen kunnen worden gedaan tijdens de afbraakfase moeten meer 
meetpunten worden gebruikt voor de schatting van k. Vanwege de uiteenlopende biologische afbraaksnelheden kan geen vast tijds ­
schema worden gegeven voor de monsterneming; bij langzame af ­
braak wordt evenwel aanbevolen om eens per week een monster te 
nemen. Als de teststof snel wordt afgebroken moet gedurende de eerste drie dagen eens per dag een monster worden genomen en daarna eens in de twee of drie dagen. Onder bepaalde omstandig ­
heden, zoals bij zeer snel gehydrolyseerde stoffen, kan het nodig zijn 
om met intervallen van uren te bemonsteren. Aanbevolen wordt om voorafgaand aan de test een verkennende test uit te voeren om de geschikte monsternemingsintervallen te bepalen. Als er monsters be ­
schikbaar moeten zijn voor verdere specifieke analyse, is het aan te 
bevelen meerdere monsters te nemen en de te analyseren monsters na afloop van het experiment uit te kiezen volgens een „achterwaartse” strategie, d.w.z. de laatste monsters worden als eerste geanalyseerd 
(zie de tweede alinea van paragraaf 1.8.9.5 voor advies over de 
stabiliteit van monsters tijdens opslag).
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Aantal kolven en monsters  
Gebruik voldoende testkolven om te kunnen beschikken over:  
— testkolven; ten minste twee kolven voor elke teststofconcentratie 
(maar bij voorkeur minimaal drie) of meerdere testkolven voor iedere concentratie, als bij elke monsterneming een hele kolf wordt genomen (symbool: F
 T ); 
— testkolven voor de berekening van de massabalans; ten minste 
twee kolven voor iedere testconcentratie (symbool: F  M ); 
— blancocontrole, zonder teststof; ten minste één blanco testkolf 
met alleen testwater (symbool: F  B ); 
— referentiecontrole; twee kolven met referentiestof (bv. aniline of 
natriumbenzoaat, concentratie: 10 μg/l) (symbool:F  C ). De refe ­
rentiecontrole is bedoeld ter bevestiging van een minimum aan microbiële activiteit. Indien gewenst kan een radioactief gemerkte referentiestof worden gebruikt, ook wanneer de afbraak van de 
teststof wordt gemonitord met behulp van chemische analyse;
 
— steriele controle; een of twee kolven met gesteriliseerd testwater 
voor het onderzoeken of er mogelijk niet-biologische afbraak of 
ander niet-biologisch verlies van teststof plaatsvindt (symbool: F
 S ). De biologische activiteit kan worden gestopt door het test ­
water te autoclaveren (20 min bij 121 °C), of door een giftige 
stof toe te voegen (bv. natriumazide (NaN  3 ) in een concentratie 
van 10-20 g/l, kwikchloride (HgCl  2 ) in een concentratie van 
100 mg/l of formaline in een concentratie van 100 mg/l), of door bestraling met gammastraling. Bij gebruik van HgCl
 2 
moet dit worden weggegooid als toxisch afval. Voor water waar ­
aan een grote hoeveelheid sediment is toegevoegd, is het niet gemakkelijk steriele omstandigheden te bereiken; in dat geval wordt aanbevolen meermaals te autoclaveren (bv. driemaal). 
Houd er rekening mee dat de sorptie-eigenschappen van het sedi ­
ment kunnen veranderen als gevolg van het autoclaveren;
 
— oplosmiddelcontroles, met testwater en testwater met referentie ­
stof; twee kolven worden behandeld met dezelfde hoeveelheid oplosmiddel en volgens dezelfde procedure als voor de toevoe ­
ging van de teststof. Het doel hiervan is om, door de afbraak van 
de referentiestof te bepalen, na te gaan of het oplosmiddel een 
nadelige invloed heeft.
 
Bij het ontwerpen van de test moet de onderzoeker rekening houden 
met het relatieve belang van hogere experimentele replicatie ten opzichte van een groter aantal monsternemingtijdstippen. Het exacte aantal benodigde kolven zal afhangen van de methode die wordt 
gebruikt voor het meten van de afbraak (zie de derde alinea van 
paragraaf 1.8.9.1; paragraaf 1.8.9.4 en aanhangsel 3).
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Uit iedere testkolf moeten op elk monsternemingstijdstip twee sub ­
monsters worden genomen (bv. aliquots van 5 ml). Als meerdere 
kolven worden gebruikt om hele kolven te kunnen nemen, moeten hiervoor op elk monsternemingstijdstip ten minste twee kolven wor ­
den bestemd (zie eerste alinea van paragraaf 1.8.9.1).
 
1.8.9.3.  Bereiding van de kolven voor de gesuspendeerd-sedimenttest [opti ­
oneel]  
Voeg de noodzakelijke volumes testwater en, indien nodig, sediment 
toe aan de testvaten (zie paragraaf 1.8.5). De bereiding van de vaten voor de gesuspendeerd-sedimenttest is hetzelfde als bij de pelagische test (zie de paragrafen 1.8.9.1 en 1.8.9.2). Gebruik bij voorkeur 
serumflessen of gelijkvormige kolven. Plaats de afgesloten kolven 
horizontaal op een schudtafel. Uiteraard moeten open kolven voor niet
 –14 C-gemerkte, niet-vluchtige stoffen rechtop worden geplaatst; 
in dit geval wordt magnetisch roeren met behulp van glas-gecoate 
roerstaafjes aanbevolen. Indien nodig kunnen de kolven worden be ­
lucht om daadwerkelijk aerobe omstandigheden te handhaven.  
1.8.9.4.  Radiochemische bepalingen  
De 14 CO 2 -ontwikkeling kan indirect en direct worden gemeten (zie 
aanhangsel 3). Voor de indirecte  14 CO 2 -bepaling wordt gekeken naar 
het verschil tussen de aanvankelijke  14 C-activiteit in het testwater of 
de testsuspensie en de totale restactiviteit op het monsternemingstijd ­
stip, zoals die wordt gemeten na het aanzuren van het monster tot pH 2-3 en het verwijderen van de CO
 2 . Op die manier wordt de 
anorganische koolstof verwijderd en is de gemeten restactiviteit af ­
komstig van organisch materiaal. Indirecte  14 CO 2 -bepaling moet niet 
worden gebruikt als tijdens de omzetting van de teststof belangrijke vluchtige omzettingsproducten worden gevormd (zie aanhangsel 3). 
Indien mogelijk moet de
 14 CO 2 -ontwikkeling direct worden gemeten 
(zie aanhangsel 3), op elk monsternemingstijdstip in ten minste één testkolf; met deze werkwijze kan zowel de massabalans als het bio ­
logisch afbraakproces worden gecontroleerd, maar zij is alleen toe ­
pasbaar bij tests die worden uitgevoerd met afgesloten kolven.
 
Als de  14 CO 2 -ontwikkeling direct wordt gemeten tijdens de test, 
moeten hiervoor aan het begin van de test meer kolven worden klaargemaakt. Directe
 14 CO 2 -bepaling wordt aanbevolen als tijdens 
de omzetting van de teststof belangrijke vluchtige omzettingsproduc ­
ten worden gevormd. Bij elk meetpunt worden de aanvullende test ­
kolven aangezuurd tot pH 2-3 en wordt  14 CO 2 opgevangen in een 
intern of extern absorbens (zie aanhangsel 3).  
Eventueel kunnen de concentraties van de met  14 C gemerkte teststof 
en van de belangrijke omzettingsproducten worden bepaald met be ­
hulp van radiochromatografie (dunnelaagchromatografie, RAD-TLC) of HPLC met radiochemische detectie.
 
Eventueel kan de faseverdeling van de resterende radioactiviteit (zie 
aanhangsel 1), de resterende referentiestof en de omzettingsproducten 
worden bepaald.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Aan het einde van de test moet de massabalans worden bepaald aan 
de hand van directe  14 CO 2 -meting, met behulp van aparte testkolven 
waaruit in de loop van de test geen monsters zijn genomen (zie aanhangsel 3).
 
1.8.9.5.  Specifieke chemische analyse  
Indien een gevoelige analysemethode beschikbaar is, kan de 
biologische afbraak worden bepaald door het meten van de 
totale restconcentratie van de teststof, in plaats van het ge ­
bruik van radioactieve merking. Bij gebruik van een radioactief gemerkte teststof (om de totale mineralisatie te meten) kunnen specifieke chemische analysemethoden parallel hieraan worden 
uitgevoerd om nuttige aanvullende informatie te verkrijgen en 
om de procedure te controleren. Specifieke chemische analyse ­
methoden kunnen ook worden gebruikt om de bij de afbraak van de teststof gevormde omzettingsproducten te meten. Dit 
word aanbevolen voor gemineraliseerde stoffen met halverings ­
tijden van meer dan 60 dagen. De concentraties van de test ­
stof en de omzettingsproducten moeten op elk monsternemings ­
tijdstip worden gemeten en gerapporteerd (als concentratie en 
als percentage van de toegevoegde hoeveelheid). Over het al ­
gemeen moeten bij elk monsternemingstijdstip de omzettings ­
producten worden geïdentificeerd die in een concentratie ≥ 10 % van de toegevoegde concentratie worden gedetecteerd. 
Ook voor omzettingsproducten waarvan de concentraties tijdens 
het onderzoek voortdurend toenemen moet identificatie worden overwogen, zelfs als de concentraties ervan de hierboven ge ­
geven grens niet bereiken, aangezien dit kan wijzen op per ­
sistentie. Ook het analyseren van omzettingsproducten in ste ­
riele controlekolven verdient te worden overwogen, als snelle niet-biologische omzetting van de teststof (bv. hydrolyse) mo ­
gelijk wordt geacht. Of het nodig is omzettingsproducten te 
kwantificeren en te identificeren moet van geval tot geval 
worden overwogen en moet worden verantwoord in het ver ­
slag. Extractietechnieken met organische oplosmiddelen moeten worden toegepast in overeenstemming met de aanwijzingen die 
in de desbetreffende analyseprocedures worden gegeven.
 
Indien de analyse binnen 24 uur wordt uitgevoerd (hetgeen de 
voorkeur verdient) moeten alle monsters bij 2 tot 4 °C lucht ­
dicht worden opgeslagen. Voor langere opslag moeten de mon ­
sters worden bevroren onder – 18 °C of chemisch worden geconserveerd. Aanzuring is af te raden als methode om mon ­
ster te conserveren, daar aangezuurde monsters instabiel kunnen 
zijn. Indien de monsters niet binnen 24 uur worden geanaly ­
seerd en langduriger worden bewaard, moet een onderzoek worden uitgevoerd naar de stabiliteit bij opslag, om de stabi ­
liteit van de betreffende verbindingen bij opslag onder – 
18 °C of onder geconserveerde omstandigheden aan te tonen. 
Indien de analysemethode extractie met oplosmiddelen of vaste- fase-extractie (SPE) omvat, moet de extractie onmiddellijk na de monsterneming of na gekoelde opslag van het monster 
gedurende maximaal 24 uur worden uitgevoerd.
 
Afhankelijk van de gevoeligheid van de analysemethode kunnen 
grotere monstervolumes dan in paragraaf 1.8.1 aangegeven nodig zijn. De test kan gemakkelijk worden uitgevoerd met testvolumes 
van een liter in kolven van 2-3 liter, waardoor het mogelijk wordt 
monsters te nemen van ca. 100 ml.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. BEHANDELING VAN DE GEGEVENS  
2.1.1.  Grafiek van de gegevens  
Rond de monsternemingstijdstippen af op een geheel aantal uren 
(tenzij de stof in een tijdspanne van minuten een substantiële afbraak 
ondergaat) maar niet op een geheel aantal dagen. Zet de geschatte restactiviteit van de teststof (voor met
 14 C gemerkte stoffen) of de 
restconcentratie (voor ongemerkte stoffen) uit tegen de tijd in zowel 
een lineaire grafiek als in een semilogaritmische grafiek (zie de 
figuren 1a en 1b). Vergelijk, als afbraak heeft plaatsgevonden, de resultaten van de F
 T -kolven met die van de F  S -kolven. Als de ge ­
middelde resultaten van de kolven met teststof (F  T ) en de steriele 
kolven (F  S ) minder dan 10 % van elkaar verschillen, kan worden 
aangenomen dat de waargenomen afbraak hoofdzakelijk niet-bio ­
logisch is. Als de afbraak in de F  S -kolven lager is, kunnen de cijfers 
worden gebruikt om de resultaten van de F  T -kolven te corrigeren 
(door aftrekking) om de mate van biologische afbraak te schatten. Wanneer optionele analysen van de omzettingsproducten zijn uitge ­
voerd, moeten naast een grafiek van de afbraak van de teststof 
grafieken van de vorming en afbraak van die omzettingsproducten 
worden geleverd.
 
Schat de aanloopfase t  L uit de afbraakcurve (de semilogaritmische 
grafiek) door het lineaire gedeelte te extrapoleren tot nul afbraak of 
anders door de tijd te bepalen tot ongeveer 10 % afbraak (zie de figuren 1a en 1b). Schat aan de hand van de semilogaritmische grafiek de eerste-orde snelheidsconstante k, en de bijbehorende stan ­
daarddeviatie door lineaire regressie van de natuurlijke logaritme van 
de resterende
 14 C-activiteit/teststofconcentratie tegen de tijd. Met 
name bij  14 C-metingen moeten alleen gegevens worden gebruikt 
vanuit het eerste lineaire gedeelte van de grafiek na afloop van de 
aanlooptijd, en verdient het de voorkeur te kiezen voor weinig ge ­
gevens die representatief zijn boven veel gegevens met een grotere onzekerheid. Onder onzekerheid vallen hierbij de fouten die inherent zijn aan het aanbevolen directe gebruik van de meetwaarden voor de 
resterende
 14 C-activiteit (zie hieronder). Indien de afbraak een twee ­
fasig patroon volgt, kan het soms relevant zijn om twee verschillende waarden voor de snelheidsconstante te berekenen. Hiertoe worden twee verschillende fasen van de afbraakcurve gedefinieerd. De snel ­
heidsconstante k en de halveringstijd t
 ½ = ln2/k moeten voor iedere 
replicaat-kolf apart worden berekend, wanneer submonsters uit de ­
zelfde kolf worden genomen, dan wel berekend op grond van ge ­
middelde waarden, wanneer op ieder monsternemingstijdstip hele 
kolven worden genomen (zie de laatste alinea van 
paragraaf 1.8.9.2). Bij gebruik van de eerstgenoemde werkwijze moeten zowel de snelheidsconstante en de halveringstijd voor iedere replicaat-kolf apart worden gerapporteerd als de gemiddelde waarden 
met standaardfout. Indien hoge teststofconcentraties zijn gebruikt kan 
het zijn dat de afbraakcurve aanzienlijk afwijkt van een rechte lijn (semilogaritmische grafiek) en dat eerste-ordekinetiek niet van toe ­
passing is. Het vaststellen van een halveringstijd heeft dan ook geen 
betekenis. Voor een beperkt gegevensbereik kan echter pseudo-eer ­
ste-ordekinetiek worden toegepast, waarmee de Disappearance Time 50 (DT
 50 ; de tijd die nodig is voor 50 % afbraak) kan worden 
geschat. Er moet evenwel rekening mee worden gehouden dat de 
DT 50 slechts een beschrijving geeft van een bepaalde reeks gegevens 
en niet kan worden gebruikt voor het voorspellen van het afbraak ­
verloop buiten dat gegevensbereik. Analysehulpmiddelen om de sta ­
tistische berekeningen en het fitten van de curven te vergemakkelij ­
ken zijn algemeen beschikbaar en het gebruik van dergelijke pro ­
grammatuur wordt aanbevolen.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Als specifieke chemische analysen worden uitgevoerd moeten de 
snelheidsconstanten en halveringstijden voor de primaire afbraak 
op dezelfde wijze worden geschat als hierboven beschreven voor de totale mineralisatie. Indien de primaire afbraak het beperkende proces is, is het soms mogelijk meetpunten uit het gehele afbraak ­
verloop te gebruiken, aangezien de metingen direct zijn, in tegen ­
stelling tot de metingen van de
 14 C-activiteit.  
Bij gebruik van met  14 C gemerkte stoffen moet in ieder geval aan 
het einde van de test een massabalans worden opgesteld, uitgedrukt 
als percentage van de toegevoegde beginconcentratie.  
2.1.2.  Restactiviteit  
Wanneer het met  14 C gemerkte gedeelte van een organische stof 
biologisch wordt afgebroken wordt het grootste deel van de  14 C 
omgezet in  14 CO 2 , terwijl een ander deel gebruikt wordt voor groei 
van de biomassa en/of synthese van extracellulaire metabolieten. Bij 
totale biologische afbraak van een stof wordt dus niet 100 % van de koolstof uit die stof omgezet in
 14 CO 2 . De  14 C die in biosynthese ­
producten wordt ingebouwd komt vervolgens langzaam vrij in de 
vorm van  14 CO 2 als gevolg van „secundaire mineralisatie”. Daardoor 
zullen grafieken van de resterende organische  14 C-activiteit (gemeten 
na het wegvangen van de CO  2 ) of de geproduceerde  14 CO 2 tegen de 
tijd „tailing” vertonen na voltooiing van de afbraak. Dit bemoeilijkt 
de kinetische interpretatie van de gegevens en daarom kan normaal 
gesproken alleen het begindeel van de curve (na het einde van de aanlooptijd tot aan het bereiken van ongeveer 50 % afbraak) worden gebruikt voor het schatten van de afbraaksnelheidsconstante. Als de 
teststof is afgebroken is de totale resterende organische
 14 C-activiteit 
altijd hoger dan de  14 C-activiteit van de overgebleven intacte teststof. 
Als de afbraak van de teststof volgens een eerste-ordereactie verloopt en een constante fractie α wordt gemineraliseerd tot CO
 2 , zal het 
begin van de helling van de  14 C-verdwijningscurve (de totale hoe ­
veelheid  14 C tegen de tijd) een factor α maal de helling van de 
overeenkomstige curve voor de teststofconcentratie zijn (of, om pre ­
cies te zijn, het met  14 C gemerkte gedeelte van de teststof). Wanneer 
de metingen van de totale organische  14 C-activiteit ongecorrigeerd 
worden gebruikt, zal de berekende afbraaksnelheidsconstante dan ook een voorzichtige schatting zijn. Procedures om de teststofcon ­
centraties te schatten aan de hand van de gemeten radiochemische 
activiteiten op basis van uiteenlopende vereenvoudigende aannamen 
zijn beschreven in referenties (2), (9), (10) en (11). Dergelijke pro ­
cedures zijn heel eenvoudig toe te passen voor gemakkelijk afbreek ­
bare stoffen.
 
2.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN  
Als de gevonden k onafhankelijk is van de toegevoegde concentratie 
(d.w.z. als de berekende k ongeveer gelijk is bij verschillende test ­
stofconcentraties) mag worden aangenomen dat de eerste-orde snel ­
heidsconstante representatief is voor de gebruikte testomstandighe ­
den, te weten de teststof, het watermonster en de testtemperatuur. In 
hoeverre generalisatie of extrapolatie van de resultaten tot andere systemen geoorloofd is moet op basis van deskundigheid worden beoordeeld. Bij gebruik van een hoge teststofconcentratie, waardoor 
de afbraak niet volgens eerste-ordekinetiek verloopt, kunnen de ge ­
gevens niet worden gebruikt voor een rechtstreekse schatting van een eerste-orde snelheidsconstante of bijbehorende halveringstijd. De ge ­
gevens uit een test met een hoge teststofconcentratie kunnen echter 
nog altijd bruikbaar zijn voor het schatten van de totale mineralisatie 
en/of het aantonen en bepalen van omzettingsproducten.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Indien de snelheden van andere verliesprocessen dan biologische 
afbraak (bv. hydrolyse of vervluchtiging) bekend zijn kunnen deze 
worden afgetrokken van de netto in de test waargenomen verlies ­
snelheid voor een ruwe schatting van de biologische afbraaksnelheid. Gegevens over hydrolyse kunnen bijvoorbeeld worden verkregen uit 
de steriele controle of uit een parallelle test met hogere teststofcon ­
centratie.
 
Indirecte of directe  14 CO 2 -bepaling (paragraaf 1.8.9.4 en 
aanhangsel 3) is alleen te gebruiken om te meten in welke mate de teststof wordt gemineraliseerd tot CO
 2 . Voor het analyseren van 
de concentraties van de met  14 C gemerkte teststof en de vorming van 
belangrijke omzettingsproducten kan radiochromatografie (RAD- TLC) of HPLC worden gebruikt (zie de derde alinea van paragraaf 1.8.9.4). Om een directe schatting van de halveringstijd 
mogelijk te maken mogen er geen belangrijke omzettingsproducten 
(gedefinieerd als ≥ 10 % van de toegevoegde hoeveelheid teststof) 
aanwezig zijn. Indien belangrijke omzettingsproducten volgens deze definitie aanwezig zijn is een gedetailleerde evaluatie van de gege ­
vens vereist, in de vorm van bijvoorbeeld herhaalde uitvoering van 
de test en/of identificatie van de omzettingsproducten (zie de eerste alinea van paragraaf 1.8.9.5), tenzij de levensloop van de omzettings ­
producten voldoende kan worden beoordeeld op basis van ervaring 
(bv. informatie over de afbraakroute). Als het aandeel van de teststof 
dat wordt omgezet in CO
 2 varieert (met een grote afhankelijkheid 
van de concentratie van de teststof of andere beschikbare substraten, de testomstandigheden en de microbiële kolonie), is deze test niet 
geschikt voor een rechtstreekse schatting van de totale biologische 
afbraak, zoals in een DOC-afnametest; de uitkomst is echter van gelijke orde als van een respirometrische test. De mineralisatiegraad zal dus minder zijn dan of gelijk aan het minimale niveau van totale 
biologische afbraak. Voor een completer beeld van de totale bio ­
logische afbraak (mineralisatie en opname in biomassa) moet aan het einde van de test de faseverdeling van de
 14 C worden geanaly ­
seerd (zie aanhangsel 1). De  14 C in de deeltjesfase zal bestaan uit de  
14 C die is opgenomen in de bacteriële biomassa en de  14 C die aan 
organische deeltjes is gesorbeerd.  
2.3. VALIDITEIT VAN DE TEST  
Indien de referentiestof niet binnen het verwachte tijdsinterval wordt 
afgebroken (voor aniline en natriumbenzoaat normaal gesproken bin ­
nen twee weken), moet de validiteit van de test worden betwijfeld en nader worden onderzocht, of anders moet de test worden herhaald 
met een nieuw watermonster. In een ISO ringtest van de methoden, 
waaraan zeven laboratoria op verschillende plaatsen in Europa heb ­
ben meegedaan, werden geadapteerde afbraaksnelheidsconstanten voor aniline gevonden van 0,3 tot 1,7 d
 –1 met een gemiddelde van 
0,8 d  –1 bij 20  o C en een standaardfout van ± 0,4 d  –1 
(t ½ = 0,9 dagen). De aanlooptijd was over het algemeen 1 tot 7 
dagen. Van de onderzochte watermonsters werd een bacteriële bio ­
massa gerapporteerd van 10  3 -10 4 kolonievormende eenheden (kve) 
per ml. De afbraaksnelheden in voedselrijke Midden-Europese water ­
monsters waren groter dan in oligotrofe Noord-Europese watermon ­
sters, hetgeen mogelijk toe te schrijven is aan het verschil in trofi ­
sche status of voorgaande blootstelling aan chemicaliën.  
De totale recovery (massabalans) aan het einde van het experiment 
moet voor radioactief gemerkte stoffen tussen 90 % en 110 % liggen, 
terwijl voor ongemerkte teststoffen de aanvankelijke recovery aan het begin van het experiment tussen 70 % en 110 % moet liggen. De aangegeven bereiken moeten evenwel worden opgevat als streef ­
cijfers en moeten niet worden gebruikt als criteria voor de aanvaard ­
baarheid van de test.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. TESTVERSLAG  
Het type onderzoek — pelagische of gesuspendeerd-sedimenttest — 
moet duidelijk worden aangegeven in het testverslag, waarin even ­
eens ten minste de volgende gegevens moeten worden opgenomen:  
Teststof en referentiestoffen:  
— triviale namen, chemische namen (IUPAC-namen en/of CAS-na ­
men), CAS-nummers, structuurformules (waarin de plaats van de  
14 C wordt aangegeven bij gebruik van een radioactief gemerkte 
stof) en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de test ­
stof en de referentiestoffen (zie de paragrafen 1.5 en 1.6);  
— chemische namen, CAS-nummers, structuurformules (waarin de 
plaats van de  14 C wordt aangegeven bij gebruik van een radio ­
actief gemerkte stof) en relevante fysisch-chemische eigenschap ­
pen van stoffen die zijn gebruikt als standaarden voor het aan ­
tonen en bepalen van omzettingsproducten;  
— de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof;  
— de zuiverheid van het label van gemerkte chemicaliën en molaire 
activiteit (indien van toepassing).  
Oppervlaktewater:  
Van het watermonster moeten ten minste de volgende gegevens 
worden vermeld:  
— de locatie en beschrijving van de monsternemingsplaats inclusief, 
indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis;  
— de datum en de tijd waarop het monster is verzameld;  
— het gehalte aan voedingsstoffen (totale N, ammonium, nitriet, 
nitraat, totale P, opgelost orthofosfaat);  
— de monsternemingsdiepte;  
— het uiterlijk van het watermonster (bv. kleur en troebelheid);  
— DOC-gehalte en TOC-gehalte;  
— het BZV;  
— de temperatuur en de pH op de plaats en het tijdstip van de 
monsterneming;  
— de zuurstofconcentratie of de redoxpotentiaal (alleen verplicht als 
aerobe omstandigheden niet vanzelfsprekend zijn);  
— de saliniteit of de conductiviteit (in geval van zeewater of brak 
water);  
— gesuspendeerde vaste stoffen (in geval van een troebel monster);  
— eventueel overige relevante informatie over de monsternemings ­
plaats op het tijdstip van monsterneming (bv. actuele en histori ­
sche gegevens over de stroomsnelheid van rivieren of zeestro ­
mingen, belangrijke lozingen in de nabijheid en het soort lozin ­
gen, weersomstandigheden voorafgaand aan de monsterneming);  
en optioneel:  
— microbiële biomassa (bv. directe telling met acridine oranje of 
kolonievormende eenheden);  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— anorganische koolstof;  
— chlorofyl-a-gehalte als specifieke schatting voor de algenbiomassa.  
Indien de gesuspendeerd-sedimenttest is uitgevoerd moeten boven ­
dien de volgende gegevens over het sediment worden vermeld:  
— de diepte waarop het sediment is verzameld;  
— het uiterlijk van het sediment (zoals gekleurd, modderig, siltig of 
zandig);  
— de textuur (bv. percentage grof zand, fijn zand, silt en klei);  
— het drooggewicht in g/l van de gesuspendeerde vaste stoffen, 
TOC-concentratie of gloeiverlies als maat voor het gehalte aan organisch materiaal;
 
— de pH;  
— de zuurstofconcentratie of de redoxpotentiaal (alleen verplicht als 
aerobe omstandigheden niet vanzelfsprekend zijn).  
Testomstandigheden:  
— de tijdsduur tussen monsterneming en het gebruik van het mon ­
ster in de laboratoriumtest, wijzen van bewaren van het monster, voorbewerking van het monster, uitvoeringsdata van de studies;
 
— de hoeveelheid toegevoegde teststof, testconcentratie en referen ­
tiestof;  
— de methode van toevoegen van de teststof en eventueel gebruik 
van oplosmiddelen;  
— het gebruikte volume oppervlaktewater en sediment (indien ge ­
bruikt) en het volume dat bij elk interval werd onttrokken voor analyse;
 
— een beschrijving van het gebruikte testsysteem.  
Indien niet in het donker is gewerkt: gegevens over de omstandig ­
heden van het „diffuse licht”;  
— gegevens over de gebruikte methode(n) voor het opzetten van de 
steriele controles (bv. de temperatuur, de tijd en het aantal au ­
toclaveringen);  
— de incubatietemperatuur;  
— gegevens over de analysetechnieken en de gebruikte methode(n) 
voor de radiochemische metingen, de massabalanscontrole en de metingen van de faseverdeling (indien uitgevoerd).
 
— het aantal replicatie-bepalingen.  
Resultaten:  
— de recovery (zie paragraaf 1.7.1);  
— de herhaalbaarheid en de gevoeligheid van de gebruikte analyse ­
methoden, inclusief de detectiegrens en de bepaalbaarheidsgrens 
(zie paragraaf 1.7.2);  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— alle onbewerkte gegevens (inclusief monsternemingstijdstippen) 
en berekende waarden in tabelvorm, en de afbraakcurven; ver ­
meld voor elke testconcentratie en voor elke replicaat-kolf de lineaire correlatiecoëfficiënt voor de helling van de logaritmische grafiek en een eerste-orde of pseudo-eerste-orde snelheidscon ­
stante (indien mogelijk), en de bijbehorende halveringstijd (of 
de halfwaardetijd, t
 50 ); 
— vermeld relevante waarden als gemiddelden van de waarnemin ­
gen in de individuele replicatie-bepalingen, bv. de lengte van de 
aanlooptijd, de afbraaksnelheidsconstante en de bijbehorende hal ­
veringstijd (of t  50 ); 
— kenmerk het systeem als geadapteerd of niet-geadapteerd op 
grond van het uiterlijk van de afbraakcurve en de mogelijke 
invloed van de testconcentratie;  
— de resultaten van de eindcontrole van de massabalans en de 
resultaten van faseverdelingsmetingen (indien uitgevoerd);  
— de fractie gemineraliseerde  14 C en, bij gebruik van specifieke 
analysen, de totale primaire afbraak;  
— de identificatie, de molaire concentratie en het percentage van de 
onderzochte en belangrijke omzettingsproducten (zie eerste alinea 
van paragraaf 1.8.9.5), indien van toepassing;  
— een voorgestelde omzettingsroute, indien van toepassing;  
— een bespreking van de resultaten.  
4. LITERATUUR  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
— Simulation Biodegradation Test.  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999) Water quality — Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations — Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions.
 
3. Testmethode C.23. Aerobe en anaerobe omzetting in aquatische 
sedimentsystemen.  
4. Testmethode C.24. Aerobe en anaerobe omzetting in de bodem.  
5. OESO (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6. ISO 8245 (1999). Water quality — Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic 
carbon (DOC).  
7. ISO 10634 (1995). Water quality — Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds 
for the subsequent evaluation of their biodegradability in an 
aqueous medium.  
8. OESO ontwerp (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental He ­
alth and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. 
No 22 (to be published summer 2000).  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394-401.  
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274-283.  
11. ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality 
— Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 — report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface 
water or surface water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Aanhangsel 1  
Faseverdeling van  14 C 
Ter controle van de procedure dienen de routinemetingen van de resterende 
organische  14 C-activiteit (TOA) worden aangevuld met massabalansmetingen 
door middel van een directe bepaling van de  14 CO 2 -ontwikkeling na opvanging 
van het CO  2 met een adsorbens (zie aanhangsel 3). Een positieve  14 CO 2 -vorming 
is op zichzelf direct bewijs voor biologische afbraak, daar deze niet optreedt bij niet-biologische afbraak of andere verliesmechanismen, zoals vervluchtiging en sorptie. Door meting van de verdeling van de TOA tussen de opgeloste fase (de 
opgeloste organische
 14 C-activiteit, DOA) en de deeltjesfase (deeltjesvormige 
organische  14 C-activiteit, POA), na scheiding van de deeltjes door middel van 
membraanfiltratie of centrifugatie, kan aanvullende informatie worden verkregen om het biologische afbraakgedrag verder te karakteriseren. De POA bestaat uit 
teststof die is gesorbeerd door de microbiële biomassa en aan andere deeltjes, 
naast de van teststof afkomstige koolstof die is gebruikt voor de synthese van nieuw celmateriaal en op die manier is opgenomen in de deeltjesvormige bio ­
massafractie. De vorming van opgelost met
 14 C gemerkt organisch materiaal kan 
worden geschat als de DOA aan het einde van het biologische afbraakproces 
(wanneer de curve van de afbraak tegen de tijd een plateau vertoont).  
Schat de faseverdeling van de resterende  14 C in geselecteerde monsters door deze 
te filteren met een 0,22 μm of 0,45 μm membraanfilter van een materiaal waar ­
aan geen significante adsorptie van teststof optreedt (te denken valt aan poly ­
carbonaatfilters). Als de sorptie van de teststof aan het filter te groot is om te 
verwaarlozen (hetgeen voorafgaand aan het experiment dient te worden gecon ­
troleerd) kan in plaats van filtratie centrifugatie bij hoge snelheid (2 000 g; 10 min.) worden gebruikt.
 
Met het filtraat of centrifugaat kan worden verdergegaan met de in aanhangsel 3 
beschreven procedure voor ongefilterde monsters. Los de membraanfilters op in een geschikte scintillatievloeistof en voer een telling uit volgens de gebruikelijke procedure, normaal gesproken met alleen dovingscorrectie aan de hand van de 
externe-standaard-kanaal-verhouding, of gebruik een oxidiser. Bij gebruik van 
centrifugatie: resuspendeer de pellet van de deeltjesfractie in 1-2 ml gedistilleerd water en breng dit over in een scintillatieflesje. Was vervolgens tweemaal met 1 ml gedistilleerd water en breng dit over in het scintillatieflesje. Indien nodig 
kan de suspensie voor de vloeistofscintillatietelling in een gel worden opge ­
nomen.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Aanhangsel 2  
Semicontinue procedure  
Voor voldoende afbraak van persistente stoffen kan langdurige incubatie nodig 
zijn, tot meerdere maanden. Normaal gesproken moet de test niet langer duren dan 60 dagen, tenzij de eigenschappen van het oorspronkelijke watermonster 
worden bewaard door de testsuspensie te verversen. De testduur kan evenwel 
worden verlengd tot maximaal 90 dagen zonder verversing van de testsuspensie, indien de afbraak van de teststof binnen de eerste 60 dagen is begonnen.
 
Gedurende langdurige incubatie kan de diversiteit van de microbiële kolonie 
afnemen als gevolg van uiteenlopende verliesprocessen en als gevolg van de 
mogelijke depletie van het watermonster van essentiële voedingsstoffen en pri ­
maire koolstofsubstraten. Voor een adequate bepaling van de afbraaksnelheid van stoffen die langzaam worden afgebroken wordt dan ook aanbevolen een semi ­
continue test te gebruiken. De test moet volgens een semicontinue procedure 
worden gestart als op basis van eerdere ervaring wordt verwacht dat een incu ­
batietijd van drie maanden nodig is om 20 % afbraak van de teststof te bereiken. Ook kan de normale ladingsgewijze test worden omgezet in een semicontinue test als gedurende ca. 60 testdagen volgens de ladingsgewijze procedure nog 
geen afbraak van de teststof is bereikt. Wanneer een aanzienlijke mate van 
afbraak is vastgesteld (bv. > 20 %) kan de semicontinue procedure worden gestopt en kan de test worden voortgezet als ladingsgewijs experiment.
 
In de semicontinue test wordt om de week ongeveer een derde van het volume 
van de testsuspensie vervangen door vers verzameld water met toegevoegde 
teststof in de beginconcentratie. Evenzo wordt sediment in de beginconcentratie (tussen 0,01 and 1 g/l) aan het vervangende water toegevoegd in geval van de optionele gesuspendeerd-sedimenttest. Indien de test wordt uitgevoerd met gesus ­
pendeerd vast sediment is het van belang dat het systeem ook gedurende de 
verversing van het water volledig in suspensie blijft, en dat de verblijftijd voor vaste stoffen en water gelijk is. Zo niet, dan kan de beoogde overeenkomstigheid met een homogeen aquatisch systeem zonder vastliggende fasen verloren gaan. 
Daarom verdient het bij gebruik van de semicontinue procedure de voorkeur dat 
een beginconcentratie van gesuspendeerd sediment wordt gekozen in het lagere bereik van het opgegeven interval.
 
De voorgeschreven toevoeging van de teststof betekent dat door de gedeeltelijke 
verversing van de testsuspensie de beginconcentratie van de teststof niet wordt 
overschreden en dat de adaptatie die dikwijls wordt waargenomen bij hoge test ­
stofconcentraties wordt vermeden. Doordat de procedure zowel zorgt voor her ­
nieuwde enting als voor compensatie voor de depletie van voedingsstoffen en primaire substraten, wordt de oorspronkelijke microbiële diversiteit hersteld en 
kan de testduur in principe tot in het oneindige worden verlengd. Bij gebruik van 
de semicontinue procedure is het van belang op te merken dat de overgebleven teststofconcentratie moet worden gecorrigeerd voor de bij iedere verversingspro ­
cedure toegevoegde en afgenomen hoeveelheden teststof. Voor verbindingen met 
weinig sorptie kunnen de totale en de opgeloste teststofconcentratie door elkaar 
worden gebruikt. Onder de omschreven omstandigheden (0,1-1 g vaste stof/l) is de sorptie te verwaarlozen (< 5 %) voor stoffen met een log Kow < 3 (geldig voor neutrale, lipofiele verbindingen). Dit wordt aanschouwelijk gemaakt in het 
volgende rekenvoorbeeld. Een vastestofgehalte van 0,1 g/l komt grofweg overeen 
met 10 mg koolstof per liter (koolstoffractie, f
 C = 0,01). Aannemende dat:  
log K  ow (van de teststof) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
Verdelingscoëfficiënt, K  d = f C × K  oc 
dan is opgeloste fractie van de totale concentratie (C-water (C  w )/C-totaal (C  t ): 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 × 
10 –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Aanhangsel 3  
Bepaling van  14 CO  2 
Indirecte  14 CO  2 -bepaling  
Voor routinemetingen is de indirecte methode normaal gesproken de minst tijd ­
rovende en meest nauwkeurige methode, als de teststof niet vluchtig is en niet 
wordt omgezet in vluchtige omzettingsproducten. Breng ongefilterde monsters 
van bv. 5 ml over in scintillatieflesjes. Een geschikte beginactiviteit in de mon ­
sters is 5 000 dpm-10 000 dpm (80-170 Bq) en de minimale beginactiviteit is zo'n 1 000 dpm. De CO
 2 moet worden verwijderd na aanzuring tot pH 2-3 met 1- 
2 druppels geconcentreerd H  3 PO 4 of HCl, door gedurende ½-1 uur lucht door te 
leiden, dan wel door de kolven gedurende 1-2 uur heftig te schudden (bv. op een microtiterplaatschudder) of een nacht lang zachter te schudden. De efficiëntie van de CO
 2 -verwijderingsprocedure moet worden gecontroleerd (door het doorleiden 
van lucht of het schudden te verlengen). Voeg vervolgens een geschikte scintil ­
latievloeistof voor het tellen van waterige monsters toe, homogeniseer het mon ­
ster met een rotatiemixer en bepaal de radioactiviteit aan de hand van vloeistofs ­
cintillatietelling, met aftrekking van de achtergrondactiviteit in de blancokolven 
(F B ). Tenzij het testwater sterk gekleurd is of een hoge concentratie deeltjes 
bevat, zal de doving van de monsters normaal gesproken gelijk zijn en is do ­
vingscorrectie met behulp van een externe standaard voldoende. Bij sterk ge ­
kleurd testwater kan dovingscorrectie door toevoeging van een interne standaard 
nodig zijn. Als de deeltjesconcentratie hoog is, kan het zijn dat het niet mogelijk 
is een homogene oplossing of gel te verkrijgen, of dat de doving te zeer varieert. In dat geval kan de hieronder beschreven telmethode voor testsuspensies worden gebruikt. Als de test wordt uitgevoerd als gesuspendeerd-sedimenttest zou de
 
14 CO 2 -meting indirect kunnen worden uitgevoerd door een homogeen monster 
van 10 ml te nemen van het testwater/de testsuspensie en de fasen te scheiden door centrifugatie bij een geschikte snelheid (bv. bij 40 000 m/s
 2 gedurende 
15 min). De waterige fase dient dan te worden behandeld als hierboven beschre ­
ven. De  14 C-activiteit in de deeltjesfase (POA) moet worden bepaald door het 
sediment te resuspenderen in een klein volume gedistilleerd water, dit over te brengen in scintillatieflesjes, en scintillatievloeistof toe te voegen om een gel te vormen (voor dit doel zijn speciale scintillatievloeistoffen verkrijgbaar). Afhan ­
kelijk van de aard van de deeltjes (bv. het gehalte aan organisch materiaal) kan 
het mogelijk zijn het monster gedurende de nacht te solubiliseren en vervolgens te homogeniseren met een rotatiemixer alvorens de scintillatievloeistof toe te voegen. De POA kan ook worden bepaald door bij overmaat zuurstof te ver ­
branden met behulp van een oxidiser. Bij het tellen moeten altijd interne stan ­
daarden worden doorgemeten en kan het nodig zijn dovingscorrecties uit te voeren door de interne standaard aan ieder afzonderlijk monster toe te voegen.
 
Directe  14 CO  2 -bepaling  
Bij directe  14 CO 2 -meting moeten aan het begin van de test meer kolven worden 
klaargemaakt. Bij ieder meetpunt moeten testkolven worden aangezuurd tot pH 2-3 en moet de
 14 CO 2 worden opgevangen in een intern (aangebracht in 
elke testkolf aan het begin van de test) of extern absorbens. Als adsorptiemedium 
kunnen alkali (bv. een 1 M NaOH-oplossing, of een NaOH-pil), ethanolamine 
dan wel afgeleiden van ethanolamine, of in de handel verkrijgbare adsorptie ­
systemen worden gebruikt. Voor de directe meting van het  14 CO 2 , moeten de 
kolven worden afgesloten, bv. met een butylrubberen septum.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figuur 1a  
Voorbeeld van een metrische gegevensgrafiek (de restactiviteit tegen de tijd)
  
Figuur 1b  
Voorbeeld van een logaritmische gegevensgrafiek (de ln van de restactiviteit tegen de tijd).
  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMNA  SP.: GROEIREMMINGSTEST  
1. METHODE  
Deze methode komt overeen met OESO TG 221 (2006) (1). De EU- 
instanties zijn het er algemeen over eens dat de Lemna-test voor sterk gekleurde stoffen een geschikt alternatief is voor een test met 
algen (2)(3).
 
1.1. INLEIDING  
Deze testmethode is bedoeld om de toxiciteit van stoffen te bepalen 
voor zoetwaterplanten van het geslacht  Lemna  (eendenkroos). De 
methode is gebaseerd op bestaande richtsnoeren(4)(5)(6)(7)(8)(9), maar met een aantal wijzigingen op deze methoden in verband met recent onderzoek en adviezen over bepaalde cruciale aspecten. 
De voorgestelde methode is door middel van een internationale rond ­
zendproef gevalideerd (10).
 
In deze testmethode worden toxiciteitstests beschreven met  Lemna 
gibba  en Lemna minor , die beide uitgebreid zijn bestudeerd en waar ­
voor bovengenoemde normen zijn verschenen. De taxonomie van  
Lemna  spp. is lastig en wordt gecompliceerd doordat er een breed 
scala van fenotypen bestaat. Hoewel er bij  Lemna  sprake kan zijn 
van genetische variabiliteit bij de respons op toxische stoffen, zijn er momenteel onvoldoende gegevens over deze bron van variabiliteit 
om het gebruik van een specifieke kloon voor deze testmethode aan 
te kunnen bevelen. Er dient te worden opgemerkt dat de test niet axenisch wordt uitgevoerd, maar dat er in bepaalde fasen van de testprocedure maatregelen worden genomen om besmetting door an ­
dere organismen tot een minimum te beperken.
 
Tests met verversing (semistatisch en doorstroom) en zonder verver ­
sing (statisch) van de testoplossing worden gedetailleerd beschreven. 
Afhankelijk van de doelstellingen van de test en de voorschriften in de regelgeving wordt aanbevolen het gebruik van semistatische en doorstroommethoden te overwegen, bijvoorbeeld voor stoffen die ten 
gevolge van verdamping, afbraak onder invloed van licht, neerslaan 
of biologische afbraak snel uit de oplossing verdwijnen. Zie (11) voor een nadere leidraad.
 
1.2. DEFINITIES  
In de context van deze testmethode worden de volgende definities en 
afkortingen gebruikt:  
Biomassa : het drooggewicht van het levende materiaal in een popu ­
latie. Bij deze test worden meestal vervangende eenheden voor bio ­
massa gemeten, zoals aantal schijfjes of schijfoppervlak, en ook deze 
eenheden kunnen bij gebruik van de term „biomassa” worden be ­
doeld.  
Chlorose : gele verkleuring van schijfweefsel.  
Doorstroomtest : een test waarbij de testoplossing continu wordt 
ververst.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : de concentratie van de in het testmedium opgeloste teststof die 
binnen een bepaalde blootstellingsperiode (die expliciet moet worden 
vermeld als deze afwijkt van de volledige of normale duur van de test) leidt tot een afname van de groei van  Lemna  met × % (bv. 
50 %). Om ondubbelzinnig aan te geven of een EC-waarde geba ­
seerd is op de groeisnelheid of de opbrengst, worden de symbolen 
„E
 s C” voor de groeisnelheid en „E  o C” voor de opbrengst gebruikt, 
gevolgd door de gebruikte meetvariabele, bv. E  s C (aantal schijfjes).  
Fenotype : de waarneembare kenmerken van een organisme die door 
de interactie van de genen met het milieu worden bepaald.  
Gebocheldheid : schijfjes die er gebocheld of gezwollen uitzien.  
Groei : een toename van de meetvariabele, bv. aantal schijfjes, 
drooggewicht, natgewicht of schijfoppervlak, gedurende de testperi ­
ode. 
Groeisnelheid (gemiddelde specifieke groeisnelheid) : de logarit ­
mische toename van de biomassa gedurende de blootstellingsperiode.  
Kloon : een organisme of cel, door ongeslachtelijke voortplanting 
ontstaan uit één individu. Individuen uit één kloon zijn derhalve 
genetisch identiek.  
Kolonie : een combinatie van aan elkaar vastzittende moeder- en 
dochterschijfjes (meestal 2 tot 4). Soms ook plant genoemd.  
LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste geteste 
concentratie waarbij wordt waargenomen dat de stof binnen een bepaalde blootstellingstijd in vergelijking met de controle tot een statistisch significante afname van de groei (p < 0,05) leidt. Alle 
testconcentraties boven de LOEC moeten echter een schadelijk effect 
hebben dat ten minste gelijk is aan het bij de LOEC waargenomen effect. Wanneer niet aan deze twee voorwaarden kan worden vol ­
daan, moet een volledige toelichting worden gegeven op de wijze 
waarop de LOEC (en dus de NOEC) is bepaald.
 
Meetvariabelen : een type variabelen dat wordt gemeten voor de 
uitdrukking van het eindpunt van de test met behulp van een of 
meer verschillende responsvariabelen. Bij deze methode zijn aantal 
schijfjes, schijfoppervlak, versgewicht en drooggewicht meetvariabe ­
len. 
Monocultuur : een cultuur met één plantensoort.  
Necrose : sterfte van schijfjesweefsel (dat daardoor wit of met water 
doordrenkt wordt).  
NOEC (No Observed Effect Concentration) : de testconcentratie 
die direct onder de LOEC ligt.  
Opbrengst : de waarde van een meetvariabele om de biomassa uit te 
drukken aan het eind van de blootstellingstijd, verminderd met de waarde van de meetvariabele aan het begin van de blootstellingstijd.
 
Responsvariabele : een variabele voor de bepaling van de toxiciteit, 
met uiteenlopende berekeningsmethoden afgeleid van de gemeten 
variabelen voor de beschrijving van de biomassa. Voor deze test ­
methode worden de responsvariabelen groeisnelheid en opbrengst afgeleid van meetvariabelen zoals aantal schijfjes, schijfoppervlak, 
versgewicht of drooggewicht.
 
Schijfje : een individuele „bladachtige” structuur van een eenden ­
kroosplant. Het is de kleinste eenheid, d.w.z. een individu dat zich kan voortplanten.
 
Semistatische (verversing) test : een test waarbij de testoplossing op 
specifieke tijdstippen gedurende de test periodiek wordt ververst.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Statische test : een testmethode waarbij de testoplossing gedurende 
de test niet wordt ververst.  
Testeindpunt : de algemene factor waarvan het de bedoeling is dat 
deze door de teststof in vergelijking met de controle zal veranderen. Het eindpunt van deze testmethode is groeiremming, die kan worden uitgedrukt door verschillende responsvariabelen die op een of meer 
meetvariabelen gebaseerd zijn.
 
Testmedium : het volledige synthetische groeimedium waarin de 
testplanten gedurende de blootstelling aan de teststof groeien. De teststof wordt normaal gesproken in het testmedium opgelost.
 
1.3. PRINCIPE VAN DE TEST  
Exponentieel groeiende plantenculturen van het geslacht  Lemna  krij­
gen de gelegenheid om gedurende zeven dagen in verschillende con ­
centraties van de teststof als monocultuur te groeien. Het doel van de 
test is om op basis van bepalingen van gekozen meetvariabelen de 
effecten van de stof op de vegetatieve groei gedurende deze periode kwantitatief te bepalen. De primaire meetvariabele is het aantal schijfjes. Daarnaast wordt ten minste één andere meetvariabele ge ­
meten (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of vers ­
gewicht), aangezien sommige stoffen andere meetvariabelen veel sterker kunnen beïnvloeden dan het aantal schijfjes. Om de effecten van de stof kwantitatief te bepalen wordt de groei in de testoplos ­
singen vergeleken met de groei van de controles en wordt de con ­
centratie bepaald die een specifiek percentage remming van de groei ­
snelheid (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de EC
 x 
(bv. EC  50 ). 
Het testeindpunt is groeiremming, uitgedrukt als de logaritmische 
toename van de meetvariabele (gemiddelde specifieke groeisnelheid) gedurende de blootstellingsperiode. Op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheden die in een reeks testoplossingen worden 
geregistreerd, wordt de concentratie bepaald die een specifiek per ­
centage remming van de groeisnelheid (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de E
 s C x (bv. E  s C 50 ). 
Bij deze testmethode wordt ook de opbrengst als responsvariabele 
gebruikt; deze kan in bepaalde landen nodig zijn om aan specifieke 
voorschriften in de regelgeving te voldoen. Deze wordt gedefinieerd 
als de meetvariabelen aan het eind van de blootstellingsperiode ver ­
minderd met de meetvariabelen aan het begin van de blootstellings ­
periode. Op basis van de opbrengst die in een reeks testoplossingen 
wordt geregistreerd, wordt de concentratie bepaald die een specifiek 
percentage afname van de opbrengst (bv. 50 %) veroorzaakt; deze wordt uitgedrukt als de E
 o C x (bv. E  o C 50 ). 
Daarnaast kunnen langs statistische weg de laagste concentratie met 
waargenomen effecten (LOEC) en de concentratie zonder waargeno ­
men effecten (NOEC) worden bepaald.  
1.4. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
Er moet een analysemethode beschikbaar zijn met een afdoende 
gevoeligheid voor de kwantitatieve bepaling van de stof in het test ­
medium.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
De informatie over de teststof, die nuttig kan zijn om de testoms ­
tandigheden te bepalen, omvat bijvoorbeeld de structuurformule, de 
zuiverheid, de oplosbaarheid in water, de stabiliteit in water en licht, de pK
 a , de K  ow , de dampspanning en de biologische afbreekbaar ­
heid. De oplosbaarheid in water en de dampspanning kunnen worden 
gebruikt om de constante van de Wet van Henry te berekenen die 
aangeeft of significante verliezen van de teststof gedurende de test ­
periode te verwachten zijn. Mede op grond hiervan kan worden bepaald of er specifieke maatregelen moeten worden genomen om 
dergelijke verliezen te beperken. Wanneer de informatie over de 
oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof onzeker is, wordt aanbe ­
volen deze onder de testomstandigheden te bepalen, d.w.z. in het groeimedium, bij de temperatuur en met het belichtingsschema zoals 
die bij de test worden gebruikt.
 
Wanneer regulering van de pH van het testmedium van bijzonder 
belang is, bijvoorbeeld bij het testen van metalen of stoffen die instabiel voor hydrolyse zijn, wordt aanbevolen een buffer aan het 
groeimedium toe te voegen (zie de eerste alinea van punt 1.7.4). 
Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fy ­
sisch-chemische eigenschappen dat ze moeilijk te testen zijn, zijn te vinden in (11).
 
1.5. REFERENTIESTOF  
Er kunnen een of meer referentiestoffen worden getest, zoals 3,5- 
dichloorfenol dat bij de internationale rondzendproef is gebruikt (10), 
om de testprocedure te controleren. Het is raadzaam ten minste twee keer per jaar of, wanneer de test met een vrij lage frequentie wordt uitgevoerd, tegelijk met de bepaling van de toxiciteit van een teststof 
een referentiestof te testen.
 
1.6. GELDIGHEID VAN DE TEST  
Voor een geldige test moet de verdubbelingstijd van het aantal 
schijfjes bij de controlegroep minder dan 2,5 dagen (60 uur) zijn, hetgeen overeenkomt met ongeveer een zevenvoudige toename in 
zeven dagen en een gemiddelde specifieke groeisnelheid van 0,275 
d
 –1 . Wanneer de in deze testmethode beschreven media en testoms ­
tandigheden worden gebruikt, kan dit criterium met een statische testopzet worden gehaald (8). Ook bij een semistatische en een door ­
stroomtest zal dit criterium naar verwachting kunnen worden ge ­
haald. In punt 2.1 wordt de berekening van de verdubbelingstijd beschreven.
 
1.7. BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
1.7.1.  Apparatuur  
Alle apparatuur die in aanraking komt met de testmedia, moet van 
glas of een ander chemisch inert materiaal gemaakt zijn. Glaswerk 
dat voor de culturen en de test wordt gebruikt, moet worden ontdaan van chemische verontreinigingen die in het medium terecht kunnen komen en moet steriel zijn. De testvaten moeten zo breed zijn dat de 
schijfjes van de verschillende kolonies in de controlevaten kunnen 
groeien zonder dat ze elkaar aan het eind van de test overlappen. De wortels mogen de bodem van de testvaten raken, maar een minimale diepte van 20 mm en een minimaal volume van 100 ml in elk testvat 
wordt aanbevolen. De keuze van de testvaten is geen kritische factor 
zolang aan deze eisen wordt voldaan. Van zowel bekerglazen (van glas) als kristalliseerschalen of glazen petrischalen met geschikte afmetingen is gebleken dat ze geschikt zijn. De testvaten moeten 
worden afgedekt om verdamping en onopzettelijke verontreiniging 
tot een minimum te beperken, waarbij echter wel de nodige uitwis ­
seling van lucht mogelijk moet zijn. Bij het kiezen van geschikte testvaten en met name deksels moet erop worden gelet dat ze geen 
schaduwwerking of veranderingen in de spectrale kenmerken van 
licht veroorzaken.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
De culturen en de testvaten mogen niet samen worden bewaard. 
Hiervoor kan het best worden gezorgd door aparte klimaatkasten, 
incubators of klimaatkamers te gebruiken. De verlichting en de tem ­
peratuur moeten kunnen worden gereguleerd en moeten constant worden gehouden (zie punt 1.7.8).
 
1.7.2.  Testorganisme  
Als organisme wordt voor deze test  Lemna gibba  of Lemna minor  
gebruikt. Aanhangsel 1 bevat een korte beschrijving van soorten eendenkroos die voor toxiciteitstests zijn gebruikt. Het plantenmate ­
riaal kan van een cultuurcollectie of een ander laboratorium worden 
betrokken of uit het veld worden gehaald. Als de planten uit het veld worden gehaald, moeten ze ten minste gedurende acht weken vóór gebruik in hetzelfde medium in cultuur worden gehouden als voor de 
test wordt gebruikt. Op de plaatsen die voor het verzamelen van de 
beginculturen worden gebruikt, mogen er geen zichtbare bronnen van verontreiniging zijn. Als ze van een ander laboratorium of van een cultuurcollectie worden betrokken, moeten ze op dezelfde manier 
gedurende minimaal drie weken in cultuur worden gehouden. De 
herkomst van het plantenmateriaal en de voor de test gebruikte soort en kloon (indien bekend) moeten altijd worden gerapporteerd.
 
Er moeten monoculturen worden gebruikt, die zichtbaar vrij zijn van 
verontreiniging door andere organismen zoals algen en protozoën. Gezonde planten van  L. minor  bestaan uit kolonies met twee tot 
vijf schijfjes, terwijl gezonde kolonies van  L. gibba  maximaal 
zeven schijfjes kunnen bevatten.
 
De kwaliteit en uniformiteit van de voor de test gebruikte planten 
zullen een significante invloed hebben op het resultaat van de test en 
de planten moeten dan ook met zorg worden gekozen. Er moeten jonge, snel groeiende planten worden gebruikt zonder zichtbare be ­
schadigingen en zonder verkleuring (chlorose). Wanneer een cultuur 
veel kolonies met ten minste twee schijfjes bevat, wijst dit op een 
goede kwaliteit. Een groot aantal losse schijfjes wijst op milieustress, bv. een nutriënt als beperkende factor, en plantenmateriaal van der ­
gelijke culturen mag niet voor de test worden gebruikt.
 
1.7.3.  Culturen  
Om de onderhoudfrequentie van culturen te beperken (bv. wanneer 
er gedurende enige tijd geen  Lemna -tests gepland zijn), kunnen de 
culturen onder beperkte verlichting en bij verlaagde temperatuur (4- 
10 °C) worden bewaard. Aanhangsel 2 bevat een gedetailleerde be ­
schrijving van deze werkwijze. Wanneer er duidelijke tekenen van verontreiniging door algen of andere organismen zijn, moet er bij 
een submonster van  Lemna -schijfjes oppervlaktesterilisatie worden 
uitgevoerd, waarna het naar vers medium wordt overgezet (zie aanhangsel 2). In dit geval moet de resterende verontreinigde cultuur worden afgekeurd.
 
Ten minste zeven dagen vóór de test worden voldoende kolonies 
aseptisch overgezet naar vers steriel medium en gedurende 7-10 dagen onder de testomstandigheden gekweekt.
 
1.7.4.  Testmedium  
Voor  Lemna minor  en Lemna gibba  worden onderstaande media 
aanbevolen. Er moet zorgvuldig worden overwogen of er een pH- buffer in het testmedium moet worden opgenomen (MOPS (4-mor ­
folinepropaansulfonzuur, CAS-nr. 1132-61-2, EINECS-nr. 214-478- 
5) in medium voor  L. minor  en NaHCO
 3 in medium voor  L. gibba ) 
wanneer het vermoeden bestaat dat deze met de teststof zou kunnen reageren en de toxische effecten zou kunnen beïnvloeden. Steinberg- 
medium (12) is ook aanvaardbaar, zo lang aan de geldigheidscriteria 
wordt voldaan.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Voor het kweken van en testen met  L. minor  wordt een gewijzigde 
versie van het  Lemna -groeimedium van het Zweedse instituut voor 
normalisatie (SIS) aanbevolen. In aanhangsel 3 wordt de samenstel ­
ling van dit medium vermeld.  
Het in aanhangsel 3 beschreven groeimedium 20X-AAP wordt aan ­
bevolen voor het kweken van en testen met  L. gibba . 
Het ook in aanhangsel 3 beschreven Steinberg-medium is ook ge ­
schikt voor  L. minor , maar kan ook voor  L. gibba  worden gebruikt, 
zo lang aan de geldigheidscriteria wordt voldaan.  
1.7.5.  Testoplossingen  
De testoplossingen worden meestal bereid door een stamoplossing te 
verdunnen. Stamoplossingen van de teststof worden meestal bereid door de stoffen in groeimedium op te lossen.
 
De hoogste geteste concentratie van de teststof mag normaal gespro ­
ken niet hoger liggen dan de oplosbaarheid in water van de stof onder de testomstandigheden. Er moet echter worden opgemerkt dat Lemna  spp. op het oppervlak drijft en kan worden blootgesteld 
aan stoffen die zich aan het grensvlak tussen water en lucht ophopen 
(bijvoorbeeld stoffen die slecht oplosbaar zijn in water, hydrofobe stoffen of oppervlakteactieve stoffen). In dergelijke situaties zullen de planten aan ander materiaal worden blootgesteld dan in de op ­
lossing aanwezig is en kunnen de testconcentraties afhankelijk van 
de kenmerken van de teststof hoger liggen dan de oplosbaarheid in water. Voor slecht in water oplosbare teststoffen kan het nodig zijn om met behulp van een organisch oplosmiddel of dispergeermiddel 
een geconcentreerde stamoplossing of dispersie van de stof te maken 
om de toevoeging van nauwkeurige hoeveelheden van de teststof aan het testmedium te vergemakkelijken en bij het dispergeren en oplos ­
sen daarvan te helpen. Al het mogelijke moet worden gedaan om 
gebruik van dergelijke materialen te vermijden. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen als hulpstof mag niet tot fyto ­
toxiciteit leiden. Vaak gebruikte oplosmiddelen die bij concentraties 
tot 100 μl·l
 –1 geen fytotoxiciteit veroorzaken, zijn bijvoorbeeld ace ­
ton en dimethylformamide. Als een oplosmiddel of dispergeermiddel wordt gebruikt, moet de uiteindelijke concentratie daarvan worden gerapporteerd en tot een minimum worden beperkt ( ≤ 100 μl·l
 –1 ) en 
moeten alle test- en controleoplossingen dezelfde concentratie oplos ­
middel of dispergeermiddel bevatten. Zie (11) voor nadere richtsnoe ­
ren voor het gebruik van dispergeermiddelen.  
1.7.6.  Dosis- en controlegroepen  
Wanneer er vooraf iets bekend is over de toxiciteit van de teststof 
voor Lemna , bijvoorbeeld uit een oriënterende test, kan dit nuttig 
zijn bij het kiezen van geschikte testconcentraties. Bij de definitieve toxiciteitstest moeten er normaal gesproken ten minste vijf testcon ­
centraties worden gebruikt die een meetkundige reeks vormen. De 
rede van de reeks mag bij voorkeur niet hoger zijn dan 3,2 maar bij een vlakke concentratie/responscurve mag een hogere waarde wor ­
den gebruikt. Als er minder dan vijf concentraties worden gebruikt, 
moet er een motivering worden gegeven. Bij elke testconcentratie 
moeten er ten minste drie duplo's worden gebruikt.
 
Bij de bepaling van het bereik van de testconcentraties (voor een 
oriënterende en/of de definitieve toxiciteitstest) moet rekening wor ­
den gehouden met de volgende overwegingen:  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Als er een EC  x wordt bepaald, moet de EC  x -waarde binnen het 
bereik van de testconcentraties vallen om een adequaat betrouw ­
baarheidsniveau te waarborgen. Als bijvoorbeeld de EC  50 wordt 
bepaald, moet de hoogste testconcentratie hoger zijn dan de EC
 50 . Als de EC  50 buiten het bereik van de testconcentraties ligt, 
zullen de bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen groot zijn en 
zal een correcte bepaling van de statistische fit van het model wellicht niet mogelijk zijn.
 
— Als het de bedoeling is de LOEC/NOEC te bepalen, moet de 
laagste testconcentratie zo laag zijn dat de groei niet significant lager is dan die van de controle. Bovendien moet de hoogste 
testconcentratie dan zo hoog zijn dat de groei significant lager is 
dan die van de controle. Als dit niet het geval is, moet de test met een ander concentratiebereik worden herhaald (tenzij de hoogste concentratie samenvalt met de oplosbaarheidsgrens of de maxi ­
maal vereiste grensconcentratie, bijvoorbeeld 100 mg·l
 –1 ). 
In elke test moeten controles worden opgenomen waarbij het medi ­
um, het aantal schijfjes en kolonies, de milieuomstandigheden en de 
procedures identiek zijn aan die van de testvaten, maar zonder de teststof. Als er een oplosmiddel of dispergeermiddel als hulpstof wordt gebruikt, moet er een extra controle worden opgenomen waar ­
aan het oplosmiddel/dispergeermiddel in dezelfde concentratie wordt 
toegevoegd als in de vaten met de teststof. Het aantal controleduplo's (en, indien van toepassing, oplosmiddelduplo's) moet ten minste ge ­
lijk zijn aan en liefst twee keer zo groot zijn als het aantal vaten dat 
voor elke testconcentratie wordt gebruikt.
 
Als de NOEC niet behoeft te worden bepaald, kan de testopzet 
zodanig worden aangepast dat het aantal concentraties wordt opge ­
voerd en het aantal duplo's per concentratie wordt verlaagd. Er moe ­
ten echter minimaal drie controleduplo's worden gebruikt.  
1.7.7.  Blootstelling  
Uit 2 tot 4 zichtbare schijfjes bestaande kolonies worden vanuit de 
entcultuur onder aseptische omstandigheden op aselecte wijze over ­
gezet naar de testvaten. Elk testvat moet in totaal 9 tot 12 schijfjes bevatten. Het aantal schijfjes en kolonies moet in elk testvat het ­
zelfde zijn. Uit de met deze methode opgedane ervaring en de ge ­
gevens van de rondzendproef is gebleken dat drie duplo's per dosis ­
groep, waarbij elke duplo aanvankelijk 9 tot 12 schijfjes bevat, vol ­
doende is om verschillen in groei tussen de dosisgroepen te detec ­
teren van ongeveer 4 % tot 7 % remming (bij berekening van de 
groeisnelheid) of 10 % tot 15 % remming (bij berekening van de opbrengst) (10).
 
Wat de locatie van de testvaten in de incubator betreft, moet een 
aselecte opzet worden gehanteerd om de invloed van plaatselijke verschillen in lichtintensiteit of temperatuur zo veel mogelijk te be ­
perken. Een blokopzet of aselecte verplaatsing van de vaten bij het 
doen van observaties (of frequenter verplaatsen) is ook vereist.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Als uit een oriënterende stabiliteitstest is gebleken dat de concen ­
tratie van de teststof in de loop van de test (7 dagen) niet op peil 
blijft (d.w.z. de gemeten concentratie daalt tot minder dan 80 % van de gemeten aanvankelijke concentratie), wordt een semistatische tes ­
topzet aanbevolen. In dit geval moeten de kolonies ten minste twee 
keer in de loop van de test (bijvoorbeeld op dag 3 en op dag 5) aan 
vers bereide test- en controleoplossingen worden blootgesteld. De frequentie van blootstelling aan vers medium is afhankelijk van de stabiliteit van de teststof; bij zeer instabiele of vluchtige stoffen kan 
een hogere frequentie nodig zijn om de concentratie vrijwel constant 
te houden. In sommige gevallen kan een doorstroomprocedure nodig zijn (11)(13).
 
Blootstelling door aanbrengen op het blad (spuiten) komt in deze 
testmethode niet aan de orde; zie hiervoor (14).  
1.7.8.  Incubatieomstandigheden  
Er moet continue warme of koele witte fluorescerende belichting 
worden gebruikt om te zorgen voor een lichtintensiteit binnen het 
bereik 85-135 μE·m  –2 ·s –1 , wanneer deze wordt gemeten binnen het 
voor fotosynthese effectieve golflengtebereik (400-700 nm) op pun ­
ten op dezelfde afstand van de lichtbron als de  Lemna -schijfjes (dit 
komt overeen met 6 500-10 000 lux). De lichtintensiteit mag niet 
meer dan ± 15 % afwijken van de over het testoppervlak gemiddelde lichtintensiteit. De methode waarmee het licht wordt gedetecteerd en gemeten, met name het type sensor, zal de gemeten waarde beïn ­
vloeden. De voorkeur wordt gegeven aan sferische sensoren (die 
reageren op licht uit alle hoeken boven en onder het meetvlak) en „cosinus”-sensoren (die reageren op licht uit alle hoeken boven het meetvlak) in plaats van unidirectionele sensoren, aangezien deze een 
hogere uitslag geven voor een meerpuntslichtbron van het hier be ­
schreven type.
 
De temperatuur in de testvaten moet 24 ± 2 °C zijn. De pH van het 
controlemedium mag gedurende de test niet meer dan 1,5 eenheden stijgen. Een afwijking van meer dan 1,5 eenheden maakt de test 
echter niet ongeldig wanneer kan worden aangetoond dat aan de 
geldigheidscriteria wordt voldaan. In speciale gevallen, bijvoorbeeld wanneer instabiele stoffen of metalen worden getest, moet extra zorg aan de pH-verschuiving worden besteed. Zie (11) voor nadere richt ­
snoeren.
 
1.7.9.  Duur  
De test wordt 7 dagen na het overzetten van de planten naar de 
testvaten beëindigd.  
1.7.10.  Metingen en analyses  
Aan het begin van de test wordt het aantal schijfjes in de testvaten 
geteld en geregistreerd, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat overlappende maar apart zichtbare schijfjes worden meegeteld. Het aantal schijfjes (normaal of abnormaal) moet aan het begin van de 
test, ten minste één keer per drie dagen gedurende de blootstellings ­
periode (d.w.z. ten minste twee keer gedurende de periode van 7 dagen) en aan het eind van de test worden bepaald. Veranderingen in de ontwikkeling van de plant (bijvoorbeeld qua grootte van de schijf ­
jes, uiterlijk, verschijnselen van necrose, chlorose of gebocheldheid, 
uit elkaar vallen of verlies van drijfvermogen van kolonies, lengte en uiterlijk van de wortels) moeten worden geregistreerd. Ook signifi ­
cante kenmerken van het testmedium (bijvoorbeeld aanwezigheid 
van onopgelost materiaal of algengroei in het testvat) moeten worden 
geregistreerd.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Naast de bepalingen van het aantal schijfjes gedurende de test moe ­
ten ook de effecten van de teststof op een (of meer) van de volgende 
meetvariabelen worden bepaald:  
i) totaaloppervlak van de schijfjes,  
ii) drooggewicht,  
iii) versgewicht.  
Het voordeel van het totaaloppervlak van de schijfjes is dat het voor 
elk testvat en controlevat aan het begin, gedurende en aan het eind 
van de test kan worden bepaald. Het droog- of versgewicht moet aan 
het begin van de test worden bepaald bij een monster van de ent ­
cultuur dat representatief is voor wat er wordt gebruikt om de test te starten, en aan het eind van de test bij het plantenmateriaal van elk 
testvat en controlevat. Als het oppervlak van de schijfjes niet wordt 
gemeten, krijgt het drooggewicht de voorkeur boven het versgewicht.
 
Het totaaloppervlak van de schijfjes, het drooggewicht en het vers ­
gewicht kunnen als volgt worden bepaald:  
i) Totaaloppervlak van de schijfjes : het totaaloppervlak van de 
schijfjes van alle kolonies kan door beeldanalyse worden be ­
paald. Met een videocamera kan een silhouet van het testvat en de planten worden opgenomen (bijvoorbeeld door het vat op een lichtbak te zetten) en dit beeld kan worden gedigitali ­
seerd. Door kalibratie met vlakke vormen met een bekend opper ­
vlak kan vervolgens het totaaloppervlak van de schijfjes in een testvat worden bepaald. Er moet op worden gelet dat storing door de rand van het testvat wordt voorkomen. Een andere me ­
thode, die echter bewerkelijker is, is een foto van de testvaten en 
planten te maken, het resulterende silhouet van de kolonies uit te knippen en het oppervlak te bepalen met een bladoppervlak-ana ­
lysator of millimeterpapier. Ook andere technieken (bv. de pa ­
piergewicht-verhouding tussen het silhouet van het kolonieopper ­
vlak en een oppervlakte-eenheid) kunnen bruikbaar zijn.
 
ii) Drooggewicht : Uit elk testvat worden alle kolonies verzameld en 
afgespoeld met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Ze worden afgevloeid om het aanhangend water te verwijderen en vervol ­
gens bij 60 °C gedroogd tot constant gewicht. Ook wortelfrag ­
menten moeten mee worden bepaald. Het drooggewicht moet worden uitgedrukt met een precisie van ten minste 0,1 mg.
 
iii) Versgewicht : Alle kolonies worden overgebracht naar vooraf ge ­
wogen buizen van polystyreen (of een ander inert materiaal) met 
kleine (1 mm) gaten in de ronde bodem. De buizen worden vervolgens gedurende tien minuten bij kamertemperatuur gecen ­
trifugeerd bij 3 000 rpm. De buizen, die de nu gedroogde kolo ­
nies bevatten, worden opnieuw gewogen en het versgewicht 
wordt berekend door het resultaat van het gewicht van de lege buis af te trekken.
 
1.7.10.1.  Frequentie van de metingen en analyses  
Als een statische testopzet wordt gebruikt, moet de pH van elke 
dosisgroep aan het begin en het eind van de test worden gemeten. Als een semistatische testopzet wordt gebruikt, moet de pH vóór elke 
verversing in elke batch „verse” testoplossing en ook in de corres ­
ponderende „gebruikte” oplossingen worden gemeten.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
De lichtintensiteit moet in de klimaatkast, incubator of klimaatkamer 
worden gemeten op punten op dezelfde afstand van de lichtbron als 
de Lemna -schijfjes. De metingen moeten ten minste eenmaal gedu ­
rende de test worden uitgevoerd. De temperatuur van het medium moet ten minste eenmaal per dag worden gemeten in een speciaal vat 
dat onder dezelfde omstandigheden in de klimaatkast, incubator of 
klimaatkamer wordt bewaard.
 
De concentraties van de teststof worden op geschikte tijdstippen 
gedurende de test bepaald. Bij statische tests moeten de concentraties minimaal aan het begin en aan het eind van de test worden bepaald.
 
Bij semistatische tests moeten, wanneer de concentratie van de test ­
stof naar verwachting niet binnen ± 20 % van de nominale concen ­
tratie zal blijven, alle vers bereide testoplossingen en dezelfde op ­
lossingen bij elke verversing (zie de derde alinea van punt 1.7.7) worden geanalyseerd. Wanneer de gemeten aanvankelijke concentra ­
tie van de teststof niet binnen ± 20 % van de nominale concentratie 
ligt, maar afdoende kan worden aangetoond dat de aanvankelijke concentraties herhaalbaar en stabiel zijn (d.w.z. binnen het bereik van 80-120 % van de aanvankelijke concentratie liggen), behoeven 
de chemische bepalingen echter alleen bij de hoogste en laagste 
testconcentratie te worden uitgevoerd. In alle gevallen behoeft de concentratie van de teststof vóór verversing slechts bij één duplo 
van elke testconcentratie te worden bepaald (of bij de gecombineerde 
inhoud van de duplo-testvaten).
 
Als een doorstroomtest wordt gebruikt, kan een vergelijkbaar bemon ­
steringsschema worden gebruikt als voor semistatische tests is be ­
schreven, met een analyse aan het begin, halverwege en aan het eind 
van de test, maar in dit geval is een meting van de „gebruikte” 
oplossingen niet relevant. Bij een dergelijke test moet de stroom ­
snelheid van het verdunningsmiddel en de teststof of de stamoplos ­
sing van de teststof dagelijks worden gecontroleerd.  
Als kan worden aangetoond dat de concentratie van de geteste stof 
de gehele test op afdoende wijze binnen ± 20 % van de nominale of 
gemeten aanvankelijke concentratie is gebleven, kan de analyse van de resultaten op basis van de nominale of gemeten aanvankelijke waarden worden uitgevoerd. Als de afwijking van de nominale of 
gemeten aanvankelijke concentratie groter is dan ± 20 %, moet de 
analyse van de resultaten worden uitgevoerd op basis van het meet ­
kundige gemiddelde van de concentratie gedurende de blootstelling of op basis van modellen waarmee de afname van de concentratie 
van de teststof wordt beschreven (11).
 
1.7.11.  Limiettest  
Onder bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld wanneer een oriënte ­
rende test erop wijst dat de teststof bij concentraties tot 100 mg·l  –1 
of tot de oplosbaarheidsgrens in het testmedium (als deze lager ligt) 
geen toxische effecten heeft, kan een limiettest worden uitgevoerd, 
waarbij de respons in een controlegroep en één dosisgroep 
(100 mg·l  –1 of een concentratie die gelijk is aan de oplosbaarheids ­
grens) wordt vergeleken. Er wordt sterk aanbevolen dit te onder ­
steunen met een analyse van de blootstellingsconcentratie. Alle in 
het voorgaande beschreven testomstandigheden en geldigheidscriteria 
zijn ook van toepassing bij een limiettest, behalve het aantal duplo's in de controlegroep, dat moet worden verdubbeld. De groei in de controlegroep en de dosisgroep kan worden geanalyseerd met behulp 
van een statistische toets om gemiddelden te vergelijken, bijvoor ­
beeld een t-toets van Student.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
2.1. VERDUBBELINGSTIJD  
Om de verdubbelingstijd (T  d ) van het aantal schijfjes te bepalen en 
na te gaan of dit geldigheidscriterium door de test wordt gehaald (zie 
punt 1.6), wordt op de gegevens van de controlevaten de volgende 
formule toegepast:  
T d = ln 2/μ 
Hierbij is μ de gemiddelde specifieke groeisnelheid, bepaald volgens 
de beschrijving in de eerste en tweede alinea van punt 2.2.1.  
2.2. RESPONSVARIABELEN  
De test is bedoeld om de effecten van de teststof op de vegetatieve 
groei van  Lemna  te bepalen. In deze testmethode worden twee res ­
ponsvariabelen beschreven, aangezien de lidstaten niet alle dezelfde voorkeuren en behoeften qua regelgeving hebben. De testresultaten zijn alleen in alle lidstaten aanvaardbaar als de effecten met beide 
onderstaande responsvariabelen a) en b) worden bepaald:
 
a) de gemiddelde specifieke groeisnelheid: deze responsvariabele 
wordt berekend op basis van de logaritmische verandering in 
het aantal schijfjes en daarnaast op basis van de logaritmische verandering in een andere meetparameter (totaaloppervlak van de 
schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in de loop van de tijd 
(uitgedrukt per dag) in de controlegroep en elke dosisgroep. Dit wordt soms de relatieve groeisnelheid genoemd (15).
 
b) de opbrengst: deze responsvariabele wordt berekend op basis van 
de verandering in het aantal schijfjes en daarnaast op basis van de verandering in een andere meetparameter (totaaloppervlak van de 
schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in de controlegroep en 
elke dosisgroep tot het eind van de test.
 
Er moet worden opgemerkt dat de met behulp van deze twee res ­
ponsvariabelen berekende waarden voor de toxiciteit niet vergelijk ­
baar zijn en bij gebruik van de resultaten van de test moet met dit verschil rekening worden gehouden. Vanwege de mathematische 
grondslagen van de respectieve benaderingen zullen de EC
 x -waarden 
op basis van de gemiddelde specifieke groeisnelheid (E  s C x ) in het 
algemeen hoger zijn dan de resultaten op basis van de opbrengst (E
 o C x ) als de testomstandigheden van deze testmethode worden aan ­
gehouden. Dit moet niet worden geïnterpreteerd als een verschil in 
gevoeligheid tussen de twee responsvariabelen, maar alleen als een mathematisch verschil tussen de waarden. Het begrip gemiddelde specifieke groeisnelheid is gebaseerd op het algemene exponentiële 
groeipatroon van eendenkroos in niet-beperkte culturen, waarbij de 
toxiciteit wordt bepaald op basis van de effecten op de groeisnelheid, zonder dat deze afhankelijk is van het absolute niveau van de spe ­
cifieke groeisnelheid van de controle, van de helling van de 
concentratie/responscurve of van de duur van de test. De resultaten 
op basis van de responsvariabele opbrengst zijn daarentegen afhan ­
kelijk van al deze andere variabelen. De E
 o C x is afhankelijk van de 
specifieke groeisnelheid van de bij elke test gebruikte eendenkroos ­
soort en van de maximale specifieke groeisnelheid die van soort tot 
soort en zelfs van kloon tot kloon kan verschillen. Deze respons ­
variabele moet niet worden gebruikt voor een vergelijking tussen eendenkroossoorten of zelfs verschillende klonen qua gevoeligheid 
voor toxische stoffen. De wetenschap geeft weliswaar de voorkeur 
aan het gebruik van de gemiddelde specifieke groeisnelheid om de toxiciteit te bepalen, maar in deze testmethode wordt ook de bepa ­
ling van de toxiciteit op basis van de opbrengst opgenomen om te 
voldoen aan de vereisten in de huidige regelgeving in bepaalde 
landen.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
De toxiciteit moet worden bepaald op basis van het aantal schijfjes 
en daarnaast één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijf ­
jes, drooggewicht of versgewicht), omdat sommige stoffen wellicht veel meer invloed hebben op andere meetvariabelen dan het aantal schijfjes. Dit effect zou niet worden gedetecteerd als alleen het aantal 
schijfjes wordt berekend.
 
Er wordt een tabel gemaakt met het aantal schijfjes en een andere 
geregistreerde meetvariabele, d.w.z. het totaaloppervlak van de schijfjes, het drooggewicht of het versgewicht, alsmede de concen ­
traties van de teststof op elk meettijdstip. Bij de latere gegevensana ­
lyse, bijvoorbeeld om de LOEC, de NOEC of de EC
 x te bepalen, 
moet worden uitgegaan van de waarden voor de afzonderlijke du ­
plo's en niet van de berekende gemiddelden voor elke dosisgroep.  
2.2.1.  Gemiddelde specifieke groeisnelheid  
De gemiddelde specifieke groeisnelheid voor een bepaalde periode 
wordt voor elke test- of controlevat met de volgende vergelijking 
berekend als de logaritmische toename van de groeivariabelen – het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht):
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
Hierbij is:  
— μ i-j de gemiddelde specifieke groeisnelheid van tijdstip  i tot 
tijdstip  j; 
— N  i de meetvariabele in het test- of controlevat op tijdstip  i; 
— N  j de meetvariabele in het test- of controlevat op tijdstip  j; 
— t de periode van tijdstip  i tot tijdstip  j. 
Voor elke dosisgroep en controlegroep wordt een gemiddelde waarde 
voor de groeisnelheid berekend en een waarde voor de variantie.  
De gemiddelde specifieke groeisnelheid moet voor de volledige test ­
periode worden berekend (tijdstip „i” in bovenstaande formule is het 
begin van de test en tijdstip „j” is het einde van de test). Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de gemiddelde specifieke groeisnelheid berekend en een waarde voor de 
variantie. Daarnaast moet de partiële groeisnelheid worden bepaald 
om effecten van de teststof gedurende de blootstellingsperiode te evalueren (bijvoorbeeld door inspectie van de log-getransformeerde groeicurves). Aanzienlijke verschillen tussen de partiële groeisnel ­
heid en de gemiddelde groeisnelheid wijzen erop dat de groei niet 
voortdurend exponentieel is en dat de groeicurves grondig moeten worden bestudeerd. In dit geval zou het een behoedzame aanpak zijn om de specifieke groeisnelheden van behandelde culturen gedurende 
de periode van maximale remming te vergelijken met die van con ­
troles gedurende dezelfde periode.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
De procentuele remming van de groeisnelheid (I  s ) kan dan voor elke 
testconcentratie (dosisgroep) worden berekend met de volgende for ­
mule:  
% I s ¼ ðμ C – μ D Þ 
μ C Ü 100 
Hierbij is:  
— % I  s procentuele remming van de gemiddelde specifieke 
groeisnelheid;  
— μ C gemiddelde waarde van μ in de controlegroep;  
— μ D gemiddelde waarde van μ in de dosisgroep.  
2.2.2.  Opbrengst  
De effecten op de opbrengst worden bepaald op basis van twee 
meetvariabelen, het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (to ­
taaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of versgewicht) in elk 
testvat aan het begin en het eind van de test. Voor het drooggewicht 
of het versgewicht wordt de biomassa aan het begin bepaald op basis van een monster met schijfjes dat wordt genomen van dezelfde batch 
die voor het beënten van de testvaten wordt gebruikt (zie de tweede 
alinea van punt 1.7.3). Voor elke testconcentratie en controle wordt een gemiddelde waarde voor de opbrengst berekend en een waarde voor de variantie. De gemiddelde procentuele remming van de op ­
brengst (%I
 o ) kan voor elke dosisgroep als volgt worden berekend:  
% I o ¼ ðb C – b D Þ 
b C Ü 100 
Hierbij is:  
— % I  o procentuele remming van de opbrengst;  
— b  C biomassa aan het eind minus biomassa aan het begin in 
de controlegroep;  
— b  D biomassa aan het eind minus biomassa aan het begin in 
de dosisgroep.  
2.2.3.  Uitzetting van de concentratie/responscurves  
Uitzetting van de gemiddelde procentuele remming van de respons ­
variabele (I  s of I  o , berekend volgens de laatste alinea van punt 2.2.1 
of punt 2.2.2) tegen de logaritme van de concentratie van de teststof 
levert concentratie/responscurves op.  
2.2.4.  Bepaling van de EC  x 
De EC  x (bv. EC  50 ) moet worden bepaald op basis van zowel de 
gemiddelde specifieke groeisnelheid (E  s C x ) als de opbrengst (E  o C x ), 
in beide gevallen op basis van het aantal schijfjes en één andere meetvariabele (totaaloppervlak van de schijfjes, drooggewicht of 
versgewicht). De reden hiervoor is dat sommige teststoffen het aantal 
schijfjes anders beïnvloeden dan andere meetvariabelen. De gewenste toxiciteitsparameters zijn derhalve vier EC
 x -waarden voor elk bere ­
kend remmingsniveau x: E  s C x (aantal schijfjes), E  s C x (totaalopper ­
vlak schijfjes, drooggewicht of versgewicht), E  o C x (aantal schijfjes) 
en E  o C x (totaaloppervlak schijfjes, drooggewicht of versgewicht).  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. STATISTISCHE PROCEDURES  
Het is de bedoeling met behulp van regressieanalyse een kwantitatief 
verband tussen concentratie en respons te verkrijgen. Het is mogelijk een gewogen lineaire regressie te gebruiken nadat op de respons ­
gegevens een linearisering-transformatie is uitgevoerd, bijvoorbeeld 
naar probit-, logit- of Weibull-eenheden (16), maar de voorkeur wordt gegeven aan niet-lineaire regressieprocedures, die beter om ­
gaan met onvermijdelijke onregelmatigheden in gegevens en afwij ­
kingen van regelmatige distributies. In de buurt van het nulpunt of 
totale remming kunnen dergelijke onregelmatigheden door de trans ­
formatie worden uitvergroot en kunnen ze de analyse storen (16). Er 
moet worden opgemerkt dat standaardmethoden voor analyses met 
behulp van probit-, logit- of Weibull-transformaties bedoeld zijn voor gebruik bij een binaire respons (bv. sterfte of overleven) en moeten worden aangepast om voor groeisnelheid- of opbrengst-data 
te kunnen worden gebruikt. Specifieke procedures voor de bepaling 
van EC
 x -waarden uit continue gegevens zijn te vinden in (17), (18) 
en (19).  
Voor elke te analyseren responsvariabele wordt het verband tussen 
concentratie en respons gebruikt voor de berekening van puntschat ­
tingen van EC  x -waarden. Waar mogelijk moeten voor elke schatting 
de 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden bepaald. De kwaliteit van 
de fitting van de responsgegevens op het regressiemodel moet gra ­
fisch of statistisch worden bepaald. De regressieanalyse moet met de individuele duplo-respons worden uitgevoerd en niet met gemiddel ­
den van dosisgroepen.
 
Als de beschikbare regressiemodellen/methoden niet geschikt zijn 
voor de gegevens, kunnen de EC  50 en de betrouwbaarheidsgrenzen 
ook worden bepaald met behulp van lineaire interpolatie met boot ­
strapping (20).  
Voor de bepaling van de LOEC en daaruit de NOEC moeten de 
gemiddelden van de dosisgroepen worden vergeleken met behulp 
van variantieanalyse-technieken (ANOVA). Het gemiddelde voor elke concentratie moet dan worden vergeleken met het gemiddelde van de controlegroep met behulp van een geschikte methode voor 
meervoudige vergelijking of trendtoets. Hiervoor kan de Dunnett- of 
Williams-toets geschikt zijn (21)(22)(23)(24). Er moet worden be ­
paald of de ANOVA-aanname van homogeniteit van variantie op ­
gaat. Deze bepaling kan grafisch worden uitgevoerd of met een 
formele toets (25). Hiervoor kan de Levene- of Bartlett-toets worden 
gebruikt. Wanneer de aanname van homogeniteit van variantie niet opgaat, kan dit soms worden gecorrigeerd door logaritmische trans ­
formatie van de gegevens. Als de heterogeniteit van variantie ex ­
treem is en niet door transformatie kan worden gecorrigeerd, moet 
een analyse met methoden als de stap-omlaag-trendtoets van Jonck ­
heere worden overwogen. Aanvullende richtsnoeren voor de bepaling van de NOEC zijn te vinden in (19).
 
Recente wetenschappelijke ontwikkelingen hebben geleid tot een 
aanbeveling om het begrip NOEC niet langer te gebruiken en te 
vervangen door op regressie gebaseerde puntschattingen van EC  x . 
Voor deze  Lemna -test is geen geschikte waarde voor x vastgesteld. 
Een interval van 10 tot 20 % lijkt echter geschikt (afhankelijk van de 
gekozen responsvariabele) en bij voorkeur moeten zowel de EC  10 als 
de EC  20 worden gerapporteerd.  
3. RAPPORTAGE  
3.1. TESTVERSLAG  
In het testverslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen:  
Teststof:  
— fysische aard en fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de 
oplosbaarheidsgrens in water;  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— chemische identificatiegegevens (bv. het CAS-nr.), waaronder de 
zuiverheid.  
Geteste soort:  
— wetenschappelijke naam, kloon (indien bekend) en herkomst.  
Testomstandigheden:  
— gebruikte testprocedure (statisch, semistatisch of doorstroom);  
— begindatum en duur van de test;  
— testmedium;  
— beschrijving van de testopzet: testvaten en deksels, volume van 
de oplossingen, aantal kolonies en schijfjes per testvat aan het begin van de test;
 
— testconcentraties (nominaal en gemeten, indien van toepassing) 
en aantal duplo's per concentratie;  
— wijze van bereiding van de stam- en testoplossingen, met ver ­
melding van het gebruik van eventuele oplosmiddelen of disper ­
geermiddelen;  
— temperatuur tijdens de test;  
— lichtbron, lichtintensiteit en -homogeniteit;  
— pH-waarden van de test- en controleoplossingen;  
— concentraties van de teststof en de analysemethode met relevante 
kwaliteitsborgingsgegevens (valideringsstudies, standaarddevia ­
ties of betrouwbaarheidsgrenzen van analyses);  
— methoden voor de bepaling van het aantal schijfjes en andere 
meetvariabelen (drooggewicht, versgewicht of oppervlak schijf ­
jes); 
— alle afwijkingen van deze testmethode.  
Resultaten:  
— de ruwe gegevens: het aantal schijfjes en andere meetvariabelen 
in elk test- en controlevat bij elke observatie en elk analysetijd ­
stip; 
— de gemiddelden en standaarddeviaties voor elke meetvariabele;  
— de groeicurves voor elke concentratie (aanbevolen met log-ge ­
transformeerde meetvariabele; zie tweede alinea van punt 2.2.1);  
— de verdubbelingstijd/groeisnelheid in de controle op basis van het 
aantal schijfjes;  
— de berekende responsvariabelen voor elke behandelde duplo met 
het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt voor de duplo's;  
— een grafische weergave van het verband tussen concentratie en 
effect;  
— de bepaalde toxische eindpunten voor responsvariabelen, zoals 
EC 50 , EC  10 en EC  20 , en de bijbehorende betrouwbaarheidsinter ­
vallen. De LOEC en/of de NOEC, indien deze zijn berekend, en 
de voor de bepaling daarvan gebruikte statistische methoden;  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— als ANOVA is gebruikt, de grootte van het effect dat kan worden 
gedetecteerd (bv. het minst significante verschil);  
— een eventuele stimulering van de groei, als deze bij een behan ­
deling is geconstateerd;  
— eventuele visuele verschijnselen van fytotoxiciteit en observaties 
van de testoplossingen;  
— bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele 
beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is 
van afwijkingen van deze testmethode.  
4. LITERATUUR  
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test.  
(2) Het gebruik van Lemna-studies voor gekleurde stoffen wordt ge ­
detailleerd besproken in hoofdstuk 13.5.3 van de „EU Manual of Decisions” van juli 2006, at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-che ­
micals
 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety as ­
sessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, available at
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
(5) USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using 
Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96-156. 8pp.  
(6) AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). 
XP T 90-337: Détermination de l’inhibition de la croissance de Lemna minor . 10pp.
 
(7) SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duc­
kweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Ma ­
crophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 pp  
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Eva ­
luation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145.  
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc — Environment Agency.  
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Tes ­
ting of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmen ­
tal Health and Safety Publications, Series on Testing and As ­
sessment No.23.  
(12) ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3-77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bio ­
assays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 
353-359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481-483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713-718.
 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.  
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121.  
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103-117.  
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93-96.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Aanhangsel 1  
Beschrijving van  Lemna  spp.  
De meestal als „eendenkroos” aangeduide waterplant,  Lemna  spp., behoort tot de 
familie  Lemnaceae , die een aantal wereldwijd voorkomende soorten in vier ge ­
slachten heeft. Hun uiterlijk en taxonomie is uitgebreid beschreven (1)(2).  Lemna 
gibba  en L. minor  zijn soorten die representatief zijn voor gematigde zones en 
worden vaak voor toxiciteitstests gebruikt. Beide soorten hebben een drijvende of in het water ondergedompelde bladachtige stengel (schijfje) en uit het midden van de onderkant van elk schijfje steekt een heel dunne wortel.  Lemna  spp. heeft 
zelden bloemen en de reproductie verloopt ongeslachtelijk door het maken van 
nieuwe schijfjes (3). De jongere planten zijn meestal bleker dan de oudere, hebben kortere wortels en bestaan uit twee of drie schijfjes die niet even groot zijn. Doordat  Lemna  klein is, een eenvoudige structuur heeft, zich ongeslachtelijk 
voortplant en een korte generatietijd heeft, zijn planten van dit geslacht heel 
geschikt voor laboratoriumproeven (4)(5).
 
Omdat de gevoeligheid waarschijnlijk van soort tot soort verschilt, mag de ge ­
voeligheid alleen binnen één soort worden vergeleken.  
Voorbeelden van  Lemna -soorten die voor tests zijn gebruikt: soortenreferentie  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. 
EPA 712-C-96-156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swe ­
dish).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733- 
742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. EPA 
712-C-96-156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Bronnen van  Lemna -soorten  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, CANADA, M5S 3 B2  
Tel: +1-416-978-3641  
Fax: +1-416-978-5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
UNITED STATES  
Tel 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
106 91 Stockholm  
SWEDEN  
Tel: +46 8 674 7240  
Fax +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
GERMANY  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Literatuur  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human uti ­
lization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Aanhangsel 2  
Bewaring van stamculturen  
Stamculturen kunnen bij lage temperatuur (4-10 °C) geruime tijd worden be ­
waard zonder opnieuw te hoeven worden opgezet Voor  Lemna  kan hetzelfde 
groeimedium worden gebruikt als voor de test, maar voor stamculturen kan 
een ander nutriëntrijk medium worden gebruikt.  
Periodiek wordt een aantal jonge, lichtgroene planten met een aseptische techniek 
overgezet naar nieuwe kweekvaten met vers medium. Onder de hier voorgestelde koele omstandigheden kan er drie maanden worden gewacht voordat er een nieuwe subcultuur wordt gemaakt.
 
Er moeten chemisch zuivere (met zuur gewassen) en steriele glazen kweekvaten 
worden gebruikt en aseptische behandelingstechnieken worden toegepast. Bij 
verontreiniging van de stamcultuur, bijvoorbeeld met algen of schimmels, moeten er maatregelen worden genomen om de verontreinigende organismen te verwij ­
deren. Bij algen en de meeste andere verontreinigende organismen kan dit ge ­
beuren door oppervlaktesterilisatie. Er wordt een monster van het verontreinigde 
plantenmateriaal genomen en de wortels worden afgeknipt. Het materiaal wordt vervolgens krachtig geschud in schoon water en vervolgens gedurende 
30 seconden tot 5 minuten ondergedompeld in 0,5 % (v/v) natriumhypochlo ­
riet-oplossing. Het plantenmateriaal wordt vervolgens afgespoeld met steriel wa ­
ter en in een aantal porties overgebracht in kweekvaten met vers groeimedium. Veel schijfjes zullen door deze behandeling afsterven, vooral als er een lange 
blootstellingstijd wordt gebruikt, maar meestal zullen sommige van de over ­
levende schijfjes vrij van verontreiniging zijn. Deze kunnen dan worden gebruikt om nieuwe culturen te beënten.
 ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Aanhangsel 3  
Media  
Voor  L. minor  en L. gibba  worden verschillende groeimedia aanbevolen. Voor  L. 
minor  wordt een gewijzigde versie van een medium van het SIS (Zweeds in ­
stituut voor normalisatie) aanbevolen, terwijl voor  L. gibba  het medium 20X- 
AAP wordt aanbevolen. Voor beide media wordt de samenstelling hieronder 
vermeld. Bij de bereiding van deze media moeten p.a. reagentia en gedeïoniseerd water worden gebruikt.
 
Groeimedium voor Lemna van het SIS  
— De stamoplossingen I-V worden in de autoclaaf (15 minuten bij 120 °C) of 
door membraanfiltratie (poriediameter ongeveer 0,2 μm) gesteriliseerd.  
— Stamoplossing VI (en facultatief VII) worden alleen door membraanfiltratie 
gesteriliseerd; deze mogen niet in de autoclaaf worden behandeld.  
— Steriele stamoplossingen moeten koel en in het donker worden bewaard. De 
stamoplossingen I-V moeten binnen zes maanden worden gebruikt, terwijl stamoplossing VI (en facultatief VII) ten hoogste één maand kunnen worden bewaard.
 
Stamoplossing 
nr. Stof Concentratie in 
stamoplossing 
(g· l  –1 ) Concentratie in 
bereid medium 
(mg·l  –1 ) Bereid medium 
Element Concentratie 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (buffer) 490 490 — —  
— Voor de bereiding van één liter SIS-medium wordt aan 900 ml gedeïoniseerd 
water toegevoegd:  
— 10 ml stamoplossing I  
— 5 ml stamoplossing II  
— 5 ml stamoplossing III  
— 5 ml stamoplossing IV  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml stamoplossing V  
— 5 ml stamoplossing VI  
— 1 ml stamoplossing VII (facultatief)  
NB: Stamoplossing VII (MOPS-buffer) kan voor bepaalde teststoffen nodig zijn (zie de 
laatste alinea van punt 1.4).  
— De pH wordt met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH op 6,5 ± 0,2 gebracht en het 
volume wordt met gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter.  
Groeimedium 20X-AAP  
De stamoplossingen worden bereid in steriel gedestilleerd of gedeïoniseerd water.  
De steriele stamoplossingen moeten koel en in het donker worden bewaard. 
Onder deze omstandigheden kunnen de stamoplossingen ten minste 6-8 weken worden bewaard.
 
Voor het medium 20X-AAP worden vijf nutriënt-stamoplossingen gemaakt (A1, 
A2, A3, B en C), waarbij p.a. reagentia worden gebruikt. Voor de bereiding van het groeimedium wordt 20 ml van elke nutriënt-stamoplossing toegevoegd aan 
ongeveer 850 ml gedeïoniseerd water. De pH wordt met 0,1 M of 1 M HCl of 
NaOH op 7,5 ± 0,1 gebracht en het volume wordt met gedeïoniseerd water aangevuld tot 1 liter. Vervolgens wordt het medium over een (ongeveer) 0,2 μm membraanfilter in een steriele fles gefiltreerd.
 
Het groeimedium voor de test moet 1-2 dagen vóór gebruik worden bereid, zodat 
de pH kan stabiliseren. De pH van het groeimedium moet vóór gebruik worden 
gecontroleerd en indien nodig met 0,1 M of 1 M HCl of NaOH worden aange ­
past, zoals hierboven is beschreven.  
Stamoplossing 
nr. Stof Concentratie in 
stamoplossing 
(g·l –1 ) (*) Concentratie in 
bereid medium 
(mg·l  –1 ) (*) Bereid medium 
Element Concentratie 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Tenzij anders vermeld.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
NB: De theoretisch juiste uiteindelijke bicarbonaat-concentratie (waarbij de pH niet signifi ­
cant hoeft te worden aangepast) is 15 mg/l en niet 300 mg/l. In het verleden, en ook bij 
de rondzendproef voor deze test, is het medium 20X-AAP echter altijd gebruikt met 300 mg/l. bicarbonaat (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999): The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. 
R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency).
 
STEINBERG-medium (volgens ISO 20079)  
Concentraties en stamoplossingen  
— Het gewijzigde Steinberg-medium wordt in ISO 20079 alleen voor  Lemna 
minor  gebruikt (aangezien daar alleen  Lemna minor  wordt toegestaan), maar 
uit tests is gebleken dat ook met  Lemna gibba  goede resultaten te verkrijgen 
zijn. 
— Bij de bereiding van het medium moeten p.a. reagentia en gedeïoniseerd 
water worden gebruikt.  
— Het nutriëntmedium wordt bereid uit stamoplossingen of het 10-voudig ge ­
concentreerde medium, dat een maximale concentratie van het medium mo ­
gelijk maakt zonder dat er een neerslag ontstaat.  
Tabel 1:  
pH-gestabiliseerd STEINBERG-medium (gewijzigd volgens Altenburger)  
Stof Nutriëntmedium  
Macro-elementen  mol.gewicht mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Micro-elementen  mol.gewicht μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
Dinatrium-EDTA, dihydraat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabel 2:  
Stamoplossingen (macro-elementen)  
1. Macro-elementen (50-voudig geconcentreerd)  g/l  
Stamoplossing 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Stamoplossing 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Stamoplossing 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabel 3:  
Stamoplossingen (micro-elementen)  
2. Micro-elementen (1 000-voudig geconcentreerd)  mg/l  
Stamoplossing 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Stamoplossing 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Stamoplossing 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Stamoplossing 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Stamoplossing 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
Dinatrium-EDTA, dihydraat 1 500,00  
— De stamoplossingen 2 en 3 en (apart) 4 tot en met 7 kunnen worden gecom ­
bineerd (rekening houdend met de vereiste concentraties).  
— Om de stamoplossingen langer te kunnen bewaren kunnen ze 20 minuten bij 
121 °C in een autoclaaf worden behandeld of steriel worden gefiltreerd 
(0,2 μm). Voor stamoplossing 8 wordt steriele filtratie (0,2 μm) sterk aan ­
bevolen.  
Bereiding van het (gewijzigde) STEINBERG-medium in de uiteindelijke con ­
centratie  
— Voeg 20 ml van de stamoplossingen 1, 2 en 3 (zie tabel 2) toe aan ongeveer 
900 ml gedeïoniseerd water om neerslaan te voorkomen.  
— Voeg 1,0 ml van de stamoplossingen 4, 5, 6, 7 en 8 toe (zie tabel 3).  
— De pH moet nu 5,5 ± 0,2 zijn (eventueel aanpassen met een minimaal volume 
verdund NaOH of HCl).  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Vul met water aan tot 1 000 ml.  
— Als de stamoplossingen gesteriliseerd waren en geschikt water is gebruikt, is 
verdere sterilisatie niet nodig. Als de sterilisatie met het uiteindelijke medium 
wordt uitgevoerd, moet stamoplossing 8 na de behandeling in de autoclaaf (20 minuten bij 121 °C) worden toegevoegd.
 
Bereiding van het 10-voudig geconcentreerde (gewijzigde) STEINBERG-me ­
dium om tijdelijk te bewaren  
— Voeg 20 ml van de stamoplossingen 1, 2 en 3 (zie tabel 2) toe aan ongeveer 
30 ml gedeïoniseerd water om neerslaan te voorkomen.  
— Voeg 1,0 ml van de stamoplossingen 4, 5, 6, 7 en 8 toe (zie tabel 3). Vul met 
water aan tot 100 ml.  
— Als de stamoplossingen gesteriliseerd waren en geschikt water is gebruikt, is 
verdere sterilisatie niet nodig. Als de sterilisatie met het uiteindelijke medium wordt uitgevoerd, moet stamoplossing 8 na de behandeling in de autoclaaf (20 minuten bij 121 °C) worden toegevoegd.
 
— De pH van het medium (uiteindelijke concentratie) moet 5,5 ± 0,2 zijn.  ▼M1 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR  
CHIRONOMIDEA  IN SEDIMENT EN WATER M.B.V. VERRIJKT 
SEDIMENT  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 218 (2004) van de OESO 
(TG 218). Deze testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van 
langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleu ­
gelige zoetwaterinsecten van  Chironomus  sp. aan stoffen. De methode is 
gebaseerd op bestaande toxiciteitstestprotocollen voor  Chironomus riparius  
en Chironomus tentans  die in Europa (1)(2)(3) en Noord-Amerika 
(4)(5)(6)(7)(8) zijn ontwikkeld en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde  Chironomidae  wor­
den gebruikt, bijvoorbeeld  Chironomus yoshimatsui  (10)(11).
 
2. Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt het sedi ­
ment met de teststof verrijkt. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het scenario waarbij sediment 
wordt verrijkt, dient om accumulatie van persistente stoffen in het sediment 
na te bootsen. Bij dit blootstellingssysteem wordt het sediment van een testsysteem van sediment en water verrijkt.
 
3. De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organis ­
men zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden 
blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die 
voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de be ­
trokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log K
 ow > 
5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan 
ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden over ­
wogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te 
voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt 
de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor  C. riparius  en C. yoshimatsui , en 28-65 dagen 
voor C. tentans . Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten 
van een onstabiele stof te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, 
kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden ver ­
wijderd.
 
4. De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en 
de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten 
na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken.
 
5. Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sedi ­
ment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten:  
— de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceer ­
bare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden 
naar niet-besmette schone sedimentbronnen;  
— het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment 
kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voor ­
behandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunst ­
matig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests;
 
— door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen 
vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerang ­
schikt.  
6. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
7. Larven in het eerste stadium van  Chironomidae  worden in 
sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof bloot ­
gesteld. Het sediment wordt met de teststof verrijkt, waarna larven in het 
eerste stadium aan de gestabiliseerde concentraties sediment en water in de 
testglazen worden toegevoegd. Aan het eind van de test worden het uit ­
komstquotiënt en het ontwikkelingstempo van  Chironomidae  gemeten. Zo 
nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de 
larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s wor ­
den gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden 
tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met 
× % (bv. EC
 15 , EC  50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om 
een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken.
 
GEGEVENS OVER DE TESTSTOF  
8. De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de 
gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en 
sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, 
met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, be ­
schikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenlig ­
gend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de struc ­
tuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke che ­
mische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering 
van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen.
 
REFERENTIESTOFFEN  
9. Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de 
betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarbor ­
gen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonder ­
zoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, penta ­
chloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13).  
GELDIGHEID VAN DE TEST  
10. De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan:  
— het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de 
test ten minste 70 % zijn (1)(6);  
— de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte  C. riparius  
en C. yoshimatsui  moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor  C. 
tentans  is een periode van 20 tot 65 dagen nodig;  
— aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste 
zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende 
temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een 
pH-waarde tussen 6 en 9 hebben;
 
— de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De 
watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te 
gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tus ­
senpozen bevestigd.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Testvaten  
11. De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en 
een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm
 2 per larve bedragen. De 
verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het boven ­
liggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon).
 
Keuze van de soorten  
12. Als testsoort heeft  Chironomus riparius  de voorkeur.  Chironomus tentans  is 
ook geschikt, maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode.  
Chironomus yoshimatsui  mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat 
bijzonderheden over de kweekmethoden van  Chironomus riparius . Er is 
ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soor ­
ten, namelijk  Chironomus tentans  (4) en  Chironomus yoshimatsui  (11). 
Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als 
de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voor ­
afgaand aan iedere test nodig.  
Sediment  
13. Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, ge ­
reconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sedi ­
ment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en 
gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhou ­
ding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de  Chironomidae  
zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het 
natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae  wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder de ­
zelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test 
wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) 
gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16):
 
a) 4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 
liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjes ­
grootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd;  
b) 20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % ka ­
oliniet);  
c) 75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn 
zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 
200 μm hebben);  
d) er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel 
een vochtgehalte van 30-50 % te geven;  
e) er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO  3 ) toegevoegd om het 
uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven. Het ge ­
halte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c).
 
14. De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De 
bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontrei ­
niging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en 
fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven 
van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment 
plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment 
voldoende geconditioneerd is.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Water  
15. Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigen ­
schappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als test ­
water. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (op ­
pervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ont ­
chloord kraanwater aanvaardbaar, mits de  Chironomidae  daarin gedurende 
het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 
hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO
 3 , niet hoger zijn 
dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden ge ­
bruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie 
moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwa ­
liteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft 
plaatsgevonden.
 
Stamoplossingen — Verrijkte sedimenten  
16. Verrijkte sedimenten worden gewoonlijk in de gekozen concentratie bereid 
door rechtstreeks een oplossing van de teststof aan het sediment toe te voegen. Een stamoplossing van de in gedeïoniseerd water opgeloste teststof wordt met het kunstmatige sediment gemengd met behulp van een wals of 
een voedermixer of door handmatig mengen. Indien de teststof slecht in 
water oplosbaar is, kan deze worden opgelost in een zo klein mogelijk volume van een geschikt organisch oplosmiddel (bv. hexaan, aceton of chloroform). Deze oplossing wordt vervolgens gemengd met 10 g fijn 
kwartszand per testvat. Laat het oplosmiddel verdampen, zodat het volledig 
uit het zand wordt verwijderd; vervolgens wordt het zand gemengd met een geschikte hoeveelheid sediment per testglas. Voor het oplossen, dispergeren of emulgeren van de teststof mogen alleen gemakkelijk verdampende op ­
losmiddelen worden gebruikt. Bij de bereiding van het sediment moet re ­
kening worden gehouden met het zand dat in het mengsel van teststof en zand aanwezig is (het sediment wordt dus met minder zand bereid). De aan het sediment toegevoegde teststof moet zorgvuldig en gelijkmatig over het 
sediment worden verdeeld. Zo nodig kunnen deelmonsters worden geanaly ­
seerd om de homogeniteit te bepalen.
 
TESTOPZET  
17. De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor 
waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau 
en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van tes ­
topzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest.
 
Opzet voor regressieanalyse  
18. De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC  15 
en EC  50 ) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van 
belang is, omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het 
bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (EC  x ) toe 
als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapo ­
laties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste con ­
centraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, 
kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Als een EC  x -schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf con ­
centraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende 
concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afge ­
weken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wan ­
neer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt ver ­
hoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen 
van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de 
groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist.
 
Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC  
20. Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf 
concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen 
de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet 
toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan ge ­
woonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets 
van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt.
 
Limiettest  
21. Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, 
kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). 
Deze limiettest wordt uitgevoerd bij een concentratie die voldoende hoog is om de besluitvormers in staat te stellen mogelijke toxische effecten van de 
teststof uit te sluiten; deze concentratie wordt vastgesteld op een niveau dat 
zich naar verwachting in geen enkele situatie zal voordoen. Een concentratie van 1 000 mg/kg (drooggewicht) wordt aanbevolen. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond 
moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een 
verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een sig ­
nificantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelings ­
tempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de 
gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, 
homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt 
is de exacte toets van Fisher geschikt.
 
PROCEDURE  
Blootstellingsomstandigheden  
Voorbereiding van het verrijkt sediment-watersysteem  
22. Voor het aanbrengen van de teststof wordt de in testmethode C.8, Toxiciteit 
voor regenwormen, beschreven verrijkingsprocedure aanbevolen (14). De 
verrijkte sedimenten worden in de vaten aangebracht, waaraan voldoende 
bovenliggend water wordt toegevoegd om te zorgen voor een volumever ­
houding van 1:4 tussen het sediment en het water (zie punten 11 en 15). De sedimentlaag moet een dikte van 1,5 tot 3 cm hebben. Om te voorkomen dat 
tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich 
van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen 
kunnen geschikt zijn.
 
23. De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdam ­
pingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie wor ­
den aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten 
ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden ge ­
bruikt.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilisatie  
24. Nadat het verrijkte sediment met bovenliggend water is voorbereid, is het 
wenselijk de teststof zich te laten verdelen uit de waterfase naar het sedi ­
ment (3)(4)(6)(13). Dit moet bij voorkeur gebeuren onder de in de test 
heersende temperatuur- en beluchtingsomstandigheden. De tijd die nodig 
is voor equilibratie hangt af van het sediment en de stof en kan variëren van enkele uren tot verscheidene dagen en soms zelfs weken (vier-vijf weken). Aangezien veel stoffen ondertussen zouden kunnen afbreken, wordt 
niet gewacht tot een evenwicht is ontstaan, maar wordt een equilibratiepe ­
riode van 48 uur aanbevolen. Aan het eind van deze nadere equilibratiepe ­
riode wordt in het bovenliggende water, het poriewater en het sediment, bij 
ten minste de hoogste en een lagere concentratie, de concentratie van de 
teststof gemeten (zie punt 38). Op basis van deze analysen van de teststof kan de massabalans worden berekend en kunnen de resultaten als gemeten concentraties worden uitgedrukt.
 
Toevoeging van testorganismen  
25. Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden 
toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het 
kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of 
enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn 
gelegd (twee tot drie dagen voor  Chironomus riparius  bij 20 °C en één tot 
vier dagen voor  Chironomus tentans  bij 23 °C en  Chironomus yoshimatsui  
bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia 
die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste 
stadium (2-3 of 1-4 dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6).
 
26. Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet wille ­
keurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het 
inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de 
beluchting van het water uitgezet (zie de punten 25 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 
voor de NOEC-bepaling.
 
Testconcentraties  
27. Om het concentratiebereik van de test te bepalen kan een bereikbepalingstest 
worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid 
per Chironomus  als in de eigenlijke test, worden de  Chironomidae  aan elke 
concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen 
duplo’s vereist.
 
28. De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uit ­
komsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties 
worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en 
met 20.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Controlegroep  
29. De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het 
vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19 en 20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een con ­
trolegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd.
 
Testsysteem  
30. Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen 
semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verver ­
sing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de 
kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorga ­
nisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijko ­
mende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk 
kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, 
zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur.
 
Voedsel  
31. De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, 
worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of 
TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te 
zijn (0,35-0,5 mg voor  C. yoshimatsui ). Oudere larven kunnen iets meer 
voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de 
controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- 
en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log K
 ow > 5) of voor stoffen die een covalente 
binding met het sediment aangaan, kan de voor de overleving en natuurlijke 
groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatie ­
periode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % 
(drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel ( Urtica dioica ), 
witte moerbei ( Morus alba ), witte klaver ( Trifolium repens ), spinazie ( Spi­
nacia oleracea ) of ander plantaardig materiaal ( Cerophyl  of alfacellulose).
 
Incubatieomstandigheden  
32. In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na 
toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de 
test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt beves ­
tigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, 
kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten.
 
33. De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). 
Voor  C. tentans  en C. yoshimatsui  bedraagt de aanbevolen temperatuur 
respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 
uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Blootstellingsduur  
34. De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en 
de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor  C. 
riparius  en C. yoshimatsui , en 65 dagen voor  C. tentans . Als eerder muggen 
uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn 
verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de contro ­
legroep.  
Waarnemingen  
Uitkomst van muggen  
35. De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en 
vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te her ­
kennen aan hun veerachtige antennes.  
36. De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een 
visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. ver ­
lating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de contro ­
legroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen 
worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen 
en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat 
opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoe ­
veel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzin ­
gen voor de meting van het uitkomen.
 
Groei en overleving  
37. Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist 
zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voort ­
zetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor 
„dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet 
meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt 
bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele droogge ­
wicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicra ­
nium van elk individu te meten.
 
Analytische bepalingen  
Concentratie van de teststof  
38. Voor aanvang van de test (d.w.z. voordat de larven worden toegevoegd) 
worden uit ten minste één vat per behandeling monsters van het bulksedi ­
ment genomen om de concentratie van de teststof in het sediment analytisch te bepalen. Aanbevolen wordt ten minste bij de hoogste en een lagere con ­
centratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sedi ­
ment te analyseren bij het begin (zie punt 24) en eind van de test. Deze 
bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem.
 
39. Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor 
de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde 
wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet 
voor biologische waarnemingen zijn gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoor ­
beeld 30 minuten bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan 
ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is.
 
Fysisch-chemische eigenschappen  
41. De pH en temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze 
worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten 
bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat 
worden gemeten bij de hoogste concentratie.  
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
42. Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het 
ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke 
en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overle ­
ving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resulta ­
ten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische 
analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ
 2 -r × 2-toets. Zo nodig worden na tien 
dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat 
van de larven bepaald.  
43. Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten sedi ­
mentconcentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die gebaseerd zijn op en uitgedrukt worden als drooggewicht.
 
44. Voor de berekening van een puntschatting voor de EC  50 of enige andere 
EC x kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij 
de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke EC  x moet reke ­
ning worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aange ­
toond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwa ­
dratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransfor ­
meerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de 
EC x -waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetrans ­
formeerd naar de oorspronkelijke waarde.  
45. Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door 
toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de vari ­
abiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke 
ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn.  
Uitkomstquotiënt  
46. Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een mo ­
notone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toe ­
gepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van 
Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens 
Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), 
moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van 
Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
47. Het aantal uitgekomen muggen per vat, n  e , wordt bepaald en gedeeld door 
het aantal in het vat gestopte larven, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
waarbij:  
ER = uitkomstquotiënt (emergence ratio);  
n e = aantal uitgekomen muggen per vat;  
n a = aantal larven dat in één vat is gestopt.  
48. Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, 
wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquo ­
tiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden 
behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van 
Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd mon ­
sters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf.
 
49. Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het 
uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een Freeman-Tukey-trans ­
formatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden ge ­
bruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher 
(Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoek ­
transformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin
 –1 ) van de vierkants ­
wortel van het uitkomstquotiënt te nemen.  
50. Voor uitkomstquotiënten worden de EC  x -waarden berekend door middel van 
regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële 
software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan 
twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt.
 
Ontwikkelingstempo  
51. Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd 
tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 
van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uit ­
komt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet reke ­
ning worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van 
inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwik ­
kelingstijd (eenheid: dag  –1 ) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling 
dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met 
de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft 
en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametri ­
sche testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikke ­
lingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue res ­
pons kunnen EC
 x = waarden worden geschat door middel van regressie ­
analyse (bv. (23)(24)).  
52. Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag 
x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijds ­
interval tussen dag x en dag x- l (l = lengte van het inspectie-interval, door ­
gaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat ( x) wordt als 
volgt berekend:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
waarbij:  
x: gemiddeld ontwikkelingstempo per vat;  
i: index van het inspectie-interval;  
m: maximumaantal inspectie-intervallen;  
ƒ i : in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen;  
n e : totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef (=  P ƒ i ) 
x i : ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen;  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
waarbij  
day  i : inspectiedag (dagen na aanbrengen);  
l i : lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag).  
Testverslag  
53. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opge ­
nomen:  
Teststof:  
— fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (op ­
losbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem 
(of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.);  
— identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, struc ­
tuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de 
analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof.  
Diersoort:  
— gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de or ­
ganismen en kweekomstandigheden;  
— informatie over de hantering van eipakketten en larven;  
— leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten 
werden gestopt.  
Testomstandigheden:  
— gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment;  
— voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sediment ­
monsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiede ­
nis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhou ­
ding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing);  
— bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen 
(gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test);
 
— bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigen ­
schappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het be ­
gin van de test);  
— dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water;  
— volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte 
sediment met en zonder poriewater;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— testvaten (materiaal en afmetingen);  
— sedimentverrijkingsmethode: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s 
en eventueel gebruik van oplosmiddel;  
— evenwichtsstabiliseringsfase van het verrijkte sediment-watersysteem: 
duur en omstandigheden;  
— incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, be ­
luchting (frequentie en intensiteit);  
— details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoe ­
veelheid en voederregime.  
Resultaten:  
— de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resul ­
taten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen;
 
— kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste 
zuurstof, hardheid en ammonia;  
— vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing;  
— aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per 
dag; 
— aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat;  
— gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per sta ­
dium, indien van toepassing;  
— percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke 
en vrouwelijke muggen gecombineerd);  
— gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per 
duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecom ­
bineerd);  
— schattingen van toxische eindpunten, bv. EC  x (met bijbehorende be ­
trouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische me ­
thoden waarmee zij zijn bepaald;  
— bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloe ­
ding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode.
 
LITERATUUR:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Devel ­
opment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Work ­
shop held in the Netherlands.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; 
Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Se ­
cond edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference 
Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
(14) Testmethode C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.  
(15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
(16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482-491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103-117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577-585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continu ­
ous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.  
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Voor de toepassing van deze testmethode wordt verstaan onder:  
kunstmatig sediment  (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment 
genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst;
 
„bovenliggend water ”: het water dat in het testvat op het sediment wordt ge ­
goten;  
„poriewater ” (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten 
tussen de sediment- en bodemdeeltjes;  
„verrijkt sediment ”: sediment waaraan teststof is toegevoegd;  
„teststof ”: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Aanhangsel 2  
Aanbevelingen voor de kweek van  Chironomus riparius  
1. Larven van  Chironomus  kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of 
grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag 
van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag ge ­
schikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uit ­
droging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting 
toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, 
zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 x 30 x 30 cm).
 
2. De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant 
klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht 
(intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve 
luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren.  
Verdunningswater  
3. Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebrui ­
kelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. 
Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water 
worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen.
 
Toediening van voedsel aan larven  
4. De larven van  Chironomus  worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg 
visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken 
toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit 
mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven.
 
5. Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweek ­
medium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toe ­
diening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig 
voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te 
veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden.
 
6. Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van 
groene algen (bv.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) worden 
toegevoegd.  
Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen  
7. Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplos ­
sing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen vol ­
wassen muggen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Uitkomst van muggen  
8. In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen 
volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
 
Eipakketten  
9. Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle lar ­
venkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwij ­
derd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van 
het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te 
beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests ge ­
bruikt.
 
10. Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen.  
Inrichting van nieuwe kweekvaten  
11. Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn een keer per week, of 
minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te 
richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer.
 
Bereiding van de testoplossingen M4 en M7  
12. Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op 
dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing 
mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de 
stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO
 3 5 H  2 O, NaNO  3 , 
KH  2 PO 4 en K  2 HPO  4 niet geschikt zijn.  
Bereiding van het medium M7  
13. Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) 
wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het me ­
dium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in 
tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen 
aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecom ­
bineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties be ­
waard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd.
 
LITERATUUR:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabel 1  
Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7  
Stamoplossingen (I) Hoeveelheid 
(mg) aangevuld 
tot 1 liter 
gedeïoniseerd 
water Gecombineerde stamoplossing (II) 
bereiden door de volgende 
hoeveelheden (ml) van de 
stamoplossingen (I) te mengen en tot 
1 liter gedeïoniseerd water aan te 
vullen Uiteindelijke concentraties in 
testoplossingen (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Deze stoffen zijn verschillend voor M4 en M7, zoals hierboven is aangegeven. 
( 2 ) Deze oplossingen worden apart bereid, vervolgens samengevoegd en onmiddellijk in een autoclaaf behandeld.  
Tabel 2  
Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7  
Hoeveelheid 
aangevuld tot 1 liter 
gedeïoniseerd water 
(mg) Hoeveelheid stamoplossing 
van macronutriënten die 
wordt toegevoegd om de 
media M4 en M7 te 
bereiden 
(ml/l) Uiteindelijke 
concentraties in de 
testoplossingen M4 en 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabel 3  
Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7. De drie vitamineoplossingen worden tot één 
vitaminestamoplossing samengevoegd  
Hoeveelheid aangevuld 
tot 1 liter gedeïoniseerd 
water 
(mg) Hoeveelheid 
vitaminestamoplossing die 
wordt toegevoegd om de 
media M4 en M7 te bereiden 
(ml/l) Uiteindelijke 
concentraties in de 
testoplossingen M4 en 
M7 
(mg/l)  
Thiaminehydrochloride 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamine (B12) 10 0,1 0,0010 Biotine 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATUUR:  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25-33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Aanhangsel 3  
BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT  
Samenstelling van het sediment  
Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld:  
Bestanddeel Eigenschappen % van het 
sediment 
(drooggewicht)  
Turf Veenmosturf, zo dicht moge ­
lijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijn ­
gemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 
mm) en aan de lucht ge ­
droogd 4-5 
Kwartszand Korrelgrootte: > 50 % van de 
deeltjes moet binnen het be ­
reik 50-200 μm liggen 75-76 
Kaolienklei Met ≥ 30 % kaoliniet 20 
Organische koolstof Aangepast door toevoeging 
van turf en zand 2 (± 0,5) 
Calciumcarbonaat CaCO
 3 , poedervormig, che ­
misch zuiver 0,05-0,1 
Water Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm 30-50  
Bereiding  
De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt 
een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van deze suspensie wordt met CaCO
 3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt 
ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd 
om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd 
water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte 
van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteinde ­
lijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO
 3 tot 6,5-7,5 
aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht 
en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunst ­
matige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor  
Chironomidae  wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde om ­
standigheden die ook in de test zullen heersen.  
Opslag  
De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen 
op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunst ­
matige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditionerings ­
periode die de bereiding afsluit, worden gebruikt.
 
LITERATUUR:  
Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Aanhangsel 4  
Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater  
Stof Concentraties  
Vaste deeltjes < 20 mg/l 
Totaalgehalte aan organische koolstof < 2 mg/l Niet-geïoniseerde ammonia < 1 μg/l 
Hardheid uitgedrukt als CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Restchloorgehalte < 10 μg/l 
Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden < 50 ng/l Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en poly ­
chloorbifenylen < 50 ng/l 
Totaalgehalte aan organisch chloor < 25 ng/l
 
(*) Opgemerkt zij echter dat als er een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof 
wordt vermoed, water met een lagere hardheid moet worden gebruikt (dan is 
Elendt-medium M4 dus ongeschikt).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Aanhangsel 5  
Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van 
chiromidae  
Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 
20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val:
 
A: nylon hor  
B: omgekeerde kunststofbekers  
C: bekerglas zonder tuit  D: openingen met hor voor wateruitwisseling  
E: water  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR  
CHIRONOMIDEA  IN SEDIMENT EN WATER M.BV VERRIJKT 
WATER  
INLEIDING  
1. Deze methode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 219 (2004) van de 
OESO. De testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoet ­
waterinsecten van  Chironomus  spp. aan stoffen. Zij berust hoofdzakelijk op 
de BBA-richtsnoeren en maakt gebruik van een testsysteem van sediment en 
water met kunstmatige grond en een blootstellingsscenario voor de water ­
kolom (1). De methode houdt ook rekening met de bestaande toxiciteitstest ­
protocollen voor  Chironomus riparius  en Chironomus tentans  die in Europa 
en Noord-Amerika zijn ontwikkeld (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) en aan een ring ­
onderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocu ­
menteerde  Chironomidae  worden gebruikt, bijvoorbeeld  Chironomus yoshi ­
matsui  (10)(11).
 
2. Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt gebruik ­
gemaakt van verrijkt water. De selectie van het juiste blootstellingsscenario 
hangt af van het beoogde doel van de test. Het waterblootstellingsscenario, 
waarbij de waterkolom wordt verrijkt, is bedoeld om een gebeurtenis na te bootsen waarbij een gespoten bestrijdingsmiddel overwaait; het scenario heeft betrekking op de initiële concentratiepiek in het poriewater. Dit sce ­
nario is ook bruikbaar voor andersoortige blootstelling (waaronder weglek ­
kende chemische stoffen), maar niet voor accumulatieprocessen die langer duren dan de testperiode.
 
3. De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organis ­
men, zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden 
blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die 
voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de be ­
trokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log K
 ow > 
5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden over ­
wogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te 
voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor  C. riparius  en C. yoshimatsui , en 28-65 dagen 
voor C. tentans . Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten 
van onstabiele stoffen te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden ver ­
wijderd.
 
4. De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en 
de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist 
zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten 
na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken.  
5. Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sedi ­
ment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten:  
— de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceer ­
bare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen;
 
— het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment 
kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voor ­
behandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunst ­
matig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het 
veld hoeft te worden verzameld voor routinetests;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen 
vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerang ­
schikt: voor verscheidene stoffen zijn de toxiciteitsgegevens uit tests met natuurlijk en kunstmatig sediment vergelijkbaar gebleken (2).
 
6. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.  
PRINCIPE VAN DE TEST  
7. Larven in het eerste stadium van  Chironomidae  worden in 
sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof bloot ­
gesteld. De test begint op het moment waarop de larven in het eerste 
stadium in de testbekers met het sediment-watersysteem worden gestopt, 
waarna het water met de teststof wordt verrijkt. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van  Chironomidae  
gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het ge ­
wicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende 
duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van 
larven met x % (bv. EC
 15 , EC  50 enz.), hetzij een statistische hypothese te 
toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden ver ­
geleken.
 
GEGEVENS OVER DE TESTSTOF  
8. De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de 
gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, be ­
schikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenlig ­
gend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de struc ­
tuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke che ­
mische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische 
afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen 
van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen.
 
REFERENTIESTOFFEN  
9. Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de 
betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarbor ­
gen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonder ­
zoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, penta ­
chloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13).  
GELDIGHEID VAN DE TEST  
10. De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan:  
— het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de 
test ten minste 70 % zijn (1)(6);  
— de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte  C. riparius  
en C. yoshimatsui  moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor  C. 
tentans  is een periode van 20 tot 65 dagen nodig;  
— aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste 
zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende 
temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een 
pH-waarde tussen 6 en 9 hebben;
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De 
watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te 
gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tus ­
senpozen bevestigd.  
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Testvaten  
11. De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en 
een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het 
sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm
 2 per larve bedragen. De 
verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het boven ­
liggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch 
inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon).
 
Keuze van de soorten  
12. Als testsoort heeft  Chironomus riparius  de voorkeur.  Chironomus tentans  is 
ook geschikt maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode.  
Chironomus yoshimatsui  mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat 
bijzonderheden over de kweekmethoden van  Chironomus riparius . Er is 
ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soor ­
ten, namelijk  Chironomus tentans  (4) en  Chironomus yoshimatsui  (11). 
Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voor ­
afgaand aan iedere test nodig.
 
Sediment  
13. Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, ge ­
reconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sedi ­
ment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhou ­
ding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het 
vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de  Chironomidae  
zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het 
natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit 
voor Chironomidae  wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder de ­
zelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) 
gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16):
 
a) 4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 
liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjes ­
grootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd;  
b) 20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % ka ­
oliniet);  
c) 75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn 
zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 
200 μm hebben);  
d) er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel 
een vochtgehalte van 30-50 % te geven;  
e) er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO  3 ) toegevoegd om het 
uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven.  
f) Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 
2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van 
extra turf en zand overeenkomstig a) en c).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De 
bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontrei ­
niging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen 
is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het 
bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is.
 
Water  
15. Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigen ­
schappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als test ­
water. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (op ­
pervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ont ­
chloord kraanwater aanvaardbaar, mits de  Chironomidae  daarin gedurende 
het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO
 3 , niet hoger zijn 
dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de 
teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden ge ­
bruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwa ­
liteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden 
gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden.
 
Stamoplossingen — verrijkt water  
16. De testconcentraties worden berekend op basis van de concentraties in de 
waterkolom, d.w.z. het boven het sediment liggende water. Testoplossingen 
van de gekozen concentraties worden gewoonlijk bereid door verdunning van een stamoplossing. De stamoplossingen worden bij voorkeur bereid door oplossing van de teststof in het testmedium. Het gebruik van oplos ­
middelen of dispergeermiddelen kan in bepaalde gevallen nodig zijn om een 
stamoplossing van een passende concentratie te verkrijgen. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn aceton, ethanol, methanol, ethyleenglycolmo ­
noëthylether, ethyleenglycoldimethylether, dimethylformamide en triëthy ­
leenglycol. Als dispergeermiddelen mogen Cremophor RH40, Tween 80, 
0,01 % methylcellulose en HCO-40 worden gebruikt. De concentratie van de solubilisator in het uiteindelijke testmedium moet minimaal zijn (d.w.z. ≤ 
0,1 ml/l) en moet in elke testgroep gelijk zijn. Indien een solubilisator wordt 
gebruikt, mag dit geen significante effecten op de overleving hebben, noch 
een zichtbaar negatief effect op de  Chironomidae -larven hebben, hetgeen 
blijkt uit de controlegroep met uitsluitend oplosmiddel. Het gebruik van deze stoffen moet echter zo veel mogelijk worden vermeden.
 
TESTOPZET  
17. De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor 
waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van tes ­
topzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de 
uitvoering van een limiettest. Regressieanalyse heeft de voorkeur boven 
toetsing van een hypothese.
 
Opzet voor regressieanalyse  
18. De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC  15 
en EC  50 ) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van 
belang is omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het 
bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (EC  x ) toe ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapo ­
laties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste con ­
centraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27).
 
19. Als een EC  x -schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf con ­
centraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de 
dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afge ­
weken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wan ­
neer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt ver ­
hoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de 
testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen 
van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende 
duplo’s vereist.
 
Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC  
20. Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf 
concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet 
toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om 
een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan ge ­
woonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets 
van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de 
toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt.
 
Limiettest  
21. Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, 
kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). De limiettest dient om aanwijzingen te verzamelen dat de toxische waarde van de teststof groter is dan de geteste limietconcentratie. Er kan geen 
concentratie voor deze testmethode worden aanbevolen; die wordt aan het 
oordeel van de regelgever overgelaten. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % 
met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 
5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voor ­
waarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). 
Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke 
variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney- toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt.
 
PROCEDURE  
Blootstellingsomstandigheden  
Voorbereiding van het verrijkt water-sedimentsysteem  
22. In de testvaten wordt voldoende kunstmatig sediment (zie de punten 13-14 
en aanhangsel 3) aangebracht om een laag van ten minste 1,5 cm te vormen. 
Vervolgens wordt een 6 cm diepe laag water toegevoegd (zie punt 15). De 
verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het water mag niet groter zijn dan 1:4 en de sedimentlaag mag niet dikker zijn dan 3 cm. Laat het sediment-watersysteem onder voorzichtige beluchting zeven 
dagen rusten voordat de testorganismen worden toegevoegd (zie punt 14 en 
aanhangsel 3). Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten 
worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt 
verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdam ­
pingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie wor ­
den aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden ge ­
bruikt.
 
Toevoeging van testorganismen  
24. Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden 
toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur 
of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het 
kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten 
gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn 
gelegd (twee tot drie dagen voor  Chironomus riparius  bij 20 °C en één tot 
vier dagen voor  Chironomus tentans  bij 23 °C en  Chironomus yoshimatsui  
bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia 
die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste 
stadium (twee-drie of één-vier dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6).
 
25. Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet wille ­
keurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het 
inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 24 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per 
concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 
voor de NOEC-bepaling.
 
26. 24 uur na toevoeging van de larven wordt de bovenliggende waterkolom 
met de teststof verrijkt, waarna weer lichte beluchting wordt toegepast. Onder het wateroppervlak worden met een pipet kleine hoeveelheden van 
de teststofoplossing ingebracht. Vervolgens wordt het bovenliggende water 
voorzichtig gemengd, zonder het sediment te verstoren.
 
Testconcentraties  
27. Om het concentratiebereik van de test te bepalen, kan een bereikbepalings ­
test worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concen ­
traties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlakte ­
dichtheid per  Chironomus  als in de eigenlijke test, worden de  Chironomidae  
aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die 
een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn 
geen duplo’s vereist.  
28. De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uit ­
komsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en 
met 20.
 
Controlegroep  
29. De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het 
vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19-20). Indien voor het aanbrengen 
van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een con ­
trolegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Testsysteem  
30. Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen 
semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verver ­
sing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de 
kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorga ­
nisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijko ­
mende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk 
kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, 
zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur.
 
Voedsel  
31. De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, 
worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg 
visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor  C. yoshimatsui ). Oudere larven kunnen iets meer 
voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per 
dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan 
worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende 
stoffen (bijvoorbeeld met log K
 ow > 5) of voor stoffen die een covalente 
binding met het sediment aangaan kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatie ­
periode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval 
wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel ( Urtica dioica ), 
witte moerbei ( Morus alba ), witte klaver ( Trifolium repens ), spinazie ( Spi­
nacia oleracea ) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose).
 
Incubatieomstandigheden  
32. In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na 
toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opge ­
loste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt 
plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten.
 
33. De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). 
Voor  C. tentans  en C. yoshimatsui  bedraagt de aanbevolen temperatuur 
respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 
uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux.  
Blootstellingsduur  
34. De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en 
de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor  C. 
riparius  en C. yoshimatsui , en 65 dagen voor  C. tentans . Als eerder muggen 
uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de contro ­
legroep.
 
WAARNEMINGEN  
Uitkomst van muggen  
35. De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en 
vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te her ­
kennen aan hun veerachtige antennes.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een 
visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. ver ­
lating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de contro ­
legroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen 
worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen 
en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat 
opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoe ­
veel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzin ­
gen voor de meting van het uitkomen.
 
Groei en overleving  
37. Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist 
zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voort ­
zetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt 
door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor 
„dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). 
Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt 
bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele droogge ­
wicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicra ­
nium van elk individu te meten.
 
Analytische bepalingen  
Concentratie van de teststof  
38. Er moeten ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van 
het bovenliggende water, het poriewater en het sediment worden geanaly ­
seerd bij het begin (bij voorkeur een uur na inbrenging van de teststof) en 
eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem. Aangezien bemonstering van het sediment bij het 
begin van de test van invloed kan zijn op het testsysteem (bv. doordat de 
testlarven worden verwijderd), moeten voor de analytische bepalingen bij het begin van de test en tijdens de test zo nodig aanvullende testvaten worden gebruikt (zie punt 39). Als in een water/sedimentstudie onder ver ­
gelijkbare omstandigheden (bv. verhouding sediment/water, soort toepas ­
sing, organischekoolstofgehalte van het sediment) de verdeling van de test ­
stof tussen het water en het sediment duidelijk is bepaald, kunnen metingen in het sediment niet noodzakelijk zijn.
 
39. Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor 
de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde 
wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet 
voor biologische waarnemingen zijn gebruikt.
 
40. Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoor ­
beeld 30 min bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsor ­
beert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het porie ­
water onmogelijk zijn doordat het monster te klein is.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fysisch-chemische eigenschappen  
41. De pH, het gehalte aan opgeloste zuurstof in het testwater en de temperatuur 
van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind 
van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de 
hoogste concentratie.
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
42. Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het 
ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overle ­
ving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een 
statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resulta ­
ten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch 
worden beoordeeld met bv. een χ
 2 -r × 2 -toets. Zo nodig worden na tien 
dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald.
 
43. Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten con ­
centraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die als con ­
centratie in het bovenliggende water worden uitgedrukt.  
44. Voor de berekening van een puntschatting voor de EC  50 of enige andere 
EC x kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij 
de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke EC  x moet reke ­
ning worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aange ­
toond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwa ­
dratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransfor ­
meerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de 
EC x -waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetrans ­
formeerd naar de oorspronkelijke waarde.  
45. Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door 
toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de vari ­
abiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn.
 
Uitkomstquotiënt  
46. Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een mo ­
notone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die 
verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toe ­
gepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens 
Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat 
de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van 
Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt.
 
47. Het aantal uitgekomen muggen per vat, n  e , wordt bepaald en gedeeld door 
het aantal in het vat gestopte larven, n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
waarbij:  
ER = uitkomstquotiënt (emergence ratio);  
n e = aantal uitgekomen muggen per vat;  
n a = aantal larven dat in één vat is gestopt.  
48. Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, 
wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over 
het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquo ­
tiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van 
Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd mon ­
sters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf.
 
49. Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het 
uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een freeman-tukeytransformatie ondergaan om een approximatieve normale ver ­
deling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute 
frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden ge ­
bruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin
 –1 ) van 
de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen.  
50. Voor uitkomstquotiënten worden de EC  x -waarden berekend door middel van 
regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, 
zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt.
 
Ontwikkelingstempo  
51. Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd 
tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 
van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uit ­
komt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet reke ­
ning worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van 
inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwik ­
kelingstijd (eenheid: dag  –1 ) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling 
dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met 
de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft 
en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametri ­
sche testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikke ­
lingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue res ­
pons kunnen EC
 x = waarden worden geschat door middel van regressie ­
analyse (bv. (23)(24)).  
52. Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag 
x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijds ­
interval tussen dag x en dag x- l (l = lengte van het inspectie-interval, door ­
gaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat ( x) wordt als 
volgt berekend:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
waarbij:  
x: gemiddeld ontwikkelingstempo per vat;  
i: index van het inspectie-interval;  
m: maximumaantal inspectie-intervallen;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen;  
n e : totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef (  P ƒ i ) 
x i : ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen;  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
waarbij:  
day  i : inspectiedag (dagen na aanbrengen);  
l i : lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag).  
Testverslag  
53. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opge ­
nomen:  
Teststof:  
— fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (op ­
losbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem 
(of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.);  
— identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, struc ­
tuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de 
analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof.  
Diersoort:  
— gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de or ­
ganismen en kweekomstandigheden;  
— informatie over de hantering van eipakketten en larven;  
— leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten 
werden gestopt.  
Testomstandigheden:  
— gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment;  
— voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sediment ­
monsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiede ­
nis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhou ­
ding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing);  
— bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen 
(gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test);
 
— bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigen ­
schappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het be ­
gin van de test);  
— dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water;  
— volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte 
sediment met en zonder poriewater;  
— testvaten (materiaal en afmetingen);  
— bereidingswijze van stamoplossingen en testconcentraties;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— aanbrenging van de teststof: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s 
en eventueel gebruik van oplosmiddel;  
— incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, be ­
luchting (frequentie en intensiteit);  
— details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoe ­
veelheid en voederregime.  
Resultaten:  
— de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resul ­
taten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen;
 
— kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste 
zuurstof, hardheid en ammonia;  
— vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing;  
— aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per 
dag; 
— aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat;  
— gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per sta ­
dium, indien van toepassing;  
— percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke 
en vrouwelijke muggen gecombineerd);  
— gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per 
duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecom ­
bineerd);  
— schattingen van toxische eindpunten, bv. EC  x (met bijbehorende be ­
trouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische me ­
thoden waarmee zij zijn bepaald;  
— bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloe ­
ding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van 
deze testmethode.  
LITERATUUR:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Devel­
opment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Work ­
shop held in the Netherlands.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; 
Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Se ­
cond edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition 
dated June 1994.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.  
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
 
(14) Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.  
(15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
(16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482-491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103-117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510-531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48:577-585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continu ­
ous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.  
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Voor de toepassing van deze methode wordt verstaan onder:  
Kunstmatig sediment  (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment 
genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst.
 
Bovenliggend water : het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten.  
Poriewater  (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen 
de sediment- en bodemdeeltjes.  
Verrijkt water : testwater waaraan teststof is toegevoegd.  
Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Aanhangsel 2  
Aanbevelingen voor de kweek van  Chironomus riparius  
1. Larven van  Chironomus  kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of 
grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag 
van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag ge ­
schikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uit ­
droging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting 
toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, 
zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 × 30 × 30 cm).
 
2. De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant 
klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht 
(intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve 
luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren.  
Verdunningswater  
3. Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebrui ­
kelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. 
Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water 
worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen.
 
Toediening van voedsel aan larven  
4. De larven van  Chironomus  worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg 
visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken 
toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit 
mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven.
 
5. Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweek ­
medium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toe ­
diening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig 
voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te 
veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden.
 
6. Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van 
groene algen (bv.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) worden 
toegevoegd.  
Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen  
7. Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplos ­
sing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen vol ­
wassen muggen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Uitkomst van muggen  
8. In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen 
volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes.
 
Eipakketten  
9. Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle lar ­
venkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwij ­
derd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van 
het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te 
beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests ge ­
bruikt.
 
10. Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen.  
Inrichting van nieuwe kweekvaten  
11. Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn één keer per week, of 
minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer 
van volwassen muggen met een minimum aan beheer.
 
Bereiding van de testoplossingen M4 en M7  
12. Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op 
dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing 
mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de 
stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO
 3 5H 2 O, NaNO  3 , 
KH  2 PO 4 en K  2 HPO  4 niet geschikt zijn.  
Bereiding van het medium M7  
13. Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) 
wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het me ­
dium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing 
wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen 
aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecom ­
bineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties be ­
waard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd.
 
Tabel 1  
Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7  
Stamoplossingen (I) Hoeveelheid 
(mg) aangevuld 
tot 1 liter 
gedeïoniseerd 
water Gecombineerde stamoplossing (II) 
bereiden door de volgende 
hoeveelheden (ml) van de 
stamoplossingen (I) te mengen en tot 
1 liter gedeïoniseerd water aan te 
vullen Uiteindelijke concentraties in 
testoplossingen (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Stamoplossingen (I) Hoeveelheid 
(mg) aangevuld 
tot 1 liter 
gedeïoniseerd 
water Gecombineerde stamoplossing (II) 
bereiden door de volgende 
hoeveelheden (ml) van de 
stamoplossingen (I) te mengen en tot 
1 liter gedeïoniseerd water aan te 
vullen Uiteindelijke concentraties in 
testoplossingen (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Deze stoffen zijn verschillend voor M4 en M7, zoals hierboven is aangegeven. 
( 2 ) Deze oplossingen worden apart bereid, vervolgens samengevoegd en onmiddellijk in een autoclaaf behandeld.  
Tabel 2  
Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7  
Hoeveelheid 
aangevuld tot 1 liter 
gedeïoniseerd water 
(mg) Hoeveelheid stamoplossing 
van macronutriënten die 
wordt toegevoegd om de 
media M4 en M7 te 
bereiden 
(ml/l) Uiteindelijke 
concentraties in de 
testoplossingen M4 en 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabel 3  
Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7  
De drie vitamineoplossingen worden tot één vitaminestamoplossing samengevoegd.  
Hoeveelheid aangevuld 
tot 1 liter gedeïoniseerd 
water 
(mg) Hoeveelheid 
vitaminestamoplossing die 
wordt toegevoegd om de 
media M4 en M7 te bereiden 
(ml/l) Uiteindelijke 
concentraties in de 
testoplossingen M4 en 
M7 
(mg/l)  
Thiaminehydrochloride 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamine (B12) 10 0,1 0,0010 Biotine 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATUUR:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Aanhangsel 3  
BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT  
Samenstelling van het sediment  
Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld:  
Bestanddeel Eigenschappen % van het sediment 
(drooggewicht)  
Turf Veenmosturf, zo dicht moge ­
lijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijn ­
gemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 
mm) en aan de lucht ge ­
droogd 4-5 
Kwartszand Korrelgrootte: > 50 % van de 
deeltjes moet binnen het be ­
reik 50-200 μm liggen 75-76 
Kaolienklei Met ≥ 30 % kaoliniet 20 
Organische koolstof Aangepast door toevoeging 
van turf en zand 2 (± 0,5) 
Calciumcarbonaat CaCO
 3 , poedervormig, che ­
misch zuiver 0,05-0,1 
Water Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm 30-50  
Bereiding  
De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt 
een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van 
deze suspensie wordt met CaCO
 3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt 
ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de 
turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd 
water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteinde ­
lijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO
 3 tot 6,5-7,5 
aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht 
en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunst ­
matige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor  
Chironomidae  wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde om ­
standigheden die ook in de test zullen heersen.  
Opslag  
De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen 
op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunst ­
matige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt 
gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditionerings ­
periode die de bereiding afsluit, worden gebruikt.  
LITERATUUR:  
Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Aanhangsel 4  
Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater  
Stof Concentraties  
Vaste deeltjes < 20 mg/l 
Totaalgehalte aan organische koolstof < 2 mg/l Niet-geïoniseerde ammonia < 1 μg/l 
Hardheid uitgedrukt als CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Restchloorgehalte < 10 μg/l 
Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden < 50 ng/l Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en poly ­
chloorbifenylen < 50 ng/l 
Totaalgehalte aan organisch chloor < 25 ng/l
 
(*) Opgemerkt zij echter dat als er een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof 
wordt vermoed, water met een lagere hardheid moet worden gebruikt (dan is 
Elendt-medium M4 dus ongeschikt).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Aanhangsel 5  
Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van  
Chiromidae  
Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 
20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val:
 
A: nylon hor  
B: omgekeerde kunststofbekers  
C: bekerglas zonder tuit  D: openingen met hor voor wateruitwisseling  
E: water  
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  GEMAKKELIJKE BIOLOGISCHE AFBREEKBAARHEID — CO  2 
IN GESLOTEN VATEN (GASRUIMTETEST)  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 310 (2006) van de OESO 
(TG 310). Deze testmethode is een schiftingsproef voor de beoordeling van 
de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid van chemische stoffen en biedt soortgelijke informatie als de zes testmethoden die in hoofdstuk C.4 A tot en met F van deze bijlage worden beschreven. Derhalve kan een chemische 
stof waarvoor bij deze testmethode positieve resultaten worden geregis ­
treerd, worden beschouwd als gemakkelijk biologisch afbreekbaar en daarom ook als snel afbreekbaar in het milieu.
 
2. De erkende koolstofdioxidemethode (CO  2 -methode) (1), op basis van de 
oorspronkelijke Sturm-test (2) voor het beoordelen van de biologische af ­
breekbaarheid van organische chemische stoffen, waarbij het door microbi ­
ële activiteit geproduceerde koolstofdioxide wordt gemeten, is gewoonlijk de eerste keuze voor het testen van slecht oplosbare chemische stoffen en 
sterk adsorberende stoffen. Deze test wordt ook gekozen voor oplosbare 
(maar niet vluchtige) chemische stoffen, aangezien de ontwikkeling van koolstofdioxide door velen wordt beschouwd als het enige ondubbelzinnige bewijs van microbiële activiteit. De verwijdering van opgeloste organische 
koolstof kan worden bereikt door fysisch-chemische processen — adsorptie, 
vervluchtiging, neerslaan, hydrolyse — evenals door microbiële activiteit. Ook vele niet-biologische reacties verbruiken zuurstof; slechts zelden wordt CO
 2 op een abiotische manier geproduceerd uit organische chemische stof ­
fen. In de oorspronkelijke en gewijzigde Sturm-test (1)(2) wordt CO  2 ver­
wijderd uit de vloeibare fase naar de absorptievaten door middel van uit ­
wassen (d.w.z. met luchtbellen die behandeld zijn om CO  2 uit het vloeibare 
medium te verwijderen), terwijl CO  2 in de versie van Larson (3)(4) wordt 
overgebracht van het reactievat naar de absorptievaten door CO  2 -vrije lucht 
door de gasruimte te blazen en daarbij het testvat continu te schudden. Enkel in de gewijzigde versie van Larson wordt het reactievat geschud, terwijl 
roeren uitsluitend wordt gespecificeerd voor onoplosbare stoffen in ISO 
9439 (5) en in de oorspronkelijke Amerikaanse versie (6), waarbij beide versies uitwassen in plaats van gasruimtevervanging specificeren. In een andere officiële Amerikaanse EPA-methode (7) op basis van de methode 
van Gledhill (8) wordt het reactievat geschud en afgesloten voor de atmos ­
feer. Het geproduceerde CO
 2 wordt rechtstreeks uit de gasvormige fase 
verzameld in een interne alkalische afscheider, zoals in de klassieke res ­
pirometerkolven van Warburg/Barcroft.  
3. Echter, aangetoond is dat anorganische koolstof (IC) zich ophoopt in het 
medium tijdens de toepassing van de standaard-, gewijzigde Sturm-test bij een aantal chemische stoffen (9). Een IC-concentratie van niet minder dan 8 mg/l werd aangetroffen tijdens de afbraak van 20 mg C/l aniline. Dit bete ­
kent dat de verzameling van CO
 2 in de alkalische afscheiders geen waar ­
heidsgetrouwe weerspiegeling was van de hoeveelheid CO  2 die op micro ­
biologische wijze werd geproduceerd op tussentijdse momenten tijdens de afbraak. Bijgevolg zal de specificatie dat > 60 % van de theoretische maxi ­
male CO
 2 -productie (ThCO  2 ) moet worden verzameld binnen een „tien ­
dagenvenster” (de tien dagen die onmiddellijk volgen op het bereiken van de biologische afbreekbaarheid van 10 %) om een teststof in te delen als gemakkelijk biologisch afbreekbaar, niet bereikt worden voor bepaalde che ­
mische stoffen die die indeling wel zouden krijgen bij toepassing van de 
verwijderingsmethode met opgeloste organische koolstof (DOC).
 
4. Als het percentage afbraak lager is dan verwacht, is mogelijk sprake van 
opeenhoping van anorganische koolstof in de testoplossing. In dergelijke 
gevallen kan gebruik worden gemaakt van de andere tests op gemakkelijke 
biologische afbreekbaarheid.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Andere nadelen van de Sturm-methodologie (omslachtig, tijdrovend, grotere 
kans op toevallige fouten en niet toepasbaar op vluchtige chemische stoffen) 
waren eerder aanleiding om te zoeken naar een techniek voor gesloten vaten, anders dan die van Gledhill, in plaats van doorblazen met gas (10)(11). Boatman  et al.  (12) hebben de vroegere methoden beoordeeld 
en gekozen voor een systeem met een gesloten gasruimte, waarin het CO
 2 
aan het eind van de incubatie door middel van aanzuren van het medium 
vrijkwam in de gasruimte. CO  2 werd gemeten door middel van 
gaschromatografie (GC)/IC-analyse in automatisch genomen monsters van 
de gasruimte, maar er werd geen rekening gehouden met opgeloste anorga ­
nische koolstof (DIC) in de vloeibare fase. Ook waren de gebruikte vaten zeer klein (20 ml) en bevatten ze slechts 10 ml medium, wat tot problemen leidde, bv. bij het toevoegen van de noodzakelijkerwijs zeer kleine hoe ­
veelheden onoplosbare teststoffen. Ook is het mogelijk dat in het geënte 
medium onvoldoende of geen micro-organismen aanwezig waren die in staat waren om te zorgen voor de afbraak van de teststoffen.
 
6. Deze moeilijkheden zijn overwonnen door de onafhankelijke onderzoeken 
van Struijs en Stoltenkamp (13) en van Birch en Fletcher (14), waarbij laatstgenoemden geïnspireerd werden door hun ervaringen met apparatuur die was gebruikt in de test op anaerobe biologische afbreekbaarheid (15). In 
de eerstgenoemde methode (13) werd CO
 2 gemeten in de gasruimte na 
aanzuren en equlibratie, terwijl in de laatstgenoemde methode (14) DIC werd gemeten in zowel de gas- als de vloeibare fase, zonder behandeling met teststof; meer dan 90 % van het geproduceerde IC was aanwezig in de 
vloeibare fase. Beide methoden hebben voordelen ten opzichte van de 
Sturm-test in de zin dat het testsysteem compacter en beter hanteerbaar is, ook vluchtige chemische stoffen getest kunnen worden en de mogelijkheid van vertraging in het meten van het geproduceerde CO
 2 wordt voorkomen.  
7. De twee methoden werden gecombineerd in de ISO-norm voor CO  2 in 
gasruimten (16), die werd onderworpen aan een ringtest (17), en dit is de norm die de basis vormt van de onderhavige testmethode. Zo ook zijn de 
twee methoden in de Amerikaanse EPA-methode (18) toegepast. Twee me ­
thoden voor het meten van CO
 2 zijn aanbevolen, namelijk CO  2 in de gas ­
ruimte na aanzuren (13) en IC in de vloeibare fase na toevoeging van een overmaat alkali. De laatstgenoemde methode werd geïntroduceerd door Pe ­
terson tijdens de CONCAWE-ringtest (19) van deze gasruimtemethode, in 
een gewijzigde vorm om inherente biologische afbreekbaarheid te meten. De wijzigingen die zijn doorgevoerd in de herziening van 1992 (20) van de in hoofdstuk C.4 van deze bijlage over gemakkelijke biologische afbreekbaar ­
heid beschreven methoden zijn in de onderhavige testmethode geïntegreerd, 
zodat de omstandigheden (medium, duur enz.) voor het overige dezelfde zijn als in de herziene Sturm-test (20). Birch en Fletcher (14) hebben aangetoond dat met deze gasruimtetest testresultaten werden bereikt die zeer vergelijk ­
baar waren met de resultaten die werden behaald met dezelfde chemische 
stoffen in de OESO-ringtest (21) van de herziene testmethoden.
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
8. De teststof, doorgaans 20 mg C/l, zijnde de enige bron van koolstof en 
energie, wordt geïncubeerd in een uit anorganische bufferzouten bestaand 
medium, dat geënt is met een gemengde populatie micro-organismen. De 
test wordt uitgevoerd in gesloten flessen met bovenin een gasruimte met lucht, die een reservoir van zuurstof voor aerobe biologische afbraak vormt. De CO
 2 -ontwikkeling die het gevolg is van de totale aerobe biologische 
afbraak van de teststof wordt bepaald door de overmaat aan IC te meten die 
wordt geproduceerd in de testflessen in vergelijking met de hoeveelheid IC die wordt geproduceerd in blanco vaten die uitsluitend geënt medium be ­
vatten. De mate van afbraak wordt uitgedrukt als een percentage van de 
theoretische maximale productie van anorganische koolstof (ThIC), op basis 
van de hoeveelheid teststof (als organische koolstof) die in eerste instantie werd toegevoegd.
 
9. De verwijdering van DOC en/of de mate van primaire biologische afbraak 
van de teststof kan eveneens worden gemeten (20).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMATIE OVER DE TESTSTOF  
10. Het gehalte aan organische koolstof (gewichtspercent) van de teststof moet 
bekend zijn, hetzij op basis van de chemische structuur ervan hetzij door het te meten, zodat de procentuele afbraak kan worden berekend. Voor vluch ­
tige teststoffen is een gemeten of berekende constante van de wet van Henry 
nuttig voor het bepalen van een geschikte verhouding van de gasruimte tot het vloeistofvolume. Informatie over de toxiciteit van de teststof voor micro-organismen is nuttig voor het kiezen van de juiste testconcentratie 
en voor het interpreteren van resultaten die op slechte biologische afbreek ­
baarheid duiden: aanbevolen wordt om de inhibitietest uit te voeren, tenzij bekend is dat de teststof geen inhibitoir effect heeft op microbiële activitei ­
ten (zie punt 24).
 
TOEPASBAARHEID VAN DE METHODE  
11. De test is toepasbaar op in water oplosbare en onoplosbare teststoffen, 
hoewel een goede dispersie van de teststof moet worden gewaarborgd. 
Met gebruikmaking van de aanbevolen verhouding tussen gasruimte en 
vloeistofvolume van 1:2 kunnen vluchtige chemische stoffen met een con ­
stante van de wet van Henry van maximaal 50 Pa.m  3 .mol  –1 worden getest, 
aangezien het aandeel van de teststof in de gasruimte niet meer zal zijn dan 
1 % (13). Een kleinere gasruimte kan worden gebruikt voor het testen van 
chemische stoffen met een hogere vluchtigheid, maar hun biobeschikbaar ­
heid kan beperkend zijn, met name indien ze slecht oplosbaar zijn in water. Echter, gebruikers moeten waarborgen dat de verhouding tussen de gas ­
ruimte en het vloeistofvolume en de teststofconcentratie dusdanig zijn dat 
voldoende zuurstof beschikbaar is om volledige aerobe biologische afbraak te kunnen doen plaatsvinden (d.w.z. vermijd het gebruik van een hoge substraatconcentratie en een klein gasruimtevolume). Richtsnoeren hiervoor 
zijn te vinden in (13)(23).
 
REFERENTIESTOFFEN  
12. Ter controle van de testprocedure moet een referentiestof met een bekende 
biologische afbreekbaarheid tegelijkertijd worden getest. Hiervoor kunnen 
aniline, natriumbenzoaat of ethyleenglycol worden gebruikt bij het testen van in water oplosbare teststoffen en 1-octanol bij het testen van slecht oplosbare teststoffen (13). De biologische afbraak van deze stoffen moet 
binnen 14 dagen > 60 % ThIC bereiken.
 
REPRODUCEERBAARHEID  
13. In de ISO-ringtest van de methode (17) werden de volgende resultaten 
behaald met gebruikmaking van de aanbevolen omstandigheden, met in ­
begrip van 20 mg C teststof/l.  
Teststof Gemiddelde 
procentuele 
biologische afbraak 
(28d) Variatiecoëfficiënt 
(%) Aantal laboratoria  
Aniline 90 16 17 
1-octanol 85 12 14  
De intertestvariabiliteit (repliceerbaarheid), met gebruikmaking van aniline, 
was laag met variabiliteitscoëfficiënten van maximaal 5 % in bijna iedere uitvoering van de test. In de twee gevallen waarin de repliceerbaarheid 
slechter was, was de grotere variabiliteit waarschijnlijk te wijten aan een 
hoge IC-productie in de blanco vaten. De repliceerbaarheid was slechter met 1-octanol, maar was nog steeds minder dan 10 % voor 79 % van de test-uitvoeringen. Deze grotere intertestvariabiliteit kan veroorzaakt zijn 
door doseerfouten, aangezien een klein volume (3 tot 4 μl) 1-octanol in 
afgesloten testflessen moest worden gespoten. Het gebruik van lagere con ­
centraties teststof zou hebben geresulteerd in hogere variantiecoëfficiënten, in het bijzonder bij concentraties van minder dan 10 mg C/l. Dit kon gedeel ­
telijk worden verholpen door de concentratie van de totale hoeveelheid 
anorganische koolstof (TIC) in het entmateriaal te verminderen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. In een EU-ringtest (24) van vijf oppervlakteactieve stoffen die werden toe ­
gevoegd in een concentratie van 10 mg C/l werden de volgende resultaten 
behaald:  
Teststof Gemiddelde 
procentuele 
biologische afbraak 
(28d) Variatiecoëffi ­
ciënt 
(%) Aantal 
laboratoria  
Tetrapropyleen 
Benzeensulfonaat 17 45 10 
Di-iso-octylsulfo-succi ­
naat 
(anionisch) 72 22 9 
Hexadecyl-tri ­
methyl (*) 
Ammoniumchloride 
(kationisch) 75 13 10 
Isononylfenol-(ethoxy ­
laat)  9 
(niet-ionisch) 41 32 10 
Cocoamidepropyl 
Dimethylhydroxy 
Sulfobetaïne 
(amfoteer) 60 23 11  
(*) SiO  2 werd toegevoegd om de toxiciteit te neutraliseren.  
Uit de resultaten blijkt in het algemeen dat de variabiliteit hoger was voor 
de minder goed afgebroken oppervlakteactieve stoffen. De intertestvariabi ­
liteit was minder dan 15 % voor meer dan 90 % van de gevallen, met als 
hoogste 30-40 %.  
NOOT: De meeste oppervlakteactieve stoffen zijn geen soorten die uit één 
molecuul bestaan, maar zijn mengsels van isomeren, homologen 
enz., die na verschillende vertragingsperioden worden afgebroken en met verschillende kinetische snelheden, wat resulteert in „va ­
ge”, uitgerekte curven, zodat de waarde van 60 % die nodig is om 
de test te doorstaan mogelijk niet gehaald wordt binnen „het tien ­
dagenvenster”, ondanks het feit dat iedere individuele moleculaire soort binnen tien dagen > 60 % zou behalen, indien afzonderlijk getest. Dit kan ook worden waargenomen bij andere complexe 
mengsels.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Apparatuur  
15. Gewone laboratoriumapparatuur en:  
a) glazen serumflessen, afgesloten met stoppen van butylrubber en alu ­
minium krimpsluitingen. De aanbevolen maat is „125 ml” met een totaal 
volume van ongeveer 160 ml (in dit geval moet het bekende volume van elke fles 160 ± 1 ml zijn). Een kleinere maat fles mag worden gebruikt, indien de resultaten voldoen aan de in de punten 66 en 67 omschreven 
voorwaarden;
 
b) koolstofanalyseapparaat of ander instrument (bv. gaschromatograaf) voor 
het meten van anorganische koolstof;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) hoogprecisie-injectienaalden voor gasvormige en vloeibare monsters;  
d) rondschudapparaat in een omgeving met temperatuurregeling;  
e) een voorraad CO  2 -vrije lucht — deze kan worden verkregen door lucht 
door natriumkalkkorrels te leiden of door gebruik te maken van een gasmengsel bestaande uit 80 % N
 2 /20 % O  2 (facultatief) (zie punt 28);  
f) membraanfiltratieapparaat met een porositeit van 0,20-0,45 μm (faculta ­
tief);  
g) analyseapparaat voor organische koolstof (facultatief).  
Reagentia  
16. Er wordt steeds gebruikgemaakt van reagentia pro analysi.  
Water  
17. Gedestilleerd of gedeïoniseerd water moet worden gebruikt met daarin een 
concentratie van ≤ 1 mg/l als totale organische koolstof. Dit vertegenwoor ­
digt ≤ 5 % van het initiële gehalte aan organische koolstof dat werd geïn ­
troduceerd door de aanbevolen dosis van de teststof.  
Stamoplossingen voor het uit anorganische zouten bestaande medium  
18. De stamoplossingen en het uit anorganische zouten bestaande medium zijn 
vergelijkbaar met die in ISO 14593 (16) en de in C.4 beschreven tests op de „gemakkelijke biologische afbreekbaarheid” (20). Het gebruik van een ho ­
gere concentratie ammoniumchloride (2,0 g/l in plaats van 0,5 g/l) zou enkel 
in zeer uitzonderlijke gevallen nodig moeten zijn, bv. als de teststofconcen ­
tratie > 40 mg C/l is. Stamoplossingen moeten gekoeld worden bewaard en na zes maanden als afval worden verwijderd, tenzij bewijs van neerslaan of 
microbiële groei bestaat. De volgende stamoplossingen worden bereid:
 
a) kaliumdiwaterstoffosfaat (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
dikaliumwaterstoffosfaat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
dinatriumwaterstoffosfaatdihydraat (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
ammoniumchloride (NH  4 Cl) 0,50 g  
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen. De pH van deze oplossing 
moet 7,4 (± 0,2) zijn. Als dit niet het geval is, moet een nieuwe oplos ­
sing worden bereid;  
b) calciumchloridedihydraat (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen;  
c) magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen;  
d) ijzer(III)chloridehexahydraat (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
In water oplossen en tot 1 liter aanvullen en één druppel geconcentreerde 
HCl toevoegen.  
Bereiding van anorganisch medium  
19. 10 ml van oplossing a) wordt gemengd met ongeveer 800 ml water (punt 
17), daaraan wordt vervolgens 1 ml van de oplossingen b), c) en d) toege ­
voegd en het geheel wordt met water aangevuld tot 1 liter (punt 17).  
Andere reagentia  
20. Geconcentreerd orthofosforzuur (H  3 PO 4 ) (> 85 % massa per volume).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Natriumhydroxideoplossing 7M  
21. 280 g natriumhydroxide (NaOH) wordt opgelost in 1 liter water (punt 17). 
De concentratie DIC van deze oplossing wordt bepaald en deze waarde wordt in acht genomen bij het berekenen van het testresultaat (zie de punten 
55 en 61), met name in het licht van het geldigheidscriterium in punt 66, 
onder b). Indien de concentratie DIC te hoog is, wordt een verse oplossing bereid.
 
Teststof  
22. Er wordt een stamoplossing van een voldoende in water oplosbare teststof in 
water (punt 17) of in het testmedium (punt 19) bereid, in een concentratie die bij voorkeur 100 maal groter is dan de uiteindelijke concentratie die in de test zal worden gebruikt; het kan nodig zijn de pH van de stamoplossing 
aan te passen. De stamoplossing moet worden toegevoegd aan het anorga ­
nische medium om een definitieve concentratie organische koolstof tussen 2 en 40 mg C/l te bereiken, bij voorkeur 20 mg C/l. Als lagere concentraties worden gebruikt, kan de verkregen precisie onvoldoende zijn. Oplosbare en 
onoplosbare vloeibare chemische stoffen kunnen rechtstreeks aan de vaten 
worden toegevoegd met behulp van hoogprecisie-injectienaalden. Voor slecht oplosbare en onoplosbare teststoffen is mogelijk een speciale behan ­
deling nodig (25). De keuzes zijn:
 
a) rechtstreeks toevoegen van bekende gewogen hoeveelheden;  
b) ultrasone dispersie vóór toevoeging;  
c) dispersie met behulp van emulgeermiddelen, waarvan vóór toevoeging 
vastgesteld moet worden of ze inhibitoire of stimulerende effecten heb ­
ben op microbiële activiteit;  
d) adsorptie van vloeibare teststoffen of van een oplossing in een geschikt 
vluchtig oplosmiddel aan een inert medium of hulpmiddel (bv. glasvezel ­
filter), gevolgd door verdamping van het oplosmiddel, indien gebruikt, 
en rechtstreekse toevoeging van bekende hoeveelheden;  
e) toevoeging van een bekend volume van een oplossing van de teststof in 
een zeer vluchtig oplosmiddel aan een leeg testvat, gevolgd door ver ­
damping van het oplosmiddel.  
Agentia of oplosmiddelen die in c), d) en e) worden gebruikt, moeten 
worden getest op een eventueel stimulerend of inhibitoir effect op microbi ­
ële activiteit (zie punt 42, onder b)).  
Referentiestof  
23. Een stamoplossing van de (oplosbare) referentiestof wordt bereid in water 
(punt 17) in een concentratie van bij voorkeur 100 maal de definitieve concentratie die zal worden gebruikt (20 mg C/l) in de test.
 
Inhibitiecontrole  
24. Teststoffen vertonen vaak geen significante afbraak onder de omstandighe ­
den die heersen bij beoordelingen van de gemakkelijke biologische afbreek ­
baarheid. Een mogelijke oorzaak is dat de teststof in de in de test gebruikte concentratie een inhibitoir effect op het entmateriaal heeft. Een inhibitie ­
controle kan in de testopzet worden opgenomen om de identificatie (achter ­
af) van inhibitie als een mogelijke oorzaak of bijdragende factor te ver ­
gemakkelijken. De inhibitiecontrole kan ook worden gebruikt om dergelijke interferenties uit te sluiten en aan te tonen dat de ontbrekende of geringe 
afbraak uitsluitend moet worden toegeschreven aan niet-vatbaarheid voor 
microbiële aanvallen onder de testomstandigheden. Om informatie te ver ­
krijgen over de toxiciteit van de teststof voor (aerobe) micro-organismen wordt een oplossing bereid in het testmedium die de teststof en de refe ­
rentiestof bevat (punt 19), elk in dezelfde respectieve concentraties als de 
toegevoegde concentraties (zie de punten 22 en 23).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Entmateriaal  
25. Het entmateriaal kan van diverse bronnen afkomstig zijn: actief slib; 
(chloorvrij) behandeld water; oppervlaktewater en grond; of een mengsel daarvan (20). De afbraakactiviteit van de bron moet worden gecontroleerd 
door gebruik te maken van een referentiestof. Ongeacht de bron mogen 
micro-organismen die eerder aan de teststof zijn blootgesteld niet worden gebruikt, indien de procedure gebruikt wordt als een test op de gemakkelijke biologische afbreekbaarheid.
 
Waarschuwing: Actief slib, rioolwater en behandeld water bevatten ziekte ­
verwekkende organismen en moeten voorzichtig worden 
gehanteerd.  
26. De ervaring leert dat het optimale volume voor het entmateriaal het volume 
is dat:  
— voldoende is om te zorgen voor toereikende biologische afbraakactivi ­
teit; 
— de referentiestof afbreekt met het voorgeschreven percentage (zie punt 
66); 
— resulteert in 10  2 tot 10  5 kolonievormende eenheden per milliliter in het 
uiteindelijke mengsel;  
— normaal resulteert in een concentratie van 4 mg/l gesuspendeerde vaste 
stoffen in het uiteindelijke mengsel bij het gebruik van actief slib; con ­
centraties van maximaal 30 mg/l kunnen worden gebruikt, maar deze 
kunnen leiden tot een significant hogere productie van CO  2 in de blanco 
vaten (26);  
— minder bijdraagt dan 10 % van de initiële concentratie van organische 
koolstof die door de teststof werd geïntroduceerd;  
— in het algemeen 1-10 ml entmateriaal is voor 1 liter testoplossing.  
Actief slib  
27. Uit de beluchtingstank van een rioolwaterzuiveringsinstallatie of een labo ­
ratoriuminstallatie die hoofdzakelijk huishoudelijk afval verwerkt, wordt vers actief slib verzameld. Indien nodig kunnen grove deeltjes door te zeven worden verwijderd (bv. door gebruik te maken van een zeef met mazen van 
1 mm
 2 ) en het slib moet aeroob worden gehouden, totdat het wordt ge ­
bruikt.  
28. Ook kan het slib, na verwijdering van eventuele grove deeltjes, worden 
bezonken of gecentrifugeerd (bv. 1 100 × g gedurende 10 minuten). De bovendrijvende vloeistof wordt als afval verwijderd. Het slib kan worden gewassen in de oplossing van mineralen. Het geconcentreerde slib wordt in 
anorganisch medium gesuspendeerd tot een concentratie van 3-5 g gesus ­
pendeerde vaste stof/l en vervolgens belucht tot het tijdstip van gebruik.
 
29. Slib moet afkomstig zijn van een correct werkende conventionele zui ­
veringsinstallatie. Als slib afkomstig is van een installatie met hoge omloop ­
snelheid, of geacht wordt remmers te bevatten, dient het te worden gewas ­
sen. Het opnieuw gesuspendeerde slib wordt na grondig mengen bezonken of gecentrifugeerd, de bovendrijvende vloeistof wordt als afval verwijderd 
en het gewassen slib wordt in een volgend volume anorganisch medium 
opnieuw gesuspendeerd. Deze procedure wordt herhaald totdat het slib ge ­
acht wordt vrij te zijn van overmaat substraat of remmer.
 
30. Nadat het slib volledig opnieuw is gesuspendeerd, of bij niet-behandeld slib 
direct, wordt vlak voor gebruik een monster genomen voor de bepaling van het drooggewicht aan gesuspendeerde vaste stoffen.
 
31. Een andere mogelijkheid is het homogeniseren van actief slib (3-5 g gesus ­
pendeerde vaste stof per l). Het slib wordt twee minuten bij matige snelheid in een Waring-menger behandeld. Het gemengde slib wordt gedurende 30 minuten of zoveel langer als nodig bezonken en de vloeistof wordt gede ­
canteerd en gebruikt als entmateriaal in een hoeveelheid van 10 mg/l an ­
organisch medium.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Een nog verdere vermindering van de blanco CO  2 -ontwikkeling kan worden 
bereikt door het slib een nacht te beluchten met CO  2 -vrije lucht. 4 mg/l 
vaste stof in het actief slib wordt gebruikt als de concentratie van het entmateriaal in deze test (13).
 
Secundair effluent van zuiveringsinstallaties  
33. Het entmateriaal kan ook worden betrokken van het secundaire effluent van 
een zuiveringsinstallatie of een laboratoriuminstallatie die hoofdzakelijk 
huishoudelijk afvalwater ontvangt. Het monster moet onder aerobe omstan ­
digheden worden bewaard en moet worden gebruikt op de dag van ver ­
zameling of, indien nodig, worden gepreconditioneerd. Het effluent moet 
worden gefilterd met een grove filter om grove deeltjes te verwijderen en de 
pH-waarde wordt gemeten.  
34. Om het gehalte aan IC te verminderen, wordt het filtraat gedurende één uur 
uitgewassen met CO  2 -vrije lucht (punt 15, onder e)), waarbij de pH wordt 
gehandhaafd op 6,5 met gebruikmaking van orthofosforzuur (punt 20). De pH-waarde wordt met natriumhydroxide (punt 21) teruggebracht op de oor ­
spronkelijke waarde en na ongeveer één uur bezinken wordt een geschikt 
volume van de bovendrijvende vloeistof genomen voor het enten. Deze 
uitwasprocedure vermindert het gehalte aan IC van het entmateriaal. Indien bijvoorbeeld het aanbevolen maximale volume van gefilterd, uitgewassen 
effluent (100 ml) per liter als entmateriaal werd gebruikt, bedroeg de hoe ­
veelheid IC in de blanco controlevaten tussen 0,4 en 1,3 mg/l (14), wat overeenkomt met 2-6,5 % van teststof C in een concentratie van 20 mg C/l en 4-13 % in een concentratie van 10 mg C/l.
 
Oppervlaktewater  
35. Uit daarvoor geschikt oppervlaktewater wordt een monster genomen. Dit 
moet onder aerobe omstandigheden worden bewaard en worden gebruikt op de dag waarop het verzameld is. Indien nodig wordt het monster gecon ­
centreerd door het te filteren of centrifugeren. Het volume van het in elk 
testvat te gebruiken entmateriaal moet voldoen aan de in punt 26 vermelde 
criteria.
 
Grond  
36. Op een diepte van maximaal 20 cm onder het grondoppervlak wordt een 
geschikt grondmonster genomen. Stenen, plantresten en ongewervelde die ­
ren moeten worden verwijderd uit het grondmonster, waarna het wordt 
gezeefd door zeefmazen van 2 mm (als het monster te nat is om onmiddel ­
lijk te zeven, eerst gedeeltelijk aan de lucht laten drogen om het zeven te vergemakkelijken). Het monster moet onder aerobe omstandigheden worden 
bewaard en worden gebruikt op de dag waarop het werd genomen (als het 
monster wordt vervoerd in een niet helemaal dichtgeknoopte zwarte zak van polyethyleen, kan het bij 2 tot 4 °C maximaal een maand in de zak worden bewaard).
 
Preconditionering van het entmateriaal  
37. Entmateriaal kan op de proefomstandigheden worden gepreconditioneerd, 
maar mag niet vooraf aan de teststof worden aangepast. Preconditionering kan de blanco CO
 2 -ontwikkeling verminderen. Preconditionering bestaat in 
het beluchten van actief slib na verdunning in testmedium tot 30 mg/l met 
vochtige CO  2 -vrije lucht gedurende vijf-zeven dagen bij testtemperatuur.  
TESTPROCEDURE  
Aantal flessen  
38. Het aantal flessen (punt 15, onder a)) dat nodig is voor een test, is afhan ­
kelijk van de analysefrequentie en de duur van de test.  
39. Aanbevolen wordt om flessen in drievoud te analyseren met een voldoende 
aantal tussenpozen, zodat het tiendagenvenster herkend kan worden. Ook moeten ten minste vijf testflessen (punt 15, onder a)) uit de sets a), b) en c) (zie punt 42) aan het eind van de test worden geanalyseerd om betrouw ­
baarheidsintervallen van 95 % te kunnen berekenen voor de gemiddelde 
procentuele biologische afbraak.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Geënt medium  
40. Het entmateriaal wordt gebruikt in een concentratie van 4 mg/l droge vaste 
stoffen in actief slib. Onmiddellijk voor het gebruik wordt voldoende geënt medium bereid door, bijvoorbeeld, 2 ml op passende wijze behandeld actief 
slib (punten 27 tot en met 32) in een concentratie van 2 000 mg/l toe te 
voegen aan 1 liter uit anorganische zouten bestaand medium (punt 19). Bij het gebruik van secundair effluent wordt maximaal 100 ml effluent (punt 33) toegevoegd aan 900 ml uit anorganische zouten bestaand medium (punt 
19) en tot 1 liter verdund met medium.
 
Flessen prepareren  
41. Bekende hoeveelheden van het geënte medium worden verdeeld over du ­
ploflessen om een verhouding tussen gasruimte en vloeistof te bereiken van 1:2 (bv. 107 ml toevoegen aan flessen met een inhoud van 160 ml). Andere verhoudingen kunnen ook worden gebruikt, maar houd hierbij rekening met 
de waarschuwing in punt 11. Ongeacht het type entmateriaal dat wordt 
gebruikt, moet het geënte medium voldoende worden gemengd om te waar ­
borgen dat het gelijk over de testflessen wordt verdeeld.
 
42. Er worden flessensets (punt 15, onder a)) met de volgende inhoud voor ­
bereid:  
a) testvaten (aangeduid als F  T ) met daarin de teststof;  
b) blanco controlevaten (aangeduid als F  B ) met daarin uitsluitend het test ­
medium plus het entmateriaal; eventuele chemische stoffen, oplosmidde ­
len, agentia of glasvezelfilters die nodig zijn om de teststof in de test ­
vaten te brengen, moeten ook worden toegevoegd;  
c) vaten (aangeduid als F  C ) met de referentiestof voor het controleren van 
de procedure;  
d) indien nodig, vaten (aangeduid als F  I ) met daarin zowel de teststof als de 
referentiestof in dezelfde concentraties (punt 24) als in respectievelijk de 
flessen F  T en F  C , voor het controleren van een eventueel inhibitoir effect 
van de teststof;  
e) vaten (aangeduid als F  S ) voor het controleren van mogelijke abiotische 
afbraak, als a) plus 50 mg/l HgCl  2 of op enige andere manier gesterili ­
seerd (bv. in een autoclaaf).  
43. In water oplosbare teststoffen en referentiestoffen worden toegevoegd als 
waterige stamoplossingen (punten 22, 23 en 24) om een concentratie van 10 tot 20 mg C/l te bereiken.
 
44. Onoplosbare teststoffen en onoplosbare referentiestoffen worden op verschil ­
lende manieren (zie punt 22, onder a)-e)) aan flessen toegevoegd in over ­
eenstemming met de aard van de teststof, hetzij voor hetzij na toevoeging van het geënte medium, afhankelijk van de behandelingsmethode van de teststof. Indien een van de in punt 22, onder a)-e), beschreven procedures 
wordt toegepast, moeten de blanco flessen F
 B (punt 42, onder b)) op een 
soortgelijke manier worden behandeld, maar zonder de teststof en de refe ­
rentiestof.  
45. Vluchtige teststoffen moeten worden geïnjecteerd in gesloten flessen (punt 
47) met behulp van een micro-injectienaald. De dosis wordt berekend op 
basis van het geïnjecteerde volume en de dichtheid van de teststof.  
46. Indien nodig moet water aan de vaten worden toegevoegd om in ieder vat 
hetzelfde vloeistofvolume te hebben. Er moet worden gewaarborgd dat de verhouding tussen gasruimte en vloeistof (gewoonlijk 1:2) en de concen ­
tratie van de teststof zodanig zijn dat voldoende zuurstof in de gasruimte 
aanwezig is om volledige biologische afbraak mogelijk te maken.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Alle flessen worden vervolgens afgesloten, bijvoorbeeld met septa van bu ­
tylrubber en aluminium doppen. Vluchtige teststoffen moeten in deze fase 
worden toegevoegd (punt 45). Voor het monitoren van de vermindering van de concentratie DOC in de testoplossing en voor het uitvoeren van tijdstip-nulanalysen voor de initiële concentratie IC (steriele controles, 
punt 42, onder e)) of andere determinanten wordt een daarvoor geschikt 
monster uit het testvat genomen. Het testvat en de inhoud ervan worden als afval verwijderd.
 
48. De gesloten flessen worden op een rondschudapparaat geplaatst (punt 15, 
onder d)), met een schudsnelheid die voldoende is om de inhoud van de flessen goed te mengen en gesuspendeerd te houden (bv. 150 tot 200 tpm), 
en worden vervolgens in het donker geïncubeerd bij een temperatuur van 
20 °C, die niet meer mag afwijken dan ± 1 °C.
 
Monstername  
49. Het patroon van de monstername is afhankelijk van de vertragingstijd en de 
kinetische snelheid van de biologische afbraak van de teststof. Flessen wor ­
den op de dag van de monstername weggenomen voor de analyse, die ten minste wekelijks of frequenter (bv. tweemaal per week) moet worden uit ­
gevoerd indien een volledige afbraakcurve vereist is. Het vereiste aantal 
duploflessen wordt uit het schudapparaat genomen, overeenkomend met 
F
 T , F B en F  C en, indien ze gebruikt worden, F  I en F  S (zie punt 42). De 
test duurt gewoonlijk 28 dagen. Indien de curve voor de biologische afbraak aangeeft dat een plateau is bereikt voordat de 28 dagen voorbij zijn, moet de 
test eerder dan na 28 dagen worden afgerond. De vijf flessen die voor de 
28e dag van de test zijn gereserveerd, worden bemonsterd en de resultaten worden gebruikt om de betrouwbaarheidslimieten of de variatiecoëfficiënt van de procentuele biologische afbreekbaarheid te berekenen. De flessen die 
zijn bedoeld voor de controles op inhibitie en voor abiotische afbraak hoe ­
ven niet zo frequent te worden bemonsterd als de andere flessen; bemon ­
stering op dag 1 en dag 28 is voldoende.
 
Analyse van anorganische koolstof (IC)  
50. De CO  2 -productie in de flessen wordt bepaald door de toename in de con ­
centratie van anorganische koolstof (IC) tijdens incubatie te meten. Er zijn twee aanbevolen methoden beschikbaar voor het meten van de hoeveelheid in de test geproduceerde IC en deze worden hieronder beschreven. Aange ­
zien de methoden enigszins verschillende resultaten kunnen opleveren, dient 
slechts één ervan in een testuitvoering te worden gebruikt.
 
51. Methode a) wordt aanbevolen in gevallen waarin de kans bestaat dat het 
medium overblijfselen bevat van bijvoorbeeld glasvezelpapier en/of on ­
oplosbare teststof. Indien een koolstofanalyseapparaat niet beschikbaar is, kan deze analyse worden uitgevoerd met een gaschromatograaf. Het is be ­
langrijk dat de flessen (bijna) de testtemperatuur hebben, wanneer het gas in 
de gasruimte wordt geanalyseerd. Methode b) is mogelijk gemakkelijker voor laboratoria die koolstofanalyseapparaten gebruiken om IC te meten. Het is belangrijk dat de natriumhydroxideoplossing (punt 21) die wordt 
gebruikt om CO
 2 om te zetten in carbonaat vers bereid is of dat het 
IC-gehalte ervan bekend is, zodat hiermee rekening kan worden gehouden bij het berekenen van de testresultaten (zie punt 66, onder b)).
 
Methode a): aanzuren tot pH < 3  
52. Vóór iedere reeks analysen wordt het IC-analyseapparaat gekalibreerd met 
behulp van een geschikte IC-standaard (bv. 1 gewichtspercent CO  2 in N  2 ). 
Geconcentreerd fosforzuur (punt 20) wordt geïnjecteerd door het septum van iedere bemonsterde fles om de pH van het medium te verlagen tot < 3 (bv. 1 
ml toevoegen aan 107 ml testmedium). De flessen worden teruggeplaatst op 
het schudapparaat. Nadat de flessen gedurende één uur bij testtemperatuur zijn geschud, worden ze van het schudapparaat genomen, waarna bekende hoeveelheden (bv. 1 ml) gas aan de gasruimte worden onttrokken en geïn ­
jecteerd in het IC-analyseapparaat. De gemeten IC-concentraties worden 
geregistreerd als mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Het principe van deze methode is dat na aanzuring tot pH < 3 en equilibratie 
bij 20 °C, de evenwichtsconstante voor de verdeling van CO  2 over de 
vloeibare en gasvormige fasen in de testflessen 1,0 is, indien gemeten als een concentratie (13). Dit moet voor het testsysteem minimaal eenmaal worden aangetoond, en wel als volgt:
 
Flessen met daarin 5 en 10 mg/l als IC, met gebruikmaking van een op ­
lossing van watervrij natriumcarbonaat (Na  2 CO 3 ) in CO  2 -vrij water dat is 
bereid door water aan te zuren tot pH 6,5 met geconcentreerd orthofosfor ­
zuur (punt 20), worden gedurende een nacht uitgewassen met CO  2 -vrije 
lucht en de pH wordt met alkali verhoogd tot neutraal. Er moet worden 
gewaarborgd dat de verhouding tussen het gasruimtevolume en het vloei ­
stofvolume dezelfde is als in de tests (bv. 1:2). Vervolgens worden het aanzuren en de equilibratie uitgevoerd als beschreven in punt 52 en wordt de IC-concentratie van zowel de gasruimte als de vloeibare fasen gemeten. 
Er wordt gecontroleerd of de twee concentraties dezelfde zijn binnen de 
marge voor toevallige fouten. Zo niet, moet de gebruiker de procedures herzien. Deze controle op de verdeling van IC over de vloeibare en gas ­
vormige fasen hoeft niet bij iedere uitvoering van de test te worden verricht, 
maar kan indien mogelijk tijdens het kalibreren worden verricht.
 
54. Indien de verwijdering van DOC moet worden gemeten (uitsluitend test ­
stoffen die in water oplosbaar zijn), moeten monsters worden genomen van de vloeibare fase uit afzonderlijke (niet aangezuurde) flessen, met een mem ­
braan worden gefilterd en worden geïnjecteerd in het DOC-analyseapparaat. 
Indien nodig kunnen deze flessen voor andere analysen worden gebruikt om 
de primaire biologische afbreekbaarheid te meten.
 
Methode b): omzetting van CO  2 in carbonaat  
55. Voor iedere reeks analysen wordt het IC-analyseapparaat gekalibreerd met 
behulp van een geschikte standaard, bijvoorbeeld een oplossing van natri ­
umbicarbonaat (NaHCO  3 ) in CO  2 -vrij water (zie punt 53) binnen het bereik 
van 0 tot 20 mg/l, als IC. Een oplossing van natriumhydroxide (7M, punt 21) (bv. 1 ml op 107 ml medium) wordt geïnjecteerd door het septum van 
iedere bemonsterde fles en de flessen worden gedurende één uur bij test ­
temperatuur geschud. Gebruik dezelfde NaOH-oplossing voor alle flessen die op een bepaalde dag worden geanalyseerd, maar niet noodzakelijkerwijs bij alle monsternamen tijdens een test. Indien absolute blanco IC-waarden 
benodigd zijn bij alle monsternamen, moet het IC-gehalte van de 
NaOH-oplossing iedere keer wanneer deze wordt gebruikt, worden bepaald. De flessen worden van het schudapparaat genomen en men laat de inhoud bezinken. Geschikte volumes (bv. 50 tot 1 000 μl) worden met een injec ­
tienaald onttrokken aan de vloeibare fase in ieder vat. De monsters worden 
in het IC-analyseapparaat geïnjecteerd en de concentraties IC worden ge ­
registreerd. Er moet worden gewaarborgd dat het gebruikte analyseapparaat 
geschikt is om de alkalinemonsters die bij deze methode geproduceerd 
worden, te verwerken.
 
56. Het principe van deze methode is dat de concentratie IC na de toevoeging 
van alkali en het schudden verwaarloosbaar is. Dit moet voor het testsys ­
teem ten minste eenmaal worden gecontroleerd door met gebruikmaking van IC-standaarden alkali toe te voegen en te laten equilibreren en vervolgens de 
concentratie IC in zowel de gasruimte als de vloeibare fasen te meten (zie 
punt 53). De concentratie in de gasruimte moet in de buurt van nul liggen. Deze controle op de nagenoeg volledige absorptie van CO
 2 hoeft niet bij 
iedere uitvoering van de test te worden verricht.  
57. Indien de verwijdering van DOC moet worden gemeten (uitsluitend test ­
stoffen die in water oplosbaar zijn), moeten monsters worden genomen van 
de vloeibare fase uit afzonderlijke flessen (zonder toegevoegd alkali), waarna ze met een membraan worden gefilterd en worden geïnjecteerd in het DOC-analyseapparaat. Indien nodig kunnen deze flessen voor andere 
analysen worden gebruikt om de primaire biologische afbreekbaarheid te 
meten.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Berekening van de resultaten  
58. Uitgaande van een mineralisatie van de teststof in CO  2 van 100 %, is de 
overmaat aan ThIC die is geproduceerd in vergelijking met de ThIC die in de blanco controlevaten is geproduceerd gelijk aan de TOC die is toege ­
voegd aan iedere testfles aan het begin van de test, dat wil zeggen:
 
ThIC ¼ TOC  
De totale massa (mg) anorganische koolstof (TIC) in elke fles is: 
TIC ¼ ðmg C in de vloeistof  þ mg C in de gasruimte Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Vergelijking [1]  
waarbij  
V L = volume van vloeistof in de fles (liter);  
CL = concentratie van IC in de vloeistof (mg/l als koolstof);  
VH = volume van de gasruimte (liter);  
CL = concentratie van IC in de gasruimte (mg/l als koolstof).  
De berekeningen van TIC voor de twee analysemethoden die worden ge ­
bruikt voor het meten van IC in deze test, worden in de onderstaande punten 60 en 61 beschreven. De procentuele biologische afbraak ( % D ) is in alle 
gevallen het resultaat van: 
%D ¼
 ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Vergelijking [2]  
waarbij  
TIC  t = mg TIC in testfles op moment t;  
TIC  b = gemiddelde mg TIC in blanco flessen op moment t;  
TOC = mg TOC in eerste instantie toegevoegd aan het testvat.  
De procentuele biologische afbraak % D wordt berekend voor de test (F  T ), 
referentie (F  C ) en, indien van toepassing, de controleflessen voor de inhibi ­
tiemonitoring (F  I ) op basis van de respectieve hoeveelheden TIC die zijn 
geproduceerd tot aan het moment van iedere monstername.  
59. Indien het TIC-gehalte van de steriele controles (F  S ) tijdens de testperiode 
significant is gestegen, kan worden geconcludeerd dat abiotische afbraak van de teststof opgetreden is en moet hiermee rekening worden gehouden 
bij de berekening van D in vergelijking [2].
 
Aanzuren tot pH < 3  
60. Aangezien het aanzuren tot pH < 3 en de equilibratie resulteert in een 
gelijke verdeling van de concentratie TIC in de vloeibare en gasvormige 
fasen, hoeft alleen de concentratie IC in de gasvormige fase te worden gemeten. Derhalve geldt op basis van vergelijking [1]:
 
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , waarbij V  B = volume van de serum ­
fles. 
Omzetting van CO  2 in carbonaat  
61. In deze methode worden de berekeningen verricht als in vergelijking [1], 
maar de verwaarloosbare hoeveelheid IC in de gasvormige fase wordt ge ­
negeerd, dat wil zeggen. V H Ü C H ¼ 0 en  TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Uitdrukking van de resultaten  
62. Een curve voor biologische afbraak wordt verkregen door de procentuele 
biologische afbraak, D, uit te zetten tegen de incubatietijd en indien moge ­
lijk worden de aanloopfase, de biologischeafbraakfase, het tiendagenvenster 
en de plateaufase, dat wil zeggen de fase waarin de maximale afbraak 
bereikt is en de curve voor biologische afbraak afgevlakt is, aangegeven. Indien vergelijkbare resultaten worden behaald voor tegelijkertijd geteste testvaten F
 T (< 20 % afwijking), wordt een curve voor het gemiddelde 
getekend (zie aanhangsel 2, figuur 1); zo niet, wordt voor ieder vat een 
curve getekend. De gemiddelde waarde van de procentuele biologische afbraak in de plateaufase wordt bepaald of de hoogste waarde wordt ge ­
nomen (bv. indien de curve in de plateaufase afneemt), maar in het laatste 
geval is het belangrijk om na te gaan of de waarde geen uitbijter is. Dit maximale niveau van biologische afbreekbaarheid moet in het testverslag als „mate van biologische afbraak van de teststof” worden vermeld. Indien het 
aantal testvaten onvoldoende was om een plateaufase aan te geven, worden 
de meetgegevens van de laatste dag van de test gebruikt om een gemiddelde waarde te berekenen. Deze laatste waarde, het gemiddelde van vijf duplo ­
vaten, dient als indicatie van de precisie waarmee de procentuele biologische 
afbreekbaarheid is bepaald. Ook moet de waarde die gemeten wordt aan het 
eind van het tiendagenvenster, worden gerapporteerd.
 
63. Op dezelfde manier wordt een curve voor de referentiestof, F  C , uitgezet en, 
indien van toepassing, voor de abiotische eliminatiecontrole, F  S , en de in ­
hibitiecontrole, F  I . 
64. De hoeveelheden TIC die in de blanco controlevaten (F  B ) aanwezig zijn, 
worden vastgelegd evenals de hoeveelheden in de kolven F  S (abiotische 
controle), voor zover deze vaten in de test werden opgenomen.  
65. Voor de vaten F  I wordt D berekend, op basis van de theoretische 
IC-opbrengst die wordt verwacht van alleen het referentiebestanddeel van 
het mengsel. Indien op dag 28 [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, kan 
worden aangenomen dat de teststof een inhibitoir effect op de activiteit van het entmateriaal heeft gehad en dit kan een verklaring zijn voor de lage 
waarden van D
 FT die zijn verkregen onder de testomstandigheden. In dit 
geval kan de test worden herhaald met een lagere testconcentratie en met bij voorkeur een vermindering van de DIC in het entmateriaal en de in de blanco controlevaten gevormde TIC, aangezien de lagere concentratie anders 
de nauwkeurigheid van de methode nadelig beïnvloedt. Als alternatief kan 
ander entmateriaal worden gebruikt. Indien in fles F
 S (abiotisch) een signi ­
ficante stijging (> 10 %) in de hoeveelheid TIC wordt waargenomen, zijn er mogelijk abiotische afbraakprocessen opgetreden.
 
Geldigheid van de resultaten  
66. Een test wordt geacht geldig te zijn, indien:  
a) de gemiddelde procentuele afbraak in de vaten F  C met daarin de refe ­
rentiestof > 60 % is op de 14e dag van de incubatie, en  
b) de gemiddelde hoeveelheid TIC die aanwezig is in de blanco contro ­
levaten F  B aan het eind van de test > 3 mg C/l is.  
Als deze grenswaarden niet worden gehaald, moet de test worden herhaald 
met een uit een andere bron afkomstig entmateriaal en/of moeten de pro ­
cedures worden herzien. Indien bijvoorbeeld hoge IC-productie in de blanco 
vaten een probleem is, moet de in de punten 27 tot en met 32 beschreven procedure worden gevolgd.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) De procentuele afbraak in vaten F  C met daarin de referentiestof. 
( 2 ) De procentuele afbraak in vaten F  I .
 67. Indien de teststof 60 % ThIC niet haalt en aangetoond is dat de teststof geen 
inhibitoir effect heeft (punt 65), kan de test worden herhaald met een hogere 
concentratie van het entmateriaal (maximaal 30 mg/l actief slib en 100 ml effluent/l) of entmaterialen uit andere bronnen, in het bijzonder indien de afbraak binnen het bereik van 20 tot 60 % lag.
 
Interpretatie van de resultaten  
68. Biologische afbraak > 60 % ThIC binnen het tiendagenvenster in deze test 
toont aan dat de teststof gemakkelijk biologisch afbreekbaar is onder aerobe omstandigheden.
 
69. Als de waarde voor het doorstaan van de test van 60 % ThIC niet wordt 
gehaald, moet de pH-waarde worden bepaald in media in flessen waaraan geen zuur of alkaline is toegevoegd; een waarde lager dan 6,5 zou duiden 
op het optreden van nitrificatie. In een dergelijk geval moet de test worden 
herhaald met een bufferoplossing met een hogere concentratie.
 
Testverslag  
70. Een tabel wordt opgesteld met % D voor iedere testfles (F  T ), referentiefles 
(F C ) en, indien van toepassing, inhibitiecontrolefles (F  I ) voor iedere mon ­
sternamedag. Indien vergelijkbare resultaten worden verkregen voor duplof ­
lessen, wordt een curve van gemiddelde % D uitgezet tegen de tijd. De hoeveelheid TIC in de blanco vaten (F
 B ) wordt vastgelegd, alsmede de 
hoeveelheid DOC in de steriele controlevaten (F  S ) en/of andere determinan ­
ten en hun procentuele verwijdering.  
71. De gemiddelde waarde van % D in de plateaufase wordt bepaald of de 
hoogste waarde wordt gebruikt als de curve voor biologische afbraak in 
de plateaufase afneemt; deze waarde wordt gerapporteerd als de „mate van biologische afbraak van de teststof”. Het is belangrijk om in het laatst ­
genoemde geval te waarborgen dat de hoogste waarde geen uitbijter is.
 
72. In het tesverslag worden de volgende gegevens opgenomen:  
Teststof:  
— de triviale naam, de chemische naam, het CAS-nummer, de structuur ­
formule en relevante fysisch-chemische eigenschappen;  
— de zuiverheid (verontreinigingen) van de teststof.  
Testomstandigheden:  
— verwijzing naar deze testmethode;  
— een beschrijving van het gebruikte testsysteem (bv. volume van het vat, 
verhouding tussen gasruimte en vloeistof, roermethode enz.);  
— de manier waarop de teststof en de referentiestof aan het testsysteem zijn 
toegevoegd: de gebruikte testconcentratie en de hoeveelheid koolstof die 
als dosis aan elke testfles is toegevoegd, eventueel gebruik van oplos ­
middelen;  
— nadere gegevens van het gebruikte entmateriaal, eventuele voorbehan ­
deling en preconditionering;  
— incubatietemperatuur;  
— validering van de principes van IC-analyse;  
— belangrijkste kenmerken van het gebruikte IC-analyseapparaat (en even ­
tuele andere toegepaste analysemethoden);  
— aantal duplobepalingen.  
Resultaten:  
— ruwe gegevens en berekende waarden van de biologische afbraak in 
tabelvorm;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— de grafiek van de procentuele afbraak uitgezet tegen de tijd voor de test- 
en referentiestof, de aanloopfase, de afbreekfase, het tiendagenvenster en 
de richtingscoëfficiënt;  
— de procentuele verwijdering in de plateaufase, aan het eind van de test 
en na het tiendagenvenster;  
— eventuele redenen om de testresultaten te verwerpen;  
— eventuele andere omstandigheden die relevant zijn voor de gevolgde 
procedure;  
— een bespreking van de resultaten.  
LITERATUUR:  
(1) Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologi ­
sche afbreekbaarheid — CO  2 -ontwikkelingstest (methode C.4-C).  
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159- 
167. 
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.  
(4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide re ­
covery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
 
(5) ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC.  
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
 
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.  
(9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
 
(10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing bio ­
degradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.  
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.  
(12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for mea ­
suring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 
233-243.  
(13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
 
(14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507-524.  
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegra ­
dation. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593, (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic bio ­
degradability of organic compounds in an aerobic medium-method by ana ­
lysis of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemos ­
phere 34: 1813-1822.  
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed ves ­
sel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substance, Washington, DC.  
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219- 
3235.
 
(20) Hoofdstuk C.4 van deze bijlage, Bepaling van de „gemakkelijke” biologi ­
sche afbreekbaarheid.  
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegra ­
dability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report 
(M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.  
(22) Hoofdstuk C.11 van deze bijlage, Test op de remming van de ademhaling 
van actief slib.  
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
 
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Cen ­
tre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
(25) ISO 10634 (1996) Water Quality — Guidance for the preparation and 
treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent 
evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Aanhangsel 1  
AFKORTINGEN EN DEFINITIES  
IC: anorganische koolstof.  
ThCO  2 : theoretische hoeveelheid kooldioxide (mg) is de hoeveelheid kool ­
dioxide die volgens berekening uit het bekende of gemeten koolstofgehalte van de teststof wordt geproduceerd, wanneer deze volledig wordt gemineraliseerd; 
wordt ook uitgedrukt als mg ontwikkelde kooldioxide per mg teststof.
 
DOC:  opgeloste organische koolstof is de organische koolstof die in de oplos ­
sing aanwezig is of die of door een filter van 0,45 μm gaat of na centrifugeren 
bij ongeveer 4 000 g (ongeveer 40 000 m s  -2 ) gedurende 15 minuten in de boven ­
staande vloeistof overblijft.  
DIC:  opgeloste anorganische koolstof.  
ThIC:  theoretische hoeveelheid anorganische koolstof.  
TIC:  totale hoeveelheid anorganische koolstof.  
Gemakkelijk biologisch afbreekbaar:  een arbitraire indeling van chemische 
stoffen die bepaalde schiftingsproeven op totale biologische afbreekbaarheid heb ­
ben doorstaan; deze proeven zijn zo streng dat geacht wordt dat dergelijke che ­
mische stoffen in aquatisch milieu onder aerobe omstandigheden snel en volledig 
biologisch worden afgebroken.  
Tiendagenvenster:  de periode van tien dagen onmiddellijk na het bereiken van 
10 % biologische afbraak.  
Inherente biologische afbreekbaarheid:  een indeling van chemische stoffen 
waarvoor elke test op biologische afbreekbaarheid een ondubbelzinnig bewijs 
van (primaire of totale) biologische afbraak levert.  
Totale aerobe biologische afbraak:  de mate van afbraak die wordt verkregen 
wanneer de teststof volledig door micro-organismen wordt omgezet tot kool ­
dioxide, water, anorganische zouten en nieuwe microbiële celbestanddelen (bio ­
massa).  
Mineralisatie:  mineralisatie is de volledige ontleding van een organische che ­
mische stof in CO  2 en H  2 O onder aerobe omstandigheden en in CH  4 , CO  2 en 
H 2 O onder anaerobe omstandigheden.  
Aanloopfase:  de tijdsduur vanaf de aanvang van de test totdat acclimatisering 
en/of adaptatie van de afbrekende micro-organismen heeft plaatsgevonden en de 
biologische afbraak van een teststof of organisch materiaal tot een detecteerbaar niveau is gestegen (bv. 10 % van de theoretische maximale biologische afbraak, of lager, afhankelijk van de nauwkeurigheid van de meettechniek).
 
Afbreekfase:  de tijd van het eind van de aanloopperiode tot het tijdstip waarop 
90 % van de maximale afbraak is bereikt.  
Plateaufase:  de plateaufase is de fase waarin de maximale afbraak is bereikt en 
de curve voor de biologische afbreekbaarheid afgevlakt is.  
Teststof:  alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Aanhangsel 2  
Voorbeeld van een curve voor biologische afbreekbaarheid  
Figuur 1  
Biologische afbraak van 1-octanol in de CO  2 -gasruimtetest
  
Legenda:  
biologische afbraak  
afbreekfase  
maximale biologische afbraak  
plateaufase  
tiendagenvenster  
testperiode (dagen)  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  BIOACCUMULATIE IN TERRESTRISCHE  OLIGOCHAETAE  
INLEIDING  
1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 317 (2010) van de OESO 
(TG 317). Testmethoden met betrekking tot het uiteindelijke lot in het 
milieu zijn onder meer Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen (hoofd ­
stuk C.13 van deze bijlage (49)) en de test voor „bioaccumulatie in in het sediment levende bentische  Oligochaetae ” (53), die in respectievelijk 1996 
en 2008 werden gepubliceerd. Het is moeilijk, zo niet onmogelijk, om 
gegevens inzake aquatische bioaccumulatie te extrapoleren naar terrestrische 
organismen zoals regenwormen. Modelberekeningen op basis van de lipo ­
filiciteit van een teststof, bv. (14)(37), worden op dit moment gebruikt voor de beoordeling van bioaccumulatie van chemische stoffen in de bodem, 
zoals bv. in de technische leidraad van de EU (19). Er is al ingegaan op 
de noodzaak van een compartimentspecifieke testmethode, zie bv. (55). Een dergelijke methode is met name belangrijk voor de evaluatie van secundaire vergiftiging in terrestrische voedselketens (4). Er zijn diverse nationale test ­
methoden voor bioaccumulatie in andere organismen dan vissen, bv. (2) en 
(72). Een methode voor het meten van bioaccumulatie uit verontreinigde grond in regenwormen ( Eisenia fetida , Savigny) en potwormen is ontwik ­
keld door de American Society for Testing and Materials (3). Een inter ­
nationaal erkende methode voor de bepaling van bioaccumulatie in verrijkte 
grond zal de risicoanalyse voor chemische stoffen in terrestrische ecosyste ­
men verbeteren, bv. (25)(29).
 
2. Ongewervelde dieren die grond opnemen, worden blootgesteld aan de che ­
mische stoffen die zich in de grond bevinden. Onder deze dieren spelen 
terrestrische  Oligochaetae  (regenwormen) een belangrijke rol in de structuur 
en functie van grond (15)(20). Terrestrische  Oligochaetae  leven in de bodem 
en hoofdzakelijk aan het bodemoppervlak (met name in de strooisellaag); in 
biomassa uitgedrukt zijn ze vaak de meest voorkomende soort (54). Door 
bioturbatie van de bodem en door als prooi te dienen kunnen deze dieren een grote invloed hebben op de biobeschikbaarheid van chemische stoffen voor andere organismen zoals ongewervelde dieren (bv. roofmijten en ke ­
vers; bv. (64)) of gewervelde roofdieren (bv. vossen en meeuwen) (18)(62). 
In aanhangsel 5 zijn een aantal van de momenteel in ecotoxicologische tests gebruikte soorten terrestrische  Oligochaetae  beschreven.
 
3. De ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bio ­
accumulation Tests with the Lumbricid Earthworm  Eisenia fetida  and the 
Enchytraeid Potworm  Enchytraeus albidus  (3) bevat vele essentiële en nut ­
tige nadere gegevens met betrekking tot de uitvoering van de onderhavige 
testmethode ter bepaling van de bioaccumulatie in de bodem. Andere docu ­
menten waarnaar in deze testmethode wordt verwezen, zijn hoofdstuk C.13 van deze bijlage, Bioconcentratie: doorstroomtest met vissen (49) en TG 315 van de OESO:  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates  
(53). Praktijkervaring met onderzoek naar bioaccumulatie in de bodem en 
publicaties uit de literatuur, bv. (1)(5)(11)(12)(28)(40)(43)(45)(57)(59)(76) (78)(79), zijn eveneens belangrijke bronnen van informatie voor deze test ­
methode.
 
4. Deze testmethode is voornamelijk van toepassing op stabiele, neutrale or ­
ganische stoffen, die neigen naar adsorptie aan de grond. Deze testmethode kan worden gebruikt om te testen op bioaccumulatie van stabiele metallo-organische verbindingen die zich aan grond hechten. De methode 
kan tevens worden toegepast op metalen en andere spoorelementen.
 
VOORWAARDE  
5. Tests voor het meten van de bioaccumulatie van een chemische stof in 
terrestrische  Oligochaetae  zijn uitgevoerd met zware metalen (zie bv. (63)) 
en persistente, organische stoffen met bekende log K  ow -waarden tussen 3,0 
en 6,0, bv. (40). Dergelijke tests kunnen ook worden toegepast op:  
— chemische stoffen met een log K  ow van meer dan 6,0 (superhydrofobe 
chemische stoffen);  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— chemische stoffen die behoren tot een klasse van organische stoffen 
waarvan bekend is dat ze kunnen bioaccumuleren in levende organis ­
men, bv. oppervlakteactieve stoffen of stoffen met een hoog adsorptie ­
vermogen;  
— chemische stoffen met structuurkenmerken die wijzen op bioaccumula ­
tiepotentieel, bv. analogen van stoffen waarvan het bioaccumulatiepoten ­
tieel bekend is, en  
— metalen.  
6. Vóór het begin van de studie moet informatie over de teststof worden ver ­
zameld, zoals de triviale naam, de chemische naam (bij voorkeur de IUPAC-naam), de structuurformule, het CAS-registratienummer, de zuiver ­
heid, voorzorgsmaatregelen, passende opslagomstandigheden en de analyse ­
methoden. Daarnaast moet de volgende informatie bekend zijn:
 
a) oplosbaarheid in water;  
b) verdelingscoëfficiënt octanol/water, K  ow ; 
c) verdelingscoëfficiënt grond/water, uitgedrukt als K  oc ; 
d) dampspanning;  
e) afbreekbaarheid (bv. in grond, water);  
f) bekende metabolieten.  
7. Er kan gebruik worden gemaakt van radioactief gelabelde of niet radioactief 
gelabelde teststoffen. Om de analyse te vergemakkelijken wordt echter het gebruik van een radioactief gelabelde teststof aanbevolen. Deze keuze wordt 
gemaakt op basis van de aantoonbaarheidsgrenswaarden of een vereiste om 
de oorspronkelijke teststof en metabolieten te meten. Indien een radioactief gelabelde teststof wordt gebruikt en de totale hoeveelheid radioactieve resi ­
duen wordt gemeten, is het belangrijk dat de radioactief gelabelde residuen 
in zowel de grond als de testorganismen worden gekenmerkt op basis van 
de percentages van de oorspronkelijke teststof en de gelabelde niet-oorspronkelijke stof, bv. in monsters die zijn genomen in stationaire 
toestand of aan het eind van de opnamefase, zodat een 
bioaccumulatiefactor (BAF) kan worden berekend voor de oorspronkelijke teststof en voor de desbetreffende grondmetabolieten (zie punt 50). Mogelijk moet de hier beschreven methode worden aangepast, bv. om voor voldoende 
biomassa te zorgen, voor het meten van niet-radioactief gelabelde organi ­
sche teststoffen of metalen. Indien de totale hoeveelheid radioactieve resi ­
duen wordt gemeten (door vloeistofscintillatietelling na extractie, verbran ­
ding of weefselsolubilisatie), wordt de bioaccumulatiefactor gebaseerd op de 
oorspronkelijke teststof en metabolieten. De berekening van de BAF moet 
bij voorkeur worden gebaseerd op de concentratie van de oorspronkelijke teststof in de organismen en de totale hoeveelheid radioactieve residuen. Vervolgens moet de voor het vetgehalte van de worm en het gehalte aan 
organische koolstof (OC) in de bodem genormaliseerde 
biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) worden berekend op basis van de BAF, zodat de resultaten van verschillende bioaccumulatietests met elkaar kunnen worden vergeleken.
 
8. De toxiciteit van de teststof voor de in de test gebruikte soort moet bekend 
zijn, bv. een effectconcentratie (EC  x ) of letale concentratie (LC  x ) voor de 
tijd van de opnamefase (bv. (19)). De geselecteerde concentratie van de teststof moet bij voorkeur ongeveer 1 % bedragen van de acute asymptoti ­
sche LC
 50 en ten minste tien keer zo hoog zijn als de aantoonbaarheidsgrens 
van de stof in grond voor de gebruikte analysemethode. De voorkeur moet worden gegeven aan toxiciteitswaarden die zijn afgeleid uit langetermijn ­
onderzoek naar subletale eindpunten (51)(52), voor zover beschikbaar. In ­
dien dergelijke gegevens niet beschikbaar zijn, geeft een test op acute toxi ­
citeit nuttige informatie (zie bv. (23)).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Er moet een geschikte analysemethode met een bekende juistheid, precisie 
en gevoeligheid voor de kwantificering van de chemische stof in de tes ­
toplossingen, in de bodem en in het biologische materiaal beschikbaar zijn, alsook nadere gegevens met betrekking tot monsterbereiding en -opslag en veiligheidsinformatiebladen voor materialen. De analytische aantoonbaar ­
heidsgrenzen van de teststof in de bodem en het wormweefsel moeten even ­
eens bekend zijn. Indien een met
 14 C gelabelde teststof wordt gebruikt, 
moeten de specifieke radioactiviteit (d.w.z. Bq mol  –1 ) en het percentage 
van de met onzuiverheden verbonden radioactiviteit bekend zijn. De speci ­
fieke radioactiviteit van de teststof moet hoog genoeg zijn om analyse 
mogelijk te maken en de gebruikte testconcentraties mogen geen toxische effecten veroorzaken.
 
10. De test kan worden uitgevoerd met kunstmatige grond of met natuurlijke 
grond. Informatie over kenmerken van de gebruikte natuurlijke grond, bv. de oorsprong van de grond of de bestanddelen ervan, de pH-waarde, het gehalte aan organische koolstof, de deeltjesgrootteverdeling (percentage 
zand, silt en klei) en het waterhoudend vermogen (WHC), moet bekend 
zijn vóór de start van de test (3)(48).
 
PRINCIPE VAN DE TEST  
11. De parameters die kenmerkend zijn voor de bioaccumulatie van een teststof 
zijn onder meer de bioaccumulatiefactor (BAF), de opnamesnelheidscon ­
stante (k  s ) en de eliminatiesnelheidsconstante (k  e ). Definities worden gege ­
ven in aanhangsel 1.  
12. De test bestaat uit twee fasen: de opnamefase (blootstelling) en de elimina ­
tiefase (na blootstelling). Tijdens de opnamefase worden duplogroepen wor ­
men blootgesteld aan grond die verrijkt is met de teststof. Naast deze test ­
dieren worden groepen controlewormen onder identieke omstandigheden 
zonder de teststof gehouden. Het drooggewicht en het vetgehalte van de testorganismen worden gemeten. Dit kan worden gedaan met behulp van de wormen van de controlegroep. Analytische nuleffectmetingen (blanco) kun ­
nen worden uitgevoerd door monsters van de controlewormen en -grond te 
analyseren. Voor de eliminatiefase worden de wormen overgebracht naar grond die vrij is van de teststof. Een eliminatiefase is altijd vereist, tenzij de opname van de teststof tijdens de blootstellingsfase niet significant was. 
Een eliminatiefase levert informatie op over de snelheid waarmee de teststof 
door de testorganismen wordt uitgescheiden (bv. (27)). Indien tijdens de opnamefase geen stationaire toestand is bereikt, moet de bepaling van de kinetische parameters — kinetische bioaccumulatiefactor BAF
 k , opname- en 
eliminatiesnelheidsconstante(n) — bij voorkeur gebaseerd zijn op simultane 
fitting van de resultaten van de opname- en de eliminatiefasen. De concen ­
tratie van de teststof in/op de wormen wordt gedurende beide fasen gemo ­
nitord.  
13. Tijdens de opnamefase worden metingen verricht op bemonsteringstijdstip ­
pen tot 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen) totdat de 
stationaire toestand is bereikt (11)(12)(67). De stationaire toestand treedt op 
wanneer de tegen de tijd uitgezette concentratie in wormen evenwijdig loopt aan de tijdas en drie opeenvolgende concentratieanalysen van monsters die genomen zijn met intervallen van ten minste twee dagen, niet meer dan 
± 20 % van elkaar variëren op basis van statistische vergelijkingen (bv. 
analyse van variantie, regressieanalyse).
 
14. De eliminatiefase bestaat uit het overbrengen van de testorganismen naar 
vaten met hetzelfde substraat zonder de teststof. Tijdens de eliminatiefase 
worden metingen verricht op bemonsteringstijdstippen gedurende 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen (regenwormen), tenzij uit eerdere analytische bepaling een vermindering van 90 % van de teststofresiduen in wormen is 
gebleken. De concentratie van de teststof in de wormen aan het eind van de 
eliminatiefase wordt gerapporteerd als niet-geëlimineerde residuen. De
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
bioaccumulatiefactor in stationaire toestand (BAF  SS ) wordt bij voorkeur 
berekend op twee manieren: als de verhouding tussen de concentratie in 
wormen (C  a ) en in de bodem (C  s ) bij een kennelijke stationaire toestand, en 
als een kinetische bioaccumulatiefactor, BAF  K , zijnde de verhouding tussen 
de snelheidsconstante van opname uit de bodem (k  s ) en de eliminatiesnel ­
heidsconstante (k  e ) (zie aanhangsel 1 voor definities), uitgaande van een 
eersteordekinetiek (zie aanhangsel 2 voor berekeningen). Indien eersteorde ­
kinetiek duidelijk niet van toepassing is, moeten andere modellen worden gebruikt.
 
15. De opnamesnelheidsconstante, de eliminatiesnelheidsconstante (of -constan ­
ten, indien andere modellen gebruikt worden), de kinetische bioaccumula ­
tiefactor (BAF  K ) en, indien mogelijk, de betrouwbaarheidsgrenzen van elk 
van deze parameters worden berekend met behulp van gecomputeriseerde modelvergelijkingen (zie aanhangsel 2 voor richtsnoeren). De kwaliteit van de fitting van ieder model dat wordt gebruikt, kan worden bepaald aan de 
hand van bijvoorbeeld de correlatiecoëfficiënt of de determinatiecoëfficiënt 
(coëfficiënten die in de buurt van één liggen, duiden op een goede fitting) of chi-kwadraattest. Ook kan de grootte van de standaardfout of betrouwbaar ­
heidsgrens rond de geschatte parameters een indicatie zijn van de kwaliteit 
van de fitting van het model.
 
16. Ter vermindering van de variabiliteit in de testresultaten voor teststoffen met 
een hoge lipofiliciteit moeten de bioaccumulatiefactoren worden uitgedrukt 
in verhouding tot het vetgehalte en het gehalte aan organische koolstof (kg 
organische koolstof in de bodem (OC) kg  –1 vetgehalte van worm). Deze 
aanpak is gebaseerd op het feit dat voor bepaalde chemische klassen een 
duidelijk verband bestaat tussen het bioaccumulatiepotentieel en de lipofili ­
citeit; dit is duidelijk vastgesteld voor vissen (47). Er is een verband tussen het vetgehalte van vissen en de bioaccumulatie van dergelijke stoffen. Voor bentische organismen zijn soortgelijke correlaties gevonden, bv. (30)(44). 
Ook voor terrestrische  Oligochaetae  is deze correlatie aangetoond, bv. 
(5)(6)(7)(14). Indien voldoende wormweefsel beschikbaar is, kan het vetge ­
halte van de testdieren op hetzelfde biologische materiaal worden bepaald als het materiaal dat gebruikt is om de concentratie van de teststof te 
bepalen. Als alternatief kunnen controledieren worden gebruikt om het vet ­
gehalte te meten.
 
GELDIGHEID VAN DE TEST  
17. Voor een geldige test moeten zowel de controle- als de testgroepen aan de 
volgende criteria voldoen:  
— aan het eind van de test mag de totale sterfte tijdens de opname- en 
eliminatiefase niet hoger zijn dan 10 % (regenwormen) of 20 % („En ­
chytraeidae”) van het totale aantal ingebrachte wormen;  
— voor  Eisenia fetida  en Eisenia andrei  mag het gemiddelde massaverlies, 
gemeten aan het eind van de opnamefase en aan het eind van de elimi ­
natiefase, niet hoger zijn dan 20 % in vergelijking met het versgewicht aan het begin van iedere fase.
 
BESCHRIJVING VAN DE METHODE  
Diersoort  
18. Diverse soorten terrestrische  Oligochaetae  worden aanbevolen voor tests op 
bioaccumulatie. In aanhangsel 5 zijn de meest gebruikte soorten beschreven, 
namelijk  Eisenia fetida  of Eisenia andrei  („Lumbricidae”), of  Enchytraeus 
albidus , Enchytraeus crypticus  of Enchytraeus luxuriosus  („Enchytraeidae”).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Apparatuur  
19. Voor alle onderdelen van de apparatuur moet het gebruik van materialen die 
de teststof kunnen oplossen of adsorberen of andere stoffen kunnen logen en die een schadelijk effect op de testdieren hebben, worden vermeden. Er 
kunnen rechthoekige of cilindervormige standaardvaten met een passend 
volume van een chemisch inert materiaal worden gebruikt, die geschikt zijn voor de densiteit, d.w.z. het aantal testwormen. Roestvrij staal, kunststof of glas kan worden gebruikt voor apparatuur die in contact komt met de 
testmedia. De testvaten moeten dusdanig zijn afgedekt dat de wormen niet 
kunnen ontsnappen, terwijl ze van voldoende lucht worden voorzien. Voor stoffen met een hoge adsorptiecoëfficiënt, zoals synthetische pyretroïden, 
kan het noodzakelijk zijn gesilaniseerd glas te gebruiken. In deze situaties 
moet de apparatuur na gebruik als afval worden verwijderd (49). Voor ­
komen moet worden dat radioactief gelabelde teststoffen en vluchtige che ­
mische stoffen ontsnappen. Er moeten afscheiders (bv. gaswasflessen van 
glas) met geschikte absorptiemiddelen worden gebruikt om eventuele resi ­
duen die uit de testvaten verdampen, op te vangen.
 
Grond  
20. De testgrond moet van een dusdanige kwaliteit zijn dat de testorganismen 
kunnen overleven en, bij voorkeur, zich kunnen voortplanten gedurende de acclimatiserings- en testperioden, zonder een abnormaal uiterlijk te hebben 
of abnormaal gedrag te vertonen. De wormen moeten boortunnels in de 
grond maken.
 
21. De kunstmatige grond die in hoofdstuk C.8 van deze bijlage (48) wordt 
beschreven, is het aanbevolen substraat in de tests. Aanhangsel 4 beschrijft 
de voorbereiding van de kunstmatige grond voor gebruik in de bioaccumu ­
latietests en geeft aanbevelingen voor de opslag van kunstmatige grond. Luchtgedroogde kunstmatige grond kan bij kamertemperatuur tot gebruik 
worden bewaard.
 
22. Natuurlijke grond van niet-verontreinigde terreinen kan echter ook als test- 
en/of kweeksubstraat dienen. Natuurlijke grond moet worden gekarakteri ­
seerd met ten minste de oorsprong (plaats van verzameling), pH, gehalte aan 
organische koolstof, deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei), het maximale waterhoudende vermogen (WHC
 max ) en het procentuele wa ­
tergehalte (3). Analyse van de grond of de bestanddelen ervan op micro ­
verontreinigingen vóór gebruik levert in dit verband nuttige informatie op. 
Indien grond van landbouwvelden wordt gebruikt, mag de grond gedurende ten minste één jaar niet met gewasbeschermingsproducten of met mest van behandelde dieren en gedurende ten minste zes maanden vóór de monster ­
name niet met organische meststoffen behandeld zijn (50). Manipulatiepro ­
cedures voor natuurlijke grond vóór het gebruik ervan in ecotoxicologische tests met  Oligochaetae  in het laboratorium zijn beschreven in (3). Voor 
natuurlijke grond moet de opslagtijd in het laboratorium zo kort mogelijk 
worden gehouden.
 
Het aanbrengen van de teststof  
23. De teststof wordt in de grond gebracht. De fysisch-chemische eigenschappen 
van de teststof moeten in aanmerking worden genomen. Een in water op ­
losbare teststof moet volledig in water opgelost zijn voordat de stof met de 
grond wordt vermengd. Als verrijkingsprocedure voor moeilijk in water 
oplosbare teststoffen wordt aanbevolen een laag teststof aan te brengen op één of meer bestanddelen van de (kunstmatige) grond. Zo kan (een deel van) het kwartszand worden doordrenkt met een oplossing van de teststof in 
een geschikt organisch oplosmiddel, dat vervolgens langzaam wordt in ­
gedampt. Vervolgens kan het met een laag van de teststof bedekte deel
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
met de vochtige grond worden gemengd. Het grote voordeel van deze pro ­
cedure is dat geen oplosmiddel in de grond terechtkomt. Bij gebruik van 
natuurlijke grond kan de teststof op de hierboven voor kunstmatige grond beschreven wijze worden toegevoegd aan een luchtgedroogd deel van de grond of door de vochtige grond worden geroerd, met vervolgens verdam ­
ping indien een solubilisator wordt gebruikt. In het algemeen moet zo veel 
mogelijk worden vermeden dat de vochtige grond in contact komt met oplosmiddelen. Er moet rekening worden gehouden met de volgende over ­
wegingen (3):
 
— indien een ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt, moet dit een 
middel zijn dat mengbaar is met water en/of kan worden afgedreven (bijvoorbeeld verdampt), waardoor alleen de teststof op de grond achter ­
blijft;
 
— indien een oplosmiddelcontrolegroep wordt gebruikt, is een negatieve 
controle niet nodig. De oplosmiddelcontrolegroep moet de hoogste con ­
centratie oplosmiddel bevatten die aan de grond is toegevoegd en het 
gebruikte oplosmiddel moet afkomstig zijn van dezelfde partij die voor 
het bereiden van de stamoplossing is gebruikt. De toxiciteit en vluchtig ­
heid van het oplosmiddel alsmede de oplosbaarheid van de teststof in het gekozen oplosmiddel moeten de voornaamste criteria zijn op basis waar ­
van een geschikte solubilisator wordt gekozen.
 
24. Voor chemische stoffen die slecht in water en in organische oplosmiddelen 
oplosbaar zijn, kan, bijvoorbeeld met behulp van een vijzel en stamper, 2,0- 2,5 g fijn gemalen kwartszand per testvat worden gemengd met de hoe ­
veelheid teststof die nodig is om de gewenste testconcentratie te verkrijgen. 
Het mengsel van kwartszand en teststof wordt toegevoegd aan de vooraf bevochtigde grond en grondig gemengd met een passende hoeveelheid ge ­
deïoniseerd water om het vereiste vochtgehalte te verkrijgen. Het uiteinde ­
lijke mengsel wordt over de testvaten verdeeld. De procedure wordt voor 
iedere testconcentratie herhaald en tevens wordt een passende controlegroep met 2,0-2,5 g fijn gemalen kwartszand per testvat bereid.
 
25. De concentratie van de teststof in de grond moet na verrijking worden 
bepaald. De homogene verdeling van de teststof in de grond moet worden gecontroleerd voordat de testorganismen worden toegevoegd. De verrij ­
kingsmethode en de redenen voor het kiezen van een specifieke verrijkings ­
procedure moeten worden gerapporteerd (24).
 
26. Idealiter moet een evenwicht tussen de grond- en de poriënwaterfase zijn 
bereikt voordat de organismen worden toegevoegd; een periode van vier dagen bij 20 °C wordt aanbevolen. Voor vele slecht in water oplosbare 
organische stoffen kan de tijd die nodig is om een echt evenwicht tussen 
geadsorbeerde en opgeloste fracties te bereiken, worden geteld in dagen of maanden. Afhankelijk van het doel van de studie, bijvoorbeeld wanneer de milieuomstandigheden moeten worden nagebootst, kan de verrijkte grond 
gedurende een langere periode „gerijpt” worden, bv. voor metalen drie 
weken bij 20 °C (22).
 
Kweken van de testorganismen  
27. Wormen moeten bij voorkeur in een permanente laboratoriumcultuur wor ­
den gehouden. Richtsnoeren voor de laboratoriumkweekmethoden voor  Ei­
senia fetida  en Eisenia andrei  en voor soorten „Enchytraeidae” zijn opge ­
nomen in aanhangsel 5 (zie ook (48)(51)(52)).  
28. De in de tests gebruikte wormen moeten vrij zijn van waarneembare ziekten, 
abnormaliteiten en parasieten.  
UITVOERING VAN DE TEST  
29. De testorganismen worden tijdens de opnamefase aan de teststof bloot ­
gesteld. De opnamefase duurt 14 dagen („Enchytraeidae”) of 21 dagen 
(regenwormen), tenzij aangetoond is dat een stationaire toestand is bereikt.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Voor de eliminatiefase worden de wormen overgebracht naar grond die vrij 
is van teststof. Het eerste monster moet 4 tot 24 uur na het begin van de 
eliminatiefase worden genomen. Voorbeelden van bemonsteringsschema’s voor een opnamefase van 21 dagen en een eliminatiefase van 21 dagen zijn opgenomen in aanhangsel 3.
 
Testorganismen  
31. Voor vele soorten terrestrische „Enchytraeidae” is het individuele gewicht 
zeer laag (bv. 5-10 mg natgewicht voor  Enchytraeus albidus  en minder voor  
Enchytraeus crypticus  of Enchytraeus luxuriosus ); om de gewichtsmetingen 
en chemische analyse uit te voeren, kan het nodig zijn om de wormen van 
de duplotestvaten in een gezamenlijke groep te bundelen (d.w.z. alle wor ­
men in een duplovat worden gebruikt om één analytisch meetresultaat voor het weefsel te verkrijgen). 20 individuele „Enchytraeidae” worden aan ieder duplovat toegevoegd en ten minste drie duplovaten moeten worden gebruikt. 
Als de analytische aantoonbaarheidsgrens van de teststof hoog is, zijn mo ­
gelijk meer wormen nodig. Voor testsoorten met een hoger individueel gewicht ( Eisenia fetida  en Eisenia andrei ) kunnen duplovaten met één 
individu worden gebruikt.
 
32. De regenwormen die in een test worden gebruikt, moeten een vergelijkbaar 
gewicht hebben (bv.  Eisenia fetida  en Eisenia andrei  moeten een individu ­
eel gewicht hebben van 250-600 mg). „Enchytraeidae” (bv.  Enchytraeus 
albidus ) moeten een lengte hebben van ongeveer 1 cm. Alle wormen die 
in een bepaalde test worden gebruikt, moeten van dezelfde bron afkomstig zijn en moeten volwassen dieren met een clitellum zijn (zie aanhangsel 5). 
Aangezien het gewicht en de leeftijd van een dier een effect kunnen hebben 
op de BAF-waarden (bv. vanwege een variërend vetgehalte en/of de aan ­
wezigheid van eieren), moeten deze parameters nauwkeurig geregistreerd worden en in aanmerking worden genomen bij het interpreteren van de 
resultaten. Daarnaast kunnen tijdens de blootstellingsperiode cocons worden 
gevormd, die eveneens van invloed zullen zijn op de BAF-waarden. Het verdient aanbeveling vóór de test een deelsteekproef van de testwormen te wegen om een schatting van het gemiddelde nat- en drooggewicht te ver ­
krijgen.
 
33. Om de afname van de teststofconcentratie in de grond tijdens de opnamefase 
te beperken, moet een grote grond-wormverhouding worden toegepast. Voor  
Eisenia fetida  en Eisenia andrei  wordt een minimale hoeveelheid van 50 g 
drooggewicht aan grond per worm aanbevolen en voor „Enchytraeidae” minimaal 10-20 g drooggewicht per testvat. De vaten moeten een grondlaag 
van 2-3 cm („Enchytraeidae”) of 4-5 cm (regenwormen) bevatten.
 
34. De in een test gebruikte wormen worden uit de cultuur verwijderd („En ­
chytraeidae” bijvoorbeeld met behulp van een juwelierspincet). Volwassen 
dieren worden overgebracht naar onbehandelde testgrond om te acclimati ­
seren en worden gevoed (zie punt 36). Als de testomstandigheden verschil ­
len van de cultuuromstandigheden, moet een acclimatiseringsfase van 24-72 
uur volstaan om de wormen aan de testomstandigheden te laten wennen. Na 
acclimatisering worden de regenwormen gespoeld door ze naar glazen scha ­
len (bv. petrischalen) met schoon water over te brengen, waarna ze worden gewogen en aan de testgrond worden toegevoegd. Voordat ze worden ge ­
wogen, moet overtollig water van de wormen worden verwijderd door ze 
voorzichtig tegen de rand van het schaaltje te houden of door ze voorzichtig droog te deppen met een licht bevochtigd papieren doekje.
 
35. Het graafgedrag van de testorganismen moet worden geobserveerd en ge ­
registreerd. In tests met regenwormen beginnen de dieren (controle- en test ­
groep) gewoonlijk binnen enkele uren tunnels te graven; dit moet binnen 24 uur na inbrenging van de wormen in de testvaten worden gecontroleerd. 
Indien de regenwormen geen tunnels in de grond graven (bv. meer dan 
10 % gedurende meer dan de helft van de opnamefase), duidt dit erop dat
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
de testomstandigheden niet passend zijn of dat de testorganismen niet ge ­
zond zijn. In een dergelijk geval moet de test worden stopgezet en herhaald. 
„Enchytraeidae” leven voornamelijk in de interstitiële poriën van de grond en vaak komt hun integument slechts gedeeltelijk in aanraking met het omringende substraat; de blootstelling van gravende en niet gravende „En ­
chytraeidae” wordt verondersteld equivalent te zijn en indien de „Enchytrae ­
idae” niet graven, wil dat niet noodzakelijkerwijs zeggen dat de test moet worden herhaald.
 
Voeding  
36. Als grond met een laag totaal gehalte aan organische koolstof wordt ge ­
bruikt, moet worden overwogen voeding toe te dienen. Bij gebruik van kunstmatige grond wordt een wekelijks rantsoen (d.w.z. de wormen moeten 
eenmaal per week worden gevoed) van 7 mg gedroogde mest per g grond 
(drooggewicht) voor regenwormen en een wekelijks rantsoen van 2-2,5 mg gemalen havervlokken per g grond (drooggewicht) voor „Enchytraeidae” aanbevolen (11). Het eerste rantsoen moet net voordat de testorganismen 
worden toegevoegd, met de grond worden vermengd. Bij voorkeur moet 
dezelfde soort voeding worden gebruikt als de voeding die in de culturen wordt gebruikt (zie aanhangsel 5).
 
Licht en temperatuur  
37. De tests moeten worden uitgevoerd bij een gecontroleerde cyclus van 16 uur 
licht en 8 uur donker, met bij voorkeur 400 tot 800 lux in het gebied van de testvaten (3). De testtemperatuur moet gedurende de gehele test 20 ± 2 °C 
zijn.
 
Testconcentraties  
38. Er wordt gebruikgemaakt van één concentratie. Situaties waarin één of meer 
aanvullende concentraties nodig zijn, moeten worden gemotiveerd. Indien de 
toxiciteit (EC  x ) van de teststof dicht bij de analytische aantoonbaarheids ­
grens ligt, verdient het aanbeveling om een radioactief gelabelde teststof met 
een hoge specifieke radioactiviteit te gebruiken. Voor metalen moet de con ­
centratie hoger zijn dan het achtergrondniveau in weefsel en grond.  
Duplo’s  
39. Voor de kinetische metingen (opname- en eliminatiefase) moeten er per 
bemonsteringspunt minimaal drie behandelde duplovaten zijn. Het totale aantal bereide duplo’s moet voldoende zijn voor alle bemonsteringstijdstip ­
pen tijdens de opname- en eliminatiefase.
 
40. Voor de biologische waarnemingen en metingen (bv. de verhouding tussen 
nat- en drooggewicht, het vetgehalte) en voor de analyse van achtergrond ­
concentraties in wormen en grond moeten ten minste twaalf duplovaten van een negatieve controlegroep (vier monsternamen aan het begin, vier aan het eind van de opnamefase en vier aan het eind van de eliminatiefase) beschik ­
baar zijn, indien geen ander oplosmiddel dan water wordt gebruikt. Indien 
een solubilisator wordt gebruikt om de teststof aan te brengen, moet in aanvulling op de met teststof behandelde duplo’s een oplosmiddelcontrole worden uitgevoerd (vier duplovaten moeten aan het begin worden bemon ­
sterd, vier aan het eind aan de opnamefase en vier aan het eind van de 
eliminatiefase) waarbij alle bestanddelen behalve de teststof worden ge ­
bruikt. In dat geval kan ook worden gezorgd voor vier aanvullende duplo ­
vaten van een negatieve controlegroep (geen oplosmiddel) voor facultatieve 
monstername aan het eind van de opnamefase. Deze duplo’s kunnen bio ­
logisch worden vergeleken met de oplosmiddelcontrolegroep om informatie te verkrijgen over een mogelijk effect van het oplosmiddel op de testorga ­
nismen. Het verdient aanbeveling te zorgen voor een voldoende aantal aan ­
vullende reserveduplovaten (bv. acht) voor zowel de testgroep als de con ­
trolegroep(en).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Frequentie van de metingen van de grondkwaliteit  
41. Aan het begin en aan het eind van de opname- en eliminatiefase worden de 
pH van de grond, het vochtgehalte van de grond en de temperatuur (continu) in de testruimte gemeten. Eenmaal per week wordt het vochtgehalte van de 
grond gecontroleerd door de testvaten te wegen en de meetwaarden met het 
initiële gewicht aan het begin van de test te vergelijken. Waterverliezen moeten worden gecompenseerd door gedeïoniseerd water toe te voegen.
 
Bemonstering en analyse van de wormen en de grond  
42. Een voorbeeld van een schema voor de opname- en eliminatiefasen van 
bioaccumulatietests met regenwormen en „Enchytraeidae” is opgenomen in aanhangsel 3.
 
43. De grond in de testvaten wordt bemonsterd om de concentratie teststof vóór 
toevoeging van de wormen en tijdens de opname- en eliminatiefasen te bepalen. Tijdens de test worden de concentraties teststof in de wormen en 
de grond bepaald. In het algemeen worden totale grondconcentraties geme ­
ten. Facultatief kunnen concentraties in poriënwater worden gemeten; in dat geval moeten voor aanvang van het onderzoek een motivering en passende methoden worden opgegeven, die tevens in het verslag worden opgenomen.
 
44. De wormen en grond worden tijdens de opname- en eliminatiefasen op 
minimaal zes momenten bemonsterd. Indien de stabiliteit van een teststof 
is aangetoond, kan het aantal grondanalysen worden verminderd. Het ver ­
dient aanbeveling om ten minste drie duplo’s aan het begin en aan het eind van de opnamefase te analyseren. Als de concentratie in de grond die aan het eind van de opnamefase wordt gemeten, meer dan 30 % afwijkt van de 
initiële concentratie, moeten de grondmonsters die op andere dagen zijn 
genomen ook worden geanalyseerd.
 
45. De wormen van een duplo moeten bij iedere monstername uit de grond 
worden verwijderd (bv. door de grond van een duplovat over een ondiepe 
schaal te verspreiden en de wormen met een zacht juwelierspincet op te pakken) en vervolgens snel met water worden gespoeld in een ondiepe glazen of stalen schaal. Overtollig water moet worden verwijderd (zie 
punt 34). De wormen worden vervolgens voorzichtig overgebracht naar 
een van tevoren gewogen vat en onmiddellijk gewogen, inclusief darm ­
inhoud.
 
46. De regenwormen ( Eisenia  spp.) ontlasten vervolgens 's nachts hun darmen, 
bv. op een vochtig stuk filterpapier in een afgedekte petrischaal (zie punt 34). Nadat de wormen hun darmen hebben ontlast, wordt het gewicht van de 
wormen bepaald om een eventuele vermindering van biomassa tijdens de 
test te beoordelen (zie geldigheidscriteria in punt 17). Het wegen en de weefselanalyse van „Enchytraeidae” wordt uitgevoerd zonder dat de dieren hun darmen hebben ontlast, aangezien dit in technisch opzicht moeilijk is 
vanwege de geringe omvang van deze wormen. Nadat het uiteindelijke 
gewicht is bepaald, moeten de wormen onverwijld worden gedood door middel van de meest passende methode (bv. met gebruikmaking van vloei ­
bare stikstof of door bevriezen bij temperaturen onder – 18 °C).
 
47. Tijdens de eliminatiefase vervangen de wormen verontreinigde darminhoud 
met schone grond. Dit betekent dat onmiddellijk vóór de eliminatiefase 
genomen monsters van wormen die zich niet hebben ontlast („Enchytrae ­
idae” in dit geval) verontreinigde darminhoud bevatten. Voor aquatische  
Oligochaetae  wordt aangenomen dat het merendeel van de verontreinigde 
darminhoud na de eerste 4 tot 24 uur van de eliminatiefase door schoon 
sediment is vervangen, zie bv. (46). In studies naar de accumulatie van 
radioactief gelabeld cadmium en zink zijn vergelijkbare bevindingen voor regenwormen gerapporteerd (78). In de „Enchytraeidae” die zich niet heb ­
ben ontlast, kan de concentratie van dit eerste monster van de eliminatiefase 
worden beschouwd als de weefselconcentratie na ontlasting van de darm. 
Om rekening te houden met de verdunning van de teststofconcentratie door opname van niet-verontreinigde grond tijdens de eliminatiefase, kan het gewicht van de darminhoud worden geschat op basis van de verhouding 
natgewicht/asgewicht van de worm of de verhouding drooggewicht/asge ­
wicht van de worm.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. De grond- en wormmonsters moeten bij voorkeur onmiddellijk na verwij ­
dering (d.w.z. binnen één-twee dagen) worden geanalyseerd om ontbinding 
of andere verliezen te voorkomen en het verdient aanbeveling om de opname- en eliminatiesnelheden bij benadering te berekenen naarmate de test vordert. Als de analyse met vertraging plaatsvindt, moeten de monsters 
op passende wijze worden bewaard, bv. diepgevroren ( ≤ – 18 °C).
 
49. Gecontroleerd moet worden of de precisie en reproduceerbaarheid van de 
chemische analyse alsmede de recovery van de teststof uit de grond- en 
wormmonsters toereikend zijn voor de gebruikte methode; de extractie-efficiëntie, de aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) moeten worden gerapporteerd. Ook moet wor ­
den gecontroleerd of de teststof in de controlevaten niet detecteerbaar is in 
hogere concentraties dan de achtergrondconcentratie. Indien bij de contro ­
lewormen de concentratie van de teststof in het testorganisme C
 a > 0, moet 
hiermee rekening worden gehouden bij de berekening van de kinetische 
parameters (zie aanhangsel 2). Alle monsters moeten tijdens de gehele test 
dusdanig worden gehanteerd dat verontreiniging en verlies (bv. ten gevolge van adsorptie van de teststof aan het bemonsteringshulpmiddel) tot een minimum worden beperkt.
 
50. Bij gebruik van radioactief gelabelde teststoffen is het mogelijk om de 
oorspronkelijke stof en de metabolieten te analyseren. Kwantificering van 
de oorspronkelijke teststof en de metabolieten in stationaire toestand of aan 
het eind van de opnamefase levert belangrijke informatie op. De monsters worden vervolgens „opgeschoond”, zodat de oorspronkelijke teststof afzon ­
derlijk kan worden gekwantificeerd. Indien individuele metabolieten een 
radioactiviteit van meer dan 10 % van de totale radioactiviteit hebben, wordt 
aanbevolen deze metabolieten te identificeren.
 
51. De totale recovery en de teststofrecovery in wormen, grond en, indien 
gebruikt, in afscheiders met absorptiemiddelen om verdampte teststof op te vangen, moeten worden geregistreerd en gerapporteerd.
 
52. Bundeling van de bemonsterde individuen uit een bepaald testvat is aan ­
vaardbaar voor „Enchytraeidae” die kleiner zijn dan regenwormen. Indien door de bundeling het aantal duplo’s afneemt, beperkt dit de statistische 
procedures die op de gegevens kunnen worden toegepast. Indien het nodig 
is een specifieke statistische procedure toe te passen of een bepaald statis ­
tisch onderscheidingsvermogen te bereiken, moet de test, rekening houdend met die bundeling, die procedure en dat onderscheidingsvermogen, met een 
voldoende aantal duplotestvaten worden uitgevoerd.
 
53. Het verdient aanbeveling om de BAF uit te drukken als functie van het 
totale drooggewicht en, indien nodig (d.w.z. voor zeer hydrofobe chemische 
stoffen), als functie van het vetgehalte. Er moeten geschikte methoden wor ­
den toegepast om het vetgehalte te bepalen (sommige bestaande methoden — bv. (31)(58) — moeten hiervoor worden aangepast). Bij deze methoden 
wordt gebruikgemaakt van een chloroform/methanol-extractietechniek. Om 
het gebruik van gechloreerde oplosmiddelen te vermijden, moet echter een aangepaste versie van de methode van Bligh en Dyer (9), als beschreven in (17), worden gebruikt. Aangezien de verschillende methoden verschillende 
resultaten kunnen opleveren, is het van belang dat bijzonderheden over de 
gebruikte methode worden verstrekt. De vetanalyse moet, indien mogelijk, d.w.z. als voldoende wormweefsel voorhanden is, worden uitgevoerd op hetzelfde monster of extract als voor de analyse van de teststof wordt 
gebruikt — de vetten moeten immers meestal toch worden verwijderd al ­
vorens het extract chromatografisch kan worden geanalyseerd (49). Als alternatief kunnen controledieren worden gebruikt om het vetgehalte te me ­
ten, dat vervolgens gebruikt kan worden om de BAF-waarden te normali ­
seren. Deze laatstgenoemde aanpak vermindert de verontreiniging van ap ­
paratuur met de teststof.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
GEGEVENS EN RAPPORTAGE  
Verwerking van de resultaten  
54. De opnamecurve van de teststof wordt verkregen door de concentratie in/op 
de wormen tijdens de opnamefase uit te zetten tegen de tijd in een lineair coördinatenstelsel. Wanneer de curve een plateau, of stationaire toestand, heeft bereikt (zie definities in aanhangsel 1), wordt de bioaccumulatiefactor 
in stationaire toestand, BAF
 ss , berekend op basis van:  
C a in stationaire toestand of aan het eind van de opnamefase  ðgemiddeldÞ 
C s in stationaire toestand of aan het eind van de opnamefase  ðgemiddeldÞ 
C a is de concentratie van teststof in het testorganisme  
C s is de concentratie van teststof in de grond  
55. Indien geen stationaire toestand wordt bereikt, moet in plaats van de BAF  ss 
de BAF  K op basis van de snelheidsconstanten worden bepaald, en wel als 
volgt:  
— de accumulatiefactor (BAF  K ) wordt bepaald als de verhouding k  s /k e ; 
— de opname- en eliminatiesnelheden worden bij voorkeur tegelijkertijd 
bepaald (zie vergelijking [11] in aanhangsel 2);  
— de eliminatiesnelheidsconstante (k  e ) wordt gewoonlijk bepaald op basis 
van de eliminatiecurve (d.w.z. de uitgezette concentratie van de teststof in de wormen tijdens de eliminatiefase). De opnamesnelheidsconstante 
k
 s wordt vervolgens berekend met de bekende k  e en een waarde van C  a 
die wordt afgeleid van de opnamecurve — zie aanhangsel 2 voor een 
beschrijving van deze methoden. Het verdient de voorkeur BAF  K en de 
snelheidsconstanten k  s en k  e te berekenen met behulp van een gecom ­
puteriseerde niet-lineaire parameterschattingstechniek. Als de eliminatie 
duidelijk niet van de eerste orde is, moeten complexere modellen wor ­
den toegepast.  
Testverslag  
56. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:  
Teststof:  
— alle beschikbare informatie met betrekking tot acute toxiciteit of toxici ­
teit op lange termijn (bv. EC  x , LC  x , NOEC) van de teststof voor in de 
bodem levende  Oligochaetae ; 
— zuiverheid, fysische aard en fysisch-chemische eigenschappen, bv. log 
K ow , oplosbaarheid in water;  
— chemische identificatiegegevens, bron van de teststof, identiteit en con ­
centratie van eventueel gebruikte oplosmiddelen;  
— indien radioactief gelabelde teststof wordt gebruikt, de precieze positie 
van de gelabelde atomen, de specifieke radioactiviteit en de radioche ­
mische zuiverheid.  
Diersoort:  
— wetenschappelijke naam, stam, oorsprong, eventuele voorafgaande be ­
handeling, acclimatisatie, leeftijd, grootte-interval enz.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Testomstandigheden:  
— gebruikte testprocedure;  
— aard en kenmerken van de gebruikte verlichting en de fotoperiode(s);  
— testopzet (bv. aantal en grootte van de testvaten, grondmassa en hoogte 
van de grondlaag, aantal duplo’s, aantal wormen per duplo, aantal test ­
concentraties, duur van de opname- en de eliminatiefase, frequentie van de bemonstering);
 
— motivering van de keuze van het testvatmateriaal;  
— methode voor het bereiden en aanbrengen van de teststof en de redenen 
voor het kiezen van een specifieke methode;  
— de nominale testconcentraties, de gemiddelden en standaardafwijkingen 
van de in de testvaten gemeten waarden en de methode waarmee deze waarden zijn bepaald;
 
— bron van de bestanddelen van de kunstmatige grond of — bij gebruik 
van natuurlijke media — oorsprong van de grond, beschrijving van eventuele voorbehandeling, resultaten van de controles (overleven, bio ­
massaontwikkeling, voortplanting), grondkenmerken (pH, totale gehalte 
aan organische koolstof, deeltjesgrootteverdeling (percentage zand, silt en klei), het maximale waterhoudende vermogen (WHC
 max ), het procen ­
tuele watergehalte aan het begin en aan het eind van de test en eventuele 
andere verrichte metingen);  
— gedetailleerde informatie over de verwerking van grond- en wormmon ­
sters, met inbegrip van details van de bereiding, opslag, verrijkingspro ­
cedures, extractie en analyseprocedures (en -precisie) voor de teststof in 
wormen en grond alsmede het vetgehalte (indien gemeten) en de re ­
covery van de teststof.  
Resultaten:  
— sterfte van de controlewormen en de wormen in elk testvat alsmede ieder 
waargenomen abnormaal gedrag (bv. vermijding van de grond, uitblijven van voortplanting in een bioaccumulatietest met „Enchytraeidae”);
 
— de verhouding tussen drooggewicht en natgewicht van de grond en de 
testorganismen (nuttig voor normalisatie);  
— het natgewicht van de wormen op ieder bemonsteringstijdstip; voor 
regenwormen, het natgewicht bij het begin van de test en op ieder 
bemonsteringstijdstip voor en na het ontlasten van de darm;  
— het vetgehalte van de testorganismen (indien bepaald);  
— grafieken van de opname- en eliminatiekinetiek van de teststof in de 
wormen en van de tijd tot de stationaire toestand;  
— C  a en C  s (met standaardafwijking en bereik, indien van toepassing) voor 
alle bemonsteringstijdstippen (C  a uitgedrukt in g kg  –1 nat- en droogge ­
wicht van het hele lichaam, C  s uitgedrukt in g kg  –1 nat- en drooggewicht 
van de grond). Indien een biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) nodig is 
(bv. om de resultaten van twee of meer tests die met dieren met een 
ander vetgehalte zijn uitgevoerd, te kunnen vergelijken), kan C  a aan­
vullend worden uitgedrukt in g kg  –1 vetgehalte van het organisme en 
kan C  s worden uitgedrukt in g kg  –1 organische koolstof (OC) van de 
grond;  
— BAF (uitgedrukt in kg grond ·kg –1 worm), de grondopnamesnelheidscon ­
stante k  s (uitgedrukt in g grond kg  –1 van worm dag  –1 ) en de eliminatie ­
snelheidsconstante k  e (uitgedrukt in dag  –1 ); BSAF (uitgedrukt in kg OC 
in de grond kg  –1 vetgehalte van de worm) kan aanvullend worden ge ­
rapporteerd;  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— indien gemeten: percentages van de oorspronkelijke stof, metabolieten 
en gebonden residuen (d.w.z. het percentage van de teststof dat niet 
geëxtraheerd kan worden met normale extractiemethoden) die in grond en testdieren zijn aangetoond;
 
— methoden die zijn gebruikt voor de statistische analyse van gegevens.  
Evaluatie van de resultaten:  
— overeenstemming van de resultaten met de in punt 17 vermelde geldig ­
heidscriteria;  
— onverwachte of ongewone resultaten, bv. onvolledige eliminatie van de 
teststof uit de testdieren.  
LITERATUUR:  
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane 
(γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University 
Coimbra.  
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
 
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Inter ­
national, E1676-04: 26 pp.  
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The 
Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. 
Beek): Bioaccumulation — New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlijn Heidelberg: 235-276.
 
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.  
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Her ­
mens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. 
Safety 25: 154-165.
 
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms ( Ei­
senia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.  
(8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.  
(9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.  
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Parijs, 671 p.  
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P 
(2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environ ­
mental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
 
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bio ­
accumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  En­
chytraeus luxuriosus  and Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, 
Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.  
(13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13-20.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.  
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29.  
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd, 
Nederland, pp. 555-576.  
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shell ­
fish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and 
Testing Programme.  
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 29: 140-145.
 
(19) Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad 
van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, hou ­
dende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van 
Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 
2000/21/EG van de Commissie (PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1).
 
(20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.  
(21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris  
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes 
by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardi ­
sierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Re ­
port to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Kan worden gedownload 
op: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
(23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: 57 pp.
 
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
 
(25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.  
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.  
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501-1514.  
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexa ­
chlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Di ­
chlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbrici ­
dae). Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF — Z. Umweltchem, Öko ­
tox. 15: 78-84.  
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for biocon ­
centration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225- 1231.
 
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods 
for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099- 
1105.  
(32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
 
(33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for 
soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
 
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.  
(35) ISO 11268-2 (1998) Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
(36) Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6-8.  
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080-2090.  
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.  
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, De ­
Jong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of 
polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligo­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
 
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.  
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Com ­
parison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
 
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.  
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp.  
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aro ­
matic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.  
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.  
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berliin 1990, VCH, Weinheim.
 
(48) Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen.  
(49) Hoofdstuk C.13 van deze bijlage, Bioconcentratie: doorstroomtest met vis ­
sen. 
(50) Hoofdstuk C.21 van deze bijlage, Micro-organismen in de bodem: bepaling 
van de omzetting van stikstof.  
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris . 
(52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia An ­
drei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris.  
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
(54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.  
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.  
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
 
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.  
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
(60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
 
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, 
In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
 
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Se ­
condary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 
2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.  
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
 
(64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413-433.
 
(65) Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Caroli ­
nea 57: 93-100.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
 
(68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.  
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scrog ­
gins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac 
Press, Pensacola, 67-81.
 
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167-1171.
 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation — Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Du ­
luth, MN, maart 2000.  
(73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277-285.  
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
(75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structu ­
reactivity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemos ­
phere 21: 1023-1033.  
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.  
(77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.  
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated flood ­
plain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
 
(79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Aanhangsel 1  
DEFINITIES  
Bioaccumulatie  is de toename van de concentratie van de teststof in of op een 
organisme ten opzichte van de concentratie van de teststof in het omringende medium. Bioaccumulatie is het gevolg van zowel bioconcentratie- als biomagni ­
ficatieprocessen (zie hieronder).
 
Bioconcentratie  is de toename van de concentratie van de teststof in of op een 
organisme ten gevolge van de opname van de chemische stof uit uitsluitend het omringende medium (d.w.z. via het lichaamsoppervlak en ingenomen grond) ten opzichte van de concentratie van de teststof in het omringende medium.
 
Biomagnificatie  is de toename van de concentratie van de teststof in of op een 
organisme ten gevolge van voornamelijk de opname van verontreinigde voeding of prooi ten opzichte van de concentratie van de teststof in de voeding of prooi. Biomagnificatie kan leiden tot een overdracht of accumulatie van de teststof 
binnen voedselketens.
 
De eliminatie  van een teststof is het verlies van die stof uit het weefsel van het 
testorganisme door actieve of passieve processen die optreden ongeacht of de 
teststof in het omringende medium aanwezig is.  
De bioaccumulatiefactor  (BAF) op enig moment van de opnamefase van deze 
bioaccumulatietest, is de verhouding tussen de concentratie van de teststof in of op het testorganisme (C
 a in g kg  –1 drooggewicht van worm) en de concentratie 
van die stof in het omringende medium (C  s in g kg  –1 drooggewicht van grond); 
de BAF heeft als eenheden kg grond ·kg –1 worm.  
De bioaccumulatiefactor in stationaire toestand  (BAF  ss ) is de BAF in statio ­
naire toestand en ondergaat gedurende langere tijd geen significante wijzigingen 
als de concentratie van de teststof in het omringende medium (C  s in g kg  –1 
drooggewicht van grond) constant blijft tijdens deze periode.  
Bioaccumulatiefactoren  die rechtstreeks op basis van de verhouding tussen de 
grondopnamesnelheidsconstante en de eliminatiesnelheidsconstante (k  s en k  e , zie 
hieronder) worden berekend, worden aangeduid met de term  kinetische bioaccu ­ 
mulatiefactor (BAF  K ). 
De biota-grondaccumulatiefactor  (BSAF) is de verhouding tussen de voor 
vetgehalte genormaliseerde concentratie van de teststof in of op het testorganisme 
en de voor organische koolstof genormaliseerde concentratie van de teststof in de 
grond in stationaire toestand. C  a wordt vervolgens uitgedrukt als g kg  –1 vetge­
halte van het organisme en C  s als g kg  –1 organisch materiaal in de grond; de 
BSAF heeft als eenheden kg OC ·kg –1 vet. 
Een plateau  of stationaire toestand  wordt gedefinieerd als het evenwicht tussen 
de opname- en eliminatieprocessen die gelijktijdig optreden tijdens de blootstel ­
lingsfase. De stationaire toestand wordt bereikt wanneer in een grafiek van de BAF als functie van de tijd de curve evenwijdig gaat lopen met de tijdas en drie 
opeenvolgende bepalingen van BAF op monsters die met tussenpozen van ten 
minste twee dagen worden genomen, niet meer dan 20 % van elkaar verschillen en er bovendien geen statistisch significant verschil bestaat tussen de waarden verkregen op de drie bemonsteringstijdstippen. Voor teststoffen die langzaam 
worden opgenomen, verdient het de voorkeur om intervallen van zeven dagen 
te gebruiken (49).
 
De organischekoolstof-water-verdelingscoëfficiënt  (K  oc ) is de verhouding tus ­
sen de concentratie van een stof in of op de fractie organische koolstof van een 
substraat en de concentratie van die stof in water in een toestand van evenwicht.  
De octanol-water-verdelingscoëfficiënt  (K ow ) is de verhouding tussen de oplos ­
baarheid van een stof in n-octanol en water bij evenwicht; deze verhouding wordt soms ook uitgedrukt als P
 ow . Het logaritme van K  ow (log K  ow ) wordt gebruikt als 
een indicatie van het bioaccumulatiepotentieel van een chemische stof door in het 
water levende organismen.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
De blootstellings- of opnamefase  is de periode gedurende welke de testorganis ­
men aan de teststof worden blootgesteld.  
De grondopnamesnelheidsconstante  (k s ) is de numerieke waarde die aangeeft 
hoe snel de concentratie van de teststof in of op de testorganismen toeneemt ten gevolge van de opname uit de grondfase. k
 s wordt uitgedrukt in g grond kg  –1 
van worm d  –1 . 
De eliminatiefase  is de periode die begint op het moment waarop de testorga ­
nismen van een medium dat de teststof bevat worden overgebracht naar een 
medium dat die stof niet bevat, en gedurende welke de eliminatie (of het netto ­
verlies) van de teststof uit het testorganisme wordt bestudeerd.  
De eliminatiesnelheidsconstante  (k e ) is de numerieke waarde die de snelheid 
aangeeft waarmee de concentratie van de teststof in of op het testorganisme 
afneemt na overbrenging van de testorganismen uit een medium dat de teststof bevat naar een medium dat de teststof niet bevat; k
 e wordt uitgedrukt in d  –1 . 
Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Aanhangsel 2  
Berekening van opname- en eliminatieparameters  
Het belangrijkste eindpunt van een bioaccumulatietest is de bioaccumulatiefactor, 
BAF. De gemeten BAF kan worden berekend door de concentratie in het tes ­
torganisme, C  a , te delen door de concentratie in de grond, C  s , in stationaire 
toestand. Indien de stationaire toestand tijdens de opnamefase niet wordt bereikt, 
wordt de BAF  K berekend op basis van de snelheidsconstanten in plaats van 
BAF  SS . Er dient echter opgetekend te worden of de BAF al dan niet gebaseerd 
is op concentraties in stationaire toestand.  
De gangbare manier voor het verkrijgen van de kinetische bioaccumulatiefactor 
(BAF  K ), de grondopnamesnelheidsconstante (k  s ) en de eliminatiesnelheidscon ­
stante (k  e ) is om gebruik te maken van gecomputeriseerde niet-lineaire parame ­
terschattingstechnieken, bv. op basis van de in (68) beschreven modellen. Op 
basis van de aan de tijd gerelateerde concentratiegegevens en modelvergelijkin ­
gen: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (Vergelijking [1])  
of 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c (Vergelijking [2])  
waarbij  
C a = concentratie van de chemische stof in wormen [g kg  –1 nat- of droogge ­
wicht];  
k s = opnamesnelheidsconstante in weefsel [g grond kg  –1 worm d  –1 ]; 
C s = concentratie van de chemische stof in grond [g kg  –1 nat- of droogge ­
wicht];  
k e = eliminatiesnelheidsconstante [d  –1 ]; 
t c = tijd aan het eind van de opnamefase,  
berekenen deze computerprogramma’s waarden voor BAF  K , k s en k  e . 
Indien de achtergrondconcentratie in de niet-blootgestelde wormen bijvoorbeeld 
op dag 0 significant afwijkt van nul (dit kan bv. het geval zijn voor metalen), moet met deze achtergrondconcentratie (C
 a,0 ) rekening worden gehouden in deze 
vergelijkingen, zodat ze aldus luiden: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (Vergelijking [3])  
en 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c (Vergelijking [4])  
In gevallen waarin een significante afname van concentratie van de teststof in de 
grond wordt waargenomen gedurende het verloop van de opnamefase, kunnen de 
volgende modellen worden gebruikt, bv. (67)(79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ (Vergelijking [5])  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
waarbij  
C s = concentratie van de chemische stof in grond [g kg  –1 nat- of droogge ­
wicht];  
k 0 = afbraaksnelheidsconstante in grond [d  –1 ]; 
C 0 = initiële concentratie van de chemische stof in grond [g kg  –1 nat- of droog ­
gewicht]; 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (Vergelijking [6]) 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c (Vergelijking [7])  
waarbij  
C a = concentratie van de chemische stof in wormen [g kg  –1 nat- of droogge ­
wicht];  
k s = opnamesnelheidsconstante in weefsel [g grond kg  –1 worm d  –1 ]; 
k 0 = afbraaksnelheidsconstante in grond [d  –1 ]; 
k e = eliminatiesnelheidsconstante [d  –1 ]; 
t c = tijd aan het eind van de opnamefase.  
Indien de stationaire toestand wordt bereikt tijdens de opnamefase (d.w.z. t = ∞), 
kan vergelijking [1] 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (Vergelijking [1])  
worden gereduceerd tot:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
of 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K (Vergelijking [8])  
Hierbij benadert k  s /k e × C  s de concentratie van de teststof in het wormweefsel in 
stationaire toestand (C  a,ss ). 
De biota-grondaccumulatiefactor (BSAF) kan als volgt worden berekend: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip (Vergelijking [9])  
waarbij f  oc de fractie organische koolstof in de grond is en f  lip de fractie worm ­
vet, beide bij voorkeur bepaald op monsternamen tijdens de test en op basis van 
respectievelijk droog- of natgewicht.  
De eliminatiekinetiek kan worden gemodelleerd met gebruikmaking van de ge ­
gevens uit de eliminatiefase en door de volgende modelvergelijking en een ge ­
computeriseerde niet-lineaire parameterschattingsmethode toe te passen. Als de tegen de tijd uitgezette gegevens wijzen op een constante exponentiële afname 
van de concentratie van de teststof in de dieren, kan een een-compartimentmodel 
(vergelijking [9]) worden gebruikt om het tijdverloop van de eliminatie te be ­
schrijven. 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t (Vergelijking [10])  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Eliminatieprocessen lijken soms uit twee fasen te bestaan in de zin dat ze tijdens 
de eerste fasen een snelle afname van C  a vertonen, waarna dit verandert in een 
langzamer verlies van teststoffen in de latere fasen van de eliminatie, bv. (27)(68). De twee fasen kunnen worden verklaard aan de hand van de aanname dat er twee verschillende compartimenten in het organisme zijn, waaruit de test ­
stof met verschillende snelheden verloren gaat. In deze gevallen moet specifieke 
literatuur worden bestudeerd, bv. (38)(39)(40)(78).
 
Met gebruikmaking van de bovenstaande modelvergelijkingen kunnen de kineti ­
sche parameters (k  s en k  e ) ook worden berekend in één uitvoering van de test 
door het eersteordekinetiekmodel op alle gegevens van zowel de opname- als de 
eliminatiefase tegelijk toe te passen. Voor een beschrijving van een methode die 
een dergelijke gecombineerde berekening van opname- en eliminatiesnelheids ­
constanten mogelijk maakt, kunnen (41), (73) en (70) worden geraadpleegd. 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
(Vergelijking [11])  
Noot:  Bij gelijktijdige schatting van de opname- en eliminatieparameters op 
basis van de gecombineerde opname- en eliminatiegegevens is „m” in 
vergelijking [11] een descriptor waarmee het computerprogramma de deeltermen van de vergelijking kan toewijzen aan de datasets van de desbetreffende fase en de vergelijking correct kan uitvoeren (m = 1 
voor opnamefase; m = 2 voor eliminatiefase).
 
Deze modelvergelijkingen moeten echter met voorzichtigheid worden gebruikt, in 
het bijzonder indien tijdens de test de biobeschikbaarheid van de teststof ver ­
andert of (biologische) afbraak optreedt (zie bv. (79)).  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Aanhangsel 3  
VOORBEELDEN VAN SCHEMA’S VOOR TESTS OP BIOACCUMULATIE 
IN DE BODEM  
Regenwormtest  
a) Opnamefase met 8 bemonsteringsdata die voor de berekening van de kine ­
tiek worden gebruikt  
Dag Activiteit  
– 6 Voorbereide grond gedurende 48 uur conditioneren. 
– 4 De grondfractie verrijken met de oplossing met de teststof; even ­
tueel oplosmiddel verdampen; grondbestanddelen vermengen; grond over de testvaten verdelen; equilibratie bij testomstandig ­
heden gedurende vier dagen (drie weken voor met metaal ver ­
rijkte grond). 
– 3 tot – 1 Testorganismen uit de cultuur nemen voor acclimatisering; 
grondbestanddelen bereiden en bevochtigen. 
0 Temperatuur en pH van de grond meten; grondmonsters uit test ­
vaten en oplosmiddelcontrolevaten nemen om de concentratie 
van de teststof te bepalen; voedingsrantsoen toevoegen; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voldoende deelmonsters van wormen achterhouden voor de bepaling van 
analytische achtergrondwaarden, nat- en drooggewicht en vetge ­
halte; alle testvaten wegen om het vochtgehalte in de grond te controleren; luchttoevoer regelen indien een gesloten testsysteem wordt gebruikt. 
1 Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, 
grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de test ­
stof te bepalen. 
2 Zelfde als dag 1. 
3 Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren. 4 Zelfde als dag 1. 
5-6 Zelfde als dag 3. 
7 Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van 
de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en ver ­
dampt water te compenseren. 
8-9 Zelfde als dag 3. 
10 Zelfde als dag 1. 
11-13 Zelfde als dag 3. 
14 Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van 
de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en ver ­
dampt water te compenseren. 
15-16 Zelfde als dag 3. 
17 Zelfde als dag 1. 
18-20 Zelfde als dag 3.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Dag Activiteit  
21 Zelfde als dag 1; temperatuur en pH van de grond meten; vocht ­
gehalte regelen door de testvaten opnieuw te wegen; opnamefase 
beëindigen; wormen van resterende blootgestelde duplo’s over ­
brengen naar vaten met schone grond voor de eliminatiefase (geen ontlasting van de darm); grond- en wormmonsters uit de oplosmiddelcontrolevaten nemen. 
Bij de planning van activiteiten die aan de blootstelling voor ­
afgaan (equilibratiefase), moet rekening worden gehouden met de eigenschappen van de teststof. 
De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden 
uitgevoerd (althans op werkdagen).
 
b) Eliminatiefase  
Dag Activiteit  
– 6 Grondbestanddelen bereiden en bevochtigen; bereide grond ge ­
durende 48 uur conditioneren. 
– 4 Grondbestanddelen mengen; grond over de testvaten verdelen; 
incubatie bij testomstandigheden gedurende vier dagen. 
0 (eind van de op ­
namefase) Temperatuur en pH van de grond meten; wormen wegen en 
gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voedingsrantsoen toe ­
voegen; wormen uit resterende blootgestelde duplo’s overbrengen naar vaten met schone grond; na 4-6 uur grond- en wormmon ­
sters nemen om de concentratie van de teststof te bepalen. 
1 Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, 
grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de test ­
stof te bepalen. 
2 Zelfde als dag 1. 3 Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren. 4 Zelfde als dag 1. 
5-6 Zelfde als dag 3. 
7 Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van 
de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en ver ­
dampt water te compenseren. 
8-9 Zelfde als dag 3. 
10 Zelfde als dag 1. 
11-13 Zelfde als dag 3. 
14 Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen toevoegen, vochtgehalte van 
de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen en ver ­
dampt water te compenseren. 
15-16 Zelfde als dag 3. 
17 Zelfde als dag 1.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Dag Activiteit  
18-20 Zelfde als dag 3. 
21 Zelfde als dag 1; temperatuur en pH van de grond meten, vocht ­
gehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te we ­
gen; grond- en wormmonsters uit oplosmiddelcontrolevaten ne ­
men. 
De grond wordt voor aanvang van de eliminatiefase op dezelfde 
manier voorbereid als voor de opnamefase. 
De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden 
uitgevoerd (althans op werkdagen).  
„Enchytraeidae”-test  
a) Opnamefase met 8 bemonsteringsdata die voor de berekening van de 
kinetiek worden gebruikt  
Dag Activiteit  
– 6 Voorbereide grond gedurende 48 uur conditioneren. 
– 4 De grondfractie verrijken met de oplossing met de teststof; even ­
tueel oplosmiddel verdampen; grondbestanddelen vermengen; 
grond over de testvaten verdelen; equilibratie bij testomstandig ­
heden gedurende vier dagen (drie weken voor met metaal ver ­
rijkte grond). 
– 3 tot – 1 Testorganismen uit de cultuur nemen voor acclimatisering; 
grondbestanddelen bereiden en bevochtigen. 
0 Temperatuur en pH van de grond meten; grondmonsters uit test ­
vaten en oplosmiddelcontrolevaten nemen om de concentratie 
van de teststof te bepalen; voedingsrantsoen aan de grond toe ­
voegen; wormen wegen en gerandomiseerd over de testvaten verdelen; voldoende deelmonsters van wormen achterhouden 
voor de bepaling van analytische achtergrondwaarden, nat- en 
drooggewicht en vetgehalte; alle testvaten wegen om het vocht ­
gehalte in de grond te controleren; luchttoevoer regelen indien een gesloten testsysteem wordt gebruikt. 
1 Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren, 
grond- en wormmonsters nemen om de concentratie van de test ­
stof te bepalen. 
2 Zelfde als dag 1. 
3 Luchttoevoer regelen, wormgedrag en temperatuur registreren. 
4 Zelfde als dag 1. 
5-6 Zelfde als dag 3. 
7 Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen, 
vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw 
te wegen en verdampt water te compenseren. 
9 Zelfde als dag 1. 
10 Zelfde als dag 3.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Dag Activiteit  
11 Zelfde als dag 1. 
12-13 Zelfde als dag 3. 
14 Zelfde als dag 1; voedingsrantsoen aan de grond toevoegen; 
temperatuur en pH van de grond meten; vochtgehalte van de grond regelen door de testvaten opnieuw te wegen; opnamefase beëindigen; wormen van resterende blootgestelde duplo’s over ­
brengen naar vaten met schone grond voor de eliminatiefase 
(geen ontlasting van de darm); grond- en wormmonsters uit de oplosmiddelcontrolevaten nemen. 
Bij de planning van activiteiten die aan de blootstelling voor ­
afgaan (equilibratiefase), moet rekening worden gehouden met 
de eigenschappen van de teststof. 
De voor dag 3 beschreven activiteiten moeten dagelijks worden 
uitgevoerd (althans op werkdagen).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Aanhangsel 4  
Kunstmatige grond — Aanbevelingen voor de voorbereiding en opslag  
Aangezien natuurlijke grond uit een bepaalde bron mogelijk niet het hele jaar 
beschikbaar is en inheemse organismen alsook de aanwezigheid van microver ­
ontreinigingen de test kunnen beïnvloeden, wordt de in hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen (48), beschreven kunstmatige grond aan ­
bevolen voor gebruik in deze test. In deze grond kunnen meerdere testsoorten 
overleven, groeien en zich voortplanten en er wordt gezorgd voor maximale 
standaardisatie en intra- en interlaboratoriumvergelijkbaarheid van test- en cul ­
tuuromstandigheden.
 
Grondbestanddelen: 
Turf: 10 % veenmosturf, overeenkomstig OESO-richtlijn 
207 (48); 
Kwartszand: 70 % industrieel kwartszand (luchtgedroogd); kor ­
relgrootte: meer dan 50 % van de deeltjes 
moet in het bereik 50-200 μm zijn, maar 
alle deeltjes moeten ≤ 2 mm zijn; 
Kaolienklei: 20 % met kaoliengehalte ≥ 30 %; 
Calciumcarbonaat: ≤ 1 % CaCO  3 , verpulverd, chemisch zuiver.  
Desgewenst kan het gehalte organische koolstof van de kunstmatige grond wor ­
den verlaagd, bv. door het turfgehalte te verminderen tot 4-5 % van de droge grond en de hoeveelheid zand dienovereenkomstig te verhogen. Door een der ­
gelijke verlaging van het gehalte organische koolstof kan de hechting van de 
teststof aan de grond (organische koolstof) afnemen en kan de beschikbaarheid van de teststof voor de wormen toenemen (74). Aangetoond is dat  Enchytraeus 
albidus  en Eisenia fetida  kunnen voldoen aan de geldigheidscriteria voor de 
voortplanting bij tests in veldgrond met een lager gehalte organische koolstof, 
bv. 2,7 % (33)(61), en de ervaring leert dat dit ook bereikt kan worden in kunstmatige grond met 5 % turf.
 
Voorbereiding  
De droge bestanddelen van de grond worden grondig gemengd (bv. in een grote 
laboratoriummenger). Dit moet ongeveer één week voor aanvang van de test worden gedaan. De gemengde droge grondbestanddelen moeten ten minste 48 
uur voordat de teststof wordt aangebracht, worden bevochtigd met gedeïoniseerd 
water om de zuurgraad te equilibreren/stabiliseren. Voor de bepaling van de pH moet een mengsel van grond en een oplossing van 1 M KCl in een verhouding van 1:5 worden gebruikt. Indien de pH-waarde niet binnen het vereiste bereik 
(6,0 ± 0,5) valt, wordt een voldoende hoeveelheid CaCO
 3 aan de grond toege ­
voegd of wordt een nieuwe partij grond voorbereid.  
Het maximale waterhoudende vermogen (WHC) van de kunstmatige grond wordt 
bepaald overeenkomstig ISO 11268-2 (35). Minimaal twee dagen voor aanvang 
van de test wordt de droge kunstmatige grond bevochtigd door genoeg gedeï ­
oniseerd of synthetisch water toe te voegen om ongeveer de helft van het uit ­
eindelijke watergehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke watergehalte moet tussen 
40 % en 60 % van het maximale waterhoudende vermogen (WHC) liggen. Bij 
aanvang van de test wordt de voorbevochtigde grond verdeeld in zoveel porties als het aantal testconcentraties en controles die voor de test gebruikt worden en wordt het vochtgehalte aangepast tot 40-60 % van WHC
 max door de oplossing 
van de teststof te gebruiken en/of gedeïoniseerd of synthetisch water toe te 
voegen. Het vochtgehalte wordt aan het begin en aan het eind van de test (bij 105 °C) bepaald. Het moet optimaal zijn voor de behoeften van de diersoort (het vochtgehalte kan ook als volgt worden gecontroleerd: wanneer men de grond 
lichtjes in de hand knijpt, moeten kleine druppels water tussen de vingers ver ­
schijnen).
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Opslag  
De droge bestanddelen van de kunstmatige grond kunnen tot gebruik bij kamer ­
temperatuur worden bewaard. De voorbereide, voorbevochtigde grond kan voor ­
afgaand aan de verrijking maximaal drie dagen op een koele plaats worden bewaard; hierbij moet de verdamping van water tot een minimum worden be ­
perkt. Grond die met de teststof verrijkt is, moet onverwijld worden gebruikt, 
tenzij informatie beschikbaar is die erop duidt dat de grond in kwestie bewaard 
kan worden zonder dat dit van invloed is op de toxiciteit en biobeschikbaarheid van de teststof. Monsters van verrijkte grond kunnen vervolgens tot de analyse onder de voor de desbetreffende teststof aanbevolen omstandigheden worden 
bewaard.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Aanhangsel 5  
Aanbevolen soorten terrestrische  Oligochaetae  voor tests op bioaccumulatie 
in de bodem  
Regenwormen  
De aanbevolen testsoort is  Eisenia fetida  (Savigny 1826), die behoort tot de 
familie „Lumbricidae”. Deze soort wordt sinds 1972 onderverdeeld in twee on ­
dersoorten ( Eisenia fetida  and Eisenia andrei  (10)). Volgens Jaenicke (36) gaat 
het om twee echte, afzonderlijke soorten.  Eisenia fetida  is gemakkelijk herken ­
baar dankzij zijn felgele strepen tussen de segmenten, terwijl  Eisenia andrei  een 
egale, donkerrode kleur heeft. Oorspronkelijk zijn ze waarschijnlijk afkomstig uit het gebied rond de Zwarte Zee, maar tegenwoordig zijn ze wereldwijd verspreid, 
in het bijzonder in door de mens aangepaste habitats zoals composthopen. Beide 
soorten kunnen voor zowel ecotoxicologische als bioaccumulatietests worden gebruikt.
 
Eisenia fetida  en Eisenia andrei  zijn in de handel verkrijgbaar, bv. als visaas. In 
vergelijking met andere lumbricidenregenwormen hebben ze een korte levens ­
cyclus en bereiken ze volwassenheid binnen ca. twee-drie maanden (bij kamer ­
temperatuur). Hun optimale temperatuur is ongeveer 20-24 °C. Ze geven de voorkeur aan relatief vochtige substraten met een nagenoeg neutrale pH en een 
hoog gehalte aan organisch materiaal. Aangezien deze soorten al 25 jaar veel ­
vuldig worden gebruikt in gestandaardiseerde ecotoxicologische tests, zijn hun kweekmethoden uitvoerig beschreven (48)(77).
 
Beide soorten kunnen worden gekweekt in een grote diversiteit aan dierlijke 
afvalstoffen. Het door de ISO (35) aanbevolen kweekmedium is een 50:50-meng ­
sel van paarden- of rundermest en turf. Het medium moet een pH-waarde van ongeveer 6 tot 7 hebben (gereguleerd met calciumcarbonaat), een lage ionische geleidbaarheid (minder dan 6 mS/cm of minder dan 0,5 % zoutconcentratie) en 
mag niet overmatig verontreinigd zijn met ammonia of dierlijke urine. Tevens 
kan in de handel verkrijgbare tuinaarde die vrij is van additieven of kunstmatige grond overeenkomstig OESO (48) of een mengsel van beide in een verhouding van 50:50 worden gebruikt. Het substraat dient vochtig maar niet te nat te zijn. 
Kweekbakken met een volume van 10 tot 50 liter zijn geschikt.
 
Om wormen met een standaardleeftijd en -massa te verkrijgen kan de kweek het 
beste worden begonnen met cocons. Daartoe worden volwassen wormen in een kweekbak met vers substraat gestopt om cocons te produceren. De praktijk wijst 
uit dat een populatiedichtheid van ongeveer 100 volwassen wormen per kg sub ­
straat (natgewicht) tot goede voortplantingssnelheden leidt. Na 28 dagen worden de volwassen wormen verwijderd. De uit de cocons gekomen regenwormen worden na minimaal twee maanden, maar minder dan twaalf maanden, wanneer 
ze volwassen zijn, voor de tests gebruikt.
 
Wormen van de hierboven beschreven soorten kunnen als gezond worden be ­
schouwd als ze zich door het substraat voortbewegen, niet proberen om het substraat te verlaten en zich voortdurend voortplanten. Zeer traag voortbewegen 
of een geel uiteinde aan de achterkant van de worm (in het geval van  Eisenia 
fetida ) duidt op uitputting van het substraat. In dat geval wordt vers substraat 
en/of een kleiner aantal dieren per bak aanbevolen.
 
Selectie van aanvullende literatuur  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S.  
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, 
London. 331-338 pp.  
„Enchytraeidae”  
De aanbevolen testsoort is  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (witte potworm).  
Enchytraeus albidus  is een van de grootste soorten (tot 15 mm) van de tot de 
gelede wormen behorende  Oligochaetae -familie van de „Enchytraeidae” en is 
wereldwijd verspreid, bv. (8).  Enchytraeus albidus  wordt aangetroffen in marie ­
ne, limnische en terrestrische habitats, hoofdzakelijk in ontbindend organisch 
materiaal (zeewier, compost) en zelden in weiden (42). Deze brede ecologische 
tolerantie en een aantal morfologische variaties duiden erop dat er mogelijk verschillende rassen voor deze soort bestaan.
 
Enchytraeus albidus  is in de handel verkrijgbaar als voeding voor vissen. Ge ­
controleerd dient te worden of de cultuur verontreinigd is door andere, gewoon ­
lijk kleinere soorten (60). Indien verontreiniging optreedt, moeten alle wormen met water worden gewassen in een petrischaal. Grote volwassen exemplaren van  
Enchytraeus albidus  worden vervolgens geselecteerd (met behulp van een ste ­
reomicroscoop) om een nieuwe cultuur te beginnen. Alle andere wormen worden verwijderd. De levenscyclus van de worm is kort, aangezien volwassenheid wordt bereikt tussen 33 dagen (bij 18 °C) en 74 dagen (bij 12 °C). Enkel cul ­
turen die zonder problemen gedurende ten minste vijf weken (één generatie) in 
het laboratorium zijn gehouden, mogen voor een test worden gebruikt.
 
Andere soorten van het geslacht  Enchytraeus  zijn ook geschikt, in het bijzonder  
Enchytraeus luxuriosus . Deze soort is een echte bodembewoner, zoals recentelijk 
is beschreven in (65). Indien andere soorten van het geslacht  Enchytraeus  worden 
gebruikt, moeten ze duidelijk worden geïdentificeerd en moet de motivering van 
de keuze van de soort worden gerapporteerd.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) is een soort die tot dezelfde 
groep behoort als  Enchytraeus luxuriosus . Het staat niet vast dat deze soort in het 
veld voorkomt, aangezien de soort alleen in regenwormculturen en composthopen 
is beschreven (Römbke 2003). De oorspronkelijk ecologische behoeften van de soort zijn derhalve onbekend. Recent laboratoriumonderzoek met diverse veld ­
substraten heeft echter bevestigd dat deze soort een ruime tolerantie heeft voor 
grondeigenschappen als pH en textuur (Jänsch  et al.  2005). In de afgelopen jaren 
is deze soort vaak gebruikt in ecotoxicologische studies vanwege de eenvoud van kweken en testen, bv. Kuperman  et al.  2003. De soort is echter klein (3-12 mm; 
gemiddeld 7 mm (Westheide & Müller 1996)) en dit maakt de hantering moei ­
lijker in vergelijking met  Enchytraeus albidus . Bij gebruik van deze soort in 
plaats van  Enchytraeus albidus  kan de omvang van het testvat kleiner zijn, 
maar dat hoeft niet. Daarnaast moet in overweging worden genomen dat deze 
soort zich zeer snel voortplant met een generatietijd van minder dan 20 dagen bij 
20 ± 2 °C (Achazi  et al.  1999) en zelfs sneller bij hogere temperaturen.
 
„Enchytraeidae” van de soort  Enchytraeus albidus  (alsmede andere  Enchytraeus-  
soorten) kunnen worden gekweekt in grote plastic bakken (bv. 30 × 60 × 10 cm 
of voor een cultuur van kleine wormen 20 × 12 × 8 cm) die gevuld zijn met een mengsel van kunstmatige grond en in de handel verkrijgbare, niet verontreinigde tuinaarde zonder additieven. Compostmateriaal moet worden vermeden, aange ­
zien dat toxische stoffen zoals zware metalen zou kunnen bevatten. Voordat de 
kweekgrond wordt gebruikt, moet fauna eruit worden verwijderd door driemaal diepvriezen. Zuiver kunstmatige grond kan ook worden gebruikt, maar de voort ­
plantingssnelheid zou langzamer kunnen zijn in vergelijking met gemengde sub ­
straten. Het substraat moet een pH van 6,0 ± 0,5 hebben. De cultuur wordt bij 
een temperatuur van 15 °C ± 2 °C bewaard in een kweekbak zonder licht. In ieder geval moet een hogere temperatuur dan 23 °C worden vermeden. De kunst ­
matige/natuurlijke grond moet vochtig zijn, maar niet nat. Wanneer zachtjes met 
de hand in de grond wordt geknepen, zouden slechts kleine waterdruppels moe ­
ten verschijnen. In ieder geval moeten anoxische omstandigheden worden ver ­
meden (als bijvoorbeeld een deksel wordt gebruikt, moet het aantal gaten in het deksel groot genoeg zijn om voldoende luchtverversing te waarborgen). De 
kweekgrond moet worden belucht door de grond eenmaal per week zorgvuldig 
te mengen.
 ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
De wormen moeten minimaal eenmaal per week ad libitum worden gevoederd 
met havervlokken die in een holte in het grondoppervlak worden geplaatst en met 
grond worden bedekt. Indien voedsel van het laatste voedertijdstip in de bak achterblijft, moet de hoeveelheid voedsel dienovereenkomstig worden aangepast. Als er schimmels op het achtergebleven voedsel groeien, moet het worden ver ­
vangen door een nieuwe hoeveelheid havervlokken. Om de voortplanting te 
stimuleren kunnen de havervlokken om de twee weken worden verrijkt met in de handel verkrijgbaar proteïnepoeder met toegevoegde vitaminen. Na drie maan ­
den worden de dieren overgebracht naar een vers voorbereide cultuur of kweek ­
substraat. De havervlokken, die in een afgesloten verpakking moeten worden 
bewaard, moeten voor gebruik in een autoclaaf worden gesteriliseerd of verhit om infecties door meelmijten (bv.  Glycyphagus  sp., Astigmata , Acarina ) of roof­
mijten (bv.  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida , Acarina ) te voorkomen. 
Na desinfectie wordt het voedsel vermalen, zodat het gemakkelijk op het grond ­
oppervlak kan worden verspreid. Andere mogelijke voedingsbronnen zijn bak ­
kersgist of het visvoer TetraMin
 ® . 
In het algemeen zijn de cultuuromstandigheden toereikend als de wormen niet 
proberen het substraat te verlaten, zich snel door de grond voortbewegen, een 
glanzend buitenoppervlak hebben waaraan geen gronddeeltjes kleven en een min 
of meer wittige kleur hebben en als wormen van verschillende leeftijden zicht ­
baar zijn. In feite kunnen wormen als gezond worden beschouwd als ze zich voortdurend voortplanten.
 
Selectie van aanvullende literatuur  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological re ­
quirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Re ­
views 13: 51-83.  
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.  
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of en ­
chytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — NL — 24.08.2014 — 005.001 — 1467