1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
veevoeders
(72/199/EEG)
(PB L 123 van 29.5.1972, blz. 6)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Richtlijn 81/680/EEG van de Commissie van 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie van 20 december 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Richtlijn 93/28/EEG van de Commissie van 4 juni 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Richtlijn 98/54/EG van de Commissie van 16 juli 1998 L 208 49 24.7.1998
►M5Richtlijn 1999/79/EG van de Commissie van 27 juli 1999 L 209 23 7.8.1999
Gerectificeerd bij:
►C1Rectificatie PB L 320 van 27.11.1980, blz. 43 (72/199/EEG)
▼B
DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analyseme-
thoden voor de officiële controle van veevoeders
(72/199/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden
voor de officiële controle van veevoeders(1), inzonderheid op artikel 2,
Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële
controle van veevoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de op
grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van veevoeders gestelde eisen is voldaan,geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende dat bij richtlijnen nr. 71/250/EEG en nr. 71/393/EEG van
de Commissie van 15 juni 1971 (
2) onderscheidenlijk 18 november
1971 (3) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden
isvas tgelegd; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamhedensindsdien hebben gemaakt het nuttig is een derde serie methoden uit
te vaardigen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor
veevoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoedersten aanzien van hun gehalte aan zetmeel, ruw eiwit,ruw eiwit oplosbaar in pepsine en zoutzuur, en aan vrij en totaal
gossypol, alsmede ten aanzien van de pepsineactiviteit, geschieden
volgensde in de bijlage I bij deze richtlijn oms chreven methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders ►M4 ◄zowel alsten aanzien van het
gehalte in veevoedersaan ►M4 ◄tylosine en virginia-
mycine geschieden volgens de in bijlage II bij deze richtlijn
omschreven methoden.
Artikel 3
De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 juli 1973 de noodzakelijke wettelijke
of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om zich te voegennaar deze richtlijn. Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan inkennis.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(3) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Deze richtlijn isgericht tot de Lid-Staten.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 3
▼B
BIJLAGE I
1.BEPALING VAN ZETMEEL
POLARIMETRISCHE METHODE
1.Doel en toepassingsgebied
Deze methode betreft de bepaling van het gehalte aan zetmeel en afbraakpro-
ducten van zetmeel met een hoog molecuulgewicht in veevoedersin het
kader van de controle op de naleving van Richtlijn 86/174/EEG en Richtlijn
96/25/EG.
2.Principe
De bepaling bestaat uit twee delen. Het eerste deel omvat de behandeling van
het warme monster met verdund zoutzuur. Na klaren en filtreren wordt de
optische draaiing van de oplossing polarimetrisch gemeten.
Het tweede deel omvat de extractie van het monster met 40 % ethanol. Na
aanzuren van het filtraat met zoutzuur, klaren en filtreren wordt de optische
draaiing gemeten zoalsbij het eers te deel.
Het verschil tussen de twee metingen, vermenigvuldigd met een bekende
factor, geeft het zetmeelgehalte van het monster.
3.Reagentia
3.1. Zoutzuur, 25 % (g/g), d = 1,126.
3.2. Zoutzuur, 1,128 % (g/v).
De sterkte moet worden gecontroleerd door titratie met 0,1 N natronloog
in aanwezigheid van 0,1 % (g/v) methylrood in 94 % (v/v) ethanol.
10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 N.
3.3. Carrez-oplossing I: los 21,9 g zinkacetaat Zn CH 3COO ðÞ2:2H2Oe n3g
ijsazijn op in water. Vul aan met water tot 100 ml.
3.4. Carrez-oplossing II: los 10,6 g tetrakaliumhexacyanoferraat
K4Fe CNðÞ6:3H2O op in water. Vul aan met water tot 100 ml.
3.5. Ethanol, 40 % (v/v), d = 0,948 bij 20 ºC.
4.Apparatuur
4.1. Erlenmeyer van 250 ml met normaalslijpstuk en refluxkoeler.4.2. Polarimeter of sacharimeter.
5.Uitvoering
5.1.Bereiding van het monster
Maal het monster zo fijn dat het door een zeef met ronde mazen van
0,5 mm diameter gaat.
5.2.Bepaling van de totale optische draaiing (P of S) (zie opmerking 7.1)
Weeg 2,5 g van het gemalen monster tot op 1 mg nauwkeurig af in een
maatkolf van 100 ml. Voeg 25 ml zoutzuur (3.2) toe, schud de kolf
totdat het proefmonster goed gesuspendeerd is en voeg nogmaals 25 ml
zoutzuur (3.2) toe. Plaatsde kolf in een kokendwaterbad en s chud gedu-
rende de eerste drie minuten krachtig en regelmatig om klontvorming te
voorkomen. De hoeveelheid water in het bad moet groot genoeg zijn om
aan de kook te blijven wanneer de kolf erin wordt geplaatst. De kolf
mag tijdenshet s chudden niet uit het water worden gehaald. Neem na
precies15 minuten de kolf uit het bad, voeg 30 ml koud water toe en
laat onmiddellijk afkoelen tot 20 ºC.
Voeg 5 ml Carrez-oplossing I (3.3) toe en schud gedurende één minuut.
Voeg vervolgens 5 ml Carrez-oplosing II (3.4) toe en schud nogmaals
gedurende één minuut. Vul aan met water tot de streep, meng en filtreer.
Alshet filtraat niet volledig helder is(wat zelden voorkomt), herhaal
dan de bepaling met grotere hoeveelheden Carrez-oplossingen I en II,
bijvoorbeeld 10 ml.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 4
▼M5
▼M5
Meet vervolgens de optische draaiing van de oplossing in een buis van
200 mm met behulp van de polarimeter of de sacharimeter.
5.3.Bepaling van de optische draaiing (P' of S') van de in 40 % ethanol
oplosbare stoffen
Weeg 5 g van het monster tot op 1 mg nauwkeurig af in een maatkolf
van 100 ml. Voeg ca. 80 ml ethanol (3.5) toe (zie opmerking 7.2). Laat
de kolf gedurende één uur staan bij kamertemperatuur; schud de oplos-
sing gedurende die tijd zes maal krachtig, zodat het proefmonster goed
met de ethanol wordt vermengd. Vul vervolgensaan met ethanol (3.5)
tot de streep, meng en filtreer. Pipetteer 50 ml van het filtraat (= 2,5 g
monster) in een erlenmeyer van 250 ml, voeg 2,1 ml zoutzuur (3.1 ) toe
en schud krachtig. Verbind de erlenmeyer met een refluxkoeler en plaats
hem in een kokendwaterbad. Neem na precies15 minuten de erlenmeyer
uit het bad, breng de inhoud ervan over in een maatkolf van 100 ml,
spoel met een kleine hoeveelheid koud water en laat afkoelen tot 20 ºC.
Klaar vervolgens met de Carrez-oplossingen I (3.3) en II (3.4), vul aan
met water tot de streep, meng, filtreer en meet de optische draaiing als
aangegeven onder 5.2, tweede en derde alinea.
6.Berekening van de resultaten
Het zetmeelgehalte van het monster (in %) wordt als volgt berekend:
6.1.Metingen met de polarimeter
Zetmeelgehalte ð%Þ¼2000 P - P0ðÞ
α½/C13820º
D
waarin:
P = totale optische draaiing in booggraden
P′= optische draaiing in booggraden van de in 40 % ethanol oplos-
bare stoffen
α½/C13820º
D= specifieke optische draaiing van zuiver zetmeel. De waarden
die meestal voor deze factor worden gebruikt zijn:
+ 185,9 º: rijstzetmeel
+ 185,4 º: aardappelzetmeel
+ 184,6 º: maïszetmeel
+ 182,7 º: tarwezetmeel
+ 181,5 º: gerstzetmeel
+ 181,3 º: haverzetmeel
+ 184,0 º: andere zetmeelsoorten en zetmeelmengsels in
mengvoeders.
6.2.Metingen m.b.v. sacharimeter
Zetmeelgehalte ð%Þ¼2000
α½/C13820º
D/C22N/C20;665 ðÞ /C2 S-S0ðÞ
100-26;6N/C2S-S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = totale optische draaiing in sacharimetrische graden
S′= optische draaiing in saccharimetrische graden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen
N = gewicht in g van de hoeveelheid sacharose die in 100 ml
water bij meting m.b.v. een buisvan 200 mm een optis che
draaiing van 100 sacharimetrische graden geeft.
Dit gewicht varieert naargelang van het type sacharimeter:
16,29 g voor Franse sacharimeters
26,00 g voor Duitse sacharimeters
20,00 g voor gemengde sacharimeters.
α½/C13820º
D= specifieke optische draaiing van zuiver zetmeel (zie 6.1).
6.3.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling van hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan: 0,4 absoluut bij zetmeelgehalten
van minder dan 40 %, en 1,1 % relatief bij zetmeelgehalten van 40 %
of meer.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 5
▼M5
7.Opmerkingen
7.1. Alshet mons ter meer dan 6 % carbonaten bevat, berekend alscalcium-
carbonaat, moeten deze voor de bepaling van de totale optische draaiing
worden ontleed door een behandeling met preciesde daarvoor beno-
digde hoeveelheid verdund zwavelzuur.
7.2. Producten met een hoog gehalte aan lactose, zoals weipoeder, magere-
melkpoeder enz., worden, na het toevoegen van de 80 ml ethanol (3.5)
alsvolgt behandeld: Verbind de erlenmeyer met een refluxkoeler en
plaatshem gedurende 30 minuten in een waterbad van 50 ºC. Laat
vervolgensafkoelen en handel verder alsbes chreven onder 5.3.
7.3. Voor de hierna vermelde voedermiddelen isbekend dat zij, alsze in
aanzienlijke hoeveelheden in veevoedersvoorkomen, interferenties
kunnen veroorzaken bij bepaling van het zetmeelgehalte via de polari-
metrische methode, zodat foutieve gegevens zouden kunnen worden
verkregen:
— producten van (suiker)bieten, zoals (suiker)bietenpulp, (suiker)bie-
tenmelasse, (suiker)bietenpulp-gemelasseerd, (suiker)bietvinasse,
(biet)suiker;
— citruspulp;— lijnzaad; lijnzaadschilfers; lijnzaadschroot;— kool- en raapzaad; kool- en raapzaadschilfers; kool- en raapzaad-
schroot; kool- en raapzaadschillen;
— zonnebloemzaad; zonnebloemzaadschroot; zonnebloemzaadschroot
van gedeeltelijk ontdopt zaad;
— kokosschilfers; kokosschroot;— aardappelvezels;— gedroogde gist;— producten met een hoog gehalte aan inuline (bijv. topinamboerchips
en -meel);
— vetkanen.
2.BEPALING VAN RUW EIWIT
1.Doel en toepassingsgebied
Met deze methode ishet mogelijk het gehalte aan ruw eiwit in diervoederste
bepalen op basis van het stikstofgehalte, bepaald volgens de Kjeldahlme-
thode.
2.Principe
Het monster wordt ontsloten met zwavelzuur in aanwezigheid van een kata-
lysator. De zure oplossing wordt met een oplossing van natriumhydroxide
basisch gemaakt. De ammoniak wordt afgedestilleerd en opgevangen in een
bekende hoeveelheid zwavelzuur, waarvan de overmaat met een standaardop-
lossing natriumhydroxide wordt teruggetitreerd.
3.Reagentia
3.1 Kaliumsulfaat.
3.2 Katalysator: koper(II)oxide (CuO) of koper(II)sulfaatpentahydraat
(CuSO
4·5H2O).
3.3 Zinkkorrels.3.4 Zwavelzuur ρ20= 1,84 g/ml.
3.5 Zwavelzuur c(½ H
2SO4) = 0,5 mol/l.
3.6 Zwavelzuur c(½ H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.7 Methylrood-indicator: 300 mg methylrood oplossen in 100 ml ethanol,
σ= 95-96 % (v/v).
3.8 Natriumhydroxide-oplossing (technische kwaliteit is voldoende), β
= 40 g/100 ml (m/v: 40 %).
3.9 Natriumhydroxide-oplossing, c = 0,25 mol/l.
3.10 Natriumhydroxide-oplossing, c = 0,1 mol/l.3.11 Puimsteenkorrels, met zoutzuur gewassen en gegloeid.3.12 Acetanilide (sm.p. = 114 ºC; N = 10,36 %).1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 6
▼M3
▼M3
3.13 Saccharose (vrij van stikstof).
4.Apparatuur
Apparatuur, geschikt voor het uitvoeren van ontsluiting, destillatie en titratie
volgensKjeldahl.
5.Werkwijze
5.1Ontsluiting
Weeg af van het monster 1 g op 0,001 g nauwkeurig en breng dit in de
recipiënt van de ontsluitingsapparatuur. Voeg hieraan toe 15 g kaliumsul-
faat (3.1), een geschikte hoeveelheid katalysator (3.2) (0,3 tot 0,4 g
koper(II)oxide of 0,9 tot 1,2 g koper(II)sulfaatpentahydraat), 25 ml
zwavelzuur (3.4) en een paar puimsteenkorrels (3.11); meng het geheel.
Verwarm de recipiënt eerst zacht onder af en toe zwenken, indien nodig,
totdat de massa is verkoold en het schuim is verdwenen; verhit vervol-
genskrachtiger totdat de vloeis tof regelmatig kookt. De verwarming is
voldoende wanneer het kokende zuur tegen de wand van de recipiënt
condenseert. Zorg ervoor dat de wand niet oververhit raakt en dat er
geen organische stof aan gaat vastzitten. Kook nog twee uur nadat de
oplossing helder en lichtgroen geworden is; laat afkoelen.
5.2Destillatie
Voeg genoeg water toe om de sulfaten volledig op te lossen. Laat
afkoelen; voeg enkele zinkkorrels(3.3) toe.
Breng in de opvangkolf van de destillatieapparatuur een nauwkeurig
afgemeten hoeveelheid van 25 ml zwavelzuur (3.5 of 3.6), afhankelijk
van het verwachte stikstofgehalte. Voeg enkele druppels methylrood
(3.7) toe.
Verbind de ontsluitingsrecipiënt met de koeler van het destillatieapparaat
en zorg ervoor dat het uiteinde van de koelbuiszich ten mins te 1 cm
onder het vloeistofoppervlak in de opvangkolf bevindt (zie opmerking
8.3). Giet langzaam 100 ml natriumhydroxideoplossing (3.8) in de
ontsluitingsrecipiënt, zonder ammoniakverlies (zie opmerking 8.1).
Vermarm de recipiënt totdat alle ammoniak overgedestilleerd is.
5.3Titratie
Titreer de overmaat zwavelzuur in de opvangkolf terug met natriumhy-
droxide-oplossing (3.9 of 3.10) afhankelijk van de concentratie van het
gebruikte zwavelzuur, totdat het eindpunt isbereikt.
5.4Blancoproef
Voer een blancoproef (ontsluiting, destillatie en titratie) uit met 1 g
saccharose (3.13) in plaats van het monster.
6.Berekening van de resultaten
Bereken het gehalte aan ruw eiwit met behulp van de volgende formule:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
waarin:
V0= volume (in ml) NaOH (3.9 of 3.10) verbruikt in de blancoproef
V1= volume (in ml) NaOH (3.9 of 3.10) verbruikt bij de titratie van het
monster
c = concentratie (mol/l) natriumhydroxide (3.9 of 3.10)
m = massa (in g) van het monster.
7.Validatie van de methode
7.1Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee parallelle, op hetzelfde
monster verrichte bepalingen mag niet meer bedragen dan:
— 0,2 % absoluut voor ruw-eiwitgehalten van minder dan 20 %;1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 7
▼M3
— 1,0 % relatief ten opzichte van de hoogste waarde voor ruweiwitge-
halten van 20 % tot 40 %;
— 0,4 % absoluut voor ruw-eiwitgehalten van meer dan 40 %.
7.2Nauwkeurigheid
Voer de bepaling (ontsluiting, destillatie en titratie) uit op 1,5 tot 2,0 g
acetanilide (3.12) in aanwezigheid van 1 g saccharose (3.13); 1 g aceta-
nilide verbruikt 14,80 ml zwavelzuur (3.5).
Er moet ten minste 99 % teruggevonden worden.
8.Opmerkingen
8.1 De apparatuur kan tot het manuele, halfautomatische of automatische
type behoren. Indien de ontsluitingsvloeistof tussen ontsluiting en destil-
latie overgebracht moet worden, mag er geen verliesoptreden. Indien de
recipiënt van de destillatieapparatuur niet voorzien is van een druppel-
trechter, moet de natriumhydroxide-oplossing langzaam langs de wand
toegevoegd worden, onmiddellijk voordat de recipiënt met de koeler
wordt verbonden.
8.2 Herhaal de bepaling met een grotere hoeveelheid zwavelzuur (3.4) dan
hoger vermeld, wanneer het materiaal tijdens het ontsluiten vast wordt.
8.3 Bij monsters met een laag stikstofgehalte kan het volume zwavelzuur
(3.6) dat in de opvangkolf wordt gebracht zo nodig worden verminderd
tot 10 of 15 ml en met water tot 25 ml worden aangevuld.
3.BEPALING VAN RUW EIWIT, OPLOSBAAR IN PEPSINE EN ZOUT-
ZUUR
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
ruw eiwit, oplosbaar in pepsine en zoutzuur onder vastgestelde omstandig-
heden. Deze methode is toepasselijk voor alle veevoerders.
2.Beginsel
Het monster wordt gedurende 48 h bij 40 ºC behandeld met een oplossing
van pepsine in zoutzuur. De suspensie wordt gefiltreerd en het gehalte aan
stikstof van het filtraat wordt bepaald volgens de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur d = 1,125.
3.2 Zoutzuur 0,075 N.
3.3 Pepsine 2,0 E/mg. Deze activiteit is gedefinieerd in de methode van deel
4 van deze bijlage en dient volgensdeze methode gecontroleerd te
worden.
3.4 Pepsine-oplossing, ca. 0,2 g/l in zoutzuur (3.2), vers bereid, activiteit
400 E/l.
3.5 Antischuimemulsie (bijvoorbeeld siliconen).
3.6 Alle reagentia genoemd onder punt 3 van de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad of broedstoof, ingesteld op 40 ºC ± 1 ºC.4.2 Destructie- en destillatieapparatuur volgens Kjeldahl.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.2)
Weeg af 2 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng dit in
een maatkolf van 500 ml. Voeg hieraan toe 450 ml pepsine-oplossing
(3.4), die van te voren op 40 ºC isgebracht.
Schud de inhoud opdat klontvorming vermeden wordt. Controleer of de
pH van de suspensie minder bedraagt dan 1,7. Breng de kolf in het1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 8
▼B
▼B
waterbad of de broedstoof (4.1) en laat gedurende 48 h staan. Zwenk de
inhoud om na 8, 24 en 32 h. Voeg na 48 h toe 15 ml zoutzuur (3.1), laat
afkoelen tot 20 ºC, vul aan met water tot de streep, meng en filtreer.
5.2Destructie
Breng 250 ml van het filtraat over in de kolf van het destructieapparaat
(4.2). Voeg toe de voor de destructie benodigde reagentia zoals is aange-
geven in de methode voor de bepaling van ruw eiwit onder punt 5.1,
tweede zin.
Meng de inhoud van de kolf en verhit tot koken. Voeg bij schuimvor-
ming enkele druppels antischuimemulsie (3.5) toe. Laat flink doorkoken
tot het water bijna volledig verdampt is. Verwijder vervolgens voor-
zichtig de laatste resten water door minder intensief te verhitten. Laat
nog gedurende 1 h doorkoken nadat de oplossing helder en kleurloos is
geworden (of lichtgroen bij aanwezigheid van een koperkatalysator).
Laat vervolgensafkoelen.
5.3Destillatie en titratie
Handel zoalsbes chreven in de punten 5.2 en 5.3 van de methode voor de
bepaling van ruw eiwit.
5.4Blancobepaling
Verricht een blancobepaling onder toepassing van de beschreven werk-
wijze, echter zonder analysemateriaal.
6.Berekening van de resultaten
Verminder het volume aan zwavelzuur, verbruikt bij de analyse van het
monster, met het volume aan zwavelzuur, verbruikt bij de analyse van de
blanco. 1 ml zwavelzuur 0,1 N komt overeen met 1,4 mg stikstof.
Vermenigvuldig de verkregen hoeveelheid stikstof met de factor 6,25. Druk
het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan
— 0,4 % absoluut bij gehalten van minder dan 20 %;
— 2 % relatief bij gehalten van 20 tot 40 %;— 0,8 % absoluut bij gehalten van meer dan 40 %.
7.Opmerkingen
7.1 De verkregen waarden staan niet in direct verband met de verteerbaar-
heidin vivo.
7.2 Produkten met een vetgehalte van meer dan 10 % moeten eerst worden
ontvet door extractie met petroleumether (kp. 40—60 ºC).
4.BEPALING VAN DE PEPSINE-ACTIVITEIT
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de controle van de activiteit van
de pepsine, die wordt gebruikt voor de bepaling van ruw eiwit, oplosbaar in
pepsine en zoutzuur.
2.Beginsel
Hemoglobine wordt onder vastgestelde omstandigheden behandeld met
pepsine en verdund zoutzuur. Het niet gehydrolyseerde gedeelte van de
eiwitten wordt met trichloorazijnzuur geprecipiteerd. Aan het filtraat wordt
natronloog en het reagensvolgensFolin-Ciocalteu toegevoegd. De extinctie
van deze oplossing wordt gemeten bij 750 nm en de hiermee corresponde-
rende hoeveelheid tyrosine wordt afgelezen van een ijkgrafiek.
Definitie: De pepsine-eenheid (E) wordt gedefinieerd als die hoeveelheid
enzym, die onder de omstandigheden van de methode zoveel hydroxyarylver-
bindingen vrijmaakt, dat na kleuring met het Folin-Ciocalteu-reagenseen
extinctie verkregen wordt, die overeenkomt met die van 1 µmol tyrosine
onder dezelfde omstandigheden.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 9
▼B
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 0,2 N.
3.2 Zoutzuur 0,06 N.
3.3 Zoutzuur 0,025 N.
3.4 Trichloorazijnzuuroplossing 50 g/l.3.5 Natronloog 0,5 N.
3.6 ReagensvolgensFolin-Ciocalteu: breng 100 g natriumwolframaat,
Na
2WO4.2 H2O, 25 g natriummolybdaat, Na2MoO4.2 H2O en 700 ml
water in een rondbodemkolf van 2 l met ingeslepen stop. Voeg toe
50 ml fosforzuur (d = 1,71) en 100 ml geconcentreerd zoutzuur (d
= 1,19). Verbind de kolf met een terugvloeikoeler, verhit de oplossing
tot koken en houd deze gedurende 10 h zachtjesaan de kook. Laat
afkoelen, verwijder de terugvloeikoeler en voeg toe 175 g lithiumsulfaat,
Li2SO4.2 H2O,50 ml water en 1 ml broom. Laat gedurende 15 minuten
koken, om de overmaat broom te verwijderen.
Laat afkoelen, breng de oplossing over in een maatkolf van 1 l, vul aan
met water tot de streep, meng en filtreer. De oplossing mag geen groene
kleur vertonen. Verdun vóór gebruik 1 volumedeel reagensmet 2
volumedelen water.
3.7 Hemoglobine-oplossing: weeg af een hoeveelheid (ca. 2 g) hemoglobine,
protease-substraat volgens Anson, die overeenkomt met 354 mg stik-
stof (1) en breng deze in een kolf van 200 ml met ingeslepen stop. Voeg
enkele ml zoutzuur (3.2) toe, sluit de kolf aan op de vacuumpomp en
schud tot de hemoglobine volledig opgelost is. Hef het vacuum op en
voeg onder omzwenken zoveel zoutzuur (3.2) toe alsnodig isom de
hoeveelheid zoutzuur aan te vullen tot 100 ml. Vóór gebruik vers
bereiden.
3.8 Standaardtyrosine-oplossing: los op 181,2 mg tyrosine in zoutzuur (3.1)
en vul aan met hetzelfde zuur tot 1 l (stamoplossing). Verdun 20,0 ml
van deze oplossing met zoutzuur (3.1) tot 100 ml. 1 ml van deze oplos-
sing bevat 0,2 µmol tyrosine.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad met ultrathermostaat, ingesteld op 25 ºC ± 0,1 ºC.4.2 Spectrofotometer.
4.3 Chronometer, nauwkeurigheid: 1 sec.
4.4 pH-meter
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.1)
Los150 mg peps ine op in 100 ml zoutzuur (3.2). Pipeteer 2 ml van de
oplossing in een maatkolf van 50 ml en vul aan met zoutzuur (3.3) tot de
streep. De met de pH-meter gemeten pH moet 1,6 ± 0,1 bedragen. Plaats
de kolf in het waterbad (4.1).
5.2Hydrolyse
Pipeteer 5,0 ml hemoglobineoplossing (3.7) in een reageerbuis en breng
in het waterbad (4.1) op een temperatuur van 25 ºC. Voeg daarna toe
1,0 ml van de in punt 5.1 verkregen pepsine-oplossing en meng door
ongeveer 10 maal op en neer bewegen met een glasstaaf, die aan het
uiteinde isafgeplat.
Plaatsde buisgedurende precies10 minuten in het waterbad (4.1) van
25 ºC, gerekend vanaf de toevoeging van de pepsine-oplossing (tijd en
temperatuur moeten nauwkeurig worden aangehouden). Voeg vervolgens
toe 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van tevoren op een
temperatuur van 25 ºC isgebracht, meng en filtreer door een droog filter.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 10
(1) Bepaal het gehalte aan stikstof volgens een semi-microkjeldahlmethode (theoretisch
gehalte: 17,7 % N).
▼B
5.3Ontwikkeling van de kleur en meting van de extinctie
Pipeteer 5,0 ml van het filtraat in een conische kolf van 50 ml, voeg toe
10,0 ml natronloog (3.5) en onder voortdurend omzwenken 3,0 ml
verdund reagensvolgensFolin-Ciocalteu (3.6). Meet na 5 à 10 minuten
de extinctie van de oplossing tegen water in cuvetten van 1 cm, met
behulp van de spectrofotometer bij 750 nm.
5.4Blancobepaling
Verricht bij iedere bepaling een blancoproef zoalshieronder bes chreven.
Pipeteer 5,0 ml hemoglobine-oplossing (3.7) in een reageerbuis, verwarm
dit in het waterbad (4.1) op 25 ºC. Voeg dan hieraan toe 10,0 mltrichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van te voren op een temperatuur
van 25 ºC isgebracht, meng en voeg vervolgens1,0 ml van de in punt
5.1 verkregen pepsine-oplossing toe. Meng met behulp van de glasstaaf
en plaatsde reageerbuisgedurende precies10 minuten in het waterbad
(4.1) bij 25 ºC. Meng en filtreer door een droogfilter. Handel verder
zoalsbes chreven onder punt 5.3.
5.5IJkgrafiek
Breng in conische kolven van 50 ml hoeveelheden van 1,0; 2,0; 3,0; 4,0
en 5,0 ml standaardtyrosine-oplossing (3.8), overeenkomend met respec-
tievelijk 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 en 1,0 µmol tyrosine. Voeg aan de reeks nog
een kolf toe zonder tyrosine. Breng met zoutzuur (3.1) op een volume
van 5,0 ml. Voeg toe 10,0 ml natronloog (3.5), alsmede onder voortdu-
rend omzwenken 3,0 ml verdund reagensvolgensFolin-Ciocalteu (3.6).
Bepaal de extinctie zoalsaangegeven in de laats te zin van punt 5.3. Stel
de ijkgrafiek op door de extinctiesuit te zetten tegen de toegevoegde
hoeveelheden tyrosine.
6.Berekening van de resultaten
Leesuit de ijkgrafiek af de hoeveelheid tyros ine in µmol, die overeenkomt
met de extiactie van de gekleurde oplossing, gecorrigeerd met de blanco.
De pepsine-activiteit in µmol tyrosine per mg en per minuut, bij 25 ºC, wordt
berekend uit de volgende formule:
Eenheden per mg E =mgðÞ ¼ 0;32/C1a
g
waarin:
a = hoeveelheid tyrosine in µmol, afgelezen uit de ijkgrafiek,
g = gewicht in mg van de hoeveelheid pepsine, toegevoegd onder 5.2
7.Opmerkingen
7.1 De op te lossen hoeveelheid pepsine moet zodanig worden gekozen, dat
bij de uiteindelijke fotometrische meting een extinctie wordt verkregen
van 0,35 ± 0,035.
7.2 2 E/mg, bepaald volgensdeze methode, komen overeen met 3,64 milli-
eenheden Anson/mg (µmol tyrosine/mg · min bij 35,5 ºC) of met 36 400
handelseenheden/g (µmol tyrosine/g · 10 minuten bij 35,5 ºC).
5.BEPALING VAN VRIJ EN TOTAAL GOSSYPOL
1.Doel en toepassingsgebied
Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
vrij gossypol, totaal gossypol en aan gossypol chemisch nauw verwante
stoffen in katoenzaad, katoenzaadmeel en -koeken en in mengvoeders die
katoenzaadprodukten bevatten.
De ondergrensvan de bepaalbaarheid bij de methode bedraagt 20 ppm.
2.Beginsel
Gossypol wordt geëxtraheerd in aanwezigheid van 3-amino-1-propanol, hetzij
met een mengsel van isopropanol en hexaan voor het bepalen van vrij
gossypol, hetzij met dimethylformamide voor het bepalen van totaal
gossypol.
Het gossypol wordt met behulp van aniline omgezet in gossypoldianiline,
waarvan de extinctie gemeten wordt bij 440 nm.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 11
▼B
3.Reagentia
3.1 Isopropanol-hexaanmengsel: Meng 60 volumedelen isopropanol p.a. met
40 volumedelen n-hexaan.
3.2 Oplosmiddel A: Breng in een maatkolf van 1 l ongeveer 500 ml isopro-
panol-hexaanmengsel (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml ijsazijn en
50 ml water. Vul aan tot 1 l met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Dit
reagensiseen week houdbaar.
3.3 Oplosmiddel B: Pipeteer in een maatkolf van 100 ml 2 ml 3-amino-1-
propanol en 10 ml ijsazijn. Koel af tot kamertemperatuur en vul aan tot
100 ml met N,N-dimethylformamide. Dit reagensiseen week houdbaar.
3.4 Aniline p.a.: Wanneer de extinctie van een blancobepaling meer
bedraagt dan 0,022 , moet de aniline worden afgedestilleerd over
zinkpoeder, waarbij 10 % voorloop en 10 % naloop worden verwijderd.
Dit reagens is enige maanden houdbaar in een gesloten bruine fles,
bewaard in een koelkast.
3.5 Gossypolstandaardoplossing A: Breng in een maatkolf van 250 ml
27,9 mg gossypolacetaat, los op in oplosmiddel A (3.2), en vul hiermee
aan tot de streep. Pipeteer 50 ml van deze oplossing in een maatkolf van
250 ml en vul aan tot 250 ml met oplosmiddel A (3.2). 1 ml van deze
oplossing bevat 0,02 mg gossypol. Laat de oplossing vóór het gebruik 1 h
staan bij kamertemperatuur.
3.6 Gossypolstandaardoplossing B: Breng in een maatkolf van 50 ml 27,9 mg
gossypolacetaat, los op in oplosmiddel B (3.3) en vul hiermee aan tot de
streep. 1 ml van deze oplossing bevat 0,5 mg gossypol.
De gossypolstandaardoplossingen zijn — in het donker bewaard — gedu-
rende 24 h houdbaar.
4.Apparatuur
4.1 Roteerapparaat met ongeveer 35 omwentelingen per minuut.4.2 Spectrofotometer.
5.Uitvoering
5.1Af te wegen hoeveelheid analysemateriaal
De af te wegen hoeveelheid analysemateriaal hangt af van het te
verwachten gehalte aan gossypol. Het verdient de voorkeur te werken
met een kleine hoeveelheid analysemateriaal en met een relatief groot
aliquoot deel van het filtraat, om een voldoende hoeveelheid gossypol
te verkrijgen voor een nauwkeurige fotometrische meting.
Voor het bepalen van vrij gossypol in katoenzaad, katoenzaadmeel en -
koeken mag het gewicht van het analysemateriaal niet meer bedragen
dan 1 g; van mengvoederskan tot 5 g worden afgewogen. In het alge-
meen kan een aliquoot deel van 10 ml van het filtraat worden
afgepipeteerd; het moet 50 à 100 µg gossypol bevatten.
Voor het bepalen van totaal gossypol kan de af te wegen hoeveelheid
analysemateriaal variëren van 0,5 tot 5 g, opdat in een aliquoot deel
van 2 ml van het filtraat 40 tot 200 µg gossypol aanwezig is.
De analyse moet worden uitgevoerd bij een omgevingstemperatuur van
nabij 20 ºC.
5.2Bepaling van vrij gossypol
Breng het afgewogen analysemateriaal in een kolf van 250 ml met slijp-
stuk en waarvan de bodem bedekt is met glaskralen. Pipeteer hierbij
50 ml oplosmiddel A (3.2), sluit de kolf en laat gedurende 1 h roteren.
Filtreer door een droogfilter en vang het filtraat op in een kleine kolf met
slijpstuk. Bedek tijdens het filtreren de trechter met een horlogeglas.
Pipeteer gelijke aliquote delen van het filtraat, die 50 tot 100 µg gossypol
bevatten, in twee maatkolven van 25 ml (A en B). Breng eventueel het
volume op 10 ml met oplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van maatkolf
(A) aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing
dient als referentieoplossing voor het monster.
Pipeteer vervolgensin twee andere maatkolven van 25 ml (C en D) 10 ml
oplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van kolf (C) aan tot 25 ml met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing dient als referentieop-
lossing voor de blanco.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 12
▼B
Voeg aan de maatkolven (D) en (B) resp. 2 ml aniline (3.4) toe.
Verwarm gedurende 30 min. op een kokend waterbad voor het ontwik-
kelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot de
streep met isopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h
staan.
Meet met behulp van de spectrofotometer de extinctie van de blanco-
oplossing (D) bij 440 nm in een glascuvet van 1 cm t.o.v. de referentie-
oplossing (C). Meet vervolgens de extinctie van de monsteroplossing (B)
t.o.v. de referentie-oplossing (A).
Verminder de extinctie van de monsteroplossing met die van de blanco-
oplossing (= gecorrigeerde extinctie). Bereken uit de aldus verkregen
waarde het gehalte aan vrij gossypol als beschreven onder 6.
5.3Bepaling van totaal gossypol
Breng een hoeveelheid analysemateriaal, die 1 à 5 mg gossypol bevat, in
een maatkolf van 50 ml en voeg toe 10 ml oplosmiddel B (3.3). Bereid
terzelfder tijd een blanco-oplossing, door 10 ml oplosmiddel B (3.3) in
een tweede maatkolf van 50 ml te brengen.
Verwarm beide kolven gedurende 30 minuten op een kokend waterbad.
Koel af tot kamertemperatuur, vul beide kolven aan tot de streep met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en meng. Laat na gedurende 10 à 15
minuten staan en filtreer dan af in kolfjes met ingeslepen stop.
Pipeteer 2 ml van het filtraat van het monster in resp. twee maatkolven
van 25 ml en 2 ml van het filtraat van de blanco in resp. twee andere
maatkolven van 25 ml. Vul van elke serie één maatkolf aan tot 25 ml
met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossingen dienen als refe-
rentieoplossingen.
Voeg vervolgens2 ml aniline (3.4) toe aan de beide overige maatkolven.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad voor het
ontwikkelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot
25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h
staan.
Meet de extincties als beschreven onder 5.2 voor vrij gossypol. Bereken
uit de verkregen waarde het gehalte aan totaal gossypol als beschreven
onder 6.
6.Berekening van de resultaten
De berekening van de resultaten kan geschieden hetzij op basis van de speci-
fieke extinctie (6.1), dan wel m.b.v. een ijkgrafiek (6.2).
6.1Opbasis van de sp ecifieke extinctie
Onder de beschreven omstandigheden bedragen de specifieke extincties
voor:
vrij gossypol: E1%
1c m¼625
totaal gossypol: E1%
1c m¼600
Het gehalte aan vrij of totaal gossypol in het monster wordt verkregen
uit de onderstaande formule:
percentage gossypol ¼E/C11250
E1%
1c m/C1g/C1v
waarin:
E = gecorrigeerde extinctie, alsbepaald onder 5.2
g = gewicht van het analysemateriaal in grammen
v = aliquoot deel van het filtraat in ml.
6.2Met behulpvan een ijkgrafiek
6.2.1Vrij gossypol
Neem twee series van telkens 5 maatkolven van 25 ml. Pipeteer in
beide series resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en 10,0 ml gossypol-
standaardoplossing A (3.5). Verdun met oplosmiddel A (3.2) tot
10 ml. Voeg aan elke serie nog een maatkolf van 25 ml toe, die
slechts 10 ml oplosmiddel A (3.2) bevat (blancoproef). Vul de
kolven van de eerste serie, met inbegrip van de blancoproef, aan
tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentieserie).1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 13
▼B
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie,
inclusief de blancoproef. Verwarm gedurende 30 minuten op een
kokend waterbad voor het ontwikkelen van de kleuring. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h staan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extinctieste s tellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.2.2Totaal gossypol
Neem zes maatkolven van 50 ml. Breng in de eerste 10 ml oplos-
middel B (3.3) en in de andere resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en
10,0 ml gossypolstandaardoplossing B (3.6). Verdun de inhoud van
elke kolf tot 10 ml met oplossmiddel B (3.3). Verwarm gedurende
30 minuten op een kokend waterbad. Koel af tot kamertempera-
tuur, vul aan tot 50 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en
meng.
Pipeteer van deze oplossingen telkens 2,0 ml in resp. twee series
van zes maatkolven van 25 ml. Vul de kolven van de eerste serie
aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentie-
serie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h staan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extinctieste s tellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
— 15 % relatief bij gehalten van minder dan 500 ppm gossypol;
— niet meer dan 75 ppm absoluut bij gehalten van 500 tot 750 ppm;— 10 % relatief bij gehalten van meer dan 750 ppm gossypol.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 14
▼B
BIJLAGE II
4.BEPALING VAN TYLOSINE
— door middel van agardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van tylosine in voeder-
middelen, voormengsels en concentraten. De ondergrens van de
bepaalbaarheid ligt bij 2 ppm.
2.Principe
Het monster wordt behandeld met een tot 80 ºC verwarmd fosfaatbuffer pH
8, waarna methanol geëxtraheerd wordt. Na centrifugeren wordt het extract
verdund en de antibiotische werking ervan gemeten via de diffusie van het
tylosine in een met Sarcina lutea geëente agarvoedingsbodem. De diffusie
wordt zichtbaar gemaakt door de vorming van remzonesin aanwezigheid
van het micro-organisme. De diameter van deze remzones is rechtevenredig
met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Sarcina lutea ATCC nr. 9341
3.1Bewaren van de stam
Sarcina lutea wordt geënt in een buisje met schuingestolde agar-
voedingsbodem (4.1), echter op pH 7,0 gebracht. Na een nacht
bebroeden bij ca. 35 ºC wordt deze cultuur in de ijskast bewaard en
alle veertien dagen op dezelfde wijze overgeënt.
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestolde
agar bereid. Direct na het bebroeden wordt deze cultuur in 2 tot 3 ml
fysiologische zoutoplossing (4.4) opgenomen. Met deze suspensie wordt
een Roux-fles met 250 ml gestolde voedingsbodem (4.1), echter op pH
7,0 gebracht beënt en 24 uur bij 35 ºC bebroed. Vervolgenswordt de
cultuur opgenomen in 25 ml fysiologische zoutoplossing (4.4). Deze
suspensie wordt gehomogeniseerd en verdund tot een lichttransmissie
van ca. 75 % bij 650 nm verkregen wordt. Deze suspensie kan, mits in
de ijskast bewaard, gedurende een week gebruikt worden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan het medium moet worden toege-
voegd om voor de toegepaste concentraties tylosine zo groot mogelijke,
maar nog scherpe remmingszones te verkrijgen. Het enten van de
voedingsbodem vindt bij 48-50 ºC plaats.
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de metingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 gVleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
Voor het bewaren van de vlam en het bereiden van de entsuspensie op
pH 7,0 brengen en voor de bepaling op pH 8,0 brengen.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 15
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.▼M4
▼B
▼B
4.2Fosfaatbuffer pH 8
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 0,523 g
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 16,730 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3Fosfaatbuffer pH 7
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 5,5 g
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 13,6 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.4 Steriele fysiologische zoutoplossing.
4.5 Methanol, chemisch zuiver.4.6 Methanol 40 % (v/v).4.6 Mengsel van fosfaatbuffer (4.2)/methanol, chemisch zuiver: 60/40 (vol.).4.8 Standaard: tylosine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Na drogen van de standaard (4.8) (3 uur 60 ºC bij 5 mm kwik) wordt 10-
50 mg afgewogen en in een maarkolf opgelost in 5 ml methanol (4.5) waarna
aangevuld wordt met fosfaatbuffer pH 7 (4.3). Met deze buffer wordt verder
verdund tot een tylosine-basisconcentratie van 1000 µg/ml is verkregen.
Uitgaande van deze stamoplossing wordt een werkstandaardoplossing S
8bereid door verdunnen met mengsel (4.7) tot een concentratie van 2 µg tylo-sinebase per ml is verkregen.
Door verdere verdunning (1 + 1) met mengsel (4.7) worden de volgende
concentratiesbereid:
S
41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extractie
Van de te onderzoeken concentraten wordt 10 g afgewogen, van voormeng-
sels en voeders 20 g. Van fosfaatbuffer pH 8 (4.2) wordt 60 ml tot 80 ºC
verwarmd en bij de afgewogen monsterhoeveelheid gevoegd, waarna geho-
mogeniseerd wordt gedurende 2 minuten (huishoudmixer, Ultra-Turrax, enz.).
Na 10 minuten staan worden 40 ml methanol (4.5) toegevoegd en wordt nog
eens5 minuten gehomogenis eerd. Na centrifugeren wordt een aliquot deel
van de bovenstaande vloeistof met mengsel (4.7) verdund tot een verwachte
concentratie aan tylosine van 2 µg/ml (= U8). Vervolgensworden de concen-
tratiesU4,U2en U1door verder verdunnen (1 + 1) met oplossing (4.7) bereid.
Bij gehalten beneden 10 ppm wordt het extract bij 35 ºC in een rotatiever-
damper drooggedampt en in 40 % methanol (4.6) opgenomen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) op pH 8,0 gebracht wordt met de entsuspensie
(3.2) bij 48-50 ºC geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri) schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentratiesen de vier mons terconcentraties(S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten. De plaatdiameter moet voldoende
zijn om in de agarlaag ten minste acht gaatjes van 10 à 13 mm te kunnen
maken De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem per plaat dient zo
berekend te worden dat een overal even dikke laag van 2 mm dikte
verkregen wordt. Bij voorkeur dienen alss chalen te worden gebruikt1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 16
▼B
vlakke glazen platen met een volledig vlakke ring van aluminium of
kunststof van 200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjesworden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt. Voor ieder monster
worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan met iedere concen-
tratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het meten van 32
remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden gedurende een nacht bij 35-37 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diametersvan de remzonesworden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentratiestegen de remzonediameters . Indien er bij de
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgensde volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
5.BEPALING VAN VIRGINIAMYCINE
— door middel van agardiffusie —
1.Doel en toepassingsgebied
Met deze methode kan virginiamycine in diervoedersen in voormengs els
worden bepaald. De ondergrensvan de bepaling ligt bij 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een methanolische oplossing van Tween
80. Het extract wordt gedecanteerd of gecentrifugeerd en verdund. De anti-
biotische activiteit van het extract wordt bepaald door meting van de
diffusie van virginiamycine op een agarvoedingsbodem die is geënt met
Micrococcus luteus . De diffusie wordt zichtbaar door de vorming van zones
waarin de groei van het micro-organisme is geremd. De doorsnede van deze
remmingszones wordt binnen het gebruikte concentratiegebied verondersteld
recht evenredig te zijn met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Bewaren van de stam
Buizen met schuingestolde voedingsbodem (4.1) worden geënt met
Micrococcus luteus en 24 uur bij 30 ºC geïncubeerd. De kweek wordt
in de koelkast bij 4 ºC bewaard. Elke twee weken wordt opnieuw over-
geënt.
3.2.Bereiding van de bacteriesuspensie (a)
De cultuur van een vers bereid agarbuisje (3.1) wordt gesuspendeerd in
2 à 3 ml natriumchlorideoplossing (4.3). 250 ml voedingsbodem (4.1) in
een Rouxfles wordt met deze suspensie geënt en 18 tot 20 uur bij 30 ºC
geïncubeerd. Neem de cultuur op in 25 ml natriumchlorideoplossing1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 17
(1) 1 mg virginiamycine komt overeen met 1 000 UK-eenheden.
(a) Andere methoden mogen ook worden gebruikt, mits vaststaat dat die dezelfde bacterie-
suspensies opleveren.▼M2
▼M2
(4.3) en meng. Verdun de suspensie 1 op 10 met natriumchlorideoplos-
sing (4.3). De lichttransmissie van de suspensie, gemeten bij 650 nm in
een cel van 1 cm tegen natriumchlorideoplossing (4.3), moet ongeveer
75 % bedragen. Deze suspensie kan ongeveer één week bij 4 ºC worden
bewaard.
4.Voedingsbodems en reagentia
4.1.Voedingsbodem (a)
Vleespepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Gistextract 3,0 g
Vleesextract 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 10,0 tot 20,0 g
Water 1 000 ml
pH 6,5 (na sterilisatie)
4.2.Fosfaatbuffer pH 6
Dikaliumwaterstoffosfaat, K2HPO42,0 g
Kaliumdiwaterstoffosfaat, KH2PO48,0 g
Water 1 000 ml
4.3. Natriumchlorideoplossing 0,8 % (m/v): los 8 g natriumchloride op in
water en verdun tot 1 000 ml; steriliseer.
4.4. Methanol.4.5. Mengsel van fosfaatbuffer en methanol: meng fosfaatbuffer (4.2) en
methanol (4.4) in de verhouding 80: 20 (v/v).
4.6. Methanolische oplossing van Tween 80, 0,5 % (m/v): los 5 g Tween 80
in methanol (4.4) op en verdun met methanol tot 1 000 ml.
4.7. Standaard: virginiamycine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Loseen nauwkeurig afgewogen hoeveelheid s tandaard (4.7) in methanol
(4.4) op en verdun met methanol tot een voorraadoplossing van 1 000 µg
virginiamycine per ml.
In een gesloten kolf bij 4 ºC is deze oplossing vijf dagen stabiel.
Bereid, uitgaande van deze voorraadoplossing, door steeds met mengsel (4.5)
te verdunnen, de volgende oplossingen:
S
81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Bereiding van het extract en de meetoplossingen
6.1.Extractie
6.1.1.Produkten met een virginiamycinegehalte tot 100 mg/kg
Weeg 50,0 g monster af, voeg 200 ml van oplossing (4.6) toe en
schud 30 minuten. Laat het mengsel uitzakken of centrifugeer het,
neem 20 ml van de bovenstaande vloeistof en damp deze in een
rotatieverdamper bij een temperatuur van maximaal 40 ºC tot
ongeveer 5 ml in. Verdun het residu met mengsel (4.5) tot een
aangenomen virginiamycinegehalte van 1 µg/ml (= U8).
6.1.2.Produkten met een virginiamycinegehalte hoger dan 100 mg/kg
Weeg ten hoogste 10,0 g monster af, zodat de afgewogen
hoeveelheid 1 tot 50 mg virginiamycine bevat, voeg 100 ml
oplossing (4.6) toe en schud 30 minuten. Laat het mengsel
uitzakken of centrifugeer het en verdun de bovenstaande vloeistof1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 18
(a) In de handel verkrijgbare voedingsbodems van vergelijkbare samenstelling, die dezelfde
resultaten geven, kunnen ook worden gebruikt.
▼M2
vervolgensmet mengs el (4.5) tot een aangenomen virginiamyci-
negehalte van 1 µg/ml (= U8).
6.2.Meetoplossingen
Bereid, uitgaande van oplossing U8, oplossingen U4(aangenomen
gehalte: 0,5 µg/ml), U2(verondersteld gehalte: 0,25 µg/ml) en U1(veron-
dersteld gehalte 0,125 µg/ml) door steeds 1 op 1 met mengsel (4.5) te
verdunnen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1.Enten van de voedingsbodem
Ent de voedingsbodem voor de bepaling (4.1) bij ongeveer 50 ºC met de
bacteriesuspensie (3.2). In voorafgaande proeven op platen met
voedingsbodem (4.1) wordt de hoeveelheid bacteriesuspensie bepaald
die bij de verschillende concentraties virginiamycine tot de grootste en
duidelijkste remmingszones leidt.
7.2.Bereiden van de platen
De agardiffusie vindt plaats op platen met de vier standaardoplossingen
(S8,S4,S2en S1) en de vier meetoplossingen (U8,U4,U2en U1). Op elke
plaat moeten alle vier concentratiesvan s tandaard en van extract worden
opgebracht. Daarom moeten de afmetingen van de platen zo worden
gekozen dat op de agarvoedingsbodem plaats is voor ten minste acht
gaatjesvan 10 tot 13 mm doors nede, waarvan de middelpunten niet
minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. Voor de bepaling kunnen
vlakke glazen platen worden gebruikt, waarop aluminium- of plastic-
ringen van 200 mm doorsnede en 20 mm hoogte worden gelegd.
Giet op de platen een hoeveelheid voedingsbodem (4.1), geënt als
aangegeven bij punt 7.1, zodat een laag van ongeveer 2 mm dik ontstaat
(60 ml voor een plaat met een doorsnede van 200 mm). Laat de
voedingsbodem in horizontale stand stollen, pons er de gaatjes in en
breng er exact afgemeten hoeveelheden standaard en extract in (0,10
tot 0,15 ml per gaatje, afhankelijk van de doorsnede). Breng iedere
concentratie ten minste in viervoud aan, zodat iedere bepaling als grond-
slag voor de berekening 32 remmingszones heeft.
7.3.Incuberen
Incubeer de platen 16 tot 18 uur bij 30 ºC ± 2 ºC.
8.Meting en berekening
Meet de doorsnede van de remmingszones tot op 0,1 mm nauwkeurig. Zet
voor elke concentratie de gemiddelde waarden op half-logaritmisch papier
uit, zodat de logaritme van de concentratiestegen de doors nede van de
remmingszones komt te staan. Trek de best passende lijnen, zowel voor de
s tandaard alsvoor het extract, en ga daarbij bij voorbeeld alsvolgt te werk:
Bepaal het meest passende punt voor de laagste standaardwaarde (SL)
volgensde formule:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Bepaal het meest passende punt voor de hoogste standaardwaarde (SH)
volgensde formule:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Bepaal op dezelfde wijze de meest passende punten voor de laagste extract-
waarde (UL) en de hoogste extractwaarde (UH) door in bovenstaande
formuless1,s2,s4en s8door u1,u2,u4en u8te vervangen.
Vul de waarden SL en SH in dezelfde grafiek in. Door deze twee punten te
verbinden, krijgt men de meest passende rechte voor de standaardoplossing.
Op dezelfde wijze verkrijgt men met UL en UH de meest passende rechte
voor het extract.
Wanneer er geen enkele storing is, moeten de rechten evenwijdig zijn. In de
praktijk kunnen de rechten alsevenwijdig worden bes chouwd wanneer (SH
— SL) en (UH — UL) niet meer dan 10 % van hun gemiddelde afwijken.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 19
▼M2
Alsde rechten niet evenwijdig zijn, kan men hetzij u1en s1, hetzij u8en s8uitsluiten. De waarden SL, SH, UL en UH waarmee men dan de meest
passende rechten kan trekken, worden dan berekend volgens de volgende
formules:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6of5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6of5s2þ2s4/C0s2
6
en analoge formulesvoor UL en UH. Nu moet wel aan bovengenoemde eis
van evenwijdigheid zijn voldaan. Wanneer het resultaat uit drie concentraties
isberekend, moet dit op het analys ecertificaat vermeld worden.
Wanneer de rechten alsevenwijdig bes chouwd kunnen worden, wordt de
logaritme van de relatieve activiteit (log A) berekend volgenséén van de
volgende formules, afhankelijk van het bereiken van evenwijdigheid met 4
of 3 concentraties:
Voor 4 concentraties:
(c) Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Voor 3 concentraties:
(d) Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
of
(d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Activiteit van het monsterextract = activiteit van de bijbehorende standaard ×
A:
(U8=S8×A )
Blijkt de relatieve activiteit buiten het gebied 0,5 tot 2,0 te liggen, dan moet
de bepaling worden herhaald met geschikte aanpassingen aan de extractcon-
centraties of, indien zulks onmogelijk is, aan de standaardoplossingen. Indien
de relatieve activiteit niet in dit vereiste gebied kan worden gebracht, moet
het resultaat als een benadering worden beschouwd en als zodanig op het
analysecertificaat worden vermeld.
Wanneer de rechten niet alsevenwijdig bes chouwd kunnen worden, moet de
bepaling worden herhaald. Wanneer dan nog steeds geen evenwijdige rechten
zijn verkregen, moet de bepaling alsniet bevredigend worden bes chouwd.
Geef de uitkomst weer in milligram virginiamycine per kilogram voeder.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen aan hetzelfde monster
uitgevoerd door dezelfde analist mag niet groter zijn dan:
— 2 mg/kg in absolute waarde bij virginiamycinegehalten tot 10 mg/kg;
— 20 % van de hoogste waarde bij gehalten van 10 tot 25 mg/kg;— 5 mg/kg in absolute waarde bij gehalten van 25 tot 50 mg/kg;— 10 % van de hoogste waarde bij gehalten van meer dan 50 mg/kg.1972L0199 — NL — 27.08.1999 — 005.001 — 20