1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B VIERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 5 december 1972
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
veevoeders
(73/46/EEG)
(PB L 83 van 30.3.1973, blz. 21)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Richtlijn 81/680/EEG van de Commissie van 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Richtlijn 92/89/EEG van de Commissie van 3 november 1992 L 344 35 26.11.1992
►M3Richtlijn 98/54/EG van de Commissie van 16 juli 1998 L 208 49 24.7.1998
▼B
VIERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 5 december 1972
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden
voor de officiële controle van veevoeders
(73/46/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethodenvoor de officiële controle van veevoeders(
1), gewijzigd door de richt-
lijn nr. 72/275/EEG van 20 juli 1972(2), inzonderheid op artikel 2,
Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële
controle van veevoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de op
grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van veevoeders gestelde eisen is voldaan,geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende dat bij E.E.G. Richtlijnen nr. 71/250, nr. 71/393 en nr. 72/
199 van de Commissie van 15 juni 1971(
3), 18 november 1971(4)e n
27 april 1972(5) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analyseme-
thoden is vastgelegd; dat gezien de vorderingen welke dewerkzaamheden sindsdien hebben gemaakt het dienstig is een vierdereeks methoden vast te stellen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor
veevoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders ten aanzien van het gehalte aan vocht in dierlijke en
plantaardige vetten en oliën, en ten aanzien van het gehalte aan magne-
sium en ruwe celstof in veevoeders, geschieden volgens de in debijlage I bij deze richtlijn omschreven methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders ten aanzien van hun gehalte aan retinol (vitamine A),►
M3 ◄geschieden volgens de in bijlage II bij deze
richtlijn omschreven methoden.
Artikel 3
De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 januari 1974 de nodige wettelijke of
bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden ten einde hun wetge-ving in overeenstemming te brengen met deze richtlijn. Zij stellen deCommissie onverwijld hiervan in kennis.1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 171 van 29. 7. 1972, blz. 39.
(3) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(4) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.
(5) PB nr. L 123 van 29. 5. 1972, blz. 6.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 3
▼B
BIJLAGE I
1.BEPALING VAN VOCHT IN DIERLIJKE EN PLANTAARDIGE
VETTEN EN OLIËN
1.Doel en toepasbaarheid
Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
vocht, water en andere vluchtige stoffen in dierlijke en plantaardige vetten
en oliën.
2.Principe
Het monster wordt bij 103 ºC gedroogd, totdat geen gewichtsverlies meer
optreedt. Het gewichtsverlies wordt door weging bepaald.
3.Apparatuur
3.1. Schaal met vlakke bodem, van corrosiebestendig materiaal, doorsnede 8
à 9 cm, hoogte ca. 3 cm.
3.2. Kwikthermometer met een versterkt reservoir en een expansieruimte,
gecalibreerd van ongeveer 80 ºC tot tenminste 110 ºC, lengte ca. 10 cm.
3.3. Zandbad of een electrische verwarmingsplaat.3.4. Exsiccator met een effectief droogmiddel.3.5. Analytische balans.
4.Uitvoering
Breng ongeveer 20 g van het gehomogeniseerde monster, tot op 1 mg nauw-
keurig gewogen, in de droge schaal (3.1), getarreerd met de thermometer
(3.2). Verhit op het zandbad of op de verwarmingsplaat (3.3) onder voortdu-
rend roeren met de thermometer zodanig, dat na ongeveer 7 min. een
temperatuur van 90 ºC bereikt wordt.
Verminder de toevoer van warmte overeenkomstig de frekwentie waarmee
gasbellen van de bodem van de schaal opstijgen. De temperatuur mag niet
hoger komen dan 105 ºC. Roer onder voortdurend schrapen over de bodem
van de schaal tot de belvorming ophoudt.
Herhaal, om zeker te zijn dat al het vocht uitgedreven wordt, meerdere keren
de verwarming tot 103 ºC ± 2 ºC en laat tussen twee opeenvolgende verhit-
tingen afkoelen tot 93 ºC. Laat vervolgens in de exsiccator afkoelen tot
kamertemperatuur en weeg. Herhaal deze procedure totdat het gewichtsver-
lies tussen twee opeenvolgende wegingen niet meer bedraagt dan 2 mg.
N. B.Een gewichtsvermeerdering van het monster na herhaalde verwarming
duidt op oxidatie van het vet. In dit geval maakt men bij de berekening
gebruik van het resultaat van de weging die vlak voor de gewichtsver-
meerdering gedaan werd.
5.Berekening van de resultaten
Bereken het gehalte aan vocht in percenten van het monster uit de formule:
M
1/C0M2 ðÞ /C1100
Mo
waarin:
Mo= gewicht van het monster (in g)
M1= gewicht van de schaal met inhoud vóór verhitting (in g)
M2= gewicht van de schaal met inhoud na verhitting (in g)
Resultaten beneden 0,05 % moeten aangegeven worden met „minder dan
0,05 %”.
HerhaalbaarheidHet verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 0,05 % absoluut.1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 4
▼B
2.BEPALING VAN MAGNESIUM
door atoomabsorptiespektrofotometrie
1.Doel en toepasbaarheid
Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
magnesium in veevoeders. Het is bijzonder geschikt voor de bepaling van
magnesiumgehalten van minder dan 5 %.
2.Principe
Het monster wordt verast en de as behandeld met zoutzuur. Indien het
monster geen organische bestanddelen bevat, wordt het direct met zoutzuur
behandeld. De oplossing wordt verdund en het magnesiumgehalte wordt
bepaald door atoomabsorptiespektrofotometrie bij 285,2 nm, aan de hand
van ijkoplossingen.
3.Reagentie
3.1. Zoutzuur p.a., d = 1,16
3.2. Zoutzuur p.a., d = 1,193.3. Magnesium of -draad of magnesiumsulfaat (Mg SO
4·7 H2O), p.a. onder
vacuum gedroogd bij kamertemperatuur
3.4. Strontiumzoutoplossing (chloride of nitraat) met 25 g strontium per 1
(= 76,08 g SrCl2.6H2O p.a./1 of 60,38 g Sr (NO3)2p.a./1.).
3.5. Magnesiumstandaardoplossing: weeg af 1 g magnesium (3.3) tot op 1 mg
nauwkeurig, nadat tevoren zorgvuldig het oxidelaagje is verwijderd, of
een overeenkomstige hoeveelheid magnesiumsulfaat (3.3) en breng dit
in een maatkolf van 1000 ml. Voeg toe 80 ml zoutzuur (3.1), los het
magnesium op en vul aan met water tot 1 000 ml. 1 ml van de
verkregen oplossing bevat 1,000 mg magnesium.
4.Apparatuur
4.1. Verassingsschalen van platina, kwarts of porselein
4.2. Elektrische moffeloven met thermostaat
4.3. Atoomabsorptiespektrofotometer
5.Uitvoering
5.1.Bereiding van de analyseoplossing
5.1.1.Veevoeders die uitsluitend uit minerale bestanddelen bestaan
Breng 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in
een maatkolf van 500 ml met 250 à 300 ml water. Voeg dan toe
40 ml zoutzuur (3.1), breng aan de kook en laat gedurende onge-
veer 30 min. zachtjes koken. Koel af, vul aan met water tot
500 ml, meng en filtreer over een droog vouwfilter in een droog
bekerglas. Werp het eerste deel (ongeveer 30 ml) van het filtraat
weg.
Bij aanwezigheid van kiezelzuur wordt 5 g van het monster met
een voldoende hoeveelheid zoutzuur (3.2) (15—30 ml) op een
waterbad tot droog ingedampt. Handel verder als beschreven
onder 5.1.2.
5.1.2.Veevoeders die voornamelijk uit minerale bestanddelen bestaan
Breng 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in
een verassingsschaal en veras in de moffeloven bij 550 ºC, totdat
as zonder kooldeeltjes wordt verkregen. Voor de scheiding van
kiezelzuur wordt aan de as een voldoende hoeveelheid zoutzuur
(3.2) (15—30 ml) toegevoegd en op het waterbad tot droog inge-
dampt. Droog vervolgens gedurende een uur in een droogstoof bij
105 ºC. Het residu wordt in 10 ml zoutzuur (3.1) opgenomen en
met warm water in een maatkolf van 500 ml overgespoeld. Kook
gedurende korte tijd, na afkoelen wordt met water aangevuld,
geschud en door een droog vouwfilter in een droog bekerglas
gefiltreerd. De eerste 30 ml van het filtraat wordt verwijderd.
5.1.3.Veevoeders die voornamelijk uit organische bestanddelen bestaan
Breng 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in
een verassingsschaal en veras in de moffeloven bij 550 ºC, totdat1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 5
▼B
as zonder kooldeeltjes wordt verkregen. Voeg toe 5 ml zoutzuur
(3.2), damp droog op een waterbad en laat vervolgens gedurende
1 h drogen bij 105 ºC in een droogstoof om het kiezelzuur onop-
losbaar te maken. Neem het residu hierna op in 5 ml zoutzuur
(3.1) en breng met behulp van heet water over in een maatkolf
van 250 ml. Kook even op en vul na afkoelen aan tot 250 ml
met water. Meng en filtreer over een droog vouwfilter in een
droog bekerglas. Werp het eerste deel (ongeveer 30 ml) van het
filtraat weg.
5.2.Meting van de atoomabsorptie
Bereid door verdunnen met water uit de magnesiumstandaardoplossing
(3.5) tenminste 5 ijkoplossingen met toenemende concentraties. De
concentraties van deze oplossingen zijn afhankelijk van het optimale
meetbereik van de atoomabsorptiespektrofotometer. Voeg aan iedere
ijkoplossing 10 ml strontiumzoutoplossing (3.4) toe en vul daarna met
water aan tot 100 ml.
Verdun met water een aliquot deel van het onder 5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3
verkregen filtraat, zodat een magnesiumconcentratie bereikt wordt, die
binnen het concentratiegebied van de ijkoplossingen ligt. De zoutzuur
concentratie van deze oplossing mag niet hoger zijn dan 0,4 N. Voeg
10 ml van het strontiumzoutoplossing (3.4) toe en vul daarna met water
aan tot 100 ml.
Meet de atoomabsorptie van de ijkoplossingen en van de analyseoplos-
sing bij een golflengte van 285,2 nm.
6.Berekening van de resultaten
Bereken het gehalte aan magnesium met behulp van de ijkoplossingen. Druk
het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 5 % relatief.
3.BEPALING VAN RUWE CELSTOF
1.Doel en toepassingsgebied
Met deze methode is het mogelijk het gehalte aan vetvrije, in zuur en basisch
medium onoplosbare organische stoffen, die volgens afspraak als ruwe
celstof worden aangeduid, in voeders te bepalen.
2.Principe
Het monster wordt, zo nodig na ontvetten, achtereenvolgens behandeld met
kokende oplossingen van zwavelzuur en kaliumhydroxide van bepaalde
concentraties. Het residu wordt afgescheiden door filtreren op een filter van
gesinterd glas, gedroogd, gewogen en bij een temperatuur van 475 tot 500 ºC
verast. Het gewichtsverlies als gevolg van het verassen is een maat voor het
gehalte aan ruwe celstof in het testmonster.
3.Reagentia
3.1. Zwavelzuur, c = 0,13 mol/l.3.2. Schuimremmingsmiddel (b.v. n-octanol).
3.3. Filtreerhulpmiddel (Celite 545 of gelijkwaardig), vier uur verhit op
500 ºC (8.6).
3.4.Aceton.
3.5. Petroleumether, kooktraject 40-60 ºC.
3.6. Zoutzuur, c = 0,5 mol/l.
3.7. Kaliumhydroxide-oplossing, c = 0,23 mol/l.
4.Apparatuur
4.1. Verwarmingstoestel voor de ontsluiting met zwavelzuur of kaliumhydro-
xide-oplossing, voorzien van een houder voor de filterkroes (4.2), een
afvoerbuis met kraan voor de vloeistofafvoer en de vacuümaansluiting,1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 6
▼M2
▼M2
eventueel met perslucht. Het toestel dient vóór gebruik dagelijks vijf
minuten met kokend water te worden voorverwarmd.
4.2. Glasfilterkroes, met filter van gesinterd glas met poriën van 40-90 µm.
Voor het eerste gebruik wordt de filterkroes enkele minuten op 500 ºC
verhit en afgekoeld (8.6).
4.3. Kookcilinder met een inhoud van ten minste 270 ml met een terugvloei-
koeler.
4.4. Droogstoof met thermostaat.
4.5. Moffeloven met thermostaat.
4.6. Koudextractietoestel, voorzien van een houder voor de filterkroes (4.2)
en een afvoerbuis met kraan voor de vacuümaansluiting en de vloeistof-
afvoer.
4.7. Verbindingsringen voor de aansluiting tussen het verwarmingstoestel
(4.1), de filterkroes (4.2) en de kookcilinder (4.3), en voor de aansluiting
tussen het koudextractietoestel (4.6) en de filterkroes.
5.Werkwijze
Weeg van het bereide monster 1 g op 0,001 g nauwkeurig af, breng het in de
filterkroes (4.2) (zie opmerkingen onder 8.1, 8.2 en 8.3) en voeg 1 g filtreer-
hulpmiddel (3.3) toe.
Sluit het verwarmingstoestel (4.1) en de filterkroes (4.2) op elkaar aan en
verbind vervolgens de kookcilinder (4.3) met de filterkroes. Breng in de
kookcilinder 150 ml tot het kookpunt verhitte zwavelzuur (3.1) en voeg zo
nodig enkele druppels schuimremmingsmiddel (3.2) toe. Breng de vloeistof
in 5 ± 2 minuten aan de kook en kook krachtig gedurende precies 30
minuten.
Open de kraan van de afvoerbuis (4.1) en filtreer het zwavelzuur onder
vacuüm door de filterkroes. Was het residu op het filter onder vacuüm drie-
maal met telkens 30 ml kokend water. Na elke wasstap dient het residu te
worden drooggezogen.
Sluit de kraan van de afvoerbuis en breng in de kookcilinder (4.3) 150 ml tot
het kookpunt verhitte kaliumhydroxide-oplossing (3.7) en enkele druppels
schuimremmingsmiddel. Breng de vloeistof in 5 ± 2 minuten aan de kook
en kook krachtig gedurende precies 30 minuten. Filtreer en was het residu
op dezelfde wijze als na de behandeling met zwavelzuur.
Zuig het residu na de laatste wasbehandeling droog en sluit de filterkroes met
inhoud aan op het koudextractietoestel (4.6). Was het residu onder vacuüm
driemaal met telkens 25 ml aceton. Na elke wasstap dient het residu te
worden drooggezogen.
Droog de filterkroes in de droogstoof bij 130 ºC tot constant gewicht. Koel
de kroes na elke droging in de exsiccator af en weeg snel. Plaats de filter-
kroes vervolgens in de moffeloven en veras de inhoud ten minste 30
minuten bij 475 tot 500 ºC tot constant gewicht.
Koel de filterkroes na elke verassing eerst af in de moffeloven en vervolgens
in de exsiccator en weeg daarna.
Verricht op gelijke wijze een blanco-bepaling zonder monster. Het gewichts-
verlies als gevolg van het verassen mag niet meer dan 4 mg bedragen.
6.Berekening van de resultaten
Het gehalte aan ruwe celstof als percentage van het monster wordt verkregen
uit de formule:
b/C0c ðÞ /C2 100
a
waarin:
a = massa van het monster, in g,
b= massaverlies na verassen van het residu van het b ij 130 ºC gedroogde
monster, in g,
c = massaverlies na verassen van het bij 130 ºC gedroogde residu van de
blanco, in g.1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 7
▼M2
7.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen twee parallelle bepalingen uitgevoerd op dezelfde steek-
proef mag niet meer zijn dan:
— 0,3 in absolute waarde voor ruwe-vezelgehalten minder dan 10 %.
— 3 % betrokken op het hogere resultaat voor ruwe-vezelgehalten gelijk aan
of hoger dan 10 %.
8.Opmerkingen
8.1. Voeders die meer dan 10 % ruw vet bevatten, moeten voorafgaande aan
de bepaling worden ontvet met petroleumether (3.5). Sluit de glasfilter-
kroes (4.2) met het ingewogen monster aan op het koudextractietoestel
(4.6) en was onder vacuüm driemaal met telkens 30 ml petroleumether
(3.5). Zuig het monster droog, sluit de filterkroes met inhoud aan op het
verwarmingstoestel (4.1) en voer de bepaling uit zoals beschreven bij
punt 5.
8.2. Voeders die niet direct met petroleumether extraheerbare vetten
bevatten, dienen volgens de werkwijze van punt 8.1 te worden ontvet
en vervolgens na opkoken met zwavelzuur nogmaals te worden ontvet.
Sluit na opkoken met zwavelzuur en daaropvolgend wassen, de filter-
kroes met inhoud aan op het koudextractietoestel (4.6) en was driemaal
met telkens 30 ml aceton, gevolgd door driemaal wassen met telkens
30 ml petroleumether. Zuig het filter droog onder vacuüm en vervolg
de bepaling zoals beschreven bij punt 5, te beginnen met de behandeling
met kaliumhydroxide-oplossing.
8.3. Voeders, welke meer dan 5 % carbonaat, uitgedrukt als calciumcarbo-
naat, bevatten, dienen als volgt te worden voorbehandeld. Sluit de
filterkroes (4.2) met het ingewogen monster aan op het verwarmingstoe-
stel (4.1). Was het monster driemaal met 30 ml zoutzuur (3.6). Wacht na
elke toevoeging van zoutzuur ongeveer een minuut voordat het monster
wordt afgefiltreerd. Was eenmaal met 30 ml water en voer de bepaling
verder uit zoals beschreven bij punt 5.
8.4. Indien voor meervoudige bepalingen uitgeruste apparatuur wordt
gebruikt (met een aantal aan hetzelfde verwarmingstoestel aangesloten
filterkroezen), mogen in dezelfde reeks geen twee bepalingen van
hetzelfde monster uitgevoerd worden.
8.5. Wanneer de zure of basische oplossingen na het opkoken moeilijk te
filtreren zijn, dient perslucht door de afvoerbuis van het verwarmings-
toestel te worden geblazen, waarna het filtreren dient te worden
voortgezet.
8.6. Met het oog op de levensduur van de glasfilterkroezen, mag de veras-
singstemperatuur niet hoger dan 500 ºC zijn. Bij het verhitten en
afkoelen dienen temperatuurschokken te worden vermeden.1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 8
▼B
BIJLAGE II
1.BEPALING VAN RETINOL (VITAMINE A)
1.Doel en toepassingsgebied
Met behulp van deze methode is het mogelijk retinol (vitamine A) te bepalen
in veevoeders, concentraten en voormengsels. De ondergrens voor de bepa-
ling ligt bij 10000 IE/kg bij pigmentrijke veevoeders en 4 000 IE/kg bij
alle andere veevoeders(1). Al naar gelang van het veronderstelde gehalte
aan retinol worden de produkten verdeeld in twee groepen.
Groep A: gehalten van minder dan 200000 IE/kg,
Groep B: gehalten gelijk aan of hoger dan 200000 IE/kg.
2.Principe
Het monster wordt in een oplossing van kaliumhydroxyde onder toevoeging
van ethanol, in aanwezigheid van een antioxydant of onder stikstofatmosfeer
warm gehydroliseerd. Het mengsel wordt geëxtraheerd met 1,2-dichloore-
thaan, het extract wordt tot droog ingedampt en opgenomen in
petroleumether. De aldus verkregen oplossing wordt gechromatografeerdaan
een kolom van aluminiumoxide (voor de produkten van groep B is de chro-
matografie slechts in bepaalde gevallen vereist). Het retinol wordt in
produkten die vallen onder groep A (na ontwikkelen van een gekleurd
complex volgens de Carr-Price reactie) fotometrisch bepaald bij 610 nm, in
producten van groep B spectrofotometrisch bij 325 nm.
3.Reagentia
a)voor de analyse van de produkten van groepen A en B
3.1. Ethanol 96 % (v/v)3.2. natriumascorbaatoplossing 10 % (g/v) p.a., of3.3. gezuiverde stikstof3.4. kaliumhydroxide-oplossing 50 % (g/v) p.a.
3.5. kaliumhydroxide-oplossing 1 N
3.6. kaliumhydroxide-oplossing 0,5 N3.7. 1,2-dichloorethaan p.a.3.8. petroleumether, kookpunt 30—35 ºC. Zuiver indien nodig de petro-
leumether op de volgende wijze: schud 1 000 ml petroleumether
zoveel maal met porties van 20 ml geconcentreerd zwavelzuur tot
het zuur kleurloos blijft. Verwijder het zuur en was achtereenvol-
gens de petroleumether eenmaal met 500 ml water, tweemaal met
250 ml natriumhydroxide-oplossing 10 % en driemaal met 500 ml
water. Verwijder de waterlaag, droog de petroleumether gedurende
een uur op actieve kool en watervrij natriumsulfaat, filtreer en
destilleer;
3.9. aluminiumoxide, gestandaardiseerd volgens Brockmann: verhit
gedurende 8 uur op 750 ºC, koel af in een exsiccator en bewaar in
een bruine fles met ingeslepen stop. Vóór het gebruik bij de chro-
matografie wordt als volgt bevochtigd: meng in een fles van bruin
glas 10 g aluminiumoxide met 0,7 ml water, sluit de fles herme-
tisch, verwarm gedurende 5 min. onder krachtig schudden in een
kokend waterbad, koel daarna af onder schudden. De activiteit van
het bereide aluminiumoxide wordt gecontroleerd door analyse
volgens 5.3 en 5.4 aan de hand van een bekende hoeveelheid reti-
nolstandaard (3.17);
3.10. basisch aluminiumoxide, activiteitsgraad I;
3.11. diethylether, zuiver. Verwijder peroxiden en sporen water door
chromatografie aan een kolom van basisch aluminiumoxide (3.10)
(25 g aluminiumoxide voor circa 250 ml diethylether);
3.12. oplossingen van diethylether (3.11) 4, 8, 12, 16 en 20 % (v/v) in
petroleumether (3.8);1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 9
(1) 1 IE = 0,3 µg retinol.
▼B
3.13. natriumsulfide-oplossing 0,5 M in glycerine 70 % (v/v) bereid op
basis van natriumsulfide p.a.
b)alleen voor de analyse van de produkten van groep A
3.14. benzeen p.a., kristalliseerbaar;
3.15. chloroform p.a. Verwijder ethanol, fosgeen en sporen water door
chromatograferen aan een kolom van basisch aluminiumoxide
(3.10) (50 g aluminiumoxide voor circa 200 ml chloroform; het
verdient aanbeveling de eerste 50 ml eluaat nogmaals over dezelfde
kolom te reinigen);
3.16. reagens volgens Carr-Price: schud ongeveer 25 g antimoniumtri-
chloride p.a. (te bewaren in exsiccator) met 100 ml chloroform
(3.15) totdat de oplossing verzadigd is. Een geringe neerslag van
antimoniumtrichloride is niet hinderlijk. Voeg toe 2 ml azijnzuuran-
hydride p.a. Bewaar in een bruine fles met ingeslepen stop in de
ijskast. Het reagens is gedurende meerdere weken houdbaar;
3.17. Retinol-standaard, spectrofotometrisch bepaald.
c)alleen voor de analyse van de produkten van groep B
3.18. Isopropanol, voor chromatografie.
4.Apparatuur
4.1. Waterbad4.2. Vacuumrotatieverdamper met ronde kolven van verschillende inhoud
4.3. Chromatografiebuizen van glas (lengte 300 mm, binnendoorsnede circa
13 mm)
4.4. Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte (van
kwarts van de metingen in het UV bereik)
4.5. UV-lamp, 365 nm.
5.Uitvoering
N.B.Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffus daglicht, even-
tueel in apparatuur van bruin glas.
5.1.Af te wegen hoeveelheid monster
Weeg, afhankelijk van het te verwachten gehalte aan vitamine A, van
het fijngemaakte monster een hoeveelheid af als volgt:
0,1 tot 1,0 g voor concentraten (gehalten boven 20000 IE/g);3,0 tot 5,0 g voor voormengsels (gehalten tussen 400 en 20000 IE/g);
10 tot 20 g voor minerale mengsels;
30 g voor de producten van groep A.Breng de afgewogen hoeveelheid direct over in een kolf met ingeslepen
stop.
5.2.Hydrolyse en extractie (
1)
Voeg achtereenvolgens toe 40 ml ethanol (3.1), 2 ml natriumascorbaat-
oplossing (3.2)(2) en 10 ml kaliumhydroxide-oplossing (3.4) en 2 ml
natriumsulfide-oplossing (3.13). Verwarm gedurende 30 min. bij
70—80 ºC onder terugvloeikoeling en koel vervolgens in stromend
water. Voeg toe 50 ml ethanol (3.1) en pipetteer hierbij 100 ml 1,2-
dichloorethaan (3.7). Schud krachtig en decanteer de bovenstaande
vloeistof in een scheitrechter. Voeg toe 150 ml kaliumhydroxide-oplos-
sing (3.5), schud gedurende 10 sec. Laat na scheiding der lagen de
dichloorethaanfase (onderlaag) in een scheitrechter af, voeg 40 ml
kaliumhydroxide-oplossing (3.6) toe, schud gedurende 10 sec. en wacht
tot de vloeistoffasen zich gescheiden hebben. Laat de dichloorethaanfase
in een scheitrechter af en was 6 tot 8 maal met steeds 40 ml water tot
alkali-vrij (tegen fenolftaleïen). Zonder de dichloorethaanfase af en
verwijder er de laatste sporen water uit met strookjes filtreerpapier.
Damp een aliquot deel van de dichloorethaan-oplossing onder vacuum1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 10
(1) Verdubbel voor kunstmelkpoeder of andere produkten die neiging vertonen tot klont-
vorming of zwelling, de hoeveelheden reagentia onder 5.2, eerste en tweede alinea.
(2) De toevoering van natriumascorbaat kan achterwege blijven wanneer de hydrolyse
plaats vindt onder stikstofatmosfeer.
▼B
op een waterbad van 40 ºC in tot droog. Neem het residu snel op in 5 ml
petroleumether (3.8).
Voor de produkten van groep A, chromatografeer als aangegeven onder
5.3.1.
Voor de produkten van groep B, breng de oplossing over in een maat-
kolf van 50 ml, vul aan met petroleumether (3.8) homogeniseer en meet
de extinctie volgens 5.4.2.
5.3.Chromatografie
5.3.1.Produkten van groep A
Vul een chromatografiebuis (4.3) tot een hoogte van 200 mm met
aluminiumoxide (3.9) dat vooraf is doordrenkt met petroleum-
ether (3.8). Breng de volgens 5.2 verkregen oplossing in de buis
en voeg onmiddellijk 20 ml petroleumether (3.8) toe. Elueer
achtereenvolgens met porties van 10 ml van de oplossingen 4, 8,
12, 16 en 20 % diethylether (3.12) in petroleumether. Regel de
druppelsnelheid tot 2 à 3 druppels per sec. door zwak vacuum of
overdruk toe te passen.
Bij de chromatografie wordt de caroteenfractie(1) het eerst geëlu-
eerd. De retinolfractie wordt in het algemeen geëlueerd door de
20 % diethylether-oplossing in petroleumether (3.12). De elutie
wordt in UV-licht gecontroleerd (korte belichting van de kolom
met behulp van een kwiklamp). De fluorescerende band van de
retinol is duidelijk gescheiden van de daaropvolgende geelge-
kleurde xantofylbanden. Vang de fractie van het eluaat die de
retinol bevat op in een erlenmeyer.
5.3.2.Produkten van de groep B
De chromatografie moet alleen worden uitgevoerd in het geval
dat de resultaten van de metingen van de extinctie volgens 5.4.2
niet beantwoorden aan het gestelde onder 5.4.2.
Indien het nodig blijkt te chromatograferen wordt een aliquot deel
van de onder 5.2 verkregen petroleumetheroplossing, dat ca.
500 IE retinol bevat op de chromatografiekolom gebracht. Het
chromatograferen gebeurt vervolgens als beschreven onder 5.3.1.
5.4.Meting van de extinctie
5.4.1.Produkten van groep A
Damp het onder 5.3.1 verkregen retinol-eluaat in tot droog onder
vacuum. Neem het residu op in 2 ml benzeen (3.14). Pipetteer
van deze oplossing 0,3 ml en voeg 3 ml van het reagens volgens
Carr-Price (3.16) toe. De kleur slaat om naar blauw. Meet de
extinctie van de vloeistof precies 30 sec. na het begin van de
reactie met behulp van de spectrofotometer bij 610 nm. Het
gehalte aan retinol wordt berekend aan de hand van een ijkkurve
die wordt opgesteld door benzeen-oplossingen met toenemende
concentraties van de retinol-standaard te behandelen met het
reagens volgens Carr-Price (2 tot 16 IE retinol-standaard (3.17)
per 0,3 ml benzeen (3.14) + 3 ml reagens volgens Carr-Price
(3.16)). De ijkkurve moet regelmatig en met korte tussenpozen
worden gecontroleerd met behulp van de standaard en van eenvers bereide oplossing van het reagens volgens Carr-Price.
5.4.2.Produkten van groep B
Pipetteer een aliquot deel van de oplossing in petroleumether,
verkregen volgens 5.2 dat ongeveer 200 IE retinol bevat. Damp
in tot droog onder vacuum en neem het residu op in 25 ml
isopropanol (3.18). Meet met behulp van de spectrofotometer de
extinctie bij 325, 310 en 334 nm. Het gehalte aan retinol van de
oplossing wordt berekend als volgt:
E
325· 18,30 = IE retinol/ml
De verhouding van de extincties
E310:E325en E334:E3251973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 11
(1) Het caroteengehalte kan worden bepaald door meting van de extinctie bij 450 nm;
E1%
1c m¼2600 :
▼B
moet echter bij benadering 6 : 7 = 0,857 zijn.
Indien een van deze verhoudingen aanmerkelijk afwijkt van deze
waarde (<0,830 of >0,880) dan moet de meting van de extincties
worden voorafgegaan door een chromatografie volgens de onder
5.3.2 aangegeven werkwijze. Indien uit de meting van de extinc-
ties na chromatograferen blijkt dat de bovengenoemde
verhoudingen nog steeds aanmerkelijk afwijken van de waarde
0,857 (<0,830 of >0,880) dan moet de bepaling worden uitge-
voerd volgens de werkwijze die is aangegeven voor de
produkten van groep A.
6.Berekening van de resultaten
Het gehalte aan retinol van het monster wordt berekend op grond van de
hoeveelheid afgewogen materiaal en van de verdunningen die in de loop
van de analyse zijn uitgevoerd. Het resultaat wordt uitgedrukt in IE retinol
per kg.
HerhaalbaarheidHet verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud aan hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan:
— 20 % relatief voor gehalten aan retinol beneden 75000 IE/kg,
— 15000 IE absoluut voor gehalten tussen 75000 en 150000 IE/kg,
— 10 % relatief voor gehalten tussen 150000 en 250000 IE/kg,— 25000 IE absoluut voor gehalten tussen 250 000 en 500000 IE/kg,— 5 % relatief voor gehalten boven 500 000 IE/kg.1973L0046 — NL — 13.08.1998 — 003.001 — 12
▼M3