02009R0152 — NL — 28.06.2022 — 008.001

Onderstaande tekst dient louter ter informatie en is juridisch niet bindend. De EU-instellingen zijn niet aansprakelijk voor de inhoud. Alleen de besluiten die zijn gepubliceerd in het Publicatieblad van de Europese Unie (te raadplegen in EUR-Lex) zijn authentiek. Deze officiële versies zijn rechtstreeks toegankelijk via de links in dit document

►B VERORDENING (EG) Nr. 152/2009 VAN DE COMMISSIE van 27 januari 2009 tot vaststelling van de bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (Voor de EER relevante tekst) (PB L 054 van 26.2.2009, blz. 1)

Gewijzigd bij:





Gerectificeerd bij:









▼B

VERORDENING (EG) Nr. 152/2009 VAN DE COMMISSIE

van 27 januari 2009

tot vaststelling van de bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders

(Voor de EER relevante tekst)







▼M3

Artikel 1

De bemonstering voor de officiële controle van diervoeders, met name in verband met de bepaling van de bestanddelen, met inbegrip van materiaal dat geheel of gedeeltelijk bestaat uit of is geproduceerd met genetisch gemodificeerde organismen (ggo’s), toevoegingsmiddelen voor diervoeding als omschreven in Verordening (EG) nr. 1831/2003 van het Europees Parlement en de Raad ( 1 ), en ongewenste stoffen als omschreven in Richtlijn 2002/32/EG van het Europees Parlement en de Raad ( 2 ), worden uitgevoerd volgens de methoden zoals beschreven in bijlage I.

De in bijlage I beschreven bemonsteringsmethoden zijn van toepassing op de controle van diervoeders in verband met de bepaling van bestrijdingsmiddelenresiduen zoals gedefinieerd in Verordening (EG) nr. 396/2005 van het Europees Parlement en de Raad ( 3 ) en de controle op de naleving van Verordening (EU) nr. 619/2011.

▼B

Artikel 2

Voor de voorbereiding van de monsters voor de analyse en de weergave van de resultaten worden de in bijlage II beschreven methoden gebruikt.

Artikel 3

De analyse voor de officiële controle van diervoeders wordt uitgevoerd met de methoden die worden beschreven in bijlage III (analysemethoden ter controle van de samenstelling van voedermiddelen en mengvoeders), bijlage IV (analysemethoden ter controle van het gehalte aan toegelaten toevoegingsmiddelen in diervoeders), bijlage V (analysemethoden voor de controle op ongewenste stoffen in diervoeders) en bijlage VI (analysemethoden voor de bepaling van bestanddelen van dierlijke oorsprong in het kader van de officiële controle van diervoeders).

Artikel 4

De energiewaarde van mengvoeders voor pluimvee wordt berekend overeenkomstig bijlage VII.

Artikel 5

De in bijlage VIII beschreven analysemethoden voor de controle op de illegale aanwezigheid van niet meer toegelaten toevoegingsmiddelen in diervoeders worden ter bevestiging gebruikt.

Artikel 6

De Richtlijnen 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG en 2003/126/EG worden ingetrokken.

Verwijzingen naar de ingetrokken richtlijnen gelden als verwijzingen naar deze verordening en worden gelezen volgens de concordantietabel in bijlage IX.

Artikel 7

Deze verordening treedt in werking op de twintigste dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Zij is van toepassing met ingang van 26 augustus 2009.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.

▼M3









BIJLAGE I

BEMONSTERINGSMETHODEN

1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

De monsters voor de officiële controle van diervoeders worden genomen volgens de hierna beschreven methoden. De aldus verkregen monsters worden representatief geacht voor de bemonsterde partijen.

Representatieve bemonstering heeft als doel een kleine fractie van een zending te verkrijgen op zodanige wijze dat de bepaling van een kenmerk van deze fractie representatief is voor de gemiddelde waarde van het kenmerk van de hele zending. De zending wordt bemonsterd door het herhaaldelijk nemen van basismonsters op verschillende afzonderlijke delen van de zending. Deze basismonsters worden door menging samengevoegd tot een verzamelmonster, waaruit de representatieve eindmonsters worden bereid door middel van representatieve verdeling.

Indien bij visuele inspectie blijkt dat delen van het te bemonsteren diervoeder in kwaliteit verschillen van de rest van het voeder van dezelfde zending, worden deze delen gescheiden van de rest van het voeder en behandeld als afzonderlijk deel van de zending. Indien het diervoeder niet kan worden gesplitst in afzonderlijke delen, wordt het diervoeder bemonsterd als één zending. In die gevallen moet dit worden vermeld in het monsternemingsverslag.

Wanneer van een volgens de bepalingen van deze verordening bemonsterd diervoeder wordt vastgesteld dat het niet aan de EU-voorschriften voldoet, en het tot een zending diervoeder van dezelfde klasse of omschrijving behoort, wordt aangenomen dat dit voor de hele zending geldt, tenzij uitvoerig onderzoek uitwijst dat er geen aanwijzingen zijn dat de rest van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet.

2. DEFINITIES

— Zending : een geïdentificeerde hoeveelheid diervoeder waarbij gemeenschappelijke kenmerken zijn vastgesteld, zoals herkomst, soort, type verpakking, verpakker, verzender of etikettering; en in het geval van een productieproces, een productie-eenheid van één enkel bedrijf dat bij de productie gebruikmaakt van uniforme parameters of een aantal van dergelijke eenheden, wanneer deze direct na elkaar wordt geproduceerd en samen wordt opgeslagen.

— Partij : een zending of een geïdentificeerd deel van de zending.

— Verzegeld monster : een monster dat zodanig is verzegeld dat het monster niet bereikbaar is zonder het zegel te verbreken of te verwijderen.

— Basismonster : een hoeveelheid die op een bepaald punt uit de partij is genomen.

— Verzamelmonster : het geheel van basismonsters van dezelfde partij.

— Deelmonster : een gedeelte van het verzamelmonster dat wordt verkregen door dat monster representatief te verkleinen.

— Eindmonster : een gedeelte van het deelmonster of van het gehomogeniseerde verzamelmonster.

— Laboratoriummonster : een monster dat voor het laboratorium bestemd is (zoals door het laboratorium ontvangen); dit kan het eindmonster, het deelmonster of het verzamelmonster zijn.

3. ALGEMENE BEPALINGEN

— Bemonsteraars: de monsters worden genomen door personen die daartoe door de bevoegde instantie zijn gemachtigd.

— Het monster wordt zodanig verzegeld dat het niet bereikbaar is zonder het zegel te verbreken of te verwijderen. Het merk van het zegel moet duidelijk herkenbaar en goed zichtbaar zijn. Een andere mogelijkheid is dat het monster wordt opgeslagen in een recipiënt die zodanig kan worden gesloten dat openen niet mogelijk is zonder de recipiënt onherstelbaar te beschadigen, zodat hergebruik ervan onmogelijk is.

— Identificatie van het monster: het monster wordt onuitwisbaar gemerkt en wordt zodanig geïdentificeerd dat er een ondubbelzinnige verwijzing naar het monsternemingsverslag wordt gemaakt.

— Uit elk verzamelmonster worden ten minste twee eindmonsters genomen: ten minste één voor controle (handhaving) en één voor de exploitant van het diervoederbedrijf (verhaal). Eventueel kan één eindmonster voor arbitragedoeleinden worden gebruikt. Indien het hele verzamelmonster wordt gehomogeniseerd, worden de eindmonsters uit het gehomogeniseerde verzamelmonster genomen, tenzij deze procedure in strijd is met de regelgeving van de lidstaat inzake de rechten van de exploitant van het diervoederbedrijf.

4. APPARATUUR

4.1. De bemonsteringsapparatuur moet zijn vervaardigd uit materiaal dat de te bemonsteren producten niet verontreinigt. Apparatuur die bedoeld is om meermaals te worden gebruikt, moet gemakkelijk schoon te maken zijn om kruiscontaminatie te voorkomen.

4.2. Aanbevolen apparatuur voor de bemonstering van vaste diervoeders 4.2.1. Handmatige bemonstering 4.2.1.1. Schop met platte bodem en verticale randen 4.2.1.2. Monsterboor met lange gleuf of met een in vakken ingedeelde gleuf. De afmetingen van de boor moeten zijn aangepast aan de eigenschappen van de partij (diepte van de verpakking, afmetingen van de zak enz.) en aan de grootte van de deeltjes waaruit het diervoeder is samengesteld. Ingeval de monsterboor verscheidene openingen heeft om te zorgen dat de steekproef op verschillende plaatsen langs de boor wordt genomen, moeten de openingen worden gescheiden door compartimenten of moeten de openingen gedraaid ten opzichte van elkaar zijn aangebracht. 4.2.2. Mechanische bemonstering Voor de bemonstering van diervoeders die in beweging zijn, mag gebruik worden gemaakt van geschikte mechanische apparaten. „Geschikt” wil zeggen dat ten minste de hele doorsnede van de stroom wordt bemonsterd. De bemonstering van diervoeders in beweging (op hoge stroomsnelheden) mag worden verricht door automatische monsternemers. 4.2.3. Monsterverdeler Indien mogelijk en dienstig, moet voor de bereiding van representatieve deelmonsters apparatuur worden gebruikt die is ontworpen om het monster in ongeveer gelijke delen te verdelen.

5. KWANTITATIEVE VEREISTEN WAT HET AANTAL BASISMONSTERS BETREFT

— De kwantitatieve vereisten in de punten 5.1 en 5.2 wat het aantal basismonsters betreft, zijn van toepassing op partijen van maximaal 500 ton die op representatieve wijze kunnen worden bemonsterd. De beschreven bemonsteringsprocedure geldt evenzeer voor grotere hoeveelheden dan de voorgeschreven maximale partijgrootte, mits het in de onderstaande tabellen vermelde maximumaantal basismonsters buiten beschouwing wordt gelaten; het aantal basismonsters wordt bepaald door de vierkantswortelformule in het desbetreffende gedeelte van de procedure (zie punt 5.3), waarbij de minimumgrootte van het verzamelmonster evenredig wordt verhoogd. Dit belet niet dat een grote zending wordt onderverdeeld in kleinere delen en elk deel wordt bemonsterd volgens de in de punten 5.1 en 5.2 omschreven procedure.

— De grootte van de partij moet zodanig zijn dat elk deel van deze partij kan worden bemonsterd.

— Voor zeer grote zendingen of delen daarvan (> 500 ton) en voor zendingen die op zodanige wijze worden vervoerd of opgeslagen dat een steekproef niet mogelijk is overeenkomstig de procedure van de punten 5.1 en 5.2 van dit hoofdstuk, is de bemonsteringsprocedure van punt 5.3 van toepassing.

— Indien de exploitant van een diervoederbedrijf wettelijk verplicht is deze verordening na te komen in het kader van een verplicht toezichtsysteem, mag hij of zij afwijken van de in dit hoofdstuk vastgestelde kwantitatieve vereisten om de operationele kenmerken in aanmerking te nemen, mits hij of zij ten genoegen van de bevoegde autoriteit heeft aangetoond dat de bemonsteringsprocedure even representatief is en na toestemming van de bevoegde autoriteit.

— In uitzonderlijke gevallen, als het niet mogelijk is de bemonsteringsmethode toe te passen wat de kwantitatieve vereisten betreft, omdat de partij onaanvaardbare economische schade zou oplopen (in verband met de vorm van de verpakking, vervoerswijze, manier van opslag enz.), mag een alternatieve bemonsteringmethode worden toegepast, mits die zo representatief mogelijk is en volledig wordt beschreven en gedocumenteerd.

5.1. Kwantitatieve vereisten wat betreft de basismonsters voor de controle van stoffen of producten die gelijkmatig in het voeder zijn verdeeld

5.1.1. Onverpakte vaste diervoeders







Grootte van de partij Minimumaantal basismonsters ≤ 2,5 ton 7 > 2,5 ton √20 maal het aantal ton waaruit de partij is samengesteld (*1), tot 40 basismonsters ( *1 ) Indien de uitkomst een gebroken getal is, moet dit getal op het eerstvolgende hogere gehele getal worden afgerond.

5.1.2. Onverpakte vloeibare diervoeders







Grootte van de partij Minimumaantal basismonsters ≤ 2,5 ton of ≤ 2 500 liter 4 (*1) > 2,5 ton of > 2 500 liter 7 (*1) ( *1 ) Wanneer de vloeistof niet homogeen kan worden gemaakt, moet het aantal basismonsters worden verhoogd.

5.1.3. Verpakte diervoeders

Diervoeders (vast en vloeibaar) kunnen worden verpakt in zakken, dozen, vaten enz. die in de tabel worden aangeduid als eenheden. Grote eenheden (≥ 500 kg of liter) moeten worden bemonsterd volgens de bepalingen voor onverpakte diervoeders (zie de punten 5.1.1 en 5.1.2).







Grootte van de partij Minimumaantal eenheden waarvan (ten minste) één basismonster moet worden genomen (*1) 1 à 20 stuks 1 eenheid (*2) 21 à 150 stuks 3 eenheden (*2) 151 à 400 stuks 5 eenheden (*2) > 400 stuks ¼ van de √aantal eenheden waaruit de partij is samengesteld (*3), tot 40 eenheden ( *1 ) Als het openen van een eenheid de analyse zouden kunnen beïnvloeden (bv. bederfelijke natte diervoeders) bestaat een basismonster uit de niet-geopende eenheid. ( *2 ) Voor eenheden met een inhoud van niet meer dan 1 kg of 1 liter, bestaat het basismonster uit de inhoud van één oorspronkelijke eenheid. ( *3 ) Indien de uitkomst een gebroken getal is, moet dit getal op het eerstvolgende hogere gehele getal worden afgerond.

5.1.4. Voederblokken en likstenen

Minimaal één te bemonsteren blok of liksteen per partij van 25 eenheden, tot maximaal vier blokken of likstenen.

Voor blokken of likstenen met een massa van niet meer dan 1 kg per stuk, bestaat het basismonster uit één blok of liksteen.

5.1.5. Ruwvoedergewassen/voedergewassen







Grootte van de partij Minimumaantal basismonsters (*1) ≤ 5 ton 5 > 5 ton √5 maal het aantal ton waaruit de partij is samengesteld (*2), tot maximaal 40 basismonsters ( *1 ) Erkend wordt dat in sommige gevallen (bv. kuilopslagplaatsen) de vereiste basismonsters niet kunnen worden genomen zonder dat de partij onaanvaardbaar wordt beschadigd. In die gevallen mag een alternatieve bemonstering worden toegepast; vóór de inwerkingtredingsdatum van deze verordening worden er richtsnoeren voor de bemonstering van dergelijke partijen opgesteld. ( *2 ) Indien de uitkomst een gebroken getal is, moet dit getal op het eerstvolgende hogere gehele getal worden afgerond.

5.2. Kwantitatieve vereisten betreffende de basismonsters voor de controle van bestanddelen of stoffen die waarschijnlijk ongelijkmatig in het voeder zijn verdeeld

Deze kwantitatieve vereisten inzake basismonsters moeten worden gebruikt in de volgende situaties:

— controle op aflatoxinen, moederkoren, andere mycotoxinen en schadelijke botanische onzuiverheden in voedermiddelen;

— controle op kruiscontaminatie door bestanddelen, inclusief genetisch gemodificeerd materiaal, of stoffen die waarschijnlijk niet gelijkmatig in het voedermiddel verdeeld zijn.

Ingeval de controlerende autoriteit een sterk vermoeden heeft dat er ook sprake is van een dergelijke ongelijkmatige verdeling in geval van kruiscontaminatie door een bestanddeel of een stof in een mengvoeder, mogen de in onderstaande tabel vastgestelde kwantitatieve vereisten worden toegepast.







Grootte van de partij Minimumaantal basismonsters < 80 ton Zie kwantitatieve vereisten in punt 5.1. Het aantal basismonsters dat moet worden genomen, moet worden vermenigvuldigd met de factor 2,5. ≥ 80 ton 100

5.3. Kwantitatieve vereisten betreffende de basismonsters in het geval van zeer grote zendingen

In het geval van grote partijen (partijen > 500 ton) is het aantal basismonsters dat moet worden genomen gelijk aan 40 basismonsters + √ton voor de controle van stoffen of producten die gelijkmatig in het diervoeder zijn verdeeld, of 100 basismonsters + √ton voor de controle van bestanddelen of stoffen die waarschijnlijk niet gelijkmatig in voedermiddelen verdeeld zijn.

6. KWANTITATIEVE VEREISTEN WAT HET VERZAMELMONSTER BETREFT







Per partij is één verzamelmonster vereist. Aard van het voeder Minimumgrootte van het verzamelmonster (*1) (*2) 6.1. Onverpakte diervoeders 4 kg 6.2. Verpakte diervoeders 4 kg (*3) 6.3. Vloeibare of halfvloeibare diervoeders 4 liter 6.4. Voederblokken en likstenen: 6.4.1. met een massa van meer dan 1 kg per stuk 4 kg 6.4.2. met een massa van niet meer dan 1 kg per stuk massa van vier oorspronkelijke blokken of likstenen 6.5. Ruwvoedergewassen/voedergewassen 4 kg (*4) ( *1 ) Indien het bemonsterde diervoeder een hoge waarde vertegenwoordigt, mag een kleinere hoeveelheid van het verzamelmonster worden genomen, mits dit wordt vermeld en gedocumenteerd in het monsternemingsverslag. ( *2 ) In overeenstemming met de bepalingen van Verordening (EU) nr. 619/2011 van de Commissie van 24 juni 2011 tot vaststelling van de bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders wat betreft de aanwezigheid van genetisch gemodificeerd materiaal waarvoor de vergunningsprocedure hangende is of waarvan de vergunning is verstreken (PB L 166 van 25.6.2011, blz. 9), moet het verzamelmonster voor de controle op de aanwezigheid van genetisch gemodificeerd materiaal minstens 35 000 granen/zaden bevatten. Dit houdt in dat de massa van het verzamelmonster voor maïs minstens 10,5 kg en voor sojabonen 7 kg moet bedragen. Voor andere zaden en granen zoals gerst, gierst, haver, rijst, rogge, tarwe en raapzaad komt een verzamelmonster van 4 kg overeen met meer dan 35 000 zaden. ( *3 ) In het geval van verpakte diervoeders, kan het ook onmogelijk zijn om voor het verzamelmonster de massa van 4 kg te bereiken, afhankelijk van de grootte van de individuele eenheden. ( *4 ) Als het gaat om ruwvoeder- of voedergewassen met een lage dichtheid (bv. hooi, stro), bedraagt de minimumgrootte van het verzamelmonster 1 kg.

7. KWANTITATIEVE VEREISTEN WAT DE EINDMONSTERS BETREFT

Eindmonsters

Er moet ten minste één eindmonster worden geanalyseerd. Het voor de analyse bestemde eindmonster omvat minimaal:







vaste diervoeders 500 g (*1) (*2) (*3) vloeibare of halfvloeibare diervoeders 500 ml (*1) ( *1 ) In overeenstemming met de bepalingen van Verordening (EU) nr. 619/2011 bevat het eindmonster voor de controle op de aanwezigheid van genetisch gemodificeerd materiaal ten minste 10 000 zaden/granen. Dit houdt in dat de grootte van het eindmonster voor maïs minstens 3 000 g en voor sojabonen 2 000 g moet bedragen. Voor andere zaden en granen zoals gerst, gierst, haver, rijst, rogge, tarwe en raapzaad, komt een verzamelmonster van 500 g overeen met meer dan 10 000 zaden. ( *2 ) Als de grootte van het verzamelmonster aanzienlijk minder dan 4 kg of liter bedraagt (zie de voetnoten in hoofdstuk 6), mag ook een kleinere hoeveelheid van het eindmonster worden genomen, mits dit wordt vermeld en gedocumenteerd in het monsternemingsverslag. ( *3 ) Voor bemonstering van peulvruchten, granen en noten voor de bepaling van bestrijdingsmiddelenresiduen bedraagt de minimumgrootte van het eindmonster 1 kg overeenkomstig de bepalingen van Richtlijn 2002/63/EG van de Commissie (PB L 187 van 16.7.2002, blz. 30).

8. BEMONSTERINGSMETHODE VOOR ZEER GROTE ZENDINGEN OF ZENDINGEN DIE WORDEN OPGESLAGEN OF VERVOERD OP EEN WIJZE DIE BEMONSTERING VAN DE HELE ZENDING ONMOGELIJK MAAKT

8.1. Algemene beginselen

Indien de wijze van vervoer of opslag het onmogelijk maakt om basismonsters van de hele zending te nemen, moet de bemonstering ervan bij voorkeur gebeuren wanneer de zending in beweging is.

Bij grote loodsen die bestemd zijn voor de opslag van diervoeders, moeten de exploitanten worden aangemoedigd om in de loods apparatuur te installeren die een (automatische) bemonstering van de hele opgeslagen zending mogelijk maakt.

Bij toepassing van de bemonsteringsprocedures als bedoeld in dit hoofdstuk 8, wordt de exploitant van het diervoederbedrijf of zijn vertegenwoordiger in kennis gesteld van de bemonsteringsprocedure. Als deze bemonsteringsmethode wordt betwist door de exploitant van het diervoederbedrijf of zijn vertegenwoordiger, stelt deze exploitant of zijn vertegenwoordiger de bevoegde autoriteit in staat de gehele zending te bemonsteren op zijn/haar kosten.

8.2. Grote zendingen die vervoerd worden per schip

8.2.1. Dynamische bemonstering van grote zendingen die vervoerd worden per schip

De bemonstering van grote zendingen in schepen wordt bij voorkeur uitgevoerd terwijl het product in beweging is (dynamische bemonstering).

De bemonstering wordt gedaan per ruim (eenheid die fysiek kan worden gescheiden). De ruimen worden echter een voor een gedeeltelijk gelost, zodat de oorspronkelijke fysieke scheiding na overbrenging in de opslaginstallaties niet meer bestaat. Daarom kan de bemonstering worden verricht naargelang van de eerste fysieke scheiding of afhankelijk van de scheiding na overbrenging in de opslaginstallaties.

Het lossen van een schip kan een aantal dagen in beslag nemen. Doorgaans moet de bemonstering worden verricht op gezette tijden tijdens de gehele duur van het lossen. Het is voor een officiële inspecteur echter niet altijd mogelijk of wenselijk om gedurende de gehele lossing aanwezig te zijn voor de bemonstering. Daarom is het toegestaan dat een deel (partij) van de gehele zending wordt bemonsterd. Het aantal basismonsters wordt bepaald aan de hand van de grootte van de partij.

Indien bij bemonstering van een deel van een zending diervoeder van dezelfde klasse of omschrijving is vastgesteld dat dat deel van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet, wordt aangenomen dat dit voor de hele zending geldt, tenzij na uitvoerig onderzoek is gebleken dat er geen bewijs is dat de rest van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet.

Zelfs als het officiële monster automatisch wordt genomen, is de aanwezigheid van een inspecteur noodzakelijk. In geval de automatische bemonstering gebeurt met vaste parameters die tijdens de bemonstering niet kunnen worden gewijzigd en de basismonsters worden verzameld in een gesloten recipiënt, waardoor iedere mogelijke fraude wordt uitgesloten, is de aanwezigheid van een inspecteur alleen verplicht bij het begin van de bemonstering, telkens wanneer de recipiënt van de monsters moet worden vervangen en aan het einde van de bemonstering.

8.2.2. Bemonstering van zendingen die vervoerd worden per schip door statische bemonstering

Indien de bemonstering op statische wijze gebeurt, moet dezelfde procedure als die voor van bovenaf toegankelijke opslaginstallaties (silo’s) worden toegepast (zie punt 8.4.1).

De bemonstering moet worden verricht op het (van boven) toegankelijke deel van de zending/het ruim). Het aantal basismonsters wordt bepaald aan de hand van de grootte van de partij. Indien bij bemonstering van een deel van een zending diervoeder van dezelfde klasse of omschrijving is vastgesteld dat dat deel van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet, wordt aangenomen dat dit voor de hele zending geldt, tenzij na uitvoerig onderzoek is gebleken dat er geen bewijs is dat de rest van de partij niet aan de EU-voorschriften voldoet.

8.3. Bemonstering van grote zendingen in loodsen

De bemonstering moet worden verricht op het toegankelijke deel van de zending. Het aantal basismonsters wordt bepaald aan de hand van de grootte van de partij. Indien bij bemonstering van een deel van een zending diervoeder van dezelfde klasse of omschrijving is vastgesteld dat dat deel van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet, wordt aangenomen dat dit voor de hele zending geldt, tenzij na uitvoerig onderzoek is gebleken dat er geen bewijs is dat de rest van de partij niet aan de EU-voorschriften voldoet.

8.4. Bemonstering van opslaginstallaties (silo’s)

8.4.1. Bemonstering van silo's die (gemakkelijk) van bovenaf toegankelijk zijn

De bemonstering moet worden verricht op het toegankelijke deel van de zending. Het aantal basismonsters wordt bepaald aan de hand van de grootte van de bemonsterde partij. Indien bij bemonstering van een deel van een zending diervoeder van dezelfde klasse of omschrijving is vastgesteld dat dat deel van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet, wordt aangenomen dat dit voor de hele zending geldt, tenzij na uitvoerig onderzoek is gebleken dat er geen bewijs is dat de rest van de partij niet aan de EU-voorschriften voldoet.

8.4.2. Bemonstering van silo’s die niet van bovenaf toegankelijk zijn (afgesloten silo’s)

8.4.2.1. Silo’s die niet van bovenaf toegankelijk zijn (afgesloten silo’s) met een capaciteit van > 100 ton

Diervoeders die in dergelijke silo’s zijn opgeslagen, kunnen niet statisch bemonsterd worden. Daarom moet, indien het diervoeder in de silo moet worden bemonsterd en er geen mogelijkheid is om de zending te verplaatsen, met de exploitant worden overeengekomen dat hij of zij de inspecteur meedeelt wanneer de silo worden gelost, zodat het diervoeder kan worden bemonsterd terwijl het in beweging is.

8.4.2.2. Silo’s die niet van bovenaf toegankelijk zijn (afgesloten silo’s) met een capaciteit van < 100 ton

De bemonsteringsprocedure bestaat uit het vullen van een recipiënt met 50 à 100 kg en de bemonstering ervan. De grootte van het verzamelmonster komt overeen met de hele zending en het aantal basismonsters staat in verhouding tot de hoeveelheid van de silo die in een recipiënt is gestort voor bemonstering. Indien bij bemonstering van een deel van een zending diervoeder van dezelfde klasse of omschrijving is vastgesteld dat dat deel van de zending niet aan de EU-voorschriften voldoet, wordt aangenomen dat dit voor de hele zending geldt, tenzij na uitvoerig onderzoek is gebleken dat er geen bewijs is dat de rest van de partij niet aan de EU-voorschriften voldoet.

8.5. Bemonstering van onverpakte diervoeders in grote gesloten containers

Dergelijke zendingen kunnen vaak alleen worden bemonsterd tijdens het lossen. In bepaalde gevallen is het niet mogelijk om te lossen op de plaats van invoer of controle en daarom moet de bemonstering plaatsvinden wanneer de containers worden gelost.

9. INSTRUCTIES BETREFFENDE DE BEMONSTERING EN DE BEREIDING EN VERPAKKING VAN DE MONSTERS

9.1. Algemeen

De monsters moeten zonder onnodig uitstel worden genomen en bereid, met inachtneming van de voorzorgsmaatregelen die vereist zijn om verandering of verontreiniging van het product te voorkomen. De bemonsteringsapparatuur alsmede de oppervlakken en recipiënten die bestemd zijn voor de monsters moeten schoon en droog zijn.

9.2. Basismonsters

De basismonsters moeten op willekeurige wijze uit de gehele partij worden genomen. De massa of het volume ervan moet ongeveer gelijk zijn.

De grootte van het basismonster bedraagt ten minste 100 g of 25 g in geval van ruwvoeder of voeder met een lage dichtheid.

Indien volgens de in hoofdstuk 8 vastgelegde voorschriften voor de bemonsteringprocedure minder dan 40 basismonsters moeten worden genomen, wordt de grootte van de basismonsters bepaald afhankelijk van de vereiste grootte van het verzamelmonster (zie hoofdstuk 6).

In geval van bemonstering van kleine zendingen van verpakte diervoeders waar volgens de kwantitatieve vereisten een beperkt aantal basismonsters moeten worden genomen, bestaat het basismonster uit de inhoud van één oorspronkelijke eenheid met een inhoud van niet meer dan 1 kg of 1 liter.

In geval van bemonstering van verpakte diervoeders die zijn samengesteld uit kleine eenheden (bijvoorbeeld < 250 g), hangt de grootte van het basismonster af van de grootte van de eenheid.

9.2.1. Onverpakte diervoeders

Eventueel kunnen de monsters worden genomen wanneer de partij in beweging wordt gebracht (laden of lossen).

9.2.2. Verpakte diervoeders

Nadat het vereiste aantal te bemonsteren eenheden genomen is, zoals in hoofdstuk 5 is aangegeven, wordt uit de inhoud van elke eenheid met een boor of een schop een gedeelte genomen. Eventueel worden de monsters genomen nadat de eenheden afzonderlijk zijn geledigd.

9.2.3. Vloeibare of halfvloeibare homogene of homogeniseerbare diervoeders

Nadat het vereiste aantal te bemonsteren eenheden gekozen is, zoals in hoofdstuk 5 is aangegeven, wordt uit elke eenheid een monster genomen nadat zo nodig de inhoud ervan gehomogeniseerd is.

De basismonsters kunnen eventueel worden genomen bij het aftappen van het product.

9.2.4. Vloeibare of halfvloeibare niet-homogeniseerbare diervoeders

Nadat het vereiste aantal te bemonsteren eenheden genomen is, zoals in hoofdstuk 5 is aangegeven, worden op verschillende niveaus monsters genomen.

De monsters mogen ook worden genomen bij het aftappen van het product, nadat de eerste fracties ervan zijn verwijderd.

In beide gevallen mag het totale volume van de monsters niet minder dan 10 liter bedragen.

9.2.5. Voederblokken en likstenen

Nadat het vereiste aantal te bemonsteren blokken of likstenen genomen is, zoals in hoofdstuk 5 is aangegeven, wordt een gedeelte van elk blok of elke liksteen genomen. Indien het vermoeden bestaat dat een blok of liksteen niet-homogeen is, kan het gehele blok of de hele steen als monster worden genomen.

Voor blokken of likstenen met een massa van niet meer dan 1 kg per stuk, bestaat het basismonster uit de inhoud van één blok of liksteen.

9.3. Bereiding van de verzamelmonsters

De basismonsters worden samengevoegd zodat één verzamelmonster wordt verkregen.

9.4. Bereiding van de eindmonsters

Elk verzamelmonster wordt zorgvuldig gemengd ( 4 ).

— Elk monster wordt in een daartoe geschikte recipiënt overgebracht. Alle nodige voorzorgen moeten worden genomen om elke wijziging in de samenstelling van het monster of elke verontreiniging of verandering die tijdens het vervoer of de opslag kan plaatsvinden, te voorkomen.

— Als bij de controle van bestanddelen of stoffen die gelijkmatig in het diervoeder verdeeld zijn, het verzamelmonster op representatieve wijze kan worden verkleind tot ten minste 2,0 kg of 2,0 liter (deelmonster) ( 5 ), bij voorkeur met behulp van een mechanische of automatische monsterverdeler. Voor de controle op de aanwezigheid van bestrijdingsmiddelenresiduen in peulvruchten, granen en noten bedraagt de minimumgrootte van het deelmonster 3 kg. Indien door de aard van het diervoeder geen monsterverdeler kan worden gebruikt of de verdeler is niet beschikbaar, mag het monster worden verkleind door kwarteren. Van de deelmonsters worden vervolgens de eindmonsters (voor controle-, verhaal- en arbitragedoeleinden) bereid met ongeveer dezelfde massa of hetzelfde volume dat overeenstemt met de kwantitatieve vereisten van hoofdstuk 7. In geval van controle van de bestanddelen, inclusief genetisch gemodificeerd materiaal of stoffen die waarschijnlijk niet gelijkmatig in voedermiddelen zijn verdeeld, wordt het verzamelmonster: — achteraf volledig gehomogeniseerd en verdeeld in eindmonsters, of — verkleind tot ten minste 2 kg of 2 liter ( 6 ) met een mechanische of automatische monsterverdeler. Alleen wanneer door de aard van het diervoeder geen monsterverdeler kan worden gebruikt, mag het monster worden verkleind door kwarteren. Voor de controle op de aanwezigheid van genetisch gemodificeerd materiaal in het kader van Verordening (EU) nr. 619/2011 omvat het deelmonster minimaal 35 000 zaden/granen om het mogelijk te maken om definitieve monsters voor controle-, verhaal- en arbitragedoeleinden van ten minste 10 000 zaden/granen te verkrijgen (zie voetnoot (**) in hoofdstuk 6 en voetnoot (*) in hoofdstuk 7).

9.5. Verpakking van de monsters

De recipiënten of verpakkingen moeten zodanig worden verzegeld en geëtiketteerd dat het onmogelijk is deze te openen zonder het zegel te beschadigen. Het hele etiket moet deel uitmaken van het zegel.

9.6. Verzending van de monsters naar het laboratorium

Het monster wordt zonder onnodig uitstel verzonden aan het aangewezen analyselaboratorium, samen met de voor de analist noodzakelijke gegevens.

10. MONSTERNEMINGSVERSLAG

Voor elk monster wordt een verslag opgesteld aan de hand waarvan de bemonsterde partij en de grootte ervan op ondubbelzinnige wijze kan worden geïdentificeerd.

In het verslag moet tevens melding worden gemaakt van elke afwijking van de bemonsteringsprocedure zoals voorgeschreven in deze verordening.

Het verslag wordt niet alleen ter beschikking gesteld aan het officiële controlelaboratorium, maar ook aan de exploitant van het diervoederbedrijf en/of het door de exploitant van het diervoederbedrijf aangewezen laboratorium.









BIJLAGE II

ALGEMENE BEPALINGEN BETREFFENDE ANALYSEMETHODEN VOOR DIERVOEDERS

A. BEREIDING VAN MONSTERS VOOR ANALYSE

1. Doel

De hieronder beschreven werkwijzen hebben betrekking op het voor de analyse gereedmaken van de naar de controlelaboratoria gezonden monsters nadat de bemonstering overeenkomstig bijlage I heeft plaatsgevonden.

Deze laboratoriummonsters worden zodanig bereid dat de voor de uitvoering van de analysemethoden afgewogen hoeveelheden homogeen zijn en representatief voor de eindmonsters.

2. Voorzorgsmaatregelen

De voor de monsterbereiding te volgen werkwijze hangt af van de te gebruiken analysemethoden en de bestanddelen of stoffen die gecontroleerd moeten worden. Het is daarom van groot belang dat ervoor wordt gezorgd dat de voor de monsterbereiding gevolgde werkwijze geschikt is voor de gebruikte analysemethode en voor de bestanddelen of stoffen die gecontroleerd moeten worden.

Alle noodzakelijke bewerkingen moeten zodanig worden uitgevoerd dat verontreiniging van het monster en verandering in de samenstelling ervan zo veel mogelijk worden vermeden.

Het malen, mengen en zeven moet zonder uitstel gebeuren onder zo gering mogelijke blootstelling van het monster aan lucht en licht. Vermijd het gebruik van maaltoestellen die het monster aanmerkelijk kunnen verwarmen.

Voor diervoeders die bijzonder gevoelig zijn voor warmte wordt malen met de hand aanbevolen. Ook moet ervoor gezorgd worden dat het maaltoestel zelf niet de oorzaak van verontreiniging vormt.

Als de monsterbereiding niet mogelijk is zonder dat het vochtgehalte van het monster daardoor sterk verandert, moet het vochtgehalte vóór en na de bereiding worden bepaald volgens de methode van deel A van bijlage III.

3. Werkwijze

3.1. Algemene werkwijze

Het aliquot wordt genomen uit het eindmonster. Kwarteren wordt niet aanbevolen, omdat dit tot grote fouten in de aliquots kan leiden.

3.1.1. Diervoeders die als zodanig gemalen kunnen worden

— Meng het gezeefde eindmonster en doe het in een geschikt schoon en droog vat, dat voorzien is van een luchtdichte stop. Meng nogmaals met het oog op volledige homogenisering, vlak voor het afwegen van de hoeveelheid voor analyse (aliquot).

3.1.2. Diervoeders die na drogen gemalen kunnen worden

— Droog het eindmonster, tenzij in de analysemethoden anders is aangegeven, zo ver dat het vochtgehalte tot 8-12 % is teruggebracht, overeenkomstig de voordroogmethode zoals beschreven in de in punt 4.3 van deel A van bijlage III opgenomen vochtbepalingsmethode. Ga dan verder te werk als in punt 3.1.1.

3.1.3. Vloeibare of halfvloeibare diervoeders

— Verzamel het eindmonster in een geschikt schoon en droog vat, dat voorzien is van een luchtdichte stop. Meng zorgvuldig met het oog op volledige homogenisering, vlak voor het afwegen van de hoeveelheid voor analyse (aliquot).

3.1.4. Andere diervoeders

— Monsters die niet volgens een van de bovenstaande methoden kunnen worden bereid, moeten worden behandeld volgens een andere werkwijze, die zodanig is dat in ieder geval de voor de analyse afgewogen hoeveelheden (aliquots) homogeen zijn en representatief voor de eindmonsters.

3.2. Specifieke werkwijze voor onderzoek door visuele inspectie of met de microscoop of in gevallen waarin het hele verzamelmonster wordt gehomogeniseerd

— Bij een onderzoek door visuele inspectie (zonder gebruikmaking van een microscoop) wordt het hele laboratoriummonster gebruikt voor het onderzoek.

— In geval van microscopisch onderzoek mag het laboratorium het verzamelmonster verkleinen of het deelmonster verder verkleinen. De eindmonsters voor verhaal- en arbitragedoeleinden worden genomen volgens een procedure die gelijkwaardig is aan de gevolgde procedure voor het eindmonster voor controledoeleinden.

— Indien het hele verzamelmonster wordt gehomogeniseerd, worden de eindmonsters genomen van het gehomogeniseerde verzamelmonster.

4. Bewaren van monsters

De monsters worden bewaard bij een temperatuur die hun samenstelling niet beïnvloedt. Monsters die bestemd zijn voor de analyse van vitaminen of stoffen die bijzonder lichtgevoelig zijn, worden zodanig bewaard dat de zij niet worden aangetast door licht.

B. BEPALINGEN BETREFFENDE IN DE ANALYSEMETHODEN GEBRUIKTE REAGENTIA EN APPARATUUR

1. Tenzij in de analysemethoden anders is aangegeven, moeten alle voor de analyse gebruikte reagentia analytisch zuiver zijn (p.a.). Bij het bepalen van sporenelementen moet de zuiverheid van de reagentia gecontroleerd worden door een blancoproef. Afhankelijk van de verkregen uitkomst kan verdergaande zuivering van de reagentia nodig zijn.

2. Elke in de analysemethoden genoemde handeling waar het gaat om bereiding van oplossingen, verdunning, spoelen of wassen, zonder dat de aard van het gebruikte oplosmiddel is aangegeven, houdt in dat water moet worden gebruikt. Als algemene regel geldt dat water moet zijn gedemineraliseerd of gedestilleerd. In bepaalde gevallen, die in de analysemethoden nader worden aangegeven, moet het een speciale zuiveringsbehandeling hebben ondergaan.

3. Van de standaardapparatuur die normaal in de controlelaboratoria aanwezig is, worden alleen speciale instrumenten en toestellen of apparatuur waaraan bijzondere eisen zijn gesteld in de analysemethoden vermeld. Deze moeten schoon zijn, vooral wanneer het gaat om de bepaling van kleine hoeveelheden stof.

C. TOEPASSING VAN ANALYSEMETHODEN EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

1. Extractieprocedure

In verscheidene methoden wordt een specifieke extractieprocedure genoemd. In de regel mogen ook andere extractieprocedures worden gebruikt, mits bewezen is dat de gevolgde procedure voor de geanalyseerde matrix hetzelfde extractierendement heeft als de in de methode genoemde procedure.

2. Clean-upprocedure

In verscheidene methoden wordt een specifieke clean-upprocedure genoemd. In de regel mogen ook andere clean-upprocedures worden gebruikt, mits bewezen is dat de gevolgde procedure voor de geanalyseerde matrix dezelfde analyseresultaten geeft als de in de methode genoemde procedure.

3. Aantal bepalingen

Als bij de analyse op ongewenste stoffen het resultaat van de eerste bepaling significant (> 50 %) onder de te controleren specificatie ligt, zijn verdere bepalingen niet nodig, mits adequate kwaliteitszorgprocedures zijn gevolgd. In andere gevallen is de duplobepaling (tweede bepaling) noodzakelijk om de mogelijkheid van interne kruiscontaminatie of een onbedoelde verwisseling van monsters uit te sluiten. Het gemiddelde van de twee bepalingen, waarbij de meetonzekerheid in aanmerking wordt genomen, wordt gebruikt voor de controle op de naleving.

Als bij de controle van het opgegeven gehalte van een stof of ingrediënt de uitslag van de eerste bepaling het opgegeven gehalte bevestigt, d.w.z. de uitslag ligt binnen de tolerantiegrenzen voor het opgegeven gehalte, zijn verdere bepalingen niet nodig, mits adequate kwaliteitszorgprocedures zijn gevolgd. In andere gevallen is de duplobepaling (tweede bepaling) noodzakelijk om de mogelijkheid van interne kruiscontaminatie of een onbedoelde verwisseling van monsters uit te sluiten. Het gemiddelde van de twee bepalingen, waarbij de meetonzekerheid in aanmerking wordt genomen, wordt gebruikt voor de controle op de naleving.

In sommige gevallen zijn deze tolerantiegrenzen in wetgeving vastgelegd, bijvoorbeeld in Verordening (EG) nr. 767/2009 van het Europees Parlement en de Raad van 13 juli 2009 betreffende het in de handel brengen en het gebruik van diervoeders, tot wijziging van Verordening (EG) nr. 1831/2003 van het Europees Parlement en de Raad en tot intrekking van Richtlijn 79/373/EEG van de Raad, Richtlijn 80/511/EEG van de Commissie, Richtlijnen 82/471/EEG, 83/228/EEG, 93/74/EEG, 93/113/EG en 96/25/EG van de Raad en Beschikking 2004/217/EG van de Commissie ( 7 ).

4. Vermelding van de gebruikte analysemethode

In het analyseverslag wordt de gebruikte analysemethode vermeld.

5. Weergave van het analyseresultaat

Het analyseresultaat moet worden opgegeven op de in de analysemethode vastgelegde wijze, met een passend aantal significante cijfers en waarbij zo nodig rekening wordt gehouden met het vochtgehalte van het eindmonster voor de behandeling.

6. Meetonzekerheid en terugvindingspercentage bij de analyse van ongewenste stoffen

Voor ongewenste stoffen in de zin van Richtlijn 2002/32/EG wordt een product dat bedoeld is voor het voederen van dieren als niet in overeenstemming met het vastgestelde maximumgehalte beschouwd indien het resultaat van de analyse — herleid tot voeder met een vochtgehalte van 12 % — dat maximumgehalte overschrijdt, met inachtneming van de uitgebreide meetonzekerheid en de correctie voor terugvinding. Aan de hand van de gemeten concentratie, gecorrigeerd voor terugvinding en na aftrek van de uitgebreide meetonzekerheid, wordt nagegaan of aan het maximumgehalte wordt voldaan. Deze werkwijze geldt alleen als de meetonzekerheid en de correctie voor terugvinding voor de gebruikte analysemethode kunnen worden bepaald (dus bijvoorbeeld niet voor microscopisch onderzoek).

Het analyseresultaat wordt als volgt weergegeven (voor zover de meetonzekerheid en het terugvindingspercentage voor de gebruikte analysemethode kunnen worden bepaald):

a) gecorrigeerd voor de terugvinding, waarbij het terugvindingspercentage moet worden vermeld. De correctie voor terugvinding is niet nodig bij terugvindingspercentages tussen 90 en 110 %;

b) als „x ± U”, waarbij x het analyseresultaat is en U de uitgebreide meetonzekerheid, met een dekkingsfactor 2, zodat een betrouwbaarheidsniveau van ongeveer 95 % wordt verkregen.

Als het analyseresultaat echter significant (> 50 %) onder de te controleren specificatie ligt, mag het analyseresultaat zonder correctie voor terugvinding worden opgegeven en mag de vermelding van het terugvindingspercentage en de meetonzekerheid achterwege blijven, mits adequate kwaliteitszorgprocedures zijn gevolgd en de analyse alleen tot doel heeft na te gaan of aan de wettelijke bepalingen is voldaan.

▼B









BIJLAGE III

ANALYSEMETHODEN TER CONTROLE VAN DE SAMENSTELLING VAN VOEDERMIDDELEN EN MENGVOEDERS

A. BEPALING VAN VOCHT

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vocht in diervoeders. Er wordt op gewezen dat in het geval van diervoeders die vluchtige stoffen, zoals organische zuren, bevatten bij de bepaling van het vochtgehalte ook een aanzienlijke hoeveelheid vluchtige stoffen wordt gemeten.

Dit voorschrift heeft geen betrekking op de analyse van melkproducten als voedermiddelen, van minerale stoffen en mengsels die overwegend uit mineralen bestaan, van dierlijke en plantaardige vetten en van oliehoudende zaden en vruchten.

2. Beginsel

Het monster wordt gedroogd onder bepaalde omstandigheden, die afhankelijk zijn van de aard van het diervoeder. Het massaverlies wordt door weging bepaald. Vaste diervoeders met een hoog vochtgehalte moeten eerst worden voorgedroogd.

3. Apparatuur

3.1. Molen van een materiaal dat geen vocht absorbeert, die gemakkelijk te reinigen is en waarmee snel en gelijkmatig kan worden gemalen zonder noemenswaardig warmte op te wekken, die zo goed mogelijk kan worden afgesloten van de buitenlucht en voldoet aan de eisen genoemd onder 4.1.1 en 4.1.2 (bv. microkruisslagmolens, micromolens met waterkoeling, demonteerbare kogelmolens, langzaam lopende kogelmolens en molens met getande schijven).

3.2. Analytische balans, nauwkeurigheid 1 mg.

3.3. Droogschalen van roestbestendig metaal of van glas voorzien van een luchtdicht afsluitend deksel en met een zodanig nuttig oppervlak dat het monster kan worden uitgespreid tot ongeveer 0,3 g/cm2.

3.4. Elektrische droogstoof met thermostaat (± 2 oC), waarmee de temperatuur snel kan worden geregeld en die goed ventileert ( 8 ).

3.5. Elektrische vacuümdroogstoof met oliepomp, voorzien van een inrichting voor toevoer van gedroogde, warme lucht of voorzien van een droogmiddel (bv. calciumoxide).

3.6. Exsiccator met dikke, geperforeerde plaat van metaal of porselein en met een effectief droogmiddel.

4. Werkwijze

NB : De in dit hoofdstuk beschreven handelingen moeten direct na het openen van de verpakking van de monsters worden uitgevoerd. De analyses moeten ten minste in duplo worden uitgevoerd.

4.1. Voorbereiding

4.1.1. Diervoeders met uitzondering van de onder 4.1.2 en 4.1.3 genoemde

Neem ten minste 50 g van het monster. Maak dit, zo nodig, op passende wijze fijn, zodanig dat veranderingen in het vochtgehalte worden voorkomen (zie 6).

4.1.2. Granen en grutten

Neem ten minste 50 g van het monster. Maal dit tot deeltjes van zodanige grootte dat ten minste 50 % ervan door een zeef van 0,5 mm gaat en dat niet meer dan 10 % blijft liggen op een zeef met ronde mazen van 1 mm.

4.1.3. Vloeibare of brijachtige diervoeders; diervoeders die in hoofdzaak bestaan uit vet

Neem ongeveer 25 g monster, tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, voeg een passende hoeveelheid watervrij zand toe, tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, en meng tot een homogeen product is verkregen.

4.2. Drogen

4.2.1. Diervoeders met uitzondering van de onder 4.2.2 en 4.2.3 genoemde

Weeg een droogschaal (3.3) met deksel tot op 1 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde droogschaal en spreid gelijkmatig uit. Plaats de droogschaal zonder deksel in een vooraf op 103 oC gebrachte droogstoof. Om te voorkomen dat de temperatuur te veel daalt, dient de droogschaal zo snel mogelijk in de droogstoof gebracht te worden. Laat gedurende 4 uur drogen, gerekend vanaf het tijdstip dat de stoof weer op een temperatuur van 103 oC is. Sluit na het openen van de stoof de droogschaal met het deksel, neem hem uit de stoof, laat gedurende 30-45 minuten afkoelen in de exsiccator (3.6) en weeg tot op 1 mg nauwkeurig.

Monsters die in hoofdzaak bestaan uit vet, worden nog eens gedurende 30 minuten bij 103 oC in de stoof gedroogd. Het verschil tussen de resultaten van beide wegingen mag niet meer bedragen dan 0,1 % vocht.

4.2.2. Graan, meel, grutten en gries

Weeg een droogschaal (3.3) met deksel tot op 0,5 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het fijngemaakte monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde droogschaal en spreid gelijkmatig uit. Plaats de droogschaal zonder deksel in een vooraf op 130 oC gebrachte droogstoof. Om te voorkomen dat de temperatuur te veel daalt, dient de droogschaal zo snel mogelijk in de droogstoof gebracht te worden. Laat gedurende 2 uur drogen, gerekend vanaf het tijdstip dat de stoof weer op een temperatuur van 130 oC is. Sluit na het openen van de stoof de droogschaal met het deksel, neem hem uit de stoof, laat gedurende 30-45 minuten afkoelen in de exsiccator (3.6) en weeg tot op 1 mg nauwkeurig.

4.2.3. Mengvoeders met een gehalte aan sacharose of lactose van meer dan 4 %: voedermiddelen als johannesbrood, gehydrolyseerde graanproducten, moutkiemen, suikerbietensnijdsels, visperssap en suikersap, en mengvoeders met meer dan 25 % minerale zouten met kristalwater.

Weeg een droogschaal (3.3) met deksel tot op 0,5 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde droogschaal en spreid gelijkmatig uit. Plaats de droogschaal zonder deksel in de vooraf op 80-85 oC gebrachte vacuümdroogstoof (3.5). Om te voorkomen dat de temperatuur te veel daalt, dient de droogschaal zo snel mogelijk in de droogstoof gebracht te worden.

Stel de druk in op 10 cm kwik en droog het monster gedurende 4 uur bij deze druk, hetzij onder toevoer van droge, warme lucht, hetzij met behulp van een droogmiddel (ongeveer 300 g voor 20 monsters). In het laatste geval wordt bij het bereiken van de voorgeschreven druk de verbinding met de vacuümpomp verbroken. Reken de droogtijd vanaf het tijdstip dat de droogstoof weer op een temperatuur van 80-85 oC is. Laat na het beëindigen van de droogtijd de druk in de stoof voorzichtig weer komen op die van de buitenlucht. Sluit na het openen van de vacuümdroogstoof de droogschaal met het deksel, neem hem uit de stoof, laat gedurende 30-45 minuten afkoelen in de exsiccator (3.6) en weeg vervolgens tot op 1 mg nauwkeurig. Droog nogmaals gedurende 30 minuten onder vacuüm in de stoof bij 80-85 oC en weeg opnieuw. Het verschil tussen de resultaten van beide wegingen mag niet meer bedragen dan 0,1 % vocht.

4.3. Voordrogen

4.3.1. Diervoeders met uitzondering van de onder 4.3.2 genoemde

Vaste diervoeders met een hoog gehalte aan vocht, die moeilijk fijn te maken zijn, worden als volgt voorgedroogd:

Breng 50 g van het ongemalen monster (geperste diervoeders of diervoeders in brokken zo nodig grof breken), tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, in een geschikte recipiënt (bv. een schaal van aluminium van 20 bij 12 cm met een rand van 0,5 cm). Droog in een stoof bij een temperatuur van 60-70 oC, totdat het vochtgehalte is teruggebracht tot een waarde tussen 8 % en 12 %. Neem de recipiënt uit de droogstoof en laat onafgedekt gedurende 1 uur afkoelen in het laboratorium; weeg vervolgens tot op 10 mg nauwkeurig. Maak het monster onmiddellijk daarna fijn als beschreven onder 4.1.1 en droog, al naargelang de aard van het monster, als beschreven onder 4.2.1 of 4.2.3.

4.3.2. Granen

Granen met een vochtgehalte van meer dan 17 % moeten als volgt worden voorgedroogd:

Breng 50 g van het ongemalen graan, tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, in een geschikte recipiënt (bv. een schaal van aluminium van 20 bij 12 cm met een rand van 0,5 cm). Droog in een stoof gedurende 5-7 minuten bij een temperatuur van 130 oC. Neem de recipiënt uit de droogstoof en laat onafgedekt gedurende 2 uur afkoelen in het laboratorium; weeg vervolgens tot op 10 mg nauwkeurig. Maak onmiddellijk daarna fijn als beschreven onder 4.1.2 en droog als beschreven onder 4.2.2.

5. Berekening van de resultaten

Het vochtgehalte van het monster in procent (X) wordt weergegeven door de volgende formules:

5.1. Drogen zonder voordrogen

waarbij:

m = oorspronkelijke massa van het monster (in g);

m0 = massa van het gedroogde monster (in g).

5.2. Drogen zonder voordrogen

waarbij:

m = oorspronkelijke massa van het monster (in g);

m1 = massa van het monster na voordrogen (in g);

m2 = massa van het monster na fijnmaken (in g);

m0 = massa van het gedroogde monster (in g).

5.3. Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan 0,2 % absoluut.

6. Waarneming

Indien het monster fijngemaakt moet worden en dit een verandering van het vochtgehalte van het product ten gevolge heeft, dienen de analyseresultaten die betrekking hebben op de bestanddelen van het diervoeder, omgerekend te worden naar het vochtgehalte van het oorspronkelijke monster.

B. BEPALING VAN VOCHT IN DIERLIJKE EN PLANTAARDIGE VETTEN EN OLIËN

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vocht, water en andere vluchtige stoffen in dierlijke en plantaardige vetten en oliën.

2. Beginsel

Het monster wordt bij 103 oC gedroogd tot constante massa (het massaverlies tussen twee opeenvolgende wegingen mag niet meer dan 1 mg zijn). Het massaverlies wordt door weging bepaald.

3. Apparatuur

3.1. Schaal met vlakke bodem, van corrosiebestendig materiaal, diameter 8-9 cm, hoogte circa 3 cm.

3.2. Thermometer met een versterkt reservoir en een expansieruimte, gekalibreerd van ongeveer 80 oC tot ten minste 110 oC, lengte circa 10 cm.

3.3. Zandbad of elektrische verwarmingsplaat.

3.4. Exsiccator met een effectief droogmiddel.

3.5. Analytische balans.

4. Werkwijze

Breng ongeveer 20 g van het gehomogeniseerde monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de droge, getarreerde schaal (3.1) met de thermometer (3.2). Verhit onder voortdurend roeren met de thermometer op het zandbad of op de verwarmingsplaat (3.3) zodanig dat na ongeveer 7 minuten een temperatuur van 90 oC bereikt wordt.

Verminder de toevoer van warmte overeenkomstig de frequentie waarmee gasbellen van de bodem van de schaal opstijgen. De temperatuur mag niet hoger komen dan 105 oC. Roer onder voortdurend schrapen over de bodem van de schaal tot de belvorming ophoudt.

Verwarm nog enkele malen tot 103 ± 2 oC om er zeker van te zijn dat al het vocht uitgedreven wordt; laat tussen twee opeenvolgende verhittingen afkoelen tot 93 oC. Laat vervolgens in de exsiccator (3.4) afkoelen tot kamertemperatuur en weeg. Herhaal deze procedure totdat het massaverlies tussen twee opeenvolgende wegingen niet meer bedraagt dan 2 mg.

NB : Een massatoename van het monster na herhaalde verwarming duidt op oxidatie van het vet. Gebruik in dat geval bij de berekening het resultaat van de weging die vlak voor de massatoename gedaan werd.

5. Berekening van de resultaten

Het vochtgehalte van het monster in procent (X) volgt uit de volgende formule:

waarbij:

m = massa van het analysemonster (in g);

m1 = massa van de schaal met inhoud voor verhitting (in g);

m2 = massa van de schaal met inhoud na verhitting (in g);

Resultaten beneden 0,05 % moeten aangegeven worden als „minder dan 0,05 %”.

Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan 0,05 % absoluut.

C. BEPALING VAN HET GEHALTE AAN RUW EIWIT

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan ruw eiwit in diervoeders aan de hand van het stikstofgehalte, bepaald volgens de kjeldahlmethode.

2. Beginsel

Het monster wordt ontsloten met zwavelzuur in aanwezigheid van een katalysator. De zure oplossing wordt met een oplossing van natriumhydroxide basisch gemaakt. De ammoniak wordt afgedestilleerd en opgevangen in een bekende hoeveelheid zwavelzuur, waarvan de overmaat met een standaardoplossing natriumhydroxide wordt getitreerd.

Ook kan de vrijgekomen ammoniak in een overmaat boorzuur worden geleid, waarna met zoutzuur of zwavelzuur wordt getitreerd.

3. Reagentia

3.1. Kaliumsulfaat.

3.2. Katalysator: koper(II)oxide (CuO) of koper(II)sulfaat-pentahydraat (CuSO4·5H2O).

3.3. Zinkkorrels.

3.4. Zwavelzuur, ρ 20 = 1,84 g/ml.

3.5. Zwavelzuur, gesteld, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Zwavelzuur, gesteld, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Zwavelzuur, gesteld, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Methylroodindicator: los 300 mg methylrood op in 100 ml ethanol, σ = 95-96 % (V/V).

3.9. Natriumhydroxideoplossing (mag technisch zuiver zijn), β = 40 g/100 ml (m/V: 40 %).

3.10. Natriumhydroxide, gestelde oplossing, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Natriumhydroxide, gestelde oplossing, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Puimsteenkorrels, met zoutzuur gewassen en gegloeid.

3.13. Aceetanilide (smeltpunt 114 oC, N-gehalte 10,36 %).

3.14. Sacharose (vrij van stikstof).

3.15. Boorzuur (H3BO3).

3.16. Methylroodindicatoroplossing: los 100 mg methylrood op in 100 ml ethanol of methanol.

3.17. Broomkresolgroenoplossing: los 100 mg broomkresolgroen op in 100 ml ethanol of methanol.

3.18. Boorzuuroplossing (10-40 g/l, afhankelijk van de gebruikte apparatuur).

Bij colorimetrische eindpuntsbepaling moeten de methylrood- en broomkresolgroenindicator aan de boorzuuroplossingen worden toegevoegd. Bij de bereiding van 1 liter boorzuur wordt, voordat het volume wordt aangevuld, 7 ml methylroodindicatoroplossing (3.16) en 10 ml broomkresolgroenoplossing (3.17) toegevoegd.

De pH van de boorzuuroplossing kan afhankelijk van het gebruikte water van keer tot keer verschillen. Vaak moet een kleine hoeveelheid base worden toegevoegd om een positieve blanco te verkrijgen.

NB : Toevoeging van 3-4 ml NaOH (3.11) aan 1 liter boorzuuroplossing van 10 g/l geeft doorgaans goede resultaten. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur in het donker en afgeschermd tegen bronnen van ammoniakdamp.

3.19. Zoutzuur, gesteld, c(HCl) = 0,10 mol/l.

NB: Andere gestelde oplossingen (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 en 3.19) mogen worden gebruikt, mits hiervoor in de berekeningen wordt gecorrigeerd. De concentraties moeten altijd tot op vier decimalen worden uitgedrukt.

4. Apparatuur

Apparatuur, geschikt voor het uitvoeren van ontsluiting, destillatie en titratie volgens Kjeldahl.

5. Werkwijze

5.1. Ontsluiting

Weeg 1 g van het monster tot op 0,001 g nauwkeurig af en breng dit in de recipiënt van de ontsluitingsapparatuur. Voeg hieraan toe 15 g kaliumsulfaat (3.1), een geschikte hoeveelheid katalysator (3.2) (0,3 -0,4 g koper(II)oxide of 0,9 -1,2 g koper(II)sulfaat-pentahydraat), 25 ml zwavelzuur (3.4) en zo nodig een paar puimsteenkorrels (3.12); meng het geheel.

Verwarm de recipiënt eerst zacht, zo nodig onder af en toe zwenken, totdat de massa is verkoold en het schuim is verdwenen; verhit vervolgens krachtiger tot de vloeistof regelmatig kookt. Er is voldoende verhit wanneer het kokende zuur tegen de wand van de recipiënt condenseert. Zorg ervoor dat de wand niet oververhit raakt en dat er geen organische stof aan de wand gaat vastzitten.

Kook nog twee uur nadat de oplossing helder en lichtgroen geworden is; laat vervolgens afkoelen.

5.2. Destillatie

Voeg genoeg water toe om de sulfaten volledig op te lossen. Laat afkoelen; voeg zo nodig enkele zinkkorrels (3.3) toe. Volg de procedure van punt 5.2.1 of 5.2.2.

5.2.1. Destillatie met opvang in zwavelzuur

Breng in de opvangkolf van de destillatieapparatuur een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid van 25 ml zwavelzuur (3.5 of 3.7), afhankelijk van het verwachte stikstofgehalte. Voeg enkele druppels methylroodindicator (3.8) toe.

Verbind de ontsluitingsrecipiënt met de koeler van het destillatieapparaat en zorg ervoor dat het uiteinde van de koelbuis zich ten minste 1 cm onder het vloeistofoppervlak in de opvangkolf bevindt (zie opmerking 8.3). Giet langzaam 100 ml natriumhydroxideoplossing (3.9) in de ontsluitingsrecipiënt, zonder ammoniakverlies (zie opmerking 8.1). Verwarm de recipiënt totdat alle ammoniak overgedestilleerd is.

5.2.2. Destillatie met opvang in boorzuur

Volg de hierna beschreven procedure als het ammoniakgehalte van het destillaat met de hand bepaald wordt. Volg de gebruiksaanwijzing van de destillatieapparatuur als deze volledig geautomatiseerd is, inclusief bepaling van het ammoniakgehalte van het destillaat.

Plaats een opvangkolf met 25-30 ml boorzuuroplossing (3.18) aan het uiteinde van de koeler, zodanig dat het uiteinde zich onder het vloeistofoppervlak van de oplossing met overmaat boorzuur bevindt. Stel het destillatieapparaat in op een afgifte van 50 ml natriumhydroxideoplossing (3.9). Stel het destillatieapparaat in werking volgens de gebruiksaanwijzing en destilleer de door het toevoegen van de natriumhydroxideoplossing vrijkomende ammoniak af. Vang het destillaat op in de boorzuuroplossing. De hoeveelheid destillaat (duur van de stoomdestillatie) hangt af van de hoeveelheid stikstof in het monster. Volg de gebruiksaanwijzing.

NB : Bij een halfautomatisch destillatieapparaat verlopen de toevoeging van overmaat natriumhydroxide en de stoomdestillatie automatisch.

5.3. Titratie

Volg de procedure van punt 5.3.1 of 5.3.2.

5.3.1. Zwavelzuur

Titreer de overmaat zwavelzuur in de opvangkolf terug met natriumhydroxideoplossing (3.10 of 3.11, afhankelijk van de concentratie van het gebruikte zwavelzuur), totdat het eindpunt is bereikt.

5.3.2. Boorzuur

Titreer de inhoud van de opvangkolf met een buret met het gestelde zoutzuur (3.19) of zwavelzuur (3.6) en lees af hoeveel titrant gebruikt is.

Bij colorimetrische eindpuntsbepaling is het eindpunt bij het eerste spoor van roze kleur in de vloeistof. Lees de buret met een nauwkeurigheid van 0,05 ml af. Een magneetroerder met verlichting of een fotometrische detector kan helpen bij de bepaling van het eindpunt.

Bij gebruik van een stoomdestillatieapparaat met automatische titratie gebeurt dit automatisch.

Volg de gebruiksaanwijzing voor het gebruikte destillatieapparaat (al dan niet met titrator).

NB : Bij gebruik van een automatisch titratiesysteem begint de titratie onmiddellijk na de destillatie en wordt de 1 %-boorzuuroplossing (3.18) gebruikt. Bij een volledig automatisch destillatieapparaat kan de automatische titratie van de ammoniak ook worden uitgevoerd met eindpuntsbepaling met een potentiometrisch pH-systeem. In dat geval wordt een automatische titrator met pH-meter gebruikt. De pH-meter moet door middel van gangbare ijkmethoden naar behoren geijkt zijn in het pH-gebied tussen 4 en 7. Het eindpunt van de titratie, het steilste punt in de titratiecurve (buigpunt) ligt bij pH 4,6 .

5.4. Blancobepaling

Om te bevestigen dat de reagentia vrij van stikstof zijn, wordt een blancobepaling (ontsluiting, destillatie en titratie) uitgevoerd met 1 g sacharose (3.14) in plaats van het monster.

6. Berekening van de resultaten

De berekeningen worden uitgevoerd zoals aangegeven in punt 6.1 of 6.2.

6.1. Berekening voor titratie als beschreven in punt 5.3.1

Het gehalte aan ruw eiwit, uitgedrukt als massapercentage, wordt berekend met de volgende formule:

waarbij:

V0 = het volume (in ml) NaOH (3.10 of 3.11) dat in de blancobepaling is gebruikt;

V1 = het volume (in ml) NaOH (3.10 of 3.11) dat in de titratie van het monster is gebruikt;

c = de concentratie (in mol/l) natriumhydroxide (3.10 of 3.11);

m = de massa (in g) van het monster.

6.2. Berekening voor titratie als beschreven in punt 5.3.2

6.2.1. Titratie met zoutzuur

Het gehalte aan ruw eiwit, uitgedrukt als massapercentage, wordt berekend met de volgende formule:

waarbij:

m = de massa (in g) van het monster;

c = de concentratie (in mol/l) van het gestelde zoutzuur (3.19);

V0 = het volume (in ml) zoutzuur dat in de blancobepaling is gebruikt;

V1 = het volume (in ml) zoutzuur dat in de monsterbepaling is gebruikt.

6.2.2. Titratie met zwavelzuur

Het gehalte aan ruw eiwit, uitgedrukt als massapercentage, wordt berekend met de volgende formule:

waarbij:

m = de massa (in g) van het analysemonster;

c = de concentratie (in mol/l) van het gestelde zwavelzuur (3.6);

V0 = het volume (in ml) zwavelzuur (3.6) dat voor de blancobepaling is gebruikt;

V1 = het volume (in ml) zwavelzuur (3.6) dat voor de monsterbepaling is gebruikt.

7. Verificatie van de methode

7.1. Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan:

— 0,2 % absoluut voor ruweiwitgehalten van minder dan 20 %,

— 1,0 % van het hoogste resultaat voor ruweiwitgehalten van 20 % tot 40 %,

— 0,4 % absoluut voor ruweiwitgehalten van meer dan 40 %.

7.2. Nauwkeurigheid

Voer de bepaling (ontsluiting, destillatie en titratie) uit op 1,5 -2,0 g aceetanilide (3.13) in aanwezigheid van 1 g sacharose (3.14); 1 g aceetanilide verbruikt 14,80 ml zwavelzuur (3.5). Er moet ten minste 99 % worden teruggevonden.

8. Opmerkingen

8.1. De apparatuur kan tot het manuele, halfautomatische of automatische type behoren. Indien de ontsluitingsvloeistof tussen ontsluiting en destillatie overgebracht moet worden, mag er geen verlies optreden. Indien de recipiënt van de destillatieapparatuur niet voorzien is van een druppeltrechter, moet de natriumhydroxideoplossing langzaam langs de wand toegevoegd worden, onmiddellijk voordat de recipiënt met de koeler wordt verbonden.

8.2. Herhaal de bepaling met een grotere hoeveelheid zwavelzuur (3.4) dan hierboven vermeld, wanneer het materiaal tijdens het ontsluiten vast wordt.

8.3. Voor producten met een laag stikstofgehalte kan het volume zwavelzuur (3.7) dat in de opvangkolf wordt gebracht zo nodig worden verminderd tot 10 of 15 ml en met water tot 25 ml worden aangevuld.

8.4. Voor routineanalyse mogen andere analysemethoden worden gebruikt om het ruweiwitgehalte te bepalen, maar de in dit deel C beschreven kjeldahlmethode is de referentiemethode. Voor elke matrix afzonderlijk moet worden aangetoond dat met de alternatieve methode (bv. Dumas) dezelfde resultaten worden verkregen als met de referentiemethode. Aangezien de met de alternatieve methode verkregen resultaten ook na verificatie van de gelijkwaardigheid van beide methoden enigszins kunnen afwijken van de met de referentiemethode verkregen resultaten, moet in het analyseverslag worden vermeld welke methode voor de bepaling van het ruweiwitgehalte gebruikt is.

D. BEPALING VAN UREUM

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan ureum in diervoeders.

2. Beginsel

Het monster wordt onder toevoeging van een klaringsmiddel in water gesuspendeerd. De suspensie wordt gefiltreerd. In het filtraat wordt na toevoegen van 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) het gehalte aan ureum bepaald door meting van de extinctie bij een golflengte van 420 mm.

3. Reagentia

3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydoplossing: los 1,6 g 4-DMAB op in 100 ml ethanol 96 % en voeg 10 ml zoutzuur (ρ20 = 1,19 g/ml) toe. Het reagens is slechts twee weken houdbaar.

3.2. Carrez I-oplossing: los 21,9 g zinkacetaat, Zn(CH3COO)2·2H2O, en 3 g ijsazijn op in water. Vul met water aan tot 100 ml.

3.3. Carrez II-oplossing: los 10,6 g kaliumhexacyanoferraat(II), K4Fe(CN)6·3H2O, op in water. Vul met water aan tot 100 ml.

3.4. Actieve kool die geen ureum adsorbeert (controleer dit).

3.5. Ureum, oplossing van 0,1 % (m/V).

4. Apparatuur

4.1. Roteerapparaat met ongeveer 35-40 omwentelingen per minuut.

4.2. Reageerbuizen: 160 × 16 mm, met geslepen stop.

4.3. Spectrofotometer.

5. Werkwijze

5.1. Analyse van het monster

Breng 2 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, en 1 g actieve kool (3.4) in een maatkolf van 500 ml. Voeg 400 ml water en 5 ml Carrez I-oplossing (3.2) toe, meng gedurende ongeveer 30 seconden en voeg 5 ml Carrez II-oplossing (3.3) toe. Laat gedurende 30 minuten mengen in het roteerapparaat. Vul vervolgens met water aan tot de streep, schud en filtreer.

Pipetteer van het heldere en kleurloze filtraat 5 ml in een reageerbuis met geslepen stop, voeg 5 ml 4-DMAB-oplossing (3.1) toe en meng. Plaats de buis in een waterbad op 20 oC (± 4 oC). Meet na 15 minuten met de spectrofotometer de extinctie van de monsteroplossing bij 420 nm. Vergelijk het resultaat met de blanco-oplossing van de reagentia.

5.2. IJkgrafiek

Breng in maatkolven van 100 ml resp. 1, 2, 4, 5 en 10 ml ureumoplossing (3.5), vul aan tot de streep met water (en meng). Pipetteer van elk van deze oplossingen 5 ml af, voeg hieraan telkens 5 ml 4-DMAB-oplossing (3.1) toe en meng. Meet de extinctie tegen een oplossing die 5 ml 4-DMAB en 5 ml water, vrij van ureum, bevat, zoals hierboven aangegeven. Stel een ijkgrafiek op.

6. Berekening van de resultaten

Bepaal aan de hand van de ijkgrafiek de hoeveelheid ureum in het monster.

Druk het resultaat uit als percentage van het monster.

7. Opmerkingen

7.1. Indien het gehalte aan ureum meer bedraagt dan 3 % wordt het monster teruggebracht tot 1 g, of het filtraat zodanig verdund dat in 500 ml niet meer dan 50 mg ureum aanwezig is.

7.2. Bij lage gehalten aan ureum moet meer analysemateriaal afgewogen worden, zo lang een helder en kleurloos filtraat wordt verkregen.

7.3. Indien het monster eenvoudige stikstofverbindingen bevat, zoals aminozuren, wordt de extinctie bij 435 nm gemeten.

E. BEPALING VAN VLUCHTIGE STIKSTOFHOUDENDE BASEN

I. DOOR MICRODIFFUSIE

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vluchtige stikstofhoudende basen, uitgedrukt als ammoniak, in diervoeders.

2. Beginsel

Het monster wordt met water geëxtraheerd, de oplossing geklaard en gefiltreerd. De vluchtige stikstofhoudende basen worden met een kaliumcarbonaatoplossing door microdiffusie uitgedreven, in een boorzuuroplossing opgevangen en met zwavelzuur getitreerd.

3. Reagentia

3.1. Trichloorazijnzuur, oplossing van 20 % (m/V).

3.2. Indicator: los 33 mg broomkresolgroen en 65 mg methylrood op in 100 ml ethanol 95-96 % (V/V).

3.3. Boorzuuroplossing: los 10 g boorzuur op in 200 ml ethanol 95-96 % (V/V) en 700 ml water in een maatkolf van 1 liter. Voeg 10 ml indicator (3.2) toe. Meng en neutraliseer de oplossing zo nodig met natriumhydroxideoplossing tot zwak rood. 1 ml van deze oplossing kan maximaal 300 μg NH3 binden.

3.4. Verzadigde oplossing van kaliumcarbonaat: los 100 g kaliumcarbonaat op in 100 ml kokend water. Laat afkoelen en filtreer.

3.5. Zwavelzuur 0,01 mol/l.

4. Apparatuur

4.1. Roteerapparaat met ongeveer 35-40 omwentelingen per minuut.

4.2. Conwayschalen (zie figuur) van glas of kunststof.

4.3. Microburet, verdeeld tot in 1/100 ml.

5. Werkwijze

Breng 10 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, met 100 ml water in een maatkolf van 200 ml en laat gedurende 30 minuten roteren. Voeg 50 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.1) toe, vul aan tot de streep met water, schud krachtig en filtreer door een vouwfilter.

Pipetteer in het midden van de conwayschaal 1 ml boorzuuroplossing (3.3) en in de buitenring 1 ml filtraat van het monster. Sluit de schaal gedeeltelijk met het ingevette deksel. Breng dan snel in de buitenring 1 ml verzadigde kaliumcarbonaatoplossing (3.4) en sluit de schaal luchtdicht af. Manipuleer vervolgens voorzichtig met de schaal zodanig, dat de beide oplossingen in de buitenring gemengd worden. Laat dan ten minste gedurende 4 uur staan bij kamertemperatuur of gedurende 1 uur bij 40 oC.

Titreer vervolgens de vluchtige basen in de boorzuuroplossing met zwavelzuur (3.5) met behulp van een microburet (4.3).

Verricht op gelijke wijze een blancobepaling zonder analysemateriaal.

6. Berekening van de resultaten

1 ml H2SO40,01 mol/l komt overeen met 0,34 mg ammoniak.

Druk het resultaat uit als percentage van het monster.

Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan:

— 10 % relatief bij gehalten aan ammoniak van minder dan 1,0 %;

— 0,1 % absoluut bij gehalten aan ammoniak van 1,0 % of meer.

7. Opmerking

Indien het gehalte aan ammoniak in het monster meer bedraagt dan 0,6 % wordt het oorspronkelijke filtraat verdund.

II. DOOR DESTILLATIE

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vluchtige stikstofhoudende basen, uitgedrukt als ammoniak, in vismelen die vrijwel geen ureum bevatten. De methode is alleen toepasbaar indien het gehalte aan ammoniak minder bedraagt dan 0,25 %.

2. Beginsel

Het monster wordt met water geëxtraheerd, de oplossing geklaard en gefiltreerd. Na toevoegen van magnesiumoxide worden de vluchtige stikstofhoudende basen bij kooktemperatuur uitgedreven en opgevangen in een bekende hoeveelheid zwavelzuur. De overmaat zuur wordt teruggetitreerd met natriumhydroxideoplossing.

3. Reagentia

3.1. Trichloorazijnzuur, oplossing van 20 % (m/V).

3.2. Magnesiumoxide.

3.3. Antischuimemulsie (bv. siliconen).

3.4. Zwavelzuur 0,05 mol/l.

3.5. Natriumhydroxideoplossing 0,1 mol/l.

3.6. Methylroodoplossing 0,3 % in ethanol 95-96 % (V/V).

4. Apparatuur

4.1. Roteerapparaat met ongeveer 35-40 omwentelingen per minuut.

4.2. Destillatieapparatuur volgens Kjeldahl.

5. Werkwijze

Breng 10 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, met 100 ml water in een maatkolf van 200 ml en laat gedurende 30 minuten roteren. Voeg 50 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.1) toe, vul aan tot de streep met water, schud krachtig en filtreer door een vouwfilter.

Breng van het heldere filtraat een bepaalde hoeveelheid — afhankelijk van het te verwachten gehalte aan vluchtige stikstofhoudende basen (in het algemeen 100 ml) — in de destillatiekolf. Verdun tot 200 ml en voeg 2 g magnesiumoxide (3.2) en enkele druppels antischuimemulsie (3.3) toe. De oplossing moet basisch reageren t.o.v. lakmoespapier; indien dit niet het geval is, moet meer magnesiumoxide (3.2) toegevoegd worden. Volg de in punt 5.2 of 5.3 beschreven methode voor het bepalen van het ruweiwitgehalte (deel C van deze bijlage).

Verricht op gelijke wijze een blancobepaling zonder analysemateriaal.

6. Berekening van de resultaten

1 ml H2SO40,05 mol/l komt overeen met 1,7 mg ammoniak.

Druk het resultaat uit als percentage van het monster.

Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.

F. BEPALING VAN AMINOZUREN (MET UITZONDERING VAN TRYPTOFAAN)

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van de vrije (synthetische en natuurlijke) aminozuren en de totale hoeveelheid (vrije en in peptiden gebonden) aminozuren in diervoeders, waarbij gebruik wordt gemaakt van een aminozuuranalysator. De methode kan worden gebruikt voor bepaling van de volgende aminozuren: cysteïne/cystine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, asparaginezuur, glutaminezuur, glycine, histidine, isoleucine, leucine, fenylalanine, proline, serine, tyrosine en valine.

Deze methode maakt geen onderscheid tussen het aminozuur zelf en de zouten ervan, en kan niet differentiëren tussen de D- en L-vorm van aminozuren. De methode kan niet worden gebruikt voor de bepaling van tryptofaan of van hydroxyanalogen van aminozuren.

2. Beginsel

2.1. Vrije aminozuren

De vrije aminozuren worden met verdund zoutzuur geëxtraheerd. Stikstofhoudende macromoleculen die meekomen bij de extractie worden geprecipiteerd met sulfosalicylzuur en door filtratie verwijderd. De pH van de gefiltreerde oplossing wordt op 2,20 gebracht. De aminozuren worden gescheiden door ionenwisselingschromatografie, en na reactie met ninhydrine bepaald door fotometrische detectie bij 570 nm.

2.2. Totaal aminozuurgehalte

De gekozen werkwijze is afhankelijk van de te onderzoeken aminozuren. Cysteïne/cystine en methionine moeten vóór hydrolyse tot resp. cysteïnezuur en methioninesulfon worden geoxideerd. Tyrosine moet worden bepaald in hydrolysaten van niet-geoxideerde monsters. Alle andere aminozuren die in punt 1 zijn genoemd kunnen zowel in geoxideerde als in niet-geoxideerde monsters worden bepaald.

De oxidatie wordt uitgevoerd bij 0 oC met een mengsel van permierenzuur en fenol. Overmaat oxidatiemiddel wordt ontleed met dinatriumdisulfiet. Het geoxideerde of niet-geoxideerde monster wordt gedurende 23 uur gehydrolyseerd met zoutzuur (3.20). De pH van het hydrolysaat wordt op 2,20 gebracht. De aminozuren worden door ionenwisselingschromatografie van elkaar gescheiden en worden bepaald door reactie met ninhydrine gevolgd door fotometrische detectie bij 570 nm (440 nm voor proline).

3. Reagentia

Er moet dubbel gedestilleerd water of water van vergelijkbare kwaliteit worden gebruikt (geleidbaarheid < 10 μS).

3.1. Waterstofperoxide, w = 30 % (m/m).

3.2. Mierenzuur, w = 98-100 % (m/m).

3.3. Fenol.

3.4. Dinatriumdisulfiet.

3.5. Natriumhydroxide.

3.6. 5-Sulfosalicylzuur-dihydraat.

3.7. Zoutzuur, d = 1,18 g/ml (ongeveer).

3.8. Trinatriumcitraat-dihydraat.

3.9. 2,2 ′-Thiodiethanol (thiodiglycol).

3.10. Natriumchloride.

3.11. Ninhydrine.

3.12. Petroleumether, kooktraject 40-60 oC.

3.13. Norleucine, of een andere verbinding die kan dienen als interne standaard.

3.14. Stikstofgas (< 10 ppm zuurstof).

3.15. Octaan-1-ol.

3.16. Aminozuren.

3.16.1. Standaardverbindingen als genoemd in punt 1. Zuivere verbindingen, zonder kristalwater. Vóór gebruik gedurende een week drogen in vacuüm boven P2O5 of H2SO4.

3.16.2. Cysteïnezuur.

3.16.3. Methioninesulfon.

3.17. Natriumhydroxideoplossing, c = 7,5 mol/l:

Los 300 g NaOH (3.5) op in water en vul aan tot 1 liter.

3.18. Natriumhydroxideoplossing, c = 1 mol/l:

Los 40 g NaOH (3.5) op in water en vul aan tot 1 liter.

3.19. Mierenzuur-fenoloplossing:

Meng 889 g mierenzuur (3.2) met 111 g water en voeg 4,73 g fenol (3.3) toe.

3.20. Hydrolysemengsel, c = 6 mol HCl/l met 1 g fenol/l:

Voeg 1 g fenol (3.3) toe aan 492 ml HCl (3.7) en vul aan met water tot 1 liter.

3.21. Extractiemengsel, c = 0,1 mol HCl/l met 2 % thiodiglycol: neem 8,2 ml HCl (3.7), meng met circa 900 ml water, voeg 20 ml thiodiglycol (3.9) toe en vul aan met water tot 1 liter (meng 3.7 en 3.9 niet direct).

3.22. 5-Sulfosalicylzuuroplossing, β = 6 %:

Los 60 g 5-sulfosalicylzuur (3.6) op in water en vul aan met water tot 1 liter.

3.23. Oxidatiemengsel (permierenzuur-fenol):

Meng in een klein bekerglas 0,5 ml waterstofperoxide (3.1) met 4,5 ml mierenzuur-fenoloplossing (3.19). Incubeer gedurende 1 uur bij 20-30 oC zodat er permierenzuur wordt gevormd, en koel vervolgens in een ijsbad met smeltend ijs (15 minuten) voordat de vloeistof aan het monster wordt toegevoegd.

Voorzichtig: vermijd aanraking met de huid en draag beschermende kleding.

3.24. Citraatbuffer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :

Los 19,61 g natriumcitraat (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g fenol (3.3) en 16,50 ml HCl (3.7) op in ongeveer 800 ml water. Breng de pH op 2,20 . Vul aan met water tot 1 liter.

3.25. Elutiebuffers, bereid overeenkomstig de voorschriften voor de gebruikte analysator (4.9).

3.26. Ninhydrinereagens, bereid overeenkomstig de voorschriften voor de gebruikte analysator (4.9).

3.27. Standaardaminozuuroplossingen. Deze oplossingen moeten worden bewaard bij een temperatuur van minder dan 5 oC.

3.27.1. Stamoplossing van aminozuren (3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml van elk aminozuur in zoutzuur.

Commercieel verkrijgbaar.

3.27.2. Stamoplossing van cysteïnezuur en methioninesulfon, c = 1,25 μmol/ml.

Los 0,2115 g cysteïnezuur (3.16.2) en 0,2265 g methioninesulfon (3.16.3) op in citraatbuffer (3.24) in een maatkolf van 1 liter, en vul aan tot de streep met citraatbuffer. Bewaar, niet langer dan twaalf maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC. Deze oplossing wordt niet gebruikt wanneer de stamoplossing (3.27.1) cysteïnezuur en methioninesulfon bevat.

3.27.3. Stamoplossing van de interne standaard, bv. norleucine, c = 20 μmol/ml.

Los 0,6560 g norleucine (3.13) op in citraatbuffer (3.24) in een maatkolf van 250 ml en vul aan tot de streep met citraatbuffer. Bewaar, niet langer dan zes maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC.

3.27.4. Standaardaminozuurijkoplossing voor gebruik bij hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl cysteïnezuur en methioninesulfon, en c = 10 nmol/50 μl van de andere aminozuren. Los 2,2 g natriumchloride (3.10) op in een 100 ml bekerglas met 30 ml citraatbuffer (3.24). Voeg 4,00 ml stamoplossing van aminozuren (3.27.1) toe, 4,00 ml stamoplossing van cysteïnezuur en methioninesulfon (3.27.2), en — indien van toepassing — 0,50 ml stamoplossing van de interne standaard (3.27.3). Breng de pH met natriumhydroxideoplossing (3.18) op 2,20 .

Breng kwantitatief over in een maatkolf van 50 ml, vul aan tot de streep met citraatbuffer (3.24) en meng.

Bewaar, niet langer dan drie maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC.

Zie ook de opmerkingen in punt 9.1.

3.27.5. Standaardaminozuurijkoplossing voor gebruik bij hydrolysaten, bereid volgens punt 5.3.3.1, en voor gebruik bij extracten (5.2). De ijkoplossing wordt bereid als beschreven in 3.27.4, met weglating van natriumchloride.

Bewaar, niet langer dan drie maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC.

4. Apparatuur

4.1. Rondbodemkolf, 100 of 250 ml, met terugvloeikoeler.

4.2. Fles van borosilicaatglas, 100 ml, met schroefdop voorzien van rubber/teflon inlay (bv. Duran, Schott) voor gebruik in de oven.

4.3. Oven met geforceerde ventilatie en temperatuurregulering, nauwkeuriger dan ± 2 oC.

4.4. pH-meter (in drie decimalen afleesbaar).

4.5. Membraanfilter, 0,22 μm.

4.6. Centrifuge.

4.7. Rotatieverdamper.

4.8. Schudapparaat of magneetroerder.

4.9. Aminozuuranalysator of HPLC-apparatuur met ionenwisselingskolom, onderdeel voor de ninhydrinereactie, nakolomsderivatisering en fotometrische detector.

De kolom wordt gevuld met gesulfoneerd polystyreenhars waarop aminozuren van elkaar en van ander ninhydrinepositief materiaal worden gescheiden. Het debiet van buffer en ninhydrine wordt gereguleerd door pompen met een nauwkeurigheid van ±0,5 %, zowel tijdens de standaardijking als tijdens de analyse van het monster.

Bij sommige aminozuuranalysatoren kunnen hydrolysemethoden worden gebruikt waarbij het hydrolysaat een natriumconcentratie heeft van c = 0,8 mol/l, terwijl ook al het uit de oxidatiestap overgebleven mierenzuur nog aanwezig is. Andere analysatoren geven geen goede scheiding van bepaalde aminozuren in hydrolysaten met een overmaat mierenzuur en/of een hoge natriumconcentratie. In zulke gevallen wordt het volume zuur gereduceerd door verdamping tot ongeveer 5 ml na hydrolyse en vóór instelling van de juiste pH. De verdamping gebeurt onder vacuüm bij ten hoogste 40 oC.

5. Werkwijze

5.1. Monstervoorbereiding

Het monster wordt gemalen tot de deeltjes een zeef met een maaswijdte van 0,5 mm passeren. Monsters met een hoog vochtgehalte moeten voor het malen eerst worden gevriesdroogd, of aan de lucht gedroogd bij ten hoogste 50 oC. Monsters met een hoog vetgehalte moeten voor het malen worden geëxtraheerd met petroleumether (3.12).

5.2. Bepaling van vrije aminozuren in diervoeders en voormengsels

Weeg een geschikte hoeveelheid (1-5 g) van het voorbewerkte monster (5.1) op 0,2 mg nauwkeurig af in een erlenmeyer en voeg 100,0 ml extractiemengsel (3.21) toe. Schud of roer het mengsel gedurende 60 minuten in een schudapparaat of met een magneetroerder (4.8). Laat het neerslag bezinken en pipetteer 10,0 ml van de bovenstaande vloeistof in een bekerglas van 100 ml.

Voeg onder aanhoudend roeren 5,0 ml sulfosalicylzuuroplossing (3.22) toe, en roer nog 5 minuten door op de magneetroerder. Filtreer of centrifugeer de bovenstaande vloeistof om eventueel aanwezig neerslag te verwijderen. Breng 10,0 ml van de verkregen oplossing in een bekerglas van 100 ml op pH 2,20 met natriumhydroxideoplossing (3.18), spoel de oplossing met citraatbuffer (3.24) in een maatkolf van geschikt volume, en vul aan tot de streep met bufferoplossing (3.24).

Voeg, als er een interne standaard wordt gebruikt, 1,00 ml interne standaard (3.27.3) toe per 100 ml eindoplossing en vul aan tot de streep met bufferoplossing (3.24).

Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4.

Als chromatografie van de extracten niet dezelfde dag mogelijk is, moeten zij worden bewaard bij een temperatuur van minder dan 5 oC.

5.3. Bepaling van de totale hoeveelheid aminozuren

5.3.1. Oxidatie

Weeg een 0,1 -1 g van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 0,2 mg nauwkeurig af in:

— een rondbodemkolf van 100 ml (4.1) in geval van open hydrolyse (5.3.2.3), of

— een rondbodemkolf van 250 ml (4.1) als een lage natriumconcentratie vereist wordt (5.3.3.1), of

— een fles van 100 ml met schroefdop (4.2) voor gesloten hydrolyse (5.3.2.4).

De ingewogen hoeveelheid monster moet een stikstofgehalte van ongeveer 10 mg hebben en mag niet meer dan 100 mg vocht bevatten.

Breng de kolf/fles in een ijsbad met smeltend ijs op 0 oC, voeg 5 ml oxidatiemengsel (3.23) toe en meng met een gebogen glazen spatel. Sluit de kolf/fles met de spatel erin af met luchtdichte folie en zet het ijsbad met het gesloten vat gedurende 16 uur in een koelkast bij 0 oC. Neem de kolf/fles na 16 uur uit de koelkast en ontleed de overmaat oxidatiereagens door 0,84 g dinatriumdisulfiet (3.4) toe te voegen.

Ga verder met 5.3.2.1.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1. Hydrolyse van geoxideerde monsters

Voeg aan het volgens 5.3.1 geoxideerde monster 25 ml hydrolysemengsel (3.20) toe, waarbij zorgvuldig alle sporen van het mengsel van de wand van het vat en van de spatel worden gespoeld.

Ga, afhankelijk van de gebruikte hydrolyseprocedure, verder met 5.3.2.3 of 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydrolyse van niet-geoxideerde monsters

Weeg 0,1 -1 g van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 0,2 mg nauwkeurig af in een rondbodemkolf van 100 ml of 250 ml (4.1) of in een fles met schroefdop van 100 ml (4.2). De ingewogen hoeveelheid monster moet een stikstofgehalte van ongeveer 10 mg hebben. Voeg voorzichtig 25 ml hydrolysemengsel (3.20) toe en meng met het monster. Ga verder met punt 5.3.2.3 of punt 5.3.2.4.

5.3.2.3. Open hydrolyse

Doe drie glasparels bij het mengsel (bereid volgens 5.3.2.1 of 5.3.2.2) en kook gedurende 23 uur in een kolf voorzien van een terugvloeikoeler. Spoel, na beëindiging van de hydrolyse, de koeler schoon met 5 ml citraatbuffer (3.24). Neem de koeler van de kolf en plaats de kolf in een ijsbad.

Ga verder met 5.3.3.

5.3.2.4. Gesloten hydrolyse

Zet de fles met het volgens 5.3.2.1 of 5.3.2.2 bereide mengsel in een oven (4.3) bij 110 oC. Laat gedurende het eerste uur de schroefdop los op de fles staan, om te voorkomen dat zich druk opbouwt als gevolg van gasvorming en om explosies te voorkomen. Sluit de fles niet af met de dop. Draai de dop na een uur op de fles en laat deze gedurende 23 uur in de oven (4.3) staan. Neem de fles uit de oven als de hydrolyse is voltooid, draai de dop voorzichtig van de fles en zet deze in een bad met smeltend ijs. Laat afkoelen.

Breng, afhankelijk van de manier waarop de pH wordt ingesteld (5.3.3), de inhoud van de fles met behulp van citraatbuffer (3.24) kwantitatief over in een bekerglas of rondbodemkolf van 250 ml.

Ga verder met 5.3.3.

5.3.3. Aanpassen van de pH

Ga verder met aanpassing van de pH volgens 5.3.3.1 of 5.3.3.2, afhankelijk van de natriumtolerantie van de aminozuuranalysator (4.9).

5.3.3.1. Chromatografiesystemen (4.9) die een lage natriumconcentratie vereisen

Bij aminozuuranalysatoren die een lage natriumconcentratie vereisen (en waarbij het volume zuur wordt ingedampt) wordt aanbevolen een stamoplossing van de interne standaard (3.27.3) te gebruiken.

Voeg in dit geval vóór het indampen 2,00 ml van de stamoplossing van de interne standaard (3.27.3) toe aan het hydrolysaat.

Voeg twee druppels octaan-1-ol (3.15) toe aan het hydrolysaat, verkregen volgens 5.3.2.3 of 5.3.2.4.

Breng met een rotatieverdamper (4.7) onder vacuüm bij 40 oC het volume terug tot 5-10 ml. Wordt het eindvolume per ongeluk kleiner dan 5 ml, dan moet het hydrolysaat worden weggegooid en de analyse opnieuw worden ingezet.

Breng de pH op 2,20 met natriumhydroxideoplossing (3.18) en ga verder met 5.3.4.

5.3.3.2. Alle andere aminozuuranalysatoren (4.9)

Neem het volgens 5.3.2.3 of 5.3.2.4 verkregen hydrolysaat en neutraliseer het ten dele door voorzichtig, onder roeren, 17 ml natriumhydroxideoplossing (3.17) toe te voegen; let op dat de temperatuur niet hoger wordt dan 40 oC.

Breng de pH op 2,20 bij kamertemperatuur met natriumhydroxideoplossing (3.17) en daarna natriumhydroxideoplossing (3.18). Ga verder met 5.3.4.

5.3.4. Monsteroplossing voor chromatografie

Breng het op pH gebrachte hydrolysaat (5.3.3.1 of 5.3.3.2) met citraatbuffer (3.24) kwantitatief over in een 200 ml maatkolf en vul aan tot de streep met buffer (3.24).

Als er nog geen interne standaard is gebruikt, voeg dan nu 2,00 ml interne standaard (3.27.3) toe en vul aan tot de streep met citraatbuffer (3.24). Meng goed.

Ga verder met de chromatografiestap (5.4).

Als chromatografie van de monsteroplossingen niet dezelfde dag mogelijk is, moeten zij worden bewaard bij een temperatuur van minder dan 5 oC.

5.4. Chromatografie

Laat het extract (5.2) of hydrolysaat (5.3.4) voor de chromatografische bepaling op kamertemperatuur komen. Schud het mengsel en filtreer een geschikte hoeveelheid door een 0,22 μm membraanfilter (4.5). De resulterende heldere oplossing wordt gebruikt voor ionenwisselingschromatografie met behulp van een aminozuuranalysator (4.9).

Injectie kan met de hand worden gedaan of automatisch. Het is van belang dat steeds dezelfde hoeveelheid oplossing ±0,5 % op de kolom wordt gebracht voor analyse van standaarden en monsters — tenzij er een interne standaard wordt gebruikt — en dat de verhouding natrium/aminozuur in standaard- en monsteroplossingen onderling zo veel mogelijk overeenkomen.

Hoe vaak er ijkbepalingen nodig zijn is afhankelijk van de stabiliteit van het ninhydrinereagens en van het analytische systeem in het algemeen. Standaarden en monsters worden zodanig met citraatbuffer (3.24) verdund dat de standaard een piekoppervlakte levert die 30-200 % bedraagt van de piekoppervlakte van het monster.

Er zal een zekere variabiliteit zitten in de chromatografie van aminozuren, afhankelijk van het type analysator en de gebruikte soort hars. Het systeem waarvoor wordt gekozen moet de aminozuren van elkaar en van andere ninhydrinepositieve stoffen kunnen scheiden. Binnen het bepalingsbereik moet het chromatografiesysteem een lineaire respons geven op veranderingen in de hoeveelheid aminozuren die op de kolom worden gebracht.

Er moeten bij de chromatografische analyse van een equimolaire oplossing van de te bepalen aminozuren dal/piekratio’s worden verkregen die overeenkomen met de hieronder genoemde. Deze equimolaire oplossing moet ten minste 30 % bevatten van de maximale hoeveelheid van elk aminozuur die met het aminozuuranalysesysteem (4.9) nog nauwkeurig kan worden bepaald.

Voor scheiding van threonine en serine mag de dal/piekratio voor de kleinste piek van de twee overlappende aminozuren op het chromatogram niet meer bedragen dan 2:10. (Als alleen cysteïne/cystine, methionine, threonine en lysine worden bepaald, wordt de nauwkeurigheid van de bepaling ongunstig beïnvloed door onvoldoende scheiding van aangrenzende pieken.) Voor alle andere aminozuren moet de scheiding beter zijn dan 1:10.

Het systeem moet lysine van „lysineartefacten” en van ornithine kunnen scheiden.

6. Berekening van de resultaten

De piekoppervlakte van monster en standaard wordt voor elk aminozuur afzonderlijk bepaald en het gehalte (X), uitgedrukt als g aminozuur per kg monster, wordt berekend.

Vermenigvuldig bij gebruik van een interne standaard met:

A = piekoppervlakte van hydrolysaat of extract;

B = piekoppervlakte van standaardijkoplossing;

C = piekoppervlakte van interne standaard in hydrolysaat of extract;

D = piekoppervlakte van interne standaard, standaardijkoplossing;

M = molecuulgewicht van het te bepalen aminozuur;

c = concentratie standaard in μmol/ml;

m = massa monster (g) (gecorrigeerd tot oorspronkelijke massa indien gedroogd of ontvet);

V = ml totaal hydrolysaat (5.3.4) of ml berekend totaal verdunningsvolume van het extract (6.1).

Cystine en cysteïne worden in hydrolysaten van geoxideerde monsters beide bepaald als cysteïnezuur, maar berekend als cystine (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol) door een molecuulgewicht van 120,15 (= 0,5 × 240,30 g/mol) te nemen.

Methionine wordt in hydrolysaten van geoxideerd monster bepaald als methioninesulfon, maar berekend als methionine met gebruikmaking van het molecuulgewicht van methionine: 149,21 g/mol.

Toegevoegd vrij methionine wordt na extractie bepaald als methionine; voor de berekening wordt hetzelfde molecuulgewicht gebruikt.

6.1. Het totale verdunningsvolume van extracten (F) voor de bepaling van vrije aminozuren (5.2) wordt als volgt berekend:

V = eindvolume van het extract.

7. Evaluatie van de methode

De methode is in 1990 getest in een internationaal ringonderzoek, waarvoor vier soorten diervoeders zijn gebruikt (mengvoer voor varkens, slachtkuikenvoer, eiwitconcentraat, voormengsel). De waarden, na eliminatie van uitschieters, van gemiddelde en standaardafwijking worden gegeven in de hierna volgende tabellen:







Gemiddelden in g/kg Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Slachtkuikenvoer 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Eiwitconcentraat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Voormengsel 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.

7.1. Herhaalbaarheid

De herhaalbaarheid, uitgedrukt als intralaboratoriumstandaardafwijking, van bovengenoemd ringonderzoek wordt weergegeven in onderstaande tabellen:







Intralaboratoriumstandaardafwijking (Sr) in g/kg Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Slachtkuikenvoer 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Eiwitconcentraat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Voormengsel 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.







Variatiecoëfficiënt (%) van de intralaboratoriumstandaardafwijking (Sr) Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Slachtkuikenvoer 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Eiwitconcentraat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Voormengsel 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.

7.2. Reproduceerbaarheid

De waarden van de interlaboratoriumstandaardafwijking, verkregen in bovengenoemd ringonderzoek worden weergegeven in onderstaande tabel:







Interlaboratoriumstandaardafwijking (SR) in g/kg Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Slachtkuikenvoer 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Eiwitconcentraat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Voormengsel 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.







Variatiecoëfficiënt (%) van de interlaboratoriumstandaardafwijking (SR) Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Slachtkuikenvoer 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Eiwitconcentraat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Voormengsel 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.

8. Gebruik van referentiematerialen

Of de methode op de juiste manier is toegepast dient te worden geverifieerd door herhaalde bepaling van gecertificeerde referentiematerialen, voor zover beschikbaar. Aanbevolen wordt de ijking uit te voeren met gecertificeerde aminozuurijkoplossingen.

9. Opmerkingen

9.1. In verband met verschillen tussen aminozuuranalysatoren moeten de uiteindelijke concentraties van de ijkoplossingen van standaardaminozuren (3.27.4 en 3.27.5) en van het hydrolysaat (5.3.4) als richtsnoer worden beschouwd.

Het lineaire meetbereik van het apparaat moet voor alle aminozuren worden gecontroleerd.

De standaardoplossing wordt zodanig verdund met citraatbuffer dat pieken in het midden van het bereik worden verkregen.

9.2. Indien HPLC-apparatuur wordt gebruikt voor de analyse van de hydrolysaten moeten de proefomstandigheden worden geoptimaliseerd overeenkomstig de aanbevelingen van de leverancier.

9.3. Bij toepassing van de methode op diervoeders die meer dan 1 % chloride bevatten (krachtvoer, minerale voeders, aanvullende diervoeders) is het mogelijk dat voor methionine een te lage waarde wordt gemeten en is een speciale behandeling vereist.

G. BEPALING VAN TRYPTOFAAN

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan en de hoeveelheid vrij tryptofaan in diervoeders. Zij maakt geen onderscheid tussen de D- en de L-vorm.

2. Beginsel

Voor de bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan wordt het monster onder basische condities gehydrolyseerd met een verzadigde bariumhydroxideoplossing en gedurende 20 uur tot 110 oC verhit. Na de hydrolyse wordt er een interne standaard toegevoegd.

Voor de bepaling van de hoeveelheid vrij tryptofaan wordt het monster onder licht zure condities geëxtraheerd in aanwezigheid van een interne standaard.

Het tryptofaan en de interne standaard in het hydrolysaat of extract worden bepaald door HPLC met fluorescentiedetectie.

3. Reagentia

3.1. Er dient dubbel gedestilleerd water of water van gelijkwaardige kwaliteit te worden gebruikt (conductiviteit < 10 μS/cm).

3.2. Standaardstof: tryptofaan (zuiverheid/gehalte ≥ 99 %), gedroogd onder vacuüm boven difosforpentaoxide.

3.3. Interne standaard: α-methyltryptofaan (zuiverheid/gehalte ≥ 99 %), gedroogd onder vacuüm boven difosforpentaoxide.

3.4. Bariumhydroxide-octahydraat (er dient op te worden toegezien dat Ba(OH)2·8H2O niet langdurig aan lucht wordt blootgesteld om de vorming van BaCO3 te voorkomen; dit zou de bepaling kunnen storen) (zie opmerking 9.3).

3.5. Natriumhydroxide.

3.6. Orthofosforzuur, w = 85 % (m/m).

3.7. Zoutzuur, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Methanol, HPLC-kwaliteit of gelijkwaardig.

3.9. Petroleumether, kooktraject 40-60 oC.

3.10. Natriumhydroxideoplossing, c = 1 mol/l:

Los 40,0 g NaOH (3.5) op in water en vul met water aan tot 1 liter (3.1).

3.11. Zoutzuur, c = 6 mol/l:

Neem 492 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter.

3.12. Zoutzuur, c = 1 mol/l:

Neem 82 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter.

3.13. Zoutzuur, c = 0,1 mol/l:

Neem 8,2 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter.

3.14. Orthofosforzuur, c = 0,5 mol/l:

Neem 34 ml orthofosforzuur (3.6) en vul met water (3.1) aan tot 1 liter.

3.15. Geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

Los 0,2553 g tryptofaan (3.2) in een maatkolf van 500 ml op in zoutzuur (3.13) en vul aan tot de streep met zoutzuur (3.13). Gedurende maximaal vier weken houdbaar bij -18 oC.

3.16. Geconcentreerde internestandaardoplossing, c = 2,50 μmol/ml:

Los 0,2728 g α-methyltryptofaan (3.3) in een maatkolf van 500 ml op in zoutzuur (3.13) en vul aan tot de streep met zoutzuur (3.13). Gedurende maximaal vier weken houdbaar bij -18 oC.

3.17. IJkstandaardoplossing van tryptofaan en interne standaard:

Neem 2,00 ml geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15) en 2,00 ml geconcentreerde internestandaardoplossing (α-methyltryptofaan) (3.16). Verdun met water (3.1) en methanol (3.8) tot ongeveer hetzelfde volume en ongeveer dezelfde methanolconcentratie (10-30 %) als het eindhydrolysaat.

Deze oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.

Bescherm tijdens de bereiding tegen direct zonlicht.

3.18. Azijnzuur.

3.19. 1,1,1-Trichloor-2-methylpropaan-2-ol

3.20. Ethanolamine, m > 98 % (m/m).

3.21. Oplossing van 1 g 1,1,1-trichloor-2-methylpropaan-2-ol (3.19) in 100 ml methanol (3.8).

3.22. Mobiele fase voor HPLC: 3,00 g azijnzuur (3.18) + 900 ml water (3.1) +50,0 ml oplossing (3.21) van 1,1,1-trichloor-2-methylpropaan-2-ol (3.19) in methanol (3.8) (1 g/100 ml). Breng de pH met ethanolamine (3.20) op 5,00 . Vul aan met water tot 1 000 ml (3.1).

4. Apparatuur

4.1. HPLC-apparatuur met een spectrofluorimetrische detector.

4.2. HPLC-kolom: 125 mm × 4 mm, C18, vulling van 3 μm, of een gelijkwaardige kolom.

4.3. pH-meter.

4.4. Polypropyleenkolf, inhoud 125 ml, met brede hals en schroefdop.

4.5. Membraanfilter, 0,45 μm.

4.6. Autoclaaf 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar.

4.7. Schudapparaat of magneetroerder.

4.8. Vortexmenger.

5. Werkwijze

5.1. Monstervoorbewerking

Het monster wordt gemalen tot de deeltjes een zeef met een maaswijdte van 0,5 mm passeren. Monsters met een hoog vochtgehalte moeten voor het malen eerst worden gevriesdroogd, of aan de lucht gedroogd bij ten hoogste 50 oC. Monsters met een hoog vetgehalte dienen voorafgaand aan het malen te worden geëxtraheerd met petroleumether (3.9).

5.2. Bepaling van de hoeveelheid vrij tryptofaan (extract)

Weeg een geschikte hoeveelheid (1-5 g) van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 1 mg nauwkeurig af in een erlenmeyer. Voeg 100,0 ml zoutzuur (3.13) en 5,00 ml geconcentreerde internestandaardoplossing (3.16) toe. Schud of meng gedurende 60 minuten met behulp van een schudapparaat of een magneetroerder (4.7). Laat het bezinksel neerslaan en pipetteer 10,0 ml van de bovenstaande oplossing in een bekerglas. Voeg 5 ml orthofosforzuur (3.14) toe. Breng de pH met natriumhydroxide (3.10) op 3. Voeg voldoende methanol (3.8) toe om een methanolconcentratie tussen 10 en 30 % in het eindvolume te verkrijgen. Breng over in een maatkolf met een geschikt volume en verdun met water tot een volume dat is vereist voor de chromatografie (bij benadering hetzelfde volume als de ijkstandaardoplossing (3.17)).

Filtreer een paar ml van de oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm (4.5) vóór injectie in de HPLC-kolom. Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4.

Bescherm de standaa