1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
veevoeders
(72/199/EEG)
(PB L 123 van 29.5.1972, blz. 6)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1 Richtlijn 81/680/EEG van de Commissie van 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie van 20 december 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3 Richtlijn 93/28/EEG van de Commissie van 4 juni 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4 Richtlijn 98/54/EG van de Commissie van 16 juli 1998 L 208 49 24.7.1998
Gerectificeerd bij:
►C1 Rectificatie PB L 320 van 27.11.1980, blz. 43 (72/199/EEG)
▼B
DERDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 27 april 1972
betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analyseme-
thoden voor de officiële controle van veevoeders
(72/199/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden
voor de officiële controle van veevoeders (1), inzonderheid op artikel 2,
Overwegende datbovenbedoelde richt lijn bepaaltdatde officiële
controle van veevoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de op
grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van veevoeders gestelde eisen is voldaan,geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende datbij richt lijnen nr. 71/250/EEG en nr. 71/393/EEG van
de Commissie van 15 juni 1971 (
2) onderscheidenlijk 18 november
1971 (3) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden
is vastgelegd; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamhedensindsdien hebben gemaakt het nuttig is een derde serie methoden uit
te vaardigen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor
veevoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders ten aanzien van hun gehalte aan zetmeel, ruw eiwit,ruw eiwit oplosbaar in pepsine en zoutzuur, en aan vrij en totaal
gossypol, alsmede ten aanzien van de pepsineactiviteit, geschieden
volgens de in de bijlage I bij deze richtlijn omschreven methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van veevoeders ►M4 ◄zowel als ten aanzien van het
gehalte in veevoeders aan ►M4 ◄tylosine en virginia-
mycine geschieden volgens de in bijlage II bij deze richtlijn
omschreven methoden.
Artikel 3
De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 juli 1973 de noodzakelijke wettelijke
of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om zich te voegennaar deze richtlijn. Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan inkennis.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(3) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 3
▼B
BIJLAGE I
1.BEPALING VAN ZETMEEL
Polarimetrische methode
1.Doel en toepassingsgebied
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
zetmeel en afbraakprodukten van zetmeel met een hoog moleculair gewicht
in veevoeders, met uitzondering van die welke bietensnijdsels, bietenpulp,
gedroogd bieteloof of gedroogde bietekoppen, aardappelpulp, gedroogde
gist, inulinehoudende stoffen (bij voorbeeld topinamboersnijdsels en -meel)
of kanen bevatten.
2.Principe
De bepaling bestaat uit twee onderdelen. Het eerste onderdeel omvat de
behandeling van het monster met warm verdund zoutzuur. Na klaren en
filtreren wordt de optische draaiing van de oplossing polarometrisch gemeten.
Het tweede onderdeel omvat de extractie van het monster met ethanol 40 %.
Na aanzuren van het filtraat met zoutzuur, klaren en filtreren wordt de opti-
sche draaiing gemeten onder dezelfde omstandigheden als bij het eerste
onderdeel.
Het verschil tussen de beide metingen, vermenigvuldigd met een bekende
factor, geeft het zetmeelgehalte van het monster.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 25 % in gewicht, d = 1,126.3.2 Zoutzuur 11,28 g/l.
De sterkte moet worden gecontroleerd door titratie met natronloog 0,1 N
t.o.v. de indicator methylrood 1 g/l in ethanol 94 % (v/v). 10 ml
= 30,94 ml NaOH 0,1 N.
3.3 Carrez-I-oplossing: los op in water 21,9 g zinkacetaat Zn (CH
3COO)2·
2H2O en 3 g ijsazijn. Vul aan met water tot 100 ml.
3.4 Carrez-II-oplossing: los op in water 10,6 g kaliumhexacyanoferraat (II),
K4[Fe (CN)6]·3 H2O· Vul aan met water tot 100 ml.
3.5 Ethanol 40 % (v/v), d: 0,948 bij 20 ºC.
4.Apparatuur
4.1 Conische kolf van 250 ml met normaalslijpstuk en terugvloeikoeler.4.2 Polarimeter of saccharimeter.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van het monster
Maak hetmonst er zodanig fijn dathetgeheel een zeef metronde mazen
van 0,5 mm diameter passeert.
5.2Bepaling van de totale optische draaiing (P of S) (zie opmerking 7.1)
Breng 2,5 g van het gemalen monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen,
in een maatkolf van 100 ml. Voeg toe 25 ml zoutzuur (3.2), schud de
kolf om, totdat de stof goed gesuspendeerd is en voeg nogmaals 25 ml
zoutzuur (3.2) toe. Plaats de kolf in een bad met kokend water en schud
gedurende de eerste 3 minuten krachtig en regelmatig om, ten einde
klontvorming te vermijden. De hoeveelheid water in het bad moet groot
genoeg zijn om aan de kook te blijven wanneer de kolf erin wordt
geplaatst. De kolf mag tijdens het omschudden niet uit het water worden
gehaald. Neem na precies 15 minuten de kolf uit het bad, voeg er 30 ml
koud water aan toe en laat onmiddellijk afkoelen tot 20 ºC.
Voeg toe 5 ml Carrez-I-oplossing (3.3) en schud gedurende één minuut
om. Voeg vervolgens toe 5 ml Carrez-II-oplossing (3.4) en schud
nogmaals gedurende één minuut om. Vul aan met water tot de streep,
meng en filtreer. Indien het filtraat niet volledig helder is (wat zelden1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 4
▼B
voorkomt), herhaal dan de analyse met grotere hoeveelheden Carrez-I en
II-oplossingen, bij voorbeeld 10 ml.
Meetvervolgens de opt ische draaiing van de oplossing in een buis van
200 mm met behulp van de polarimeter of de saccharimeter.
5.3Bepaling van de optische draaiing (P ′of S ′) van de in 40 % ethanol
oplosbare stoffen
Weeg af 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng deze in
een maatkolf van 100 ml. Voeg toe ca. 80 ml ethanol (3.5) (zie opmer-
king 7.2) en laat de kolf gedurende 1 h staan bij kamertemperatuur;
schud de oplossing gedurende die tijd 6 maal krachtig, zodat de stof
goed met het ethanol wordt vermengd. Vul vervolgens aan met ethanol
(3.5) tot de streep, meng en filtreer.
Pipeteer 50 ml van het filtraat (= 2,5 g monster) in een conische kolf van
250 ml, voeg toe 2,1 ml zoutzuur (3.1) en zwenk krachtig om. Verbind
de conische kolf met een terugvloeikoeler en plaats de kolf in een bad
met kokend water. Neem na precies 15 minuten de conische kolf uit het
bad, breng de inhoud ervan meteen kleine hoeveelheid koud wat er over
in een maatkolf van 100 ml en laat afkoelen tot 20 ºC.
Klaar vervolgens metde Carrez-oplossingen I (3.3) en II (3.4), vul aan
met water tot de streep, meng, filtreer en meet de optische draaiing als
aangegeven onder 5.2, tweede en derde alinea.
6.Berekening van de resultaten
Bereken het gehalte aan zetmeel, uitgedrukt in percenten van het monster, als
volgt:
6.1Metingen met de polarimeter
percentzet meel ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
waarin:
P = totale optische draaiing in booggraden
P′ = optische draaiing in booggraden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen
α½/C13820º
D = specifiek draaiend vermogen van zuiver zetmeel. De
waarden die conventioneel D voor deze factor worden
gebruiktzijn de volgende:
+ 185,9º: rijstezetmeel,
+ 185,4º: aardappelzetmeel,+ 184,6º: maïszetmeel,
+ 182,7º: tarwezetmeel+ 181,5º: gerstezetmeel+ 181,3º: haverzetmeel
+ 184,0º: andere zetmeelsoorten alsmede zetmeelmengsels in
mengvoeders.
6.2Metingen m.b.v. de saccharimeter
percentzet meel ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = totale optische draaiing in saccharimetrische graden.
S′ = optische draaiing in saccharimetrische graden van de in 40 %
ethanol oplosbare stoffen.
N = gewichtin g van de hoeveelheid saccharose, die in 100 ml
water bij een laagdikte van 200 mm een optische draaiing van
100 saccharimetrische graden geeft.
Dit gewicht varieert naargelang van het type saccharimeter:16,29 g voor Franse saccharimeters
26,00 g voor Duitse saccharimeters1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 5
▼C1
▼B
▼B
20,00 g voor gemengde saccharimeters
α½/C13820º
D= specifiek draaiend vermogen van zuiver zetmeel (zie 6.1).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
0,4 % absoluut bij gehalten van minder dan 40 % zetmeel;1 % relatief bij gehalten van 40 % zetmeel of meer.
7.Opmerkingen
7.1 Indien het monster meer dan 6 % carbonaten bevat, berekend als
calciumcarbonaat, moeten deze worden ontleed vóór de bepaling van de
totale optische draaiing door een behandeling met precies de daarvoor
benodigde hoeveelheid verdund zwavelzuur.
7.2 Produkten met een hoog gehalte aan lactose, zoals weipoeder, onder-
melkpoeder, enzovoort worden, na het toevoegen van de 80 ml ethanol
(3.5) als volgtbehandeld:
Verbind de kolf met een terugvloeikoeler en plaats de kolf gedurende 30
minuten in een waterbad van 50 ºC. Laat vervolgens afkoelen en handel
verder als beschreven onder 5.3.
2.BEPALING VAN RUW EIWIT
1.Doel en toepassingsgebied
Met deze methode is het mogelijk het gehalte aan ruw eiwit in diervoeders te
bepalen op basis van het stikstofgehalte, bepaald volgens de Kjeldahlme-
thode.
2.Principe
Het monster wordt ontsloten met zwavelzuur in aanwezigheid van een kata-
lysator. De zure oplossing wordt met een oplossing van natriumhydroxide
basisch gemaakt. De ammoniak wordt afgedestilleerd en opgevangen in een
bekende hoeveelheid zwavelzuur, waarvan de overmaatmeteen st andaardop-
lossing natriumhydroxide wordt teruggetitreerd.
3.Reagentia
3.1 Kaliumsulfaat.
3.2 Katalysator: koper(II)oxide (CuO) of koper(II)sulfaatpentahydraat
(CuSO
4·5H2O).
3.3 Zinkkorrels.3.4 Zwavelzuur ρ20= 1,84 g/ml.
3.5 Zwavelzuur c(½ H
2SO4) = 0,5 mol/l.
3.6 Zwavelzuur c(½ H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.7 Methylrood-indicator: 300 mg methylrood oplossen in 100 ml ethanol,
σ= 95-96 % (v/v).
3.8 Natriumhydroxide-oplossing (technische kwaliteit is voldoende), β
= 40 g/100 ml (m/v: 40 %).
3.9 Natriumhydroxide-oplossing, c = 0,25 mol/l.
3.10 Natriumhydroxide-oplossing, c = 0,1 mol/l.3.11 Puimsteenkorrels, met zoutzuur gewassen en gegloeid.3.12 Acetanilide (sm.p. = 114 ºC; N = 10,36 %).3.13 Saccharose (vrij van stikstof).
4.Apparatuur
Apparatuur, geschikt voor het uitvoeren van ontsluiting, destillatie en titratie
volgens Kjeldahl.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 6
▼M3
▼M3
5.Werkwijze
5.1Ontsluiting
Weeg af van hetmonst er 1 g op 0,001 g nauwkeurig en breng ditin de
recipiënt van de ontsluitingsapparatuur. Voeg hieraan toe 15 g kaliumsul-
faat (3.1), een geschikte hoeveelheid katalysator (3.2) (0,3 tot 0,4 g
koper(II)oxide of 0,9 tot 1,2 g koper(II)sulfaatpentahydraat), 25 ml
zwavelzuur (3.4) en een paar puimsteenkorrels (3.11); meng het geheel.
Verwarm de recipiënteerstzachtonder af en t oe zwenken, indien nodig,
totdat de massa is verkoold en het schuim is verdwenen; verhit vervol-
gens krachtiger totdat de vloeistof regelmatig kookt. De verwarming is
voldoende wanneer hetkokende zuur t egen de wand van de recipiënt
condenseert . Zorg ervoor datde wand nietoververhitraakten dater
geen organische stof aan gaat vastzitten. Kook nog twee uur nadat de
oplossing helder en lichtgroen geworden is; laat afkoelen.
5.2Destillatie
Voeg genoeg water toe om de sulfaten volledig op te lossen. Laat
afkoelen; voeg enkele zinkkorrels (3.3) toe.
Breng in de opvangkolf van de destillatieapparatuur een nauwkeurig
afgemeten hoeveelheid van 25 ml zwavelzuur (3.5 of 3.6), afhankelijk
van het verwachte stikstofgehalte. Voeg enkele druppels methylrood
(3.7) toe.
Verbind de ontsluitingsrecipiënt met de koeler van het destillatieapparaat
en zorg ervoor dat het uiteinde van de koelbuis zich ten minste 1 cm
onder hetvloeist ofoppervlak in de opvangkolf bevindt(zie opmerking
8.3). Gietlangzaam 100 ml nat riumhydroxideoplossing (3.8) in de
ontsluitingsrecipiënt, zonder ammoniakverlies (zie opmerking 8.1).
Vermarm de recipiënt totdat alle ammoniak overgedestilleerd is.
5.3Titratie
Titreer de overmaat zwavelzuur in de opvangkolf terug met natriumhy-
droxide-oplossing (3.9 of 3.10) afhankelijk van de concentratie van het
gebruikte zwavelzuur, totdat het eindpunt is bereikt.
5.4Blancoproef
Voer een blancoproef (ontsluiting, destillatie en titratie) uit met 1 g
saccharose (3.13) in plaats van het monster.
6.Berekening van de resultaten
Bereken hetgehalt e aan ruw eiwitmetbehulp van de volgende formule:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
waarin:
V0= volume (in ml) NaOH (3.9 of 3.10) verbruiktin de blancoproef
V1= volume (in ml) NaOH (3.9 of 3.10) verbruikt bij de titratie van het
monster
c = concentratie (mol/l) natriumhydroxide (3.9 of 3.10)m = massa (in g) van hetmonst er.
7.Validatie van de methode
7.1Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee parallelle, op hetzelfde
monster verrichte bepalingen mag niet meer bedragen dan:
— 0,2 % absoluut voor ruw-eiwitgehalten van minder dan 20 %;
— 1,0 % relatief ten opzichte van de hoogste waarde voor ruweiwitge-
halten van 20 % tot 40 %;
— 0,4 % absoluut voor ruw-eiwitgehalten van meer dan 40 %.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 7
▼M3
7.2Nauwkeurigheid
Voer de bepaling (ontsluiting, destillatie en titratie) uit op 1,5 tot 2,0 g
acetanilide (3.12) in aanwezigheid van 1 g saccharose (3.13); 1 g aceta-
nilide verbruikt14,80 ml zwavelzuur (3.5).
Er moet ten minste 99 % teruggevonden worden.
8.Opmerkingen
8.1 De apparatuur kan tot het manuele, halfautomatische of automatische
type behoren. Indien de ontsluitingsvloeistof tussen ontsluiting en destil-
latie overgebracht moet worden, mag er geen verlies optreden. Indien de
recipiënt van de destillatieapparatuur niet voorzien is van een druppel-
trechter, moet de natriumhydroxide-oplossing langzaam langs de wand
toegevoegd worden, onmiddellijk voordat de recipiënt met de koeler
wordtverbonden.
8.2 Herhaal de bepaling meteen grot ere hoeveelheid zwavelzuur (3.4) dan
hoger vermeld, wanneer het materiaal tijdens het ontsluiten vast wordt.
8.3 Bij monsters met een laag stikstofgehalte kan het volume zwavelzuur
(3.6) datin de opvangkolf wordtgebrachtzo nodig worden verminderd
tot 10 of 15 ml en met water tot 25 ml worden aangevuld.
3.BEPALING VAN RUW EIWIT, OPLOSBAAR IN PEPSINE EN ZOUT-
ZUUR
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
ruw eiwit, oplosbaar in pepsine en zoutzuur onder vastgestelde omstandig-
heden. Deze methode is toepasselijk voor alle veevoerders.
2.Beginsel
Hetmonst er wordtgedurende 48 h bij 40 ºC behandeld meteen oplossing
van pepsine in zoutzuur. De suspensie wordt gefiltreerd en het gehalte aan
stikstof van het filtraat wordt bepaald volgens de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur d = 1,125.
3.2 Zoutzuur 0,075 N.
3.3 Pepsine 2,0 E/mg. Deze activiteit is gedefinieerd in de methode van deel
4 van deze bijlage en dient volgens deze methode gecontroleerd te
worden.
3.4 Pepsine-oplossing, ca. 0,2 g/l in zoutzuur (3.2), vers bereid, activiteit
400 E/l.
3.5 Antischuimemulsie (bijvoorbeeld siliconen).
3.6 Alle reagentia genoemd onder punt 3 van de methode voor de bepaling
van ruw eiwit.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad of broedstoof, ingesteld op 40 ºC ± 1 ºC.
4.2 Destructie- en destillatieapparatuur volgens Kjeldahl.
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.2)
Weeg af 2 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig, en breng dit in
een maatkolf van 500 ml. Voeg hieraan toe 450 ml pepsine-oplossing
(3.4), die van te voren op 40 ºC is gebracht.
Schud de inhoud opdat klontvorming vermeden wordt. Controleer of de
pH van de suspensie minder bedraagtdan 1,7. Breng de kolf in het
waterbad of de broedstoof (4.1) en laat gedurende 48 h staan. Zwenk de
inhoud om na 8, 24 en 32 h. Voeg na 48 h toe 15 ml zoutzuur (3.1), laat
afkoelen tot 20 ºC, vul aan met water tot de streep, meng en filtreer.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 8
▼B
▼B
5.2Destructie
Breng 250 ml van het filtraat over in de kolf van het destructieapparaat
(4.2). Voeg toe de voor de destructie benodigde reagentia zoals is aange-
geven in de methode voor de bepaling van ruw eiwit onder punt 5.1,
tweede zin.
Meng de inhoud van de kolf en verhitt otkoken. Voeg bij schuimvor-
ming enkele druppels antischuimemulsie (3.5) toe. Laat flink doorkoken
tot het water bijna volledig verdampt is. Verwijder vervolgens voor-
zichtig de laatste resten water door minder intensief te verhitten. Laat
nog gedurende 1 h doorkoken nadatde oplossing helder en kleurloos is
geworden (of lichtgroen bij aanwezigheid van een koperkatalysator).
Laatvervolgens afkoelen.
5.3Destillatie en titratie
Handel zoals beschreven in de punten 5.2 en 5.3 van de methode voor de
bepaling van ruw eiwit.
5.4Blancobepaling
Verrichteen blancobepaling onder t oepassing van de beschreven werk-
wijze, echter zonder analysemateriaal.
6.Berekening van de resultaten
Verminder hetvolume aan zwavelzuur, verbruiktbij de analyse van het
monster, met het volume aan zwavelzuur, verbruikt bij de analyse van de
blanco. 1 ml zwavelzuur 0,1 N komt overeen met 1,4 mg stikstof.
Vermenigvuldig de verkregen hoeveelheid stikstof met de factor 6,25. Druk
het resultaat uit in percenten van het monster.
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan
— 0,4 % absoluutbij gehalt en van minder dan 20 %;
— 2 % relatief bij gehalten van 20 tot 40 %;
— 0,8 % absoluutbij gehalt en van meer dan 40 %.
7.Opmerkingen
7.1 De verkregen waarden st aan nietin directverband metde vert eerbaar-
heidin vivo .
7.2 Produkten met een vetgehalte van meer dan 10 % moeten eerst worden
ontvet door extractie met petroleumether (kp. 40—60 ºC).
4.BEPALING VAN DE PEPSINE-ACTIVITEIT
1.Doel en toepasbaarheid
Dit voorschrift beschrijft de methode voor de controle van de activiteit van
de pepsine, die wordtgebruiktvoor de bepaling van ruw eiwit , oplosbaar in
pepsine en zoutzuur.
2.Beginsel
Hemoglobine wordt onder vastgestelde omstandigheden behandeld met
pepsine en verdund zoutzuur. Het niet gehydrolyseerde gedeelte van de
eiwitten wordt met trichloorazijnzuur geprecipiteerd. Aan het filtraat wordt
natronloog en het reagens volgens Folin-Ciocalteu toegevoegd. De extinctie
van deze oplossing wordtgemet en bij 750 nm en de hiermee corresponde-
rende hoeveelheid tyrosine wordt afgelezen van een ijkgrafiek.
Definitie: De pepsine-eenheid (E) wordtgedefinieerd als die hoeveelheid
enzym, die onder de omstandigheden van de methode zoveel hydroxyarylver-
bindingen vrijmaakt , datna kleuring methetFolin-Ciocalt eu-reagens een
extinctie verkregen wordt, die overeenkomt met die van 1 µmol tyrosine
onder dezelfde omstandigheden.
3.Reagentia
3.1 Zoutzuur 0,2 N.
3.2 Zoutzuur 0,06 N.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 9
▼B
3.3 Zoutzuur 0,025 N.
3.4 Trichloorazijnzuuroplossing 50 g/l.
3.5 Natronloog 0,5 N.
3.6 Reagens volgens Folin-Ciocalteu: breng 100 g natriumwolframaat,
Na2WO4.2 H2O, 25 g natriummolybdaat, Na2MoO4.2 H2O en 700 ml
water in een rondbodemkolf van 2 l met ingeslepen stop. Voeg toe
50 ml fosforzuur (d = 1,71) en 100 ml geconcentreerd zoutzuur (d
= 1,19). Verbind de kolf meteen t erugvloeikoeler, verhitde oplossing
tot koken en houd deze gedurende 10 h zachtjes aan de kook. Laat
afkoelen, verwijder de terugvloeikoeler en voeg toe 175 g lithiumsulfaat,
Li2SO4.2 H2O,50 ml water en 1 ml broom. Laat gedurende 15 minuten
koken, om de overmaatbroom t e verwijderen.
Laatafkoelen, breng de oplossing over in een maat kolf van 1 l, vul aan
met water tot de streep, meng en filtreer. De oplossing mag geen groene
kleur vertonen. Verdun vóór gebruik 1 volumedeel reagens met 2
volumedelen water.
3.7 Hemoglobine-oplossing: weeg af een hoeveelheid (ca. 2 g) hemoglobine,
protease-substraat volgens Anson, die overeenkomt met 354 mg stik-
stof (1) en breng deze in een kolf van 200 ml metingeslepen st op. Voeg
enkele ml zoutzuur (3.2) toe, sluit de kolf aan op de vacuumpomp en
schud tot de hemoglobine volledig opgelost is. Hef het vacuum op en
voeg onder omzwenken zoveel zoutzuur (3.2) toe als nodig is om de
hoeveelheid zoutzuur aan te vullen tot 100 ml. Vóór gebruik vers
bereiden.
3.8 Standaardtyrosine-oplossing: los op 181,2 mg tyrosine in zoutzuur (3.1)
en vul aan met hetzelfde zuur tot 1 l (stamoplossing). Verdun 20,0 ml
van deze oplossing met zoutzuur (3.1) tot 100 ml. 1 ml van deze oplos-
sing bevat0,2 µmol t yrosine.
4.Apparatuur
4.1 Waterbad met ultrathermostaat, ingesteld op 25 ºC ± 0,1 ºC.
4.2 Spectrofotometer.
4.3 Chronometer, nauwkeurigheid: 1 sec.4.4 pH-meter
5.Uitvoering
5.1Bereiding van de oplossing (zie opmerking 7.1)
Los 150 mg pepsine op in 100 ml zoutzuur (3.2). Pipeteer 2 ml van de
oplossing in een maatkolf van 50 ml en vul aan met zoutzuur (3.3) tot de
streep. De met de pH-meter gemeten pH moet 1,6 ± 0,1 bedragen. Plaats
de kolf in hetwat erbad (4.1).
5.2Hydrolyse
Pipeteer 5,0 ml hemoglobineoplossing (3.7) in een reageerbuis en breng
in het waterbad (4.1) op een temperatuur van 25 ºC. Voeg daarna toe
1,0 ml van de in punt5.1 verkregen pepsine-oplossing en meng door
ongeveer 10 maal op en neer bewegen meteen glasst aaf, die aan het
uiteinde is afgeplat.
Plaats de buis gedurende precies 10 minuten in het waterbad (4.1) van
25 ºC, gerekend vanaf de toevoeging van de pepsine-oplossing (tijd en
temperatuur moeten nauwkeurig worden aangehouden). Voeg vervolgens
toe 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van tevoren op een
temperatuur van 25 ºC is gebracht, meng en filtreer door een droog filter.
5.3Ontwikkeling van de kleur en meting van de extinctie
Pipeteer 5,0 ml van het filtraat in een conische kolf van 50 ml, voeg toe
10,0 ml natronloog (3.5) en onder voortdurend omzwenken 3,0 ml
verdund reagens volgens Folin-Ciocalteu (3.6). Meet na 5 à 10 minuten
de extinctie van de oplossing tegen water in cuvetten van 1 cm, met
behulp van de spectrofotometer bij 750 nm.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 10
(1) Bepaal het gehalte aan stikstof volgens een semi-microkjeldahlmethode (theoretisch
gehalte: 17,7 % N).
▼B
5.4Blancobepaling
Verrichtbij iedere bepaling een blancoproef zoals hieronder beschreven.
Pipeteer 5,0 ml hemoglobine-oplossing (3.7) in een reageerbuis, verwarm
dit in het waterbad (4.1) op 25 ºC. Voeg dan hieraan toe 10,0 ml
trichloorazijnzuuroplossing (3.4), die van te voren op een temperatuur
van 25 ºC is gebracht, meng en voeg vervolgens 1,0 ml van de in punt
5.1 verkregen pepsine-oplossing toe. Meng met behulp van de glasstaaf
en plaats de reageerbuis gedurende precies 10 minuten in het waterbad(4.1) bij 25 ºC. Meng en filtreer door een droogfilter. Handel verder
zoals beschreven onder punt5.3.
5.5IJkgrafiek
Breng in conische kolven van 50 ml hoeveelheden van 1,0; 2,0; 3,0; 4,0
en 5,0 ml standaardtyrosine-oplossing (3.8), overeenkomend met respec-
tievelijk 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 en 1,0 µmol tyrosine. Voeg aan de reeks nog
een kolf toe zonder tyrosine. Breng met zoutzuur (3.1) op een volume
van 5,0 ml. Voeg toe 10,0 ml natronloog (3.5), alsmede onder voortdu-
rend omzwenken 3,0 ml verdund reagens volgens Folin-Ciocalteu (3.6).
Bepaal de extinctie zoals aangegeven in de laatste zin van punt 5.3. Stel
de ijkgrafiek op door de extincties uit te zetten tegen de toegevoegde
hoeveelheden tyrosine.
6.Berekening van de resultaten
Lees uitde ijkgrafiek af de hoeveelheid t yrosine in µmol, die overeenkomt
met de extiactie van de gekleurde oplossing, gecorrigeerd met de blanco.
De pepsine-activiteit in µmol tyrosine per mg en per minuut, bij 25 ºC, wordt
berekend uitde volgende formule:
Eenheden per mg E =mgðÞ ¼ 0;32/C1a
g
waarin:
a = hoeveelheid tyrosine in µmol, afgelezen uit de ijkgrafiek,
g = gewichtin mg van de hoeveelheid pepsine, t oegevoegd onder 5.2
7.Opmerkingen
7.1 De op te lossen hoeveelheid pepsine moet zodanig worden gekozen, dat
bij de uiteindelijke fotometrische meting een extinctie wordt verkregen
van 0,35 ± 0,035.
7.2 2 E/mg, bepaald volgens deze methode, komen overeen met 3,64 milli-
eenheden Anson/mg (µmol tyrosine/mg · min bij 35,5 ºC) of met 36 400
handelseenheden/g (µmol tyrosine/g · 10 minuten bij 35,5 ºC).
5.BEPALING VAN VRIJ EN TOTAAL GOSSYPOL
1.Doel en toepassingsgebied
Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan
vrij gossypol, totaal gossypol en aan gossypol chemisch nauw verwante
stoffen in katoenzaad, katoenzaadmeel en -koeken en in mengvoeders die
katoenzaadprodukten bevatten.
De ondergrens van de bepaalbaarheid bij de methode bedraagt 20 ppm.
2.Beginsel
Gossypol wordt geëxtraheerd in aanwezigheid van 3-amino-1-propanol, hetzij
meteen mengsel van isopropanol en hexaan voor hetbepalen van vrij
gossypol, hetzij met dimethylformamide voor het bepalen van totaal
gossypol.
Hetgossypol wordtmetbehulp van aniline omgezetin gossypoldianiline,
waarvan de extinctie gemeten wordt bij 440 nm.
3.Reagentia
3.1 Isopropanol-hexaanmengsel: Meng 60 volumedelen isopropanol p.a. met
40 volumedelen n-hexaan.
3.2 Oplosmiddel A: Breng in een maatkolf van 1 l ongeveer 500 ml isopro-
panol-hexaanmengsel (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml ijsazijn en
50 ml water. Vul aan tot 1 l met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Dit
reagens is een week houdbaar.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 11
▼B
3.3 Oplosmiddel B: Pipeteer in een maatkolf van 100 ml 2 ml 3-amino-1-
propanol en 10 ml ijsazijn. Koel af tot kamertemperatuur en vul aan tot
100 ml metN,N-dimet hylformamide. Ditreagens is een week houdbaar.
3.4 Aniline p.a.: Wanneer de extinctie van een blancobepaling meer
bedraagt dan 0,022 , moetde aniline worden afgedest illeerd over
zinkpoeder, waarbij 10 % voorloop en 10 % naloop worden verwijderd.
Ditreagens is enige maanden houdbaar in een geslot en bruine fles,
bewaard in een koelkast.
3.5 Gossypolstandaardoplossing A: Breng in een maatkolf van 250 ml
27,9 mg gossypolacetaat, los op in oplosmiddel A (3.2), en vul hiermee
aan tot de streep. Pipeteer 50 ml van deze oplossing in een maatkolf van
250 ml en vul aan tot 250 ml met oplosmiddel A (3.2). 1 ml van deze
oplossing bevat0,02 mg gossypol. Laatde oplossing vóór hetgebruik 1 h
staan bij kamertemperatuur.
3.6 Gossypolstandaardoplossing B: Breng in een maatkolf van 50 ml 27,9 mg
gossypolacetaat, los op in oplosmiddel B (3.3) en vul hiermee aan tot de
streep. 1 ml van deze oplossing bevat 0,5 mg gossypol.
De gossypolstandaardoplossingen zijn — in het donker bewaard — gedu-
rende 24 h houdbaar.
4.Apparatuur
4.1 Roteerapparaat met ongeveer 35 omwentelingen per minuut.4.2 Spectrofotometer.
5.Uitvoering
5.1Af te wegen hoeveelheid analysemateriaal
De af te wegen hoeveelheid analysemateriaal hangt af van het te
verwachten gehalte aan gossypol. Het verdient de voorkeur te werken
meteen kleine hoeveelheid analysemat eriaal en meteen relat ief groot
aliquoot deel van het filtraat, om een voldoende hoeveelheid gossypol
te verkrijgen voor een nauwkeurige fotometrische meting.
Voor het bepalen van vrij gossypol in katoenzaad, katoenzaadmeel en -
koeken mag hetgewichtvan hetanalysemat eriaal nietmeer bedragen
dan 1 g; van mengvoeders kan tot 5 g worden afgewogen. In het alge-
meen kan een aliquootdeel van 10 ml van hetfilt raatworden
afgepipeteerd; het moet 50 à 100 µg gossypol bevatten.
Voor het bepalen van totaal gossypol kan de af te wegen hoeveelheid
analysemateriaal variëren van 0,5 tot 5 g, opdat in een aliquoot deel
van 2 ml van het filtraat 40 tot 200 µg gossypol aanwezig is.
De analyse moet worden uitgevoerd bij een omgevingstemperatuur van
nabij 20 ºC.
5.2Bepaling van vrij gossypol
Breng hetafgewogen analysemat eriaal in een kolf van 250 ml metslijp-
stuk en waarvan de bodem bedekt is met glaskralen. Pipeteer hierbij
50 ml oplosmiddel A (3.2), sluitde kolf en laatgedurende 1 h rot eren.
Filtreer door een droogfilter en vang het filtraat op in een kleine kolf met
slijpstuk. Bedek tijdens het filtreren de trechter met een horlogeglas.Pipeteer gelijke aliquote delen van het filtraat, die 50 tot 100 µg gossypol
bevatten, in twee maatkolven van 25 ml (A en B). Breng eventueel het
volume op 10 ml metoplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van maat kolf
(A) aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing
dient als referentieoplossing voor het monster.
Pipeteer vervolgens in twee andere maatkolven van 25 ml (C en D) 10 ml
oplosmiddel A (3.2). Vul de inhoud van kolf (C) aan tot 25 ml met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossing dientals referent ieop-
lossing voor de blanco.
Voeg aan de maatkolven (D) en (B) resp. 2 ml aniline (3.4) toe.
Verwarm gedurende 30 min. op een kokend waterbad voor het ontwik-
kelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot de
streep met isopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laat gedurende 1 h
staan.
Meet met behulp van de spectrofotometer de extinctie van de blanco-
oplossing (D) bij 440 nm in een glascuvet van 1 cm t.o.v. de referentie-
oplossing (C). Meet vervolgens de extinctie van de monsteroplossing (B)
t.o.v. de referentie-oplossing (A).1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 12
▼B
Verminder de extinctie van de monsteroplossing met die van de blanco-
oplossing (= gecorrigeerde extinctie). Bereken uit de aldus verkregen
waarde hetgehalt e aan vrij gossypol als beschreven onder 6.
5.3Bepaling van totaal gossypol
Breng een hoeveelheid analysemateriaal, die 1 à 5 mg gossypol bevat, in
een maatkolf van 50 ml en voeg toe 10 ml oplosmiddel B (3.3). Bereid
terzelfder tijd een blanco-oplossing, door 10 ml oplosmiddel B (3.3) ineen tweede maatkolf van 50 ml te brengen.
Verwarm beide kolven gedurende 30 minuten op een kokend waterbad.
Koel af tot kamertemperatuur, vul beide kolven aan tot de streep met
isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en meng. Laatna gedurende 10 à 15
minuten staan en filtreer dan af in kolfjes met ingeslepen stop.
Pipeteer 2 ml van het filtraat van het monster in resp. twee maatkolven
van 25 ml en 2 ml van het filtraat van de blanco in resp. twee andere
maatkolven van 25 ml. Vul van elke serie één maatkolf aan tot 25 ml
metisopropanol-hexaanmengsel (3.1). Deze oplossingen dienen als refe-
rentieoplossingen.
Voeg vervolgens 2 ml aniline (3.4) toe aan de beide overige maatkolven.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad voor het
ontwikkelen van de kleuring. Koel af tot kamertemperatuur, vul aan tot
25 ml metisopropanol-hexaanmengsel (3.1), meng en laatgedurende 1 h
staan.
Meet de extincties als beschreven onder 5.2 voor vrij gossypol. Bereken
uit de verkregen waarde het gehalte aan totaal gossypol als beschreven
onder 6.
6.Berekening van de resultaten
De berekening van de resultaten kan geschieden hetzij op basis van de speci-
fieke extinctie (6.1), dan wel m.b.v. een ijkgrafiek (6.2).
6.1Opbasis van de sp ecifieke extinctie
Onder de beschreven omstandigheden bedragen de specifieke extincties
voor:
vrij gossypol: E1%
1c m¼625
totaal gossypol: E1%
1c m¼600
Het gehalte aan vrij of totaal gossypol in het monster wordt verkregen
uitde onderst aande formule:
percentage gossypol ¼E/C11250
E1%
1c m/C1g/C1v
waarin:
E = gecorrigeerde extinctie, als bepaald onder 5.2
g = gewichtvan hetanalysemat eriaal in grammenv = aliquootdeel van hetfilt raatin ml.
6.2Met behulpvan een ijkgrafiek
6.2.1Vrij gossypol
Neem twee series van telkens 5 maatkolven van 25 ml. Pipeteer in
beide series resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en 10,0 ml gossypol-
standaardoplossing A (3.5). Verdun met oplosmiddel A (3.2) tot
10 ml. Voeg aan elke serie nog een maatkolf van 25 ml toe, die
slechts 10 ml oplosmiddel A (3.2) bevat (blancoproef). Vul de
kolven van de eerste serie, met inbegrip van de blancoproef, aan
tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentieserie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie,
inclusief de blancoproef. Verwarm gedurende 30 minuten op een
kokend waterbad voor het ontwikkelen van de kleuring. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laatgedurende 1 h st aan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 13
▼B
uit door de extincties te stellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.2.2Totaal gossypol
Neem zes maatkolven van 50 ml. Breng in de eerste 10 ml oplos-
middel B (3.3) en in de andere resp. 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 en10,0 ml gossypolstandaardoplossing B (3.6). Verdun de inhoud van
elke kolf tot 10 ml met oplossmiddel B (3.3). Verwarm gedurende
30 minuten op een kokend waterbad. Koel af tot kamertempera-
tuur, vul aan tot 50 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) en
meng.
Pipeteer van deze oplossingen telkens 2,0 ml in resp. twee series
van zes maatkolven van 25 ml. Vul de kolven van de eerste serie
aan tot 25 ml met isopropanol-hexaanmengsel (3.1) (referentie-
serie).
Voeg toe 2 ml aniline (3.4) aan elke kolf van de tweede serie.
Verwarm gedurende 30 minuten op een kokend waterbad. Koel af
tot kamertemperatuur, vul aan tot de streep met isopropanol-hexa-
anmengsel (3.1), meng en laatgedurende 1 h st aan
(standaardserie).
Bepaal de extinctie van elke oplossing van de standaardserie tegen
de corresponderende oplossing van de referentieserie, onder de
omstandigheden als beschreven onder 5.2. Zet de ijkcurve grafisch
uit door de extincties te stellen tegenover de hoeveelheden
gossypol (in µg).
6.3Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in
hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan:
— 15 % relatief bij gehalten van minder dan 500 ppm gossypol;
— niet meer dan 75 ppm absoluut bij gehalten van 500 tot 750 ppm;— 10 % relatief bij gehalten van meer dan 750 ppm gossypol.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 14
▼B
BIJLAGE II
4.BEPALING VAN TYLOSINE
— door middel van agardiffusiemethode —
1.Doel en toepasbaarheid
Deze methode beschrijft de kwantitatieve bepaling van tylosine in voeder-
middelen, voormengsels en concentraten. De ondergrens van de
bepaalbaarheid ligtbij 2 ppm.
2.Principe
Het monster wordt behandeld met een tot 80 ºC verwarmd fosfaatbuffer pH
8, waarna methanol geëxtraheerd wordt. Na centrifugeren wordt het extract
verdund en de antibiotische werking ervan gemeten via de diffusie van het
tylosine in een met Sarcina lutea geëente agarvoedingsbodem. De diffusie
wordtzicht baar gemaaktdoor de vorming van remzones in aanwezigheid
van het micro-organisme. De diameter van deze remzones is rechtevenredig
met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Sarcina lutea ATCC nr. 9341
3.1Bewaren van de stam
Sarcina lutea wordtgeëntin een buisje metschuingest olde agar-
voedingsbodem (4.1), echter op pH 7,0 gebracht. Na een nacht
bebroeden bij ca. 35 ºC wordtdeze cult uur in de ijskastbewaard en
alle veertien dagen op dezelfde wijze overgeënt.
3.2Bereiden van de entsuspensie
Op de in (3.1) beschreven wijze wordt een cultuur op schuingestolde
agar bereid. Direct na het bebroeden wordt deze cultuur in 2 tot 3 ml
fysiologische zoutoplossing (4.4) opgenomen. Met deze suspensie wordt
een Roux-fles met 250 ml gestolde voedingsbodem (4.1), echter op pH
7,0 gebrachtbeënten 24 uur bij 35 ºC bebroed. Vervolgens wordtde
cultuur opgenomen in 25 ml fysiologische zoutoplossing (4.4). Deze
suspensie wordt gehomogeniseerd en verdund tot een lichttransmissie
van ca. 75 % bij 650 nm verkregen wordt. Deze suspensie kan, mits in
de ijskastbewaard, gedurende een week gebruiktworden.
Via voorproeven op platen met voedingsbodem (4.1) dient nagegaan te
worden hoeveel van deze suspensie aan hetmedium moetworden t oege-
voegd om voor de toegepaste concentraties tylosine zo groot mogelijke,
maar nog scherpe remmingszones te verkrijgen. Het enten van de
voedingsbodem vindtbij 48-50 ºC plaat s.
4.Voedingsbodem en reagentia
4.1Voedingsbodem voor de metingen (1)
Glucose 1 g
Pepton (trypton) 10 gVleesextract 1,5 g
Gistextract 3 g
Agar-agar (afhankelijk van
type)10 à 20 g
Gedestilleerd water tot 1000 ml
Voor hetbewaren van de vlam en hetbereiden van de ent suspensie op
pH 7,0 brengen en voor de bepaling op pH 8,0 brengen.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 15
(1) Iedere voedingsbodem uit de handel met overeenkomstige samenstelling, die dezelfde
resultaten geeft, kan gebruikt worden.▼M4
▼B
▼B
4.2Fosfaatbuffer pH 8
MonokaliumfosfaatKH2PO4p.a. 0,523 g
DikaliumfosfaatK2HPO4p.a. 16,730 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.3Fosfaatbuffer pH 7
MonokaliumfosfaatKH2PO4p.a. 5,5 g
DikaliumfosfaatK2HPO4p.a. 13,6 g
Gedestilleerd water tot 1 000 ml
4.4 Steriele fysiologische zoutoplossing.
4.5 Methanol, chemisch zuiver.4.6 Methanol 40 % (v/v).4.6 Mengsel van fosfaatbuffer (4.2)/methanol, chemisch zuiver: 60/40 (vol.).4.8 Standaard: tylosine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Na drogen van de standaard (4.8) (3 uur 60 ºC bij 5 mm kwik) wordt 10-
50 mg afgewogen en in een maarkolf opgelostin 5 ml met hanol (4.5) waarna
aangevuld wordtmetfosfaat buffer pH 7 (4.3). Metdeze buffer wordtverder
verdund tot een tylosine-basisconcentratie van 1000 µg/ml is verkregen.
Uitgaande van deze stamoplossing wordt een werkstandaardoplossing S
8bereid door verdunnen met mengsel (4.7) tot een concentratie van 2 µg tylo-sinebase per ml is verkregen.
Door verdere verdunning (1 + 1) metmengsel (4.7) worden de volgende
concentraties bereid:
S
41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extractie
Van de te onderzoeken concentraten wordt 10 g afgewogen, van voormeng-
sels en voeders 20 g. Van fosfaatbuffer pH 8 (4.2) wordt 60 ml tot 80 ºC
verwarmd en bij de afgewogen monsterhoeveelheid gevoegd, waarna geho-
mogeniseerd wordt gedurende 2 minuten (huishoudmixer, Ultra-Turrax, enz.).
Na 10 minuten staan worden 40 ml methanol (4.5) toegevoegd en wordt nog
eens 5 minuten gehomogeniseerd. Na centrifugeren wordt een aliquot deel
van de bovenstaande vloeistof met mengsel (4.7) verdund tot een verwachte
concentratie aan tylosine van 2 µg/ml (= U8). Vervolgens worden de concen-
traties U4,U2en U1door verder verdunnen (1 + 1) metoplossing (4.7) bereid.
Bij gehalten beneden 10 ppm wordt het extract bij 35 ºC in een rotatiever-
damper drooggedampten in 40 % met hanol (4.6) opgenomen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1Enten van de voedingsbodem
De voedingsbodem (4.1) op pH 8,0 gebrachtwordtmetde ent suspensie
(3.2) bij 48-50 ºC geënt.
7.2Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in (petri) schalen of platen, met de vier stan-
daardconcentraties en de vier monsterconcentraties (S8,S4,S2en S1resp.
U8,U4,U2en U1). Iedere plaat moet beslist alle vier concentraties van
zowel standaard als monster bevatten. De plaatdiameter moet voldoende
zijn om in de agarlaag ten minste acht gaatjes van 10 à 13 mm te kunnen
maken De hoeveelheid te gebruiken voedingsbodem per plaat dient zo
berekend te worden dat een overal even dikke laag van 2 mm dikte
verkregen wordt. Bij voorkeur dienen als schalen te worden gebruikt1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 16
▼B
vlakke glazen platen met een volledig vlakke ring van aluminium of
kunststof van 200 mm diameter en 20 mm hoogte.
In de gaatjes worden met een pipet exact afgemeten hoeveelheden anti-
bioticumoplossing gebracht, waarbij de hoeveelheid, afhankelijk van de
diameter van de gaatjes, tussen 0,10 en 0,15 ml ligt. Voor ieder monster
worden ten minste vier diffusiebepalingen gedaan met iedere concen-
tratie, zodanig dat iedere bepaling neerkomt op het meten van 32
remzones.
7.3Bebroeden
De platen worden gedurende een nacht bij 35-37 ºC bebroed.
8.Meting en berekening
De diameters van de remzones worden bij voorkeur via projectie gemeten.
De gemeten waarden worden op halflogaritmisch papier uitgezet, d.w.z. de
logaritmen van de concentraties tegen de remzonediameters. Indien er bij de
bepaling geen storingen opgetreden zijn, dienen deze lijnen recht en even-
wijdig te zijn.
De logaritme van deze relatieve activiteit wordt volgens de volgende formule
berekend:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Werkelijke activiteit = verwachte activiteit × relatieve activiteit.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde
monster mag niet meer bedragen dan 10 % relatief.
5.BEPALING VAN VIRGINIAMYCINE
— door middel van agardiffusie —
1.Doel en toepassingsgebied
Metdeze met hode kan virginiamycine in diervoeders en in voormengsels
worden bepaald. De ondergrens van de bepaling ligtbij 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Principe
Het monster wordt geëxtraheerd met een methanolische oplossing van Tween
80. Het extract wordt gedecanteerd of gecentrifugeerd en verdund. De anti-
biotische activiteit van het extract wordt bepaald door meting van de
diffusie van virginiamycine op een agarvoedingsbodem die is geëntmet
Micrococcus luteus . De diffusie wordtzicht baar door de vorming van zones
waarin de groei van hetmicro-organisme is geremd. De doorsnede van deze
remmingszones wordt binnen het gebruikte concentratiegebied verondersteld
recht evenredig te zijn met de logaritme van de antibioticumconcentratie.
3.Micro-organisme: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Bewaren van de stam
Buizen metschuingest olde voedingsbodem (4.1) worden geëntmet
Micrococcus luteus en 24 uur bij 30 ºC geïncubeerd. De kweek wordt
in de koelkastbij 4 ºC bewaard. Elke t wee weken wordtopnieuw over-
geënt.
3.2.Bereiding van de bacteriesuspensie (a)
De cultuur van een vers bereid agarbuisje (3.1) wordt gesuspendeerd in
2 à 3 ml natriumchlorideoplossing (4.3). 250 ml voedingsbodem (4.1) in
een Rouxfles wordtmetdeze suspensie geënten 18 t ot20 uur bij 30 ºC
geïncubeerd. Neem de cultuur op in 25 ml natriumchlorideoplossing1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 17
(1) 1 mg virginiamycine komtovereen met1 000 UK-eenheden.
(a) Andere methoden mogen ook worden gebruikt, mits vaststaat dat die dezelfde bacterie-
suspensies opleveren.▼M2
▼M2
(4.3) en meng. Verdun de suspensie 1 op 10 metnat riumchlorideoplos-
sing (4.3). De lichttransmissie van de suspensie, gemeten bij 650 nm in
een cel van 1 cm tegen natriumchlorideoplossing (4.3), moet ongeveer
75 % bedragen. Deze suspensie kan ongeveer één week bij 4 ºC worden
bewaard.
4.Voedingsbodems en reagentia
4.1.Voedingsbodem (a)
Vleespepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Gistextract 3,0 g
Vleesextract 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 10,0 tot 20,0 g
Water 1 000 ml
pH 6,5 (na sterilisatie)
4.2.Fosfaatbuffer pH 6
Dikaliumwaterstoffosfaat, K2HPO42,0 g
Kaliumdiwaterstoffosfaat, KH2PO48,0 g
Water 1 000 ml
4.3. Natriumchlorideoplossing 0,8 % (m/v): los 8 g natriumchloride op in
water en verdun tot 1 000 ml; steriliseer.
4.4. Methanol.4.5. Mengsel van fosfaatbuffer en methanol: meng fosfaatbuffer (4.2) en
methanol (4.4) in de verhouding 80: 20 (v/v).
4.6. Methanolische oplossing van Tween 80, 0,5 % (m/v): los 5 g Tween 80
in methanol (4.4) op en verdun met methanol tot 1 000 ml.
4.7. Standaard: virginiamycine van bekende activiteit.
5.Standaardoplossingen
Los een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid standaard (4.7) in methanol
(4.4) op en verdun met methanol tot een voorraadoplossing van 1 000 µg
virginiamycine per ml.
In een gesloten kolf bij 4 ºC is deze oplossing vijf dagen stabiel.
Bereid, uitgaande van deze voorraadoplossing, door steeds met mengsel (4.5)
te verdunnen, de volgende oplossingen:
S
81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Bereiding van het extract en de meetoplossingen
6.1.Extractie
6.1.1.Produkten met een virginiamycinegehalte tot 100 mg/kg
Weeg 50,0 g monster af, voeg 200 ml van oplossing (4.6) toe en
schud 30 minuten. Laat het mengsel uitzakken of centrifugeer het,
neem 20 ml van de bovenstaande vloeistof en damp deze in een
rotatieverdamper bij een temperatuur van maximaal 40 ºC tot
ongeveer 5 ml in. Verdun hetresidu metmengsel (4.5) t oteen
aangenomen virginiamycinegehalte van 1 µg/ml (= U8).
6.1.2.Produkten met een virginiamycinegehalte hoger dan 100 mg/kg
Weeg ten hoogste 10,0 g monster af, zodat de afgewogen
hoeveelheid 1 tot 50 mg virginiamycine bevat, voeg 100 ml
oplossing (4.6) toe en schud 30 minuten. Laat het mengsel
uitzakken of centrifugeer het en verdun de bovenstaande vloeistof1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 18
(a) In de handel verkrijgbare voedingsbodems van vergelijkbare samenstelling, die dezelfde
resultaten geven, kunnen ook worden gebruikt.
▼M2
vervolgens metmengsel (4.5) t oteen aangenomen virginiamyci-
negehalte van 1 µg/ml (= U8).
6.2.Meetoplossingen
Bereid, uitgaande van oplossing U8, oplossingen U4(aangenomen
gehalte: 0,5 µg/ml), U2(verondersteld gehalte: 0,25 µg/ml) en U1(veron-
dersteld gehalte 0,125 µg/ml) door steeds 1 op 1 met mengsel (4.5) te
verdunnen.
7.Uitvoering van de bepaling
7.1.Enten van de voedingsbodem
Entde voedingsbodem voor de bepaling (4.1) bij ongeveer 50 ºC metde
bacteriesuspensie (3.2). In voorafgaande proeven op platen met
voedingsbodem (4.1) wordtde hoeveelheid bact eriesuspensie bepaald
die bij de verschillende concentraties virginiamycine tot de grootste en
duidelijkste remmingszones leidt.
7.2.Bereiden van de platen
De agardiffusie vindt plaats op platen met de vier standaardoplossingen
(S8,S4,S2en S1) en de vier meetoplossingen (U8,U4,U2en U1). Op elke
plaat moeten alle vier concentraties van standaard en van extract worden
opgebracht. Daarom moeten de afmetingen van de platen zo worden
gekozen dat op de agarvoedingsbodem plaats is voor ten minste acht
gaatjes van 10 tot 13 mm doorsnede, waarvan de middelpunten niet
minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. Voor de bepaling kunnen
vlakke glazen platen worden gebruikt, waarop aluminium- of plastic-
ringen van 200 mm doorsnede en 20 mm hoogte worden gelegd.
Gietop de plat en een hoeveelheid voedingsbodem (4.1), geëntals
aangegeven bij punt 7.1, zodat een laag van ongeveer 2 mm dik ontstaat
(60 ml voor een plaatmeteen doorsnede van 200 mm). Laatde
voedingsbodem in horizontale stand stollen, pons er de gaatjes in en
breng er exact afgemeten hoeveelheden standaard en extract in (0,10
tot 0,15 ml per gaatje, afhankelijk van de doorsnede). Breng iedere
concentratie ten minste in viervoud aan, zodat iedere bepaling als grond-
slag voor de berekening 32 remmingszones heeft.
7.3.Incuberen
Incubeer de platen 16 tot 18 uur bij 30 ºC ± 2 ºC.
8.Meting en berekening
Meetde doorsnede van de remmingszones t otop 0,1 mm nauwkeurig. Zet
voor elke concentratie de gemiddelde waarden op half-logaritmisch papier
uit, zodat de logaritme van de concentraties tegen de doorsnede van de
remmingszones komt te staan. Trek de best passende lijnen, zowel voor de
standaard als voor het extract, en ga daarbij bij voorbeeld als volgt te werk:
Bepaal het meest passende punt voor de laagste standaardwaarde (SL)
volgens de formule:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Bepaal het meest passende punt voor de hoogste standaardwaarde (SH)
volgens de formule:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Bepaal op dezelfde wijze de meest passende punten voor de laagste extract-
waarde (UL) en de hoogste extractwaarde (UH) door in bovenstaande
formules s1,s2,s4en s8door u1,u2,u4en u8te vervangen.
Vul de waarden SL en SH in dezelfde grafiek in. Door deze twee punten te
verbinden, krijgt men de meest passende rechte voor de standaardoplossing.
Op dezelfde wijze verkrijgtmen metUL en UH de meestpassende recht e
voor het extract.
Wanneer er geen enkele storing is, moeten de rechten evenwijdig zijn. In de
praktijk kunnen de rechten als evenwijdig worden beschouwd wanneer (SH
— SL) en (UH — UL) nietmeer dan 10 % van hun gemiddelde afwijken.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 19
▼M2
Als de rechten niet evenwijdig zijn, kan men hetzij u1en s1, hetzij u8en s8uitsluiten. De waarden SL, SH, UL en UH waarmee men dan de meest
passende rechten kan trekken, worden dan berekend volgens de volgende
formules:
(a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6of5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6of5s2þ2s4/C0s2
6
en analoge formules voor UL en UH. Nu moetwel aan bovengenoemde eis
van evenwijdigheid zijn voldaan. Wanneer het resultaat uit drie concentraties
is berekend, moetditop hetanalysecert ificaatvermeld worden.
Wanneer de rechten als evenwijdig beschouwd kunnen worden, wordt de
logaritme van de relatieve activiteit (log A) berekend volgens één van de
volgende formules, afhankelijk van hetbereiken van evenwijdigheid met4
of 3 concentraties:
Voor 4 concentraties:
(c) Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Voor 3 concentraties:
(d) Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
of
(d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Activiteit van het monsterextract = activiteit van de bijbehorende standaard ×
A:
(U8=S8×A )
Blijkt de relatieve activiteit buiten het gebied 0,5 tot 2,0 te liggen, dan moet
de bepaling worden herhaald met geschikte aanpassingen aan de extractcon-
centraties of, indien zulks onmogelijk is, aan de standaardoplossingen. Indien
de relatieve activiteit niet in dit vereiste gebied kan worden gebracht, moet
hetresult aatals een benadering worden beschouwd en als zodanig op het
analysecertificaat worden vermeld.
Wanneer de rechten niet als evenwijdig beschouwd kunnen worden, moet de
bepaling worden herhaald. Wanneer dan nog steeds geen evenwijdige rechten
zijn verkregen, moetde bepaling als nietbevredigend worden beschouwd.
Geef de uitkomst weer in milligram virginiamycine per kilogram voeder.
9.Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen aan hetzelfde monster
uitgevoerd door dezelfde analist mag niet groter zijn dan:
— 2 mg/kg in absolute waarde bij virginiamycinegehalten tot 10 mg/kg;
— 20 % van de hoogste waarde bij gehalten van 10 tot 25 mg/kg;— 5 mg/kg in absolute waarde bij gehalten van 25 tot 50 mg/kg;— 10 % van de hoogste waarde bij gehalten van meer dan 50 mg/kg.1972L0199 — NL — 13.08.1998 — 004.001 — 20