1991R2568 — NL — 04.08.2016 — 029.001

Onderstaande tekst dient louter ter informatie en is juridisch niet bindend. De EU-instellingen zijn niet aansprakelijk voor de inhoud. Alleen de besluiten die zijn gepubliceerd in het Publicatieblad van de Europese Unie (te raadplegen in EUR-Lex) zijn authentiek. Deze officiële versies zijn rechtstreeks toegankelijk via de links in dit document

Gewĳzigd bĳ:





Gerectificeerd bĳ:









▼B

VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE

van 11 juli 1991

inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven en de desbetreffende analysemethoden







▼M20

Artikel 1

1. Als „olijfoliën van eerste persing” in de zin van punt 1, onder a) en b), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG worden aangemerkt de oliën waarvan de respectieve kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punten 1 en 2, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

2. Als „olijfolie voor verlichting” in de zin van punt 1, onder c), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 3, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

3. Als „geraffineerde olijfolie” in de zin van punt 2 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 4, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

4. Als „olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing” in de zin van punt 3 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 5, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

5. Als „ruwe olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 4 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 6, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

6. Als „geraffineerde olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 5 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 7, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

7. Als „olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 6 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 8, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

▼M26

Artikel 2

1. De in bijlage I vastgestelde kenmerken van de oliën worden aan de hand van de volgende analysemethoden bepaald:

a) voor de bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, uitgedrukt in een percentage oliezuur, de in bijlage II beschreven methode;

b) voor de bepaling van het peroxidegetal, de in bijlage III beschreven methode;

c) voor de bepaling van het gehalte aan was, de in bijlage IV beschreven methode;

d) voor de bepaling van de samenstelling van en het gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie, de in bijlage V beschreven methode;

e) voor de bepaling van het percentage 2-glycerylmonopalmitaat, de in bijlage VII beschreven methode;

f) voor de spectrofotometrische analyse, de in bijlage IX beschreven methode;

▼M28

g) voor de bepaling van de vetzuursamenstelling, de in bijlage X beschreven methode;

▼M26

h) voor de bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen, de in bijlage XI beschreven methode;

i) voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie, de in bijlage XII beschreven methode;

j) voor de bepaling van stigmastadiënen, de in bijlage XVII beschreven methode;

k) voor de bepaling van het gehalte aan triglyceriden met ECN42, de in bijlage XVIII beschreven methode;

▼M28

l) voor de bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen, de in bijlage XIX beschreven methode;

▼M26

m) voor de bepaling van het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren, de in bijlage XX beschreven methode.

▼M28 —————

▼M26

2. De verificatie van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers wordt uitgevoerd door een door de lidstaten erkend proeverspanel.

De organoleptische kenmerken van in de eerste alinea genoemde olie zijn die van de voor de olijfolie opgegeven categorie wanneer een door de betrokken lidstaat erkend panel de indeling in die categorie bevestigt.

Wanneer het panel de indeling van de olie ten aanzien van de organoleptische kenmerken van de opgegeven categorie niet bevestigt, laten de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers op verzoek van de belanghebbende onverwijld twee tegenanalyses door andere proeverspanels uitvoeren, waarvan minstens één door een panel dat is erkend door de lidstaat van de betrokken producent. Er wordt aangenomen dat de betrokken kenmerken overeenstemmen met de opgegeven kenmerken als de twee tegenanalyses de indeling bevestigen. Zo niet, komen de kosten van de tegenanalyses voor rekening van de belanghebbende.

3. Wanneer de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers de kenmerken van de olie overeenkomstig lid 1 verifiëren, worden monsters voor de controle van de kenmerken van de in lid 1 bedoelde olie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers worden genomen volgens de internationale normen EN ISO 661 met betrekking tot de voorbehandeling van het monster en EN ISO 5555 met betrekking tot de monsterneming. In afwijking van punt 6.8 van norm EN ISO 5555 worden echter voor partijen van dergelijke oliën in onmiddellijke verpakkingen monsters genomen volgens bijlage I bis bij deze verordening. In het geval van bulkoliën waarvoor de bemonstering niet kan worden uitgevoerd in overeenstemming met EN ISO 5555 wordt de bemonstering uitgevoerd in overeenstemming met de door de bevoegde autoriteit van de lidstaat verstrekte instructies.

Onverminderd het bepaalde in norm EN ISO 555 en hoofdstuk 6 van norm EN ISO 661 worden de genomen monsters zo snel mogelijk tegen licht en hitte beschermd en niet later dan de vijfde werkdag na het nemen verzonden naar het laboratorium voor analyse; anders worden de monsters op zodanige wijze bewaard dat zij niet aan kwaliteit verliezen of beschadigd raken tijdens het vervoer of de opslag voordat zij naar het laboratorium worden gezonden.

4. Voor de in lid 3 bedoelde verificatie worden in het geval van verpakte producten de in de bijlagen II, III, IX, XII en XX bepaalde analyses en in voorkomend geval de door de nationale wetgevingen voorgeschreven tegenexpertises uitgevoerd vóór de datum van minimale houdbaarheid. Voor bulkoliën worden deze analyses niet later uitgevoerd dan de zesde maand na de maand waarin het monster is genomen.

Voor de andere in deze verordening bepaalde analyses is geen termijn van toepassing.

Als de resultaten van de analyses niet beantwoorden aan de kenmerken van de aangegeven categorie olijfolie of olie uit perskoeken van olijven, wordt de betrokkene hiervan uiterlijk één maand vóór het verstrijken van de in de eerste alinea bedoelde termijn in kennis gesteld, tenzij het monster minder dan twee maanden vóór de datum van minimale houdbaarheid is genomen.

5. Voor de bepaling van de kenmerken van olijfolie volgens de in de lid 1, eerste alinea, aangegeven methoden, worden de analyseresultaten rechtstreeks vergeleken met de in deze verordening vastgestelde grenswaarden.

▼M25

Artikel 2 bis

1. In het kader van dit artikel wordt onder „in de handel gebrachte olijfolie” verstaan: de totale hoeveelheid olijfolie en olie uit afvallen van olijven van een bepaalde lidstaat die in die lidstaat wordt verbruikt of die wordt uitgevoerd uit die lidstaat.

2. De lidstaten zien erop toe dat op een risicoanalyse gebaseerde normcontroles zorgvuldig en voldoende frequent worden verricht om te garanderen dat de in de handel gebrachte olijfolie overeenstemt met de opgegeven categorie.

3. Als criteria voor de beoordeling van het risico kunnen de volgende gegevens in aanmerking worden genomen:

a) de categorie olie, de productieperiode, de prijs van de olie in verhouding tot andere plantaardige oliën, de meng- en verpakkingshandelingen, de opslagvoorzieningen en -omstandigheden, het land van oorsprong, het land van bestemming, de vervoermiddelen of het volume van de partij;

b) de positie van de marktdeelnemers in de afzetketen, het volume en/of de waarde van de door hen afgezette producten, de verschillende categorieën olie die zij in de handel brengen, de aard van hun werkzaamheden, zoals malen, opslag, raffinage, mengen, verpakken of kleinhandel;

c) uitkomsten van eerdere controles, waaronder het aantal en de aard van de geconstateerde afwijkingen, de gebruikelijke kwaliteit van de in de handel gebrachte olie, het prestatieniveau van de gebruikte technische uitrusting;

d) de betrouwbaarheid van de door de marktdeelnemer gebruikte kwaliteitsborgingssystemen of internecontrolesystemen met betrekking tot de naleving van de handelsnormen;

e) de plaats waar de controle wordt uitgevoerd, in het bijzonder als het gaat over de plaats waar de olie de Unie binnenkomt, waar deze de Unie verlaat of waar deze wordt geproduceerd, verpakt, geladen of verkocht aan de eindverbruiker;

f) andere gegevens die kunnen wijzen op een risico van niet-naleving.

4. De lidstaten stellen vooraf het volgende vast:

a) de criteria voor de beoordeling van het risico dat partijen niet aan de handelsnormen voldoen;

b) op basis van een risicoanalyse voor elke risicocategorie, het minimumaantal marktdeelnemers of partijen en/of hoeveelheden die aan een normcontrole zullen worden onderworpen.

Jaarlijks wordt ten minste één normcontrole verricht per duizend ton olijfolie die in de lidstaat in de handel wordt gebracht.

5. De lidstaten gaan de naleving na door:

a) de in bijlage I voorgeschreven analyses uit te voeren in om het even welke volgorde; of

b) de in bijlage I ter betreffende het beslissingsschema bepaalde volgorde te volgen totdat dit proces uitmondt in een van de in dat schema vermelde beslissingen.

▼M19 —————

▼M25

Artikel 3

Wanneer wordt geconstateerd dat een bepaalde olie verschilt van de beschrijving van de categorie waartoe deze behoort, past de betrokken lidstaat, onverminderd eventuele andere sancties, doeltreffende, evenredige en afschrikkende boeten toe, waarvan de hoogte wordt bepaald op basis van de ernst van de geconstateerde onregelmatigheid.

Wanneer bij controles significante onregelmatigheden aan het licht komen, verrichten de lidstaten frequentere controles van het handelsstadium, de categorie olie, de oorsprong of andere parameters.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Voor de beoordeling en controle van de organoleptische kenmerken door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordiger kunnen de lidstaten panels van proevers erkennen.

De erkenningsvoorwaarden worden door de lidstaten vastgesteld en wel zodanig dat:

— aan de voorwaarden van punt 4 van bijlage XII wordt voldaan;

— de voorzitter van het panel wordt opgeleid door een daartoe door de lidstaat erkende instelling en onder door de lidstaat goedgekeurde voorwaarden;

— de geldigheid van de erkenning afhankelijk wordt gemaakt van de resultaten van een jaarlijkse controle door de lidstaat.

Elke lidstaat stelt de Commissie in kennis van de lijst van erkende panels en van de overeenkomstig dit lid genomen maatregelen.

▼M5

2. Ingeval een Lid-Staat op zijn grondgebied moeilijk een panel van proevers kan instellen, mag hij een beroep doen op een door een andere Lid-Staat erkend panel.

3. Elke Lid-Staat stelt de lijst op van de door beroepsorganisaties of sectorale organisaties overeenkomstig de in lid 1 vermelde voorwaarden ingestelde panels van proevers en ziet toe op de naleving van deze voorwaarden.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Het oliegehalte van afvallen van olijven en van de andere bij de winning van olijfolie verkregen afvallen (GN-codes 2306 90 11 en 2306 90 19 ) wordt bepaald overeenkomstig de in bijlage XV opgenomen methode.

2. Het in lid 1 bedoelde oliegehalte wordt uitgedrukt in gewichtspercenten berekend over de droge stof.

▼M20

Artikel 7

De communautaire bepalingen betreffende de aanwezigheid van verontreinigende stoffen zijn van toepassing.

Wat het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen betreft, gelden voor alle categorieën olijfolie de volgende grenswaarden:

— maximumgehalte voor elk gedetecteerd gehalogeneerd oplosmiddel: 0,1 mg/kg,

— maximumgehalte voor de som van de gedetecteerde gehalogeneerde oplosmiddelen: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikel 7 bis

De natuurlijke of rechtspersonen en de groepen personen die, in welke hoedanigheid dan ook, beroepshalve of voor handelsdoeleinden olijfolie en olie uit afvallen van olijven, vanaf de winning in de molen tot en met de botteling, in hun bezit hebben, zijn verplicht registers bij te houden waarin met name elke in- of uitslag van elke categorie van deze oliën wordt vermeld.

De lidstaten zien erop toe dat de in de eerste alinea bedoelde verplichting naar behoren wordt nageleefd.

▼M25

Artikel 8

1. De lidstaten stellen de Commissie in kennis van de ter uitvoering van deze verordening genomen maatregelen. Zij stellen de Commissie in kennis van latere wijzigingen.

2. Uiterlijk op 31 mei van elk jaar dienen de lidstaten bij de Commissie een verslag in over de tenuitvoerlegging van deze verordening in het voorgaande kalenderjaar. Dit verslag bevat op zijn minst de resultaten van de volgens de modellen in bijlage XXI op olijfolie verrichte normcontroles.

3. De in deze verordening bedoelde kennisgevingen worden gedaan overeenkomstig Verordening (EG) nr. 792/2009 van de Commissie ( 1 ).

▼B

Artikel 9

Verordening (EEG) nr. 1058/77 wordt hierbij ingetrokken.

Artikel 10

1. Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.

De in bijlage XII beschreven methode wordt, behalve voor verrichtingen in het kader van de interventieregeling, met ingang van ►M1 1 november 1992 ◄ toegepast.

▼M5

Deze methode geldt niet voor olijfolie van de eerste persing die vóór 1 november 1992 is verpakt.

▼B

2. Deze verordening is niet van toepassing op olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn verpakt en tot en met 31 oktober 1992 worden verkocht.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.









BIJLAGEN

Inhoudsopgave







Bijlage I: Kenmerken van olijfolie Bijlage I bis: Bemonstering van olijfolie of olie uit perskoeken van olijven die worden geleverd in onmiddellijke verpakkingen Bijlage I ter: Beslissingsschema om na te gaan of een monster olijfolie overeenstemt met de aangegeven categorie Bijlage II: Bepaling van vrije vetzuren, koude methode Bijlage III: Bepaling van het peroxidegetal Bijlage IV: Bepaling van het wasgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie Bijlage V: Bepaling van de samenstelling van en het gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie Bijlage VII: ►M21 Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat ◄ ▼M20 ————— ▼B Bijlage IX: Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied ▼M28 Bijlage X: Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren ▼B Bijlage XI: Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen Bijlage XII: Methode van de internationale olijfolieraad voor de organoleptische beoordeling van olijfolie van de eerste persing ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Bijlage XV: Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven Bijlage XVI: Bepaling van het joodgetal Bijlage XVII: Methode voor de bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën Bijlage XVIII: Bepaling van het verschil tussen het werkelijke en het theoretische gehalte aan triacylglycerolen met ECN 42 Bijlage XIX: ►M28 Bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen middels capillaire gaschromatografie ◄ ▼M23 Bijlage XX: Methode voor de bepaling van het gehalte aan wassen, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren met behulp van capillaire gaschromatografie ▼M28 ————— ▼M25 Bijlage ХХI: Resultaten van de conformiteitscontroles van olijfoliën als bedoeld in artikel 8, lid 2

▼M27









BIJLAGE I

KENMERKEN VAN OLIJFOLIE







Categorie Ethylesters van vetzuren (FAEE's) (*) Zuurgraad (%) (*) Peroxidegetal mEq O2/kg (*) Was mg/kg (**) Glycerol-2-monopalmitaat (%) Stigmastadiënen mg/kg (1) Verschil: ECN42 (HPLC) en ECN42 (theoretische berekening) K232 (*) K268 of K270 (*) Delta-K (*) Organoleptische beoordeling Mediaan voor de gebreken (Md) (*) Organoleptische beoordeling Mediaan „fruitig” (Mf) (*) 1. Extra olijfolie van eerste persing FAEE's ≤ 40 mg/kg (oogstjaar 2013-2014) (2) FAEE's ≤ 35 mg/kg (oogstjaar 2014-2016) FAEE's ≤ 30 mg/kg (na oogstjaar 2016) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % 2. Olijfolie van eerste persing — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % 3. Olijfolie voor verlichting — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14 % 4. Geraffineerde olijfolie — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14 % 5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % 6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olie uit perskoeken van olijven — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Totaal van de isomeren dat (al dan niet) kan worden gescheiden over een capillaire kolom. (2) Deze grenswaarde is van toepassing op olijfoliën die vanaf 1 maart 2014 worden geproduceerd. (3) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als olijfolie voor verlichting aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen niet hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol niet meer bedraagt dan 3,5 %. (4) Of de mediaan voor de gebreken is lager dan of gelijk aan 3,5 en de mediaan „fruitig” is gelijk aan 0. (5) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als ruwe olie uit perskoeken van olijven aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen hoger is dan 350 mg/kg en wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol meer bedraagt dan 3,5 %.







Categorie Vetzuursamenstelling (1) Totaal transoliezuurisomeren (%) Totaal translinolzuur en translinoleenzuurisomeren (%) Sterolsamenstelling Totaal sterolen (mg/kg) Erytrodiol en uvaol (%) (**) Myristinezuur (%) Linoleenzuur (%) Arachidezuur (%) Eicosaanzuur (%) Beheenzuur (%) Lignocerinezuur (%) Cholesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (2) (%) Stigmasterol (%) App β-sitosterol (3) (%) (**) Delta-7-stigmastenol (2) (%) 1. Extra olijfolie van eerste persing ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Olijfolie van eerste persing ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Olijfolie voor verlichting ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Geraffineerde olijfolie ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Ruwe olie uit perskoeken van olijven ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olie uit perskoeken van olijven ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Gehalte aan andere vetzuren (%): palmitinezuur: 7,50-20,00; palmitoleïnezuur: 0,30-3,50; heptadecaanzuur: ≤ 0,30; heptadeceenzuur: ≤ 0,30; stearinezuur: 0,50-5,00; oliezuur: 55,00-83,00; linolzuur: 2,50-21,00. (2) Zie het aanhangsel bij deze bijlage. (3) App β-sitosterol: delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol. (4) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als olijfolie voor verlichting aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen niet hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol niet meer bedraagt dan 3,5 %. (5) Olie met een wasgehalte van 300 mg/kg tot 350 mg/kg wordt als ruwe olie uit perskoeken van olijven aangemerkt wanneer het totaalgehalte aan alifatische alcoholen hoger is dan 350 mg/kg of wanneer het gehalte aan erytrodiol en uvaol meer bedraagt dan 3,5 %.

Opmerkingen:

a) De resultaten van de analyses moeten worden opgegeven met hetzelfde aantal decimale cijfers als in de normen voor elk kenmerk. De laatste significante decimaal wordt naar boven afgerond als de volgende decimaal hoger is dan 4.

b) Om olie in een andere categorie in te delen of qua zuiverheid onvoldoende te verklaren, volstaat het dat een van de kenmerken niet aan de vastgestelde normen beantwoordt.

c) Bij de kenmerken met een asterisk (*) die betrekking hebben op de kwaliteit van de olie, geldt: — voor olijfolie voor verlichting kunnen beide relevante grenswaarden tegelijkertijd verschillen van de vermelde waarden; — voor olijfolie van eerste persing wordt, wanneer minstens een van deze grenswaarden afwijkt van de vermelde waarden, de categorie van de olijfolie gewijzigd, maar wordt de olie wel ingedeeld in een van de categorieën olijfolie van eerste persing.

d) Bij de kenmerken met dubbele asterisk (**) geldt voor alle oliën uit perskoeken van olijven dat beide relevante grenswaarden tegelijkertijd kunnen afwijken van de vermelde waarden.









Aanhangsel

BESLISSINGSSCHEMA

Beslissingssschema betreffende campesterol voor olijfolie van eerste persing en extra olijfolie van eerste persing:

De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.

Beslissingsschema betreffende delta-7-stigmastenol voor:

— Olijfolie van eerste persing en extra olijfolie van eerste persing —

De andere parameters moeten aan de in deze verordening vastgestelde grenswaarden voldoen.

— Olie uit perskoeken van olijven (ruw en geraffineerd) —

▼M26









BIJLAGE I bis

BEMONSTERING VAN OLIJFOLIE OF OLIE UIT PERSKOEKEN VAN OLIJVEN DIE WORDEN GELEVERD IN ONMIDDELLIJKE VERPAKKINGEN

Onderstaande bemonsteringsmethode is van toepassing op partijen olijfolie of olie uit perskoeken van olijven in onmiddellijke verpakkingen. Er zijn verschillende bemonsteringsmethoden van toepassing, afhankelijk van of de onmiddellijke verpakking groter is dan 5 liter of niet.

Onder "partij" wordt verstaan een verzameling voor verkoop bestemde eenheden die onder zodanige omstandigheden zijn geproduceerd, vervaardigd en verpakt dat de olie in al deze eenheden als homogeen wordt beschouwd wat alle analytische kenmerken betreft. De afzonderlijke identificatie van een partij moet worden uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2011/91/EU van het Europees Parlement en de Raad ( 2 ).

Onder "increment" wordt verstaan: de hoeveelheid olie in een onmiddellijke verpakking die afkomstig is van een willekeurig punt in de partij.

1. SAMENSTELLING VAN EEN PRIMAIR MONSTER

1.1. Onmiddellijke verpakking van maximaal 5 liter

Onder "primair monster" voor onmiddellijke verpakkingen van maximaal 5 liter wordt verstaan: het aantal incrementen genomen uit een partij en in overeenstemming met tabel 1.







Tabel 1 Het primaire monster omvat ten minste In het geval van onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van moet het primaire monster olie bevatten van a) 1 liter of meer, a) 1 onmiddellijke verpakking, b) minder dan 1 liter, b) het minimumaantal verpakkingen met een totale capaciteit van minstens 1,0 liter.

Het in tabel 1 vermelde aantal verpakkingen dat een primair monster vormt, kan door elke lidstaat naar eigen behoefte worden verhoogd (bijvoorbeeld organoleptische beoordeling door een ander laboratorium dan het laboratorium dat de chemische analyses heeft uitgevoerd, contra-analyse enz.).

1.2. Onmiddellijke verpakking van meer dan 5 liter

Onder "primair monster" voor onmiddellijke verpakkingen van meer dan 5 liter wordt verstaan: een representatief deel van het totale aantal incrementen, verkregen door het monster exemplaren in overeenstemming met tabel 2 te verkleinen. Het primaire monster moet bestaan uit verschillende voorbeelden.

Onder "exemplaar" van een primair monster wordt verstaan: elk van de verpakkingen waaruit het primaire monster bestaat.







Tabel 2 Minimumaantal te selecteren incrementen Aantal verpakkingen in de partij Minimumaantal te selecteren incrementen Tot en met 10 1 Van … 11 tot en met 150 2 Van … 151 tot en met 500 3 Van … 501 tot en met 1 500 4 Van … 1 501 tot en met 2 500 5 > 2 500 per 1 000 verpakkingen 1 extra increment

Om het volume van de bemonsterde onmiddellijke verpakkingen te verkleinen, wordt de inhoud van de bemonsterde incrementen gehomogeniseerd voor de bereiding van het primaire monster. De porties van de verschillende incrementen worden in één recipiënt gegoten om door middel van roeren te worden gehomogeniseerd, zodat het zo goed mogelijk wordt beschermd tegen lucht.

De inhoud van het primaire monster moet in een reeks verpakkingen met elk een minimale capaciteit van 1,0 liter worden gegoten; elk van de verpakkingen vormt een exemplaar van het primaire monster.

Het aantal primaire monsters kan door elke lidstaat naar eigen behoefte worden verhoogd (bijvoorbeeld organoleptische beoordeling door een ander laboratorium dan het laboratorium dat de chemische analyses heeft uitgevoerd, contra-analyse enz.).

Elke verpakking moet op zodanige wijze worden gevuld dat de luchtlaag aan de bovenzijde minimaal is en daarna zodanig worden gesloten en verzegeld dat niet met het product kan worden gefraudeerd.

Deze exemplaren moeten worden voorzien van een etiket om de juiste identificatie te verzekeren.

2. ANALYSES EN RESULTATEN

2.1. Elk primair monster moet worden onderverdeeld in laboratoriummonsters, in overeenstemming met punt 2.5 van norm EN ISO 5555 en worden geanalyseerd in de volgorde die is weergegeven in het beslissingsschema dat is opgenomen in bijlage 1 bis of in een andere willekeurige volgorde.

2.2. Indien alle resultaten van de analyses overeenstemmen met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de partij in haar geheel als in overeenstemming met de voorschriften beschouwd. Indien één van de resultaten van de analyses niet overeenstemt met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de voorschriften beschouwd.

3. VERIFICATIE VAN DE CATEGORIE VAN DE PARTIJ

3.1. Om de categorie van de partij te verifiëren, kan de bevoegde autoriteit het aantal primaire monsters dat op verschillende punten in de partij wordt genomen, verhogen overeenkomstig de volgende tabel:



Tabel 3 Aantal primaire monsters vastgesteld aan de hand van de omvang van de partij Omvang van de partij (liter) Aantal primaire monsters Minder dan 7 500 2 Van 7 500 tot minder dan 25 000 3 Van 25 000 tot minder dan 75 000 4 Van 75 000 tot minder dan 125 000 5 Gelijk aan of meer dan 125 000 6 + 1 voor elke extra 50 000 liter Elk increment waaruit een primair monster bestaat, moet worden genomen van een continue plaats in de partij; de locatie van elk primair monster moet worden genoteerd en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd. Elk primair monster moet worden gevormd overeenkomstig de in de punten 1.1 en 1.2 bedoelde procedures. Elk primair monster wordt dan onderworpen aan de in artikel 2, lid 1, bedoelde analyses.

3.2. Indien een van de resultaten van de in artikel 2, lid 1, bedoelde analyses van minstens één primair monster niet overeenstemt met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de bemonsterde partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de voorschriften beschouwd.









BIJLAGE 1 ter

BESLISSINGSSCHEMA OM NA TE GAAN OF EEN MONSTER OLIJFOLIE OVEREENSTEMT MET DE AANGEGEVEN CATEGORIE

Tabel 1

Tabel 2

Tabel 3









Aanhangsel 1







Equivalentietabel tussen de bijlagen bij deze verordening en de in het beslissingsschema vermelde analyses — Zuurgraad Bijlage II Bepaling van vrije vetzuren, koude methode — Peroxidegetal Bijlage III Bepaling van het peroxidegetal — UV-spectrometrie Bijlage IX Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied — Organoleptische beoordeling Bijlage XII Organoleptische beoordeling van olijfolie van de eerste persing — Ethylesters Bijlage XX Methode voor de bepaling van het gehalte aan was, methylesters van vetzuren en ethylesters van vetzuren met behulp van capillaire gaschromatografie — 3,5-Stigmastadieen Bijlage XVII Methode voor de bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën ▼M28 — Transisomeren van vetzuren Bijlage X Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren — Gehalte aan vetzuren Bijlage X Gaschromatografische bepaling van methylesters van vetzuren ▼M26 — ΔECN42 Bijlage XVIII Bepaling van triglyceriden met ECN42 (verschil tussen HPLC-gegevens en theoretisch gehalte) — Sterolsamenstelling en totaal gehalte aan sterolen — Erytrodiol en uvaol Bijlage V Bepaling van de samenstelling van en het gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie — Wassen Bijlage IV Bepaling van het wasgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie ▼M28 — Alifatische en triterpeenalcoholen Bijlage XIX Bepaling van het gehalte aan alifatische en triterpeenalcoholen middels capillaire gaschromatografie ▼M26 — Verzadigde vetzuren op de 2-positie Bijlage VII Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat

▼M29









BIJLAGE II

BEPALING VAN VRIJE VETZUREN, KOUDE METHODE

1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

Deze methode beschrijft hoe het gehalte aan vrije vetzuren in olijfolie en olie uit perskoeken van olijven moet worden bepaald. Het gehalte aan vrije vetzuren wordt uitgedrukt in de zuurgraad die is berekend als percentage oliezuur.

2. PRINCIPE

Oplossing van het monster in een mengsel van oplosmiddelen, daarna titrering van de aanwezige vrije vetzuren met behulp van een oplossing van kaliumhydroxide of natriumhydroxide.

3. REAGENTIA

Alle reagentia moeten p.a. zijn en het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

3.1. Diëthylether — 95 % ethanol (v/v), mengsel 1:1 (v/v) in volume. Neutraliseer, precies op het ogenblik van gebruik, met de kaliumhydroxide-oplossing (3.2), in aanwezigheid van 0,3 ml fenolftaleïne-oplossing (3.3) voor 100 ml mengsel. Opmerking 1: Diëthylether is zeer ontvlambaar en kan explosieve peroxiden vormen. Bij gebruik ervan dienen bijzondere voorzorgen te worden genomen. Opmerking 2: Indien gebruik van diëthylether onmogelijk is, kan een mengsel van uit ethanol en tolueen bestaande oplosmiddelen worden gebruikt. Zo nodig kan ethanol worden vervangen door propanol-2.

3.2. Kaliumhydroxide of natriumhydroxide, in ethanol of water getitreerde oplossing, c(KOH) [of c(NaOH)], ongeveer 0,1 mol/l of, indien nodig, c(KOH) [of c(NaOH)], ongeveer 0,5 mol/l. Oplossingen zijn in de handel verkrijgbaar. De precieze concentratie van de kaliumhydroxideoplossing (of de natriumhydroxideoplossing) dient bekend te zijn en vóór gebruik te worden geverifieerd. Gebruik een oplossing die minstens vijf dagen voor gebruik is bereid en is gedecanteerd in een donkerbruine, met een rubberen stop gesloten fles. De oplossing dient kleurloos of strogeel te zijn. Indien fasescheiding optreedt bij gebruik van een oplossing in water van kaliumhydroxide (of natriumhydroxide), een oplossing in ethanol in plaats van in water gebruiken. Opmerking 3: Een stabiele, kleurloze oplossing van kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) kan op de volgende wijze worden bereid. 1 000 ml ethanol of water op temperatuur en gedurende één uur koken, met reflux, met 8 g kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) en 0,5 g aluminiumsnippers. Onmiddellijk distilleren. In het distillaat de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) oplossen. Verschillende dagen laten rusten en het heldere supernatant van het neerslag van kaliumcarbonaat (of natriumcarbonaat) decanteren. De oplossing kan ook zonder distillatie op de volgende wijze worden bereid: aan 1 000 ml ethanol (of water) 4 ml aluminiumbutylaat toevoegen en het mengsel enkele dagen laten staan. Het supernatant decanteren en de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) erin oplossen. De oplossing is klaar voor gebruik.

3.3. Fenolftaleïne, oplossing van 10 g/l in 95-96 % ethanol (v/v) of alkaliblauw 6B of thymolftaleïne, oplossing van 20 g/l in 95-96 % ethanol (v/v). Bij sterk gekleurde oliën dient alkaliblauw of thymolftaleïne te worden gebruikt.

4. APPARATUUR

Gebruikelijk laboratoriummateriaal, en met name:

4.1. analytische balans;

4.2. kolf van 250 ml;

4.3. buret van 10 ml, klasse A, met een schaalverdeling van 0,05 ml, of gelijkwaardige automatische buret.

5. WERKWIJZE

5.1. Bereiding van het analysemonster

Een troebel monster moet worden gefiltreerd.

5.2. Monsterweging

Houd bij het nemen van het monster rekening met de verwachte zuurgraad volgens de gegevens van de volgende tabel.







Verwachte zuurgraad (zuurgraad van de olie in g/100 g) Hoeveelheid af te wegen monster (g) Nauwkeurigheid van de weging van het monster (g) 0 t/m 2 10 0,02 > 2 t/m 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Weeg het monster in de kolf (4.2).

5.3. Bepaling

Los het monster (5.2) op in 50 tot 100 ml van het mengsel diëthylether/ethanol (3.1) dat tevoren is geneutraliseerd.

Titreer, al schuddend, met de oplossing 0,1 mol/l kaliumhydroxide (of natriumhydroxide) (3.2) (zie opmerking 4) tot omslag van de indicator (de kleuring van de gekleurde indicator houdt ten minste 10 seconden aan).

Opmerking 4: Als de nodige hoeveelheid 0,1 mol/l kaliumhydroxideoplossing (of natriumhydroxideoplossing) 10 ml overschrijdt, gebruik dan een oplossing van 0,5 mol/l of wijzig de hoeveelheid af te wegen monster op basis van de verwachte zuurgraad en de voorgestelde tabel.

Opmerking 5: Als de oplossing troebel wordt tijdens de titrering, voeg dan een hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen (3.1) toe tot de oplossing helder wordt.

Alleen een tweede bepaling uitvoeren indien het eerste resultaat boven de voor de desbetreffende categorie olijfolie vastgestelde grens ligt.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

De zuurgraad, uitgedrukt in gewichtspercentage oliezuur, is gelijk aan:

waarbij:

V = het volume in ml van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing (of natriumhydroxideoplossing);

c = de precieze concentratie, in mol/l van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing (of natriumhydroxideoplossing);

M = 282 g/mol, de molaire massa, in grammen per mol, van het oliezuur;

m = de massa van het monster in g.

De zuurgraad van de olie wordt als volgt gerapporteerd:

a) afgerond tot op twee decimalen voor waarden van 0 tot en met 1;

b) afgerond tot op één decimaal voor waarden van 1 tot en met 100.

▼B









BIJLAGE III

BEPALING VAN HET PEROXIDEGETAL

1. DOEL

Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het peroxidegetal van oliën en vetten.

2. TOEPASSINGSGEBIED

Deze norm geldt voor dierlijke en plantaardige oliën en vetten.

3. DEFINITIE

Het peroxidegetal is de hoeveelheid stoffen in het monster, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, die kaliumjodide oxideren bij de beschreven werkomstandigheden.

4. PRINCIPE VAN DE METHODE

Het in een mengsel van azijnzuur en chloroform opgeloste vet wordt behandeld met kaliumjodide en het vrijgemaakte jodide wordt getitreerd met natriumthiosulfaatoplossing.

5. APPARATUUR

Alle gebruikte apparatuur dient vrij te zijn van reducerende of oxiderende stoffen.

Opmerking:

Geslepen oppervlakten niet invetten.

5.1. 3 ml glazen weegschuitje.

5.2. Kolven met geslepen halzen en stoppen, van ongeveer 250 ml, vooraf gedroogd en gevuld met een zuiver, droog inert gas (stikstof of, bij voorkeur, koolstofdioxide).

5.3. Buret van 25 of 50 ml, met een schaalindeling van 0,1 ml.

6. REAGENTIA

6.1. Chloroform, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog inert gas.

6.2. IJsazijn, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog gas.

6.3. Kaliumjodide, verzadigde oplossing in water, vlak vóór gebruik bereid, vrij van jodium of jodaat.

6.4. Natriumthiosulfaat, 0,01 of 0,002 N nauwkeurig gestelde oplossing in water, onmiddellijk vóór gebruik gesteld.

6.5. Zetmeeloplossing, 10 g/l oplossing in water, vers bereid uit natuurlijk oplosbaar zetmeel.

7. MONSTER

Zorg ervoor dat het monster niet in de nabijheid van licht wordt genomen, dat het in het donker wordt bewaard en vervolgens koud wordt opgeslagen in volledig gevulde glazen recipiënten, hermetisch afgesloten met stoppen van geslepen glas of kurk.

8. WERKWIJZE

De proef dient in diffuus daglicht of bij kunstlicht te worden uitgevoerd. Weeg in een glazen weegschuitje (5.1), of bij gebrek daaraan in een kolf (5.2), tot op 0,001 g nauwkeurig, een hoeveelheid van het monster volgens de volgende tabel, afhankelijk van het verwachte peroxidegetal.







Verwacht peroxidegetal (meq O2/kg) Hoeveelheid van het monster (g) 0 tot 12 5,0 tot 2,0 12 tot 20 2,0 tot 1,2 20 tot 30 1,2 tot 0,8 30 tot 50 0,8 tot 0,5 50 tot 90 0,5 tot 0,3

Ontstop een kolf (5.2) en breng er het glazen weegschuitje in dat het monster bevat. Voeg 10 ml chloroform toe (6.1). Los het monster snel op door roeren. Voeg 15 ml azijnzuur (6.2) toe, daarna 1 ml kaliumjodideoplossing (6.3). Sluit snel af met de stop, schud gedurende één minuut en laat precies vijf minuten in het donker staan bij een temperatuur van 15 tot 25 °C.

Voeg ongeveer 75 ml gedistilleerd water toe. Titreer, krachtig schuddend, het vrijgekomen jodium met de natriumthiosulfaatoplossing (6.4) (0,002 N oplossing voor verwachte waarden van minder dan 12 en 0,01 N oplossing voor verwachte waarden boven 12), met gebruik van de zetmeeloplossing (6.5) als indicator.

Voer twee bepalingen uit op hetzelfde proefmonster.

Voer terzelfder tijd een blanco bepaling uit. Indien het resultaat van de blanco bepaling meer bedraagt dan 0,05 ml van de 0,01 N natriumthiosulfaatoplossing (6.4), vervang dan de onzuivere reagentia.

9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Het peroxidegetal, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, wordt weergegeven met de formule:

waarin:

V = de gebruikte hoeveelheid gestelde natriumthiosulfaatoplossing (6.4) in millimeter, gecorrigeerd om rekening te houden met de blanco bepaling;

T = de precieze normaliteit van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing (6.4);

m = het gewicht van het monster, in gram.

Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee uitgevoerde bepalingen.

▼M21









BIJLAGE IV

BEPALING VAN HET WASGEHALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1. DOEL

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het wasgehalte van olijfolie. De was wordt aan de hand van het aantal koolstofatomen gescheiden. De methode kan vooral worden gebruikt om geperste olijfolie te onderscheiden van geëxtraheerde olijfolie (uit persafvallen van olijven).

2. PRINCIPE

De olie of het vet, waaraan een geschikte interne standaard is toegevoegd, wordt gefractioneerd door kolomchromatografie over een gehydrateerde silicagel-kolom. De onder de werkomstandigheden eerst geëlueerde fractie (met een lagere polariteit dan de triglyceridenfractie) wordt opgevangen en vervolgens direct geanalyseerd met behulp van capillaire gaschromatografie.

3. APPARATUUR

3.1. Erlenmeyer, 25 ml.

3.2. Glazen kolom voor gaschromatografie met een inwendige diameter van 15,0 mm en een lengte van 30-40 cm, voorzien van een kraan.

3.3. Geschikte gaschromatograaf voor een capillaire kolom, voorzien van een „on-column” injectiesysteem, bestaande uit: 3.3.1. Een oven met thermostaat voor de kolom met programmeerbare temperatuur. 3.3.2. Een „cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen. 3.3.3. Een vlamionisatiedetector met een omzetter/versterker. 3.3.4. Een recorder/integrator, geschikt voor gebruik met de omzetter/versterker (3.3.3), met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid. (Er kan ook een computersysteem worden gebruikt waarmee de gaschromatografie-gegevens via een pc kunnen worden geregistreerd.) 3.3.5. Capillaire kolom, glas of kwartsglas, met een lengte van 8-12 m en een inwendige diameter van 0,25-0,32 mm en inwendig bekleed met een laagje stationaire fase met een uniforme dikte van 0,10-0,30 μm. (Gebruiksklare stationaire fase van type SE52 of SE54 is in de handel verkrijgbaar.)

3.4. Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, voor directe injectie op de kolom.

3.5. Elektrisch schudapparaat.

3.6. Rotatieverdamper.

3.7. Droogstoof.

3.8. Analytische balans met een nauwkeurigheid van + 0,1 mg.

3.9. Standaard-laboratoriumglaswerk.

4. REAGENTIA

4.1. Silicagel met een korrelgrootte tussen 60 en 200 μm. Droog de silicagel in een droogstoof gedurende ten minste 4 uur bij 500 °C. Voeg na afkoelen een volume water toe dat overeenkomt met 2 % van het gewicht van de gebruikte silicagel. Schud voldoende om de massa uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik in het donker rusten.

4.2. n-Hexaan (voor chromatografie).

4.3. Ethylether (voor chromatografie).

4.4. n-Heptaan (voor chromatografie).

4.5. Standaardoplossing van laurylarachidaat, 0,1 % (m/v) in hexaan (interne standaard). (Ook palmitylpalmitaat en myristylstearaat kunnen worden gebruikt.) 4.5.1. Soedanrood 1 (1-fenylazo-2-naftol).

4.6. Draaggas: zuivere waterstof of helium (voor gaschromatografie).

4.7. Hulpgassen: — zuivere waterstof (voor gaschromatografie); — zuivere lucht (voor gaschromatografie).

5. PROCEDURE

5.1. Voorbehandeling van de chromatografiekolom

Suspendeer 15 g silicagel (4.1) in n-hexaan (4.2) en breng dit in de kolom (3.2). Laat eerst spontaan uitzakken en vervolgens met een elektrisch schudapparaat (3.5) om de chromatografielaag homogener te maken. Laat 30 ml n-hexaan doorlopen om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Weeg met de balans (3.8) nauwkeurig 500 mg monster af in de erlenmeyer van 25 ml (3.1) en voeg afhankelijk van het verwachte wasgehalte de juiste hoeveelheid interne standaard (4.5) toe. Voeg bij olijfolie bijvoorbeeld 0,1 mg laurylarachidaat toe en bij olie uit afvallen van olijven 0,25-0,5 mg. Breng het zo voorbehandelde monster met behulp van twee porties van elk 2 ml n-hexaan (4.2) op de chromatografiekolom.

Laat het oplosmiddel door de kolom lopen tot 1 mm boven de bovenkant van het adsorbens en laat vervolgens nog eens 70 ml n-hexaan doorlopen om van nature aanwezige n-alkanen te verwijderen. Begin vervolgens de chromatografische elutie met 180 ml van het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) met een elutiesnelheid van ongeveer 15 druppels per 10 seconden. De elutie van het monster moet bij kamertemperatuur (22 ± 4 °C) worden uitgevoerd.

NB:

— Het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) moet elke dag vers worden bereid.

— Voor een visuele controle op een juiste elutie van de was kan aan het opgeloste monster 100 μl soedanrood 1 (1 % in de elutievloeistof) worden toegevoegd. Aangezien deze kleurstof een retentietijd tussen die van de was en de triglyceriden heeft, kan de elutie worden gestopt wanneer de kleur de onderkant van de chromatografiekolom bereikt, omdat de was dan volledig is geëlueerd.

Damp de aldus verkregen fractie in de rotatieverdamper (3.6) in tot bijna droog. Verwijder de laatste 2 ml oplosmiddel met een zachte stikstofstroom en neem het residu op in 2-4 ml n-heptaan.

5.2. Gaschromatografische analyse

5.2.1. Voorbereidende werkzaamheden

Bevestig de kolom in de gaschromatograaf (3.3), waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten op het „on-column”-systeem en het uiteinde op de detector. Voer de gebruikelijke controle van de gaschromatografieapparatuur uit (toestand van de gasleidingen, efficiëntie van de detector en de recorder enz.).

Als de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, wordt conditionering aanbevolen. Laat een zachte gasstroom door de kolom lopen en schakel de gaschromatografieapparatuur in. Verwarm geleidelijk totdat na ongeveer 4 uur een temperatuur van 350 °C wordt bereikt. Houd deze temperatuur gedurende ten minste 2 uur aan en stel vervolgens de apparatuur in op de gebruiksomstandigheden (gassnelheid instellen, vlam ontsteken, elektronische recorder (3.3.4) aansluiten, temperatuur van de kolomoven instellen, temperatuur van de detector instellen enz.) en registreer het signaal bij een gevoeligheid die ten minste twee keer zo groot is als bij de uitvoering van de analyse wordt verwacht. De basislijn moet lineair zijn, mag geen enkele piek vertonen en mag niet verlopen.

Een rechtlijnig negatief verloop wijst op lekkage bij de aansluiting van de kolom; een positief verloop wijst op een onvoldoende conditionering van de kolom.

5.2.2. Keuze van de werkomstandigheden

In het algemeen dienen de volgende werkomstandigheden te worden aangehouden:

— kolomtemperatuur: —



20 °C/minuut 5 °C/minuut 20 °C/minuut vanaf 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detectortemperatuur: 350 °C;

— geïnjecteerde hoeveelheid: 1 μl van de oplossing (2-4 ml) in n-heptaan;

— draaggas: helium of waterstof met de optimale lineaire snelheid voor het gekozen gas (zie aanhangsel);

— gevoeligheid van de recorder: deze moet voldoen aan de volgende voorwaarden:

Deze voorwaarden kunnen afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig worden gewijzigd dat alle wassen volledig worden gescheiden met een afdoende resolutie van de pieken (zie figuur), terwijl de retentietijd van de interne standaard (C32) 18 ± 3 minuten moet bedragen. De meest representatieve piek van de wassen moet een hoogte van ten minste 60 % van de volle schaaluitslag hebben.

De piekintegratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakken wordt verkregen.

NB:Gezien de hoge eindtemperatuur wordt een positief verloop toegestaan, dat niet groter mag zijn dan 10 % van de volle schaaluitslag.

5.3. Uitvoering van de analyse

Zuig met de 10 μl micro-injectiespuit 1 μl oplossing op. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Steek de naald door het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden; trek de naald ongeveer 5 seconden later langzaam terug.

Neem het chromatogram op tot de was volledig is geëlueerd.

De basislijn moet steeds aan de vereiste voorwaarden voldoen.

5.4. Identificatie van de pieken

De verschillende pieken worden geïdentificeerd aan de hand van de retentietijd en door vergelijking met wasmengsels met een bekende retentietijd die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.

De figuur bevat een chromatogram van de wassen in een olijfolie van eerste persing.

5.5. Kwantitatieve evaluatie

Bereken met de integrator het piekoppervlak van de interne standaard en de alifatische esters (C40-C46).

Bereken met de volgende formule het wasgehalte van elke ester in mg/kg vet:

Hierbij is:

Ax = het piekoppervlak van elke ester in mm2;

As = het piekoppervlak van de interne standaard in mm2;

ms = de toegevoegde massa interne standaard in mg;

m = de massa van het monster voor de bepaling in g.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Vermeld de som van de gehaltes aan de verschillende wassen (C40-C46) in mg/kg vet (ppm).

NB:De te kwantificeren verbindingen verwijzen naar de pieken met een even aantal koolstofatomen tussen de esters C40 en C46, zoals weergegeven in onderstaand chromatogram voor was uit olijfolie. Als de ester C46 een dubbele piek oplevert, wordt aanbevolen voor de identificatie daarvan de wasfractie van een olijfolie uit afvallen van olijven te analyseren, aangezien de C46-fractie daarin duidelijk de overhand heeft en de piek dus gemakkelijk te identificeren is.

De resultaten worden met één cijfer achter de komma vermeld.

Figuur

Gaschromatogram van de wasfractie van een olijfolie ( 3 )

Verklaring:

I.S. = Laurylarachidaat

1 = Diterpeenesters

2 + 2′ = C40-esters

3 + 3′ = C42-esters

4 + 4′ = C44-esters

5 = C46-esters

6 = Sterolesters en triterpeenalcoholen.









AANHANGSEL

Bepaling van de lineaire gassnelheid

Injecteer 1-3 μl methaan (of propaan) in de gaschromatograaf nadat deze op de normale werkomstandigheden is ingesteld. Registreer hoeveel tijd verstrijkt tussen het moment waarop het gas op de kolom wordt geïnjecteerd en het moment waarop de piek verschijnt (tM).

De lineaire snelheid (in cm/s) wordt berekend met de formule L/tM, waarbij L de lengte van de kolom in cm is en tM de geregistreerde tijd in seconden.

▼M26









BIJLAGE V

BEPALING VAN DE SAMENSTELLING VAN EN HET GEHALTE AAN STEROLEN EN TRITERPEENDIALCOHOLEN MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1. DOEL

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het individuele en totale gehalte aan sterolen en triterpeendialcoholen van olijfoliën en olie uit perskoeken van olijven.

2. PRINCIPE

De olie, waaraan α-cholestanol als interne standaard is toegevoegd, wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met ethylether.

De sterol- en triterpeendialcoholfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden met behulp van basische kiezelgel dunnelaagchromatografie. De van de dunnelaagplaat verzamelde fracties worden omgezet in trimethylsilylethers en via capillaire gaschromatografie geanalyseerd.

3. APPARATUUR

De gebruikelijke laboratoriumuitrusting en in het bijzonder het volgende:

3.1. Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2. Scheitrechters van 500 ml.

3.3. Kolven van 250 ml.

3.4. Volledige uitrusting voor dunnelaagchromatografie met 20 × 20 cm glasplaten.

3.5. Ultravioletlamp met een golflengte van 254 of 366 nm.

3.6. Injectiespuiten van 100 μl en 500 μl.

3.7. Filterkroes G 3 (porositeit 15-40 μm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21 (uitwendig).

3.8. Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21 (inwendig), waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten (punt 3.7).

3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem bestaande uit: 3.10.1. een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ± 1 °C; 3.10.2. een temperatuurgeregelde injectie-eenheid met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement en splitsysteem; 3.10.3. een vlamionisatiedetector (FID); 3.10.4. gegevensverzamelsysteem dat geschikt is voor gebruik met de FID (punt 3.10.3), geschikt voor handmatige integratie.

3.11. Fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m, inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met 5 % difenyl - 95 % simethylpolysiloxaan (SE-52 of SE-54 stationaire fase of equivalent) in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 μm.

3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 μl met een geharde naald voor splitinjectie.

3.13. Met calciumchloride gevulde exsiccator.

4. REAGENTIA

4.1. Kaliumhydroxideoplossing met een minimumgehalte van 85 %.

4.2. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (punt 4.1) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (punt 4.10). Bewaar de oplossing maximaal twee dagen in goed afgesloten flessen van donker glas.

4.3. Ethylether, p.a.

4.4. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 0,2 M in ethanol. Los 13 g kaliumhydroxide (punt 4.1) op in 20 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol (punt 4.10).

4.5. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.

4.6. Glasplaten (20x20 cm) gecoat met kiezelgel zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).

4.7. Tolueen, voor chromatografische doeleinden.

4.8. Aceton, voor chromatografische doeleinden.

4.9. n-hexaan, voor chromatografische doeleinden.

4.10. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.

4.11. Ethanol, p.a.

4.12. Ethylacetaat, p.a.

4.13. Dunne-laagchromatografische referentieoplossing: cholesterol of fytosyerolen en een 5 %-oplossing van erytrodiol in ethylacetaat (punt 4.11).

4.14. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing (punt 4.2).

4.15. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden (zie opmerking 5).

4.16. Hexamethyldisilazaan, p.a.

4.17. Trimethylchloorsilaan, p.a.

4.18. Standaardoplossingen van steroltrimethylsilylethers. Direct vóór gebruik te bereiden uit sterolen en erytrodiol verkregen uit oliën die deze bevatten.

4.19. α-cholestanol, zuiverheid meer dan 99 % (zuiverheid moet worden gecontroleerd door gaschromatografische analyse).

4.20. α-cholestanol, 0,2 (m/V) oplossing in ethylacetaat (punt 4.11) (interne standaard)

4.21. Fenolftaleïne-oplossing, 10 g/l in ethanol (punt 4.10).

4.22. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.

4.23. Hulpgassen: waterstof, helium, stikstof en lucht, gaschromatografisch zuiver.

4.24. Mengsel van n-hexaan (punt 4.9)/ethylether (punt 4.10) met een 65:35-verhouding (v/v).

4.25. Silyleringsreagens, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan 9:3:1 (v/v/v).

5. WERKWIJZE

5.1. Bereiding van het onverzeepbare residu. 5.1.1. Breng in de kolf van 250 ml (punt 3.1) met behulp van de injectiespuit van 500 μl (punt 3.6) een hoeveelheid α-cholestanoloplossing (interne standaard) (punt 4.20) in die een hoeveelheid cholestanol bevat die overeenkomt met ongeveer 10 % van het sterolgehalte van het monster. Bijvoorbeeld: voeg voor 5 g monster 500 μl α-cholestanoloplossing (punt 4.20) toe indien het gaat om olijfolie en 1 500 μl indien het gaat om olie uit perskoeken van olijven. Damp met behulp van een lichte stikstofstroom droog in een warmwaterbad en weeg vervolgens, na afkoeling van de kolf, in dezelfde kolf 5±0,01 g van het gedroogde gefiltreerde monster af. Opmerking 1: Dierlijke of plantaardige oliën en vetten die een aanmerkelijke hoeveelheid cholesterol bevatten, kunnen een piek vertonen met dezelfde retentietijd als cholestanol. Is dit het geval, dan moet de sterolfractie tevens zonder interne standaard worden geanalyseerd. 5.1.2. Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing (punt 4.2) met wat puimsteen toe, bevestig de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken tot de verzeping heeft plaatsgevonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 °C. 5.1.3. Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml scheitrechter (punt 3.2), met behulp van meerdere porties gedistilleerd water (50 ml). Voeg ongeveer 80 ml ethylether (punt 4.10) toe, schud krachtig gedurende ongeveer 60 seconden, waarbij u regelmatig de druk laat ontsnappen door de scheitrechter om te keren en de plugkraan te openen. Laat de oplossing staan tot de twee fasen volledige gescheiden zijn (opmerking 2). Laat de zeepoplossing daarna zo volledig mogelijk in een tweede scheitrechter lopen. Herhaal de extractie van de water-alcohollaag twee keer op dezelfde manier en gebruik hierbij telkens 60-70 ml ethylether (punt 4.10). Opmerking 2: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door kleine hoeveelheden ethanol (punt 4.11) toe te voegen. 5.1.4. Verzamel de drie etherextracten in een scheitrechter met 50 ml water. Ga verder met wassen met water (50 ml) tot het waswater niet meer roze kleurt na toevoeging van een druppel fenolftaleïne-oplossing (punt 4.21). Verwijder het waswater en filtreer over watervrij natriumsulfaat (punt 4.5) in een van tevoren gewogen 250 ml kolf, was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden ethylether (punt 4.10). 5.1.5. Verdamp het oplosmiddel op een rotatieverdamper bij 30 °C onder vacuüm. Voeg 5 ml aceton toe en verwijder het vluchtige oplosmiddel volledig in een zachte luchtstroom. Droog het residu in de oven bij 103 ± 2 °C gedurende 15 min. Laat afkoelen in de exsiccatoren en weeg tot de dichtstbijzijnde 0,1 mg.

5.2. Scheiding van de sterol- en triterpeendialcholfractie (erytrodiol + uvaol) 5.2.1. Bereiding van de basische platen voor dunnelaagchromatografie: Dompel de kiezelgelplaten (punt 4.6) gedurende 10 seconden ongeveer 4 cm in de 0,2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing (punt 4.5), laat de platen gedurende twee uur in een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende één uur in een stoof bij 100 °C. Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (punt 3.13) (op deze manier bereide platen moeten binnen 15 dagen worden gebruikt). Opmerking 3: Bij gebruik van basische-kiezelgelplaten voor de scheiding van de sterolfractie is de behandeling van het onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig. Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren en andere) vastgehouden op de startlijn en is de sterolband duidelijk gescheiden van de band van de alifatische- en triterpeenalcoholen. 5.2.2. Breng in de ontwikkeltank een mengsel van hexaan/ethylether (punt 4.24) (opmerking 4) in de ontwikkeltank, tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende minstens een half uur staan op een koele plaats zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten. Opmerking 4: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden ververst om volkomen reproduceerbare elutiecondities te verwezenlijken. Als alternatief kan een mengsel van hexaan/ethylether, 50:50 (V/V), worden gebruikt. 5.2.3. Bereid een ongeveer 5 % oplossing van het onverzeepbare residu (punt 5.1.5) in ethylacetaat (punt 4.12) en breng hiervan aan de onderkant van de chromatografische plaat (2 cm) (punt 5.2.1) met behulp van de 100 μl injectiespuit 0,3 ml aan in een dunne uniforme lijn. Breng op dezelfde hoogte tevens 2-3 μl aan van de referentieoplossing (punt 4.13) zodat de sterol- en triterpeendialcoholband na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd. 5.2.4. Plaats de plaat in de volgens punt 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 en 20 °C (opmerking 5). Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te zetten. Opmerking 5: Een hogere temperatuur kan de scheiding verergeren. 5.2.5. Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing (punt 4.14) en laat drogen. De sterol- en triterpeenband kan door bekijken onder ultraviolet licht worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte ligt als de vlek van de referentieoplossing (punt 4.13). Markeer de grenzen van de band aan de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood (zie de plaat voor dunne-laagchromatografie in afbeelding 3). 5.2.6. Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filterkroes (punt 3.7). Voeg 10 ml heet ethylacetaat (punt 4.12) toe, meng zorgvuldig met de metalen spatel en filtreer onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de afzuigkolf (punt 3.8), verbonden aan de filterkroes. Was het residu in de filterkroes driemaal met ethylether (punt 4.3) (telkens ongeveer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf die is verbonden aan de kroes. Damp het filtraat in tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (punt 3.9), damp droog door voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele druppels aceton (punt 4.8) toe, damp weer droog. Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal moet bestaan uit de sterol- en triterpeendialcoholfractie.

5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers 5.3.1. Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige sterol- en triterpeenfractie een hoeveelheid silyleringsreagens (punt 4.25) (opmerking 6) toe, waarbij voor elke mg sterol en triterpeendialcoholen 50 μl wordt toegevoegd. Vermijd hierbij bevochtiging (opmerking 7). Opmerking 6: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Andere silyleringsreagentia zijn ook beschikbaar, zoals bijvoorbeeld bistrimethylsilyltrifluoaceetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden verdund met een gelijk volume watervrije pyridine. Pyridine kan worden vervangen door dezelfde hoeveelheid acetonitril. 5.3.2. Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te draaien) tot de verbindingen volledig zijn opgelost. Laat ten minste 15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten. De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse. Opmerking 7: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden gevormd, is normaal en veroorzaakt geen afwijking. De vorming van witte vlokken of de verschijning van een roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van vocht of van veroudering van het reagens. In deze gevallen moet opnieuw worden begonnen (alleen wanneer hexamethyldisilizaan/trimethylchloorsilaan wordt gebruikt).

5.4. Gaschromatografische analyse 5.4.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de capillaire kolom. 5.4.1.1. Bevestig de kolom (punt 3.11) in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector. Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem enz.). 5.4.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij geconditioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een temperatuur van ten minste 20 °C boven de bij de analyse gebruikelijke temperatuur (opmerking 8). Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, ontsteking van de vlam, aansluiting van het computersysteem, regeling van de temperatuur van de kolomruimte, de detector en de injector enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen. Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende uitgevoerde conditionering van de kolom. Opmerking 8: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten minste 20 °C lager zijn dan de maximumtemperatuur die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven. 5.4.2. Keuze van de bedrijfsomstandigheden 5.4.2.1. De bedrijfsomstandigheden zijn de volgende: — kolomtemperatuur: 260 ± 5 °C; — injectietemperatuur: 280-300 °C; — detectortemperatuur: 280-300 °C; — lineaire snelheid van het draaggas: helium 20-35 cm/s, waterstof 30-50 cm/s; — splitverhouding: van 1:50 tot 1:100; — gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking; — gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag; — injectiehoeveelheid: 0,5-1 μl TMSE-oplossing. Deze omstandigheden kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en de gaschromatograaf zodat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen: — de retentietijd van de ß-sitosterolpiek moet ongeveer 20 ± 5 minuten zijn; — de campesterolpiek moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie (gemiddeld gehalte 3 %) 20 ± 5 % volle schaaluitslag, voor sojaolie (gemiddelde gehalte 20 %) 80 ± 10 % volle schaaluitslag; — alle aanwezige sterolen moeten gescheiden zijn. Daarnaast moeten andere pieken volledig gescheiden zijn, dat wil zeggen dat het signaal tussen pieken volledig naar de basislijn moet terugkeren. Onvolledige scheiding kan echter getolereerd worden mits de piek met een relatieve retentietijd van 1,02 (sitostanol) met behulp van een loodlijn kan worden gekwantificeerd. 5.4.3. Bepaling 5.4.3.1. Zuig in de 10 μl injectiespuit 1 μl hexaan, 0,5 μl lucht en ten slotte 0,5-1,0 μl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injector en injecteer snel na 1-2 seconden, verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald. Er kan ook een automatische injector worden gebruikt. 5.4.3.2. Neem het chromatogram op tot alle aanwezige TMSE-triterpeendialcoholen volledig zijn geëlueerd. De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste kwalificaties (punt 5.4.1.2). 5.4.4. Identificatie van de pieken Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door een vergelijking met mengsels van TMSE-sterolen en -triterpeendoalcoholen die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd (zie aanhangsel). De sterolen en triterpeendialcoholen worden geëlueerd in de volgorde: cholesterol, brassicasterol, ergosterol, 24-methyleencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol en uvaol. In tabel I worden de relatieve retentietijden ten opzichte van ß-sitosterol opgegeven voor SE-52- en SE-54-kolommen. In de figuren 1 en 2 worden typische chromatogrammen getoond voor enkele oliën. 5.4.5. Berekening 5.4.5.1. Bereken met behulp van het computersysteem het oppervlak van de pieken van het α-cholestanol en de sterol en triterpeendialcoholen. Houd geen rekening met pieken van stoffen die niet (ergosterol hoeft niet te worden berekend) op de lijst van tabel 1 voorkomen. De responsfactor van α-cholestanol wordt op 1 gesteld. 5.4.5.2. Bereken de concentratie van elk individueel sterol in mg/kg vethoudend materiaal als volgt: waarbij: Ax = piekoppervlak van sterol x, in computersysteemeenheden; As = oppervlak van de α-cholestanolpiek, in computersysteemeenheden; ms = hoeveelheid van het toegevoegde α-cholestanol, in milligram; m = hoeveelheid van het onderzochte monster, in gram.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1. Geef de gehaltes van de individuele sterolen op in mg/kg vethoudend materiaal en hun som als "totaal sterolen". De samenstelling van alle individuele sterolen en van erytrodiol en uvaol moet worden uitgedrukt met één cijfer achter de komma. De samenstelling van het totaal sterolen moet worden uitgedrukt zonder cijfers achter de komma.

▼M28

6.2. Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som van de piekoppervlakken van de sterolen: waarbij: Ax = piekoppervlak van x; ΣA = som van de piekoppervlakken van alle sterolen.

▼M26

6.3. Kennelijke β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Berekenen van het percentage erytrodiol en uvaol: waarbij: ΣA = totale oppervlak voor sterolen in de computersysteemtellingen; Er = oppervlak van erytrodiol in computersysteemtellingen; Uv = oppervlak van uvaol in computersysteemtellingen.









Aanhangsel

Bepaling van de lineaire snelheid van het draaggas

Injecteer 1-3 μl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek (tM).

De lineaire snelheid in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij L de lengte van de kolom in centimeters is en tM de gemeten tijd in seconden.







Tabel 1 Relatieve retentietijden voor de sterolen Piek Identificatie Relatieve retentie-tijd SE 54-kolom SE 52-kolom 1 Cholesterol Δ-5-cholesteen-3ß-ol 0,67 0,63 2 Cholestanol 5α-cholestaan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassicasterol [24S]-24-methyl-Δ-5,22-cholestadieen-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 methy Δ5-7-22 cholestatrieen 3ß-ol 0,78 0,76 4 24-methyleencholesterol 24-methyleen-Δ-5,24-cholestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Campesterol (24R)-24-methyl-Δ-5-cholesteen-3ß-ol 0,83 0,81 6 Campestanol (24R)-24-methyl-cholestaan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol (24S)-24-ethyl-Δ-5,22-cholestadieen-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ7-campesterol (24R)-24-methyl-Δ-7-cholesteen-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-ethyl-Δ-5,23-cholestadieen-3ß-ol 0,95 0,95 10 Chlerosterol (24S)-24-ethyl-Δ-5,25-cholestadieen-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-ethyl-Δ-5-cholesteen-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-ethyl-cholestaan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ5-avenasterol (24Z)-24-ethylideen-Δ-cholesteen-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-ethyl-Δ5,24-cholestadieen-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ7-stigmastenol (24R,S)-24-ethyl-Δ7-cholesteen-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ7-avenasterol (24Z)-24-ethylideen-Δ7-cholesteen-3ß-ol 1,16 1,16 17 Erytrodiol 5α oleaan-12en-3ß28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-urseen-3ß28 diol 1,52 1,52

Afbeelding 1

Gaschromatogram van de sterol- en triterpeendialcoholfractie van een olijfolie voor verlichting (met interne standaard)

Afbeelding 2

Gaschromatogram van de sterol- en triterpeendialcoholfractie van een geraffineerde olijfolie (met interne standaard)

Afbeelding 3

Plaat voor dunnelaaggaschromatografie met olie uit perskoeken van olijven met de zone die moet worden weggeschraapt voor de bepaling van sterolen en triterpeendialcoholen

1 – Squaleen

2 – Triterpeen en alifatische alcoholen

3 – Sterolen en triterpeendialcoholen

4 – Begin en vetzuren

▼M26 —————

▼M21









BIJLAGE VII

BEPALING VAN HET PERCENTAGE GLYCEROL-2-MONOPALMITAAT

1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

Hier wordt de analysemethode beschreven voor de bepaling van het percentage palmitinezuur op de 2-positie van triglyceriden via de bepaling van glycerol-2-monopalmitaat

Deze methode kan worden gebruikt voor plantaardige oliën die bij kamertemperatuur (20 °C) vloeibaar zijn.

2. PRINCIPE

Na een voorbehandeling wordt het oliemonster behandeld met pancreaslipase: door een partiële en specifieke hydrolyse op de 1- en 3-positie van het triglyceride ontstaan 2-monoglyceriden. Het percentage glycerol-2-monopalmitaat in de monoglyceridefractie wordt na silylering bepaald met behulp van capillaire gaschromatografie.

3. APPARATUUR EN STANDAARDMATERIAAL

3.1. Erlenmeyer, 25 ml.

3.2. Bekerglazen, 100, 250 en 300 ml.

3.3. Glazen chromatografiekolom met een inwendige diameter van 21-23 mm en een lengte van 400 mm, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan.

3.4. Maatcilinders, 10, 50, 100 en 200 ml.

3.5. Kolven, 100 en 250 ml

3.6. Rotatieverdamper.

3.7. Centrifugebuizen met een ronde bodem, 10 ml, met geslepen stop.

3.8. Centrifuge voor buizen van 10 en 100 ml.

3.9. Waterbad waarin de temperatuur op 40 °C + 0,5 °C kan worden gehouden.

3.10. Meetpipetten, 1 en 2 ml.

3.11. Injectiespuit, 1 ml.

3.12. Micro-injectiespuit, 100 μl.

3.13. Scheitrechter, 1 000 ml.

3.14. Gaschromatograaf voor een capillaire kolom met een „cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen en een oven waarin de ingestelde temperatuur op ± 1 °C nauwkeurig kan worden gehouden.

3.15. „Cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen.

3.16. Vlamionisatiedetector en elektrometer.

3.17. Recorder/integrator, geschikt voor de elektrometer, met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid.

3.18. Capillaire kolom, glas of kwartsglas, met een lengte van 8-12 m en een inwendige diameter van 0,25-0,32 mm en bekleed met een laagje 5 % methylpolysiloxaan of fenylmethylpolysiloxaan met een dikte van 0,10-0,30 μm, die bij 370 °C kan worden gebruikt.

3.19. Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, met een lengte van ten minste 7,5 cm, voor directe injectie op de kolom.

4. REAGENTIA

4.1. Silicagel met een korrelgrootte tussen 0,063 en 0,200 mm (70/280 mesh), als volgt voorbehandeld: droog de silicagel in een porseleinen kroes in een droogstoof gedurende 4 uur bij 160 °C en laat vervolgens in een exsiccator afkoelen. Voeg als volgt een volume water toe dat overeenkomt met 5 % van het gewicht van de silicagel: weeg in een erlenmeyer van 500 ml 152 g silicagel af en voeg 8 g gedestilleerd water toe; sluit de erlenmeyer af en schud voorzichtig om het water uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik rusten.

4.2. n-Hexaan (voor chromatografie).

4.3. Isopropanol.

4.4. Isopropanol, 1/1 (v/v) oplossing in water.

4.5. Pancreaslipase. De gebruikte lipase moet een activiteit tussen 2,0 en 10 lipase-eenheden per mg hebben (In de handel is pancreaslipase met een activiteit tussen 2 en 10 enzymeenheden per mg verkrijgbaar.)

4.6. Tris(hydroxymethyl)aminomethaan-bufferoplossing: 1 M oplossing in water, met geconcentreerd HCl (1/1 v/v) op pH 8 gebracht (controle met potentiometer).

4.7. Natriumcholaat, enzymkwaliteit, 0,1 %-oplossing in water (deze oplossing moet binnen 15 dagen na de bereiding worden gebruikt).

4.8. Calciumchloride, 22 %-oplossing in water.

4.9. Diethylether (voor chromatografie).

4.10. Elutievloeistof: mengsel van n-hexaan en diethylether (87/13 v/v).

4.11. Natriumhydroxide, 12 %-oplossing (g/g).

4.12. Fenolftaleïne, 1 %-oplossing in ethanol.

4.13. Draaggas: waterstof of helium (voor gaschromatografie).

4.14. Hulpgassen: waterstof (minimaal 99 %, watervrij en zonder organische stoffen) en lucht (voor gaschromatografie en met dezelfde zuiverheid).

4.15. Silaniseringsreagens: mengsel pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan (9/3/1 v/v/v) (In de handel zijn gebruiksklare oplossingen verkrijgbaar.) Er kunnen ook andere silyleringsreagentia worden gebruikt, bijvoorbeeld bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, verdund met een gelijk volume watervrije pyridine.

4.16. Referentiemonsters: zuivere monoglyceriden of mengsels van monoglyceriden met een bekende samenstelling die vergelijkbaar is met die van het monster.

5. PROCEDURE

5.1. Voorbehandeling van het monster

5.1.1. Olie met een gehalte aan vrij zuur van minder dan 3 % behoeft niet vóór de silicagel-kolomchromatografie te worden geneutraliseerd. Olie met een gehalte aan vrij zuur van meer dan 3 % moet overeenkomstig punt 5.1.1.1 worden geneutraliseerd. 5.1.1.1. Breng in een scheitrechter van 1 000 ml (3.13) 50 g olie en 200 ml n-hexaan. Voeg 100 ml isopropanol toe en een hoeveelheid 12 %-natriumhydroxideoplossing (4.11) die overeenkomt met het gehalte aan vrij zuur van de olie plus 5 %. Schud krachtig gedurende één minuut. Voeg 100 ml gedestilleerd water toe, schud opnieuw en laat bezinken. Laat na scheiding van de lagen de onderste laag met de zepen weglopen. Verwijder tevens mogelijke tussenlagen (slijmachtige en onopgeloste stoffen). Was de oplossing van de geneutraliseerde olie in hexaan met opeenvolgende porties van 50-60 ml van de oplossing van isopropanol in water (1/1 v/v) (4.4) tot de roze kleur van fenolftaleïne verdwijnt. Verwijder het merendeel van het hexaan door vacuümdestillatie (bijvoorbeeld met een rotatieverdamper) en breng de olie over in een kolf van 100 ml (3.5). Droog de olie onder vacuüm tot het oplosmiddel volledig is verwijderd. Na deze bewerking moet de zuurgraad van de olie lager dan 0,5 % zijn.

5.1.2. Breng 1,0 g olie, voorbehandeld zoals hierboven beschreven, in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) en los dit op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Laat de oplossing vóór de silicagel-kolomchromatografie gedurende ten minste 15 minuten rusten. Centrifugeer de oplossing, als deze troebel is, om optimale omstandigheden voor de chromatografie te waarborgen. (Er kunnen gebruiksklare SPE-silicagelpatronen van 500 mg worden gebruikt).

5.1.3. Voorbehandeling van de chromatografiekolom Giet ongeveer 30 ml elutievloeistof (4.10) in de kolom (3.3) en breng met een glasstaaf onder in de kolom een propje watten; duw het aan om de lucht te verwijderen. Bereid in een bekerglas een suspensie van 25 g silicagel (4.1) in ongeveer 80 ml elutievloeistof en giet dit met behulp van een trechter in de kolom. Controleer of alle silicagel in de kolom is gegoten; spoel met elutievloeistof (4.10), open de kraan en laat het vloeistofniveau zakken tot ongeveer 2 mm boven de bovenkant van de silicagel-laag.

5.1.4. Kolomchromatografie Weeg in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) precies 1,0 g monster af, voorbehandeld volgens punt 5.1. Los het monster op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Schenk de oplossing op de chromatografiekolom, voorbehandeld volgens punt 5.1.3. Zorg dat het oppervlak van de kolom niet verstoord wordt. Open de kraan en laat de monsteroplossing inzakken tot de bovenkant van de silicagel-laag. Elueer met 150 ml elutievloeistof. Stel de snelheid in op 2 ml/minuut (zodat de 150 ml in ongeveer 60-70 minuten door de kolom loopt). Vang het eluaat op in een vooraf getarreerde kolf van 250 ml. Verdamp het oplosmiddel onder vacuüm en verwijder de laatste sporen ervan onder een stikstofstroom. Weeg de kolf en bereken de opgevangen hoeveelheid extract. (Bij gebruik van gebruiksklare SPE-silicagelpatronen is de werkwijze: Breng 1 ml oplossing (5.1.2) in de vooraf voorbereide patronen met 3 ml n-hexaan. Elueer na het doorlopen van de oplossing met 4 ml n-hexaan/diethylether (9/1 v/v). Vang het eluaat op in een buis van 10 ml en damp droog onder een stikstofstroom. Laat pancreaslipase (5.2) op het residu inwerken. Het is van cruciaal belang dat de vetzuursamenstelling vóór en na de passage door de SPE-patroon wordt bepaald).

5.2. Hydrolyse met pancreaslipase

5.2.1. Weeg in de centrifugebuis overeenkomstig punt 5.1 0,1 g van de voorbehandelde olie af. Voeg 2 ml bufferoplossing (4.6), 0,5 ml natriumcholaatoplossing (4.7) en 0,2 ml calciumchlorideoplossing toe en schud na elke toevoeging goed. Sluit de buis met de geslepen stop en zet hem in het waterbad bij 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Voeg 20 mg lipase toe, schud voorzichtig (zorg dat de stop niet nat wordt) en zet de buis gedurende precies 2 minuten in het waterbad, haal de buis eruit, schud krachtig gedurende precies één minuut en laat de buis afkoelen.

5.2.3. Voeg 1 ml diethylether toe, zet de stop op de buis en schud krachtig, centrifugeer en breng de etheroplossing met een micro-injectiespuit over in een schone droge buis.

5.3. Bereiding van de gesilaniseerde verbindingen en voorbereiding van de gaschromatografie

5.3.1. Breng met een micro-injectiespuit 100 μl oplossing (5.2.3) in een rondbodemkolf van 10 ml.

5.3.2. Verwijder het oplosmiddel onder een zachte stikstofstroom, voeg 200 μl silaniseringsreagens (4.15) toe, zet de stop op de kolf en laat gedurende 20 minuten staan.

5.3.3. Voeg na 20 minuten 1-5 ml (afhankelijk van de chromatografie-omstandigheden) n-hexaan toe: de resulterende oplossing is gereed voor gaschromatografie.

5.4. Gaschromatografie

De werkomstandigheden zijn als volgt:

— temperatuur van de injector („on column” injector) onder het kookpunt van het oplosmiddel (68 °C);

— temperatuur van de detector: 350 °C;

— temperatuur van de kolom: de oventemperatuur wordt als volgt geprogrammeerd: eerst gedurende 1 minuut op 60 °C, daarna met 15 °C per minuut oplopend tot 180 °C, vervolgens met 5 °C per minuut oplopend tot 340 °C en ten slotte gedurende 13 minuten op 340 °C;

— Draaggas: waterstof of helium met een lineaire snelheid die voldoende is om de in figuur 1 aangegeven resolutie te verkrijgen. De retentietijd van triglyceride C54 moet 40 + 5 minuten zijn (zie figuur 2). (Bovenstaande werkomstandigheden worden ter indicatie aangegeven. Ze moeten in elke situatie worden geoptimaliseerd om de gewenste resolutie te verkrijgen. De piekhoogte van glycerol-2-monopalmitaat moet minimaal 10 % van de volle schaaluitslag van de recorder zijn.)

— Geïnjecteerde hoeveelheid: 0,5-1 μl van de oplossing (5 ml) in n-hexaan (5.3.3).

5.4.1. Identificatie van de pieken

De verschillende monoglyceriden worden geïdentificeerd aan de hand van de verkregen retentietijd en door vergelijking met de pieken voor standaardmengsels monoglyceriden die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.

5.4.2. Kwantitatieve bepaling

Met een elektronische integrator wordt het oppervlak van elke piek berekend.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Het percentage glycerol-2-monopalmitaat wordt aan de hand van de verhouding tussen het piekoppervlak voor deze stof en het piekoppervlak voor alle monoglyceriden samen (zie figuur 2) berekend met de formule:

Gycerolmonopalmitaat (%) =

Hierbij is:

Ax = het piekoppervlak voor glycerol-2-monopalmitaat en

ΣA = de som van de piekoppervlakken van alle monoglyceriden samen.

Het resultaat moet met één cijfer achter de komma worden vermeld.

7. ANALYSEVERSLAG

Het analyseverslag moet bevatten:

— een verwijzing naar deze methode;

— alle informatie die nodig is om het monster volledig te kunnen identificeren;

— het resultaat van de analyse;

— elke afwijking van deze methode, ongeacht of dit op grond van een besluit van de betrokken partijen of om een andere reden is gebeurd;

— de identificatiegegevens van het laboratorium, de datum van de analyse en de handtekeningen van de voor de analyse verantwoordelijke personen.

Figuur 1

Chromatogram van de producten van de silaniseringsreactie, verkregen door de inwerking van lipase op een geraffineerde olijfolie waaraan 20 % veresterde olie is toegevoegd (100 %).

NdT: Acides gras libres = Vrije vetzuren; Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = Geraffineerde olijfolie + 20 % veresterde olie; 1-2 monopalmitoléine = 1-2-monopalmitoleïne; 1-2 monopalmitine = 1-2 monopalmitine; 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono C18 onverz.; Squalene = Squaleen

Figuur 2

Chromatogram van:

A) onveresterde olijfolie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. Verklaring: 1 = Vrije vetzuren 2 = Monoglyceriden 3 = Diglyceriden 4 = Triglyceriden * = 2-monopalmitine ** = Triglyceride C54

Chromatogram van:

B) veresterde olie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. Verklaring: 1 = Vrije vetzuren 2 = Monoglyceriden 3 = Diglyceriden 4 = Triglyceriden * = 2-monopalmitine ** = Triglyceride C54

8. OPMERKINGEN

BEREIDING VAN LIPASE

Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel verkrijgbaar. Het kan ook als volgt in het laboratorium worden bereid:

Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 °C. Verwijder het omringende vet en bindweefsel en maal het restant in een messenmolen fijn tot een vloeibare pasta is overgebleven. Roer deze pasta gedurende 4-6 uur met 2,5 l watervrije aceton en centrifugeer daarna. Extraheer het residu nog driemaal met hetzelfde volume watervrije aceton en vervolgens tweemaal met een 1/1 (v/v) mengsel van aceton en diethylether en tweemaal met diethylether.

Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuüm; hierdoor wordt een stabiel poeder verkregen dat lange tijd vochtvrij in een koelkast kan worden bewaard.

CONTROLE VAN DE LIPASEACTIVITEIT

Bereid als volgt een olijfolie-emulsie:

Schud in een mengapparaat gedurende 10 minuten een mengsel van 165 ml van een oplossing van arabische gom (100 g/l), 15 g ijsgruis en 20 ml vooraf geneutraliseerde olijfolie.

Breng in een bekerglas van 50 ml achtereenvolgens 10 ml van deze emulsie, 0,3 ml natriumcholaatoplossing (0,2 g/ml) en 20 ml gedestilleerd water.

Zet het bekerglas in een waterbad dat op 37 °C is ingesteld; hang de elektroden van de pH-meter in de vloeistof en voeg een roermagneetje toe.

Voeg met een buret druppelsgewijs een 0,1 N natriumhydroxideoplossing toe tot een pH van 8,3 is bereikt.

Voeg een hoeveelheid suspensie van lipasepoeder in water toe (0,1 g lipase/ml). Start de stopwatch zodra de pH-meter een pH van 8,3 aangeeft en voeg druppelsgewijs de natriumhydroxideoplossing met een zodanige snelheid toe dat de pH 8,3 blijft. Noteer elke minuut het verbruikte volume.

Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij op de x-as de tijd wordt aangegeven en op de y-as het volume (ml) 0,1 N alkalioplossing dat is verbruikt om de pH constant te houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn.

De lipaseactiviteit, uitgedrukt in lipase-eenheden per mg, wordt met de volgende formule berekend:

Hierbij is:

A = de activiteit in lipase-eenheden/mg;

V = het volume (ml) 0,1 N natriumhydroxideoplossing per minuut (berekend uit de grafiek);

N = de normaliteit van de natriumhydroxideoplossing;

m = de massa van het onderzochte lipase (in mg).

Eén lipase-eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 micro-equivalent zuur vrijmaakt.

▼M20 —————

▼M28









BIJLAGE IX

SPECTROFOTOMETRISCH ONDERZOEK IN HET ULTRAVIOLETTE GEBIED

OPMERKING VOORAF

Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied kan informatie verschaffen over de kwaliteit van een vet, de toestand van bewaring en veranderingen veroorzaakt door technologische processen. De absorptie bij de in deze methode aangegeven golflengten wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van dubbele en drievoudig onverzadigde systemen als gevolg van oxidatieprocessen en/of raffinagepraktijken. Deze absorpties worden uitgedrukt als de specifieke extincties

(de extinctie van een oplossing van 1 % (m/v) van het vet in het aangegeven oplosmiddel, in een 10 mm-cuvet), en worden volgens afspraak als K, ook extinctiecoëfficiënt genoemd, opgegeven.

1. DOEL

Deze bijlage bevat een beschrijving van de werkwijze voor de uitvoering van een spectrofotometrisch onderzoek van vetten in het ultraviolette gebied.

2. PRINCIPE VAN DE METHODE

Het monster wordt in het vereiste oplosmiddel opgelost en de absorptie wordt gemeten bij de opgegeven golflengten ten opzichte van het zuivere oplosmiddel.

De specifieke extincties bij 232 nm en 268 nm in iso-octaan of bij 232 nm en 270 nm in cyclohexaan worden berekend voor een concentratie van 1 % (m/v) in een 10 mm-cuvet.

3. APPARATUUR

3.1. Een spectrofotometer, geschikt voor metingen bij ultraviolette golflengten (tussen 220 en 360 nm), instelbaar tot op de nm nauwkeurig. Een regelmatige controle van de absorptie- en de golflengteschaal op nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid en van het strooilicht wordt aanbevolen. 3.1.1. Golflengteschaal: Deze kan worden gecontroleerd met behulp van een referentiemateriaal bestaande uit een optische glasfilter met holmiumoxide of een holmiumoxideoplossing (al dan niet afgesloten), die karakteristieke absorptiebanden vertoont. De referentiematerialen zijn bestemd voor de verificatie en ijking van de golflengteschalen van zichtbaarlicht- en ultravioletspectrofotometers met een nominale spectrale bandbreedte van 5 nm of minder. De metingen worden verricht ten opzichte van een blanco monster (lucht) over het golflengtebereik van 640 tot 240 nm, volgens de gebruiksaanwijzing van de referentiematerialen. Bij elke wijziging van de breedte van de spleet wordt met een leeg cuvet in de lichtweg een basislijncorrectie uitgevoerd. De golflengten van de standaard worden vermeld in het certificaat van het referentiemateriaal. 3.1.2. Absorptieschaal: Deze kan worden gecontroleerd met behulp van in de handel verkrijgbare afgesloten referentiematerialen bestaande uit zure kaliumdichromaatoplossingen, in bepaalde concentraties en gecertificeerde absorptiewaarden bij de λmax (van vier oplossingen van kaliumdichromaat in perchloorzuur, ingesloten in vier UV-kwartscuvetten, ter bepaling van de lineariteit en de fotometrische referentienauwkeurigheid in het UV-gebied). De metingen van de kaliumdichromaatoplossingen worden verricht ten opzichte van een blancomonster van het gebruikte zuur, na basislijncorrectie, volgens de gebruiksaanwijzing van het referentiemateriaal. De absorptiewaarden worden vermeld in het certificaat van het referentiemateriaal. Een andere mogelijkheid om de respons van de fotocel en de fotomultiplier te controleren, is de volgende: weeg 0,2000 g zuiver kaliumchromaat, voor spectrofotometrische doeleinden, af in een 1 000 ml maatkolf en los op in 0,05 N kaliumhydroxideoplossing en vul hiermee aan tot de streep. Pipetteer 25 ml van deze oplossing in een 500 ml maatkolf en vul aan tot de streep met dezelfde kaliumhydroxideoplossing. Bepaal de extinctie van deze oplossing bij 275 nm, waarbij wordt gemeten tegen de kaliumhydroxideoplossing. De met een 1 cm-cuvet gemeten extinctie moet 0,200 ± 0,005 bedragen.

3.2. Kwartscuvetten, met deksel, geschikt voor metingen bij de ultraviolette golflengten (tussen 220 en 360 nm) met een optische weglengte van 10 mm. Gevuld met water of een ander geschikt oplosmiddel mogen de cuvetten onderling geen verschillen vertonen groter dan 0,01 extinctie-eenheden.

3.3. Maatkolven van 25 ml, klasse A.

3.4. Analytische balans, afleesbaar tot op 0,0001 g nauwkeurig.

4. REAGENTIA

Gebruik bij de analyse, tenzij anders bepaald, uitsluitend reagentia die p.a. zijn, en gedestilleerd of gedemineraliseerd water of water van een gelijkwaardige zuiverheid.

Oplosmiddel: iso-octaan (2,2,4-trimethylpentaan) voor metingen bij 232 nm en 268 nm of cyclohexaan voor metingen bij 232 nm en 270 nm, met een absorptie van minder dan 0,12 bij 232 nm en minder dan 0,05 bij 270 nm ten opzichte van gedistilleerd water, als gemeten in een 10 mm-cuvet.

5. WERKWIJZE

5.1. Het monster dient volledig homogeen te zijn en vrij van gesuspendeerde onzuiverheden. Is dat niet het geval, dan moet het over papier worden gefiltreerd bij een temperatuur van ongeveer 30 °C.

5.2. Weeg 0,25 g van het voorbehandelde monster (tot op 1 mg nauwkeurig) af in een maatkolf van 25 ml, vul aan tot de streep met het aangegeven oplosmiddel en homogeniseer. De verkregen oplossing moet volmaakt helder zijn. Indien opalescentie of troebeling optreedt, dient direct over papier te worden gefiltreerd. LET OP: Doorgaans is een massa van 0,25-0,30 g voldoende voor absorptiemetingen van olijfolie van de eerste persing en extra olijfolie van de eerste persing bij 268 nm en 270 nm. Voor metingen bij 232 nm is gewoonlijk 0,05 g monster vereist; dan worden dus twee afzonderlijke oplossingen bereid. Voor absorptiemetingen van oliën uit perskoeken van olijven, geraffineerde olijfoliën en aangelengde olijfoliën is vanwege de hogere absorptie ervan gewoonlijk een kleiner monster van bijvoorbeeld 0,1 g nodig.

5.3. Corrigeer zo nodig de basislijn (220-290 nm) met oplosmiddel in beide kwartscuvetten (monster en referentie), vul vervolgens de kwartscuvet van het monster met de testoplossing en meet de extincties ten opzichte van het als referentie gebruikte oplosmiddel bij 232, 268 of 270 nm. De gemeten extinctiewaarden moeten tussen 0,1 en 0,8 liggen of binnen het lineariteitsbereik van de spectrofotometer, hetgeen moet worden geverifieerd. Zo niet, dan moeten de metingen worden herhaald bij een aangepaste inweeg van het monster.

5.4. Meet na de meting van de absorptie bij 268 of 270 nm de absorptie bij λmax, λmax + 4 en λmax – 4. Deze absorptiewaarden worden gebruikt ter bepaling van de variatie in de specifieke extinctie (ΔΚ). LET OP: λmax wordt geacht 268 nm te zijn voor iso-octaan als oplosmiddel en 270 nm voor cyclohexaan.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1. Geef de specifieke extincties op, die bij de verschillende golflengten als volgt worden berekend: waarbij: Kλ = specifieke extinctie bij golflengte λ Ελ = extinctie, gemeten bij golflengte λ c = gehalte van de oplossing, in g/100 ml s = weglengte van de kwartscuvet in cm weergegeven met twee cijfers achter de komma.

6.2. Variatie van de specifieke extinctie (ΔΚ) De variatie van de absolute waarde van de extinctie (ΔΚ) wordt bepaald aan de hand van de volgende formule: waarbij Km de specifieke extinctie is bij de golflengte van het absorptiemaximum bij 270 nm en 268 nm, welke afhangt van het gebruikte oplosmiddel; De resultaten moeten worden weergegeven met twee cijfers achter de komma.









BIJLAGE X

GASCHROMATOGRAFISCHE BEPALING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN

1. DOEL

Deze bijlage bevat richtsnoeren voor de gaschromatografische bepaling van vrije en gebonden vetzuren in plantaardige oliën en vetten na de omzetting ervan in methylesters van vetzuren.

De gebonden vetzuren van de triacylglycerolen (TAG's) en, afhankelijk van de veresteringsmethode, de vrije vetzuren (FFA's) worden omgezet in methylesters van vetzuren (FAME's), die worden bepaald middels capillaire gaschromatografie.

Met de in deze bijlage beschreven methode kunnen FAME's van C12 tot en met C24, inclusief verzadigde, cis- en trans-mono-onverzadigde en cis- en trans-poly-onverzadigde methylesters van vetzuren, worden bepaald.

2. PRINCIPE

Gaschromatografie (GC) wordt gebruikt voor de kwantitatieve analyse van FAME's. De FAME's worden bereid overeenkomstig deel A. Vervolgens worden ze geïnjecteerd en gevaporiseerd in de injector. De scheiding van FAME's vindt plaats op analytische kolommen met een specifieke polariteit en lengte. Een vlamionisatiedetector (FID) wordt gebruikt voor de detectie van de FAME's. De analyseomstandigheden worden gegeven in deel B.

Waterstof of helium kan worden gebruikt als draaggas (mobiele fase) in de gaschromatografie van FAME's met FID's. Waterstof versnelt de scheiding en geeft scherpere pieken. De stationaire fase is een microscopisch dunne vloeistoffilm op een inert vast oppervlak van fused silica.

Wanneer ze door de capillaire kolom stromen, gaan de te analyseren vervluchtigde stoffen een interactie aan met de stationaire fase waarmee de binnenzijde van de kolom is gecoat. Door de uiteenlopende interactie van de verschillende stoffen hebben ze elk een bepaalde tijd nodig om te elueren, hetgeen de retentietijd van de stof voor een bepaalde reeks analyseparameters wordt genoemd. Aan de hand van een vergelijking van de retentietijden worden de verschillende stoffen geïdentificeerd.

DEEL A

BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN VAN OLIJFOLIE EN OLIE UIT PERSKOEKEN VAN OLIJVEN

1. DOEL

In dit deel wordt ingegaan op de bereiding van de methylesters van vetzuren. Het bevat een beschrijving van methoden voor de bereiding van methylesters van vetzuren van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven.

2. TOEPASSINGSGEBIED

De methylesters van vetzuren van olijfolie en olie uit perskoeken van olijven worden bereid middels omestering met een methanoloplossing van kaliumhydroxide bij omgevingstemperatuur. Het hangt van het gehalte aan vrije vetzuren van het monster en van de te bepalen analyseparameter af of het monster vóór de omestering moet worden gezuiverd. In dit verband kan de volgende tabel worden gebruikt:







Soort olie Methode Olijfolie van de eerste persing met een gehalte aan vetzuren ≤ 2,0 % 1. Vetzuren 2. Transvetzuren 3. ΔECN42 (na zuivering met silicagel SPE) Geraffineerde olijfolie Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing Geraffineerde olie uit perskoeken van olijven Olie uit perskoeken van olijven Olijfolie van de eerste persing met een gehalte aan vetzuren > 2,0 %. Ruwe olie uit perskoeken van olijven 1. Vetzuren (na zuivering met silica-gel SPE) 2. Transvetzuren (na zuivering met silica-gel SPE) 3. ΔECN42 (na zuivering met silica-gel SPE)

3. METHODIEK

3.1. Omestering met een methanoloplossing van kaliumhydroxide bij omgevingstemperatuur

3.1.1. Principe

De methylesters worden gevormd door omestering in een methanoloplossing van kaliumhydroxide, als tussenfase vóór de verzeping.

3.1.2. Reagentia

3.1.2.1. Methanol met hoogstens 0,5 % (m/m) water

3.1.2.2. Hexaan voor chromatografie

3.1.2.3. Heptaan voor chromatografie

3.1.2.4. Diethylether, gestabiliseerd voor analysedoeleinden

3.1.2.5. Aceton voor chromatografie

3.1.2.6. Elutievloeistof voor het zuiveren van de olie door kolom-/SPE-chromatografie: mengsel van hexaan/diethylether 87/13 (v/v)

3.1.2.7. Kaliumhydroxide, methanoloplossing van ca. 2 M: los 11,2 g kaliumhydroxide op in 100 ml methanol.

3.1.2.8. Silicagelpatronen, 1 g (6 ml) voor vastefase-extractie

3.1.3. Apparatuur

3.1.3.1. Reageerbuisjes met schroefsluiting (capaciteit 5 ml), met een dop die voorzien is van een PTFE-dichting

3.1.3.2. Pipetten, met schaalverdeling of automatische, van 2 ml en 0,2 ml

3.1.4. Zuivering van oliemonsters

Indien nodig worden de monsters gezuiverd door deze door een silicagelpatroon voor vastefase-extractie te voeren. Plaats een silicagelpatroon (3.1.2.8) in een apparaat voor elutie onder vacuüm en was met 6 ml hexaan (3.1.2.2); het wassen geschiedt niet onder vacuüm. Breng vervolgens op de kolom een oplossing van de olie (ongeveer 0,12 g) in 0,5 ml hexaan (3.1.2.2). De oplossing wordt naar beneden getrokken. Elueer met 10 ml hexaan/diethylether (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogeniseer het totaal van de eluaten en verdeel deze in twee gelijke volumes. Laat een van de volumes tot uitdroging verdampen in een draaibaar verdamptoestel onder verminderde druk en bij omgevingstemperatuur. Los het residu op in 1 ml heptaan. De verkregen oplossing is klaar voor de GC-analyse van vetzuren. Laat het tweede volume verdampen en los het residu op in 1 ml aceton voor de HPLC-analyse van de triglyceriden, indien nodig.

3.1.5. Werkwijze

Weeg ca. 0,1 g van het oliemonster af in een reageerbuisje van 5 ml met schroefsluiting (3.1.3.1). Voeg 2 ml heptaan toe (3.1.2.2) en schud. Voeg 0,2 ml van de methanoloplossing van kaliumhydroxide toe (3.1.2.7), sluit met behulp van de dop die van een PTFE-dichting is voorzien, sluit goed af en schud krachtig gedurende 30 seconden. Laat rusten totdat het bovenste deel van de oplossing helder wordt. Schenk de bovenste laag af; dat is de laag waarin zich de methylesters bevinden. De heptaanoplossing is gereed om in de chromatograaf geïnjecteerd te worden. Het verdient aanbeveling om de oplossing in de koelkast te laten tot het ogenblik van de chromatografische analyse. Het is af te raden de oplossing langer dan twaalf uur te bewaren.

DEEL B

GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN

1. DOEL

Dit deel bevat richtsnoere