1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B ZEVENDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 1 maart 1976
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
diervoeders
(76/372/EEG)
(PB L 102 van 15.4.1976, blz. 8)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Richtlijn 81/680/EEG van de Commissie van 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
ZEVENDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 1 maart 1976
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden
voor de officiële controle van diervoeders
(76/372/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de
invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden
voor de officiële controle van veevoeders(1), laatstelijk gewijzigd bij
de Toetredingsakte(2), inzonderheid op artikel 2,
Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële
controle van diervoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de opgrond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake dekwaliteit en de samenstelling van diervoeders gestelde eisen is voldaan,
geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende dat bij de E.E.G.-Richtlijnen 71/250, 71/393, 72/199, 73/
46, 74/203 en 75/84 van de Commissie van 15 juni 1971(
3), 18
november 1971(4), 27 april 1972(5), 5 december 1972(6), 25 maart
1974(7) en 20 december 1974(8) reeds een zeker aantal gemeenschap-
pelijke analysemethoden is vastgesteld; dat het gezien de vorderingen
welke de werkzaamheden sindsdien hebben gemaakt, dienstig is een
zevende reeks methoden vast te stellen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voordiervoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle
van diervoeders ten aanzien van hun gehalte aan aflatoxine B1geschieden volgens de in de bijlage bij deze richtlijn omschreven
methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 oktober 1976 de nodige wettelijke of
bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden, die nodig zijn om aandeze richtlijn te voldoen en stellen de Commissie daarvan onverwijld inkennis.
Artikel 3
Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 73 van 27. 3. 1972, blz. 14.
(3) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(4) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.
(5) PB nr. L 123 van 29. 5. 1972, blz. 6.
(6) PB nr. L 83 van 30. 3. 1973, blz. 21.
(7) PB nr. L 108 van 22. 4. 1974, blz. 7.
(8) PB nr. L 32 van 5. 2. 1975, blz. 26.▼M1
▼B
▼B
BIJLAGE
BEPALING VAN AFLATOXINE B1
A. METHODE DOOR MIDDEL VAN EENDIMENSIONALE UNNELAAG-
CHROMATOGRAFIE
1. Doel en toepassingsgebied
Met behulp van deze methode is het mogelijk het gehalte aan afla-
toxine B1te bepalen in de volgende diervoeders: grondnoten-,
kopra-, lijn-, soja-, sesam-, babassu- en maïskiem-koek, granen en
graanprodukten, erwtenmeel, aardappelpulp en aardappelmeel. De
ondergrens van de bepaling ligt bij 0,01 mg/kg (10 ppb).
Indien de aanwezigheid van bepaalde stoffen de bepaling stoort,
moet de analyse opnieuw worden verricht maar dan volgens
methode B (door middel van tweedimensionale dunnelaagchroma-
tografie).
2. Principe
Het monster wordt onderworpen aan een extractie met chloroform.
Het extract wordt gefiltreerd en een evenmatig deel wordt door
middel van chromatografie op een kolom van silicagel gezuiverd.
Het eluaat wordt ingedampt en het residu wordt in een bepaalde
hoeveelheid chloroform of benzeen-acetonitrilmengsel opgelost.
Een evenmatig deel van deze oplossing wordt aan dunnelaagchro-
matografie onderworpen. De hoeveelheid aflatoxine B1wordt
onder UV-licht of visueel of fluorodensitometrisch bepaald door
vergelijking met bekende hoeveelheden aflatoxine-B1-standaard.
De identiteit van de uit het diervoeder geëxtraheerde aflatoxine B1moet met behulp van de aangegeven methode worden bevestigd.
3. Reagentia
Noot:Alle reagentia dienen, voor zover niet anders vermeld, van
analytisch zuivere kwaliteit te zijn.
3.1. Aceton
3.2. Chloroform, gestabiliseerd met 0,5 — 1,0 % ethanol 96 % (v/v).3.3. n-Hexaan3.4. Methanol3.5. Diëthylether, vrij van water en peroxyden.3.6. Mengsel van benzeen en acetonitril 98/2 (v/v).
3.7. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4) 97/3 (v/v).
3.8. Silicagel voor kolomchromatografie, korrelgrootte 0,05 — 0,20 mm.3.9. Watten, hydrofiel en met chloroform ontvet, of glaswol.3.10. Natriumsulfaat, vrij van water, korrels.3.11. Inert gas, b.v. stikstof.3.12. Zoutzuur, 1 N.3.13. Zwavelzuur 50 % (v/v).3.14. Diatomeeënaarde (Hyflosupercel), met zuur gewassen.3.15. Silicagel G-HR of gelijkwaardig voor dunnelaagchromatografie.3.16. Standaardoplossing, bevattende ongeveer 0,1 µg aflatoxine B
1per
ml in chloroform (3.2) of in het mengsel van benzeen en acetonitril
(3.6), bereid en gecontroleerd zoals aangegeven onder punt 7.
3.17. Kwalitatieve standaardoplossing, bevattende ongeveer 0,1 µg afla-
toxine B1en B2per ml in chloroform (3.2) of in het mengsel van
benzeen en acetonitril (3.6). Deze concentraties zijn als richtsnoer
gegeven. Zij moeten zodanig worden gekozen, dat voor beide afla-
toxinen dezelfde fluorescentie-intensiteit wordt verkregen.
3.18. Loopvloeistoffen:1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
3.18.1. Mengsel van chloroform (3.2) en aceton (3.1): 9/1 (v/v), onverza-
digde ontwikkelbak;
3.18.2. Mengsel van diëthylether (3.5), methanol (3.4) en water: 96/3/1 (v/
v/v), onverzadigde ontwikkelbak;
3.18.3. Mengsel van diëthylether (3.5), methanol (3.4) en water: 94/4,5/1,5
(v/v/v), verzadigde ontwikkelbak;
3.18.4. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4): 94/6 (v/v), verza-
digde ontwikkelbak;
3.18.5. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4): 97/3 (v/v), verza-
digde ontwikkelbak.
4. Apparatuur
4.1. Meng- en maalapparaat.4.2. Schudmachine of magnetische roerder.4.3. Vouwfilters, Schleicher & Schül nr. 588, of gelijkwaardig, diameter
24 cm.
4.4. Chromatografiekolommen, van glas (binnendiameter 22 mm, lengte
300 mm), met teflonkraan en reservoir van 250 ml.
4.5. Rotatievacuümverdamper met rondbodemkolf van 500 ml.4.6. Konische kolven van 500 ml met ingeslepen stop.4.7. Uitrusting voor dunnelaagchromatografie.4.8. Glazen platen voor dunnelaagchromatografie van 200 × 200 mm,
als volgt gemaakt (de aangegeven hoeveelheden zijn voldoende
voor vijf platen): Breng 30 g silicagel G-HR (3.15) in een konische
kolf. Voeg 60 ml water toe en schud gedurende één minuut. Breng
de suspensie in een uniforme laag van 0,25 mm dikte op de platen
aan. Laat de platen drogen aan de lucht en bewaar'ze daarna in de
exsiccator over silicagel. Activeer ze vóór gebruik, door deze gedu-
rende één uur in de droogstoof bij 110 ºC te plaatsen.
Er kan gebruik gemaakt worden van kant-en-klaar-platen indien
daarbij een zelfde resultaat wordt verkregen als bij de platen die
op de hierboven beschreven wijze zijn gemaakt.
4.9. Lamp voor langgolvig Ultraviolet licht 360 nm. De stralingsintensi-
teit moet voldoende zijn en een aflatoxine-B
1-vlek van 1,0 ng op
een plaat voor dunnelaagchromatografie op een afstand van 10 cm
van de lamp nog duidelijk zichtbaar te maken.
4.10. Reageerbuisjes van 10 ml, met maatverdeling, voorzien van poly-
ethyleen stop.
4.11. UV-spectrofotometer.4.12. Fluorodensitometer (facultatief).
5. Uitvoering
5.1. Voorbereiding van het monster (zie opmerkingen in deel C, punt 1)
Maal het monster zodanig dat het door een zeef met mazen van
1 mm (overeenkomstig ISO-aanbeveling R 565) gaat.
5.2. Extractie
Breng van het gemalen en gehomogeniseerde monster 50,0 g over
in een konische kolf van 500 ml (4.6) en voeg 25 g diatomeeë-
naarde (3.14), 25 ml water en 250 ml chloroform (3.2) toe. Sluit
de kolf af en schud, resp. roer daarna gedurende 30 minuten met
behulp van de schudmachine of de roerder (4.2). Filtreer vervolgens
door een vouwfilter (4.3), verwijder de eerste 10 ml van het filtraat
en vang de volgende 50 ml op.
5.3. Kolomzuivering
Breng onder in de chromatografiekolom (4.4) een prop watten of
glaswol (3.9) aan, vul de kolom tot ongeveer 2/3 met chloroform
(3.2), voeg daarna 5 g natriumsulfaat (3.10) toe, waarbij erop
moet worden gelet dat het bovenoppervlak van de natriumsulfaat-
laag een vlakke basis vormt. Voeg 10 g silicagel (3.8) in kleine
porties toe. Roer na iedere toevoeging voorzichtig om, om lucht-
bellen te verwijderen. Laat de silicagel 15 minuten inklinken en1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
voeg vervolgens voorzichtig 15 g natriumsulfaat (3.10) toe. Laat
daarna de vloeistof aflopen tot juist boven de natriumsulfaatlaag.
Meng de 50 ml van het onder 5.2 verkregen filtraat met 100 ml n-
hexaan (3.3). Breng het mengsel kwantitatief op de kolom en laat
de vloeistof doorlopen tot juist boven de natriumsulfaatlaag.
Verwijder de doorgelopen vloeistof. Voeg daarna 100 ml diëthyle-
ther (3.5) toe en laat de vloeistof weer doorlopen tot boven de
natriumsulfaatlaag. De doorloopsnelheid moet 8 tot 12 ml/minuut
bedragen. Zorg ervoor dat de kolom niet droogloopt. Verwijder de
doorgelopen vloeistof. Elueer vervolgens met 150 ml van het
mengsel van chloroform en methanol (3.7) en vang daarbij het
gehele eluaat op. Damp het eluaat in de rotatievacuümverdamper
(4.5) onder een inerte gasstroom (3.11) en bij een temperatuur van
hoogstens 50 ºC tot bijna geheel droog in. Breng het residu kwanti-
tatief met chloroform (3.2) of het mengsel van benzeen en
acetonitril (3.6) over in een reageerbuisje van 10,0 ml (4.10).
Concentreer de oplossing onder een inerte gasstroom (3.11) en
breng vervolgens met chloroform (3.2) of het mengsel van benzeen
en acetonitril (3.6) het volume op 2,0 ml.
5.4. Dunnelaagchromatografie
Breng op een plaat voor dunnelaagchromatografie (4.8) op 2 cm
van de onderrand naast elkaar op onderlinge afstanden van 2 cm
de volgende hoeveelheden standaardoplossing en extract punt-
vormig op:
— 10, 15, 20, 30 en 40 µl aflatoxine-B1-standaardoplossing (3.16);
— 10 µl van het onder 5.3 verkregen extract en 20 µl standaardop-
lossing (3.16) op één standpunt.
— 10 en 20 µl van het onder 5.3 verkregen extract.
Ontwikkel het chromatogram in het donker met een van de loop-
vloeistoffen (3.18).
Breng met het oog op het kiezen van een geschikte loopvloeistof
vooraf 25 µl van de kwalitatieve standaardoplossing (3.17) op een
van de platen op en ga na of na de ontwikkeling een volledige
scheiding van aflatoxine B1en B2is bereikt.
Laat de loopvloeistoffen in het donker verdampen en bekijk daarna
de plaat onder UV-licht op een afstand van 10 cm van de lamp
(4.9). De aflatoxine B1-vlekken fluoresceren blauw.
5.5. Kwantitatieve bepaling
Voer de bepaling ofwel visueel ofwel fluorodensitometrisch uit.
5.5.1. Visuele bepaling
Bepaal de hoeveelheid aflatoxine B1in het extract door de intensi-
teit van de fluorescentie van de vlek van het extract met een van de
vlekken van de standaardoplossing te vergelijken. Interpoleer
indien nodig. De fluorescentie van de vlek verkregen door het
over elkaar aanbrengen van extract en standaardoplossing moet
sterker zijn dan die van 10 µl van het extract en er mag slechts
één vlek zichtbaar zijn. Verdun, indien de fluorescentie-intensiteit
van 10 µl extract sterker is dan die van 40 µl standaardoplossing,
het extract 10 of 100 maal met chloroform (3.2) of het mengsel
van benzeen en acetonitril (3.6) alvorens het extract aan een nieuwe
dunnelaagchromatographische scheiding te onderwerpen.
5.5.2. Bepaling door fluorodensitometrie
Meet de fluorescentie-intensiteit van de aflatoxine-B1-vlekken met
behulp van een fluorodensitometer bij een golflengte van 365 nm
voor de extinctie en bij een golflengte van 443 nm voor de emissie.
Bepaal de hoeveelheid aflatoxine B1in de extractvlekken door de
fluorescentie-intensiteiten van de vlekken van het extract en van
de standaardoplossing onderling te vergelijken.
5.6. Bevestiging van de identiteit van aflatoxine B1
Bevestig de identiteit van aflatoxine B1in het extract, door middel
van de hierna beschreven technieken:
5.6.1. Behandeling met zwavelzuur
Verstuif zwavelzuur (3.13) over het overeenkomstig 5.4 verkregen
chromatogram. De fluorescentie van de aflatoxine-B1-vlek onder
UV-licht moet zijn veranderd van blauw naar geel.1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
5.6.2. Tweedimensionale chromatografie met vorming van
aflatoxine B1-hemiacetaal (aflatoxine B2a)
Noot:De hierna beschreven verrichtingen moeten worden uitge-
voerd als aangegeven in figuur 3.
5.6.2.1. Opbrengen van de oplossingen
Trek op een plaat (4.8) twee lijnen evenwijdig aan twee aanlig-
gende zijden (op een afstand van 6 cm van deze zijden) die de
migratie van de loopvloeistoffen moeten afbakenen. Breng met
behulp van capillaire pipetten of microspuitjes op een plaat de hier-
onder aangegeven oplossingen op:
—in punt A: een hoeveelheid gezuiverd extract van het monster
dat onder 5.3 is verkregen en dat ongeveer 2,5 nanogram afla-
toxine B1bevat;
—in de punten B en C: 25 µl van de standaardoplossing (3.16).
5.6.2.2. Ontwikkeling
Ontwikkel het chromatogram in richting I met behulp van de loop-
vloeistof (3.18.1) (laag van 1 cm in een onverzadigde
ontwikkelbak) in het donker totdat het vloeistoffront de grenslijn
bereikt. Neem de plaat uit de ontwikkelbak en laat deze 5 minuten
in het donker en bij omgevingstemperatuur drogen. Verstuif vervol-gens zoutzuur (3.12) op een strook van 2,5 cm breed waarin de
punten A en B zijn gelegen (in fig. 3 met arcering aangegeven)
totdat deze donker wordt en bescherm de rest van de plaat met
een glasplaat. Laat gedurende 10 minuten in het donker reageren
en droog met een luchtstroom bij omgevingstemperatuur.
Ontwikkel vervolgens het chromatogram in richting II met behulp
van de loopvloeistof (3.18.1) (laag van 1 cm in een onverzadigde
ontwikkelbak) eveneens in het donker, totdat het front van de loop-
vloeistof de grenslijn bereikt. Neem de plaat uit de ontwikkelbak en
laat deze bij omgevingstemperatuur drogen.
5.6.2.3. Beoordelen van het chromatogram
Bekijk het chromatogram onder UV-licht (4.9) en ga de hierna
aangegeven bijzonderheden of kenmerken na:
a) Een blauwe fluorescerende aflatoxine-B
1-vlek wordt zichtbaar,
afkomstig van de in punt C opgebrachte standaardoplossing
(migratie in richting I).
b) Een blauwe fluorescerende vlek van aflatoxine B1(welke niet
met het zoutzuur heeft gereageerd) wordt zichtbaar alsmede
een intensere blauwe fluorescerende vlek van aflatoxine B1-
hemiacetaal, beide afkomstig van de in punt B opgebrachte
standaardoplossing (migratie in richting II).
c) Vlekken zoals die welke onder b) zijn aangegeven, afkomstig
van het in punt A opgebrachte extract van het monster worden
zichtbaar. De plaats van deze vlekken wordt bepaald door de
migratieafstand van aflatoxine B1van punt A af in richting I
(dezelfde afstand als die welke door de in punt C opgebrachte
standaardoplossing is afgelegd) en door de migratie-afstanden
die in richting II zijn afgelegd door aflatoxine B1(welke niet
met het zoutzuur heeft gereageerd) en door aflatoxine B1-hemi-
acetaal (zelfde afstanden als die welke door de in punt B
opgebrachte standaardoplossing zijn afgelegd). De fluores-
centie-intensiteiten van de hemiacetaalvlekken afkomstig van
het extract en van de in punt B opgebrachte standaardoplossing
moeten redelijk overeenstemmen.
6. Berekening van de resultaten
6.1. Visuele meting
Het gehalte aan aflatoxine B1van het monster in µg/kg (ppb) wordt
berekend met behulp van de volgende formule:
S/C1Y/C1V
W /C1X1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
waarin:
Y en X = volumina in microliter uitgedrukt van de aflatoxine-B1-
standaardoplossing (3.16), resp. van het extract
waarvan de fluorescentie-intensiteiten gelijk zijn;
S = concentratie in microgram aflatoxine B1per ml in de
standaardoplossing (3.16);
V = eindvolume van het extract in microliter, met inachtne-
ming van een eventueel gemaakte verdunning;
W = massa van het monster in gram, overeenkomend met de
voor de kolomzuivering gebruikte hoeveelheid extract.
6.2. Het meten door middel van fluorodensitometrie
Het gehalte aan aflatoxine B1van het monster in µg/kg (ppb) wordt
berekend met behulp van de volgende formule:
S/C1V
W /C1Y
waarin:
Y = volume van het op de plaat opgebrachte extract in microliter
(10 of 20 µl);
S = het aantal nanogram aflatoxine B1in de extractvlek (reke-
ning houdend met het volume Y) afgeleid uit de metingen;
V = eindvolume van het extract in microliter, met inachtneming
van een eventueel gemaakte verdunning;
W = massa van het monster in gram, overeenkomend met de
voor de kolomzuivering gebruikte hoeveelheid extract.
7. Bereiding en controle van de standaardoplossing (3.16)
7.1. Bepaling van de aflatoxine-B1-concentratie
Bereid een aflatoxine-B1-standaardoplossing in chloroform (3.2) of
in het mengsel van benzeen en acetonitril (3.6) met een concen-
tratie van 8 tot 10 µg per ml. Meet het absorptiespectrum tussen
330 en 370 nm met een spectrofotometer (4.11).
Bepaal de optische dichtheid (A) bij 363 nm wanneer chloroform
als oplosmiddel is gebruikt en bij 348 nm wanneer het mengsel
benzeen-acetonitril als oplosmiddel is gebruikt.
Bereken de aflatoxine-B1-concentratie in microgram per ml oplos-
sing met behulp van de volgende formules:
312 /C1A/C11000
20600voor de oplossing in chloroform
312 /C1A/C11000
19800voor de oplossing in het mengsel van benzeen en
acetonitril.
Voer de, voor het bereiden van een standaard-werkoplossing met
een aflatoxine-B1-concentratie van ongeveer 0,1 µg per ml, noodza-
kelijke verdunningen uit onder het uitsluiten van daglicht. Deze
oplossing blijft twee weken stabiel indien zij in de koelkast wordt
bewaard bij 4 ºC.
7.2. Controle op de chromatografische zuiverheid
Breng op een plaat voor dunnelaagchromatografie (4.8) 5 µl op van
de standaardoplossing, die 8 tot 10 µg aflatoxine B1per ml bevat
(zie 7.1). Ontwikkel het chromatogram volgens 5.4. Onder UV-licht
mag slechts één vlek zichtbaar zijn; er mag geen fluorescentie
worden waargenomen daar waar de stof oorspronkelijk werd opge-
bracht.1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
8. Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de resultaten van twee door dezelfde analist aan
hetzelfde monster uitgevoerde parallelle bepalingen zou niet meer
mogen bedragen dan:
25 % van de hoogste waarde bij aflatoxine-B1-gehalten van 10 tot
en met 20 µg/kg,
5 µg in absolute waarde bij gehalten van 20 tot en met 50 µg/kg,10 % van de hoogste waarde bij gehalten van meer dan 50 µg/kg.
9. Reproduceerbaarheid
Zie opmerkingen in deel C, punt 2,
B. METHODE DOOR MIDDEL VAN TWEEDIMENSIONALE DUNNE-
LAAGCHROMATOGRAFIE
1. Doel en toepassingsgebied
Met behulp van deze methode is het mogelijk het aflatoxine-B
1-
gehalte te bepalen in diervoeders die niet binnen het toepassingsge-
bied van methode A vallen. De ondergrens van de bepaling ligt bij
0,01 mg/kg (10 ppb). De methode is niet toepasbaar op voeders
welke citruspersresten bevatten.
2. Principe
Het monster wordt onderworpen aan een extractie met chloroform.
Het extract wordt gefiltreerd en een evenmatig deel wordt door
middel van chromatografie op een kolom van silicagel gezuiverd.
Het eluaat wordt ingedampt en het residu wordt in een bepaalde
hoeveelheid chloroform of benzeen-acetonitrilmengsel opgelost.
Een evenmatig deel van deze oplossing wordt aan tweedimensio-
nale dunnelaagchromatografie onderworpen. De hoeveelheid
aflatoxine B1wordt onder UV-licht of visueel of fluorodensitome-
trisch bepaald door vergelijking met bekende hoeveelheden
aflatoxine-B1-standaard. De identiteit van de uit het diervoeder
geëxtraheerde aflatoxine B1moet met behulp van de aangegeven
methode worden bevestigd.
3. Reagentia
Noot:Alle reagentia dienen, voor zover niet anders vermeld, van
analytisch zuivere kwaliteit te zijn.
3.1. Aceton.
3.2. Chloroform, gestabiliseerd met 0,5 — 1,0 % ethanol 96 % (v/v).3.3. n-Hexaan.3.4. Methanol.3.5. Diëthylether, vrij van water en peroxyden.3.6. Mengsel van benzeen en acetonitril: 98/2 (v/v).3.7. Mengsel van chloroform (3.2) en methanol (3.4): 97/3 (v/v).3.8. Silicagel voor kolomchromatografie, korrelgrootte 0,05 — 0,20 mm.3.9. Watten, hydrofiel en met chloroform ontvet, of glaswol.3.10. Natriumsulfaat, vrij van water, korrels.3.11. Inert gas, b.v. stikstof.3.12. Zoutzuur 1 N.3.13. Diatomeeënaarde (Hyflosupercel), met zuur gewassen.3.14. Silicagel G-HR of gelijkwaardig voor dunnelaagchromatografie.
3.15. Loopvloeistoffen.
3.15.1. Mengsel van diëthylether (3.5), methanol (3.4), en water: 94/4,5/1,5
(v/v/v), verzadigde ontwikkelbak.
3.15.2. Mengsel van chloroform (3.2) en aceton (3.1): 9/1 (v/v), onverza-
digde ontwikkelbak.1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
3.16. Standaardoplossing bevattende ongeveer 0,1 µg aflatoxine B1per
ml in chloroform (3.2) of in het mengsel van benzeen en acetonitril
(3.6), bereid en gecontroleerd zoals aangegeven onder punt 7 van
methode A.
4. Apparatuur
Zie punt 4 van methode A.
5. Uitvoering
5.1. Voorbereiding van het monster
zie de punten 5.1, 5.2 en 5.3
van methode A/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2. Extractie
5.3. Kolomzuivering
5.4. Tweedimensionale dunnelaagchromatografie
5.4.1. Opbrengen van oplossingen (als aangegeven in figuur 1)
Trek op een plaat (4.8) twee lijnen evenwijdig aan twee aanlig-
gende zijden (op een afstand van respectievelijk 5 en 6 cm van
deze zijden), die de migratie van de loopvloeistoffen moeten afba-
kenen. Breng met behulp van capillaire pipetten of microspuitjes op
de plaat de hieronder aangegeven oplossing op:
—in punt A 20 µl van het onder 5.3 verkregen gezuiverde extract
van het monster;
—in punt B 20 µl van de standaardoplossing (3.16);
—in punt C 10 µl van de standaardoplossing (3.16);
—in punt D 20 µl van de standaardoplossing (3.16);
—in punt E 40 µl van de standaardoplossing (3.16).
Droog met behulp van een zwakke stroom lucht of inert gas (3.11).
De verkregen vlekken moeten een diameter van ongeveer 5 mm
hebben.
5.4.2. Ontwikkeling (als aangegeven in figuur 1)
Ontwikkel het chromatogram in richting I met behulp van de loop-
vloeistof (3.15.1) (laag van 1 cm in een verzadigde ontwikkelbak)
in het donker, totdat het vloeistoffront de grenslijn bereikt. Neem
de plaat uit de ontwikkelbak en laat deze minstens 15 minuten in
het donker en bij omgevingstemperatuur drogen. Ontwikkel vervol-
gens het chromatogram in richting II met behulp van deloopvloeistof (3.15.2) (laag van 1 cm in een onverzadigde ontwik-
kelbak) in het donker, totdat het front van de loopvloeistof de
grenslijn bereikt. Neem de plaat uit de ontwikkelbak en laat deze
in het donker bij omgevingstemperatuur drogen.
5.4.3. Beoordelen van het chromatogram (zie figuur 2)
Bekijk het chromatogram onder UV-licht op een afstand van 10 cm
van de lamp (4.9). Bepaal de plaats van de vlekken met blauwe
fluorescentie B, C, D en E van aflatoxine B
1afkomstig van de stan-
daardoplossing en trek twee denkbeeldige lijnen door deze vlekken
loodrecht op de richtingen van het ontwikkelen. Het snijpunt P van
deze lijnen is de plaats waar men de aflatoxine-B1-vlek zou
verwachten, afkomstig van het in A opgebrachte extract van het
monster (fig. 1). Deze vlek kan zich echter in werkelijkheid
bevinden in punt Q gelegen op het snijpunt van twee denkbeeldige
lijnen die onderling een hoek van ongeveer 100º vormen en respec-
tievelijk door de vlekken B en C gaan. Bepaal de hoeveelheid
aflatoxine B1van het extract van het monster zoals aangegeven in
5.5.
5.4.4. Aa nvullende chromatografie
Trek op een nieuwe plaat (4.8) twee lijnen evenwijdig aan twee
aanliggende zijden, zoals aangegeven in fig. 1. Breng in punt A
(zie fig. 1) 20 µl van het onder 5.3 gezuiverde extract van het
monster en op dezelfde plaats 20 µl van de standaardoplossing(3.16) op Ontwikkel zoals aangegeven in 5.4.2. Bekijk het chroma-
togram onder UV-licht (4.9) en ga na of:
— de aflatoxine-B
1-vlekken van het extract en de standaardoplos-
sing samenvallen,
— de fluorescentie van deze vlek intenser is dan die van de afla-
toxine-B1-vlek in punt Q van de eerste plaat.1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
5.5. Kwantitatieve bepaling
Voer de bepaling ofwel visueel ofwel fluorodensitometrisch uit op
de wijze die hierna is beschreven:
5.5.1. Visuele bepaling
Bepaal de hoeveelheid aflatoxine B1in het extract door de intensi-
teit van de fluorescentie van de vlek in het extract met een van de
vlekken C, D en E van de standaardoplossing te vergelijken. Inter-
poleer indien nodig. Verdun indien de fluorescentie-intensiteit van
20 µl extract sterker is dan die van 40 µl standaardoplossing hetex-
tract 10 of 100 maal met chloroform (3.2) of het mengsel van
benzeen en acetonitril (3.6) alvorens het extract aan een nieuwe
dunnelaagchromatografische scheiding te onderwerpen.
5.5.2. Bepaling door fluorodensitometrie
Meet de fluorescentie-intensiteit van de aflatoxine-B1-vlekken met
behulp van een fluorodensitometer bij een golflengte van 365 nm
voor de extinctie en bij een golflengte van 443 nm voor de emissie.
Bepaal de hoeveelheid aflatoxine B1van de extractvlekken door de
fluorescentie-intensiteiten van deze vlekken te vergelijken met die
van de vlekken C, D en E van de standaardoplossing.
5.6. Bevestiging van de identiteit van aflatoxine B1
Zie punt 5.6 van methode A.
6. Berekening van de resultaten
Zie punt 6 van methode A.
7. Herhaalbaarheid
Zie punt 8 van methode A.
8. Reproduceerbaarheid
Zie opmerkingen in deel C, punt 2.
C. OPMERKINGEN IN VERBAND MET DE METHODEN A EN B
1.Ontvetten
Monsters met een vetgehalte van meer dan 5 % moeten met petroleumether
(kookpunt 40-60 ºC worden ontvet nadat zij op de in punt 5.1 aangegeven
wijze werden voorbereid. In dergelijke gevallen moeten de analyseresultaten
worden uitgedrukt op basis van het gewicht van het niet-ontvette monster.
2.Reproduceerbaarheid van de resultaten
De reproduceerbaarheid van de resultaten, zijnde de variatie tussen de resul-
taten verkregen door twee of meer laboratoria gemeten aan hetzelfde monster
werd geschat op:
± 50 % van de gemiddelde waarde in aflatoxine B1bij gemiddelde waarden
van 10 tot en met 20 µg/kg;
± 10 µg/kg van de gemiddelde waarde bij gemiddelde waarden groter dan 20
en tot en met 50 µg/kg;
± 20 % van de gemiddelde waarde bij gemiddelde waarden van meer dan
50 µg/kg.1976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
BIJLAGE
Figuur 1
Figuur 21976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Figuur 31976L0372 — NL — 19.08.1981 — 001.001 — 12