1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en versch ĳnt buiten de verantwoordel ĳkheid van de instellingen
►B VERORDENING (EG) Nr.86/94VAN DE COMMISSIE
van 19 januari 1994
houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van sitosterol en stigmasterol in
boter
(PB L 17 van 20.1.1994, blz. 7)
Gewĳzigd b ĳ:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Verordening (EG) nr. 175/1999 van de Commissie van 26 januari 1999 L20 22 27.1.1999
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 2
▼B
VERORDENING (EG) Nr.86/94VAN DE COMMISSIE
van 19 januari 1994
houdende vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling
van sitosterol en stigmasterol in boter
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,
GeletopVerordening(EEG)nr.804/68vandeRaadvan27juni1968
houdende een gemeenschappel ĳke ordening der markten in de sector
melk en zuivelprodukten(1), laatstel ĳk gew ĳzigd b ĳVerordening
(EEG) nr. 2071/92(2), met name op artikel 6, lid 7,
Overwegende dat overeenkomstig de artikelen 3 en 6 van Verordening
(EEG)nr.570/88vandeCommissie(3),laatstel ĳkgew ĳzigdb ĳVeror-
dening (EG) nr. 3049/93(4), aan boter verklikstoffen kunnen worden
toegevoegd en de produkten met verklikstoffen aan controle moetenworden onderworpen;
Overwegende dat strikte naleving van de bepalingen voor het gebruik
van verklikstoffen in boter essentieel is om frauduleus gebruik vangesubsidieerde boter te voorkomen;
Overwegende dat het, gezien het belang van verklikstoffen voor een
goedewerkingvanderegeling,nodigisgemeenschappel ĳke,indehele
Gemeenschap op dezelfde w ĳze toe te passen methoden vast te stellen
voor het opsporen van alle voor deze regeling vereiste verklikstoffen;dat dit met name een gel ĳke behandeling zou waarborgen van alle
bedrĳvendiegebruikmakenvandezeregelingeneeneindezalmaken
aan ongel ĳke concurrentievoorwaarden, die thans het gevolg kunnen
zĳn van verschillende nationale analysemethoden;
Overwegende dat b ĳVerordening (EEG) nr. 3942/92 van de
Commissie(
5)eenreferentiemethodevoordebepalingvanstigmasterol
en sitosterol in boterolie is vastgesteld; dat deze methode in enigszinsgewĳzigde vorm kan worden gebruikt voor de bepaling van sterolver-
klikstoffen in boter;
Overwegende dat de nauwkeurigheid van de methode en de tolerantie-
grenzen moesten worden vastgesteld;
Overwegendedatdeindezeverordeningvervattemaatregeleninover-
eenstemmingz ĳnmethetadviesvanhetComitévanbeheervoormelk
en zuivelprodukten,
HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:
Artikel 1
De referentieanalysemethode voor de bepaling van het gehalte aan
stigmasterol of β-sitosterol van boter overeenkomstig artikel 6 van
►M1Verordening (EG) nr. 2571/97 ◄is opgenomen in de b ĳlage.
De toevoeging van verklikstoffen aan boter is op correcte w ĳze
gebeurd,indiendeverkregenresultateninovereenstemmingz ĳnmetde
in punt 8 van deze b ĳlage gespecificeerde eisen.
(1) PB nr. L 148 van 28. 6. 1968, blz. 13.
(2) PB nr. L 215 van 30. 7. 1992, blz. 64.
(3) PB nr. L 55 van 1. 3. 1988, blz. 31.
(4) PB nr. L 273 van 5. 11. 1993, blz. 7.
(5) PB nr. L 399 van 31. 12. 1992, blz. 29.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 3
▼B
Artikel 2
Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die
vanhaarbekendmakinginhet Publikatieblad van de Europese Gemeen-
schappen.
Zĳis van toepassing met ingang van 1 april 1994.
Dezeverordeningisverbindendinalhaaronderdelenenisrechtstreeks
toepassel ĳk in elke Lid-Staat.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 4
▼B
BĲLAGE
BEPALING VAN SITOSTEROL OF STIGMASTEROL IN BOTER MET
BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Indezemethodewordteenwerkw ĳzebeschrevenvoordekwantitatieve
bepaling van sitosterol of stigmasterol in boter. Onder sitosterol wordtverstaan de totale hoeveelheid β-sitosterol en 22-dihydro- β-sitosterol;
overige sitosterolen gelden als te verwaarlozen. De methode is vantoepassing op monsters die krachtens Verordening (EEG) nr. 570/88worden ontvangen.
2. PRINCIPE
De boter wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxide-oplossing,
waarnadeonverzeepbarebestanddelenwordengeëxtraheerdmetdiethy-lether.
De sterolen worden omgezet in trimethylsilylethers en met behulp van
capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald, waarb ĳbetulinol als
interne standaard wordt gebruikt.
3. APPARATUUR
3.1. Kolf, 150 ml, voorzien van een refluxkoeler met sl ĳpstukken.
3.2. Scheitrechters, 500 ml.3.3. Kolven, 250 ml.3.4. Tegendrukscheitrechters, 250 ml, of soortgel ĳke apparatuur voor het
opvangen van gebruikte diethylether.
3.5. Glazenkolom,350mm×20mm,meteenfilterplaatvangesinterdglas.3.6. Waterbad of verwarmingsmantel.3.7. Reactieflesjes, 2 ml.3.8. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom,
bestaande uit:
3.8.1. een oven waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen
worden gehouden met een nauwkeurigheid van ± 1 °C;
3.8.2. een injector met regelbare temperatuur;
3.8.3. een vlamionisatiedetector met elektronische versterker;3.8.4. elektronische rekenapparatuur (integrator), geschikt voor gebruik met
een elektronische versterker (3.8.3).
3.9. Een fused-silica capillaire kolom, inwendig gecoat met BP1 of equiva-
lentmeteenuniformediktevan0,25µm;metdezekolommoetresolutievandetrimethylsilyl-derivatenvanlanosterolensitosterolmogel ĳkzĳn;
hiervoorkaneenBP1-kolommeteenlengtevan12meneeninwendigediameter van 0,2 mm worden gebruikt.
3.10. Injectiespuit, van ten hoogste 1 µl, geschikt voor de injector (3.8.2).
4. REAGENTIA
Alle reagentia moeten p.a. z ĳn. Het gebruikte water dient gedestilleerd
water of water van gel ĳkwaardige zuiverheid te z ĳn.
4.1. Ethanol, minimaal 95 % zuiver.4.2. Kaliumhydroxide, oplossing van 60 %. Los 600 g kaliumhydroxide
(minimaal 85 %) op in water en vul met water aan tot 1 liter.
4.3. Betulinol, minimaal 99 % zuiver.
4.3.1. Interne standaard: oplossingen van betulinol in diethylether (4.4):
4.3.1.1. de concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van sitost-
erol moet 1,0 mg/ml z ĳn.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 5
▼B
4.3.1.2. de concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van stig-
masterol moet 0,4 mg/ml z ĳn.
4.4. Diethylether, p.a. (peroxide- en restvr ĳ).
4.5. Natriumsulfaat, watervr ĳ, 2 uur gedroogd b ĳ102 °C.
4.6. Silyleringsreagens, b.v. TRI-SIL (verkr ĳgbaar b ĳPierce Chemical Co,
Cat. nr. 49001) of gel ĳkwaardig. (WAARSCHUWING: TRI-SIL is
ontvlambaar,toxisch,b ĳtendenmogel ĳkerwĳscarcinogeen.Hetlabora-
toriumpersoneelmoetopdehoogtez ĳnvandeveiligheidsvoorschriften
voor de TRI-SIL en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen.)
4.7. Lanosterol.4.8. Sitorsterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.
Opmerking 1: De zuiverheid van het voor de ĳking gebruikte stan-
daardmateriaal moet volgens de interne normalisatiemethode wordenbepaald. Neem aan dat alle in het monster aanwezige sterolen in hetchromatogram voorkomen, dat het totale piekoppervlak overeenkomtmet 100 % van de sterol-bestanddelen en dat de detector voor allesterolendezelfderesponsgeeft.Controleerofhetsysteemophetb ĳde
analyse gebruikte concentratiebereik lineair is.
4.8.1. Sitosterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001
mg/mlnauwkeurig,ongeveer0,5mg/ml(W
1)sitosterol(4.8)indiethyle-
ther (4.4) bevat.
4.9. Stigmasterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.4.9.1. Stigmasterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001
mg/mlnauwkeurig,ongeveer0,2mg/ml(W
1)stigmasterol(4.9)indiet-
hylether (4.4) bevat.
4.10. Mengsel voor controle van de resolutie: bereid een oplossing die 0,05
mg/mllanosterol(4.7)en0,5mg/mlsitosterol(4.8)indiethylether(4.4)bevat.
5. WERKW ĲZE
5.1. Bereiding van de standaardoplossingen voor chromatografie: de interne
standaardoplossing (4.3.1) moet op hetzelfde moment aan de desbetref-fende standaardoplossing met sterolen en aan het verzeepte monster(5.2.2) worden toegevoegd.
5.1.1. Standaardoplossing sitosterol voor chromatografie: breng 1 ml van de
standaardoplossing sitosterol (4.8.1) in elk van twee reactieflesjes (3.7)en verdamp de diethylether met een stikstofstroom. Voeg 1 ml internestandaardoplossing (4.3.1.1) toe en verdamp de diethylether met eenstikstofstroom.
5.1.2. Standaardoplossingstigmasterolvoorchromatografie:breng1mlvande
standaardoplossingstigmasterol(4.9.1)inelkvandetweereactieflesjes(3.7) en verdamp de diethylether met een stikstofstroom. Voeg 1 mlinternestandaardoplossing(4.3.1.2)toeenverdampdediethylethermeteen stikstofstroom.
5.2. Bereiding van de onverzeepbare bestanddelen.
5.2.1. Laat het botermonster smelten door verwarming tot ten hoogste 35 °C,
menghetmonstergrondigdoorroerenenweegtotop1mgnauwkeurigongeveer 1 g boter (W
2) af in een kolf van 150 ml (3.1). Voeg 50 ml
ethanol(4.1)en10mlkaliumhydroxide-oplossing(4.2)toe.Bevestigderefluxkoeler,verwarmtotongeveer75 °Cenhandhaafdezetemperatuur
gedurende30minuten.Verw ĳderdekoelerenlaatdekolfafkoelentot
kamertemperatuur.
5.2.2. Voeg1,0mlinternestandaardoplossingtoe(4.3.1.1alssitosterolwordt
bepaaldof4.3.1.2alsstigmasterolwordtbepaald).Mengzorgvuldigenbreng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een scheitrechter van500 ml (3.2), waarna de kolf achtereenvolgens wordt gewassen met 50ml water en 250 ml diethylether (4.4). Schud de scheitrechter krachtig
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 6
▼B
gedurende 2 minuten en wacht tot de fasen gescheiden z ĳn. Laat de
waterige onderlaag weglopen en was de etherlaag door viermaal teschudden met 100 ml water.
Opmerking 2: Omemulsievormingtevoorkomenmoethetwassenmet
water de eerste tweemaal voorzichtig gebeuren (tienmaal omkeren). Dederdemaalkangedurende30secondenkrachtigwordengeschud.Indiener een emulsie onstaat, kan deze worden afgebroken door 5-10 mlethanol toe te voegen. Indien ethanol wordt toegevoegd, moet er nogeens tweemaal krachtig met water worden gewassen.
5.2.3. Laatdehelderezeepvr ĳeetherlaagdooreenglazenkolom(3.5)met30
gwatervr ĳnatriumsulfaat(4.5)lopen.Vangdeetheropineenkolfvan
250 ml (3.3). Voeg een kooksteentje toe en damp de oplossing vr ĳwel
droog op een waterbad of met een verwarmingsmantel. Zorg er daarb ĳ
voor dat het verdampte oplosmiddel wordt opgevangen.
Opmerking 3: Als de vloeistof b ĳeen te hoge temperatuur volledig
wordt ingedampt, is het mogel ĳk dat er ook sterolen verloren gaan.
5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers.
5.3.1. Breng de in de kolf resterende etheroplossing over in een reactieflesje
van 2 ml (3.7) met 2 ml diethylether en verdamp de ether met eenstikstofstroom.Wasdekolftweemaalalsvolgt:breng2mldiethyletherin de kolf, breng deze over naar het reactieflesje en verdamp de ethermet stikstof.
5.3.2. Silyleerhetmonsterdoor1mlTRI-SIL(4.6)toetevoegen.Sluithetvat
af en schud krachtig om de sterolen op te lossen. Verwarm, als desterolen niet volledig oplossen, tot 65-70 °C. Laat de oplossing gedu-
rendetenminste5minutenstaanalvorensdezeindegaschromatograafte injecteren. Silyleer de standaardoplossing (5.1.1 of 5.1.2) en hetmengselomderesolutietecontroleren(4.10)opdezelfdemanieralsdemonsters.
Opmerking 4: Hetsilylerenmoetineenwatervr ĳeomgevinggebeuren.
Wanneer betulinol onvolledig is gesilyleerd, versch ĳnt er vlak b ĳde
betulinol-piek een tweede piek.
Hetsilyleringsproceswordtgestoorddoordeaanwezigheidvanethanol
indeoplossing,dieeengevolgkanz ĳnvanonvoldoendewassennade
extractie. Indien dit probleem aanhoudt, was dan na de extractie eenvĳfde maal, waarb ĳgedurende 30 seconden krachtig wordt geschud.
5.4. Gaschromatografie.
5.4.1. Keuze van de werkomstandigheden.
Volg voor de instelling van de gaschromatograaf de instructies van de
fabrikant op.
Voor de werkomstandigheden gelden de volgende richtl ĳnen:
— kolomtemperatuur: 265 °C
— injectortemperatuur: 280 °C
— detectortemperatuur: 300 °C
— stroomsnelheid draaggas: 0,6 ml/min— waterstofdruk: 84 kPa— luchtdruk: 155 kPa— splitverhouding: van 10: 1 tot 50: 1; de splitverhouding moet
volgens de instructies van de fabrikant worden geoptimaliseerd envervolgens moet worden gecontroleerd of de respons van de detectorop het gebruikte concentratiebereik lineair is.
Opmerking 5: Het is vooral belangr ĳk dat de liner van de injector
regelmatig wordt schoongemaakt.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 7
▼B
— geïnjecteerde hoeveelheid: 1 µl TMSE-oplossing.
Laat het systeem equilibreren en begin niet met de analyse voordat de
respons voldoende stabiel is.
Steldeomstandigheden,dieafhankel ĳkvandekenmerkenvandekolom
en de gaschromatograaf z ĳn, zodanig in dat er chromatogrammen
worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:
— de resolutie tussen de sitosterol-piek en de lanosterol-piek moet
afdoende z ĳn. Bĳeen gesilyleerd mengsel voor controle op de
resolutie (4.10) moet een soortgel ĳk chromatogram worden
verkregen als in figuur 1 is weergegeven,
— vooronderstaandesterolenmoetongeveerdedaarb ĳvermelderela-
tieve retentiet ĳd worden verkregen:
cholesterol: 1,0
stigmasterol: 1,3sitosterol: 1,5betulinol: 2,5,
— de retentiet ĳd voor betulinol moet ongeveer 24 minuten z ĳn.
5.4.2. Analyse.
Injecteer1µlgesilyleerdestandaardoplossing(stigmasterolofsitosterol)
en stel de kalibratieparameters van de integrator in.
Injecteer 1 µl gesilyleerde standaardoplossing om de responsfactor in
vergel ĳking met betulinol te bepalen.
Injecteer 1 µl gesilyleerde monsteroplossing en meet de piekopper-
vlakken. Voor en na elke chromatografische reeks moet er 1 µl stan-daardoplossing worden geïnjecteerd. Als leidraad kan worden gestelddatvóórennaelkereeksvan6monsteroplossingendestandaardoplos-sing wordt geïnjecteerd.
Opmerking 6: Bĳde integratie van de stigmasterol-piek moet ook het
oppervlakvaneventuelestaarten,zoalsaangegevenb ĳdepunten1,2en
3 in figuur 2b, worden meegerekend.
Wanneer de totale hoeveelheid sitosterol wordt bepaald, moet b ĳde
integratie van de sitosterol-piek ook het oppervlak van de piek van22--dihydro- β-sitosterol (stigmastanol), dat vlak na sitosterol elueert,
worden meegerekend.
6. BEREKENING VAN DE RESULTATEN
6.1. Bepaalhetoppervlakvandesterol-piekenendebetulinol-piekenb ĳde
standaardoplossingen voor en na een reeks en bereken R
1:
R1=gemiddeld sterol-piekoppervlak in standaardoplossing
gemiddeld betulinol-piekoppervlak in standaardoplossing
Bepaalhetoppervlakvandesterol-piek(stigmasterolofsitosterolende
betulinol-piek in de monsteroplossing en bereken R2:
R2=sterol-piekoppervlak in monsteroplossing
betulinol-piekoppervlak in monsteroplossing
W1= sterol-concentratie van de standaard in de standaardoplossing
(4.8.1 of 4.9.1) in mg/ml
W2= gewicht van het monster (5.2.1) in g
P = zuiverheid van de standaard-sterol (4.8 of 4.9).
Sterol-gehalte van het monster (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE
7.1. Herhaalbaarheid.
7.1.1. Stigmasterol.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 8
▼B
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo
kortmogel ĳketĳduitgevoerddoordezelfdepersoonmetdezelfdeappa-
ratuur op hetzelfde monster, mag niet groter z ĳn dan 19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol.
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo
kortmogel ĳketĳduitgevoerddoordezelfdepersoonmetdezelfdeappa-
ratuur op hetzelfde monster, mag niet groter z ĳn dan 23,0 mg/kg.
7.2. Reproduceerbaarheid.
7.2.1. Stigmasterol.
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door
personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur ophetzelfde monster, mag niet groter z ĳn dan 31,9 mg/kg.
7.2.2. Sitosterol.
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door
personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur ophetzelfde monster, mag niet groter z ĳn dan 8,7 % van het gemiddelde
van de bepalingen.
7.3. Herkomst van de precisiegegevens.
Deprecisiegegevensz ĳnvastgesteldopbasisvaneenexperimentdatin
1992 in acht laboratoria werd uitgevoerd met zes monsters (drie blindeduplo’s) voor stigmasterol en zes monsters (drie blinde duplo’s) voorsitosterol.
8. TOLERANTIEGRENZEN
▼
M1
8.1. Om na te gaan of de toevoeging van verklikstoffen aan het product op
correctew ĳzeisgebeurd,moetenvanditproductdriemonstersworden
genomen.
▼B
8.2. Stigmasterol.
8.2.1. Het b ĳmengingsgehalte voor stigmasterol bedraagt 150 g met een
zuiverheid van ten minste 95 % per ton boter, d.w.z. 142,5 mg/kg, of170 g met een zuiverheid van ten minste 85 % per ton boter, d.w.z.144,5 mg/kg.
▼
M1
8.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie
monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene b ĳmen-
ging van de verklikstof te verifieren, en het laagste resultaat wordtvergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil b ĳeen waar-
schĳnlĳkheid van 95% (CrD95)):
— 120,0mg/kg(95%vanhetminimum-b ĳmengingsgehaltevoor95%
zuiver stigmasterol);
— 122,0mg/kg(95%vanhetminimum-b ĳmengingsgehaltevoor85%
zuiver stigmasterol);
— 84,0 mg/kg (70% van het minimum-b ĳmengingsgehalte voor 95%
zuiver stigmasterol);
— 86,0 mg/kg (70% van het minimum-b ĳmengingsgehalte voor 85%
zuiver stigmasterol).
De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resul-
taatoplevert,wordtgebruiktincombinatiemetinterpolatietussen120,0mg/kg en 84,0 mg/kg, respectievel ĳk 122,0 mg/kg en 86,0 mg/kg.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 9
▼B
8.3. Sitosterol.
8.3.1. Hetb ĳmengingsgehaltevoorsitosterolbedraagt600gmettenminste90
% zuiver sitosterol per ton boter, d.w.z. 540 mg/kg.
▼M1
8.3.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie
monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene b ĳmen-
ging van de verklikstof te verifieren, en het laagste resultaat wordtvergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil b ĳeen waar-
schĳnlĳkheid van 95% (CrD95)):
— 486,0mg/kg(95%vanhetminimum-b ĳmengingsgehaltevoor90%
zuiver sitosterol);
— 358,0mg/kg(70%vanhetminimum-b ĳmengingsgehaltevoor90%
zuiver sitosterol).
De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resul-
taatoplevert,wordtgebruiktincombinatiemetinterpolatietussen486,0mg/kg en 358,0 mg/kg.
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 10
▼
M1
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 11
▼
M1
1994R0086 — NL — 03.02.1999 — 001.001 — 12
▼
M1