1991R2568 — NL — 01.10.2008 — 022.001

Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschĳnt buiten de verantwoordelĳkheid van de instellingen

Gewĳzigd bĳ:





Gerectificeerd bĳ:









▼B

VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE

van 11 juli 1991

inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven en de desbetreffende analysemethoden







DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN, Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap, Gelet op Verordening nr. 136/66/EEG van de Raad van 22 september 1966 houdende de totstandbrenging van een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector oliën en vetten ( 1 ), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 3577/90 ( 2 ), en met name op artikel 35 bis, Overwegende dat in de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG de benamingen en definities zijn vastgesteld van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven die in elke Lid-Staat, in het kader van het handelsverkeer tussen de Lid-Staten onderling en in de handel met derde landen, worden verkocht; Overwegende dat, onverminderd andere bestaande bepalingen ter zake, ter onderscheiding van de verschillende soorten olie, de fysisch-chemische kenmerken van elke soort en de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen oliën dienen te worden bepaald, zodat zuiverheid en kwaliteit van de betrokken produkten kunnen worden gewaarborgd; Overwegende dat het dienstig is om de aanwezigheid van de kenmerken van de verschillende soorten olie in de gehele Gemeenschap op uniforme wijze te bepalen; dat daartoe communautaire methoden voor chemische analyse en organoleptische beoordeling dienen te worden vastgesteld; dat evenwel tijdens een overgangsperiode het gebruik van andere in de Lid-Staten toegepaste analysemethoden moet worden toegestaan, met dien verstande dat in geval van uiteenlopende resultaten de uitkomsten van de communautaire methode doorslaggevend zijn; Overwegende dat als gevolg van de bepaling van de fysisch-chemische kenmerken van de olijfoliën en de omschrijving van de analysemethoden de aanvullende aantekeningen van hoofdstuk 15 van de gecombineerde nomenclatuur aanpassing behoeven; Overwegende dat in het kader van de methode voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen oliën „panels” van geselecteerde en getrainde proevers dienen te worden gevormd; dat derhalve de nodige tijd moet worden gelaten om een dergelijke structuur tot stand te brengen; dat, gezien de moeilijkheden die sommige Lid-Staten zullen hebben om proefpanels te vormen, dient te worden toegestaan dat op in andere Lid-Staten reeds bestaande proefpanels een beroep wordt gedaan; Overwegende dat met het oog op de correcte werking van de regeling inzake de heffingen op de invoer van afvallen van olijven, een uniforme methode voor de bepaling van het oliegehalte van die produkten dient te worden vastgesteld; Overwegende dat het, om de handel niet te schaden, dienstig is een beperkte periode vast te stellen waarbinnen vóór de inwerkingtreding van deze verordening verpakte olie nog mag worden afgezet; Overwegende dat Verordening (EEG) nr. 1058/77 van de Commissie ( 3 ), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1858/88 ( 4 ), bijgevolg dient te worden ingetrokken; Overwegende dat het Comité van beheer voor oliën en vetten geen advies heeft uitgebracht binnen de door zijn voorzitter bepaalde termijn. HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:







▼M20

Artikel 1

1. Als „olijfoliën van eerste persing” in de zin van punt 1, onder a) en b), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG worden aangemerkt de oliën waarvan de respectieve kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punten 1 en 2, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

2. Als „olijfolie voor verlichting” in de zin van punt 1, onder c), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 3, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

3. Als „geraffineerde olijfolie” in de zin van punt 2 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 4, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

4. Als „olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing” in de zin van punt 3 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 5, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

5. Als „ruwe olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 4 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 6, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

6. Als „geraffineerde olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 5 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 7, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

7. Als „olie uit afvallen van olijven” in de zin van punt 6 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 8, bij de onderhavige verordening zijn vermeld.

▼B

Artikel 2

1. De in bijlage I vastgestelde kenmerken van de oliën worden aan de hand van de volgende analysemethoden bepaald:

— voor de bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, uitgedrukt in een percentage oliezuur, de in bijlage II beschreven methode;

— voor de bepaling van het peroxidegetal, de in bijlage III beschreven methode;

▼M19

— voor de bepaling van het gehalte aan was, de in bijlage IV beschreven methode;

▼B

— voor de bepaling van de sterolsamenstelling, de in bijlage V beschreven methode;

— voor de bepaling van het erythrodiol- en uvaolgehalte, de in bijlage VI beschreven methode;

▼M21

— voor de bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat, de in bijlage VII beschreven methode;

▼M20 —————

▼B

— voor de spectrofotometrische analyse, de in bijlage IX beschreven methode;

— voor de bepaling van de vetzuursamenstelling, de in de bijlagen X.A en X.B beschreven methode;

— voor de bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen, de in bijlage XI beschreven methode;

— voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie, de in bijlage XII beschreven methode, toegepast overeenkomstig het bepaalde in lid 2;

▼M20 —————

▼M11

— voor de bepaling van het gehalte aan stigmastadiënen, de in bijlage XVII beschreven methode;

▼M13

— voor de bepaling van de samenstelling van de triglyceriden met ECN42, de in bijlage XVIII beschreven methode;

▼M19

— voor de bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen, de in bijlage XIX beschreven methode.

▼M19

2. De verificatie van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers wordt uitgevoerd door een door de lidstaten erkend proeverspanel.

De organoleptische kenmerken van in de eerste alinea genoemde olie zijn die van de voor de olijfolie opgegeven categorie wanneer een door de betrokken lidstaat erkend panel de indeling in die categorie bevestigt.

Wanneer het panel de indeling van de olie ten aanzien van de organoleptische kenmerken van de opgegeven categorie niet bevestigt, laten de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers op verzoek van de belanghebbende twee tegenanalyses door andere proeverspanels uitvoeren, waarvan minstens één door een panel dat is erkend door de lidstaat van de betrokken producent. Er wordt aangenomen dat de betrokken kenmerken overeenstemmen met de opgegeven kenmerken als de twee tegenanalyses de indeling bevestigen. Zo niet, komen de kosten van de tegenanalyses, onverminderd andere sancties, voor rekening van de belanghebbende.

▼M17

3. Monsters voor de controle van de kenmerken van de in lid 1 bedoelde olie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers worden genomen volgens de internationale normen EN ISO 661 en EN ISO 5555 met betrekking tot de voorbereiding van de monsters voor onderzoek en de monsterneming. In afwijking van punt 6.8 van norm EN ISO 5555, worden echter voor partijen van dergelijke oliën in onmiddellijke verpakkingen, met een inhoud van maximaal 100 liter, monsters genomen volgens bijlage I bis.

▼M19

Onverminderd de voorschriften van norm EN ISO 5555 en hoofdstuk 6 van norm EN 661, worden de monsters zo snel mogelijk tegen licht en hitte beschermd en:

— wat de periode oktober-mei betreft, uiterlijk op de tiende werkdag na de dag waarop ze zijn genomen, of

— wat de periode juni-september betreft, uiterlijk op de vijfde werkdag na de dag waarop ze zijn genomen,

voor analyse naar het laboratorium gezonden.

▼M17

4. ►M20 Voor de in lid 3 bedoelde verificatie worden de in de bijlagen II, III, IX, X en XII bepaalde analyses en in voorkomend geval de door de nationale wetgevingen voorgeschreven tegenexpertises uitgevoerd vóór de datum van minimale houdbaarheid. Indien het monster meer dan vier maanden vóór de datum van minimale houdbaarheid wordt genomen, moeten de bovenbedoelde analyses uiterlijk in de vierde maand na de maand van de bemonstering worden verricht. Voor de andere in deze verordening bepaalde analyses is geen termijn van toepassing. ◄

Als de resultaten van de analyses niet beantwoorden aan de kenmerken van de aangegeven categorie olijfolie of olie uit afvallen van olijven, wordt de betrokkene hiervan uiterlijk één maand vóór het verstrijken van de in de eerste alinea bedoelde termijn in kennis gesteld, tenzij het monster minder dan een maand vóór de datum van minimale houdbaarheid is genomen.

▼M19

5. Voor de bepaling van de kenmerken van olijfolie volgens de in lid 1 aangegeven methoden worden de analyseresultaten rechtstreeks vergeleken met de in deze verordening vastgestelde grenswaarden.

▼M20

Artikel 2 bis

De verificatie door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordigers of een monster olijfolie of olie uit afvallen van olijven overeenstemt met de opgegeven categorie, kan worden verricht:

a) hetzij door de in bijlage I voorgeschreven analyses uit te voeren in om het even welke volgorde;

b) hetzij door de in bijlage I ter betreffende het beslissingsschema bepaalde volgorde te volgen totdat dit proces uitmondt in een van de in dat schema vermelde beslissingen.

▼M19 —————

▼M5

Artikel ►M19 3 ◄

Wanneer wordt geconstateerd dat de organoleptische kenmerken van een bepaalde olie verschillen van die welke deze olie op grond van haar benaming zou moeten hebben, past de betrokken Lid-Staat, onverminderd de eventuele andere sancties, administratieve geldboetes toe, waarvan de hoogte wordt bepaaldt op basis van de ernst van de geconstateerde onregelmatigheid.

Voor de beoordeling van de onregelmatigheid wordt met name rekening gehouden met de natuurlijke ontwikkeling van de kenmerken van olie die onder normale omstandigheden is bewaard.

De Lid-Staten brengen de Commissie aan het begin van ieder halfjaar op de hoogte van het aantal en de aard van de geconstateerde onregelmatigheden alsmede van de in het voorafgaande halfjaar toegepaste sancties.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Voor de beoordeling en controle van de organoleptische kenmerken door de nationale autoriteiten of hun vertegenwoordiger kunnen de lidstaten panels van proevers erkennen.

De erkenningsvoorwaarden worden door de lidstaten vastgesteld en wel zodanig dat:

— aan de voorwaarden van punt 4 van bijlage XII wordt voldaan;

— de voorzitter van het panel wordt opgeleid door een daartoe door de lidstaat erkende instelling en onder door de lidstaat goedgekeurde voorwaarden;

— de geldigheid van de erkenning afhankelijk wordt gemaakt van de resultaten van een jaarlijkse controle door de lidstaat.

Elke lidstaat stelt de Commissie in kennis van de lijst van erkende panels en van de overeenkomstig dit lid genomen maatregelen.

▼M5

2. Ingeval een Lid-Staat op zijn grondgebied moeilijk een panel van proevers kan instellen, mag hij een beroep doen op een door een andere Lid-Staat erkend panel.

3. Elke Lid-Staat stelt de lijst op van de door beroepsorganisaties of sectorale organisaties overeenkomstig de in lid 1 vermelde voorwaarden ingestelde panels van proevers en ziet toe op de naleving van deze voorwaarden.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Het oliegehalte van afvallen van olijven en van de andere bij de winning van olijfolie verkregen afvallen (GN-codes 2306 90 11 en 2306 90 19) wordt bepaald overeenkomstig de in bijlage XV opgenomen methode.

2. Het in lid 1 bedoelde oliegehalte wordt uitgedrukt in gewichtspercenten berekend over de droge stof.

▼M20

Artikel 7

De communautaire bepalingen betreffende de aanwezigheid van verontreinigende stoffen zijn van toepassing.

Wat het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen betreft, gelden voor alle categorieën olijfolie de volgende grenswaarden:

— maximumgehalte voor elk gedetecteerd gehalogeneerd oplosmiddel: 0,1 mg/kg,

— maximumgehalte voor de som van de gedetecteerde gehalogeneerde oplosmiddelen: 0,2 mg/kg.

▼B

Artikel 8

1. Elke Lid-Staat stelt de Commissie van de ter uitvoering van deze verordening genomen maatregelen in kennis.

2. Elke Lid-Staat legt de Commissie aan het begin van elk halfjaar een verzamelstaat met de analyseresultaten van de in het voorgaande halfjaar uitgevoerde bepalingen over.

Deze resultaten worden volgens de procedure van artikel 39 van Verordening nr. 136/66/EEG door het Comité van beheer voor oliën en vetten onderzocht.

Artikel 9

Verordening (EEG) nr. 1058/77 wordt hierbij ingetrokken.

Artikel 10

1. Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.

De in bijlage XII beschreven methode wordt, behalve voor verrichtingen in het kader van de interventieregeling, met ingang van ►M1 1 november 1992 ◄ toegepast.

▼M5

Deze methode geldt niet voor olijfolie van de eerste persing die vóór 1 november 1992 is verpakt.

▼B

2. Deze verordening is niet van toepassing op olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn verpakt en tot en met 31 oktober 1992 worden verkocht.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.









BIJLAGEN

Inhoudsopgave







Bijlage I: Kenmerken van olijfolie Bijage I bis: Bemonstering van partijen olijfolie en olie uit afvallen van olijven in onmiddellijke verpakkingen van ten hoogste 100 liter Bijlage I ter: Beslissingsschema Bijlage II: ►M21 Bepaling van vrije vetzuren, koude methode ◄ Bijlage III: Bepaling van het peroxidegetal Bijlage IV: ►M6 Bepaling van het gehalte aan was met behulp van capillaire gaschromatografie ◄ Bijlage V: Bepaling van de sterolsamenstelling en het sterolgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie Bijlage VI: Bepaling van het gehalte aan erythrodiol en uvaol Bijlage VII: ►M21 Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat ◄ Bijlage VIII: Bepaling van het gehalte aan trilinoleïne Bijlage IX: Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied Bijlage X.A: Gaschromatografische analyse van methylesters van vetzuren Bijlage X.B: Bereiding van methylesters van vetzuren overeenkomstig bijlage VI, punten I en II, van Verordening (EEG) nr. 72/77 of volgens de hieronder beschreven methode Bijlage XI: Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen Bijlage XII: Organoleptische beoordeling van olijfolie van eerste persing Bijlage XIII: ►M6 Neutralisering en ontkleuring van olijfolie in het laboratorium ◄ Bijlage XIV: Aanvullende aantekeningen 2, 3 en 4 bij hoofdstuk 15 van de gecombineerde nomenclatuur Bijlage XV: Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven Bijlage XVI: Bepaling van het joodgetal Bijlage XVII: Methode voor de bepaling van de stigmastadiënen in plantaardige oliën Bijlage XVIII: Methode voor de bepalingen van de samenstelling van de triglyceriden met ECN42 Bijlage XIX: Methode voor de bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen

▼M21









BIJLAGE I

KENMERKEN VAN OLIJFOLIE







Categorie Zuurgraad (%) (*) Peroxidegetal mEq O2/kg (*) Was mg/kg (**) Glycerol-2-monopalmitaat (%) Stigmastadiënen mg/kg (1) Verschil ECN42, HPLC en ECN42, theoretische berekening K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptische beoordeling Mediaan voor de gebreken (Md) (*) Organoleptische beoordeling Mediaan „fruitig” (Mf) (*) 1. Extra olijfolie van eerste persing ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Olijfolie van eerste persing ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ ►M22 3,5 ◄ Mf > 0 3. Olijfolie voor verlichting > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > ►M22 3,5 ◄ (2) — 4. Geraffineerde olijfolie ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 1,1 als % palmitinezuur totaal > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 als % palmitinezuur totaal ≤ 14 % ≤ 1,0 als % palmitinezuur totaal > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Ruwe oliën uit afvallen van olijven — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Geraffineerde oliën uit afvallen van olijven ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olie uit afvallen van olijven ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Categorie Vetzuurgehalte (1) Totaal transoliezuurisomeren (%) Totaal translinolzuur en translinoleenzuurisomeren (%) Sterolsamenstelling Totaal sterolen (mg/kg) Erythrodiol plus uvaol (%) (**) Myristinezuur (%) Linoleenzuur (%) Arachidezuur (%) Eicosaanzuur (%) Beheenzuur (%) Lignocerinezuur (%) Cholesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7-stigmasterol (%) 1. Extra olijfolie van eerste persing ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Olijfolie van eerste persing ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Olijfolie voor verlichting ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Geraffineerde olijfolie ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olijfolie bestaande uit geraffineerde olijfoliën en olijfoliën van eerste persing ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Ruwe olie uit afvallen van olijven ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Geraffineerde olie uit afvallen van olijven ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olie uit afvallen van olijven ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









BIJLAGE I bis

Bemonstering van olijfolie en olie uit afvallen van olijven die worden geleverd in onmiddellijke verpakkingen van ten hoogste 100 l

De onderstaande bemonsteringsmethode is van toepassing op leveranties olijfolie of olie uit afvallen van olijven van maximaal 125 000 l, in onmiddellijke verpakkingen van maximaal 100 l.

Wanneer de leverantie groter is dan 125 000 l, wordt deze verdeeld in partijen van 125 000 of minder. Wanneer de leverantie niet groter is dan 125 000 l, vormt zij een partij. De methode wordt vervolgens toegepast op elke partij.

Het minimumaantal primaire monsters dat moet worden genomen, is afhankelijk van de grootte van de partij zoals aangegeven in de tabel in punt 1.

De omvang van het primaire monster is afhankelijk van de inhoud van de onmiddellijke verpakkingen zoals aangegeven in de tabel in punt 2.1.

Voor de begrippen „leverantie”, „primair monster” en „laboratoriummonster” gelden de begripsomschrijvingen in norm EN ISO 5555.

Onder „partij” wordt verstaan een verzameling voor verkoop bestemde eenheden die onder zodanige omstandigheden zijn geproduceerd, vervaardigd en verpakt dat de olie in al deze eenheden als homogeen wordt beschouwd wat alle analytische kenmerken betreft.

1. AANTAL PRIMAIRE MONSTERS

Het minimumaantal primaire monsters dat moet worden genomen, is afhankelijk van de grootte van de partij en wordt bepaald volgens de onderstaande tabel:







Partij kleiner dan (in l) Minimumaantal primaire monsters 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

De onmiddellijke verpakkingen die in een primair monster worden opgenomen, moeten in de partij naast elkaar liggen.

In geval van twijfel verhoogt de lidstaat het aantal te nemen primaire monsters.

2. SAMENSTELLING VAN EEN PRIMAIR MONSTER

2.1 De primaire monsters bestaan uit het volgende







In het geval van onmiddellijke verpakkingen met een inhoud van: omvat het primaire monster: a) ten minste 5 l a) de olie van 3 onmiddellijke verpakkingen b) ten minste 3 l en minder dan 5 l b) de olie van 3 onmiddellijke verpakkingen c) ten minste 2 l en minder dan 3 l c) de olie van 3 onmiddellijke verpakkingen d) ten minste 1 l en minder dan 2 l d) de olie van 6 onmiddellijke verpakkingen e) ten minste 0,75 l en minder dan 1 l e) de olie van 6 onmiddellijke verpakkingen f) minder dan 0,75 l f) driemaal de olie van het aantal verpakkingen dat minimaal nodig is om op een totale inhoud van meer dan 1,5 liter te komen

2.2 De primaire monsters moeten tot het tijdstip van de analyse in de onmiddellijke verpakking worden bewaard. De olie van de primaire monsters wordt vervolgens in voorkomend geval in drie laboratoriummonsters gesplitst voor het verrichten van:

a) de in de bijlagen II, III, IX en X bepaalde analyses,

b) de in bijlage XII bepaalde analyse en

c) de overige analyses.

2.3 De verpakkingen die een primair monster vormen, worden gesplitst volgens de in de nationale wetgeving vastgestelde controleprocedures.

3. ANALYSES EN RESULTATEN

a) Elk van de in punt 1 bedoelde primaire monsters wordt overeenkomstig punt 2.5 van norm EN ISO 5555 gesplitst in laboratoriummonsters, waarop de volgende analyses worden uitgevoerd: — bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren als bedoeld in artikel 2, lid 1, eerste streepje, — bepaling van het peroxidegetal als bedoeld in artikel 2, lid 1, tweede streepje, — spectrofotometrische analyse als bedoeld in artikel 2, lid 1, achtste streepje, — bepaling van de vetzuursamenstelling als bedoeld in artikel 2, lid 1, negende streepje.

b) Indien de resultaten van de onder a) bedoelde analyses voor ten minste één van de primaire monsters uit dezelfde partij niet allemaal overeenstemmen met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de betrokken partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de voorschriften beschouwd. Indien de resultaten van de onder a) bedoelde analyses voor de onderscheiden primaire monsters uit dezelfde partij, gelet op de herhaalbaarheid van de betrokken methoden, niet allemaal homogeen zijn, wordt de partij in haar geheel als niet homogeen beschouwd en moet elk primair monster aan de overige vereiste analyses worden onderworpen. In het tegenovergestelde geval wordt slechts één van de primaire monsters uit de partij aan de overige vereiste analyses onderworpen.

c) Indien één van de resultaten van de onder b), tweede alinea, bedoelde analyses niet overeenstemt met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de betrokken partij in haar geheel als niet in overeenstemming met de voorschriften beschouwd. Indien alle resultaten van de onder b), tweede alinea, bedoelde analyses overeenstemmen met de kenmerken van de opgegeven categorie olie, wordt de betrokken partij in haar geheel als in overeenstemming met de voorschriften erkend.

▼M20









BIJLAGE I ter

BESLISSINGSSCHEMA OM NA TE GAAN OF EEN MONSTER OLIJFOLIE OVEREENSTEMT MET DE OPGEGEVEN CATEGORIE

De analyse om na te gaan of olijfolie of olie uit afvallen van olijven overeenstemt met de opgegeven categorie, kan worden verricht:

a) hetzij door de analyses die zijn voorgeschreven om na te gaan of de olie aan de in bijlage I bepaalde kenmerken voldoet, uit te voeren in om het even welke volgorde,

b) hetzij door de analyses waarin het beslissingsschema voorziet, in de in dat schema aangegeven volgorde uit te voeren totdat dit proces uitmondt in één van de in dat schema vermelde beslissingen.

De analyses betreffende verontreinigende stoffen die nodig zijn om na te gaan of aan de normen van de Europese Gemeenschap is voldaan, worden los hiervan uitgevoerd.

Het beslissingsschema geldt voor alle categorieën olijfolie en olie uit afvallen van olijven. Het bestaat uit van 1 tot en met 11 genummerde tabellen die moeten worden gebruikt in de in de algemene tabel vermelde volgorde, afhankelijk van de categorie die voor de betrokken olie is opgegeven.

Voor de interpretatie van de algemene tabel tot en met tabel 11 geldt het volgende:

— Een dubbele lijn (=) geeft de weg aan die moet worden gevolgd als is voldaan (positief antwoord) aan de in het voorgaande vak bedoelde voorwaarden. Een stippellijn (…) daarentegen geeft de weg aan die moet worden gevolgd als niet aan die voorwaarden is voldaan.

— De titels van de vakken in de tabellen 1 tot en met 11 verwijzen naar de in deze verordening voorgeschreven analyses zoals aangegeven in de concordantietabel in aanhangsel 1 van deze bijlage.

— De verwijzingsletters in de cirkels betreffende een negatieve beslissing in de tabellen 1 tot en met 11 hebben betrekking op indicatieve informatie die is opgenomen in aanhangsel 2 van deze bijlage. Zij impliceren op zichzelf niet dat de analyses moeten worden voortgezet of dat het vermelde met zekerheid wordt gesteld.

Algemene tabel

Tabel 1

Tabel 2

Tabel 3

Tabel 4

Tabel 5

Tabel 6

Tabel 7

Tabel 8

Tabel 9

Tabel 10

Tabel 11









Aanhangsel 1

Concordantietabel tussen de bijlagen bij deze verordening en de in het beslissingsschema bedoelde analyses







▼M21 — Zuurgraad: Bijlage II Bepaling van vrije vetzuren, koude methode ▼M20 — Peroxidegetal: Bijlage III Bepaling van het peroxidegetal. — UV-spectrofotometrie: Bijlage IX Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied. — Organoleptische beoordeling: Bijlage XII Organoleptische beoordeling van olijfolie van eerste persing. — Stigmasta -3,5-dieen: Bijlage XVII Methode voor de bepaling van stigmastadiënen in plantaardige oliën. — Trans-isomeren van vetzuren: Bijlage X.A en Gaschromatografische analyse van methylesters van vetzuren. bijlage X.B Bereiding van methylesters van vetzuren. — Vetzuursamenstelling: Bijlage X.A en Gaschromatografische analyse van methylesters van vetzuren. bijlage X.B Bereiding van methylesters van vetzuren. — ΔECN42: Bijlage XVIII Bepaling van triacylglycerolen met ECN42 (verschil tussen HPLC-gegevens en theoretisch gehalte). — Sterolsamenstelling en totaalgehalte aan sterolen: Bijlage V Bepaling van de sterolsamenstelling en het sterolgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie. — Gehalte aan erythrodiol en uvaol: Bijlage VI Bepaling van het gehalte aan erythrodiol en uvaol. — Gehalte aan was: Bijlage IV Bepaling van het gehalte aan was met behulp van capillaire gaschromatografie. — Alifatische alcoholen: Bijlage XIX Bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie. ▼M21 — Verzadigde vetzuren op de 2-positie: Bijlage VII Bepaling van het percentage glycerol-2-monopalmitaat. ▼M20









Aanhangsel 2

Tabel 1

a) Zie olijfolie van eerste persing of olijfolie voor verlichting (kwaliteitscriteria, tabel 2, of kwaliteits- en zuiverheidscriteria, tabel 4)

b) Zie olijfolie voor verlichting (kwaliteits- en zuiverheidscriteria, tabel 4)

Tabel 2

a) Zie olijfolie voor verlichting (kwaliteits- en zuiverheidscriteria, tabel 4)

b) Zie extra olijfolie van eerste persing (kwaliteitscriteria, tabel 1)

Tabel 3

a) Bevat geraffineerde olie (olijfolie of andere)

b) Bevat olie van afvallen van olijven

Tabel 4

a) Zie extra olijfolie van eerste persing en olijfolie van eerste persing (kwaliteitscriteria, tabellen 1 en 2)

b) Bevat geraffineerde olie (olijfolie of andere)

c) Bevat olie van afvallen van olijven

d) Bevat veresterde oliën

Tabel 7

a) Bevat olie van afvallen van olijven

b) Bevat veresterde oliën

Tabel 8

a) Bevat geraffineerde olie (olijfolie of andere)

b) Zie olijfolie voor verlichting (kwaliteits- en zuiverheidscriteria, tabel 4)

c) Bevat veresterde oliën

Tabel 11

a) Bevat veresterde oliën

▼B









BIJLAGE II

▼M21

BEPALING VAN VRIJE VETZUREN, KOUDE METHODE.

▼B

1. DOEL

Bepaling van de vrije vetzuren in olijfolie. Het gehalte aan vrije vetzuren wordt uitgedrukt in de volgens de klassieke methode berekende zuurgraad.

1.1. Principe van de methode

Oplossing van het monster in een mengsel van oplosmiddelen, daarna titrering van de aanwezige vrije vetzuren met behulp van een oplossing van kaliumhydroxide in ethanol.

1.2. Reagentia

Alle reagentia moeten p.a. zijn en het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

1.2.1. Diëthylether: 95 % ethanol (v/v), mengsel 1: 1 (v/v) in volume. Waarschuwing: Diëthylether is zeer ontvlambaar en kan explosieve peroxiden vormen. Bij gebruik ervan dienen bijzondere voorzorgen te worden genomen. Neutraliseer, precies op het ogenblik van gebruik, met de kaliumhydroxide-oplossing (1.2.2), in aanwezigheid van 0,3 ml phenolphtaleïne-oplossing (1.2.3) voor 100 ml mengsel. Opmerking: Indien gebruik van diëthylether onmogelijk is, kan een mengsel van uit ethanol en tolueen bestaande oplosmiddelen worden gebruikt. Zonodig kan ethanol worden vervangen door propanol-2.

1.2.2. Kaliumhydroxide, in ethanol getitreerde oplossing, c(KOH), ongeveer 0,1 mol/l of, indien nodig, c(KOH) ongeveer 0,5 mol/l. De precieze concentratie van de oplossing van kaliumhydroxide in ethanol dient bekend te zijn en onmiddellijk voor gebruik te worden geverifieerd. Gebruik een oplossing die minstens vijf dagen voor gebruik is bereid en is gedecanteerd in een donkerbruine, met een rubberen stop gesloten fles. De oplossing dient kleurloos of strogeel te zijn. Opmerking: Een stabiele, kleurloze kaliumhydroxideoplossing kan op de volgende wijze worden bereid. 1 000 ml ethanol op temperatuur en gedurende één uur koken, met reflux, met 8 g kaliumhydroxide en 0,5 g aluminiumsnippers. Onmiddellijk distilleren. In het distillaat de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide oplossen. Verschillende dagen laten rusten en de heldere supernotans van het kaliumcarbonaatneerslag decanteren. De oplossing kan ook zonder distillatie op de volgende wijze worden bereid. Aan 1 000 ml ethanol 4 ml aluminiumbutylaat toevoegen en het mengsel enkele dagen laten staan. Het supernotans decanteren en de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide erin oplossen. De oplossing is klaar voor gebruik.

1.2.3. Phenolphtaleïne, oplossing van 10 g/l in 95-96 % ethanol (v/v) of alkalisch blauw (in geval van sterk gekleurde vetten), oplossing van 20 g/l in 95-96 % ethanol (v/v).

1.3. Apparatuur

Gebruikelijk laboratoriummateriaal, en met name:

1.3.1. Analytische balans.

1.3.2. Kolf van 250 ml.

1.3.3. Buret van 10 ml, met een schaalindeling van 0,05 ml.

1.4. Werkwijze

1.4.1. Bereiding van het te analyseren monster De bepaling wordt uitgevoerd op een gefiltreerd monster. Wanneer de som van vochtgehalte en gehalte aan onzuiverheden kleiner is dan 1 %, wordt de bepaling uitgevoerd op het monster als zodanig.

1.4.2. Monsterneming Houd bij het nemen van het monster rekening met het verwachte zuurgetal volgens de gegevens van de volgende tabel.



Verwacht zuurgetal Hoeveelheid af te wegen monster (g) Nauwkeurigheid van de weging van het monster (g) < 1 20 0,05 1 tot 4 10 0,02 4 tot 15 2,5 0,01 15 tot 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Weeg het monster in de kolf (1.3.2).

1.4.3 Bepaling Los het monster (1.4.2) op in 50 tot 150 ml van het mengsel diëthylether/ethanol (1.2.1) dat tevoren is geneutraliseerd. Titreer, al schuddend, met de oplossing 0,1 mol/l kaliumhydroxide (1.2.2) (zie opmerking 3) tot omslag van de indicator (rose kleuring van de phenophtaleïne die ten minste 10 seconden aanhoudt). Opmerking 1: De getitreerde kaliumhydroxideoplossing in ethanol (1.2.2) kan worden vervangen door een oplossing in water van kalium- of natriumhydroxide wanneer het erin gebrachte volume water niet tot een fasescheiding leidt. Opmerking 2: Als de nodige hoeveelheid 0,1 mol/l kaliumhydroxideoplossing 10 ml overschrijdt, gebruik dan een oplossing van 0,5 mol/l. Opmerking 3: Als de oplossing troebel wordt tijdens de titrering, voeg dan een hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen (1.2.1) toe tot de oplossing helder wordt.

1.5 Formulering in zuurgraad in percentage oliezuur

De zuurgraad, uitgedrukt in gewichtspercentage, is gelijk aan:

waarin:

V = het volume in ml van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing;

c = de precieze concentratie, in mol/l van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing;

M = het molaire gewicht, in grammen per mol, van het zuur dat voor de weergave van de resultaten is gekozen (= 282);

m = de hoeveelheid af te wegen monster in gram.

Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde ►M6 van twee bepalingen ◄ .









BIJLAGE III

BEPALING VAN HET PEROXIDEGETAL

1. DOEL

Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het peroxidegetal van oliën en vetten.

2. TOEPASSINGSGEBIED

Deze norm geldt voor dierlijke en plantaardige oliën en vetten.

3. DEFINITIE

Het peroxidegetal is de hoeveelheid stoffen in het monster, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, die kaliumjodide oxideren bij de beschreven werkomstandigheden.

4. PRINCIPE VAN DE METHODE

Het in een mengsel van azijnzuur en chloroform opgeloste vet wordt behandeld met kaliumjodide en het vrijgemaakte jodide wordt getitreerd met natriumthiosulfaatoplossing.

5. APPARATUUR

Alle gebruikte apparatuur dient vrij te zijn van reducerende of oxiderende stoffen.

Opmerking:

Geslepen oppervlakten niet invetten.

5.1. 3 ml glazen weegschuitje.

5.2. Kolven met geslepen halzen en stoppen, van ongeveer 250 ml, vooraf gedroogd en gevuld met een zuiver, droog inert gas (stikstof of, bij voorkeur, koolstofdioxide).

5.3. Buret van 25 of 50 ml, met een schaalindeling van 0,1 ml.

6. REAGENTIA

6.1. Chloroform, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog inert gas.

6.2. IJsazijn, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog gas.

6.3. Kaliumjodide, verzadigde oplossing in water, vlak vóór gebruik bereid, vrij van jodium of jodaat.

6.4. Natriumthiosulfaat, 0,01 of 0,002 N nauwkeurig gestelde oplossing in water, onmiddellijk vóór gebruik gesteld.

6.5. Zetmeeloplossing, 10 g/l oplossing in water, vers bereid uit natuurlijk oplosbaar zetmeel.

7. MONSTER

Zorg ervoor dat het monster niet in de nabijheid van licht wordt genomen, dat het in het donker wordt bewaard en vervolgens koud wordt opgeslagen in volledig gevulde glazen recipiënten, hermetisch afgesloten met stoppen van geslepen glas of kurk.

8. WERKWIJZE

De proef dient in diffuus daglicht of bij kunstlicht te worden uitgevoerd. Weeg in een glazen weegschuitje (5.1), of bij gebrek daaraan in een kolf (5.2), tot op 0,001 g nauwkeurig, een hoeveelheid van het monster volgens de volgende tabel, afhankelijk van het verwachte peroxidegetal.







Verwacht peroxidegetal (meq O2/kg) Hoeveelheid van het monster (g) 0 tot 12 5,0 tot 2,0 12 tot 20 2,0 tot 1,2 20 tot 30 1,2 tot 0,8 30 tot 50 0,8 tot 0,5 50 tot 90 0,5 tot 0,3

Ontstop een kolf (5.2) en breng er het glazen weegschuitje in dat het monster bevat. Voeg 10 ml chloroform toe (6.1). Los het monster snel op door roeren. Voeg 15 ml azijnzuur (6.2) toe, daarna 1 ml kaliumjodideoplossing (6.3). Sluit snel af met de stop, schud gedurende één minuut en laat precies vijf minuten in het donker staan bij een temperatuur van 15 tot 25 °C.

Voeg ongeveer 75 ml gedistilleerd water toe. Titreer, krachtig schuddend, het vrijgekomen jodium met de natriumthiosulfaatoplossing (6.4) (0,002 N oplossing voor verwachte waarden van minder dan 12 en 0,01 N oplossing voor verwachte waarden boven 12), met gebruik van de zetmeeloplossing (6.5) als indicator.

Voer twee bepalingen uit op hetzelfde proefmonster.

Voer terzelfder tijd een blanco bepaling uit. Indien het resultaat van de blanco bepaling meer bedraagt dan 0,05 ml van de 0,01 N natriumthiosulfaatoplossing (6.4), vervang dan de onzuivere reagentia.

9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Het peroxidegetal, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, wordt weergegeven met de formule:

waarin:

V = de gebruikte hoeveelheid gestelde natriumthiosulfaatoplossing (6.4) in millimeter, gecorrigeerd om rekening te houden met de blanco bepaling;

T = de precieze normaliteit van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing (6.4);

m = het gewicht van het monster, in gram.

Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee uitgevoerde bepalingen.

▼M21









BIJLAGE IV

BEPALING VAN HET WASGEHALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1. DOEL

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het wasgehalte van olijfolie. De was wordt aan de hand van het aantal koolstofatomen gescheiden. De methode kan vooral worden gebruikt om geperste olijfolie te onderscheiden van geëxtraheerde olijfolie (uit persafvallen van olijven).

2. PRINCIPE

De olie of het vet, waaraan een geschikte interne standaard is toegevoegd, wordt gefractioneerd door kolomchromatografie over een gehydrateerde silicagel-kolom. De onder de werkomstandigheden eerst geëlueerde fractie (met een lagere polariteit dan de triglyceridenfractie) wordt opgevangen en vervolgens direct geanalyseerd met behulp van capillaire gaschromatografie.

3. APPARATUUR

3.1. Erlenmeyer, 25 ml.

3.2. Glazen kolom voor gaschromatografie met een inwendige diameter van 15,0 mm en een lengte van 30-40 cm, voorzien van een kraan.

3.3. Geschikte gaschromatograaf voor een capillaire kolom, voorzien van een „on-column” injectiesysteem, bestaande uit: 3.3.1. Een oven met thermostaat voor de kolom met programmeerbare temperatuur. 3.3.2. Een „cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen. 3.3.3. Een vlamionisatiedetector met een omzetter/versterker. 3.3.4. Een recorder/integrator, geschikt voor gebruik met de omzetter/versterker (3.3.3), met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid. (Er kan ook een computersysteem worden gebruikt waarmee de gaschromatografie-gegevens via een pc kunnen worden geregistreerd.) 3.3.5. Capillaire kolom, glas of kwartsglas, met een lengte van 8-12 m en een inwendige diameter van 0,25-0,32 mm en inwendig bekleed met een laagje stationaire fase met een uniforme dikte van 0,10-0,30 μm. (Gebruiksklare stationaire fase van type SE52 of SE54 is in de handel verkrijgbaar.)

3.4. Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, voor directe injectie op de kolom.

3.5. Elektrisch schudapparaat.

3.6. Rotatieverdamper.

3.7. Droogstoof.

3.8. Analytische balans met een nauwkeurigheid van + 0,1 mg.

3.9. Standaard-laboratoriumglaswerk.

4. REAGENTIA

4.1. Silicagel met een korrelgrootte tussen 60 en 200 μm. Droog de silicagel in een droogstoof gedurende ten minste 4 uur bij 500 °C. Voeg na afkoelen een volume water toe dat overeenkomt met 2 % van het gewicht van de gebruikte silicagel. Schud voldoende om de massa uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik in het donker rusten.

4.2. n-Hexaan (voor chromatografie).

4.3. Ethylether (voor chromatografie).

4.4. n-Heptaan (voor chromatografie).

4.5. Standaardoplossing van laurylarachidaat, 0,1 % (m/v) in hexaan (interne standaard). (Ook palmitylpalmitaat en myristylstearaat kunnen worden gebruikt.) 4.5.1. Soedanrood 1 (1-fenylazo-2-naftol).

4.6. Draaggas: zuivere waterstof of helium (voor gaschromatografie).

4.7. Hulpgassen: — zuivere waterstof (voor gaschromatografie); — zuivere lucht (voor gaschromatografie).

5. PROCEDURE

5.1. Voorbehandeling van de chromatografiekolom

Suspendeer 15 g silicagel (4.1) in n-hexaan (4.2) en breng dit in de kolom (3.2). Laat eerst spontaan uitzakken en vervolgens met een elektrisch schudapparaat (3.5) om de chromatografielaag homogener te maken. Laat 30 ml n-hexaan doorlopen om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Weeg met de balans (3.8) nauwkeurig 500 mg monster af in de erlenmeyer van 25 ml (3.1) en voeg afhankelijk van het verwachte wasgehalte de juiste hoeveelheid interne standaard (4.5) toe. Voeg bij olijfolie bijvoorbeeld 0,1 mg laurylarachidaat toe en bij olie uit afvallen van olijven 0,25-0,5 mg. Breng het zo voorbehandelde monster met behulp van twee porties van elk 2 ml n-hexaan (4.2) op de chromatografiekolom.

Laat het oplosmiddel door de kolom lopen tot 1 mm boven de bovenkant van het adsorbens en laat vervolgens nog eens 70 ml n-hexaan doorlopen om van nature aanwezige n-alkanen te verwijderen. Begin vervolgens de chromatografische elutie met 180 ml van het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) met een elutiesnelheid van ongeveer 15 druppels per 10 seconden. De elutie van het monster moet bij kamertemperatuur (22 ± 4 °C) worden uitgevoerd.

NB:

— Het mengsel n-hexaan/ethylether (99:1) moet elke dag vers worden bereid.

— Voor een visuele controle op een juiste elutie van de was kan aan het opgeloste monster 100 μl soedanrood 1 (1 % in de elutievloeistof) worden toegevoegd. Aangezien deze kleurstof een retentietijd tussen die van de was en de triglyceriden heeft, kan de elutie worden gestopt wanneer de kleur de onderkant van de chromatografiekolom bereikt, omdat de was dan volledig is geëlueerd.

Damp de aldus verkregen fractie in de rotatieverdamper (3.6) in tot bijna droog. Verwijder de laatste 2 ml oplosmiddel met een zachte stikstofstroom en neem het residu op in 2-4 ml n-heptaan.

5.2. Gaschromatografische analyse

5.2.1. Voorbereidende werkzaamheden

Bevestig de kolom in de gaschromatograaf (3.3), waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten op het „on-column”-systeem en het uiteinde op de detector. Voer de gebruikelijke controle van de gaschromatografieapparatuur uit (toestand van de gasleidingen, efficiëntie van de detector en de recorder enz.).

Als de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, wordt conditionering aanbevolen. Laat een zachte gasstroom door de kolom lopen en schakel de gaschromatografieapparatuur in. Verwarm geleidelijk totdat na ongeveer 4 uur een temperatuur van 350 °C wordt bereikt. Houd deze temperatuur gedurende ten minste 2 uur aan en stel vervolgens de apparatuur in op de gebruiksomstandigheden (gassnelheid instellen, vlam ontsteken, elektronische recorder (3.3.4) aansluiten, temperatuur van de kolomoven instellen, temperatuur van de detector instellen enz.) en registreer het signaal bij een gevoeligheid die ten minste twee keer zo groot is als bij de uitvoering van de analyse wordt verwacht. De basislijn moet lineair zijn, mag geen enkele piek vertonen en mag niet verlopen.

Een rechtlijnig negatief verloop wijst op lekkage bij de aansluiting van de kolom; een positief verloop wijst op een onvoldoende conditionering van de kolom.

5.2.2. Keuze van de werkomstandigheden

In het algemeen dienen de volgende werkomstandigheden te worden aangehouden:

— kolomtemperatuur: —



20 °C/minuut 5 °C/minuut 20 °C/minuut vanaf 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detectortemperatuur: 350 °C;

— geïnjecteerde hoeveelheid: 1 μl van de oplossing (2-4 ml) in n-heptaan;

— draaggas: helium of waterstof met de optimale lineaire snelheid voor het gekozen gas (zie aanhangsel);

— gevoeligheid van de recorder: deze moet voldoen aan de volgende voorwaarden:

Deze voorwaarden kunnen afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig worden gewijzigd dat alle wassen volledig worden gescheiden met een afdoende resolutie van de pieken (zie figuur), terwijl de retentietijd van de interne standaard (C32) 18 ± 3 minuten moet bedragen. De meest representatieve piek van de wassen moet een hoogte van ten minste 60 % van de volle schaaluitslag hebben.

De piekintegratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakken wordt verkregen.

NB: Gezien de hoge eindtemperatuur wordt een positief verloop toegestaan, dat niet groter mag zijn dan 10 % van de volle schaaluitslag.

5.3. Uitvoering van de analyse

Zuig met de 10 μl micro-injectiespuit 1 μl oplossing op. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Steek de naald door het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden; trek de naald ongeveer 5 seconden later langzaam terug.

Neem het chromatogram op tot de was volledig is geëlueerd.

De basislijn moet steeds aan de vereiste voorwaarden voldoen.

5.4. Identificatie van de pieken

De verschillende pieken worden geïdentificeerd aan de hand van de retentietijd en door vergelijking met wasmengsels met een bekende retentietijd die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.

De figuur bevat een chromatogram van de wassen in een olijfolie van eerste persing.

5.5. Kwantitatieve evaluatie

Bereken met de integrator het piekoppervlak van de interne standaard en de alifatische esters (C40-C46).

Bereken met de volgende formule het wasgehalte van elke ester in mg/kg vet:

Hierbij is:

Ax = het piekoppervlak van elke ester in mm2;

As = het piekoppervlak van de interne standaard in mm2;

ms = de toegevoegde massa interne standaard in mg;

m = de massa van het monster voor de bepaling in g.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Vermeld de som van de gehaltes aan de verschillende wassen (C40-C46) in mg/kg vet (ppm).

NB: De te kwantificeren verbindingen verwijzen naar de pieken met een even aantal koolstofatomen tussen de esters C40 en C46, zoals weergegeven in onderstaand chromatogram voor was uit olijfolie. Als de ester C46 een dubbele piek oplevert, wordt aanbevolen voor de identificatie daarvan de wasfractie van een olijfolie uit afvallen van olijven te analyseren, aangezien de C46-fractie daarin duidelijk de overhand heeft en de piek dus gemakkelijk te identificeren is.

De resultaten worden met één cijfer achter de komma vermeld.

Figuur

Gaschromatogram van de wasfractie van een olijfolie ( 5 )

Verklaring:

I.S. = Laurylarachidaat

1 = Diterpeenesters

2 + 2′ = C40-esters

3 + 3′ = C42-esters

4 + 4′ = C44-esters

5 = C46-esters

6 = Sterolesters en triterpeenalcoholen.









AANHANGSEL

Bepaling van de lineaire gassnelheid

Injecteer 1-3 μl methaan (of propaan) in de gaschromatograaf nadat deze op de normale werkomstandigheden is ingesteld. Registreer hoeveel tijd verstrijkt tussen het moment waarop het gas op de kolom wordt geïnjecteerd en het moment waarop de piek verschijnt (tM).

De lineaire snelheid (in cm/s) wordt berekend met de formule L/tM, waarbij L de lengte van de kolom in cm is en tM de geregistreerde tijd in seconden.

▼B









BIJLAGE V

BEPALING VAN DE STEROLSAMENSTELLING EN HET STEROLGEHALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1. DOEL

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het individuele en totale sterolgehalte van vetstoffen.

2. PRINCIPE VAN DE METHODE

De vetstof, waaraan α-cholestanol als interne standaard is toegevoegd, wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met ethylether.

De sterolfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden met behulp van basische kiezelgel dunne-laagchromatografie. De van de dunne-laagplaat verzamelde sterolen worden omgezet in trimethylsilylethers en via capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald.

3. APPARATUUR

3.1. Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2. Scheitrechters van 500 ml.

3.3. Kolven van 250 ml.

3.4. Volledige uitrusting voor dunne-laagchromatografie met 20 × 20 cm glasplaten.

3.5. Ultravioletlamp met een golflengte van 366 of 254 nm.

3.6. Injectiespuiten van 100 μl en 500 μl.

3.7. Filterkroes G 3 (poreusiteit 15—40 μm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuüm te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.

3.8. Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21, waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten.

3.9. Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.10. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem bestaande uit: 3.10.1. Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van ± 1 °C. 3.10.2. Een temperatuurgeregelde verdampingseenheid met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement. 3.10.3. Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid, 3.10.4. Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid.

3.11. Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20—30 m, inwendige diameter 0,25—0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52- of SE-54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 μm.

3.12. Gaschromatografische injectiespuit van 10 μl met een geharde naald.

4. REAGENTIA

4.1. Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol. Bewaar de oplossing in goed afgesloten flessen van donker glas.

4.2. Ethylether, p.a.

4.3. Natriumsulfaat, p.a., watervrij.

4.4. Glazen dunne-laagplaten gecoat met kiezelgel zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).

4.5. Kaliumhydroxideoplossing, 0,2 M in Methanol. Los 13 g kaliumhydroxide op in 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol aan tot 1 liter.

4.6. Benzeen, voor chromatografische doeleinden.

4.7. Aceton, voor chromatografische doeleinden.

4.8. Hexaan, voor chromatografische doeleinden.

4.9. Ethylether, voor chromatografische doeleinden.

4.10. Chloroform, p.a.

4.11. Dunnelaagchromatografische referentieoplossing: cholesterol of fytosterol, ►M6 2 % ◄ oplossing in chloroform.

4.12. 2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing.

4.13. Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.

4.14. Hexamethyldisilazaan.

4.15. Trimethylchloorsilaan.

4.16. Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de sterolen. Direct vóór gebruik te bereiden uit de zuivere sterolen of uit het mengsel van sterolen verkregen uit de oliën die deze sterolen bevatten.

4.17. α-cholestanol, 0,2 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).

4.18. Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.

4.19. Hulpgassen: — waterstof, gaschromatografisch zuiver, — lucht, gaschromatografisch zuiver.

5. WERKWIJZE

5.1. Bereiding van het onverzeepbare residu. 5.1.1. Breng in de kolf van 250 ml met behulp van de injectiespuit van 500 μl een hoeveelheid 0,2 % α-cholestanoloplossing in chloroform (4.17) die overeenkomt met ongeveer 10 % van de sterolfractie van het te onderzoeken monster. Bij voorbeeld: voeg voor 5 g monster 500 μl 0,2 % α-cholestanoloplossing toe indien het gaat om olijfolie en 1 500 μl indien het gaat om ►M6 ————— ◄ olie uit afvallen van olijven. Damp met behulp van een stikstofstroom droog en weeg vervolgens in dezelfde kolf nauwkeurig 5 g van het gedroogde gefiltreerde monster af. ►M6 Oliën ◄ die een aanmerkelijke hoeveelheid cholesterol bevatten, kunnen een piek vertonen met dezelfde retentietijd als cholestanol. Is dit het geval dan moet de sterolfractie tevens zonder interne standaard worden geanalyseerd ►M6 of moet in plaats van cholestanol betulinol worden gebruikt ◄ . 5.1.2. Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken op een waterbad onder voortdurend krachtig schudden tot de verzeping heeft plaatsgevonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 °C. 5.1.3. Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml scheitrechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml ethylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en laat uitzakken (zie opmerking 1). Tap de waterige onderlaag af en vang deze op in een tweede scheitrechter. Herhaal de extractie van de waterlaag twee keer op dezelfde manier en gebruik hierbij telkens 60—70 ml ethylether. Opmerking 1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylalcohol toe te voegen. 5.1.4. Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens 50 ml gedistilleerd water tot het waswater neutraal reageert. Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf, was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden ethylether. 5.1.5. Distilleer de ether tot op enkele ml af, droog door toepassing van een kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in een oven bij 100 °C gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in een exsiccator en weeg.

5.2. Scheiding van de sterolfractie. 5.2.1. Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedurende 10 seconden volledig in de 0,2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing, laat de platen gedurende 2 uur in een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende 1 uur in een stoof bij 100 °C. Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de op deze manier bereide platen moeten binnen 2 weken worden gebruikt). Opmerking 2: Bij gebruik van basische-kiezelgelplaten voor de scheiding van de sterolfractie is de behandeling van het onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig. Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren en andere) vastgehouden op de startlijn en is de sterolband duidelijk gescheiden van de band van de alifatische- en triterpeenalcoholen. 5.2.2. Breng in de ontwikkeltank een mengsel van benzeen/aceton, 95: 5 (v/v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Als alternatief kan een mengsel van hexaan/ethylether, 65: 35 (v/v), worden gebruikt. Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende ongeveer een half uur staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten. Opmerking 3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden ververst om volkomen reproduceerbare elutie-condities te verwezenlijken. 5.2.3. Bereid een ongeveer 5 % oplossing van het onverzeepbare residu (5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulp van de 100 μl injectiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens 2—3 μl aan van de sterol-referentieoplossing (4.11) zodat de sterolband na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd. 5.2.4. Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 °C en 20 °C. Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te zetten. 5.2.5. Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. De sterolband kan door bekijken onder ultraviolet licht worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte ligt als de vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen van de band aan de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood. 5.2.6. Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filterkroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de metalen spatel en filtreer onder vacuüm. Verzamel het filtraat in de afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes. Was het residu in de filterkroes drie maal met ethylether (telkens ongeveer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf. Damp het filtraat in tot een volume van 4—5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), damp droog door voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende ongeveer 10 minuten in een oven bij 105 °C, laat afkoelen in een exsiccator en weeg. Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal is de sterolfractie.

5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers. 5.3.1. Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige sterolfractie een hoeveelheid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethydisilazaan/trimethylchloorsilaan 9: 3: 1 (v/v/v) (zie opmerking 4), waarbij voor elke mg sterol 50 μl wordt toegevoegd. Vermijd hierbij bevochtiging (zie opmerking 5). Opmerking 4: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar, zoals bij voorbeeld bistrimethylsilyltrifluoaceetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden verdund met een gelijk volume watervrije pyridine. 5.3.2. Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te draaien) tot de sterolen volledig zijn opgelost. Laat ten minste 15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten. De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse. Opmerking 5: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De vorming van witte vlokken of de verschijning van een roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van vocht of van veroudering van het reagens. In deze gevallen moet opnieuw worden begonnen.

5.4. Gaschromatografische analyse. 5.4.1. Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom. 5.4.1.1. Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector. Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.). 5.4.1.2. Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij geconditioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een temperatuur van ten minste 20 °C boven de bij de analyse gebruikelijke temperatuur (zie opmerking 6). Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, ontsteking van de vlam, aansluiting van de elektronische recorder, regeling van de temperatuur van de kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen. Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende uitgevoerde conditionering van de kolom. Opmerking 6: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten minste 20 °C lager zijn dan de maximumtemperatuur die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven. 5.4.2. Keuze van de werkomstandigheden. 5.4.2.1. Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden dienen: — kolomtemperatuur: 260 °C ± 5 °C; — injectietemperatuur: 280 °C; — detectortemperatuur: 290 °C; — lineaire snelheid van het draaggas: helium 20—35 cm/s, waterstof 30—50 cm/s; — splitverhouding: van 1: 50 tot 1: 100; — gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking; — gevoeligheid van de recorder: 1—2 mV volle schaaluitslag; — papiersnelheid: 30—60 cm/uur; — injectiehoeveelheid: 0,5—1 μl TMSE-oplossing. Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen: — de retentietijd van β-sitosterol moet ongeveer 20 ± 5 minuten zijn; — de campesterolpiek moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie (gemiddeld gehalte 3 %) 15 ± 5 % volle schaaluitslag, voor sojaolie (gemiddelde gehalte 20 %) 80 ± 10 % volle schaaluitslag; — alle aanwezige sterolpieken moeten gescheiden zijn. Daarnaast moeten andere pieken voldoende gescheiden zijn, dat wil zeggen dat het signaal tussen pieken volledig naar de basislijn moet terugkeren. Onvolledige scheiding kan echter getolereerd worden mits de piek met een relatieve retentietijd van 1,02 met behulp van een loodlijn kan worden gekwantificeerd. 5.4.3. Bepaling. 5.4.3.1. Zuig in de 10 μl injectiespuit 1 μl hexaan, o,5 μl lucht en ten slotte 0,5—1,0 μl monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1—2 seconden, verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald. 5.4.3.2. Neem het chromatogram op tot alle aanwezige TMSE-sterolen volledig zijn geëlueerd. De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste kwalificaties (5.4.1.2). 5.4.4. Identificatie van de pieken. Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door een vergelijking met mengsels van TMSE-sterolen die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd. De sterolen worden geëlueerd in de volgorde: cholesterol, brassicasterol, 24-methyleencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ5-avanesterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol. In tabel I worden de relatieve retentietijden ten oprichte van sitosterol opgegeven voor SE 52- en SE 54-kolommen. In de figuren 1 en 2 worden typische chromatogrammen getoond voor enkele oliën. 5.4.5. Berekening. 5.4.5.1. Bereken met de integrator de oppervlakten van de α-cholestanol en de sterolpieken. Houd geen rekening met pieken van stoffen die niet op de lijst van tabel I voorkomen. De responsfactor van α-cholestanol wordt op 1 gesteld. 5.4.5.2. Bereken de concentratie van elk individueel sterol in mg/100 g vethoudend materiaal als volgt: waarin: Ax = piekoppervlak van sterol x, in integratoreenheden; As = piekoppervlak van α-cholestanol, in integratoreenheden; ms = hoeveelheid van het toegevoegde α-cholestanol, in milligram; m = hoeveelheid van het onderzochte monster, in gram.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1. Geef de gehaltes van de individuele sterolen op in mg/100 g vethoudend materiaal en hun som als „totaal sterolen”.

6.2. Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som van de piekoppervlakken van de sterolen: waarin: Ax = piekoppervlak van sterol x; A = som van de piekoppervlakken van alle sterolen.









AANHANGSEL

Bepaling van de lineaire snelheid van het draaggas

Injecteer 1—3 μl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek (tM).

De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij L de lengte is van de kolom in centimeters en tM de gemeten tijd in seconden.







Tabel I Relatieve retentietijden voor de sterolen Piek Identificatie Relatieve retentietijd SE 54-kolom SE 52-kolom 1 cholesterol Δ5-cholesteen-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestaan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassicasterol [24S]-24-methyl-Δ5,22-cholestadieen-3β-ol 0,73 0,71 4 24-methyleen-cholesterol 24-methyleen-Δ5,24-cholestadieen-3β-ol 0,82 0,80 5 campesterol [24R]-24-methyl-Δ5-cholesteen-3β-ol 0,83 0,81 6 campestanol [24R]-24-methyl-cholestaan-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24S]-24-ethyl-Δ5,22-cholestadieen-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ7-campesterol [24R]-24-methyl-Δ7-cholesteen-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-ethyl-Δ5,23-cholestadieen-3β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]-24-ethyl-Δ5,25-cholestadieen-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]-24-ethyl-Δ5-cholesteen-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-ethyl-cholestaan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ5-avenasterol [24Z]-24-ethylideen-5-cholesteen-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ5,24-stigmastadienol [24S,R]-24-ethyl-Δ5,24-cholestadieen-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ7-stigmastenol [24R,S]-24-ethyl-Δ7,24-cholesteen-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ7-avenasterol [24Z]-24-ethylideen-Δ7-cholesteen-3β-ol 1,16 1,16

De capillaire gaschromatografische bepaling van erythrodiol en uvaol, welke dezelfde sterolanalyse gebruikt, wordt momenteel door de NGD gepubliceerd.

Figuur 1

Gaschromatogram van de sterolfractie in een ongeraffineerde olijfolie

Figuur 2

Gaschromatogram van de sterolfractie in een geraffineerde olijfolie









BIJLAGE VI

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ERYTHRODIOL EN UVAOL

OPMERKING VOORAF

Erythrodiol (onder deze term verstaat men gewoonlijk het geheel van diolen, erythrodiol en uvaol samen) is een bestanddeel van het onverzeepbare residu, en is kenmerkend voor bepaalde vetstoffen. De concentratie ervan is beduidend hoger in olijfolie vervaardigd door extractie dan in de andere soorten olie waarin het voorkomt (koudgeperste olijfolie, druivepittenolie), en daarom kan door bepaling ervan de aanwezigheid van door extractie verkregen olijfolie worden aangetoond.

1. DOEL

De methode beschrijft de werkwijze voor de bepaling van erythrodiol in vetstoffen.

2. PRINCIPE VAN DE METHODE

De vetstof wordt verzeept met een ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met diëthylether en wordt gezuiverd door passage over een kolom met aluminiumoxide.

Het onverzeepbare residu wordt gefractioneerd met behulp van kiezelgel dunne-laagchromatografie en de band van de sterolfractie en die van de erythrodiolfractie worden afgezonderd. De van de dunne-laagplaat verzamelde sterolen en erythrodiol worden omgezet in trimethylsilylethers en het mengsel wordt via gaschromatografie kwantitatief bepaald. Het resultaat wordt uitgedrukt als percentage van erythrodiol in de totale hoeveelheid erythrodiol en sterolen.

3. APPARATUUR

3.1. Dezelfde apparatuur als die welke is beschreven in bijlage V (bepaling van de sterolfractie).

4. REAGENTIA

4.1. Dezelfde reagentia als die welke zijn beschreven in bijlage V (bepaling van de sterolfractie).

4.2. Referentieoplossing van erythrodiol 0,5 % in chloroform.

5. WERKWIJZE

5.1. Bereiding van het onverzeepbare residu

Men gaat te werk zoals beschreven in paragraaf 5.1.2 van bijlage V.

5.2. Scheiding van de erythrodiol- en de sterolfractie.

5.2.1. Zie paragraaf 5.2.1 van methode C-51.

5.2.2. Zie paragraaf 5.2.2 van vorengenoemde methode.

5.2.3. Bereid een 5 % oplossing van het onverzeepbare residu in chloroform. Breng van deze oplossing met behulp van de 0,1 ml injectiespuit 0,3 ml aan op ongeveer 1,5 cm van de benedenrand van de chromatografische plaat in een vloeiende lijn die zo dun en uniform mogelijk moet zijn. Breng aan één kant van de plaat tevens enkele microliter van de cholesterol- en erythrodioloplossingen aan als referentie.

5.2.4. Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient ongeveer 20 °C te bedragen. Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete luchtstroom.

5.2.5. Besproei de plaat uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. Door bekijken onder ultraviolet licht kunnen de sterolband en de erythrodiolband worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte liggen als de referentievlek. Markeer met een punt iets buiten de zijkanten van de fluorescentie.

5.2.6. Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in de gemarkeerde gebieden af. Breng het afgeschraapte materiaal in de afzuigkolf van 50 ml; voeg 15 ml hete chloroform toe, schud goed en filter op de filterkroes door de kiezelgel op het filter te leggen. Was het residu driemaal met hete chloroform (telkens ongeveer 10 ml), en vang het filtraat op in een glazen kolf van 100 ml. Damp het filtraat in tot een volume van 4—5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren getarreerde 10 ml konisch afgeronde centrifugebuis, damp droog door voorzichtige verwarming in een stikstofstroom, en weeg.

5.3. Bereiding van trimethylsilylethers

Ga te werk zoals is beschreven in punt 5.3 van bijlage V.

5.4. Gaschromatografische analyse

Ga te werk zoals beschreven in punt 5.4 van bijlage V. De werkwijze van de gaschromatografische analyse moet zodanig zijn dat niet alleen aan de eisen voor de bepaling van de sterolen wordt voldaan, maar dat ook een scheiding van TMSE van het erythrodiol en van het uvaol wordt verkregen.

Injecteer de monsteroplossing en laat het papier draaien totdat de aanwezige sterolen, erythrodiol en uvaol zijn geëlueerd; identificeer vervolgens de pieken (de retentietijden van erythrodiol en uvaol zijn circa 1,45, respectievelijk 1,55 maal groter dan die van B-sitosterol) en bereken de oppervlakten ervan zoals aangegeven voor de sterolen.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

waarin:

A1 = piekoppervlak van erythrodiol, in vierkante millimeter;

A2 = piekoppervlak van uvaol, in vierkante millimeter;

A = som van de piekoppervlakten van de aanwezige sterolen, in vierkante millimeter.

Het resultaat wordt uitgedrukt tot op éen cijfer achter de komma.

▼M21









BIJLAGE VII

BEPALING VAN HET PERCENTAGE GLYCEROL-2-MONOPALMITAAT

1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED

Hier wordt de analysemethode beschreven voor de bepaling van het percentage palmitinezuur op de 2-positie van triglyceriden via de bepaling van glycerol-2-monopalmitaat

Deze methode kan worden gebruikt voor plantaardige oliën die bij kamertemperatuur (20 °C) vloeibaar zijn.

2. PRINCIPE

Na een voorbehandeling wordt het oliemonster behandeld met pancreaslipase: door een partiële en specifieke hydrolyse op de 1- en 3-positie van het triglyceride ontstaan 2-monoglyceriden. Het percentage glycerol-2-monopalmitaat in de monoglyceridefractie wordt na silylering bepaald met behulp van capillaire gaschromatografie.

3. APPARATUUR EN STANDAARDMATERIAAL

3.1. Erlenmeyer, 25 ml.

3.2. Bekerglazen, 100, 250 en 300 ml.

3.3. Glazen chromatografiekolom met een inwendige diameter van 21-23 mm en een lengte van 400 mm, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan.

3.4. Maatcilinders, 10, 50, 100 en 200 ml.

3.5. Kolven, 100 en 250 ml

3.6. Rotatieverdamper.

3.7. Centrifugebuizen met een ronde bodem, 10 ml, met geslepen stop.

3.8. Centrifuge voor buizen van 10 en 100 ml.

3.9. Waterbad waarin de temperatuur op 40 °C + 0,5 °C kan worden gehouden.

3.10. Meetpipetten, 1 en 2 ml.

3.11. Injectiespuit, 1 ml.

3.12. Micro-injectiespuit, 100 μl.

3.13. Scheitrechter, 1 000 ml.

3.14. Gaschromatograaf voor een capillaire kolom met een „cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen en een oven waarin de ingestelde temperatuur op ± 1 °C nauwkeurig kan worden gehouden.

3.15. „Cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen.

3.16. Vlamionisatiedetector en elektrometer.

3.17. Recorder/integrator, geschikt voor de elektrometer, met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid.

3.18. Capillaire kolom, glas of kwartsglas, met een lengte van 8-12 m en een inwendige diameter van 0,25-0,32 mm en bekleed met een laagje 5 % methylpolysiloxaan of fenylmethylpolysiloxaan met een dikte van 0,10-0,30 μm, die bij 370 °C kan worden gebruikt.

3.19. Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, met een lengte van ten minste 7,5 cm, voor directe injectie op de kolom.

4. REAGENTIA

4.1. Silicagel met een korrelgrootte tussen 0,063 en 0,200 mm (70/280 mesh), als volgt voorbehandeld: droog de silicagel in een porseleinen kroes in een droogstoof gedurende 4 uur bij 160 °C en laat vervolgens in een exsiccator afkoelen. Voeg als volgt een volume water toe dat overeenkomt met 5 % van het gewicht van de silicagel: weeg in een erlenmeyer van 500 ml 152 g silicagel af en voeg 8 g gedestilleerd water toe; sluit de erlenmeyer af en schud voorzichtig om het water uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik rusten.

4.2. n-Hexaan (voor chromatografie).

4.3. Isopropanol.

4.4. Isopropanol, 1/1 (v/v) oplossing in water.

4.5. Pancreaslipase. De gebruikte lipase moet een activiteit tussen 2,0 en 10 lipase-eenheden per mg hebben (In de handel is pancreaslipase met een activiteit tussen 2 en 10 enzymeenheden per mg verkrijgbaar.)

4.6. Tris(hydroxymethyl)aminomethaan-bufferoplossing: 1 M oplossing in water, met geconcentreerd HCl (1/1 v/v) op pH 8 gebracht (controle met potentiometer).

4.7. Natriumcholaat, enzymkwaliteit, 0,1 %-oplossing in water (deze oplossing moet binnen 15 dagen na de bereiding worden gebruikt).

4.8. Calciumchloride, 22 %-oplossing in water.

4.9. Diethylether (voor chromatografie).

4.10. Elutievloeistof: mengsel van n-hexaan en diethylether (87/13 v/v).

4.11. Natriumhydroxide, 12 %-oplossing (g/g).

4.12. Fenolftaleïne, 1 %-oplossing in ethanol.

4.13. Draaggas: waterstof of helium (voor gaschromatografie).

4.14. Hulpgassen: waterstof (minimaal 99 %, watervrij en zonder organische stoffen) en lucht (voor gaschromatografie en met dezelfde zuiverheid).

4.15. Silaniseringsreagens: mengsel pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan (9/3/1 v/v/v) (In de handel zijn gebruiksklare oplossingen verkrijgbaar.) Er kunnen ook andere silyleringsreagentia worden gebruikt, bijvoorbeeld bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, verdund met een gelijk volume watervrije pyridine.

4.16. Referentiemonsters: zuivere monoglyceriden of mengsels van monoglyceriden met een bekende samenstelling die vergelijkbaar is met die van het monster.

5. PROCEDURE

5.1. Voorbehandeling van het monster

5.1.1. Olie met een gehalte aan vrij zuur van minder dan 3 % behoeft niet vóór de silicagel-kolomchromatografie te worden geneutraliseerd. Olie met een gehalte aan vrij zuur van meer dan 3 % moet overeenkomstig punt 5.1.1.1 worden geneutraliseerd. 5.1.1.1. Breng in een scheitrechter van 1 000 ml (3.13) 50 g olie en 200 ml n-hexaan. Voeg 100 ml isopropanol toe en een hoeveelheid 12 %-natriumhydroxideoplossing (4.11) die overeenkomt met het gehalte aan vrij zuur van de olie plus 5 %. Schud krachtig gedurende één minuut. Voeg 100 ml gedestilleerd water toe, schud opnieuw en laat bezinken. Laat na scheiding van de lagen de onderste laag met de zepen weglopen. Verwijder tevens mogelijke tussenlagen (slijmachtige en onopgeloste stoffen). Was de oplossing van de geneutraliseerde olie in hexaan met opeenvolgende porties van 50-60 ml van de oplossing van isopropanol in water (1/1 v/v) (4.4) tot de roze kleur van fenolftaleïne verdwijnt. Verwijder het merendeel van het hexaan door vacuümdestillatie (bijvoorbeeld met een rotatieverdamper) en breng de olie over in een kolf van 100 ml (3.5). Droog de olie onder vacuüm tot het oplosmiddel volledig is verwijderd. Na deze bewerking moet de zuurgraad van de olie lager dan 0,5 % zijn.

5.1.2. Breng 1,0 g olie, voorbehandeld zoals hierboven beschreven, in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) en los dit op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Laat de oplossing vóór de silicagel-kolomchromatografie gedurende ten minste 15 minuten rusten. Centrifugeer de oplossing, als deze troebel is, om optimale omstandigheden voor de chromatografie te waarborgen. (Er kunnen gebruiksklare SPE-silicagelpatronen van 500 mg worden gebruikt).

5.1.3. Voorbehandeling van de chromatografiekolom Giet ongeveer 30 ml elutievloeistof (4.10) in de kolom (3.3) en breng met een glasstaaf onder in de kolom een propje watten; duw het aan om de lucht te verwijderen. Bereid in een bekerglas een suspensie van 25 g silicagel (4.1) in ongeveer 80 ml elutievloeistof en giet dit met behulp van een trechter in de kolom. Controleer of alle silicagel in de kolom is gegoten; spoel met elutievloeistof (4.10), open de kraan en laat het vloeistofniveau zakken tot ongeveer 2 mm boven de bovenkant van de silicagel-laag.

5.1.4. Kolomchromatografie Weeg in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) precies 1,0 g monster af, voorbehandeld volgens punt 5.1. Los het monster op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Schenk de oplossing op de chromatografiekolom, voorbehandeld volgens punt 5.1.3. Zorg dat het oppervlak van de kolom niet verstoord wordt. Open de kraan en laat de monsteroplossing inzakken tot de bovenkant van de silicagel-laag. Elueer met 150 ml elutievloeistof. Stel de snelheid in op 2 ml/minuut (zodat de 150 ml in ongeveer 60-70 minuten door de kolom loopt). Vang het eluaat op in een vooraf getarreerde kolf van 250 ml. Verdamp het oplosmiddel onder vacuüm en verwijder de laatste sporen ervan onder een stikstofstroom. Weeg de kolf en bereken de opgevangen hoeveelheid extract. (Bij gebruik van gebruiksklare SPE-silicagelpatronen is de werkwijze: Breng 1 ml oplossing (5.1.2) in de vooraf voorbereide patronen met 3 ml n-hexaan. Elueer na het doorlopen van de oplossing met 4 ml n-hexaan/diethylether (9/1 v/v). Vang het eluaat op in een buis van 10 ml en damp droog onder een stikstofstroom. Laat pancreaslipase (5.2) op het residu inwerken. Het is van cruciaal belang dat de vetzuursamenstelling vóór en na de passage door de SPE-patroon wordt bepaald).

5.2. Hydrolyse met pancreaslipase

5.2.1. Weeg in de centrifugebuis overeenkomstig punt 5.1 0,1 g van de voorbehandelde olie af. Voeg 2 ml bufferoplossing (4.6), 0,5 ml natriumcholaatoplossing (4.7) en 0,2 ml calciumchlorideoplossing toe en schud na elke toevoeging goed. Sluit de buis met de geslepen stop en zet hem in het waterbad bij 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Voeg 20 mg lipase toe, schud voorzichtig (zorg dat de stop niet nat wordt) en zet de buis gedurende precies 2 minuten in het waterbad, haal de buis eruit, schud krachtig gedurende precies één minuut en laat de buis afkoelen.

5.2.3. Voeg 1 ml diethylether toe, zet de stop op de buis en schud krachtig, centrifugeer en breng de etheroplossing met een micro-injectiespuit over in een schone droge buis.

5.3. Bereiding van de gesilaniseerde verbindingen en voorbereiding van de gaschromatografie

5.3.1. Breng met een micro-injectiespuit 100 μl oplossing (5.2.3) in een rondbodemkolf van 10 ml.

5.3.2. Verwijder het oplosmiddel onder een zachte stikstofstroom, voeg 200 μl silaniseringsreagens (4.15) toe, zet de stop op de kolf en laat gedurende 20 minuten staan.

5.3.3. Voeg na 20 minuten 1-5 ml (afhankelijk van de chromatografie-omstandigheden) n-hexaan toe: de resulterende oplossing is gereed voor gaschromatografie.

5.4. Gaschromatografie

De werkomstandigheden zijn als volgt:

— temperatuur van de injector („on column” injector) onder het kookpunt van het oplosmiddel (68 °C);

— temperatuur van de detector: 350 °C;

— temperatuur van de kolom: de oventemperatuur wordt als volgt geprogrammeerd: eerst gedurende 1 minuut op 60 °C, daarna met 15 °C per minuut oplopend tot 180 °C, vervolgens met 5 °C per minuut oplopend tot 340 °C en ten slotte gedurende 13 minuten op 340 °C;

— Draaggas: waterstof of helium met een lineaire snelheid die voldoende is om de in figuur 1 aangegeven resolutie te verkrijgen. De retentietijd van triglyceride C54 moet 40 + 5 minuten zijn (zie figuur 2). (Bovenstaande werkomstandigheden worden ter indicatie aangegeven. Ze moeten in elke situatie worden geoptimaliseerd om de gewenste resolutie te verkrijgen. De piekhoogte van glycerol-2-monopalmitaat moet minimaal 10 % van de volle schaaluitslag van de recorder zijn.)

— Geïnjecteerde hoeveelheid: 0,5-1 μl van de oplossing (5 ml) in n-hexaan (5.3.3).

5.4.1. Identificatie van de pieken

De verschillende monoglyceriden worden geïdentificeerd aan de hand van de verkregen retentietijd en door vergelijking met de pieken voor standaardmengsels monoglyceriden die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.

5.4.2. Kwantitatieve bepaling

Met een elektronische integrator wordt het oppervlak van elke piek berekend.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Het percentage glycerol-2-monopalmitaat wordt aan de hand van de verhouding tussen het piekoppervlak voor deze stof en het piekoppervlak voor alle monoglyceriden samen (zie figuur 2) berekend met de formule:

Hierbij is:

Ax = het piekoppervlak voor glycerol-2-monopalmitaat en

ΣA = de som van de piekoppervlakken van alle monoglyceriden samen.

Het resultaat moet met één cijfer achter de komma worden vermeld.

7. ANALYSEVERSLAG

Het analyseverslag moet bevatten:

— een verwijzing naar deze methode;

— alle informatie die nodig is om het monster volledig te kunnen identificeren;

— het resultaat van de analyse;

— elke afwijking van deze methode, ongeacht of dit op grond van een besluit van de betrokken partijen of om een andere reden is gebeurd;

— de identificatiegegevens van het laboratorium, de datum van de analyse en de handtekeningen van de voor de analyse verantwoordelijke personen.

Figuur 1

Chromatogram van de producten van de silaniseringsreactie, verkregen door de inwerking van lipase op een geraffineerde olijfolie waaraan 20 % veresterde olie is toegevoegd (100 %).

NdT: Acides gras libres = Vrije vetzuren; Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = Geraffineerde olijfolie + 20 % veresterde olie; 1-2 monopalmitoléine = 1-2-monopalmitoleïne; 1-2 monopalmitine = 1-2 monopalmitine; 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono C18 onverz.; Squalene = Squaleen

Figuur 2

Chromatogram van:

A) onveresterde olijfolie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. Verklaring: 1 = Vrije vetzuren 2 = Monoglyceriden 3 = Diglyceriden 4 = Triglyceriden * = 2-monopalmitine ** = Triglyceride C54

Chromatogram van:

B) veresterde olie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. Verklaring: 1 = Vrije vetzuren 2 = Monoglyceriden 3 = Diglyceriden 4 = Triglyceriden * = 2-monopalmitine ** = Triglyceride C54

8. OPMERKINGEN

Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel verkrijgbaar. Het kan ook als volgt in het laboratorium worden bereid:

Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 °C. Verwijder het omringende vet en bindweefsel en maal het restant in een messenmolen fijn tot een vloeibare pasta is overgebleven. Roer deze pasta gedurende 4-6 uur met 2,5 l watervrije aceton en centrifugeer daarna. Extraheer het residu nog driemaal met hetzelfde volume watervrije aceton en vervolgens tweemaal met een 1/1 (v/v) mengsel van aceton en diethylether en tweemaal met diethylether.

Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuüm; hierdoor wordt een stabiel poeder verkregen dat lange tijd vochtvrij in een koelkast kan worden bewaard.

Bereid als volgt een olijfolie-emulsie:

Schud in een mengapparaat gedurende 10 minuten een mengsel van 165 ml van een oplossing van arabische gom (100 g/l), 15 g ijsgruis en 20 ml vooraf geneutraliseerde olijfolie.

Breng in een bekerglas van 50 ml achtereenvolgens 10 ml van deze emulsie, 0,3 ml natriumcholaatoplossing (0,2 g/ml) en 20 ml gedestilleerd water.

Zet het bekerglas in een waterbad dat op 37 °C is ingesteld; hang de elektroden van de pH-meter in de vloeistof en voeg een roermagneetje toe.

Voeg met een buret druppelsgewijs een 0,1 N natriumhydroxideoplossing toe tot een pH van 8,3 is bereikt.

Voeg een hoeveelheid suspensie van lipasepoeder in water toe (0,1 g lipase/ml). Start de stopwatch zodra de pH-meter een pH van 8,3 aangeeft en voeg druppelsgewijs de natriumhydroxideoplossing met een zodanige snelheid toe dat de pH 8,3 blijft. Noteer elke minuut het verbruikte volume.

Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij op de x-as de tijd wordt aangegeven en op de y-as het volume (ml) 0,1 N alkalioplossing dat is verbruikt om de pH constant te houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn.

De lipaseactiviteit, uitgedrukt in lipase-eenheden per mg, wordt met de volgende formule berekend:

Hierbij is:

A = de activiteit in lipase-eenheden/mg;

V = het volume (ml) 0,1 N natriumhydroxideoplossing per minuut (berekend uit de grafiek);

N = de normaliteit van de natriumhydroxideoplossing;

m = de massa van het onderzochte lipase (in mg).

Eén lipase-eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 micro-equivalent zuur vrijmaakt.

▼M20 —————

▼B









BIJLAGE IX

SPECTROFOTOMETRISCH ONDERZOEK IN HET ULTRAVIOLETTE GEBIED

Opmerking vooraf

Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied kan informatie verschaffen over de kwaliteit van een vet, de toestand van bewaring en veranderingen veroorzaakt door technologische processen.

De absorptie bij de in deze methode aangegeven golflengten wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van dubbele en drievoudig onverzadigde systemen. Deze absorpties worden uitgedrukt als de specifieke extincties E1cm 1 % (de extinctie van een 1 % oplossing van het vet in het aangegeven oplosmiddel, bij een optische weglengte van 1 cm), en worden volgens afspraak als K, ook extinctiecoëfficiënt genoemd, opgegeven.

1. DOEL

Deze methode beschrijft de werkwijze voor de uitvoering van een spectrofotometrisch onderzoek van vetten in het ultraviolette gebied.

2. PRINCIPE VAN DE METHODE

Het te onderzoeken vet wordt opgelost in het vereiste oplosmiddel, vervolgens wordt de extinctie bepaald bij de opgegeven golflengten ten opzichte van het zuivere oplosmiddel. De specifieke extincties worden uit de aflezingen van de spectrofotometer berekend.

3. APPARATUUR

3.1. Een spectrofotometer, geschikt voor metingen in het ultraviolette gebied tussen 220 en 360 nm, instelbaar tot op de nm nauwkeurig.

3.2. Kwartscuvetten, met deksel, met een optische weglengte van 1 cm. Gevuld met water of een ander geschikt oplosmiddel mogen de cuvetten onderling geen verschillen vertonen groter dan 0,01 extinctie-eenheden.

3.3. Maatkolven van 25 ml.

▼M6

3.4. Chromatografiekolom waarvan het bovenste gedeelte 270 mm lang is en een doorsnede heeft van 35 mm en het onderste gedeelte 270 mm lang met een doorsnede van 10 mm.

▼B

4. REAGENTIA

4.1. Iso-octaan (2,2,4-trimethylpentaan), voor spectrofotometrische doeleinden: bij 220 nm moet dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie hebben van ten minste 60 % en bij 250 nm van ten minste 95 %, of — cyclohexaan, voor spectrofotometrische doeleinden: bij 220 nm moet dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie hebben van ten minste 40 % en bij 250 nm van ten minste 95 %. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Aluminiumhydroxide, voor kolomchromatografische doeleinden, voorbehandeld en gecontroleerd zoals omschreven in aanhangsel I.

4.3. Hexaan voor chromatografische doeleinden.

5. WERKWIJZE

5.1. Het te onderzoeken monster dient volledig homogeen te zijn en vrij van onzuiverheden. Oliën die bij kamertemperatuur vloeibaar zijn, worden over papier gefiltreerd bij een temperatuur van ongeveer 30 °C, vetten worden gehomogeniseerd en gefiltreerd bij een temperatuur die niet meer dan 10 °C boven het smeltpunt ligt.

5.2. Weeg nauwkeurig ongeveer 0,25 g van het voorbehandelde monster af in een maatkolf van 25 ml, vul aan tot de streep met het aangegeven oplosmiddel en homogeniseer. De verkregen oplossing moet volmaakt helder zijn. Indien opalescentie of troebeling optreedt dient direct over papier te worden gefiltreerd.

5.3. Vul een cuvet met deze oplossing en meet de extincties ten opzichte van het oplosmiddel bij geschikte golflengten tussen 232 en 276 nm. De gemeten extinctiewaarden moeten tussen 0,1 en 0,8 liggen. Zo niet, dan moeten de metingen worden herhaald bij een aangepaste inweeg van het monster.

5.4. Indien een meting van de specifieke extinctie is vereist na het doorlopen van de aluminiumoxidekolom, ga dan als volgt te werk. Breng in de chromatografiekolom 30 g aluminiumoxide in een hexaansuspensie. Verwijder, nadat de suspensie is uitgezakt, zoveel van de overmaat hexaan dat boven het aluminiumoxide nog ongeveer 1 cm hexaan staat. Los 10 g volgens punt 5.1 gehomogeniseerd en gefiltreerd vet op in 100 ml hexaan en giet de oplossing op de kolom. Verzamel het eluaat en verwijder het oplosmiddel onder vacuüm bij een temperatuur onder 25 °C. Met het aldus verkregen vet dient de bepaling onmiddellijk te worden voortgezet, zoals omschreven in punt 5.2.

6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1. Geef de specifieke extincties op, die bij de verschillende golflengten als volgt worden berekend: waarin: Kλ = specifieke extinctie bij golflengte λ, Eλ = extinctie, gemeten bij golflengte λ; c = gehalte van de oplossing, in g/100 ml; s = optische weglengte, in centimeter. De resultaten dienen te worden opgegeven met twee cijfers achter de komma.

6.2. Het spectrofotometrisch onderzoek van olijfolie volgens de officiële bij de EEG-Verordening voorgeschreven methode vereist de bepaling van de specifieke extinctie in een iso-octaan oplossing bij golflengten van 232 en 270 nm en de bepaling van de grootheid ΔK volgens de formule: waarin: Km = de specifieke extinctie bij golflengte m, de golflengte van het absorptiemaximum bij ongeveer 270 nm.









AANHANGSEL I

Bereiding van de aluminiumoxidekolom en het testen van de activiteit

A.1.1. Bereiding van de aluminiumoxidekolom

Breng in een hermetisch afsluitbare kolf een hoeveelheid aluminiumoxide, welke gedurende 3 uur in een oven bij een temperatuur van 380—400 °C is gedroogd, voeg per 100 g aluminiumoxide 5 ml gedistilleerd water toe, sluit de kolf onmiddellijk, schud regelmatig en laat vervolgens gedurende ten minste 12 uur staan alvorens dit te gebruiken.

A.1.2. Controle op de activiteit van het aluminiumoxide

Vul een chromatografiekolom met 30 g aluminiumoxide. Ga hierbij te werk zoals omschreven in punt 5.4 en leid een mengsel door bestaande uit:

— 95 % koudgeperste olijfolie van eerste persing met een specifieke extinctie van minder dan 0,18 bij 268 nm,

— 5 % bij de raffinage met aarde behandelde aardnotenolie met een specifieke extinctie van ten minste 4,0 bij 268 nm.

Indien de door de kolom gelopen vloeistof een specifieke extinctie van ten minste 0,11 bij 268 nm heeft dan kan het aluminiumhydroxide worden gebruikt, zo niet dan moet het percentage water worden opgevoerd.









AANHANGSEL II

IJking van de spectrofotometer

A.2. Het apparaat moet regelmatig (ten minste iedere 6 maanden) worden gecontroleerd op een correcte golflengteaanwijzing en op de nauwkeurigheid van de respons. A.2.1. De golflengte kan worden gecontroleerd met een kwiklamp of met geschikte filters. A.2.2. Ga, om de respons van de fotocel en de fotomultiplier te controleren, als volgt te werk: weeg 0,2000 g kaliumchromaat, voor spectrofotometrische doeleinden, af in een 1 000 ml maatkolf en los op in 0,05 M kaliumhydroxideoplossing en vul hiermee aan tot de streep. Pipetteer 25 ml van deze oplossing in een 500 ml maatkolf en vul aan tot de streep met dezelfe kaliumhydroxideoplossing. Bepaal de extinctie van deze oplossing bij 275 nm, waarbij wordt gemeten tegen de kaliumhydroxideoplossing. De met een 1 cm cuvet gemeten extinctie moet 0,200 ± 0,005 bedragen.









BIJLAGE X.A

GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN

1. DOEL

Deze norm beschrijft de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatografische bepaling met gepakte of capillaire kolom van een mengsel van methylesters van vetzuren, verkregen volgens bijlage X.B.

Deze norm kan niet worden toegepast op gepolymeriseerde vetzuren.

2. REAGENTIA

2.1. Draaggas

Inert gas (stikstof, helium, argon, waterstof, enz.), zeer goed gedroogd en met een zuurstofgehalte kleiner dan 10 mg/kg.

Opmerking 1:

Waterstof, dat uitsluitend als draaggas wordt gebruikt bij capillaire kolommen, kan de snelheid van de analyse verdubbelen, maar is gevaarlijk. Veiligheidsvoorzieningen zijn verkrijgbaar.

2.2. Hulpgassen

2.2.1. Waterstof (zuiverheid ten minste 99,9 %), vrij van organisch materiaal.

2.2.2. Lucht of zuurstof, vrij van organisch materiaal.

2.3. Standaardmengsel

Een mengsel van methylesters van zuivere vetzuren of de methylesters van een vetstof met bekende samenstelling, bij voorkeur met dezelfde vetzuursamenstelling als het te analyseren monster.

Zorg ervoor oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren te voorkomen.

3. APPARATUUR

De richtlijnen hebben betrekking op apparatuur die gewoonlijk wordt gebruikt bij gas/vloeistofchromatografie met een gepakte en/of capillaire kolom en een vlamionisatiedetector. Elk apparaat waarmee de efficiëntie en het scheidend vermogen zoals bepaald volgens en aangegeven in punt 4.1.2 kunnen worden bereikt, is geschikt.

3.1. Gaschromatograaf

De gaschromatograaf dient te bestaan uit de volgende onderdelen:

3.1.1. Injectiestuk

a) voor een gepakte kolom moet een injectiestuk worden gebruikt dat een zo klein mogelijke dode ruimte heeft (het injectiestuk moet kunnen worden verwarmd tot een temperatuur die 20 tot 50 °C hoger is dan die van de kolom);

b) voor capillaire koloms dient een speciaal ontworpen injectiestuk te worden gebruikt. Dit injectiestuk mag van het splittype zijn of van het kolominjectortype.

Opmerking 2:

Indien geen vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen aanwezig zijn, mag een beweegbare naaldinjector worden gebruikt.

3.1.2. Oven

De oven moet de kolom tot ten minste 260 °C kunnen verwarmen en de gekozen temperatuur op 1 °C nauwkeurig kunnen aanhouden voor een gepakte kolom en op 0,1 °C voor een capillaire kolom. De laatstgenoemde voorwaarde is van bijzonder belang wanneer een fused-silica capillaire kolom wordt gebruikt.

Het verdient aanbeveling steeds temperatuur-geprogrammeerde gaschromatografie toe te passen, in het bijzonder voor vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen.

3.1.3. Gepakte kolom

3.1.3.1. Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren verbindingen (dat wil zeggen glas of roestvrij staal), van de volgende afmetingen: a) lengte: 1 tot 3 m. Er dient een relatief korte kolom te worden gebruikt als vetzuren met lange ketens (meer dan 20 C-atomen) aanwezig zijn. Voor de bepaling van C 4- en C 6-vetzuren wordt een kolom van twee meter aanbevolen; b) inwendige diameter: 2—4 mm. Opmerking 3: In een roestvrij stalen kolom kunnen meervoudig onverzadigde componenten met meer dan drie dubbele bindingen zich ontleden. Opmerking 4: Er mag een systeem met dubbele gepakte kolommen worden gebruikt.

3.1.3.2. Pakking a) Drager: zuurgewassen, gesilaniseerde diatomeeënaarde of elke andere geschikte inerte drager met een korrelgrootte tussen 125 en 200 μm (onderlinge verschillen niet groter dan 25 μm), afhankelijk van de inwendige diameter en de lengte van de kolom. b) Stationaire fase: type polyester van polaire vloeistof (bij voorbeeld van diëthyleenglycolpolysuccinaat, butaandiolpolysuccinaat, ethyleenglycolpolyadipaat, enz.), cyaansiliconen of elke andere vloeistof die de vereiste chromatografische scheiding mogelijk maakt (zie punt 4). De stationaire fase moet ongeveer 5—20 % (m/m) van de pakking uitmaken. Voor bepaalde scheidingen kunnen apolaire stationaire fasen worden gebruikt.

3.1.3.3. Conditionering van de kolom Maak, indien mogelijk, de kolom los van de detector en verwarm de oven geleidelijk tot 185 °C; laat bij deze temperatuur gedurende ten minste 16 uur een stroom inert gas door de nieuwe kolom gaan met een snelheid van 20—60 ml/min. en bij 195 °C nog eens gedurende 2 uur.

3.1.4. Capillaire kolom

3.1.4.1. Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren verbindingen (gewoonlijk glas of fused silica). Inwendige diameter 0,2—0,8 mm. De binnenzijde dient een adequate behandeling te ondergaan (bij voorbeeld voorbehandeling van de oppervlakte, inactivering) voordat ze met de stationaire fase wordt gecoat. In de meeste gevallen is een kolom van 25 m voldoende.

3.1.4.2. Stationaire fase: gewoonlijk van het type polyglycol (poly(ethyleenglycol) 20 000), polyester (butaandiolpolysuccinaat) of polair polysiloxaan (cyaansiliconen). Er mogen kruiselings verbonden kolommen worden gebruikt. Opmerking 5: Polaire polysiloxanen kunnen moeilijkheden geven bij het identificeren en de scheiding van linoleenzuur en vetzuren van C20. De coating moet dun zijn, dat wil zeggen 0,1—0,2 μm.

3.1.4.3. Montage en conditionering van de kolom Neem de gebruikelijke voorzorgen voor het monteren van capillaire kolommen, dat wil zeggen bevestiging van de kolom in de oven, keuze en montage van verbindingsstukken (lekken), plaatsing van de uiteinden van de kolom in de injector en de detector (beperking van dode ruimten). Leid een stroom van draaggas onder druk door de kolom (bij voorbeeld 0,3 bar (30 kPa) voor een kolom van 25 m lengte en een inwendige diameter van 0,3 mm). Conditioneer de kolom door de temperatuur in de oven geprogrammeerd met 3 °C/min. te verhogen van de omgevingstemperatuur tot 10 °C onder de ontledingstemperatuur van de stationaire fase. Houd de oven gedurende 1 uur op deze temperatuur, tot stabilisatie van de basislijn. Verlaag de temperatuur tot 180 °C en werk onder isotherme omstandigheden. Opmerking 6: In de handel zijn geschikte, reeds geconditioneerde kolommen verkrijgbaar.

3.1.5. Detector

De detector moet bij voorkeur verwarmd kunnen worden tot een temperatuur die hoger is dan de kolomtemperatuur.

3.2. Injectiespuit

Injectiespuit van maximaal 10 μl, met schaalverdeling in 0,1 μl.

3.3 Registratieapparatuur

Als de curve van de registratieapparatuur dient te worden gebruikt voor de berekening van de samenstelling van het geanalyseerde mengsel, is een elektronisch registratieapparaat met grote nauwkeurigheid vereist. Dit apparaat moet compatibel zijn met de overige apparatuur en dient de volgende kenmerken te hebben:

a) responstijd kleiner dan 1,5 sec., liefst kleiner dan 1 sec. (de responstijd is de tijd die nodig is om de pen van het registratieapparaat van 0 tot 90 % te laten gaan bij een plotseling signaal van 100 %);

b) papierbreedte: minimaal 20 cm;

c) papiersnelheid: regelbaar van 0,4—2,5 cm/min.

3.4. Rekenapparatuur (optioneel)

Elektronische rekenapparatuur (bij voorbeeld een integrator) biedt de mogelijkheid snelle en nauwkeurige berekeningen uit te voeren. De integratie moet lineair zijn, een voldoende gevoeligheid hebben en de correctie van het eventuele verloop van de basislijn moet toereikend zijn.

4. WERKWIJZE

De in de punten 4.1 tot en met 4.3 beschreven handelingen b