1998L0057 — NL — 30.07.2006 — 001.001

Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschĳnt buiten de verantwoordelĳkheid van de instellingen

Gewĳzigd bĳ:









▼B

RICHTLIJN 98/57/EG VAN DE RAAD

van 20 juli 1998

betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.







DE RAAD VAN DE EUROPESE UNIE, Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap, inzonderheid op artikel 43, Gezien het voorstel van de Commissie ( 1 ), Gezien het advies van het Europees Parlement ( 2 ), Gezien het advies van het Economisch en Sociaal Comité ( 3 ), Overwegende dat het schadelijk organisme Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. voorheen bekend stond onder de naam Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; dat Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. waarschijnlijk de algemeen aanvaarde naam voor het organisme zal worden; dat in de onderhavige richtlijn rekening dient te worden gehouden met deze wetenschappelijke ontwikkeling; Overwegende dat in de landbouwproductie van de Gemeenschap de aardappel- en de tomatenteelt een belangrijke plaats innemen; dat schadelijke organismen een constante bedreiging vormen voor de opbrengsten in de aardappel- en tomatenteelt; Overwegende dat, door de aardappel- en de tomatenteelt tegen deze schadelijke organismen te beschermen, niet alleen de productiecapaciteit in stand wordt gehouden, maar bovendien de landbouwproductiviteit kan worden verbeterd; Overwegende dat beschermende maatregelen om het binnenbrengen van schadelijke organismen op het grondgebied van een lidstaat te voorkomen, slechts een beperkt effect zouden sorteren indien geen maatregelen worden genomen om die organismen overal in de Gemeenschap gelijktijdig en systematisch te bestrijden en om verspreiding ervan te voorkomen; Overwegende dat één van de schadelijke organismen voor aardappelen en tomaten Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. is, het pathogene agens van bruinrot bij aardappelen en van verwelkingsziekte bij aardappelen en tomaten; dat gevallen van de door dit pathogene agens veroorzaakte ziekte in enkele delen van de Gemeenschap zijn gesignaleerd en er nog steeds enkele besmettingshaarden van beperkte omvang zijn; Overwegende dat een en ander voor de aardappel- en de tomatenteelt overal in de Gemeenschap een aanzienlijk gevaar oplevert, tenzij voor deze gewassen adequate maatregelen worden genomen om het organisme te lokaliseren en de verspreiding ervan vast te stellen, teneinde het optreden en de verspreiding ervan te voorkomen, en waar het organisme wordt aangetroffen ervoor te zorgen dat het zich niet verder kan verspreiden en dat de nodige bestrijdingsmaatregelen worden genomen met het oog op uitroeiing; Overwegende dat daartoe binnen de Gemeenschap een aantal maatregelen dient te worden genomen; dat de lidstaten zo nodig aanvullende of strengere maatregelen moeten kunnen vaststellen, met dien verstande dat het verkeer van aardappelen of tomaten binnen de Gemeenschap daarvan geen andere hinder mag ondervinden dan is toegestaan op grond van Richtlijn 77/93/EEG van de Raad van 21 december 1976 betreffende beschermende maatregelen tegen het binnenbrengen en de verspreiding in de Gemeenschap van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen ( 4 ); dat van dergelijke maatregelen aan de andere lidstaten en aan de Commissie kennis dient te worden gegeven; Overwegende dat er daarbij rekening mee dient te worden gehouden dat systematische officiële onderzoeken moeten worden verricht om het pathogene agens te kunnen lokaliseren; dat dergelijke onderzoeken controleprocedures moeten omvatten en, zo nodig, aangezien de ziekte in bepaalde milieuomstandigheden latent aanwezig kan zijn en onopgemerkt kan blijven bij de aardappelen als gewas en bij de bewaring, ook bemonsterings- en testprocedures; dat de verspreiding van het pathogene agens bij het gewas zelf niet de belangrijkste factor is, maar het pathogene agens zich via het oppervlaktewater en via sommige verwante in het wild voorkomende nachtschadeachtigen kan verspreiden en irrigatie van aardappelen en tomaten met besmet water daarom een besmettingsrisico lijkt op te leveren; dat het pathogene agens bovendien kan overwinteren in opslag van aardappelen en tomaten, die daardoor een infectiehaard kan vormen waardoor de ziekte zich in het daaropvolgende seizoen opnieuw voordoet; dat het pathogene agens zich eveneens verspreidt door contact met besmette aardappelen, of met poot/plant-, oogst- of behandelingsmachines of containers voor vervoer en opslag die met besmette aardappelen in contact zijn geweest; Overwegende dat verspreiding van het pathogene agens kan worden tegengegaan of voorkomen door dergelijke voorwerpen te desinfecteren; dat besmetting van pootaardappelen een groot risico van verspreiding van het pathogene agens oplevert; dat latente infectie van pootaardappelen een groot risico van verspreiding van het pathogene agens oplevert dat kan worden voorkomen door pootaardappelen te gebruiken die zijn geteeld in het kader van een officieel erkend programma waarbij de pootaardappelen zijn onderzocht en vrij zijn bevonden van besmetting; Overwegende dat de huidige kennis van de biologische eigenschappen en de epidemiologie van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. onder Europese condities nog onvolledig is en dat de voorgestelde maatregelen naar verwachting binnen een aantal seizoenen opnieuw zullen moeten worden bekeken; dat ook de testprocedures zullen moeten worden aangepast in het licht van verder onderzoek naar in het bijzonder de gevoeligheid en specificiteit van de testmethoden dat zal worden verricht om de beste testmethoden die beschikbaar zijn te kunnen kiezen en standaardiseren; Overwegende dat het wenselijk is dat de lidstaten bij het verder uitwerken van dergelijke algemene maatregelen en van de door de lidstaten te treffen strengere of aanvullende maatregelen ter voorkoming van het binnenbrengen van het pathogene agens op hun grondgebied, nauw met de Commissie samenwerken binnen het Permanent Plantenziektekundig Comité, hierna „het comité” genoemd, HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:







Artikel 1

Deze richtlijn heeft betrekking op de maatregelen die in de lidstaten moeten worden genomen tegen Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., vroeger bekend als Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (hierna „het organisme” genoemd) ten aanzien van de in bijlage I, deel I, vermelde gastheerplanten van het organisme (hierna „het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal” genoemd), teneinde:

a) het organisme te lokaliseren en de verspreiding ervan vast te stellen,

b) het optreden en de verspreiding ervan te voorkomen, en,

c) waar het organisme wordt aangetroffen, verspreiding ervan te voorkomen en het te bestrijden met het oog op uitroeiing.

Artikel 2

1. De lidstaten verrichten ieder jaar systematisch officiële onderzoeken naar het organisme op het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal dat van hun grondgebied afkomstig is. Met het oog op de identificatie van mogelijke andere besmettingsbronnen die een bedreiging vormen voor de teelt van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal, voeren de lidstaten in de productiegebieden van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal een risico-evaluatie uit en, als daaruit een risico van verspreiding van het organisme naar voren komt, voeren zij gerichte officiële onderzoeken uit naar het organisme op andere planten dan het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal, inclusief in het wild voorkomende nachtschadeachtigen die als gastheerplant kunnen optreden, alsmede zowel in oppervlaktewater dat wordt gebruikt voor irrigatie of bespuiting van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal, als in vloeibaar afval dat wordt geloosd uit bedrijven waar het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal industrieel wordt verwerkt en verpakt en dat wordt gebruikt voor irrigatie of beregening van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal. De omvang van deze gerichte onderzoeken wordt bepaald afhankelijk van de geconstateerde risico's. De lidstaten kunnen eveneens officiële onderzoeken naar het organisme op ander materiaal verrichten, zoals groeimedium, grond, en vast afval van bedrijven voor industriële verwerking en verpakking.

2. De in lid 1 bedoelde officiële onderzoeken worden als volgt uitgevoerd:

a) voor het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal: overeenkomstig de in bijlage I, deel II, punt 1, aangegeven methode, en

b) voor andere gastheerplanten dan het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal, alsmede water, inclusief vloeibaar afval: overeenkomstig daartoe geëigende methoden, waarbij, indien van toepassing, monsters worden genomen voor officieel of onder officieel toezicht verricht laboratoriumonderzoek;

c) zo nodig, voor ander materiaal: overeenkomstig de daartoe geëigende methoden.

Met het oog op deze onderzoeken wordt door de verantwoordelijke officiële instanties als bedoeld in Richtlijn 77/93/EEG, volgens deugdelijke wetenschappelijke en statistische beginselen en op grond van de biologische eigenschappen van het organisme, nader bepaald welke inspectieprocedures moeten worden gevolgd, alsmede waar en op welk tijdstip en hoeveel monsters moeten worden genomen en hoe de samenstelling van de steekproef dient te zijn, waarbij rekening wordt gehouden met de voor de betrokken lidstaat specifieke methoden voor de teelt van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal en, zo nodig, andere gastheerplanten van het organisme.

3. Nadere gegevens over en de uitkomsten van de in lid 1 bedoelde onderzoeken worden elk jaar aan de andere lidstaten en aan de Commissie ter kennis gebracht overeenkomstig het bepaalde in bijlage I, deel II, punt 2. Deze kennisgevingen worden gedaan vóór 1 juni, behalve over aardappelen die worden gebruikt als op eigen bedrijf gewonnen zaad waarvoor ze vóór 1 september moeten worden gedaan. De nadere gegevens over en de uitkomsten betreffende de gewassen moeten worden afgezet tegen de productie in het voorgaande jaar. De verstrekte gegevens kunnen aan het comité worden voorgelegd.

4. Volgens de procedure van artikel 16 bis van Richtlijn 77/93/EEG worden bepalingen vastgesteld ten aanzien van:

— de geëigende methoden voor de onderzoeken en de laboratoriumtests als bedoeld in lid 2, eerste alinea, onder b).

5. Volgens de procedure van artikel 16 bis van Richtlijn 77/93/EEG kunnen de volgende bepalingen worden vastgesteld:

— de geëigende methoden voor de onderzoeken als bedoeld in lid 2, eerste alinea, onder c);

— nadere bepalingen inzake de onderzoeken als bedoeld in lid 2, tweede alinea, om te garanderen dat de lidstaten gelijkwaardige garantieniveaus bieden.

Artikel 3

De lidstaten zien erop toe dat gevallen van vermoede of bevestigde aanwezigheid van het organisme op hun grondgebied aan hun eigen verantwoordelijke officiële instanties worden gemeld.

Artikel 4

1. Telkens wanneer wordt vermoed dat het organisme voorkomt, dienen de verantwoordelijke officiële instanties van de betrokken lidstaat (lidstaten) toe te zien op de volledige afwikkeling van het officiële of onder officieel toezicht verrichte laboratoriumonderzoek, waarbij voor het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal gebruik wordt gemaakt van de geëigende methode van bijlage II overeenkomstig de in bijlage III, punt 1, gestipuleerde voorwaarden of, in andere gevallen, een andere officieel erkende methode, teneinde de vermoede aanwezigheid van het organisme te bevestigen dan wel te weerleggen. Indien bevestigd wordt dat het organisme voorkomt, geldt het bepaalde in bijlage III, punt 2.

2. In afwachting dat de vermoede aanwezigheid wordt bevestigd of weerlegd, als bedoeld in lid 1, dienen de verantwoordelijke officiële instanties van de lidstaten, in alle gevallen waarin:

i) diagnostische symptomen van de door het organisme veroorzaakte ziekte zijn waargenomen en een positieve uitkomst is verkregen bij de snelle screeningstest(s) als omschreven in bijlage II, deel I, punt 1, en deel II, of

ii) een positieve uitkomst is verkregen bij de screeningstest(s) als omschreven in bijlage II, deel I, punt 2, en deel III,

met betrekking tot hun eigen productie

a) te verbieden dat planten en knollen van alle gewassen, partijen of zendingen waarvan de monsters zijn genomen, worden verplaatst, tenzij dit onder hun toezicht gebeurt en op voorwaarde dat vaststaat dat er geen aanwijsbaar risico is dat het organisme zich kan verspreiden;

b) het nodige te doen om de oorsprong van de vermoede aanwezigheid van het organisme te achterhalen;

c) op grond van het geschatte risico passende aanvullende voorzorgsmaatregelen te nemen, in het bijzonder ten aanzien van de productie van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal en van het verplaatsen van andere dan onder a) bedoelde partijen pootaardappelen die geteeld zijn op de productieplaats waar de onder a) genoemde monsters zijn genomen, om verspreiding van het organisme te voorkomen.

3. Indien er bij vermoede aanwezigheid van het organisme een risico bestaat dat het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal of het oppervlaktewater stromend naar of afkomstig van (een) andere lidstaat (lidstaten) wordt besmet, dient de lidstaat waar de vermoede aanwezigheid is gerapporteerd de andere betrokken lidstaat (lidstaten) onverwijld en overeenkomstig het geconstateerde risico nadere gegevens inzake de vermoede aanwezigheid mede te delen; tussen de betrokken lidstaten wordt op passende wijze samengewerkt. De aldus in kennis gestelde lidstaten treffen voorzorgsmaatregelen overeenkomstig lid 2, onder c), en nemen alle nodige maatregelen overeenkomstig het bepaalde in lid 1 en lid 2.

4. De volgende maatregelen kunnen worden vastgesteld volgens de procedure van artikel 16 bis van Richtlijn 77/93/EEG:

— de maatregelen als bedoeld in lid 2, onder c).

Artikel 5

1. Wanneer het officiële of onder officieel toezicht verrichte laboratoriumonderzoek waarbij de in bijlage II beschreven methode of, in alle overige gevallen, een andere officieel erkende methode is toegepast, de aanwezigheid van het organisme in het overeenkomstig deze richtlijn genomen monster bevestigt, nemen de verantwoordelijke officiële instanties van de lidstaat, rekening houdend met deugdelijke wetenschappelijke beginselen, de biologische eigenschappen van het organisme en de in de lidstaten gebruikelijke teelt-, afzet- en verwerkingsmethoden voor de gastheerplanten van het organisme, de volgende maatregelen:

a) voor het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal: i) stellen zij een onderzoek in om de omvang en de primaire bron(nen) van de besmetting te bepalen, overeenkomstig het bepaalde in bijlage IV, met verdere tests overeenkomstig artikel 4, lid 1, op ten minste alle klonaal verwante voorraden pootaardappelen, en ii) verklaren zij het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal, de zending en/of partij waarvan het monster is genomen, alsmede de machines, het voer- of vaartuig, de opslagplaats, of delen daarvan, en enig ander voorwerp, inclusief verpakkingsmateriaal dat met het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal waarvan het monster is genomen, in contact is geweest, besmet; indien van toepassing verklaren zij ook het veld (de velden), de eenheid (eenheden) waar het gewas onder beschermde condities is geteeld, en de productieplaats(en) waar het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal is geoogst waarvan het monster is genomen, besmet; voor de tijdens de vegetatieperiode genomen monsters verklaren zij het veld (de velden), de productieplaats(en) en, in voorkomend geval, de eenheid (eenheden) waar het gewas waarvan het monster is genomen, onder beschermde condities is geteeld, besmet, en iii) bepalen zij, overeenkomstig het bepaalde in bijlage V, punt 1, de omvang van de waarschijnlijke besmetting door contact met de aangewezen besmettingsbronnen vóór of na de oogst, via de teeltwijze, de irrigatie of de bespuiting, of via stamverwantschap met de aangewezen besmettingsbronnen, en iv) bakenen zij een zone af uitgaande van de onder ii) bedoelde besmetverklaring, de onder iii) bedoelde omvang van de waarschijnlijke besmetting en de mogelijke verspreiding van het organisme, overeenkomstig het bepaalde in bijlage V, punt 2, onder i);

b) voor gewassen van andere dan de onder a) bedoelde gastheerplanten, indien er een aanwijsbaar risico voor de teelt van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal bestaat: i) stellen zij een onderzoek in overeenkomstig het bepaalde in punt a), onder i), en ii) verklaren zij de gastheerplanten van het organisme, waarvan het monster is genomen, besmet, en iii) bepalen zij de waarschijnlijke besmetting en bakenen zij een zone af overeenkomstig het bepaalde in punt a), onder respectievelijk iii) en iv), ten aanzien van de productie van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal;

c) voor het oppervlaktewater (inclusief vloeibaar afval van bedrijven voor industriële verwerking of verpakking van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal) dat in contact komt met in het wild voorkomende nachtschadeachtigen die als gastheerplant kunnen optreden, wanneer vaststaat dat er aanwijsbare risico's bestaan voor de teelt van het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal via irrigatie, bespuiting of overstroming met oppervlaktewater: i) stellen zij een onderzoek in met onder meer een officieel onderzoek, op de daartoe geschikte tijdstippen, van monsters van oppervlaktewater en, in voorkomend geval, in het wild voorkomende nachtschadeachtigen die als gastheerplant optreden, teneinde de omvang van de besmetting te bepalen, en ii) verklaren zij, voorzover nodig en op grond van het onder i) bedoelde onderzoek, het oppervlaktewater waarvan het monster is of de monsters zijn genomen, besmet, en iii) bepalen zij de waarschijnlijke besmetting en bakenen zij op basis van de onder ii) bedoelde besmetverklaring en de mogelijke verspreiding van het organisme een zone af, waarbij rekening wordt gehouden met het bepaalde in bijlage V, punt 1 en punt 2, onder ii).

2. De lidstaten stellen op de in bijlage V, punt 3, vastgestelde wijze de andere lidstaten en de Commissie onverwijld in kennis van elke besmetverklaring als bedoeld in lid 1, punt a), onder ii), en lid 1, punt c), onder ii), en verstrekken nadere gegevens betreffende de zoneafbakening als bedoeld in lid 1, punt a), onder iv), en, indien van toepassing, lid 1, punt c), onder iii). De op grond van deze alinea verstrekte gegevens kunnen aan het comité worden voorgelegd.

Daarnaast leggen de lidstaten de in bijlage V, punt 4, bedoelde aanvullende kennisgeving aan de Commissie voor. De op grond van deze alinea verstrekte gegevens worden onmiddellijk aan de leden van het comité voorgelegd.

3. Als gevolg van een in lid 2 bedoelde kennisgeving en de daarin vermelde gegevens gaan de andere, in de kennisgeving vermelde lidstaten over tot een onderzoek overeenkomstig het bepaalde in lid 1, punt a), onder i), en, waar van toepassing, lid 1, punt c), onder i), en nemen zij, indien van toepassing, maatregelen overeenkomstig het bepaalde in lid 1 en lid 2.

Artikel 6

1. De lidstaten bepalen dat het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal dat krachtens artikel 5, lid 1, punt a), onder ii), besmet is verklaard niet mag worden gepoot of uitgeplant en dat daarvoor onder toezicht van hun verantwoordelijke officiële instanties één van de in bijlage VI, punt 1, genoemde maatregelen wordt getroffen zodat vaststaat dat er geen aanwijsbaar risico voor verspreiding van het organisme bestaat.

2. De lidstaten bepalen dat het in de lijst opgenomen plantaardige materiaal dat krachtens artikel 5, lid 1, punt a), onder iii), en punt c), onder iii), „waarschijnlijk besmet” is verklaard, met inbegrip van het in de lijst opgenomen materiaal waarvoor een risico is geconstateerd, dat is geproduceerd op productieplaatsen die krachtens artikel 5, lid 1, punt a), onder iii), „waarschijnlijk besmet” zijn verklaard, niet mag worden gepoot of uitgeplant en dat het onder toezicht van hun verantwoordelijke officiële instanties op de in bijlage VI, punt 2, aangegeven adequate wijze wordt gebruikt of verwijderd, zodat wordt vastgesteld dat er geen aanwijsbaar risico voor verspreiding van het organisme bestaat.

3. De lidstaten schrijven voor dat machines, voer- of vaartuigen, opslagplaatsen, of delen daarvan, en andere voorwerpen, verpakkingsmateriaal inbegrepen, die overeenkomstig artikel 5, lid 1, punt a), onder ii), besmet zijn verklaard of waarvan overeenkomstig artikel 5, lid 1, punt a), onder iii), en punt c), onder iii), is vastgesteld dat zij waarschijnlijk besmet zijn, volgens de in bijlage VI, punt 3, beschreven adequate methoden worden vernietigd of gedesinfecteerd. Dergelijke voorwerpen worden na desinfectie niet langer als besmet beschouwd.

4. Onverminderd de maatregelen die krachtens de leden 1, 2 en 3 van dit artikel worden genomen, bepalen de lidstaten dat in de overeenkomstig artikel 5, lid 1, punt a), onder iv), en punt c), onder iii), afgebakende zone een reeks maatregelen wordt genomen, zoals gespecificeerd in bijlage VI, punten 4.1 en 4.2. De nadere bijzonderheden van deze maatregelen worden ieder jaar aan de andere lidstaten en aan de Commissie medegedeeld. De daarbij verstrekte gegevens kunnen aan het comité worden voorgelegd.

Artikel 7

1. De lidstaten schrijven voor dat pootaardappelen moeten voldoen aan de in Richtlijn 77/93/EEG vervatte eisen en in rechte lijn moeten afstammen van in het kader van een officieel goedgekeurd programma verkregen aardappelmateriaal dat bij officiële of onder officieel toezicht verrichte onderzoeken waarbij de overeenkomstige in bijlage II bedoelde methode is gevolgd, vrij van het organisme is bevonden.

Bovenbedoelde onderzoeken worden door een lidstaat verricht:

a) wanneer bevestigd is dat het organisme is aangetroffen in de pootaardappelenproductie van de betrokken lidstaat, i) door middel van onderzoek van de daaraan voorafgaande generaties, met inbegrip van de oorspronkelijke kloonselectie, en systematisch onderzoek van de basispootgoedklonen, of ii) wanneer vastgesteld is dat er geen klonale verwantschap bestaat, door middel van onderzoek van alle basispootgoedklonen of de daaraan voorafgaande generaties, met inbegrip van de oorspronkelijke kloonselectie, en

b) in andere gevallen: op elke plant van de oorspronkelijke kloonselectie of op representatieve monsters van het basispootgoed of van de aan het basispootgoed voorafgaande generaties.

2. Volgens de procedure van artikel 16 bis van Richtlijn 77/93/EEG kunnen worden vastgesteld:

— de nadere toepassingsbepalingen van lid 1, tweede alinea, onder a);

— de bepalingen betreffende de representatieve monsters als bedoeld in lid 1, tweede alinea, onder b).

Artikel 8

Het in bezit hebben van en het werken met het organisme wordt door de lidstaten verboden.

Artikel 9

Onverminderd het bepaalde in Richtlijn 77/93/EEG, mogen de lidstaten toestaan dat voor experimenten, voor wetenschappelijke doeleinden of voor selectiewerkzaamheden wordt afgeweken van het bepaalde in de artikelen 6 en 8 van deze richtlijn, overeenkomstig het bepaalde in Richtlijn 95/44/EG van de Commissie ( 5 ).

Artikel 10

De lidstaten mogen voor hun eigen productie aanvullende of strengere maatregelen vaststellen wanneer dit nodig is om het organisme te bestrijden of om verspreiding ervan te voorkomen, voorzover die maatregelen in overeenstemming zijn met het bepaalde in Richtlijn 77/93/EEG.

De nadere bijzonderheden van die maatregelen worden ter kennis gebracht van de andere lidstaten en de Commissie. De daarbij verstrekte gegevens kunnen aan het comité worden voorgelegd.

Artikel 11

De op grond van de stand van wetenschap of techniek in de bijlagen bij deze richtlijn aan te brengen wijzigingen worden vastgesteld volgens de procedure van artikel 16 bis van Richtlijn 77/93/EEG. Voor de in bijlage II vastgestelde methoden en de in de punten 4.1 en 4.2 van bijlage VI bij de onderhavige richtlijn vastgestelde maatregelen, stelt de Commissie een verslag op, waarbij zij deze methoden en maatregelen opnieuw bekijkt in het licht van de opgedane ervaring; dit verslag wordt vóór 1 januari 2002 aan het comité voorgelegd.

Artikel 12

1. De lidstaten doen de nodige wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om met ingang van 21 augustus 1999 aan deze richtlijn te voldoen. Zij stellen de Commissie daarvan onverwijld in kennis.

Wanneer de lidstaten deze bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen naar de onderhavige richtlijn verwezen of wordt hiernaar verwezen bij de officiële bekendmaking van de bepalingen. De regels voor deze verwijzing worden vastgesteld door de lidstaten.

2. De lidstaten delen de Commissie onverwijld alle belangrijke bepalingen van intern recht mee die zij op het onder deze richtlijn vallende gebied vaststellen. De Commissie stelt de andere lidstaten daarvan in kennis.

Artikel 13

Deze richtlijn treedt in werking op de dag van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Artikel 14

Deze richtlijn is gericht tot de lidstaten.









BIJLAGE I

DEEL I

Lijst van gastheerplanten van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. als bedoeld in artikel 1







Planten (inclusief knollen) van Solanum tuberosum L., met uitzondering van zaden Aardappelen Planten van Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw., met uitzondering van vruchten en zaden Tomaten

DEEL II

Onderzoeken

1. Bij de officiële onderzoeken als bedoeld in artikel 2, lid 2, onder a), moet worden uitgegaan van de biologische eigenschappen van het organisme en de specifieke productiemethoden in de betrokken lidstaat; de onderzoeken moeten het volgende omvatten: i) voor aardappelen: — op daartoe geschikte tijdstippen, visueel onderzoek van het ongeoogste gewas en/of nemen van monsters, tijdens de vegetatieperiode of tijdens de opslag, van zowel pootaardappelen als andere aardappelen. De knollen die als monster zijn genomen, worden doorgesneden en officieel of onder officieel toezicht visueel onderzocht, — en — voor pootaardappelen en, zo nodig, voor andere aardappelen, officiële of onder officieel toezicht uit te voeren laboratoriumtests, waarbij de methode van bijlage II wordt gebruikt; ii) voor tomaten: — visueel onderzoek, op daartoe geschikte tijdstippen, van ten minste de voor herplanting voor professioneel gebruik bestemde ongeoogste tomatenplanten, op daartoe geschikte tijdstippen.

2. De in artikel 2, lid 3, bedoelde kennisgeving van de officiële onderzoeken dient het volgende te bevatten: i) voor onderzoeken met betrekking tot aardappelen: — een raming van het totale teeltareaal, zowel pootaardappelen als andere aardappelen (in ha); — een uitsplitsing van de gegevens in klassen van pootaardappelen en consumptieaardappelen, en, zo nodig, naar gebied; — het aantal monsters dat voor onderzoek is genomen, en het tijdstip waarop zij zijn genomen; — het aantal op het veld uitgevoerde visuele onderzoeken; — het aantal op knollen uitgevoerde visuele onderzoeken (en omvang van het monster); ii) voor onderzoeken met betrekking tot ten minste voor herplanting voor professioneel gebruik bestemde ongeoogste tomatenplanten: — een raming van het totale aantal planten; — het aantal visuele onderzoeken; iii) voor onderzoeken met betrekking tot andere gastheerplanten dan aardappelen en tomaten, met inbegrip van in het wild voorkomende nachtschadeachtigen die als gastheerplant kunnen optreden: — soort; — aantal en tijdstip van genomen monsters; — bemonsterd gebied/bemonsterde rivier, al naar gelang van het geval; — analysemethode; iv) voor onderzoeken met betrekking tot water en vloeibaar afval van bedrijven voor industriële verwerking of verpakking: — aantal en tijdstip van genomen monsters; — bemonsterd gebied/bemonsterde rivier/bemonsterde bedrijfsterreinen, al naar gelang van het geval; — analysemethode.

▼M1









BIJLAGE II

ONDERZOEKSMETHODE VOOR DE DIAGNOSE, DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

OVERZICHT VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

Deze onderzoeksmethode beschrijft de verschillende procedures voor:

i) de diagnose van bruinrot in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en enkele andere waardplanten;

ii) de detectie van Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) in monsters van aardappelknollen, aardappel- en tomatenplanten en andere waardplanten, water en grond;

iii) de identificatie van R. solanacearum.

INHOUD







Algemene beginselen DEEL I Toepassing van de onderzoeksmethode 1. Stroomdiagram voor de diagnose van bruinrot (R. solanacearum) in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot 2. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen 3. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere waardplanten DEEL II Methoden voor de detectie van R. solanacearum in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot 1. Symptomen 2. Snelle screeningstests 3. Isolatieprocedure 4. Identificatietests voor R. solanacearum DEEL III 1. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen 1.1. Bereiding van de monsters 1.2. Testmethode 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere planten 2.1. Bereiding van de monsters 2.2. Testmethode DEEL IV 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water 2.1. Bereiding van de monsters 2.2. Testmethode DEEL V 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond 2.1. Bereiding van de monsters 2.2. Testmethode DEEL VI Geoptimaliseerde protocollen voor de detectie en identificatie van R. solanacearum A. Diagnose en detectie 1. Slijmdradentest 2. Detectie van poly-β-hydroxybutyraatkorrels 3. Serumagglutinatietests 4. Selectieve isolatie 4.1. Selectieve uitplating 4.2. Ophopingsprocedure 5. Immunofluorescentiestest (IF-test) 6. Polymerasekettingreactietest (PCR-test) 6.1. DNA-zuiveringsmethoden a) Methode volgens Pastrik (2000) b) Andere methoden 6.2. PCR 6.3. Analyse van het PCR-product 7. Fluorescentie-in-situ-hybridisatietest (FISH-test) 8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-tests a) Indirecte ELISA b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA 9. Bioassay B. Identificatietests 1. Voedingstests en enzymatische identificatietests 2. IF-test 3. ELISA-test 4. PCR-test 5. FISH-test 6. Vetzuurprofiel (FAP) 7. Stamkarakterisatie 7.1. Biovarbepaling 7.2. Genetische vingerafdruk 7.3. PCR-methoden C. Bevestigingstest Aanhangsel 1 Bij de optimalisering en validering van de protocollen ingeschakelde laboratoria Aanhangsel 2 Isolatie- en kweekmedia voor R. solanacearum Aanhangsel 3 A) In de handel verkrijgbaar gestandaardiseerd controlemateriaal B) Bereiding van positieve en negatieve controles voor de screeningstests (PCR/IF en FISH) Aanhangsel 4 Buffers voor testprocedures Aanhangsel 5 Bepaling van het besmettingsniveau met de IF- en de FISH-test Aanhangsel 6 Gevalideerde PCR-protocollen en -reagentia Aanhangsel 7 Gevalideerde reagentia voor de FISH-test Aanhangsel 8 Aubergine- en tomatenteelt Literatuurverwijzingen

ALGEMENE BEGINSELEN

In de aanhangsels worden geoptimaliseerde protocollen voor de verschillende methoden, gevalideerde reagentia, en nadere bijzonderheden betreffende de bereiding van analyse- en controlemateriaal beschreven. Aanhangsel 1 bevat een lijst van laboratoria die bij de optimalisering en validering van de protocollen zijn betrokken.

Aangezien de protocollen betrekking hebben op de detectie van een quarantaineorganisme en daarbij levensvatbare culturen van R. solanacearum als controlemateriaal gebruikt worden, moeten de procedures onder adequate quarantaineomstandigheden met de nodige faciliteiten voor afvalverwijdering worden uitgevoerd en moeten de officiële autoriteiten voor plantenquarantaine de vereiste vergunningen hebben verstrekt.

De testparameters moeten zodanig zijn dat R. solanacearum bij de drempelwaarden die voor de gekozen methoden zijn vastgesteld op consistente en reproduceerbare wijze gedetecteerd wordt.

Het is essentieel dat de positieve controlemonsters zorgvuldig bereid worden.

Om de tests met de vereiste drempelwaarden te kunnen verrichten moet verder de apparatuur juist ingesteld, in goede staat van onderhoud en geijkt zijn, moeten de reagentia zorgvuldig gehanteerd en bewaard worden en moeten alle maatregelen worden genomen om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen; zo moeten de positieve controlemonsters gescheiden van de analysemonsters bewaard worden. Er moeten kwaliteitsbewakingsnormen worden toegepast om administratieve en andere fouten te vermijden, met name bij de etikettering en documentatie.

Een vermoede aanwezigheid als bedoeld in artikel 4, lid 2, van Richtlijn 98/57/EG betekent dat een positieve uitslag is verkregen bij een diagnostische of screeningstest op een monster zoals aangegeven in de stroomdiagrammen. Een positieve eerste screeningstest (IF, PCR/FISH, selectieve isolatie) moet met een tweede, op andere biologische principes gebaseerde screeningstest worden bevestigd.

Als de eerste screeningstest positief is, wordt besmetting met R. solanacearum vermoed en moet een tweede screeningstest worden uitgevoerd. Is de tweede screeningstest ook positief, dan wordt het vermoeden bevestigd (vermoede aanwezigheid) en moeten de tests volgens de onderzoeksmethode worden voortgezet. Als de tweede screeningstest negatief is, wordt aangenomen dat het monster niet met R. solanacearum besmet is.

Onder bevestigde aanwezigheid als bedoeld in artikel 5, lid 1, van Richtlijn 98/57/EG wordt verstaan dat een reincultuur van R. solanacearum is geïsoleerd en geïdentificeerd en de pathogeniteit ervan bevestigd is.

DEEL I

TOEPASSING VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

1. Stroomdiagram voor de diagnose van bruinrot (R. solanacearum) in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot

De testprocedure is bedoeld voor aardappelknollen en -planten met symptomen die karakteristiek zijn voor bruinrot of een vermoeden daarvan doen rijzen. Ze omvat een snelle screeningstest, isolatie van het pathogeen uit geïnfecteerd vaatweefsel op (selectief) medium en, in geval van een positieve uitslag, identificatie van de cultuur als R. solanacearum.

2. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen

Principe

Deze testprocedure is bedoeld voor het opsporen van latente infecties in aardappelknollen. Een positieve uitslag bij ten minste twee, op verschillende biologische principes gebaseerde screeningstests3 moet worden bevestigd door isolatie van het pathogeen. In geval van isolatie van karakteristieke kolonies wordt de procedure vervolgd door identificatie van een reincultuur als R. solanacearum. Een positieve uitslag bij slechts één van de screeningstests is niet voldoende om het monster als verdacht aan te merken.

Met de screenings- en isolatietests moet een detectiegrens worden gehaald van 103-104 cellen/ml van de geresuspendeerde pellet die als positieve controle aan elke testreeks wordt toegevoegd.

3. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- of andere waardplanten

DEEL II

METHODEN VOOR DE DETECTIE VAN R. SOLANACEARUM IN AARDAPPELKNOLLEN EN AARDAPPEL-, TOMATEN- EN ANDERE WAARDPLANTEN MET SYMPTOMEN VAN BRUINROT

1. Symptomen (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Symptomen bij aardappel

Aardappelplant. Het eerste infectiestadium uit zich in bladverwelking nabij de top van de plant bij hoge temperaturen overdag met herstel's nachts. Aanvankelijk blijven de bladeren groen, later vergelen ze en treedt bruine necrose op. Ook komt epinastie voor. De verwelking van scheuten of hele planten is al snel onomkeerbaar; de plant zakt ineen en sterft. Het vaatweefsel in dwars doorgesneden stengels van verwelkte planten ziet er doorgaans bruin uit en uit het snijvlak komt een melkachtig bacterieslijm (spontaan of als de stengel wordt dichtgeknepen). Wanneer een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, komen er slijmdraden uit de vaatbundels.

Aardappelknol. De aardappelknollen moeten dicht bij het naveleinde (stoloon) dwars of over de stoloon overlangs doorgesneden worden. Het eerste infectiestadium uit zich in een glazige gele tot lichtbruine verkleuring van de vaatbundelring, waaruit na enkele minuten spontaan roomkleurig bacterieslijm komt. Later wordt de vaatverkleuring duidelijker bruin en kan de necrose zich tot in het parenchym uitstrekken. In gevorderde stadia komt uit de navel en de ogen bacterieslijm waaraan bodemdeeltjes blijven hangen. Op de schil kunnen door instorting van onderliggend vaatweefsel roodbruine, iets verzonken laesies verschijnen. In gevorderde stadia van de ziekte komt secundair vaak zacht bacterieel of schimmelrot voor.

1.2. Symptomen bij tomaat

Tomatenplant. Het eerste zichtbare symptoom is dat de jongste bladeren er slap bijhangen. In voor het pathogeen gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur ongeveer 25 °C, 100 % luchtvochtigheid) volgen na enkele dagen epinastie en eenzijdige of totale verwelking van de plant, waarna deze volledig inzakt. In minder gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur lager dan 21 °C) treedt minder verwelking op, maar kunnen zich aan de stengel grote aantallen bijwortels ontwikkelen. Vanaf de voet van de stengel verschijnen met water verzadigde ribbels, wat wijst op necrose in het vaatstelsel. Als de stengel dwars wordt doorgesneden, komt er wit of gelig bacterieslijm uit het bruin verkleurde vaatweefsel.

1.3. Symptomen bij andere waardplanten

Solanum dulcamara (bitterzoet) en S. nigrum (zwarte nachtschade) — In het wild wordt verwelking bij deze onkruidplanten zelden waargenomen, tenzij bij bodemtemperaturen van meer dan 25 °C of extreem hoge inoculumniveaus (bijvoorbeeld wanneer S. nigrum vlak naast zieke aardappel- of tomatenplanten groeit). Als verwelking wel optreedt, zijn de symptomen dezelfde als bij tomaat. Niet-verwelkende S. dulcamara die met wortel en stengel in water staat kan op een dwarse doorsnede van de onderste of onder water gelegen stengeldelen een lichtbruine verkleuring van het vaatweefsel vertonen. Bacterieslijm of -slijmdraden kunnen uit het vaatweefsel komen als een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, ook als er geen verwelkingssymptomen zijn.

2. Snelle screeningstests

Snelle screeningstests zijn nuttig voor een voorlopige diagnose, maar niet essentieel. Voer een of meer van de onderstaande gevalideerde tests uit.

2.1. Slijmdradentest

(Zie VI.A.1)

2.2. Detectie van poly-β-hydroxybutyraatkorrels (PHB-korrels)

Kleur thermisch gefixeerde uitstrijkjes bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel op een objectglaasje met nijlblauw A of sudanzwart om de karakteristieke PHB-korrels in de cellen van R. solanacearum te zien (VI.A.2).

2.3. Serumagglutinatietests

(Zie VI.A.3)

2.4. Andere tests

Andere geschikte snelle screeningstests zijn onder meer de IF-test (VI.A.5), FISH-test (VI.A.7), ELISA-tests (VI.A.8) en PCR-tests (VI.A.6).

3. Isolatieprocedure

a) Neem wat slijm of verkleurd vaatweefsel uit de aardappelknol of uit de stengel van de verwelkte aardappel-, tomaten- of andere waardplant. Suspendeer dit in een klein volume steriel gedestilleerd water of steriele fosfaatbuffer 50 mM (aanhangsel 4) en laat 5-10 minuten staan.

b) Maak een reeks decimale verdunningen van de suspensie.

c) Breng 50-100 µl van de suspensie en verdunningen over op een algemeen medium (NA, YPGA of SPA; aanhangsel 2) en/of op Kelman's tetrazoliummedium (aanhangsel 2) of een ander gevalideerd selectief medium (zoals SMSA; aanhangsel 2). Gebruik daarvoor een geschikte techniek. Plaat als positieve controle eventueel ook een verdunde celsuspensie van R. solanacearum biovar 2 uit.

d) Incubeer de platen 2-6 dagen bij 28 °C. — Op een algemeen medium vormen virulente isolaten van R. solanacearum parelwitte, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies, vaak met kenmerkende slierten in het midden. Avirulente isolaten vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig roomkleurige, botervette kolonies. — Op Kelman's tetrazolium en SMSA zijn de slierten bloedrood. Avirulente isolaten van R. solanacearum vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig dieprode, botervette kolonies.

4. Identificatietests voor R. solanacearum

Onder VI. B worden tests beschreven om de identificatie van vermoedelijke isolaten van R. solanacearum te bevestigen.

DEEL III

1. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen

1.1. Bereiding van de monsters

Opmerkingen

— De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. Intensievere bemonstering houdt in dat er meer tests op monsters van deze grootte worden genomen. Wanneer een groter aantal knollen per monster wordt genomen, treedt remming op of zijn de resultaten moeilijk te interpreteren. De procedure is echter ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen, wanneer er niet zoveel beschikbaar zijn.

— De hierna beschreven detectiemethoden zijn gevalideerd met monsters van 200 knollen.

— Het hierna beschreven aardappelextract kan ook worden gebruikt voor de detectie van de aardappelringrotbacterie, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Facultatieve behandeling vóór de bereiding van het monster:

a) Incubeer de monsters vooraf maximaal twee weken voor de test bij 25-30 °C, zodat eventueel aanwezige R. solanacearum zich vermenigvuldigt.

b) Was de knollen. Gebruik geschikte ontsmettingsmiddelen (als een PCR-test uitgevoerd wordt, chloorverbindingen om eventueel aanwezig pathogeen-DNA te verwijderen) en reinigingsmiddelen na elk monster. Laat de knollen aan de lucht drogen. Deze wasprocedure is vooral nuttig, maar niet verplicht, voor monsters met veel aanhangende grond en als een PCR-test of directe isolatie moet worden uitgevoerd.

1.1.1. Verwijder met een schoon, ontsmet scalpel of aardappelschilmes de schil aan het naveleinde (stoloon) van elke knol, zodat het vaatweefsel zichtbaar wordt. Snij voorzichtig een kleine kegelvormige kern vaatweefsel uit het naveleinde van elke knol en zorg er daarbij voor dat deze zo weinig mogelijk niet-vaatweefsel bevat (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). NB: Houd (rottende) knollen met verdachte symptomen van bruinrot apart en test die afzonderlijk. Als bij het uitsnijden van het naveleindstukje voor bruinrot verdachte symptomen worden waargenomen, moet de knol visueel worden onderzocht en bij de navel worden doorgesneden. Doorgesneden knollen met vermoedelijke symptomen moeten ten minste twee dagen bij kamertemperatuur worden bewaard om verkurking te laten optreden en vervolgens gekoeld (bij 4-10 °C) onder de juiste quarantaineomstandigheden worden opgeslagen. Alle knollen, ook die met verdachte symptomen, moeten overeenkomstig bijlage III worden bewaard.

1.1.2. Verzamel de naveleindstukjes in ongebruikte afsluitbare of verzegelbare wegwerpcontainers (als de containers wel opnieuw gebruikt worden, moeten ze grondig worden gereinigd en met chloorverbindingen worden ontsmet). De naveleindstukjes worden bij voorkeur direct verwerkt. Is dat niet mogelijk, dan moeten ze zonder toevoeging van buffer in de container worden bewaard; gekoeld mogen ze hooguit 72 uur worden bewaard, bij kamertemperatuur hooguit 24 uur. Verwerk de naveleindstukjes volgens een van onderstaande procedures: a) overgiet de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud 4 uur (bij minder dan 24 °C) of 16-24 uur (gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of b) homogeniseer de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) in een blender (bv. Waring of Ultra Thurax) of door ze fijn te maken in een afgesloten wegwerpbaar maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba sterk polytheen, 150 × 250 mm, met straling gesteriliseerd) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). NB: Bij gebruik van een blender is er een groot risico op kruisbesmetting tussen de monsters. Neem maatregelen om aërosolvorming en morsen tijdens de extractie te vermijden. Voor elk monster moeten pas gesteriliseerde blendermessen en vaten gebruikt worden. Als de PCR-test wordt gedaan, moet worden vermeden dat er DNA in de containers of maalapparatuur achterblijft. Aanbevolen wordt om voor de PCR-test het materiaal in wegwerpzakjes fijn te maken en wegwerpbuisjes te gebruiken.

1.1.3. Schenk de bovenstaande vloeistof af. Als de vloeistof erg troebel is, kan dit worden verholpen door centrifugeren bij laag toerental (maximaal 180 g, 10 minuten, 4-10 °C) of vacuümfiltratie (40-100 µm) waarbij het filter met ongeveer 10 ml extractiebuffer wordt nagespoeld.

1.1.4. Concentreer de bacteriefractie door 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g (of 10 minuten bij 10 000 g) bij 4-10 °C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.

1.1.5. Resuspendeer de pellet in 1,5 ml pelletbuffer (aanhangsel 4). Gebruik 500 µl voor de test op R. solanacearum, 500 µl voor die op Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en 500 µl voor referentiedoeleinden. Voeg aan het referentiealiquot van 500 µl en aan het niet-gebruikte analysealiquot steriele glycerol toe tot een eindconcentratie van 10-25 % (V/V), vortex en bewaar tussen 16 en 24 °C (enkele weken) of 68 en 86 °C (enkele maanden). Bewaar de analysealiquots tijdens het onderzoek bij 4-10 °C. Herhaald invriezen en ontdooien wordt niet aangeraden. Als het extract moet worden vervoerd, moet het binnen 24 à 48 uur in een koelbox worden afgeleverd.

1.1.6. Alle positieve R. solanacearum-controles en -monsters moeten gescheiden behandeld worden om contaminatie te voorkomen. Dit geldt voor de IF-glaasjes en voor alle tests.

1.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels:

selectieve isolatie (VI.A.4);

IF-test (VI.A.5);

PCR-tests (VI.A.6);

FISH-test (VI.A.7);

ELISA-tests (VI.A.8);

bioassay (VI.A.9).

2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere waardplanten

2.1. Bereiding van de monsters

NB: Voor de detectie van latente R. solanacearum-populaties wordt aangeraden samengestelde monsters te testen. De methode is goed bruikbaar voor samengestelde monsters van maximaal 200 stengeldelen. Surveyonderzoeken moeten gebaseerd zijn op een statistisch representatieve steekproef van de onderzochte plantenpopulatie.

2.1.1. Doe stengeldelen van 1-2 cm in een gesloten steriele container overeenkomstig de onderstaande bemonsteringsprocedures. Zaailingen van tomatenplanten: Snij met een schoon, ontsmet mes een stuk van 1 cm van het onderste deel van elke stengel, vlak boven het bodemniveau. Kas- of vollegrondtomatenplanten: Snij met een schoon, ontsmet mes de onderste zijscheut van elke plant zo dicht mogelijk bij de hoofdstengel af. Neem de onderste 1 cm van elke zijscheut. Andere planten: Snij met een schoon, ontsmet mes of dito snoeischaar een stuk van 1 cm van het onderste deel van de stengel af, vlak boven het bodemniveau. Snij van S. dulcamara of andere in water groeiende planten een stuk van 1-2 cm van het deel van de stengel onder water of de stoloon met waterwortels. Test bij het bemonsteren van een bepaalde plaats bij voorkeur een statistisch representatieve steekproef van ten minste tien planten per bemonsteringspunt van elke mogelijke onkruidwaard. Het pathogeen is het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, al kan natuurlijke infectie in overblijvend bitterzoet (S. dulcamara) in waterlopen het hele jaar worden gedetecteerd. Het organisme komt onder meer voor in aardappelopslag, S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium en andere planten van de nachtschadefamilie, en daarnaast in Pelargonium spp. en Portulaca oleracea. R. solanacearum biovar 2/ras 3 kan in specifieke omstandigheden voorkomen in de wortel of rizosfeer van Europese onkruidsoorten als Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfara en Urtica dioica. NB: In dit stadium kan het visuele onderzoek naar inwendige symptomen (vaatverkleuring of bacterieslijm) plaatsvinden. Bewaar en test stengeldelen met symptomen afzonderlijk (zie deel II).

2.1.2. Ontsmet de stengeldelen kort met ethanol 70 % en dep ze direct droog met tissuepapier. Verwerk de stengeldelen daarna volgens een van de volgende procedures: a) overgiet de stengeldelen met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud gedurende 4 uur (bij minder dan 24 °C) dan wel 16-24 uur (indien gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of b) verwerk de stengeldelen onmiddellijk door ze fijn te maken in een sterk maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba) met voldoende extractiebuffer (aanhangsel 4) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). Is dit niet mogelijk, dan kunnen ze gekoeld hooguit 72 uur worden bewaard en bij kamertemperatuur hooguit 24 uur.

2.1.3. Laat 15 minuten bezinken en schenk de bovenstaande vloeistof af.

2.1.4. Het is doorgaans niet nodig het extract verder te zuiveren of de bacteriefractie te concentreren; desgewenst kan dit worden gedaan door filtratie en/of centrifugering zoals beschreven onder III.1.1.3 tot 1.1.5.

2.1.5. Verdeel het oorspronkelijke of geconcentreerde monsterextract in twee gelijke delen. Houd de ene helft gedurende het onderzoek op 4-10 °C en bewaar de andere helft na toevoeging van 10-25 % (V/V) steriele glycerol tussen 16 en 24 °C (enkele weken) of 68 en 86 °C (enkele maanden) voor het geval verder onderzoek nodig is.

2.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels:

selectieve isolatie (VI.A.4);

IF-test (VI.A.5);

PCR-tests (VI.A.6);

FISH-test (VI.A.7);

ELISA-tests (VI.A.8);

bioassay (VI.A.9).

DEEL IV

1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water

2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water

Principe

Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in oppervlaktewatermonsters en monsters afvalwater van aardappelverwerkingsinstallaties of riooleffluent. De verwachte detectiegevoeligheid hangt echter van het substraat af. De gevoeligheid van de isolatietest hangt af van de populatie concurrerende saprofytische bacteriën, die doorgaans veel groter is in aardappelverwerkingsafvalwater of effluent dan in oppervlaktewater. Met de onderstaande methode kan in oppervlaktewater een concentratie van 103 cellen per liter nog worden gedetecteerd, maar voor afvalwater ligt de gevoeligheid waarschijnlijk aanzienlijk lager. Daarom wordt afvalwater het beste getest na een eventuele zuivering (bv. sedimentatie, filtratie), waardoor de populatie saprofytische bacteriën wordt gereduceerd. Bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen moet rekening worden gehouden met de gevoeligheid van de testmethode. Deze methode is met succes toegepast bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in oppervlaktewater, maar heeft haar beperkingen bij vergelijkbaar onderzoek op aardappelverwerkingsafvalwater of riooleffluent.

2.1. Bereiding van de monsters

Opmerkingen

— In oppervlaktewater is R. solanacearum het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, bij een watertemperatuur van meer dan 15 °C.

— Herhaalde bemonstering van dezelfde plaatsen op verschillende tijdstippen in die periode reduceert de weersinvloed en verhoogt daardoor de betrouwbaarheid van de detectie.

— Zware regenval en de geografie van de waterloop kunnen leiden tot een grote verdunning die de aanwezigheid van het pathogeen kan maskeren.

— Bemonster oppervlaktewater in de buurt van waardplanten (indien aanwezig).

2.1.1. Neem op de bemonsteringsplaatsen in steriele wegwerpbuizen of -flessen watermonsters op een diepte van meer dan 30 cm (indien mogelijk) en binnen 2 m van de oever. Neem afvalwater- of effluentmonsters bij het lozingspunt. Neem bij voorkeur monsters van maximaal 500 ml per bemonsteringspunt. Als kleinere monsters worden genomen, worden op elke bemonsteringsplaats bij voorkeur op ten minste drie verschillende tijdstippen telkens twee submonsters in duplo van ten minste 30 ml genomen. Kies voor intensief onderzoek ten minste drie bemonsteringsplaatsen per 3 km waterloop en bemonster ook de zijwaterlopen.

2.1.2. Vervoer de monsters koel (4-10 °C) en in het donker en test ze binnen 24 uur.

2.1.3. Concentreer de bacteriefractie indien nodig op een van de volgende manieren: a) centrifugeer submonsters van 30-50 ml 10 minuten bij 10 000 g (of 15 minuten bij 7 000 g), bij voorkeur bij 4-10 °C. Giet de bovenstaande vloeistof af. Resuspendeer de pellet in 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4); b) filtreer de suspensie door een membraan (minimale maasgrootte 0,45 µm). Was het filter met 5-10 ml pelletbuffer en bewaar de wasvloeistof. Deze werkwijze is geschikt voor grotere volumes water met weinig saprofyten. Monsters van aardappelverwerkingsafvalwater of effluent worden doorgaans beter niet geconcentreerd, omdat te grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën de detectie van R. solanacearum hinderen.

2.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels.

DEEL V

1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond

2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond

Principe

Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in bodemmonsters en monsters van vast aardappelverwerkingsafval of rioolslib. Ze is echter niet gevoelig genoeg om detectie van lage concentraties of onregelmatig verspreide populaties van R. solanacearum in natuurlijk besmette monsters van deze substraten te waarborgen.

Houd bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen en bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in bodems of slib rekening met de gevoeligheid van de testmethode. De betrouwbaarste manier om na te gaan of het pathogeen in een bodem aanwezig is, is een vatbare waardplant te planten en op infectie te controleren, maar ook met die methode kunnen lage besmettingsniveaus niet altijd worden gedetecteerd.

2.1. Bereiding van de monsters

2.1.1. Neem bodemmonsters volgens de standaardprincipes voor bemonstering bij nematodenonderzoek. Verzamel 0,5-1 kg grond per monster op 60 plaatsen per 0,3 ha (in een raster van 7 × 7 m) op een diepte van 10-20 cm. Gebruik 120 bemonsteringspunten per 0,3 ha als aanwezigheid van het pathogeen wordt vermoed. Bewaar de monsters bij 12-15 °C. Bemonster aardappelverwerkings- en rioolslib door in totaal 1 kg slib te verzamelen dat representatief is voor het hele te testen volume. Meng elk monster grondig voor het testen.

2.1.2. Dispergeer submonsters van 10-25 g grond of slib in 60-150 ml extractiebuffer (aanhangsel 4) op een rondschudapparaat (250 rpm, maximaal 2 uur). Voeg zo nodig steriele 0,02 % Tween 20 en 10-20 g steriele kiezel toe voor een betere dispersie.

2.1.3. Bewaar de suspensie tijdens het testen bij 4 °C.

2.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels.

DEEL VI

GEOPTIMALISEERDE PROTOCOLLEN VOOR DE DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN R. SOLANACEARUM

A. Diagnose en detectie

1. Slijmdradentest

De volgende eenvoudige oriënterende test geeft aan of R. solanacearum aanwezig is in stengels van verwelkende aardappel-, tomaten- of andere planten. Snij de stengel vlak boven het bodemniveau af. Dompel het snijvlak in een buis schoon water. Kijk of er na enkele minuten spontaan bacterieslijmdraden uit de doorgesneden vaatbundels komen.

2. Detectie van poly-β-hydroxybutyraatkorrels

1. Maak op een objectglaasje een uitstrijkje van bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel of uit een 48 uur oude kweek op YPGA- of SPA-medium (aanhangsel 2).

2. Maak uitstrijkjes van een biovar 2-stam van R. solanacearum als positieve controle en eventueel van een bekende PHB-negatieve soort als negatieve controle.

3. Laat aan de lucht drogen en haal elk glaasje door de vlam om de uitstrijkjes te fixeren.

4. Kleur de preparaten met nijlblauw of sudanzwart en bekijk ze onder de microscoop volgens de onderstaande procedure.

Nijlblauwkleuring

a) Overgiet elk glaasje met een 1 % oplossing van nijlblauw A in water. Incubeer 10 minuten bij 55 °C.

b) Laat de kleuroplossing weglopen. Spoel even in rustig stromend kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier.

c) Overgiet met azijnzuur 8 % en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur.

d) Spoel even in rustig stromend kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier.

e) Herbevochtig met een druppel water en breng een dekglaasje aan.

f) Bekijk het preparaat met een epifluorescentiemicroscoop (450 nm, olie-immersie, 600-1 000 ×).

g) Kijk of er een helderoranje fluorescentie van PHB-korrels te zien is. Controleer onder doorvallend natuurlijk licht of de korrels zich wel degelijk in de cellen bevinden en de celmorfologie karakteristiek is voor R. solanacearum.

Sudanzwartkleuring

a) Overgiet elk glaasje met een 0,3 % oplossing van sudanzwart B in ethanol 70 %. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.

b) Laat de kleuroplossing weglopen. Spoel even met kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier.

c) Dompel even in xyleen en dep droog op tissuepapier. Let op! Xyleen is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast.

d) Overgiet met waterige safranineoplossing 0,5 % (m/V) en laat 10 seconden bij kamertemperatuur inwerken. Let op! Safranine is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast.

e) Spoel in rustig stromend kraanwater. Dep droog op tissuepapier. Breng een dekglaasje aan.

f) Bekijk het preparaat met een lichtmicroscoop onder doorvallend licht (olie-immersie, 1 000 ×).

g) Kijk of er blauwzwarte PHB-korrels te zien zijn in R. solanacearum-cellen met roze celwanden.

3. Serumagglutinatietests

Agglutinatie van R. solanacearum-cellen in bacterieslijm of weefselextract van planten met symptomen is het beste waar te nemen met gevalideerde antilichamen (aanhangsel 3) die met kleur zijn gelabeld, bv. met rode Staphylococcus aureus of gekleurde latexdeeltjes. Volg bij gebruik van in de handel verkrijgbare kits (aanhangsel 3) de instructies van de fabrikant en anders de volgende procedure:

a) Meng ongeveer 5 µl van een suspensie van gelabeld antilichaam met ongeveer 5 µl bacterieslijm op venstertjes van een objectglaasje met meerdere venstertjes.

b) Maak positieve en negatieve controles met suspensies van R. solanacearum biovar 2 en een heterologe stam.

c) Meng zachtjes gedurende 15 seconden. In positieve monsters treedt agglutinatie op.

4. Selectieve isolatie

4.1. Selectieve uitplating

NB: Controleer vóór de eerste toepassing van deze methode of de toevoeging van 103-104 kve/ml R. solanacearum aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar wordt gedetecteerd.

Gebruik een geschikt gevalideerd selectief medium, bv. SMSA zoals gemodificeerd door Elphinstone e.a. (1996) (aanhangsel 2).

Om R. solanacearum te onderscheiden van andere bacteriën die op het medium kolonies kunnen vormen, is zorg vereist. Kolonies van R. solanacearum kunnen bovendien een atypische morfologie vertonen op overvolle platen en in aanwezigheid van antagonistische bacteriën. Test het monster bij een vermoeden van concurrentie of antagonisme met een andere test opnieuw.

Deze methode is het gevoeligst met vers bereide monsterextracten. Zij kan echter ook worden gebruikt met extracten die tussen 68 en 86 °C in glycerol zijn bewaard.

Maak als positieve controle decimale verdunningen van een suspensie van 106 kve/ml van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Om contaminatie uit te sluiten moeten de positieve controles volledig gescheiden van de analysemonsters worden bereid.

Ga voor elke nieuw bereide charge van een selectief medium na of die geschikt is voor het kweken van de bacterie en gebruik haar pas daarna om routinemonsters te testen.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

4.1.1. Neutraliseer eventueel aanwezige saprofytische kolonievormende populaties door verdunning en uitplating. Strijk per plaat monsterextract en per verdunning 50-100 µl uit.

4.1.2. Incubeer de platen bij 28 °C. Bekijk ze na 48 uur en daarna zes dagen lang dagelijks. Karakteristieke kolonies van R. solanacearum op SMSA zijn melkwit, plat, onregelmatig en uitvloeiend; na drie dagen incubatie worden ze in het midden roze tot bloedrood, met interne strepen en slierten (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). NB: R. solanacearum vormt op dit medium soms ook atypische kolonies. Deze kunnen klein, rond, helemaal rood en niet of slechts gedeeltelijk uitvloeiend zijn, waardoor ze moeilijk van saprofytische kolonievormende bacteriën te onderscheiden zijn.

4.1.3. Kweek vermoedelijke R. solanacearum-kolonies rein na uitstrijken of uitplaten van verdunningen op een algemeen medium om geïsoleerde kolonies te krijgen (aanhangsel 2).

4.1.4. De kweek kan worden bewaard in steriel water (pH 6-8, chloorvrij) in het donker en bij kamertemperatuur (kort) of in een geschikt cryoprotectans bij 68 à 86 °C of gevriesdroogd (lang).

4.1.5. Identificeer vermoedelijke culturen (VI. B) en voer een pathogeniteitstest uit (VI. C).

De test is negatief als de platen na zes dagen geen kolonies of geen vermoedelijke R. solanacearum-kolonies vertonen, mits er geen aanwijzingen zijn voor remming door concurrentie of antagonisme van andere bacteriën en de positieve controles wel karakteristieke R. solanacearum-kolonies vertonen. De test is positief als er vermoedelijke R. solanacearum-kolonies worden geïsoleerd.

4.2. Ophopingsprocedure

Gebruik een gevalideerd ophopingsmedium, bv. gemodificeerde Wilbrink-bouillon (aanhangsel 2).

Deze procedure dient om populaties van R. solanacearum in monsterextracten selectief te stimuleren en de detectiegevoeligheid te verbeteren. Ook worden remmers van de PCR-reactie doeltreffend verdund (1:100). De ophoping van R. solanacearum kan echter mislukken door concurrentie of antagonisme van saprofytische organismen die vaak ook worden gestimuleerd. Daarom is isolatie van R. solanacearum uit kweken in ophopingsbouillon soms moeilijk. Voor de ELISA-test verdienen specifieke monoklonale (in plaats van polyklonale) antilichamen de voorkeur, daar populaties van serologisch verwante saprofyten ook kunnen toenemen.

4.2.1. Breng voor ophoping+PCR 100 µl monsterextract over in 10 ml ophopingsbouillon (aanhangsel 2) in DNA-vrije buisjes of flesjes. Voor ophoping+ELISA kan de concentratie van het monsterextract worden verhoogd (bv. 100 µl in 1,0 ml ophopingsbouillon).

4.2.2. Incubeer 72 uur bij 27-30 °C (al dan niet op een schudapparaat) met de dop los op de buisjes voor de beluchting.

4.2.3. Meng de suspensies voor de ELISA- of PCR-test grondig.

4.2.4. Behandel de bouillon vervolgens op dezelfde manier als de monsters in de boven beschreven tests. NB: Bij een hoge kans op remming van de ophoping van R. solanacearum door grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën levert ophoping van de monsterextracten vóór centrifugering of andere concentratiestappen vaak betere resultaten op.

5. Immunofluorescentiestest (IF-test)

Principe

De IF-test wordt als eerste screeningstest aanbevolen vanwege de aangetoonde robuustheid ten opzichte van de vereiste drempelwaarden.

Wanneer de IF-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede screeningstest een isolatie-, PCR- of FISH-test worden gedaan. Wanneer de IF-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd voor de verdere analyses.

NB: Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugaat, overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. De gevalideerde polyklonale antiserums hebben allemaal een IF-titer van ten minste 1:2 000. Bij het onderzoek moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer.

De test moet worden uitgevoerd op vers bereide monsterextracten. Zo nodig kan de test ook goed worden uitgevoerd op extracten die tussen 68 en 86 °C in glycerol zijn bewaard. De glycerol kan uit het monster worden verwijderd door toevoegen van 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4), 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g en resuspensie in een gelijk volume pelletbuffer. Dit is vaak niet nodig, met name als de monsters op de objectglaasjes worden gefixeerd door ze door de vlam te halen.

Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B), en eventueel in buffervloeistof.

Natuurlijk geïnfecteerd weefsel (geconserveerd door vriesdrogen of invriezen bij –16 tot24 °C) moet zo mogelijk als soortgelijke controle op hetzelfde glaasje worden gebruikt.

Als negatieve controle kunnen aliquots monsterextract worden gebruikt waarbij een eerdere test voor R. solanacearum negatief was.

Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Gebruik microscoopglaasjes met meerdere venstertjes, bij voorkeur tien venstertjes met een diameter van minstens 6 mm.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

5.1. Prepareer de objectglaasjes volgens een van onderstaande procedures:

i) voor pellets met betrekkelijk weinig zetmeelsediment: Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm — vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van een 1:100-verdunning van de geresuspendeerde aardappelpellet op het eerste venstertje. Pipetteer vervolgens eenzelfde volume onverdunde pellet (1/1) op de resterende venstertjes van de rij. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 1.

ii) voor andere pellets: Maak decimale oplossingen (1:10 en 1:100) van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm — vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van de geresuspendeerde pellet en van elke verdunning op een rij venstertjes. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 2.

5.2. Laat de druppels bij kamertemperatuur of door verwarming tot 40-45 °C drogen. Fixeer de bacteriecellen op het glaasje door het te verwarmen (15 minuten op 60 °C), door het door de vlam te halen, met ethanol 95 % of volgens de specifieke aanwijzingen van de leverancier van de antilichamen. Zo nodig kunnen de gefixeerde glaasjes hierna bevroren in een doos met droogmiddel bewaard worden voor verder onderzoek (dit mag niet langer dan nodig en hooguit drie maanden duren).

5.3. IF-procedure i) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 5.1. i): Maak een reeks tweevoudige verdunningen. Het eerste venstertje krijgt een halve titer (T/2) en de volgende een kwart titer (T/4), een halve titer (T/2), een titer (T) en twee titers (2T). ii) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 5.1. ii): Maak de werkverdunning van het antilichaam aan in IF-buffer. De werkverdunning beïnvloedt de specificiteit.



Figuur 1 Prepareren van het objectglaasje volgens 5.1. i) en 5.3. i) Verdunningen van geresuspendeerde pellet 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Verdunning van geresuspendeerde pellet (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Tweevoudige verdunningen van antiserum/antilichaam Monster 1 1 2 3 4 5 Duplo van monster 1, of monster 2 6 7 8 9 10



Figuur 2 Prepareren van het objectglaasje volgens 5.1. ii) en 5.3. ii) Werkverdunning van antiserum/antilichaam 1/1 1/10 1/100 leeg leeg  Decimale verdunning van geresuspendeerde pellet Monster 1 1 2 3 4 5 Duplo van monster 1, of monster 2 6 7 8 9 10 5.3.1. Leg de glaasjes op vochtig tissuepapier. Bedek alle testvenstertjes volledig met antilichaamverdunning. Het op elk venstertje aangebrachte volume antilichaam moet ten minste gelijk zijn aan het volume aangebracht extract. Wanneer de leverancier van de antilichamen geen specifieke aanwijzingen heeft verstrekt, moet de volgende procedure worden gevolgd. 5.3.2. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 °C). 5.3.3. Schud de druppels van elk glaasje af en spoel de glaasjes zorgvuldig met IF-buffer. Was door onderdompeling gedurende 5 minuten in IF-buffer-Tween (aanhangsel 4) en vervolgens in IF-buffer. Vermijd aërosolvorming en druppeloverdracht waardoor kruisbesmetting kan optreden. Verwijder overtollig vocht zorgvuldig door zachtjes af te deppen. 5.3.4. Leg de glaasjes op vochtig papier. Bedek alle venstertjes met de verdunning van het FITC-conjugaat die gebruikt werd om de titer te bepalen. Het volume conjugaat op de venstertjes moet identiek zijn aan het volume antilichaam. 5.3.5. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 °C). 5.3.6. Schud de druppels conjugaat van het glaasje af. Spoel af en was als voorheen (5.3.3). Verwijder overtollig vocht zorgvuldig. 5.3.7. Pipetteer 5-10 µl 0,1 M fosfaatgebufferde glycerol (aanhangsel 4), of een in de handel verkrijgbaar antifading inbedmiddel, op elk venstertje en breng een dekglaasje aan.

5.4. Aflezen van de IF-test 5.4.1 Bekijk de glaasjes met een epifluorescentiemicroscoop die voorzien is van geschikte filters voor excitatie van FITC (olie- of waterimmersie, 500-1 000 ×). Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden. Onderzoek eerst het positieve controleglaasje. De cellen moeten helder fluorescerend en volledig gekleurd zijn bij de bepaalde antilichaamtiter of werkverdunning. De IF-test (VI.A.5) moet herhaald worden bij afwijkende kleuring. 5.4.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende morfologie (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan die van de positieve controlestam bij dezelfde antilichaamverdunning. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden. Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes. 5.4.3. Aan de immunofluorescentietest zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden vaak achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën gevonden die qua grootte en morfologie lijken op R. solanacearum. 5.4.4. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie bij de titer of werkverdunning van de antilichamen zoals aangegeven in punt 5.3. 5.4.5. Interpretatie van de IF-test i) Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 5). De IF-uitslag is positief als het monster ten minste 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat. Het monster wordt als mogelijk besmet aangemerkt en moet nader onderzocht worden. ii) De IF-test is negatief als het monster minder dan 5 × 103 cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat; het monster wordt als negatief aangemerkt. Verder onderzoek is dan niet nodig.

6. Polymerasekettingreactietest (PCR-test)

Principe

Wanneer de PCR-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningstest isolatie of IF worden gedaan. Wanneer PCR als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

Het wordt aangeraden deze methode alleen algemeen als eerste screeningstest te gebruiken als er voldoende gespecialiseerde ervaring mee is opgedaan.

NB: Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten 103-104 cellen/ml R. solanacearum, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden. Er kunnen optimalisatieproeven nodig zijn om in alle laboratoria een maximale gevoeligheid en specificiteit te bereiken.

Gebruik gevalideerde PCR-reagentia en -protocollen (aanhangsel 6). Kies bij voorkeur een methode met een interne controle.

Neem de nodige voorzorgen om contaminatie van het monster met doel-DNA te vermijden. De PCR-test moet worden uitgevoerd door ervaren analisten in speciale moleculair-biologische laboratoria om de kans op contaminatie met doel-DNA tot een minimum te beperken.

Negatieve controles (bij de DNA-extractie en de PCR-procedures) moeten altijd op dezelfde wijze worden behandeld als de uiteindelijke monsters, om na te gaan of er verontreiniging met DNA is opgetreden.

In de PCR-test moeten de volgende negatieve controles worden meegenomen:

— monsterextract waarbij een eerdere test op R. solanacearum negatief was;

— controles met de buffer die bij de extractie van de bacterie en het DNA uit het monster is gebruikt;

— PCR-reactiemix.

Als positieve controles moeten worden genomen:

— aliquots van geresuspendeerde pellets waaraan R. solanacearum is toegevoegd (voor de bereiding zie aanhangsel 3, onder B);

— een suspensie van 106 cellen/ml van R. solanacearum in water uit een virulent isolaat (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3, onder B);

— gebruik zo mogelijk ook DNA dat is geëxtraheerd uit positieve controlemonsters in de PCR-test.

Om contaminatie te vermijden moeten de positieve controles in een andere ruimte worden bereid dan de analysemonsters.

De monsterextracten moeten zoveel mogelijk vrij van grond zijn. Het kan dus soms raadzaam zijn om extracten uit gewassen aardappelen te bereiden als er PCR-protocollen gebruikt zullen worden.

Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

6.1. DNA-zuiveringsmethoden

Gebruik positieve en negatieve controlemonsters zoals hierboven beschreven (aanhangsel 3).

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

Er zijn diverse methoden beschikbaar voor het zuiveren van doel-DNA uit complexe monstersubstraten, waarbij remmers van de PCR en andere enzymatische reacties worden verwijderd en het doel-DNA in het monsterextract wordt geconcentreerd. De volgende methode is geoptimaliseerd voor gebruik met de gevalideerde PCR-methoden als beschreven in aanhangsel 6.

a) Methode volgens Pastrik (2000)

1) Pipetteer 220 µl lysisbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in een eppendorfbuisje van 1,5 ml.

2) Voeg 100 µl monsterextract toe en zet het buisje 10 minuten in een verwarmingsblok of waterbad op 95 °C.

3) Koel het buisje 5 minuten op ijs.

4) Voeg 80 µl lysozym-voorraadoplossing (50 mg lysozym per ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C.

5) Voeg 220 µl Easy DNA® solution A (Invitrogen) toe, vortex grondig en incubeer 30 minuten bij 65 °C.

6) Voeg 100 µl Easy DNA® solution B (Invitrogen) toe, vortex krachtig tot het neerslag vrij in het buisje beweegt en het monster gelijkmatig viskeus is.

7) Voeg 500 µl chloroform toe en vortex tot de viscositeit afneemt en het mengsel homogeen is.

8) Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 °C om de fasen te scheiden en de interfase te vormen.

9) Breng de bovenste fase over in een schoon eppendorfbuisje.

10) Voeg 1 ml ethanol 100 % (20 °C) toe, vortex kort en incubeer 10 minuten op ijs.

11) Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 °C en verwijder de ethanol van de pellet.

12) Voeg 500 µl ethanol 80 % (20 °C) en meng door het buisje om te keren.

13) Centrifugeer 10 minuten bij 15 000 g en 4 °C, bewaar de pellet en verwijder de ethanol.

14) Droog de pellet aan de lucht of in een DNA Speed Vac.

15) Resuspendeer de pellet in 100 µl steriel UPW en laat minstens 20 minuten bij kamertemperatuur staan.

16) Bewaar bij 20 °C voor de PCR.

17) Draai eventueel aanwezig wit neerslag af in een centrifuge en gebruik 5 µl van de bovenstaande vloeistof, die het DNA bevat, voor de PCR.

b) Andere methoden

Er kunnen andere DNA-extractiemethoden (bv. Qiagen DNeasy Plant Kit) worden gebruikt, mits die even doeltreffend blijken te zijn bij het zuiveren van DNA uit controlemonsters met 103-104 pathogene cellen/ml.

6.2. PCR

6.2.1. Bereid analyse- en controletemplates voor de PCR volgens de gevalideerde protocollen (VI.A.6). Bereid een tienvoudige verdunning van monster-DNA-extract (1:10 in UPW).

6.2.2. Bereid de geschikte PCR-reactiemix in een contaminatievrije omgeving volgens de gepubliceerde protocollen (aanhangsel 6). Gebruik zo mogelijk een multiplex-PCR-protocol met interne PCR-controle.

6.2.3. Voeg volgens de PCR-protocollen in steriele PCR-buisjes 2-5 µl DNA-extract toe per 25 µl PCR-reactiemix (aanhangsel 6).

6.2.4. Neem ook een negatief controlemonster mee met alleen PCR-reactiemix; voeg hieraan in plaats van het monster UPW toe uit dezelfde bron als in de PCR-mix is gebruikt.

6.2.5. Zet de buisjes in hetzelfde PCR-apparaat als voor de voorbereidende tests is gebruikt en werk het geoptimaliseerde PCR-programma af (aanhangsel 6).

6.3. Analyse van het PCR-product

6.3.1. Scheid de amplicons met behulp van agarosegelelektroforese. Laat minimaal 12 µl geamplificeerd DNA-reactiemengsel van elk monster, gemengd met 3 µl laadbuffer (aanhangsel 6), lopen in 2,0 % (m/V) agarosegels in TAE-buffer (Tris-acetaat-EDTA, aanhangsel 6) bij 5-8 V/cm. Gebruik een geschikte DNA-marker, bv. 100 bp ladder.

6.3.2. Maak de DNA-banden zichtbaar door kleuring met ethidiumbromide (0,5 mg/l) gedurende 30-60 minuten. Deze stof is mutageen – neem de nodige voorzorgen in acht.

6.3.3. Onderzoek de gekleurde gel door transilluminatie met kortgolvig UV (λ = 302 nm) op geamplificeerde PCR-producten van de verwachte lengte (aanhangsel 6) en leg het resultaat vast.

6.3.4. Ga bij alle nieuwe bevindingen/gevallen na of het PCR-amplicon authentiek is met behulp van een restrictie-enzymanalyse op een monster van het resterende geamplificeerde DNA door dat bij de optimale temperatuur en gedurende de optimale tijd met een geschikt enzym en geschikte buffer (aanhangsel 6) te incuberen. Scheid de verkregen fragmenten met behulp van agarosegelelektroforese zoals hierboven beschreven; bekijk het karakteristieke restrictiefragmentpatroon onder UV-transilluminatie na kleuring met ethidiumbromide en vergelijk dit met de niet-gedigesteerde en de gedigesteerde positieve controle.

Interpretatie van het resultaat van de PCR-test

De PCR-test is negatief als er geen R. solanacearum-specifiek PCR-amplicon van de verwachte lengte wordt aangetroffen in het analysemonster, maar wel in alle positieve controlemonsters (bij multiplex-PCR met plantspecifieke interne controleprimers moet er een tweede PCR-product van de verwachte lengte met het analysemonster geamplificeerd zijn).

De PCR-test is positief als het R. solanacearum-specifieke PCR-amplicon van de verwachte lengte en met het verwachte restrictiepatroon (indien nodig) wordt aangetoond, mits dit niet in een van de negatieve controlemonsters geamplificeerd is. Een positief resultaat kan ook op betrouwbare wijze worden bevestigd door de test met een tweede set PCR-primers te herhalen (aanhangsel 6).

NB: Als het verwachte amplicon wel bij het positieve controlemonster met R. solanacearum in water wordt verkregen, maar niet bij de positieve controles met R. solanacearum in aardappelextract, is remming van de PCR waarschijnlijk de oorzaak. Bij multiplex-PCR-protocollen met interne PCR-controles is er waarschijnlijk sprake van remming als geen van beide amplicons worden verkregen.

Er moet aan contaminatie worden gedacht als het verwachte amplicon in een of meer van de negatieve controles wordt gevonden.

7. Fluorescentie-in-situ-hybridisatietest (FISH-test)

Principe

Wanneer de FISH-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningstest een isolatie- of IF-test worden gedaan. Wanneer de FISH-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

NB: Gebruik gevalideerde, R. solanacearum-specifieke oligo-probes (aanhangsel 7). Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten minstens 103-104 cellen van R. solanacearum per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden.

De onderstaande procedure wordt bij voorkeur uitgevoerd op vers bereid monsterextract maar kan ook goed worden uitgevoerd op monsterextract dat in glycerol bewaard is tussen 16 en 24 °C of 68 en 86 °C.

Als negatieve controle worden aliquots monsterextract gebruikt waarbij eerdere tests op R. solanacearum negatief waren.

Als positieve controle worden suspensies bereid met 105-106 cellen/ml R. solanacearum biovar 2 (bv. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3) in 0,01 M fosfaatbuffer (PB) van een drie- tot vijfdaagse cultuur. Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B).

Het gebruik van de FITC-gelabelde eubacteriële oligo-probe kan als controle voor het hybridisatieproces dienen, omdat hierdoor alle eubacteriën in het monster gekleurd worden.

Zie aanhangsel 3, onder A, voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

7.1. Fixatie van het aardappelextract

Het volgende protocol is gebaseerd op Wullings e.a. (1998):

7.1.1. Bereid het fixatief (aanhangsel 7).

7.1.2. Pipetteer 100 µl van elk monsterextract in een eppendorfbuisje en centrifugeer 7 minuten bij 7 000 g.

7.1.3. Verwijder de bovenstaande vloeistof en los de pellet op in 200 µl korter dan 24 uur tevoren bereid fixatief. Vortex en incubeer 1 uur in de koelkast.

7.1.4. Centrifugeer 7 minuten bij 7 000 g, schenk de bovenstaande vloeistof af en resuspendeer de pellet in 75 µl 0,01 M PB (aanhangsel 7).

7.1.5. Breng 16 µl van de gefixeerde suspensies op een schoon objectglaasje met venstertjes zoals aangegeven in figuur 7.1. Breng twee verschillende monsters op het glaasje, onverdund en in een 1:100-verdunning (gebruik hiervoor 10 µl in 0,01 M PB). De resterende monsteroplossing (49 µl) kan na toevoeging van eenzelfde volume ethanol 96 % bij 20 °C worden bewaard. Als de FISH-test herhaald moet worden, wordt de ethanol door centrifugeren verwijderd en een gelijk deel 0,01 M PB toegevoegd en door vortexen gemengd.



Figuur 7.1 Overzicht van het FISH-glaasje Monster 1 Blanco Blanco Blanco Monster 2 venster 1 venster 2 venster 3 venster 4 venster 5 Monster 1 Blanco Blanco Blanco Monster 2 venster 6 venster 7 venster 8 venster 9 venster 10 Dekglaasje 1 Dekglaasje 2

7.1.6. Droog de glaasjes aan de lucht (of op een droger bij 37 °C) en fixeer ze door ze door de vlam te halen. Op dit punt kan de procedure worden onderbroken om de volgende dag verder te gaan met de hybridisatie. De objectglaasjes moeten stofvrij en droog bij kamertemperatuur worden bewaard.

7.2. Hybridisatie

7.2.1. Dehydrateer de cellen in een ethanolreeks (50 %, 80 %, 96 %, telkens 1 minuut). Droog de glaasjes aan de lucht in een houder.

7.2.2. Maak een vochtige incubatiekamer door de bodem van een luchtdicht vat te bedekken met tissue- of filtreerpapier, doordrenkt met 1× hybmix (aanhangsel 7). Pre-incubeer het vat in de hybridisatieoven gedurende ten minste 10 minuten bij 45 °C.

7.2.3. Breng 10 µl hybridisatieoplossing (aanhangsel 7) aan op acht venstertjes (1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 en 10; figuur 7.1) van elk glaasje en laat de twee middelste venstertjes (3 en 8) blanco.

7.2.4. Leg zonder lucht in te sluiten een dekglaasje (24 × 24 mm) op de eerste en laatste vier venstertjes. Zet de objectglaasjes in de voorverwarmde incubatiekamer en hybridiseer 5 uur in de oven in het donker bij 45 °C.

7.2.5. Bereid drie bekerglazen met 1 l Milli Q (water van moleculair-biologische kwaliteit), 1 l 1X hybmix (334 ml 3× hybmix en 666 ml Milli Q) en 1 l 1/8× hybmix (42 ml 3× hybmix en 958 ml Milli Q). Pre-incubeer elk bekerglas in een waterbad bij 45 °C.

7.2.6. Verwijder de dekglaasjes van de objectglaasjes en doe de objectglaasjes in een houder.

7.2.7. Verwijder de overmaat probe door 15 minuten bij 45 °C te incuberen in het bekerglas met 1X hybmix.

7.2.8. Zet de houder in de 1/8X hybmix (wasoplossing) en incubeer nogmaals 15 minuten.

7.2.9. Dompel de objectglaasjes even in Milli Q en leg ze op filtreerpapier. Verwijder overtollige vloeistof door het oppervlak voorzichtig met filtreerpapier te bedekken. Pipetteer 5-10 μl antifading inbedmiddel (bv. Vectashield van Vecta Laboratories, CA, USA of gelijkwaardig) op elk venstertje en leg een groot dekglaasje (24 × 60 mm) op het objectglaasje.

7.3. Aflezen van de FISH-test

7.3.1. Bekijk de objectglaasjes onmiddellijk met een microscoop die geschikt is voor epifluorescentiemicroscopie bij een vergroting van 630 of 1 000 × en olie-immersie. Met een filter dat geschikt is voor fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) lichten eubacteriële cellen (waaronder de meeste gramnegatieve cellen) in het monster groen op. Met een filter voor tetramethylrodamine-5-isothiocyanaat lichten Cy3-gekleurde cellen van R. solanacearum rood op. Vergelijk de celmorfologie met die van de positieve controles. De cellen moeten helder fluoresceren en volledig gekleurd zijn. Bij afwijkende kleuring moet de FISH-test herhaald worden (VI.A.7). Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden.

7.3.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende morfologie (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan, of beter dan, die van de positieve controlestam. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden.

7.3.3. Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes.

7.3.4. Aan de FISH-test zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden soms, maar veel minder vaak dan bij de IF-test, achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën waargenomen die qua grootte en morfologie lijken op R. solanacearum.

7.3.5. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie.

7.3.6. Interpretatie van het resultaat van de FISH-test i) De resultaten van de FISH-test zijn valide als in alle positieve controles en in geen van de negatieve controles met het FITC-filter heldergroen fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum karakteristieke grootte en morfologie worden waargenomen en met het rodaminefilter helderrood fluorescerende cellen. Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 4). Monsters met ten minste 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als mogelijk besmet aangemerkt. Er is dan verder onderzoek nodig. Monsters met minder dan 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als negatief aangemerkt. ii) De FISH-test is negatief als met het rodaminefilter geen helderrood fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende grootte en morfologie worden waargenomen, mits die met dat filter wel in de positieve controlepreparaten zijn waargenomen.

8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-tests

Principe

ELISA mag wegens de relatief lage gevoeligheid alleen als facultatieve test naast IF, PCR of FISH worden gebruikt. Bij de DAS-ELISA-test zijn ophoping en monoklonale antilichamen verplicht (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Voorafgaande ophoping van de monsters kan de gevoeligheid van ELISA verhogen, maar dit mislukt soms wegens concurrentie van andere organismen in het monster.

NB: Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt conjugaat met het tweede antilichaam overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. Bij het onderzoek moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer van de commerciële formulering.

Bepaal de titer van de antilichamen op een suspensie van 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum.

Gebruik als negatieve controle een monsterextract waarbij eerdere tests op R. solanacearum negatief waren en een suspensie van een niet-kruisreagerende bacterie in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

Gebruik als positieve controle aliquots monsterextract waarbij eerdere tests negatief waren, gemengd met 103-104 cellen/ml van R. solanacearum biovar 2 (bv. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3, onder A en B). Gebruik een standaardsuspensie van 105-106 cellen/ml van R. solanacearum in PBS om de resultaten op elke plaat te vergelijken.

Zie aanhangsel 3, onder A, voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

Er zijn twee gevalideerde ELISA-protocollen.

a) Indirecte ELISA (Robinson-Smith e.a. (1995))

1) Gebruik aliquots van 100-200 µl monsterextract. (Soms worden niet-specifieke resultaten gereduceerd door 4 minuten verwarming bij 100 °C in een waterbad of verwarmingsblok.)

2) Voeg een gelijk volume coatingbuffer van dubbele sterkte toe (aanhangsel 4) en vortex.

3) Doe telkens 100 µl in ten minste twee putjes van een microtiterplaat (bv. Nunc-Polysorp of gelijkwaardig) en incubeer 1 uur bij 37 °C of overnacht bij 4 °C.

4) Schud het extract uit de putjes. Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4) en laat de laatste spoelvloeistof minstens 5 minuten in de putjes.

5) Bereid de benodigde verdunning van antilichamen tegen R. solanacearum in blokkeerbuffer (aanhangsel 4). Gebruik de aanbevolen verdunningen voor gevalideerde in de handel verkrijgbare antilichamen (doorgaans tweemaal de titerconcentratie).

6) Doe 100 µl in elk putje en incubeer 1 uur bij 37 °C.

7) Schud de antilichaamoplossing uit de putjes en spoel zoals onder 4.

8) Bereid in blokkeerbuffer de benodigde verdunning conjugaat (tweede antilichaam met alkalische fosfatase). Doe 100 µl in elk putje en incubeer 1 uur bij 37 °C.

9) Schud het conjugaat uit de putjes en spoel als onder 4.

10) Doe 100 µl oplossing van alkalischefosfatasesubstraat (aanhangsel 4) in elk putje. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en lees gedurende 90 minuten periodiek de extinctie bij 405 nm af.

b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA

1) Bereid de benodigde verdunning van polyklonale immunoglobulines tegen R. solanacearum in coatingbuffer (pH 9,6) (aanhangsel 4). Doe 200 µl in elk putje. Incubeer 4-5 uur bij 37 °C of 16 uur bij 4 °C.

2) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4). Doe in ten minste twee putjes 190 µl monsterextract. Doe in telkens twee putjes per plaat ook een positieve en een negatieve controle. Incubeer 16 uur bij 4 °C.

3) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).

4) Bereid een geschikte verdunning van specifieke monoklonale antilichamen tegen R. solanacearum in PBS (aanhangsel 4) met 0,5 % bovien serumalbumine (BSA) en doe 190 µl in elk putje. Incubeer 2 uur bij 37 °C.

5) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).

6) Bereid een geschikte verdunning van conjugaat van anti-muis-immunoglobulines met alkalische fosfatase in PBS. Doe 190 µl in elk putje. Incubeer 2 uur bij 37 °C.

7) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).

8) Bereid een oplossing van alkalischefosfatasesubstraat met 1 mg p-nitrofenylfosfaat per ml substraatbuffer (aanhangsel 4). Doe 200 µl in elk putje. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en lees gedurende 90 minuten periodiek de extinctie bij 40 nm af.

Interpretatie van de ELISA-testresultaten

De ELISA-test is negatief als de gemiddelde optische dichtheid (OD) in de duplomonsterputjes kleiner is dan 2 × OD in het putje met de negatieve monsterextractcontrole, mits de OD voor de positieve controles altijd groter is dan 1,0 (na 90 minuten incubatie met substraat) en groter is dan 2 × OD voor de negatieve monsterextracten.

De ELISA-test is positief als de gemiddelde OD in de duplomonsterputjes groter is dan 2 × OD voor het negatieve monsterextract, mits de OD in elk putje voor negatieve controle kleiner is dan 2 × OD voor de positieve controles.

Negatieve ELISA-aflezingen in putjes voor positieve controle wijzen op een slechte uitvoering of op remming van de test. Positieve ELISA-aflezingen in putjes voor negatieve controle wijzen op kruisbesmetting of niet-specifieke antilichaambinding.

9. Bioassay

NB: Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten 103-104 kolonievormende eenheden R. solanacearum per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden (voor de bereiding zie aanhangsel 3).

De grootste detectiegevoeligheid wordt verkregen met vers bereid monsterextract en optimale groeicondities. De methode kan echter ook goed worden toegepast op extracten die tussen 68 en 86 °C in glycerol zijn bewaard.

Het volgende protocol is gebaseerd op Janse (1988).

9.1. Neem voor elk monster tien testplanten van een vatbaar tomatenras (bv. Moneymaker of een door het testlaboratorium even vatbaar bevonden ras) in het volgroeid 3-bladstadium. Voor nadere bijzonderheden over de teelt zie aanhangsel 8. Aubergines (bv. Black Beauty of een even vatbaar ras) in het 2- tot volgroeid 3-bladstadium kunnen ook worden gebruikt. De symptomen zijn bij aubergines minder ernstig en ontwikkelen zich trager. Gebruik daarom zo mogelijk tomatenplanten.

9.2. Verdeel 100 µl monsterextract over de testplanten. 9.2.1. Injectie-inoculatie Inoculeer de stengels net boven de zaadlobben met een injectiespuit voorzien van een hypodermische naald (minimaal 23G). Verdeel het monster over de testplanten. 9.2.2. Snede-inoculatie Houd de plant tussen twee vingers en pipetteer een druppel (5-10 µl) gesuspendeerde pellet op de stengel tussen de zaadlobben en het eerste blad. Maak met een steriel scalpel vanaf de pelletdruppel een diagonale snede van ongeveer 1,0 cm lang en ongeveer 2/3 van de stengeldikte diep. Stop de snede dicht met steriele vaseline uit een injectiespuit.

9.3. Inoculeer met dezelfde techniek vijf zaailingen met een waterige suspensie van 105-106 cellen/ml, bereid uit een 48 uur oude kweek van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 als positieve controle en met pelletbuffer (aanhangsel 4) als negatieve controle. Houd de positieve en negatieve controleplanten gescheiden van de andere om kruisbesmetting te vermijden.

9.4. Teelt de testplanten maximaal vier weken in quarantaine bij 25-30 °C en hoge luchtvochtigheid met aangepaste bewatering zodat geen oververzadiging of verwelking optreedt. Incubeer positieve en negatieve controleplanten op van elkaar gescheiden plaatsen in een broeikas of groeikamer om contaminatie te vermijden; is dat wegens ruimtegebrek niet mogelijk, zorg er dan voor dat de verschillende behandelingen strikt gescheiden gehouden worden. Als planten voor verschillende monsters dicht bij elkaar geïncubeerd moeten worden, moeten ze met geschikte schermen gescheiden gehouden worden. Bij het bemesten, bewateren en onderzoeken en bij alle overige handelingen moet de uiterste zorg in acht genomen worden om kruisbesmetting te vermijden. De kassen en groeikamers moeten absoluut vrij van insecten gehouden worden, aangezien die de bacterie van het ene monster naar het andere kunnen overbrengen. Let op symptomen van verwelking, epinastie, chlorose en/of verminderde groei.

9.5. Isoleer reinculturen die vermoedelijk uit R. solanacearum bestaan uit geïnfecteerde planten (II.3) en identificeer ze (VI. B).

9.6. Als na drie weken geen symptomen zijn waargenomen, voer dan een IF-, PCR- of isolatietest uit op een samengesteld monster van stengeldelen van 1 cm lang van elke testplant, die boven de inoculatieplaats zijn afgesneden. Als de test positief is, verdunnen en uitplaten (4.1).

9.7. Identificeer eventuele reinculturen die vermoedelijk uit R. solanacearum bestaan (VI. B).

De met de bioassay verkregen resultaten zijn valide als de planten van de positieve controle karakteristieke symptomen vertonen, de bacteriën weer uit deze planten geïsoleerd kunnen worden en op de negatieve controles geen symptomen worden gevonden. De bioassay is negatief als de testplanten niet met R. solanacearum geïnfecteerd zijn, mits R. solanacearum in de positieve controles wel wordt gedetecteerd. De bioassay is positief als de testplanten wel met R. solanacearum geïnfecteerd zijn.

B. IDENTIFICATIETESTS

Identificeer reinculturen van vermoedelijke R. solanacearum-isolaten aan de hand van ten minste twee van de volgende, op verschillende biologische principes gebaseerde tests.

Voorzover van toepassing moet elke test ook worden uitgevoerd op bekende referentiestammen (aanhangsel 3).

1. Voedingstests en enzymatische identificatietests

Bepaal de volgende fenotypische eigenschappen, die universeel aan