1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B ACHTSTE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 15 juni 1978
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van
diervoeders
(78/633/EEG)
(PB L 206 van 29.7.1978, blz. 43)
Gerectificeerd bij:
►C1Rectificatie PB L 232 van 24.8.1978, blz. 11 (78/633/EEG)
▼B
ACHTSTE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE
van 15 juni 1978
houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden
voor de officiële controle van diervoeders
(78/633/EEG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische
Gemeenschap,
Gelet op de Richtlijn 70/373/EEG van de Raad van 20 juli 1970 betref-
fende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- enanalysemethoden voor de officiële controle van veevoeders(
1), laatste-
lijk gewijzigd bij de Toetredingsakte inzonderheid op artikel 2,
Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële
controle van diervoeders, welke ertoe strekt na te gaan of aan de op
grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake de
kwaliteit en de samenstelling van diervoeders gestelde eisen is voldaan,geschiedt volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden;
Overwegende dat bij de volgende Richtlijnen van de Commissie 71/
250/EEG van 15 juni 1971(
2), 71/393/EEG van 18 november 1971(3),
72/199/EEG van 27 april 1972(4), 73/46/EEG van 5 december 1972(5),
74/203/EEG van 25 maart 1974(6), 75/84/EEG van 20 december
1974(7) en 76/372/EEG van 1 maart 1976(8) reeds een zeker aantal
gemeenschappelijke analysemethoden is vastgesteld; dat het gezien devorderingen welke de werkzaamheden sindsdien hebben gemaakt, dien-stig is een achtste reeks methoden vast te stellen;
Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeen-
stemming zijn met het advies van het Permanent Comité voordiervoeders,
HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:
Artikel 1
1. De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële
controle van diervoeders ten aanzien van hun gehalte aan zinkbacitra-cine, flavofosfolipol, ijzer, koper, mangan en zink geschieden volgens
de in de bijlage van deze richtlijn omschreven methoden.
2. De algemene bepalingen van deel 1 „Inleiding” van de bijlage
van de Eerste Richtlijn 71/250/EEG, met uitzondering van het gedeeltebetreffende de voorbereiding van het analysemonster, zijn toepasselijkop de in de bijlage van deze richtlijn beschreven methoden.
Artikel 2
De Lid-Staten doen op 1 januari 1979 de nodige wettelijke of bestuurs-
rechtelijke bepalingen in werking treden, die nodig zijn om aan deze
richtlijn te voldoen en stellen de Commissie daarvan onverwijld inkennis.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 2
(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.
(2) PB nr. L 155 van 12. 7. 1971, blz. 13.
(3) PB nr. L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.
(4) PB nr. L 123 van 29. 5. 1972, blz. 6.
(5) PB nr. L 83 van 30. 3. 1973, blz. 21.
(6) PB nr. L 108 van 22. 4. 1974, blz. 7.
(7) PB nr. L 32 van 5. 2. 1975, blz. 26.
(8) PB nr. L 102 van 15. 4. 1976, blz. 8.
▼B
Artikel 3
Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 3
▼B
BIJLAGE
1.BEPALING VAN ZINKBACITRACINE — DOOR MIDDEL VAN
AGARDIFFUSIE
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Met deze methode kan zinkbacitracine in diervoeders, concentraten en
voormengsels worden bepaald. De ondergrens van de bepaling ligt bij
5 mg/kg (5 ppm)(*). De methode is ongeldig indien storende stoffen
aanwezig zijn, in het bijzonder grote hoeveelheden koper of acorbine-
zuur.
2. PRINCIPE
Het monster wordt bij pH 2 geëxtraheerd met een mengsel van
methanol, water en zoutzuur. Het extract wordt op pH 6,5 gebracht,
zonodig geconcentreerd en (eventueel daarna) verdund. Hierna wordt
de antibiotische activiteit bepaald door meting van de diffusie van
zinkbacitracine in een agarvoedingsbodem, die geënt is met Micro-
coccus luteus (Syn.: M. flavus). De diffusie wordt zichtbaar door de
vorming van groeiremmingszones van het microörganisme. De diameter
van deze remzones wordt geacht recht evenredig te zijn met de loga-
rithme van de antibioticumconcentratie binnen het gebruikte
concentratiegebied.
3. MICROÖRGANISME: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1.Bewaren van de stam
Buizen met schuingestolde voedingsbodem (4.1) worden geënt met
Micrococcus luteus, en na 24 uur bebroeden bij 30—37 ºC bewaard in
de koelkast bij ca. 4 ºC. Alle twee weken wordt opnieuw overgeënt.
3.2.Bereiding van de entsuspensie (a)
Een vers bereide cultuur in een agarbuisje (3.1) wordt gesuspendeerd in
2 à 3 ml zoutoplossing (4.3). Met deze suspensie wordt het oppervlak
beënt van 250 ml in een Roux-fles gestolde voedingsbodem (4.1), die
daarna 18—20 uur bebroed wordt bij 30—37 ºC. Neem de cultuur op
in 25 ml zoutoplossing (4.3) en homogeniseer. Verdun de suspensie op
1/10 met zoutoplossing (4.3). De lichttransmissie van de suspensie moet
ongeveer 75 % zijn, wanneer bij 650 nm in een cuvet van 1 cm
gemeten wordt in vergelijking met zoutoplossing (4.3).
4. VOEDINGSBODEMS EN REAGENTIA
4.1.Voedingsbodem voor het voortkweken van de stam (b)
Pepton uit vlees 6,0 g
Trypton 4,0 gGistextract 3,0 g
Vleesextract 1,5 g
Glucose 1,0 gAgar-agar 15,0 g
Water 1 000 ml
pH 6,5—6,6 (na sterilisatie).
4.2.Voedingsbodem voor de metingen (
b)
Trypton 10,0 g
Gistextract 3,0 g
Vleesextract 1,5 gGlucose 1,0 g
Agar-agar 20,0 g
Tween 80 1 mlWater 1 000 ml
pH 6,5 (na sterilisatie).
4.3. Zoutoplossing 0,8 % (g/v): los 8 g natriumchloride p.a. op in water,
verdun tot 1 000 ml en steriliseer.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 4
(*) 1 mg zinkbacitracine (diervoederkwaliteit) wordt gedefinieerd als een hoeveelheid die
42 internationale eenheden bevat (IE).
(a) Andere methoden kunnen gebruikt worden voor zover is bewezen dat zij overeenkom-
stige bacteriesuspensies geven.
(b) Elke handelsvoedingsbodem van vergelijkbare samenstelling, die dezelfde resultaten
geeft, kan gebruikt worden.
▼B
4.4. Mengsel van zuivere methanol/water/zoutzuur p.a. (d: 1,18—1,19): 80/
17,5/2,5 (v/v/v).
4.5.Fosfaatbuffer, pH 6,5
Dikaliumfosfaat K2HPO4p.a. 22,15 g
Monokaliumfosfaat KH2PO4p.a. 27,85 g
Water tot 1000 ml.
4.6. Zoutzuur p.a., s.g.: 1,18—1,19.
4.7. Zoutzuur p.a. 0,1 N.4.8. Natriumhydroxyde p.a. 1 N.
4.9. 0,04 % broomkresolpurperoplossing (w/v): los 0,1 g broomkresolpurper
op in 18,5 ml 0,01 N natriumhydroxyde. Vul aan tot 250 ml met water
en meng goed.
4.10. Standaard: zinkbacitracine met bekende activiteit (in IE).
5. STANDAARDOPLOSSINGEN
Weeg een hoeveelheid zinkbacitracine standaard (4.10) af, die overeen-
komt met 1 050 IE (volgens het aangegeven gehalte). Voeg 5 ml 0,1 N
zoutzuur (4.7) toe en laat 15 minuten staan. Voeg 30 ml water toe,
breng de pH op 4,5 met fosfaatbuffer pH 6,5 (4.5) (ca. 4 ml), vul aan
tot 50 ml met water en meng goed (1 ml = 21 IE).
Bereid, door verder verdunnen van deze oplossing en door successief
verdunnen met fosfaatbuffer pH 6,5 (4.5) de volgende oplossingen:
S
80,42 IE/ml
S40,21 IE/ml
S20,105 IE/ml
S10,0525 IE/ml.
6. BEREIDING VAN HET EXTRACT
6.1.Extractie
6.1.1. Concentraten, voormengsels en mineraalmengsels
Weeg een hoeveelheid monster van 2,0 tot 5,0 g af, voeg 30 ml
mengsel (4.4) toe en schud kort. Controleer pH (moet ongeveer 2
zijn). Schud 10 minuten, voeg 30 ml fosfaatbuffer pH 6,5 (4.5) toe en
schud 15 minuten. Verdun met fosfaatbuffer (4.5) tot een aangenomen
gehalte van 0,42 IE/ml is verkregen (= U8).
6.1.2 Eiwitconcentraten
Weeg een hoeveelheid monster van 10,0 g af, voeg 50 ml mengsel (4.4)
toe en schud kort. Controleer of de pH ca. 2 is. Schud 10 minuten, voeg
50 ml fosfaatbuffer pH 6,5 (4.5) toe en schud 15 minuten. Verdun met
fosfaatbuffer (4.5) tot een aangenomen zinkbacitracinegehalte van
0,42 IE/ml verkregen is (=U8).
6.1.3. Andere voeders
Weeg een hoeveelheid monster van 10,0 g af (20,0 g bij een aange-
nomen gehalte aan zinkbacitracine van 5 mg/kg), voeg 25 ml mengsel
(4.4) toe en homogeniseer gedurende ongeveer 10 minuten. Voeg 25 ml
fosfaatbuffer pH 6,5 (4.5) toe, schud 15 minuten en centrifugeer. Neem
20,0 ml van de bovenstaande vloeistof en breng de pH op 6,5 met 1 N
natriumhydroxyde (4.8) met broomkresolpurperoplossing (4.9) als indi-
cator. Damp tot ca. 4 ml in, in een rotatieverdamper bij een temperatuur
van ten hoogste 35 ºC. Verdun het residu met water tot een aange-
nomen zinkbacitracinegehalte van 0,42 IE ml bereikt is (= U8)
6.2.Verdunningen van het extract
Bereid, uitgaande van U8, door successieve verdunningen (1 + 1) met
fosfaatbuffer (4.5), de oplossingen U4(aangenomen gehalte 0,21 IE/
ml), U2(aangenomen gehalte 0,105 IE/ml) en U1(aangenomen gehalte
0,0525 IE/ml).
7. Uitvoering van de bepaling
7.1.Enten van de voedingsbodem
Beënt bij ca. 50 ºC de voedingsbodem (4.2) met de bacteriesuspensie
(3.2). Door voorproeven met platen met voedingsbodem (4.2) dient
men de hoeveelheid bacteriesuspensie te bepalen die bij de verschil-1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 5
▼B
lende concentraties zinkbacitracine zo groot mogelijke remzones geeft,
die toch nog scherp zijn.
7.2.Gereedmaken van de platen
De agardiffusie vindt plaats in platen waarop de vier standaard concen-
traties (S8,S4,S2en S1) voorkomen en de vier extractconcentraties (U8,
U4,U2en U1). Elke plaat moet beslist alle vier concentraties van stan-
daard en extract bevatten. Daarom moet de afmeting van de platen zo
gekozen worden dat men in de agarvoedingsbodem ten minste 8 gaatjes
kan ponsen van 10 tot 13 mm diameter, waarvan de middelpunten niet
minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. Als platen kan men
vlakke glazen platen gebruiken, waarop aluminium of plastic ringen
van 200 mm diameter en 20 mm hoogte gezet worden.
Giet in de platen een hoeveelheid voedingsbodem (4.2), die geënt is als
aangegeven in 7.1, die een laagdikte van ca. 2 mm geeft (50 ml voor
een plaat van 200 mm diameter). Laat de voedingsbodem stollen, pons
er de gaatjes in en plaats er de exact afgemeten hoeveelheden van stan-
daard en extract in (0,10 tot 0,15 ml per gaatje afhankelijk van de
diameter).
Breng iedere concentratie ten minste in viervoud aan, zodat iedere
bepaling als grondslag voor de berekening 32 remzones heeft.
7.3.Bebroeding
Bebroed de platen 16—18 uur bij ca 30 ºC.
8. METING EN BEREKENING
Meet de diameter van de remzones tot 0,1 mm nauwkeurig. Zet voor
elke concentratie de gemiddelde waarden op semilogarithmisch papier
uit, zodanig dat de logarithme van de concentraties tegen de diametervan de remzones komt te staan. Trek de best passende lijnen voor stan-
daard en extract en ga daarbij, bij voorbeeld, als volgt te werk.
Bepaal het meest passende punt voor de laagste standaardwaarde (SL)
volgens de formule:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Bepaal het meest passende punt voor de hoogste standaardwaarde (SH)
volgens de formule:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Bepaal op dezelfde wijze de meest passende punten voor de laagste
extractwaarde (UL) en de hoogste extractwaarde (UH) door in boven-
staande formules S1,S2,S4en S8door U1,U2,U4en U8te vervangen.
Vul de waarden SL en SH in dezelfde grafiek in. Door deze twee
punten te verbinden krijgt men de meest passende rechte voor de stan-
daardoplossing. Op dezelfde wijze verkrijgt men met UL en UH de
meest passende rechte voor het extract.
Wanneer er geen enkele storing, is, moeten de rechten evenwijdig zijn.
►C1In de praktijk kunnen de rechten als evenwijdig worden
beschouwd wanneer (SH — SL) en (UH — UL) niet meer dan 10 %
van hun gemiddelde afwijken. ◄
Als de rechten niet evenwijdig zijn, kan men hetzij U1en S1, hetzij U8en S8uitsluiten. De waarden SL, SH, UL en UH waarmee men dan de
meest passende rechten kan trekken worden dan berekendvolgens de
volgende formules:
(a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6of5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6of5S8þ2S4/C0S2
6
en analoge formules voor UL en UH. De met deze alternatieve
formules getrokken rechten moeten ook op evenwijdigheid onderzocht
worden, zoals boven aangegeven. Wanneer het resultaat uit drie niveaus
berekend is moet dit op het analysecertificaat vermeld worden.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 6
▼B
Wanneer de rechten alsevenwijdig bes chouwd kunnen worden, wordt
de logarithme van de relatieve activiteit (log A) berekend volgens een
van de volgende formules:
Voor 4 niveaus
(c) log A ¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Voor 3 niveaus
(d) log AU1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
of
(d) log AU2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Werkelijke activiteit = aangenomen activiteit × relatieve activiteit.
Wanneer de rechten niet alsevenwijdig bes chouwd kunnen worden,
moet men de bepaling herhalen. Wanneer het dan nog steeds niet lukt
evenwijdige rechten te verkrijgen, moet men de logarithme van de rela-
tieve activiteit (log A) berekenen met formule (c). Het resultaat moet
dan echter beschouwd worden als een benadering en dat moet op het
analysecertificaat vermeld worden.
9. HERHAALBAARHEID
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen op hetzelfde
monster uitgevoerd door dezelfde analyst zou niet groter mogen zijn
dan:
20 % van de hoogste waarde voor zinkbacitracinegehaltes van 5 tot
25 mg/kg,
5 mg/kg, in absolute waarde, voor gehaltes boven 25 mg/kg en tot
50 mg/kg,
10 % van de hoogste waarde voor gehaltes boven 50 mg/kg.
2.BEPALING VAN FLAVOFOSFOLIPOL — DOOR MIDDEL VAN
AGARDIFFUSIE
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Met deze methode kan flavofosfolipol in diervoeders, concentraten en
voormengsels worden bepaald. De ondergrens van de bepaling ligt bij
1 mg/kg (1 ppm).
2. PRINCIPE
Het monster wordt geëxtraheerd door koken met verdunde methanol
onder een terugvloeikoeler. Na centrifugeren wordt het extract zo nodig
gezuiverd met een ionenwisselaar en verdund. Hierna wordt de antibio-
tische activiteit bepaald door meting van de diffusie van flavofosfolipol
in een agarvoedingsbodem, die geënt is met Staphyloccocus aureus. De
diffussie wordt zichtbaar door de vorming van groeiremmingszones van
het microörganisme. De diameter van deze remzones wordt geacht
evenredig te zijn met de logarithme van de antibioticumconcentratie
binnen het gebruikte concentratiegebied.
3. MICROÖRGANISME: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1.Bewaren van de stam
Buizen met schuingestolde voedingsbodem (4.1) worden geënt met
Staphylococcus aureus, en na 24 uur bebroeden bij 37 ºC bewaard in
de koelkast bij ca. 4 ºC. Elke maand wordt opnieuw overgeënt.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 7
▼B
3.2.Bereiding van de entsuspensie (a)
Wekelijks worden twee buizen met schuingestolde voedingsbodem uit
de stamcultuur (3.1) geënt en na 24 uur bebroeden bij 37 º C in de
koelkast bij ca. 4 ºC bewaard.
24 uur voor de bepaling worden met deze cultuur 2 tot 4 schuine buizen
met voedingsbodem (4.1) geënt en 16—18 uur bij 37 ºC bebroed.
Daarna wordt de cultuur opgenomen in zoutoplossing (4.3)
en daarmee verdund tot de lichttransmissie bij 578 nm en 1 cm laag-
dikte ca. 40 % is.
4. VOEDINGSBODEMS EN REAGENTIA
4.1.Voedingsbodems voor het voortkweken van de stam (b)
Pepton uit vlees 6,0 g
Trypton 4,0 gGistextract 3,0 gVleesextract 1,5 gGlucose 1,0 gAgar-agar 15,0 gWater 1 000 mlpH 6,5 (na sterilisatie).
4.2.Voedingsbodem voor de metingen
4.2.1. Onderste laag (
c)
Pepton uit vlees 6,0 g
Gistextract 3,0 gVleesextract 1,5 gAgar-agar 10,0 gWater 1 000 mlpH 6,5 (na sterilisatie).
4.2.2. Te beënten laag
Voedingsbodem (4.1) met de toevoeging van 2,0 g siliconen-antischui-
memulsie(
d).
4.3. Zoutoplossing 0,4 % (g/v): los 4 g natriumchloride p.a. op in water,
verdun tot 1 000 ml en steriliseer.
4.4. Methanol, zuiver.4.5. Methanol 50 % (v/v): meng 500 ml methanol (4.4) met 500 ml water.4.6. Methanol 80 % (v/v): meng 800 ml methanol (4.4) met 200 ml water.
4.7. Tris(hydroxymethyl) aminomethaan p.a.
4.8. Kaliumchlorideoplossing in methanol, 1,5 %: los 1,5 g kaliumchloride
p.a. op in 20 ml water, en breng op 100 ml met methanol (4.4).
4.9. Kationenwisselaar: Dowex 50 WX8, 20—50 mesh, Na-vorm (Serva
catalogus nr. 41600) of gelijkwaardig.
4.10. Anionenwisselaar: Dowex 1X2, 50—100 mesh, Cl-vorm (Serva cata-
logus nr. 41010) of gelijkwaardig. Voor het gebruik het produkt 12 tot
14 uur in 80 % methanol (4.6) bewaren.
4.11. Glaswol.
4.12. pH-indicatorpapier (pH 6,6—8,1).4.13. Ascorbinezuur.4.14. Standaard: flavofosfolipol met bekende activiteit.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 8
(a) Andere methoden kunnen gebruikt worden voorzover is bewezen dat zij overeenkom-
stige bacteriesuspensies geven.
(b) Elke handelsvoedingsbodem van vergelijkbare samenstelling, die dezelfde resultaten
geeft, kan gebruikt worden, bv. Oxoid Antibiotic Medium 1 (CM 327) met toevoeging
van Oxoid agar nr. 3 (L 13).
(c) Elke handelsvoedingsbodem van vergelijkbare samenstelling, die dezelfde resultaten
geeft kan gebruikt worden, bv. Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) met toevoegingvan Oxoid agar nr. 3 (L 13).
(
d) Bv. SE 2 van Wacker Chemie GmbH, München.
▼B
5. APPARATUUR
5.1. Glazen chromatografiekolom, binnendiameter 9 mm, lengte
150—200 mm, met een kraan aan de onderzijde en boven een slijpstuk
(voor het opzetten van een druppeltrechter 5.2.).
5.2. Druppeltrechter 250 ml, met kraan en slijpstuk.5.3. Erlenmeyer 250 ml met slijpstuk5.4. Terugvloeikoeler met slijpstuk (passend op 5.3).
6. STANDAARDOPLOSSINGEN
Los een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid standaard (4.14) op in 50 %
methanol (4.5), en verdun tot een voorraadoplossing van 100 µ g flavo-
fosfolipol per ml. Deze kan in gesloten kolven 2 maanden bij 4 ºC
bewaard worden.
Met deze voorraadoplossing worden door successieve verdunning met
50 % methanol (4.5) de volgende oplossingen bereid:
S
80,2 µ g/ml
S40,1 µ g/ml
S20,05 µ g/ml
S10,025µ g/ml.
7. BEREIDING VAN HET EXTRACT
7.1.Extractie
7.1.1. Concentraten, voormengsels en mineraalmengsels
Aan een afgewogen hoeveelheid van 2,0 tot 5,0 g van het monster
wordt ongeveer 150 mg ascorbinezuur (4.13) toegevoegd, en daarna in
een erlenmeyer (5.3) met 150 ml 50 % methanol (4.5) gemengd). De
pH wordt met ca. 400 mg tris(hydroxymethyl) aminomethaan op8,1—8,2 gebracht, wat met indicatorpapier (4.12) gecontroleerd wordt.
Na 15 minuten wordt de pH met Tris (4.7) opnieuw op 8,1-8,2 gebracht
en daarna wordt 10 minuten onder voortdurend roeren gekookt onder de
terugvloeikoeler. Na afkoelen wordt gecentrifugeerd en het extract afge-
goten.
7.1.2. Overige voeders
Weeg een hoeveelheid monster af van 5,0 tot 30,0 g, zodanig dat deze
ten minste 30 µ g flavofosfolipol bevat. Meng deze hoeveelheid in een
erlenmeyer (5.3) met 150 ml 50 % methanol (4.5) en breng de pH op
8,1—8,2 met ca. 400 mg Tris (4.7). Controleer de pH met indicatorpa-
pier (4.12). Breng na 15 minuten de pH opnieuw met Tris (4.7) op
8,1—8,2 en kook 10 minuten onder de terugvloeikoeler (5.4) onder
voortdurend roeren. Na afkoelen wordt gecentrifugeerd en het extract
afgegoten.
7.2.Zuivering (bij concentraten, voormengsels en mineralenmengsels
niet nodig)
Aan 110 ml van het extract wordt 11 g kationenwisselaar (4.9) toege-
voegd waarna 1 minuut onder voortdurend roeren onder de
terugvloeikoeler gekookt wordt. Na afscheiden van de kationenwisse-
laar door centrifugeren of filteren wordt aan 100 ml extract 150 ml
methanol (4.4) toegevoegd en dit mengsel daarna 12—15 uur bij 4 ºC
bewaard. Het daarbij uitgevlokte materiaal wordt door filteren onder
koeling verwijderd.
Een glaswolprop (4.11) wordt in het ondereind van een kolom (5.1)
aangebracht waarna 5 ml anionenwisselaar (4.10) in de kolom wordt
gegoten en met 100 ml 80 % methanol (4.6) gewassen. Met behulp
van de druppeltrechter (5.2) wordt ten minste 100 ml filtraat, waarin
ten minste 16 µ g flavofosfolipol aanwezig moet zijn, op de kolom
gebracht (200 ml bij 30 g voedermonster met 1 mg per kg). Indien
nodig, wordt het filtraat van tevoren met 80 % methanol (4.6) verdund
tot een verwacht gehalte van 16 µ g per 100 ml. De doorloopsnelheid
wordt geregeld op ca. 2 ml per minuut, en de doorgelopen vloeistof
weggegooid. De kolom wordt dan met 50 ml 80 % methanol (4.6)
gewassen en doorgelopen vloeistof weggegooid.
Het flavofosfolipol wordt geëlueerd met KCL-methanol (4.8) met een
doorloopsnelheid van ca. 2 ml/minuut. 50 ml van dit eluaat wordt in
een maatcylinder opgevangen en met 30 ml water gemengd. Deze
oplossing moet naar verwachting 0,2 µ g/ml (= U
8) bevatten.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 9
▼B
7.3.Verdunningen van het extract
Indien nodig (d.w.z. wanneer geen zuivering plaatsgehad heeft) wordt
het in 7.1.1 verkregen extract met 50 % methanol (4.5) verdund tot
een verwacht flavofosfolipolgehalte van 0,2 µ g/ml (= U8).
Van de oplossing U8worden de oplossingen U4(verwacht gehalte
0,1 µg/ml), U2(verwacht gehalte 0,05 µ g/ml) en U1(verwacht gehalte
0,025 µ g/ml) door successieve verdunning (1 + 1) met 50 % methanol
(4.5) bereid.
8. UITVOERING VAN DE BEPALING
8.1.Enten van de voedingsbodem
De te beënten voedingsbodem (4.2.2) wordt bij ca. 50 ºC met de entsus-
pensie (3.2) geënt. Door voorproeven met voedingsbodem (4.2.2) dient
men de hoeveelheid entsuspensie te bepalen die bij de verschillende
concentraties flavofosfolipol zo groot mogelijke remzones geeft, die
toch nog scherp zijn (ongeveer 30 ml per liter).
8.2.Gereedmaken van de platen
De agardiffussie vindt plaats in platen waarop de vier standaardconcen-
traties (S8,S4,S2en S1) voorkomen en de vier extractconcentraties (U8,
U4,U2en U1). Elke plaat moet beslist alle vier concentraties van stan-
daard en extract bevatten. Daarom moet de afmeting van de platen
zogekozen worden dat men in de agarvoedingsbodem tenminste 8
gaatjes kan ponsen van 10 tot 13 mm diameter, waarvan de middel-
punten niet minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. Als platen
kan men vlakke glazen platen gebruiken, waarop aluminium of plastic
ringen van 200 mm diameter en 20 mm hoogte gezet worden.
In de platen wordt een hoeveelheid onderlaagvoedingsbodem (4.2.1)
gegoten die een laagdikte van 1,5 mm geeft (45 ml voor een plaat van
200 mm diameter). Nadat deze laag vast geworden is wordt een
hoeveelheid voedingsbodem (4.2.2), beënt als onder 8.1 beschreven,
over de vastgeworden laag heen gegoten, voldoende om een laag van
1 mm dikte te krijgen (30 ml voor een plaat van 200 mm diameter).
Nadat ook deze laag vast geworden is worden de gaatjes geponst en
exact afgemeten hoeveelheden van standaard- en extractverdunningen
ingepipetteerd (0,10 tot 0,15 ml per gaatje, afhankelijk van de diameter
van de gaatjes).
Iedere concentratie moet ten minste in viervoud opgebracht worden,
zodat iedere bepaling 32 remzones als grondslag voor de berekening
heeft.
8.3.Bebroeding
Bebroed de platen 16 tot 18 uur bij 28—30 ºC.
9. METING EN BEREKENING
Meet de diameter van de remzones tot 0,1 mm nauwkeurig. Zet voor
elke concentratie de gemiddelde waarden op semilogarithmisch papier
uit, zodanig dat de logarithme van de concentraties tegen de diameter
van de remzones komt te staan. Trek de best passende lijnen voor stan-
daard en extracten, ga daarbij bij voorbeeld als volgt te werk.
Bepaal het meest passende punt voor de laagste standaardwaarde (SL)
volgens de formule:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Bepaal het meest passende punt voor de hoogste standaardwaarde (SH)
volgens de formule:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Bepaal op dezelfde wijze de meest passende punten voor de laagste
extractwaarde (UL) en de hoogste extractwaarde (UH) door in boven-
staande formules S1,S2,S4en S8door U1,U2,U4en U8te vervangen.
Vul de waarden SL en SH in dezelfde grafiek in. Door deze twee
punten te verbinden krijgt men de meest passende rechte voor de stan-
daardoplossing. Op dezelfde wijze verkrijgt men met UL en UH de
meest passende rechte voor het extract.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 10
▼B
Wanner er geen enkele storing is, moeten de rechten evenwijdig zijn.
►C1In de praktijk kunnen de rechten als evenwijdig worden
beschouwd wanneer (SH — SL) en (UH — UL) niet meer dan 10 %
van hun gemiddelde afwijken. ◄
Als de rechten niet evenwijdig zijn, kan men hetzij U1en S1, hetzij U8en S8uitsluiten. De waarden SL, SH, UL en UH waarmee men dan de
meest passende rechten kan trekken worden dan berekend volgens de
volgende formules:
(a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6of5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6of5S8þ2S4/C0S2
6
en analoge formules voor UL en UH. De met deze alternatieve
formules getrokken rechten moeten ook op evenwijdigheid onderzocht
worden, zoals boven aangegeven. Wanneer het resultaat uit drie niveaus
berekend is moet dit op het analysecertificaat vermeld worden.
Wanneer de rechten alsevenwijdig bes chouwd kunnen worden, wordt
de logarithme van de relatieve activiteit (log A) berekend volgens een
van de volgende formules:
Voor 4 niveaus
(c) log A ¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Voor 3 niveaus
(d) log A ¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
of
(d) log A ¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Werkelijke activiteit = aangenomen activiteit × relatieve activiteit.
Wanneer de rechten niet alsevenwijdig bes chouwd kunnen worden,
moet men de bepaling herhalen. Wanneer het dan nog steeds niet lukt
evenwijdige rechten te verkrijgen, moet men de logarithme van de rela-
tieve activiteit (log A) berekenen met formule (c). Het resultaat moet
dan echter beschouwd worden als een benadering en dat moet op het
analysecertificaat vermeld worden.
10. HERHAALBAARHEID
Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen op hetzelfde
monster uitgevoerd door dezelfde analyst mag niet groter zijn dan:
0,5 mg/kg, in absolute waarde, voor gehaltes aan flavofosfolipol van 1
tot 2 mg/kg,
25 % van de hoogste waarde voor gehaltes boven 2 en tot 10 mg/kg,
20 % van de hoogste waarde voor gehaltes boven 10 mg/kg en tot
25 mg/kg,
5 mg/kg, in absolute waarde, voor gehaltes boven 25 mg/kg en tot
50 mg/kg,
10 % van de hoogste waarde voor gehaltes boven 50 mg/kg.
3.BEPALING VAN DE SPOREËLEMENTEN IJZER, KOPER,
MANGAAN EN ZINK
1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED
Met deze methode kunnen de sporeëlementen ijzer, koper, mangaan en
zink in veevoeder worden bepaald. De ondergrenzen van de bepalingen
zijn:
ijzer (Fe) 20 mg/kg
koper (Cu) 10 mg/kg1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 11
▼B
mangaan (Mn) 20 mg/kg
zink (Zn) 20 mg/kg.
2. PRINCIPE
Het monster wordt, na destructie van eventueel aanwezig organisch
materiaal, in zoutzuur opgelost. De elementen ijzer, koper, mangaan
en zink worden na gepaste verdunning bepaald door middel van atoom-
absorptiespectometrie.
3. REAGENTIA
Inleiding
Voor de bereiding van reagentia en analyse-oplossingen dient water te
worden genomen waarin de te bepalen kationen niet voorkomen; dit
kan worden bereid door het water tweemaal te destilleren in een destil-
leerapparaat van boorsilicaatglas of kwarts, dan wel door het tweemaal
te zuiveren met behulp van ionenwisselaars.
De zuiveringsgraad van reagentia dient ten minste p.a. te zijn. De afwe-
zigheid van het te bepalen element moet worden gecontroleerd door een
blanco bepaling. Zo nodig moeten de reagentia nog verder worden
gezuiverd.
In plaats van de hieronder beschreven standaardoplossingen kunnen in
de handel verkrijgbare standaardoplossingen worden gebruikt, waarvan
de zuiverheid is gegarandeerd, en vóór gebruik gecontroleerd.
3.1. Zoutzuur p.a., d: 1,19.3.2. Zoutzuur p.a., 6 N.3.3. Zoutzuur p.a., 0,5 N.
3.4. Fluorwaterstofzuur, 38—40 % (v/v), met een ijzergehalte van minder
dan 1 mg/l en een indamprest (uitgedrukt als sulfaat) van minder dan
10 mg/l.
3.5. Zwavelzuur p.a., d: 1,84.3.6. Waterstofperoxyde p.a., ongeveer 100 vol, zuurstof (30 gew. %).3.7. Standaardijzeroplossing (1 000 µ g Fe/ml), als volgt bereid: los 1 g
ijzerdraad p.a. op in 200 ml zoutzuur 6 N (3.2), voeg 16 ml waterstof-
peroxyde (3.6) toe en vul aan met water tot 1 l.
3.7.1. Verdunde standaardijzeroplossing van ijzer (100 µ g Fe/ml), bereid door
de standaardoplossing (3.7) 1 + 9 met water te verdunnen.
3.8. Standaardkoperoplossing (1 000 µ g Cu/ml), als volgt bereid: los 1 g
koperpoeder p.a. op in 25 ml zoutzuur 6 N (3.2), voeg 5 ml waterstof-
peroxyde (3.6) toe en vul aan met water tot 1 l.
3.8.1. Verdunde standaardkoperoplossing (10 µ g Cu/ml), bereid door de stan-
daardoplossing (3.8) 1 + 9 met water te verdunnen en de aldus bereide
oplossing wederom 1 + 9 met water te verdunnen.
3.9. Standaardmangaanoplossing (1 000 µ g Mn/ml), als volgt bereid: los 1 g
mangaanpoeder p.a. op in 25 ml zoutzuur 6 N (3.2) en vul aan met
water tot 1 l.
3.9.1. Verdunde standaardmangaanoplossing (10 µ g Mn/ml), bereid door de
standaardoplossing (3.9) 1 + 9 met water te verdunnen en de aldus
bereide oplossing wederom 1 + 9 met water te verdunnen.
3.10. Standaardzinkoplossing (1 000 µ g Zn/ml), als volgt bereid: los 1 g
zinkband of bladzink p.a. op in 25 ml zoutzuur 6 N (3.2) en vul aan
met water tot 1 l.
3.10.1. Verdunde standaardzinkoplossing (10 µ g Zn/ml), bereid door de stan-
daardoplossing (3.10) 1 + 9 met water te verdunnen en de aldus bereide
oplossing wederom 1 + 9 met water te verdunnen.
3.11. Lathaancloride-oplossing, bereid als volgt: los 12 g lathaanoxyde op in
150 ml water, voeg 100 ml zoutzuur 6 N (3.2) toe en vul aan met water
tot 1 l.
4. APPARATUUR
4.1. Moffeloven met temperatuurregelaar en pyrometer.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 12
▼B
4.2. Glaswerk van resistent boorsilicaat. Aanbevolen wordt materiaal te
gebruiken dat uitsluitend voor de bepaling van sporeëlementen wordt
aangewend.
4.3. Platinaschaal of eventueel een kwartsschaal.4.4. Atoomabsorptiespectrofotometer die qua gevoeligheid en nauwkeurig-
heid in het betreffende meetgebied voldoet aan de eisen die in verband
met de methode worden gesteld.
5. UITVOERING
5.1.Monsters met organisch materiaal
5.1.1. Verassen en bereiden van de oplossing voor de analyse (*)
(i) Breng een tot op 0,2 mg nauwkeurig afgewogen hoeveelheid
monster van 5 tot 10 g in een schaal van kwarts of platina (4.3)
(zie opm. b), droog in de droogstof bij 105 ºC en plaats de schaal
in de koude moffeloven (4.1) Sluit de oven (zie opm. c) en breng
de temperatuur in ongeveer 90 minuten geleidelijk op 450—475 ºC.
Handhaaf deze temperatuur gedurende 4—16 uur (bij voorbeeldgedurende de nacht ten einde kooldeeltjes te verwijderen; open
vervolgens de moffeloven en laat afkoelen (zie opm. d).
Bevochtig de inhoud van de schaal met water en breng deze over in
een bekerglas van 250 ml. Spoel de schaal uit met in totaal onge-
veer 5 ml zoutzuur (3.1) en voeg dit langzaam en voorzichtig toe
aan de inhoud van het bekerglas (de reactie kan hevig zijn doordat
erCO
2ontstaat). Voeg onder roeren druppelgewijs meer zoutzuur
(3.1) toe tot het bruisen ophoudt. Damp in tot droog onder nu en
dan roeren met een glazen staaf.
Voeg vervolgens bij het residu 15 ml zoutzuur 6 N (3.2) toe en
daarna ongeveer 120 ml water. Roer met de glazen staaf, die in
het bekerglas blijft en dek het bekerglas af met een horlogeglas.
Breng de inhoud zachtjes aan de kook en houd aan de kook tot er
geen as meer zichtbaar in de oplossing gaat. Filtreer over asvrij
filtreerpapier en vang het filtraat op in een maatkolf van 250 ml.
Was het bekerglas en het filtreerpapier uit met 5 ml heet zoutzuur
6 N (3.2) en tweemaal met kokend water. Koel af en vul aan met
water tot de maatstreep (de zoutzuurconcentratie is dan ongeveer
0,5 N).
(ii) Indien het residu op het filtreerpapier zwart is (koolstof) breng het
dan opnieuw in de moffeloven en veras weer bij 450—475 ºC.
Deze verassing, die slechts enkele uren duurt (ongeveer 3—5 uur),
is beëindigd zodra de as wit of bijna wit lijkt. Los het residu op
met ongeveer 2 ml zoutzuur (3.1), damp in tot droog en voeg 5 ml
zoutzuur 6 N (3.2) toe. Verwarm de oplossing en filtreer deze in de
maatkolf; koel af en vul aan met water tot de maatstreep. De zout-
zuurconcentratie is dan ongeveer 0,5 N).
Opmerkingen:
a) Bij de bepaling van sporeëlementen dient men bedacht te zijn op het
gevaar van contaminatie, vooral door zink, koper en ijzer. Daarommogen deze metalen niet voorkomen in het materiaal dat voor de
bereiding van de monsters wordt gebruikt.
Ter beperking van het algemene besmettingsrisico dient te worden
gewerkt in een stofvrije atmosfeer met uiterst schone apparatuur en
zorgvuldig gewassen glaswerk. Vooral de zinkbepaling is gevoelig
voor verschillende soorten besmetting, b.v. door glaswerk, reagentia,
stof, enz.
b) Het gewicht van het te verassen monster wordt berekend op grond
van het te verwachten gehalte aan sporeëlementen in het veevoer,
rekening houdende met de gevoeligheid van de te gebruiken spectro-
fotometer. Bij sommige voedermiddelen met een zeer laag gehalte
aan sporeëlementen kan het wellicht noodzakelijk zijn te beginnen
met 10—20 g analysemateriaal en de uiteindelijke oplossing aan te
vullen tot slechts 100 ml.
c) Het verassen dient te geschieden in een gesloten moffeloven zonder
lucht- of zuurstofvoer.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 13
(*) Groenvoer (vers of gedroogd) bevat soms grote hoeveelheden organisch kiezelzuur dat
moet worden verwijderd omdat deze sporeelementen kan vasthouden. Bij monstersvan dergelijke voedermiddelen dient derhalve de volgende gewijzigde procedure te
worden toegepast.
▼B
d) De op de pyrometer afgelezen temperatuur mag niet meer bedragen
dan 475 ºC.
5.1.2. Spectrofotometrische bepaling
5.1.2.1. Bereid voor ieder te bepalen element op basis van de verdunde stan-
daardoplossingen 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 en 3.10.1 een reeks ijkoplossingen,
elk met een zoutzuurconcentratie van ongeveer 0,5 N en (bij ijzer,
mangaan en zink) een gehalte aan lanthaanchloride dat overeenkomt
met 0,1 % La (g/v). De gekozen gehaltes aan sporeëlementen dienen
binnen het gevoeligheidsbereik van de te gebruiken spectrofotometer te
liggen. In onderstaande tabellen zijn bij wijze van voorbeeld de samen-
stellingen opgegeven van typische reeksen ijkoplossingen; naar gelang
van het type en de gevoeligheid van de gebruikte spectrofotometer,
kan het echter noodzakelijk zijn andere concentraties te kiezen.
IJzer
µ g Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml verdunde stan-
daardoplossing
(3.7.1)
(1 ml = 100 µ g
Fe)0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml HCl 6 N
(3.2.)7 7 77777
+ 10 ml lanthaanchloride-oplossing (3.11) en met water aanvullen tot
100 ml
Koper
µ g Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 0,1
ml verdunde stan-
daardoplossing
(3.8.1)
(1 ml = 10 µ g Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
met water aanvullen tot 100 ml
Mangaan
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml verdunde stan-
daardoplossing
(3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
10 ml lanthaanchloride-oplossing (3.11) en met water aanvullen tot
100 ml
Zink
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml verdunde stan-
daardoplossing (3.
10. 1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ml HCl 6N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
10 ml lanthaanchloride-oplossing (3.11) en met water aanvullen tot
100 ml1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 14
▼B
5.1.2.2. Bereiding van de oplossingen voor de analyse
Voor de bepaling van koper kan de volgens 5.1.1 bereide oplossing in
de regel rechtstreeks worden gebruikt. Indien het noodzakelijk is om het
gehalte binnen de reeks van de ijkoplossingen te brengen, kan een
aliquot deel van die oplossing worden gepipetteerd in een maatkolf
van 100 ml welke daarna wordt aangevuld met zoutzuur 0,5 N (3.3)
tot de maatstreep.
Voor de bepaling van ijzer, mangaan en zink dient een aliquot deel van
de volgens 5.1.1 bereide oplossing te worden gepipetteerd in een maat-
kolf van 100 ml; voeg 10 ml lanthaan choride-oplossing (3.11) toe en
vul aan tot de maatstreep met zoutzuur 0,5 N (3.3) (zie ook opmerking
onder 8).
5.1.2.3. Blanco-proef
Bij de blanco-proef dient de volledige werkwijze te worden toegepast,
echter zonder monstermateriaal.
De ijkoplossing „0” mag niet als blanco-proef worden gebruikt.
5.1.2.4. Meting van de atoomabsorptie
Meet de atoomabsorptie van de ijkoplossingen en van de te analyseren
oplossing met behulp van een oxyderende luchtacetyleen-vlam bij de
volgende golflengten:
Fe 248,3 nm
Cu 324,8 nm
Mn 279,5 nm
Zn 213,8 nm.
Voer iedere meting viermaal uit.
5.2.Mineraalvoeders
Indien het monster geen organisch materiaal bevat, is verassing vooraf
overbodig. Handel dan als omschreven in 5.1.1 (i), te beginnen met de
tweede alinea. Indampen met fluorwaterstofzuur kan worden wegge-
laten.
6. BEREKENING VAN DE RESULTATEN
Bereken het gehalte aan sporeëlementen in de te analyseren oplossing
met behulp van een ijkgrafiek. Druk de resultaten uit in mg sporeële-
ment per kg monster (ppm).
7. HERHAALBAARHEID
Het verschil tussen de resultaten van twee parallel bepalingen in
hetzelfde monster door dezelfde analyst, mag niet meer bedragen dan:
— 5 mg/kg absoluut, voor gehaltes aan het betrokken sporeëlement van
maximaal 50 mg/kg;
— 10 % van het hoogste resultaat, voor gehaltes aan het betrokken
sporeëlement van 50 tot en met 100 mg/kg;
— 10 mg/kg absoluut, voor gehaltes aan het betrokken sporeëlement
van 100 tot en met 200 mg/kg;
— 5 % van het hoogste resultaat, voor gehaltes aan het betrokken spor-
eëlement van meer dan 200 mg/kg.
8. OPMERKING
De aanwezigheid van grote hoeveelheden fosfaten kan tot storingen
leiden bij de bepaling van ijzer, mangaan en zink. Deze storing kan
worden voorkomen door toevoeging van lanthaanchloride-oplossing
(3.11). Indien in het monster de gewichtsverhoudingCaþMg
Pgroter is
dan 2, kan de toevoeging van lanthaanchloride-oplossing (3.11) aan de
analyseoplossing en de ijkoplossingen vervallen.1978L0633 — NL — 22.06.1978 — 000.001 — 15