1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 1
Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen
►B BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE
van 15 juli 1994
tot vaststelling van de veterinairrechtelijke voorschriften en van de voorschriften inzake veteri-
naire certificering voor de invoer van sperma van runderen uit derde landen
(94/577/EG)
(PB L 221 van 26.8.1994, blz. 26)
Gewijzigd bij:
Publicatieblad
nr. blz. datum
►M1Beschikking 1999/495/EG van de Commissie van 1 juli 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2Beschikking 2004/52/EG van de Commissie van 9 januari 2004 L 10 67 16.1.2004
Gewijzigd bij:
►A1Akte betreffende de toetredingsvoorwaarden voor de Tsjechische Repu-
bliek, de Republiek Estland, de Republiek Cyprus, de RepubliekLetland, de Republiek Litouwen, de Republiek Hongarije, de Republiek
Malta, de Republiek Polen, de Republiek Slovenië en de Slowaakse
Republiek en de aanpassing van de Verdragen waarop de EuropeseUnie is gegrondL 236 33 23.9.2003
▼B
BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE
van 15 juli 1994
tot vaststelling van de veterinairrechtelijke voorschriften en van de
voorschriften inzake veterinaire certificering voor de invoer van
sperma van runderen uit derde landen
(94/577/EG)
DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,
Gelet op Richtlijn 88/407/EEG van de Raad van 14 juni 1988 tot vast-
stelling van de veterinairrechtelijke voorschriften van toepassing op hetintracommunautaire handelsverkeer in sperma van runderen en deinvoer daarvan (
1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 93/60/EEG (2), en
met name op de artikelen 10 en 11,
Overwegende dat de lijst van derde landen van waaruit de invoer van
diepgevroren sperma van runderen door de Lid-Staten wordt toege-staan, hierna „de lijst van derde landen” genoemd, is vastgesteld bij
Beschikking 90/14/EEG van de Commissie (
3), gewijzigd bij Beschik-
king 91/276/EEG (4);
Overwegende dat in verband met de gezondheidssituatie in Israël de
invoer uit dat land bij Beschikking 91/277/EEG van de Commissie (5)-
werd verboden;
Overwegende dat de veterinairrechtelijke voorschriften en die inzake
veterinaire certificering voor de invoer van sperma van runderen uitde Verenigde Staten van Amerika, Canada, Polen, Finland, Nieuw-Zeeland, Oostenrijk, Zwitserland, Zweden, Hongarije, Noorwegen, enTsjechoslovakije zijn vastgesteld bij, respectievelijk, de Beschikkingen
91/479/EEG (
6), 91/549/EEG (7), 92/123/EEG (8), 92/124/EEG (9), 92/
125/EEG (10), 92/126/EEG (11), 92/127/EEG (12), 92/128/EEG (13), 92/
386/EEG (14), 92/387/EEG (15), en 92/445/EEG (16) van de Commissie;
Overwegende dat Richtlijn 88/407/EEG is gewijzigd bij Richtlijn 93/
60/EEG die door de Lid-Staten vóór 1 juli 1994 ten uitvoer dient te
worden gelegd; dat bovengenoemde beschikkingen voor derde landen
bijgevolg eveneens moeten worden gewijzigd; dat, om de communau-taire wetgeving ter zake te vereenvoudigen en te verduidelijken,bovengenoemde beschikkingen in één tekst dienen te worden bijeenge-bracht en de voor elk land afzonderlijke beschikkingen derhalve dienen
te worden ingetrokken;
Overwegende dat in verband met de Overeenkomst betreffende de
Europese Economische Ruimte de veterinaire certificaten voor deinvoer van rundersperma uit Oostenrijk, Finland, Noorwegen enZweden niet behoeven te worden gehandhaafd;
Overwegende dat overeenkomstig het advies van het Wetenschappelijk
Veterinair Comité een bijkomende test op epizoötische hemorragischeziekte wordt vereist;1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 2
(1) PB nr. L 194 van 22. 7. 1988, blz. 10.
(2) PB nr. L 186 van 28. 7. 1993, blz. 28.
(3) PB nr. L 8 van 11. 1. 1990, blz. 71.
(4) PB nr. L 135 van 30. 5. 1991, blz. 58.
(5) PB nr. L 135 van 30. 5. 1991, blz. 60.
(6) PB nr. L 258 van 16. 9. 1991, blz. 1.
(7) PB nr. L 298 van 29. 10. 1991, blz. 6.
(8) PB nr. L 48 van 22. 2. 1992, blz. 1.
(9) PB nr. L 48 van 22. 2. 1992, blz. 10.
(10) PB nr. L 48 van 22. 2. 1992, blz. 19.
(11) PB nr. L 48 van 22. 2. 1992, blz. 28.
(12) PB nr. L 48 van 22. 2. 1992, blz. 37.
(13) PB nr. L 48 van 22. 2. 1992, blz. 46.
(14) PB nr. L 204 van 21. 7. 1992, blz. 13.
(15) PB nr. L 204 van 21. 7. 1992, blz. 22.
(16) PB nr. L 247 van 27. 8. 1992, blz. 1.
▼B
Overwegende dat alleen voor Canada geldt dat de routinetests op deze
ziekte om de zes maanden vóór de spermawinning worden uitgevoerd;dat voor Canada bijgevolg in een overgangsperiode voor de invoering
van het bij deze beschikking bepaalde dient te worden voorzien ten
einde de Canadese veterinaire autoriteiten de nodige tijd te gunnenom de nieuwe test in het routineprogramma op te nemen;
Overwegende dat, aangezien recentelijk een beter inzicht in de epizoö-
tiologie van „blue tongue” is verkregen, bovendien thans de invoer vansperma van runderen uit Australië kan worden toegestaan;
Overwegende dat de diergezondheidssituatie in de landen van de lijst
van derde landen ten aanzien van ziekten die door sperma kunnen
worden overgedragen, goed blijkt te zijn en door goed gestructureerde
en georganiseerde veterinaire diensten wordt gecontroleerd;
Overwegende dat de bevoegde veterinaire autoriteiten van de landen op
de lijst van derde landen zich ertoe hebben verbonden de Commissieen de Lid-Staten per telex- of per fax-bericht binnen 24 uur van elkebevestigde uitbraak van een van de ziekten van lijst A van het Interna-tionaal Bureau voor besmettelijke veeziekten (OIE) en van elke
wijziging in het vaccinatiebeleid ten aanzien van een van deze ziekten
in kennis te stellen, en, binnen een redelijke termijn, van elke uitbraakvan een van de ziekten van lijst B van het OIE en van elke voorge-stelde wijziging in de invoerregeling voor huisdieren en sperma enembryo's daarvan;
Overwegende dat de bevoegde veterinaire autoriteiten van de landen op
de lijst van derde landen zich ertoe hebben verbonden op de afgifte vancertificaten op grond van deze beschikking officieel toezicht te houden
en ervoor te zorgen dat alle certificaten, alle uitzonderingen en alle
laboratoriumresultaten op grond waarvan een certificaat is afgegeven,gedurende ten minste twaalf maanden na de verzending van het spermawaarop zij betrekking hebben, in de officiële databestanden blijven;
Overwegende dat de bevoegde veterinaire autoriteiten van de landen op
de lijst van derde landen zich voor de uitvoer van sperma van runderennaar de Europese Gemeenschap ertoe hebben verbonden spermacentra
officieel te erkennen, overeenkomstig artikel 9 van Richtlijn 88/407/
EEG;
Overwegende dat de veterinairrechtelijke voorschriften en die inzake
veterinaire certificering naar gelang van de diergezondheidssituatie inhet betrokken derde land aanpassing behoeven;
Overwegende dat de in deze beschikking vervatte maatregelen in over-
eenstemming zijn met het advies van het Permanent Veterinair Comité,
HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:
Artikel 1
De Lid-Staten staan de invoer toe van sperma van runderen dat voldoet
aan de eisen die zijn vastgesteld in de certificaten volgens de modellenin deel 1 van de bijlagen A, B, C, respectievelijk D, doch alleen uit diederde landen die in deel 2 van de bijlagen A, B, C, respectievelijk Dzijn opgenomen.
De Lid-Staten staan tot en met 31 december 1994 de invoer uit Canada
toe van sperma van runderen dat is gewonnen en behandeld overeen-
komstig Beschikking 91/549/EEG.
Artikel 2
De Beschikkingen 91/479/EEG, 92/123/EEG, 92/124/EEG, 92/125/
EEG, 92/126/EEG, 92/127/EEG, 92/128/EEG, 92/386/EEG, 92/387/
EEG en 92/445/EEG worden ingetrokken.
Beschikking 91/549/EEG wordt ingetrokken op 1 januari 1995.1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 3
▼B
Artikel 3
De in artikel 1, eerste alinea, vervatte voorschriften zijn met betrekking
tot Canada van toepassing met ingang van 1 januari 1995.
Artikel 4
Deze beschikking is gericht tot de Lid-Staten.1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 4
▼B
BIJLAGE A
DEEL 1
GEZONDHEIDSCERTIFICAAT
voor de invoer van rundersperma
1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 5
▼B
►M1◄1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 6
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 7
▼A1
DEEL 2
Lijst van landen waarvoor het in deel 1 van bijlage A opgenomen model
van gezondheidscertificaat mag worden gebruikt
NIEUW-ZEELAND
ROEMENIË
ZWITSERLAND1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 8
▼B
BIJLAGE B
DEEL 1
GEZONDHEIDSCERTIFICAAT
voor de invoer van rundersperma uit de Verenigde Staten van Amerika
1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 9
▼B1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 10

▼B
►(1) (2)M11994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 11
▼B
DEEL 2
Lijst van landen die gebruik mogen maken van het gezondheidscertificaat
volgens het model in deel 1 van deze bijlage
VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 12
▼B
BIJLAGE C
DEEL 1
GEZONDHEIDSCERTIFICAAT
voor de invoer van rundersperma
1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 13
▼B
►M1◄1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 14
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 15
▼B
DEEL 2
Lijst van landen die gebruik mogen maken van het gezondheidscertificaat
volgens het model in deel 1 van deze bijlage
CANADA Met uitzondering van het gebied Okanagan Valley in Brits
Columbia, omschreven als het gebied dat omsloten wordt door eenlijn vanaf het punt op de grens tussen Canada en de Verenigde
Staten van Amerika met de coördinaten 120º 15 ′WL, 49º NB,
noordwaarts tot het punt met de coördinaten 119º 35 ′WL, 50º 30 ′
NB, noordoostwaarts tot het punt met de coördinaten 119º WL, 50º
45′NB, zuidwaarts tot het punt op de grens tussen Canada en de
Verenigde Staten van Amerika met de coördinaten 118º 15 ′WL,
49º NB.1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 16
▼B
BIJLAGE D
DEEL 1
GEZONDHEIDSCERTIFICAAT
voor de invoer van rundersperma
1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 17
▼B
►M1◄1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 18
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 19
▼B
DEEL 2
Lijst van derde landen die van het gezondheidscertificaat volgens het model
in deel 1 van deze bijlage gebruik mogen maken
AUSTRALIË1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 20
▼B
BIJLAGE E
Protocol voor een „blocking” of competitieve Elisa („enzyme-linked immu-
nosorbent assay”) met gebruik van een groepspecifiek monoklonaal
antilichaam voor de opsporing van antilichamen tegen virus van blue
tongue
COMPETITIEVE ELISA VOOR DE OPSPORING VAN BLUE TONGUE
MET GEBRUIK VAN EEN MONOKLONAAL ANTILICHAAM 3-17-A3
Met de test kunnen antilichamen tegen alle bekende serotypes van het blue-
tonguevirus (BTV) worden opgespoord.
Het principe van de test is de onderbreking van de reactie tussen BTV-antigeen
en een groepspecifiek monoklonaal antilichaam (3-17-A3) door toevoeging van
verdunningen van het testserum. De in het testserum aanwezige antilichamen
tegen BTV blokkeren de reactiviteit van het monoklonaal antilichaam (MAB)
en leiden tot een vermindering van de verwachte kleurontwikkeling bij toevoe-
ging van enzymsubstraat.
MATERIALEN EN REAGENTIA
1. Microtiterplaatjes met vlakke bodem.
2. Antigeen: bereid zoals hierna beschreven.
3. Blokkeerbuffer: 5 % (g/V) „Marvel” gedroogd melkpoeder, 0,1 % (V/V).
Tween 20 (geleverd als polyoxyethyleensorbitonmonolauraat-siroop) in PBS.
4. Monoklonaal antilichaam: 3-17-A3 (geleverd in de vorm van supernatant van
hybridoom weefselcultuur) opgeslagen bij − 20 ºC of gevriesdroogd, vóórgebruik verdund tot 1/50 met een blokkeerbuffer, en gericht tegen het groeps-
pecifieke polypeptide p7.
5. Conjugaat: konijn-antimuis-globuline (geadsorbeerd en geëlueerd), geconju-
geerd met mierikswortelperoxidase en in het donker bewaard bij 4 ºC.
6. Substraat en chromogeen: 0,2 g orthofenyleendiamine (OPD), opgelost in een
buffer bestaande uit 2,553 g citroenzuur en 4,574 g dinatriumhydrogeenort-
hofosfaat, waaraan tot 500 ml gedistilleerd water is toegevoegd, verdeeld in
fracties van 25 ml en in het donker bewaard bij − 20 ºC, met 12 µ/25 ml
waterstofperoxide (30 % g/v) die onmiddellijk vóór gebruik worden toege-
voegd.
VOORZICHTIG MET ORTHOFENYLEENDIAMINE — GEBRUIK
GUMMIHANDSCHOENEN. VERMOEDELIJK MUTAGEEN.
7. Een molair zwavelzuur: 26,6 ml zuur, toegevoegd aan 473,4 ml gedistilleerd
water.
LET OP: STEEDS ZUUR TOEVOEGEN AAN WATER, NOOIT WATER
AAN ZUUR.
8. Roteerschudapparaat.
9. Elisa-afleesapparaat (de test kan visueel worden afgelezen).1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 21
▼B
PROEFOPSTELLING
1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 22
▼B
PROTOCOL
Blanco-controle
Rij 1.A-H is een blanco-controle, bestaande uit BTV-antigeen en conjugaat.
Deze kan worden gebruikt om een nulwaarde in te stellen op het Elisa-afleesap-
paraat.
MAB-controle
Rij 2.A-H is de MAB-controle en bestaat uit BTV-antigeen, monoklonaal anti-
lichaam en conjugaat. Dit vormt een negatieve controle. Het gemiddelde van de
gemeten optische dichtheid van deze controlerij is de 0 %-inhibitiewaarde.
Positieve controleRij 3.A-H is de positieve controle. Deze bestaat uit BTV-antigeen, voor BTV
positieve antiserumverdunningen, monoklonaal antilichaam en conjugaat. Deze
controle wordt in de test opgenomen om na te gaan of de test goed functioneert
en voor alle tests zouden analoge inhibitieniveaus moeten worden verkregen.
TestseraBij de hierboven beschreven proefopstelling kunnen 18 sera worden getest in de
verdunningen 1/2, 1/4, 1/8 en 1/16. Dit zal een indicatie geven van de antili-
chaamtiter in de testsera. De verdunningsreeks zou verder kunnen worden
uitgebreid ter verkrijging van eindpunttiters van de serumverdunning. Anderzijds
kunnen, in het kader van serologische controles op grote schaal, sera worden
getest in één enkele verdunning (1/4) of in twee verdunningen (1/2 en 1/4) als
een snelle screeningtest.
METHODE
1. Verdun BTV-antigeen tot een gepretitreerde concentratie in PBS, bewerk kort
met ultrasone trillingen ten einde de virusklontjes te verdunnen (indien geen
ultrasoonapparaat beschikbaar is, krachtig pipetteren) en voeg 50 µl toe aan
alle putjes van de Elisa-plaat. Tik tegen de zijkanten van de plaat om het
antigeen te verspreiden.
2. Incubeer bij 37 ºC gedurende 60 minuten op een roteerschudapparaat. Spoel
de platen driemaal door ze onder water te zetten en de putjes met niet-steriele
PBS te ledigen en droog af op absorberend papier.
3. Voeg per putje 50 µl blokkeerbuffer toe. Voeg testsera en positief serum toe
aan de juiste putjes en verdun alle putjes met behulp van een meerkanaal-
spipet. Voeg geen sera toe aan de blanco-controle of de MAB-controle.
4. Los, onmiddellijk na toevoeging van de testsera, MAB op in een blokkeer-
buffer (tot een vooraf getitreerde oplossing) en voeg 50 µl toe aan alle
putjes van de plaat, met uitzondering van de blanco-controle.
5. Incubeer bij 37 ºC gedurende 60 minuten op een roteerschudapparaat. Spoel
driemaal met PBS en droog af.
6. Verdun konijn-antimuisconcentraat tot 1/5 000 in de blokkeerbuffer en voeg
50µl toe aan alle putjes van de plaat.
7. Incubeer bij 37 ºC gedurende 60 minuten op een roteerschudapparaat. Spoel
driemaal met PBS en droog af.
8. Ontdooi de OPD en voeg onmiddellijk vóór gebruik 12 µl van 30 % water-
stofperoxide toe aan elke 25 ml OPD. Voeg 50 µl toe aan alle putjes van de
plaat. Laat de kleur ontwikkelen gedurende ongeveer tien minuten en stop de
reactie met 1 M zwavelzuur (50 µl per putje). De kleur zou moeten ontwik-
kelen in de MAB-controleputjes en in die putjes die sera bevatten zonder
antilichaam tegen BTV.
9. Onderzoek de platen en registreer de resultaten hetzij optisch, hetzij met
gebruik van een spectrofotometer.
ANALYSE VAN DE RESULTATEN
Bereken het gemiddelde OD-resultaat van de MAB-controles. Dit is de 0 %-
inhibitiewaarde. De gemeten optische dichtheid van de testsera wordt uitgedrukt
in procentuele inhibitiewaarden, met gebruik van de volgende formule:
Procentuele inhibitiewaarde ¼100/C0
OD in aanwezigheid van testserum
OD in afwezigheid van testserum/C2100 :1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 23
▼B
Inhibitiewaarden van meer dan 40 %, bij een serumverdunning van 1/4, worden
als positief beschouwd. Optisch lezen is mogelijk aangezien 40 % inhibitie de
laagste waarde is die gemakkelijk met het oog kan worden onderscheiden.
BEREIDING VAN HET BTV-ELISA-ANTIGEEN
1. Spoel tien Rouxkolven met BHK.21-celcultures driemaal met een serumvrij
Eagle's medium, en besmet ze met blue-tonguevirus serotype 1 in serumvrij
Eagle's medium.
2. Incubeer bij 37 ºC en onderzoek dagelijks op cytopathogeen effect (cpe)
3. Wanneer cpe duidelijk is bij 80-90 % van de cellaag van elke Rouxkolf,
verzamel dan het virus door het losschudden van mogelijk nog aan het
glas vastgehechte cellen.
4. Centrifugeer bij 2 000-3 000 rpm ten einde de cellen neer te slaan.5. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in ongeveer 30
ml PBS, met 1 % „Sarkosyl” en 2 ml fenylmethylsulfonyl-fluoride (lysis-
buffermengsel). Dit kan er de oorzaak van zijn dat de cellen een gel
vormen en om dit effect te verminderen kan meer lysisbuffermengsel
worden toegevoegd.
NB:fenylmethylsulfonyl-fluoride is schadelijk — hanteer met uiterste voor-
zichtigheid.
6. Breek de cellen gedurende 60 seconden met een ultrasone sonde bij een
amplitude van 30 micron.
7. Centrifugeer tien minuten bij 10000 rpm.8. Bewaar het supernatant bij + 4 ºC en breng de overblijvende celpellet
opnieuw in suspensie in 10-20 ml lysisbuffermengsel.
9. Bewerk met ultrasone trillingen en laat uitklaren, en sla het supernatant
telkens op: doe dit in totaal driemaal.
10. Voeg de supernatants samen en centrifugeer bi j24 000 rpm gedurende 120
minuten, bij + 4 ºC op een 5 ml-kussen van 40 % sucrose (G/V in PBS) met
behulp van 30 ml Beckmann-centrifugeerbuizen en een SW 28-rotor.
11. Giet het supernatant weg, verwijder de vloeistof grondig uit de buisjes en
breng de pellet opnieuw in suspensie in PBS met het ultrasoonapparaat.
Sla het antigeen op in gelijke delen bij − 70 ºC.
TITRERING VAN BTV-ELISA-ANTIGEEN
Blue-tongue-Elisa-antigeen wordt getitreerd met de indirecte Elisa. Tweevou-
dige oplossingen van antigeen worden getitreerd tegen een constante
verdunning (1/50) van monoklonaal antilichaam 3-17-A3. De test wordt uitge-
voerd met inachtneming van de onderstaande voorschriften.
METHODE
1. Verdun BTV-antigeen in PBS op de hele microtiterplaat met een meerkanaal-
spipet in een tweevoudige verdunningsserie (50 µl/putje).
2. Incubeer gedurende een uur bij 37 ºC op een roteerschudapparaat.
3. Spoel de platen driemaal met PBS.4. Voeg 50 µl monoklonaal antilichaam 3-17-A3 (verdund tot 1/50) toe aan elk
putje van de microtiterplaat.
5. Incubeer gedurende een uur bij 37 ºC op een roteerschudapparaat.6. Spoel de platen driemaal met PBS.
7. Voeg aan elk putje van de microtiterplaat 50 µl konijn-antimuisglobuline toe,
geconjugeerd met mierikswortelperoxidase en verdund tot een gepretitreerde
optimale concentratie.
8. Incubeer gedurende een uur bij 37 ºC op een roteerschudapparaat.9. Voeg substraat en chromogeen toe, zoals hierboven beschreven. Zet de
reactie stop na tien minuten door toevoeging van 1 molair zwavelzuur (50
µl/putje).
In de competitieve test moet het monoklonaal antilichaam in overmaat aanwezig
zijn; daarom wordt een verdunning van het antigeen gekozen die ligt op de titra-
tiecurve (niet op het horizontale gedeelte), wat ongeveer 0,8 OD geeft na tien
minuten.1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 24
▼B
Protocol voor een agargelimmunodiffusietest voor de opsporing van antili-
chamen tegen epizoötische hemorragische ziekte
De agargelimmunodiffusietest wordt uitgevoerd met inachtneming van de onder-
staande voorschriften:
MATERIAAL EN REAGENTIA1. Antigeen
Precipiterend antigeen wordt bereid in een celcultuur die geschikt is voor de
snelle vermeerdering van een referentiestam van het blue-tonguevirus. Bij
voorkeur wordt hiervoor gebruik gemaakt van BHK- of Verocellen. Het anti-
geen bevindt zich in het aan het einde van de virusgroei verkregen
supernatant, maar moet 50 tot 100 keer worden geconcentreerd om effectief
te zijn. Daartoe kan om het even welke gestandaardiseerde methode voor
eiwitconcentratie worden gebruikt; het virus in het antigeen kan worden
geïnactiveerd door toevoeging van 0,3 % (v/v) beta-propiolacton.
2. Positief controleserum
Met gebruikmaking van het internationale referentie-antiserum en -antigeen
wordt een nationaal standaardserum geproduceerd, dat voor een optimale
verhouding wordt gestandaardiseerd ten opzichte van het internationale refe-
rentieserum; vervolgens wordt het gevriesdroogd en bij iedere test als positief
controleserum gebruikt.
3. Testserum
PROCEDURE
1. 1 %-ige agar, in een boraat- of natriumbarbituraatbuffer, pH 8,5 à 9,0, wordt
in een petrischaaltje gegoten, en wel zo dat het laagje agar een dikte heeft
van ten minste 3,0 mm.
2. In de agar worden zeven vochtvrije putjes gemaakt, met een diameter van elk
5 mm. Eén putje ligt centraal en de zes andere liggen er omheen in een cirkel
met een straal van 3 mm:
3. Het centrale putje wordt gevuld met het standaardantigeen. De perifere putjes
2, 4 en 6 worden gevuld met het positieve controleserum en de putjes 1, 3 en
5 met het testserum.
4. Het geheel wordt gedurende 72 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in een
gesloten vochtige kamer.
INTERPRETATIE
Een testserum is positief indien het een specifieke precipitatielijn vormt met het
antigeen en een volledig identieke lijn met het controleserum. Een testserum is
negatief indien het geen specifieke lijn vormt met het antigeen en indien het de
lijn van het controleserum niet buigt. De petrischaaltjes moeten worden bekeken
bij donkerveldbelichting met indirect licht.1994D0577 — NL — 01.05.2004 — 003.001 — 25