8 . Desulfogluconapina //

9 . Desulfo-4-idrossiglucobrassicina //

10 . Desulfoglucobrassicanapina //

11 . Desulfoglucotropeolina //

12 . Desulfoglucobrassicina //

13 . Desulfogluconasturzina //

14 . Desulfo-4-metossiglucobrassicina //

15 . Desulfoneoglucobrassicina .

7 .

ESPRESSIONE DEI RISULTATI

7.1 .

Calcolo del contenuto di ciascun glucosinolato //

Il contenuto di ciascun glucosinolato, espresso in micromoli per grammo di semi secchi interi, è pari a :

1.2.3.4 //

area del picco del desulfoglucosinolato area del picco della desulfosinigrina

x

quantità di standard interno aggiunto alla provetta di 6.4 ( in *moli ) peso del campione di seme estratto

1.2.3.4x fattore di risposta del desulfoglucosinolato ( 7.2 )

x

100 100 _ H

1.2 //

dove : //

H è il contenuto di umidità e di sostanze volatili espresso come percentuale in massa del campione di prova ( 6.2 ). //

In taluni casi l'espressione dei risultati viene richiesta a un livello di umidità specifico ( adesso 9 %). In questi casi moltiplicare per //

( 1 000 _ umidità ) 100

il risultato ottenuto per la sostanza secca .

7.2 .

Fattori di risposta . //

I valori del fattore di risposta sono stati determinati sperimentalmente; essi sono stati concordati tra i vari laboratori che hanno preso parte e potranno essere riveduti all'occorrenza : //

Desulfoglucoiberina 1,07 //

Desulfoglucobrassicanapina 1,15 //

Desulfoglucorafanina 1,07 //

Desulfo-4-idrossiglucobrassicina 0,28 //

Desulfoglucoalisina 1,07 //

Desulfoglucobrassicina 0,29 //

Desulfoprogoitrina 1,09 //

Desulfoneoglucobrassicina 0,20 //

Desulfoepi-Progoitrina 1,09 //

Desulfoglucotropeolina 0,95 //

Desulfosinigrina 1,00 //

Desulfogluconasturzina 0,95 //

Desulfogluconapina 1,11 //

Desulfogluconapoleiferina 1,00 //

Desulfo-4-metossiglucobrassicina 0,25 //

Altri desulfoglucosinolati 1,00

7.3 .

Tenore totale di glucosinolato . //

Il tenore totale di glucosinolato, espresso in micromoli per grammo di sostanza anidra del campione, è pari alla somma di ciascun glucosinolato, al quale corrisponde un picco la cui area supera dell'1 % la somma totale delle aree dei picchi . //

L'uso degli standard interni di riferimento a due concentrazioni ( 4.5.1 e 4.5.2 ) consente di tener conto della sinigrina contenuta nel campione o della presnza di un composto sconosciuto che eluisce insieme alla sinigrina //

_ se la differenza tra i risultati relativi al contenuto totale di glucosinolati delle due ripetizioni è conforme alle condizioni di ripetibilità ( 8.1.1 ), non vi è contaminazione del riferimento interno . Il risultato è la media aritmetica delle due determinazioni, //

_ se la differenza tra i risultati è al di fuori delle condizioni di ripetibilità ( 8.1.2 ), ripetere la determinazione su due altri campioni di prova ed eseguire una prova di riferimento ( 6.7 ) omettendo la soluzione di standard interno . L'area del contaminante viene detratta dall'area dello standard interno in modo da dare la vera e propria area del riferimento interno usata nella formula 7.1 . Il risultato è la media aritmetica dei risultati delle due nuove determinazioni .

8 .

PRECISIONE ED ACCURATEZZA

8.1 .

Precisione ( ripetibilità e riproducibilità ) //

Uno studio effettuato tra vari laboratori nel 1988 a livello internazionale con la partecipazione di 12 laboratori, ciascuno dei quali effettuava due determinazioni sui 4 campioni di colza, dà i valori di ripetibilità e di riproducibilità indicati nella tabella 1 . I risultati sono stati valutati secondo la norma ISO 5725 . //

( Statistical Application _ Accuracy of trial methods _ Determination of a trial method normalised by inter-laboratory trial : Applicazione statistica _ Accuratezza dei metodi di prova _ Determinazione di un metodo di prova normalizzato mediante una prova effettuata tra vari laboratori ).

Tabella 1 : Valori di ripetibilità e riproducibilità ottenuti a partire dallo studio tra vari laboratori

1.2.3.4.5 // // // // //

Campioni

Seme di ravizzone A

Seme di ravizzone B

Seme di ravizzone C

Seme di ravizzone D // // // // //

Numero di laboratori dopo l'eliminazione di quelli che hanno avuto risultati anomali

11

11

11

11 // // // // //

Media

20,6

14,1

4,9

25,6 // // // // //

Deviazione standard di ripetibilità

1,7

0,6

0,3

0,8

Coefficiente della variazione di ripetibilità

8,5 %

4,4 %

6,7%

3,3 %

Ripetibilità

4,9

1,7

0,9

2,4 // // // // //

Deviazione standard di riproducibilità

3,4

2,5

1,5

2,4

Coefficiente di variazione di riproducibilità

17 %

18 %

31 %

9,4 %

Riproducibilità

9,6

7,1

1,4

6,8 // // // // //

1.28.1.1 .

Ripetibilità . //

Nell'applicazione dei risultati di cui sopra ( 8.1 ), la differenza tra il valore del due determinazioni effettuate rapidamente, l'una dopo l'altra, dallo stesso analista che usava la stessa apparecchiatura sullo stesso campione di prova, non deve superare 2 *moli/g per contenuti inferiori a 20 *moli/g e 4 *moli/g per i contenuti compresi tra 20 e 35 *moli/g .

8.1.2 .

Riproducibilità . //

Nell'applicare i risultati di cui sopra ( 8.1 ), la differenza tra i valori del risultato finale ottenuto da due laboratori che usavano l'attuale metodo per analizzare lo stesso campione di laboratorio non deve superare le 4 *moli/g per contenuti inferiori a 20 *moli/g e 8 *moli/g per contenuti compresi tra 20 e 35 *moli/g .

8.2 .

Esattezza . //

L'utilizzazione corretta del metodo sarà verificata dalle misure ripetitive su dei campioni di riferimento a tenore certificato in glucosinolati totali e che coprono la gamma di concentrazione in questione . //

Dei campioni di riferimento appropriati a tenore certificato possono essere ottenuti presso il Bureau communautaire de référence ( BCR ) della Commissione delle Comunità europee . //

Il protocollo per paragonare i risultati di laboratorio ottenuti con dei campioni di riferimento a tenore certificato è descritto nel paragrafo " instruction for use " del rapporto che accompagna i campioni di riferimento .

9 .

RELAZIONE SULLA PROVA //

La relazione sulla prova deve definire il metodo usato ed il risultato ottenuto . Essa deve menzionare altresì qualsiasi dettaglio operativo non specificato nello standard internazionale o considerato come facoltativo, assieme a qualsiasi evento che possa eventualmente avere influenzato il risultato . //

La relazione sulla prova deve dare tutte le informazioni necessarie all'indentificazione completa del campione .*****

REGOLAMENTO (CEE) N. 1864/90 DELLA COMMISSIONE

del 29 giugno 1990

che modifica il regolamento (CEE) n. 1470/68 relativo al prelievo ed alla riduzione dei campioni, nonché ai metodi di analisi dei semi oleosi

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,

visto il regolamento (CEE) n. 136/66/CEE del Consiglio, del 22 settembre 1966, relativo all'attuazione di un'organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi (1), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 2902/89 (2), in particolare l'articolo 24 bis,

considerando che la denominazione « doppio zero » per i semi di colza e di ravizzone dipende dal loro tenore in glucosinolati; che è opportuno prevedere il metodo più idoneo per la determinazione di tale tenore;

considerando che il regolamento (CEE) n. 1470/68 della Commissione (3), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 2435/86 (4) ha definito un metodo unico comunitario per la determinazione del tenore di glucosinolati nei semi di colza; che in questi anni è stato messo a punto sperimentato un metodo d'analisi migliore e che è pertanto necessario modificare il metodo unico per la Comunità per la determinazione del tenore di glucosinolati;

considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i grassi,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

L'articolo VIII del regolamento (CEE) n. 1470/68 è sostituito dall'allegato del presente regolamento.

Articolo 2

Il presente regolamento entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Esso si applica a decorrere dal 1o luglio 1990.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, il 29 giugno 1990.

Per la Commissione

Ray MAC SHARRY

Membro della Commissione

(1) GU n. 172 del 30. 9. 1966, pag. 3025/66.

(2) GU n. L 280 del 29. 9. 1989, pag. 2.

(3) GU n. L 239 del 28. 9. 1968, pag. 2.

(4) GU n. L 210 dell'1. 8. 1986, pag. 55.

ALLEGATO

« ALLEGATO VIII

SEMI OLEOSI - DETERMINAZIONE DEI GLUCOSINOLATI

Mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

1.2 // // // 1. // CAMPO DI APPLICAZIONE // // Il presente allegato descrive un metodo per la determinazione di vari glucosinolati nei semi oleosi della specie Brassica, in particolare nella colza, mediante la cromatografia liquida ad alte prestazioni. Il metodo non comprende i glucosinolati sostituiti nella molecola di glucosio, che peraltro hanno scarsa importanza nel seme di colza commerciale. // 2. // RIFERIMENTI // // I campioni per l'analisi devono essere preparati conformemente ai corrispondenti allegati del presente regolamento. In particolare sono importanti i seguenti allegati: // // Allegato II - Riduzione dei campioni da contratto a campioni per analisi // // Allegato III - Determinazione del tenore di umidità e di sostanze volatili // 3. // PRINCIPIO // // Estrazione di glucosinolati in una soluzione di metanolo, quindi depurazione e desolfatazione enzimatica su resine a scambio ionico. Determinazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa con un gradiente di eluizione e rilevamento U.V. // 4. // REAGENTI E MATERIALI // // Tutti i reagenti devono essere di « reagent grade » e l'acqua usata deve essere acqua distillata o acqua di purezza almeno equivalente. // 4.1. // Metanolo, soluzione al 70 % (V/V) in acqua. // 4.2. // Acetato di sodio, soluzione 0,02 mol/l a pH 4,0. // 4.3. // Acetato di sodio, soluzione 0,2 mol/l. // 4.4. // Imidazolo formiato, soluzione 6 mol/l. // // Sciogliere 204 g di imidazolo in 113 ml di acido formico, in un pallone tarato da 500 ml. Portare a 500 ml con acqua. // 4.5. // Standard interno. // // Usare sinigrina (potassio allilglucosinolato monoidrato, PM = 415,49), la cui purezza deve essere controllata come indicato al punto 4.5.3. // 4.5.1. // Soluzione di sinigrina 5 mmol/l. // // Sciogliere 207,7 mg di potassio allilglucosinolato monoidrato in acqua, in un pallone tarato da 100 ml e portare a volume. // 4.5.2. // Soluzione di sinigrina 20 mmol/l. // // Sciogliere 831,0 mg di potassio allilglucosinolato monoidrato in acqua, in un pallone tarato da 100 ml e portare a volume. // // Conservare queste soluzioni in un frigorifero a circa 4 °C se si tratta di un breve periodo (ad esempio una settimana), oppure in un congelatore a - 18 °C per periodi più prolungati. // 4.5.3. // Prova di purezza della sinigrina. // // Usare una o più delle tre seguenti prove: // // - l'analisi mediante HPLC con il presente metodo dovrebbe dare un solo picco importante; // // - l'analisi della sinigrina intatta mediante HPLC (tecnica della coppia ionica) dovrebbe dare un solo picco importante; // // - l'analisi della sinigrina desolfatata e sililata mediante gascromatografia dovrebbe dare soltanto un picco importante. // // // In queste prove il picco principale deve rappresentare almeno il 98 % dell'area di picco totale. // // Confermare determinando il quantitativo di glucosio liberato dopo l'idrolisi con la mirosinasi (tioglucoside glucoidrolasi EC 3.2.3.1). Il glucosio deve essere dosato enzimaticamente usando una di quelle confezioni di reagenti reperibili in commercio. È necessario tener conto del glucosio eventualmente presente, che dovrà essere determinato senza aggiunta di mirosinasi. La concentrazione molare di glucosio misurata deve corrispondere ad almeno il 98 % della concentrazione molare della soluzione di sinigrina analizzata. // 4.5.4. // Standard interno alternativo: Glucotropeolina. // // In alcuni semi della specie Brassica o in semi di specie simili (coltivate o spontanee) la sinigrina può essere presente naturalmente. Quando la sinigrina è presente allo stato naturale, un altro controllo interno alternativo, la glucotropeolina (benzilglucosinolato sale potassico, PM = 447,52), dovrà essere utilizzato, ma qualche volta è difficile separarlo da altri glucosinolati naturali di minore importanza. // // Usare la glucotropeolina nello stesso modo (soluzioni 5 e 20 mmol/l) della sinigrina, dopo averne provato la purezza con la procedura descritta al punto 4.5.3 e verificato che il suo fattore di risposta, rispetto alla sinigrina, corrisponda a quella indicata al punto 7.2. // 4.6. // Fasi mobili. // 4.6.1. // Eluente A: l'acqua (qualità HPLC). // 4.6.2. // Eluente B: soluzione di acetonitrile (qualità HPLC) al 20 % (V/V) in acqua (qualità HPLC). La concentrazione può essere modificata in relazione alle colonne usate. // 4.7. // Resina a scambio ionico. // 4.7.1. // DEAE Sepharose C1-6B in sospensione, venduta pronta per l'uso. // 4.7.2. // DEAE Sephadex A25 in sospensione, preparata come segue: // // Miscelare 10 g di resina in un eccesso di acido acetico a 2 mol/l. Lasciar riposare. Aggiungere 2 mol/l di acido acetico finché il volume della sospensione diventa pari al doppio del volume del materiale depositato. // 4.8. // Solfatasi, Helix pomatia tipo H1 (EC 3.1.6.1), precedentemente purificata ed analizzata come indicato qui di seguito e quindi diluita. // 4.8.1. // Preparazione delle colonne a scambio ionico. // // Tagliare 5 pipette di Pasteur (5.9) 7 cm al di sopra del collo ed inserire nel collo stesso un tappo di lana di vetro (5.8). Appoggiare le pipette verticalmente su un supporto e sistemare in ciascuna di esse una sospensione di resina a scambio ionico DEAE Sepharose C1-6B (4.7.1) tale che, una volta che l'acqua è scolata via, si ottenga un volume di 500 ml di resina. // // Versare 1 ml di soluzione di imidazolo formiato 6 mol/l (4.4) in ciascuna pipetta e sciacquare 2 volte con 1 ml di acqua. // 4.8.2. // Depurazione della solfatasi. // // Pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 25 mg di Helix pomatia tipo H1, sciogliere in 2,5 ml di acqua e travasare 500 ml di questa soluzione in ciascuna della colonne rigenerate (4.8.1). Lavare ciascuna colonna con 1,5 ml di acqua rimuovendo l'effluente. Aggiungere quindi 1,5 mio di una soluzione di sodio acetato 0,2 mol/l (4.3), recuperare e raccogliere gli eluati delle 5 colonne in una provetta. // // Contentrare gli eluati mediante filtrazione su un Millipore PTGC 11K25 fino a ottenimento di un residuo di circa 100 ml (la solfatasi con un peso molecolare superiore a 5 000 non viene rimossa). Aggiungere 2,5 ml d'acqua e concentrare ancora una volta mediante filtrazione fino a ottenimento di un residuo di circa 100 ml. Portare a 2,5 ml con acqua e conservare le solfatasi depurata in un congelatore a una temperatura di - 18 °C (in piccoli quantitativi, in modo da consentire lo sgelamento del quantitativo necessario per un uso immediato). // 4.8.3. // Prova dell'attività della solfatasi. // 4.8.3.1. // Preparazione di una soluzione 0,15 mol/l di sinigrina, tamponata a pH 5,8. // // Preparare le seguenti soluzioni in successione: // // a) trasferire 1 ml di acido acetico in un pallone da 500 ml e portare a volume con acqua; // // b) trasferire 1 ml di etilendiammina in un pallone da 500 ml e portare a volume con acqua; // // // c) miscelare 73 ml di soluzione a) e 40 ml di soluzione b). // // d) portare a pH 5,8 con soluzioni a) o b). // // Versare 3 ml della soluzione 5 mol/l di sinigrina (4.5.1) in un pallone da 100 ml e portare a volume con la soluzione c). // 4.8.3.2. // Prova di attività. // // Un'unità di attività viene espressa come la produzione di 1 micromole di sinigrina desolfatata per minuto a 30 °C e a pH 5,8. // // Per la prova trasferire 2 ml della soluzione tamponata di sinigrina (4.8.3.1) nelle cellule di riferimento e di misurazione dello spettrometro (5.3) regolato a una lunghezza d'onda di 228 nm con una temperatura cellulare di 30 °C. Al tempo t = 0 sistemare 50 ml di solfatasi depurata (4.8.2) in una cellula di misurazione ed accendere il registratore. Spegnere il registratore quando l'assorbanza non cambia più (Ae), tracciare la tangente nel punto t = 0 e misurarne il gradiente D A D t . // // L'attività della solfatasi espressa in unità di attività per millilitro di soluzione di solfatasi è pari a: 1.2.3.4.5.6.7 // // D A D t // × // V D E // × // 1 000 50 // × 106 1.2 // // dove: 1.2.3 // // D A D t // è il gradiente della tangente nel punto t = 0, in unità di assorbanza per minuto; // // V // è il volume, in litri, del mezzo di reazione (cioè 2,0510 × 10-31); // // D E // è la differenza tra i coefficienti di estinzione molare della sinigrina e della sesulfosinigrina a 228 nm 1.2.3.4 // // // D E = // D Ae e × c 1.2.3 // // // dove: 1.2.3.4 // // // D Ae // è la differenza tra l'assorbanza all'equilibrio della sinigrina desolfatata e l'assorbanza nel tempo t = 0 // // // e // è la lunghezza cellulare, in centimetri (cioè 1 cm); // // // c // è la concentrazione della sinigrina desolfata al punto di equilibrio, in poli per litro (cioè 1.2.3.4.5.6 // // // // c = // 0,15 × 10-3 × 0,95 × 2 2,05 // = 1,39 × 10-4 mol/l 1.2 // // La resa al punto di equilibrio della desolfatazione della sinigrina è di 0,95. // // Calcolare DE che deve essere nell'ordine di 1 500 l.mol-1. cm-1 // // L'attività della solfatasi può essere calcolata altresì usando la seguente formula semplificata: 1.2.3 // // Attività = // D A × 5,7 D t × D Ae 1.2 // // L'attività trovata deve essere in eccesso di 0,5 m mol/min.ml di soluzione di solfatasi depurata (4.8.2). // 4.8.4. // Diluizione. // // Usando una pipetta trasferire 1 ml di solfatasi depurata (4.8.2) in un pallone tarato da 10 ml, portare a volume con acqua e agitare. Dividere la soluzione in piccole aliquote e conservare a - 18 °C. // 5. // APPARECCHIATURA // // Normale apparecchiatura da laboratorio e in particolare: // 5.1. // Cromatografo liquido ad alte prestazioni, per ottenere un gradiente di eluizione e controllo della temperatura della colonna a 30 °C, collegato a un rivelatore UV che consente misurazioni a 229 nm. // 5.2. // Colonna di cromatografia per HPLC, tipo C18 oppure C8 con particelle di dimensioni 5 mm, oppure ad esempio: 1.2.3 // // Colonna Lichrosorb RP 18 5 mm // (150 mm × 4,6 mm) // // Colonna Spherisorb ODS2 5 mm // (250 mm × 4-5 mm) // // Colonna Novapak C18 4 mm // (150 mm × 4 mm) // // Colonna Lichrospher RP8 5 mm // (125 mm × 4 mm) // // Colonna Nucleosil C18 5 mm // (200 mm × 4 mm) 1.2 // 1.2 // // Le prestazioni della colonna scelta devono essere regolarmente controllate, di preferenza usando un campione di riferimento costituito da desulfoglucosinolato di semi di ravizzone, di preferenza ottenuto dai campioni dell'Ufficio comunitario di riferimento. In particolare la colonna non deve decomporre la 4-idrossiglucobrassicina, glucosinolato importante, ma relativamente instabile. // // Le colonne nuove devono essere sottoposte ad una prova preliminare, in modo da poter ottenere risultati riproducibili. // 5.3. // Spettrofotometro a doppio raggio, capace di funzionare all'ultravioletto e, se possibile, ad una temperatura controllata di 30 °C, equipaggiato di cellule di quarzo e, se possibile, di un sistema di registrazione. // 5.4. // Micromacinatore, ad esempio un macinacaffè. // 5.5. // Centrifuga, per provette di 6 ml, in grado di raggiungere un'accelerazione di 5 000 giri. // 5.6. // Bagno d'acqua caldo o blocco di riscaldamento, regolabile a 75 °C. // 5.7. // Provette di polipropilene aventi una capacità di 6 ml. // 5.8. // Lana di vetro. // 5.9. // Pipette di Pasteur, lunghe 150 mm. // 6. // PROCEDIMENTO // 6.1. // Preparazione del campione di prova. // // Ridurre il campione di laboratorio secondo l'allegato II e triturare nel micromacinatore (5.4) per 20 secondi. Mescolare la farina e triturarla per altri 5 secondi. // // Se i semi hanno un tenore di umidità superiore al 10 % (m/m), essiccarli in primo luogo usando una corrente d'aria di circa 45 °C. // // Nota: Se si analizzano i semi trattati, lavarli con diclorometano prima di macinarli. // 6.2. // Determinazione del tenore di umidità e di sostanze volatili // // Determinare il tenore di umidità e di sostanze volatili del campione di prova in conformità con l'allegato III. // 6.3. // Aliquota di prova. // // Preparare due provette (5.7) e trasferire 200 mg di campione di prova di semi oleosi, pesati con l'approssimazione di 0,1 milligrammi, in ciascuna di esse. // 6.4. // Estrazione dei glucosinolati. // // Immergere le provette nel bagno d'acqua caldo o nel blocco di riscaldamento (5.6) regolato a 75 °C e lasciarle per 1 minuto. Aggiungere 2 ml di una soluzione bollente costituita dal 70 % di metanolo (4.1) e aggiungere quindi immediatamente: // // - nella prima provetta A, 200 ml di soluzione di 5 mmol/l di sinigrina (4.5.1); // // - nella seconda provetta B, 200 ml di soluzione 20 mmol/l di sinigrina (4.5.2). // // Continuare a scaldare nel bagno d'acqua a 75 °C per 10 minuti agitando regolarmente. Mescolare il contenuto di ciascuna provetta e centrifugare con un'accelerazione di 5 000 giri per 3 minuti. Trasferire ciascun surnatante in un'altra provetta (5.7). // // Aggiungere 2 ml di una soluzione di metanolo bollente al 70 % (4.1) a ciascun sedimento e scaldare nuovamente nel bagno d'acqua a 75 ° per 10 minuti, agitando regolarmente. Centrifugare per 3 minuti e aggiungere il surnatante all'originale. Portare il volume a circa 5 ml con acqua ed agitare. // // Questo estratto può essere conservato per 2 settimane, al buio, in un congelatore alla temperatura di - 18 °C. // 6.5. // Preparazione delle colonne a scambio ionico. // // Tagliare il numero necessario di pipette di Pasteur (5.9), cioè una pipetta per campione, in modo da lasciare un volume di 1,2 ml al di sopra del collo e inserire un tappo di lana di vetro (5.8) nel collo. Sistemare le pipette verticalmente su un supporto. // // Immettere 0,5 ml della sospensione ben miscelata di DEAE Sephadex A 25 (4.7.2) in ciascuna colonna e lasciar riposare. // // Sciacquare le colonne con 2 ml di imidazolo formiato 6 mol/l (4.4) e poi 2 volte con 1 ml di acqua. //

// // // 6.6. // Purificazione e desolfatazione. // // Depositare 1 ml dell'estratto (6.4) nella colonna preparata (6.5) senza alterare la superficie della resina e lasciar scolare. Aggiungere due volte 1 ml di tampone all'acetato di sodio, a 0,02 mol/l, pH 4,0 (4.2) lasciandolo scolare ogni volta. // // Depositare 75 ml di soluzione di solfatasi purificata diluita (4.8.4). Lasciare agire tutta la notte a temperatura ambiene. Diluire il desulfoglucosinolato ottenuto con due porzioni da 1 ml di acqua (qualità CLAP) lasciate scolare tra un'aggiunta e l'altra. Raccogliere l'eluato in una provetta. Agitare bene l'eluato e conservare al buio in un congelatore a - 18 °C, a meno che non debba essere cromatografato immediatamente. // 6.7. // Prova di riferimento. // // Se necessario (vedi 7.3), eseguire una prova di riferimento nelle stesse condizioni e sulla stessa porzione di prova, ma omettendo la soluzione di standard interno della sinigrina, in modo da individuare e quantificare, se possibile, la sinigrina presente nell'aliquota di prova. // 6.8. // Cromatografia. // 6.8.1. // Regolazione dell'apparechio. // // Velocità di efflusso della fase mobile: dipende dalla natura della colonna (vedi 6.8.2) // // Temperatura della colonna: 30 °C // // Lunghezza d'onda di rivelazione: 229 nm // 6.8.2. // Prova e gradiente di eluizione // // Usando le istruzioni d'uso dell'apparecchio iniettare non oltre 50 ml della soluzione di desulfoglucosinolati ottenuta al punto 6.6. // // A seconda della colonna usata può essere opportuno un certo numero di gradienti. // // - Colonna Spherisorb RP 18 5 mm (150 mm × 4,6 mm): // // - 100 % di eluente A (4.6.1) + 0 % di eluente B (4.6.2) per 1 minuto; // // - un gradiente di eluzione lineare in 20 minuti fino a ottenimento dello 0 % di eluente A e del 100 % di eluente B; // // - un gradiente di eluzione lineare in 5 minuti fino a ottenimento del 100 % di eluente A e dello 0 % di eluente B; // // - 100 % di eluente A e 0 % di eluente B per 5 minuti per equilibrare. // // - Colonna Lichrospher RP8 5 mm (125 mm × 4,0 mm): // // - 100 % di eluente A per 2 minuti e 30 secondi; // // - un gradiente di eluzione lineare in 18 minuti fino a ottenimento dello % di eluente A + 100 % di eluente B; // // - 100 % di eluente B per 5 minuti; // // - un gradiente di eluzione lineare in 2 minuti dello 0 % di eluente A + 100 % dell'eluente B fino a ottenimento del 100 % di eluente A e dello 0 % di eluente B; // // - equilibrare per 5 minuti. // // Nota: L'andamento dei gradienti può essere modificato in modo da dare separazioni ottimali conformemente alle colonne usate. // 6.8.3. // Esame dei cromatogrammi. // // Prendere in considerazione unicamente i picchi dei glucosinolati di area superiore all'1 % della somma totale dell'area dei picchi. // // L'ordine di eluzione dei picchi con una colonna del tipo C18 ed il gradiente di eluzione di 6.8.2 è generalmente come segue: // // 1. Desulfoglucoiberina // // 2. Desulfoprogoitrina // // 3. Desulfoepi-Progoitrina // // 4. Desulfosinigrina // // 5. Desulfoglucorafanina // // 6. Desulfogluconapoleiferina // // 7. Desulfoglucoalisina // // 8. Desulfogluconapina // // 9. Desulfo-4-idrossiglucobrassicina // // 10. Desulfoglucobrassicanapina // // 11. Desulfoglucotropeolina // // 12. Desulfoglucobrassicina // // 13. Desulfogluconasturzina // // 14. Desulfo-4-metossiglucobrassicina // // 15. Desulfoneoglucobrassicina. // // 7. // ESPRESSIONE DEI RISULTATI // 7.1. // Calcolo del contenuto di ciascun glucosinolato // // Il contenuto di ciascun glucosinolato, espresso in micromoli per grammo di semi secchi interi, è pari a:

1.2.3.4 // // area del picco del desulfoglucosinolato area del picco della desulfosinigrina // × // quantità di standard interno aggiunto alla provetta di 6.4 (in mmoli) peso del campione di seme estratto 1.2.3.4 // // × fattore di risposta del desulfoglucosinolato (7.2) // × // 100 100 - H 1.2 // // dove: // // H è il contenuto di umidità e di sostanze volatili espresso come percentuale in massa del campione di prova (6.2). // // In taluni casi l'espressione dei risultati viene richiesta a un livello di umidità specifico (adesso 9 %). In questi casi moltiplicare per // // (1 000 - umidità) 100 // // il risultato ottenuto per la sostanza secca. // 7.2. // Fattori di risposta. // // I valori del fattore di risposta sono stati determinati sperimentalmente; essi sono stati concordati tra i vari laboratori che hanno preso parte e potranno essere riveduti all'occorrenza: // // Desulfoglucoiberina 1,07 // // Desulfoglucobrassicanapina 1,15 // // Desulfoglucorafanina 1,07 // // Desulfo-4-idrossiglucobrassicina 0,28 // // Desulfoglucoalisina 1,07 // // Desulfoglucobrassicina 0,29 // // Desulfoprogoitrina 1,09 // // Desulfoneoglucobrassicina 0,20 // // Desulfoepi-Progoitrina 1,09 // // Desulfoglucotropeolina 0,95 // // Desulfosinigrina 1,00 // // Desulfogluconasturzina 0,95 // // Desulfogluconapina 1,11 // // Desulfogluconapoleiferina 1,00 // // Desulfo-4-metossiglucobrassicina 0,25 // // Altri desulfoglucosinolati 1,00 // 7.3. // Tenore totale di glucosinolato. // // Il tenore totale di glucosinolato, espresso in micromoli per grammo di sostanza anidra del campione, è pari alla somma di ciascun glucosinolato, al quale corrisponde un picco la cui area supera dell'1 % la somma totale delle aree dei picchi. // // L'uso degli standard interni di riferimento a due concentrazioni (4.5.1 e 4.5.2) consente di tener conto della sinigrina contenuta nel campione o della presnza di un composto sconosciuto che eluisce insieme alla sinigrina // // - se la differenza tra i risultati relativi al contenuto totale di glucosinolati delle due ripetizioni è conforme alle condizioni di ripetibilità (8.1.1), non vi è contaminazione del riferimento interno. Il risultato è la media aritmetica delle due determinazioni, // // - se la differenza tra i risultati è al di fuori delle condizioni di ripetibilità (8.1.2), ripetere la determinazione su due altri campioni di prova ed eseguire una prova di riferimento (6.7) omettendo la soluzione di standard interno. L'area del contaminante viene detratta dall'area dello standard interno in modo da dare la vera e propria area del riferimento interno usata nella formula 7.1. Il risultato è la media aritmetica dei risultati delle due nuove determinazioni. // 8. // PRECISIONE ED ACCURATEZZA // 8.1. // Precisione (ripetibilità e riproducibilità) // // Uno studio effettuato tra vari laboratori nel 1988 a livello internazionale con la partecipazione di 12 laboratori, ciascuno dei quali effettuava due determinazioni sui 4 campioni di colza, dà i valori di ripetibilità e di riproducibilità indicati nella tabella 1. I risultati sono stati valutati secondo la norma ISO 5725. // // (Statistical Application - Accuracy of trial methods - Determination of a trial method normalised by inter-laboratory trial: Applicazione statistica - Accuratezza dei metodi di prova - Determinazione di un metodo di prova normalizzato mediante una prova effettuata tra vari laboratori). // // // Tabella 1: Valori di ripetibilità e riproducibilità ottenuti a partire dallo studio tra vari laboratori 1.2.3.4.5 // // // // // // Campioni // Seme di ravizzone A // Seme di ravizzone B // Seme di ravizzone C // Seme di ravizzone D // // // // // // Numero di laboratori dopo l'eliminazione di quelli che hanno avuto risultati anomali // 11 // 11 // 11 // 11 // // // // // // Media // 20,6 // 14,1 // 4,9 // 25,6 // // // // // // Deviazione standard di ripetibilità // 1,7 // 0,6 // 0,3 // 0,8 // Coefficiente della variazione di ripetibilità // 8,5 % // 4,4 % // 6,7% // 3,3 % // Ripetibilità // 4,9 // 1,7 // 0,9 // 2,4 // // // // // // Deviazione standard di riproducibilità // 3,4 // 2,5 // 1,5 // 2,4 // Coefficiente di variazione di riproducibilità // 17 % // 18 % // 31 % // 9,4 % // Riproducibilità // 9,6 // 7,1 // 1,4 // 6,8 // // // // // 1.2 // 8.1.1. // Ripetibilità. // // Nell'applicazione dei risultati di cui sopra (8.1), la differenza tra il valore del due determinazioni effettuate rapidamente, l'una dopo l'altra, dallo stesso analista che usava la stessa apparecchiatura sullo stesso campione di prova, non deve superare 2 mmoli/g per contenuti inferiori a 20 m moli/g e 4 mmoli/g per i contenuti compresi tra 20 e 35 m moli/g. // 8.1.2. // Riproducibilità. // // Nell'applicare i risultati di cui sopra (8.1), la differenza tra i valori del risultato finale ottenuto da due laboratori che usavano l'attuale metodo per analizzare lo stesso campione di laboratorio non deve superare le 4 mmoli/g per contenuti inferiori a 20 mmoli/g e 8 mmoli/g per contenuti compresi tra 20 e 35 mmoli/g. // 8.2. // Esattezza. // // L'utilizzazione corretta del metodo sarà verificata dalle misure ripetitive su dei campioni di riferimento a tenore certificato in glucosinolati totali e che coprono la gamma di concentrazione in questione. // // Dei campioni di riferimento appropriati a tenore certificato possono essere ottenuti presso il Bureau communautaire de référence (BCR) della Commissione delle Comunità europee. // // Il protocollo per paragonare i risultati di laboratorio ottenuti con dei campioni di riferimento a tenore certificato è descritto nel paragrafo « instruction for use » del rapporto che accompagna i campioni di riferimento. // 9. // RELAZIONE SULLA PROVA // // La relazione sulla prova deve definire il metodo usato ed il risultato ottenuto. Essa deve menzionare altresì qualsiasi dettaglio operativo non specificato nello standard internazionale o considerato come facoltativo, assieme a qualsiasi evento che possa eventualmente avere influenzato il risultato. // // La relazione sulla prova deve dare tutte le informazioni necessarie all'indentificazione completa del campione.