ALLEGATO I

Schema delle prove da effettuare a norma degli articoli 3, 4, 5, 7 e 8

1. PRINCIPI GENERALI RELATIVI ALLA PRESENZA DELL’ORGANISMO NOCIVO SPECIFICATO

1.1. Si sospetta la presenza dell’organismo nocivo specificato quando si ottiene un risultato positivo nella prima prova di individuazione effettuata sulla pianta specificata. Per il materiale vegetale sintomatico la prima prova di individuazione può essere un isolamento selettivo.

1.2. La presenza dell’organismo nocivo specificato è confermata su campioni sintomatici delle piante specificate nei seguenti casi: a) quando la prima prova di individuazione è un isolamento selettivo che dà luogo a colonie con morfologia tipica: si ottengono risultati positivi in due prove di identificazione; b) quando la prima prova di individuazione è una prova diversa dall’isolamento selettivo: i) si ottengono risultati positivi in due prove di identificazione dopo che il campione è stato sottoposto a isolamento selettivo; ii) si ottengono risultati positivi in una seconda prova di individuazione diversa dall’isolamento selettivo.

1.3. La presenza dell’organismo nocivo specificato è confermata su campioni asintomatici delle piante specificate nei seguenti casi: a) quando si ottiene un risultato positivo nella seconda prova di individuazione a condizione che la prima o la seconda prova di individuazione sia una prova molecolare (basata sul DNA) (PCR in tempo reale TaqMan® o PCR tradizionale); b) per i campioni prelevati in uno Stato membro o in un’area di uno Stato membro in cui non è nota la presenza dell’organismo nocivo specificato e per i campioni originari di un altro Stato membro: quando si ottengono un risultato positivo nella seconda prova di individuazione conformemente alla lettera a) e risultati positivi in due prove di identificazione effettuate dopo che il campione è stato sottoposto a isolamento selettivo.

2. PROVE

2.1. Prove di individuazione

Le prove di individuazione sono tali da individuare sistematicamente almeno 104 cellule/ml di sedimento risospeso.

La seconda prova di individuazione deve basarsi su principi biologici o regioni nucleotidiche differenti rispetto alla prima prova di individuazione.

Le prove di individuazione sono le seguenti:

a) prove di immunofluorescenza, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

b) ibridazione fluorescente in situ (FISH) [van Beuningen et al. (1995) (1)], come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

c) isolamento, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali, applicando una delle due opzioni seguenti: i) isolamento diretto su substrati colturali semiselettivi (o non selettivi), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; ii) dopo l’arricchimento mediante saggio biologico, isolamento come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

d) PCR tradizionale utilizzando i primer di Pastrik (2000) (2), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

e) PCR in tempo reale TaqMan® utilizzando i primer e le sonde di: i) Schaad et al. (1999) (3), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (prova NYtor), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iii) Gudmestad et al. (2009), adattato da Vreeburg et al. (2018)4, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iv) Massart et al. (2014) (5), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

2.2. Prove di identificazione

Le prove di identificazione sono le seguenti:

a) una prova di immunofluorescenza, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

b) PCR tradizionale [Pastrik (2000)], come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

c) PCR in tempo reale TaqMan® utilizzando i primer e le sonde di: i) Schaad et al. (1999), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; ii) Vreeburg et al. (2018) (prova NYtor), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iii) Gudmestad et al. (2009), adattato da Vreeburg et al. (2018), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iv) Massart et al. (2014), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

d) DNA barcoding, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

e) spettrometria di massa MALDI-TOF (Zaluga et al. (2011) (6)), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

3. DIAGRAMMI DI FLUSSO DEI PROCEDIMENTI

Diagramma di flusso n. 1: procedimento diagnostico per accertare la presenza dell’organismo nocivo specificato in campioni sintomatici della pianta specificata.

a Per la prima o la seconda prova di individuazione può essere utilizzato l’isolamento. Se si sospetta la presenza dell’organismo nocivo specificato sul substrato colturale, occorre purificare le colonie in modo da ottenere colture pure sulle quali effettuare due prove di identificazione. Per confermare la presenza dell’organismo nocivo sono necessari risultati positivi nelle due prove di identificazione.

b La terza prova di individuazione deve basarsi su principi biologici o regioni nucleotidiche differenti.

Diagramma di flusso n. 2: procedimento diagnostico per accertare la presenza dell’organismo nocivo specificato in campioni asintomatici della pianta specificata.

a Non va utilizzato l’isolamento.

b La terza prova di individuazione deve basarsi su principi biologici o regioni nucleotidiche differenti. Non va utilizzato l’isolamento.

c Per i campioni di cui al punto 1.3, lettera b), la conferma della presenza dell’organismo nocivo specificato dopo la seconda prova di individuazione positiva richiede l’isolamento dell’organismo nocivo specificato dal campione, seguito da due prove di identificazione positive.

4. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

4.1. Campioni di tuberi asintomatici

Il campione standard è di 200 tuberi per prova. Il procedimento di laboratorio appropriato per trattare i coni ombelicali al fine di ottenere l’estratto per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato è descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

4.2. Campioni di materiale vegetale asintomatico diverso dai tuberi

L’individuazione delle infezioni latenti è effettuata su campioni compositi di segmenti di fusto. Il procedimento può essere applicato per un massimo di 200 parti di fusto di piante diverse in un unico campione. Il procedimento di laboratorio appropriato per disinfettare e trattare i segmenti di fusto al fine di ottenere l’estratto per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato è descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

4.3. Campioni della pianta specificata sintomatica

Sono asetticamente rimosse sezioni di tessuto dall’anello vascolare di un tubero o dai fasci vascolari del fusto delle piante specificate che presentano sintomi di avvizzimento. Il procedimento di laboratorio appropriato per trattare tali tessuti al fine di ottenere l’estratto per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato è descritto dettagliatamente nelle norme diagnostiche internazionali.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). «Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe». Züchtungs Forschung 1, 266-269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). «Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA». European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). «Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system». Plant Disease 83, 1095-1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). «Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach». EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). «Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay». European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). «GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter». Systematic and applied microbiology 34, 400-7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.