Regolamento (CE) n. 440/2003 della Commissione, del 10 marzo 2003, recante modificazione del regolamento (CEE) n. 2676/90 che determina i metodi d'analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino



Gazzetta ufficiale n. L 066 del 11/03/2003 pag. 0015 - 0023



Regolamento (CE) n. 440/2003 della Commissione del 10 marzo 2003 recante modificazione del regolamento (CEE) n. 2676/90 che determina i metodi d'analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, visto il regolamento (CE) n. 1493/1999 del Consiglio, del 17 maggio 1999, relativo all'organizzazione comune del mercato vitivinicolo(1), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 2585/2001(2), in particolare l'articolo 46, paragrafo 3, primo comma, considerando quanto segue: (1) L'allegato del regolamento (CEE) n. 2676/90 della Commissione(3), modificato da ultimo dal regolamento (CEE) n. 1622/2000(4), descrive i metodi d'analisi da utilizzare nel settore del vino. (2) È stato approntato e convalidato, secondo criteri riconosciuti a livello internazionale, un metodo d'analisi dell'acido D-malico adatto alla misurazione di bassi tenori di acido D-malico nei vini. La descrizione di tale nuovo metodo è stata adottata dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino nel corso della sua assemblea generale del giugno 2002. (3) È stato approntato e convalidato, secondo criteri riconosciuti a livello internazionale, un nuovo metodo d'analisi del rapporto isotopico del carbonio dell'etanolo del vino o dell'etanolo ottenuto per fermentazione dei mosti di uve, dei mosti di uve concentrati e dei mosti di uve concentrati rettificati. La descrizione di tale nuovo metodo è stata adottata dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino nel corso della sua assemblea generale del 2001. (4) L'applicazione di questi metodi d'analisi può migliorare il controllo della qualità e dell'autenticità dei vini ed evitare controversie conseguenti all'applicazione di metodi di controllo meno precisi, segnatamente per quanto riguarda l'arricchimento mediante miscele di zuccheri di differenti provenienze e il controllo dell'acidificazione dei vini con acido malico. (5) Occorre completare il metodo in vigore per il dosaggio dell'acido D-malico, descritto nell'allegato del regolamento (CEE) n. 2676/90, precisando la procedura applicabile per la determinazione di bassi tenori nonché inserire la descrizione del nuovo metodo isotopico per il carbonio dell'etanolo. (6) Le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i vini, HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO: Articolo 1 L'allegato del regolamento (CEE) n. 2676/90 è modificato come segue: 1) Al capitolo "20. Acido D-malico", il testo del punto 8 è sostituito da quello riportato nell'allegato I del presente regolamento. 2) È aggiunto il capitolo 45 riportato nell'allegato II del presente regolamento. Articolo 2 Il presente regolamento entra in vigore il settimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 10 marzo 2003. Per la Commissione Franz Fischler Membro della Commissione (1) GU L 179 del 14.7.1999, pag. 1. (2) GU L 345 del 29.12.2001, pag. 10. (3) GU L 272 del 3.10.1990, pag. 1. (4) GU L 194 del 31.7.2000, pag. 1. ALLEGATO I "8. DOSAGGIO DELL'ACIDO D-MALICO [D(+)-MALICO] NEI VINI, PER BASSI TENORI 8.1. Campo di applicazione Il metodo descritto è applicato al dosaggio, per via enzimatica, dell'acido D-malico dei vini con tenori inferiori a 50 mg/l. 8.2. Principio Il principio del metodo è descritto al punto 1. La formazione di NADH, misurata tramite l'aumento dell'assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di D-malato presente, dopo l'introduzione, nella cella di misurazione, di una quantità di acido D-malico equivalente a 50 mg/l. 8.3. Reagenti Soluzione di acido D-malico a 0,199 g/l, oltre ai reagenti indicati al punto 2. 8.4. Apparecchiatura La stessa indicata al punto 3. 8.5. Preparazione del campione Come indicato al punto 4. 8.6. Modo di operare Il modo di operare è quello indicato al punto 5, ma con l'introduzione nella cella di misurazione di una quantità di acido D-malico equivalente a 50 mg/l (introduzione di 0,025 ml di una soluzione di acido D-malico a 0,199 g/l, in sostituzione del volume equivalente dell'acqua); i valori ottenuti sono diminuiti di 50 mg/l. 8.7. Convalida interna La seguente tabella riassume il dossier di convalida interna del metodo di dosaggio dell'acido D-malico, dopo aggiunta preliminare di 50 mg/l di questo isomero. >SPAZIO PER TABELLA>" ALLEGATO II "45. DETERMINAZIONE DEL RAPPORTO ISOTOPICO 13C/12C PER SPETTROMETRIA DI MASSA ISOTOPICA DELL'ETANOLO DEL VINO O DELL'ETANOLO OTTENUTO PER FERMENTAZIONE DEI MOSTI, DEI MOSTI CONCENTRATI O DEI MOSTI CONCENTRATI RETTIFICATI 1. CAMPO DI APPLICAZIONE Il metodo consente la misurazione del rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo del vino e di quello dell'etanolo ottenuto per fermentazione dei prodotti derivati della vite (mosto, mosto concentrato, mosto concentrato rettificato). 2. RIFERIMENTI NORMATIVI ISO: 5725: 1994 'Esattezza dei risultati e metodi di misura - Determinazione della ripetibilità e della riproducibilità di un metodo di misura normalizzato mediante test interlaboratori' V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372). Metodo 8 dell'allegato del presente regolamento: 'Rivelazione dell'aumento di titolo alcolometrico naturale dei mosti di uve, dei mosti di uve concentrati, dei mosti di uve concentrati rettificati e dei vini mediante la risonanza magnetica nucleare del deuterio (RMN-FINS)'. 3. TERMINI E DEFINIZIONI 13C/12C: Rapporto tra il numero di isotopi del carbonio 13 (13C) e del carbonio 12 (12C) per un campione determinato. δ13C: Tenore di carbonio 13 (13C) espresso in parti per mille ([permil ]). RMN-FINS: Frazionamento isotopico naturale specifico studiato per risonanza magnetica nucleare. V-PDB: Vienna Pee Dee Belemnite. Il PDB, riferimento primario per la misura delle variazioni naturali dei tenori isotopici di carbonio 13, era un carbonato di calcio proveniente da un rostro di belemnite del periodo Cretaceo della formazione 'Pee-Dee' dello Stato della Carolina del Sud (USA). Il suo rapporto isotopico 13C/12C o RPDB è RPDB = 0,0112372. Il PDB è esaurito da parecchio tempo, ma è rimasto il riferimento primario per esprimere le variazioni naturali dei tenori isotopici di carbonio 13, rispetto al quale vengono tarati i materiali di riferimento, disponibili presso l'Agenzia internazionale dell'energia atomica (AIEA) a Vienna (Austria). Le determinazioni isotopiche dell'abbondanza naturale di carbonio 13 sono pertanto espresse, per convenzione, rispetto al V-PDB. m/z: Rapporto massa/carico. 4. PRINCIPIO Nella fotosintesi, l'assimilazione di anidride carbonica da parte dei vegetali avviene secondo due principali tipi di metabolismo: il C3 (ciclo di Calvin) e il C4 (Hatch e Slack). Questi due meccanismi di fotosintesi presentano un frazionamento isotopico differente. I prodotti delle piante C4, quali gli zuccheri e l'alcole da fermentazione, presentano dei tenori di carbonio 13 più elevati di quelli dei loro omologhi provenienti dalle piante C3. La maggior parte dei vegetali quali la vite e la barbabietola, appartengono al gruppo C3. La canna da zucchero e il granturco appartengono al gruppo C4. La misurazione del tenore di carbonio 13 consente quindi di rivelare e di valutare lo zucchero di origine C4 (zucchero di canna o isoglucosio di granturco) aggiunto ai prodotti derivati dall'uva (mosti di uve, vini ...). Le informazioni combinate del tenore di carbonio 13 con quelle ottenute per RMN-FINS consentono anche di quantificare l'aggiunta di miscele di zuccheri o di alcoli originari delle piante C3 e C4. Il tenore di carbonio 13 è determinato sull'anidride carbonica risultante dalla combustione completa del campione. Le abbondanze dei principali isotopomeri di massa 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 e 12C17O16O) e 46 (12C16O18O), risultanti dalle varie combinazioni possibili degli isotopi 18O, 17O, 16O, 13C e 12C, vengono determinate a partire dalle correnti ioniche misurate su tre collettori differenti di uno spettrometro di massa isotopica. I contributi degli isotopomeri 13C17O16O e 12C17O2 possono essere trascurati, data la loro abbondanza molto scarsa. La corrente ionica per m/z = 45 viene corretta, per tener conto del contributo di 12C17O16O che viene calcolato in funzione dell'intensità della corrente misurata per m/z = 46, considerando le abbondanze relative di 18O e 17O (correzione di Craig). La comparazione con un riferimento tarato in base al riferimento internazionale V-PDB consente il calcolo del tenore di carbonio 13 sulla scala relativa δ13C. 5. REAGENTI I materiali e le sostanze consumabili dipendono dall'apparecchiatura (6) utilizzata dal laboratorio. I sistemi generalmente utilizzati sono quelli basati sull'analizzatore elementare. Quest'ultimo può essere progettato per l'introduzione di campioni posti in capsule metalliche sigillate o per l'iniezione di campioni liquidi attraverso una membrana con una siringa. A seconda del tipo di apparecchiatura utilizzata, possono essere utilizzati i seguenti materiali di riferimento, reagenti e sostanze consumabili: - Materiali di riferimento - disponibili presso l'AIEA: >SPAZIO PER TABELLA> - disponibili presso l'IRMM di Geel (B) (Istituto dei materiali e misure di riferimento): >SPAZIO PER TABELLA> - Campione standard di lavoro con rapporto 13C/12C noto, tarato su materiali di riferimento internazionali. - L'elenco indicativo delle sostanze consumabili qui in appresso vale per i sistemi a flusso continuo: - Elio per analisi (CAS 07440-59-7), - Ossigeno per analisi (CAS 07782-44-7), - Biossido di carbonio per analisi, utilizzato come gas di riferimento secondario per il tenore di carbonio 13 (CAS 00124-38-9), - Reagente di ossidazione per il forno del sistema di combustione, ad esempio ossido di rame (II) per analisi elementare (CAS 1317-38-0), - Essiccante per eliminare acqua prodotta dalla combustione, ad esempio, anidrone per analisi elementare (perclorato di magnesio) (CAS 10034-81-8). (Non necessario per le apparecchiature dotate di un sistema di eliminazione dell'acqua per criocattura o mediante un capillare selettivamente permeabile). 6. ATTREZZATURA E MATERIALE 6.1. Spettrometro di massa per rapporto isotopico (SMRI) Spettrometro di massa per rapporto isotopico (SMRI) che consente di determinare il tenore relativo di 13C del gas CO2 in abbondanza naturale con una precisione interna dello 0,05 [permil ] o meglio espresso in valore relativo (9). La precisione interna viene qui definita come la differenza tra due misure dello stesso campione di CO2. Lo spettrometro di massa per la misurazione dei rapporti isotopici è generalmente munito di un collettore triplo per misurare simultaneamente le intensità per m/z = 44, 45 e 46. Lo spettrometro di massa per rapporto isotopico deve essere munito di un sistema di introduzione doppio, per misurare in alternanza il campione in esame e un campione di riferimento oppure deve disporre di un sistema integrato che effettui la combustione quantitativa dei campioni e separi il biossido di carbonio dagli altri prodotti della combustione prima della misurazione nello spettrometro di massa. 6.2. Apparecchiatura di combustione Apparecchiatura di combustione in grado di convertire quantitativamente l'etanolo in biossido di carbonio ed eliminare tutti gli altri prodotti di combustione (acqua compresa) senza alcun frazionamento isotopico. L'apparecchiatura può essere costituita da un sistema a flusso continuo incorporato nella strumentazione di spettrometria di massa (6.2.1) o da un sistema di combustione distinto (6.2.2). Essa deve consentire di ottenere una precisione almeno equivalente a quella indicata al punto 11. 6.2.1. Sistemi a flusso continuo Questi sistemi sono costituiti da un analizzatore elementare o da un cromatografo in fase gassosa munito di un sistema di combustione in linea. Per i sistemi atti all'introduzione dei campioni contenuti in capsule metalliche, viene utilizzato il seguente materiale di laboratorio: - microsiringa o micropipetta volumetrica con punte adeguate, - bilancia con sensibilità di lettura almeno di 1 μg, - pinza per incapsulamento, - capsule di stagno per campioni liquidi, - capsule di stagno per campioni solidi. Nota: per limitare i rischi di evaporazione dei campioni di etanolo, è possibile porre nelle capsule una sostanza assorbente (ad esempio, cromosorb W 45-60 maglie) di cui si sarà preventivamente verificato, con una misurazione in bianco, che non contiene quantità significative di carbonio tali da alterare le misurazioni. Nel caso di un analizzatore elementare con iniettore per liquidi o di un sistema di preparazione per cromatografia-combustione, viene utilizzato il seguente materiale di laboratorio: - siringa per liquidi, - flaconi a chiusura stagna e setti inerti. Questi materiali di laboratorio sono qui indicati a titolo esemplificativo e possono essere sostituiti con altri materiali che offrano prestazioni equivalenti, a seconda del tipo di apparecchiatura di combustione e di spettrometria di massa utilizzata dal laboratorio. 6.2.2. Sistemi di preparazione separati In questo caso, i campioni di biossido di carbonio derivanti dalla combustione dei campioni in esame e del riferimento sono raccolti in fiale che sono successivamente poste nel doppio sistema di entrata dello spettrometro per l'analisi isotopica. Si possono utilizzare diversi tipi di apparecchiature di combustione descritte nella letteratura: - sistema chiuso di combustione riempito con gas ossigeno circolante, - analizzatore elementare con flusso di elio e di ossigeno, - fiala sigillata in vetro riempita con ossido di rame (II), come agente ossidante. 7. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER IL TEST L'etanolo deve essere estratto a partire dal vino prima della determinazione isotopica. Questa estrazione viene effettuata per distillazione del vino, come descritto al punto 3.1 del metodo n. 8 (RMN-FINS). Nel caso di mosto di uve, di mosto di uve concentrato e di mosto di uve concentrato rettificato, gli zuccheri devono essere fermentati in etanolo, innanzitutto come descritto al punto 3.2 del metodo n. 8. 8. MODO DI OPERARE Tutte le fasi preparatorie devono essere effettuate senza perdita significativa di etanolo per evaporazione, il che altererebbe la composizione isotopica del campione. La descrizione qui in appresso fa riferimento alle procedure generalmente utilizzate per la combustione dei campioni di etanolo mediante sistemi automatici di combustione esistenti in commercio. Per la preparazione del biossido di carbonio per l'analisi isotopica può essere utilizzato qualsiasi altro metodo che procuri che il campione di etanolo sia quantitativamente convertito in biossido di carbonio, senza alcuna perdita di etanolo per evaporazione. Procedura sperimentale basata sull'utilizzazione di un analizzatore elementare a) Incapsulamento dei campioni - utilizzare capsule, pinze e un vassoio di preparazione puliti, - prendere una capsula della dimensione adeguata con le pinze, - introdurre il volume necessario di liquido nella capsula con la micropipetta, - nota bene: per ottenere 2 mg di carbonio sono necessari 3,84 mg di etanolo assoluto oppure 4,17 mg di distillato con titolo alcolometrico di 92 % m/m. La quantità appropriata di distillato deve essere calcolata nello stesso modo a seconda della quantità di carbonio necessaria in funzione della sensibilità della strumentazione di spettrometria di massa, - richiudere la capsula con le pinze, - ogni capsula dev'essere chiusa a tenuta assolutamente stagna; in caso contrario deve essere scartata e occorre prepararne un'altra, - per ogni campione, preparare due capsule, - porre le capsule adeguatamente sul dispositivo automatico di inserimento dei campioni nell'analizzatore elementare; ogni capsula deve essere accuratamente identificata con un numero d'ordine, - disporre sistematicamente capsule contenenti i riferimenti di lavoro all'inizio e alla fine della serie di campioni, - inserire regolarmente campioni di controllo nella serie di campioni. b) Controllo e regolazione della strumentazione d'analisi elementare e di spettrometria di massa - regolare la temperatura dei forni dell'analizzatore elementare e i flussi di gas elio ed ossigeno per una combustione ottimale del campione, - verificare che non vi siano perdite nel sistema d'analisi elementare e di spettrometria di massa (ad esempio, controllando la corrente ionica per m/z = 28 corrispondente a N2), - regolare lo spettrometro di massa per misurare le intensità delle correnti ioniche per m/z = 44, 45 e 46, - verificare il sistema mediante i campioni di controllo noti, prima di iniziare le misurazioni sui campioni. c) Svolgimento di una serie di misurazioni I campioni posti sul dispositivo automatico di inserimento dei campioni per l'analizzatore elementare (o del cromatografo) vengono introdotti in successione. Il biossido di carbonio di ogni combustione di campione viene eluito verso lo spettrometro di massa che misura le correnti ioniche. Il computer collegato con la strumentazione registra le intensità delle correnti ioniche e calcola i valori δ per ogni campione (9). 9. CALCOLO L'obiettivo del metodo consiste nel misurare il rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo estratto a partire dal vino o dai prodotti derivati dell'uva dopo fermentazione. Il rapporto isotopico 13C/12C può essere espresso dalla sua deviazione da un riferimento di lavoro. La deviazione isotopica del carbonio 13 (δ 13C) viene quindi calcolata su una scala delta per mille (δ/1000) per comparazione dei risultati ottenuti per il campione in esame rispetto a quelli del riferimento di lavoro precedentemente tarato in base al riferimento primario internazionale (V-PDB). I valori δ 13C sono espressi in base al riferimento di lavoro mediante la seguente formula: δ13Ccamp./rif [permil ] = 1000 × (Rcamp-Rrif)/Rrif dove Rcamp. e Rrif sono rispettivamente i rapporti isotopici 13C/12C del campione e quelli del biossido di carbonio utilizzato come gas di riferimento. I valori δ 13C sono allora espressi rispetto al V-PDB secondo la formula δ13Ccamp/V-PDB [permil ] = δ13Ccamp./rif δ13Crif/V-PDB + (δ13Ccamp./rif × δ13Crif/V-PDB)/1000 dove δ13Crif/V-PDB è la deviazione isotopica preventivamente determinata del riferimento di lavoro rispetto al V-PDB. Durante la misurazione in linea, possono essere rilevate piccole derive dovute alla variazione delle condizioni strumentali. In tal caso, le δ13C dei campioni devono essere corrette in funzione della differenza del valore δ13C misurato per il campione standard di lavoro e il suo valore vero, precedentemente tarato sul V-PDB per comparazione con uno dei materiali di riferimento internazionali. Tra due misure del campione standard di lavoro, si può assumere che la deriva, e quindi la correzione da apportare ai risultati dei campioni, siano lineari. Il campione standard di lavoro deve essere misurato all'inizio e alla fine di ogni serie di campioni. Si può quindi calcolare una correzione per ogni campione mediante un'interpolazione lineare. 10. GARANZIA DI QUALITÀ E CONTROLLO Controllare che il valore 13C per il riferimento di lavoro non differisca di oltre lo 0,5 [permil ] dal valore ammesso. In caso contrario, dovrà essere controllata ed eventualmente riaggiustata la regolazione della strumentazione dello spettrometro. Per ogni campione, verificare che la differenza di risultato tra le due capsule misurate successivamente sia inferiore allo 0,3 [permil ]. Il risultato finale per un campione determinato è allora il valore medio delle due capsule. Se la differenza è maggiore dello 0,3 [permil ], la misura deve essere ripetuta. Un controllo del funzionamento corretto della misura può essere basato sull'intensità della corrente ionica per m/z = 44, che è proporzionale alla quantità di carbonio iniettata nell'analizzatore elementare. Nelle condizioni standard, l'intensità di questa corrente ionica dovrebbe essere praticamente costante per i campioni in esame. Una deviazione significativa deve far sospettare un'evaporazione di etanolo (ad esempio, una capsula non perfettamente sigillata) oppure una instabilità dell'analizzatore elementare o dello spettrometro di massa. 11. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE DEL METODO (Precisione) È stato effettuato un primo studio in collaborazione (11.1) su distillati contenenti alcoli di origine vinica, alcoli di canna e di barbabietola e varie miscele di queste tre origini. Questo studio non ha tenuto conto della fase di distillazione; sono pertanto state considerate anche informazioni complementari ottenute da altri test interlaboratori effettuati su vini (11.2) e segnatamente circuiti di test di attitudine (11.3) per le misure isotopiche. Risulta che i differenti sistemi di distillazione utilizzati in condizioni soddisfacenti - e in particolare quelli per le misure RMN-FINS - non comportano variabilità significative per le determinazioni δ13C dell'etanolo del vino. I parametri di fedeltà osservati per i vini sono pressoché identici a quelli ottenuti nello studio in collaborazione (11.1) sui distillati. 11.1. Studio in collaborazione sui distillati Anno del test interlaboratori: 1996 Numero di laboratori: 20 Numero di campioni: 6 campioni in doppio cieco Analita: δ 13C dell'etanolo >SPAZIO PER TABELLA> >SPAZIO PER TABELLA> 11.2. Studio interlaboratori su due vini e un alcole Anno del test interlaboratori: 1996 Numero di laboratori: 14 per la distillazione dei vini, di cui 7 anche per la misura δ 13C dell'etanolo dei vini 8 per la misura δ 13C del campione di alcole Numero di campioni: 3 (vino bianco TAV 9,3 % vol., vino bianco TAV 9,6 % vol. e alcole di titolo alcolometrico 93 % m/m) Analita: δ 13C dell'etanolo >SPAZIO PER TABELLA> I laboratori partecipanti hanno utilizzato differenti sistemi di distillazione. Le determinazioni isotopiche δ 13C effettuate da un solo laboratorio sull'insieme dei distillati rispediti dai partecipanti non rivelano alcun valore aberrante né alcun valore significativamente differente dai valori medi. La varianza dei risultati (S2 = 0,0059) è comparabile alle varianze della ripetibilità Sr2 dello studio in collaborazione sui distillati (11.1). 11.3. Risultati delle serie di prove di attitudine ai test isotopici Dal dicembre 1994 vengono organizzati regolarmente degli esercizi di attitudine internazionali per le determinazioni isotopiche sui vini e sugli alcoli (distillati di TAV 96 % vol.). I risultati consentono ai laboratori partecipanti di controllare la qualità delle loro analisi. L'utilizzazione statistica dei risultati consente di apprezzare la variabilità delle determinazioni in condizioni di riproducibilità e quindi di stimare i parametri della varianza e del limite di riproducibilità. I risultati ottenuti per le determinazioni δ 13C dell'etanolo dei vini e dei distillati sono riassunti nella tabella seguente: >SPAZIO PER TABELLA> N numero di laboratori partecipanti. 11.4. Limiti di ripetibilità e di riproducibilità I dati dei vari esercizi interlaboratori presentati nelle precedenti tabelle consentono pertanto di stabilire per questo metodo (inserendo anche la fase di distillazione) i limiti di ripetibilità e di riproducibilità seguenti: Limite di ripetibilità r: 0,24 Limite di riproducibilità R: 0,6."