«ALLEGATO XIX

DETERMINAZIONE DELLA COMPOSIZIONE E DEL CONTENUTO DI STEROLI E DEL CONTENUTO DI COMPOSTI ALCOLICI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE

1. OGGETTO

Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di composti alcolici, singoli e totali, degli oli di oliva e degli oli di sansa di oliva nonché di miscele di tali oli.

I composti alcolici degli oli di oliva e degli oli di sansa di oliva comprendono alcoli alifatici, steroli e dialcoli triterpenici.

2. PRINCIPIO

Gli oli, addizionati di α-colestanolo e di 1-eicosanolo quali standard interni, sono saponificati con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi l'insaponificabile viene estratto con etere etilico.

Le diverse frazioni costituite da composti alcolici sono separate dall'insaponificabile mediante cromatografia su strato sottile su una placca di gel di silice basica (metodo di riferimento) oppure mediante HPLC con colonna di gel di silice. La frazione recuperata dalla separazione su gel di silice viene trasformata in trimetilsilileteri e quindi analizzata mediante gascromatografia in colonna capillare.

PARTE 1

PREPARAZIONE DELL'INSAPONIFICABILE

1. OGGETTO

La presente parte descrive la preparazione e l'estrazione dell'insaponificabile, compresa la preparazione e l'estrazione dell'insaponificabile dagli oli di oliva e dagli oli di sansa di oliva.

2. PRINCIPIO

Una porzione di prova viene saponificata mediante ebollizione a ricadere con una soluzione etanolica di idrossido di potassio. L'insaponificabile viene estratto con etere etilico.

3. APPARECCHIATURA

La normale apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.

3.1. Matraccio a fondo arrotondato (pallone) da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere con giunti smerigliati.

3.2. Imbuto separatore da 500 ml.

3.3. Matracci da 250 ml.

3.4. Microsiringhe da 100 μl e 500 μl.

3.5. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 μm) di diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, idoneo per filtrazione sotto vuoto con giunto smerigliato maschio.

3.6. Beuta da 50 ml con giunto femmina smerigliato, adattabile all'imbuto filtrante (3.5).

3.7. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo di vetro a tenuta.

3.8. Essiccatore a cloruro di calcio.

4. REAGENTI

4.1. Idrossido di potassio, titolo minimo 85 %.

4.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica circa 2 M: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (4.1) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo (4.7). Si conserva la soluzione in bottiglie di vetro scuro ben tappate, per un massimo di due giorni.

4.3. Etere etilico, per analisi.

4.4. Sodio solfato anidro, per analisi.

4.5. Acetone, per cromatografia.

4.6. Etere etilico, per cromatografia.

4.7. Etanolo per analisi.

4.8. Acetato di etile per analisi.

4.9. Quale standard interno, α-colestanolo puro a oltre il 99 % (la purezza deve essere verificata mediante analisi gascromatografica).

4.10. α-colestanolo, soluzione di standard interno allo 0,2 % (m/V) in acetato di etile (4.8).

4.11. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/L in etanolo (4.7).

4.12. 1-eicosanolo, soluzione allo 0,1 % (m/v) in acetato di etile (standard interno).

5. PROCEDIMENTO

Nel matraccio da 250 ml (3.1) si introduce, impiegando la microsiringa da 500 μl (3.4), un volume di soluzione di standard interno α-colestanolo (4.10) e un volume di 1-eicosanolo (4.12) che contenga una quantità di colestanolo e di eicosanolo corrispondente a circa il 10 % del contenuto di steroli e di alcoli del campione. Ad esempio, per 5 g di campione di un olio di oliva si aggiungano 500 μl della soluzione di α-colestanolo (4.10) e 250 μl della soluzione di 1-eicosanolo (4.12). Per gli oli di sansa di oliva si aggiungano 1 500 μl della soluzione di α-colestanolo (4.10) e altrettanti della soluzione di 1-eicosanolo (4.12). Si fa evaporare fino a secchezza in leggera corrente di azoto su bagnomaria caldo. Dopo il raffreddamento, nello stesso matraccio si pesano 5,00 ± 0,01 g di campione secco filtrato.

Nota 1: In oli e grassi animali e vegetali contenenti quantità notevoli di colesterolo può essere presente un picco avente tempo di ritenzione identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare la frazione sterolica in doppio con e senza standard interno.

Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 M (4.2) e della pomice, si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione fino a saponificazione avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e si raffredda il matraccio a circa 30 °C.

Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto separatore da 500 ml (3.2), aiutandosi con acqua distillata, a più riprese (50 ml). Si aggiungono circa 80 ml di etere etilico (4.6), si agita energicamente per circa 60 secondi, smettendo periodicamente di applicare pressione mediante capovolgimento dell'imbuto separatore e apertura del rubinetto. Si lascia quindi riposare fino alla completa separazione delle due fasi (Nota 2). A questo punto si raccoglie la maggior quantità possibile di soluzione saponificata in un secondo imbuto separatore. Sulla fase acquosa-alcolica si effettuano ancora due estrazioni, con le stesse modalità, impiegando 60-70 ml di etere etilico (4.6).

Nota 2: Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo piccole quantità di etanolo (4.7).

Si riuniscono i tre estratti eterei in un unico imbuto separatore contenente 50 ml di acqua e si continua il lavaggio con acqua (50 ml) finché quest'ultima non presenta più una colorazione rosa all'aggiunta di una goccia di soluzione di fenolftaleina (4.11). Eliminata l'acqua di lavaggio, si filtra su sodio solfato anidro (4.4) in un matraccio da 250 ml precedentemente pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico (4.6).

Si distilla il solvente in un evaporatore rotante a 30 °C sotto vuoto. Si aggiungono 5 ml di acetone (4.5) e si rimuove completamente il solvente volatile in leggera corrente di azoto. Il residuo viene essiccato in stufa a 103 ± 2 °C per 15 minuti, raffreddato in essiccatori e pesato approssimando a 0,1 mg.

PARTE 2

SEPARAZIONE DELLE FRAZIONI DEI COMPOSTI ALCOLICI

1. OGGETTO

L'insaponificabile preparato come descritto nella parte 1 è frazionato nei diversi composti alcolici, alcoli alifatici, steroli e dialcoli triterpenici (eritrodiolo e uvaolo).

2. PRINCIPIO

L'insaponificabile può essere frazionato per mezzo della cromatografia basica su strato sottile (metodo di riferimento), rivelato per poi raschiare ed estrarre le corrispondenti bande. Come metodo alternativo, la separazione può essere realizzata mediante HPLC con colonna di gel di silice e rivelatore UV raccogliendo le diverse frazioni. Gli alcoli alifatici e triterpenici nonché gli steroli e i dialcoli triterpenici sono isolati insieme.

3. APPARECCHIATURA

La normale apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.

3.1. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su strato sottile, per lastre di vetro 20 × 20 cm.

3.2. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366 o 254 nm.

3.3. Microsiringhe da 100 μl e 500 μl.

3.4. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità 15-40 μm) di diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, idoneo per filtrazione sotto vuoto con giunto smerigliato maschio.

3.5. Beuta da 50 ml con giunto femmina smerigliato, adattabile all'imbuto filtrante (3.4).

3.6. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo di vetro a tenuta.

3.7. Essiccatore a cloruro di calcio.

3.8. Sistema HPLC costituito da: 3.8.1. pompa binaria; 3.8.2. iniettore manuale o automatico dotato di loop da 200 μl; 3.8.3. degassificatore in linea; 3.8.4. rivelatore UV-VIS o IR.

3.9. Colonna HPLC (25 cm × 4 mm d.i.) con gel di silice 60 (particelle da 5 μm).

3.10. Filtro per siringhe da 0,45 μm.

3.11. Beuta da 25 ml.

4. REAGENTI

4.1. Idrossido di potassio, titolo minimo 85 %.

4.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica circa 2 M: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (4.1) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta a 1 litro con etanolo (4.9). Si conserva la soluzione in bottiglie di vetro scuro ben tappate, per un massimo di due giorni.

4.3. Etere etilico, per analisi.

4.4. Idrossido di potassio, soluzione etanolica circa 0,2 M: si sciolgono 13 g di idrossido di potassio (4.1) in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo (4.9).

4.5. Lastre di vetro 20 × 20 cm stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per l'uso).

4.6. Acetone, per cromatografia.

4.7. n-esano, per cromatografia.

4.8. Etere etilico, per cromatografia.

4.9. Etanolo per analisi.

4.10. Acetato di etile per analisi.

4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su strato sottile: colesterolo, fitosteroli, alcoli e soluzione di eritrodiolo al 5 % in acetato di etile (4.10).

4.12. Soluzione di 2,7-diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende leggermente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 M di idrossido di potassio (4.2).

4.13. Miscela n-esano (4.7)/etere etilico (4.8) in rapporto 65:35 (V/V).

4.14. Per la fase mobile HPLC, n-esano (4.7)/etere etilico (4.8) in rapporto 1:1 (V/V).

5. METODO DI RIFERIMENTO: SEPARAZIONE DEI COMPOSTI ALCOLICI MEDIANTE LASTRA BASICA PER LA CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

Preparazione delle lastre basiche per la cromatografia su strato sottile: si immergono o intingono le lastre al gel di silice (4.5) per circa 4 cm nella soluzione etanolica 0,2 M di idrossido di potassio (4.4) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa per due ore e infine si pongono in stufa a 100 °C per un'ora.

Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio (3.7) fino al momento dell'impiego (le lastre così trattate devono essere impiegate entro 15 giorni).

Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela esano/etere etilico (4.13) (Nota 3) fino all'altezza di circa 1 cm. Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora, in luogo fresco, in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici interne della camera possono essere fissate delle strisce di carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare eluizione dei componenti.

Nota 3: Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente riproducibili, la miscela di sviluppo deve essere sostituita a ogni prova; in alternativa è possibile utilizzare un solvente costituito da n-esano/etere etilico 50:50 (V/V).

Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile preparato come descritto nella parte 1 in acetato di etile (4.10) e, con la microsiringa da 100 μl (3.3), si depositano sulla placca cromatografica (4.5), a 2 cm dall'estremità inferiore, 0,3 ml della soluzione in una striscia sottile e uniforme. In allineamento con la linea di caricamento, si depositano 2-3 μl della soluzione di riferimento (4.11), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, le bande degli steroli, dei dialcoli triterpenici e degli alcoli.

Si pone la placca nella camera di sviluppo (3.1). La temperatura ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20 °C (Nota 4). Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si fa evaporare il solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca per un po' di tempo sotto cappa.

Nota 4: Una temperatura più elevata potrebbe peggiorare la separazione.

Si spruzza la placca debolmente e uniformemente con la soluzione di 2,7-diclorofluoresceina (4.12) e la si lascia asciugare. Osservando la placca alla lampada ultravioletta (3.2) si individuano le bande degli steroli, dei dialcoli triterpenici e degli alcoli per allineamento con la macchia ottenuta con la soluzione di riferimento (4.11); si delimitano con una matita nera i limiti delle bande lungo i margini di fluorescenza (v. placca cromatografica Figura 1).

Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene introdotto nell'imbuto filtrante (3.4); si aggiungono 10 ml di acetato di etile caldo (4.10), si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra (sotto vuoto se necessario), raccogliendo il filtrato nella beuta (3.5) collegata all'imbuto filtrante.

Si lava il residuo nella beuta per tre volte con etere etilico (4.3) (circa 10 ml per volta), raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta attaccata all'imbuto; si fa evaporare il filtrato fino a un volume di circa 4-5 ml, si trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml precedentemente pesata (3.6), si porta a secco con blando riscaldamento in leggera corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone (4.6), si riporta ancora a secco mediante evaporazione. Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalle frazioni di steroli e dialcoli triterpenici o dalle frazioni di alcoli e alcoli triterpenici.

6. SEPARAZIONE DELLA FRAZIONE ALCOLICA MEDIANTE HPLC

Si dissolve l'insaponificabile ottenuto come descritto nella parte 1 in 3 ml della fase mobile (4.14), si filtra la soluzione con un filtro per siringa (3.10) e si mette da parte.

Si iniettano 200 μl della soluzione di insaponificabile filtrata nel sistema HPLC (3.8).

Si effettua la separazione HPLC a 0,8 ml/min, si scartano i primi 5 minuti e si raccoglie in beute da 25 ml (3.11) tra i 5 e i 10 minuti per gli alcoli alifatici e triterpenici e tra 11 e 25 minuti per gli steroli, l'eritrodiolo e l'uvaolo (Nota 5).

La separazione può essere controllata con un rivelatore UV a lunghezze d'onda 210 nm o un rivelatore dell'indice di rifrazione (v. Figura 6).

Le frazioni sono fatte evaporare fino a secchezza e preparate per l'analisi cromatografica.

Nota 5: Controllare attentamente la pressione della pompa HPLC, l'etere etilico può aumentare la pressione; regolare il flusso in modo da mantenere sotto controllo la pressione.

PARTE 3

ANALISI GASCROMATOGRAFICA DELLE FRAZIONI DEI COMPOSTI ALCOLICI

1. OGGETTO

La presente parte fornisce un orientamento generale per la determinazione mediante gascromatografia con colonna capillare della composizione qualitativa e quantitativa dei composti alcolici isolati con il procedimento specificato nella parte 2 del presente metodo.

2. PRINCIPIO

Le frazioni raccolte dall'insaponificabile mediante cromatografia su strato sottile o HPLC sono trasformate in trimetilsilileteri e analizzate mediante gascromatografia in colonna capillare con iniezione split e rivelatore a ionizzazione di fiamma.

3. APPARECCHIATURA

La normale apparecchiatura di laboratorio e in particolare quanto segue.

3.1. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo di vetro a tenuta.

3.2. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di dispositivo di iniezione di tipo split, costituito da: 3.2.1. camera termostatica per le colonne, in grado di mantenere la temperatura desiderata con la precisione di ± 1 °C; 3.2.2. complesso di iniezione termoregolabile con elemento vaporizzatore in vetro persilanizzato e sistema split; 3.2.3. rivelatore a ionizzazione di fiamma; 3.2.4. sistema di acquisizione di dati idoneo per il funzionamento con il rivelatore a ionizzazione di fiamma (3.10.3), integrabile manualmente.

3.3. Colonna capillare in silice fusa, lunga 20 - 30 m, diametro interno 0,25 - 0,32 mm, internamente ricoperta di una miscela costituita da 5 % difenil - 95 % dimetilpolisilossano (fase stazionaria SE-52 o SE-54 o equivalenti), fino a uno spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 μm.

3.4. Microsiringa per gascromatografia da 10 μl con ago cementato idonea all'iniezione split.

4. REAGENTI

4.1. Piridina anidra, per cromatografia.

4.2. Esametildisilazano per analisi.

4.3. Trimetilclorosilano per analisi.

4.4. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al momento dell'impiego partendo da steroli ed eritrodiolo ottenuti da oli che li contengano.

4.5. Soluzioni standard di trimetilsilileteri degli alcoli alifatici da C20 a C28: si preparano al momento dell'impiego a partire da miscele di alcoli puri.

4.6. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia.

4.7. Gas ausiliari: idrogeno, elio, azoto e aria, puri per gascromatografia.

4.8. Reagente per la sililazione costituito da una miscela 9:3:1 (V/V/V) di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano.

4.9. n-esano, per cromatografia.

5. PREPARAZIONE DEI TRIMETILSILILETERI

Nella provetta (3.1) contenente la frazione di composto alcolico si aggiunge il reagente per la sililazione (4.8) (Nota 6), in ragione di 50 μl per ogni milligrammo di composto alcolico, evitando ogni assorbimento di umidità (Nota 7).

Nota 6: Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono inoltre disponibili altri reagenti per la sililazione, quali ad esempio il bis-trimetilsililtrifluoroacetammide + 1 % di trimetilclorosilano da diluire in uno stesso volume di piridina anidra. La piridina può essere sostituita dalla stessa quantità di acetonitrile.

Nota 7: L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e non è causa di alcuna anomalia. La formazione di un flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio della presenza di umidità o di alterazione del reagente. In questi casi la prova dovrà essere ripetuta (solo se si utilizza esametildisilazano/trimetilclorosilano).

Si tappa la provetta (3.1), si agita cautamente (senza capovolgere) fino a completa solubilizzazione dei composti. Si lascia a sé per almeno 15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica.

6. ANALISI GASCROMATOGRAFICA

6.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna capillare

Si installa la colonna (3.3) nel gascromatografo, collegando il terminale di ingresso all'iniettore del dispositivo split e il terminale di uscita al rivelatore.

Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del sistema di split e del sistema di registrazione ecc.).

Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento: si fa scorrere un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20 °C superiore a quella di esercizio (Nota 8). Si mantiene tale temperatura per almeno due ore, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas e del dispositivo split, accensione della fiamma, collegamento con l'elaboratore, regolazione della temperatura della colonna, del rivelatore e dell'iniettore ecc.) e si registra il segnale a una sensibilità almeno due volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, mentre una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna.

Nota 8: La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20 °C rispetto alla temperatura massima prevista per la fase stazionaria utilizzata.

6.2. Condizioni operative

Ottimizzare il programma di temperatura e il flusso del gas vettore in modo da ottenere cromatogrammi simili alle Figure da 3 a 6.

Sono stati testati e sono risultati utili i seguenti parametri:

6.2.1. Alcoli alifatici

Programma della stufa 180 °C (8 min.) → 260 °C (a 5 °C/min.) → 260 °C (15 min.) Temperatura dell'iniettore 280 °C Temperatura del rivelatore 290 °C Velocità lineare del gas vettore elio (20 - 30 cm/s); idrogeno (30 - 50 cm/s) Rapporto di split da 1:50 a 1:100 Volume iniettato 0,5 - 1 μl di soluzione di TMSE.

6.2.2. Steroli e dialcoli triterpenici

Programma della stufa 260 ± 5 °C isotermica Temperatura dell'iniettore 280 – 300 °C Temperatura del rivelatore 280 – 300 °C Velocità lineare del gas vettore elio (20 - 30 cm/s); idrogeno (30 - 50 cm/s) Rapporto di split da 1:50 a 1:100 Volume iniettato 0,5 - 1 μl di soluzione di TMSE.

Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo, in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:

— il tempo di ritenzione dell'alcole C26 deve essere 18 ± 5 minuti

— il picco dell'alcole C22 deve essere: per l'olio di oliva 80 ± 20 % del fondo scala, per l'olio di sansa di oliva 40 ± 20 % del fondo scala

— il tempo di ritenzione del picco di β-sitosterolo deve essere 20 ± 5 minuti

— il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto medio 3 %) 20 ± 5 % del fondo scala

— si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario che i picchi oltre che separati siano anche completamente risolti, cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima di risalire per il picco successivo. È tuttavia tollerata anche una risoluzione incompleta purché il picco TRR 1,02 (sitostanolo) sia quantificabile secondo la perpendicolare.

6.3. Esecuzione dell'analisi

Con la microsiringa da 10 μl (3.4) si preleva 1 μl di esano, si aspirano 0,5 μl di aria e successivamente 0,5 - 1 μl della soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana dell'iniettore e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi. È possibile utilizzare anche un iniettore automatico.

Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE dei corrispondenti composti alcolici presenti. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti delle pertinenti condizioni operative (6.2.1 o 6.2.2).

6.4. Identificazione dei picchi

L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli alcoli alifatici e triterpenici o degli steroli e dei dialcoli triterpenici, analizzate nelle medesime condizioni. La Figura 3 riporta un cromatogramma della frazione costituita da alcoli alifatici e triterpenici; la Figura 2 riporta i corrispondenti cromatogrammi degli steroli e dei dialcoli triterpenici.

Gli alcoli alifatici vengono eluiti secondo il seguente ordine: C20-olo (S.I.), C22-olo, C23-olo, C24-olo, C25-olo, C26-olo, C27-olo e C28-olo.

Gli steroli e i dialcoli triterpenici vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, brassicasterolo, ergosterolo, 24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo, stigmasterolo, Δ7-campesterolo, Δ5,23-stigmastadienolo, clerosterolo, β-sitosterolo, sitostanolo, Δ5-avenasterolo, Δ5,24-stigmastadienolo, Δ7-stigmastenolo, Δ7-avenasterolo, eritrodiolo e uvaolo.

6.5. Valutazione quantitativa

Si procede al calcolo delle aree dei picchi di 1-eicosanolo e degli alcoli alifatici C22, C24, C26 e C28 mediante un sistema di acquisizione dei dati. Il coefficiente di risposta di 1-eicosanolo si deve intendere unitario.

Si procede al calcolo delle aree dei picchi di α-colestanolo, steroli e dialcoli triterpenici mediante l'elaboratore. Non vengono considerati i picchi di eventuali componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella 1 (non si deve calcolare l'ergosterolo). Il coefficiente di risposta dell'α-colestanolo si deve intendere unitario.

Si calcola la concentrazione di ogni singolo composto alcolico, in mg/kg di sostanza grassa, come segue:

in cui:

Ax = area del picco del composto alcolico x, in unità di calcolo dell'elaboratore As = area del picco di 1-eicosanolo/α-colestanolo, in unità di calcolo dell'elaboratore ms = massa di 1-eicosanolo/α-colestanolo aggiunta, in milligrammi m = massa del campione prelevato per la determinazione, in grammi.

7. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Si riportano le concentrazioni dei singoli alcoli alifatici e triterpenici, in mg/kg di sostanza grassa e, come «tenore totale di alcoli alifatici», la loro somma. Il tenore totale è la somma di C22, C24, C26 e C28.

Il contenuto di ogni singolo composto alcolico deve essere espresso con una cifra decimale.

La concentrazione totale di steroli deve essere espressa senza decimali.

Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto fra l'area del picco corrispondente e la somma delle aree dei picchi degli steroli:

in cui:

Ax = area del picco per lo sterolo x ΣA = somma delle aree di tutti i picchi degli steroli.

β-sitosterolo apparente: Δ5,23-stigmastadienolo + clerosterolo + β-sitosterolo + sitostanolo + Δ5-avenasterolo + Δ5,24-stigmastadienolo.

Si calcola il contenuto percentuale di eritrodiolo e uvaolo:

in cui:

AEr = area dell'eritrodiolo in unità di calcolo dell'elaboratore AUv = area dell'uvaolo in unità di calcolo dell'elaboratore Σ AT = somma delle aree degli steroli + eritrodiolo + uvaolo in unità di calcolo dell'elaboratore.

Oltre a calcolare la percentuale relativa dei singoli steroli e dialcoli triterpenici e la concentrazione totale di steroli, si deve calcolare anche la concentrazione di eritrodiolo e uvaolo e la relativa somma, in mg/kg di sostanza grassa, secondo le seguenti espressioni:

in cui: