Regolamento (CE) n. 213/2001 della Commissione, del 9 gennaio 2001, che stabilisce modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 per quanto riguarda i metodi per le analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e modifica i regolamenti (CE) n. 2771/1999 e (CE) n. 2799/1999



Gazzetta ufficiale n. L 037 del 07/02/2001 pag. 0001 - 0099



Regolamento (CE) n. 213/2001 della Commissione del 9 gennaio 2001 che stabilisce modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 per quanto riguarda i metodi per le analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e modifica i regolamenti (CE) n. 2771/1999 e (CE) n. 2799/1999 LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, visto il regolamento (CE) n. 1255/1999 del Consiglio, del 17 maggio 1999, relativo all'organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari(1), in particolare gli articoli 10 e 15, l'articolo 26, paragrafo 3, l'articolo 29, paragrafo 1, e l'articolo 31, paragrafo 14, considerando quanto segue: (1) I regolamenti della Commissione (CEE) n. 1216/68, (CEE) n. 3942/92, (CE) n. 86/94, (CE) n. 2721/95, (CE) n. 1080/96, (CE) n. 1081/96, (CE) n. 1082/96, (CE) n. 1854/96, (CE) n. 880/98 e (CE) n. 1459/98, i cui riferimenti completi figurano nell'allegato XXVI del presente regolamento, stabiliscono i metodi di riferimento e di routine per l'analisi e la valutazione qualitativa del latte e dei prodotti lattiero-caseari e definiscono il campo e le modalità d'applicazione di tali metodi. Per motivi di chiarezza è opportuno procedere alla rifusione dei suddetti regolamenti in un unico testo, in modo da mettere a disposizione degli operatori del settore un unico corpus dei metodi summenzionati e delle relative modalità d'applicazione. Allo stesso scopo è necessario modificare i regolamenti della Commissione (CE) n. 2771/1999, del 16 dicembre 1999, recante modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 del Consiglio per quanto riguarda le misure di intervento sul mercato del burro e della crema di latte(2) e (CE) n. 2799/1999, del 17 dicembre 1999, recante modalità d'applicazione del regolamento (CE) n. 1255/1999 in ordine alla concessione di un aiuto per il latte scremato e il latte scremato in polvere destinati all'alimentazione degli animali e in ordine alla vendita di tale latte scremato in polvere(3), al fine di incorporare nel presente regolamento i relativi allegati sui metodi d'analisi. (2) La composizione e le caratteristiche qualitative del latte e dei prodotti lattiero-caseari stabilite nel quadro dei regimi previsti dal regolamento (CE) n. 1255/1999 devono essere verificate allo scopo di garantirne la completa conformità con i requisiti fissati. (3) Spesso i metodi di riferimento previsti per tali verifiche sono metodi pubblicati da organismi internazionali quali CEN, IDF, ISO e AOAC International e regolarmente aggiornati da tali organismi. In alcuni casi esiste un metodo di riferimento comunitario, mentre in altri casi la normativa comunitaria non prevede alcun metodo di riferimento. Allo scopo di garantire un'applicazione uniforme dei metodi di riferimento, è opportuno compilare annualmente un elenco dei metodi di riferimento e precisare che il metodo da applicare deve figurare nel suddetto elenco. (4) Non si deve tuttavia escludere la possibilità di applicare metodi di routine, dei quali occorre quindi specificare le condizioni di applicazione. (5) Allo scopo di stabilire una prassi uniforme per la valutazione dei risultati delle analisi, è inoltre opportuno fissare metodi comuni. Lo stesso vale per la valutazione organolettica dei prodotti considerati e per il riesame dei risultati in caso di contestazione. (6) Per talune analisi non esistono attualmente metodi di riferimento convalidati internazionalmente riconosciuti. Non sono quindi disponibili informazioni sulle variazioni dei risultati analitici da laboratorio a laboratorio. È pertanto opportuno stabilire metodi a livello comunitario, convalidati secondo le norme stabilite a livello internazionale, da applicare come metodi di riferimento. (7) Il regolamento (CE) n. 2571/97 della Commissione, del 15 dicembre 1997, relativo alla vendita a prezzo ridotto di burro e alla concessione di un aiuto per la crema, il burro e il burro concentrato destinati alla fabbricazione di prodotti della pasticceria, di gelati e di altri prodotti alimentari(4), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 635/2000(5), dispone, in certi casi, l'aggiunta di determinati rivelatori alla crema, al burro e al burro concentrato che permettono di verificarne la corretta utilizzazione finale. Data l'importanza di verificare il corretto funzionamento del sistema di marcatura e per assicurare la parità di trattamento di tutti gli operatori partecipanti, è opportuno stabilire, per quanto possibile, metodi comuni per la determinazione di alcuni di tali rivelatori. (8) Il burro concentrato deve essere sottoposto a marcatura in condizioni controllate, in conformità del regolamento (CEE) n. 3143/1985 della Commissione, dell'11 novembre 1985, relativo allo smaltimento a prezzo ridotto di burro d'intervento destinato al consumo diretto sotto forma di burro concentrato(6), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 101/1999(7), del regolamento (CEE) n. 429/90 della Commissione, del 20 febbraio 1990, relativo alla concessione tramite gara di un aiuto per il burro concentrato destinato al consumo diretto nella Comunità(8), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 124/1999(9), e del regolamento (CE) n. 2571/97. Il rigoroso rispetto dei requisiti di marcatura del burro concentrato è essenziale per prevenire il rischio di impieghi non autorizzati. È pertanto opportuno definire un metodo comune di individuazione dei rivelatori. (9) A norma dell'articolo 9 del regolamento (CE) n. 1255/1999 è possibile concedere un aiuto all'ammasso privato di formaggi a base di latte di pecora. Per questi stessi prodotti può essere concessa una speciale restituzione a norma dell'articolo 31 del suddetto regolamento. È prevista l'importazione nella Comunità a condizioni preferenziali, in provenienza da taluni paesi terzi, di formaggi prodotti con latte di pecora, di capra o di bufala oppure con miscele di latte di questi animali. A motivo delle succitate disposizioni è necessario verificare mediante controlli adeguati che nei formaggi di cui trattasi non sia stato incorporato latte vaccino. È quindi opportuno definire un metodo di riferimento comunitario atto a rivelare la presenza di latte vaccino, fatto salvo il ricorso a metodi di routine conformi a determinati criteri. (10) A norma del regolamento (CEE) n. 2921/90 della Commissione, del 10 ottobre 1990, relativo alla concessione di aiuti per il latte scremato destinato alla fabbricazione di caseina e di caseinati(10), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 2654/1999(11), deve essere accertata l'assenza di coliformi. Il metodo di riferimento riconosciuto a livello internazionale per la ricerca di coliformi nel latte e nei prodotti lattiero-caseari è la norma internazionale IDF 73A: 1985. Tuttavia per la ricerca di coliformi in una certa quantità di prodotto il suddetto metodo può essere utilizzato soltanto in forma modificata. Occorre quindi stabilire un metodo di riferimento comunitario per la ricerca di coliformi basato sulla succitata norma. (11) Il regolamento (CEE) n. 2658/87 del Consiglio, del 23 luglio 1987, relativo alla nomenclatura tariffaria e statistica e alla tariffa doganale comune(12), modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 254/2000(13), differenzia le aliquote dei dazi doganali degli alimenti composti per animali appartenenti alla voce tariffaria 2309 in funzione del loro tenore in prodotti lattiero-caseari. Ai fini di un'applicazione uniforme delle disposizioni in oggetto, occorre determinare un metodo d'analisi del tenore in lattosio obbligatorio per tutti gli Stati membri, adottando a tal fine un metodo generalmente riconosciuto. (12) A norma del regolamento (CE) n. 1255/1999 il burro e il latte scremato in polvere destinati all'intervento, nonché il latte scremato in polvere destinato all'alimentazione degli animali devono soddisfare determinati requisiti di qualità. È quindi opportuno stabilire metodi di riferimento per accertare il rispetto dei suddetti requisiti. (13) L'applicazione di taluni metodi introdotti per la prima volta dal presente regolamento presuppone un periodo di adattamento. È pertanto opportuno differirne l'applicazione. (14) Il comitato di gestione per il latte e i prodotti lattiero-caseari non si è pronunciato nel termine fissato dal suo presidente, HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO: CAPO I DISPOSIZIONI GENERALI Articolo 1 Finalità e campo di applicazione Il presente regolamento stabilisce disposizioni d'applicazione dei metodi per le analisi chimiche, fisiche e microbiologiche e per la valutazione organolettica del latte e dei prodotti lattiero-caseari nell'ambito dei regimi previsti dall'organizzazione comune dei mercati nel settore del latte e dei prodotti lattiero-caseari, istituita dal regolamento (CE) n. 1255/1999, e fissa alcuni dei metodi suddetti. Articolo 2 Elenco dei metodi 1. L'elenco dei metodi di riferimento applicabili alle analisi di cui all'articolo 1 è fissato nell'allegato I. 2. La Commissione aggiorna detto elenco almeno una volta all'anno secondo la procedura di cui all'articolo 42 del regolamento (CE) n. 1255/1999. Articolo 3 Metodi di routine Per l'esecuzione delle analisi previste dalla normativa comunitaria possono essere applicati metodi di routine, purché questi vengano adeguatamente tarati e periodicamente verificati rispetto al metodo di riferimento. Per il controllo dei risultati ottenuti mediante metodi di routine e prossimi ai valori limite specificati nei pertinenti regolamenti, si può applicare la procedura indicata nell'allegato II. In caso di controversia, prevalgono i risultati ottenuti con il metodo di riferimento. Articolo 4 Convalida dei metodi di riferimento 1. Un metodo di riferimento è convalidato se è conforme a criteri di precisione prestabiliti per quanto riguarda il limite di ripetibilità e di riproducibilità. 2. Se un metodo di riferimento indicato nei pertinenti regolamenti non è stato convalidato, gli Stati membri stabiliscono un limite di riproducibilità provvisorio. Tale limite è ottenuto conformemente alla procedura prevista all'allegato III, lettera b). Tuttavia, nel corso degli otto mesi successivi all'entrata in vigore del presente regolamento, gli Stati membri possono utilizzare una procedura equivalente. Il rispetto del limite è verificato almeno una volta all'anno. 3. Se i risultati ottenuti applicando metodi di riferimento convalidati o metodi con valori di precisione provvisori indicano che è stato superato un determinato limite, per determinare la differenza critica rispetto a tale limite si può applicare il metodo di valutazione dei risultati analitici descritto nell'allegato IV. Articolo 5 Ammissibilità dei risultati analitici 1. Le analisi sono praticate in laboratori che applicano una procedura interna di controllo della qualità conforme a quella descritta all'allegato V, lettera a), o una procedura di livello equivalente. Nel laboratorio deve essere disponibile una descrizione particolareggiata della procedura applicata. 2. I laboratori fissano i propri parametri interni di precisione nell'ambito di una serie per tutti i metodi conformemente a) alla procedura definita nell'allegato V, lettera b); o b) a una procedura convalidata, pubblicata, avente una determinata ripetibilità. Il rispetto del limite di riproducibilità deve essere verificato almeno una volta all'anno conformemente alla procedura definita nell'allegato III, lettera a). Il secondo comma non si applica qualora il laboratorio abbia partecipato ad un programma di verifica dell'idoneità nel corso dell'anno. 3. Nella relazione di laboratorio sui risultati dell'analisi figurano gli elementi atti a consentire una valutazione dei risultati conformemente all'allegato IV e all'allegato VIII. 4. I risultati di un'analisi sono considerati ammissibili se sono stati ottenuti in conformità dei criteri di accettabilità descritti nella procedura interna di controllo della qualità di cui al paragrafo 1 e dei parametri interni di precisione di cui al paragrafo 2. Articolo 6 Valutazione organolettica 1. Nel caso del burro, per verificare il livello delle prestazioni degli assaggiatori e l'attendibilità dei risultati si applicano le procedure indicate nell'allegato VI. La procedura descritta nell'allegato VII si applica come metodo di riferimento per la valutazione organolettica. 2. Per quanto riguarda il latte e i prodotti lattiero-caseari diversi dal burro, gli Stati membri utilizzano, quale metodo di riferimento per la valutazione organolettica, la Norma IDF 99C/1997 o altri metodi equivalenti debitamente comunicati alla Commissione. Per verificare il livello delle prestazioni degli assaggiatori e l'attendibilità dei risultati, possono essere applicate le procedure indicate nell'allegato VI. Articolo 7 Campionamento e contestazione dei risultati analitici 1. Per l'esecuzione delle analisi previste dalla normativa comunitaria si procede al prelievo di campioni in doppio. 2. Qualora i risultati di un'analisi siano contestati dall'operatore, si applica la procedura indicata nell'allegato VIII. CAPO II METODI DI ANALISI Articolo 8 Tenore di acqua, sostanze secche, materie grasse nel burro 1. Il metodo di analisi descritto nell'allegato IX si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di acqua nel burro. 2. Il metodo di analisi descritto nell'allegato X si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di sostanze secche non grasse nel burro. 3. Il metodo di analisi descritto nell'allegato XI si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di materie grasse nel burro. Articolo 9 Determinazione dei rivelatori 1. Il metodo d'analisi descritto all'allegato XII si applica come metodo di riferimento per la determinazione della vanillina nel burro concentrato, nel burro o nella crema. 2. Il metodo d'analisi descritto nell'allegato XIII si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di estere etilico dell'acido beta-apo-8'-carotenico nel burro concentrato o nel burro. 3. Il metodo d'analisi descritto nell'allegato XIV si applica come metodo di riferimento per la determinazione del tenore di stigmasterolo o di β-sitosterolo nel burro e nel burro concentrato. 4. L'aggiunta di rivelatori al burro concentrato, al burro o alla crema è effettuata nel rispetto della pertinente normativa comunitaria se i risultati ottenuti sono conformi alle specifiche del punto 8 degli allegati di cui ai paragrafi 1, 2 e 3. Articolo 10 Ricerca di caseina di latte vaccino 1. Per verificare che il formaggio che deve essere prodotto esclusivamente con latte di pecora, con latte di capra o con latte di bufala oppure con miscele di latte di pecora, capra o bufala non contenga caseina di latte vaccino si applica il metodo d'analisi di riferimento specificato nell'allegato XV. Si considera che la caseina di latte vaccino è presente se il tenore apparente di caseina di latte vaccino nel campione da analizzare è pari o superiore a quello del campione di riferimento descritto nell'allegato XV contenente l'1 % di latte vaccino. 2. I metodi di routine per individuare la presenza di caseina di latte vaccino nei formaggi di cui al paragrafo 1 possono essere applicati alle seguenti condizioni: a) il limite di individuazione non deve essere superiore allo 0,5 %; b) non si devono ottenere risultati falsamente positivi; c) la caseina di latte vaccino deve essere individuabile con l'opportuna sensibilità anche dopo i lunghi periodi di maturazione consueti in commercio. Se la condizione di cui alla lettera b) non è soddisfatta, i campioni risultati positivi devono essere analizzati con il metodo di riferimento. Se la condizione di cui alla lettera c) non è soddisfatta per uno dei tipi di formaggi di cui al paragrafo 1, tale formaggio deve essere analizzato con il metodo di riferimento. Articolo 11 Ricerca di coliformi 1. Per la ricerca di coliformi nel burro, nel latte scremato in polvere, nella caseina e nei caseinati si applica il metodo d'analisi di riferimento descritto nell'allegato XVI. 2. Per la ricerca di coliformi si possono applicare metodi di routine che garantiscano, riguardo ai risultati, una precisione equivalente a quella del metodo di riferimento descritto nel suddetto allegato. In particolare, i metodi di routine devono garantire un sufficiente limite di individuazione. Inoltre, essi non devono produrre risultati falsamente positivi. Se ciò avviene, i risultati positivi dovranno essere confermati applicando il metodo di riferimento. Articolo 12 Tenore di lattosio Il metodo per la determinazione del tenore di lattosio nei prodotti appartenenti alla voce 2309 della nomenclatura combinata è descritto nell'allegato XVII. Articolo 13 Ricerca di siero di latte presamico 1. Il metodo per individuare la presenza di siero di latte presamico nel latte scremato in polvere destinato all'ammasso pubblico è descritto nell'allegato XVIII. 2. Il metodo per individuare la presenza di siero di latte presamico nel latte scremato in polvere e nelle miscele destinate all'alimentazione animale è descritto nell'allegato XIX. Articolo 14 Ricerca di latticello Il metodo per individuare la presenza di latticello nel latte scremato in polvere è descritto nell'allegato XX. Articolo 15 Residui di antibiotici Il metodo per determinare la presenza di residui di antibiotici e di solfonammide/dapson nel latte scremato in polvere è descritto nell'allegato XXI. Articolo 16 Tenore di latte scremato in polvere Il metodo per determinare il tenore di latte scremato in polvere negli alimenti composti per animali è descritto nell'allegato XXII. Articolo 17 Ricerca di amido Il metodo per individuare la presenza di amido nel latte scremato in polvere, nel latte in polvere denaturato e negli alimenti composti per animali è descritto nell'allegato XXIII. Articolo 18 Tenore di umidità del latticello acido in polvere Il metodo per determinare il tenore di umidità del latticello acido in polvere destinato all'impiego in alimenti per animali è descritto nell'allegato XXIV. Articolo 19 Ricerca di grassi estranei Il metodo per determinare la presenza di grassi estranei nel grasso del latte è descritto nell'allegato XXV. CAPO III DISPOSIZIONI FINALI Articolo 20 Modifiche del regolamento (CE) n. 2771/1999 Il regolamento (CE) n. 2771/1999 è modificato come segue: 1) All'articolo 4, paragrafo 1, il testo della prima frase è sostituito dal seguente: "Le autorità competenti controllano la qualità del burro secondo i metodi di analisi di cui all'allegato I e su campioni prelevati secondo le modalità di cui all'allegato IV". 2) All'allegato I, il testo della nota n. 2 a piè di pagina è sostituito dal presente: "Si veda l'allegato I del regolamento (CE) n. 213/2001 (il presente regolamento)". 3) Gli allegati II e III sono soppressi. 4) All'allegato IV, punto 2, penultima riga, i termini "nell'allegato III" sono sostituiti dai termini: "nell'allegato VIII del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento]." Articolo 21 Modifica del regolamento (CE) n. 2799/1999 Il regolamento (CE) n. 2799/1999 è modificato come segue: 1) All'articolo 20, il testo dei paragrafi 1, 2, 3 e 4 è sostituito dal seguente: "1. Il tenore in latte scremato in polvere delle miscele e degli alimenti composti viene verificato con una doppia analisi almeno, eseguita secondo il metodo indicato nell'allegato XXII del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento] e completata dai controlli di cui all'articolo 17, paragrafo 3. In caso di risultati discordanti tra tali verifiche, prevalgono i risultati dei controlli in loco. 2. L'assenza di siero di latte presamico è accertata secondo il metodo descritto nell'allegato XIX del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento]. 3. Il tenore in amido negli alimenti composti è accertato nell'ambito dei controlli di cui all'articolo 17, paragrafo 3, completati dal metodo di analisi descritto nell'allegato XXIII del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento]. 4. Il tenore in umidità del latticello acido in polvere è accertato secondo il metodo d'analisi illustrato nell'allegato XXIV del regolamento (CE) n. 213/2001 [il presente regolamento]." 2) Gli allegati III, IV, V e VI sono soppressi. Articolo 22 Abrogazioni I regolamenti (CEE) n. 1216/68, (CEE) n. 3942/92, (CE) n. 86/94, (CE) n. 2721/95, (CE) n. 1854/96, (CE) n. 1080/96, (CE) n. 1081/96, (CE) n. 1082/96, (CE) n. 880/98 e (CE) n. 1459/98 sono abrogati. I riferimenti ai regolamenti abrogati s'intendono fatti al presente regolamento. Articolo 23 Entrata in vigore Il presente regolamento entra in vigore il settimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Tuttavia i metodi descritti negli allegati III, IV punto 4, V, VI e VIII si applicano a decorrere dal diciottesimo mese successivo all'entrata in vigore del presente regolamento. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 9 gennaio 2001. Per la Commissione Franz Fischler Membro della Commissione (1) GU L 160 del 26.6.1999, pag. 48. (2) GU L 333 del 24.12.1999, pag. 11. (3) GU L 340 del 31.12.1999, pag. 3. (4) GU L 350 del 20.12.1997, pag. 3. (5) GU L 76 del 25.3.2000, pag. 9. (6) GU L 298 del 12.11.1985, pag. 9. (7) GU L 11 del 16.1.1999, pag. 14. (8) GU L 45 del 21.2.1990, pag. 8. (9) GU L 16 del 21.1.1999, pag. 19. (10) GU L 279 dell'11.10.1990, pag. 22. (11) GU L 325 del 17.12.1999, pag. 10. (12) GU L 256 del 7.9.1987, pag. 1. (13) GU L 28 del 3.2.2000, pag. 16. ALLEGATO I (Articolo 2) ELENCO DEI METODI DI RIFERIMENTONote all'elenco dei metodi di riferimento dell'Unione europea: Nota 1: Isolamento delle materie grasse del latte secondo la norma IDF 6B: 1989 (protezione dalla luce). Nota 2: Non è stato stabilito nessun metodo di riferimento. Nota 3: La preparazione del campione dev'essere eseguita secondo la norma IDF 122 C: 1996 o la norma IDF 73A: 1985. Nota 4: Incubazione per 48 ore alla temperatura 55 °C, precauzioni da adottare per evitare il prosciugamento del terreno di coltura. Nota 5: % s.s.n.g. = % sostanza secca - % materia grassa. Nota 6: Il burro deve corrispondere alla categoria nazionale di qualità dello Stato membro di produzione di cui all'allegato V del regolamento (CE) n. 2771/1999 della Commissione. Nota 7: Direttiva n. 4/84/CEE della Commissione. Nota 8: Regolamento (CE) n. 1758/94 della Commissione (GU L 183 del 19.7.1994, pag. 14). Nota 9: Direttiva 78/633/CEE della Commissione. >SPAZIO PER TABELLA> >SPAZIO PER TABELLA> ALLEGATO II (Articolo 3) CONTROLLO DEI RISULTATI OTTENUTI MEDIANTE METODI DI ROUTINE E PROSSIMI AI VALORI LIMITE PER LE CARATTERISTICHE DI COMPOSIZIONE E DI QUALITÀ NEI REGOLAMENTI Se mo è valore limite per le caratteristiche di composizione e di qualità specificate in un regolamento, il limite (L) di decisione è >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> se RRout/RRef <= 1RRout: limite di riproducibilità del metodo di routine RRif: limite di riproducibilità del metodo di riferimento Se mo è un limite superiore RRout/Rrif > 1, il limite di decisione è dato dalla formula >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> Se, nelle stesse condizioni, mo è un limite inferiore, il limite di decisione è dato da >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> CrD95 è la differenza critica del metodo di riferimento (cfr. allegato IV). Se mo è un limite superiore, il risultato finale, ottenuto mediante un metodo di routine e superiore al limite di decisione, deve venire sostituito con il risultato finale ottenuto con il metodo di riferimento. Questo risultato finale deve essere basato almeno sullo stesso numero di analisi/campioni con cui si è ottenuto il risultato finale del metodo di routine. Se mo è un limite inferiore, occorre applicare la stessa procedura relativa ad un risultato finale ottenuto mediante un metodo di routine e più basso del limite di decisione. Nota: La procedura descritta sopra può venire applicata se non vi sono effetti di matrice rivelabili. Gli effetti di matrice possono venire rivelati nella maniera seguente: per ciascun campione utilizzato per la taratura, si determina la differenza (wi) tra i risultati ottenuti mediante il metodo di riferimento e il metodo di routine. La deviazione standard calcolata utilizzando la formula: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> m: numero di campioni utilizzati per la taratura viene confrontata con la media aritmetica della deviazione standard di ripetibilità dei metodi di riferimento e di routine >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> Non si può escludere un effetto di matrice se si ha >PIC FILE= "L_2001037IT.001502.EPS"> dove: f= m (f: numero di gradi di libertà) α= probabilità di errore; α = 0,05. In questo caso, sono necessari studi ulteriori prima di poter fissare un limite di decisione. ALLEGATO III (Articoli 4 e 5) a) Procedura per la determinazione della conformità con un limite di riproducibilità stabilito (analisi chimica) La conformità con il limite di riproducibilità viene controllata mediante confronto dei risultati del laboratorio con quelli ottenuti da un laboratorio sperimentato(1) su un campione identico. In ambedue i laboratori viene eseguita una determinazione in doppio e i risultati vengono valutati utilizzando la formula: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: CrD95: differenza critica (P = 0,95) >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica di due risultati ottenuti nel laboratorio 1 >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica di due risultati ottenuti nel laboratorio 2 R: limite di riproducibilità: da determinarsi mediante interpolazione r: limite di ripetibilità: se la precisione varia in funzione del livello Se viene superata la differenza critica occorre effettuare un altro esperimento entro i due mesi successivi. In caso di non conformità con il limite di riproducibilità in questo secondo esperimento, le autorità competenti devono prendere le opportune misure. b) Procedura per l'ottenimento di un limite provvisorio di riproducibilità (analisi chimica) Si ottiene un limite provvisorio di riproducibilità (Rprov) utilizzando la seguente formula: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media di due risultati ottenuti nel laboratorio 1 >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media di due risultati ottenuti nel laboratorio 2 (vedi allegato IIIa) r: limite di ripetibilità o limite provvisorio di ripetibilità. N.B.: 1. Rprov può venire utilizzato per calcolare differenze critiche (vedi allegato VI). 2. Se il valore calcolato per Rprov è minore di 2r, Rprov viene fissato pari a 2r. 3. Se il valore calcolato è maggiore di 3r o maggiore del doppio del valore di R ottenuto dalla formula di Horwitz(2), allora Rprov è troppo alto e non può venire utilizzato per calcolare la differenza critica. 4. Rprov deve venire determinato almeno una volta all'anno sulla base di risultati ottenuti in due laboratori (vedi allegato IV). 5. Per il calcolo delle differenze critiche usare il valore medio di Rprov. Per ottenere il valore medio di Rprov si applicano le regole di cui ai punti 2 e 3. Il limite di riproducibilità (R) viene ottenuto dal valore calcolato di RSDR- come segue: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> (>RIFERIMENTO A UN GRAFICO> = media aritmetica dei risultati ottenuti) Valori calcolati di RSDR (esempi) >SPAZIO PER TABELLA> Per una concentrazione dell'analita di 1 g/100 g si ottiene: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>. (1) In linea di principio, un laboratorio sperimentato è un laboratorio che ha partecipato con successo alla convalida del metodo di prova o a una prova di idoneità. (2) Formula di Horwitz: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: RSDR: deviazione standard relativa della riproducibilità C: concentrazione espressa come frazione decimale (esempio: 10 g/100 g = 0,1). Bibliografia: Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R. J. Ass. Off. Anal. Chem. 72 (5), 784-806 (1989). ALLEGATO IV (Articolo 4) VALUTAZIONE DI RISULTATI ANALITICI OTTENUTI CON L'UTILIZZO DI METODI CONVALIDATI Se dal risultato analitico risulta che è stato superato un limite, si calcola la media aritmetica di due o più risultati. Si applica la seguente procedura: 1) Nel caso in cui il risultato analitico sia costituito di un singolo risultato, si esegue una seconda analisi in condizioni di ripetibilità. Se le due analisi non possono venire eseguite in condizioni di ripetibilità, si esegue un'ulteriore analisi in doppio in condizioni di ripetibilità e si utilizzano tali risultati per la valutazione della conformità con la differenza critica. 2) Si determina il valore assoluto della differenza tra la media aritmetica dei risultati ottenuti in condizioni di ripetibilità e il limite. Se il valore assoluto di questa differenza è maggiore della differenza critica, il campione che è stato analizzato non soddisfa i requisiti. La differenza critica viene determinata utilizzando la formula seguente: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica dei risultati ottenuti mo: limite n: numero di analisi/campione Se la precisione varia con il livello, può essere necessario determinare r e R per interpolazione. Normalmente, il risultato finale riportato per un campione deve essere conforme con il limite. Risultati finali - compresi tra >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> e >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>, se il limite è un valore massimo, - compresi tra >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> e >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>, se il limite è un valore minimo; devono pertanto presentarsi solo eccezionalmente. Risultati finali compresi nei margini citati sono accettabili solo se si verificano al massimo una volta ogni 5 campioni analizzati per ogni partita. Se per ogni partita vengono analizzati meno di 5 campioni, è accettabile un risultato compreso tra i suddetti valori. Tuttavia, in caso di partite fornite regolarmente da un produttore, va rispettata la regola in base alla quale su 5 campioni analizzati non deve essere ottenuto più di un risultato compreso nei margini sopra specificati. 3) Se il risultato finale x viene calcolato applicando la formula x = y1 +/- y2 (per esempio: acqua + contenuto di sostanza secca non grassa del burro per calcolare il tenore di materie grasse), dove y1 e y2 sono i risultati finali di un solo tipo di analisi, i limiti complessivi di ripetibilità e di riproducibilità rx e Rx dei risultati finali x vengono calcolati nel modo seguente: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove r1 e r2 sono i limiti di ripetibilità e R1 e R2 sono i limiti di riproducibilità rispettivamente di y1 e y2. Si confronta x con il limite mo seguendo le regole specificate ai punti 1 e 2. La differenza critica viene determinata utilizzando la formula >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove x è la media aritmetica dei risultati xi ottenuti. 4) Se il risultato finale viene calcolato utilizzando la formula >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> (esempio: contenuto di grasso nella sostanza secca di formaggio) dove y1 e y2 sono i risultati finali di un solo tipo di analisi, i limiti complessivi di ripetibilità e riproducibilità rx e Rx vengono calcolati come segue: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> μ1: limite o valore ottimale per y1 (per esempio: sostanza grassa) μ2: limite o valore ottimale per y2 (per esempio: sostanza secca) >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: r1: limite di ripetibilità, y1 r2: limite di ripetibilità, y2 >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: R1: limite di riproducibilità, y1 R2: limite di riproducibilità, y2 Le procedure per il calcolo di rx e Rx possono venire applicate solo se i limiti relativi di ripetibilità e di riproducibilità (r*1; r*2; R*1; R*2) sono minori o uguali a 0,15. Si confronta x con il limite μx seguendo le regole specificate ai punti 1 e 2. La differenza critica viene determinata utilizzando la formula >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> è la media aritmetica dei risultati x ottenuti in ordine cronologico(1). (1) N.B.: Se per esempio vengono ottenuti i risultati y11, y12, y21 e y22 si deve calcolare la media aritmetica di y11/y21 e y12/y22. ALLEGATO V CONTROLLO INTERNO (Articolo 5) a) Procedura per il controllo interno della qualità (CIQ) (analisi chimica) Definizione di materiale di controllo Materiale utilizzato ai fini del controllo interno della qualità e analizzato secondo la stessa procedura, o parte della stessa procedura, dei materiali sottoposti a test. Un materiale di controllo può essere: - un materiale di riferimento certificato, - un materiale di riferimento interno, - un materiale convalidato mediante una prova interlaboratori, - un materiale addizionato di rivelatore. Procedura per instaurare il CIQ Il laboratorio deve istituire un CIQ secondo la procedura descritta nel documento IUPAC "Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories"(1). Il CQI viene realizzato mediante l'inclusione di materiali di controllo nella sequenza analitica o mediante analisi in multiplo del campione in esame. I materiali di controllo devono avere una composizione chimica simile a quella dei campioni ed essere adeguatamente stabili nel periodo di tempo di pertinenza. Deve essere dimostrato che essi possono venire suddivisi idoneamente in porzioni identiche per l'analisi e che presentano una concentrazione dell'analita appropriata per l'intervallo di pertinenza. Un materiale di controllo deve venire inserito almeno una volta in ciascuna serie di analisi e il valore ottenuto deve venire riportato su un diagramma di controllo allo scopo di misurare gli errori a lungo termine. Inoltre, il laboratorio deve dimostrare periodicamente la conformità alle condizioni di ripetibilità all'interno della serie. A tal fine si eseguono analisi in doppio di materiali di controllo e/o di test. I risultati di queste analisi devono venire confrontati con eventuali limiti di ripetibilità pubblicati e con dati esistenti relativi alla precisione interna del laboratorio. Nel caso vengano utilizzati materiali di controllo, i valori ottenuti per l'analisi del materiale di controllo tra una serie e l'altra verranno riportati su un diagramma di Shewhart [ISO 8258 (1991)] con appropriati limiti di controllo. I limiti di azione vengono fissati a >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>, dove st è la deviazione standard totale, e i limiti di vigilanza sono fissati a >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> Deviazione standard totale >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: sb: deviazione standard tra serie sw: deviazione standard all'interno di una serie n: numero di determinazioni In casi nei quali non vengono utilizzati materiali di controllo (per esempio a causa della mancanza di stabilità), almeno uno dei materiali in esame deve essere analizzato in doppio in ciascuna serie. Le differenze assolute ottenute dalle analisi in doppio entro una serie (vedi allegato III) sono riportate in grafico. La linea centrale è 1,128 sw, il limite inferiore è pari a zero, il limite superiore (limite d'azione) è 3,686 sw, dove sw è la deviazione standard all'interno della serie. La procedura di controllo deve includere materiali dei livelli alto e basso quando l'intervallo di concentrazione è ampio. Se i materiali di analisi coprono un ampio intervallo di concentrazioni dell'analita, il laboratorio deve stabilire la relazione tra precisione e livello. Se la precisione è proporzionale al livello, il successivo controllo deve venire effettuato sulla base della precisione relativa (cioè differenza assoluta in percentuale del valore medio). Si è in condizioni di fuori controllo nel sistema analitico se si verifica uno dei casi seguenti: A) l'ultimo valore del tracciato cade al di fuori dei limiti d'azione, B) l'ultimo valore e il valore precedente cadono al di fuori dei limiti di vigilanza, ma all'interno dei limiti d'azione, C) se si utilizzano materiali di controllo, nove valori successivi cadono sullo stesso lato della linea mediana. In condizioni di fuori controllo il laboratorio deve A) sospendere l'analisi fino a quando vengano eseguite prove diagnostiche e si effettuino le opportune operazioni correttive e B) scartare la serie di risultati e ripetere l'analisi dei materiali in esame. b) Procedura per la selezione di materiale di controllo interno e per la determinazione dei limiti di precisione "interni" (analisi chimica) Dati relativi alla precisione interna del laboratorio vengono ottenuti mediante analisi in multiplo di materiali di controllo e/o mediante analisi in multiplo di campioni da analizzare. Per la determinazione dei parametri di precisione per le variazioni entro una serie e tra serie differenti, da utilizzare in seguito per costruire schede di controllo, i laboratori applicano la seguente procedura. I laboratori possono adottare procedure alternative a condizione che possano dimostrare adeguatamente che ne sono stati derivati parametri di precisione affidabili. 1. Scelta dei materiali di controllo Nel caso sia opportuno che il laboratorio utilizzi un materiale di controllo, devono innanzitutto venire raccolti dati per definire i limiti. Se possibile, si devono utilizzare materiali di riferimento certificati (MRC). I potenziali materiali di controllo devono venire analizzati in condizioni di ripetibilità all'interno di una serie, includendo adatti MRC con replicazione e randomizzazione. Ove tale approccio non sia possibile, i laboratori devono cercare di partecipare a prove di idoneità e stabilire valori medi di consenso (valori assegnati) che possano venire considerati come media vera convenzionale associata a un'incertezza significativa. Altre procedure consistono nell'assegnazione di un valore vero mediante formulazione oppure mediante l'uso di materiali di controllo addizionati di rivelatore. Inoltre, qualora il laboratorio esegua regolarmente questo tipo di analisi ed abbia già istituito un controllo statistico, un nuovo materiale di controllo (occorrente per esempio a causa dell'esaurimento delle scorte) deve essere scelto per confronto con analisi sotto controllo di materiali esistenti. 2. Assegnazione dei limiti Dopo aver scelto un materiale di controllo, il laboratorio deve stabilire valori numerici della precisione nell'ambito di una serie e tra serie differenti utilizzando questo materiale. Come requisito minimo per stabilire la precisione nell'ambito di una serie, il materiale di controllo deve venire analizzato in doppio per 12 volte. L'analisi in doppio deve essere eseguita in condizioni di repetibilità, vale a dire dallo stesso operatore, con i medesimi reagenti, ecc. L'analisi in doppio del materiale di controllo deve essere randomizzata all'interno di una serie analitica. Ciascuna analisi in doppio deve essere effettuata in giorni differenti su un periodo di tempo tale da riflettere ragionevoli variazioni da serie a serie, che tengano conto delle variazioni normali, per esempio di reagenti, ritaratura degli strumenti e, se del caso, differenti analisti. NB. Va notato che l'uso di dati non del tutto rappresentativi delle variazioni da serie a serie può causare un'inutile ripetizione dell'analisi a causa della definizione di limiti troppo stretti. Al contrario, un laboratorio che presenti dati di precisione troppo imprecisi può non essere in grado di rispettare i limiti prescritti nei metodi di riferimento, rischia di ottenere risultati scadenti rispetto a laboratori di pari livello e di non riuscire a produrre dati idonei allo scopo. 2.1. Determinazione della precisione nell'ambito di una serie 2.1.1. Precisione nell'ambito di una serie quando sia disponibile un materiale di controllo. I dati in doppio (minimo 12 analisi in doppio) devono innanzitutto essere sottoposti ad un test di varianza massima di Cochran. Questo consiste nel confronto del quadrato della differenza massima di una prova in doppio con la somma del quadrato delle differenze. >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove di= differenza tra analisi in doppio Il valore del criterio di Cochran, C, viene confrontato con valori tabulati [ISO 5725 (1994)]. Se un valore può essere classificato come sospetto o erratico, il risultato deve essere esaminato e spiegato, per esempio per errore tecnico, errore di calcolo, disattenzione nell'esecuzione della prova, analisi di un campione sbagliato. Se, in base alla spiegazione dell'errore tecnico, è impossibile sostituire il risultato sospetto, questo deve venire scartato come vero valore erratico. Se permangono risultati sospetti o erratici privi di spiegazione, i valori sospetti vengono conservati come corretti e i valori erratici statistici vengono scartati. Il laboratorio deve cercare di ottenere valori sostitutivi. Quando il laboratorio è sicuro che i dati non contengono valori erratici, la deviazione standard nell'ambito di una serie sw viene ottenuta come segue: Per ciascuna coppia xi1, xi2 dei dati in doppio, si calcolano la somma dei due risultati >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> e la differenza dei due risultati >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> e si calcolano le somme >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> Una stima della deviazione standard nell'ambito di una serie è >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> Il limite interno di precisione è 2,8 sw. Se si usa un metodo di riferimento, il limite di precisione interno dovrà essere confrontato con il limite di ripetibilità pubblicato. Il laboratorio deve soddisfare a quanto previsto dal metodo di riferimento; in caso contrario bisogna ricercarne le ragioni. I limiti stabiliti devono essere considerati come provvisori e soggetti a revisione. 2.1.2. Precisione nell'ambito di una serie nel caso non sia disponibile un materiale di controllo Il laboratorio può scegliere di stabilire la precisione nell'ambito di una serie mediante analisi in doppio di campioni rappresentativi (almeno 12 analisi in doppio). In casi nei quali non sia possibile utilizzare materiali di controllo, per esempio perché instabili, devono venire raccolti dati in doppio ottenuti mediante questo metodo. NB. Si assume che le analisi coprano un intervallo relativamente stretto di valori e che pertanto sia possibile applicare un valore singolo a tutti i campioni. Quando la gamma dei risultati è più ampia (se, per esempio, si estende su un ordine di grandezza) e la precisione dipende dal livello, i laboratori devono prendere in considerazione l'utilizzo di deviazioni standard relative. I dati devono venire sottoposti al test di Cohran, come al punto 2.1.1. Una volta che il laboratorio ha stabilito che i dati non comprendono valori erratici, si possono ottenere la deviazione standard nell'ambito di una serie e il limite di precisione interno come definito al punto 2.1.1. La deviazione standard sw nell'ambito di una serie può venire utilizzata per costruire diagrammi di controllo (vedi allegato II). I limiti stabiliti devono essere considerati come provvisori e soggetti a revisione. 2.2. Determinazione della precisione tra serie differenti Calcolare il valore medio (s1/2) per ciascuna coppia e sottoporre questi valori al test di Grubbs [ISO 5725 (1994)]. I criteri di scarto/accettazione dei valori erratici o dei valori sospetti sono uguali a quelli descritti al punto 2.1.1. Il laboratorio deve cercare di ottenere un valore sostitutivo per ogni risultato scartato. Quando il laboratorio è sicuro che i dati non contengano valori erratici, si calcola la deviazione standard tra serie differenti sb. >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> oppure si assume uguale a zero se l'espressione sotto il segno di radice quadrata è negativa. La deviazione standard totale st viene utilizzata per costruire diagrammi di controllo per la media di n determinazioni (vedi allegato II). I limiti stabiliti devono essere considerati come provvisori e soggetti a revisione. 3. Revisione dei limiti iniziali I limiti di controllo stabiliti come descritto sopra devono essere considerati stime iniziali. Allo scopo di aggiornare i limiti stabiliti sulla base di una precisione accettabile nell'ambito di una serie (punto 2.1.2) si devono raccogliere ulteriori dati in doppio sui campioni. La frequenza del riesame dei dati dipenderà in generale dalla frequenza delle analisi. Indicativamente, i dati devono venire revisionati ogni 10 risultati successivi in doppio. Tutti i dati devono poi venire sottoposti al test di Cochran e i limiti devono venire fissati nuovamente sulla base del nuovo valore della deviazione standard. Decisioni successive sulla validità dei limiti di controllo verranno prese alla luce di dati ulteriori. Il riesame dei dati iniziali ottenuti per la precisione tra serie differenti dipende anch'esso dalla frequenza di analisi. Indicativamente, dopo aver ottenuto 10 dati dall'analisi del materiale di controllo, ad una frequenza di un'analisi per partita, si dovrebbero riesaminare i valori assunti inizialmente per la deviazione standard e per la media. Tutti i dati devono venire sottoposti al test di Grubbs per la ricerca di valori erratici. Sulla base dei nuovi dati si calcolano poi nuovamente la media e la deviazione standard. In aggiunta, a questo stadio il laboratorio dovrebbe utilizzare un grafico di campionamento sequenziale (grafico "Cusum") [BS 5700: (1984) e modifica 5480 (1987)] per studiare problemi che possono essere associati per esempio all'invecchiamento dei reagenti. Cercare una spiegazione per qualsiasi singolo risultato che cade al di fuori dei limiti della "V-mask" del suddetto grafico. I nuovi limiti (media e deviazione standard) devono venire esaminati regolarmente con l'utilizzo della tecnica del grafico "Cusum". Qualsiasi indicazione che possa far sorgere dubbi sulla validità del materiale di controllo deve essere accuratamente studiata. 4. Comunicazione dei dati sulla precisione Il laboratorio trasmette le seguenti informazioni alle competenti autorità nazionali: - metodo impiegato, - deviazione standard nell'ambito di una serie, sw, e limite di precisione interno, - deviazione standard tra serie differenti, sb, - deviazione standard totale s1, - numero di analisi eseguite per ottenere i dati sulla precisione. (1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995). ALLEGATO VI (Articolo 6) VALUTAZIONE DEGLI ASSAGGIATORI E DELL'AFFIDABILITÀ DEI RISULTATI DI ANALISI ORGANOLETTICHE Le procedure che seguono sono applicabili se vengono utilizzati metodi di classificazione mediante punteggio (norma IDF 99C/1997). a) Determinazione dell'"indice di ripetibilità" Un assaggiatore deve analizzare alla cieca almeno 10 campioni in doppio entro un periodo di 12 mesi. Tale operazione viene usualmente effettuata in più sessioni. I risultati delle caratteristiche dei singoli prodotti vengono valutati utilizzando la formula seguente: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: wI: dice di ripetibilità xi1: punteggio per la prima valutazione del campione xi xi2: punteggio per la seconda valutazione del campione xi n: numero di campioni I campioni da valutare devono coprire un'ampia gamma di qualità. wI non deve superare 1,5 (scala a 5 punti). b) Determinazione dell'"indice di deviazione" Tale indice si applica per controllare se un assaggiatore utilizza, per la valutazione qualitativa, la stessa scala di un gruppo sperimentato di assaggiatori. I punteggi attribuiti dall'assaggiatore vengono confrontati con la media dei punteggi del gruppo di assaggiatori. Per la valutazione dei risultati si utilizza la formula seguente: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: xi1; xi2: cfr. lettera a) >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>; >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: punteggio medio del gruppo di assaggiatori per la prima e, rispettivamente, la seconda valutazione del campione xi n: numero di campioni (almeno 10 in 12 mesi). I campioni da valutare devono coprire un'ampia gamma di qualità. DI non deve superare 1,5 (scala a 5 punti). Gli Stati membri comunicano eventuali difficoltà incontrate nell'applicazione di questa procedura. c) Confronto dei risultati ottenuti in differenti regioni di uno Stato membro e in differenti Stati membri Ove del caso, almeno una volta all'anno deve essere organizzata una prova che permetta il confronto dei risultati ottenuti da assaggiatori di differenti regioni. Se si rilevano differenze significative, occorre fare in modo di individuarne le ragioni e arrivare a risultati simili. Gli Stati membri possono organizzare prove che permettano il confronto dei risultati ottenuti dai loro assaggiatori o da assaggiatori di Stati membri confinanti. Eventuali differenze significative formano oggetto di un esame approfondito allo scopo di giungere a risultati simili. Gli Stati membri comunicano alla Commissione i risultati di tali confronti. ALLEGATO VII (Articolo 6) VALUTAZIONE ORGANOLETTICA DEL BURRO 1. Obiettivo La presente procedura per la valutazione organolettica del burro ha lo scopo di fornire un metodo uniforme applicabile in tutti gli Stati membri. 2. Definizioni Per valutazione organolettica si intende l'esame delle caratteristiche di un prodotto mediante gli organi di senso. Per gruppo di esperti si intende un gruppo di esperti selezionati per la valutazione che, durante le operazioni di valutazione, lavorano senza comunicare fra di loro e senza influenzarsi reciprocamente. Per punteggio si intende il risultato della valutazione organolettica effettivata da parte di un gruppo di esperti ed espressa mediante l'uso di una scala numerica. Si deve usare una nomenclatura dei difetti. Per classificazione si intende una classificazione di qualità eseguita sulla base del punteggio. Documenti di controllo: documenti utilizzati per registrare i punteggi singoli per ciascuna caratteristica e la classificazione finale del prodotto. (Questo documento può venire usato anche per registrare la composizione chimica). 3. Locale di prova 3.1. Prendere opportune precauzioni perché gli assaggiatori nella camera di prova non siano influenzati da fattori esterni. 3.2. La camera di prova deve essere esente da odori estranei e facilmente pulibile. Le pareti devono essere di colore chiaro. 3.3. La camera di prova e la sua illuminazione devono essere tali da non influire sulle proprietà del prodotto da valutare. La camera deve essere equipaggiata con un'appropriata strumentazione di controllo della temperatura. 4. Selezione degli assaggiatori L'assaggiatore deve avere familiarità con i prodotti a base di burro e avere la competenza necessaria per eseguire una valutazione organolettica. La sua competenza deve essere riesaminata periodicamente (almeno una volta all'anno) da parte dell'autorità competente. 5. Requisiti del gruppo di esperti Il numero di esperti nel gruppo deve essere dispari, al minimo tre. Essi devono essere, per la maggior parte, dipendenti dell'autorità competente o persone autorizzate non occupati presso l'industria lattiero-casearia. Affinché gli assaggiatori possano fornire prestazioni ottimali, prima di procedere alla valutazione occorre tener conto di diversi fattori: - gli assaggiatori non devono essere affetti da malattie che potrebbero compromettere le prestazioni; ove ciò si verifichi è necessario inserire nel gruppo un altro assaggiatore, - gli assaggiatori devono presentarsi puntualmente per partecipare alla valutazione e disporre di tempo sufficiente per compierla, - gli assaggiatori devono evitare l'impiego di prodotti fortemente odorosi quali profumi, lozioni dopobarba, deodoranti e astenersi dal consumo di alimenti molto aromatizzati (speziati), ecc., - nella mezzora che precede la valutazione gli assaggiatori non devono fumare, né mangiare o bere tranne acqua. 6. Valutazione di ciascuna caratteristica 6.1. La valutazione organolettica viene eseguita in relazione alle seguenti tre caratteristiche: aspetto, consistenza e gusto. Aspetto comprende le caratteristiche seguenti: colore, purezza visibile, sviluppo di muffe e dispersione dell'acqua. La dispersione dell'acqua è valutata conformemente alla norma FIL 112/A/1989. Consistenza comprende le caratteristiche seguenti: compattezza e spalmabilità. Per la valutazione della consistenza del burro si possono utilizzare metodi fisici. La Commissione prevede di armonizzare in futuro questi metodi. Gusto implica le caratteristiche seguenti: sapore e odore. Uno scostamento significativo dalla temperatura raccomandata impedisce una valutazione corretta della consistenza, del gusto. La temperatura è della massima importanza. 6.2. Ciascuna caratteristica deve venire valutata, dal punto di vista organolettico, separatamente. Il punteggio deve essere assegnato secondo la tabella 1. 6.3. Può essere opportuno che, prima di iniziare la valutazione, gli assaggiatori assegnino insieme un punteggio ad uno o più campioni di riferimento per quanto riguarda aspetto, consistenza e gusto, al fine di raggiungere una maggiore uniformità. 6.4. Il punteggio per l'accettazione è il seguente: >SPAZIO PER TABELLA> Quando non si raggiunge il punteggio richiesto, deve essere fornita una descrizione del difetto. Il punteggio assegnato da ciascun assaggiatore per ciascuna caratteristica deve essere registrato nel documento di controllo. Il prodotto viene accettato o scartato sulla base di una decisione a maggioranza. Casi in cui le differenze tra i punteggi individuali per ciascuna caratteristica siano più ampie di un punto non devono verificarsi frequentemente (non più di una volta su venti campioni). In caso contrario il capogruppo deve riesaminare la competenza del gruppo di assaggiatori. 7. Supervisione In generale, il capogruppo, che deve essere un funzionario dell'autorità competente e che può essere membro del gruppo di assaggiatori, sarà responsabile dell'intera procedura. Il capogruppo deve registrare i punteggi individuali per ciascuna caratteristica nel documento di controllo e certificare se il prodotto è stato accettato o scartato. 8. Campionamento e preparazione del campione 8.1. - È opportuno che l'identità dei campioni sia tenuta celata durante la valutazione allo scopo di evitare qualsiasi influenza. - Di questo si deve occupare il capogruppo prima della valutazione, in assenza degli altri membri del gruppo. 8.2. Quando la valutazione organolettica viene eseguita presso il magazzino frigorifero, il campione di burro viene prelevato mediante un campionatore per burro. Se la valutazione organolettica viene eseguita in un luogo diverso dal magazzino frigorifero, prelevare un campione di almeno 500 g. 8.3. Durante la valutazione, il burro deve avere una temperatura di 10-12 °C. Evitare assolutamente grandi scostamenti da questo intervallo. 9. Nomenclatura Fare riferimento all'allegata tabella 2. Tabella 1: Punteggio del burro >SPAZIO PER TABELLA> >SPAZIO PER TABELLA> >SPAZIO PER TABELLA> Tabella 2: Nomenclatura dei difetti del burro I. Aspetto 1. acquoso, goccioline d'acqua evidenti 2. colore non uniforme, due colori 3. striata 4. screziato, marezzato 5. chiazzato 6. separazione d'olio 7. colore eccessivo 8. poroso 9. granuloso 10. materiale estraneo 11. muffa 12. sale non disciolto II. Consistenza 14. corta, fragile, friabile 15. pastosa, untuosa, molle 16. appiccicosa 17. dura 18. molle III. Gusto e aroma 20. mancanza d'aroma, insipido 21. impuro(1) 22. gusto estraneo 23. stantio 24. sapore di formaggio, di formaggio acido 25. acido 26. sapore di lievito 27. a) sapore di cotto b) sapore di bruciato 28. sapore di muffa 29. rancido 30. oleoso, di pesce 31. sapore di sego 32. a) sapore di ossidato b) sapore metallico 33. sapore di foraggio 34. acre, amaro 35. eccessivamente salato 36. ammuffito, marcio 37. sapore di malto 38. sapore di prodotti chimici (1) Questa definizione deve venire usata il più raramente possibile e solo quando il difetto non può venire descritto in modo più accurato. ALLEGATO VIII (Articolo 7) PROCEDURA DA SEGUIRE IN CASO DI CONTROVERSIA SUI RISULTATI DI UN'ANALISI (ANALISI CHIMICA) 1. Un'ulteriore analisi viene praticata su richiesta del produttore entro 7 giorni lavorativi dalla comunicazione dei risultati della prima analisi, a condizione che siano disponibili campioni prelevati in doppio, sigillati e che siano stati conservati in modo appropriato presso organismi competenti. 2. Su richiesta del produttore e a spese del medesimo, l'organismo competente invia tali campioni ad un secondo laboratorio. Questo laboratorio deve essere autorizzato ad eseguire analisi ufficiali e deve possedere una dimostrata competenza per le analisi in questione. Tale competenza deve risultare della sua partecipazione (con risultati soddisfacenti) a studi in collaborazione, a prove di idoneità o a confronti interlaboratori. Il secondo laboratorio deve utilizzare il metodo di riferimento. I risultati ottenuti dai due laboratori vengono valutati come segue. a) Se i due laboratori soddisfano i requisiti di ripetibilità e di riproducibilità Come risultato finale viene riportata la media aritmetica dei risultati d'analisi ottenuti dai due laboratori. Questo risultato finale viene valutato, tenendo conto della differenza critica, con la formula seguente: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO>: media aritmetica di tutti i risultati ottenuti dai due laboratori mo: limite R: riproducibilità r: ripetibilità n1: numero dei risultati ottenuti dal laboratorio 1 n2: numero dei risultati ottenuti dal laboratorio 2 Nota: Se il risultato finale viene calcolato utilizzando le formule >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> o >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> (si veda l'allegato IV, rispettivamente ai punti 3 e 4) nelle formule occorre inserire R2x e r2x al posto di R2 e r2. b) Se i due laboratori soddisfano il requisito di ripetibilità ma non quello di riproducibilità Se la prima analisi è confermata dalla seconda, la quantità analizzata è respinta come non conforme. In caso contrario tale quantità viene accettata. c) Se solo un laboratorio soddisfa il requisito di ripetibilità Per la decisione sull'accettabilità della quantità sottoposta ad analisi, ci si basa sul risultato finale del laboratorio che soddisfa il requisito di ripetibilità. d) Se nessuno dei due laboratori soddisfa il requisito di ripetibilità, ma solo quello di riproducibilità Si applica il disposto della lettera a). e) Se nessuno dei due laboratori soddisfa il requisito di ripetibilità né quello di riproducibilità La quantità sottoposta ad analisi viene accettata se i risultati ottenuti da un laboratorio portano a questa conclusione. f) Se i risultati sono stati ottenuti con metodi non convalidati La quantità sottoposta ad analisi viene accettata se i risultati ottenuti da un laboratorio portano a questa conclusione. 3. L'autorità competente comunica quanto prima al produttore i risultati della seconda analisi. Nel caso in cui la quantità sottoposta ad analisi sia respinta i costi della seconda analisi sono a carico del produttore. 4. Se il produttore dimostra che la procedura di campionamento non è stata correttamente eseguita, occorre, se possibile, ripetere il campionamento. Ove non sia possibile procedere a un nuovo campionamento, la quantità sottoposta ad analisi viene accettata. ALLEGATO IX (Articolo 8) DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN ACQUA DEL BURRO 1. Finalità e campo di applicazione Il presente metodo specifica le modalità per la determinazione del contenuto in acqua del burro. 2. Riferimento Norma IDF 50 C: 1995 - Latte e prodotti lattiero-caseari - metodo di campionamento. 3. Definizione Contenuto in acqua del burro: la perdita di massa dopo completamento del processo di riscaldamento descritto nella presente norma. Esso è espresso in grammi/100 grammi. 4. Principio Evaporazione dell'acqua da un'aliquota di prova, in presenza di pomice, alla temperatura di 102 °C in stufa di essiccazione. 5. Apparecchiatura e materiali Usuale apparecchiatura di laboratorio; in particolare: 5.1. Bilancia analitica, con sensibilità 1 mg. 5.2. Essiccatore, fornito di un efficace agente essiccante (esempio: gel di silice recentemente essiccato, con indicatore igroscopico). 5.3. Stufa di essiccazione, ventilata, sotto controllo termostatico, funzionante a 102 ± 2 °C su tutto lo spazio di lavoro. 5.4. Capsule di vetro, porcellana o materiale anticorrosione, di altezza 20 mm circa e diametro 60-80 mm. 5.5. Pietra pomice lavata, in granuli, di diametro 0,8-10 mm. 6. Campionamento Cfr. norma IDF 50 C: 1995 7. Modo di operare 7.1. Preparazione della porzione da esaminare: Nel recipiente chiuso, in vetro o materiale plastico idoneo, che deve essere pieno da metà a due terzi, riscaldare il campione di laboratorio fino a una temperatura alla quale il campione sia abbastanza molle da consentire una facile miscelazione (con agitatore meccanico o a mano) fino al raggiungimento di uno stato omogeneo. La temperatura di miscelazione non deve normalmente superare i 35 °C. Lasciar raffreddare il campione a temperatura ambiente. Appena possibile dopo il raffreddamento, aprire il contenitore del campione ed agitare brevemente (non più di 10 secondi) con un appropriato strumento come un cucchiaio o una spatola, prima della pesata. 7.2. Determinazione del contenuto in acqua 7.2.1. Introdurre almeno 10 grammi di pomice nella capsula. 7.2.2. Essiccare la capsula contenente la pomice nella stufa, alla temperatura di 102 ± 2 °C per almeno un'ora. Nota: i periodi di essiccazione menzionati ai punti 7.2.2, 7.2.5 e 7.2.7 iniziano quando la temperatura della stufa raggiunge i 102 ± 2 °C. 7.2.3. Lasciar raffreddare la capsula nell'essiccatore fino alla temperatura della sala bilance e pesare con l'approssimazione di 1 mg. 7.2.4. Pesare nella capsula, con l'approssimazione di 1 mg, una porzione da 5 gr circa del campione in esame. 7.2.5. Porre la capsula nel forno a 102 ± 2 °C e lasciarvela per 3 ore. 7.2.6. Lasciar raffreddare la capsula nell'essiccatore alla temperatura della sala bilance e pesare con l'approssimazione di 1 mg. 7.2.7. Ripetere il processo di essiccazione per ulteriori periodi di 1 ora, lasciando raffreddare e pesando ogni volta come specificato al punto 7.2.6 fino a massa costante (le variazioni di massa non debbono superare 1 mg). Nel caso di un incremento della massa, assumere come base di calcolo il più basso valore di massa registrato. 8. Espressione dei risultati 8.1. Metodo di calcolo e formula Calcolare il contenuto d'acqua W come percentuale rispetto alla massa, impiegando la seguente formula: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove m0: massa in grammi della capsula contenente la pomice (7.2.3) m1: massa in grammi della porzione esaminata, della capsula e della pomice prima dell'essiccazione (7.2.4) m2: massa in grammi della porzione esaminata, della capsula e della pomice dopo essiccazione (7.2.7) Indicare il risultato con una cifra decimale. 8.2. Ripetibilità La differenza assoluta tra i risultati di due singole determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso operatore, nelle stesse condizioni e su materiale di prova identico, non deve superare lo 0,2 %. 8.3. Riproducibilità La differenza assoluta fra due singoli risultati indipendenti ottenuti da due operatori che lavorano in laboratori diversi su materiale di esame identico non deve superare lo 0,3 %. 9. Relazione La relazione deve precisare il metodo impiegato e i risultati ottenuti. Essa deve altresì menzionare tutti i particolari operativi non specificati nella citata norma internazionale o considerati come facoltativi, nonché gli eventuali incidenti che possano avere influenzato il risultato. La relazione deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del campione. ALLEGATO X (Articolo 8) DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN SOLIDI MAGRI DEL BURRO 1. Finalità a campo di applicazione La presente norma specifica un metodo per la determinazione del contenuto di solidi magri del latte. 2. Riferimento Norma IDF Standard 50 C: 1995 - Latte e prodotti lattiero-caseari - metodo di campionamento. 3. Definizioni Contenuto in solidi magri del burro: percentuale in massa delle sostanze, come determinata col procedimento specificato. Essa è espressa in grammi/100 grammi. 4. Principio Evaporazione dell'acqua da una massa nota di burro, estrazione del grasso con etere di petrolio o pesatura del residuo. 5. Reattivi Etere di petrolio con intervallo di ebollizione compreso tra 30 e 60 °C. Dopo evaporazione, 100 ml del reattivo non debbono lasciare più di 1 mg di residuo. 6. Attrezzatura e materiali 6.1. Bilancia analitica, con sensibilità di 1 mg. 6.2. Essiccatore, fornito di un efficace agente essiccante (esempio: gel di silice recentemente essiccato, con indicatore igroscopico). 6.3. Stufa di essiccazione, ventilata, sotto controllo termostatico, funzionante a 102 +- 2 °C su tutto lo spazio di lavoro 6.4. Capsule di vetro, porcellana o materiale anticorrosione, di altezza 20 mm circa e diametro 60-80 mm, fornita di bacchetta in vetro per l'agitazione. 6.5. Crogiuolo filtrante in vetro sinterizzato, diametro dei pori da 16 a 40 μm con matraccio di aspirazione. 7. Campionamento Cfr. norma IDF Standard 50 C: 1995 8. Modo di operare 8.1. Preparazione del campione per la prova Nel recipiente chiuso, in vetro o materiale plastico idoneo, che deve essere pieno da metà a due terzi, riscaldare il campione di laboratorio fino a una temperatura alla quale il campione sia abbastanza molle da consentire una facile miscelazione (con agitatore meccanico o a mano) fino al raggiungimento di uno stato omogeneo. La temeperatura di miscelazione non deve normalmente superare i 35 °C. Lasciar raffreddare il campione a temperatura ambiente. Appena possibile dopo il raffreddamento, aprire il contenitore del campione ed agitare brevemente (non più di 10 secondi) con un appropriato strumento, come un cucchiaio o una spatola, prima della pesata. 8.2. Determinazioni 8.2.1. Essiccare per 1 ora la capsula contenente la bacchetta (6.4) e il crogiuolo (6.5) nel forno (6.3). Lasciare raffreddare questi oggetti nell'essiccatore a pesare insieme capsula, bacchetta e crogiuolo con l'approssimazione di 1 mg (m0) Note: - Di norma, un tempo di raffreddamento di 45 minuti è sufficiente. - È importante impiegare la stessa combinazione di capsula, bacchetta e crogiuolo per ciascuna aliquota di prova, qualora nella partita venga analizzata più di una porzione di prova. 8.2.2. Allontanare il crogiuolo, registrare il peso globale della bacchetta e della capsula con l'approssimazione di 1 mg (m1). 8.2.3. Pesare nella capsula, con l'approssimazione di 1 mg, una aliquota da circa 5 gr del campione in esame (8.1) (m2). 8.2.4. Collocare la capsula (contenente la bacchetta e il burro) nel forno a 102 +- 2 °C e lasciarveli per tutta la notte. 8.2.5. Lasciar raffreddare il piatto (8.2.3) fino a temperatura ambiente. 8.2.6. Aggiungere nella capsula 15 ml di etere di petrolio tiepido (a 25 °C circa) e con la bacchetta di vetro staccare la maggior parte possibile del sedimento che aderisce alla capsula. Trasferire il solvente nel crogiuolo e filtrarlo nel matraccio ad aspirazione. 8.2.7. Eseguire altre 4 volte l'operazione 8.2.6. Qualora non si rilevino tracce di grasso sulla superficie della capsula, trasferire quantitativamente, durante il quarto lavaggio, la maggior parte possibile del sedimento nel crogiuolo. Altrimenti, ripetere l'operazione 8.2.6 fino ad eliminazione completa di tutte le tracce di grasso. 8.2.8. Lavare il sedimento nel crogiuolo con 25 ml di etere di petrolio con 25 ml di etere di petrolio tiepido. 8.2.9. Essiccare insieme nel forno la capsula, la bacchetta di vetro e il crogiuolo, alla temperatura di 102 +- 2 °C per 30 minuti. 8.2.10. Lasciar raffreddare nell'essiccatore fino a temperatura ambiente e pesare con l'approssimazione di 1 mg. 8.2.11. Ripetere le operazioni 8.2.9 e 8.2.10 fino a massa costante (variazioni della massa non superiori a 1 mg) per l'insieme capsula, bacchetta e crogiolo (m3). 9. Espressione dei risultati 9.1. Calcolo del contenuto in solidi magri Calcolare il contenuto in solidi magri SNF come percentuale rispetto alla massa, impiegando la seguente formula: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove m0: massa in grammi della capsula vuota con la bacchetta di vetro e il crogiolo (8.2.1) m1: massa in grammi della capsula vuota con la bacchetta di vetro (8.2.2) m2: massa in grammi dell'aliquota in esame e della capsula contenente la bacchetta di vetro (8.2.3) m3: massa finale in grammi della capsula con la bacchetta e del crogiolo contenente i sedimenti (8.2.11) Indicare il risultato con una cifra decimale. 9.2. Ripetibilità La differenza assoluta fra i risultati di due singole determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso operatore, nelle stesse condizioni e su materiale identico, non deve superare lo 0,1 %. 9.3. Riproducibilità La differenza assoluta fra due singoli risultati indipendenti ottenuti da due operatori che lavorano in laboratori diversi su materiali di esame identici non deve superare lo 0,2 %. 10. Relazione La relazione deve precisare il metodo impiegato e i risultati ottenuti. Essa deve inoltre menzionare tutti i particolari operativi non specificati nella citata norma internazionale o considerati come facoltativi, nonché gli eventuali incidenti che possano avere influenzato i risultati. La relazione deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del campione. Nota: >SPAZIO PER TABELLA> Si può concludere che i valori relativi alla precisione ottenuti per la determinazione dei solidi magri valgono per la determinazione dei solidi magri del latte. ALLEGATO XI (Articolo 8) DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN MATERIE GRASSE DEL BURRO Il contenuto in materie grasse è contenuto indirettamente tramite determinazione del contenuto in acqua e del contenuto in solidi magri, secondo gli allegati IX e X. La percentuale in massa di materie grasse è pari a: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove W percentuale in massa di acqua SNF percentuale in massa di solidi magri >SPAZIO PER TABELLA> ALLEGATO XII (Articolo 9) DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO IN VANILLINA NEL BURRO CONCENTRATO, NEL BURRO O NELLA CREMA, PER CROMATOGRAFIA IN FASE LIQUIDA AD ALTO RENDIMENTO 1. Finalità e campo di applicazione Il metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa del contenuto di vanillina nel burro concetrato, nel burro o nella crema. 2. Principio Estrazione di una quantità nota di campione con una miscela di isopropanolo/acetonitrile (1:1:2). Precipitazione della maggior parte del grasso per raffreddamento fra -15 e -20 °C e successiva centrifugazione. Dopo diluizione con acqua, determinazione del contenuto in vanillina per cromatografia in fase liquida ad alto rendimento (HPLC). 3. Apparecchiatura Normale apparecchiatura di laboratorio, e in particolare: 3.1. congelatore, campo di temperatura da -15 a -20 °C; 3.2. siringhe a perdere, della capacità di 2 ml; 3.3. microfiltri a membrana con pori da 0,45 μm e resistenti a una soluzione contenente il 5 % della soluzione di estrazione (4.4); 3.4. sistema di cromatografia in fase liquida, consistente in una pompa (della portata di 1,0 ml/min), un iniettore (iniezione da 20 μl, automatica o manuale), un rivelatore UV (funzionante, a 306 nm, fondo scala a 0,01 AU), un registratore o integratore e un termostato a colonna funzionante a 25 °C; 3.5. colonna analitica (250 mm x 4,6 mm d.i.), riempita con LiChrospher RP 18 (Merck, 5μm) o equivalente; 3.6. colonna di guardia (ca. 20 mm x 3 mm d.i.), riempita a secco con Perisorb RP 18 (30-40 μm) od equivalente; 4. Reagenti Tutti i reagenti impiegati debbono essere di purezza analitica riconosciuta. 4.1. Isopropanolo 4.2. Etanolo 96 % (v/v) 4.3. Acetonitrile 4.4. Soluzione di estrazione Mescolare isopropanolo (4.1), etanolo (4.2) ed acetonitrile (4.3) nel rapporto 1:1:2 (v/v). 4.5. Vanillina (4-idrossi-3-metossibenzaldeide) 4.5.1. Soluzione madre di vanillina (=50 μg/ml) In un matraccio tarato da 100 ml, persare 50 mg circa (CM mg) di vanillina (4.5) con la precisione di 0,1 mg; aggiungere 25 ml di soluzione di estrazione (4.4) e portare a volume con acqua. 4.5.2. Soluzione standard di vanillina (= 10 μg/ml) Pipettare 5,00 ml di soluzione di riserva di vanillina (4.5.1) in un matraccio tarato da 250 ml e portare a volume con acqua. 4.6. Metanolo per HPLC 4.7. Acido acetico glaciale 4.8. Acqua per HPLC 4.9. Fase mobile HPLC In un matraccio tarato da 1000 ml, miscelare 300 ml di metanolo (4.6) con 500 ml circa d'acqua (4.8) e 20,0 ml di acido acetico (4.7); portare a volume con acqua (4.8). Filtrare per filtro da 0,45 μm (3.3). 5. Procedimento 5.1. Preparazione delle aliquote da analizzare 5.1.1. Burro Riscaldare il campione fino a fusione incipiente. Evitare il surriscaldamento locale oltre i 40 °C. Quando il campione diventa sufficientemente plastico, renderlo omogeneo agitando. Rimescolare il burro per 15 secondi prima di prelevarne un'aliquota. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 5 g (s.s.n.g.) di burro, con l'approssimazione di 1 mg. 5.1.2. Burro concentrato Immediatamente prima di prelevare l'aliquota da analizzare, collocare il contenitore col burro concentrato in una stufa a 40-50 °C fino a fusione completa a rendere omogeneo il campione, agitando in senso rotatorio o rimescolando, senza eccedere in energia per evitare la formazione di bolle d'aria. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 4 g (SM g) di burro concentrato, con l'approssimazione di 1 mg. 5.1.3. Crema Riscaldare il campione in bagnomaria o termostato a 35-40 °C. Distribuire il grasso in modo omogeneo agitando in senso rotatorio e, se necessario, rimescolando. Portare rapidamente il campione alla temperatura di 20 +- + 2 °C. Il campione deve presentarsi omogeneo; in caso contrario, ripetere l'operazione. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 10 g (SM g) di crema, con l'approssimazione di 1 mg. 5.2. Preparazione della soluzione da analizzare Aggiungere 75 ml circa di soluzione di estrazione (4.4) all'aliquota da analizzare (5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3), agitare o scuotere energicamente per 15 minuti circa e portare a volume con la soluzione di estrazione (4.4). Trasferire 10 ml circa di questo estratto in una provetta fornita di tappo. Collocare la provetta nel congelatore (3.1) e lasciar riposare per 30 minuti circa. Centrifugare l'estratto freddo per 5 minuti a 2000 rpm circa e decantare immediatamente. Lasciare che la soluzione decantata raggiunga la temperatura ambiente. Pipettare 5,00 ml della soluzione decantata in un matraccio tarato da 100 ml e portare a volume con acqua. Filtrare una porzione del liquido per microfiltro a membrana (3.3). Il filtrato è pronto per la determinazione HPLC. 5.3. Calibratura In un matraccio tarato da 100 ml, pipettare 5,00 ml della soluzione standard di vanillina (4.5.2). Aggiungere 5,0 ml di soluzione di estrazione (4.4) e portare a segno con acqua. Questa soluzione contiene 0,5 μg/ml vanillina. 5.4. Determinazione HPLC Lasciar stabilizzare il sistema cromatografico per 30 minuti circa. Iniettare la soluzione standard (5.3). Ripetere l'operazione finché la differenza di superficie o di altezza delle cuspidi fra due iniezioni successive è inferiore al 2 %. Nelle condizioni descritte, il tempo di ritenzione della vanillina è di circa 9 minuti. Analizzare in doppio la soluzione standard (5.3), iniettando 20 μl. Iniettare 20 μl delle soluzioni (5.2). Determinare la superficie o l'altezza della cuspide ottenuta per la vanillina. Ripetere il duplicato della soluzione standard (5.3) dopo dieci iniezioni delle soluzioni (5.2). 6. Calcolo dei risultati Calcolare il valore medio delle superfici (o delle altezze), (AC), delle cuspidi per la vanillina associate all'iniezione in doppio effettuata per inquadrare ciascun gruppo di soluzioni (quattro superfici o altezze in totale). Calcolare il fattore di risposta (R) con la formula >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove CM rappresenta la massa della vanillina in mg (4.5.1). Il contenuto (C) di vanillina nel campione esaminato, espresso in mg/kg, è dato dalla formula >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> dove: AS= area della cuspide della vanillina del campione esaminato SM= massa in g del campione esaminato (5.1.1, 5.1.2, 5.1.3). Quando la crema viene analizzata per individuare la vanillina, la concentrazione del rivelatore va espressa in mg rivelatore/kg grasso di latte. A tal fine si moltiplica C per 100/f, essendo il tenore di grasso in percentuale della crema (m/m). 20= fattore che tiene conto delle diluizioni dello standard e del campione esaminato 0,96= fattore di correzione per il contenuto in grasso nella prima diluizione del campione di prova. Nota: in luogo delle superfici delle cuspidi, si possono impiegare le rispettive altezze (cfr. 8.3). 7. Precisione del metodo 7.1. Ripetibilità (r) La differenza fra i risultati di due determinazioni eseguite nel più breve tempo possibile da un solo operatore, impiegando la stessa apparecchiatura su materiali identici, non deve superare 16 mg/kg. 7.2. Riproducibilità (R) La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in laboratori diversi, impiegando apparecchiature diverse su materiali identici, non deve superare 27 mg/kg. 8. Limiti di tolleranza 8.1. Per verificare l'omogeneità del prodotto contrassegnato, bisogna prelevare tre campioni. 8.2. Rivelatore ottenuto partendo dalla vainiglia o dalla vanillina sintetica. 8.2.1. La quantità di 4-idrossi-3-metossibenzaldeide da incorporare è di 250 g grammi per tonnellate di burro concentrato o di burro. Nel caso della crema, il tasso di incorporazione è di 250 g/t di materia grassa del latte. 8.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]: - 221,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione), - 159,0 mg/g (il 70 % del tasso minimo di incorporazione). La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 221,0 mg/kg e 159,0 mg/kg. 8.3. Tracciante ottenuto esclusivamente a partire da baccelli di vaniglia o loro estratti integrali. 8.3.1. La quantità di 4-idrossi-3-metossibenzaldeide da incorporare è di 100 grammi per tonnellata di burro concentrato o di burro. Nel caso della crema, il tasso di incorporazione è di 100 g/t di grasso di latte. 8.3.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]: - 79,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione), - 54,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione). La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg. 9. Note 9.1. Il valore r della ripetibilità è il valore al di sotto del quale la differenza assoluta fra i risultati di due prove singole ottenuti applicando lo stesso metodo a materiali identici e nelle stesse condizioni (stessa apparecchiatura, stesso laboratorio e a breve distanza di tempo), può prevedibilmente rientrare in una probabilità specifica; in mancanza di altre indicazioni, la probabilità è del 95 %. 9.2. Il valore R della riproducibilità è il valore al di sotto del quale la differenza assoluta tra i risultati di due prove singole, ottenuti applicando lo stesso metodo a materiali identici ma in condizioni diverse (operatori diversi, apparecchiature differenti, laboratori differenti e/o tempi differenti), può prevedibilmente rientrare in una probabilità specifica; in mancanza di altre indicazioni, la probabilità è del 95 %. 9.3. Il recupero della vanillina aggiunta al livello di 250 mg/kg di butteroil varia da 97,0 a 103,8. Il contenuto medio ritrovato è risultato essere del 99,9 % con una deviazione standard del 2,7 %. 9.4. La soluzione standard contiene il 5 % di soluzione di estrazione per compensare l'allargamento della cuspide provocato dalla presenza del 5 % della soluzione di estrazione nelle aliquote analizzate. Ciò consente una quantificazione attraverso l'altezza della cuspide. 9.5. L'analisi è fondata su una curva di taratura lineare, con intercetta zero. La linearità deve essere controllata impiegando appropriate diluizioni della soluzione standard (4.5.2), la prima volta che l'analisi viene effettuata e successivamente ad intervalli regolari, nonché dopo ogni modifica o riparazione dell'apparecchiatura HPLC. ALLEGATO XIII (Articolo 9) DETERMINAZIONE PER SPETTROMETRIA DELL'ESTERE ETILICO DELL'ACIDO BETA-APO-8'-CAROTENICO NEL BURRO E NEL BURRO CONCENTRATO 1. Finalità a campo d'applicazione Il metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa dell'estere etilico dell'acido beta-apo-8'-carotenico (estere apocarotenico) nel burro e nel burro concentrato. L'estere apocarotenico è la somma di tutte le sostanze presenti in un estratto di campioni ottenuto nelle condizioni descritte nel metodo e che assorbe luce di lunghezza d'onda 440 nm. 2. Principio Il grasso di burro viene sciolto in etere di petrolio e l'assorbanza è misurata a 440 nm. Il tenore di estere apocarotenico viene determinato ad uno standard esterno. 3. Apparecchiatura 3.1. Pipette graduate da 0,25, 0,50, 0,75 e 1,0 ml. 3.2. Spettrofotometro utilizzabile a 440 nm (e da 447 a 449 nm) e munito di celle con cammino ottico di 1 cm. 3.3. Palloni volumetrici, ad esempio da 20 ml e da 100 ml. 3.4. Bilancia analitica, con sensibilità 0,1 mg 4. Reagenti Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. 4.1. Sospensione di estere apocarotenico (circa 20 %). 4.1.1. Determinare il tenore della sospensione come segue. In un taraccio (100 ml) pesare con precisione 400 mg, disciogliere in 20 ml di cloroformio (4.4) e portare a volue con cicloesano (4.5). Diluire 5 ml di questa soluzione portandola a 100 ml con cicloesano. Misurare l'assorbanza a 447-449 (misurare il massimo in rapporto al cicloesano come bianco, utilizzando celle con cammino ottico di un 1 cm) >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> AmaxX= assorbanza della soluzione in esame al massimo A= peso del campione (g) 2550= valore di riferimento A (1 %, 2 cm) La purezza della sospensione è P (%). Nota: la sospensione di estere apocarotenico è sensibile all'aria, al calore e alla luce; può essere conservata per circa 12 mesi nel suo contenitore originale chiuso (sigillato sotto azoto), in luogo fresco; dopo l'apertura, la sospensione deve essere utilizzata entro breve tempo. 4.1.2. Soluzione standard di estere apocarotenico, circa 0,2 mg/ml. Pesare, a meno di 0,1 mg, circa 0,100 g di sospensione di estere apocarotenico (4.1.1) (Wg), disciogliere in essenza di petrolio (4.2), trasferire quantitativamente in un pallone volumetrico della capacità di 100 ml e portare alla tacca con essenza di petrolio. Questa soluzione contiene (W.P.)/10 mg/ml di estere apocarotenico. Nota: la soluzione deve essere conservata in luogo fresco e al buio; la soluzione non utilizzata deve essere scartata dopo un mese. 4.2. Essenza di petrolio (40-60 °C). 4.3. Solfato di sodio anidro, granulare e preventivamente essiccato a 102 °C per due ore. 4.4. Cloroformio 4.5. Cicloesano 5. Procedura 5.1. Preparazione del campione di prova 5.1.1. Burro concentrato Fondere il campione in un forno a circa 45 °C. 5.1.2. Burro Fondere il campione in un forno a circa 45 °C e filtrarne una parte rappresentativa attraverso un filtro contenente circa 10 g di solfato di sodio anidro (4.3), in ambiente protetto da luce naturale e artificiale forte, alla temperatura di 45 °C. Raccogliere una quantità opportuna di materia grassa del latte. 5.2. Determinazione Pesare, a meno di 1 mg, circa 1 g di burro concentrato o di materia grassa del latte (5.1.2), (Mg). Trasferire quantitativamente in un pallone volumetrico da 20 ml (Vml) usando essenza di petrolio (4.2); portare alla tacca e miscelare accuratamente. Trasferirne una parte in una cella da 1 cm e misurare l'assorbanza a 440 nm, in rapporto ad un bianco di essenza di petrolio. Ottenere la concentrazione di estere apocarotenico nella soluzione, per riferimento al diagramma di taratura (C μg/ml). 5.3. Diagramma di tatatura Pipettare 0, 0,25, 0,5 0,75 e 1,0 ml di soluzione standard di estere apocarotenico (4.1.2) in cinque palloni volumetrici da 100 ml. Diluire a volume con essenza petrolio (4.2) ed agitare. Le concentrazioni approssimative delle soluzioni vanno da 0 a 2 μg/ml e sono calcolate accuratamente per riferimento alla concentrazione della soluzione standard (4.1.2) (W.P)/10 mg/ml. Misurare le assorbanze a 440 nm in rapporto ad un bianco di essenza di petrolio (4.2). Riportare su un diagramma i valori dell'assorbanza (asse delle y) in funzione della concentrazione di estere apocarotenico (asse delle x). 6. Calcolo dei risultati 6.1. Il tenore di estere apocarotenico, espresso in mg/kg di prodotto, è dato da Burro concentrato (C.V.)/M Burro: 0,82 (C.V)M dove: C= tenore di estere apocarotenico (μg/ml) letto sul diagramma di taratura (5.3). V= volume (ml) della soluzione da analizzare (5.2) M= massa (g) della porzione di prova (5.2). 0,82= fattore di correzione per il tenore di materia grassa del latte del burro. 7. Precisione del metodo 7.1. Ripetibilità 7.1.1. Analisi del burro La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nell'intervallo di tempo minimo possibile dallo stesso opertore con la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare 1,4 mg/kg. 7.1.2. Analisi del burro concentrato La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate nell'intervallo di tempo minimo possibile dallo stesso operatore con la stessa apparecchiatura su un materiale di prova identico non deve superare 1,6 mg/kg. 7.2. Riproducibilità 7.2.1. Analisi del burro La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da opeatori in laboratori differenti con apparecchiature differenti con apparecchiature differenti su un identico materiale di prova non deve superare 4,7 mg/kg. 7.2.2. Analisi del burro concentrato La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in laboratori differenti con apparecchiature differenti su un identico materiale di prova non deve superare 5,3 mg/kg. 7.3. Fonte dei dati di precisione I dati di precisione sono stati determinati mediante un esperimento eseguito nel 1995, cui hanno partecipato 11 laboratori, su 12 campioni marcati (6 prove in doppio cieco) per il burro e altrettanti 12 campioni marcati (6 prove in doppio cieco) per il burro concentrato. 8. Limiti di tolleranza 8.1. Per verificare che l'aggiunta di rivelatori ha avuto luogo correttamente, dal prodotto marcato devono essere prelevati tre campioni. 8.2. Burro 8.2.1. Il tasso di incorporazione per il burro, tenendo conto dell'assorbanza di fondo, è 22 mg/kg. 8.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]: - 18,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione), - 13,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione). La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 18,0 mg/kg e 13,0 mg/kg. 8.3. Burro concentrato 8.3.1. Il tasso di incorporazione per il burro concentrato, tenendo conto dell'assorbanza di fondo, è 24 mg/kg. 8.3.2. i risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del rivelatore: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95 % (DCr95)]: - 20,0 mg/kg (il 95 % del tasso minimo di incorporazione), - 14,0 mg/kg (il 70 % del tasso minimo di incorporazione). La concentrazione di rivelatore nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 20,0 mg/kg e 14,0 mg/kg. ALLEGATO XIV (Articolo 9) DETERMINAZIONE DEL SITOSTEROLO OPPURE DELLO STIGMASTEROLO NEL BURRO CONCENTRATO O NEL BURRO MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA CON COLONNA CAPILLARE 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa del sitosterolo o dello stigmasterolo nel burro concentrato e nel burro. Il sitosterolo viene considerato come la somma del β-sitosterolo e del 22-diidro-β-sitosterolo, in quanto gli altri sitosteroli vengono considerati irrilevanti. 2. Principio Il burro concentrato o il burro viene saponificato con idrossido di potassio in soluzione etanolica e l'insaponificabile viene estratto con etere etilico. Gli steroli vengono trasformati in eteri trimetil-sililici ed analizzati mediante gascromatografia su colonna capillare facendo riferimento ad uno standard interno a base di betulino. 3. Apparecchiatura 3.1. Pallone di saponificazione da 150 ml provvisto di condensatore a ricadere con giunti in vetro smerigliato. 3.2. Imbuti separatori da 500 ml. 3.3. Palloni da 250 ml. 3.4. Imbuti livellatori di pressione, da 250 ml o simili, per la raccolta dell'etere etilico di scarto. 3.5. Colonna di vetro, da 350 mm x 20 mm, provvista di setto in vetro sinterizzato. 3.6. Bagnomaria o cuffia riscaldante. 3.7. Fiale da 2 ml. 3.8. Gascromatografo idoneo ad essere usato con una colonna capillare e provvisto di un sistema di splitting costituito da: 3.8.1. camera termostatica per colonne, capace di mantenere la temperatura desiderata con una precisione di +- 1 °C; 3.8.2. una unità di vaporizzazione termoregolabile; 3.8.3. un rivelatore a ionizzazione di fiamma ed un convertitore-amplificatore; 3.8.4. un integratore-registratore idoneo ad essere usato con il convertitore-amplificatore (3.8.3). 3.9. Una colonna capillare in silice fusa coperta interamente di BP1 o equivalente con uno spessore uniforme di 0,25 μm; la colonna deve essere in grado di separare i derivati trimetilsililici di lanosterolo e sitosterolo ed è consigliabile un BP1 avente una lunghezza di 12 m ed un diametro interno di 0,2 mm. 3.10. Microsiringa per gascromatografia, da 1 μl, provvista di ago in acciaio temperato. 4. Reagenti Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua che viene usata deve essere acqua distillata o acqua di purezza perlomeno equivalente. 4.1. Etanolo, avente una purezza di almeno il 95 %. 4.2. Idrossido di potassio, soluzione al 60 %: sciogliere 600 g di idrossido di potassio (minimo 85 %) in acqua e portare al volume di 1 l con acqua. 4.3. Betulino avente una purezza di almeno il 99 %. 4.3.1. Soluzioni di standard interno di betulino in etere etilico (4.4). 4.3.1.1. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determinazione del sitosterolo deve essere pari a 1,0 mg/ml. 4.3.1.2. La concentrazione della soluzione di betulino usata per la determinazione dello stigmasterolo deve essere pari a 0,4 mg/ml. 4.4. Etere etilico, di purezza analitica (esente da perossidi o da residui). 4.5. Solfato di sodio anidro, granulare, preventivamente essiccato a 102 o C per 2 ore. 4.6. Reagente sililante, ad esempio TRI-SIL (disponibile presso la Pierce Chemical Co., Cat No. 49001) o equivalente (Attenzione: il TRI-SIL è infiammabile, tossico, corrosivo e forse cancerogeno. Il personale di laboratorio deve conoscere i dati di sicurezza relativi al prodotto e prendere le relative precauzioni.) 4.7. Lanosterolo. 4.8. Sitosterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P). Nota 1: La purezza dei materiali standard usati per la calibratura deve essere determinata con il metodo di normalizzazione. Si suppone che tutti gli steroli presenti nel campione siano rappresentati sul cromatogramma, che l'area totale dei picchi rappresenti il 100 % dei costituenti sterolici e che gli steroli diano la stessa risposta al rivelatore. La linearità del sistema deve essere convalidata alle gamme di concentrazione che interessano. 4.8.1. Soluzione standard di sitosterolo: preparare una soluzione contenente, con l'approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,5 mg/ml (W1) di sitosterolo (4.8) in etere etilico (4.4). 4.9. Stigmasterolo, di purezza nota non inferiore al 90 % (P). 4.9.1. Soluzione standard di stigmasterolo: preparare una soluzione contenente, con l'approssimazione di 0,001 mg/ml, circa 0,2 mg/ml (W1) di stigmasterolo (4.9) in etere etilico (4.4). 4.10. Miscela per la prova di risoluzione: preparare una soluzione contenente 0,05 mg/ml di lanosterolo (4.7) e 0,05 mg/ml di sitosterolo (4.8) in etere etilico (4.4). 5. Procedimento 5.1. Preparazione di soluzioni standard per cromatografia: la soluzione di standard interno (4.3.1) dev'essere aggiunta alla appropriata soluzione standard di sterolo, nello stesso momento in cui viene aggiunta al campione saponificato (cfr. 5.2.2). 5.1.1. Soluzione cromatografica standard di sitosterolo: trasferire 1 ml di soluzione standard di sitosterolo (4.8.1) in ciascuna delle due fiale (3.7) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.1) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto. 5.1.2. Soluzione cromatografica standard di stigmasterolo: trasferire 1 ml di soluzione standard di stigmasterolo (4.9.1) in ciascuna delle due fiale (3.7) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto. Aggiungere 1 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.2) ed eliminare l'etere etilico in corrente di azoto. 5.2. Preparazione degli insaponificabili 5.2.1. Fondere il campione di burro ad una temperatura non superiore a 35 °C, agitare vigorosamente. Pesare con l'approssimazione di 1 mg, circa 1 g di burro (W2) o di burro concentrato (W2) in un pallone da 150 ml (3.1). Aggiungere 50 ml di etanolo (4.1) e 10 ml di soluzione di idrossido di potassio (4.2). Applicare il condensatore a ricadere e scaldare a circa 75 °C per 30 minuti. Staccare il condensatore e raffreddare il pallone a una temperatura prossima a quella ambiente. 5.2.2. Aggiungere 1,0 ml di soluzione di standard interno (4.3.1.1) al pallone se si deve determinare il sitosterolo, oppure di soluzione (4.3.1.2) se si deve determinare lo stigmasterolo. Agitare accuratamente. Trasferire quantitativamente il contenuto dei palloni in un imbuto separatore da 500 ml (3.2), sciacquando il pallone alternativamente con 50 ml d'acqua e 250 ml di etere etilico (4.4). Agitare vigorosamente l'imbuto separatore per due minuti e lasciar separare le fasi. Eliminare lo stato acquoso inferiore e lavare lo strato etereo agitando con 4 successive aliquote d'acqua da 100 ml ciascuna. Nota 2: Per evitare che si formi un'emulsione, è essenziale che i primi due risciacqui con acqua vengano effettuati delicatamente (10 inversioni). Il terzo risciacquo dev'essere effettuato agitando vigorosamente per 30 secondi. Se si forma un'emulsione, essa può essere dissolta aggiungendo 5-10 ml di etanolo. Se si aggiunge l'etanolo, è essenziale effettuare due ulteriori lavaggi vigorosi con acqua. 5.2.3. Far passare lo strato etereo limpido, esente da sapone, attraverso una colonna di vetro (3.5) contenente 30 g di solfato di sodio anidro (4.5). Raccogliere l'etere in un pallone di 250 ml (3.3). Aggiungere granuli regolatori d'ebollizione ed evaporare quasi completamente su bagnomaria o cuffia riscaldante avendo cura di raccogliere i solventi di scarto. Nota 3: Se gli estratti di campione sono portati a completo essiccamento a una temperatura troppo elevata, si possono verificare perdite di sterolo. 5.3. Preparazione di eteri trimetilsililici 5.3.1. Trasferire la soluzione eterea che resta nel pallone in una fiala da 2 ml (3.7) con 2 ml di etere etilico ed eliminare l'etere in corrente di azoto. Sciacquare il pallone con altri 2 ml di etere etilico, trasferendo nella fiala ed eliminando ogni volta l'etere in corrente di azoto. 5.3.2. Sililare il campione aggiungendo 1 ml di TRI-SIL (4.6). Chiudere la fiala ed agitare vigorosamente in modo da sciogliere. Se lo scioglimento è incompleto, scaldare a 65-70 °C. Far riposare per almeno 5 minuti prima di iniettare nel gascromatografo. Sililare gli standard nello stesso modo dei campioni. Sililare la miscela per la prova di risoluzione (4.10) nello stesso modo dei campioni. Nota 4: La sililazione deve essere effettuata in ambiente anidro. La sililazione incompleta del betulino è indicata da un secondo picco vicino a quello del betulino. La presenza di etanolo nella fase di sililazione interferisce con la sililazione stessa. Ciò può derivare da un risciacquo insufficiente nella fase di estrazione. Se questo problema persiste, nella fase di estrazione si può risciacquare per la quinta volta, agitando vigorosamente per 30 secondi. 5.4. Analisi gascromatografica 5.4.1. Scelta delle condizioni operative. Regolare il gascromatografo conformemente alle istruzioni del fabbricante. Le condizioni operative sono le seguenti: - temperatura della colonna: 265 °C - temperatura dell'iniettore: 280 °C - temperatura del rivelatore: 300 °C - flusso del gas vettore: 0,6 ml/min. - pressione dell'idrogeno: 84 kPa - pressione dell'aria: 155 kPa - rapporto di splittagio da 10: 1 fino a 50: 1; il rapporto di splittagio deve essere ottimizzato conformemente alle istruzioni del fabbricante e la linearità della risposta del rivelatore deve essere convalidata sulla gamma di concentrazione che interessa. Nota 5: È importante soprattutto che l'iniettore venga regolarmente pulito. - Quantitativo di sostanza iniettata, 1 μl di soluzione di TMSE. Prima di dare inizio a qualsiasi analisi, far sì che il sistema si riequilibri e che si ottenga una risposta sufficientemente stabile. Queste condizioni possono essere modificate alla luce delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere cromatogrammi che rispettino i seguenti requisiti: - il picco del sitosterolo deve essere opportunamente separato da quello del lanosterolo. La figura 1 mostra un tipico cromatogramma che dovrebbe essere ottenuto da una miscela sililata per la prova di risoluzione (4.10), - i tempi di ritenzione relativi degli steroli sottoindicati devono essere all'incirca i seguenti: colesterolo: 1,0 stigmasterolo: 1,3 sitosterolo: 1,5 betulino: 2,5, - il tempo di ritenzione relativo al betulino deve essere di circa 24 minuti. 5.4.2. Procedimento analitico. Iniettare 1 μl di soluzione standard sililata (stigmasterolo o sitosterolo) e regolare i parametri della taratura integrati). Iniettare un altro μl di soluzione standard sililata per determinare i fattori di risposta relativi al betulino. Iniettare 1 μl di soluzione di campione sililata e misurare le aree dei picchi. Ogni cromatografia effettuata deve essere preceduta da una iniezione di standard. A titolo indicativo, ogni cromatologia deve comprendere sei iniezioni di campione. Nota 6: L'integrazione del picco dello stigmasterolo deve comprendere le eventuali "code", come definito ai punti 1, 2 e 3 della figura 2 b). L'integrazione del picco del sitosterolo deve comprendere l'area del picco del 22-diidro-β-sitosterolo (stigmastanolo) che eluisce immediatamente dopo il sitosterolo (vedi figura 3 b) al momento della valutazione del sitosterolo totale. 6. Calcolo dei risultati 6.1. Determinare l'area dei picchi degli steroli e del betulino in entrambi gli standard che precedono l'area media del picco dello sterolo nello standard seguono un campione e calcolare R1: >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> Deter