Direttiva 98/73/CE della Commissione del 18 settembre 1998 recante ventiquattresimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose (Testo rilevante ai fini del SEE)



Gazzetta ufficiale n. L 305 del 16/11/1998 pag. 0001 - 0181



DIRETTIVA 98/73/CE DELLA COMMISSIONE del 18 settembre 1998 recante ventiquattresimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose (Testo rilevante ai fini del SEE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, vista la direttiva 67/548/CEE del Consiglio, del 27 giugno 1967, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative, relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose (1), modificata da ultimo dalla direttiva 97/69/CE della Commissione (2), in particolare l'articolo 28, considerando che l'allegato I della direttiva 67/548/CEE contiene un elenco di sostanze pericolose e dettagli relativi alle procedure di classificazione ed etichettatura per ogni sostanza; che l'elenco delle sostanze pericolose figurante nel predetto allegato deve essere adattato e completato alla luce delle attuali conoscenze scientifiche e tecniche, considerando che l'allegato V della direttiva 67/548/CEE definisce i metodi di determinazione delle proprietà fisico-chimiche, della tossicità ed ecotossicità di sostanze e preparati; che è necessario adeguare al progresso tecnico tale allegato; considerando che le disposizioni della presente direttiva sono conformi al parere del comitato per l'adeguamento delle direttive al progresso tecnico al fine di eliminare le barriere tecniche al commercio di sostanze e preparati pericolosi, HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA: Articolo 1 La direttiva 67/548/CEE è così modificata: 1) L'allegato I è così modificato: a) Le voci di cui all'allegato I della presente direttiva sostituiscono quelle dell'allegato I della direttiva 67/548/CEE. b) Le voci di cui all'allegato II della presente direttiva sono aggiunte per la prima volta all'allegato I della direttiva 67/548/CEE. 2) L'allegato V è così modificato: a) Il testo degli allegati III A, III B e III C della presente direttiva è inserito al termine della parte A dell'allegato V della direttiva 67/548/CEE. b) Il testo dell'allegato III D della presente direttiva è inserito al termine della parte C dell'allegato V della direttiva 67/548/CEE. Articolo 2 Gli Stati membri mettono in vigore entro il 31 ottobre 1999, le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva. Essi ne informano immediatamente la Commissione. Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate da un siffatto riferimento all'atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità del riferimento sono decise dagli Stati membri. Articolo 3 La presente direttiva entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Articolo 4 Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva. Fatto a Bruxelles, il 18 settembre 1998. Per la Commissione Ritt BJERREGAARD Membro della Commissione (1) GU 196 del 16. 8. 1967, pag. 1. (2) GU L 343 del 13. 12. 1997, pag. 19. ANEXO I - BILAG I - ANHANG I - ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ I - ANNEX I - ANNEXE I - ALLEGATO I - BIJLAGE I - ANEXO I - LIITE I - BILAGA I >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> ANEXO II - BILAG II - ANHANG II - ÐÁÑÁÑÔÇÌÁ II - ANNEX II - ANNEXE II - ALLEGATO II - BIJLAGE II - ANEXO II - LIITE II - BILAGA II >RIFERIMENTO A UN GRAFICO> ALLEGATO III A A.18. PESO MOLECOLARE MEDIO NUMERICO E DISTRIBUZIONE DEL PESO MOLECOLARE DI POLIMERI 1. METODO Il presente metodo cromatografico a permeazione di gel corrisponde al metodo OCSE TG 118 (1996). I principi fondamentali e ulteriori informazioni tecniche sono riportati nel riferimento bibliografico (1). 1.1. Introduzione Data la varietà delle proprietà dei polimeri, è impossibile descrivere un singolo metodo che definisca con precisione condizioni di separazione e di valutazione tali da coprire tutte le particolarità e specificità che si incontrano nella separazione di polimeri. In particolare, sistemi di polimeri complessi spesso non sono adatti alla cromatografia a permeazione di gel (GPC). Quando non si può ricorrere alla GPC, il peso molecolare può venire determinato mediante altri metodi (vedi allegato). In tali casi, fornire ampi dettagli e la motivazione del metodo usato. Il metodo descritto è basato sulla norma DIN 55672 (1), nella quale si trovano informazioni dettagliate su come eseguire gli esperimenti e valutare i dati. Nel caso siano necessarie modifiche delle condizioni sperimentali, queste modifiche devono essere motivate. Si possono usare altre norme purché fornite con riferimenti completi. Il metodo descritto ricorre a campioni di polistirene di polidispersità nota per la taratura e può richiedere modifiche per adeguarlo a certi polimeri, per esempio polimeri solubili in acqua e ramificati a catena lunga. 1.2. Definizione e unità Il peso molecolare medio numerico Mn e il peso molecolare medio ponderale Mw vengono determinati con le seguenti equazioni. Mn = >NUM>Ói = lnHi >DEN>Ói = ln >NUM>Hi/ >DEN>Mi Mw = >NUM>Ói = lnHixMi >DEN>Ói = lnHi in cui Hi è il livello del segnale del rivelatore relativo alla linea di base per il volume di ritenzione Vi, Mi è il peso molecolare della frazione di polimero in corrispondenza del volume di ritenzione Vi, e n è il numero di punti. L'ampiezza della distribuzione del peso molecolare, che è una misura della dispersità del sistema, è data dal rapporto Mw/Mn. 1.3. Sostanze di riferimento Poiché la GPC è un metodo relativo, è necessaria una taratura. A questo scopo vengono di norma utilizzati standard di polistirene a struttura lineare con pesi molecolari medi Mn e Mw noti e distribuzione nota del peso molecolare. La curva di taratura può venire usata nella determinazione del peso molecolare del campione sconosciuto solo se le condizioni scelte per la separazione del campione e degli standard sono identiche. Una determinata relazione tra il peso molecolare e il volume di eluizione è valida solo nelle specifiche condizioni del particolare esperimento. Queste condizioni includono soprattutto la temperatura, il solvente (o miscele di solventi), le condizioni cromatografiche e la colonna e il sistema di colonne di separazione. I pesi molecolari del campione determinati in questo modo sono valori relativi e sono descritti come «pesi molecolari equivalenti in polistirene». Questo significa che, secondo le differenze strutturali e chimiche tra il campione e gli standard, i pesi molecolari possono deviare dai valori assoluti in misura più o meno grande. Se si usano altri standard, per esempio polietilenglicole, polietilenossido, polimetil-metacrilato, acido poliacrilico, indicarne la ragione. 1.4. Principio del metodo di analisi Utilizzando la GPC, si possono determinare sia la distribuzione del peso molecolare del campione che i pesi molecolari medi (Mn, Mw). La GPC è un particolare tipo di cromatografia liquida in cui il campione viene separato in base ai volumi idrodinamici dei singoli costituenti (2). La separazione viene effettuata mentre il campione passa attraverso una colonna riempita di un materiale poroso, tipicamente un gel organico. Le molecole piccole possono penetrare nei pori, mentre le molecole grandi ne sono escluse. Il percorso delle molecole grandi è pertanto più breve e queste vengono eluite per prime. Le molecole di medie dimensioni penetrano in alcuni dei pori e vengono eluite più tardi. Le molecole più piccole, con un raggio idrodinamico più piccolo dei pori del gel, possono penetrare in tutti i pori. Queste vengono eluite per ultime. In una situazione ideale, la separazione è determinata unicamente dalla dimensione delle specie molecolari, ma in pratica è difficile evitare l'interferenza di almeno qualche effetto di assorbimento. Un riempimento disuniforme della colonna e volumi morti possono peggiorare la situazione (2). La rivelazione viene effettuata per esempio mediante l'indice di diffrazione o l'assorbimento nell'UV e fornisce una curva di distribuzione semplice. Tuttavia, per attribuire valori effettivi di peso molecolare alla curva, è necessario tarare la colonna facendo passare attraverso di essa polimeri di peso molecolare noto, possibilmente anche di struttura approssimativamente simile, per esempio vari standard di polistirene. Tipicamente si ottiene una curva gaussiana, talvolta distorta con una piccola coda verso il lato dei pesi molecolari bassi, in cui l'asse verticale indica la quantità in peso delle specie di vario peso molecolare eluite e l'asse orizzontale indica il logaritmo del peso molecolare. 1.5. Criteri di qualità La ripetibilità (deviazione standard relativa - Relative Standard Deviation: RSD) del volume di eluizione dovrebbe essere migliore dello 0,3 %. Se un cromatogramma viene valutato in funzione del tempo e non corrisponde al criterio succitato, la ripetibilità di analisi richiesta deve essere garantita mediante correzione attraverso uno standard interno (1). Le polidispersità dipendono dal peso molecolare degli standard. Nel caso degli standard di polistirene valori tipici sono: >SPAZIO PER TABELLA> 1.6. Descrizione del metodo di analisi 1.6.1. Preparazione delle soluzioni di polistirene standard Gli standard di polistirene vengono sciolti mediante accurata miscelazione nell'eluente scelto. Nella preparazione delle soluzioni tener conto delle raccomandazioni del produttore. La scelta delle concentrazioni degli standard dipende da vari fattori, per esempio il volume di iniezione, la viscosità della soluzione e la sensibilità del rivelatore analitico. Il volume massimo di iniezione deve essere adeguato alla lunghezza della colonna allo scopo di evitare un sovraccarico. Volumi di iniezione tipici per separazioni analitiche con la GPC su una colonna da 30 cm × 7,8 mm sono normalmente compresi tra 40 e 100 ìl. Sono possibili volumi più elevati, ma non devono superare i 250 ìl. Il rapporto ottimale tra il volume di iniezione e la concentrazione va determinato prima dell'effettiva taratura della colonna. 1.6.2. Preparazione della soluzione campione In linea di principio, per la preparazione delle soluzioni campione valgono gli stessi requisiti. Il campione viene sciolto in un solvente adatto, per esempio, tetraidrofurano (THF), mediante un accurato sbattimento. In nessun caso deve essere sciolto utilizzando un bagno ad ultrasuoni. Se necessario, la soluzione campione viene purificata su un filtro a membrana con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 2 ìm. Nella relazione finale deve essere registrata l'eventuale presenza di particelle indisciolte perché queste possono essere dovute a specie di peso molecolare elevato. Usare un metodo appropriato per determinare la percentuale in peso delle particelle indisciolte. Utilizzare le soluzioni entro 24 ore. 1.6.3. Apparecchiature - serbatoio del solvente - degasatore (se del caso) - pompa - ammortizzatore di pulsazioni (se del caso) - sistema di iniezione - colonne per cromatografia - rivelatore - flussimetro (se del caso) - registratore-elaboratore dati - recipiente di scarico. Assicurarsi che il sistema GPC sia inerte rispetto ai solventi utilizzati (p. es. mediante l'uso di capillari d'acciaio se come solvente si usa il THF). 1.6.4. Sistema di iniezione e di erogazione del solvente Caricare nella colonna un volume definito della soluzione campione utilizzando un autocampionatore oppure manualmente in una zona nettamente definita. Nel caso di una operazione manuale, se lo stantuffo della siringa viene tirato o spinto troppo rapidamente la distribuzione dei pesi molecolari osservata può variare. Nei limiti del possibile il sistema di erogazione del solvente deve essere esente da pulsazioni e l'ideale sarebbe che vi fosse incorporato un attenuatore delle pulsazioni. La portata è dell'ordine di 1 ml/min. 1.6.5. Colonna Secondo il campione, il polimero viene caratterizzato utilizzando una colonna semplice o più colonne collegate in serie. In commercio sono disponibili vari materiali porosi per colonne con proprietà (p. es. dimensione dei pori, limiti di esclusione) definite. La scelta del gel di separazione o della lunghezza della colonna dipende sia dalle proprietà del campione (volumi idrodinamici, distribuzione dei pesi molecolari) che dalle specifiche condizioni di separazione come il solvente, la temperatura e la portata (1) (2) (3). 1.6.6. Piatti teorici La colonna o la combinazione di colonne utilizzata per la separazione deve essere caratterizzata mediante il numero di piatti teorici. Questo, nel caso venga utilizzato il THF come solvente di eluizione, implica di caricare una soluzione di etilbenzene o altro adatto soluto apolare su una colonna di lunghezza nota. Il numero di piatti teorici è dato dall'equazione seguente: N = 5,54 ( >NUM>Ve >DEN>W½ )2 o N = 16 ( >NUM>Ve >DEN>W )2 in cui N è il numero di piatti teorici Ve è il volume di eluizione al massimo del picco W è la larghezza del picco alla linea di base W½ è la larghezza del picco a mezza altezza. 1.6.7. Efficienza di separazione Oltre al numero di piatti teorici, che è una quantità che determina l'ampiezza della banda, è importante anche l'efficienza di separazione, che è determinata dalla rapidità della curva di taratura. L'efficienza di separazione di una colonna si ottiene dalla seguente relazione: >NUM>Ve,Mx - Ve, (10M x) >DEN>cross sectional area of the column ≥ 6,0 [ >NUM>cm3 >DEN>cm2 ] in cui Ve,Mx è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare Mx Ve,(10Mx) è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare dieci volte maggiore. La risoluzione del sistema è definita in generale come segue: R1,2 = 2 × >NUM>Ve1 - Ve2 >DEN>W1 + W2 × >NUM>1 >DEN>log10(M2/M1) in cui, Ve1, Ve2 sono i volumi di eluizione dei due standard di polistirene al massimo del picco W1, W2 sono le larghezze del picco alla linea di base M1, M2 sono i pesi molecolari al massimo del picco (dovrebbero differire di un fattore 10) Il valore di R del sistema di colonne deve essere maggiore di 1,7 (4). 1.6.8. Solventi Tutti i solventi devono essere di purezza elevata (per il THF si utilizza una purezza del 99,5 %). Il serbatoio del solvente (se necessario sotto atmosfera di gas inerte) deve essere sufficientemente grande per la taratura della colonna e per l'analisi di parecchi campioni. Degasare il solvente prima di trasportarlo alla colonna mediante la pompa. 1.6.9. Controllo della temperatura La temperatura dei componenti interni critici (ansa di iniezione, colonne, rivelatore e tubature) deve essere costante e coerente con il solvente scelto. 1.6.10. Rivelatore La funzione del rivelatore è di registrare quantitativamente la concentrazione del campione eluito dalla colonna. Per evitare un inutile allargamento dei picchi, il volume della cuvetta della cella del rivelatore deve essere il più piccolo possibile. Salvo per rivelatori a diffrazione della luce e rivelatori di viscosità, questo volume non deve superare i 10 ìl. Il metodo di solito utilizzato per la rivelazione è la rifrattometria differenziale. Tuttavia, se richiesto dalle proprietà specifiche del campione o del solvente di eluizione, si possono utilizzare altri tipi di rivelatori, per esempio UV/VIS, IR, rivelatori viscosimetrici ecc. 2. DATI E RELAZIONE 2.1. Dati Fare riferimento alla norma DIN (1) per i criteri di valutazione dettagliati e per i requisiti di raccolta ed elaborazione dei dati. Per ciascun campione eseguire due esperimenti indipendenti, che dovranno venire analizzati singolarmente. Per ogni misura si devono ottenere i valori di Mn, Mw, Mw/Mn e Mp. È necessario indicare esplicitamente che i valori misurati sono valori relativi equivalenti al peso molecolare dello standard usato. Dopo la determinazione dei volumi di ritenzione o dei tempi di ritenzione (possibilmente corretti usando uno standard interno), i valori di log Mp (Mp sono i massimi dei picchi dello standard di taratura) vengono riportati contro una delle suddette quantità. Per ogni decade di peso molecolare sono necessari almeno due punti di taratura e per la curva totale sono richiesti almeno cinque punti di misura, che devono coprire il peso molecolare stimato del campione. L'estremità della curva di taratura corrispondente al basso peso molecolare è definita da n-esilbenzene o altro soluto apolare adatto. I pesi molecolari medi numerico e ponderale vengono in generale determinati mediante sistemi elettronici di elaborazione dati sulla base delle formule riportate nella sezione 1.2. Se si utilizza una digitalizzazione manuale, si può consultare il metodo ASTM D 3536-91 (3). La curva di distribuzione deve essere fornita come tabella o come figura (frequenza differenziale o sommatoria delle percentuali contro log M). Nella rappresentazione grafica, una decade di peso molecolare deve avere normalmente una larghezza di circa 4 cm e il massimo del picco deve avere un'altezza di circa 8 cm. Nel caso di curve di distribuzione integrali la differenza in ordinata tra lo 0 e il 100 % deve essere di circa 10 cm. 2.2. Relazione d'analisi La relazione d'analisi deve includere le seguenti informazioni: 2.2.1. Sostanza in esame: - informazioni disponibili sulla sostanza in esame (identità, additivi, impurezze); - descrizione del trattamento del campione, osservazioni, problemi. 2.2.2. Strumentazione: - serbatoio dell'eluente, gas inerte, degasaggio dell'eluente, composizione dell'eluente, impurezze; - pompa, attenuatore di pulsazioni, sistema di iniezione; - colonne di separazione (fabbricante, tutte le informazioni sulle caratteristiche delle colonne, come dimensione dei pori, tipo di materiale di separazione ecc., numero, lunghezza e ordine delle colonne usate); - numero di piatti teorici della colonna (o combinazione di colonne), efficienza di separazione (risoluzione del sistema); - informazioni sulla simmetria dei picchi; - temperatura della colonna, tipo di controllo della temperatura; - rivelatore (principio di misurazione, tipo, volume della cuvetta); - flussimetro se usato (produttore, principio di misurazione); - sistema di registrazione ed elaborazione dati (hardware e software). 2.2.3. Taratura del sistema: - descrizione dettagliata del metodo usato per costruire la curva di taratura; - informazioni sui criteri di qualità per questo metodo (p. es. coefficiente di correlazione, varianza ecc.); - informazioni su tutte le estrapolazioni, ipotesi e approssimazioni fatte durante la procedura sperimentale e durante la valutazione e l'elaborazione dei dati; - tutte le misure usate per costruire la curva di taratura devono essere documentate in una tabella includente le seguenti informazioni per ciascun punto di taratura: - nome del campione - produttore del campione - valori caratteristici degli standard Mp, Mn, Mw, Mw/Mn, forniti dal produttore o ricavati da misure successive, insieme con dettagli relativi al metodo di determinazione - volume di iniezione e concentrazione di iniezione - valore di Mp usato per la taratura - volume di eluizione o tempo di ritenzione corretto misurato in corrispondenza del massimo dei picchi - Mp calcolato al massimo del picco - errore percentuale dell' Mp calcolato e del valore di taratura. 2.2.4. Valutazione: - valutazione su base temporale: metodi usati per garantire la riproducibilità richiesta (metodo di correzione, standard interno ecc.); - indicazione se la valutazione sia stata effettuata sulla base del volume di eluizione o del tempo di ritenzione; - informazioni riguardo ai limiti della valutazione se un picco non viene analizzato completamente; - descrizione dei metodi di lisciatura, se usati; - procedure di preparazione e pretrattamento del campione; - presenza di eventuali particelle indisciolte; - volume di iniezione (ìl) e concentrazione di iniezione (mg/ml); - osservazioni indicanti effetti che portano a deviazioni dal profilo GPC ideale; - descrizione dettagliata di tutte le modifiche applicate alle procedure di analisi; - dettagli sugli intervalli di errore; - qualsiasi altra informazione e osservazione utile all'interpretazione dei risultati. 3. BIBLIOGRAFIA (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.,D,. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Allegato Esempi di altri metodi per la determinazione del peso molecolare medio numerico (MN) di polimeri La cromatografia a permeazione di gel (GPC) è il metodo preferito per la determinazione di Mn, in particolare quando sia disponibile una serie di standard la cui struttura è confrontabile con quella del polimero. Tuttavia, nel caso vi siano difficoltà pratiche per usare la GPC o si preveda già che la sostanza non rispetti un criterio normativo di Mn (che richiede conferma), sono disponibili metodi alternativi come: 1. Uso di proprietà colligative 1.1. Ebullioscopia/crioscopia: prevede la misura dell'innalzamento del punto di ebollizione (ebullioscopia) o dell'abbassamento del punto di congelamento (crioscopia) di un solvente quando si aggiunge un polimero. Il metodo è basato sul fatto che l'effetto del polimero disciolto sul punto di ebollizione/congelamento del liquido dipende dal peso molecolare del polimero (1) (2). Applicabilità: Mn ALLEGATO III B A.19. CONTENUTO DI FRAZIONI A BASSO PESO MOLECOLARE IN POLIMERI 1. METODO Questo metodo cromatografico a permeazione di gel corrisponde al metodo OCSE TG 119 (1996). I principi fondamentali e ulteriori informazioni tecniche sono presentati nei riferimenti bibliografici. 1.1. Introduzione Data la varietà delle proprietà dei polimeri, è impossibile descrivere un singolo metodo che definisca con precisione condizioni di separazione e di valutazione tali da coprire tutte le particolarità e specificità che si incontrano nella separazione di polimeri. In particolare, sistemi di polimeri complessi spesso non sono adatti alla cromatografia a permeazione di gel (GPC). Quando non si può ricorrere alla GPC, il peso molecolare può venire determinato mediante altri metodi (vedi allegato). In tali casi, fornire ampi dettagli e la motivazione del metodo usato. Il metodo descritto è basato sulla norma DIN 55672 (1), che contiene informazioni dettagliate su come eseguire gli esperimenti e valutare i dati. Nel caso siano necessarie modifiche delle condizioni sperimentali, queste modifiche devono essere motivate. Si possono usare altre norme purché fornite con riferimenti completi. Il metodo descritto ricorre a campioni di polistirene di polidispersità nota per la taratura e può richiedere modifiche per adeguarlo a certi polimeri, per esempio polimeri solubili in acqua e ramificati a catena lunga. 1.2. Definizioni e unità Un basso peso molecolare è definito arbitrariamente come un peso molecolare inferiore a 1 000 dalton. Il peso molecolare medio numerico Mn e il peso molecolare medio ponderale Mw vengono determinati con le seguenti equazioni. Mn = >NUM>Ói = lnHi >DEN>Ói = ln >NUM>Hi/ >DEN>Mi Mw = >NUM>Ói = lnHixMi >DEN>Ói = lnHi in cui Hi è il livello del segnale del rivelatore relativo alla linea di base per il volume di ritenzione Vi, Mi è il peso molecolare della frazione di polimero in corrispondenza del volume di ritenzione Vi, e n è il numero di punti. L'ampiezza della distribuzione del peso molecolare, che è una misura della dispersità del sistema, è data dal rapporto Mw/Mn. 1.3. Sostanze di riferimento Poiché la GPC è un metodo relativo, è necessaria una taratura. A questo scopo vengono di norma utilizzati standard di polistirene a struttura lineare con pesi molecolari medi Mn e Mw noti e distribuzione nota del peso molecolare. La curva di taratura può venire usata nella determinazione del peso molecolare del campione sconosciuto solo se le condizioni scelte per la separazione del campione e degli standard sono identiche. Una determinata relazione tra il peso molecolare e il volume di eluizione è valida solo nelle specifiche condizioni del particolare esperimento. Queste condizioni includono soprattutto la temperatura, il solvente (o miscele di solventi), le condizioni cromatografiche e la colonna e il sistema di colonne di separazione. I pesi molecolari del campione determinati in questo modo sono valori relativi e sono descritti come «pesi molecolari equivalenti in polistirene». Questo significa che, secondo le differenze strutturali e chimiche tra il campione e gli standard, i pesi molecolari possono deviare dai valori assoluti in misura più o meno grande. Se si usano altri standard, per esempio polietilenglicole, polietilenossido, polimetil-metacrilato, acido poliacrilico, indicarne la ragione. 1.4. Principio del metodo di analisi Utilizzando la GPC, si possono determinare sia la distribuzione del peso molecolare del campione che i pesi molecolari medi (Mn, Mw). La GPC è un particolare tipo di cromatografia liquida in cui il campione viene separato in base ai volumi idrodinamici dei singoli costituenti (2). La separazione viene effettuata mentre il campione passa attraverso una colonna riempita di un materiale poroso, tipicamente un gel organico. Le molecole piccole possono penetrare nei pori, mentre le molecole grandi ne sono escluse. Il percorso delle molecole grandi è pertanto più breve e queste vengono eluite per prime. Le molecole di medie dimensioni penetrano in alcuni dei pori e vengono eluite più tardi. Le molecole più piccole, con un raggio idrodinamico più piccolo dei pori del gel, possono penetrare in tutti i pori. Queste vengono eluite per ultime. In una situazione ideale, la separazione è determinata unicamente dalla dimensione delle specie molecolari, ma in pratica è difficile evitare l'interferenza di almeno qualche effetto di assorbimento. Un riempimento disuniforme della colonna e volumi morti possono peggiorare la situazione (2). La rivelazione viene effettuata per esempio mediante l'indice di diffrazione o l'assorbimento nell'UV e fornisce una curva di distribuzione semplice. Tuttavia, per attribuire valori effettivi di peso molecolare alla curva, è necessario tarare la colonna facendo passare attraverso di essa polimeri di peso molecolare noto, possibilmente anche di struttura approssimativamente simile, per esempio vari standard di polistirene. Tipicamente si ottiene una curva gaussiana, talvolta distorta con una piccola coda verso il lato dei pesi molecolari bassi, in cui l'asse verticale indica la quantità in peso delle specie di vario peso molecolare eluite e l'asse orizzontale indica il logaritmo del peso molecolare. Il contenuto di sostanze a basso peso molecolare si ricava da questa curva. Il calcolo può essere accurato solo se le specie di basso peso molecolare hanno una risposta, riferita alla massa, equivalente al polimero nel suo complesso. 1.5. Criteri di qualità La ripetibilità (deviazione standard relativa - Relative Standard Deviation: RSD) del volume di eluizione dovrebbe essere migliore dello 0,3 %. Se un cromatogramma viene valutato in funzione del tempo e non corrisponde al criterio succitato, la ripetibilità di analisi richiesta deve essere garantita mediante correzione attraverso uno standard interno (1). Le polidispersità dipendono dal peso molecolare degli standard. Nel caso degli standard di polistirene valori tipici sono: >SPAZIO PER TABELLA> 1.6. Descrizione del metodo di analisi 1.6.1. Preparazione delle soluzioni di polistirene standard Gli standard di polistirene vengono sciolti mediante accurata miscelazione nell'eluente scelto. Nella preparazione delle soluzioni tener conto delle raccomandazioni del produttore. La scelta delle concentrazioni degli standard dipende da vari fattori, per esempio il volume di iniezione, la viscosità della soluzione e la sensibilità del rivelatore analitico. Il volume massimo di iniezione deve essere adeguato alla lunghezza della colonna allo scopo di evitare un sovraccarico. Volumi di iniezione tipici per separazioni analitiche con la GPC su una colonna da 30 cm × 7,8 mm sono normalmente compresi tra 40 e 100 ìl. Sono possibili volumi più elevati, ma non devono superare i 250 ìl. Il rapporto ottimale tra il volume di iniezione e la concentrazione deve essere determinato prima dell'effettiva taratura della colonna. 1.6.2. Preparazione della soluzione campione In linea di principio, per la preparazione delle soluzioni campione valgono gli stessi requisiti. Il campione viene sciolto accuratamente in un solvente adatto, per esempio tetraidrofurano (THF), per sbattimento. In nessun caso deve essere sciolto utilizzando un bagno ad ultrasuoni. Se necessario, la soluzione campione viene purificata su un filtro a membrana con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 2 ìm. Nella relazione finale deve essere registrata l'eventuale presenza di particelle indisciolte perché queste possono essere dovute a specie di peso molecolare elevato. Usare un metodo appropriato per determinare la percentuale in peso delle particelle indisciolte. Utilizzare le soluzioni entro 24 ore. 1.6.3. Correzione dell'errore dovuto a impurezze e additivi È di solito necessaria una correzione del contenuto di specie MNUM>Ve >DEN>W½ )2 o N = 16 ( >NUM>Ve >DEN>W )2 in cui N è il numero di piatti teorici Ve è il volume di eluizione al massimo del picco W è la larghezza del picco alla linea di base W½ è la larghezza del picco a mezza altezza 1.6.8. Efficienza di separazione Oltre al numero di piatti teorici, che è una quantità che determina l'ampiezza della banda, è importante anche l'efficienza di separazione, che è determinata dalla ripidità della curva di taratura. L'efficienza di separazione di una colonna si ottiene dalla seguente relazione: >NUM>Ve,Mx - Ve,(10M x) >DEN>cross sectional area of the column ≥ 6,0 [ >NUM>cm3 >DEN>cm2 ] in cui Ve,Mx è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare Mx Ve,(10Mx) è il volume di eluizione per polistirene di peso molecolare dieci volte maggiore. La risoluzione del sistema è definita in generale come segue: R1,2 = 2 × >NUM>Ve1 - Ve2 >DEN>W1 + W2 × >NUM>1 >DEN>log10(M2/M1) in cui, Ve1, Ve2 sono i volumi di eluizione dei due standard di polistirene al massimo del picco W1, W2 sono le larghezze del picco alla linea di base M1, M2 sono i pesci molecolari al massimo del picco (dovrebbero differire di un fattore 10). Il valore di R del sistema di colonne deve essere maggiore di 1,7 (4). 1.6.9. Solventi Tutti i solventi devono essere di purezza elevata (per il THF si usa una purezza del 99,5 %). Il serbatoio del solvente (se necessario sotto atmosfera di gas inerte) deve essere sufficientemente grande per la taratura della colonna e per l'analisi di parecchi campioni. Degasare il solvente prima di trasportarlo alla colonna mediante la pompa. 1.6.10. Controllo della temperatura La temperatura dei componenti interni critici (ansa di iniezione, colonne, rivelatore e tubature) deve essere costante e coerente con il solvente scelto. 1.6.11. Rivelatore La funzione del rivelatore è di registrare quantitativamente la concentrazione del campione eluito dalla colonna. Per evitare un inutile allargamento dei picchi, il volume della cuvetta della cella del rivelatore deve essere il più piccolo possibile. Salvo per rivelatori a diffrazione della luce e rivelatori a viscosità, questo volume non deve superare i 10 ìl. Il metodo di solito utilizzato per la rivelazione è la rifrattometria differenziale. Tuttavia, se richiesto dalle proprietà specifiche del campione o del solvente di eluizione, si possono utilizzare altri tipi di rivelatori, per esempio UV/VIS, IR, rivelatori viscosimetrici ecc. 2. DATI E RELAZIONE 2.1. Dati Fare riferimento alla norma DIN (1) per i criteri di valutazione dettagliati e per i requisiti di raccolta ed elaborazione dei dati. Per ciascun campione eseguire due esperimenti indipendenti, che dovranno venire analizzati singolarmente. In ogni caso è essenziale determinare i dati anche sui bianchi trattati nelle stesse condizioni del campione. È necessario indicare esplicitamente che i valori misurati sono valori relativi equivalenti al peso molecolare dello standard usato. Dopo la determinazione dei volumi di ritenzione o dei tempi di ritenzione (possibilmente corretti usando uno standard interno), i valori di log Mp (Mp sono i massimi dei picchi dello standard di taratura) vengono riportati contro una delle suddette quantità. Per ogni decade di peso molecolare sono necessari almeno due punti di taratura e per la curva totale sono richiesti almeno cinque punti di misura, che devono coprire il peso molecolare stimato del campione. L'estremità della curva di taratura corrispondente al basso peso molecolare è definita da n-esilbenzene o altro soluto apolare adatto. Si determina la porzione della curva corrispondente a pesi molecolari inferiori a 1 000 e, se necessario, la si corregge per compensare impurezze e additivi. In genere le curve di eluzione vengono valutate con sistemi elettronici di elaborazione. Se si utilizza una digitalizzazione manuale, si può consultare il metodo ASTM D 3536-91 (3). Se eventuali polimeri insolubili vengono trattenuti sulla colonna, è probabile che il loro peso molecolare sia più elevato di quello della frazione solubile, e non considerandolo si sovrastimerebbe il contenuto di sostanze di basso peso molecolare. Nell'allegato sono fornite indicazioni per la correzione del contenuto di sostanze a basso peso molecolare per tener conto del polimero insolubile. La curva di distribuzione deve essere fornita come tabella o come figura (frequenza differenziale o sommatoria delle percentuali contro log M). Nella rappresentazione grafica, una decade di peso molecolare deve avere normalmente una larghezza di circa 4 cm e il massimo del picco deve avere un'altezza di circa 8 cm. Nel caso di curve di distribuzione integrali la differenza in ordinata tra lo 0 e il 100 % deve essere di circa 10 cm. 2.2. Relazione d'analisi La relazione d'analisi deve includere le seguenti informazioni: 2.2.1. Sostanza in esame - informazioni disponibili sulla sostanza in esame (identità, additivi, impurezze); - descrizione del trattamento del campione, osservazioni, problemi. 2.2.2. Strumentazione - serbatoio dell'eluente, gas inerte, degasaggio dell'eluente, composizione dell'eluente, impurezze; - pompa, attenuatore di pulsazioni, sistema di iniezione; - colonne di separazione (fabbricante, tutte le informazioni sulle caratteristiche delle colonne, come dimensione dei pori, tipo di materiale di separazione ecc., numero, lunghezza e ordine delle colonne usate); - numero di piatti teorici della colonna (o combinazione di colonne), efficienza di separazione (risoluzione del sistema); - informazioni sulla simmetria dei picchi; - temperatura della colonna, tipo di controllo della temperatura; - rivelatore (principio di misurazione, tipo, volume della cuvetta); - flussimetro se usato (produttore, principio di misurazione); - sistema di registrazione ed elaborazione dati (hardware e software). 2.2.3. Taratura del sistema - descrizione dettagliata del metodo usato per costruire la curva di taratura. - informazioni sui criteri di qualità per questo metodo (coefficiente di correlazione, varianza ecc.); - informazioni su tutte le estrapolazioni, ipotesi e approssimazioni fatte durante la procedura sperimentale e durante la valutazione e l'elaborazione dei dati; - tutte le misure usate per costruire la curva di taratura devono essere documentate in una tabella includente le seguenti informazioni per ciascun punto di taratura: - nome del campione - produttore del campione - valori caratteristici degli standard Mp, Mn, Mw, Mw/Mn, forniti dal produttore o ricavati da misure successive, insieme con dettagli relativi al metodo di determinazione - volume di iniezione e concentrazione di iniezione - valore di Mp usato per la taratura - volume di eluizione o tempo di ritenzione corretto misurato in corrispondenza del massimo dei picchi - Mp calcolato al massimo del picco - errore percentuale dell'Mp calcolato e del valore di taratura. 2.2.4. Informazioni sul contenuto di polimero a basso peso molecolare - descrizione dei metodi usati nell'analisi e del modo in cui sono stati condotti gli esperimenti; - informazioni sul contenuto percentuale (p/p) di specie di basso peso molecolare riferito al campione totale; - informazioni sulle impurezze, gli additivi e altre specie non polimeriche in percentuale in peso riferita al campione totale. 2.2.5. Valutazione - valutazione su base temporale: metodi usati per garantire la riproducibilità richiesta (metodo di correzione, standard interno ecc.); - indicazione se la valutazione sia stata effettuata sulla base del volume di eluizione o del tempo di ritenzione; - informazioni riguardo ai limiti della valutazione se un picco non viene analizzato completamente; - descrizione dei metodi di lisciatura, se usati; - procedure di preparazione e pretrattamento del campione; - presenza di eventuali particelle indisciolte; - volume di iniezione (ìl) e concentrazione di iniezione (mg/ml); - osservazioni indicanti effetti che portano a deviazioni dal profilo GPC ideale; - descrizione dettagliata di tutte le modifiche applicate alle procedure di analisi; - dettagli sugli intervalli di errore; - qualsiasi altra informazione e osservazione utile all'interpretazione dei risultati. 3. BIBLIOGRAFIA (1) DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Allegato Indicazioni per la correzione del contenuto di specie di basso peso molecolare in funzione della presenza di polimero insolubile Quando in un campione è presente polimero insolubile, si verifica una perdita di massa durante l'analisi GPC. Il polimero insolubile viene trattenuto in modo irreversibile sulla colonna o sul filtro del campione, mentre la porzione solubile del campione passa attraverso la colonna. Se l'incremento dell'indice di rifrazione (dn/dc) del polimero può essere stimato o misurato, si può stimare la massa di campione persa sulla colonna. In tal caso si effettua una correzione usando una taratura esterna con materiali standard di concentrazione nota e dn/dc noto per tarare la risposta del rifrattometro. Nel seguente esempio si usa uno standard di poli(metilmetacrilato) (pMMA). Nella taratura esterna per l'analisi di polimeri acrilici, si analizza uno standard di pMMA di concentrazione nota in tetraidrofurano mediante GPC e i dati risultanti vengono usati per trovare la costante del rifrattometro secondo l'equazione: K = >NUM>R/ >DEN>(C × V × >NUM>dn/ >DEN>dc ) in cui K è la costante del rifrattometro (in microvoltsecondi/ml), R è la risposta dello standard di pMMA (in microvoltsecondi), C è la concentrazione dello standard di pMMA (in mg/ml), V è il volume di iniezione (in ml) e dn/dc è l'incremento di indice di rifrazione per il pMMA in tetraidrofurano (in ml/mg). I seguenti sono dati tipici di uno standard di pMMA: R = 2937891 C = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg. Il valore di K risultante, 3,05 × 1011 viene poi utilizzato per calcolare la risposta teorica del rivelatore se il 100 % del polimero iniettato fosse stato eluito attraverso il rivelatore. ALLEGATO III C A.20. COMPORTAMENTO DI SOLUZIONE/ESTRAZIONE DEI POLIMERI IN ACQUA 1. METODO Il metodo descritto corrisponde alla versione riveduta del metodo OCSE TG 120 (1997). Ulteriori informazioni tecniche sono fornite nel riferimento bibliografico (1). 1.1. Introduzione Per certuni polimeri, come i polimeri in emulsione, può essere necessario un lavoro di preparazione iniziale prima di poter utilizzare il metodo qui presentato. Il metodo non può essere applicato a polimeri liquidi e a polimeri che reagiscono con l'acqua nelle condizioni del saggio. Quando il metodo non è pratico o è impossibile da applicare, il comportamento di soluzione/estrazione può essere studiato mediante altri metodi. In tal caso, fornire dettagli completi e la motivazione del metodo usato. 1.2. Sostanze di riferimento Nessuna. 1.3. Principi del metodo di saggio Il comportamento di soluzione/estrazione di polimeri in un ambiente acquoso viene determinato con il metodo del pallone (cfr. A.6. Solubilità in acqua, metodo del pallone) con le modifiche descritte nel seguito. 1.4. Criteri di qualità Nessuno. 1.5. Descrizione del metodo di saggio 1.5.1. Apparecchiatura Per il metodo occorre la seguente apparecchiatura: - dispositivo di triturazione, per esempio un macinino, per la produzione di particelle di dimensioni note - apparecchiature di scuotimento con possibilità di controllo della temperatura - sistema di filtrazione su membrana - apparecchiature analitiche appropriate - setacci standardizzati. 1.5.2. Preparazione del campione Un campione rappresentativo deve innanzitutto venire ridotto ad una dimensione granulometrica compresa tra 0,125 e 0,25 mm con l'utilizzo di appropriati setacci. Può essere richiesto un raffreddamento ai fini della stabilità del campione o per la macinazione. Materiali di natura gommosa possono venire tritati alla temperatura dell'azoto liquido (1). Se non è possibile ottenere la frazione di dimensione granulometrica richiesta, ridurre il più possibile le dimensioni delle particelle e indicare il risultato nella relazione. Nella relazione è necessario indicare come è stato conservato il campione tritato prima dell'analisi. 1.5.3. Procedura Tre campioni da 10 g della sostanza in analisi vengono pesati in tre recipienti dotati di tappi di vetro e in ciascun recipiente si aggiungono 1 000 ml di acqua. Se la manipolazione di una quantità di 10 g di polimero si dimostra irrealizzabile, utilizzare la massima quantità manipolabile e regolare in proporzione il volume d'acqua. I recipienti vengono tappati ermeticamente ed agitati a 20 °C. Usare un dispositivo di agitazione in grado di funzionare a temperatura costante. Dopo un periodo di 24 ore, il contenuto di ciascun recipiente viene centrifugato o filtrato e si determina la concentrazione del polimero nella fase acquosa limpida mediante un adatto metodo analitico. Se non sono disponibili metodi analitici adatti per la fase acquosa, si può stimare la solubilità/estrattività totale del peso secco del residuo trattenuto sul filtro o del precipitato centrifugato. Di solito è necessario distinguere quantitativamente le impurezze e gli additivi, da una parte, dalle specie di basso peso molecolare, dall'altra parte. Nel caso di una determinazione gravimetrica, è importante anche eseguire una prova in bianco senza sostanza in esame per tener conto di residui dovuti alla procedura sperimentale. Il comportamento di soluzione/estrazione di polimeri in acqua a 37 °C a pH 2 e pH 9 può venire determinato come descritto per l'esperimento a 20 °C. Questi pH si possono ottenere mediante l'aggiunta di adatti tamponi o di acidi o basi appropriate, come acido cloridrico, acido acetico, idrossido di sodio o di potassio per analisi o NH3. Secondo il metodo di analisi usato, si devono eseguire una o due prove. Quando sono disponibili metodi sufficientemente specifici per determinare il componente polimerico mediante l'analisi diretta della fase acquosa, dovrebbe essere sufficiente una prova eseguita come descritto sopra. Se invece tali metodi non sono disponibili e la determinazione del comportamento di soluzione/estrazione del polimero è limitata all'analisi indiretta mediante la sola determinazione del carbonio organico totale (TOC) contenuto nell'estratto acquoso, si dovrebbe eseguire una prova addizionale. Anche questa prova addizionale deve essere eseguita in triplo utilizzando campioni di polimero dieci volte più piccoli e le stesse quantità di acqua usate nella prima prova. 1.5.4. Analisi 1.5.4.1. Saggio condotto con una sola dimensione del campione Se disponibili, usare metodi per l'analisi diretta dei componenti polimerici nella fase acquosa. In alternativa, si può prendere in considerazione anche un'analisi indiretta dei componenti del polimero disciolti/estratti mediante determinazione del contenuto totale di parti solubili e correzione per tener conto dei componenti non specifici del polimero. Per determinare le specie polimeriche totali è possibile effettuare l'analisi della fase acquosa: o mediante un metodo di sufficiente sensibilità, per esempio: - TOC mediante digestione con persolfato o dicromato a dare CO2, e stima mediante IR o analisi chimica; - spettrometria di assorbimento atomico (AAS) o il suo equivalente emissione a plasma accoppiato induttivamente (ICP) per polimeri contenenti silicio o metalli; - assorbimento UV o spettrofluorimetria per i polimeri arilici; - LC-MS per campioni di basso peso molecolare; oppure mediante evaporazione a secchezza sotto vuoto dell'estratto acquoso e analisi spettroscopica (IR, UV, ecc.) o AAS/ICP del residuo. Se l'analisi della fase acquosa tal quale non è praticabile, l'estratto acquoso dovrebbe venire estratto con un solvente organico immiscibile con l'acqua, per esempio un idrocarburo clorurato. Il solvente viene poi evaporato e il residuo viene analizzato come sopra per determinare il contenuto di polimero di cui sopra. I componenti di questo residuo identificati come impurezza o additivo devono venire sottratti per determinare così il grado di soluzione/estrazione del polimero stesso. Quando tali sostanze sono presenti in quantità relativamente grandi, può essere necessario sottoporre il residuo per esempio ad un'analisi HPLC o GC per distinguere le impurezze dal monomero e dalle specie derivate dal monomero presenti, in modo che sia possibile determinare il reale contenuto di queste ultime. In alcuni casi può essere sufficiente una semplice evaporazione a secchezza del solvente seguita dalla pesata del residuo secco. 1.5.4.2. Prova condotta con due differenti dimensioni del campione Si determina il TOC su tutti gli estratti acquosi. Eseguire una determinazione gravimetrica sulla parte indisciolta/non estratta del campione. Se, dopo centrifugazione o filtrazione del contenuto di ciascun recipiente, rimangono residui di polimero attaccati alla parete del recipiente, risciacquarlo con il filtrato fino a rimuoverne tutti i residui visibili, dopo di che il filtrato viene di nuovo centrifugato o filtrato. I residui che rimangono sul filtro o nella provetta da centrifuga vengono essiccati a 40 °C sotto vuoto e pesati. Continuare l'essiccazione fino a peso costante. 2. DATI 2.1. Prova condotta con una sola dimensione del campione Indicare i singoli risultati di ciascuno dei tre palloni e valori medi, in unità di massa per volume della soluzione (tipicamente mg/l) o di massa per massa del campione di polimero (tipicamente mg/g). Indicare anche la perdita di peso del campione (calcolata come peso del soluto diviso per il peso del campione iniziale). Si dovrebbero calcolare le deviazioni standard relative (RSD). Indicare i singoli valori per la sostanza totale (polimero più additivi essenziali ecc.) e per il solo polimero (cioè dopo aver sottratto il contributo di tali additivi). 2.2. Prova condotta con due differenti dimensioni del campione Fornire i singoli valori di TOC degli estratti acquosi dei due esperimenti in triplo e il valore medio di ciascun esperimento in unità di massa per volume della soluzione (tipicamente mg C/l), nonché in unità di massa per peso del campione iniziale (tipicamente mg C/g). Se non vi sono differenze tra i risultati ai rapporti campione/acqua alto e basso, questo può indicare che effettivamente sono stati estratti tutti i componenti estraibili. In tal caso normalmente non sarà necessaria l'analisi diretta. Indicare i singoli pesi dei residui espressi in percentuale del peso iniziale dei campioni. Per ogni esperimento calcolare le medie. Le differenze tra 100 e le percentuali trovate rappresentano le percentuali di materiale solubile ed estraibile contenuto nel campione originario. 3. RELAZIONE 3.1. Relazione sul saggio La relazione sul saggio deve includere le informazioni seguenti: 3.1.1. Sostanza esaminata: - informazioni disponibili sulla sostanza esaminata (identità, additivi, impurezze, contenuto di specie di basso peso molecolare). 3.1.2. Condizioni sperimentali - descrizione delle procedure usate e delle condizioni sperimentali; - descrizione dei metodi analitici e di rivelazione. 3.1.3. Risultati: - risultati di solubilità/estraibilità in mg/l; valori singoli e valori medi delle prove di estrazione nelle varie soluzioni, scomposti in contenuto di polimero e impurezze, additivi ecc. - risultati di solubilità/estraibilità in mg/g di polimero - valori di TOC per gli estratti acquosi, peso del soluto e percentuali calcolate, se misurati - pH di ciascun campione - informazioni riguardo ai valori del bianco - se necessario, indicazioni sulla instabilità chimica della sostanza in esame sia durante il processo di saggio che durante il processo analitico - tutte le informazioni ritenute importanti per l'interpretazione dei risultati. 4. BIBLIOGRAFIA (1) DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. ALLEGATO III D C.13. BIOCONCENTRAZIONE: SAGGIO SUI PESCI, METODO A FLUSSO CONTINUO 1. METODO Questo metodo di bioconcentrazione corrisponde al metodo OCSE TG 305 (1996). 1.1. Introduzione Il presente metodo descrive una procedura per caratterizzare il potenziale di bioconcentrazione di una sostanza nei pesci in condizioni di flusso continuo. Benché i regimi di saggio a flusso continuo siano ampiamente preferibili, sono ammissibili regimi semistatici, purché soddisfatti i criteri di validità. Il metodo fornisce dettagli sufficienti per eseguire il saggio concedendo una libertà adeguata per adattare l'impianto sperimentale alle particolari condizioni di laboratorio e alla variabilità delle caratteristiche delle sostanze analizzate. La sua validità è massima per composti chimici organici stabili con log Poa compreso tra 1,5 e 6,0 (1), ma è applicabile anche a sostanze superlipofile (log Poa > 6,0). La stima preliminare del fattore di bioconcentrazione (BCF), indicato talvolta con KB, per tali sostanze superlipofile sarà presumibilmente più elevata del fattore di bioconcentrazione allo stato stazionario (BCFSS) prevedibilmente ottenuto da esperimenti di laboratorio. Stime preliminari del fattore di bioconcentrazione per composti chimici organici con valori di log Poa fino a circa 9,0 si possono ricavare dall'equazione di Bintein at al (2). I parametri che caratterizzano il potenziale di bioconcentrazione includono la costante di velocità di assorbimento (k1), la costante di velocità di depurazione (k2) e il BCFSS. L'analisi dei campioni acqua e di pesce può risultare più facile se le sostanze in esame sono radiomarcate; e queste possono venire utilizzate per determinare se sia il caso di procedere all'identificazione e alla qualificazione dei prodotti di degradazione. Se si misurano i residui radioattivi totali (per esempio per combustione o solubilizzazione dei tessuti), il BCF risulta basato sul composto progenitore, eventuali metaboliti trattenuti e anche sul carbonio assimilato. I BCF basati sui residui radioattivi totali non sono pertanto confrontabili direttamente con un BCF ottenuto mediante analisi chimica specifica del solo composto progenitore. Negli studi con radiomarcante si possono impiegare procedure di bonifica per determinare il BCF sulla base del composto progenitore, e se ritenuto necessario si possono caratterizzare i principali metaboliti. È anche possibile combinare uno studio di metabolismo nei pesci con uno studio di bioconcentrazione mediante l'analisi e l'identificazione dei residui nei tessuti. 1.2. Definizioni e unità Bioconcentrazione/Bioaccumulo è l'aumento di concentrazione della sostanza in esame in o su un organismo (suoi tessuti specificati) rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell'ambiente circostante. Il fattore di bioconcentrazione (BCF o KB) in qualsiasi momento durante la fase di assorbimento di questo saggio di accumulo è la concentrazione della sostanza in esame nel o sul pesce o suoi tessuti specificati [Cf in ìg/g (ppm)] divisa per la concentrazione del composto chimico nell'ambiente circostante [Cw in ìg/ml (ppm)]. Il fattore di bioconcentrazione allo stato stazionario (BCFSS o KB) non cambia in modo significativo su un periodo di tempo prolungato, la concentrazione della sostanza in esame nell'ambiente circostante essendo costante durante tale periodo di tempo. Un livello costante o stato stazionario nel tracciato della sostanza in esame nei pesci (Cf) contro il tempo viene raggiunto quando la curva diventa parallela all'asse del tempo e tre analisi successive di Cf su campioni prelevati ad intervalli di almeno due giorni differiscono di non oltre il ± 20 % una dall'altra, e non vi sono differenze significative tra i tre periodi di campionamento. Quando si analizzano campioni raggruppati, sono necessarie almeno quattro analisi successive. Per il controllo di sostanze che vengono assorbite lentamente saranno più opportuni intervalli di sette giorni. Fattori di bioconcentrazione calcolati direttamente dalle costanti di velocità cinetiche (k1/k2) sono definiti fattore di concentrazione cinetico, BCFk. Il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua (Poa) è il rapporto della solubilità di un composto chimico in n-ottanolo su quella in acqua all'equilibrio (metodo A.8), espresso anche come Koa. Il logaritmo di Poa viene usato come indicazione del potenziale di bioconcentrazione di un composto chimico da parte di organismi acquatici. La fase di esposizione o assorbimento è il tempo durante il quale i pesci sono esposti al composto chimico in esame. La costante di velocità di assorbimento (k1) è il valore numerico che definisce la velocità di aumento della concentrazione della sostanza in esame nel o sul pesce di prova (o suoi tessuti specificati) quando il pesce viene esposto a tale composto chimico (k1 è espresso in giorni -1). La fase post-esposizione o di depurazione (perdita) è il tempo, dopo il trasferimento del pesce di prova da un ambiente contenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza, durante il quale viene studiata la depurazione (o perdita netta) della sostanza dal pesce di prova (o suo tessuto specificato). La costante di velocità di depurazione (perdita) (k2) è il valore numerico che definisce la velocità di riduzione della concentrazione della sostanza in esame nel pesce di prova (o suoi tessuti specificati) dopo il trasferimento del pesce da un ambiente contenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza (k2 è espresso in giorni -1). 1.3. Principio del metodo di saggio Il saggio è costituito da due fasi: la fase di esposizione (assorbimento) e di post-esposizione (depurazione). Durante la fase di assorbimento, gruppi separati di pesci di una stessa specie vengono esposti ad almeno due concentrazioni della sostanza in esame. Essi vengono poi trasferiti in un ambiente esente dalla sostanza in esame per la fase di depurazione. È sempre necessaria una fase di depurazione, salvo che l'assorbimento della sostanza durante la fase di assorbimento sia risultato insignificante (per esempio BCF minore di 10). La concentrazione della sostanza in esame nel o sul pesce (o suo tessuto specificato) viene seguita in tutte e due le fasi della prova. In aggiunta alle due concentrazioni di prova, un gruppo di pesci di controllo viene mantenuto in condizioni identiche, salvo per l'assenza della sostanza in esame, per confrontare possibili effetti dannosi osservati nel saggio di bioconcentrazione con un gruppo di controllo corrispondente e per ottenere concentrazioni di fondo della sostanza in esame. La fase di assorbimento viene eseguita per 28 giorni salvo dimostrazione che l'equilibrio è stato raggiunto prima. Per una previsione della durata della fase di assorbimento e del tempo necessario per arrivare allo stato stazionario ci si può basare sull'equazione fornita nell'allegato 3. Viene poi iniziato il periodo di depurazione trasferendo il pesce in un altro contenitore pulito con lo stesso ambiente ma senza la sostanza in esame. Se possibile, il fattore di bioconcentrazione viene calcolato preferibilmente sia come rapporto (BCFSS) delle concentrazioni nel pesce (Cf) e nell'acqua (Cw) nello stato stazionario apparente che come fattore di bioconcentrazione cinetico, BCFk, che è il rapporto fra le costanti di velocità di assorbimento (k1) e di depurazione (k2) assumendo una cinetica di primo ordine. Se appare ovvio che la cinetica seguita non è di primo ordine, impiegare modelli più complessi (allegato 5). Se lo stato stazionario non viene raggiunto entro 28 giorni, la fase di assorbimento deve essere prolungata fino al raggiungimento dello stato stazionario, con un limite massimo di 60 giorni, dopo di che si incomincia la fase di depurazione. La costante di velocità di assorbimento, la costante di velocità di depurazione (perdita) (o le costanti nel caso di modelli più complessi), il fattore di bioconcentrazione e, se possibile, i limiti di confidenza di ciascuno di questi parametri vengono calcolati sulla base del modello che meglio descrive le concentrazioni misurate di sostanza in esame nel pesce e nell'acqua. Il BCF è espresso in funzione del peso umido totale del pesce. Tuttavia, per scopi speciali, se il pesce è sufficientemente grande o può venire diviso in parti commestibili (filetto) e non commestibili (viscere), si possono usare tessuti od organi specificati (per esempio muscolo, fegato). Poiché per molte sostanze organiche esiste una chiara relazione tra il potenziale di bioconcentrazione e la lipofilia, esiste anche una relazione corrispondente tra il contenuto di liquidi nel pesce di prova e la bioconcentrazione osservata di tali sostanze. Pertanto, allo scopo di ridurre questa fonte di variabilità nei risultati sperimentali per le sostanze di elevata lipofilia (cioè con log Poa > 3), la bioconcentrazione dovrebbe essere espressa in relazione al contenuto di lipidi oltre che al peso corporeo totale. Il contenuto di lipidi deve essere determinato possibilmente sullo stesso materiale biologico usato per determinare la concentrazione della sostanza in esame. 1.4. Informazione sulla sostanza in esame Prima di eseguire la prova di bioconcentrazione si dovrebbero conoscere le seguenti informazioni sulla sostanza in esame: a) solubilità in acqua b) coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua Poa (indicato anche con Koa, determinato mediante HPLC in A.8) c) idrolisi d) fototrasformazione in acqua, determinata sotto irraggiamento solare o solare simulato e nelle condizioni di irraggiamento della prova di bioconcentrazione (3) e) tensione superficiale (per sostanze per le quali non è possibile determinare il log Poa) f) tensione di vapore g) pronta biodegradabilità (se del caso) Un'altra informazione richiesta è la tossicità nei confronti delle specie ittiche usate nel saggio, preferibilmente la CL50 asintotica (cioè indipendente dal tempo). Per la quantificazione della sostanza in esame nelle soluzioni di saggio e nel materiale biologico, oltre ai dettagli relativi alla preparazione e conservazione del campione è necessario disporre di un metodo analitico appropriato, di accuratezza, precisione e sensibilità note. Dovrebbe essere noto anche il limite di rivelazione analitica in acqua e nei tessuti del pesce della sostanza in esame. Quando per l'esame si utilizza una sostanza marcata con 14C è necessario conoscere la percentuale di radioattività associata ad impurezze. 1.5. Validità del saggio Perché il saggio sia valido occorre rispettare le seguenti condizioni: - le variazioni di temperatura devono essere minori di ± 2 °C; - la concentrazione dell'ossigeno disciolto non deve scendere al di sotto del 60 % della saturazione; - la concentrazione della sostanza in esame nelle camere deve venire mantenuta entro ± 20 % della media dei valori misurati durante la fase di assorbimento; - la mortalità o altri effetti dannosi o malattie sia nei pesci di controllo che in quelli trattati devono essere minori del 10 % al termine della prova. Quando la prova viene prolungata a varie settimane o mesi, il tasso di mortalità o altri effetti dannosi in tutte e due le serie di pesci deve essere minore del 5 % al mese e non supera il 30 % in totale. 1.6. Composti di riferimento Per verificare la procedura sperimentale, laddove richiesto, può servire l'uso di composti di riferimento di potenziale di bioconcentrazione noto. Tuttavia per ora non è possibile raccomandare sostanze specifiche. 1.7. Descrizione del metodo di saggio 1.7.1. Apparecchiatura Per tutte le parti dell'apparecchiatura, evitare accuratamente l'uso di materiali soggetti a dissoluzione, assorbimento o lisciviatura e che possano avere un effetto dannoso sul pesce. Si possono usare vasche rettangolari o cilindriche normali di materiale chimicamente inerte e di capacità adeguata al tasso di carico. Minimizzare l'uso di tubature in materia plastica flessibile. Usare di preferenza tubature di Teflon (R), acciaio inossidabile e/o vetro. L'esperienza ha dimostrato che per sostanze con elevati coefficienti di assorbimento come i piretroidi sintetici può essere necessario il vetro silanizzato. In queste situazioni le apparecchiature non possono venire riutilizzate. 1.7.2. Acqua Nel saggio si usa in genere acqua naturale che dovrebbe essere prelevata da una fonte non contaminata e di qualità uniforme. L'acqua di diluizione deve essere di una qualità che permetta la sopravvivenza delle specie ittiche scelte per la durata del periodo di acclimatazione e del periodo di prova senza che mostrino alcun aspetto o comportamento anomalo. L'ideale sarebbe dimostrare che la specie in esame è in grado di sopravvivere, crescere e riprodursi nell'acqua di diluizione (per esempio in una coltura di laboratorio o in un saggio di tossicità su tutto il ciclo di vita). L'acqua deve essere caratterizzata almeno con il pH, la durezza, i solidi totali, il carbonio organico totale e di preferenza anche ammonio, nitriti e alcalinità nonché, per le specie marine, la salinità. I parametri importanti per il benessere ottimale dei pesci sono perfettamente noti, ma l'allegato 1 fornisce concentrazioni massime raccomandate per un certo numero di parametri per le acque dolci e marine usate nel saggio. L'acqua dovrebbe essere di qualità costante per tutta la durata di un saggio. Il pH dovrebbe essere compreso tra 6,0 e 8,5, ma durante un dato saggio deve restare entro ± 0,5 unità di pH. Per assicurarsi che l'acqua di diluizione non abbia influenze indesiderate sul risultato sperimentale (per esempio per complessazione della sostanza in esame) o influisca dannosamente sul pesce, prelevare di quando in quando dei campioni per l'analisi. La determinazione dei metalli pesanti (per esempio Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), dei principali anioni e cationi (per esempio Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), dei pesticidi (per esempio pesticidi organofosforati totali e organoclorurati totali), del carbonio organico totale e dei solidi in sospensione deve essere effettuata per esempio ogni 3 mesi, ove si sappia che l'acqua di diluizione è di qualità relativamente costante. Se la qualità dell'acqua si è dimostrata costante per almeno un anno, le determinazioni possono essere effettuate con minore frequenza, a intervalli più lunghi (per esempio ogni sei mesi). Il contenuto naturale di particelle in sospensione nonché il carbonio organico totale (TOC) nell'acqua di diluizione devono essere i più bassi possibili per evitare un assorbimento della sostanza in esame su materia organica che ne può ridurre la biodisponibilità (4). Il valore massimo accettabile è di 5 mg/l per i solidi sospesi (materia secca che non passa attraverso un filtro da 0,45 ìm) e di 2 mg/l per il carbonio organico totale (vedi allegato 1). Se necessario, filtrare l'acqua prima dell'uso. Il contributo del pesce di prova al contenuto di carbonio organico nell'acqua (escrezioni) e quello dei residui alimentari deve essere il più basso possibile. Durante tutto il saggio, la concentrazione del carbonio organico nel recipiente di esecuzione del saggio non deve superare la concentrazione di carbonio organico derivata dalla sostanza in esame e dall'eventuale agente solubilizzante più 10 mg/l (± 20 %). 1.7.3. Soluzioni di saggio Preparare una soluzione madre («stock») della sostanza in esame a una concentrazione adatta. La soluzione madre deve essere preparata preferibilmente per semplice miscelazione o agitazione della sostanza in esame nell'acqua di diluizione. È preferibile non usare solventi o disperdenti (agenti solubilizzanti); può tuttavia essere opportuno in alcuni casi per produrre una soluzione madre di concentrazione adatta. Solventi che si possono usare sono etanolo, metanolo, etere monometilico del glicol etilenico, etere dimetilico del glicol etilenico, dimetilformammide e glicol trietilenico. Disperdenti utilizzabili sono Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulosa 0,01 % e HCO-40. Prestare attenzione quando si usano agenti prontamente biodegradabili perché possono causare problemi di crescita batterica nelle prove a flusso continuo. La sostanza in esame può essere radiomarcata e dovrebbe avere la massima purezza (preferibilmente > 98 %). Per le prove a flusso continuo occorre un sistema che eroghi e diluisca in continuo una soluzione madre della sostanza in esame (per esempio pompa dosatrice, diluitore proporzionale, sistema di saturazione) per fornire le concentrazioni di prova nelle camere di saggio. Il volume di ciascuna camera di saggio deve essere sostituito preferibilmente almeno cinque volte al giorno. La modalità a flusso continuo va preferita, ma laddove non sia possibile (per esempio quando ciò ha un'influenza dannosa sugli organismi in esame) si può utilizzare una tecnica semistatica, purché siano rispettati i criteri di validità. Le portate di soluzione madre e acqua di diluizione devono essere controllate 48 ore prima del saggio e poi almeno una volta al giorno durante il saggio. In questo controllo deve essere inclusa la determinazione della portata attraverso ciascuna camera di saggio e si deve garantire che questa vari non più del 20 % all'interno di ciascuna camera e tra una camera e l'altra. 1.7.4. Scelta delle specie Criteri importanti nella scelta delle specie sono la disponibilità, la possibilità di ottenerle di dimensioni convenienti e di mantenerle in modo soddisfacente in laboratorio. Altri criteri per la scelta delle specie ittiche includono l'importanza ricreativa, commerciale ed ecologica nonché una sensibilità paragonabile, il fatto che essa sia stata già utilizzata con successo in passato, ecc. Specie sperimentali raccomandate sono indicate nell'allegato 2. Si possono usare anche altre specie, ma può darsi che la procedura di saggio debba venire adattata per ottenere condizioni sperimentali idonee. In questo caso, la relazione deve indicare la ragione della scelta della specie e il metodo di saggio. 1.7.5. Stabulazione del pesce Acclimatare la popolazione ittica di scorta per almeno due settimane in acqua alla temperatura di saggio e alimentarla con mangime dello stesso tipo usato durante il saggio in quantità sufficiente. Dopo un periodo di ambientazione di 48 ore, si registra la mortalità e si applicano i seguenti criteri: - mortalità superiore al 10 % della popolazione in sette giorni: l'intera partita viene respinta; - mortalità tra il 5 % e il 10 % della popolazione in sette giorni: l'acclimatazione prosegue per altri sette giorni; - mortalità minore del 5 % della popolazione in sette giorni: la partita è accettabile - in caso di mortalità superiore al 5 % durante il secondo periodo di sette giorni l'intera partita viene respinta. Assicurarsi che i pesci usati nelle prove non presentino malattie o anomalie osservabili. Scartare qualsiasi pesce ammalato. Nelle due settimane che precedono il saggio e durante il saggio i pesci non devono ricevere alcun trattamento per la cura di malattia. 1.8. Esecuzione del saggio 1.8.1. Saggio preliminare Può essere utile condurre un esperimento preliminare allo scopo di ottimizzare le condizioni sperimentali del test definitivo, per esempio la scelta delle concentrazioni della sostanza in esame e la durata delle fasi di assorbimento e di depurazione. 1.8.2. Condizioni di esposizione 1.8.2.1. Durata della fase di assorbimento PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO: 398L0073.1 La durata prevedibile della fase di assorbimento si può ricavare dall'esperienza pratica (per esempio da uno studio precedente o da un composto chimico con accumulo simile) o da certe relazioni empiriche, conoscendo la solubilità in acqua o il coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua della sostanza in esame (vedi allegato 3). La fase di assorbimento deve durare 28 giorni, salvo dimostrazione che l'equilibrio è stato raggiunto prima. Se in 28 giorni non si raggiunge lo stato stazionario, prolungare la fase di assorbimento effettuando ulteriori misure, fino al raggiungimento dello stato stazionario, con un massimo di 60 giorni. 1.8.2.2. Durata della fase di depurazione Un periodo pari a metà della durata della fase di assorbimento è solitamente sufficiente per una riduzione appropriata (per esempio del 95 %) del carico della sostanza nel corpo (vedi allegato 3 per una spiegazione della stima). Se il tempo necessario per raggiungere una perdita del 95 % è troppo lungo nella pratica, per esempio se supera il doppio della normale durata della fase di assorbimento (cioè oltre 56 giorni), si può utilizzare un periodo più breve (fino ad una riduzione della concentrazione della sostanza in esame al di sotto del 10 % della concentrazione nello stato stazionario). Tuttavia, per sostanze con caratteristiche di assorbimento e depurazione più complesse di quelle rappresentate da un modello ittico a compartimento singolo, che fornisce una cinetica di primo ordine, prevedere fasi di depurazione più lunghe per la determinazione delle costanti di velocità di perdita. Il periodo può tuttavia dipendere dal tempo durante il quale la concentrazione della sostanza in esame nel pesce rimane al di sopra del limite analitico di rivelazione. 1.8.2.3. Numero di pesci di prova Scegliere il numero di pesci per ogni concentrazione di prova in modo tale che ad ogni campionamento siano disponibili almeno quattro pesci per campione. Se si richiede una potenza statistica più elevata, sarà necessario un maggior numero di pesci per campione. Se si usano pesci adulti, indicare nella relazione se l'esperimento viene effettuato con maschi o femmine o ambedue. Se si utilizzano tutti e due i sessi, prima di incominciare l'esposizione documentare che le differenze di contenuto di lipidi tra i sessi non siano significative; può essere necessario raggruppare tutti i maschi e tutte le femmine. In ogni saggio scegliere pesci di peso simile, tale che il più piccolo abbia un peso non inferiore a due terzi del più grande. I pesci dovrebbero essere tutti della stessa classe di età e provenire dalla stessa fonte. Poiché il peso e l'età di un pesce sembrano talvolta avere un effetto significativo sui valori di BCF (1), riportare accuratamente questi dettagli nella relazione. Si raccomanda di pesare un sottocampione dello stock di pesci prima del saggio per stimare il peso medio. 1.8.2.4. Carico Usare rapporti acqua su pesce elevati per minimizzare la riduzione di Cw causata dall'aggiunta del pesce all'inizio del saggio e per evitare riduzioni della concentrazione di ossigeno disciolto. È importante che il carico sia appropriato per la specie usata nel saggio. In ogni caso si raccomanda normalmente un carico di 0,1-1,0 g di pesce (peso umido) per litro d'acqua per giorno. Si possono utilizzare carichi elevati se si dimostra che la concentrazione della sostanza in esame può venire mantenuta entro i limiti di ± 20 % del valore richiesto, e che la concentrazione dell'ossigeno disciolto non scende al di sotto del 60 % della saturazione. Nella scelta di appropriati regimi di carico si deve tener conto dell'habitat normale della specie ittica. Per esempio, pesci che vivono sul fondo, a pari volume d'acqua, possono richiedere un acquario con area di fondo più grande rispetto alle specie ittiche pelagiche. 1.8.2.5. Alimentazione Durante i periodi di acclimatazione e di saggio, mantenere i pesci ad un regime alimentare appropriato, avente un contenuto di lipidi e di proteine totali noto, in quantità sufficiente per tenerli in condizioni di buona salute e per mantenere il peso corporeo. Per tutto il periodo di acclimatazione e di prova somministrare ai pesci il cibo in una quantità approssimativamente dall'1 % al 2 % del peso corporeo al giorno; nella maggior parte delle specie ittiche questo regime mantiene la concentrazione dei lipidi ad un livello relativamente costante durante il saggio. La quantità di mangime deve venire ricalcolata, per esempio una volta alla settimana, per mantenere costanti il peso corporeo e il contenuto di lipidi. Per questo calcolo, si può stimare il peso dei pesci in ciascuna camera di saggio in base al peso del pesce campionato più recentemente nella stessa camera. Non pesare i pesci rimasti nella camera. Cibo non consumato e feci vengono sifonati giornalmente dalle camere di saggio poco dopo la fornitura del cibo (da 30 minuti a 1 ora). Mantenere le camere più pulite possibile per tutto il saggio in modo che la concentrazione di materia organica rimanga più scarsa possibile perché la presenza di carbonio organico può limitare la biodisponibilità della sostanza in esame (1). Poiché molti mangimi derivano da farina di pesce, analizzare il contenuto della sostanza in esame nel mangime. È desiderabile analizzare nel mangime anche il contenuto di pesticidi e metalli pesanti. 1.8.2.6. Luce e temperatura Il fotoperiodo è normalmente da 12 a 16 ore e la temperatura (± 2 °C) dovrebbe essere appropriata per la specie di prova (vedi allegato 2). Il tipo e le caratteristiche dell'illuminazione devono essere noti. Fare attenzione ad una possibile fototrasformazione della sostanza in esame nelle condizioni di irraggiamento dello studio. Usare un'illuminazione appropriata evitando l'esposizione del pesce a fotoprodotti non naturali. In alcuni casi può essere appropriato utilizzare un filtro per bloccare la radiazione UV al di sotto di 290 nm. 1.8.2.7. Concentrazioni di prova I pesci vengono esposti in condizioni di flusso continuo ad almeno due concentrazioni della sostanza in esame in acqua. Normalmente la concentrazione più elevata (o massima) della sostanza in esame viene scelta intorno all'1 % della sua CL50 asintotica acuta e almeno dieci volte più elevata del suo limite di rivelazione in acqua mediante il metodo analitico usato. La concentrazione di prova massima può venire determinata anche dividendo la CL50 acuta a 96 ore per un appropriato rapporto acuta/cronica (rapporti appropriati per alcuni composti chimici possono essere da circa 3 fino a 100). Se possibile, scegliere l'altra o le altre concentrazioni in modo che differiscano dalla suddetta di un fattore 10. Se ciò non è possibile perché il limite analitico urta con il criterio dell'1 % della CL50, si può usare un fattore minore di 10, altrimenti prendere in considerazione la marcatura con 14C della sostanza in esame. Non usare mai una concentrazione superiore alla solubilità della sostanza in esame. Se si usa un agente solubilizzante, la sua concentrazione non dovrebbe essere superiore a 0,1 ml/l, e deve essere uguale in tutte le vasche di saggio. Il suo contributo, insieme con la sostanza in esame, al contenuto complessivo di carbonio organico nell'acqua usata per il saggio deve essere noto. Fare comunque il possibile per evitare l'uso di tali materiali. 1.8.2.8. Prove di controllo Oltre alla serie dei saggi, eseguire una prova di controllo con l'acqua di diluizione o, se del caso, una prova con acqua contenente l'agente solubilizzante, posto che sia stato stabilito che l'agente non ha effetti sul pesce; altrimenti eseguire tutte e due le prove di controllo. 1.8.3. Frequenza delle misure della qualità dell'acqua Durante il saggio, misurare in tutte le vasche ossigeno disciolto, TOC, pH e temperatura. La durezza totale e la salinità, se del caso, devono essere misurate nelle prove di controllo e in una vasca alla concentrazione massima. Come minimo, l'ossigeno disciolto e, se del caso, la salinità devono essere misurati tre volte - all'inizio, verso la metà e alla fine del periodo di assorbimento - e una volta alla settimana durante il periodo di depurazione. Il TOC deve essere misurato all'inizio del saggio (24 h e 48 h prima dell'inizio della fase di assorbimento) prima dell'aggiunta del pesce e almeno una volta la settimana durante le fasi di assorbimento e depurazione. La temperatura va misurata giornalmente, il pH all'inizio e al termine di ciascun periodo e la durezza una volta per ogni saggio. La temperatura dovrebbe preferibilmente essere controllata in continuo in almeno una vasca. 1.8.4. Campionamento e analisi dei pesci e dell'acqua 1.8.4.1. Programma di campionamento del pesce e dell'acqua Per la determinazione della concentrazione della sostanza in esame, l'acqua delle camere di saggio viene campionata prima dell'aggiunta del pesce e durante le fasi di assorbimento e depurazione. Campionare l'acqua come minimo tutte le volte che viene campionato il pesce e prima della fornitura del mangime. Durante la fase di assorbimento, determinare le concentrazioni della sostanza in esame per verificare il rispetto dei criteri di validità. I pesci vengono campionati almeno cinque volte durante la fase di assorbimento e almeno quattro volte durante la fase di depurazione. Poiché in qualche caso risulterà difficile calcolare una stima ragionevolmente precisa del BCF sulla base di questo numero di campioni, in particolare quando la cinetica di depurazione non è una semplice cinetica di primo ordine, è consigliabile prelevare campioni a frequenza più elevata in tutti e due i periodi (vedi allegato 4). I campioni in più vengono conservati e analizzati solo se i risultati della prima serie di analisi si dimostrano inadeguati per il calcolo del BCF con la precisione desiderata. L'allegato 4 presenta un esempio di un programma di campionamento accettabile. Se si usano altri valori di Poa per calcolare il tempo di esposizione necessario per un assorbimento del 95 %, si possono facilmente calcolare altri programmi. Il campionamento viene continuato durante la fase di assorbimento fino a quando si stabilisce lo stato stazionario, con un limite massimo di 28 giorni. Se non si raggiunge lo stato stazionario in 28 giorni, il campionamento continua fino al raggiungimento dello stato stazionario, con un massimo di 60 giorni. Prima dell'inizio della fase di depurazione, i pesci vengono trasferiti in vasche pulite. 1.8.4.2. Campionamento e preparazione del campione I campioni d'acqua per l'analisi vengono ottenuti per esempio mediante sifonatura attraverso tubature inerti da un punto centrale della camera di saggio. Poiché sembra che né la filtrazione né la centrifugazione separino sempre la frazione non-biodisponibile della sostanza in esame da quella biodisponibile (in particolare per composti chimici super-lipofili, cioè quelli con un log Poa > 5) (1) (5), i campioni non devono essere sottoposti a questi trattamenti. Curare, invece, di mantenere le vasche più pulite possibile e controllare il contenuto di carbonio organico totale durante le fasi di assorbimento e depurazione. Ad ogni campionamento rimuovere dalle camere di saggio un numero appropriato di pesci (normalmente almeno quattro). I pesci campionati vengono rapidamente risciacquati con acqua, «asciugati» per tamponamento, uccisi immediatamente con l'uso del metodo più appropriato e umano e poi pesati. È preferibile analizzare il pesce e l'acqua immediatamente dopo il campionamento allo scopo di evitare degradazione o altre perdite e calcolare tassi approssimativi di assorbimento e depurazione nel corso del saggio. L'analisi immediata evita inoltre ritardi nella determinazione del raggiungimento di un livello costante. In mancanza di analisi immediata, conservare i campioni mediante un metodo appropriato. Prima di iniziare lo studio procurarsi le informazioni sul metodo appropriato di conservazione per la particolare sostanza in esame - per esempio surgelazione, mantenimento a 4 °C, durata della conservazione, estrazione, ecc. 1.8.4.3. Qualità del metodo analitico Poiché tutta la procedura è basata sostanzialmente sull'accuratezza, la precisione e la sensibilità del metodo analitico utilizzato per la sostanza in esame, controllare sperimentalmente che la precisione e la riproducibilità dell'analisi chimica, e che il recupero della sostanza in esame dall'acqua e dal pesce, siano soddisfacenti per quel particolare metodo. Inoltre, controllare che la sostanza in esame non sia rilevabile nell'acqua di diluizione usata. Se necessario, correggere i valori di Cw e Cf ottenuti nel saggio per tener conto del livello di recupero e dei valori di fondo delle prove di controllo. Manipolare sempre i campioni di pesce e acqua in modo da minimizzare la contaminazione e le perdite (per esempio per assorbimento sul dispositivo di campionamento). 1.8.4.4. Analisi del campione di pesce Se nel saggio vengono usati materiali radiomarcati, è possibile analizzare il radiomarcante totale (cioè progenitore e metaboliti), oppure i campioni possono venire depurati, così da poter analizzare il composto progenitore separatamente. Inoltre si possono caratterizzare i principali metaboliti allo stato stazionario, oppure al termine della fase di assorbimento se viene conclusa prima del raggiungimento dello stato stazionario. Se il BCF, in termini di residui radiomarcati totali, è ≥ 1000 %, può essere consigliabile, e per alcune categorie di composti chimici come i pesticidi è fortemente raccomandato, identificare e quantificare i composti di degradazione che rappresentano ≥ 10 % dei residui totali nei tessuti del pesce allo stato stazionario. Se si identificano e quantificano i prodotti di degradazione che rappresentano ≥ 10 % dei residui radiomarcati totali nei tessuti del pesce, si raccomanda di identificarli e quantificarli anche nell'acqua di prova. La concentrazione della sostanza in esame viene di solito determinata su ciascun singolo pesce pesato. Se ciò non è possibile, si possono raggruppare i campioni in occasione di ciascun campionamento, ma questo limita le procedure statistiche applicabili ai dati. Se si dà importanza ad una specifica procedura statistica e alla sua potenza, nel saggio va incluso un numero di pesci adeguato per tener conto della procedura di raggruppamento e della potenza desiderate (6) (7). Il BCF va espresso sia in funzione del peso umido totale che, per le sostanze fortemente lipofile, in funzione del contenuto di lipidi. Determinare se possibile il contenuto di lipidi nel pesce ad ogni campionamento. Per la determinazione del contenuto lipidico utilizzare metodi adatti (rif. 8 e 2 dell'allegato 3). Come metodo standard si può raccomandare la tecnica di estrazione con cloroformio/metanolo (9). I vari metodi non forniscono valori identici (10), per cui è importante indicare in dettaglio il metodo usato. Se possibile l'analisi dei lipidi deve essere effettuata sullo stesso estratto prodotto per l'analisi della sostanza in esame, perché i lipidi devono spesso venire rimossi dall'estratto prima di poterlo analizzare per via cromatografica. La differenza del contenuto di lipidi del pesce (in mg/kg di peso umido) tra l'inizio e il termine dell'esperimento non deve essere superiore a ± 25 %. Registrare anche i solidi percentuali del tessuto per poter convertire la concentrazione lipidica da base umida a base secca. 2. DATI 2.1. Trattamento dei risultati La curva di assorbimento della sostanza in esame viene ottenuta riportando la sua concentrazione nel/sul pesce (o tessuti specificati) durante la fase di assorbimento contro il tempo su scale aritmetiche. Se la curva ha raggiunto un andamento costante, cioè è diventata approssimativamente asintotica all'asse del tempo, il BCFSS allo stato stazionario si calcola da: >NUM>Cf stato stazionario (media) >DEN>Cw stato stazionario (media) Quando non si raggiunge lo stato stazionario si può calcolare un BCFSS di sufficiente precisione per una valutazione di rischio da uno «stato stazionario» all'80 % (1,6/k2) o al 95 % (3,0/k2) dell'equilibrio. Determinare inoltre il fattore di concentrazione (BCFk) come rapporto k1/k2, cioè delle due costanti cinetiche di primo ordine. La costante di velocità di depurazione (k2) viene di solito determinata dalla curva di depurazione (cioè da una curva di riduzione della concentrazione della sostanza in esame nel pesce contro il tempo). La costante di velocità di assorbimento (K1) viene poi calcolata sulla base di k2 e di un valore di Cf che si ottiene dalla curva di assorbimento (vedi anche allegato 5). Il metodo preferito per l'ottenimento del BCFk e delle costanti di velocità k1 e k2 consiste nell'uso di metodi di stima parametrica non lineare su computer (11). Altrimenti per calcolare k1 e k2 si possono usare metodi grafici. Se è evidente che la curva di depurazione non è di primo ordine, bisogna allora impiegare modelli più complessi (vedi bibliografia dell'allegato 3) con l'assistenza di un biostatistico. 2.2. Interpretazione dei risultati Se le concentrazioni misurate delle soluzioni di prova sono prossime al limite di rivelazione del metodo analitico, i risultati devono essere interpretati con cautela. Curve di assorbimento e di perdita chiaramente definite sono un'indicazione di buona qualità dei dati di bioconcentrazione. La variazione delle costanti di assorbimento/depurazione tra le due concentrazioni di prova deve essere minore del 20 %. Se si osservano differenze significative nelle velocità di assorbimento/depurazione tra le due concentrazioni di prova applicate, registrarle e fornire una possibile spiegazione. In genere, il limite di confidenza di BCF ottenuti da studi ben impostati è vicino al ± 20 %. 3. RELAZIONE La relazione sulla prova deve includere le seguenti informazioni: 3.1. Sostanza di prova - natura fisica e, se del caso, proprietà chimico fisiche; - dati di identificazione chimica (incluso, se opportuno, il contenuto di carbonio organico); - se radiomarcata, la posizione precisa dell'atomo o degli atomi marcati e la percentuale di radioattività associata ad impurezze; 3.2. Specie usata nel saggio - nome scientifico, ceppo, provenienza, eventuali pretrattamenti, acclimatazione, età, intervallo di dimensioni, ecc. 3.3. Condizioni sperimentali - procedura di saggio usata (per esempio a flusso continuo o semistatica); - tipo e caratteristiche dell'illuminazione usata e fotoperiodo(i); - impostazione della prova (per esempio numero e dimensioni delle camere di saggio, tasso di sostituzione del volume d'acqua, molteplicità dei campioni, numero di pesci per campione, numero delle concentrazioni di prova, durata delle fasi di assorbimento e depurazione, frequenza di campionamento per i campioni di pesce e di acqua); - metodo di preparazione delle soluzioni madre e frequenza di rinnovo (se usato, indicare l'agente solubilizzante, la sua concentrazione e il suo contributo al contenuto di carbonio organico dell'acqua); - concentrazioni nominali nel saggio, medie dei valori misurati e loro deviazioni standard nelle vasche di saggio, e metodo mediante cui sono stati ottenuti questi valori; - fonte dell'acqua di diluizione, descrizione degli eventuali pretrattamenti, risultati di eventuali dimostrazioni della capacità del pesce di saggio di vivere nell'acqua, e caratteristiche dell'acqua: pH, durezza, temperatura, concentrazione di ossigeno disciolto, livelli residui di cloro (se misurati), carbonio organico totale, solidi sospesi, salinità dell'ambiente di prova (se del caso) ed eventuali altre misure effettuate; - qualità dell'acqua all'interno delle vasche di saggio, pH, durezza, TOC, temperatura e concentrazione dell'ossigeno disciolto; - informazioni dettagliate sull'alimentazione (per esempio tipo di mangime, fonte, composizione - se possibile almeno il tenore lipidico e proteico, quantità somministrata e frequenza); - informazioni sul trattamento dei campioni di pesce e d'acqua, inclusi dettagli di preparazione, conservazione, estrazione e procedure analitiche (e loro precisione) per la sostanza in esame e il contenuto di lipidi (se misurato). 3.4. Risultati - risultati di eventuali studi preliminari eseguiti; - mortalità dei pesci di controllo e dei pesci in ciascuna camera di esposizione ed eventuale comportamento anomalo osservato; - contenuto di lipidi del pesce (se determinato durante l'esecuzione delle prove); - curve (con tutti i dati di misura) di assorbimento e di depurazione del composto chimico in esame nel pesce, tempo di raggiungimento dello stato stazionario; - Cf e Cw (con deviazione standard e intervallo, se del caso) per tutti i momenti di campionamento [Cf espresso in ìg/g di peso umido (ppm) del corpo intero o dei suoi tessuti specificati, per esempio lipidi, e Cw in ìg/ml (ppm)]. Valori di Cw per la serie di controllo (riportare anche il valore di fondo); - fattore di bioconcentrazione allo stato stazionario (BCFSS) e/o fattore di concentrazione cinetico (BCFk) e, se del caso, limiti di confidenza al 95 % per le costanti di velocità di assorbimento e depurazione (perdita) (tutte espresse in relazione al corpo intero e al contenuto totale di lipidi, se misurato, dell'animale o di suoi tessuti specificati), limiti di confidenza e deviazione standard (se disponibili) e metodi di calcolo o analisi dei dati per ciascuna concentrazione della sostanza in esame usata; - se vengono usate sostanze radio-marcate, e se richiesto, si può presentare l'accumulo di tutti i metaboliti rilevati; - qualsiasi cosa insolita riguardo al saggio, eventuali deviazioni da queste procedure e qualsiasi altra informazione pertinente. Minimizzare i risultati come «non rilevato a questo limite di rivelazione» mediante lo sviluppo pre-test del metodo e l'imposizione sperimentale, perché tali risultati non possono venire utilizzati per i calcoli delle costanti di velocità. 4. BIBLIOGRAFIA (1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp 117-156. (2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390. (3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in «The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation», Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, The Netherlands. (9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105. (10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984-1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. Allegato 1 >SPAZIO PER TABELLA> Allegato 2 >SPAZIO PER TABELLA> Varie specie di estuario e marine sono in uso in differenti paesi, per esempio >SPAZIO PER TABELLA> Raccolta I pesci d'acqua dolce suelencati sono facilmente allevabili e/o sono largamente disponibili per tutto l'anno, mentre la disponibilità delle specie marine e di estuario è parzialmente confinata ai rispettivi paesi. Possono riprodursi e venire allevati sia in stabilimenti di acquacoltura che in laboratorio, in condizioni di controllo delle malattie e dei parassiti, in modo che gli animali di saggio siano sani e geneticamente controllati. Questi pesci sono disponibili in molte parti del mondo. Allegato 3 Previsione della durata delle fasi di assorbimento e depurazione 1. Previsione della durata della fase di assorbimento Prima di eseguire il saggio, si può ricavare una stima di k2 e quindi di una data percentuale del tempo occorrente per arrivare allo stato stazionario da relazioni empiriche tra k2 e il coefficiente di ripartizione n-ottanolo/acqua (Poa) o tra k2 e la solubilità in acqua (s). Una stima di k2 (giorni-1) si può ottenere per esempio dalla seguente relazione empirica (1): log10k2 = -0,414 log10(Poa) + 1,47 (r2 = 0,95) [equazione 1] Per altre relazioni vedi rif. (2). Se il coefficiente di ripartizione (Poa) non è noto, si può ricavare una stima (3) conoscendo la solubilità in acqua della sostanza da utilizzare: log10(Poa) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) [equazione 2] in cui s = solubilità (moli/l): (n = 36) Queste relazioni valgono solo per composti chimici con valori di Poa compresi tra 2 e 6,5 (4). Il tempo necessario per raggiungere una certa percentuale dello stato stazionario si può ricavare, applicando il valore stimato di k2, dall'equazione cinetica generale che descrive l'assorbimento e la depurazione (cinetica di primo ordine): >NUM>dCf >DEN>dt = k1.Cw - k2.Cf o, se Cw è costante: Cf = >NUM>k1 >DEN>k2 .Cw (1 - e-k2t ) [equazione 3] Approssimandosi allo stato stazionario, (t . ∞), l'equazione 3 può venire ridotta (5) (6) a: Cf = >NUM>k1 >DEN>k2 . Cw o Cf/Cw = k1/k2 = BCF Allora k1/k2 . Cw è un'approssimazione della concentrazione nel pesce allo «stato stazionario» (Cf,s). L'equazione 3 può venire riscritta come: Cf = Cf,s (1 - e-k2t ) o >NUM>Cf >DEN>Cfs = 1 - e-k2t [equazione 4] Applicando l'equazione 4, si può prevedere il tempo necessario per raggiungere una certa percentuale dello stato stazionario quando k2 sia stato pre-stimato con l'equazione 1 o 2. Indicativamente, la durata statisticamente ottimale della fase di assorbimento per ottenere dati statisticamente accettabili (BCFk) è il periodo necessario perché la curva del logaritmo della concentrazione della sostanza in esame nel pesce contro il tempo, su scala lineare raggiunga il suo punto medio, o 1,6/k2, o 80 % dello stato stazionario, ma non più di 3,0/k2 o 95 % dello stato stazionario (7). Il tempo necessario per raggiungere l'80 % dello stato stazionario si ottiene da (equazione 4): 0,80 = 1 - e-k2t80 o t80 = >NUM>1,6 >DEN>k2 [equazione 5] Similmente, il 95 % dello stato stazionario si ottiene da: t95 = >NUM>3,0 >DEN>k2 [equazione 6] Per esempio, la durata dalla fase di assorbimento (as) per una sostanza in esame con log Poa = 4 sarà (utilizzando le equazioni 1, 5, 6): log10k2 = -0,414.(4) + 1,47 k2 = 0,652 giorni-1 top = t80 = 1,6/0,652, cioè 2,45 giorni (59 ore) o top = t95 = 3,0/0,652, cioè 4,60 giorni (110 ore) Similmente, per una sostanza con s = 10-5 mol/l (log(s) = - 5,0), la durata dell'assorbimento sarà (utilizzando le equazioni 1, 2, 5, 6): log10 (Poa) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 = -0,414 (5,02) + 1,47 k2 = 0,246 giorni-1 top = t80 = 1,6/0,246, cioè 6,5 giorni (156 ore) o top = t95 = 3,0/0,246, cioè 12,2 giorni (293 ore) In alternativa, si può utilizzare l'espressione: teq = 6,54 × 10-3 Poa + 55,31 (ore) per calcolare il tempo necessario per raggiungere uno stato stazionario efficace (4). 2. Previsione della durata della fase di depurazione Una previsione del tempo necessario per ridurre il carico sul corpo ad una certa percentuale della concentrazione iniziale si può ricavare anch'essa dall'equazione generale che descrive l'assorbimento e la depurazione (cinetica di primo ordine) (1) (8). Per la fase di depurazione, si assume che Cw sia zero. L'equazione si può ridurre a: >NUM>dCf >DEN>dt = -k2Cf o Cf = Cf,o .e-k2t dove Cf,o è la concentrazione all'inizio del periodo di depurazione. Una depurazione del 50 % verrà allora raggiunta al tempo (t50): >NUM>Cf >DEN>Cf,o = >NUM>1 >DEN>2 = e-k2t50 o t50 = >NUM>0,693 >DEN>k2 Similmente, una depurazione del 95 % verrà raggiunta a: t95 = >NUM>3,0 >DEN>k2 Se per il primo periodo si usa un assorbimento dell'80 % (1,6/k2) e nella fase di depurazione si usa una perdita del 95 % (3,0/k2), la fase di depurazione dura allora circa il doppio della fase di assorbimento. È importante notare, tuttavia, che le stime sono basate sull'ipotesi che l'assorbimento e la depurazione seguano una cinetica di primo ordine. Se è ovvio che non viene seguita una cinetica di primo ordine, si devono impiegare modelli più complessi [per esempio rif (1)]. Bibliografia (dell'allegato 3) (1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pagine 309-320. (2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ: Sci. Technol. 16 (1), pagine 4-10. (4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pagine 701-707. (5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pagine 785-792. (6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Apprai