8)

Nella parte B sono aggiunti i seguenti capitoli: "B.63 PROVA DI SCREENING DELLA TOSSICITÀ PER LA RIPRODUZIONE/LO SVILUPPO INTRODUZIONE 1. Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida n. 421 dell’OCSE (2016). Le linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche sono periodicamente rivedute e aggiornate alla luce del progresso scientifico. La linea guida n. 421 sulla prova di screening è stata adottata inizialmente nel 1995, sulla base di un protocollo per una «prova preliminare di screening della tossicità per la riproduzione» di cui si è discusso nell’ambito di due riunioni di esperti, a Londra nel 1990 (1) e a Tokyo nel 1992 (2). 2. Il presente metodo di prova è stato aggiornato mediante l’aggiunta di endpoint pertinenti per il rilevamento di interferenti endocrini, come seguito all’attività ad alta priorità avviata dall’OCSE nel 1998 volta a rivedere le linee guida esistenti e a elaborarne di nuove, per lo screening e la sperimentazione relativi a potenziali interferenti endocrini (3). La linea guida n. 407 dell’OCSE (studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 28 giorni sui roditori, corrispondente al capitolo B.7 del presente allegato), ad esempio, è stata migliorata nel 2008 mediante l’aggiunta di parametri adatti per l’individuazione dell’attività endocrina delle sostanze in esame. La linea guida n. 421 è stata aggiornata con l’intento di includere gli endpoint pertinenti per il rilevamento di interferenti endocrini nelle linee guida in cui i periodi di esposizione coprono alcuni dei periodi sensibili dello sviluppo (i periodi precedenti o immediatamente successivi alla nascita). 3. Gli ulteriori endpoint pertinenti per il rilevamento di interferenti endocrini selezionati, che fanno parte anche della linea guida n. 443 (studio esteso di tossicità per la riproduzione su una generazione, corrispondente al capitolo B.56 del presente allegato), sono stati aggiunti alla linea guida n. 421 sulla base di uno studio di fattibilità riguardante questioni scientifiche e tecniche relative alla loro inclusione, come pure gli eventuali adattamenti del disegno sperimentale necessari per la loro inclusione (4). 4. Il presente metodo di prova è inteso a generare informazioni limitate concernenti gli effetti delle sostanze chimiche in esame sulla capacità riproduttiva maschile e femminile, quali la funzione delle gonadi, il comportamento in fase di accoppiamento, il concepimento, lo sviluppo dell’organismo concepito e il parto. Esso non rappresenta un’alternativa ai metodi di prova esistenti B.31, B.34, B.35 e B.56, né li sostituisce. CONSIDERAZIONI INIZIALI 5. Il presente metodo di prova di screening può essere utilizzato per fornire informazioni iniziali concernenti i possibili effetti sulla riproduzione e/o lo sviluppo, nella fase iniziale di valutazione delle proprietà tossicologiche delle sostanze chimiche o nella valutazione di sostanze potenzialmente pericolose. Esso può essere utilizzato anche nell’ambito di una serie di prove di screening iniziali per le sostanze chimiche esistenti per le quali le informazioni tossicologiche disponibili sono scarse o inesistenti, come studio volto a determinare gli intervalli di dosaggio per studi più approfonditi sulla riproduzione o sullo sviluppo o in altri casi in cui sia ritenuto opportuno. Durante lo svolgimento dello studio è opportuno seguire i principi guida e le considerazioni di cui al documento di orientamento dell’OCSE n. 19, Recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (5). 6. Il presente metodo di prova non fornisce informazioni complete su tutti gli aspetti della riproduzione e dello sviluppo. In particolare, esso offre solo mezzi limitati per individuare manifestazioni postnatali di un’esposizione prenatale o effetti eventualmente riconducibili a un’esposizione postnatale. Tenuto conto, tra le altre cose, del numero relativamente ridotto di animali nei gruppi di trattamento, della selettività degli endpoint e della breve durata dello studio, il presente metodo non fornisce prove sufficienti per trarre conclusioni definitive circa l’assenza di effetti. Inoltre, in assenza di dati desunti da altre prove di tossicità per la riproduzione/lo sviluppo, risultati positivi sono utili per una valutazione iniziale dei pericoli e permettono di prendere decisioni circa la necessità di procedere a ulteriori prove e i tempi per effettuarle. 7. I risultati ottenuti per quanto riguarda i parametri endocrini devono essere interpretati alla luce del «Quadro concettuale dell’OCSE per le prove e la valutazione delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino» (6). La linea guida migliorata dell’OCSE n. 421 fa parte del livello 4 di questo quadro concettuale come saggio in vivo in grado di fornire dati sugli effetti nocivi sugli endpoint pertinenti per il sistema endocrino. Un segnale endocrino potrebbe tuttavia non essere considerato di per sé una prova sufficiente ad attestare che la sostanza chimica in esame è un interferente endocrino. 8. Il presente metodo di prova prevede la somministrazione orale della sostanza chimica da esaminare. Potrebbero essere necessarie modifiche in caso di utilizzo di altre vie di somministrazione. 9. Prima di applicare il presente metodo di prova a una miscela per generare dati ai fini regolamentari previsti, si deve considerare se, e in caso affermativo, perché, esso possa fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie laddove esista una disposizione normativa che obblighi a sottoporre a prova la miscela. 10. L’appendice 1 contiene le definizioni dei termini utilizzati. PRINCIPIO DELLA PROVA 11. La sostanza chimica in esame viene somministrata in dosi graduate a diversi gruppi di maschi e femmine. Ai maschi le dosi devono essere somministrate per almeno quattro settimane e fino al prima della soppressione programmata, compreso tale giorno (tale periodo comprende un minimo di due settimane prima dell’accoppiamento, il tempo dell’accoppiamento e circa due settimane dopo l’accoppiamento). Tenuto conto della durata limitata del periodo di esposizione prima dell’accoppiamento nei maschi, la fertilità potrebbe non essere un particolare indicatore di sensibilità della tossicità testicolare. È pertanto essenziale un esame istologico particolareggiato delle prove. La combinazione di un periodo di esposizione di due settimane prima dell’accoppiamento (seguito da osservazioni sull’accoppiamento e la fertilità) e di un periodo di esposizione complessivo di almeno quattro settimane (seguito da un dettagliato esame istopatologico delle gonadi maschili) è considerata sufficiente a consentire l’individuazione della maggior parte degli effetti sulla fertilità maschile e sulla spermatogenesi. 12. Alle femmine la sostanza va somministrata durante l’intero studio. Tale periodo comprende due settimane prima dell’accoppiamento (con l’obiettivo di coprire almeno due cicli estrali completi), l’intervallo variabile che precede il concepimento, la durata della gestazione e almeno tredici giorni dopo il parto, fino al giorno precedente alla soppressione programmata, compreso tale giorno. 13. La durata dello studio, dopo l’acclimatazione e la valutazione del ciclo estrale precedente la somministrazione, dipende dal comportamento della femmina ed è di circa 63 giorni [almeno 14 giorni prima dell’accoppiamento, un massimo di 14 giorni per l’accoppiamento, 22 giorni di gestazione, 13 giorni di allattamento]. 14. Durante il periodo di somministrazione gli animali vengono esaminati attentamente e quotidianamente al fine di rilevare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o soppressi durante il periodo della prova vengono sottoposti a necroscopia; al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia. DESCRIZIONE DEL METODO Selezione della specie animale 15. Il presente metodo di prova è destinato ad essere utilizzato con i ratti. Se i parametri specificati nel metodo di prova sono studiati in un’altra specie di roditori, occorre fornire una giustificazione dettagliata. Nel programma internazionale di validazione per l’individuazione degli interferenti endocrini nella linea guida n. 407 dell’OCSE (che corrisponde al capitolo B.7 del presente allegato) il ratto è stata l’unica specie animale utilizzata. Non vanno usati ceppi a bassa fecondità o con nota elevata incidenza di difetti dello sviluppo. Si devono utilizzare animali vergini sani, non sottoposti in precedenza a esperimenti. Gli animali utilizzati nella prova devono essere caratterizzati quanto alle specie, al ceppo, al sesso, al peso e all’età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali utilizzati deve essere minima e non superare il 20 % del peso medio di ciascun sesso. Per gli studi preliminari a studi a lungo termine o effettuati su un’intera generazione, è preferibile ricorrere in entrambi gli studi ad animali dello stesso ceppo e della stessa provenienza. Condizioni di stabulazione e alimentazione 16. Tutte le procedure devono attenersi agli standard locali in materia di cura degli animali da esperimento. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °). L’umidità relativa deve raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 % (eccetto nel corso delle pulizie degli ambienti), ma occorre puntare a un valore del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua da bere. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della sostanza chimica in esame, se quest’ultima è somministrata con il cibo. 17. Gli animali devono essere sistemati nelle gabbie in piccoli gruppi dello stesso sesso; possono essere sistemati in gabbie individuali se necessario per ragioni scientifiche. Ciascuna gabbia non deve ospitare più di cinque animali. L’accoppiamento va effettuato in gabbie adeguate allo scopo. Le femmine gravide devono essere tenute in gabbie individuali e rifornite di materiale per la costruzione della tana. Le femmine che allattano vanno poste in gabbie individuali insieme alla prole. 18. L’alimentazione deve essere analizzata periodicamente per verificare la presenza di contaminanti. Un campione del mangime somministrato deve essere conservato fino al completamento della relazione. Preparazione degli animali 19. Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e gruppi di trattamento. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni prima dell’inizio dello studio. Preparazione delle dosi 20. Si raccomanda di somministrare la sostanza chimica in esame per via orale, a meno che non si considerino più appropriate altre vie di somministrazione. Se si sceglie la via orale, la sostanza chimica è generalmente somministrata mediante sonda gastrica; tuttavia, in alternativa, può essere somministrata con la dieta o l’acqua da bere. 21. Ove necessario, la sostanza in esame è disciolta o sospesa in un mezzo disperdente adeguato. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ove possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri mezzi disperdenti. Le caratteristiche tossiche dei mezzi disperdenti diversi dall’acqua devono essere note. È necessario determinare la stabilità e l’omogeneità della sostanza chimica in esame nel mezzo disperdente. PROCEDURA Numero e sesso degli animali 22. Si raccomanda di costituire gruppi di almeno 10 maschi e 12-13 femmine. Nella fase pre-esposizione si procede alla valutazione della ciclicità estrale nelle femmine e gli animali che non presentano un ciclo tipico di 4-5 giorni non sono inclusi nello studio; si raccomanda pertanto di utilizzare un numero supplementare di femmine per ottenere 10 femmine per ciascun gruppo. Eccetto i casi in cui gli effetti tossici sono notevoli, si dovrebbero ottenere per ciascun gruppo almeno 8 femmine gravide, che generalmente è il numero minimo accettabile. Lo scopo è ottenere un numero di gravidanze e nidiate che consenta una valutazione significativa del potenziale della sostanza chimica in esame di influire negativamente sulla fertilità, sulla gravidanza, sul comportamento materno, sulla suzione, sulla crescita e sullo sviluppo della progenie F 1 , dal concepimento al tredicesimo giorno dopo il parto. Dosaggio 23. Si utilizzano generalmente almeno tre gruppi da trattare e un gruppo di controllo. I livelli di dosaggio possono essere basati sulle informazioni derivanti dalle prove di tossicità acuta o sui risultati di studi con dosi ripetute. Fatta eccezione per la somministrazione della sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo devono essere trattati in modo identico agli esemplari dei gruppi sottoposti al trattamento. Se si usa un mezzo disperdente per la somministrazione della sostanza chimica in esame, al gruppo di controllo verrà somministrato il medesimo mezzo disperdente nel volume massimo utilizzato. 24. I livelli di dosaggio devono essere selezionati tenendo conto di tutti i dati disponibili sulla tossicità e le caratteristiche (tossico-)cinetiche. Bisogna inoltre tener conto del fatto che potrebbero esserci differenze di sensibilità tra le femmine gravide e quelle non gravide. Il livello massimo di dosaggio deve essere tale da indurre effetti tossici senza cagionare la morte o sofferenze gravi. Deve essere inoltre definita una serie decrescente di livelli di dosaggio al fine di individuare un’eventuale correlazione dose-risposta e l’assenza di effetti avversi al dosaggio minimo (NOAEL, no-observed-adverse effects ). In genere, per determinare i livelli decrescenti di dosaggio si consiglia un intervallo con un fattore compreso tra 2 e 4 e spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di studio piuttosto che avere un intervallo eccessivamente lungo (ad esempio superiore a un fattore 10) fra un dosaggio e l’altro. 25. Nel caso di tossicità generale osservata (ad es. riduzione del peso corporeo, effetti a livello epatico, cardiaco, polmonare o renale ecc.) o di altri cambiamenti che potrebbero non essere dovuti ad effetti tossici (ad es. diminuzione dell’assunzione di alimenti, dilatazione del fegato), gli effetti rilevati sugli endpoint endocrini devono essere interpretati con cautela. Prova limite 26. Se uno studio orale, effettuato secondo le procedure descritte per il presente studio, con un livello di dosaggio di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o in caso di somministrazione con gli alimenti o l’acqua, a una concentrazione equivalente, non produce effetti tossici osservabili e se i dati relativi a sostanze di struttura analoga non indicano tossicità, si può considerare che non è necessario eseguire uno studio completo utilizzando diversi livelli di dosaggio. Si applica la prova limite, tranne quando l’esposizione umana indica la necessità di utilizzare un livello di dosaggio orale più elevato. Per altri tipi di somministrazione, ad esempio inalazione o applicazione cutanea, la concentrazione massima raggiungibile dipende in molti casi dalle proprietà fisico-chimiche delle sostanze chimiche da esaminare. Somministrazione delle dosi 27. Agli animali viene somministrata una dose giornaliera della sostanza chimica in esame sette giorni alla settimana. Se viene effettuata per via intragastrica, la somministrazione deve avvenire in dose singola mediante sonda gastrica o idonea cannula per intubazione. Il volume massimo di liquido che può essere somministrato in una sola volta dipende dalla taglia dell’animale. Il volume non deve superare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere somministrate in quantità pari a 2 ml/100 g di peso corporeo. Salvo nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l’aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da mantenere un volume costante per tutti i livelli di dosaggio. 28. Per le sostanze chimiche somministrate con la dieta o l’acqua da bere è importante impedire che la quantità della sostanza chimica in esame interferisca con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può utilizzare una concentrazione costante nella dieta (ppm) o un livello di dosaggio costante in funzione del peso corporeo di ciascun animale; la scelta di eventuali alternative va specificata. Nel caso di sostanze chimiche somministrate mediante sonda gastrica, la dose va somministrata ogni giorno all’incirca agli stessi orari e regolata almeno settimanalmente per mantenere un livello costante delle dosi rispetto al peso corporeo degli animali. Protocollo sperimentale 29. La somministrazione della sostanza a entrambi i sessi deve iniziare almeno due settimane prima dell’accoppiamento, dopo un periodo di acclimatazione di almeno cinque giorni e dopo avere osservato nelle femmine un ciclo estrale normale (durante un periodo di pre-trattamento di 2 settimane). Lo studio deve essere programmato in modo tale che la valutazione del ciclo estrale inizi subito dopo il raggiungimento della maturità sessuale completa da parte degli animali. Ciò può variare leggermente a seconda dei ceppi di ratti e dei laboratori, ad esempio 10 settimane per i ratti Sprague Dawley e circa 12 settimane per i ratti Wistar. Le femmine con prole devono essere soppresse il tredicesimo giorno dopo il parto o poco dopo. Il giorno della nascita (ossia quello in cui viene completato il parto) è il giorno 0 post-parto. Le femmine per le quali non vi sono prove di avvenuta copulazione sono soppresse 24-26 giorni dopo l’ultimo giorno del periodo di accoppiamento. La somministrazione della sostanza va continuata, in entrambi i sessi, durante il periodo di accoppiamento. Dopo tale periodo, la somministrazione deve proseguire per i maschi almeno fino al completamento del periodo di dosaggio totale minimo di 28 giorni. I maschi sono in seguito soppressi o, in alternativa, mantenuti in vita e continuano a ricevere la sostanza in esame ai fini di un eventuale secondo accoppiamento, ove ritenuto opportuno. 30. La somministrazione giornaliera delle dosi alle femmine riproduttrici va continuata per tutta la gravidanza e almeno fino al tredicesimo giorno dopo il parto o al giorno prima della soppressione incluso. Per gli studi in cui la sostanza chimica in esame è somministrata tramite inalazione o per via cutanea, la somministrazione deve proseguire almeno fino al diciannovesimo giorno di gestazione incluso e deve essere iniziata di nuovo appena possibile e comunque entro il quarto giorno dopo il parto (PND 4). 31. Un diagramma del calendario della prova è contenuto nell’appendice 2. Procedura di accoppiamento 32. Nel presente studio si utilizza normalmente il sistema di accoppiamento 1:1 (un maschio per una femmina). Possono essere previste eccezioni in caso di morte occasionale di esemplari maschi. Si deve mettere una femmina con lo stesso maschio fino a quando la copulazione è comprovata o sono trascorse due settimane. Ogni mattina le femmine devono essere esaminate per verificare la presenza di sperma o di tappi vaginali. Il giorno 0 della gravidanza è definito come il giorno in cui si riscontra la prova dell’avvenuta copulazione (presenza di un tappo vaginale o di sperma). Nel caso in cui l’accoppiamento non abbia successo, si può valutare la possibilità di far accoppiare le femmine con maschi di comprovata capacità riproduttiva dello stesso gruppo. Dimensioni della nidiata 33. Il quarto giorno dopo la nascita è possibile uniformare le dimensioni di ogni nidiata eliminando i piccoli in eccesso tramite selezione casuale, in modo da ottenere, nella misura del possibile, quattro o cinque piccoli per sesso per ciascuna nidiata, a seconda delle dimensioni normali della nidiata nei ceppi di ratti utilizzati. I campioni di sangue devono essere prelevati da due dei piccoli in eccedenza, raggruppati e utilizzati per determinare i livelli sierici di T4. L’eliminazione selettiva dei piccoli, ad esempio in base al peso corporeo o alla distanza anogenitale (AGD), non è opportuna. Ogni volta che il numero di piccoli maschi o femmine non permette di avere quattro o cinque animali di ciascun sesso per nidiata, è accettabile una regolazione parziale (ad esempio, sei maschi e quattro femmine). Se le dimensioni della nidiata scendono al di sotto della soglia di uniformazione (8 o 10 piccoli per ciascuna nidiata), nessun piccolo sarà eliminato. Qualora vi sia un solo piccolo al di sopra della soglia di uniformazione, esso sarà eliminato e utilizzato per prelevare il campione di sangue ai fini della determinazione dei livelli sierici di T4. 34. Se le dimensioni della nidiata non sono uniformate, si sacrificano due piccoli per nidiata il quarto giorno dopo la nascita e si prelevano campioni di sangue per valutare la concentrazione sierica degli ormoni tiroidei. Se possibile, nel selezionare i due piccoli per nidiata da sacrificare, scegliere due femmine per tenere da parte i maschi per la valutazione della retrazione del capezzolo, tranne nel caso in cui l’eliminazione di questi piccoli non lasci alcuna femmina per le valutazioni da effettuare al termine. Non bisogna eliminare alcun piccolo se vi sono meno di 8 o 10 piccoli per nidiata (a seconda delle dimensioni normali della nidiata nei ceppi di ratti utilizzati). Qualora vi sia un solo piccolo in più rispetto alle dimensioni normali della nidiata, un solo piccolo sarà eliminato e utilizzato per prelevare il campione di sangue ai fini della determinazione dei livelli sierici di T4. Osservazioni in vivo Osservazioni cliniche 35. Durante l’intero periodo della prova, le osservazioni cliniche generali vanno effettuate almeno una volta al giorno, con una frequenza maggiore se si constatano segni di tossicità. Le osservazioni devono essere effettuate preferibilmente ogni giorno alla stessa ora, tenendo conto del periodo probabile di massima intensità degli effetti dopo la somministrazione. Si devono registrare tutte le variazioni comportamentali pertinenti, i segni di parto difficile o prolungato e tutti i sintomi di tossicità, compresa la mortalità. Le registrazioni devono includere il momento dell’insorgenza, la gravità e la durata degli effetti tossici. Peso corporeo e consumo di cibo/acqua 36. I maschi e le femmine devono essere pesati il primo giorno della somministrazione, in seguito almeno settimanalmente, e al termine della somministrazione. Le femmine devono essere pesate durante la gravidanza i giorni 0, 7, 14 e 20 ed entro 24 ore dal parto (giorno 0 o 1 dopo il parto) e almeno il quarto e il tredicesimo giorno dopo il parto. Queste osservazioni vanno riportate singolarmente per ciascun animale adulto. 37. Durante il periodo precedente l’accoppiamento e durante la gravidanza e l’allattamento, l’assunzione di cibo deve essere misurata almeno una volta alla settimana. La misurazione dell’assunzione di cibo durante l’accoppiamento è facoltativa. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con acqua da bere, durante questi periodi va misurata anche l’assunzione di acqua. Cicli estrali 38. I cicli estrali devono essere monitorati prima dell’inizio del trattamento per selezionare per lo studio femmine aventi una ciclicità regolare (cfr. il paragrafo 22). Vanno monitorati anche gli strisci vaginali, ogni giorno dall’inizio del periodo di trattamento finché l’accoppiamento non risulti avvenuto. Se vi è il sospetto che effetti legati a forte stress all’inizio del trattamento possano alterare i cicli estrali, i laboratori possono esporre gli animali utilizzati nella prova per due settimane e quindi effettuare ogni giorno strisci vaginali per monitorare il ciclo estrale per almeno due settimane iniziando nel periodo precedente l’accoppiamento e proseguendo durante il periodo dell’accoppiamento finché quest’ultimo non risulti avvenuto. Durante il prelievo delle cellule vaginali/cervicali occorre prestare attenzione a non ledere la mucosa per evitare un’eventuale induzione di pseudogravidanza (7) (8). Parametri relativi alla progenie 39. La durata della gestazione deve essere registrata e calcolata dal giorno 0 di gravidanza. Ogni nidiata deve essere esaminata non appena possibile dopo il parto per stabilire il numero e il sesso dei piccoli, dei nati morti, dei nati vivi e degli esemplari più piccoli del normale (i piccoli di dimensioni molto inferiori ai corrispondenti piccoli di controllo) e la presenza di grosse anomalie. 40. Si procede a contare i piccoli vivi e a identificarne il sesso e a pesare le nidiate entro 24 ore dal parto (giorno 0 o 1 dopo il parto) e almeno il quarto e il tredicesimo giorno dopo il parto. Oltre a quanto osservato al paragrafo 35, deve essere registrato qualsiasi comportamento anomalo della prole. 41. Occorre misurare la distanza anogenitale (AGD) di ogni piccolo nello stesso giorno dalla nascita, tra il PND 0 e il PND 4. Il peso corporeo del piccolo va registrato il giorno in cui ne viene misurata l’AGD, che deve essere normalizzata in funzione della taglia, preferibilmente usando la radice cubica del peso corporeo (9). Va contato il numero di capezzoli/areole nei piccoli di sesso maschile il PND 12 o 13, come raccomandato nella linea guida n. 151 dell’OCSE (10). Biochimica clinica 42. Vanno prelevati campioni di sangue da un sito specifico in base al seguente programma: — da almeno due piccoli per nidiata il quarto giorno dopo la nascita, se il numero di piccoli lo consente (cfr. i paragrafi 33-34) — da tutte le madri e almeno due piccoli di 13 giorni per nidiata al termine dell’esperimento e — da tutti i maschi adulti, al termine dell’esposizione. Tutti i campioni di sangue vanno conservati in condizioni adeguate. Si procede alla valutazione della concentrazione sierica per gli ormoni tiroidei (T4) nei campioni di sangue dei piccoli di 13 giorni e degli adulti maschi. Se del caso, si effettua un’ulteriore valutazione dell’ormone T4 nei campioni di sangue delle madri e dei piccoli di 4 giorni. Se opportuno, si possono misurare facoltativamente anche i livelli di altri ormoni. I prelievi di sangue dei piccoli possono essere raggruppati per nidiata ai fini dell’analisi degli ormoni tiroidei. Gli ormoni tiroidei (T4 e TSH) sono misurati di preferenza come «totale». 43. I fattori seguenti possono influenzare la variabilità e le concentrazioni assolute delle analisi ormonali: — momento della soppressione, per via della variazione diurna delle concentrazioni ormonali; — metodi di soppressione, evitando di stressare inutilmente gli animali in quanto ciò potrebbe incidere sulle concentrazioni ormonali; — kit per le analisi ormonali che possono differire per le loro curve standard. 44. I campioni di plasma destinati specificatamente all’analisi ormonale devono essere prelevati nelle stesse ore della giornata. I valori numerici ottenuti dalle analisi delle concentrazioni ormonali differiscono in funzione dei kit disponibili in commercio utilizzati. Patologia Necroscopia macroscopica 45. Al momento della soppressione o del decesso durante lo studio va effettuato un esame macroscopico dei soggetti adulti alla ricerca di eventuali anomalie o alterazioni patologiche. Occorre prestare particolare attenzione agli organi dell’apparato riproduttivo e prendere nota del numero dei siti di impianto. Gli strisci vaginali devono essere esaminati al mattino il giorno della necroscopia per determinare lo stadio del ciclo estrale e consentire di stabilire correlazioni con l’istopatologia delle ovaie. 46. Testicoli ed epididimi, come pure l’insieme composto dalla prostata e dalle vescicole seminali con le ghiandole della coagulazione, di tutti i maschi adulti vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. Inoltre, si possono pesare facoltativamente altri organi, come l’insieme del muscolo elevatore dell’ano e del muscolo bulbocavernoso, le ghiandole bulbouretrali e il glande nei maschi e le due ovaie (peso a umido) e l’utero (compresa la cervice) nelle femmine; se effettuate, queste misurazioni facoltative devono avvenire subito dopo la dissezione. 47. I piccoli morti o soppressi il tredicesimo giorno dopo il parto, o poco dopo, devono essere sottoposti almeno a un attento esame esterno volto a individuare eventuali anomalie evidenti. Particolare attenzione deve essere dedicata all’apparato riproduttivo esterno, che va esaminato alla ricerca di eventuali alterazioni dello sviluppo. Il tredicesimo giorno bisogna conservare la tiroide di 1 piccolo maschio e di 1 piccolo femmina per nidiata. 48. Le ovaie, i testicoli, gli organi sessuali accessori (utero e cervice, epididimi, prostata, vescicole seminali con ghiandole di coagulazione), la tiroide e tutti gli organi degli animali adulti che presentano lesioni macroscopiche devono essere conservati. La fissazione in formalina è sconsigliata per l’esame di routine di testicoli ed epididimi. Un metodo accettabile per questi tessuti è l’uso del liquido fissativo di Bouin o del liquido fissativo di Davidson modificato (11). La tunica albuginea può essere perforata, con un ago, con delicatezza e superficialmente in entrambi i poli dell’organo per consentire la rapida penetrazione del fissativo. Esame istopatologico 49. Va eseguito un esame istologico dettagliato di ovaie, testicoli ed epididimi (con particolare attenzione alle fasi della spermatogenesi e dell’istopatologia della struttura delle cellule interstiziali dei testicoli) degli animali del gruppo cui viene somministrata la dose più elevata e del gruppo di controllo. Gli altri organi conservati, compresa la tiroide dei piccoli e degli animali adulti, possono essere esaminati se necessario. Il peso della tiroide può essere stabilito dopo la fissazione. Anche in questo caso l’ablazione deve essere eseguita con cautela e solo previa fissazione per evitare di danneggiare i tessuti. L’eventuale danneggiamento dei tessuti infatti potrebbe compromettere l’analisi istopatologica. Si procede a questi esami anche sugli animali degli altri gruppi trattati se nel gruppo cui viene somministrata la dose più elevata si osservano alterazioni. Il documento di orientamento sull’istopatologia (11) fornisce informazioni supplementari sulla dissezione, la fissazione, l’asportazione e l’istopatologia dei tessuti endocrini. DATI E RELAZIONE Dati 50. Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabella, evidenziando per ciascun gruppo di studio il numero di animali all’inizio della prova, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento di eventuali decessi o soppressioni, il numero di animali fertili, il numero di femmine gravide, il numero di animali che mostrano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, ivi compresi il momento dell’insorgenza, la durata e la gravità degli effetti tossici, i tipi di alterazioni istopatologiche, nonché tutti i dati di rilievo riguardanti le nidiate. Un formato tabulare di relazione sintetica che si è rivelato molto utile per la valutazione degli effetti sulla riproduzione/sullo sviluppo è contenuto nell’appendice 3. 51. Tenuto conto della portata ridotta dello studio, le analisi statistiche sotto forma di prove intese ad accertare la «significatività» dei risultati hanno un valore limitato per molti endpoint, soprattutto quelli riproduttivi. Se si ricorre ad analisi statistiche, il metodo scelto deve essere adatto alla distribuzione della variabile esaminata e selezionato prima di iniziare lo studio. L’analisi statistica dell’AGD e della retrazione del capezzolo deve essere basata sui dati individuali dei piccoli, tenendo conto degli effetti sulle nidiate. Se opportuno, utilizzare la nidiata come unità di analisi. L’analisi statistica del peso corporeo dei piccoli deve essere basata sui dati individuali dei piccoli, tenendo conto delle dimensioni della nidiata. A causa delle dimensioni ridotte del gruppo, può essere utile anche rifarsi ad eventuali dati di controllo storici (ad esempio, per le dimensioni della nidiata) per facilitare l’interpretazione dei dati emersi dallo studio. Valutazione dei risultati 52. I risultati del presente studio di tossicità vanno valutati in base agli effetti osservati e ai risultati della necroscopia e dell’esame microscopico. La valutazione deve includere il rapporto fra la dose della sostanza chimica in esame e la presenza o l’assenza, l’incidenza e la gravità delle anomalie, comprese eventuali lesioni macroscopiche, gli organi bersaglio identificati, l’infertilità, le anomalie cliniche, la capacità riproduttiva, gli effetti sulla generazione successiva, le alterazioni del peso corporeo, gli effetti sulla mortalità ed eventuali altri effetti tossici. 53. Tenuto conto del breve periodo di trattamento del maschio, l’istopatologia dei testicoli e degli epididimi deve essere considerata insieme ai dati sulla fertilità nel quadro della valutazione degli effetti sulla riproduzione del maschio. Può essere utile anche utilizzare eventuali dati di controllo storici sulla riproduzione/lo sviluppo (ad esempio per le dimensioni della nidiata, l’AGD, la retrazione del capezzolo, i livelli sierici di T4) per facilitare l’interpretazione dello studio. 54. Ai fini del controllo di qualità, si suggerisce di raccogliere dati di controllo storici e di calcolare i coefficienti di variazione per i dati numerici, in particolare per i parametri legati all’individuazione degli interferenti endocrini. Questi dati possono essere utilizzati, a fini di confronto, in fase di valutazione degli studi effettivamente realizzati. Relazione sull’esecuzione della prova 55. La relazione sull’esecuzione della prova deve comprendere le seguenti informazioni: Sostanza chimica in esame: — origine, numero di lotto, data limite per l’uso, se disponibili; — stabilità della sostanza chimica in esame, se nota; Sostanza monocostituente: — aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche; — dati di identificazione chimica: denominazioni IUPAC o CAS, numero CAS, codice SMILES o InChI, formula strutturale, purezza, identità chimica delle impurezze, se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono, ecc.; Sostanza multicostituente, UVCB e miscele: — caratterizzate nella massima misura possibile con l’identità chimica (cfr. sopra), con la presenza quantitativa e con le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti; Mezzo disperdente (se del caso): — giustificazione per la scelta del mezzo disperdente utilizzato, se diverso dall’acqua; Animali utilizzati nella prova: — specie/ceppo impiegati; — numero, età e sesso degli animali; — origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.; — peso di ciascun animale all’inizio della prova; — qualora non siano stati utilizzati ratti, spiegazione del motivo; Condizioni sperimentali: — criteri di selezione delle dosi; — informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza chimica in esame/preparazione della dieta, sulle concentrazioni finali, sulla stabilità e sull’omogeneità del preparato; — modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame; — se del caso, conversione della concentrazione della sostanza nella dieta o nell’acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno); — dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua; — descrizione dettagliata del protocollo di randomizzazione utilizzato per selezionare gli eventuali piccoli da sopprimere; Risultati: — peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo; — assunzione di cibo ed eventualmente di acqua; — dati sulla risposta tossica per sesso e per dose, compresi i dati sulla fertilità, la gestazione ed eventuali altri sintomi di tossicità; — durata della gestazione, — effetti tossici o di altro tipo sulla riproduzione, sulla prole, sulla crescita postnatale, ecc.; — natura, gravità e durata dei segni clinici (sia reversibili che non reversibili); — numero di femmine adulte con ciclo estrale normale o anomalo e durata del ciclo; — numero di nati vivi e di perdite post-impianto; — dati relativi al peso corporeo dei piccoli; — AGD di tutti i piccoli (e peso corporeo il giorno della misurazione dell’AGD); — retrazione del capezzolo nei piccoli di sesso maschile; — livelli degli ormoni tiroidei, piccoli di 13 giorni e maschi adulti (e madri e piccoli di 4 giorni se sottoposti a misurazione); — numero di piccoli con anomalie evidenti, valutazione macroscopica degli organi genitali esterni, numero di esemplari più piccoli del normale; — momento del decesso durante lo studio o indicazione della sopravvivenza degli animali alla conclusione della prova; — numero di impianti e dimensioni e peso della nidiata al momento della registrazione; — peso corporeo al momento della soppressione e dati sul peso degli organi negli animali genitori; — risultati della necroscopia; — descrizione dettagliata dei risultati istopatologici; — dati sull’assorbimento (se disponibili); — elaborazione statistica dei risultati, se del caso. Discussione dei risultati Conclusioni Interpretazione dei risultati 56. Lo studio fornirà valutazioni della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo associata alla somministrazione di dosi ripetute (cfr. i paragrafi 5 e 6). Esso può fornire indicazioni sulla necessità di condurre ulteriori indagini e fornisce orientamenti in merito alla progettazione di studi successivi. Si consulti il documento di orientamento n. 43 dell’OCSE per indicazioni sull’interpretazione dei risultati in merito alla riproduzione e allo sviluppo (12). Il documento di orientamento n. 106 dell’OCSE sulla valutazione istologica delle prove endocrine e sulla riproduzione nei roditori (11) fornisce informazioni sulla preparazione e la valutazione degli organi (endocrini) e degli strisci vaginali che possono essere utili per questa linea guida. BIBLIOGRAFIA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic and Cooperation and Development, Paris. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Appendice 1 DEFINIZIONI (CFR. ANCHE LA LINEA GUIDA N. 150 DELL'OCSE (6)) Androgenicità: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone androgenico naturale (ad es. il testosterone) in un mammifero. Antiandrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di inibire l'attività di un ormone androgenico naturale (ad es. il testosterone) in un mammifero. Antiestrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di inibire l'attività di un ormone estrogenico naturale (ad es. l'estradiolo 17ß) in un mammifero. Attività antitiroidea: la capacità di una sostanza chimica di inibire l'attività di un ormone tiroideo naturale (ad es. T3) in un mammifero. Sostanza chimica: una sostanza o una miscela. Tossicità per lo sviluppo: la manifestazione della tossicità per la riproduzione, che risulta in disturbi prenatali, perinatali, postnatali, strutturali o funzionali nella progenie. Dosaggio: termine generale che ricomprende la dose, la frequenza e la durata della somministrazione. Dose: quantità di sostanza chimica somministrata. La dose è espressa come peso della sostanza chimica in esame per unità di peso corporeo dell'animale utilizzato nella prova per giorno (mg/kg peso corporeo/giorno) o come una concentrazione costante nella dieta. Tossicità evidente: termine generale che designa i segnali evidenti di tossicità a seguito della somministrazione di una sostanza chimica. Questi segni devono essere sufficienti per consentire la valutazione dei pericoli ed essere tali che si possa prevedere che l'aumento della dose somministrata comporti la comparsa di segni di tossicità grave e probabilmente la mortalità. Compromissione della fertilità: i disturbi delle funzioni o della capacità riproduttive maschili o femminili. Tossicità materna: gli effetti nocivi sulle femmine gravide, che si verificano in modo specifico (effetto diretto) o non specifico (effetto indiretto). NOAEL: l'abbreviazione di no-observed-adverse-effect level, ossia la dose più elevata alla quale non si osservano effetti avversi legati al trattamento. Estrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone estrogenico naturale (ad es. l'estradiolo 17ß) in un mammifero. Tossicità della riproduzione: gli effetti nocivi sulla progenie e/o la compromissione delle funzioni o della capacità riproduttive maschili e femminili. Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. Attività tiroidea: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone tiroideo naturale (ad es. T3) in un mammifero. Validazione: processo scientifico destinato a caratterizzare i requisiti e i limiti operativi di un metodo di prova e a dimostrarne l'affidabilità e la pertinenza per un fine specifico. Appendice 2 DIAGRAMMA DEL PROTOCOLLO SPERIMENTALE INDICANTE LA DURATA MASSIMA DELLO STUDIO, BASATO SU UN PERIODO DI ACCOPPIAMENTO COMPLETO DI 14 GIORNI Appendice 3 RELAZIONE SINTETICA IN FORMATO TABULARE DEGLI EFFETTI SULLA RIPRODUZIONE/SULLO SVILUPPO OSSERVAZIONI VALORI Dosaggio (unità) 0 (controllo) ... ... ... ... Coppie formate (N) Ciclo estrale (almeno durata media e frequenza dei cicli irregolari) Femmine per le quali la copulazione risulta avvenuta (N) Femmine gravide (N) Giorni di concepimento 1 - 5 (N) Giorni di concepimento 6 -...( (21) ) (N) Gravidanza ≤ 21 giorni (N) Gravidanza = 22 giorni (N) Gravidanza ≥ 23 giorni (N) Madri che hanno partorito piccoli vivi (N) Madri con piccoli vivi il quarto giorno dopo il parto (N) Impianti/madre (media) Piccoli vivi/madre alla nascita (media) Piccoli vivi/madre al quarto giorno (media) Rapporto numerico tra i sessi (m/f) alla nascita (media) Rapporto numerico tra i sessi (m/f) al quarto giorno (media) Peso della nidiata alla nascita (media) Peso della nidiata al quarto giorno (media) Peso dei piccoli alla nascita (media) Peso dei piccoli al momento della misurazione dell'AGD (media maschi, media femmine) AGD dei piccoli misurata lo stesso giorno dalla nascita, tra la nascita e il giorno 4 (media maschi, media femmine, prendere nota del PND) Peso dei piccoli al quarto giorno (media) Retrazione del capezzolo dei piccoli maschi al tredicesimo giorno (media) Peso dei piccoli al tredicesimo giorno (media) PICCOLI CON ANOMALIE Madri con 0 Madri con 1 Madri con ≥ 2 PERDITA DELLA PROGENIE Perdite prenatali/dopo l'impianto (impianti meno piccoli nati vivi) Femmine con 0 Femmine con 1 Femmine con 2 Femmine con ≥ 3 Perdite postnatali (piccoli nati vivi meno piccoli vivi il tredicesimo giorno dopo il parto) Femmine con 0 Femmine con 1 Femmine con 2 Femmine con ≥ 3 B.64 STUDIO DI TOSSICITÀ CON DOSE RIPETUTA COMBINATO CON LA PROVA DI SCREENING DELLA TOSSICITÀ PER LA RIPRODUZIONE/LO SVILUPPO INTRODUZIONE 1. Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida n. 422 dell’OCSE (2016). Le linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche sono periodicamente rivedute e aggiornate alla luce del progresso scientifico. La linea guida n. 422 sulla prova di screening è stata adottata inizialmente nel 1996, sulla base di un protocollo per una «prova di screening della tossicità con dose ripetuta combinata con una prova di screening della tossicità per la riproduzione e lo sviluppo» di cui si è discusso nell’ambito di due riunioni di esperti, a Londra nel 1990 (1) e a Tokyo nel 1992 (2). 2. Il presente metodo di prova consta di una parte in cui è effettuato uno screening della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo, basata sull’esperienza acquisita negli Stati membri attraverso l’utilizzo del metodo originario con le sostanze chimiche esistenti a elevato volume di produzione e la conduzione di prove esplorative con sostanze utilizzate come controllo positivo (3) (4), e di una parte in cui viene esaminata la tossicità mediante prove con dosi ripetute, conformemente alla linea guida per le prove n. 407 dell’OCSE (studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 28 giorni sui roditori, corrispondente al capitolo B.7 del presente allegato). 3. Il presente metodo di prova è stato aggiornato mediante l’aggiunta di endpoint pertinenti per il rilevamento di interferenti endocrini, come seguito all’attività ad alta priorità avviata dall’OCSE nel 1998 volta a rivedere le linee guida esistenti e a elaborarne di nuove, per lo screening e la sperimentazione relativi a potenziali interferenti endocrini (5). In tale contesto, la linea guida n. 407 dell’OCSE (che corrisponde al capitolo B.7 del presente allegato) è stata migliorata nel 2008 mediante l’aggiunta di parametri adatti per l’individuazione dell’attività endocrina delle sostanze chimiche in esame. La linea guida n. 422 è stata aggiornata con l’intento di includere gli endpoint pertinenti per il rilevamento di interferenti endocrini nelle linee guida in cui i periodi di esposizione coprono alcuni dei periodi sensibili dello sviluppo (i periodi precedenti o immediatamente successivi alla nascita). 4. Gli ulteriori endpoint pertinenti per il rilevamento di interferenti endocrini selezionati, che fanno parte anche della linea guida n. 443 (studio esteso di tossicità per la riproduzione su una generazione, corrispondente al capitolo B.56 del presente allegato), sono stati aggiunti alla linea guida n. 422 sulla base di uno studio di fattibilità riguardante questioni scientifiche e tecniche relative alla loro inclusione, come pure gli eventuali adattamenti del disegno sperimentale necessari per la loro inclusione (6). 5. Il presente metodo di prova è inteso a generare informazioni limitate concernenti gli effetti delle sostanze chimiche in esame sulla capacità riproduttiva maschile e femminile, quali la funzione delle gonadi, il comportamento in fase di accoppiamento, il concepimento, lo sviluppo dell’organismo concepito e il parto. Esso non rappresenta un’alternativa ai metodi di prova esistenti B.31, B.34, B.35 e B.56, né li sostituisce. CONSIDERAZIONI INIZIALI 6. Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossiche di una sostanza chimica è possibile determinare la tossicità orale utilizzando dosi ripetute dopo aver ottenuto dati preliminari sulla tossicità mediante prove di tossicità acuta. Il presente studio fornisce informazioni sui rischi che l’esposizione ripetuta per un periodo di tempo relativamente limitato può comportare per la salute. Il metodo prevede uno studio di base della tossicità a dosi ripetute che può essere utilizzato per le sostanze chimiche per le quali uno studio di 90 giorni non si giustifica (ad esempio quando il volume di produzione non supera determinate quantità) o prima di uno studio a lungo termine. Durante lo svolgimento dello studio è opportuno seguire i principi guida e le considerazioni di cui al documento di orientamento dell’OCSE n. 19, Recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (7). 7. Esso comprende inoltre una prova di screening della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo e, pertanto, può essere utilizzato anche per fornire informazioni iniziali sui possibili effetti sulla capacità riproduttiva maschile e femminile, quali la funzione delle gonadi, il comportamento in fase di accoppiamento, il concepimento, lo sviluppo dell’organismo concepito e il parto, nella fase iniziale di valutazione delle proprietà tossicologiche delle sostanze chimiche o nella valutazione di sostanze potenzialmente pericolose. Il presente metodo di prova non fornisce informazioni complete su tutti gli aspetti della riproduzione e dello sviluppo. In particolare, esso offre solo mezzi limitati per individuare manifestazioni postnatali di un’esposizione prenatale o effetti eventualmente riconducibili a un’esposizione postnatale. Tenuto conto (tra le altre cose) della selettività degli endpoint e della breve durata dello studio, il presente metodo non fornisce prove sufficienti per trarre conclusioni definitive circa l’assenza di effetti sulla riproduzione o lo sviluppo. Inoltre, in assenza di dati desunti da altre prove di tossicità per la riproduzione/lo sviluppo, risultati positivi sono utili per una valutazione iniziale dei pericoli e permettono di prendere decisioni circa la necessità di procedere a ulteriori prove e i tempi per effettuarle. 8. I risultati ottenuti per quanto riguarda i parametri endocrini devono essere interpretati alla luce del «Quadro concettuale dell’OCSE per le prove e la valutazione delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino» (8). La linea guida migliorata dell’OCSE n. 422 fa parte del livello 4 di questo quadro concettuale come saggio in vivo in grado di fornire dati sugli effetti nocivi sugli endpoint pertinenti per il sistema endocrino. Un segnale endocrino potrebbe tuttavia non essere considerato di per sé una prova sufficiente ad attestare che la sostanza chimica in esame è un interferente endocrino. 9. Il presente metodo di prova attribuisce inoltre particolare importanza agli effetti neurologici in quanto parametro specifico di valutazione e comporta la necessità di un’accurata osservazione clinica degli animali per ottenere il maggior numero possibile di informazioni. Tale metodo è finalizzato all’individuazione di sostanze chimiche dotate di un potenziale neurotossico, che potranno successivamente richiedere indagini più approfondite al riguardo. Inoltre, il metodo può fornire anche un’indicazione di base degli effetti immunologici. 10. In assenza di dati desunti da altri studi sulla tossicità sistemica, la tossicità per la riproduzione/lo sviluppo, la neurotossicità e/o l’immunotossicità, risultati positivi sono utili per una valutazione iniziale dei pericoli e permettono di prendere decisioni circa la necessità di procedere a ulteriori prove e i tempi per effettuarle. La prova può essere particolarmente utile nell’ambito delle serie di dati di informazione di monitoraggio dell’OCSE per la valutazione delle sostanze chimiche esistenti per le quali le informazioni tossicologiche sono scarse o inesistenti e può essere utilizzata come alternativa alla conduzione di due prove distinte, rispettivamente per la tossicità a dosi ripetute (linea guida n. 407 dell’OCSE, corrispondente al capitolo B.7 del presente allegato) e la tossicità per la riproduzione/lo sviluppo (linea guida n. 421 dell’OCSE, corrispondente al capitolo B.63 del presente allegato). Può essere utilizzata anche come studio di determinazione degli intervalli di dosaggio per studi più approfonditi sulla riproduzione o sullo sviluppo o in altri casi in cui sia ritenuto opportuno. 11. In genere, si presuppone che vi siano differenze a livello di sensibilità tra le femmine gravide e quelle non gravide. Di conseguenza, rispetto alla conduzione di prove distinte, in questa prova combinata può essere più complicato determinare i livelli di dosaggio adeguati per valutare sia la tossicità sistemica generale sia la tossicità specifica per la riproduzione/lo sviluppo. Inoltre, rispetto alla conduzione di uno studio a dosi ripetute, l’interpretazione dei risultati della prova per quanto riguarda la tossicità sistemica generale può essere più difficile, soprattutto quando i parametri sierici e istopatologici non sono valutati contemporaneamente nello studio. A causa di queste complessità tecniche, per eseguire questa prova di screening combinata è richiesta molta esperienza nella conduzione di prove di tossicità. Dall’altro lato, oltre a coinvolgere un numero inferiore di animali, la prova combinata può consentire di distinguere meglio gli effetti diretti sulla riproduzione/lo sviluppo da quelli secondari rispetto ad altri effetti (sistemici). 12. Il periodo di esposizione di questa prova è più lungo rispetto a quello di un convenzionale studio a dosi ripetute di 28 giorni. Tuttavia, il numero di animali di ciascun sesso per gruppo è inferiore a quello utilizzato nel caso di un convenzionale studio a dosi ripetute di 28 giorni condotto in aggiunta a una prova di screening della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo. 13. Il presente metodo di prova prevede la somministrazione orale della sostanza chimica da esaminare. Potrebbero essere necessarie modifiche in caso di utilizzo di altre vie di somministrazione. 14. Prima di applicare il presente metodo di prova a una miscela per generare dati ai fini regolamentari previsti, si deve considerare se, e in caso affermativo, perché, esso possa fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie laddove esista una disposizione normativa che obblighi a sottoporre a prova la miscela. 15. L’appendice 1 contiene le definizioni dei termini utilizzati. PRINCIPIO DELLA PROVA 16. La sostanza chimica in esame viene somministrata in dosi graduate a diversi gruppi di maschi e femmine. Ai maschi le dosi devono essere somministrate per almeno quattro settimane e fino al giorno precedente alla soppressione programmata, compreso tale giorno (tale periodo comprende un minimo di due settimane prima dell’accoppiamento, il tempo dell’accoppiamento e circa due settimane dopo l’accoppiamento). Tenuto conto della breve durata del periodo di esposizione prima dell’accoppiamento nei maschi, la fertilità potrebbe non essere un particolare indicatore di sensibilità per la tossicità testicolare. È pertanto essenziale un esame istologico particolareggiato delle prove. La combinazione di un periodo di esposizione di due settimane prima dell’accoppiamento (seguito da osservazioni sull’accoppiamento e la fertilità) e di un periodo di esposizione complessivo di almeno quattro settimane (seguito da un dettagliato esame istopatologico delle gonadi maschili) è considerata sufficiente a consentire l’individuazione della maggior parte degli effetti sulla fertilità maschile e sulla spermatogenesi. 17. Alle femmine la sostanza va somministrata durante l’intero studio. Tale periodo comprende due settimane prima dell’accoppiamento (con l’obiettivo di coprire almeno due cicli estrali completi), l’intervallo variabile che precede il concepimento, la durata della gestazione e almeno tredici giorni dopo il parto, fino al giorno precedente alla soppressione programmata, compreso tale giorno. 18. La durata dello studio, dopo l’acclimatazione e la valutazione del ciclo estrale precedente la somministrazione, dipende dal comportamento della femmina ed è di circa 63 giorni [almeno 14 giorni prima dell’accoppiamento, un massimo di 14 giorni per l’accoppiamento, 22 giorni di gestazione, 13 giorni di allattamento]. 19. Durante il periodo di somministrazione gli animali vengono esaminati attentamente e quotidianamente al fine di rilevare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono sottoposti a necroscopia; al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia. DESCRIZIONE DEL METODO Selezione della specie animale 20. Il presente metodo di prova è destinato ad essere utilizzato con i ratti. Se i parametri specificati nella presente linea guida n. 422 sono studiati in un’altra specie di roditori occorre fornire una giustificazione dettagliata. Nel programma internazionale di validazione per l’individuazione degli interferenti endocrini nella linea guida n. 407 il ratto è stata l’unica specie animale utilizzata. Non vanno usati ceppi a bassa fecondità o con nota elevata incidenza di difetti dello sviluppo. Si devono utilizzare animali vergini sani, non sottoposti in precedenza a esperimenti. Gli animali utilizzati nella prova devono essere caratterizzati quanto alle specie, al ceppo, al sesso, al peso e all’età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali utilizzati deve essere minima e non superare il 20 % circa del peso medio di ciascun sesso. Per gli studi preliminari a studi a lungo termine o effettuati su un’intera generazione, è preferibile ricorrere in entrambi gli studi ad animali dello stesso ceppo e della stessa provenienza. Condizioni di stabulazione e alimentazione 21. Tutte le procedure devono attenersi agli standard locali in materia di cura degli animali da esperimento. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). L’umidità relativa deve essere non inferiore al 30 % e, preferibilmente, non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia dei locali. L’illuminazione deve essere artificiale, con un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua da bere. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della sostanza chimica in esame, se quest’ultima è somministrata con il cibo. 22. Gli animali devono essere sistemati nelle gabbie in piccoli gruppi dello stesso sesso; possono essere sistemati in gabbie individuali se necessario per ragioni scientifiche. Ciascuna gabbia non deve ospitare più di cinque animali. L’accoppiamento va effettuato in gabbie adeguate allo scopo. Le femmine gravide devono essere tenute in gabbie individuali e rifornite di materiale per la costruzione della tana. Le femmine che allattano vanno poste in gabbie individuali insieme alla prole. 23. L’alimentazione deve essere analizzata periodicamente per verificare la presenza di contaminanti. Un campione del mangime somministrato deve essere conservato fino al completamento della relazione. Preparazione degli animali 24. Vengono scelti a caso soggetti giovani adulti destinati ai gruppi di trattamento e alle gabbie. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali vanno identificati inequivocabilmente e acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni prima dell’inizio dello studio. Preparazione delle dosi 25. Si raccomanda di somministrare la sostanza chimica in esame per via orale, a meno che non si considerino più appropriate altre vie di somministrazione. Se si sceglie la via orale, la sostanza chimica è generalmente somministrata mediante sonda gastrica; tuttavia, in alternativa, può essere somministrata anche con la dieta o l’acqua da bere. 26. Ove necessario, la sostanza in esame è disciolta o sospesa in un mezzo disperdente adeguato. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/sospensione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri mezzi disperdenti. Le caratteristiche tossiche dei mezzi disperdenti non acquosi devono essere note. È necessario determinare la stabilità e l’omogeneità della sostanza chimica in esame nel mezzo disperdente. PROCEDURA Numero e sesso degli animali 27. Si raccomanda di costituire gruppi di almeno 10 maschi e 12-13 femmine. Nella fase pre-esposizione si procede alla valutazione della ciclicità estrale nelle femmine e gli animali che non presentano un ciclo tipico di 4-5 giorni non sono inclusi nello studio; si raccomanda pertanto di utilizzare un numero supplementare di femmine per ottenere 10 femmine per ciascun gruppo. Eccetto i casi in cui gli effetti tossici sono notevoli, si dovrebbero ottenere per ciascun gruppo almeno 8 femmine gravide, che generalmente è il numero minimo accettabile. Lo scopo è ottenere un numero di gravidanze e nidiate che consenta una valutazione significativa del potenziale della sostanza chimica in esame di influire negativamente sulla fertilità, sulla gravidanza, sul comportamento materno, sulla suzione, sulla crescita e sullo sviluppo della progenie F 1 , dal concepimento al tredicesimo giorno dopo il parto. Qualora si preveda di sacrificare a intervalli intermedi alcuni animali, il numero va aumentato del numero di animali che si prevede di sacrificare prima del completamento dello studio. Si può considerare di includere un gruppo satellite supplementare di cinque animali (5 per sesso) nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato con la dose più elevata al fine di monitorare la reversibilità, la persistenza o l’insorgenza ritardata di effetti tossici sistemici, per almeno 14 giorni dopo il trattamento. Gli animali del gruppo satellite non vengono fatti accoppiare e, di conseguenza, non sono utilizzati ai fini della valutazione della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo. Dosaggio 28. Si utilizzano generalmente almeno tre gruppi da trattare e un gruppo di controllo. Per stabilire le dosi da utilizzare, in mancanza di dati adeguati relativi alla tossicità in generale si può effettuare uno studio preliminare di tipo range finding . Fatta eccezione per la somministrazione della sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo devono essere trattati in modo identico agli esemplari dei gruppi sottoposti al trattamento. Se si usa un mezzo disperdente per la somministrazione della sostanza chimica in esame, al gruppo di controllo verrà somministrato il medesimo mezzo disperdente nel volume massimo utilizzato. 29. I livelli di dosaggio devono essere selezionati tenendo conto di tutti i dati disponibili sulla tossicità e le caratteristiche (tossico-)cinetiche. Bisogna inoltre tener conto del fatto che potrebbero esserci differenze di sensibilità tra le femmine gravide e quelle non gravide. Il livello massimo di dosaggio deve essere tale da indurre effetti tossici senza cagionare la morte o sofferenze gravi. Sarà inoltre definita una serie decrescente di dosaggi al fine di individuare eventuali risposte a dosi determinate e dimostrare l’assenza di effetti avversi al dosaggio minimo. Per la determinazione dei livelli di dose decrescenti risulta spesso ottimale applicare un fattore di divisione compreso tra due e quattro; è comunque preferibile aggiungere un quarto gruppo di studio piuttosto che avere uno scarto eccessivo (ad esempio superiore a un fattore 10) tra un dosaggio e l’altro. 30. Nel caso di tossicità generale osservata (ad es. riduzione del peso corporeo, effetti a livello epatico, cardiaco, polmonare o renale ecc.) o di altri cambiamenti che potrebbero non essere dovuti ad effetti tossici (ad es. diminuzione dell’assunzione di alimenti, dilatazione del fegato), gli effetti rilevati sugli endpoint endocrini devono essere interpretati con cautela. Prova limite 31. Qualora uno studio orale, effettuato in conformità con il metodo descritto, con un livello di dosaggio di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o, in caso di somministrazione con gli alimenti o l’acqua, ad una concentrazione equivalente (in funzione del peso corporeo), non produca effetti tossici osservabili e se i dati relativi a sostanze di struttura analoga non indicano tossicità, si può ritenere non necessario uno studio completo con diversi dosaggi. La prova limite va effettuata, tranne quando i dati sull’esposizione umana indicano la necessità di utilizzare un livello di dosaggio più elevato. Per altri tipi di somministrazione, ad esempio per inalazione o applicazione cutanea, il livello massimo di esposizione realizzabile dipende in molti casi dalle proprietà fisico-chimiche delle sostanze chimiche da esaminare. Somministrazione delle dosi 32. Agli animali viene somministrata una dose giornaliera della sostanza chimica in esame sette giorni alla settimana. Se viene effettuata per via intragastrica, la somministrazione deve avvenire in dose singola mediante sonda gastrica o idonea cannula per intubazione. Il volume massimo di liquido che può essere somministrato in una sola volta dipende dalla taglia dell’animale. Il volume non deve superare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere somministrate in quantità pari a 2 ml/100 g di peso corporeo. Salvo nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l’aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da mantenere un volume costante per tutti i livelli di dosaggio. 33. Per le sostanze chimiche somministrate con la dieta o l’acqua da bere è importante impedire che la quantità della sostanza chimica in esame interferisca con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può utilizzare una concentrazione costante nella dieta (ppm) o un livello di dosaggio costante in funzione del peso corporeo di ciascun animale; la scelta di eventuali alternative va specificata. Nel caso di sostanze chimiche somministrate mediante sonda gastrica, la dose va somministrata ogni giorno all’incirca agli stessi orari e regolata almeno settimanalmente per mantenere un livello costante delle dosi rispetto al peso corporeo degli animali. Se lo studio combinato è preliminare a uno studio sulla tossicità a lungo termine o a uno studio effettuato su un’intera generazione, occorre utilizzare una dieta simile in entrambi gli studi. Protocollo sperimentale 34. La somministrazione della sostanza a entrambi i sessi deve iniziare due settimane prima dell’accoppiamento, dopo un periodo di acclimatazione di almeno cinque giorni e dopo avere osservato nelle femmine un ciclo estrale normale (durante un periodo di pre-trattamento di 2 settimane). Lo studio deve essere programmato in modo tale che la valutazione del ciclo estrale inizi subito dopo il raggiungimento della maturità sessuale completa da parte degli animali. Ciò può variare leggermente a seconda dei ceppi di ratti e dei laboratori, ad esempio 10 settimane per i ratti Sprague Dawley e circa 12 settimane per i ratti Wistar. Le femmine con prole devono essere soppresse il tredicesimo giorno dopo il parto o poco dopo. Per consentire il digiuno notturno delle madri prima del prelievo di sangue (se si preferisce tale opzione), non è necessario sopprimere le madri e la loro progenie lo stesso giorno. Il giorno della nascita (ossia quello in cui viene completato il parto) è il giorno 0 post-parto. Le femmine per le quali non vi sono prove di avvenuta copulazione sono soppresse 24-26 giorni dopo l’ultimo giorno del periodo di accoppiamento. La somministrazione della sostanza va continuata, in entrambi i sessi, durante il periodo di accoppiamento. Dopo tale periodo, la somministrazione deve proseguire per i maschi almeno fino al completamento del periodo di dosaggio totale minimo di 28 giorni. I maschi sono in seguito soppressi o mantenuti in vita e continuano a ricevere la sostanza in esame ai fini di un eventuale secondo accoppiamento, ove ritenuto opportuno. 35. La somministrazione giornaliera delle dosi alle femmine riproduttrici va continuata per tutta la gravidanza e almeno fino al tredicesimo giorno dopo il parto o al giorno prima della soppressione incluso. Per gli studi in cui la sostanza chimica in esame è somministrata tramite inalazione o per via cutanea, la somministrazione deve proseguire almeno fino al diciannovesimo giorno di gestazione incluso e deve essere iniziata di nuovo appena possibile e comunque entro il quarto giorno dalla nascita (PND 4). 36. Gli animali del gruppo satellite destinati al monitoraggio di follow-up, se inclusi, non vengono fatti accoppiare. Essi devono essere esaminati per almeno altri 14 giorni dopo la prima soppressione pianificata delle madri, senza alcun trattamento, al fine di individuare l’insorgenza tardiva, la persistenza o la scomparsa degli effetti tossici. 37. Un diagramma del calendario della prova è contenuto nell’appendice 2. Cicli estrali 38. I cicli estrali devono essere monitorati prima dell’inizio del trattamento per selezionare per lo studio femmine aventi una ciclicità regolare (cfr. il paragrafo 27). Vanno monitorati anche gli strisci vaginali, ogni giorno dall’inizio del periodo di trattamento finché l’accoppiamento non risulti avvenuto. Se vi è il sospetto che effetti legati a forte stress all’inizio del trattamento possano alterare i cicli estrali, i laboratori possono esporre gli animali utilizzati nella prova per due settimane e quindi effettuare ogni giorno strisci vaginali per monitorare il ciclo estrale per almeno due settimane iniziando nel periodo precedente l’accoppiamento e proseguendo durante il periodo dell’accoppiamento finché quest’ultimo non risulti effettuato. Durante il prelievo delle cellule vaginali/cervicali occorre prestare attenzione a non ledere la mucosa per evitare un’eventuale induzione di pseudogravidanza (8) (9). Procedura di accoppiamento 39. Nel presente studio si utilizza normalmente il sistema di accoppiamento 1:1 (un maschio per una femmina). Possono essere previste eccezioni in caso di morte occasionale di esemplari maschi. Si deve mettere una femmina con lo stesso maschio fino a quando la copulazione è comprovata o sono trascorse due settimane. Ogni mattina le femmine devono essere esaminate per verificare la presenza di sperma o di tappi vaginali. Il giorno 0 della gravidanza è definito come il giorno in cui si riscontra la prova dell’avvenuta copulazione (presenza di un tappo vaginale o di sperma). Nel caso in cui l’accoppiamento non abbia successo, si può valutare la possibilità di far accoppiare le femmine con maschi di comprovata capacità riproduttiva dello stesso gruppo. Dimensioni della nidiata 40. Il quarto giorno dopo la nascita è possibile uniformare le dimensioni di ogni nidiata eliminando i piccoli in eccesso tramite selezione casuale, in modo da ottenere, nella misura del possibile, quattro o cinque piccoli per sesso per ciascuna nidiata, a seconda delle dimensioni normali della nidiata nei ceppi di ratti utilizzati. I campioni di sangue devono essere prelevati da due dei piccoli in eccedenza, raggruppati e utilizzati per determinare i livelli sierici di T4. L’eliminazione selettiva dei piccoli, ad esempio in base al peso corporeo o alla distanza anogenitale (AGD), non è opportuna. Ogni volta che il numero di piccoli maschi o femmine non permette di avere quattro o cinque animali di ciascun sesso per nidiata, è accettabile una regolazione parziale (ad esempio, sei maschi e quattro femmine). Se le dimensioni della nidiata scendono al di sotto della soglia di uniformazione (8 o 10 piccoli per ciascuna nidiata), nessun piccolo sarà eliminato. Qualora vi sia un solo piccolo al di sopra della soglia di uniformazione, esso sarà eliminato e utilizzato per prelevare il campione di sangue ai fini della determinazione dei livelli sierici di T4. 41. Se le dimensioni della nidiata non sono uniformate, si sacrificano due piccoli per nidiata il quarto giorno dopo la nascita e si prelevano campioni di sangue per valutare la concentrazione sierica degli ormoni tiroidei. Se possibile, nel selezionare i due piccoli per nidiata da sacrificare, scegliere due femmine per tenere da parte i maschi per la valutazione della retrazione del capezzolo, tranne nel caso in cui l’eliminazione di questi piccoli non lasci alcuna femmina per le valutazioni da effettuare al termine. Non bisogna eliminare alcun piccolo se vi sono meno di 8 o 10 piccoli per nidiata (a seconda delle dimensioni normali della nidiata nei ceppi di ratti utilizzati). Qualora vi sia un solo piccolo in più rispetto alle dimensioni normali della nidiata, un solo piccolo sarà eliminato e utilizzato per prelevare il campione di sangue ai fini della determinazione dei livelli sierici di T4. Osservazioni 42. Le osservazioni cliniche generali devono essere effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa ora e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Vanno registrate le informazioni concernenti le condizioni di salute degli animali. Almeno due volte al giorno, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità. 43. Una volta prima dell’esposizione iniziale (per consentire un confronto sullo stesso soggetto) e, successivamente, almeno una volta alla settimana tutti gli animali genitori vengono sottoposti ad osservazioni cliniche particolareggiate. A tale scopo gli animali vengono tolti dalle gabbie, collocati in un recinto standard ed esaminati di preferenza sempre alla stessa ora, ogni giorno. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio che esegue la prova. Si avrà cura di ridurre al minimo le variazioni delle condizioni sperimentali; le osservazioni devono essere effettuate da persone che non sono a conoscenza del trattamento somministrato. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività neurovegetativa (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Vanno inoltre registrati cambiamenti dell’andatura, della postura e della risposta alla manipolazione, nonché la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipie (ad esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in cerchio), parto difficoltoso o prolungato o comportamenti insoliti (ad esempio automutilazione, marcia a ritroso) (10). 44. Ad un certo punto durante lo studio, devono essere svolte valutazioni della reattività sensoriale a stimoli di vario tipo (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) (8) (9) (11), della forza di presa (12) e dell’attività motoria (13) per cinque maschi e cinque femmine, selezionati da ciascun gruppo secondo un criterio di casualità. Ulteriori indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate anche procedure alternative non indicate nella bibliografia. Nei maschi queste osservazioni funzionali devono essere effettuate verso la fine del periodo di esposizione, poco prima della soppressione programmata ma prima del prelievo dei campioni di sangue per gli esami ematologici o gli esami biochimici clinici (cfr. i paragrafi 53-56, compresa la nota a piè di pagina 1). La prova sulle femmine, che devono trovarsi in uno stato fisiologico simile durante queste prove funzionali, deve essere effettuata di preferenza una sola volta nell’ultima settimana di allattamento (ad esempio, il sesto-tredicesimo giorno di allattamento), poco prima della soppressione programmata. Nella misura del possibile, ridurre i tempi di separazione delle madri e dei piccoli. 45. Le osservazioni funzionali effettuate una volta verso la fine dello studio possono essere evitate nel caso di uno studio preliminare ad un successivo studio subcronico (90 giorni) o ad un successivo studio a lungo termine. In questa eventualità, le osservazioni funzionali devono essere incluse nello studio complementare. D’altro canto, le informazioni ricavate dalle osservazioni funzionali nel corso dello studio a dosi ripetute possono essere utili nella determinazione dei livelli di dosaggio per un successivo studio subcronico o a lungo termine. 46. Eccezionalmente è possibile omettere le osservazioni funzionali per i gruppi che evidenzino comunque segni di tossicità tali da interferire in modo significativo con l’esecuzione degli esami funzionali. 47. La durata della gestazione deve essere registrata e calcolata dal giorno 0 di gravidanza. Ogni nidiata deve essere esaminata non appena possibile dopo il parto per stabilire il numero e il sesso dei piccoli, dei nati morti, dei nati vivi e degli esemplari più piccoli del normale (i piccoli molto più piccoli dei piccoli di controllo) e la presenza di grosse anomalie. 48. Si procede a contare e identificare il sesso dei piccoli vivi e a pesare le nidiate entro 24 ore dal parto (giorno 0 o 1 dopo il parto) e almeno il quarto e il tredicesimo giorno dopo il parto. Oltre a quanto osservato per gli animali genitori (cfr. i paragrafi 43 e 44), deve essere registrato qualsiasi comportamento anomalo della prole. 49. Occorre misurare la distanza anogenitale (AGD) di ogni piccolo nello stesso giorno dalla nascita, tra il PND 0 e il PND 4. Il peso corporeo del piccolo va registrato il giorno in cui ne viene misurata l’AGD, che deve essere normalizzata in funzione della taglia, preferibilmente usando la radice cubica del peso corporeo (14). Va contato il numero di capezzoli/areole nei piccoli di sesso maschile il PND 12 o 13, come raccomandato nella linea guida n. 151 dell’OCSE (15). Peso corporeo e consumo di cibo/acqua 50. I maschi e le femmine devono essere pesati il primo giorno della somministrazione, in seguito almeno settimanalmente, e al termine della somministrazione. Le femmine devono essere pesate durante la gravidanza i giorni 0, 7, 14 e 20 ed entro 24 ore dal parto (giorno 0 o 1 dopo il parto) e almeno il quarto e il tredicesimo giorno dopo il parto. Queste osservazioni vanno riportate singolarmente per ciascun animale adulto. 51. Durante il periodo precedente l’accoppiamento e durante la gravidanza e l’allattamento, l’assunzione di cibo deve essere misurata almeno una volta alla settimana. La misurazione dell’assunzione di cibo durante l’accoppiamento è facoltativa. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con acqua da bere, durante questi periodi va misurata anche l’assunzione di acqua. Ematologia 52. Una volta durante lo studio devono essere effettuati i seguenti esami ematologici su cinque maschi e cinque femmine, selezionati da ciascun gruppo secondo un criterio di casualità: ematocrito, concentrazioni di emoglobina, conteggio degli eritrociti, reticulociti, conteggio totale e differenziale dei leucociti, numero di placchette e misura del tempo e del potenziale di coagulazione. Se la sostanza in esame o i suoi metaboliti putativi hanno o possono avere proprietà ossidanti occorre effettuare altre analisi, relative tra l’altro alla concentrazione di metaemoglobine o ai corpi di Heinz. 53. I campioni di sangue devono essere prelevati da un determinato sito. Durante il prelievo dei campioni le femmine devono trovarsi in uno stato fisiologico simile. Allo scopo di evitare le difficoltà pratiche connesse alla variabilità all’inizio della gestazione, i prelievi di sangue nelle femmine possono essere effettuati alla fine del periodo precedente l’accoppiamento in alternativa al prelievo dei campioni di sangue al momento della soppressione degli animali o nel periodo immediatamente precedente. Per i maschi, i campioni di sangue devono essere prelevati di preferenza al momento della soppressione degli animali o nel periodo immediatamente precedente. In alternativa, i prelievi di sangue nei maschi possono essere effettuati anche alla fine del periodo precedente l’accoppiamento se per le femmine è stato prescelto questo momento. 54. I campioni devono essere conservati in condizioni adeguate. Biochimica clinica 55. Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti tossici gravi sui tessuti e, specificamente, degli effetti su reni e fegato, vanno condotte su campioni di sangue prelevati dai cinque maschi e dalle cinque femmine di ciascun gruppo selezionati. Si raccomanda di lasciare gli animali a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni ( 22 ) . Le analisi sul plasma o sul siero comprenderanno il sodio, il potassio, il glucosio, il colesterolo totale, l’urea, la creatinina, le proteine totali e l’albumina, almeno due enzimi indicatori degli effetti epatocellulari (come l’alanina aminotransferasi, l’aspartato aminotransferasi e la sorbitol deidrogenasi). Le determinazioni di altri enzimi (di origine epatica o di altro tipo) e della bilirubina possono talvolta fornire indicazioni utili. 56. Vanno prelevati campioni di sangue da un sito specifico in base al seguente programma: — da almeno due piccoli per nidiata il quarto giorno dopo la nascita, se il numero di piccoli lo consente (cfr. i paragrafi 40-41) — da tutte le madri e almeno due piccoli di 13 giorni per nidiata al termine dell’esperimento e — da tutti i maschi adulti, al termine dell’esperimento. Tutti i campioni di sangue vanno conservati in condizioni adeguate. Si procede alla valutazione della concentrazione sierica per gli ormoni tiroidei (T4) nei campioni di sangue dei piccoli di 13 giorni e degli adulti maschi. Se del caso, si effettua un’ulteriore valutazione dell’ormone T4 nei campioni di sangue delle madri e dei piccoli di 4 giorni. Se opportuno, si possono misurare facoltativamente anche i livelli di altri ormoni. I prelievi di sangue dei piccoli possono essere raggruppati per nidiata ai fini dell’analisi degli ormoni tiroidei. Gli ormoni tiroidei (T4 e TSH) sono misurati di preferenza come «totale». 57. A titolo facoltativo, nel corso dell’ultima settimana dello studio si possono effettuare le seguenti analisi delle urine su campioni raccolti in momenti specifici: aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine, glucosio e sangue/cellule ematiche. 58. È inoltre necessario considerare la possibilità di condurre studi sui marker sierologici dei danni generici ai tessuti. Altre determinazioni dovranno essere eseguite qualora si abbia motivo di ritenere o di sospettare che le proprietà della sostanza chimica in esame possano alterare i profili metabolici riguardanti il calcio, il fosfato, i trigliceridi a digiuno e la glicemia a digiuno, gli ormoni specifici, la metemoglobina e la colinesterasi. Questi devono essere confermati caso per caso. 59. I fattori seguenti possono influenzare la variabilità e le concentrazioni assolute delle analisi ormonali: — momento della soppressione, per via della variazione diurna delle concentrazioni ormonali; — metodi di soppressione, evitando di stressare inutilmente gli animali in quanto ciò potrebbe incidere sulle concentrazioni ormonali; — kit per le analisi ormonali che possono differire per le loro curve standard. 60. I campioni di plasma destinati specificatamente all’analisi ormonale devono essere prelevati nelle stesse ore della giornata. I valori numerici ottenuti dalle analisi delle concentrazioni ormonali differiscono in funzione dei kit disponibili in commercio utilizzati. 61. Se i dati di riferimento storici sono inadeguati, occorre tenere conto delle variabili ematologiche e di biochimica clinica prima di iniziare i dosaggi, di preferenza su un gruppo di animali diverso dal gruppo in esame. Per le femmine, i dati devono riguardare animali che allattano. PATOLOGIA Necroscopia macroscopica 62. Tutti gli animali adulti utilizzati nello studio vanno sottoposti a un’autopsia macroscopica completa e dettagliata che comprenda un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Occorre prestare particolare attenzione agli organi dell’apparato riproduttivo e prendere nota del numero dei siti di impianto. Gli strisci vaginali devono essere esaminati il giorno dell’autopsia per determinare lo stadio del ciclo estrale e consentire di stabilire correlazioni con l’istopatologia degli organi riproduttivi femminili. 63. Testicoli ed epididimi, come pure l’insieme composto dalla prostata e dalle vescicole seminali con le ghiandole della coagulazione, di tutti i maschi adulti vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. Inoltre, si possono pesare facoltativamente altri organi, come l’insieme del muscolo elevatore dell’ano e del muscolo bulbocavernoso, le ghiandole bulbouretrali e il glande nei maschi e le due ovaie (peso a umido) e l’utero (compresa la cervice) nelle femmine; se effettuate, queste misurazioni facoltative devono avvenire subito dopo la dissezione. Le ovaie, i testicoli, gli epididimi, gli organi sessuali accessori e tutti gli organi degli animali adulti che presentano lesioni macroscopiche devono essere conservati. 64. Per tutti i maschi e le femmine adulti e per un piccolo maschio e un piccolo femmina di tredici giorni di ciascuna nidiata, le ghiandole della tiroide devono essere conservate nel mezzo di fissazione più adatto per il successivo esame istopatologico che si intende effettuare. Il peso della tiroide può essere stabilito dopo la fissazione. Anche in questo caso l’ablazione deve essere eseguita con cautela e solo previa fissazione per evitare di danneggiare i tessuti. L’eventuale danneggiamento dei tessuti infatti potrebbe compromettere l’analisi istopatologica. I campioni di sangue devono essere prelevati da un determinato sito immediatamente prima o durante la soppressione degli animali e conservati in condizioni adeguate (cfr. il paragrafo 56). 65. Inoltre, per almeno cinque maschi e femmine adulti, selezionati a caso da ciascun gruppo (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati prima della conclusione dello studio), fegato, reni, ghiandole surrenali, timo, milza, cervello e cuore vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più adatto, sia per il tipo di tessuto, sia per il successivo esame istopatologico che si intende effettuare: tutte le lesioni macroscopiche, cervello (porzioni rappresentative comprendenti cervello, cervelletto e ponte), midollo spinale, occhi, stomaco, intestino tenue e crasso (comprese le placche di Peyer), fegato, reni, ghiandole surrenali, milza, cuore, timo, trachea e polmoni (conservati con dilatazione mediante fissativo e poi immersione), gonadi (testicoli e ovaie), organi sessuali accessori (utero e collo dell’utero, epididimi, prostata, vescicole seminali con ghiandole della coagulazione), vagina, vescica e linfonodi [oltre al linfonodo più vicino un altro linfonodo, in funzione dell’esperienza del laboratorio (16)], nervo periferico (sciatico o tibiale) preferibilmente in prossimità del muscolo, muscolo e osso dello scheletro con il midollo osseo (una sezione o un preparato fresco di midollo osseo aspirato). Si raccomanda di fissare i testicoli mediante immersione in un fissativo di Bouin o di Davidson modificato (16) (17) (18); la fissazione in formalina è sconsigliata per questi tessuti. La tunica albuginea può essere perforata, con un ago, con delicatezza e superficialmente in entrambi i poli dell’organo per consentire la rapida penetrazione del fissativo. I risultati clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame. 66. I tessuti elencati qui di seguito possono apportare informazioni utili sugli effetti endocrini: gonadi (ovaie e testicoli), organi sessuali accessori (utero, collo dell’utero, epididimi, vescicole seminali con ghiandole di coagulazione, prostata dorso laterale e ventrale), vagina, ipofisi, ghiandola mammaria maschile e ghiandola surrenale. Non ci sono sufficienti riscontri di alterazioni nelle ghiandole mammarie maschili, ma questo parametro può essere molto sensibile alle sostanze con attività estrogenica. L’osservazione degli organi/tessuti non ripresi nel paragrafo 65 è facoltativa. 67. I piccoli morti o soppressi il tredicesimo giorno dopo il parto, o poco dopo, devono essere sottoposti almeno a un attento esame esterno volto a individuare eventuali anomalie evidenti. Particolare attenzione deve essere dedicata all’apparato riproduttivo esterno, che va esaminato alla ricerca di eventuali alterazioni dello sviluppo. Esame istopatologico 68. Gli organi e i tessuti conservati di tutti gli animali selezionati del gruppo di controllo e del gruppo trattato con la dose più elevata vanno sottoposti a un esame istopatologico completo (con particolare attenzione alle fasi della spermatogenesi nelle gonadi maschili e dell’istopatologia della struttura delle cellule interstiziali dei testicoli). La ghiandola della tiroide dei piccoli e degli animali adulti restanti può essere esaminata se necessario. Si procede a questi esami anche sugli animali degli altri gruppi se nel gruppo cui viene somministrata la dose più elevata si osservano alterazioni correlate al trattamento. Il documento di orientamento sull’istopatologia (10) fornisce informazioni supplementari sulla dissezione, la fissazione, l’asportazione e l’istopatologia dei tessuti endocrini. 69. Vanno esaminate tutte le lesioni macroscopiche. Allo scopo di contribuire alla determinazione dei NOAEL, devono essere esaminati gli organi bersaglio di altri gruppi-dose, soprattutto dei gruppi che presenterebbero un NOAEL. 70. Quando si utilizza un gruppo satellite l’esame istopatologico va eseguito sui tessuti e sugli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. DATI E RELAZIONE Dati 71. Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabella, evidenziando per ciascun gruppo di studio il numero di animali all’inizio della prova, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento di eventuali decessi o soppressioni, il numero di animali fertili, il numero di femmine gravide, il numero di animali che mostrano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, ivi compresi il momento dell’insorgenza, la durata e la gravità degli effetti tossici, i tipi di alterazioni istopatologiche, nonché tutti i dati di rilievo riguardanti le nidiate. Un formato tabulare di relazione sintetica che si è rivelato molto utile per la valutazione degli effetti sulla riproduzione/sullo sviluppo è contenuto nell’appendice 3. 72. Se possibile, i risultati numerici devono essere valutati sulla base di un metodo statistico appropriato e comunemente accettato. Per i confronti degli effetti osservati nell’ambito di un intervallo di dosaggio si deve evitare il ricorso a prove t multiple. I metodi statistici devono essere selezionati durante la fase di progettazione dello studio. L’analisi statistica dell’AGD e della retrazione del capezzolo deve essere basata sui dati individuali dei piccoli, tenendo conto degli effetti sulle nidiate. Se opportuno, utilizzare la nidiata come unità di analisi. L’analisi statistica del peso corporeo dei piccoli deve essere basata sui dati individuali dei piccoli, tenendo conto delle dimensioni della nidiata. Tenuto conto della portata ridotta dello studio, le analisi statistiche sotto forma di prove intese ad accertare la «significatività» dei risultati hanno un valore limitato per molti endpoint, soprattutto quelli riproduttivi. Alcuni dei metodi più ampiamente utilizzati, soprattutto le prove parametriche per la valutazione della tendenza centrale, sono inadeguati. Se si ricorre ad analisi statistiche, il metodo scelto deve essere adatto alla distribuzione della variabile esaminata e selezionato prima dell’inizio dello studio. Valutazione dei risultati 73. I risultati del presente studio di tossicità vanno valutati in base agli effetti osservati e ai risultati della necroscopia e dell’esame microscopico. La valutazione deve includere il rapporto fra la dose della sostanza chimica in esame e la presenza o l’assenza, l’incidenza e la gravità delle anomalie, comprese eventuali lesioni macroscopiche, gli organi bersaglio identificati, l’infertilità, le anomalie cliniche, la capacità riproduttiva, gli effetti sulla generazione successiva, le alterazioni del peso corporeo, gli effetti sulla mortalità ed eventuali altri effetti tossici. 74. Tenuto conto del breve periodo di trattamento del maschio, l’istopatologia dei testicoli e degli epididimi deve essere considerata insieme ai dati sulla fertilità nel quadro della valutazione degli effetti sulla riproduttività del maschio. Può essere utile anche utilizzare eventuali dati di controllo storici sulla riproduzione/lo sviluppo (ad esempio per le dimensioni della nidiata, l’AGD, la retrazione del capezzolo, i livelli sierici di T4) per facilitare l’interpretazione dello studio. 75. Ai fini del controllo di qualità, si suggerisce di raccogliere dati di controllo storici e di calcolare i coefficienti di variazione per i dati numerici, in particolare per i parametri legati all’individuazione degli interferenti endocrini. Questi dati possono essere utilizzati, a fini di confronto, in fase di valutazione degli studi effettivamente realizzati. Relazione sull’esecuzione della prova 76. La relazione sull’esecuzione della prova deve comprendere le seguenti informazioni: Sostanza chimica in esame: — origine, numero di lotto, data limite per l’uso, se disponibili; — stabilità della sostanza chimica in esame, se nota; Sostanza monocostituente: — aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche; — dati di identificazione chimica: denominazioni IUPAC o CAS, numero CAS, codice SMILES o InChI, formula strutturale, purezza, identità chimica delle impurezze, se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono, ecc.; Sostanza multicostituente, UVCB e miscele: — caratterizzate nella massima misura possibile con l’identità chimica (cfr. sopra), con la presenza quantitativa e con le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti ; Mezzo disperdente (se del caso): — giustificazione per la scelta del mezzo disperdente utilizzato, se diverso dall’acqua; Animali utilizzati nella prova: — specie/ceppo impiegati; — numero, età e sesso degli animali; — origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.; — peso di ciascun animale all’inizio della prova; — qualora non siano stati utilizzati ratti, spiegazione del motivo; Condizioni sperimentali: — criteri di selezione delle dosi; — informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza chimica in esame/incorporazione nella dieta, sulla concentrazione finale, sulla stabilità e sull’omogeneità del preparato; — modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame; — se del caso, conversione della concentrazione della sostanza nella dieta o nell’acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno); — dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua; — descrizione dettagliata del protocollo di randomizzazione utilizzato per selezionare gli eventuali piccoli da sopprimere; Risultati: — peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo; — assunzione di cibo ed eventualmente di acqua; — dati sulla risposta tossica per sesso e per dose, compresa la fertilità, la gestazione ed eventuali altri sintomi di — tossicità; — durata della gestazione, effetti tossici o di altro tipo sulla riproduzione, sulla prole, sulla crescita postnatale, ecc.; — natura, gravità e durata dei segni clinici (sia reversibili che non reversibili); — valutazione dell’attività sensoriale, della forza prensile e dell’attività motoria; — esami ematologici con i relativi valori basali; — esami biochimici clinici con i relativi valori basali; — numero di femmine adulte con ciclo estrale normale o anomalo e durata del ciclo; — numero di nati vivi e di perdite post-impianto; — numero di piccoli con anomalie evidenti; valutazione macroscopica degli organi genitali esterni, numero di esemplari più piccoli del normale; — momento del decesso durante lo studio o indicazione della sopravvivenza degli animali alla conclusione della prova; — numero di impianti e dimensioni e peso della nidiata al momento della registrazione; — dati relativi al peso corporeo dei piccoli; — AGD di tutti i piccoli (e peso corporeo il giorno della misurazione dell’AGD); — retrazione del capezzolo nei piccoli di sesso maschile; — livelli di ormoni tiroidei, piccoli di 13 giorni e maschi adulti (e madri e piccoli di 4 giorni se sottoposti a misurazione); — peso corporeo al momento della soppressione e dati sul peso degli organi negli animali genitori; — risultati della necroscopia; — descrizione dettagliata dei risultati istopatologici; — dati sull’assorbimento (se disponibili); — elaborazione statistica dei risultati, se del caso. Discussione dei risultati Conclusioni Interpretazione dei risultati 77. Lo studio fornirà valutazioni della tossicità per la riproduzione/lo sviluppo associata alla somministrazione di dosi ripetute. In particolare, poiché lo studio verte sia sulla tossicità generale sia sugli endpoint di tossicità per la riproduzione/lo sviluppo, i risultati consentiranno di distinguere gli effetti sulla riproduzione o sullo sviluppo che si osservano in assenza di tossicità generale da quelli espressi solo a livelli che risultano tossici anche per gli animali genitori (cfr. i paragrafi 7-11). Esso può fornire indicazioni sulla necessità di condurre ulteriori indagini e orientamenti in merito alla progettazione di studi successivi. Si consulti il documento di orientamento n. 43 dell’OCSE per indicazioni sull’interpretazione