96/240/CE: Decisione della Commissione, del 5 febbraio 1996, che modifica la decisione 92/532/CEE che stabilisce i piani di campionamento ed i metodi diagnostici per individuare e confermare alcune malattie dei pesci (Testo rilevante ai fini del SEE)



Gazzetta ufficiale n. L 079 del 29/03/1996 pag. 0019 - 0028



DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 5 febbraio 1996 che modifica la decisione 92/532/CEE che stabilisce i piani di campionamento ed i metodi diagnostici per individuare e confermare alcune malattie dei pesci (Testo rilevante ai fini del SEE) (96/240/CE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, vista la direttiva 91/67/CEE del Consiglio, del 28 gennaio 1991, che stabilisce le norme di polizia sanitaria per la commercializzazione di animali e prodotti di acquicoltura (1), modificata da ultimo dalla direttiva 95/22/CE (2), in particolare l'articolo 15, considerando che la decisione 92/532/CEE della Commissione (3), stabilisce i piani di campionamento ed i metodi diagnostici per individuare e confermare alcune malattie dei pesci; considerando che i progressi tecnici e scientifici successivi all'adozione della suddetta decisione impongono l'aggiornamento dei succitati piani di campionamento e metodi diagnostici; considerando che detto aggiornamento riguarda le dimensioni, il prelievo e il trasporto dei campioni nonché il metodo di isolamento dei virus eventualmente presenti nel campione; considerando che al riguardo è stato consultato il comitato scientifico veterinario, istituito con la decisione 81/651/CEE della Commissione (4); considerando che le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato permanente veterinario, HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE: Articolo 1 L'allegato della decisione 92/532/CEE è sostituito dall'allegato della presente decisione. Articolo 2 Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione. Fatto a Bruxelles, il 5 febbraio 1996. Per la Commissione Franz FISCHLER Membro della Commissione (1) GU n. L 46 del 19. 2. 1991, pag. 1. (2) GU n. L 243 dell'11. 10. 1995, pag. 1. (3) GU n. L 337 del 21. 11. 1992, pag. 18. (4) GU n. L 233 del 19. 8. 1981, pag. 32. ALLEGATO PARTE PRIMA METODI DI CAMPIONAMENTO E DI ACCERTAMENTO DELLA VHS E CONTROLLI RELATIVI ALLA IHN I. Campionamento 1. Intervalli di campionamento Le aziende sono sottoposte a controllo sanitario almeno due volte all'anno, nel periodo che va da ottobre a giugno o comunque quando la temperatura dell'acqua è inferiore a 14 °C. L'intervallo tra un'ispezione e l'altra deve essere almeno di quattro mesi. In tutte le unità di produzione (stagni, vasche, acquari, gabbie, ecc.) va rilevata la presenza di pesci morti, deboli o dal comportamento anomalo. In particolare, vanno controllate (se possibile) le zone in prossimità delle griglie di scarico dell'acqua, dove i soggetti deboli tendono ad accumularsi spinti dalla corrente. 2. Selezione e raccolta dei campioni In base ai controlli di cui alla tabella 1 A, vengono prelevati da 30 a 150 campioni di pesce e/o di fluido ovarico. Se la trota iridea è presente nell'azienda, l'intero campione deve provenire da questa specie; altrimenti, i prelievi vanno effettuati su tutte le altre specie allevate, ritenute soggette alla VHS e/o alla IHN in base all'elenco contenuto nell'allegato A della direttiva 91/67/CEE del Consiglio che stabilisce le norme di polizia sanitaria per la commercializzazione di animali e prodotti dell'acquicoltura. Le specie presenti nell'allevamento devono essere rappresentate in uguale proporzione nel campione. Nei primi due anni del periodo di controllo quadriennale anteriore al conseguimento dello status di zona riconosciuta immune, il numero di unità da prelevare è 150, onde accertare, con un coefficiente di confidenza del 95 %, la presenza di portatori di virus con una prevalenza di portatori del 2 %, ad eccezione degli allevamenti di salmonidi senza riproduttori in zone costiere, per i quali le dimensioni del campione è di 30 unità. Negli ultimi due anni del periodo di controllo la dimensione del campione potrà essere ridotta a 30 esemplari allo scopo di rivelare, con un coefficiente di confidenza del 95 %, la presenza di virus con una prevalenza del 10 %. Negli anni successivi (conservazione dello status di zona riconosciuta) la dimensione del campione potrà essere analogamente ridotta a 30 esemplari. Nelle aziende che si sottopongono regolarmente a controlli sanitari sulla base di un programma ufficiale e che risultano immuni da VHS e IHN da almeno 4 anni, la dimensione del campione può essere di 30 esemplari anche durante l'intero quadriennio iniziale. Se un'azienda utilizza diversi tipi di acque per l'allevamento, i campioni (di 30 o 150 unità) devono provenire dalle diverse zone. Il prelievo deve innanzitutto comprendere i soggetti deboli, di morte recente (non in stato di decomposizione) o che presentano un comportamento anomalo. Qualora non sussistano le patologie suddette, il campione va scelto tra gli esemplari di aspetto normale e sano, deve provenire in modo proporzionale, dalle varie zone dell'allevamento e rappresentare tutte le varie annate. 3. Preparazione ed invio dei campioni Prima dell'invio o del trasferimento dei campioni al laboratorio, si asportano dai pesci, con forbici o forcipi sterili, pezzi degli organi da esaminare, che vengono posti in provette di plastica contenenti il medium di trasporto, ossia un terreno di coltura cellulare costituito per il 10 % da siero di vitello e antibiotici. Si può raccomandare un'associazione di 200 UI di penicillina, 200 µg di streptomicina e 200 µg di canamicina per ml, ma si possono utilizzare anche altri antibiotici di provata efficacia. Gli organi da esaminare sono la milza, il rene anteriore e il cuore o l'encefalo. In taluni casi, si dovrà esaminare il fluido ovarico (tabelle 1 A e 1 B). Si possono raccogliere in una provetta di plastica da 10 ml contenente 4 ml di medium di trasporto parti di organo o fluido ovarico provenienti da 10 pesci (tabelle 1 A e 1 B), che costituiscono un campione collettivo. In ogni campione il tessuto dovrebbe pesare almeno 0,5 g. Le provette sono poste in contenitori isolati (ad esempio scatole di polistirene con pareti spesse) con sufficiente ghiaccio o blocchi di refrigerazione, affinché i campioni siano raffreddati ad una temperatura compresa tra 0 e 5 °C durante il trasporto al laboratorio. Si deve evitare il congelamento dei campioni. La temperatura del campione durante il trasporto non deve superare i 10 °C e, all'arrivo, nel contenitore deve ancora trovarsi del ghiaccio. L'esame virologico deve iniziare quanto prima, e comunque non più tardi di 48 ore dalla raccolta dei campioni oppure, in casi eccezionali non più tardi di 72 ore dopo la raccolta del materiale da esaminare, sempreché esso sia protetto con medium di trasporto e siano soddisfatti i requisiti di temperatura durante il trasporto stesso (1.1.3, paragrafo 3). Al laboratorio possono essere inviati anche pesci interi se possono essere soddisfatti i requisiti di temperatura durante il trasporto. I pesci interi possono essere avvolti in carta assorbente e devono quindi essere inviati in sacchetti di plastica refrigerati come indicato più sopra. Può essere inviato anche pesce vivo. 4. Raccolta di ulteriore materiale diagnostico A seconda degli accordi presi con il laboratorio diagnostico incaricato, possono essere raccolti e preparati anche altri tessuti dei pesci in vista di ulteriori esami. II. Preparazione dei campioni per l'esame virologico 1. Omogeneizzazione di organi In laboratorio, il contenuto delle provette viene interamente omogeneizzato (con stomacher, miscelatore o mortaio e pestello). L'omogeneizzato viene quindi messo in sospensione nel medium di trasporto originale. Se il campione è costituito da un pesce intero di lunghezza inferiore a 6 cm, esso viene tritato con forbici sterili previo asporto della parte del corpo situata dopo l'apertura anale, omogeneizzato come sopra indicato e messo in sospensione in un medium di trasporto. Al termine dell'operazione il rapporto tra materiale tissutale e medium deve risultare 1: 10. 2. Centrifugazione dell'omogeneizzato L'omogeneizzato viene immesso in una centrifuga refrigerata a 2-5 °C a 2 000-4 000 × g per 15 minuti e il supernatante viene raccolto e trattato per 4 ore a 15 °C o per una notte a 4 °C, con antibiotici (ad esempio, gentamicina 1 mg/ml). Se il campione è stato inviato in un medium di trasporto (ossia con esposizione ad antibiotici), il supernatante può non essere trattato con antibiotici. Il trattamento con antibiotici serve a controllare la contaminazione batterica nei campioni e a rendere superfluo il filtraggio attraverso membrane. Se il supernatante raccolto viene conservato a - 80 °C entro 48 ore successive al campionamento, esso può essere scongelato e riutilizzato soltanto una volta per l'esame virologico. Qualora insorgano difficoltà pratiche (ad esempio interruzione della stufa termostatica, problemi con le colture cellulari, ecc.) che non rendono possibile l'inoculazione delle cellule entro le 48 ore successive alla raccolta dei campioni tissutali, è ammissibile il congelamento del supernatante a - 80 °C e l'esame virologico entro 14 giorni. Prima dell'inoculazione nelle cellule il supernatante viene miscelato con parti uguali di un gruppo di antisieri, opportunamente diluiti, dei sierotipi indigeni del virus dell'IPN e il tutto viene incubato da un minimo di un'ora a 15 °C ad un massimo di 18 ore a 4 °C. Il titolo dell'antisiero deve essere almeno di 1: 2 000 in una prova di neutralizzazione delle placche al 50 %. Il trattamento di tutti gli inoculi con antisiero del virus dell'IPN (che in alcune parti d'Europa si manifesta nel 50 % dei campioni di pesce) serve a impedire che si sviluppino nelle colture cellulari inoculate effetti citopatogeni (CPE) provocati dal virus dell'IPN. Si riduce in tal modo la durata degli esami virologici, nonché il numero di casi in cui la comparsa di CPE dovrebbe essere considerata potenzialmente indicativa di VHS o IHN. Se i campioni provengono da unità di produzione ufficialmente considerate immuni da IPN, si può fare a meno di trattare gli inoculi con il relativo antisiero. III. Esame virologico 1. Colture cellulari e media Cellule BF-2 oppure RTG-2 nonché cellule EPC oppure FHM sono coltivate a 20-30 °C in un medium adeguato, ad esempio nel MEM di Eagle (o in sue modifiche) con aggiunta del 10 % di siero bovino fetale e di antibiotici in concentrazioni standard. Se le cellule sono coltivate in fiale chiuse, si raccomanda di tamponare il medium con bicarbonato. Il terreno utilizzato per la coltura di cellule in unità aperte può essere tamponato con Tris-HCl (23 mM) e bicarbonato di sodio (6 mM). Il pH deve essere il più prossimo possibile a 7,6. Le colture cellulari da impiegare per l'inoculazione con materiale tissutale devono essere giovani (da 4 a 48 ore di vita) e devono svilupparsi rapidamente (non concrescenti) quando vengono inoculate. 2. Inoculazione delle colture cellulari La sospensione di organi trattata con antibiotici è inoculata in colture cellulari a due diluizioni, cioè una diluzione primaria e una diluzione di 1: 10 in modo da ottenere diluizioni finali del materiale tissutale nel terreno di coltura cellulare di 1: 100 e di 1: 1 000, rispettivamente per prevenire interferenze omologhe. Debbono essere inoculate almeno due linee cellulari (vedi punto III.1). Il rapporto tra la grandezza dell'inoculo e il volume del terreno di coltura cellulare dovrebbe approssimarsi a 1: 10. Per ogni diluizione ed ogni linea cellulare si utilizza una superficie cellulare minima di circa 2 cm², corrispondente ad un pozzetto su una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Si raccomanda l'uso di piastre di colture cellulari, ma sono ammesse anche unità aventi una superficie di sviluppo analoga o più grande. 3. Incubazione delle colture cellulari Le colture cellulari inoculate sono incubate per 7-10 giorni alla temperatura di 15 °C. Se il colore del terreno di coltura cellulare vira dal rosso al giallo e indica quindi una acidificazione del mezzo, occorre regolare il pH con una soluzione di bicarbonato sterile o sostanze equivalenti, in modo da garantire la sensibilità della cellula all'infezione virale. Una volta ogni sei mesi si procede alla titolazione delle scorte congelate dei virus della VHS e della IHN per controllare la sensibilità delle colture cellulari all'infezione. 4. Microscopia Le colture cellulari inoculate vengono controllate ogni giorno per individuare la comparsa di CPE mediante ingrandimento di circa 40 volte. Qualora si constati chiaramente la presenza di CPE, si inizia immediatamente la procedura di identificazione del virus secondo quanto disposto al capitolo IV. 5. Subcoltivazione Se dopo 7-10 giorni di incubazione primaria non si sono sviluppati CPE, si effettua una subcoltivazione di cellule colturali fresche, utilizzando una superficie cellulare simile a quella della coltura principale. Se dopo 7-10 giorni dopo l'inoculazione, vengono raggruppate, in base alla linea cellulare, alcune aliquote del medium (supernatante) di tutti i pozzetti/colture che costituiscono la coltura primaria. Questi gruppi vengono quindi inoculati in colture cellulari omologhe non diluite e diluite a 1: 10 (ottenendo diluizioni finali del supernatante di 1: 10 e di 1: 100, rispettivamente) come descritto al punto I.III.2. L'inoculazione può essere preceduta da una preincubazione delle diluizioni dell'antisiero del virus IPN, ad una diluizione adeguata come descritto al punto I.II.2. Le colture inoculate vengono poi incubate per 7-10 giorni alla temperatura di 15 °C, effettuando le osservazioni di cui al punto III.4. Se nei primi 3 giorni di incubazione si sono sviluppati CPE tossici, si può eseguire in quella fase una subcoltivazione, ma le cellule devono essere allora incubate per 7 giorni e nuovamente subcoltivate, con un'ulteriore incubazione per altri 7 giorni. In caso di sviluppo di CPE tossici dopo 3 giorni, le cellule possono essere esaminate una volta e incubate sino a 14 giorni, in totale, dall'inoculazione primaria. Negli ultimi 7 giorni di incubazione non deve emergere prova di tossicità. IV. Identificazione del virus 1. Test di identificazione Se in una coltura cellulare sono stati osservati CPE, il medium (supernatante) viene raccolto ed esaminato mediante una o più delle seguenti tecniche: neutralizzazione, immunofluorescenza (IF), saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Se i test non hanno permesso un'identificazione sicura del virus entro una settimana, il virus dev'essere inviato ad un laboratorio nazionale di riferimento per le malattie dei pesci o ad un laboratorio comunitario di riferimento, per l'identificazione immediata. Gli immunoreagenti utilizzati per l'identificazione del virus devono essere di qualità di riferimento e approvati dal laboratorio nazionale di riferimento per le malattie dei pesci, per quanto riguarda la loro titolazione e specificità. 2. Neutralizzazione Estrarre le cellule dal medium raccolto, mediante centrifugazione (2 000-4 000 × g) o filtraggio su membrana (0,45 µm) e diluire il medium a 1: 100 e a 1: 10 000 nel terreno di coltura cellulare. Alcune aliquote delle diluizioni sono mescolate e inoculate per 60 minuti a 15 °C separatamente con aliquote uguali dei seguenti reagenti: >SPAZIO PER TABELLA> Almeno due colture cellulari di ogni miscela siero-virus sono inoculate con 50 µl ciascuna e quindi incubate a 15 °C. Lo sviluppo di CPE viene controllato secondo quanto descritto al punto III.4. In alternativa, sono ammessi altri test di neutralizzazione, purché di provata efficacia. 3. Immunofluorescenza (IF) Per ogni isolato di virus da identificare, 8 vetrini o equivalenti sono seminati con cellule EPC ad una densità che conduca ad una confluenza del 60-90 % dopo 24 ore di coltivazione. Vengono scelte a tale scopo cellule EPC a causa della loro forte aderenza alle superfici vetrose. Quando le cellule si sedimentano sulla superficie del vetro (circa un'ora dopo la semina) o quando le colture sono state incubate fino a 24 ore, il virus da identificare viene inoculato. Quattro colture vengono inoculate ad un rapporto di 1: 10 (volume/volume) e quattro colture ad un rapporto di 1: 100. Dopo 20-30 ore dall'inoculazione, le colture sono sciacquate due volte nel MEM di Eagle senza siero, fissate nell'acetone e quindi tinte mediante IF a due strati. Il primo strato di reagenti è costituito da anticorpi poli o monoclonali di qualità di riferimento. Il secondo strato di reagenti è un antisiero coniugato FITC dell'immunoglobulina utilizzata nel primo strato. Per ciascuno degli antisieri saggiati si devono tingere almeno una coltura inoculata a dose elevata e una coltura inoculata a dose bassa. La prove deve comportare regolari controlli negativi e positivi. Le colture tinte vengono preparate con una soluzione fisiologica addizionata di glicerolo. L'esame al microscopio va fatto con luce UV incidente, utilizzando oculari da 10 o da 12 ed obiettivi da 25 o da 40 con rispettive aperture >0,7 e >1,3. Alcuni ceppi di virus Egtved reagiscono fortemente con l'antisiero del ceppo di riferimento F 1 nell'IF, sebbene non reagiscano nelle prove di neutralizzazione. La tecnica IF qui indicata è fornita a titolo d'esempio. In alternativa, sono ammissibili altre tecniche IF (per quanto riguarda le colture cellulari, la fissazione e gli anticorpi di qualità di riferimento) purché di provata efficacia. 4. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) I pozzetti nelle piastre di microtitolazione (ad esempio: immunopiastre Nunc-Maxisorp, Nunc, Danimarca) sono coperti per una notte con diluizioni raccomandate di frazioni di immunoglobulina purificata a proteina A degli anticorpi di qualità di riferimento. Dopo aver sciacquato i pozzetti con il tampone PBS-Tween-20, si aggiunge ai pozzetti il virus da identificare con diluizioni effettuate 2 o 4 volte e lo si lascia reagire con l'anticorpo per 60 minuti a 37 °C. Dopo il risciacquo con il tampone PBS-Tween-20, si aggiungono anticorpi biotinilati di una specificità corrispondente a quella degli anticorpi di copertura e li si lascia reagire per 60 minuti a 20 °C. Dopo un altro risciacquo effettuato come sopra, si aggiunge streptavidina coniugata HRP e la si lascia reagire per un'ora a 20 °C. Dopo un ultimo risciacquo l'enzima legato viene visualizzato per mezzo di un adeguato substrato ELISA (OPD o altri). Il metodo ELISA a base di biotina-avidina sopra descritto è stato presentato a titolo d'esempio, ma si possono utilizzare anche altre versioni di ELISA, che siano di provata efficacia. >SPAZIO PER TABELLA> >SPAZIO PER TABELLA> >SPAZIO PER TABELLA> PARTE SECONDA METODI DIAGNOSTICI PER L'ACCERTAMENTO DELLA IHN E DELLA VHS NEI CASI SOSPETTI DI INFEZIONE La necrosi emopoietica infettiva (IHN) e la setticemia emorragica virale (VHS) possono essere diagnosticate con una delle seguenti tecniche: - A. Isolamento convenzionale del virus e sua successiva identificazione sierologica. - B. Isolamento del virus e sua simultanea identificazione sierologica. - C. Altre tecniche diagnostiche (IFAT, ELISA). Una prima diagnosi della IHN o della VHS nelle aziende delle zone riconosciute non si può basare solamente sul metodo C: deve essere usato anche il metodo A o il metodo B. I tessuti da utilizzare per l'esame virologico debbono, in alcuni casi, essere accompagnati da altro materiale per esami batteriologici, parassitologici, istologici o di altro tipo, necessari per effettuare una diagnosi differenziale. Questo materiale deve essere raccolto in base alle procedure stabilite dall'OIE. II.A. Isolamento convenzionale del virus e sua successiva identificazione II.A.I.1. Selezione dei campioni Per l'esame vengono scelti almeno 10 pesci che presentino sintomi clinici di IHN o VHS. II.A.I.2. Preparazione ed invio dei campioni Come I.I.3. II.A.I.3. Raccolta di ulteriore materiale diagnostico Come I.I.4. II.A.II Preparazione dei campioni per l'esame virologico Come I.II. II.A.III Esame virologico Come I.III, salvo che, per l'inoculazione nel materiale tissutale, possono essere utilizzate cellule BF-2 oppure RTG-2 nonché cellule EPC oppure FHM. II.A.IV Identificazione del virus Come I.IV. II.B. Isolamento del virus e sua simultanea identificazione sierologica II.B.I.1. Raccolta dei campioni Come II.A.I.1. II.B.I.2. Preparazione e invio dei campioni Come I.I.3. II.B.I.3. Raccolta di ulteriore materiale diagnostico Come I.I.4. II.B.II.1. Omogenizzazione degli organi Come I.II.1. II.B.II.2. Centrifugazione dell'omogeneizzato Come I.II.2. II.B.II.3. Trattamento del supernatante con antisieri diagnostici La sospensione di organi trattata con antibiotici e anti-IPN viene diluita a 1: 10 e 1: 10 000 in terreno di coltura cellulare e delle aliquote vengono miscelate e incubate per 60 minuti a 15 °C con parti uguali dei reagenti elencati al punto I.IV.2. II.B.III.1. Colture cellulari e media Cellule BF-2 oppure RTG-2 nonché cellule EPC oppure FHM sono coltivate a 20-30 °C in un terreno opportuno, come ad esempio nel MEM di Eagle (o in sue modifiche) con aggiunta del 10 % di siero fetale bovino e di antibiotici in concentrazioni standard. Se le cellule sono coltivate in fiale chiuse, si raccomanda di tamponare il terreno di coltura con bicarbonato. Il terreno utilizzato per la coltivazione di cellule in unità aperte può essere tamponato con Tris-HCl (23 mM) e bicarbonato di sodio (6 mM). Il pH deve essere il più prossimo possibile al valore 7,6. Le colture cellulari da utilizzare per l'inoculazione con materiale tissutale devono essere giovani (da 4 a 48 ore di vita) e devono svilupparsi rapidamente (non confluenti) quando vengono inoculate. II.B.III.2. Inoculazione delle colture cellulari Per ogni miscela siero-virus (preparata conformemente al punto II.B.II.3) almeno due colture cellulari per ogni linea cellulare vengono inoculate ciascuna con 50 µl. II.B.III.3. Incubazione delle colture cellulari Come punto I.III.3. II.B.III.4. Microscopia Le colture cellulari inoculate vengono controllate ogni giorno per individuare la comparsa di CPE mediante ingrandimento di circa 40 volte. Se la comparsa di CPE viene ostacolata da uno degli antisieri utilizzati, si può considerare identificato il virus. Se nessuno degli antisieri è efficace, debbono essere intraprese le procedure di identificazione del virus descritte al punto I.IV. II.B.III.5. Subcoltivazione Se dopo sette giorni non si sono sviluppati CPE, deve essere effettuata una subcoltivazione a partire da colture inoculate con supernatante più medium (II.B.II.3.) conformemente al punto I.III.5. II.C. Altre tecniche diagnostiche Il supernatante preparato come indicato al punto II.A.II.2 è sottoposto a test IFAT o ELISA, descritti rispettivamente ai punti II.A.IV.3 e II.A.IV.4. Queste tecniche rapide vanno integrate con un'indagine virologica conforme ad A o B entro le 48 ore successive alla raccolta dei campioni, qualora: a) si ottenga una reazione negativa, oppure b) si ottenga una reazione positiva che rappresenti il primo caso di IHN o VHS nelle zone riconosciute. Il materiale tissutale può essere sottoposto ad esame con altre tecniche diagnostiche quali IF su sezioni congelate oppure immunoistochimica su tessuto fissato in formalina. Queste tecniche devono sempre essere accompagnate da inoculazione di materiale tissutale non fissato su colture cellulari. ABBREVIAZIONI BF-2 fibroblasto del persico sole (linea cellulare) CPE effetto citopatico ELISA saggio di immunoassorbimento enzimatico EPC Epithelioma papulosum cyprini (linea cellulare) FHM fathead minnow (linea cellulare) FITC isotiocianato di fluorescina HRP perossidasi del rafano IF immunofluorescenza IFAT test degli anticorpi a fluorescenza indiretta IHN(V) necrosi emopoietica infettiva (virus) IPN necrosi pancreatica infettiva (virus) MEM medium minimo essenziale OPD ortofenilendiammina PBS soluzione salina tamponata con fosfato RTG-2 gonade di trota iridea (linea cellulare) Tris-HCl tris (idrosimetil) metilammina - HCl VHS(V) setticemia emorragica virale (virus) (1*) Controlli sanitari