Nona direttiva 81/715/CEE della Commissione, del 31 luglio 1981, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali



Gazzetta ufficiale n. L 257 del 10/09/1981 pag. 0038 - 0046

edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 13 pag. 0233

edizione speciale spagnola: capitolo 03 tomo 23 pag. 0070

edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 13 pag. 0233

edizione speciale portoghese: capitolo 03 tomo 23 pag. 0070



++++ NONA DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE del 31 luglio 1981 che fissa i metodi d ' analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali ( 81/715/CEE ) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE , visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea , vista la direttiva 70/373/CEE del Consiglio , del 20 luglio 1970 , relativa all ' introduzione di modi di prelievo di campioni e di metodi di analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali ( 1 ) , modificata da ultimo dall ' atto di adesione della Grecia , in particolare l ' articolo 2 , considerando che la suddetta direttiva prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per animali destinati a constatare l ' osservanza delle condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative , regolamentari o amministrative , concernenti le qualità e la composizione degli alimenti per animali , siano effettuati secondo i modi di prelievo di campioni ed i metodi di analisi comunitari ; considerando che le direttive della Commissione 71/250/CEE ( 2 ) , 71/393/CEE ( 3 ) , 72/199/CEE ( 4 ) , 73/46/CEE ( 5 ) , 74/203/CEE ( 6 ) , 75/84/CEE ( 7 ) , 76/372/CEE ( 8 ) e 78/633/CEE ( 9 ) , modificate da ultimo dalla direttiva del 30 luglio 1981 , hanno già fissato un certo numero di metodi di analisi comunitari ; che , tenuto conto dello stato di avanzamento dei lavori sin qui effettuati , è necessario adottare una nona serie di metodi ; considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente degli alimenti per gli animali , HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA : Articolo 1 Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali , per quanto riguarda il loro contenuto in avoparcina e monensin sodio siano effettuate secondo i metodi descritti nell ' allegato . Articolo 2 Gli Stati membri mettono in vigore il 1° dicembre 1981 disposizioni legislative , regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alle disposizioni della presente direttiva e ne informano immediatamente la Commissione . Articolo 3 Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva . Fatto a Bruxelles , il 31 luglio 1981 . Per la Commissione Il Presidente Gaston THORN ( 1 ) GU n . L 170 del 3 . 8 . 1970 , pag . 2 . ( 2 ) GU n . L 155 del 12 . 7 . 1971 , pag . 13 . ( 3 ) GU n . L 279 del 20 . 12 . 1971 , pag . 7 . ( 4 ) GU n . L 123 del 29 . 5 . 1972 , pag . 6 . ( 5 ) GU n . L 83 del 30 . 3 . 1973 , pag . 21 . ( 6 ) GU n . L 108 del 22 . 4 . 1974 , pag . 7 . ( 7 ) GU n . L 32 del 5 . 2 . 1975 , pag . 26 . ( 8 ) GU n . L 102 del 15 . 4 . 1976 , pag . 8 . ( 9 ) GU n . L 206 del 29 . 7 . 1978 , pag . 43 . ALLEGATO 1 . DOSAGGIO DELL ' AVOPARCINA PER DIFFUSIONE IN AGAR 1 . OGGETTO E CAMPO D ' APPLICAZIONE Il presente metodo permette di dosare l ' avoparcina nei mangimi e nelle premiscele . Il limite inferiore di dosaggio è di 2 mg/kg ( 2 ppm ) . La presenza di antibiotici polietere può interferire nel dosaggio . 2 . PRINCIPIO Il campione viene estratto con una miscela acetone-aqua-acido cloridrico . L ' estratto è centrifugato : la sua attività antibiotica è determinata misurando la diffusione dell ' avoparcina su terreno agarizzato insemenzato con Bacillus subtilis . La diffusione è rivelata dalla formazione di aloni di inibizione del microrganismo . Si ammette che il diametro di tali aloni sia direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione di antibiotico nel campo delle concentrazioni utilizzate . 3 . MICRORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 ( NCIB 8054 ) 3.1 . Conservazione del ceppo Insemenzare con Bacillus subtilis il terreno colturale ( 4.1 ) , distribuito in provette a becco di clarino . Incubare per una notte a 30° C , conservare in frigorifero a 4° C circa e trapiantare ogni mese . 3.2 . Preparazione della sospensione di spore ( 1 ) Mediante 2-3 ml di acqua sterilizzata , raccogliere la patina di una agar-coltura ( 3.1 ) , preparata di recente . Con tale sospensione , insemenzare una bottiglia di Roux contenente 300 ml del terreno di coltura ( 4.1 ) ; incubare per 3-5 giorni a 30° C . Dopo controllo della sporulazione al microscopio , raccogliere le spore con 15 ml di etanolo ( 4.2 ) e omogenizzare . Questa sospensione può essere conservata per almeno 5 mesi alla temperatura di 4° C circa . 4 . TERRENI COLTURALI E REATTIVI 4.1 . Terreno di mantenimento del ceppo ( 2 ) Peptone * 6,0 g * Triptone * 4,0 g * Estratto di lievito * 3,0 g * Estratto di carne * 1,5 g * Glucosio * 1,0 g * Agar * 15,0 g * Acqua * 1 000 ml * pH 6,5 ( dopo sterilizzazione ) . 4.2 . Etanolo al 20 % ( v/v ) : diluire 200 ml di etanolo con 800 ml di acqua . 4.3 . Acido cloridrico , d : 1,18-1,19 . 4.4 . Soluzione 2 M di idrossido di sodio . 4.5 . Tampone fosfato 0,1 M : Fosfato monopotassico , KH2PO4 : 13,6 g . Acqua q.b . 1 000 ml . Portare il pH a 4,5 . 4.6 . Miscela acetone-acqua-acido cloridrico ( 4.3 ) : 65/32,5/2,5 ( v/v/v ) . 4.7 . Sostanza di riferimento : solfato di avoparcina ad attività nota . 5 . SOLUZIONI DI RIFERIMENTO Sciogliere nel tampone fosfato ( 4.5 ) una quantità di sostanza di riferimento ( 4.7 ) esattamente pesata e prossima ai 10 mg ; diluire col tampone in modo da ottenere una soluzione madre di avoparcina contenente 100 (...) g/ml . Se conservata a 4° C in bottiglia tappata , questa soluzione è stabile per sette giorni . 5.1 . Per le premiscele A partire da questa soluzione , preparare per diluizioni successive col tampone fosfato ( 4.5 ) le seguenti soluzioni : S8 * 4,0 (...) g/ml * S4 * 2,0 (...) g/ml * S2 * 1,0 (...) g/ml * S1 * 0,5 (...) g/ml * 5.2 . Per i mangimi A partire dalla soluzione madre , preparare per diluizioni successive col tampone fosfato ( 4.5 ) le seguenti soluzioni : S8 * 2,0 (...) g/ml * S4 * 1,0 (...) g/ml * S2 * 0,5 (...) g/ml * S1 * 0,25 (...) g/ml * 6 . PREPARAZIONE DELL ' ESTRATTO E DELLE SOLUZIONI 6.1 . Premiscele Pesare , con l ' approssimazione di 10 mg , una quantità di campione contenente da 10 a 100 mg di avoparcina ; travasare in pallone tarato da 100 ml , aggiungere 60 ml della miscela ( 4.6 ) e sottoporre per 15 minuti ad agitazione meccanica . Verificare il pH e , se necessario , portarlo a 2 con acido cloridrico ( 4.3 ) . Portare a volume con la miscela ( 4.6 ) ed omogenizzare . Filtrare una parte del liquido su carta da filtro adatta ( per es . Whatman n . 1 ) , scartando i primi cinque ml di filtrato . Prelevare un ' aliquota e portare il pH a 4,5 con la soluzione di idrossido di sodio ( 4.4 ) . Diluire questa soluzione con tampone fosfato ( 4.5 ) , fino ad ottenere una concentrazione presunta in avoparcina , pari a 4 (...) g/ml ( = U8 ) . A partire da questa soluzione , preparare per diluizioni successive ( 1 + 1 ) col tampone fosfato ( 4.5 ) le soluzioni U4 ( concentrazione presunta : 2 (...) g/ml ) , U2 ( concentrazione presunta : 1 (...) g/ml ) ed U1 ( concentrazione presunta : 0,5 ( ...)g/ml ) . 6.2 . Mangimi Pesare una quantità di campione da 50,0 g , aggiungere 100 ml della miscela ( 4.6 ) e sottoporre per 30 minuti ad agitazione meccanica . Chiarificare l ' estratto per centrifugazione ( in provette tappate ) , prelevare un ' aliquota dell ' estratto limpido ( vedi tabella più oltre ) e portare il pH a 4,5 con la soluzione di idrossido di sodio ( 4.4 ) . Diluire la soluzione con tampone fosfato ( 4.5 ) per ottenere la soluzione U8 ( vedi tabella più oltre ) . A partire da questa soluzione , preparare per diluizioni successive ( 1 + 1 ) col tampone fosfato ( 4.5 ) le soluzioni U4 ( concentrazione presunta : 1,0 (...) g/ml ) , U2 ( concentrazione presunta : 0,5 (...) g/ml ) ed U 1 ( concentrazione presunta : 0,25 (...) g/ml ) . Tenore presunto in avoparcina ( mg/kg ) * 5 * 7,5 * 10 * 15 * 20 * 40 * Peso del campione in g ( ± 0,1 g ) * 50 * 50 * 50 * 50 * 50 * 50 * Volume della miscela ( 4.6 ) ( ml ) * 100 * 100 * 100 * 100 * 100 * 100 * Volume dell ' estratto limpido ( ml ) * 20 * 15 * 20 * 15 * 20 * 10 * Volume finale ( ml ) : U8 * 25 * 25 * 50 * 50 * 100 * 100 * Concentrazione presunta U8 in (...) g/ml * 2 * 2 circa * 2 * 2 circa * 2 * 2 * 7 . MODALITÀ DI DOSAGGIO 7.1 . Inoculazione del terreno di coltura Con la sospensione di spore ( 3.2 ) , insemenzare alla temperatura di 50-60° C il terreno base per il dosaggio ( 4.1 ) . Mediante saggi preliminari su piastra col terreno ( 4.1 ) , determinare la quantità d ' inoculo che consente di ottenere , per le diverse concentrazioni in avoparcina , aloni d ' inibizione che abbiano la maggiore estensione possibile e che siano ancora netti . 7.2 . Preparazione delle piastre La diffusione in agar si effettua su piastre , con le quattro concentrazioni della soluzione di riferimento ( S8 , S4 , S2 , S1 ) e le quattro concentrazioni dell ' estratto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Ogni piastra deve necessariamente contenere le quattro concentrazioni della sostanza di riferimento e dell ' estratto . A tale scopo , impiegare piastre di dimensioni tali che possano contenere nel terreno agarizzato almeno 8 pozzetti del diametro di 10-13 mm , i cui centri non siano distanti fra loro meno di 30 mm . Si possono adoperare come piastre delle lastre di vetro piane , provviste di un anello di alluminio o di materiale plastico del diametro di 200 mm e dell ' altezza di 20 mm . Versare nelle piastre una quantità di terreno ( 4.1 ) , insemenzato come indicato al punto ( 7.1 ) , che permetta di ottenere uno strato dello spessore di 2 mm circa ( 60 ml per una piastra di 200 mm di diametro ) . Lasciar solidificare , praticare i pozzetti e deporvi dei volumi esattamente misurati delle soluzioni della sostanza di riferimento e dell ' estratto ( da 0,10 a 0,15 ml per pozzetto a seconda del diametro ) . Le operazioni descritte vanno ripetute almeno quattro volte per ogni concentrazione , in modo da ottenere per ciascuna determinazione 32 aloni di inibizione . 7.3 . Incubazione Incubare le piastre per 16-18 ore , alla temperatura di 30° C . 8 . VALUTAZIONE Misurare il diametro degli aloni di inibizione con l ' approssimazione di 0,1 mm . Per ogni concentrazione , registrare le misure medie su carta semilogaritmica , riportando il logaritmo alle concentrazioni in funzione del diametro dell ' alone di inibizione . Tracciare le rette più appropriate per la soluzione di riferimento e per l ' estratto , procedendo ad esempio come segue . Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della soluzione di riferimento ( SL ) mediante la formula : ( a ) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8/10 Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato della soluzione di riferimento ( SH ) mediante la formula : ( b ) SH = 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1/10 Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per l ' estratto al livello più basso ( UL ) ed al livello più alto ( UH ) sostituendo nelle formule sopra riportate i valori di S1 , S2 , S4 e S8 con quelli di U1 , U2 , U4 ed U8 . Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico . Congiungendo i due punti si ottiene la retta più appropriata per la soluzione standard . Procedendo allo stesso modo per UL ed UH si ottiene la retta più appropriata per l ' estratto . In mancanza di interferenze le rette dovrebbero essere parallele . In pratica , esse sono considerate parallele allorchù ( SH-SL ) ed ( UH-UL ) non differiscono fra loro di più del 10 % della loro media . Se le rette non sono parallele , ù possibile eliminare sia U1 ed S1 , sia U8 e S8 . I valori SL , SH , UL ed UH che permettono di ottenere le rette più appropriate vanno calcolati mediante le formule seguenti : ( a' ) SL = 5 S1 + 2 S2 - S4/6 o 5 S2 + 2 S4 - S8/6 ( b' ) SH = 5 S4 + 2 S2 - S1/6 o 5 S8 + 2 S4 - S2/6 e mediante formule analoghe per UL ed UH . Se si utilizza quest ' alternativa , bisogna verificare il parallelismo delle rette nel modo sopra descritto . Se il risultato è stato ottenuto a partire da tre punti , ciò va indicato sul certificato di analisi . Quando le rette sono considerate parallele , calcolare il logaritmo dell ' attività relativa ( log . A ) con una delle formule seguenti : Per 4 punti ( c ) log . A = ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) × 0,602/U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 Per 3 punti ( d ) log . A = ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) × 0,401/U4 + S4 - U1 - S1 o ( d' ) log . A = ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) × 0,401/U8 + S8 - U2 - S2 Attività reale = attività presunta × attività relativa . Se l ' attività relativa si trova al di fuori della gamma di valori compresi fra 0,5 e 2,0 , ripetere la determinazione procedendo ad opportune regolazioni delle concentrazioni dell ' estratto o , eventualmente , delle soluzioni di riferimento . Quando tale attività non può essere ricondotta nella gamma di valori richiesta , il risultato deve essere considerato approssimativo e tale indicazione deve figurare sul certificato di analisi . Allorchù le rette non sono considerate parallele , ripetere la determinazione . Se in base a questa nuova determinazione non è ancora possibile ottenere il parallelismo , la determinazione deve essere considerata insoddisfacente . 9 . RIPETIBILITÀ La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione dallo stesso analista non dovrebbe eccedere : - 2mg/kg , in valore assoluto , per i contenuti in avoparcina da 2 a 10mg/kg ; - il 20 % del risultato più elevato per i contenuti da 10 a 25 mg/kg ; - 5 mg/kg , in valore assoluto , per i contenuti da 25 a 50 mg/kg ; - il 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 mg/kg . 2 . DOSAGGIO DEL MONENSIN SODIO PER DIFFUSIONE IN AGAR 1 . OGGETTO E CAMPO D ' APPLICAZIONE Il presente metodo permette di dosare il monensin sodio nei mangimi e nelle premiscele . Il limite inferiore di dosaggio è di 10 mg/kg ( 10 ppm ) ( 3 ) . 2 . PRINCIPIO Il campione viene estratto con metanolo al 90 % . L ' estratto è sottoposto a trattamenti appropriati al contenuto in monensin sodio del campione . La sua attività antibiotica è determinata misurando la diffusione del monensin sodio su terreno agarizzato insemenzato con Bacillus subtilis . La diffusione è rivelata dalla formazione di aloni di inibizione del microrganismo . Si ammette che il diametro di tali aloni sia direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione di antibiotico nel campo di concentrazioni utilizzate . La sensibilità del metodo è ridotta dalla presenza di ioni sodio . 3 . MICRORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 ( NCIB 8054 ) 3.1 . Conservazione del ceppo Insemenzare con Bacillus subtilis il terreno colturale ( 4.1 ) , distribuito in provette a becco di clarino . Incubare per una notte a 30° C , conservare in frigorifero a 4° C circa e trapiantare ogni mese . 3.2 . Preparazione della sospensione di spore ( 1 ) Mediante 2-3 ml di acqua sterilizzata , raccogliere la patina di una agar-coltura ( 3.1 ) , preparata di recente . Con tale sospensione , insemenzare una bottiglia di Roux contenente 300 ml del terreno di coltura ( 4.1 ) ; incubare per 3-5 giorni a 30° C . Dopo controllo della sporulazione al microscopio , raccogliere le spore con 15 ml di etanolo al 20 % ( 4.3 ) e omegenizzare . Questa sospensione può essere conservata per almeno 5 mesi alla temperatura di 4° C circa . 4 . TERRENI COLTURALI E REATTIVI 4.1 . Terreno di mantenimento del ceppo ( 4 ) Triptone * 10,0 g * Estratto di lievito * 3,0 g * Estratto di carne * 1,5 g * Glucosio * 1,0 g * Agar ( secondo la qualità ) * da 10,0 a 20,0 g * Acqua * 1 000 ml * pH 6,5 ( dopo sterilizzazione ) . 4.2 . Terreno di base per il dosaggio Glucosio * 10,0 g * Estratto di lievito * 2,5 g * Fosfato bitopotassico , K2HPO4 * 0,69 g * Fosfato monopotassico , KH2PO4 * 0,45 g Agar ( secondo la qualità ) * da 10,0 a 20,0 g * Acqua * 1 000 ml * pH 6,0 ( dopo sterilizzazione ) . 4.3 . Etanolo al 20 % ( v/v ) : diluire 200 ml di etanolo con 800 ml di acqua . 4.4 . Metanolo , anidro . 4.5 . Metanolo al 90 % ( v/v ) : diluire 900 ml di metanolo ( 4.4 ) con 100 ml d ' acqua . 4.6 . Metanolo al 50 % ( v/v ) : diluire 500 ml di metanolo ( 4.4 ) con 500 ml d ' acqua . 4.7 . Ossido d ' alluminio , granulato ( alcoa F , 20 mesh ; activated alumina UGI : F . Lancaster and Co . , o equivalente ) . 4.8 . Sostanza di riferimento : monensin sodio di attività nota ( disponibile segnatamente presso , l ' International Laboratory for Biological Standards , Central Veterinany Laboratory , Weybridge , Surrey KT15 3NB , Gran Bretagna ) . 5 . APPARECCHIATURA 5.1 . Evaporatore rotante , provvisto di pallone a fondo rotondo da 250 ml . 5.2 . Tubo per cromatografia , in vetro ( diametro interno : 25 mm , lunghezza : 400 mm ) , recante ad un ' estremità un ' apertura affusolata del diametro di 2 mm . 5.3 . Tubo per cromatografia , in vetro ( diametro interno : 11 mm , lunghezza : 300 mm circa ) , recante ad un ' estremità un ' apertura affusolata del diametro di 2 mm . 6 . SOLUZIONI DI RIFERIMENTO Sciogliere in metanolo ( 4.4 ) una quantità esattamente pesata di sostanza di riferimento ( 4.8 ) e diluire in modo da ottenere una soluzione madre di monensin sodio contenente 800 (...) g . Se conservata a 4° C in bottiglia tappata , questa soluzione è stabile per due settimane . A partire da questa soluzione , preparare per diluizioni successive con metanolo al 50 % ( 4.6 ) le seguenti soluzioni : S8 * 8 (...) g/ml * S4 * 4 (...) g/ml * S2 * 2 (...) g/ml * S2 * 2 (...) g/ml * 7 . PREPARAZIONE DELL ' ESTRATTO 7.1 . Estrazione 7.1.1 . Premiscele Pesare una quantità di campione di 2,0 g , aggiungere 100 ml di metanolo al 90 % ( 4.5 ) , omogenizzare , poi centrifugare per qualche minuto . Diluire il supernatente con metanolo al 50 % ( 4.6 ) , fino ad ottenere una concentrazione presunta in monensin pari ad 8 (...) g/ml ( = U8 ) . 7.1.2 . Alimenti con tenore in monensin sodio non inferiore a 50 ppm Pesare una quantità di campione da 10,0 a 20,0 g , aggiungere 100 ml di metanolo al 90 % ( 4.5 ) , omogenizzare per 15 minuti e lasciare riposare . Introdurre un tampone di cotone nell ' apertura affusolata del tubo di vetro ( 5.2 ) , aggiungere ossido di alluminio ( 4.7 ) , impartendo leggere scosse al tubo , finchù la colonna raggiunga l ' altezza di 75-80 mm . Decantare l ' estratto sulla colonna di ossido di alluminio e raccogliere il filtrato . Prelevare 30 ml del filtrato e diluirli con acqua a 50 ml . Diluire poi con metanolo al 50 % ( 4.6 ) fino ad ottenere una concentrazione presunta in monensin sodio pari a 8 (...) g/ml ( = U8 ) . 7.1.3 . Alimenti con tenore in monensin sodio inferiore a 50 ppm ( fino al limite di 10 ppm ) Pesare una quantità di campione da 10,0 a 20,0 g , aggiungere 100 ml di metanolo al 90 % ( 4.5 ) ed omogenizzare per 15 minuti . Centrifugare in modo da ottenere un estratto limpido . Per un campione il cui contenuto in monensin sodio è di 20 ppm , prelevare 40 ml del supernatante ; per un campione il cui contenuto è di 10 ppm , prelevarne 80 ml . Portare a secco con l ' evaporatore rotante ( 5.1 ) , a temperatura non superiore a 40° C . Disciogliere il residuo in 10 ml di metanolo al 90 % ( 4.5 ) . Introdurre un tampone di cotone nell ' apertura affusolata del tubo di vetro ( 5.3 ) ; aggiungere ossido di alluminio ( 4.7 ) , impartendo leggere scosse al tubo , finchù la colonna raggiunga l ' altezza di 75-80 mm . Decantare la soluzione metanolica del residuo sulla colonna di ossido di alluminio e raccogliere il filtrato . Lavare la colonna con 10 ml di metanolo al 90 % ( 4.5 ) ed aggiungere il liquido di risciacquo al filtrato . Portare la soluzione a secco con l ' evaporatore rotante ( 5.1 ) , a temperatura inferiore a 40° C . Disciogliere il residuo in 10 ml di metanolo anidro ( 4.4 ) e portare a 20 ml con acqua . Centrifugare ad almeno 4 000 g/m per almeno 5 minuti . Diluire poi con metanolo al 50 % ( 4.6 ) , fino ad ottenere una concentrazione presunta in monensin sodio pari a 8 (...) g/ml ( = U8 ) . 7.2 . Soluzione dell ' estratto A partire dalla soluzione U8 , preparare per diluizioni successive ( 1 + 1 ) con metanolo al 50 % ( 4.6 ) le soluzion U 4 ( concentrazione presunta : 4 (...) g/ml ) , U2 ( concentrazione presunta : 2 (...) g/ml e U 1 ( concentrazione presunta : 1 (...) g/ml ) . 8 . MODALITÀ DI DOSAGGIO 8.1 . Inoculazione del terreno di coltura Con la sospensione di spore ( 3.2 ) , insemenzare il terreno base per il dosaggio ( 4.2 ) , alla temperatura di 50-60° C . Mediante saggi preliminari su piastra col terreno ( 4.2 ) , determinare la quantità di inoculo che consente di ottenere , per le diverse concentrazioni in monensin sodio , aloni di inibizione che abbiano la maggiore estensione possibile e che siano ancora netti . 8.2 . Preparazione delle piastre La diffusione in agar si effettua su piastre con le quattro concentrazioni della soluzione di riferimento ( S8 , S4 , S2 , S1 ) e le quattro concentrazioni dell ' estratto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Ogni piastra deve necessariamente contenere le quattro concentrazioni della sostanza di riferimento dell ' estratto . A tale scopo , impiegare piastre di dimensioni tali che possano contenere nel terreno agarizzato almeno 8 pozzetti del diametro di 10-13 mm , i cui centri non siano distanti fra loro meno di 30 mm . Si possono adoperare come piastre delle lastre di vetro piane provviste di un anello di alluminio o di materiale plastico del diametro di 200 mm e dell ' altezza di 20 mm . Versare nelle piastre una quantità di terreno ( 4.2 ) , insemenzato come indicato al punto ( 8.1 ) , che permetta di ottenere uno strato dello spessore di 2 mm circa ( 60 ml per una piastra di 200 mm di diametro ) . Lasciar solidificare , praticare i pozzetti e deporvi dei volumi esattamente misurati delle soluzioni della sostanza di riferimento e dell ' estratto ( da 0,10 a 0,15 ml per pozzetto a seconda del diametro ) . Le operazioni descritte vanno ripetute almeno quattro volte per ogni concentrazione , in modo da ottenere per ciascuna determinazione 32 aloni di inibizione . 8.3 . Incubazione Incubare le piastre per 18 ore circa , alla temperatura di 35-37° C . 9 . VALUTAZIONE Misurare il diametro degli aloni di inibizione con l ' approssimazione di 0,1 mm . Per ogni concentrazione , registrare le misure medie su carta semilogaritmica riportando il logaritmo delle concentrazioni in funzione del diametro dell ' alone di inibizione . Tracciare le rette più appropriate per la soluzione di riferimento e per l ' estratto , procedendo ad esempio come segue . Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della soluzione di riferimento ( SL ) mediante la formula : ( a ) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2S8/10 Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato della soluzione di riferimento ( SH ) mediante la formula : ( b ) SH = 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1/10 Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per l ' estratto al livello più basso ( UL ) ed al livello più alto ( UH ) sostituendo nelle formule sopra riportate i valori di S1 , S2 , S4 e S8 con quelli di U1 , U2 , U4 , ed U8 . Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico . Congiungendo i due punti si ottiene la retta più appropriata per la soluzione standard . Procedendo allo stesso modo per UL ed UH si ottiene la retta più appropriata per l ' estratto . In mancanza di interferenze le rette dovrebbero essere parallele . In pratica , esse sono considerate parallele allorchù ( SH-SL ) ed ( UH-UL ) non differiscono fra loro di più del 10 % della loro media . Se le rette non sono parallele , è possibile eliminare sia U1 e S1 , sia U8 e S8 . I valori SL , SH , UL ed UH che permettono di ottenere le rette più appropriate vanno calcolati mediante le formule seguenti : ( a' ) SL = 5 S1 + 2 S2 - S4/6 o 5 S2 + 2 S4 - S8/6 ( b' ) SH = 5 S4 + 2 S2 - S1/6 o 5 S8 + 2 S4 - S2/6 e mediante formule analoghe per UL ed UH . Se si utilizza quest ' alternativa , bisogna verificare il parallelismo dette rette nel modo sopra descritto . Se il risultato è stato ottenuto a partire da tre punti , ciò va indicato sul certificato di analisi . Quando le rette sono considerate parallele , calcolare il logaritmo dell ' attività relativa ( log . A ) con una delle formule seguenti : Per 4 punti ( c ) log . A = ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) × 0,602/U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 Per 3 punti ( d ) log . A = ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) × 0,401/U4 + S4 - U1 - S1 o ( d' ) log . A = ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) × 0,401/U8 + S8 - U2 - S2 Attività reale = attività presunta × attività relativa . Se l ' attività relativa si trova al di fuori della gamma di valori compresi fra 0,5 e 2,0 , ripetere la determinazione procedendo ad opportune regolazioni delle concentrazioni dell ' estratto o , eventualmente , delle soluzioni di riferimento . Quando tale attività non può essere ricondotta nella gamma di valori richiesta , il risultato deve essere considerato approssimativo e tale indicazione deve figurare sul certificato di analisi . Allorchù le rette non sono considerate parallele , ripetere la determinazione . Se in base a questa nuova determinazione non è ancora possibile ottenere il parallelismo , la determinazione deve essere considerata insoddisfacente . 10 . RIPETIBILITÀ La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo stesso campione dallo stesso analista non dovrebbe eccedere : - il 20 % del risultato più elevato per i contenuti in monensin sodio da 10 a 25 mg/kg ; - 5 mg/kg , in valore assoluto , per i contenuti da 25 a 50 mg/kg ; - il 10 % del risultato più elevato per i contenuti superiori a 50 mg/kg . ( 1 ) Possono essere impiegati altri metodi , purchù sia dimostrato che essi diano sospensioni di spore analoghe . ( 2 ) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio che dia gli stessi risultati . ( 3 ) 1 mg di monensin sodio equivale a 1 000 unità « UK » ( 4 ) Si può utilizzare qualunque terreno colturale del commercio di composizione analoga , purchù dia gli stessi risultati .