Regolamento (CEE) n. 2676/90 della Commissione, del 17 settembre 1990, che determina i metodi di analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino



Gazzetta ufficiale n. L 272 del 03/10/1990 pag. 0001 - 0192

edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 34 pag. 0005

edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 34 pag. 0005



Progetto di REGOLAMENTO (CEE) N. 2676/90 DELLA COMMISSIONE del 17 settembre 1990 che determina i metodi d'analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea, visto il regolamento (CEE) n. 822/87 del Consiglio, del 16 marzo 1987, relativo all'organizzazione del mercato vitivinicolo (1), modificato dal regolamento (CEE) n. 1325/90 (2), in particolare l'articolo 74, considerando che l'articolo 74, paragrafo 1 del regolamento (CEE) n. 822/87 prescrive l'adozione dei metodi di analisi che consentono di determinare la composizione dei prodotti di cui all'articolo 1 del regolamento in causa e definisce le norme che consentono di stabilire se questi prodotti hanno subito dei trattamenti in violazione delle pratiche enologiche autorizzate; considerando che, non avendo la Comunità fissato ancora i limiti quantitativi della presenza degli elementi che caratterizzano il ricorso a certe pratiche enologiche e le tabelle che consentono il confronto dei dati analitici, è opportuno autorizzare gli Stati membri a determinare tali limiti; considerando che l'articolo 13, paragrafo 1 del regolamento (CEE) n. 822/87 prevede un esame analitico riguardante come minimo i valori degli elementi caratteristici del v.q.p.r.d. in questione che figurano tra quelli enumerati nell'allegato del regolamento stesso; considerando che il controllo delle indicazioni figuranti nei documenti relativi ai prodotti in oggetto rende necessaria l'adozione di metodi d'analisi uniformi che permettano di ottenere dati precisi e comparabili; che tali metodi devono pertanto essere obbligatori per ogni transazione commerciale ed ogni operazione di controllo; che, date le esigenze di controllo e le limitate possibilità del commercio, è tuttavia opportuno ammettere un numero limitato di procedimenti usuali che consentano una determinazione rapida e sufficientemente sicura degli elementi ricercati; considerando che è opportuno adottare, per quanto possibile, metodi che sono unanimemente riconosciuti, ad esempio i metodi sviluppati nell'ambito della Convenzione internazionale per l'unificazione dei metodi d'analisi e di apprezzamento dei vini del 1954 pubblicati dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi del vino; considerando che il regolamento (CEE) n. 1108/82 (3) fissa alcuni metodi d'analisi comunitari applicabili nel settore del vino; che, tenuto conto del progresso scientifico, si è reso necessario sostituire con metodi più appropriati taluni metodi, modificarne altri ed introdurne di nuovi, in particolare quelli approvati successivamente dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino; che, a causa dell'elevato numero e della complessità di tali adattamenti, è opportuno raggruppare tutti i metodi di analisi in un nuovo regolamento ed abrogare il regolamento (CEE) n. 1108/82; considerando che, per assicurare la comparabilità dei risultati ottenuti applicando i metodi d'analisi di cui all'articolo 74 del regolamento (CEE)n. 822/87, è opportuno fare riferimento, per quanto concerne la ripetibilità e la riproducibilità di tali risultati, alle definizioni fissate dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino; considerando che, per tenere conto del progresso scientifico e della dotazione dei laboratori ufficiali e per rendere il lavoro di tali laboratori più efficace e produttivo, è opportuno consentire l'applicazione dei metodi di analisi automatizzati a talune condizioni; che è opportuno precisare che, in caso di controversie, i metodi automatizzati non possono sostituire i metodi di riferimento ed i metodi usuali; considerando che i risultati di una misurazione di densità con il metodo automatizzato basato sul principio del risonatore di flessione sono, in quanto ad accuratezza, ripetibilità e riproducibilità, almeno pari ai risultati ottenuti con i metodi descritti al punto 1 dell'allegato del presente regolamento per la misurazione della massa volumica o della densità relativa; che è quindi opportuno, ai sensi dell'articolo 74, paragrafo 3 del regolamento (CEE) n. 822/87, considerare detto metodo automatizzato equivalente ai metodi di cui all'allegato del presente regolamento; considerando che il modo di operare descritto al capitolo 25, punto 2.2.3.3.2 dell'allegato al presente regolamento per l'analisi del tenore di biossido di zolfo totale dei vini e dei mosti aventi un tenore presunto inferiore a 50 mg/l permette una migliore estrazione di questa sostanza in rapporto al modo di operare descritto nel capitolo 13, punto 13.4 dell'allegato al regolamento (CEE) n. 1108/82; che in tal modo si ottengono tenori più elevati in biossido di zolfo totale che possono superare, specialmente nel caso di alcuni succhi di uva il limite massimo prescritto; che, allo scopo di evitare difficoltà per lo smaltimento di succhi di uva, già elaborati al momento dell'entrata in vigore del presente regolamento ed in attesa che i processi di elaborazione siano adattati per ottenere una desolfitazione più completa dei mosti muti di uva, è necessario permettere durante un periodo transitorio che il modo di operare descritto nel regolamento precitato sia ancora utilizzato; considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i vini, HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO: Articolo 1 1. I metodi d'analisi comunitari applicabili nel settore del vino che consentono, nelle transazioni commerciali e nelle operazioni di controllo: - di stabilire la composizione dei prodotti di cui all'articolo 1 del regolamento (CEE) n. 822/87, -di accertare se i prodotti di cui trattasi hanno subito trattamenti che contravvengono alle pratiche enologiche autorizzate, sono quelli riportati nell'allegato del presente regolamento. 2. Per le sostanze per le quali sono stati fissati metodi di riferimento e metodi usuali, prevalgono i risultati ottenuti applicando i metodi di riferimento. Articolo 2 Ai fini dell'applicazione del presente regolamento: a) la ripetibilità rappresenta il valore al di sotto del quale è situato, con una probabilità specificata, il valore assoluto della differenza tra due singoli risultati ottenuti mediante misure effettuate nelle stesse condizioni (stesso operatore, stesso apparecchio, stesso laboratorio e breve intervallo di tempo; b) la riproducibilità rappresenta il valore al di sotto del quale è situato, con una probabilità specificata, il valore assoluto della differenza tra due singoli risultati ottenuti in condizioni diverse (operatori diversi, apparecchiature diverse e/o laboratori diversi e/o tempi diversi). Per «singolo risultato» si intende il valore ottenuto applicando una volta e completamente il metodo di analisi normalizzato su un solo campione. In assenza di indicazioni la probabilità è del 95 %. Articolo 3 1. Sotto la responsabilità del direttore del laboratorio, i metodi di analisi automatizzati sono ammessi a condizione che la ripetibilità e la riproducibilità dei risultati siano almeno equivalenti a quelle dei risultati ottenuti con i metodi di analisi di cui all'allegato. In caso di controversie, i metodi automatizzati non possono prevalere su quelli riportati in allegato. 2. Il metodo automatizzato per la misura della densità, basato sul principio della variazione della frequenza di oscillazione, è considerato equivalente ai metodi di cui al punto 1 dell'allegato del presente regolamento. Articolo 4 Quando si fa riferimento all'acqua per le soluzioni, le diluizioni o i lavaggi, si intende sempre acqua distillata o acqua demineralizzata di purezza almeno equivalente. Tutti i prodotti chimici devono essere di purezza analitica, salvo specificazioni diverse. Articolo 5 Il regolamento (CEE) n. 1108/82 è abrogato. Tuttavia l'articolo 1, paragrafo 4 del regolamento precitato resta applicabile fino al 31 dicembre 1990. Articolo 6 Il presente regolamento entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Esso è applicabile a decorrere dal 1o ottobre 1990. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 17 settembre 1990. Per la CommissioneRay MAC SHARRYMembro della Commissione Nota: Le tabelle, i diagrammi e una parte delle figure riportati nell'allegato sono stati messi a disposizione della Commissione delle Comunità europee dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino di Parigi. (1)GU n. L 84 del 27. 3. 1987,pag. 1. (2)GU n. L 132 del 23. 5. 1990,pag. 19. (3)GU n. L 133 del 14. 5. 1982,pag. 1. ALLEGATO 1. MASSA VOLUMICA A 20 °C E DENSITÀ RELATIVA A 20 °C 1. DEFINIZIONI La massa volumica è il rapporto fra la massa di un certo volume di vino o di mosto a 20 °C e il volume stesso. Si esprime in grammi per millilitro ed il suo simbolo è r 20 °C. La densità relativa a 20 °C o densità 20 °C/20 °C è il rapporto, espresso in numeri decimali, fra la massa di un certo volume di vino o di mosto a 20 °C e la massa dello stesso volume di acqua alla stessa temperatura. Il suo simbolo è d20 °C20 °C2. PRINCIPIO DEI METODI La massa volumica e la densità relativa a 20 °C vengono determinati sul campione di analisi: - mediante picnometria: metodo di riferimento; - mediante areometria o densimetria per mezzo della bilancia idrostatica: metodi usuali. Osservazione:Per determinazioni molto precise, la massa volumica deve essere corretta dell'azione del biossido di zolfo: r2 20 °C = r2 20 °C 0,0006 · Sr2 20 °C = massa volumica correttar2 20 °C = massa volumica osservataS = biossido di zolfo totale in g/l3. TRATTAMENTO PRELIMINARE DEL CAMPIONE Se il vino o il mosto contengono quantità notevoli di biossido di carbonio, eliminarne la maggior parte agitando 250 ml di campione in un pallone da 1 000 ml o filtrando sotto vuoto su 2 g di cotone collocato in un'allunga.4. METODO DI RIFERIMENTO 4.1. ApparecchiaturaMateriale d'uso comune in laboratorio, in particolare: 4.1.1. Picnometro (1), in vetro pyrex da circa 100 ml provvisto di un termometro mobile con raccordo smerigliato, graduato in decimi di grado da 10 °C a 30 °C. Tale termometro deve essere controllato (fig. 1). Fig. 1 Picnometro e relativo pallone tara Detto picnometro porta un tubo laterale di 25 mm di lunghezza e di 1 mm al massimo di diametro interno, terminante con una parte conica smerigliata. Questo tubo laterale può essere chiuso da un «tappo ricevitore» costituito da un tubo conico smerigliato terminante con una parte affilata. Questo tappo serve da camera di dilatazione. Le due smerigliature dell'apparecchiatura devono essere realizzate con la massima cura. 4.1.2. Pallone tara avente lo stesso volume esterno del picnometro (a meno di circa 1 ml) e di massa uguale alla massa del picnometro pieno di un liquido di densità 1,01 (soluzione al 2 % m/v di cloruro di sodio). Involucro coibentato che si adatta perfettamente al corpo del picnometro. 4.1.3. Bilancia a due piatti con portata di almeno 300 g e sensibilità di 0,1 mg, oppure bilancia monopiatto con portata di almeno 200 g e sensibilità di 0,1 mg.4.2. Taratura del picnometro La taratura del picnometro comporta la determinazione delle seguenti caratteristiche:- tara a vuoto,- volume a 20 °C,- massa dell'acqua a 20 °C.4.2.1. Utilizzazione di una bilancia a due piatti Una volta collocato il pallone tara sul piatto sinistro della bilancia ed il picnometro pulito ed asciutto munito del relativo «tappo ricevitore» sul piatto destro, raggiungere l'equilibrio ponendo accanto al picnometro i pesi necessari: p grammi. Riempire con cura il picnometro con acqua distillata a temperatura ambiente ed immergere il termometro; asciugare con cura il picnometro e collocarlo nell'involucro coibentato; agitare capovolgendo finché la temperatura letta al termometro sia costante. Portare il livello esattamente al bordo superiore del tubo laterale. Asciugare questo tubo ed applicare il «tappo ricevitore»; leggere la temperatura t °C con accuratezza ed effettuare l'eventuale correzione della scala del termometro. Pesare il picnometro pieno d'acqua: sia p2 la massa in grammi che realizza l'equilibrio. Calcoli (2) Tara del picnometro vuoto:Tara a vuoto = p + mm = massa d'aria contenuta nel picnometrom = 0,0012 (p p2) Volume a 20 °C:V20 °C = (p + m p2) · FtFt = fattore ricavato dalla tabella I per la temperatura t °CV20 °C deve essere noto con l'approssimazione di ± 0,001 ml Massa in acqua a 20 °C:M20 °C = V20 °C· 0,9982030,998203 = massa volumica dell'acqua a 20 °C. 4.2.2. Utilizzazione di una bilancia monopiatto Determinare:- la massa del picnometro pulito ed asciutto: P;- la massa del picnometro pieno d'acqua, a t °C: P1 seguendo le indicazioni di cui al punto 4.2.1;- la massa del pallone tara To. Calcoli (3): Tara del picnometro vuoto:Tara a vuoto: P mm = massa d'aria contenuta nel picnometrom = 0,0012 (P1 P) Volume a 20 °CV20 °C = [P1 (P m)] · FtFt = fattore ricavato nella tabella I in corrispondenza alla temperatura t °CIl volume a 20 °C deve essere noto con l'approssimazione di ± 0,001 ml. Massa dell'acqua a 20 °C.M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = massa volumica dell'acqua a 20 °C.4.3. Modo di operare (3) 4.3.1. Utilizzazione di una bilancia a due piatti Pesare il picnometro riempito con il campione preparato per l'analisi (3) secondo le indicazioni descritte al punto 4.2.1. Sia p" la massa in grammi che realizza l'equilibrio a t °C. Massa del liquido contenuto nel picnometro = p + m p". Massa volumica apparente a t °C: Calcolare la massa volumica a 20 °C con l'aiuto di una delle tabelle di correzione riportate di seguito, in funzione della natura del liquido studiato: vino secco (tabella II), mosto naturale o concentrato (tabella III), vino dolce (tabella IV). Si esprime la densità 20 °C/20 °C del vino dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.4.3.2.Utilizzazione di una bilancia monopiatto Pesare il pallone tara, sia T1 la sua massa.Calcolare dT = T1 T0.Massa del picnometro vuoto al momento della misurazione = P m + dT. Pesare il picnometro riempito con il campione preparato per l'analisi (3), seguendo le istruzioni riportate al punto 4.2.1. Sia P2 la massa misurata a t °C. Massa del liquido contenuto nel picnometro a t °C = P2 (P m + dT). Massa volumica apparente a t °C: Calcolare la massa volumica a 20 °C del liquido studiato (vino secco, mosto naturale e concentrato, vino dolce) con il procedimento indicato al punto 4.3.1. La densità 20 °C/20 °C si ottiene dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203. 4.3.3. Ripetibilità sulla massa volumica:- per i vini secchi e amabili: r = 0,00010; - per i vini dolci: r = 0,00018. 4.3.4. Riproducibilità sulla massa volumica:- per i vini secchi e amabili: R = 0,00037;- per i vini dolci: R = 0,00045.5. METODI USUALI 5.1.Areometro 5.1.1. Apparecchiatura 5.1.1.1. Areometro Per quanto riguarda le dimensioni e le graduazioni, gli areometri devono soddisfare alle prescrizioni dell'ISO. Essi debbono avere una carena cilindrica ed una cannello di sezione circolare di almeno 3 mm di diametro. Per i vini secchi, devono essere graduati da 0,983 a 1,003 in millesimi e quinti di millesimo. Ogni millesimo deve distare almeno 5 mm dal millesimo successivo. Per la misura della densità dei vini dealcolizzati, dei vini dolci e dei mosti, si userà una serie di 5 areometri graduati rispettivamente da 1,000 a 1,030; 1,030 a 1,060; 1,060 a 1,090; 1,090 a 1,120; 1,120 a 1,150. Questi apparecchi devono essere tarati in masse volumiche a 20 °C con divisioni almeno in millesimi e mezzi millesimi. Ogni millesimo deve inoltre distare almeno 3 mm dal millesimo successivo. Questi areometri devono essere graduati in modo da essere letti alla «sommità del menisco». L'indicazione della graduazione in massa volumica a 20 °C o in densità relativa a 20 °C e della lettura al livello del menisco sarà riportata sia sulla scala graduata, sia su una striscia di carta inclusa nella carena. Questi apparecchi debbono essere controllati da un servizio ufficiale. 5.1.1.2. Termometro di precisione graduato almeno in 0,5 °C. 5.1.1.3. Provetta cilindrica di 36 mm di diametro interno e di 320 mm di altezza, mantenuta verticalmente mediante un supporto a viti calanti.5.1.2. Modo di operare Tecnica di una misurazione Porre, nella provetta 5.1.1.3, 250 ml del campione preparato per l'analisi (3), introdurre l'areometro e il termometro. Effettuare la lettura sul termometro un minuto dopo aver agitato per realizzare l'equilibrio termico. Togliere il termometro e leggere la massa volumica apparente a t °C sullo stelo dell'areometro dopo un minuto di riposo. Correggere la massa volumica apparente letta a t °C dell'azione della temperatura mediante le tabelle: vini secchi (tabella V), mosti (tabella VI) e vini contenenti zucchero (tabella VII). La densità 20 °C/20 °C si ottiene dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.5.2. Densimetria per mezzo della bilancia idrostatica 5.2.1. Apparecchiatura 5.2.1.1. Bilancia idrostatica La bilancia idrostatica, con portata di almeno 100 g, deve essere sensibile a 1/10 di mg. Sotto ciascun piatto è fissato un galleggiante in vetro pyrex di almeno 20 ml di volume. Questi due galleggianti identici sono sospesi con un filo di diametro inferiore o uguale a 0,1 mm. Il galleggiante sospeso sotto il piatto di destra deve poter essere introdotto in una provetta cilindrica munita di un segno di livello. Questa provetta deve avere un diametro interno maggiore di almeno 6 mm di quello del galleggiante. Quest'ultimo deve poter essere contenuto per intero nel volume della provetta situato al di sotto del segno di riferimento, mentre la superficie del liquido su cui va effettuata la misura deve essere attraversata soltanto dal filo di sospensione. La temperatura del liquido contenuto nella provetta è misurata con un termometro graduato in quinti di grado. Si può anche usare una bilancia idrostatica monopiatto.5.2.2.Modo di operare 5.2.2.1. Taratura di una bilancia idrostatica Con i due galleggianti nell'aria, raggiungere l'equilibrio collocando sul piatto di destra i pesi di precisionep. Riempire la provetta di acqua fino al segno di riferimento, leggere la temperatura t °C dopo agitazione e riposo di 2-3 minuti. Ristabilire l'equilibrio per mezzo di pesi di precisione collocati sul piatto di destra, siano p2 questi pesi. Il volume del galleggiante a 20 °C:V20 °C = (p2 p) (F + 0,0012)F = fattore dato dalla tabella I alla temperatura t °C. p e V20 °C sono le caratteristiche del galleggiante.5.2.2.2. Tecnica di misurazione Immergere il galleggiante nella provetta riempita di vino (o di mosto) fino al segno di riferimento. Leggere la temperatura t °C del vino (o del mosto), siano: p" i pesi di precisione necessari a ristabilire l'equilibrio r t °C, la massa volumica apparente:Riportare questa massa volumica a 20 °C mediante una delle tabelle II, III o IV. 6. ESEMPIO DI CALCOLO DELLA MASSA VOLUMICA A 20 °C E DELLA DENSITÀ A 20 °C/20 °C (METODO DI RIFERIMENTO) 6.1. Picnometria su bilancia a due piatti 6.1.1. Determinazione delle costanti del picnometro 1.Pesata del picnometro pulito ed asciutto:Tara = picnometro + p p = 104,9454 g 2. Pesata del picnometro pieno d'acqua alla temperatura t °C:Tara = picnometro + acqua + p2 p2 = 1,2396 g per t = 20,5 °C 3. Calcolo della massa d'aria contenuta nel picnometro:m = 0,0012 (p p2) m = 0,0012 (104,9454 1,2396) m = 0,1244 g 4. Caratteristiche da tenere presenti:Tara del picnometro vuoto: p + m p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 gVolume a 20 °C = (p + m p2) · Ft °CF20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698 1,2396) · 1,001900 V20 °C = 104,0275 mlMassa dell'acqua a 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 103,8405 g6.1.2. Determinazione della massa volumica a 20 °C e della densità 20 °C/20 °C di un vino secco: p" = 1,2622 a 17,80 °Cr 17,80 °C = 0,99788 g/ml La tabella II consente di calcolare r 20 °C a partire da r t °C mediante la relazione: Per t = 17,80 °C e per un titolo alcolometrico di 11 % vol, si trova c = 0,546.2. Picnometria su bilancia monopiatto 6.2.1. Determinazioni delle costanti del picnometro 1. Pesata del picnometro pulito e asciuttoP = 67,7913 g 2. Pesata del picnometro pieno d'acqua alla temperatura t °CP1 = 169,2715 a 21,65 °C 3. Calcolo della massa d'aria contenuta nel picnometro:m = 0,0012 (P1 - P) m = 0,0012 × 101,4802 m = 0,1218 g 4. Caratteristiche da tenere presenti:Tara del picnometro vuoto: P- m P - m = 67,7913 - 0,1218 P - m = 67,6695 g Volume a 20 °C = [P1 - (P - m)] Ft ° C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715 - 67,6695) × 1,002140V20 °C = 101,8194 ml Massa dell'acqua a 20 °C = V20 °C × 0,998203 M20 °C = 101,6364 g Massa del pallone tara: To To = 171, 9160 g.6.2.2. Determinazione della massa volumica a 20 °C e della densità 20 °C/20 °C di un vino secco: T1 = 171,9178 g dT = 171,9178 - 171,9160 = 0,0018 g P - m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g P2 = 169,2799 a 18 °Cr 18 °C = 0,99793 g/ml La tabella II consente di calcolare r 20 °C a partire da r t °C mediante la relazione: Per t = 18 °C con un titolo alcolometrico di 11 % vol, si trova c = 0,49 TABELLA I Fattori Fper i quali bisogna moltiplicare la massa dell'acqua contenuta nel picnometro in pyrex a t° per calcolare il volume del picnometro a 20 °C TABELLA II Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini secchi e dei vini secchi privati dell'alcole misurata a t° con un picnometro in pyrex per ricondurre il risultato a 20 °C TABELLA III Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei mosti naturali e dei mosti concentrati misurata a t° con un picnometro in pyrex per ricondurre il risultato a 20 °C TABELLA IV Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini di 13 % vol o più contenenti zucchero residuo misurata con picnometro in pyrex a t° per ricondurre il risultato a 20 °C TABELLA V Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini secchi e dei vini secchi privati dell'alcole misurata a t° mediante un areometro od un picnometro in vetro ordinario a t° per ricondurre il risultato a 20 °C TABELLA VI Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei mosti naturali e dei mosti concentrati misurata a t° mediante un picnometro od un areometro in vetro ordinario per ricondurre il risultato a 20 °C TABELLA VII Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini di 13 % vol o più contenenti zucchero residuo misurata mediante areometro o picnometro in vetro ordinario a t° per ricondurla a 20 °C 2. DETERMINAZIONE DEL TENORE ZUCCHERINO DEI MOSTI, DEI MOSTI CONCENTRATI E DEI MOSTI CONCENTRATI RETTIFICATI MEDIANTE RIFRATTOMETRIA 1. PRINCIPIO DEL METODO Si riporta l'indice di rifrazione a 20 °C, espresso in valore assoluto o in percento in massa di saccarosio, nella tabella corrispondente per ottenere il grado zuccherino in grammi/litro o in grammi per chilogrammo di mosto, di mosto concentrato e di mosto concentrato rettificato.2. APPARECCHIATURA 2.1. Rifrattometro tipo Abbé Il rifrattometro deve essere dotato di una scala che indichi:- la percentuale in massa di saccarosio con l'approssimazione dello 0,1 %- oppure gli indici di rifrazione con quattro cifre decimali. Il rifrattometro deve essere provvisto di un termometro con una scala compresa almeno tra + 15 °C e + 25 °C e di un dispositivo di circolazione d'acqua che consenta di effettuare le misurazioni a una temperatura di 20 °C ± 5 °C. Occorre seguire scrupolosamente le istruzioni per l'impiego dello strumento, in particolare per quanto riguarda la taratura e la sorgente luminosa.3. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE 3.1. Mosti e mosti concentrati Filtrare eventualmente i mosti con una garza asciutta piegata in quattro e, dopo aver eliminato le prime gocce di filtrato, effettuare la determinazione sul prodotto filtrato.3.2. Mosto concentrato rettificato Utilizzare, a seconda della concentrazione, il mosto concentrato rettificato oppure la soluzione ottenuta portando a 500 g, con acqua, 200 g di mosto concentrato rettificato pesato accuratamente.4. MODO DI OPERARE Portare il campione ad una temperatura prossima ai 20 °C. Deporre una piccola presa di campione sul prisma inferiore del rifrattometro, avendo cura che, pressando i prisma l'uno contro l'altro, il campione copra uniformemente la superficie del vetro, ed effettuare la misura seguendo le istruzioni per l'uso dell'apparecchio in questione. Leggere la percentuale in massa di saccarosio con la precisione dello 0,1 % oppure l'indice di rifrazione con 4 cifre decimali. Effettuare almeno due determinazioni sullo stesso campione preparato. Rilevare la temperatura t °C.5. CALCOLI 5.1. Correzione di temperatura 5.1.1. Apparecchi graduati in % in massa di saccarosio: per la correzione della temperatura ricorrere alla tabella I. 5.1.2. Apparecchi graduati in indice di rifrazione: riportare l'indice misurato a t °C nella tabella II per ottenere (colonna 1) il corrispondente valore della percentuale in massa di saccarosio a t °C. Tale valore viene quindi corretto rispetto alla temperatura ed espresso a 20 °C per mezzo della tabella I.5.2. Tenore zuccherino dei mosti e dei mosti concentrati Riportare nella tabella II la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C per ottenere il tenore zuccherino in grammi/litro e in grammi/chilogrammo. Il tenore zuccherino è espresso in zucchero invertito con una cifra decimale.5.3. Tenore zuccherino del mosto concentrato rettificato Riportare la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C nella tabella III per ottenere il tenore zuccherino in grammi/litro e in grammi/chilogrammo. Il tenore zuccherino è espresso in zucchero invertito con una cifra decimale. Se la misura è stata effettuata sul mosto concentrato rettificato diluito, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.5.4. Indice di rifrazione dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati Riportare nella tabella II la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C per ricavare l'indice di rifrazione a 20 °C. Tale valore è espresso con quattro cifre decimali. TABELLA I Correzione da apportare nel caso in cui la percentuale in massa di saccarosio sia stata determinata a una temperatura diversa da 20 °C Nota: Le variazioni di temperatura per rapportare a 20 °C non devono superare ± 5 °C. TABELLA II La tabella riporta il tenore zuccherino (4) dei mosti e dei mosti concentrati espresso in grammi/litro e in grammi/chilogrammo, determinato per mezzo di un rifrattometro graduato in percentuale in massa di saccarosio a 20 °C o in indice di rifrazione a 20 °C. È anche riportata la massa volumica a 20 °C. TABELLA III La tabella riporta il tenore zuccherino (5) dei mosti concentrati rettificati in grammi/litro e in grammi/chilogrammo, determinato per mezzo di un rifrattometro graduato in percentuale in massa di saccarosio a 20 °C oppure in indice di rifrazione a 20 °C. È anche riportata la massa volumica a 20 °C. 3. TITOLO ALCOLOMETRICO VOLUMICO 1. DEFINIZIONE Il titolo alcolometrico volumico è uguale al numero di litri di etanolo contenuti in 100 l di vino. Detti volumi si intendono misurati alla temperatura di 20 °C. Il simbolo è «% vol». Osservazione:Nel titolo alcolometrico oltre all'etanolo sono compresi i suoi omologhi e gli esteri etilici che passano nel distillato.2. PRINCIPIO DEI METODI 2.1. Distillazione del vino alcalinizzato con una sospensione di idrossido di calcio Determinazione del titolo alcolometrico del distillato. 2.2. Metodo di riferimento: determinazione della massa volumica del distillato mediante picnometria.2.3. Metodi usuali 2.3.1. Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per aerometria 2.3.2. Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per densimetria mediante bilancia idrostatica 2.3.3. Determinazione del titolo alcolometrico del distillato mediante rifrattometria Nota:Per esprimere il titolo alcolometrico partendo dalla massa volumica del distillato, utilizzare le tabelle pratiche I, II e III riportate nell'allegato II del presente capitolo. Queste sono state calcolate a partire dalla tabella alcolometrica internazionale pubblicata nel 1972 dall'Organizzazione internazionale di metrologia legale nella raccomandazione n. 22 ed adottata dall'OIV (assemblea generale del 1974). Nella tabella I è riportata l'equazione generale che correla il titolo alcolometrico volumico e la massa volumica delle miscele idroalcoliche in funzione della temperatura.3. DISTILLAZIONE 3.1. Apparecchiatura 3.1.1. Apparecchio di distillazione costituito da:- un pallone da 1 litro a smerigliatura normalizzata;- una colonna di rettifica alta circa 20 cm o qualsiasi altro dispositivo atto ad impedire il traseinamento;- una sorgente di calore; occorre prevedere un opportuno dispositivo che impedisca la pirogenazione delle sostanze che compongono l'estratto;- un refrigerante terminante con un tubo affilato che porti il distillato nel fondo del pallone di raccolta tarato contenente alcuni millilitri di acqua. 3.1.2. Dispositivo per l'estrazione in corrente di vapore costituita da:1. un generatore di vapore d'acqua;2. un gorgogliatore;3. una colonna di rettifica;4. un refrigerante. Si può utilizzare qualunque modello di apparecchio di distillazione o di apparecchio di estrazione in corrente di vapore d'acqua a condizione che rispondano al saggio seguente: distillare 5 volte di seguito una miscela idroalcolica a 10 % vol. Dopo l'ultima distillazione, il distillato deve presentare un titolo alcolometrico di almeno 9,9 % vol, vale a dire che nel corso di ciascuna distillazione non si deve perdere una quantità di alcool superiore a 0,02 % vol.3.2. Reattivi 3.2.1. Sospensione di idrossido di calcio 2 M Si ottiene versando con cautela 1 l di acqua calda (60-70 °C) su 120 g di calce viva CaO.3.3. Preparazione del campione I vini giovani o i vini spumanti devono essere preliminarmente privati della maggior parte del biossido di carbonio agitando 250-300 ml di vino in un pallone di 500 ml.3.4. Modo di operare Prelevare mediante un pallone tarato 200 ml di vino. Annotare la sua temperatura. Versarli nel pallone dell'apparecchiatura di distillazione o nel gorgogliatore dell'apparecchio di estrazione in corrente di vapore d'acqua. Risciacquare quattro volte il pallone tarato con 5 ml di acqua che si aggiunge nel pallone o nel gorgogliatore. Aggiungere 10 ml di idrossido di calcio (3.2.1) ed alcuni frammenti di materiale poroso inerte (pietra pomice) nel caso della distillazione. Raccogliere il distillato nel pallone tarato da 200 ml che è stato utilizzato per misurare il vino. Raccogliere, nel caso della distillazione, un volume uguale ai tre quarti circa del volume iniziale mentre, nel caso dell'estrazione in vapore d'acqua, raccogliere 198-199 ml di distillato. Portare a 200 millilitri con acqua distillata a una temperatura uguale a quella iniziale, con l'approssimazione di ± 2 °C. Mescolare con cautela. AvvertenzaNel caso di vini particolarmente ricchi di ioni ammoniacali, ridistillare eventualmente il distillato nelle condizioni descritte precedentemente sostituendo la sospensione di idrossido di calcio con 1 ml di acido solforico al 10 % (v/v).4. METODO DI RIFERIMENTO: Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per picnometria.4.1. Apparecchiatura 4.1.1. Utilizzare il picnometro tarato come riportato al capitolo «massa volumica».4.2. Modo di operare Effettuare la determinazione della massa volumica apparente del distillato (3.4) a t °C come indicato nel capitolo 1 «Massa volumica» ai punti 4.3.1 e 4.3.2; sia rt °C tale massa volumica.4.3. Espressione dei risultati 4.3.1. Modo di calcolare Esprimere il titolo alcolometrico a 20 °C mediante la tabella I. Nella tabella cercare sulla linea orizzontale corrispondente alla temperatura T intera immediatamente inferiore a t° la più piccola massa volumica superiore a rt. Utilizzare la differenza tabulare letta sotto tale massa volumica per calcolare la massa volumicar alla temperatura intera considerata T. Sulla riga di detta temperatura T, dalla massa volumica r2 della tabella immediatamente superiore a r si sottrae la massa volumica calcolata. Questa differenza va divisa per la differenza tabulare letta a destra della massa volumica r2. Il quoziente dà la parte decimale del titolo alcolometrico, mentre la parte del grado stesso è indicata in testa alla colonna ove figura la massa volumica r2. Nell'allegato del presente capitolo è illustrato un esempio di calcolo del titolo alcolometrico. AvvertenzaPer tale correzione di temperatura, è stato elaborato un programma di calcolo che consente eventualmente di effettuarla automaticamente.4.3.2. Ripetibilità (r): r = 0,10 % vol4.3.3. Riproducibilità (R): R = 0,19 % vol5. METODI USUALI 5.1. Areometria 5.1.1. Apparecchiatura 5.1.1.1. Alcolometro L'alcolometro deve rispondere alle specifiche per gli apparecchi della classe I o della classe II definite nella raccomandazione internazionale n. 44 «Alcolometri e areometri per l'alcole» dell'OIML (Organizzazione internazionale di metrologia legale). 5.1.1.2. Termometro graduato in gradi e decimi di grado da 0 a 40 °C, controllato con l'approssimazione di 1/20 di grado. 5.1.1.3. Cilindro di 36 mm di diametro e 320 mm di altezza tenuto verticalmente mediante un supporto con viti calanti.5.1.2. Modo di operare Versare il distillato (3.4) nel cilindro che va tenuto bene in posizione verticale. Introdurre il termometro e l'alcolometro. Effettuare la lettura della temperatura un minuto dopo aver agitato per ottenere uniformità di temperatura tra il cilindro, il termometro, l'alcolometro e il distillato. Estrarre il termometro e leggere il titolo alcolometrico apparente dopo un minuto di riposo. Effettuare almeno tre letture con l'ausilio di una lente d'ingrandimento. Il titolo apparente misurato a t °C sarà corretto dell'influenza della temperatura mediante la tabella II. È necessario che la tempertura del liquido sia poco diversa dalla temperatura ambiente (al massimo 5 °C di differenza).5.2. Densimetria mediante bilancia idrostatica 5.2.1. Apparecchiatura Utilizzare la bilancia idrostatica come indicato al capitolo «Massa volumica». 5.2.2. Modo di operare Procedere alla determinazione della massa volumica apparente a t °C del distillato come indicato al capitolo 1 «Massa volumica» al punto 5.2.2.5.2.3. Espressione dei risultati Esprimere il titolo alcolometrico a 20 °C seguendo le indicazioni riportate al punto 4.3.1 per mezzo della tabella I, se il galleggiante è di pirex, o della tabella III se il galleggiante è di vetro ordinario.5.3. Rifrattometria 5.3.1. Apparecchiatura 5.3.1.1. Rifrattometro atto a misurare gli indici di rifrazione compresi tra 1,330 e 1,346. A seconda del tipo di apparecchio, le misure vanno fatte:- a 20 °C, mediante l'uso di un dispositivo appropriato;- oppure alla temperatura ambiente t °C misurata per mezzo di un termometro con precisione di almeno 0,05 °C. L'apparecchio deve essere corredato di una tabella di correzione della temperatura.5.3.2. Modo di operare Effettuare la misura dell'indice di rifrazione sul distillato di vino (3.4) seguendo il modo di operare previsto per il tipo di apparecchio utilizzato.5.3.3.Espressione dei risultati La tabella IV riporta il titolo alcolometrico corrispondente all'indice di rifrazione a 20 °C. OsservazioneLa tabella IV dà la corrispondenza tra gli indici di rifrazione delle miscele idroalcoliche pure e quelle dei distillati di vino. Nel caso dei distillati di vino essa tiene conto delle impurezze del distillato (in prevalenza alcoli superiori). La presenza di metanolo provoca una diminuzione dell'indice di rifrazione e quindi del titolo alcolometrico. 6. ESEMPIO DI CALCOLO DEL TITOLO ALCOLOMETRICO DI UN VINO 6.1.Picnometria su bilancia a due piatti 6.1.1. Le costanti del picnometro sono state determinate e calcolate come indicato al capitolo 1 «Massa volumica e densità relativa» (6.1.1).6.1.2. Pesata del picnometro pieno di distillatoEsempio numericot °C = 18,90 °C Tara = picnometro + distillato a t °C + p" t °C corretto = 18,70 °C p" = 2,8074 g p + m p" = massa del distillato a t °C 105,0698 2,8074 = 102,2624 g Massa volumica apparente a t °C 6.1.3. Calcolo del titolo alcolometrico Riferirsi alla tabella delle masse volumiche apparenti delle miscele idro-alcoliche a diverse temperature, come indicato precedentemente Sulla riga 18 °C della tabella delle masse volumiche apparenti, la più piccola massa superiore alla massa osservata 0,983076 è 0,98398, nella colonna 11 %. La massa volumica a 18 °C è: (98307,6 + 0,7 × 22) 10 5 = 0,98323 0,98398 0,98323 = 0,00075. La parte decimale del titolo alcolometrico è 75/114 = 0,65. Il titolo alcolometrico è: 11,65 % vol.6.2. Picnometria su bilancia monopiatto 6.2.1. Le costanti del picnometro sono state determinate e calcolate al capitolo 1 «Massa volumica e densità relativa» (6.2.1). 6.2.2. Pesata del picnometro pieno di distillato Peso del pallone tara al momento della determinazione (in grammi): T1 = 171,9178Picnometro pieno di distillato a 20,50 °C (in grammi): P2 = 167,8438Variazione della spinta dell'aria: dT = 171,9178 171,9160 = + 0,0018Massa del distillato a 20,50 °C: Lt = 167,8438 (67,6695 + 0,0018) = 100,1725Massa volumica apparente del distillato6.2.3. Calcolo del titolo alcolometrico Riferirsi alla tabella delle masse volumiche apparenti delle miscele idro-alcoliche a diverse temperature, come indicato precedentemente Sulla riga 20 °C della tabella delle masse volumiche apparenti, la più piccola massa superiore alla massa osservata 0,983825 è 0,98471, nella colonna 10 %. La massa volumica a 20 °C è: (98382,5 + 0,50 × 24) 10 5 = 0,983945 0,98471 0,983945 = 0,000765. La parte decimale del titolo alcolometrico è 76,5/119 = 0,64. Il titolo alcolometrico è: 10,64 % vol. FORMULA PER IL CALCOLO DELLE TABELLE ALCOLOMETRICHE DELLE MISCELE DI ALCOLE ETILICO ED ACQUALa massa volumica «r», espressa in chilogrammi per metro cubo (kg/m³), di una miscela di alcole etilico e di acqua alla temperatura t, espressa in gradi Celsius, è data dalla formula seguente in funzione: - del titolo massico p espresso con un numero decimale (6);- della temperatura t espressa in gradi Celsius (E.I.P.T. 68);- dei coefficienti numerici riportati di seguito.La formula è valida per le temperature comprese tra 20 °C e +40 °C. Coefficienti numerici della formula TABELLA I TITOLO ALCOLOMETRICO INTERNAZIONALE A 20 °CTabella delle masse volumiche apparenti di miscele idroalcoliche misurate con picnometro in vetro pyrex Masse volumiche a t° corrette della spinta dell'ariaTitolo alcolometrico volumico in % vol TABELLA II TITOLO ALCOLOMETRICO INTERNAZIONALE A 20 °CTabella delle correzioni da apportare al titolo alcolometrico apparente per correggere l'influenza della temperaturaAggiungere o sottrarre al titolo alcolometrico apparente a t°C (alcolometro in vetro ordinario) la correzione qui sotto indicata. TABELLA III TITOLO ALCOLOMETRICO INTERNAZIONALE A 20 °C Tavola delle masse volumiche apparenti delle miscele idroalcolicheApparecchi in vetro ordinarioMasse volumiche a t°C, corrette della spinta dell'aria TABELLA IV Tabella di corrispondenza tra gli indici di rifrazione a 20 °C e i titoli alcolometrici a 20 °C delle miscele idroalcoliche pure e dei distillati 4. ESTRATTO SECCO TOTALE Sostanze secche totali1. DEFINIZIONE L'estratto secco totale o sostanze secche totali è costituito dall'insieme di tutte le sostanze che, in condizioni fisiche determinate, non volatilizzano. Queste condizioni fisiche debbono essere fissate in modo tale che le sostanze componenti tale estratto subiscano il minimo di alterazione possibile. L'estratto non riduttore è l'estratto secco totale dal quale sono stati detratti gli zuccheri totali. L'estratto ridotto è l'estratto secco dal quale sono stati detratti gli zuccheri totali eccedenti 1 g/l, il solfato di potassio eccedente 1 g/l, il mannitolo, se presente, e tutte le sostanze chimiche eventualmente aggiunte al vino. Il resto di estratto è l'estratto non riduttore dal quale è stata detratta l'acidità fissa, espressa in acido tartarico. L'estratto è espresso in grammi per litro e dev'essere determinato con l'approssimazione di 0,5 g.2. PRINCIPIO DEL METODO Metodo unico: metodo densimetrico. L'estratto secco totale è calcolato indirettamente in base al valore della densità del mosto e, nel caso del vino, in base alla densità del vino dealcolizzato. Questo estratto secco è espresso dalla quantità di saccarosio che, disciolta in una quantità d'acqua sufficiente ad avere un litro, dà una soluzione avente la stessa densità del mosto o del vino dealcolizzato. Questa quantità è fornita dalla tabella I.3. MODO DI OPERARE La densità relativa d2020 del «vino dealcolizzato» (dr) è calcolata con la formula:dr = dv da + 1,000dove dv = densità relativa del vino a 20 °C (corretta per l'acidità volatile) (7) da = densità relativa a 20 °C della miscela idroalcolica avente lo stesso titolo alcolometrico del vino Il valore di dr può anche essere calcolato in base alle masse volumiche a 20 °C, rv del vino e ra della miscela idroalcolica allo stesso titolo alcolometrico, mediante la formula:dr = 1,0018 (rv ra) + 1,000dove il coefficiente 1,0018 può praticamente essere assimilato ad 1 allorché rv è inferiore ad 1,05, come avviene nella maggioranza dei casi.4. ESPRESSIONE DEI RISULTATI Riportare la densità dr2020 del vino dealcolizzato o la densità d2020 del mosto nella tabella I per ricavare il peso dell'estratto secco totale in grammi per litro. Il peso dell'estratto secco totale è espresso in g/l con una cifra decimale. TABELLA I per il calcolo del tenore in estratto secco totale (grammi per litro) TABELLA DI INTERPOLAZIONE 5. ZUCCHERI RIDUTTORI 1. DEFINIZIONE Gli zuccheri riduttori sono costituiti dall'insieme degli zuccheri a funzione chetonica o aldeidica dosati in base alla loro azione riducente sulla soluzione cupro-alcalina.2. PRINCIPIO DEI METODI 2.1. Defecazione 2.1.1. Metodo di riferimento: passaggio del vino neutralizzato e dealcolizzato su una colonna scambiatrice di anioni sotto forma di acetato, dove i suoi anioni vengono scambiati con ioni acetici, e successiva defecazione con acetato neutro di piombo. 2.1.2. Metodi usuali: il vino viene trattato con uno dei seguenti reattivi: 2.1.2.1. Acetato neutro di piombo 2.1.2.2. Ferrocianuro II di zinco2.2. Dosaggio 2.2.1. Metodo unico: dopo aver fatto reagire il vino o il mosto defecati con una quantità determinata di soluzione cupro-alcalina, l'eccesso di ioni rameici viene dosato per iodometria.3. DEFECAZIONE Il liquido nel quale vanno dosati gli zuccheri deve avere un contenuto in zuccheri compreso tra 0,5 e 5 g/l. Se il vino è secco, bisogna evitare di diluirlo durante la defecazione; se è dolce, esso va diluito nel corso della defecazione, in modo da portare il contenuto in zuccheri entro i limiti indicati secondo la tabella seguente. DenominazioneContenuto in zuccheri, in grammi per litro, compreso fraMassa volumica compresa fraDiluizione da prevedere (%)Mosti e mistelle> 125> 1,0381Vini dolci, alcolizzati o meno25 e 1251,005 e 1,0384Vini amabili5 e 250,997 e 1,00520Vini secchi< 5< 0,997nessuna diluizione3.1. Metodo di riferimento 3.1.1. Reattivi 3.1.1.1. Soluzione di acido cloridrico (HCl), 1 M 3.1.1.2. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 1 M 3.1.1.3. Soluzione di acido acetico (CH3COOH), 4 M 3.1.1.4. Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 2 M 3.1.1.5. Resina scambiatrice di anioni [tipo Dowex 3 (20 50 mesh) o resina equivalente] preparata nel modo seguente: In fondo ad una buretta collocare un piccolo tampone di lana di vetro e 15 ml di resina scambiatrice di anioni (3.1.1.5). Al momento della messa in funzione, sottoporre la resina a 2 cicli completi di rigenerazione con passaggi alternati di soluzioni M di acido cloridrico (3.1.1.1) e di idrossido di sodio (3.1.1.2). Dopo il lavaggio con 50 ml di acqua distillata, travasare la resina in un becher, aggiungere 50 ml di una soluzione 4 M di acido acetico (3.1.1.3) ed agitare per 5 minuti Riempire nuovamente la buretta e far passare attraverso la colonna 100 ml di soluzione di acido acetico 4 M (3.1.1.3) (è preferibile disporre di una riserva di resina conservata in un recipiente riempito con la soluzione 4 M di acido acetico). Lavare la colonna con acqua distillata sino a neutralità dell'effluente. Rigenerazione della resina. Far passare 150 ml di una soluzione 2 M di idrossido di sodio per eliminare gli acidi e gran parte delle sostanze coloranti fissate sulla resina. Lavare con 100 ml d'acque. Far passare 100 ml di soluzione 4 M di acido acetico. Lavare la colonna sino a neutralità dell'effluente. 3.1.1.6. Soluzione di acetato neutro di piombo (approssimativamente satura):Acetato neutro di piombo Pb (CH3COO)2 · 3 H2O 250 g Acqua molto calda q.b.a: 500 mlAgitare sino a dissoluzione. 3.1.1.7. Carbonato di calcio, Ca CO3.3.1.2. Modo di operare 3.1.2.1. Vini secchi Introdurre 50 ml di vino in un recipiente cilindrico del diametro di 10-12 cm circa ed addizionare ½ (n 0,5) ml di una soluzione M di idrossido di sodio (3.1.1.2) (dove n è il volume di una soluzione 0,1 M di idrossido di sodio impiegato per il dosaggio dell'acidità totale su 10 ml di vino); evaporare su bagnomaria bollente con l'aiuto di un getto di aria calda sino a ridurre la quantità di liquido a circa 20 ml. Fare defluire 3 ml di tale liquido ogni 2 minuti attraverso la colonna scambiatrice di anioni in forma di acetato (3.1.1.5). Raccogliere l'effluente in un matraccio tarato da 100 ml. Lavare sei volte il recipiente e la colonna con 10 ml di acqua distillata, aggiungere agitando 2,5 ml di soluzione satura di acetato di piombo (3.1.1.6) e 0,5 g di carbonato di calcio (3.1.1.7); agitare a più riprese e lasciare riposare almeno 15 minuti; portare a volume con acqua. Filtrare. 1 ml di questo filtrato corrisponde a 0,5 ml di vino. 3.1.2.2. Mosti, mistelle, vini dolci e vini amabili Si riportano a titolo indicativo alcune diluizioni. 1.Mosti e mistelleDiluire al 10 % il liquido da analizzare e prelevare 10 ml di tale diluizione. 2. Vini dolci, alcolizzati o meno, di massa volumica compresa tra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml di liquido da analizzare previamente diluito al 20 %. 3. Vini amabili, di massa volumica compresa tra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito.Fare defluire il volume di vino o di mosto sopra indicato attraverso la colonna scambiatrice di anioni sotto forma di acetato nella misura di 3 ml ogni due minuti. Raccogliere l'effluente in un pallone tarato da 100 ml, lavare la colonna con acqua fino ad ottenere 90 ml circa di effluente. Aggiungere 0,5 g di carbonato di calcio, 1 ml di una soluzione satura di acetato di piombo; agitare e lasciare riposare per almeno 15 minuti agitando di tanto in tanto; portare a volume con acqua. Filtrare. In questi casi:1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella,2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,04 ml di vino dolce,3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino amabile. 3.2. Metodi usuali 3.2.1. Defecazione con acetato neutro di piombo 3.2.1.1. Reattivi Soluzione di acetato neutro di piombo (approssimativamente satura) (vedi 3.1.1.6)Carbonato di calcio3.2.1.2. Modo di operare 3.2.1.2.1. Vini secchi Introdurre 50 ml di vino in un pallone tarato da 100 ml; aggiungere ½ (n 0,5) ml di soluzione M di idrossido di sodio (3.1.1.2), dove n è il volume di soluzione 0,1 M utilizzato per dosare l'acidità totale di 10 ml di vino. Aggiungere agitando 2,5 ml di soluzione satura di acetato di piombo (3.1.1.6) e 0,5 g di carbonato di calcio (3.1.1.7); agitare a più riprese e lasciare riposare per almeno 15 minuti; portare a volume con acqua. Filtrare.1 ml di filtrato corrisponde a 0,5 ml di vino.3.2.1.2.2. Mosti, mistelle, vini dolci e vini amabili In un pallone tarato da 100 ml, introdurre un volume di vino o di mosto o di mistella definito come segue (le diluizioni sono riportate a titolo indicativo): 1. Mosti e mistelle.Diluire al 10 % il liquido da analizzare; prelevare 10 ml di tale diluizione. 2. Vini dolci, alcolizzati o meno, di massa volumica compresa tra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml del liquido da analizzare, previamente diluito al 20 %. 3. Vini amabili,di massa volumica compresa fra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito.Aggiungere 0,5 g di carbonato di calcio, circa 60 ml di acqua e 0,5 offure 1 o 2 ml di soluzione satura di acetato di piombo; agitare e lasciare riposare per almeno 15 minuti agitando di tanto in tanto. Portare a volume con acqua. Filtrare. In questi casi:1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella,2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,004 ml di vino dolce,3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino pastoso.3.2.2. Defecazione con ferrocianuro di zinco Questo procedimento di defecazione dovrà essere utilizzato soltanto per i vini bianchi, i vini dolci poco coloratie i mosti.3.2.2.1. Reattivi 3.2.2.1.1. Soluzione I di ferrocianuro (II) di potassio: ferrocianuro di potassio [K4 Fe (CN)6 · 3 H2O]: 150 g Acqua q. b. a: 1 000 ml 3.2.2.1.2. Soluzione II di solfato di zinco:solfato di zinco (Zn SO4 · 7 H2O): 300 g acqua q. b. a: 1 000 ml 3.2.2.2. Modo di operare Introdurre in un pallone tarato da 100 ml un volume di vino (o di mosto o di mistella) definito come segue, le diluizioni vengono date a titolo indicativo: 1) Mosti e mistelle.Diluire al 10 % il liquido da analizzare, prelevare 10 ml di tale diluizione. 2)Vini dolci, alcolizzati o meno, la cui massa volumica è compresa fra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml di liquido da analizzare previamente diluito al 20 %. 3) Vini amabili, la cui massa volumica è compresa fra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito. 4) Vini secchi, prelevare 50 ml di vino non diluitoAggiungere 5 ml di soluzione I di ferrocianuro di potassio (3.2.2.1.1) e 5 ml di soluzione II di solfato di zinco (3.2.2.1.2). Mescolare. Portare a volume con acqua. Attendere 10 minuti e filtrare. In questi casi:1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella,2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,004 ml di vino dolce,3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino amabile,4) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,50 ml di vino secco. 4. DOSAGGIO 4.1.Reattivi 4.1.1. Soluzione cupro-alcalina:Solfato di rame puro (CuSO4 · 5 H2O): 25 g Acido citrico (C6 H8 O7 · H2O) 50 g Carbonato di sodio cristallizzato (Na2 CO3 · 10 H2O): 388 g Acqua q.b. a: 1 000 mlSciogliere il solfato di rame in 100 ml di acqua, l'acido citrico in 300 ml di acqua e il carbonato di sodio in 300-400 ml di acqua calda. Mescolare la soluzione di acido citrico e la soluzione di carbonato di sodio. Aggiungere quindi la soluzione di solfato di rame e portare a 1 l.4.1.2.Soluzione di ioduro di potassio al 30 %:ioduro di potassio (KI): 30 g acqua q.b. a: 100 mlConservare in bottiglia di vetro scuro.4.1.3. Acido solforico al 25 %:Acido solforico (H2SO4) r20 = 1,84 g/ml: 25 g acqua q.b. a: 100 mlVersare l'acido nell'acqua, lasciare raffreddare e portare a 100 ml.4.1.4. Salda d'amido a 5 g/l: Disperdere 5 g di amido in circa 500 ml di acqua. Portare a ebollizione agitando e mantenere l'ebollizione per 10 minuti; aggiungere 200 g di cloruro di sodio (NaCl) e, dopo il raffreddamento, portare a 1 l.- Tiosolfato di sodio, soluzione 0,1 M- Soluzione di zucchero invertito di 5 g/l: soluzione da utilizzare per verificare la tecnica di dosaggio. In un pallone tarato da 200 ml introdurre:saccarosio (C12H22O11): 4,75 g acqua, circa: 100 ml acido cloridrico (HCl) (r20 = 1,16 1,19 g/ml): 5 mlImmergere il pallone in bagnomaria a 60 °C per il tempo sufficiente affinché la soluzione raggiunga la temperatura di 50 °C, da mantenere per 15 minuti. Lasciare quindi raffreddare il pallone spontaneamente per 30 minuti immergendolo poi in un bagno di acqua fredda. Travasare quindi in un pallone tarato da 1 l e portare a volume; questa soluzione si mantiene per un mese. Al momento dell'impiego neutralizzare la quantità prelevata (tale soluzione è approssimativamente 0,06 M acida), con una soluzione di idrossido di sodio.4.2. Modo di operare In un pallone da 300 ml, introdurre 25 ml di soluzione cupro-alcalina, 15 ml di acqua e 10 ml di soluzione defecante. Questo volume di soluzione zuccherina non deve contenere più di 60 mg di zucchero invertito. Aggiungere alcuni granuli di pietra pomice. Adattare al pallone un refrigerante a ricadere e portare ad ebollizione entro 2 minuti. Mantenere l'ebollizione per 10 minuti esatti. Raffreddare immediatamente in corrente d'acqua fredda. Completato il raffreddamento aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio al 30 % (4.1.2), 25 ml di acido solforico al 25 % (4.1.3) e 2 ml di salda d'amido (4. 1.4). Titolare con la soluzione 0,1 M di tiosolfato di sodio (4.1.5). Sia n il numero di millilitri utilizzati. Effettuare a parte una prova in bianco, sostituendo i 25 ml di soluzione zuccherina con 25 ml di acqua distillata. Sia n2 il volume di tiosolfato impiegato.4.3. Espressione dei risultati 4.3.1.Calcoli La quantità di zucchero del rino , espressa in zucchero invertito, contenuta nel campione in esame, è riportata nella tabella seguente in funzione del numero (n2 n) di millilitri di tiosolfato utilizzati. Esprimere il tenore di zucchero in grammi di zucchero invertito per litro con una cifra decimale, tenendo conto delle diluizioni effettuate nel corso della defecazione e del volume del di campione.4.3.2. Ripetibilità r = 0,015 xixi = concentrazione di zucchero invertito in g/l del campione4.3.3. Riproducibilità R = 0,058 xixi = concentrazione di zucchero invertito in g/l del campione 6. SACCAROSIO 1. PRINCIPIO DEI METODI II. Metodo ri ricerca qualitativa per cromatografia su strato sottile. Il saccarosio è separato dagli altri zuccheri per cromatografia su strato sottile di cellulosa e rivelato per mezzo del reattivo urea-acido cloridrico in stufa a 105 °C. II. Metodo di ricerca e di dosaggio per cromatografia liquida ad alta risoluzione. Il saccarosio viene separato su colonna di silice addizionata di alchilammina e rivelato per rifrattometria. Il dosaggio viene effettuato rispetto ad uno standard esterno analizzato nelle stesse condizioni. Osservazione:La genuinità di un mosto o di un vino può essere controllata con il metodo della RMN del deuterio descritta per la rivelazione dello zuccheraggio dei mosti, dei mosti concentrati, dei mosti concentrati rettificati e dei vini.Per la ricerca ed il dosaggio del saccarosio può essere impiegato il metodo gascromatografico descritto nel capitolo 42, lettera f).2. METODO DI RICERCA QUALITATIVA PER CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE 2.1. Materiale 2.1.1. Lastre per cromatografia ricoperte di uno strato sottile di cellulosa. 2.1.2. Vasca cromatografica 2.1.3. Siringa micrometrica o micropipetta 2.1.4. Stufa termostatabile a 105 ± 2 °C2.2. Reattivi 2.2.1. Carbone decolorante 2.2.2. Fase mobile: cloruro di metilene acido acetico (d20° 1,05 g/ml) etanolo metanolo acqua (50 : 25 : 9 : 6 : 10) 2.2.3. RivelatoreUrea: 5 g Acido cloridrico 2 M: 20 ml Etanolo: 100 ml 2.2.4. Soluzione di riferimentoGlucosio: 35 g Fruttosio: 35 g Saccarosio: 0,5 g Acqua q.b. a: 1 000 ml2.3. Modo di operare 2.3.1. Preparazione del campione Se il mosto o il vino è fortemente colorato, decolorarlo trattandolo con carbone attivo. Nel caso di mosto concentrato rettificato, usare la soluzione avente un tenore zuccherino del 25 % (m/m) (25° Brix) preparata come indicato al capitolo «Determinazione del pH» al punto 4.1.2 e diluirla a un quarto portando da 25 ml a 100 ml con acqua in pallone tarato. 2.3.2. Cromatogramma A 2,5 cm dal bordo inferiore della lastra cromatografica deporre:- 10 µl del campione;- 10 µl della soluzione di riferimento. Porre la lastra nella vasca per cromatografia satura dei vapori della fase mobile e lasciar migrare il solvente fino ad un centimetro dal bordo superiore. Togliere la lastra e asciugarla in corrente di aria calda. Ripetere due volte la migrazione asciugando ogni volta la lastra. Polverizzare uniformemente sulla lastra 15 ml del rivelatore e porla in stufa a 105 °C per 5 minuti.2.4. Risultati Il saccarosio ed il fruttosio danno macchie di colore blu intenso su fondo bianco; il glucosio dà una macchia verdastra meno intensa.3. METODO DI RICERCA E DI DETERMINAZIONE PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE Le condizioni cromatografiche sono date a titolo indicativo.3.1. Apparecchiatura 3.1.1. Cromatografo in fase liquida ad alta risoluzione corredato di: 1) un iniettore (loop) da 10 µl,2) un rivelatore, rifrattometro differenziale o rifrattometro interferometro,3) una colonna di silice con alchilammina legata (lunghezza 250 mm e diametro interno 4 mm),4) una precolonna riempita con la stessa fase,5) un dispositivo per isolare o termostatare (30 °C) l'insieme precolonna-colonna,6) un registratore ed eventualmente un integratore,7) flusso della fase mobile: 1 ml/minuto.3.1.2. Dispositivo di filtrazione su membrana (0,45 µm)3.2. Reattivi 3.2.1. Acqua bidistillata 3.2.2. Acetonitrile (CH3 CN) di qualità HPLC 3.2.3. Fase mobile: acetonitrile-acqua, previamente filtrati su membrana (0,45 µm), (80 20 v/v)Detta fase mobile deve essere degassificata prima dell'uso. 3.2.4. Soluzione di riferimento: soluzione acquosa di saccarosio di 1,2 g/l. Filtrarla su membrana (0,45 µm). 3.3. Modo di operare 3.3.1. Preparazione del campione - Per i vini e i mosti, filtrare su membrana (0,45 µm).- Per i mosti concentrati rettificati, utilizzare la soluzione che si ottiene diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % m/v come indicato al capitolo«acidità totale» (5.1.2) e filtrarla su membrana (0,45 µm).3.3.2. Determinazione cromatografica Iniettare in fasi successive nel cromatografo 10 µl della soluzione di riferimento e 10 µl del campione preparato come indicato al punto 3.3.1.Ripetere le iniezioni nello stesso ordine.Registrare il cromatogramma.Il tempo di ritenzione del saccarosio è di circa 10 minuti.3.4. Calcoli Utilizzare per il calcolo la media delle due risposte ottenute per la soluzione di riferimento e per il campione.3.4.1.Per i vini e i mosti Calcolare il tenore in g/l.3.4.2. Per i mosti concentrati ed i mosti concentrati rettificati Sia C = g/l il tenore in saccarosio della soluzione del mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v). Tenore zuccherino in grammi per chilogrammo di mosto concentrato rettificato: 2,5 · C3.5. Espressione dei risultati Il tenore in saccarosio si esprime con una cifra decimale in g/l nel caso dei vini, dei mosti e dei mosti concentrati rettificati nel caso dei mosti concentrati rettificati, in g/kg. 7. GLUCOSIO E FRUTTOSIO 1. DEFINIZIONE Il glucosio ed il fruttosio possono essere determinati singolarmente con un metodo enzimatico, al solo scopo di calcolare il rapporto glucosio/fruttosio.2. PRINCIPIO Il glucosio e il fruttosio sono fosforilati con adenosina-trifosfato (ATP) con una reazione enzimatica catalizzata dall'esochinasi (HK) e danno glucosio-6-fosfato (G6P) e fruttosio-6-fosfato (F6P): glucosio + ATP G6P + ADP fruttosio + ATP F6P + ADP In un primo tempo il glucosio-6-fosfato viene ossidato a gluconato-6-fosfato dal nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato (NADP) in presenza dell'enzima glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (G6PDH). La quantità di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato ridotto (NADPH) che si forma corrisponde alla quantità di glucosio-6-fosfato e quindi a quella del glucosio. G6P + NADP+ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ Il nicotinammide-adenina-dinulceotide-fosfato ridotto si dosa per assorbimento a 340 nm. Al termine di questa reazione, il fruttosio-6-fosfato viene trasformato dall'azione della fosfoglucosio-isomerasi (PGI) in glucosio-6-fosfato Il glucosio-6-fosfato reagisce di nuovo con il nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato per dare gluconato-6-fosfato e nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato ridotto; questo viene quindi dosato.3. APPARECCHIATURA - Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, valore massimo di assorbimento del NADPH. Trattandosi di misure assolute (senza curva di taratura, ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADPH) le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio devono essere controllate.In mancanza di quest'apparecchiatura, utilizzare uno spettrofotometro a spettro discontinuo che consenta di effettuare le misure a 334 nm o a 365 nm.- Celle di vetro avente un cammino ottico di 1 cm o celle monouso.- Pipette per prova enzimatica da 0,02- 0,05- 0,01- 0,2 ml.4. REATTIVI 4.1. Soluzione 1: tampone (trietanolammina 0,3 M; pH = 7,6; 4 · 10 3 M in Mg ++) sciogliere 11,2 g di cloridrato di trietanolammina (C2H5)3N · HCl) e 0,2 g di Mg SO4 · 7 H2O in 150 ml di acqua bidistillata, aggiungere circa 4 ml di soluzione 5 M di idrossido di sodio (NaOH) per ottenere un pH uguale a 7,6 e portare a 200 ml. Questa soluzione tampone può essere conservata a + 4 °C per quattro settimane. 4.2.Soluzione 2: soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato (circa 11,5 · 10 3 M): sciogliere 50 mg di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato bisodico in 5 ml di acqua bidistillata. La soluzione si conserva a +4 °C per quattro settimane. 4.3. Soluzione 3: soluzione di adenosina-52-trifosfato (circa 81· 10 3M): sciogliere 250 mg di adenosina-52-trifosfato disodico e 250 mg di bicarbonato di sodio NaHCO3 in 5 ml di acqua bidistillata. Questa soluzione si mantiene a + 4 °C per quattro settimane. 4.4. Soluzione 4: Esochinasi/glucosio-6-fosfato-deidrogenasi: miscelare 0,5 ml di esochinasi (2 mg di proteina/ml, cioè 280 U/ml) e 0,5 ml di glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (1 mg di proteina per ml). A + 4 °C la soluzione si conserva per un anno. 4.5 Soluzione 5:fosfoglucosio-isomerasi (2 mg di proteina per ml, cioè 700 U/ml). La sospensione viene utilizzata senza diluizione. A + 4 °C circa la soluzione si conserva per un anno. Nota:l'insieme dei reattivi per il dosaggio si trova pronto in commercio.5. MODO DI OPERARE 5.1. Preparazione del campione Effettuare le seguenti diluizioni in funzione della quantità presunta di glucosio + fruttosio per litro: Misura a 340 e 334 nm365 nmDiluizione con acquaFattore F di diluizionefino a 0,4 g/l 0,8 g/l--fino a 4,0 g/l 8,0 g/l1+ 9 10fino a 10,0 g/l20,0 g/l1+ 24 25fino a 20,0 g/l40,0 g/l1+ 49 50fino a 40,0 g/l80,0 g/l1+ 99 100al di sopra di 40,0 g/l80,0 g/l1+9991 000 5.2. Dosaggio Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure rispetto all'aria (senza la cella sul percorso ottico) o rispetto all'acqua.Temperatura 20-25 °C.In 2 celle aventi un cammino ottico di 1 cm, introdurre: Prova in bianco CampioneSoluzione 1 (4.1) (portata a 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Soluzione 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Soluzione 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Campione da determinare 0,20 ml Acqua bidistillata 0,20 ml Mescolare e dopo circa 3 minuti leggere l'assorbanza delle soluzioni (A1). Provocare la reazione aggiungendo:Soluzione 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml Mescolare; aspettare 15 minuti; effettuare la misura dell'assorbanza e verificare dopo 2 minuti che la reazione sia terminata (A2). Aggiungere immediatamente:Soluzione 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml Mescolare; effettuare la lettura dopo 10 minuti; verificare l'arresto della reazione dopo 2 minuti (A3). Determinare le differenze di assorbanza:A2 A1 che corrisponde al glucosio,A3 A2 che corrisponde al fruttosio,per la prova in bianco e per il campione. Determinare la differenza di assorbanza tra la prova in bianco (DAT) ed il campione (DAD) e fissare:per il glucosio: DAG =DAC DABper il fruttosio:DAF = DAC DAB Osservazione: il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Qui sopra è riportato soltanto a titolo indicativo. Si raccomanda di determinarlo per ciascun lotto.5.3. Espressione dei risultati 5.3.1. Calcolo La formula generale per il calcolo delle concentrazioni è la seguente:V = volume della soluzione impiegata per la prova (ml) v = volume del campione (ml) PM = massa molecolare della sostanza da dosare d = cammino ottico della cella (cm) e = coefficiente di assorbimento dell'NADPH a 340 nm = 6,3 (m mole 1 · l · cm 1) V = 2,92 ml per la determinazione del glucosio V = 2,94 ml per la determinazione del fruttosio v = 0,20 ml PM = 180 d = 1 Si ottiene:Per il glucosio: Cg/l = 0,417 · DAG Per il fruttosio: Cg/l = 0,420 · DAF Se per preparare il campione, è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore F. Osservazione:Per misure effettuate alle lunghezze d'onda 334 o 365 nm si ottiene:- misura a 334 nm: e = 6,2 (m mole 1 · l · cm 1)per il glucosio: Cg/l = 0,425 · DAG per il fruttosio: Cg/l = 0,428 · DAF- misura a 365 nm: e = 3,4 (m mole 1 · l · cm 1)per il glucosio: Cg/l = 0,773 · DAG per il fruttosio: Cg/l = 0,778 · DAF5.3.2. Ripetibilità (r) r = 0,056 xi5.3.3.Riproducibilità (R) R = 0,12 + 0,076 xi PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 390R2676.1xi = tenore in glucosio o fruttosio in grammi per litro 8. RIVELAZIONE DELL'AUMENTO DEL TITOLO ALCOLOMETRICO NATURALE DEI MOSTI DI UVE, DEI MOSTI DI UVE CONCENTRATI , DEI MOSTI DI UVE CONCENTRATI RETTIFICATI E DEI VINI MEDIANTE LA RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE DEL DEUTERIO (RMN FINS/SNIF NMR) 1. DEFINIZIONE Gli atomi di deuterio contenuti negli zuccheri e nell'acqua di un mosto di uva si ridistribuiscono dopo la fermentazione nelle molecole I, II, III e IV del vino:CH2D CH2 OH CH3 CHD OH I IICH3 CH2 OD HOD III IV L'aggiunta di zuccheri esogeni (zuccheraggio a secco) prima della fermentazione del mosto si ripercuoterà sulla ridistribuzione del deuterio. Rispetto ai valori dei parametri relativi ad un vino campione naturale della stessa regione, lo zuccheraggio con zucchero esogeno provocherà le seguenti variazioni: Parametri Vino(D/H)I(D/H)II(D/H)QWR- Naturale - Arricchito - zucchero di barbabietola - zucchero di canna - zucchero di mais (D/H)I : rapporto isotopico nella molecola I(D/H)II : rapporto isotopico nella molecola II(D/H)QW : rapporto isotopico dell'acqua e del vino R = 2(D/H)II/(D/H)I, esprime la distribuzione relativa del deuterio nelle molecole I e II; R viene direttamente misurato a partire dalle intensità h dei segnali e quindi R = 3hII/hI. (D/H)I caratterizza soprattutto la specie vegetale che ha sintetizzato lo zucchero ed in misura minore la geografia del luogo di raccolta (natura dell'acqua impiegata per la fotosintesi). (D/H)II rappresenta la climatologia del luogo di produzione delle uve (qualità dell'acqua piovana e condizioni meteorologiche) ed in misura minore, la concentrazione zuccherina del mosto iniziale. (D/H)QW rappresenta la climatologia del luogo di produzione e la ricchezza in zucchero del mosto iniziale.2. PRINCIPIO La determinazione dei parametri sopra definiti [(R, (D/H)I, (D/H)II)], è effettuata per RMN del deuterio sull'etanolo estratto dal vino o dai prodotti di fermentazione del mosto, del mosto concentrato, del mosto concentrato rettificato ottenuti in determinate condizioni. Essa è eventualmente completata con la determinazione del rapporto isotopico dell'acqua estratta dal vino, (D/H)QW e del rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo. In attesa della costituzione di una banca dati comunitaria:- nel caso dei vini i campioni prelevati per il controllo nelle zone di produzione devono essere accompagnati dal prelevamento di campioni testimoni naturali (almeno tre) della stessa origine (luogo geografico e annata); tali prelevamenti vanno effettuati in tre esemplari;- nel caso dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati, i campioni testimoni (almeno 3) sono costituiti da mosti naturali della stessa origine (luogo geografico e annata); Per i controlli dei prodotti elaborati nel proprio territorio, in attesa della costituzione di una banca dati comunitaria, gli Stati membri possono in via transitoria utilizzare una banca dati nazionale.3. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L'ANALISI 3.1. Estrazione dell'etanolo e dell'acqua dal vino Osservazione: Può essere utilizzata qualsiasi apparecchiatura per l'estrazione dell'etanolo a condizione che permetta di recuperare il 98-98,5 % dell'alcol del vino ottenendo un distillato che abbia un titolo compreso tra il 92 e il 93 % mas. (95 % vol).3.1.1. Apparecchiature e reattivi - Dispositivo per l'estrazione dell'etanolo (figura 1) comprendente:- riscaldatore semisferico elettrico con variatore di tensione- matraccio sferico da un litro con collo smerigliato- colonna Cadiot con asta rotante (mobile in teflon)- matracci conici con collo smerigliato da 125 ml- bottiglie con tappodi di plastica da 125 e 60 ml- Reattivi per il dosaggio dell'acqua con la tecnica di Karl Fischer (ad esempio Merck 9241 e 9243)3.1.2. Modo di operare 3.1.2.1. Determinare il titolo alcolometrico del vino con l'approssimazione di 0,05 % vol. Sia tv.3.1.2.2. Estrazione dell'etanolo Versare una presa di campione omogeneo di 500 ml di vino avente titolo alcolometrico tv nel pallone dell'apparecchiatura per la distillazione che abbia un tasso di riflusso costante di circa 0,9. Collocare un matraccio con smerigliatura da 125 ml, preventivamente tarato, per la raccolta del distillato. Raccogliere il liquido che distilla tra 78,0 e 78,2 °C pari a circa 40-60 ml. Interrompere l'operazione per 5 minuti quando la temperatura supera i 78,5 °C. Non appena la temperatura raggiunge nuovamente i 78 °C tornare a prelevare il distillato sino a 78,5 °C e ripetere tale operazione fino a quando la temperatura, dopo aver interrotto il prelievo ed aver fatto continuare l'operazione in circuito chiuso, non decresce più. La distillazione completa dura circa 5 ore. Questo procedimento consente di recuperare il 98-98,5 % dell'alcool totale del vino, in un distillato al 92-93 % in massa (95 % vol), titolo per il quale sono state fissate le condizioni RMN descritte al paragrafo 4. Pesare l'etanolo estratto. In un flacone da 60 ml conservare una parte (60 ml) omogenea delle code di distillazione, che rappresenta l'acqua del vino. Determinare eventualmente il suo rapporto isotopico. Osservazione:se si dispone di uno spettrometro con sonda da 10 mm (vedi paragrafo 4), saramo sufficienti 300 ml di vino.3.1.2.3. Determinazione del titolo alcolometrico dell'alcol estratto Su un campione di circa 0,5 ml di alcol, di massa p esattamente nota, determinare il tenore in acqua con il metodo Karl Fischer e sia esso p2g. Figura 1 - Dispositivo per l'estrazione dell'etanolo Il titolo massico dell'etanolo è dato da3.2. Fermentazione dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati 3.2.1. Materiali e reattivi - Acido tartarico- Bacto Yeast Nitrogen (Base without amino acids) DIFCO- Lieviti secchi attivi (Saccharomyces cerevisiae) Se si conosce il rapporto isotopico dell'acqua del mosto, i lieviti possono essere preventivamente riattivati insemensandoli per 5 minuti in una piccola quantità di acqua tiepida non distillata (1 g in 50 ml), avente un rapporto isotopico vicino a quello dell'acqua del mosto. Quando non si conosce il rapporto isotopico dell'acqua del mosto, è preferibile insemensare direttamente. La quantità di lieviti secchi da utilizzare è dell'ordine di 1 g, cioè circa 1010 cellule per 1 l di mosto. Recipiente per la fermentazione da 1,5 l munito di un dispositivo che consenta di operare senza contatto con l'aria e di condensare i vapori di alcol in modo che durante la fermentazione non si abbia alcuna perdita di etanolo. La percentuale di conversione degli zuccheri fermentescibili in etanolo deve essere superiore al 98 %.3.2.2. Modo di operare 3.2.2.1. Mosti - Mosti freschiVersare un litro di mosto di cui sia stata previamente determinata la concentrazione in zuccheri fermentescibili, nel recipiente destinato alla fermentazione. Aggiungere 1 g di lieviti secchi precedentemente riattivati. Collocare il dispositivo che consente di operare fuori dal contatto con l'aria. Effettuare la fermentazione ad una temperatura prossima a 20 °C sino all'esaurimento degli zuccheri. Dopo aver determinato il titolo alcolometrico del prodotto della fermentazione e calcolato la percentuale di conversione degli zuccheri in alcol, centrifugare il liquido fermentato ottenuto e distillarlo per estrarre l'etanolo. - Mosti mutizzati con anidride solforosaDesolfitare un volume di mosto di poco superiore ad un litro (1,2 l) per gorgogliamento di una corrente di azoto nel mosto riscaldato in bagnomaria a 70-80 °C in riflusso sino a quando il tenore di anidride solforosa totale sia inferiore a 200 mg/l. Aver cura di non provocare alcuna concentrazione del mosto per evaporazione dell'acqua utilizzando un refrigerante efficace.Versare un litro di mosto desolfitato nel recipiente da fermentazione e continuare come indicato per i mosti freschi.Osservazione: Se per solfitare il mosto è stato impiegato del metabisolfito di potassio, prima del desolfitaggio occorre addizionare a quest'ultimo dell'acido solforico nella misura di 0,25 ml di acido solforico concentrato (r20 = 1,84 g/ml) per grammo di metabisolfito impiegato in un litro di mosto.3.2.2.2. Mosti concentrati Nel recipiente di fermentazione versare un volume V ml di mosto concentrato contenente circa 170 g di zucchero. Completare il volume ad 1 l con (1 000 V) ml di acqua avente lo stesso rapporto isotopico dell'acqua del mosto naturale testimone. Insemensare come indicato al punto 3.2.1. Aggiungere 3 grammi di Bacto Yeast Nitrogen (Base without amino acids DIFCO). Omogeneizzare e continuare come prima.3.2.2.3. Mosti concentrati rettificati Procedere come descritto al punto 3.2.2.2 portando al volume di un litro con (1 000 V) ml di acqua avente lo stesso rapporto isotopico dell'acqua del mosto naturale testimone in cui sono stati sciolti 3 grammi di acido tartarico. Osservazione: Conservare 50 ml di campione di mosto, di mosto desolfitato, di mosto concentrato o di mosto concentrato rettificato per l'eventuale estrazione dell'acqua e la determinazione del suo rapporto isotopico (D/H)QW.L'estrazione dell'acqua dai mosti potrà essere effettuata molto semplicemente per distillazione azeotropica con toluene. 3.3. Preparazione del campione di alcol per la misura RMN 3.3.1. Reattivi N,N-tetrametilurea (TMU): utilizzare un campione di riferimento di TMU avente rapporto isotopico D/H conosciuto e controllato. Tale campione può essere fornito da:Direction générale Science, recherche et développement Bureau communautaire de référence Rue de la Loi 200 B-1049 Bruxelles3.3.2. Modo di operare - Sonda RMN con diametro da 15 mm:Introdune in una bottiglia preventivamente tarata, 7 ml dell'alcol ottenuto al punto 3.1.2 e pesarli con l'approssimazione di 0,1 mg, sia mA la massa; introdurre quindi 3 ml dello standard interno (TMU) e pesare nuovamente con l'approssimazione di 0,1 mg, sia mst la massa. Omogeneizzare la miscela per agitazione. - Sonda RMN, diametro 10 mm:3,2 ml di alcol e 1,3 ml di TMU sono sufficienti. A seconda del tipo di spettrometro e di sonda utilizzati (vedi paragrafo 4), aggiungere come sostanza di stabilizzazione del campo frequenza (lock) una quantità sufficiente di esafluorobenzene. SpettrometroSonda10 mm15 mm7,05 T150 µl200 µl9,4 T 35 µl 50 µl 3.4. Preparazione del campione di acqua per la misurazione RMN, che servirà eventualmente a determinarne il suo rapporto isotopico.3.4.1. Reattivi N,N-tetrametilurea (TMU): vedi 3.3.1 3.4.2. Modo di operare Introdune in una bottiglia preventivamente tarata 3 ml di acqua ottenuta come al punto 3.1.2 o al punto 3.2 (Osservazione); pesare con l'approssimazione di 0,1 mg (m2E); aggiungere quindi 4 ml dello standard interno (TMU) e pesarlo con l'approssimazione di 0,1 mg (m2st); omogeneizzare la miscela per agitazione. Osservazione: Se il laboratorio dispone di uno spettrometro di massa di rapporti isotopici, tale misura potrà essere effettuata su detto strumento in modo da alleggerire il carico dello spettrometro RMN. È in effetti necessario verificare il rapporto TIV (5.2) per ciascuna serie di vini studiata.4. REGISTRAZIONE DEGLI SPETTRI RMN2H DELL'ALCOL E DELL'ACQUA Determinazione dei parametri isotopici4.1. Apparecchiatura - Spettrometro RMN corredato di una sonda specifica «deuterio» regolata alla frequenza caratteristica o del campo (Bo ) (ad esempio, per Bo = 7,05 T, o = 46,05 MHz e per Bo = 9,4 T, o = 61,4 MHz), avente un canale di disaccoppiamento del protone (B2) e un canale di stabilizzazione del campo frequenza (lock), alla frequenza del fluoro. La risoluzione, misurata sullo spettro, trasformato senza moltiplicazione esponenziale (cioè LB = O) (figura 2b) e espressa dall'ampiezza a metà altezza dei picchi metile e metilene dell'etanolo e del picco metile del TMU, deve essere inferiore a 0,5 Hz. La sensibilità, misurata con un fattore di moltiplicazione esponenziale LB uguale a 2 (figura 2a), deve essere maggiore o uguale a 150 per il picco metile dell'etanolo al 95 % in vol (93,5 % mas). In queste condizioni, l'intervallo fiduciale della misura dell'altezza del segnale, calcolato per una probabilità del 97,5 % (prova a un'ala) e per 10 ripetizioni dello spettro, è di 0,35 %.- Campionatore automatico eventuale.- Software per l'elaborazione dei dati.- Tubi portacampione da 15 mm o da 10 mm a seconda del potere risolutivo dello spettrometro.4.2. Regolazione dello spettrometro e verifiche 4.2.1.Regolazione Procedere alle normali regolazioni di omogeneità e di sensibilità seguendo le indicazioni del costruttore.4.2.2. Verifica della validità delle regolazioni Utilizzare etanoli di riferimento, contrassegnati con le lettere C, V e B, che presentino una composizione isotopica diversa ma tarata con precisione. Siano C = alcol di canna da zucchero o di mais, V = alcol di vino e B = alcol di barbabietola. Tali campioni sono forniti dal BCR (3.3.1). Seguendo il procedimento di cui al punto 4.3, determinare i valori isotopici di questi alcol e trascriverli Cmis, Vmis, Bmis. (Vedi 5.3). Confrontarli con i rispettivi valori di riferimento dati, contrassegnati da Cst, Bst, Vst (vedi 5.3). Figura 2aSpettro RMN²H di un etanolo di vino con uno standard interno (TMU: N,N tetrametilurea) Figura 2bSpettro²H dell'etanolo realizzato nelle stesse condizioni della figura 2a senza moltiplicazione esponenziale (LB=O) Lo scarto tipo di ripetibilità ottenuto sulla media di 10 ripetizioni di ciascuno spettro deve essere inferiore a 0,01 per il rapporto R ed inferiore a 0,3 ppm per (D/H)I e per (D/H)II. I valori medi ottenuti per i vari parametri isotopici [(R, (D/H)I, (D/H)II)] devono cadere nel corrispondente scarto tipo di ripetibilità dato, per tali parametri, per i tre alcol di riferimento, del BCR in caso contrario occorre effettuare nuovamente la regolazione.4.3. Registrazione degli spettri RMN Porre il campione di alcol preparato come in 3.3 (o quello di acqua preparato come in 3.4) in un tubo da 15 o da 10 mm e introdurlo nella sonda. Gli spettri RMN devono essere ottenuti nelle seguenti condizioni:- la temperatura della sonda: (ad esempio 302 K) deve essere costante;- tempo di acquisizione di almeno 6,8 secondi per 1200 Hz di ampiezza spettrale (Memoria 16 K, cioè circa 20 ppm a 61,4 MHz, oppure circa 27 ppm a 46,1 MHz.);- impulso: 90 °;- regolare il termine di acquisizione; il suo valore deve essere dello stesso ordine di grandezza dei tempi di campionamento («dwell time»);- rivelazione in quadratura: fissare l'«offset» 01 tra i segnali - OD - CHD per l'etanolo e tra i segnali HOD e TMU per l'acqua;- determinare il valore dell'«offset» di disaccoppiamento 02 utilizzando lo spettro protonico misurato dalla bobina di disaccoppiamento sullo stesso tubo. Si ottiene un buon disaccoppiamento quando O2 si trova al centro dell'intervallo di frequenza esistente tra i gruppi CH3- e -CH2-. Utilizzare il disaccoppiamento a banda larga. Effettuare per ciascuno spettro un numero di accumulazioni NS sufficiente ad ottenere il rapporto segnale/rumore dato al punto 4-1 e ripetere NE=10 volte tale serie di NS accumulazioni. I valori di NS dipendono dal tipo di spettrometro e di sonda utilizzati (vedi 4) e si sceglierà ad esempio: SpettrometroSonda10 mm15 mm7,05 TNS = 304NS = 2009,04 TNS = 200NS = 128 5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 5.1. Caso dell'etanolo Per ciascuno dei 10 spettri determinare (vedi spettro RMN dell'etanolo, figura 2a):- CH3CHDO Hmst e mA (vedi 3.3.2)- tDm (vedi 3.1.2.3)- (D/H)st = rapporto isotopico dello standard interno (TMU) indicato sulla confezione fornita dal BCR. L'utilizzazione dell'altezza dei segnali al posto delle superfici misurabili con minore precisione suppone larghezze uguali a metà altezza e questa è un'approssimazione ragionevole (figura 2 b).5.2. Caso dell'acqua Quando il rapporto isotopico dell'acqua è determinato con l'RMN, partendo dalla miscela acqua-TMU, si usa la seguente relazione:dove- m2st et m2E vedi 3.4.2- (D/H)st = rapporto isotopico dello standard interno (TMU) indicato sulla confezione fornita dal BCR 5.3. Per ciascuno dei parametri isotopici, calcolare la media di 10 determinazioni e l'intervallo fiduciale. Un software opzionale (ad esempio RMN-FINS) adattabile all'elaboratore dello spettrometro consente di effettuare in linea tali calcoli. Osservazione: Se, dopo la regolazione dello spettrometro, si ha uno scarto sistematico tra i valori medi ottenuti per le caratteristiche isotopiche degli alcoli di riferimento (4.2.2) e i valori indicati dal BCR, a meno dello scarto-tipo, si potrà applicare la seguente correzione per ottenere il valore reale di un campione X qualsiasi. L'interpolazione si effettuerà prendendo i valori dei campioni di riferimento immediatamente superiore e inferiore a quello del campione X. Sia (D/H)iXmis il valore misurato e (D/H)iXcorr il valore corretto; si avrà:(D/H)iXcorr = (D/H)iBst + a [(D/H)iXmis (D/H)iBmis] dove Esempio:Campioni di riferimento forniti e tarati dal BCR:(D/H)IVst = 102,0 ppm (D/H)IBst = 91,95 ppmCampioni di riferimento misurati dal laboratorio:(D/H)IVmis = 102,8 ppm (D/H)IBmis = 93,0 ppmCampione sospetto non corretto:(D/H)IXmis = 100,2 ppmSi calcola a = 1,0255 e (D/H)IXcorr = 99,3 ppm6. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Confrontare il valore RX ottenuto per il rapporto R del campione sospetto con i rapporti ottenuti per i vini testimoni. Se il valore di RX si discosta di più di 2 scarti tipo dal valore medio RT ottenuto per i vini testimoni, vi è presunzione di adulterazione.6.1. Aumento del titolo alcolometrico naturale con aggiunta di zucchero di barbabietola o di canna o con glucosio di mais 6.1.1. Vini RX maggiore di RT: presunzione di addizione di zucchero di barbabietola. RX inferiore a RT: presunzione di addizione di zucchero da canna o di zucchero da mais.Notare che (D/H)XII e (D/H)WQX sono aumentati.Esaminare (D/H)IX. Vi è presunzione di:- arricchimento con zucchero da barbabietola:(D/H)XII del campione sospetto è inferiore a (D/H)IT, valore medio ottenuto con i campioni di riferimento, di oltre uno scarto tipo;- arricchimento con zucchero da canna o da mais: (D/H)IX è maggiore di (D/H)IT, di oltre uno scarto tipo sulla misura.- Calcolo dell'arricchimento E, espresso in % in volume di etanolo:- Caso di arricchimento con zucchero di barbabietola:(D/H)IB = rapporto isotopico per il sito I dell'alcol d barbabietola: (D/H)IB = 92.5 (8)tV = titolo alcolometrico del vino analizzato (X)- Caso di arricchimento con zucchero di canna o di mais: (D/H)IC = rapporto isotopico per il sito I dell'alcol di canna da zucchero o di mais: (D/H)IC = 110,5 (9)tV = titolo alcolometrico del vino analizzato (X)6.1.2. Mosti, mosti concentrati e mosti concentrati rettificati I valori dei parametri isotopici dell'alcol estratto, come indicato al punto 3.1 del prodotto fermentato ottenuto (3.2) dal mosto, dal mosto concentrato e dal mosto concentrato rettificato, vengono esaminati secondo quanto prescritto in 6 «interpretazione dei risultati» (6.1.1) confrontandoli con l'alcol estratto dal prodotto di fermentazione dei mosti naturali testimoni. L'arricchimento, E % vol, esprime il volume di alcol apportato al prodotto fermentato. Conoscendo l'eventuale diluizione effettuata prima della fermentazione (mosti concentrati e mosti concentrati rettificati) ammettendo che 16,83 g di zucchero danno l'1 % vol di alcol, calcolare la quantità in massa di zucchero aggiunto per litro di mosto, di mosto concentrato o di mosto concentrato rettificato.6.2. Aumento del titolo alcolometrico naturale con l'aggiunta di una miscela di zucchero di barbabietola e di zucchero di canna o di glucosio di mais I rapporti istotopici (D/H)I e R risultano meno modificati che nel caso di arricchimento con un solo tipo di zucchero. (D/H)II e (D/H)WQ risultano aumentati.La conferma di queste aggiunte può aversi determinando il rapporto 13C/12C dell'etanolo con lo spettrometria di massa; questo rapporto risulterà in tale caso aumentato. 9. CENERI 1. DEFINIZIONE Con il termine ceneri si intende l'insieme dei prodotti ottenuti per incenerimento del residuo dell'evaporazione del vino, condotto in modo da ottenere la totalità dei cationi (ad esclusione dello ione ammonio) sotto forma di carbonati o di altri sali minerali anidri.2. PRINCIPIO DEL METODO Incenerimento dell'estratto del vino, effettuato fra 500 e 550 °C fino a combustione completa del carbonio.3. APPARECCHIATURA 3.1. Bagnomaria a 100 °C 3.2. Bilancia con sensibilità di un decimo di milligrammo 3.3. Piastra riscaldante o evaporatore all'infrarosso 3.4. Forno elettrico con termoregolatore 3.5. Essiccatore 3.6. Capsula in platino a fondo piano del diametro di 70 mm ed altezza di 25 mm4. MODO DI OPERARE Versare 20 ml di vino nella capsula in platino previamente tarata (Po g). Fare evaporare su bagnomaria a 100 °C, scaldare il residuo sulla piastra riscaldante a 200 °C o sotto l'evaporatore all'infrarosso, fino a carbonizzazione. Quando non si ha più emissione di vapore, porre la capsula nel forno elettrico portato alla temperatura di 525 ± 25 °C. Dopo 15 minuti di carbonizzazione, ritirare la capusla dal forno, aggiungere 5 ml di acqua distillata che vengono successivamente fatti evaporare sul bagnomaria o sotto l'evaporatore all'infrarosso e riscaldare di nuovo a 525 °C per una decina di minuti. Se la combustione delle particelle carboniose non è completa, ricominciare le operazioni di lavaggio delle particelle carboniose, di evaporazione dell'acqua e di incenerimento. Per i vini ricchi di zucchero, conviene, precedentemente alla prima calcinazione, aggiungere all'estratto alcune gocce di olio vegetale puro per impedire che il contenuto trabocchi. Dopo raffreddamento in essiccatore, pesare la capsula; sia P1g il peso. Il peso delle ceneri corrispondente al campione prelevato per la prova (20 ml) è p = (P1 Po) g.5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 5.1. Metodo di calcolo Il peso P delle ceneri epresso in grammi per litro con due cifre decimali sarà:P = 50 · p 10. ALCALINITÀ DELLE CENERI 1. DEFINIZIONE Si denomina l'alcalinità delle ceneri la somma dei cationi, diversi dall'ammonio, combinati agli acidi organici del vino.2. PRINCIPIO DEL METODO Titolazione in presenza di metilarancio delle ceneri solubilizzate a caldo con un eccesso noto di acido titolato.3. REATTIVI E MATERIALE 3.1. Soluzione 0,05 M di acido solforico (H2SO4) 3.2. Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH) 3.3. Soluzioni in acqua distillata di metilarancio allo 0,1 % 3.4. Bagnomaria a 100 °C4. MODO DI OPERARE Aggiungere nella capsula di platino contenente le ceneri di 20 ml di vino 10 ml di soluzione 0,05 M di acido solforico (3.1); porre la capsula su bagnomaria a 100 °C per 15 minuti circa, rompendo il residuo con l'aiuto di una bacchetta di vetro per agevolare la dissoluzione. Aggiungere quindi due gocce di soluzione di metilarancio e titolare l'eccesso di acido solforico con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) fino a viraggio al giallo dell'indicatore.5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI Metodo di calcolo L'alcalinità delle ceneri espressa in milliequivalenti per litro, con una cifra decimale sarà: A = 5 (10 n)n = numero di millilitri di idrossido di sodio 0,1 M 11. CLORURI 1. PRINCIPIO DEL METODO I cloruri vengono dosati direttamente nel vino mediante potenziometria facendo uso dell'elettrodo Ag/AgCl.2. APPARECCHIATURA 2.1. pH metro millivoltmetro graduato almeno di 2 in 2 mV 2.2. Agitatore magnetico 2.3. Elettrodo Ag/AgCl, con una soluzione satura di nitrato di potassio come elettrolita 2.4. Microburetta graduata a 1/100 di ml 2.5. Cronometro3. REATTIVI 3.1. Soluzione standard di cloruri: 2,1027 g di cloruro di potassio, KCl (massimo 0,005 % guadi Brix), essiccati prima dell'uso mediante conservazione per qualche giorno in un essiccatore, vengono sciolti in acqua distillata e portati al volume di 1 litro. 1 ml di questa soluzione contiene 1 mg di Cl . 3.2. Soluzione titolata di nitrato di argento: 4,7912 g di nitrato di argento, AgNO3, vengono sciolti e portati al volume di 1 litro in una soluzione alcolica al 10 % (v/v) : 1 ml di questa soluzione corrisponde a 1 mg di Cl . 3.3. Acido nitrico almeno al 65 % (r20 = 1,40 g/ml).4. MODO DI OPERARE 4.1. 5,0 ml di soluzione standard di cloruri vengono introdotti in un recipiente cilindrico di 150 ml sistemato su un agitatore magnetico, diluiti a 100 ml circa con acqua distillata ed acidificati con 1,0 ml di acido nitrico al 65 % minimo. Dopo l'immersione dell'elettrodo, titolare aggiungendo con la microburetta la soluzione titolata di nitrato di argento, agitando moderatamente. Le aggiunte effettuate sono, all'inizio di 1,00 ml per i primi 4 ml, leggere i valori corrispondenti in millivolt. Aggiungere poi i 2 ml successivi suddivisi in frazioni di 0,20 ml. Riprendere infine le aggiunte di 1 ml per volta, finché non saranno stati aggiunti in totale 10 ml. Dopo ciascuna aggiunta aspettare circa 30 secondi prima di effettuare la lettura dei millivolt corrispondenti. Portare i valori ottenuti su carta millimetrata, in funzione dei millilitri di soluzione titolata corrispondenti e determinare il potenziale del punto di equivalenza in base al punto singolo della curva ottenuta. 4.2. In un recipiente cilindrico da 150 ml vengono introdotti 5 ml della soluzione standard di cloruri, nonché 95 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico al 65 % minimo. Immergere l'elettrodo e titolare agitando fino a ottenimento del potenziale del punto di equivalenza. Questa determinazione viene ripetuta fino al raggiungimento di una buona concordanza tra i risultati. È necessario effettuare questo controllo prima di ciascuna serie di dosaggi dei cloruri nei campioni. 4.3. 50 ml di vino da analizzare vengono introdotti in un recipiente cilindrico da 150 ml. Aggiungere 50 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico di concentrazione non inferiore al 65 % e titolare secondo il procedimento indicato al punto 4.2.5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 5.1. Calcoli Se n rappresenta il numero dei millilitri di soluzione titolata di nitrato d'argento, il tenore in cloruri del prodotto in esame è: 20 × n espresso in milligrammi di Cl per litro,0,5633 × n espresso in milliequivalenti per litro,32,9 × n espresso in milligrammi di cloruro di sodio per litro.5.2. Ripetibilità (r) r = 1,2 mg di C1 per litror = 0,03 meq/lr = 2,0 mg NaCl/l5.3. Riproducibilità (R) R = 4,1 mg di Cl per litroR = 0,12 meq/lR = 6,8 mg NaCl/l6. Osservazioni: Dosaggio molto preciso. Si fa riferimento alla curva di titolazione completa ottenuta durante il dosaggio del prodotto in esame mediante la soluzione di nitrato di argento. a) Versare 50 ml di vino da analizzare in un recipiente cilindrico da 150 ml. Aggiungere 50 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico ad una concentrazione non inferiore al 65 %. Titolare per mezzo della soluzione di nitrato di argento, procedendo ad aggiunte di 0,5 ml per le quali si rileva il corrispondente potenziale in millivolt. Dedurre da questa prima titolazione il volume approssimativo di soluzione di nitrato di argento necessario. b) Ricominciare il dosaggio nelle stesse condizioni. Procedere all'inizio ad aggiunte di 0,5 ml di soluzione titolante fino a che il volume aggiunto è inferiore di 1,52 ml al volume determinato in a). Procedere quindi ad aggiunte di 0,2 ml; continuare le aggiunte al di là del punto di equivalenza approssimativamente individuato, in modo simmetrico, mediante aggiunta di 0,2 e poi di 0,5 ml. Il punto finale del dosaggio ed il volume di soluzione di nitrato di argento esattamente consumato viene ottenuto:- tracciando la curva e determinando il punto di equivalenza, oppure- con il calcolo:dove:V = volume di soluzione titolata al punto di equivalenzaV2 = volume di soluzione titolata prima del più grande salto di potenzialeDVi = volume costante delle frazioni di soluzione titolata aggiunte, ovvero 0,2 mlDDE1 = differenza di potenziale prima della più grande variazione di potenzialeDDE2 = seconda differenza di potenziale dopo la più grande variazione di potenziale Esempio: Volume di soluzione titolata di AgNO3Potenziale E in mVDifferenza DEDifferenza seconda DDE 0204 4 0,2208 0 4 0,4212 2 6 0,6218 0 6 0,8224 0 6 1,0230 2 8 1,2238 4 12 1,4250 10 22 1,6272 22 44 1,8316 10 34 2,0350 8 26 2,2376 6 20 2,4396 In questo esempio il punto finale della titolazione è situato tra 1,6 e 1,8 ml: perché è in questo intervallo che appare il più grande salto di potenziale (DE = 44 mV). Il volume di soluzione titolata di nitrato di argento consumato per dosare i cloruri nella aliquota di sostanza da analizzare è il seguente: 12. SOLFATI 1. PRINCIPIO DEI METODI 1.1. Metodo di riferimento Precipitazione del solfato di bario e pesata. Il fosfato di bario precipitato nelle stesse condizioni viene eliminato mediante lavaggio del precipitato con acido cloridrico. Nel caso dei mosti o dei vini ricchi di anidride solforosa, è necessaria una desolfitazione preliminare mediante ebollizione al riparo dall'aria.1.2. Metodo rapido di prova Classificazione dei vini in diverse categorie mediante un metodo detto dei limiti, basato sulla precipitazione del solfato di bario mediante una soluzione titolata di ione bario.2. METODO DI RIFERIMENTO 2.1. Reattivi 2.1.1. Acido cloridrico in soluzione 2 M. 2.1.2. Cloruro di bario in soluzione di 200 g/l di BaCl2, 2H2O.2.2. Modo di operare 2.2.1. Caso generale In una provetta da centrifuga da 50 ml introdurre 40 ml di campione da analizzare; aggiungere 2 ml di acido cloridrico 2 M e 2 ml di soluzione di cloruro di bario di 200 g/l; agitare con una bacchetta di vetro; lavare la bacchetta con poca acqua distillata e lasciare a riposo per 5 minuti. Centrifugare per 5 minuti, poi decantare con precauzione il liquido surnatante. Lavare quindi il precipitato di solfato di bario procedendo come segue: aggiungere 10 ml di acido cloridrico 2 M, mettere il precipitato in sospensione e centrifugare per 5 minuti. Separare con precauzione il liquido surnatante. Ripetere due volte il lavaggio del precipitato nelle stesse condizioni con 15 ml di acqua distillata ogni volta. Travasare quantitativamente lavando con acqua distillata il precipitato in una capsula di platino tarata e sistemarla su un bagnomaria a 100 °C fino a evaporazione a secco. Il precipitato essiccato viene calcinato parecchie volte brevemente su fiamma fino a ottenimento di un residuo bianco. Lasciar raffreddare in un essiccatore e pesare. Sia m la massa in milligrammi di solfato di bario ottenuta.2.2.2. Caso particolare: mosti solfitati e vino a elevato tenore di anidride solforosa Procedere in primo luogo all'eliminazione dell'anidride solforosa. In una beuta da 500 ml munita di imbuto separatore e di tubo di scarico introdurre 25 ml d'acqua e 1 ml di acido cloridrico (r20 = 1,15 1,18 g/ml). Far bollire questa soluzione per eliminare l'aria e introdurre 100 ml di vino attraverso l'imbuto separatore, mantenendo l'ebollizione. Continuare l'ebollizione finché il volume del liquido contenuto nella beuta viene ridotto a circa 75 ml e travasarlo quantitativamente, previo raffreddamento, in un matraccio tarato da 100 ml. Portare a volume con acqua. Procedere al dosaggio dei solfati su un'aliquota di 40 ml, come indicato al punto 2.2.1. 2.3. Espressione dei risultati 2.3.1. Calcoli Il tenore in solfati, espresso in milligrammi per litro di solfato di potassio, K2SO4 è di:18,67 × m Il tenore del mosto o del vino in solfati viene espresso in milligrammi per litro di solfato di potassio, senza decimali. 2.3.2. Ripetibilità (r) Fino a 1 000 mg/l: r = 27 mg/lAttorno a 1 500 mg/l: r = 41 mg/l 2.3.3. Riproducibilità (R) Fino a 1 000 mg/l: R = 51 mg/lAttorno a 1 500 mg/l: R = 81 mg/l3. SAGGIO RAPIDO 3.1. Reattivi 3.1.1. Soluzione titolata di cloruro di bario 2,804 g di cloruro di bario, BaCl2, 2H2O e 10 ml di acido cloridrico (r20 = 1,15 1,18 g/ml) vengono sciolti in una quantità d'acqua sufficiente a ottenere 1 l di soluzione, 1 ml di questa soluzione precipita un quantitativo di ioni solfato equivalente a 2 mg di solfato di potassio. 3.1.2. Acido solforico (r20 = 1,84 g/ml) in soluzione diluita 1/10 (m/v)3.2. Modo di operare In tre provette porre 10 ml di mosto o di vino; aggiungere al n. 1 : 3,5 ml, al n. 2 : 5 ml e al n. 3 : 10 ml della soluzione di cloruro di bario. Agitare e portare a ebollizione; lasciar riposare 1-2 h. Il liquido di ogni provetta, decantato, viene filtrato e diviso in due porzioni. In una aggiungere qualche goccia della soluzione diluita di acido solforico, nell'altra aggiungere qualche goccia della soluzione di cloruro di bario. Esaminare ogni provetta e osservare la sua limpidezza o la sua torbidità. L'interpretazione viene data nella tabella seguente. VinoCloruro di barioVino filtrato +acido solforico diluitosoluzione di cloruro di bario1a prova(ml)(ml)torbidolimpido103,5(meno di 0,7 g di K2SO4/l) limpido torbido (oltre 0,7 g di K2SO4/l)2a prova105torbidolimpido(meno di 1 g di K2SO4/l) limpido torbido (oltre 1 g di K2SO4/l)3a prova1010torbidolimpido(meno di 2 g di K2SO4/l) limpido torbido (oltre 2 g di K2SO4/l) 13. ACIDITÀ TOTALE 1. DEFINIZIONE L'acidità totale è la somma delle acidità titolabili allorché si porta il pH a 7 per addizione di una soluzione alcalina titolata. Il biossido di carbonio non è compreso nell'acidità totale.2. PRINCIPIO DI METODO Titolazione potenziometrica o titolazione in presenza di blu di bromotimolo, come indicatore di fine reazione, per confronto con un campione colorato.3. REATTIVI 3.1. Soluzione tampone a pH 7,0:fosfato monopotassico KH2PO4: 107,3 g soluzione M di idrossido di sodio (NaOH): 500 ml acqua q.b. a: 1 000 ml Le soluzioni tampone reperibili in commercio possono essere utilizzate. 3.2. Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH). 3.3. Soluzione di blu di bromotimolo a 4 g/l. Blu di bromotimolo (C27H28Br2O5S):4 gAlcool neutro a 96 % vol: 200 mlDopo aver solubilizzato aggiungere:Acqua esente da CO2: 200 mlSoluzione M di idrossido di sodioq.b. a colorazione blu-verde (pH = 7): 7,5 mlAcqua q.b. a:1 000 ml4. APPARECCHIATURA 4.1. Pompa per vuoto ad acqua. 4.2. Beuta da vuoto da 500 ml. 4.3. Potenziometro con scala tarata in unità di pH e relativi elettrodi. L'elettrodo di vetro deve essere conservato in acqua distillata. L'elettrodo al calomelano-cloruro di potassio saturo deve essere conservato in una soluzione satura di cloruro di potassio. Nella maggior parte dei casi si usa un elettrodo combinato; conservarlo in acqua distillata. 4.4. Recipiente cilindrico da 50 ml per i vini e da 100 ml per i mosti concentrati rettificati.5. MODO DI OPERARE 5.1. Preparazione del campione 5.1.1. Vini Eliminazione del biossido di carbonio. Porre in una beuta da vuoto 50 ml di vino; agitare e fare contemporaneamente il vuoto mediante la pompa ad acqua. L'agitazione deve durare 1-2 minuti. 5.1.2. Mosti concentrati rettificati Introdurre 200 g di mosto concentrato rettificato pesato esattamente, in un pallone tarato da 500 ml