2)

all'allegato V è aggiunta la seguente parte I bis: «PARTE I bis Metodi di analisi del latte scremato in polvere destinato all'intervento pubblico Parametro Metodo Proteine ISO 8968 parte 1 Grasso ISO 1736 Acqua ISO 5537 Acidità ISO 6091 Lattati ISO 8069 Prova di fosfatasi ISO 11816 parte 1 Indice di insolubilità ISO 8156 Particelle combuste (2) ADPI Microrganismi ISO 4833 parte 1 Latticello Appendice I Siero di latte presamico (3) Appendici II e III Siero di latte acido (4) ISO 8069 o controlli in loco Controlli organolettici (5) ISO 22935 parti 2 e 3 Appendice I LATTE SCREMATO IN POLVERE: DETERMINAZIONE DELLA QUANTITÀ DI FOSFATIDILSERINA E FOSFATIDILETANOLAMINA Metodo: HPLC in fase inversa 1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE Il metodo descrive una procedura per la determinazione quantitativa della fosfatidilserina (PS) e della fosfatidiletanolamina (PE) nel latte scremato in polvere (LSP) ed è adatto per rivelare particelle solide di latticello nel LSP. 2. DEFINIZIONE Contenuto di PS + PE: la frazione in massa di sostanza determinata utilizzando la procedura qui specificata. Il risultato è espresso in milligrammi di dipalmitoilfosfatidiletanolamina (PEDP) per 100 g di polvere. 3. PRINCIPIO DEL METODO Estrazione degli amminofosfolipidi mediante metanolo da latte in polvere ricostituito. Determinazione di PS e PE come derivati della dialdeide o-ftalica (OPA) mediante HPLC in fase inversa (RP) e rivelazione per fluorescenza. Quantificazione del contenuto di PS e PE nel campione d'analisi per riferimento ad un campione standard contenente una quantità nota di PEDP. 4. REAGENTI Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua deve essere distillata o di purezza almeno equivalente, salvo diversamente specificato. 4.1. Materiale standard: PEDP, purezza 99 % minimo Nota: Il materiale standard deve essere conservato a – 18 °C. 4.2. Reagenti per le preparazioni del campione standard e del campione d'analisi 4.2.1. Metanolo per HPLC 4.2.2. Cloroformio per HPLC 4.2.3. Triptamina monocloridrato 4.3. Reagenti per la derivatizzazione con dialdeide o-ftalica 4.3.1. Idrossido di sodio, soluzione acquosa 12M 4.3.2. Acido borico, soluzione acquosa 0,4M regolata a pH 10,0 con idrossido di sodio (4.3.1) 4.3.3. 2-mercaptoetanolo 4.3.4. Dialdeide o-ftalica (OPA) 4.4. Solventi per l'eluizione HPLC 4.4.1. I solventi di eluizione devono essere preparati utilizzando reagenti per HPLC 4.4.2. Acqua per HPLC 4.4.3. Metanolo di purezza fluorimetrica controllata 4.4.4. Tetraidrofurano 4.4.5. Diidrogenofosfato di sodio 4.4.6. Acetato di sodio 4.4.7. Acido acetico 5. APPARECCHIATURA 5.1. Bilancia analitica, in grado di pesare con l'approssimazione di 1 mg e con risoluzione di 0,1 mg 5.2. Becher da 25 e 100 ml 5.3. Pipette da 1 e 10 ml 5.4. Agitatore magnetico 5.5. Pipette graduate da 0,2, 0,5 e 5 ml 5.6. Matracci tarati da 10, 50 e 100 ml 5.7. Siringhe da 20 e 100 μl 5.8. Bagno ad ultrasuoni 5.9. Centrifuga a 27 000 × g 5.10. Flaconi di vetro della capacità di circa 5 ml 5.11. Cilindro graduato da 25 ml 5.12. pH-metro, con l'approssimazione di 0,1 unità di pH 5.13. Apparecchiatura HPLC 5.13.1. Sistema di pompaggio a gradiente in grado di funzionare a 1,0 ml/min a 200 bar 5.13.2. Autocampionatore con possibilità di derivatizzazione 5.13.3. Riscaldatore di colonna termostatato a 30 °C ± 1 °C 5.13.4. Rivelatore a fluorescenza regolato alla lunghezza d'onda di eccitazione di 330 nm e alla lunghezza d'onda di emissione di 440 nm 5.13.5. Integratore o software di elaborazione dati in grado di misurare l'area dei picchi 5.13.6. Una colonna LiChrosphere® — 100 (250 × 4,6 mm) o una colonna equivalente riempita con ottadecilsilano (C 18), granulometria 5 μm. 6. CAMPIONAMENTO Il campionamento deve essere eseguito secondo la norma ISO 707. 7. PROCEDIMENTO 7.1. Preparazione della soluzione dello standard interno 7.1.1. Pesare 30,0 ± 0,1 mg di triptamina monocloridrato (4.2.3) in un matraccio tarato da 100 ml (5.6) e portare alla tacca con metanolo (4.2.1). 7.1.2. Pipettare 1 ml (5.3) di questa soluzione in un matraccio tarato da 10 ml (5.6) e integrare alla tacca con metanolo (4.2.1) in modo da ottenere una concentrazione di triptamina pari a 0,15 mM. 7.2. Preparazione della soluzione campione d'analisi 7.2.1. Pesare 1,000 ± 0,001 g del campione di LSP in un becher da 25 ml (5.2). Aggiungere 10 ml di acqua distillata a 40 °C ± 1 °C mediante una pipetta (5.3) e agitare con l'agitatore magnetico (5.4) per 30 minuti per sciogliere eventuali grumi. 7.2.2. Pipettare 0,2 ml (5.5) del latte ricostituito in un matraccio tarato da 10 ml (5.6), aggiungere 100 μl della soluzione di triptamina 0,15 mM (7.1) con una siringa (5.7) e portare a volume con metanolo (4.2.1). Miscelare accuratamente capovolgendo il matraccio e sottoponendolo a bagno ultrasonico (5.8) per 15 minuti. 7.2.3. Centrifugare (5.9) a 27 000 g per 10 minuti e raccogliere il surnatante in un flacone di vetro (5.10). Nota: La soluzione campione deve essere conservata a 4 °C fino al momento dell'esecuzione dell'analisi HPLC. 7.3. Preparazione della soluzione dello standard esterno 7.3.1. Pesare 55,4 mg di PEDP (4.1) in un matraccio tarato da 50 ml (5.6) e aggiungere circa 25 ml di cloroformio (4.2.2) mediante un cilindro graduato (5.11). Riscaldare il matraccio tappato a 50 °C ± 1 °C e miscelare accuratamente fino a quando il PEDP si scioglie. Raffreddare il matraccio a 20 °C, portare a volume con metanolo (4.2.1) e miscelare capovolgendolo. 7.3.2. Pipettare 1 ml (5.3) di questa soluzione in un matraccio tarato da 100 ml (5.6) e portare a volume con metanolo (4.2.1). Pipettare 1 ml (5.3) di questa soluzione in un matraccio tarato da 10 ml (5.6), aggiungere 100 μl (5.7) di soluzione di triptamina 0,15 mM (7.1) e portare a volume con metanolo (4.2.1). Miscelare mediante capovolgimento. Nota: La soluzione del campione deve essere conservata a 4 °C fino al momento dell'esecuzione dell'analisi HPLC. 7.4. Preparazione del reagente di derivatizzazione Pesare 25,0 ± 0,1 mg di OPA (4.3.4) in un matraccio tarato da 10 ml (5.6), aggiungere 0,5 ml (5.5) di metanolo (4.2.1) e miscelare accuratamente per sciogliere l'OPA. Portare alla tacca con soluzione di acido borico (4.3.2) e aggiungere 20 μl di 2-mercaptoetanolo (4.3.3) con una siringa (5.7). Nota: Il reagente di derivatizzazione deve essere conservato a 4 °C in un flacone scuro; in tal modo rimane stabile per una settimana. 7.5. Determinazione HPLC 7.5.1. Solventi di eluizione (4.4) Solvente A: soluzione di diidrogenofosfato di sodio 0,3 mM e di acetato di sodio 3 mM (regolata a pH 6,5 ± 0,1 con acido acetico): metanolo: tetraidrofurano = 558:440:2 (v/v/v) Solvente B: metanolo 7.5.2. Gradiente di eluizione consigliato: Durata (min) Solvente A (%) Solvente B (%) Portata (ml/min) Iniziale 40 60 0 0,1 40 60 0,1 5,0 40 60 0,1 6,0 40 60 1,0 6,5 40 60 1,0 9,0 36 64 1,0 10,0 20 80 1,0 11,5 16 84 1,0 12,0 16 84 1,0 16,0 10 90 1,0 19,0 0 100 1,0 20,0 0 100 1,0 21,0 40 60 1,0 29,0 40 60 1,0 30,0 40 60 0 Nota: Il gradiente di eluizione può richiedere leggere modifiche per ottenere la risoluzione mostrata in figura 1. Temperatura della colonna: 30 °C. 7.5.3. Volume di iniezione: 50 μl di reagente di derivatizzazione e 50 μl di soluzione campione. 7.5.4. Equilibratura della colonna Tutti i giorni, all'avviamento del sistema flussare la colonna con solvente B al 100 % per 15 minuti, regolarla poi su A:B = 40:60 ed equilibrarla a 1 ml/min per 15 minuti. Eseguire una prova in bianco iniettando metanolo (4.2.1). Nota: Se si prevede di non usare la colonna per un tempo prolungato, flussarla con metanolo: cloroformio = 80:20 (v/v) per 30 minuti. 7.5.5. Determinazione del contenuto di PS + PE nel campione d'analisi 7.5.6. Eseguire la sequenza delle analisi cromatografiche mantenendo costante il tempo da una prova all'altra allo scopo di ottenere tempi di ritenzione costanti. Iniettare la soluzione dello standard esterno (7.3) ogni 5-10 soluzioni del campione d'analisi per calcolare il coefficiente di risposta. Nota: La colonna deve essere pulita mediante flussaggio con solvente B al 100 % (7.5.1) per almeno 30 minuti ogni 20-25 prove. 7.6. Modalità di integrazione 7.6.1. Picco PEDP Il PEDP viene eluito come picco singolo. Determinare l'area del picco mediante integrazione da valle a valle. 7.6.2. Picco della triptamina La triptamina viene eluita come picco singolo (figura 1). Determinare l'area del picco mediante integrazione da valle a valle. 7.6.3. Gruppo dei picchi PS e PE Nelle condizioni descritte (figura 1), la PS eluisce nella forma di due picchi principali parzialmente non risolti preceduti da un picco minore; la PE eluisce nella forma di tre picchi principali parzialmente non risolti. Determinare l'area totale di ciascun gruppo di picchi fissando la linea di base come indicato nella figura 1. 8. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI Calcolare il contenuto di PS e PE nel campione d'analisi con la formula seguente: C = 55,36 × [(A2)/(A1)] × [(T1)/(T2)] dove: C = contenuto di PS o PE (mg/100 g di polvere) nel campione d'analisi; A 1 = area del picco della PEDP della soluzione campione standard (7.3); A 2 = area del picco PS o PE della soluzione campione d'analisi (7.3); T 1 = area del picco della triptamina della soluzione campione standard (7.3); T 2 = area del picco della triptamina della soluzione campione d'analisi (7.2). 9. PRECISIONE DEL METODO Nota: I valori della ripetibilità sono stati calcolati secondo la norma internazionale FIL (*). 9.1. Ripetibilità La deviazione standard relativa della ripetibilità (che esprime la variabilità di risultati analitici indipendenti ottenuti dallo stesso operatore utilizzando la stessa apparecchiatura nelle stesse condizioni sullo stesso campione d'analisi e a breve distanza di tempo) non deve superare il 2 % in valore relativo. La differenza relativa tra i risultati di due determinazioni ottenute in queste condizioni non deve essere superiore al 6 % della media aritmetica dei risultati. 9.2. Riproducibilità La differenza relativa tra i risultati di due determinazioni ottenute da operatori di differenti laboratori utilizzando apparecchiature differenti in differenti condizioni per l'analisi dello stesso campione non deve essere maggiore dell'11 % della media aritmetica dei risultati. 10. BIBLIOGRAFIA 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., “Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids.” Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Figura 1 Diagramma HPLC di derivati OPA della fosfatidilserina (PS) e della fosfatidiletanolammina (PE) in estratto metanolico di latte scremato in polvere ricostituito. È riportato il modo di integrazione dei picchi di PS, PE e triptamina (standard interno) Appendice II RICERCA DEL LATTOSIERO PRESAMICO NEL LATTE SCREMATO IN POLVERE DESTINATO ALL'AMMASSO PUBBLICO ATTRAVERSO IL DOSAGGIO DEI CASEINOMACROPEPTIDI MEDIANTE IL METODO PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (HPLC) 1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE Questo metodo permette di evidenziare la presenza di lattosiero presamico nel latte scremato in polvere destinato all'ammasso pubblico attraverso il dosaggio dei caseinomacropeptidi. 2. RIFERIMENTO Norma internazionale ISO 707 - Latte e prodotti lattieri – Orientamenti in materia di campionamento. 3. DEFINIZIONE Il contenuto di siero di latte presamico in polvere è espresso come percentuale di massa, determinato mediante il contenuto di caseinomacropeptidi secondo il metodo in appresso descritto. 4. PRINCIPIO — Ricostituzione del latte scremato in polvere in acqua calda, eliminazione dei grassi e delle proteine con acido tricloroacetico, centrifugazione o filtrazione. — Determinazione della quantità di caseinomacropeptidi (CMP) presente nel surnatante mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). — Valutazione del risultato ottenuto in confronto con campioni di riferimento costituiti da latte scremato in polvere esente o addizionato di una percentuale nota di lattosiero in polvere. 5. REAGENTI Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua da impiegare deve essere acqua distillata o acqua di purezza almeno equivalente. 5.1. Soluzione di acido tricloracetico Sciogliere in acqua 240 g di acido tricloroacetico (CCl3COOH) e portare a 1 000 ml. La soluzione deve essere chiara e incolore. 5.2. Soluzione eluente a pH 6,0 Sciogliere 1,74 g di fosfato dipotassico (K2HPO4), 12,37 g di fosfato monopotassico (KH2PO4) e 21,41 g di solfato di sodio (Na2SO4) in 700 ml d'acqua circa. Se necessario, regolare a pH 6,0 mediante una soluzione di acido fosforico o di idrossido di potassio. Portare a 1 000 ml con acqua e miscelare. Nota: La composizione dell'eluente può essere aggiornata per rispettare il certificato delle norme o le raccomandazioni del fabbricante del materiale di confezione della colonna. Prima dell'impiego, filtrare la soluzione eluente su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm. 5.3. Soluzione di lavaggio Mescolare 1 volume di acetonitrile (CH3CN) con 9 volumi d'acqua. Prima dell'utilizzazione, filtrare la miscela su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm. Nota: Può essere impiegata qualsiasi altra soluzione di lavaggio dotata di effetto battericida e tale da non alterare l'efficacia di risoluzione delle colonne. 5.4. Campioni di riferimento 5.4.1. Latte scremato in polvere rispondente alle esigenze del presente regolamento, indicato in seguito con [0]. 5.4.2. Lo stesso latte, sofisticato al 5 % (m/m) con lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in seguito con [5]. 6. APPARECCHIATURA 6.1. Bilancia analitica 6.2. Centrifuga (facoltativa) capace di raggiungere 2 200 g e fornita di provette a tappo della capacità di 50 ml circa 6.3. Agitatore meccanico 6.4. Agitatore magnetico 6.5. Imbuti in vetro del diametro di 7 cm circa 6.6. Dischi di carta da filtro (porosità media) del diametro di 12,5 cm circa 6.7. Dispositivo di filtrazione in vetro provvisto di membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm 6.8. Pipette graduate capaci di erogare 10 ml (norma ISO 648, classe A o ISO/R 835) oppure un sistema capace di erogare 10,0 ml in due minuti 6.9. Sistema erogatore capace di erogare 20,0 ml di acqua a ca. 50 °C 6.10. Bagnomaria, termostatato a 25 ± 0,5 °C 6.11. Apparecchiatura HPLC comprendente: 6.11.1. pompa; 6.11.2. iniettore, manuale o automatico, da 15 a 30 μl di capacità; 6.11.3. due colonne in serie TSK 2 000-SW (lunghezza 30 cm, diametro interno 0,75 cm) o colonne di pari efficacia (es. colonna singola TSK 2 000-SWxl, colonna singola Agilent Technologies Zorbax GF 250) ed una precolonna a monte (3 cm × 0,3 cm), caricata con I 125 o con un materiale di pari efficacia; 6.11.4. forno a colonna, termostatato a 35 ± 1 °C; 6.11.5. rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, capace di effettuare misure a 205 nm con la sensibilità di 0,008 Å; 6.11.6. integratore capace di misurare l'altezza dei picchi da valle a valle. Nota: Si può lavorare mantenendo le colonne a temperatura ambiente, ma il potere di risoluzione risulta leggermente più basso. In questo caso, le variazioni di temperatura nel corso di una stessa serie di analisi devono essere inferiori a ± 5 °C. 7. CAMPIONAMENTO 7.1. Il prelievo dei campioni si effettua in base alla procedura prevista dalla norma internazionale ISO 707. Gli Stati membri possono tuttavia impiegare un altro metodo di campionamento purché conforme ai principi della succitata norma. 7.2. Conservare il campione in condizioni tali da non consentire alcun deterioramento o modifica di composizione. 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparazione del campione da analizzare Travasare la polvere in un recipiente di capacità all'incirca doppia del volume della polvere, provvisto di un coperchio impermeabile all'aria. Chiudere immediatamente il recipiente. Mescolare bene il latte in polvere capovolgendo più volte il recipiente. 8.2. Aliquota da analizzare In una provetta da centrifuga (6.2) o in una bottiglia chiusa idonea (50 ml) pesare 2,000 g del campione con l'approssimazione di 0,001 g. 8.3. Eliminazione dei grassi e delle proteine 8.3.1. Aggiungere all'aliquota da analizzare 20,0 ml di acqua calda (50 °C). Sciogliere la polvere agitando per 5 minuti con l'agitatore (6.3). Mettere la provetta a bagnomaria (6.10) fino a raggiungere i 25 °C. 8.3.2. Lavorando sotto agitazione magnetica (6.4), aggiungere 10,0 ml della soluzione di acido tricloroacetico (5.1) a ca. 25 °C in 2 minuti. Collocare la provetta nel bagnomaria (6.10) e mantenervela per 60 minuti. 8.3.3. Centrifugare (6.2) a 2 200 g per 10 minuti, oppure filtrare su carta (6.6), eliminando i primi 5 ml di filtrato. 8.4. Determinazione cromatografica 8.4.1. Iniettare nell'apparecchio HPLC (6.11) da 15 a 30 μl del surnatante o del filtrato (8.3.3), misurati esattamente, mantenendo la velocità di flusso della soluzione eluente (5.2) sul valore di 1,0 ml/minuto. Nota 1: Si può usare un'altra velocità di flusso in funzione del diametro interno delle colonne usate o delle istruzioni del fabbricante della colonna. Nota 2: Al momento di ogni interruzione, risciacquare le colonne con acqua. Non lasciarle mai sotto la soluzione eluente (5.2). Prima di ogni interruzione superiore a 24 ore, risciacquare le colonne con acqua, poi lavarle con la soluzione (5.3) per almeno 3 ore, alla velocità di 0,2 ml/minuto. 8.4.2. I risultati dell'analisi cromatografica del campione in esame [E] sono ottenuti sotto forma di cromatogramma in cui ogni picco è identificato dal suo tempo di ritenzione RT, vale a dire: Picco II: secondo picco del cromatogramma, con RT uguale a 12,5 minuti circa. Picco III: terzo picco del cromatogramma, corrispondente ai CMP, con RT uguale a 15,5 minuti. La scelta delle colonne può influire notevolmente sui tempi di ritenzione dei vari picchi. L'integratore (6.11.6) calcola automaticamente la superficie A di ogni picco: AII: superficie del picco II AIII: superficie del picco III Per rilevare le eventuali anomalie dovute a un cattivo funzionamento dell'apparecchiatura o delle colonne, oppure all'origine e alla natura del campione analizzato, è necessario osservare l'aspetto di ogni cromatogramma prima di qualsiasi interpretazione quantitativa. In caso di dubbio, ripetere l'analisi. 8.5. Taratura 8.5.1. Applicare esattamente ai campioni di riferimento (5.4) il modo di operare descritto dal punto 8.2 al punto 8.4.2. Utilizzare soluzioni preparate di recente, in quanto, in presenza di tricloroacetico all'8 %, i CMP si degradano (alla temperatura di 30 °C, difatti, la loro concentrazione diminuisce dello 0,2 % circa ogni ora). 8.5.2. Prima di procedere a qualsiasi determinazione cromatografica sui campioni, condizionare le colonne iniettando ripetutamente la soluzione (8.5.1) del campione di riferimento (5.4.2), finché la superficie e il tempo di ritenzione del picco corrispondente ai CMP risultino costanti. 8.5.3. Determinare i coefficienti di risposta R iniettando volumi di filtrati (8.5.1) uguali a quelli utilizzati per i campioni. 9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 9.1. Metodo di calcolo e formule 9.1.1. Calcolo dei coefficienti di risposta R: Picco II: RII = 100/(AII[0]) dove: RII = coefficiente di risposta del picco II, AII [0] = le superfici dei picchi II del campione di riferimento [0] ottenute in 8.5.3. Picco III: RIII = W/(AIII[5] – AIII[0]) dove: RIII = coefficiente di risposta del picco III, AIII [0] and AIII [5] = le superfici del picco III nei campioni di riferimento [0] e [5] rispettivamente ottenute in 8.5.3, W = quantità di lattosiero presente nel campione di riferimento [5], cioè 5. 9.1.2. Calcolo della superficie relativa dei picchi del campione [E]: SII[E] = RII × AII[E] SIII[E] = RIII × AIII[E] SIV[E] = RIV × AIV[E] dove: SII [E], SIII [E], SIV [E] = superfici relative, rispettivamente dei picchi II, III e IV nel campione [E], AII [E], AIII [E] = superfici rispettivamente dei picchi II e III nel campione [E], ottenute in 8.4.2, RII, RIII = coefficienti di risposta calcolati in 9.1.1. 9.1.3. Calcolo del tempo di ritenzione relativo del picco III del campione [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) dove: RRTIII [E] = tempo di ritenzione relativo del picco III del campione [E], RTIII [E] = tempo di ritenzione del picco III del campione [E] ottenuto in 8.4.2, RTIII [5] = tempo di ritenzione del picco III del campione di controllo [5] ottenuto in 8.5.3. 9.1.4. È stata sperimentalmente dimostrata l'esistenza di una relazione lineare fra il tempo di ritenzione relativo del picco III, cioè RRTIII [E], e la percentuale di lattosiero in polvere aggiunto fino al 10 %: — RRTIII [E] è < 1,000 se il contenuto di lattosiero è > 5 %, — RRTIII [E] è ≥ 1,000 se il contenuto di lattosiero è ≤ 5 %. L'incertezza ammessa per i valori di RRTIII è ± 0,002. Di norma il valore di RRTIII [0] è poco diverso da 1,034. Secondo lo stato delle colonne, esso può avvicinarsi a 1,000, restando tuttavia sempre superiore. 9.2. Calcolo della percentuale di lattosiero presamico in polvere contenuto nel campione: W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)] dove: W = percentuale m/m di lattosiero presamico contenuto nel campione [E], SIII [E] = superficie relativa del picco III del campione da analizzare [E] ottenuto in 9.1.2, 1,3 = superficie relativa media del picco III, espressa in grammi di lattosiero presamico per 100 g determinato in latte scremato in polvere non sofisticato di diversa origine. Questa cifra è stata ottenuta sperimentalmente, SIII [0] = superficie relativa del picco III, che è uguale a RIII × AIII [0]. Tali valori sono ottenuti rispettivamente nei punti 9.1.1 e 8.5.3, (SIII [0] – 0,9) = correzione da apportare alla superficie relativa media 1,3 quando il valore SIII [0] è diverso da 0,9. Sperimentalmente la superficie relativa media del picco III del campione di controllo [0] è di 0,9. 9.3. Precisione del metodo 9.3.1. Ripetibilità La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso analista, impiegando la stessa apparecchiatura e sulla stessa aliquota di campione non deve superare lo 0,2 % m/m. 9.3.2. Riproducibilità La differenza tra due risultati individuali ed indipendenti ottenuti in due laboratori diversi sulla stessa aliquota di campione, non deve superare lo 0,4 % m/m. 9.4. Interpretazione 9.4.1. È possibile concludere per l'assenza di lattosiero se la superficie relativa del picco III, SIII [E], espressa in g di lattosiero presamico per 100 g di prodotto, è ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9) dove: 2,0 è il valore massimo ammesso per la superficie relativa del picco III, che tiene conto della superficie media relativa del picco III, ossia 1,3, dell'incertezza dovuta alle variazioni di composizione del latte scremato in polvere e della riproducibilità del metodo (9.3.2), (SIII [0] — 0,9) è la correzione da apportare quando il valore SIII [0] è diverso da 0,9 (cfr. punto 9.2). 9.4.2. Se la superficie relativa del picco III, SIII [E] è > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e la superficie relativa del picco II, SII [E], è ≤ 160, determinare il tenore di lattosiero presamico presente nel modo indicato al punto 9.2. 9.4.3. Se la superficie relativa del picco III, SIII [E] è > di 2,0 + (SIII[0] – 0,9) e la superficie relativa del picco II, SII [E], è ≤ 160, determinare il tenore di proteine totale (P %); in seguito esaminare i grafici 1 e 2. 9.4.3.1. I dati ottenuti dall'analisi di campioni di latte scremato in polvere non sofisticato che presentano un tenore elevato di proteine totale sono riportati nei grafici 1 e 2. La retta continua rappresenta la retta di regressione lineare i cui coefficienti sono calcolati con il metodo dei minimi quadrati. La retta tratteggiata indica il limite superiore della superficie relativa del picco III, con una probabilità del 90 % di non essere superata. Le equazioni delle rette tratteggiate dei grafici 1 e 2 sono, rispettivamente, uguali a: SIII = 0,376 P % – 10,7 (grafico 1) SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93 (grafico 2) dove: SIII è la superficie relativa del picco III, calcolata in base al tenore di proteine totali o in base alla superficie relativa del picco SII [E], P % è il tenore di proteine totali espresso in percentuale in peso, SII [E] è la superficie relativa del campione, calcolata come indicato nel punto 9.1.2. Queste equazioni sono equivalenti a 1,3, valore menzionato al punto 9.2. Lo scarto (T1 e T2) tra la superficie relativa SIII [E] osservata e la superficie relativa SIII si ricava dalle seguenti relazioni: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)] Se T1 e/o T2 sono inferiori o uguali a zero, non si può concludere che è presente lattosiero presamico. Se T1 e T2 sono superiori a zero, si può concludere che è presente lattosiero presamico. Il tenore di lattosiero presente è calcolato utilizzando la formula seguente: W = T2 + 0,91 dove: 0,91 rappresenta lo scarto sull'asse verticale tra la retta continua e la retta tratteggiata. Appendice III DETERMINAZIONE DEL LATTOSIERO PRESAMICO IN POLVERE NEL LATTE SCREMATO IN POLVERE 1. OGGETTO: RICERCA DELL'AGGIUNTA DI SIERO DI LATTE PRESAMICO IN POLVERE AL LATTE SCREMATO IN POLVERE 2. RIFERIMENTI: NORMA INTERNAZIONALE ISO 707 3. DEFINIZIONE Il contenuto di siero di latte presamico in polvere è espresso come percentuale di massa, determinato mediante il contenuto di caseinomacropeptidi secondo il metodo in appresso descritto. 4. PRINCIPIO I campioni sono analizzati ai fini della ricerca del caseinomacropeptide A mediante il metodo per cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in fase inversa. Valutazione del risultato ottenuto in confronto con campioni di riferimento costituiti da latte scremato in polvere esente o addizionato di una percentuale nota di siero di latte in polvere. I risultati superiori all'1 % (m/m) mostrano la presenza di polvere di siero di latte presamico. 5. REAGENTI Tutti i reagenti devono essere di purezza analitica riconosciuta. L'acqua da impiegare deve essere acqua distillata o acqua di purezza almeno equivalente. L'acetonitrile deve essere di qualità spettroscopica o HPLC. 5.1. Soluzione di acido tricloracetico Sciogliere in acqua 240 g di acido tricloroacetico (CCl3COOH) e portare a 1 000 ml. 5.2. Eluenti A e B Eluente A: in un pallone da 1 000 ml porre 150 ml di acetonitrile (CH3CN), 20 ml di isopropanolo (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml di acido trifluoroacetico (TFA, CF3COOH) e portare al volume di 1 000 ml con acqua. Eluente B: in un pallone da 1 000 ml porre 550 ml di acetonitrile, 20 ml di isopropanolo e 1,00 ml di TFA e portare al volume di 1 000 ml con acqua. Prima dell'impiego, filtrare la soluzione eluente su membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm. 5.3. Conservazione della colonna Dopo le analisi la colonna viene lavata con l'eluente B (con gradiente) e successivamente con acetonitrile (con gradiente per 30 minuti). La colonna è conservata in acetonitrile. 5.4. Campioni di riferimento 5.4.1. Latte scremato in polvere rispondente ai requisiti previsti per l'ammasso pubblico, indicato in appresso con [0]. 5.4.2. Lo stesso latte, sofisticato al 5 % (m/m) con lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in seguito con [5]. 5.4.3. Lo stesso latte, sofisticato al 50 % (m/m) con lattosiero in polvere di tipo presamico di composizione media, indicato in seguito con [50]. 6. APPARECCHIATURA 6.1. Bilancia analitica 6.2. Centrifuga (facoltativa) capace di raggiungere 2 200 g e fornita di provette a tappo della capacità di 50 ml circa 6.3. Agitatore meccanico 6.4. Agitatore magnetico 6.5. Imbuti in vetro del diametro di 7 cm circa 6.6. Dischi di carta da filtro (porosità media) del diametro di 12,5 cm circa 6.7. Dispositivo di filtrazione in vetro provvisto di membrana filtrante con pori del diametro di 0,45 μm 6.8. Pipette graduate capaci di erogare 10 ml (norma ISO 648, classe A o ISO/R 835) oppure un sistema capace di erogare 10,0 ml in due minuti 6.9. Sistema erogatore capace di erogare 20,0 ml di acqua a ca. 50 °C 6.10. Bagnomaria, termostatato a 25 ± 0,5 °C 6.11. Apparecchiatura HPLC comprendente: 6.11.1. sistema di pompaggio a gradiente binario; 6.11.2. iniettore manuale o automatico da 100 μl di capacità; 6.11.3. colonna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (lunghezza 25 cm × diametro interno 0,46 cm) o una colonna equivalente per fase inversa a base di silice a pori larghi; 6.11.4. forno a colonna, termostatato a 35 ± 1 °C; 6.11.5. rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile, capace di effettuare misure fino a 210 nm (se necessario si può utilizzare una lunghezza d'onda superiore, fino a 220 nm), con la sensibilità di 0,02 Å; 6.11.6. integratore capace di impostare l'integrazione o sulla linea di base o da valle a valle. Nota: È possibile far funzionare la colonna a temperatura ambiente purché tale temperatura non abbia fluttuazioni superiori ad 1 °C, altrimenti il tempo di ritenzione del CMP A sarebbe soggetto a variazioni troppo grandi. 7. CAMPIONAMENTO 7.1. Il prelievo dei campioni si effettua in base alla procedura prevista dalla norma internazionale ISO 707. Gli Stati membri possono tuttavia impiegare un altro metodo di campionamento purché conforme ai principi della succitata norma. 7.2. Conservare il campione in condizioni tali da non consentire alcun deterioramento o modifica di composizione. 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparazione del campione da analizzare Travasare la polvere in un recipiente di capacità all'incirca doppia del volume della polvere, provvisto di un coperchio impermeabile all'aria. Chiudere immediatamente il recipiente. Mescolare bene il latte in polvere capovolgendo più volte il recipiente. 8.2. Aliquota da analizzare In una provetta da centrifuga (6.2) o in una bottiglia chiusa idonea (50 ml) pesare 2,00 g del campione con l'approssimazione di 0,001 g. Nota: Nel caso delle miscele, pesare una porzione dell'aliquota da analizzare in modo che la porzione sgrassata del campione corrisponda a 2,00 g. 8.3. Eliminazione dei grassi e delle proteine 8.3.1. Aggiungere all'aliquota da analizzare 20,0 ml di acqua calda (50 °C). Sciogliere la polvere agitando per 5 minuti con l'agitatore meccanico (6.3). Mettere la provetta a bagnomaria (6.10) fino a raggiungere i 25 °C. 8.3.2. Aggiungere 10,0 ml di soluzione di acido tricloroacetico a ca. 25 °C (5.1) senza interruzione per 2 minuti, agitando vigorosamente con l'agitatore magnetico (6.4). Collocare la provetta nel bagnomaria (6.10) e mantenervela per 60 minuti. 8.3.3. Centrifugare a 2 200 g (6.2) per 10 minuti oppure filtrare su carta (6.6), eliminando i primi 5 ml di filtrato. 8.4. Determinazione cromatografica 8.4.1. Il metodo HPLC in fase inversa esclude la possibilità d falsi positivi a causa della presenza di latticello acido in polvere. 8.4.2. Prima di eseguire l'analisi HPLC in fase inversa andranno ottimizzate le condizioni del gradiente. Un tempo di ritenzione di 26 minuti ± 2 minuti per il CMPΑ è ottimale per i sistemi a gradiente con un volume morto di circa 6 ml (volume dal punto in cui i solventi confluiscono sino al volume del circuito dell'iniettore compreso). Per i sistemi a gradiente con un volume morto inferiore (ad esempio 2 ml) si deve utilizzare come tempo ottimale di ritenzione un tempo di 22 minuti. Prendere soluzioni dei campioni di riferimento (5.4) con e senza lattosiero presamico al 50 %. Iniettare 100 μl del surnatante o del filtrato (8.3.3) nell'apparecchiatura HPLC operante alle condizioni di gradiente di esplorazione date nella tabella 1. Tabella 1 Condizioni del gradiente di esplorazione per l'ottimizzazione della cromatografia Tempo (min) Flusso (ml/min) % A % B Curva Iniziale 1,0 90 10 * 27 1,0 60 40 lin 32 1,0 10 90 lin 37 1,0 10 90 lin 42 1,0 90 10 lin Confrontando i due cromatogrammi si dovrebbe individuare il picco del CMPΑ. Utilizzando la formula che segue si può calcolare la composizione del solvente iniziale da utilizzare per il gradiente normale (secondo 8.4.3):% B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11 dove: RTcmpA : tempo di ritenzione del CMPΑ nel gradiente di esplorazione 10 : la % B iniziale del gradiente di esplorazione 2,5 : la % B al punto intermedio meno la % B al punto iniziale nel gradiente normale 13,5 : tempo del punto intermedio del gradiente di esplorazione 26 : tempo di ritenzione necessario del CMPΑ 6 : rapporto dei coefficienti di direzione del gradiente di esplorazione e del gradiente normale 30 : la % B al punto iniziale meno la % B a 27 minuti nel gradiente di esplorazione 27 : tempo di operazione del gradiente di esplorazione 8.4.3. Prendere soluzioni dei campioni da analizzare Iniettare nell'apparecchio HPLC 100 μl del surnatante o del filtrato (8.3.3) misurati esattamente, mantenendo la velocità di flusso della soluzione eluente (5.2) sul valore di 1,0 ml/minuto. La composizione dell'eluente all'inizio dell'analisi si ottiene da 8.4.2. Normalmente essa è prossima ad A: B = 76:24 (5.2). Subito dopo l'iniezione viene avviato un gradiente lineare che dopo 27 minuti porta ad una percentuale di B maggiore del 5 %. Successivamente viene avviato un gradiente lineare che in 5 minuti porta la composizione dell'eluente a 90 % B. Questa composizione viene mantenuta per 5 minuti, dopo di che con un gradiente lineare la composizione cambia e torna in 5 minuti a quella iniziale. Sulla base del volume interno del sistema di pompaggio l'iniezione successiva può essere effettuata 15 minuti dopo aver raggiunto le condizioni iniziali. Nota 1: Il tempo di ritenzione del CMPA deve essere di 26 minuti ± 2 minuti. Esso può essere ottenuto variando le condizioni iniziali e finali del primo gradiente. Tuttavia la differenza nella % B per quanto riguarda le condizioni iniziali e finali del primo gradiente deve rimanere del 5 % B. Nota 2: Gli eluenti devono essere adeguatamente degassati e restare tali. Ciò è essenziale per il corretto funzionamento del sistema di pompaggio del gradiente. La deviazione standard per il tempo di ritenzione del picco CMPA deve essere inferiore a 0,1 minuto (n = 10). Nota 3: Ogni 5 campioni è necessario iniettare il campione di riferimento [5] da utilizzare per calcolare un nuovo coefficiente di risposta R (9.1.1). 8.4.4. I risultati dell'analisi cromatografica del campione da analizzare [E] sono ottenuti sotto forma di un cromatogramma in cui il picco CMPA è identificato dal suo tempo di ritenzione che è di circa 26 minuti. L'integratore (6.11.6) calcola automaticamente l'altezza di picco H del picco CMPA. In ogni cromatogramma si deve controllare la posizione della linea di base. Se la linea di base non è correttamente localizzata occorre ripetere l'analisi o l'integrazione. Nota: Se il picco CMPA è separato sufficientemente dagli altri picchi occorre usare il metodo dell'integrazione attraverso l'assegnazione della linea di base da valle a valle; altrimenti tracciare linee perpendicolari ad una linea di base comune, il cui punto di partenza deve essere vicino al picco CMPA (ma non a t = 0 min!). Usare lo stesso tipo di integratore per lo standard di riferimento e i campioni e, nel caso di una linea di base comune, verificarne la coerenza per i campioni e lo standard di riferimento. Prima di procedere all'interpretazione quantitativa è necessario esaminare l'aspetto di ciascun cromatogramma al fine di individuare anomalie dovute al cattivo funzionamento dell'apparecchio o della colonna, oppure all'origine e alla natura del campione analizzato. In caso di dubbio, ripetere l'analisi. 8.5. Taratura 8.5.1. Applicare esattamente ai campioni di riferimento (5.4.1-5.4.2) il modo di operare descritto dal punto 8.2 al punto 8.4.4. Utilizzare soluzioni preparate di recente, in quanto a temperatura ambiente il CMP si degrada in ambiente tricloroacetico all'8 %. A 4 °C la soluzione rimane stabile per 24 ore. Nel caso si debba procedere a lunghe serie di analisi è opportuno l'impiego, nell'iniettore automatico, di una vaschetta raffreddata per il campione. Nota: 8.4.2. può essere omesso se la % B alle condizioni iniziali è nota da analisi precedenti. Il cromatogramma del campione di riferimento [5] dovrebbe essere analogo alla figura 1. In questa figura il picco CMPA è preceduto da due piccoli picchi. È essenziale ottenere una separazione analoga. 8.5.2. Prima di procedere alla determinazione cromatografica dei campioni iniettare 100 μl del campione di riferimento senza lattosiero presamico [0] (5.4.1). Nel cromatogramma non si deve vedere un picco al tempo di ritenzione del picco CMPA. 8.5.3. Determinare i coefficienti di risposta R iniettando un volume di filtrato (8.5.1) pari a quello utilizzato per i campioni. 9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 9.1. Metodo di calcolo e formule 9.1.1. Calcolo del coefficiente di risposta R: Picco CMPA: R = W/H dove: R = coefficiente di risposta del picco CMPA H = altezza del picco CMPA W = quantità di lattosiero presente nel campione di riferimento [5] 9.2. Calcolo della percentuale di lattosiero presamico in polvere contenuto nel campione: W(E) = R × H(E) dove: W (E) = percentuale m/m di lattosiero presamico contenuto nel campione [E] R = coefficiente di risposta del picco CMPA (9.1.1) H(E) = altezza del picco CMPA del campione [E] Se W[E] è maggiore dell'1 % e la differenza fra il tempo di ritenzione e quello del campione di riferimento [5] è inferiore a 0,2 minuti, è presente lattosiero presamico in polvere. 9.3. Precisione del metodo 9.3.1. Ripetibilità La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o a breve distanza di tempo dallo stesso analista, impiegando la stessa apparecchiatura e sulla stessa aliquota di campione non deve superare lo 0,2 % m/m. 9.3.2. Riproducibilità Non determinata. 9.3.3. Linearità Dallo 0 al 16 % di lattosiero presamico si deve ottenere una relazione lineare con un coefficiente di correlazione > 0,99. 9.4. Interpretazione Il limite del 1 % tiene conto dell'incertezza dovuta alla riproducibilità. Figura 1 Ni—4.6 standard (*) Norma internazionale FIL 135B/1991. Latte e prodotti lattiero-caseari. Caratteristiche di precisione dei metodi di analisi. Descrizione di un metodo di studio in collaborazione.»;