6)

L’allegato VII è sostituito dal seguente: «ALLEGATO VII DETERMINAZIONE DELLA PERCENTUALE DI 2 GLICERIL MONOPALMITATO 1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE Il metodo descrive il procedimento analitico per la determinazione della percentuale di acido palmitico in posizione 2 nei trigliceridi mediante valutazione del 2-gliceril monopalmitato. Esso si applica agli oli vegetali liquidi a temperatura ambiente (20 °C). 2. PRINCIPIO Una volta preparato, il campione di olio è sottoposto all’azione della lipasi pancreatica: un’idrolisi parziale e specifica nelle posizioni 1 e 3 della molecola di trigliceride determina la comparsa dei monogliceridi in posizione 2. La percentuale di 2-gliceril monopalmitato nella frazione monogliceridica è determinata, previa sililazione, mediante gascromatografia in colonna capillare. 3. APPARECCHIATURA E MATERIALE 3.1. Beuta da 25 ml. 3.2. Beakers da 100, 250 e 300 ml. 3.3. Colonna di vetro per cromatografia, con diametro interno 21-23 mm e lunghezza 400 mm, provvista di disco di vetro sinterizzato e di rubinetto. 3.4. Provette tarate da 10, 50, 100 e 200 ml. 3.5. Matracci da 100 e 250 ml. 3.6. Evaporatore rotante. 3.7. Provette da centrifuga a fondo conico da 10 ml con tappo smerigliato. 3.8. Centrifuga per provette da 10 e 100 ml. 3.9. Termostato in grado di mantenere una temperatura di 40 °C + 0,5 °C. 3.10. Pipette tarate da 1 e 2 ml. 3.11. Siringa ipodermica da 1 ml. 3.12. Microsiringa da 100 μl. 3.13. Imbuto da 1 000 ml. 3.14. Gascromatografo idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di dispositivo di iniezione “on column” a freddo per l’introduzione diretta del campione nella colonna e di stufa in grado di mantenere la temperatura desiderata con l’approssimazione di 1 °C. 3.15. Iniettore a freddo “on column” per introduzione diretta in colonna. 3.16. Rivelatore a ionizzazione di fiamma ed elettrometro. 3.17. Registratore-integratore adatto all’elettrometro, con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile. 3.18. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 8-12 m, diametro interno 0,25-0,32 mm, ricoperta di metilpolisilossano o di fenilmetilpolisilossano al 5 %, di spessore compreso fra 0,10 e 0,30 μm, resistente a una temperatura di 370 °C. 3.19. Microsiringa da 10 μl con ago cementato lungo almeno 7,5 cm, per iniezione diretta in colonna. 4. REAGENTI 4.1. Gel di silice di granulometria compresa tra 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparato nel modo seguente: mettere il gel di silice in una capsula di porcellana, essiccare nella stufa a 160 °C per 4 ore, quindi lasciar raffreddare a temperatura ambiente in essiccatore. Aggiungere un volume d’acqua equivalente al 5 % del peso del gel di silice, procedendo come segue: in una beuta da 500 ml pesare 152 g di gel di silice e aggiungere 8 g di acqua distillata, tappare e agitare delicatamente per ottenere una ripartizione uniforme dell’acqua. Lasciare a riposo per almeno 12 ore prima dell’uso. 4.2. n-esano per cromatografia. 4.3. Isopropanolo. 4.4. Isopropanolo in soluzione acquosa 1:1 (v/v). 4.5. Lipasi pancreatica avente un’attività compresa tra 2,0 e 10 unità di lipasi per mg (esistono in commercio lipasi pancreatiche con attività compresa tra 2 e 10 unità per mg di enzima). 4.6. Soluzione tampone di tris-idrossimetilamminometano: soluzione acquosa 1 M portata a pH 8 (controllare con il potenziometro) mediante aggiunta di acido cloridrico concentrato (1:1 v/v). 4.7. Colato di sodio (qualità enzimatica), soluzione acquosa allo 0,1 % (la soluzione deve essere utilizzata entro i 15 giorni successivi alla preparazione). 4.8. Cloruro di calcio, soluzione acquosa al 22 %. 4.9. Etere etilico per cromatografia. 4.10. Solvente di sviluppo: miscela n-esano/etere etilico (87/13) (v/v). 4.11. Idrossido di sodio, soluzione al 12 % in peso. 4.12. Fenolftaleina, soluzione etanolica all’1 %. 4.13. Gas vettore: idrogeno o elio per gascromatografia. 4.14. Gas ausiliari: idrogeno (minimo 99 %), esente da umidità e sostanze organiche, e aria per gascromatografia della stessa purezza. 4.15. Reagente di silanizzazione: miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9/3/1 (v/v/v) (Esistono in commercio soluzioni pronte per l’uso. Possono essere utilizzati anche altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire con uno stesso volume di piridina anidra). 4.16. Campioni di riferimento: monogliceridi puri o miscele di monogliceridi a composizione percentuale nota, simile a quella del campione. 5. PROCEDIMENTO 5.1. Preparazione del campione 5.1.1. Gli oli la cui acidità libera è inferiore al 3 % non devono essere neutralizzati prima della cromatografia su colonna di gel di silice. Gli oli la cui acidità libera è superiore al 3 % devono essere sottoposti a neutralizzazione secondo il procedimento descritto al punto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Versare nell’imbuto da 1 000 ml (3.13) 50 g di olio e 200 ml di n-esano. Aggiungere 100 ml di isopropanolo e una quantità di soluzione di idrossido di sodio al 12 % (4.11) corrispondente all’acidità libera dell’olio maggiorata del 5 %. Agitare energicamente per un minuto. Aggiungere 100 ml di acqua distillata, agitare nuovamente e lasciare a riposo. A decantazione avvenuta, eliminare lo strato inferiore contenente i saponi. Eliminare eventuali strati intermedi (mucillagine e sostanze insolubili). Lavare la soluzione esanica dell’olio neutralizzato con porzioni consecutive di 50-60 ml della soluzione di isopropanolo/acqua 1:1 (v/v) (4.4), fino alla scomparsa della colorazione rosea dovuta alla fenolftaleina. Eliminare la maggior parte dell’esano mediante distillazione sotto vuoto (utilizzando per esempio l’evaporatore rotante) e travasare l’olio in un matraccio da 100 ml (3.5). Essiccare l’olio sotto vuoto fino ad eliminazione completa del solvente. Ultimata questa operazione, l’acidità dell’olio deve risultare inferiore allo 0,5 %. 5.1.2. Introdurre nella beuta da 25 ml (3.1) 1,0 g di olio preparato nel modo sopra indicato e scioglierlo in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Lasciare a riposo la soluzione per almeno 15 minuti prima di procedere alla cromatografia su colonna di gel di silice. Se la soluzione è torbida, centrifugarla per garantire condizioni ottimali per la cromatografia. (Si possono utilizzare cartucce di gel di silice SPE da 500 mg pronte per l’uso). 5.1.3. Preparazione della colonna cromatografica Versare nella colonna (3.3) circa 30 ml di solvente di sviluppo (4.10); introdurre un batuffolo di cotone nella parte inferiore della colonna con l’ausilio di una bacchetta di vetro; comprimere per far uscire l’aria. Preparare in un beaker una sospensione di 25 g di gel di silice (4.1) in circa 80 ml di solvente di sviluppo e versarla nella colonna attraverso un imbuto. Verificare che tutto il gel di silice sia stato immesso nella colonna; lavare con solvente di sviluppo (4.8), aprire il rubinetto e lasciar fluire il liquido fino a circa 2 mm sopra il livello superiore del gel di silice. 5.1.4. Cromatografia su colonna Nella beuta da 25 ml (3.1.) pesare esattamente 1,0 g di campione preparato secondo il procedimento descritto al punto 5.1. Sciogliere il campione in 10 ml di solvente di sviluppo (4.10). Versare la soluzione nella colonna cromatografica preparata nel modo indicato al punto 5.1.3. Evitare di agitare la superficie della colonna. Aprire il rubinetto e lasciar fluire la soluzione campione fino al livello del gel di silice. Sviluppare con 150 ml di solvente di sviluppo. Regolare il flusso a 2 ml/min (in modo che i 150 ml passino attraverso la colonna in 60-70 minuti circa). Recuperare l’eluato in un matraccio da 250 ml previamente tarato. Far evaporare il solvente sotto vuoto ed eliminarne le ultime tracce con una corrente di azoto. Pesare il matraccio e calcolare l’estratto raccolto. [Se si utilizzano cartucce di silice SPE pronte per l’uso, procedere come segue: introdurre 1 ml di soluzione (5.1.2) nelle cartucce previamente preparate con 3 ml di n-esano. Una volta percolata la soluzione, sviluppare con 4 ml di n-esano/etere etilico 9:1 (v/v). Recuperare l’eluato in una provetta da 10 ml e sottoporlo a evaporazione in corrente di azoto fino a essiccazione completa. Sottoporre il residuo secco all’azione della lipasi pancreatica (5.2). È essenziale che la composizione in acidi grassi sia verificata prima e dopo passaggio su cartuccia SPE]. 5.2. Idrolisi con lipasi pancreatica 5.2.1. Pesare nella provetta della centrifuga 0,1 g di olio preparato nel modo descritto al punto 5.1. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone (4.6), 0,5 ml della soluzione di colato di sodio (4.7) e 0,2 ml della soluzione di cloruro di calcio, agitando bene dopo ogni aggiunta. Chiudere la provetta con il tappo smerigliato e inserirla nel termostato a 40 + 0,5 °C. 5.2.2. Aggiungere 20 mg di lipasi, agitare accuratamente (evitando di bagnare il tappo), mettere la provetta nel termostato per esattamente 2 minuti, quindi ritirarla, agitare vigorosamente per esattamente 1 minuto e lasciar raffreddare. 5.2.3. Aggiungere 1 ml di etere etilico, tappare e agitare vigorosamente, quindi centrifugare e travasare la soluzione in una provetta pulita e asciutta con la microsiringa. 5.3. Preparazione dei derivati silanizzati e della gascromatografia 5.3.1. Introdurre con la microsiringa 100 μl di soluzione (5.2.3) in una provetta da 10 ml a fondo conico. 5.3.2. Eliminare il solvente con una leggera corrente di azoto, aggiungere 200 μl di reagente di silanizzazione (4.15), tappare la provetta e lasciare a riposo per 20 minuti. 5.3.3. Dopo 20 minuti, aggiungere da 1 a 5 ml di n-esano (in funzione delle condizioni cromatografiche): la soluzione così ottenuta è pronta per la gascromatografia. 5.4. Gascromatografia Le condizioni operative sono le seguenti: — temperatura dell’iniettore (iniettore “on column”) inferiore alla temperatura di ebollizione del solvente (68 °C), — temperatura del rivelatore: 350 °C, — temperatura della colonna: temperatura della stufa programmata a 60 °C per 1 minuto, quindi incrementata di 15 °C al minuto fino a 180 °C, poi di 5 °C al minuto fino a 340 °C e mantenuta a 340 °C per 13 minuti, — gas vettore: idrogeno o elio regolato alla velocità lineare adeguata per ottenere la risoluzione rappresentata nella figura 1; il tempo di ritenzione del trigliceride C54 deve essere di 40 + 5 minuti (cfr. figura 2). (Le condizioni operative sopra indicate sono proposte a titolo indicativo. L’operatore provvederà ad ottimizzarle per ottenere la risoluzione desiderata. Il picco corrispondente al 2-gliceril monopalmitato deve avere un’altezza minima pari al 10 % della scala del registratore.), — quantità di sostanza iniettata: 0,5-1 μl della soluzione (5 ml) di n-esano (5.3.3). 5.4.1. Identificazione dei picchi I singoli monogliceridi sono identificati in base ai tempi di ritenzione, in confronto a quelli ottenuti con miscele standard di monogliceridi analizzate nelle medesime condizioni. 5.4.2. Valutazione quantitativa L’area dei picchi è calcolata mediante un integratore elettronico. 6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI La percentuale di 2-gliceril monopalmitato è calcolata in base al rapporto tra l’area del picco corrispondente e la somma delle aree dei picchi di tutti i monogliceridi (cfr. figura 2), applicando la seguente formula: gliceril monopalmitato (%): in cui: Ax = area del picco corrispondente al gliceril monopalmitato ΣA = somma delle aree di tutti i picchi dei monogliceridi. Il risultato si esprime con una cifra decimale. 7. RAPPORTO DI ANALISI Il rapporto di analisi deve recare: — il riferimento al metodo descritto, — ogni indicazione utile per la completa identificazione del campione, — il risultato dell’analisi, — ogni deviazione dal metodo indicato, sia essa dovuta ad una decisione delle parti interessate o a qualsiasi altro motivo, — gli estremi per l’identificazione del laboratorio, la data dell’analisi e la firma dei responsabili. Figura 1 Cromatogramma dei prodotti della reazione di silanizzazione ottenuti dall’azione della lipasi su un olio d’oliva raffinato addizionato del 20 % di olio esterificato (100 %). Figura 2 Cromatogramma di: (A) olio d’oliva non esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. Cromatogramma di: (B) olio esterificato dopo lipasi; dopo silanizzazione; in queste condizioni (colonna capillare 8-12 m), la frazione cerosa viene eluita contemporaneamente alla frazione di digliceride o poco dopo. Dopo lipasi, il tenore di trigliceridi non dovrebbe superare il 15 %. 8. NOTE Nota 1: PREPARAZIONE DELLA LIPASI Esistono in commercio lipasi con attività soddisfacente. Si possono anche preparare in laboratorio con il seguente procedimento. Raffreddare 5 kg di pancreas suino fresco a 0 °C. Rimuovere il grasso solido e il tessuto connettivo circostanti e triturare in un mescolatore in modo da ottenere un fluido pastoso. Agitare questa pasta per 4-6 ore con 2,5 l di acetone anidro e centrifugare. Estrarre il residuo altre tre volte con lo stesso volume di acetone, poi due volte con una miscela 1:1 (v/v) di acetone e di etere etilico e due volte con etere etilico. Essiccare il residuo sotto vuoto per 48 ore in modo da ottenere una polvere stabile, da conservare in frigorifero al riparo dall’umidità. Nota 2: CONTROLLO DELL’ATTIVITÀ LIPASICA Preparare un’emulsione di olio d’oliva nel modo seguente: Agitare per 10 minuti in un mescolatore una miscela di 165 ml di soluzione di gomma arabica a 100g/l, 15 g di ghiaccio tritato e 20 ml di un olio d’oliva neutralizzato. In un beaker da 50 ml versare 10 ml di questa emulsione, quindi 0,3 ml di soluzione di colato di sodio a 0,2 g/ml e 20 ml di acqua distillata. Mettere il beaker in un termostato regolato a 37 °C; introdurre gli elettrodi del pHmetro e l’agitatore ad elica. Mediante una buretta aggiungere goccia a goccia una soluzione di idrossido di sodio 0,1 N fino ad ottenere un pH 8,3. Aggiungere un volume di soluzione acquosa di polvere di lipasi (0,1 g/ml di lipasi). Non appena il pHmetro indica un pH 8,3, avviare il cronometro e aggiungere goccia a goccia la soluzione di idrossido di sodio in modo da mantenere il pH a 8,3. Annotare il volume di soluzione consumato ogni minuto. Riportare i dati in un diagramma indicando le letture di tempo nelle ascisse e i millilitri di soluzione alcalina 0,1 N consumati per mantenere costante il pH nelle ordinate. Si deve ottenere un grafico lineare. L’attività della lipasi, misurata in unità di lipasi per mg, è data dalla formula seguente: in cui: A è l’attività in unità di lipasi/mg V è il numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N/min, desunto dal diagramma N è la normalità della soluzione di idrossido di sodio m è la massa in mg della lipasi utilizzata per la prova. L’unità di lipasi è definita come la quantità di enzima che libera 10 microequivalenti di acido al minuto.»