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Sono aggiunti i seguenti capitoli da C.31 a C.46: « C.31. PROVA SULLE PIANTE TERRESTRI: EMERGENZA DELLE PLANTULE E CRESCITA DELLE PLANTULE INTRODUZIONE 1. Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 208 (2006). I metodi di prova sono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici e dell'applicabilità a fini regolamentari. Il presente metodo di prova aggiornato è inteso a valutare i potenziali effetti delle sostanze chimiche sull'emergenza e la crescita delle plantule. Esso non copre gli effetti cronici o gli effetti sulla riproduzione (ossia granitura, formazione dei fiori, maturazione dei frutti). È necessario tenere conto delle condizioni di esposizione e delle proprietà delle sostanze chimiche da esaminare per garantire l'utilizzo di metodi di prova appropriati (ad esempio, nelle prove su metalli o composti di metalli è necessario considerare gli effetti del pH e dei controioni associati) (1). Il presente metodo di prova non riguarda le piante esposte ai vapori delle sostanze chimiche. Esso si applica alle prove su sostanze chimiche generali, biocidi e fitofarmaci (denominati anche prodotti fitosanitari o pesticidi). È stato elaborato sulla base di metodi esistenti (2) (3) (4) (5) (6) (7). Sono stati presi in considerazione anche altri riferimenti bibliografici correlati alle prove sulle piante (8) (9) (10). L'appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo. PRINCIPIO DELLA PROVA 2. La prova valuta gli effetti dell'esposizione alla sostanza chimica in esame contenuta nel terreno (o in un'altra matrice del suolo appropriata) sull'emergenza delle plantule e sulle fasi iniziali di crescita delle piante superiori. I semi sono messi a contatto con il terreno trattato con la sostanza chimica in esame, i cui effetti sono valutati generalmente 14-21 giorni dopo l'emergenza del 50 % delle plantule nel gruppo di controllo. Gli endpoint misurati sono la valutazione visiva dell'emergenza delle plantule, il peso dei germogli secchi (in alternativa, il peso dei germogli freschi) e in alcuni casi l'altezza dei germogli, nonché la valutazione degli effetti nocivi visibili su diverse parti della pianta. Tali misurazioni e osservazioni sono confrontate con quelle effettuate su piante di controllo non trattate. 3. A seconda della via di esposizione prevista, la sostanza chimica in esame è incorporata nel terreno (o eventualmente in una matrice del suolo artificiale) o applicata sulla superficie dello stesso, condizione rappresentativa della potenziale via di esposizione alla sostanza chimica. L'incorporazione avviene mediante il trattamento del terreno in massa. In seguito all'applicazione, il terreno è trasferito in vasi e quindi i semi della specie vegetale prescelta vengono piantati nel terreno. Nel caso dell'applicazione superficiale, la sostanza è applicata al terreno in vaso in cui siano già stati piantati i semi. Le unità di prova (i controlli e il terreno trattato più i semi) sono quindi collocate in un luogo in cui possano godere di condizioni appropriate in grado di favorire la germinazione e/o la crescita delle piante. 4. Secondo l'obiettivo dello studio, la prova può essere eseguita al fine di determinare la curva dose-risposta oppure per saggiare una singola concentrazione/un singolo tasso, nel qual caso costituisce una prova limite. Se i risultati della prova a una singola concentrazione/un singolo tasso superano un determinato livello di tossicità (ad esempio, se si osservano effetti superiori all'x %), si procede all'esecuzione di una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni per determinare il limite superiore e quello inferiore per la tossicità, seguita da una prova a più concentrazioni/tassi per generare una curva dose-risposta. Si ricorre a un'analisi statistica appropriata per ottenere una concentrazione efficace ECx o un tasso di applicazione efficace ERx (ad esempio, EC25, ER25, EC50, ER50) per il parametro o i parametri pertinenti più sensibili. Questa prova consente di ottenere anche i valori per la concentrazione senza effetti osservabili (NOEC, No Observed Effect Concentration) e la concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo (LOEC, Lowest Observed Effect Concentration). INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME 5. Le seguenti informazioni sono utili per identificare la via di esposizione prevista alla sostanza chimica e progettare la prova: formula strutturale, purezza, idrosolubilità, solubilità nei solventi organici, coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua, comportamento di assorbimento del suolo, tensione di vapore, stabilità chimica in acqua e alla luce e biodegradabilità. VALIDITÀ DELLA PROVA 6. Affinché la prova possa essere ritenuta valida, i controlli devono soddisfare i seguenti criteri: — l'emergenza delle plantule è pari ad almeno il 70 %; — sulle plantule non sono visibili effetti fitotossici (ad esempio clorosi, necrosi, appassimento, deformazioni di foglie e stelo) e si osservano solo variazioni normali della crescita e della morfologia per la specie esaminata; — il tasso medio di sopravvivenza delle plantule di controllo emerse è di almeno il 90 % per la durata dello studio; — le condizioni ambientali per una particolare specie sono identiche e i mezzi colturali contengono la stessa quantità di matrice del suolo, mezzo di supporto o substrato proveniente dalla stessa fonte. SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO 7. È possibile sottoporre a prova una sostanza chimica di riferimento a intervalli regolari per verificare che l'esecuzione della prova, la risposta delle piante scelte per la prova e le condizioni sperimentali non cambino in modo significativo nel tempo. In alternativa, è possibile utilizzare misurazioni storiche della biomassa o della crescita dei controlli per esaminare le prestazioni del sistema di prova in laboratori particolari; tali misurazioni possono essere utilizzate anche per il controllo della qualità intralaboratorio. DESCRIZIONE DEL METODO Terreno naturale — substrato artificiale 8. Le piante possono essere coltivate in vasi contenenti terreno sabbioso limoso, sabbia limacciosa o limo argilloso e sabbioso con tenore in carbonio organico dell'1,5 % (circa il 3 % di materia organica). Si può utilizzare anche del terriccio da rinvaso commerciale o una miscela di terreno sintetico contenente fino all'1,5 % di carbonio organico. Non bisogna utilizzare terreni argillosi se la sostanza chimica in esame ha notoriamente un'affinità elevata per le argille. Il terreno di campo deve essere setacciato per omogeneizzare la dimensione delle particelle in modo che non superino i 2 mm, rimuovendo le particelle più grosse. Si devono indicare il tipo e la struttura, la percentuale di carbonio organico, il pH e il tenore di sale calcolato in base alla conduttività elettronica del terreno preparato finale. Il terreno deve essere classificato in base a un sistema di classificazione standard (11). Al fine di ridurre gli effetti dei patogeni del terreno, quest'ultimo può essere pastorizzato o sottoposto a trattamento termico. 9. L'impiego di terreno naturale può rendere più complessa l'interpretazione dei risultati e aumentare la variabilità a causa delle differenze nelle caratteristiche chimico-fisiche e nelle popolazioni microbiche. Queste variabili a loro volta modificano la capacità di ritenzione dell'umidità, la capacità di legame chimico, l'aerazione e il tenore in nutrienti e oligoelementi. Alle variazioni che riguardano questi fattori fisici si aggiungono variazioni relative alle caratteristiche chimiche, come il pH e il potenziale di ossido-riduzione, che possono influire sulla biodisponibilità della sostanza chimica in esame (12) (13) (14). 10. Di solito i substrati artificiali non sono utilizzati per sottoporre a prova i fitofarmaci, ma possono essere utili per sottoporre a prova le sostanze chimiche generali o se si desidera ridurre al minimo la variabilità dei terreni naturali e aumentare la comparabilità dei risultati delle prove. I substrati utilizzati devono essere costituiti da materiali inerti che presentino interazioni minime con la sostanza chimica in esame, il vettore solvente o entrambi. La sabbia di quarzo lavata in acido, la lana minerale e le perle di vetro (per esempio con un diametro compreso tra 0,35 e 0,85 mm) si sono rivelate materiali inerti idonei, che assorbono la sostanza chimica in esame in misura minima (15), garantendo così la sua massima disponibilità per le plantule mediante assorbimento dalle radici. Tra i substrati non idonei figurano la vermiculite, la perlite o altri materiali altamente assorbenti. È necessario assicurare l'apporto di nutrienti che favoriscano la crescita delle piante per evitare che queste soffrano di carenze nutritive, le quali, ove possibile, devono essere accertate mediante un'analisi chimica o una valutazione visiva delle piante di controllo. Criteri di selezione delle specie sperimentali 11. La gamma delle specie selezionate deve essere ragionevolmente ampia, ad esempio in termini di diversità tassonomica nel regno vegetale, distribuzione, abbondanza, caratteristiche del ciclo di vita specifiche della specie e regioni di presenza naturale, per permettere lo sviluppo di una serie di risposte (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Nella selezione delle specie sperimentali bisogna tenere conto delle seguenti caratteristiche: — i semi della specie sono uniformi e facilmente reperibili presso una o più fonti standard affidabili e producono una germinazione regolare, affidabile e uniforme, nonché una crescita uniforme delle plantule; — la pianta può essere sottoposta a prova in laboratorio e può dare risultati affidabili e riproducibili nello stesso laboratorio e tra laboratori diversi; — la sensibilità della specie sottoposta a prova deve essere coerente con le risposte delle piante che si trovano nell'ambiente esposto alla sostanza chimica; — la specie è stata già utilizzata in qualche misura in precedenti prove di tossicità e il suo utilizzo, ad esempio nei saggi biologici sugli erbicidi, nello screening per la rilevazione di metalli pesanti, nelle prove di stress salino o minerale o negli studi sull'allelopatia, indica una sensibilità a una vasta gamma di fattori di stress; — la specie è compatibile con le condizioni colturali del metodo di prova; — la specie soddisfa i criteri di validità della prova. Nell'appendice 2 sono elencate alcune delle specie storicamente più utilizzate nelle prove, mentre nell'appendice 3 sono elencate potenziali specie non coltivate. 12. Il numero di specie da sottoporre a prova dipende dalle pertinenti disposizioni regolamentari e pertanto non è specificato nel presente metodo di prova. Applicazione della sostanza chimica in esame 13. La sostanza chimica deve essere applicata utilizzando un vettore appropriato (ad esempio, acqua, acetone, etanolo, polietilenglicole, gomma arabica, sabbia). È possibile sottoporre a prova anche le miscele (prodotti formulati o formulazioni) contenenti principi attivi e diversi adiuvanti. Incorporazione nel terreno o nel substrato artificiale 14. È possibile aggiungere all'acqua le sostanze chimiche idrosolubili o in sospensione in acqua e quindi mescolare la soluzione con del terreno con l'ausilio di un adeguato miscelatore. Questo tipo di prova può essere appropriato se l'esposizione alla sostanza chimica avviene attraverso il terreno o l'acqua interstiziale o se sussiste il rischio di assorbimento dalle radici. La quantità di sostanza in esame aggiunta non deve superare la capacità di ritenzione idrica del terreno. Il volume di acqua aggiunto deve essere identico per ogni concentrazione di prova, ma è opportuno limitarlo per impedire la formazione di agglomerati di terreno. 15. Le sostanze chimiche che presentano una bassa idrosolubilità devono essere disciolte in un solvente volatile adeguato (ad esempio acetone, etanolo) e mescolate alla sabbia. Il solvente può quindi essere rimosso dalla sabbia utilizzando un flusso d'aria mentre si mescola continuamente la sabbia. La sabbia trattata è mescolata al terreno sperimentale. Viene preparato un secondo controllo costituito unicamente da sabbia e solvente. Ai trattamenti a tutti i livelli e al secondo controllo vengono aggiunti quantitativi identici di sabbia in cui il solvente sia stato mescolato e quindi rimosso. Nel caso in cui le sostanze chimiche in esame siano solide e insolubili, occorre mescolare il terreno asciutto e la sostanza in un miscelatore idoneo. Dopo avere aggiunto il terreno ai vasi si procede immediatamente con la semina. 16. Quando si utilizza un substrato artificiale al posto del terreno, le sostanze chimiche idrosolubili possono essere disciolte nella soluzione nutritiva appena prima dell'inizio della prova. Le sostanze chimiche che non sono idrosolubili, ma che possono essere messe in sospensione nell'acqua mediante un vettore solvente, devono essere aggiunte con quest'ultimo alla soluzione nutritiva. Le sostanze chimiche non idrosolubili per le quali non è disponibile un vettore solubile in acqua non tossico devono essere disciolte in un solvente volatile appropriato. La soluzione, mescolata alla sabbia o alle perle di vetro, è collocata in un'apparecchiatura rotante sotto vuoto, dove viene fatta evaporare, lasciando uno strato uniforme di sostanza chimica sulla sabbia o sulle perle. È necessario estrarre una quantità pesata di perle con lo stesso solvente organico e dosare la sostanza chimica prima di riempire i vasi. Applicazione superficiale 17. Nel caso dei fitofarmaci, la sostanza chimica in esame spesso viene applicata mediante dispersione della soluzione di prova nebulizzata sulla superficie del terreno. Il modello e la capacità di tutte le apparecchiature utilizzate per eseguire le prove, comprese le apparecchiature con cui viene preparata e applicata la sostanza chimica in esame, devono essere tali da consentire un'esecuzione precisa delle prove, con una copertura riproducibile. La copertura deve essere uniforme sulle superfici del terreno. Bisogna prestare attenzione per evitare l'eventuale interazione, mediante assorbimento o reazione, delle sostanze chimiche con l'apparecchiatura (ad esempio, tubi di plastica e sostanze chimiche lipofile o elementi e parti in acciaio). La polverizzazione della sostanza chimica in esame sulla superficie del terreno è effettuata simulando le tipiche applicazioni con nebulizzatore. In generale, i volumi polverizzati devono corrispondere a quelli utilizzati nella normale pratica agricola e devono essere indicati (quantità d'acqua, ecc.). È necessario selezionare un tipo di ugello che consenta una copertura uniforme della superficie del terreno. Se si applicano solventi e vettori, bisogna stabilire un secondo gruppo di piante di controllo che riceva unicamente il solvente o il vettore. Tale procedura non è necessaria per i fitofarmaci che vengono testati come formulazioni. Verifica della concentrazione o del tasso della sostanza chimica in esame 18. Le concentrazioni o i tassi di applicazione devono essere confermati da un'adeguata verifica analitica. Per le sostanze chimiche solubili, la verifica di tutte le concentrazioni o di tutti i tassi può essere confermata mediante l'analisi della concentrazione più elevata della soluzione di prova, associata alla documentazione sulle diluizioni successive e all'utilizzo di apparecchiature per l'applicazione tarate (ad esempio, vetreria per analisi tarata, taratura del nebulizzatore). Nel caso delle sostanze chimiche insolubili, la verifica dei materiali compositi deve basarsi sul peso della sostanza chimica in esame aggiunta al terreno. Se è richiesta la dimostrazione dell'omogeneità, può rendersi necessaria l'analisi del terreno. PROCEDURA Disegno sperimentale 19. Semi della stessa specie sono piantati nei vasi. Il numero di semi piantati per ogni vaso dipende dalla specie, dalle dimensioni del vaso e dalla durata della prova. Il numero di piante per vaso deve essere tale da garantire condizioni colturali adeguate ed evitare l'affollamento per l'intera durata della prova. La densità massima deve essere di circa 3-10 semi per 100 cm2, a seconda della dimensione dei semi. Si consiglia ad esempio, per un recipiente di 15 cm, una densità di 1-2 piante di mais, soia, pomodoro, cetriolo o barbabietola da zucchero, di tre piante di colza o piselli e di 5-10 piante di cipolla, grano o altri semi di piccole dimensioni. Il numero di semi e di vasi di replica (una replica corrisponde a un vaso e pertanto le piante nello stesso vaso non costituiscono una replica) deve essere adeguato alle condizioni richieste da un'analisi statistica ottimale (21). Va osservato che la variabilità è maggiore per le specie sperimentali per le quali si utilizza un numero inferiore di semi grandi per ciascun vaso (replica) rispetto alle specie sperimentali per le quali è possibile utilizzare un numero più alto di semi piccoli per ciascun vaso. Piantando il medesimo numero di semi in ogni vaso si può ridurre al minimo la variabilità. 20. I gruppi di controllo sono utilizzati per garantire che gli effetti osservati siano associati o attribuiti unicamente all'esposizione alla sostanza chimica in esame. Il gruppo di controllo appropriato deve essere identico sotto tutti gli aspetti al gruppo sottoposto a prova, eccetto per l'esposizione alla sostanza chimica in esame. Nell'ambito di una data prova, tutte le piante sottoposte a prova, compresi i controlli, devono provenire dalla stessa fonte. Per prevenire le distorsioni, è indispensabile un'assegnazione casuale dei vasi di prova e di controllo. 21. Va evitato l'uso di semi conciati con insetticidi o fungicidi (semi trattati). Tuttavia, l'uso di taluni fungicidi da contatto non sistemici (ad esempio il captano o il tiram) è consentito da alcune autorità di regolamentazione (22). L'eventuale problema dei patogeni portati da seme può essere risolto immergendo brevemente i semi in una soluzione debole di ipoclorito al 5 % e quindi sciacquandoli accuratamente con acqua corrente e asciugandoli. Non sono consentiti altri trattamenti curativi a base di fitofarmaci. Condizioni sperimentali 22. Le condizioni sperimentali devono essere molto simili alle condizioni necessarie alla crescita normale delle specie e delle varietà testate (cfr. appendice 4 per esempi delle condizioni sperimentali). Le piante emergenti devono essere curate facendo ricorso a buone pratiche colturali in locali ad ambiente controllato, fitotroni o serre. Quando si utilizzano strutture per la coltivazione, queste pratiche generalmente comprendono il controllo e una registrazione sufficientemente frequente (ad esempio giornaliera) della temperatura, dell'umidità, della concentrazione di biossido di carbonio, della luce (intensità, lunghezza d'onda, irraggiamento fotosinteticamente attivo) e del fotoperiodo, dei mezzi di irrigazione, ecc. al fine di assicurare una crescita soddisfacente della pianta quale stabilita sulla base dell'osservazione delle piante di controllo della specie selezionata. La temperatura delle serre va regolata attraverso sistemi di ventilazione, riscaldamento e/o raffreddamento. Le seguenti condizioni sono generalmente raccomandate per le prove in serra: — temperatura: 22 °C ± 10 °C; — umidità: 70 % ± 25 %; — fotoperiodo: minimo 16 ore di luce; — intensità luminosa: 350 ± 50 μE/m2/s. Potrebbe essere necessaria un'illuminazione aggiuntiva se l'intensità diminuisce al di sotto di 200 μE/m2/s, lunghezza d'onda 400-700 nm, ad eccezione di alcune specie con un fabbisogno di luce inferiore. Le condizioni ambientali devono essere monitorate e riferite durante lo studio. Le piante devono essere coltivate in vasi vetrinati o di plastica non porosi poggiati su sottovasi. È possibile riposizionare periodicamente i vasi per ridurre al minimo la variabilità in termini di crescita delle piante (dovuta al variare delle condizioni sperimentali all'interno delle strutture per la coltivazione). I vasi devono essere sufficientemente grandi da consentire una crescita normale. 23. È possibile integrare nutrienti del terreno in base alle necessità per mantenere il vigore delle piante. È possibile stabilire la necessità di ulteriori nutrienti e il calendario per la loro aggiunta osservando le piante di controllo. Si consiglia di irrigare le piante dal fondo dei contenitori (ad esempio utilizzando stoppini in fibra di vetro). Tuttavia un'irrigazione iniziale effettuata dall'alto può stimolare la germinazione dei semi e, in caso di applicazione sulla superficie del terreno, facilitare la penetrazione della sostanza chimica nello stesso. 24. Le condizioni di coltura specifiche devono essere appropriate per la specie sottoposta a prova e la sostanza chimica in esame. È necessario mantenere le stesse condizioni ambientali per le piante utilizzate come controlli e quelle trattate, prendendo tuttavia misure adeguate per evitare l'esposizione incrociata (ad esempio a sostanze chimiche volatili) tra trattamenti differenti e l'esposizione dei controlli alla sostanza chimica in esame. Esecuzione della prova a una singola concentrazione o a un singolo tasso 25. Ai fini della determinazione della concentrazione o del tasso appropriato di una sostanza chimica per l'esecuzione di una prova a una singola concentrazione o a un singolo tasso (stimolazione/limite) vanno presi in considerazione diversi fattori. Per le sostanze chimiche generali, tra questi fattori figurano le proprietà chimico-fisiche. Per i fitofarmaci bisogna tenere conto delle proprietà chimico-fisiche e del modello d'uso della sostanza chimica in esame, della sua concentrazione massima o del suo tasso di applicazione massimo, del numero di applicazioni per ogni stagione e/o della persistenza della sostanza. Per stabilire se una sostanza chimica generale possiede proprietà fitotossiche, può essere opportuno eseguire la prova a un livello massimo di 1 000 mg/kg di terreno asciutto. Prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni 26. Se necessario, è possibile eseguire una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni per ottenere indicazioni sulle concentrazioni o sui tassi da testare nello studio dose-risposta definitivo. In una prova di questo tipo le concentrazioni o i tassi da testare devono essere ampiamente distanziati (ad esempio: 0,1 - 1,0 - 10 - 100 e 1 000 mg/kg di terreno asciutto). Per i fitofarmaci, si possono calcolare le concentrazioni o i tassi a partire dalla concentrazione o dal tasso di applicazione massimo o raccomandato, ad esempio 1/100, 1/10, 1/1 rispetto alla concentrazione o al tasso di applicazione massimo o raccomandato. Esecuzione della prova a più concentrazioni o tassi 27. Lo scopo di una prova a più concentrazioni o tassi è stabilire una relazione dose-risposta e determinare un valore ECx o ERx per l'emergenza, la biomassa e/o gli effetti visibili rispetto ai controlli non esposti, come richiesto dalle autorità di regolamentazione. 28. Il numero di concentrazioni o di tassi e gli intervalli tra di essi devono essere sufficienti a produrre una relazione dose-risposta e un'equazione di regressione affidabili e a ottenere una stima dei valori ECx. o ERx.. Le concentrazioni o i tassi selezionati devono includere i valori ECx o ERx da determinare. Ad esempio, per ottenere un valore EC50 è preferibile eseguire la prova a tassi in grado di produrre un effetto compreso tra il 20 e l'80 %. Il numero raccomandato di concentrazioni o tassi di prova per conseguire questo risultato è pari almeno a 5 in una serie geometrica, più un controllo non trattato, con un fattore di spaziatura non superiore a 3. Per ogni gruppo di trattamento e di controllo, il numero di repliche deve essere pari almeno a 4 e il numero totale di semi almeno a 20. Al fine di aumentare la significatività statistica della prova, per alcune piante che presentano un tasso di germinazione basso o una crescita variabile possono essere necessarie più repliche. Se si utilizza un numero elevato di concentrazioni o tassi di prova, il numero di repliche può essere ridotto. Per stimare la NOEC, potrebbero essere necessarie più repliche al fine di ottenere la significatività statistica desiderata (23). Osservazioni 29. Durante il periodo di osservazione, ossia da 14 a 21 giorni dopo l'emergenza del 50 % delle piante di controllo (e, se del caso, dei controlli con solvente), le piante vengono osservate spesso (almeno una volta la settimana e, se possibile, una volta al giorno) per valutare l'emergenza, la fitotossicità visibile e la mortalità. Alla fine della prova è necessario registrare la misurazione della percentuale di emergenza e della biomassa delle piante sopravvissute, nonché gli effetti nocivi visibili sulle diverse parti della pianta, tra i quali figurano anomalie nell'aspetto delle plantule emerse, crescita ritardata, clorosi, scolorimento, mortalità ed effetti sullo sviluppo. La biomassa finale può essere misurata a partire dal peso medio finale dei germogli secchi delle piante sopravvissute, dopo aver raccolto i germogli sulla superficie del terreno e averli fatti essiccare fino a peso costante a 60 °C. In alternativa, è possibile misurare la biomassa finale a partire dal peso dei germogli freschi. Se richiesto dalle autorità di regolamentazione, l'altezza del germoglio può essere un ulteriore endpoint da misurare. È opportuno utilizzare un sistema di punteggio uniforme per le lesioni visibili per valutare le risposte tossiche osservabili. Esempi per l'esecuzione di valutazioni visive qualitative e quantitative sono forniti nei riferimenti (23) (24). DATI E RELAZIONE Analisi statistica Prova a una singola concentrazione o a un singolo tasso 30. I dati per ogni specie vegetale vanno analizzati utilizzando un metodo statistico appropriato (21). Si deve indicare il livello dell'effetto alla concentrazione o al tasso di prova oppure il mancato ottenimento di un dato effetto alla concentrazione o al tasso di prova (ad esempio, < x % dell'effetto con la concentrazione o il tasso y). Prova a più concentrazioni o tassi 31. Viene stabilita una relazione dose-risposta come equazione di regressione. Si può ricorrere a modelli diversi: ad esempio, per ottenere una stima di ECx o ERx (ad esempio EC25, ER25, EC50, ER50) e dei rispettivi limiti di confidenza per l'emergenza sotto forma di dati quantali, può essere appropriato utilizzare i metodi logit, probit, Weibull, Spearman-Karber, Spearman-Karber semplificato e così via. Per valutare la crescita delle plantule (peso e altezza) come endpoint continui, i valori ECx o ERx e i rispettivi limiti di confidenza possono essere stimati ricorrendo a un'analisi di regressione appropriata (ad esempio, l'analisi di regressione non lineare Bruce-Versteeg (25)). Ove possibile, il valore di R2 deve essere pari o superiore a 0,7 per le specie più sensibili e le concentrazioni o i tassi di prova utilizzati devono comprendere gli effetti dal 20 all'80 %. Qualora sia necessario stimare la NOEC, è preferibile ricorrere a prove statistiche potenti, da scegliere in base alla distribuzione dei dati (21) (26). Relazione sulla prova 32. La relazione sulla prova deve riportare i risultati degli studi e contenere una descrizione dettagliata delle condizioni sperimentali, un'approfondita disamina dei risultati, l'analisi dei dati e le conclusioni tratte dall'analisi. È necessario fornire una tabella di riepilogo e una sintesi dei risultati. La relazione deve includere le seguenti informazioni: Sostanza chimica in esame: — dati di identificazione della sostanza chimica, proprietà pertinenti della sostanza chimica in esame (ad esempio, log Pow, idrosolubilità, tensione di vapore e informazioni sul destino e sul comportamento nell'ambiente, se disponibili); — dettagli sulla preparazione della soluzione di prova e verifica delle concentrazioni di prova, secondo quanto specificato al paragrafo 18. Specie sperimentale: — dettagli sull'organismo sottoposto alla prova: specie/varietà, famiglia di piante, nome scientifico e nome comune, fonte e storia del seme con il maggior numero possibile di dettagli (ossia, nome del fornitore, percentuale di germinazione, classe di dimensione del seme, numero di lotto o partita, anno del seme o stagione di coltivazione, data di valutazione della germinazione), sopravvivenza, ecc.; — numero di specie monocotiledoni e dicotiledoni sottoposte a prova; — giustificazione della scelta delle specie; — descrizione della conservazione, del trattamento e del mantenimento dei semi. Condizioni sperimentali: — infrastrutture di prova (ad esempio laboratorio fitologico, fitotrone e serra); — descrizione del sistema di prova (ad esempio dimensioni dei vasi, materiale dei vasi e quantità di terreno); — caratteristiche del terreno (struttura o tipo di terreno: distribuzione e classificazione delle particelle di terreno, proprietà chimico-fisiche tra cui la percentuale di materia organica, la percentuale di carbonio organico e il pH); — preparazione del terreno o del substrato (ad esempio terreno, terreno artificiale, sabbia, altro) prima della prova; — descrizione del mezzo nutritivo, se utilizzato; — applicazione della sostanza chimica in esame: descrizione del metodo di applicazione, descrizione dell'apparecchiatura, tassi di esposizione e volumi, comprese la verifica chimica, la descrizione del metodo di calibrazione e la descrizione delle condizioni ambientali durante l'applicazione; — condizioni colturali: intensità luminosa (ad esempio l'irraggiamento fotosinteticamente attivo), fotoperiodo, temperature minime/massime, metodo e programma di irrigazione, fertilizzazione; — numero di semi per vaso, numero di piante per dose, numero di repliche (vasi) per tasso di esposizione; — tipo e numero di controlli (controlli negativi e/o positivi, controllo con solvente se utilizzato); — durata della prova. Risultati: — tabella di tutti gli endpoint per ciascuna replica, concentrazione/tasso di prova e specie; — numero e percentuale di emergenza rispetto ai controlli; — misurazioni della biomassa (peso secco o peso fresco dei germogli) delle piante come percentuale dei controlli; — altezza dei germogli delle piante come percentuale dei controlli, se misurata; — lesioni visibili in percentuale e descrizione qualitativa e quantitativa di tali lesioni (clorosi, necrosi, appassimento, deformazione di foglie e stelo, nonché assenza di qualsiasi effetto) causate dalla sostanza chimica in esame rispetto alle piante di controllo; — descrizione della scala di valutazione utilizzata per stimare le lesioni visibili, nel caso in cui venga fornita una valutazione visiva; — per gli studi a tasso singolo, è necessario indicare la percentuale di lesioni; — i valori ECx o ERx (ad esempio EC50, ER50, EC25, ER25) e i rispettivi limiti di confidenza. Se si effettua l'analisi di regressione, fornire l'errore standard per l'equazione di regressione e l'errore standard per la stima dei singoli parametri (ad esempio coefficiente angolare, intercetta); — valori di NOEC (e LOEC), se calcolati; — descrizione delle procedure statistiche e delle ipotesi utilizzate; — rappresentazione grafica di tali dati e della relazione dose-risposta delle specie sottoposte a prova. Varianti delle procedure descritte nel presente metodo di prova ed eventuali eventi anomali verificatisi durante la prova. BIBLIOGRAFIA (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Qualità del suolo — Determinazione dell'effetto di inquinanti sulla flora del suolo — Parte 1: Metodo per la misurazione dell'inibizione della crescita delle radici. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Qualità del suolo — Determinazione dell'effetto di inquinanti sulla flora del suolo — Parte 2: Effetti di suoli contaminati sulla emersione e crescita iniziale di vegetali superiori. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Détermination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol. 9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. 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Appendice 1 Definizioni Principio attivo (o sostanza attiva) : materiale destinato a provocare uno specifico effetto biologico (ad esempio lotta contro gli insetti, contro le malattie delle piante e contro le erbe infestanti nella superficie interessata dal trattamento), denominato anche principio attivo (o sostanza attiva) di grado tecnico. Sostanza chimica : sostanza o miscela. Fitofarmaci, prodotti fitosanitari o pesticidi : materiali con una specifica attività biologica utilizzati intenzionalmente per proteggere le colture dai parassiti (quali ad esempio micosi, insetti e piante concorrenti). ECx (concentrazione efficace all'x %) o ERx (tasso efficace all'x %) : la concentrazione o il tasso che provoca un cambiamento o un'alterazione indesiderata pari all'x % nell'endpoint in esame rispetto al controllo (ad esempio, una riduzione del 25 % o del 50 % dell'emergenza delle plantule, dell'altezza dei germogli e del numero finale di piante presenti o un aumento del 25 % o del 50 % delle lesioni visibili corrispondono rispettivamente ai valori EC25/ER25 o EC50/ER50). Emergenza : comparsa del coleottile o del cotiledone sulla superficie del terreno. Formulazione : prodotto formulato commerciale contenente la sostanza attiva (principio attivo), chiamato anche preparato finale (8) o prodotto finale tipico. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration — concentrazione minima a cui si osserva un effetto statisticamente significativo) : la concentrazione più bassa della sostanza chimica in esame che produce un effetto. In questa prova, la concentrazione corrispondente alla LOEC ha un effetto statisticamente significativo (p < 0,05) in un dato periodo di esposizione rispetto al controllo ed è più alta del valore della NOEC. Piante non bersaglio : piante esterne all'area che comprende le piante bersaglio. Per i fitofarmaci, tale termine si riferisce generalmente alle piante non comprese nella superficie interessata dal trattamento. NOEC (No Observed Effect Concentration — concentrazione senza effetti osservabili) : concentrazione più alta della sostanza chimica in esame alla quale non si osserva alcun effetto. In questa prova, la concentrazione corrispondente alla NOEC non ha alcun effetto statisticamente significativo (p < 0,05) in un dato periodo di esposizione rispetto al controllo. Fitotossicità : variazioni dannose (secondo le misurazioni e le valutazioni visive) rispetto al normale aspetto e al normale modello di crescita delle piante in risposta all'esposizione a una determinata sostanza chimica. Replica : unità sperimentale che rappresenta il gruppo di controllo e/o il gruppo di trattamento. In questi studi una replica corrisponde a un vaso. Valutazione visiva : accertamento del danno visibile sulla base dell'osservazione dello stato della pianta, del suo vigore, della presenza di malformazioni, clorosi e necrosi e dell'aspetto complessivo rispetto al controllo. Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela testata applicando il presente metodo di prova. Appendice 2 Elenco di specie storicamente utilizzate nelle prove sulle piante Famiglia Specie Nomi comuni DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Carota Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Girasole Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Lattuga Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Senape bianca Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Cavolo cinese Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Colza Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Cavolo cappuccio Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Rapa Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Crescione inglese Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Ravanello Chenopodiaceae Beta vulgaris Barbabietola da zucchero Cucurbitaceae Cucumis sativus Cetriolo Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soia Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Fagiolo mungo Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Fagiolo Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Pisello Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Fieno greco Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Ginestrino Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Trifoglio rosso Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Veccia Linaceae Linum usitatissimum Lino Polygonaceae Fagopyrum esculentum Grano saraceno Solanaceae Solanum lycopersicon Pomodoro MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Cipolla Poaceae (Gramineae) Avena sativa Avena Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Orzo Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Loglio perenne Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Riso Poaceae (Gramineae) Secale cereale Segale Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorgo da granella, sorgo gentile Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Grano Poaceae (Gramineae) Zea mays Mais Appendice 3 Elenco di potenziali specie non coltivate Potenziali specie secondo l'OCSE per le prove di tossicità sulle piante. Nota: la seguente tabella fornisce informazioni su 52 specie non coltivate (i riferimenti sono riportati tra parentesi per ogni voce). I tassi di emergenza indicati provengono dalla letteratura pubblicata e sono forniti solo come indicazione generale. L'esperienza individuale può variare in base alla fonte dei semi e ad altri fattori. FAMIGLIA Nome botanico della specie (nome comune in italiano) Durata di vita (9) e habitat Peso dei semi (mg) Fotoperiodo per la germinazione o la crescita (10) Profondità di semina (mm) (11) Tempi di germinazione (giorni) (12) Trattamenti speciali (13) Prova di tossicità (14) Fornitori di sementi (15) Altri riferimenti (16) APIACEAE Torilis japónica (lappolina petrosella) А, В zone perturbate, siepi, pastura (16, 19) 1,7 — 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) stratificazione a freddo (7, 14, 18, 19) maturazione eventualmente necessaria (19) germinazione inibita dall'oscurità (1, 19) nessun trattamento speciale (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (pratolina) Ρ prateria, seminativi, terreno erboso (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (18, 19) nessun trattamento speciale (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (fiordaliso) A campi, cigli stradali, habitat aperti (16) 4,1 -4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) nessun trattamento speciale (2, 4) POST (2, 4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (centaurea maggiore) Ρ campi, cigli stradali, habitat aperti (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) maturazione eventualmente necessaria (18, 19) germinazione inibita dall'oscurità (19) nessun trattamento speciale (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (enula campana) Ρ zone umide, zone perturbate (16) 1 — 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) nessun trattamento speciale (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (dente di leone) Ρ campi, cigli stradali, zone perturbate (16, 19) 0,85 -1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (17, 18, 19), nessun trattamento speciale (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Rudbeckia irta) Β, Ρ zone perturbate (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) nessun trattamento speciale (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (verga d'oro del Canada) Ρ pastura, spazi aperti (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) mescolare con una quantità uguale di sabbia e immergere in GA da 500 ppm per 24 ore (11) nessun trattamento speciale (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (lappola comune) A campi, habitat aperti (16) 25-61 (14, 29) 0(1) 5(29) la germinazione può essere inibita dall'oscurità (1) immergere in acqua calda per 12 ore (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (lappola spinosa) A habitat aperti (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) scarificatura (14) nessun trattamento speciale (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (lappola italiana) A campi, habitat aperti (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) nessun trattamento speciale (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (crescione dei prati) Ρ campi, cigli stradali, terreno erboso (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (18, 19) nessun trattamento speciale (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (fior cuculo) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) maturazione eventualmente necessaria (18) nessun trattamento speciale (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (chenopodio bianco) A margini dei campi, zone perturbate (16, 19) 0,7 — 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) il trattamento varia a seconda del colore dei semi (19) dormienza in deposito asciutto (19) germinazione inibita dall'oscurità (1, 18, 19) stratificazione a freddo (18) nessun trattamento speciale (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (erba di San Giovanni comune) Ρ campi, seminativi, habitat aperti (16, 19) 0,1-0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (1, 18, 19) nessun trattamento speciale (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (campanelle viola) A cigli stradali, habitat aperti, campi di mais (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) nessun trattamento speciale (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (zigolo infestante) Ρ seminativi, pastura, cigli stradali (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) germinazione inibita dall'oscurità (1) nessun trattamento speciale (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (ginestrino) Ρ zone erborse, cigli stradali, habitat aperti (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificatura (14, 19) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (18, 19) nessun trattamento speciale (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (cassia obtusifolia) A boschi umidi (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) immergere i semi in acqua per 24 ore (9) scarificatura (14) vitalità dei semi dipendente dal colore (1) nessun trattamento speciale (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata (canapa) A terreno alluvionale (16) 11 — 13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) immergere i semi in acqua per 24 ore (9) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) nessun trattamento speciale (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (trifoglio rosso) Ρ campi, cigli stradali, seminativi (16, 19) 1,4 — 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificatura (14, 18) maturazione eventualmente necessaria (19) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1, 19) nessun trattamento speciale (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (cardiaca) Ρ spazi aperti (16) 0,75-1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) nessun trattamento speciale (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (menta verde) Ρ zone umide (16) 2,21 (4) 0 (4) nessun trattamento speciale (4) POST (4) F Nepeta cataria (erba gatta) Ρ zone perturbate (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) nessun trattamento speciale (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (prunella comune) Ρ seminativi, zone erbose, zone perturbate (16, 19) 0,58-1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (18, 19) germinazione favorita da semi più grandi (1) nessun trattamento speciale (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (betonica comune) Ρ prateria, margini dei campi (19) 14-18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) nessun trattamento speciale (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (cencio molle) A campi, habitat aperti (16) 8,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) scarificatura (14) nessun trattamento speciale (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (sida spinosa) A campi, cigli stradali (16) 3,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) scarificatura (14) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) nessun trattamento speciale (6, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (papavero) A campi, seminativi, zone perturbate (16, 19) 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) stratificazione a freddo e scarificatura (1, 19, 32) nessun trattamento speciale (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (agrostide volgare) prato, pastura (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) germinazione inibita dall'oscurità (1, 17-19), nessun trattamento speciale (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (coda di volpe) A campi, habitat aperti (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) scarificatura (14) trattare con 101 mg/L di KNO3 (14) stratificazione a caldo (1) germinazione inibita dall'oscurità (1) nessun trattamento speciale (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (avena selvatica) A aree coltivate, habitat aperti (16) 7-37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) scarificatura (7, 32) germinazione inibita dall'oscurità (1) stratificazione a freddo (1, 18) nessun trattamento speciale (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (forasacco dei tetti) A campi, cigli stradali, seminativi (16) 0,45-2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) periodo di maturazione (1, 7, 32) germinazione inibita dalla luce (1) nessun trattamento speciale (14) PRE & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (covetta dei prati) P campi, cigli stradali, habitat aperti (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (19) nessun trattamento speciale (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (sanguinella comune) A campi, terreno erboso, habitat aperti (16) 0,52-0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) scarificatura, stratificazione a freddo e maturazione (1, 7, 14, 32) trattare con 101 mg/L di KNO3 (14) germinazione inibita dall'oscurità (1) nessun trattamento speciale (21) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (panico selvatico) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) scarificatura (7, 32) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) nessun trattamento speciale (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (segale selvatica canadese) P zone riparie, zone perturbate (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) nessun trattamento speciale (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (festuca) P campi, zone umide (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) nessun trattamento speciale (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (orzo piccolo) A pastura, cigli stradali, habitat aperti (16) 3,28 (14) stratificazione a caldo (1) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) PRE (31) 7 Phieum pratense (coda di topo, fleolo) P pastura, seminativi, zone perturbate (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) germinazione inibita dall'oscurità (19) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (17) nessun trattamento speciale (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (convolvolo nero) A habitat aperti, cigli stradali (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) stratificazione a freddo per 4-8 settimane (1, 2, 4, 20, 29) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (persicaria maggiore) A terreno umido (16) 1,8-2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (1) germinazione inibita dall'oscurità (18) stratificazione a freddo (1) nessun trattamento speciale (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (poligono della Pennsylvania) A campi, habitat aperti (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) stratificazione a freddo per 4 settimane a 0-5 °C (1, 29) germinazione inibita dall'oscurità (1) PRE (31) A, E Polygonum persicaria (poligono persicaria, persicaria maculosa) A zone perturbate, seminativi (16, 19) 2,1 -2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) scarificatura, stratificazione a freddo, trattamento con GA (14) stratificazione a freddo, maturazione (17-19) germinazione inibita dall'oscurità (19) nessun trattamento speciale (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (romice crespa) P seminativi, cigli stradali, spazi aperti (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) germinazione inibita dall'oscurità (18, 19) maturazione eventualmente necessaria (18) nessun trattamento speciale (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (centonchio) A seminativi, spazi aperti, zone perturbate (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) stratificazione a freddo, trattamento con GA (1,14, 18, 19, 32) la germinazione richiede la luce (1) nessun trattamento speciale (2, 4) POST (2, 4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (ranuncolo comune) Ρ seminativi, cigli stradali, spazi aperti (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 -56 (19, 29) nessun trattamento speciale (5, 14, 22, 24 -26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (cariofillata comune) Ρ siepi, zone umide (16, 19) 0,8-1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (18, 19) stratificazione a caldo (1) nessun trattamento speciale (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (aparine) A seminativi, zone umide, zone perturbate (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) stratificazione a freddo (1, 18, 19) germinazione non influenzata dall'irraggiamento (18, 19) germinazione inibita dalla luce (1) nessun trattamento speciale (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (caglio comune) Ρ scarpate, spazi aperti (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) nessun trattamento speciale (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (digitale purpurea) Β, Ρ siepi, spazi aperti (16, 19) 0,1-0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (1,17-19) nessun trattamento speciale (4, 22-26) POST (4, 22 — 26) D, G, F Veronica persica (veronica) A seminativi, spazi aperti, zone perturbate (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) germinazione inibita dall'oscurità (18, 19) stratificazione a freddo (18) nessun trattamento speciale (14) PRE & POST (28) A 32 Fornitori di sementi citati ID fornitore Informazioni sul fornitore A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www. herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 — 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 — 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 — 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 — 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 — 7333 www.thompson-morgan.com RIFERIMENTI CITATI (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. 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Le specie coltivate sono le seguenti: — pomodoro (Solanum lycopersicon); — cetriolo (Cucumis sativus); — lattuga (Lactuca sativa); — soia (Glycine max); — cavolo cappuccio (Brassica oleracea var. capitata); — carota (Daucus carota); — avena (Avena sativa); — loglio perenne (Lolium perenne); — mais (Zea mays); — cipolla (Allium cepa). C.32. PROVA DI RIPRODUZIONE SU ENCHITREIDI INTRODUZIONE 1. Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell'OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 220 (2004). Esso è finalizzato a valutare gli effetti delle sostanze chimiche sulla riproduzione degli Enchitreidi, Enchytraeus albidus (Henle 1873) nel terreno. Si basa principalmente su un metodo messo a punto dall'Umweltbundesamt (Germania) (1) che è stato sottoposto a prove interlaboratorio (2). Sono stati presi in considerazione anche altri metodi di valutazione della tossicità delle sostanze chimiche sugli Enchitreidi e i lombrichi (3)(4)(5)(6)(7)(8). CONSIDERAZIONI INIZIALI 2. Gli anellidi del suolo del genere Enchytraeus sono specie ecologicamente adatte per le prove ecotossicologiche. Benché spesso presenti nei terreni in cui vivono i lombrichi, gli Enchitreidi sono spesso però molto diffusi anche in terreni da cui i lombrichi sono assenti. Gli Enchitreidi possono essere utilizzati in prove di laboratorio come pure in studi sul campo e in semicampo. Da un punto di vista pratico numerose specie di Enchytraeus sono facili da manipolare e da allevare e il loro tempo di moltiplicazione è significativamente inferiore a quello dei lombrichi. La durata di una prova di riproduzione con gli Enchitreidi è pertanto di sole 4-6 settimane, mentre nel caso dei lombrichi (Eisenia fetida) è di 8 settimane. 3. Nozioni di base di tipo ecologico e ecotossicologico sugli Enchitreidi in ambiente terrestre figurano nei riferimenti (9)(10)(11)(12). PRINCIPIO DELLA PROVA 4. Gli Enchitreidi adulti sono esposti a una gamma di concentrazioni della sostanza chimica in esame mescolata in un terreno artificiale. La prova può essere divisa in due fasi: a) una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, qualora non siano disponibili informazioni sufficienti, in cui la mortalità costituisce il principale risultato esaminato dopo due settimane di esposizione e b) la prova di riproduzione propriamente detta in cui sono valutati la consistenza totale della progenie per animale riproduttore e la sopravvivenza degli animali riproduttori. La durata complessiva della prova è di sei settimane. Dopo tre settimane vengono rimossi gli esemplari adulti e ne sono registrati i cambiamenti morfologici. Al termine delle tre settimane successive viene contata la progenie nata dai bozzoli prodotti dagli adulti. Il tasso di riproduzione degli animali esposti alla sostanza chimica in esame è confrontato con il o i gruppi di controllo per determinare i) la concentrazione senza effetti osservati (NOEC) e/o ii) l'ECx (ad esempio, EC10, EC50) utilizzando un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x del tasso di riproduzione. Le concentrazioni di prova devono comprendere l'ECx (e.g. EC10, EC50) in modo che l'ECx sia ottenuta per interpolazione anziché per estrapolazione. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME 5. È auspicabile conoscere l'idrosolubilità, il log Kow, il coefficiente di ripartizione nel terreno (ad esempio, capitoli C.18 o C.19 del presente allegato) e la tensione di vapore della sostanza chimica in esame. È auspicabile anche l'acquisizione di informazioni supplementari sul destino della sostanza chimica in esame nel terreno, quali i tassi di fotolisi e di idrolisi. 6. Il presente metodo di prova può essere usato per sostanze chimiche solubili o insolubili in acqua. Ciò che cambia sono tuttavia le modalità di applicazione della sostanza chimica in esame. Il metodo di prova non è applicabile alle sostanze chimiche volatili, ovvero alle sostanze chimiche per le quali la costante di Henry o il coefficiente di ripartizione aria/acqua sono maggiori di uno o alle sostanze chimiche per le quali la tensione di vapore è superiore a 0,0133 Pa a 25 °C. VALIDITÀ DELLA PROVA 7. Perché la prova sia valida, nei gruppi di controllo devono essere soddisfatti i seguenti criteri di prestazione: — la mortalità degli esemplari adulti non deve superare il 20 % al termine della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni e dopo le prime tre settimane della prova di riproduzione; — se per la prova sono stati utilizzati 10 esemplari adulti per recipiente, alla fine della prova la progenie deve essere pari ad almeno una media di 25 esemplari per recipiente; — il coefficiente di variazione relativamente alla consistenza media della progenie non deve essere superiore al 50 % alla fine della prova di riproduzione. Una prova che non soddisfi i criteri suesposti non deve essere proseguita, a meno che non sia possibile giustificare una sua continuazione. La giustificazione va allegata alla relazione sulla prova. SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO 8. È necessario sottoporre a prova una sostanza chimica di riferimento a intervalli regolari o, eventualmente, inserirla in ciascuna prova per verificare che la reazione degli organismi di prova non cambi significativamente nel corso del tempo. A tal fine una sostanza chimica di riferimento adeguata è il carbendazim, che ha effetti dimostrati sulla sopravvivenza e la riproduzione degli Enchitreidi (13)(14), o anche altre sostanze chimiche i cui dati sulla tossicità siano ben noti. In una prova interlaboratorio (2) è stata utilizzata una formulazione di carbendazim, nota con il nome commerciale di Derosal™ della società AgrEvo (Francoforte, Germania), contenente 360 g/l (32,18 %) di principio attivo. L'EC50 per la riproduzione determinata nella prova interlaboratorio si situava nella gamma 1,2 ± 0,8 mg di principio attivo per kg di massa secca (2). Se nella serie di prove è incluso uno standard di tossicità positivo, viene utilizzata una sola concentrazione e il numero delle repliche deve essere uguale a quello dei gruppi di controllo. Per il carbendazim, si raccomanda di sottoporre a prova 1,2 mg di principio attivo per kg peso a secco (saggiato in formulazione liquida). DESCRIZIONE DELLA PROVA Apparecchiatura 9. I recipienti per la prova devono essere di vetro o di altro materiale chimicamente inerte. Sono adeguati recipienti di vetro (ad esempio, volume: 0,20 - 0,25 litro; diametro; ≈ 6 cm), muniti di coperchi trasparenti (ad esempio di vetro o di polietilene) progettati per ridurre l'evaporazione dell'acqua, consentendo al contempo gli scambi gassosi tra il terreno e l'atmosfera. I coperchi devono essere trasparenti per consentire la trasmissione della luce. 10. L'esperimento richiede un'apparecchiatura normale di laboratorio, nello specifico: — una camera di essiccazione; — un microscopio stereoscopico; — un pH-metro e un fotometro; — bilance di precisione adeguata; — attrezzature adeguate per il controllo della temperatura; — attrezzature adeguate per il controllo dell'umidità (non essenziali se i recipienti per l'esposizione sono muniti di coperchi); — un'incubatrice o stanzetta con aria condizionata; — pinzette, ami o anse; — una bacinella per uso fotografico. Preparazione del terreno artificiale 11. In questa prova è utilizzato un terreno artificiale (5)(7) che presenta la seguente composizione (sulla base del peso a secco, con essiccazione fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C): — 10 % di torba di spagno essiccata all'aria e finemente macinata (è accettabile una dimensione delle particelle di 2 ± 1 mm); si raccomanda di verificare che il terreno preparato con un nuovo lotto di torba sia adatto per l'allevamento dei lombrichi prima di essere utilizzato nella prova; — 20 % di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %); — tra lo 0,3 e l'1,0 % circa di carbonato di calcio (CaCO3, polverizzato, al grado analitico) per ottenere un pH di 6,0 ± 0,5; il quantitativo di carbonato di calcio da aggiungere può dipendere principalmente dalla qualità/natura della torba; — circa il 70 % di sabbia di quarzo essiccata all'aria (in funzione del quantitativo di CaCO3 necessario), in prevalenza sabbia fine con più del 50 % delle particelle di dimensioni comprese tra 50 e 200 micron. Prima di utilizzare il terreno artificiale nella prova, è opportuno dimostrarne l'adeguatezza per l'allevamento dei vermi e il rispetto dei criteri di validità della prova. Si raccomanda in particolare di effettuare un tale controllo per accertarsi che i risultati della prova non siano compromessi in caso di riduzione del tenore di carbonio organico del terreno artificiale, ad esempio riducendo il tenore di torba al 4-5 % e aumentando conseguentemente il tenore di sabbia. Con una tale riduzione del tenore di carbonio organico, possono diminuire le possibilità di assorbimento della sostanza chimica in esame nel terreno (carbonio organico) e aumentare la disponibilità della sostanza chimica in esame per i vermi. È stato dimostrato che l'Enchytraeus albidus può soddisfare i criteri di validità relativi alla riproduzione quando testato in terreni naturali con un tenore di carbonio organico inferiore a quello sopramenzionato, ad esempio 2,7 % (15), ed è stato sperimentalmente constatato — per quanto in misura limitata — che ciò vale anche con un terreno artificiale contenente il 5 % di torba. Nota: Anche quando si utilizza terreno naturale in ulteriori prove (ad esempio, sperimentazioni di livello più elevato), deve essere dimostrata l'adeguatezza del terreno e il rispetto dei criteri di validità della prova. 12. I componenti secchi del terreno sono accuratamente mescolati (ad esempio in un grande miscelatore da laboratorio), operazione che deve essere eseguita almeno una settimana prima dell'inizio della prova. La miscela di terreno va conservata per due giorni allo scopo di equilibrarne/stabilizzarne l'acidità. Per determinare il pH si miscela il terreno con una soluzione di 1 M di cloruro di potassio (KCl) o 0,01 M di cloruro di calcio (CaCl2) in proporzione di 1 a 5 (cfr. (16) e appendice 3). Se l'acidità del suolo è superiore a quella della gamma prevista (cfr. paragrafo 11), può essere corretta aggiungendovi un quantitativo adeguato di CaCO3. Se il terreno è troppo alcalino, può essere riequilibrato aggiungendo un quantitativo superiore della miscela di cui al paragrafo 11, ma escludendo il CaCO3. 13. La capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno artificiale è determinata in base alle procedure illustrate nell'appendice 2. Uno o due giorni prima dell'inizio della prova, il terreno artificiale secco è preumidificato aggiungendo acqua deionizzata in quantità sufficiente a ottenere circa la metà del tenore di acqua finale, ovvero tra il 40 % e il 60 % della capacità massima di ritenzione idrica. All'inizio della prova il terreno preumidificato è suddiviso in porzioni corrispondenti al numero delle concentrazioni di prova (e, se del caso, alla sostanza chimica di riferimento) e dei gruppi di controllo utilizzati nella prova. Il tenore di umidità è adeguato al 40 %-60 % della capacità massima di ritenzione idrica aggiungendo la soluzione della sostanza chimica in esame e/o acqua distillata o deionizzata (cfr. paragrafi 19-21). Il tenore di umidità viene misurato all'inizio e alla fine della prova (con essiccazione fino al raggiungimento di un peso costante a 105 °C) e deve situarsi nella gamma ottimale per per la sopravvivenza degli animali. Un esame sommario del tenore di umidità del terreno può essere fatto stringendo leggermente in mano un pugno di terreno: se il tenore di umidità è corretto, tra le dita dovrebbero comparire goccioline d'acqua. Selezione e preparazione degli animali per la prova 14. La specie consigliata per questa prova è Enchytraeus albidus (Henle 1837 — verme bianco), della famiglia Enchytraeidae (ordine Oligochaeta, phylum Annelida). E. albidus è una delle specie di Enchitreidi più diffuse, con esemplari di lunghezza documentata fino a 35 mm (17)(18). E. albidus è una specie con distribuzione mondiale e si ritrova in ambiente marino, di acqua dolce e terrestre, principalmente nella materia organica in putrefazione (alghe, compost) e, raramente, nei terreni prativi (9). L'ampia tolleranza ecologica che caratterizza questa specie e alcune sue variazioni morfologiche indica che potrebbero esisterne varie razze. 15. L'E. albidus è reperibile in commercio, sotto forma di mangime per pesci. Occorre verificare se l'allevamento è contaminato da altre specie, generalmente più piccole (1) (19), nel qual caso tutti gli animali vanno lavati con acqua in una capsula Petri. Per avviare un nuovo allevamento, si scelgono (utilizzando un microscopio stereoscopico) gli esemplari adulti di grandi dimensioni di E. albidus e si scartano tutti gli altri. L'E. albidus può essere allevato facilmente in un'ampia gamma di materiali organici (cfr. appendice 4). Il ciclo di vita dell'E. albidus è breve, dato che raggiunge la maturità in un tempo oscillante tra 33 (a 18 °C) e 74 giorni (a 12 °C) (1). Per questa prova possono essere utilizzati solo gli animali tenuti in laboratorio per almeno 5 settimane (una generazione) e che non abbiano mostrato complicazioni. 16. Per la prova sono adatte anche altre specie del genere Enchytraeus, ad esempio E. buchholzi (Vejdovsky 1879) o E. crypticus (Westheide & Graefe 1992) (cfr. appendice 5). Se si impiegano altre specie di Enchytraeus occorre identificarle in modo chiaro e giustificare tale scelta nella relazione. 17. Tutti gli animali impiegati nella prova devono essere esemplari adulti, devono portare uova (punti bianchi) nella regione del clitello e avere grosso modo le stesse dimensioni (lunghezza di circa 1 cm). La sincronizzazione della coltura di allevamento non è necessaria. 18. Se gli Enchitreidi non sono allevati nello stesso tipo di terreno e alle condizioni (compresa l'alimentazione) utilizzate nella prova propriamente detta, essi devono essere acclimatati per un periodo che va da 24 ore a tre giorni. All'inizio è necessario acclimatare un numero di esemplari adulti superiore a quello necessario per l'esecuzione della prova per tenere conto della necessità di scartare esemplari con lesioni o inutilizzabili per altre ragioni. Alla fine del periodo di acclimatazione sono selezionati per la prova solo gli esemplari recanti uova e che non esibiscono anomalie comportamentali (come, ad esempio, cercare di uscire dal terreno). Gli animali sono rimossi con attenzione utilizzando pinzette da orafo, ami o anse e sono messi in una capsula Petri contenente un piccolo quantitativo di acqua dolce. A tal fine è preferibile utilizzare acua dolce artificiale come proposto nel capitolo C.20 del presente allegato (prova sulla riproduzione della Daphnia magna), in quanto l'acqua deionizzata, demineralizzata o del rubinetto potrebbe essere nociva per gli animali. Gli animali sono analizzati con un microscopio stereoscopico, scartando quelli che non contengono uova. Si deve prestare particolare cura a rimuovere e scartare eventuali acari o Collemboli che potrebbero aver infettato le colture. Gli animali sani non utilizzati per la prova devono essere reimmessi nella coltura madre. Preparazione delle concentrazioni di prova Sostanza chimica in esame solubile in acqua 19. Viene preparata una soluzione della sostanza chimica in esame in acqua deionizzata in quantità sufficiente per tutte le repliche di una concentrazione di prova. Si raccomanda di utilizzare un quantitativo di acqua adeguato per raggiungere il tenore di umidità richiesto, ovvero tra il 40 % e 60 % della capacità massima di ritenzione idrica (cfr. paragrafo 13). Ciascuna soluzione della sostanza chimica in esame è adeguatamente miscelata con un lotto di terreno preumidificato prima di essere introdotta nel recipiente di prova. Sostanza chimica in esame insolubile in acqua 20. Nel caso di sostanze chimiche insolubili in acqua ma solubili nei solventi organici, la sostanza chimica in esame può essere disciolta nel minor volume possibile di un mezzo disperdente adeguato (per esempio, acetone). A tal fine devono essere utilizzati esclusivamente solventi volatili. Il mezzo disperdente viene nebulizzato oppure mescolato con un piccolo quantitativo, ad esempio 2,5 grammi, di sabbia di quarzo fine. Il mezzo disperdente è eliminato per evaporazione sotto una cappa chimica per almeno un'ora. La miscela di sabbia di quarzo e della sostanza chimica in esame è incorporata al terreno preumidificato, mescolando a fondo dopo l'aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il grado di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova. 21. Per le sostanze poco solubili in acqua e nei solventi organici, è possibile mescolare alla quantità di sostanza chimica in esame l'equivalente di 2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata per recipiente di prova per ottenere la concentrazione sperimentale voluta. La miscela di sabbia di quarzo e della sostanza chimica in esame è incorporata al terreno preumidificato, mescolando a fondo dopo l'aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il tenore di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova. La procedura è ripetuta per ogni concentrazione di prova preparando anche un adeguato gruppo di controllo. 22. Di norma le sostanze chimiche non devono essere sottoposte a prova a concentrazioni superiori a 1 000 mg/kg di massa secca di terreno. La prova a concentrazioni superiori può essere tuttavia necessaria in funzione degli obiettivi di una prova specifica. ESECUZIONE DELLE PROVE Gruppi di prova e di controllo 23. Per ciascuna concentrazione di prova viene distribuito nel recipiente di prova (cfr.paragrafi 19-21) un quantitativo di terreno di prova corrispondente a 20 g di peso secco. Vengono inoltre preparati i recipienti di controllo privi della sostanza chimica in esame. In ciascun recipiente sono aggiunti gli alimenti in conformità alle procedure di cui al paragrafo 29. In ciascun recipiente sono distribuiti dieci animali scelti a caso. Gli animali sono deposti con cautela sulla superficie del terreno in ciascun recipiente di prova utilizzando, ad esempio, pinzette da orafo, ami o anse. Il numero di repliche per le concentrazioni di prova e i controlli dipende dal tipo di prova utilizzato (cfr. paragrafo 34). I recipienti di prova sono posizionati a caso nell'incubatrice di prova e tali posizioni sono cambiate, sempre a caso, con cadenza settimanale. 24. Se per l'applicazione della sostanza chimica in esame si utilizza un mezzo disperdente, occorre allestire, oltre alla serie di prova, una serie di controllo contenente sabbia di quarzo nebulizzata o mescolata con un solvente. La concentrazione del solvente o disperdente deve essere la stessa di quella utilizzata nei recipienti di prova contenenti la sostanza chimica in esame. Una serie di controllo contenente ulteriore sabbia di quarzo (2,5 g per recipiente) deve essere allestita per le sostanze chimiche che richiedono una somministrazione in conformità con le procedure di cui al paragrafo 21. Condizioni di prova 25. La temperatura di prova è di 20 ± 2 °C. Per scoraggiare gli animali a uscire dal terreno, le prove sono condotte sulla base di un fotoperiodo controllato di luce/buio (di preferenza 16 ore di luce e 8 ore di buio) con un'intensità luminosa compresa tra 400 e 800 lux nella zona dei recipienti di prova. 26. Al fine di verificare l'umidità del terreno, i recipienti sono pesati all'inizio della prova e successivamente una volta alla settimana. La perdita di peso è compensata con l'aggiunta di un quantitativo adeguato di acqua deionizzata. Va rilevato che la perdita di peso può essere ridotta mantenendo un'elevata umidità atmosferica (> 80 %) nell'incubatrice di prova. 27. Il tenore di umidità e il pH devono essere misurati all'inizio della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni e all'inizio della prova vera e propria. Le misurazioni sono effettuate in campioni dei terreni di controllo e trattati (per tutte le concentrazioni) preparati e mantenuti nello stesso modo delle colture di prova ma non contenenti animali. Gli alimenti vengono aggiunti a tali campioni soltanto all'inizio della prova per facilitare l'attività microbica e in quantitativi identici a quelli aggiunti alle colture di prova. Non è necessario aggiungere ulteriori alimenti in tali recipienti durante la prova. Alimentazione 28. Per l'alimentazione può essere usato un mangime in grado di mantenere la popolazione di Enchitreidi; l'esperienza ha dimostrato che i fiocchi di avena, di preferenza sterilizzati in autoclave (o riscaldati) prima dell'uso per evitare la contaminazione microbica, costituiscono un alimento adeguato. 29. All'inizio il mangime è somministrato miscelando 50 mg di fiocchi di avena macinati con il terreno di ciascun recipiente prima di introdurvi gli animali. In seguito il mangime è somministrato quotidianamente fino al 21o giorno. Il 28o giorno non viene aggiunto mangime poiché in questa fase gli esemplari adulti sono già stati rimossi e quelli appena nati hanno bisogno di relativamente poco cibo in più a partire da quel momento. L'alimentazione durante la prova prevede 25 mg di fiocchi di avena macinati per contenitore che devono essere sparsi con attenzione sulla superficie del terreno per evitare di recare danno agli animali. Per ridurre la comparsa di funghi, i fiocchi di avena devono essere interrati e ricoperti di un leggero strato di terreno. Se non tutto il mangime viene consumato, si deve diminuire la razione. Concezione della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni 30. Se necessario, viene effettuata una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, utilizzando, ad esempio, cinque diverse concentrazioni della sostanza chimica in esame: 0,1, 1,0, 10, 100 e 1 000 mg/kg (peso secco di terreno). È sufficiente una replica per ciascun gruppo di trattamento e di controllo. 31. La durata complessiva della prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni è di due settimane. Al termine della prova viene valutata la mortalità degli animali. Un animale è registrato come morto se non presenta alcuna reazione a uno stimolo meccanico all'estremità anteriore. Ulteriori informazioni sulla mortalità possono essere utili per decidere l'ordine di grandezza delle concentrazioni da utilizzare nella prova vera e propria. Devono inoltre essere registrate le modifiche comportamentali negli esemplari adulti (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova), i mutamenti morfologici (ad esempio, la presenza di ferite aperte) oltre alla presenza di progenie. Quest'ultima può essere determinata utilizzando il metodo di colorazione descritto nell'appendice 6. 32. Il valore LC50 può essere determinato in modo approssimativo calcolando la media geometrica dei dati sulla mortalità. Nel determinare l'ordine di grandezza delle concentrazioni per la prova vera e propria si presuppone che gli effetti sulla riproduzione siano inferiori a LC50 di un fattore che può arrivare fino a 10. Si tratta tuttavia di una relazione empirica che potrebbe non verificarsi in casi particolari. Ulteriori osservazioni effettuate nella prova per determinare le concentrazioni, quali la presenza di progenie, possono aiutare ad affinare ulteriormente la gamma di concentrazioni di prova da utilizzare nella prova propriamente detta. 33. Al fine di determinare in modo accurato il valore LC50 si raccomanda di effettuare la prova utilizzando almeno quattro repliche per concentrazione della sostanza chimica in esame e un numero adeguato di concentrazioni per ottenere almeno quattro risultati medi differenti e statisticamente significativi in rapporto a tali concentrazioni. Eventualmente viene utilizzato un numero analogo di concentrazioni e repliche per i gruppi di controllo. Concezione della prova di riproduzione propriamente detta 34. Sulla base delle raccomandazioni emerse da una prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni (2), si propongono tre diverse articolazioni della prova. — Per determinare la NOEC si devono sottoporre a prova almeno cinque concentrazioni in una serie geometrica. Si raccomanda di utilizzare almeno quattro repliche per ciascuna concentrazione di prova oltre a otto controlli. Le concentrazioni devono essere spaziate di un fattore non superiore a 1,8. — Per determinare la ECx (ad esempio, EC10, EC50), occorre sottoporre a prova almeno cinque concentrazioni e tali concentrazioni devono comprendere la ECx così da consentire di ottenere ECx per interpolazione e non per estrapolazione. Si raccomanda di effettuare almeno quattro repliche per ciascuna concentrazione di prova e quattro repliche per i controlli. Il fattore di spaziatura può variare, ovvero essere pari o inferiore a 1,8 nella gamma di effetti attesa e superiore a 1,8 a concentrazioni superiori o inferiori. — Un approccio combinato consente di determinare sia la NOEC che la ECx. In questo caso si devono utilizzare otto concentrazioni di trattamento formanti una serie geometrica. Si raccomanda di utilizzare almeno quattro repliche per ciascun trattamento oltre a otto controlli. Le concentrazioni devono essere spaziate di un fattore non superiore a 1,8. 35. Si devono utilizzare dieci animali adulti per recipiente di prova (cfr. paragrafo 23). Il mangime è distribuito nei recipienti di prova all'inizio della prova e successivamente una volta alla settimana (cfr. paragrafo 29) fino al 21o giorno incluso. Il 21o giorno campioni di terreno sono accuratamente ispezionati a mano e gli esemplari adulti viventi sono osservati e contati, registrandone le modifiche comportamentali (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova) e i mutamenti morfologici (ad esempio, la presenza di ferite aperte). Tutti gli esemplari adulti sono quindi rimossi dai recipienti e dal terreno di prova. Il terreno di prova contenente eventuali bozzoli che sono stati prodotti è mantenuto nell'incubatrice per tre ulteriori settimane nelle stesse condizioni di prova, fatta eccezione per il fatto che l'alimentazione è somministrata soltanto il 35o giorno (25 mg di fiocchi di avena macinati per contenitore). 36. Dopo sei settimane si procede alla conta dei nuovi esemplari nati. Si raccomanda di utilizzare il metodo basato sulla colorazione rosso Bengala (cfr. appendice 6), per quanto si siano mostrate affidabili (4)(10)(11)(20) anche altre tecniche di estrazione in umido (ma non a caldo) e di flottazione (cfr. appendice 6). La colorazione rosso bengala è raccomandata in quanto l'estrazione in umido da un terreno può essere ostacolata dalla torbidità causata dalle particelle di argilla in sospensione. Prova limite 37. Se nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni non si osserva alcun effetto alla concentrazione più alta (ovvero 1 000 mg/kg), la prova di riproduzione può essere effettuata come prova limite utilizzando 1 000 mg/kg al fine di dimostrare che la NOEC per la riproduzione è superiore a questo valore. Sintesi e calendario per la prova 38. Le fasi della prova possono essere sintetizzate come segue: Calendario Prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni Prova propriamente detta Giorno –7 o precedente — Preparazione del terreno artificiale (miscela dei componenti secchi) — Preparazione del terreno artificiale (miscela dei componenti secchi) Giorno –5 — Verifica del pH del terreno artificiale — Misurazione della capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno — Verifica del pH del terreno artificiale — Misurazione della capacità massima di ritenzione idrica (WHC) del terreno Giorno da –5 a –3 — Selezione degli animali per l'acclimatazione — Selezione degli animali per l'acclimatazione Giorno da — 3 a 0 — Acclimatazione degli animali per almeno 24 ore — Acclimatazione degli animali per almeno 24 ore Giorno –1 — Preumidificazione artificiale del suolo e sua ripartizione in lotti — Preumidificazione artificiale del suolo e sua ripartizione in lotti Giorno 0 — Preparazione delle soluzioni madre — Applicazione della sostanza chimica in esame — Pesatura del terreno di prova nei recipienti di prova — Aggiunta del mangime — Aggiunta degli animali — Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo — Preparazione delle soluzioni madre — Applicazione della sostanza chimica in esame — Pesatura del terreno di prova nei recipienti di prova — Aggiunta del mangime — Aggiunta degli animali — Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo Giorno 7 — Misurazione del tenore di umidità del suolo — Misurazione del tenore di umidità del suolo — Alimentazione Giorno 14 — Determinazione della mortalità degli esemplari adulti — Stima della consistenza della progenie — Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo — Misurazione del tenore di umidità del suolo — Alimentazione Giorno 21 — Osservazione del comportamento degli adulti — Rimozione degli esemplari adulti — Determinazione della mortalità degli esemplari adulti — Misurazione del tenore di umidità del suolo — Alimentazione Giorno 28 — Misurazione del tenore di umidità del suolo — Nessuna alimentazione Giorno 35 — Misurazione del tenore di umidità del suolo — Alimentazione Giorno 42 — Conteggio della progenie — Misurazione del pH e del tenore di umidità del suolo DATI E RELAZIONE Trattamento dei risultati 39. Il presente metodo di prova non presenta alcun orientamento statistico definito per analizzare i risultati della prova, anche se nell'appendice 7 sono fornite indicazioni generali. 40. Nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni il principale risultato è dato dalla mortalità. Devono essere inoltre registrate le modifiche comportamentali negli esemplari adulti (ad esempio, l'incapacità di infossarsi nel terreno; il fatto di giacere immobili contro la parete di vetro del recipiente di prova), i mutamenti morfologici (ad esempio, ferite aperte) oltre alla presenza di progenie. Per determinare la LC50 è opportuno di norma applicare l'analisi Probit (21) o la regressione logistica. Tuttavia, nei casi in cui tale metodo di analisi si riveli inadeguato (ad esempio, se si ottengono meno di tre concentrazioni che provocano una mortalità parziale), possono essere utilizzati metodi alternativi, quali le medie mobili (22), il metodo Spearman-Karber semplificato (23) o l'interpolazione semplice (ad esempio, la media geometrica di LC0 e LC100, calcolata mediante la radice quadrata di LC0 moltiplicata per LC100). 41. Nella prova vera e propria il risultato principale è la fecondità (ovvero, la consistenza della progenie prodotta). Tuttavia, come nella prova di determinazione dell'intervallo delle concentrazioni, tutti gli altri indicatori di nocività devono essere registrati nella relazione di prova. Ai fini dell'analisi statistica è necessario calcolare la media aritmetica e la deviazione standard relativa alla riproduzione negli animali sottoposti al trattamento e in quelli di controllo. 42. Se è stata effettuata un'analisi della varianza, la deviazione standard, s, e i gradi di libertà, df, possono essere sostituiti con la stima raggruppata della varianza ottenuta rispettivamente dall'analisi della varianza (ANOVA) e dai suoi gradi di libertà — a condizione che la varianza non dipenda dalla concentrazione. In questo caso si utilizzano varianze uniche per i gruppi di controllo e di trattamento. Tali valori sono calcolati di solito mediante software statistici disponibili in commercio che utilizzano i risultati per recipiente come repliche. Se il raggruppamento dei dati relativi ai gruppi di controllo negativi e ai gruppi di controllo contenenti solventi appare più pertinente rispetto al calcolo dei risultati della prova in relazione a uno dei due gruppi di controllo, è necessario verificare mediante una prova che non vi siano differenze significative (un'indicazione delle prove adeguate figura al paragrafo 45 e all'appendice 7). 43. Ulteriori prove e inferenze statistiche dipendono dal fatto che i valori delle repliche siano o no omogenei e distribuiti in modo normale per quanto attiene alla loro varianza. Stima della NOEC 44. Deve essere preferita l'applicazione di prove di potenza, verificando che i dati abbiano una distribuzione grosso modo normale sulla base delle informazioni disponibili, ad esempio quelle di altre prove interlaboratorio o di altri dati storici. L'omogeneità della varianza (omoschedasticità) è più determinante. L'esperienza ci insegna che la varianza aumenta spesso di pari passo con la media. In questi casi una trasformazione dei dati potrebbe determinare un'omogeneità della varianza. Tale trasformazione, tuttavia deve essere basata sull'esperienza acquisita con i dati storici piuttosto che sui dati in corso di analisi. In presenza di dati omogenei si deve procedere a prove t multiple, quali il test di Williams (α = 0,05, test a una coda) (24)(25) o in alcuni casi il test di Dunnett (26)(27). Va rilevato che, nei casi di repliche diseguali, i valori t della tabella devono essere rettificati come suggerito da Dunnett e Williams. Talvolta, in presenza di una variazione significativa, può accadere che l'aumento/diminuzione dei risultati non abbia carattere regolare. In questo caso è opportuno discostarsi in modo marcato dalla monotonicità del test di Dunnett. Nei casi di deviazione dalla monotonicità della varianza, può essere corretto indagare più da vicino i possibili effetti sulle varianze per decidere se sia possibile applicare le prove t senza perdere molto in potenza (28). In alternativa possono essere effettuati — e sono in genere preferibili alle prove t per varianze diseguali — una prova U multipla, ad esempio il test U di Bonferroni secondo Holm (29) o, quando i dati evidenziano un'eteroschedasticità ma sono altrimenti coerenti con un rapporto dose-risposta monotonico soggiacente, un'altra prova non parametrica [ad esempio, Jonckheere-Terpstra (30) (31) o Shirley (32) (33)]. (si veda anche lo schema di cui all'appendice 7). 45. Se è stata effettuata una prova limite e sono stati rispettati i prerequisiti delle prove parametriche (normalità, omogeneità), si può utilizzare il test t bilaterale di Student oppure il test U di Mann-Whitney (29). Stima dell'ECx 46. Per calcolare qualsiasi valore di ECx si utilizzano le medie per trattamento per l'analisi di regressione (lineare o non lineare) dopo aver ottenuto un'adeguata funzione dose-risposta. Se la crescita degli animali è considerata una risposta continua, i valori della ECx- possono essere stimati avvalendosi di un'adeguata analisi di regressione (35). Tra le funzioni adeguate per i dati di tipo quantale (mortalità/sopravvivenza e consistenza della progenie prodotta) figurano le funzioni sigmoidee normali, le funzioni logistiche o di Weibull, contenenti due o quattro parametri, alcuni dei quali possono anche modellizzare una risposta ormetica. Se una funzione dose-risposta è stata adeguata mediante un'analisi della regressione lineare, si dove trovare mediante l'analisi della regressione un r2 (coefficiente di determinazione) e/o una pendenza significativi prima di stimare la ECx inserendo un valore corrispondente a x % della media del controllo nell'equazione ottenuta mediante analisi della regressione. I limiti di confidenza del 95 % sono calcolati come indicato da Fieller (citato in Finney (21)) o con altri metodi recenti appropriati. 47. In alternativa la risposta è modellizzata come percentuale o proporzione del parametro del modello che è interpretato come la risposta media del controllo. In altri casi la curva sigmoide normale (logistica, Weibull) può essere spesso adeguata facilmente ai risultati utilizzando la procedura di regressione Probit (21). In questi casi la funzione di ponderazione deve essere adeguata per i risultati metrici, come illustrato da Christensen (36). Tuttavia, se viene constatata un'ormesi, è necessario sostituire l'analisi Probit con una funzione logistica o Weibull a quattro parametri adeguata mediante una procedura di regressione non lineare (37). Qualora sia impossibile adeguare ai dati una funzione appropriata dose-risposta, è possibile utilizzare metodi alternativi per stimare la ECx e i suoi limiti di confidenza, quali le medie mobili secondo Thompson (22) e il metodo Spearman-Karber semplificato (23). RELAZIONE SULLA PROVA 48. La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti. Sostanza chimica in esame: — natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (ad esempio, idrosolubilità, tensione di vapore); — identificazione chimica della sostanza chimica in esame secondo la nomenclatura IUPAC, numero CAS, lotto di fabbricazione, lotto di condizionamento, formula strutturale e purezza; — data di scadenza del campione. Specie di prova: — animali utilizzati per la prova: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento. Condizioni di prova: — ingredienti e preparazione del terreno artificiale; — metodo di applicazione della sostanza chimica in esame; — descrizione delle condizioni di prova, tra cui temperatura, tenore di umidità, pH, ecc.; — descrizione completa del disegno e delle procedure di prova. Risultati della prova: — mortalità degli esemplari adulti dopo due settimane e consistenza della progenie al termine della prova di determinazione dell