IT Gazzetta ufficiale dell’Unione europea L 220/1

REGOLAMENTO (CE) N. 761/2009 DELLA COMMISSIONE

del 23 luglio 2009

recante modifica, ai fini dell'adeguamento al progresso tecnico, del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH)

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un'Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l'articolo 13, paragrafo 3,

considerando quanto segue:

(1) Il regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione (2) istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l'ecotossicità delle sostanze applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006.

(2) È necessario aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi le modifiche a taluni metodi di prova e numerosi nuovi metodi adottati dall'OCSE. Le parti interessate sono state consultate in merito alla proposta. Dette modifiche adeguano i metodi in questione al progresso scientifico e tecnologico.

(3) Occorre rivedere le disposizioni relative alla tensione di vapore al fine di includere il nuovo metodo di effusione.

(4) È necessario aggiungere un nuovo metodo per misurare il diametro medio geometrico delle fibre ponderato rispetto alla lunghezza.

(5) È opportuno aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi in via prioritaria un nuovo metodo di prova in vitro per l'irritazione cutanea volto a ridurre al minimo il numero di animali usati a scopi di sperimentazione, conformemente alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio, del 24 novembre 1986, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative degli Stati membri relative alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici (3). Anche se al momento in ambito OCSE è ancora in discussione un progetto di metodo di prova in vitro per l'irritazione cutanea, in questo caso eccezionale è opportuno inserire il metodo B.46 nel presente regolamento. Tale metodo deve essere aggiornato non appena verrà raggiunto un accordo in sede OCSE o se saranno disponibili altri dati che ne giustifichino la revisione.

(6) Le disposizioni relative al test di inibizione della crescita algale devono essere riviste per includere specie supplementari e soddisfare i requisiti per la valutazione dei rischi e la classificazione delle sostanze chimiche.

(7) È necessario aggiungere un nuovo metodo per misurare la mineralizzazione aerobica nelle acque di superficie tramite un test di simulazione della biodegradazione e un nuovo metodo di valutazione della tossicità per il genere Lemna tramite un test di inibizione della crescita.

(8) Il regolamento (CE) n. 440/2008 va quindi modificato di conseguenza.

(9) Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato istituito dall'articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

L'allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato:

1) La parte A è così modificata: a) il capitolo A.4 è sostituito dal capitolo A.4 che figura nell'allegato I del presente regolamento; b) è aggiunto il capitolo A.22 che figura nell'allegato II del presente regolamento.

2) La parte B è così modificata: è inserito il capitolo B.46 che figura nell'allegato III del presente regolamento.

3) La parte C è così modificata: a) il capitolo C.3 è sostituito dal capitolo C.3 che figura nell'allegato IV del presente regolamento; b) sono aggiunti i capitoli C.25 e C.26 che figurano negli allegati V e VI del presente regolamento.

Articolo 2

Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 23 luglio 2009. Per la Commissione Stavros DIMAS Membro della Commissione

(1) GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1.

(2) GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1.

(3) GU L 358 del 18.12.1986, pag. 1.

ALLEGATO I A.4. TENSIONE DI VAPORE 1. METODO Questo metodo è equivalente al metodo OCSE TG 104 (2004). 1.1. INTRODUZIONE La presente versione riveduta del metodo A.4 (1) comprende un metodo supplementare, il metodo di effusione mediante termogravimetria isotermica, ideato per sostanze chimiche con livelli di pressione molto bassi (fino a 10–10 Pa). Alla luce della necessità di disporre di procedure atte a ricavare la tensione di vapore, specie nel caso di sostanze con bassa tensione di vapore, le altre procedure di questo metodo sono state riesaminate rispetto ad altri intervalli d'applicazione. All'equilibrio termodinamico, la tensione di vapore di una sostanza pura è funzione della sola temperatura. I principi fondamentali sono illustrati altrove (2)(3). Non esiste un unico procedimento di misura che sia applicabile all’intero spettro di tensione di vapore compreso tra valori inferiori a 10–10 e 105 Pa. Il metodo qui illustrato comprende otto procedure per misurare la tensione di vapore, utilizzabili in diversi intervalli di tensione di vapore. La tabella 1 offre un quadro sinottico dei vari metodi sotto il profilo dell'applicazione e dei relativi intervalli di misura. I metodi possono essere utilizzati unicamente per quei composti che non subiscono decomposizione nelle condizioni di prova. Qualora per ragioni tecniche non sia possibile effettuare misure sperimentali, la tensione di vapore può essere stimata. Un metodo consigliato è illustrato nell'appendice. 1.2. DEFINIZIONI E UNITÀ DI MISURA La tensione di vapore di una sostanza è definita come la pressione di saturazione al di sopra di un solido o di un liquido. Deve essere utilizzata l'unità SI di pressione, che è il pascal (Pa). Altre unità impiegate in passato sono qui di seguito elencate con i relativi fattori di conversione: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa L'unità SI di temperatura è il kelvin (K). La conversione dei gradi Celsius in kelvin è eseguita mediante la formula: T = t + 273,15 dove T rappresenta la temperatura kelvin o termodinamica, mentre t è la temperatura Celsius. Tabella 1 Metodo di misura Sostanze Ripetibilità stimata Riproducibilità stimata Intervallo raccomandato Solide Liquide Metodo dinamico basso- fondenti sì fino al 25 % 1-5 % fino al 25 % 1-5 % da 103 Pa a 2 × 103 Pa da 2 × 103 Pa a 105 Pa Metodo statico sì sì 5-10 % 5-10 % da 10 Pa a 105 Pa da 10–2 Pa a 105 Pa (1) Metodo isoteniscopico sì sì 5-10 % 5-10 % da 102 Pa a 105 Pa Metodo di effusione: bilancia a tensione di vapore sì sì 5-20 % fino al 50 % da 10–3 a 1 Pa Metodo di effusione: cellula di Knudsen sì sì 10-30 % — da 10–10 a 1 P Metodo di effusione: termogravimetria isotermica sì sì 5-30 % fino al 50 % da 10–10 a 1 Pa Metodo di saturazione del gas sì sì 10-30 % fino al 50 % da 10–10 a 103 Pa Metodo del rotore sì sì 10-20 % — da 10–4 a 0,5 Pa 1.3. PRINCIPIO DELLA PROVA Generalmente la tensione di vapore è determinata a varie temperature. In un intervallo di temperatura ristretto, il logaritmo della tensione di vapore di una sostanza pura è funzione lineare del reciproco della temperatura termodinamica, secondo l'equazione semplificata di Clausius-Clapeyron: dove: p = tensione di vapore in pascal ΔHv = calore di vaporizzazione in J mol–1 R = costante universale dei gas 8,314 J mol–1 K–1 T = temperatura in K 1.4. SOSTANZE DI RIFERIMENTO Non occorre utilizzare sostanze di riferimento. Queste servono principalmente a controllare periodicamente la prestazione del metodo e a permettere il confronto tra i risultati ottenuti con metodi differenti. 1.5. DESCRIZIONE DEL METODO 1.5.1. Metodo dinamico (metodo di Cottrell) 1.5.1.1. Principio La tensione di vapore è determinata misurando la temperatura di ebollizione della sostanza a varie pressioni prestabilite comprese approssimativamente tra 103 e 105 Pa. Questo metodo è raccomandato anche per la determinazione della temperatura di ebollizione e a tal fine è utilizzabile fino a 600 K. La temperatura di ebollizione dei liquidi rilevata a 3-4 cm di profondità è di circa 0,1 °C superiore a quella rilevata in superficie, a causa della pressione idrostatica esercitata dalla colonna di liquido. Con il metodo di Cottrell (4) il termometro è posto nel vapore sopra la superficie del liquido; il liquido in ebollizione è pompato continuamente sul bulbo del termometro, sul quale forma un sottile strato di liquido in stato di equilibrio con il vapore a pressione atmosferica. Il termometro rileva quindi il vero punto di ebollizione, senza gli errori causati dal surriscaldamento o dalla pressione idrostatica. La pompa originariamente usata da Cottrell è illustrata in figura 1. Il tubo A contiene il liquido in ebollizione. Un filo di platino B incorporato nel fondo favorisce l'uniformità dell'ebollizione. Il tubo laterale C conduce ad un condensatore e la guaina D impedisce al condensato freddo di entrare in contatto con il termometro E. Quando il liquido in A bolle, le bollicine e il liquido intrappolati dall'imbuto si riversano sul bulbo del termometro attraverso i due bracci della pompa F. Figura 1 Figura 2 Pompa Cottrell (4) A: Termocoppia B: Polmone per il vuoto C: Manometro D: Al vuoto E: Punto di misura F: Elemento riscaldante (150 W circa) 1.5.1.2. Apparecchiatura La figura 2 mostra un'apparecchiatura molto accurata che sfrutta il principio di Cottrell. La sezione di ebollizione è nella parte inferiore del tubo, mentre il dispositivo di raffreddamento è in quella centrale. Nella parte superiore si trovano un'uscita ed una flangia. La pompa Cottrell è posta nella sezione di ebollizione, che è riscaldata mediante una cartuccia elettrica. La temperatura è misurata con una termocoppia incamiciata o un termometro a resistenza infilato attraverso la flangia in alto. L'uscita è collegata al sistema di regolazione della pressione, composto da una pompa da vuoto, un polmone, un manostato attraverso il quale è introdotto l'azoto per regolare la pressione ed un manometro. 1.5.1.3. Procedimento La sostanza è posta nella sezione di ebollizione. Con i solidi che si presentano in forma diversa dalla polvere è possibile incontrare dei problemi, che tuttavia possono essere talvolta risolti riscaldando la camicia di raffreddamento. L'apparecchio viene sigillato in corrispondenza della flangia e la sostanza viene degassata. Questo metodo non è adatto per effettuare misure su sostanze schiumogene. Si imposta quindi la pressione minima desiderata e si aziona il riscaldamento, attivando contemporaneamente il collegamento del sensore di temperatura ad un registratore. L'equilibrio è raggiunto quando si registra una temperatura di ebollizione costante a pressione costante. Bisogna prestare molta attenzione al fine di evitare la formazione di grosse bolle durante l'ebollizione. Inoltre, sul refrigerante deve avvenire una condensazione completa. Quando si determina la tensione di vapore di solidi basso-fondenti, occorre stare attenti ad evitare il blocco del condensatore. Dopo aver registrato tale punto di equilibrio, si regola la pressione su un valore più elevato. Tale operazione è ripetuta fino a raggiungere una pressione di 105 Pa (per un totale di circa 5-10 punti di misura). A titolo di controllo, la determinazione dei punti di equilibrio deve essere ripetuta a pressioni decrescenti. 1.5.2. Metodo statico 1.5.2.1. Principio Nel metodo statico (5), si determina la tensione di vapore ad una data temperatura in condizioni di equilibrio termodinamico. Questo metodo si presta sia per sostanze che per solidi e liquidi multicomponenti nell'intervallo da 10–1 a 105 Pa, nonché nell'intervallo da 1 a 10 Pa, purché si proceda con attenzione. 1.5.2.2. Apparecchiatura La strumentazione consiste in un bagno mantenuto a temperatura costante (tolleranza pari a ±0,2 K), un contenitore per il campione collegato ad una linea da vuoto, un manometro ed un sistema per regolare la pressione. La camera del campione (figura 3a) è collegata alla linea da vuoto mediante una valvola ed un manometro differenziale (un tubo ad U contenente un opportuno fluido manometrico), che funge da indicatore di zero. Per il manometro differenziale è possibile utilizzare mercurio, fluidi siliconici e ftalati, a seconda dell'intervallo di pressione e del comportamento chimico della sostanza esaminata. Tuttavia, sulla base di considerazioni di ordine ambientale, l'uso del mercurio, se possibile, dovrebbe essere evitato. È necessario che la sostanza di prova non si sciolga in modo apprezzabile nel fluido contenuto nel tubo ad U o che non reagisca con esso. Il tubo ad U può essere sostituito da un manometro (figura 3b). Per il manometro, nell'intervallo compreso tra pressione normale e 102 Pa può essere utilizzato il mercurio, mentre i fluidi siliconici e gli ftalati sono adatti per l'uso nell'intervallo da 102 Pa a 10 Pa. Esistono poi altri misuratori di pressione che possono essere utilizzati per pressioni inferiori a 102 Pa. I manometri capacitativi a membrana riscaldabile possono essere impiegati anche al di sotto di 10–1 Pa. La temperatura è misurata sulla parete esterna del recipiente contenente il campione oppure nel recipiente stesso. 1.5.2.3. Procedimento Servendosi della strumentazione descritta in figura 3a, riempire il tubo ad U con il liquido scelto, che deve essere degassato a temperatura elevata prima di effettuare le letture. La sostanza di prova è posta nell'apparecchiatura e degassata a temperatura ridotta. Nel caso di campioni multicomponenti, la temperatura deve essere sufficientemente bassa da assicurare che la composizione del materiale non venga alterata. L'equilibrio può essere raggiunto più rapidamente mediante agitazione. Il campione può essere raffreddato con azoto liquido o ghiaccio secco, avendo cura tuttavia di non far condensare l'aria o il fluido della pompa. L'aria viene eliminata attivando l’aspirazione per diversi minuti, mantenendo aperta la valvola posta al di sopra del recipiente del campione. Se necessario, l'operazione di degassaggio può essere ripetuta varie volte. Figura 3a Figura 3b Quando il campione è riscaldato con la valvola chiusa, la tensione di vapore aumenta. Ciò altera l'equilibrio del fluido contenuto nel tubo a U. Per compensare questo effetto, si immette azoto o aria nell'apparecchio fino a che l'indicatore di pressione differenziale è nuovamente a zero. La pressione richiesta a questo scopo può essere letta dal manometro o da uno strumento di maggiore precisione. Tale pressione corrisponde alla tensione di vapore della sostanza alla temperatura di misura. Utilizzando la strumentazione illustrata in figura 3b, la tensione di vapore è letta direttamente. La tensione di vapore è determinata ad intervalli adeguatamente ridotti (per un totale di circa 5-10 punti di misura) fino al massimo valore di temperatura desiderato. Le letture a bassa temperatura devono essere ripetute per verifica. Se i valori ottenuti dalla ripetizione delle letture non coincidono con la curva ottenuta a temperatura crescente, la ragione può essere una delle seguenti: i) il campione contiene ancora aria (come nel caso, per esempio, di materiali ad elevata viscosità) o sostanze basso-bollenti, che è/sono liberata/e durante il riscaldamento; ii) la sostanza subisce una reazione chimica nell'intervallo di temperatura considerato (per esempio decomposizione, polimerizzazione). 1.5.3. Metodo isoteniscopico 1.5.3.1. Principio L'isoteniscopio (6) è basato sul principio del metodo statico. Il metodo prevede che il campione sia posto in un bulbo tenuto a temperatura costante, collegato ad un manometro e ad una pompa da vuoto. Le impurezze più volatili della sostanza sono eliminate degassando a pressione ridotta. La tensione di vapore del campione in corrispondenza dei valori di temperatura prescelti è bilanciata da una pressione nota di gas inerte. Benché sia stato messo a punto per misurare la tensione di vapore di alcuni idrocarburi liquidi, l'isoteniscopio si presta anche per l'esame di solidi. Il metodo non è solitamente adatto per sistemi multicomponenti. I risultati sono soggetti solo a lievi errori qualora i campioni contengano impurezze non volatili. L'intervallo raccomandato è da 102 a 105 Pa. 1.5.3.2. Apparecchiatura Un esempio di dispositivo di misura è illustrato in figura 4. Per la descrizione completa si consulti la norma ASTM D 2879-86 (6). 1.5.3.3. Procedimento Nel caso di liquidi, la sostanza medesima funge da fluido per il manometro differenziale. Una quantità di liquido sufficiente a riempire il bulbo ed il ramo corto del manometro viene introdotta nell'isoteniscopio. Questo è quindi collegato ad un sistema da vuoto e svuotato, per poi essere successivamente riempito con azoto. Lo svuotamento e la pulizia del sistema sono ripetuti due volte per eliminare l'ossigeno residuo. Una volta riempito, l'isoteniscopio è messo in posizione orizzontale, in modo che il campione si sparga in uno strato sottile nel bulbo del campione e nella sezione manometrica. La pressione del sistema è ridotta a 133 Pa ed il campione è riscaldato delicatamente, fino a quando incomincia a bollire (eliminazione dei gas disciolti). L'isoteniscopio viene poi disposto in modo che il campione ritorni nel bulbo e riempia il ramo corto del manometro. La pressione viene mantenuta a 133 Pa. L'estremità del bulbo portacampione viene riscaldata con una piccola fiamma, fino a quando i vapori del campione liberati si espandono al punto da spostare parte del campione dalla parte superiore del bulbo e del braccio manometrico nella sezione manometrica dell'isoteniscopio, creando uno spazio riempito di vapore ed esente da azoto. L'isoteniscopio è quindi posto in un bagno a temperatura costante e la pressione dell'azoto viene regolata fino a coincidere con quella del campione. All'equilibrio, la pressione dell'azoto è uguale alla tensione di vapore della sostanza. Figura 4 Nel caso di solidi, ed in funzione degli intervalli di pressione e temperatura, sono usati come liquidi manometrici fluidi siliconici e ftalati. Il liquido manometrico degassato viene introdotto in una boccia sul braccio lungo dell'isoteniscopio. Il solido da analizzare è quindi posto nel bulbo portacampione e degassato a temperatura elevata. Dopo questa operazione, l'isoteniscopio è inclinato così che il liquido manometrico possa defluire nel tubo ad U. 1.5.4. Metodo di effusione: bilancia a tensione di vapore (7) 1.5.4.1. Principio Un campione della sostanza di prova è riscaldato in un piccolo forno e posto in una campana evacuata. Il forno è coperto mediante un coperchio recante dei piccoli fori di diametro noto. Il vapore della sostanza che fuoriesce da uno dei fori è convogliato sul piatto di una bilancia ad alta sensibilità, anch'essa racchiusa nella campana evacuata. In alcuni modelli, il piatto è collocato in una cassetta di refrigerazione, che provvede alla dissipazione del calore verso l'esterno per conduzione termica, ed è raffreddato per irraggiamento così che il vapore che fuoriesce dal forno si condensi sul piatto. La quantità di moto del getto di vapore agisce come una forza sulla bilancia. La tensione di vapore può essere ricavata in due modi: direttamente dalla forza esercitata sul piatto della bilancia oppure dalla velocità di evaporazione applicando l'equazione di Hertz-Knudsen (2): dove: G = velocità di evaporazione (kg s–1 m–2) M = massa molare (g mol–1) T = temperatura (K) R = costante universale del gas (J mol–1 K–1) p = tensione di vapore (Pa) L'intervallo raccomandato è da 10–3 a 1 Pa. 1.5.4.2. Apparecchiatura Il principio generale dell'apparecchiatura è illustrato in figura 5. Figura 5 A: Piastra di base F: Cassetta di refrigerazione e barra di raffreddamento B: Strumento a spirale mobile G: Forno evaporatore C: Campana H: Dewar con azoto liquido D: Bilancia con piatto I: Misura della temperatura del campione E: Vacuometro J: Sostanza di prova 1.5.5. Metodo ad effusione: cella di Knudsen 1.5.5.1. Principio Il metodo è basato sulla stima della massa della sostanza di prova liberata per unità di tempo da una cella di Knudsen sotto forma di vapore, attraverso un micro-orifizio in condizioni di vuoto spinto (8). La massa di vapore effuso può essere ricavata misurando la perdita di massa della cella oppure facendo condensare il vapore a bassa temperatura e determinando la quantità di sostanza volatilizzata mediante cromatografia. La tensione di vapore è calcolata tramite la relazione di Hertz-Knudsen (cfr. punto 1.5.4.1), applicando dei fattori di correzione definiti in funzione dei parametri dell'apparecchiatura (9). L'intervallo raccomandato è da 10–10 a 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Apparecchiatura Il principio generale della strumentazione è illustrato in figura 6. Figura 6 1: Collegamento al vuoto 7: Coperchio a vite 2: Pozzetti per il termometro a resistenza di platino o per la misura e il controllo della temperatura 8: Dadi ad alette 3: Coperchio del recipiente da vuoto 9: Bulloni 4: O-ring 10: Celle di effusione in acciaio inossidabile 5: Recipiente da vuoto in alluminio 11: Cartuccia riscaldante 6: Dispositivo per installare e rimuovere le celle di effusione 1.5.6. Metodo di effusione: termogravimetria isotermica 1.5.6.1. Principio Il metodo è basato sulla determinazione della velocità di evaporazione accelerata della sostanza di prova a temperature elevate e pressione ambiente mediante termogravimetria (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). La velocità di evaporazione vT è ricavata esponendo il composto scelto ad un lento flusso di gas inerte e controllando la perdita di peso a definiti valori di temperatura costante T in kelvin, per opportuni lassi di tempo. La tensione di vapore pT è calcolata dai valori di vT utilizzando la relazione lineare tra il logaritmo della tensione di vapore ed il logaritmo della velocità di evaporazione. Se necessario, i valori a temperatura di 20 e 25 °C possono essere estrapolati mediante analisi di regressione del logaritmo log pT vs. 1/T. Questo metodo si presta per quelle sostanze che hanno tensione di vapore pari a 10–10 Pa (10–12 mbar) e la cui purezza è il più possibile prossima al 100 %, onde evitare che le perdite di peso misurate siano interpretate in modo erroneo. 1.5.6.2. Apparecchiatura Il principio generale della strumentazione è illustrato in figura 7. Figura 7 Il piatto portacampione, appeso ad una microbilancia all'interno di una camera a temperatura controllata, è investito da un flusso di gas di azoto secco che trasporta le molecole vaporizzate della sostanza di prova. All'uscita della camera, il flusso di gas è purificato da un'unità di adsorbimento. 1.5.6.3. Procedimento La sostanza di prova è distribuita sotto forma di strato omogeneo su un piatto di vetro ruvido. Qualora la sostanza sia solida, il piatto è bagnato in modo uniforme con una soluzione della sostanza in un opportuno solvente ed è poi asciugato in atmosfera inerte. Il piatto così ricoperto è sospeso in un analizzatore termogravimetrico, che misura la perdita di peso in modo continuo in funzione del tempo. La velocità di evaporazione vT ad una determinata temperatura è calcolata dalla perdita di peso Δm del piatto del campione mediante la formula dove F è l'area superficiale dello strato della sostanza di prova, che solitamente corrisponde all'area superficiale del piatto del campione, mentre t è il tempo durante il quale è osservata la perdita di peso Δm. La tensione di vapore pT è calcolata in funzione della velocità di evaporazione vT: Log pT = C + D log vT dove C e D sono costanti specifiche del dispositivo sperimentale utilizzato che dipendono dal diametro della camera di misura e dalla velocità del flusso del gas. Tali costanti devono essere stabilite una volta per tutte misurando una serie di composti di cui si conosce la tensione di vapore e mediante regressione del logaritmo log pT vs. log vT (11)(21)(22). La relazione tra la tensione di vapore pT e la temperatura T in kelvin è data da Log pT = A + B 1/T dove A e B sono costanti ricavate mediante regressione del logaritmo log pT vs. 1/T. Questa equazione permette di estrapolare la tensione di vapore a qualsiasi altra temperatura. 1.5.7. Metodo di saturazione del gas (23) 1.5.7.1. Principio Un flusso di gas inerte, di cui si conosce la portata, viene fatto passare a temperatura ambiente sopra o attraverso un campione della sostanza di prova a velocità sufficientemente ridotta da assicurare la saturazione. È determinante che si raggiunga la saturazione nella fase gassosa. La sostanza trasportata è intrappolata, solitamente mediante un adsorbente; se ne determina poi la quantità. In alternativa all'uso di trappole adsorbenti ed alla successiva analisi, è possibile determinare la quantità di sostanza trasportata mediante tecniche analitiche a flusso continuo, quali la gascromatografia. La tensione di vapore è calcolata partendo dall'ipotesi che sia soddisfatta la legge dei gas ideali e che la pressione totale di una miscela gassosa sia uguale alla somma delle pressioni esercitate dai singoli gas che la compongono. La pressione parziale della sostanza di prova, ossia la tensione di vapore, è ricavata dal volume complessivo noto del gas e dalla massa del materiale trasportato. Il metodo di saturazione del gas può essere utilizzato sia per sostanze solide che liquide e per valori di tensione di vapore fino a 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Il metodo offre la massima affidabilità per valori inferiori a 103 Pa. Al di sopra di 103 Pa, la tensione di vapore è di solito sovrastimata, probabilmente a causa della formazione di aerosol. Essendo le misure della tensione di vapore effettuate a temperatura ambiente, non occorre estrapolare i dati a temperature elevate, evitando un'operazione che è spesso fonte di gravi errori. 1.5.7.2. Apparecchiatura Il metodo richiede l'impiego di una cassetta mantenuta a temperatura costante. Lo schema riportato in figura 8 mostra una cassetta dotata di tre portacampioni per solidi e di altrettanti portacampioni per liquidi, tale da consentire l’analisi in triplo di un campione liquido o solido. La temperatura è controllata con una tolleranza pari a ±0,5 °C o inferiore. Figura 8 Generalmente come gas inerte di trasporto è utilizzato l'azoto, ma alle volte può essere richiesto l'impiego di un altro gas (24). Il gas vettore deve essere secco. Il flusso di gas, ripartito in sei flussi regolati da valvole ad ago (aventi un foro di circa 0,79 mm) entra nella cassetta attraverso un tubo di rame avente un diametro interno di 3,8 mm. Equilibrata la temperatura, il gas attraversa il campione e la trappola adsorbente, per poi fuoriuscire dalla cassetta. I campioni solidi sono introdotti in un tubo con un diametro interno di 5 mm, tra due strati di lana di vetro (cfr. figura 9). La figura 10 mostra un portacampione per liquidi ed il sistema di adsorbimento. Il modo più riproducibile per misurare la tensione di vapore di liquidi consiste nel ricoprire con uno strato di liquido delle palline di vetro o un materiale adsorbente inerte, quale la silice, con cui riempire il portacampione. In alternativa, è possibile far passare il gas di trasporto in una fritta ruvida ed una bolla attraverso una colonna della sostanza di prova liquida. Figura 9 Figura 10 Il dispositivo di adsorbimento consta di due sezioni adsorbenti: una anteriore ed una posteriore con funzione di riserva. Nel caso di valori di tensione di vapore molto bassi, l'adsorbente trattiene solo piccole quantità. In tal caso l'adsorbimento sulla lana di vetro e sul tubo di vetro nella sezione tra il campione e l'adsorbente può rappresentare un grave problema. Un modo altrettanto efficiente per raccogliere il materiale vaporizzato consiste nell'impiego di trappole raffreddate con CO2 solida. Non producono alcuna contropressione sulla colonna del saturatore ed inoltre consentono con facilità di rimuovere completamente il materiale intrappolato. 1.5.7.3. Procedimento La portata del flusso in uscita del gas di trasporto è misurata a temperatura ambiente. Durante l'esperimento, la portata del flusso deve essere controllata frequentemente per garantire un valore esatto del volume totale del gas di trasporto. È preferibile un controllo continuo mediante un flussimetro di massa. La saturazione della fase gassosa può richiedere un tempo di contatto considerevole, per cui i valori della portata del flusso del gas possono essere alquanto bassi (25). Al termine dell'esperimento, sia la sezione adsorbente anteriore che la sezione di riserva sono analizzate separatamente. Il composto depositato su ciascuna sezione è desorbito aggiungendo un solvente. Le soluzioni così ottenute sono sottoposte ad analisi quantitativa per determinare la massa di sostanza desorbita da ciascuna sezione. La scelta del metodo di analisi (nonché dell'adsorbente, così come del solvente per il desorbimento) dipende dalle caratteristiche del materiale analizzato. L'efficienza del desorbimento è determinata iniettando una quantità nota di campione sull'adsorbente, procedendo quindi al suo desorbimento ed analizzando il quantitativo recuperato. È importante che la verifica dell'efficienza del desorbimento sia effettuata allo stesso livello di concentrazione del campione nelle condizioni di prova, o in prossimità di esso. Per essere sicuri che il gas di trasporto sia saturo della sostanza di prova, sono utilizzate tre diverse portate del flusso. Il gas è ritenuto saturo quando la tensione di vapore calcolata non manifesta alcuna dipendenza dalla portata. La tensione di vapore è calcolata mediante l'equazione: dove: p = tensione di vapore (Pa) W = massa della sostanza di prova evaporata (g) V = volume del gas saturo (m3) R = costante universale dei gas 8,314 (J mol–1 K–1) T = temperatura (K) M = massa molare della sostanza di prova (g mol–1). I volumi misurati devono essere corretti per tenere conto delle differenze di temperatura e pressione tra il flussimetro e il saturatore. 1.5.8. Rotore 1.5.8.1. Principio Questo metodo si avvale di un viscosimetro a rotore, il cui elemento di misura è costituito da una piccola sfera d'acciaio che, sospesa in un campo magnetico, viene fatta ruotare su se stessa da campi rotanti (26)(27)(28). La velocità di rotazione è misurata mediante bobine di trasduzione. Quando la sfera raggiunge una certa velocità di rotazione, solitamente 400 giri al secondo, la fornitura di energia viene interrotta ed ha luogo una decelerazione dovuta all'attrito col gas. La diminuzione della velocità di rotazione è misurata in funzione del tempo. La tensione di vapore è ricavata dal rallentamento del moto della sfera d'acciaio, che è appunto dipendente dalla pressione. L'intervallo di pressione raccomandato è compreso tra 10–4 e 0,5 Pa. 1.5.8.2. Apparecchiatura La strumentazione è illustrata schematicamente in figura 11. La testina di misurazione è collocata in un recipiente termostatato, con una tolleranza di regolazione di 0,1 °C. Il contenitore del campione è posto in un recipiente a parte, anch'esso termostatato con una tolleranza di regolazione di 0,1 °C. Tutte le altre parti dell'apparecchiatura sono tenute ad una temperatura più elevata per impedire la condensazione. L'intera apparecchiatura è collegata ad un sistema per alto vuoto. Figura 11 2. DATI E RELAZIONE 2.1. DATI La tensione di vapore ottenuta mediante uno qualunque dei metodi precedenti deve essere determinata ad almeno due temperature. Per verificare la linearità della curva di tensione di vapore sono preferibili tre o più temperature nell'intervallo tra 0 e 50 °C. Nel caso in cui siano utilizzati i metodi di effusione (cella di Knudsen e termogravimetria isotermica) e di saturazione del gas, sono raccomandati valori di temperatura di misura compresi tra 120 e 150 °C, anziché nell'intervallo 0-50 °C. 2.2. RELAZIONE DELLA PROVA La relazione della prova deve comprendere le seguenti informazioni: — metodo usato, — descrizione precisa della sostanza (identità ed impurezze) ed eventuale stadio preliminare di purificazione, — almeno due valori di tensione di vapore e temperatura — preferibilmente tre o più — richiesti nell'intervallo da 0 a 50 °C (o da 120 a 150 °C), — almeno uno dei due valori di temperatura dovrebbe essere pari o inferiore a 25 °C, se tecnicamente possibile in base al metodo scelto, — tutti i dati originali, — una curva log p contro 1/T, — una stima della tensione di vapore a 20 o 25 °C. Qualora si osservi una transizione (cambiamento di stato, decomposizione), devono essere fornite le informazioni seguenti: — la natura del cambiamento, — la temperatura a cui il cambiamento si verifica a pressione atmosferica, — la tensione di vapore a 10° C e a 20° C al di sotto della temperatura di transizione, nonché a 10° C e a 20° C al di sopra di tale temperatura (a meno che la transizione non consista nel passaggio dallo stato solido allo stato gassoso). Devono essere riportate tutte le informazioni e osservazioni significative ai fini dell'interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurezze e lo stato fisico della sostanza. 3. BIBLIOGRAFIA 1. Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 383 A del 1992, pagg. 26-47. 2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B. e Vodar, B. (a cura di) Butterworths, London. 3. Weissberger R., a cura di (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3a ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. 4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2a ed., Van Nostrand Company, New York. 5. NF T 20-048 AFNOR (settembre 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa — Static method. 6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. 7. NF T 20-047 AFNOR (settembre 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. 8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. 10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532. 11. Tomlin, C.D.S. (a cura di), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). 12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28. 13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269-278. 14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 N. 1 (1987), 117-122. 15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. 16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400. 17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168. 18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31. 19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. 20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512-20. 21. Lide, D.R. (a cura di), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C. 22. Meister, R.T. (a cura di), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). 23. 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC. 24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 26. Messer G., Röhl, P., Grosse G. e Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 27. Comsa G., Fremerey J.K. eLindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. 28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Utilizzando un manometro capacitivo. Appendice Metodo di stima INTRODUZIONE I valori stimati della tensione di vapore possono essere usati: — per decidere quale tra i metodi sperimentali sia appropriato, — per fornire una stima o un valore limite nei casi in cui il metodo sperimentale non possa essere applicato per ragioni tecniche. METODO DI STIMA La tensione di vapore di liquidi e solidi può essere stimata utilizzando la correlazione di Watson modificata (a). L'unico dato sperimentale richiesto è il punto di ebollizione normale. Il metodo può essere applicato nell'intervallo di pressione da 105 Pa a 10–5 Pa. Per informazioni particolareggiate sul metodo si consulti il testo «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (b). Si rinvia inoltre a «OECD Environmental Monograph No.67» (c). PROCEDURA DI CALCOLO La tensione di vapore è calcolata come segue: dove: T = temperatura d'interesse Tb = punto di ebollizione normale PVP = tensione di vapore alla temperatura T ΔHVb = calore di vaporizzazione ΔZb = fattore di comprimibilità (stimato a 0,97) m = fattore empirico dipendente dallo stato fisico alla temperatura d'interesse inoltre, dove KF è un fattore empirico che tiene conto della polarità della sostanza. Per alcuni tipi di composti, i fattori KF sono elencati nel riferimento b). Frequentemente sono disponibili dati per i quali è fornito il punto di ebollizione a pressione ridotta. In tal caso, la tensione di vapore è calcolata nel seguente modo: dove T1 è il punto di ebollizione a pressione ridotta P1. RELAZIONE Qualora si usi il metodo di stima, la relazione deve includere la documentazione completa del calcolo. BIBLIOGRAFIA a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

ALLEGATO II A.22. DIAMETRO GEOMETRICO MEDIO DELLE FIBRE PONDERATO RISPETTO ALLA LUNGHEZZA 1. METODO 1.1. INTRODUZIONE Il presente metodo descrive una procedura che permette di misurare il diametro medio geometrico ponderato rispetto alla lunghezza (DMGPL) di fibre minerali artificiali (FMA). Poiché il DMGPL della popolazione ha una probabilità del 95 % di essere compreso nei limiti di confidenza al 95 % (DMGPL ± due errori standard) del campione, il valore riportato (valore di prova) costituirà il limite inferiore di confidenza al 95 % del campione (cioè DMGPL — 2 errori standard). Il presente metodo si basa sull’aggiornamento di una bozza (del giugno 1994) di procedura concordata tra industria e HSE approvata nel corso di una riunione tra la ECFIA e la HSE a Chester il 26 settembre 1993 e sviluppata per e sulla base di un secondo confronto interlaboratoriale (1, 2). Questo metodo di misurazione può essere utilizzato per caratterizzare il diametro delle fibre di sostanze in massa o di prodotti contenenti FMA, comprese fibre ceramiche refrattarie (FCR), fibre vetrose artificiali (FVA) e fibre cristalline e policristalline. La ponderazione in base alla lunghezza permette di compensare gli effetti sulla distribuzione del diametro dovuti alla rottura delle fibre lunghe durante il campionamento o la manipolazione del materiale. Per misurare la distribuzione dei diametri delle FMA sono utilizzate statistiche geometriche (media geometrica), giacché tali diametri hanno una distribuzione prossima alla distribuzione lognormale. La misurazione della lunghezza e del diametro è un'operazione noiosa e lunga ma, se sono misurate solo le fibre in contatto con una linea infinitamente sottile del campo di visione del microscopio elettronico a scansione (SEM), la probabilità di selezionare una determinata fibra è proporzionale alla sua lunghezza. Poiché questo metodo tiene conto della lunghezza nei calcoli di ponderazione in base alla lunghezza, l’unica misurazione necessaria è quella del diametro, mentre il DMGPL-2ES può essere calcolato come descritto. 1.2. DEFINIZIONI Particella: Oggetto il cui rapporto lunghezza/larghezza è inferiore a 3:1. Fibra: Oggetto il cui rapporto lunghezza/larghezza (rapporto di allungamento) è di almeno 3:1. 1.3. SCOPO E LIMITAZIONI Questo metodo è inteso ad esaminare la distribuzione dei diametri aventi un valore mediano compreso tra 0,5 e 6 µm. I diametri superiori possono essere misurati utilizzando ingrandimenti inferiori del SEM, ma questo metodo tende ad essere sempre più limitato man mano che la distribuzione dimensionale delle fibre diventa più fine. Per contro, se il diametro mediano è inferiore a 0,5 µm si raccomanda di eseguire le misurazioni con un microscopio elettronico a trasmissione (MET). 1.4. PRINCIPIO DEL METODO DI PROVA Un certo numero di campioni rappresentativi sono prelevati da un materassino (o feltro) di fibre oppure da fibre sciolte in massa. La lunghezza delle fibre in massa è ridotta per compressione, quindi un subcampione rappresentativo è disperso in acqua. Ne vengono estratte delle aliquote, che sono filtrate tramite un filtro in policarbonato con pori di 0,2 µm, prima di essere preparate per l'esame con la tecnica di microscopia elettronica a scansione (SEM). I diametri delle fibre sono misurati con un ingrandimento dello schermo di 10 000 × o maggiore (1) utilizzando il metodo della linea trasversale, in modo da ottenere una stima non distorta del diametro medio. L'intervallo inferiore di confidenza al 95 % (sulla base di un test unilaterale) è calcolato per ottenere una stima del valore minimo del diametro medio geometrico delle fibre del materiale. 1.5. DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA 1.5.1. Sicurezza/precauzioni L'esposizione del personale alle fibre in sospensione nell'atmosfera deve essere ridotta al minimo, e devono essere utilizzate una cappa d'aspirazione o un glove box in occasione della manipolazione delle fibre allo stato secco. Per determinare l'efficacia dei metodi di controllo dovranno essere eseguiti controlli periodici dell'esposizione del personale. In occasione della manipolazione delle FMA, il personale dovrà indossare guanti monouso per ridurre i rischi d'irritazione cutanea ed evitare qualsiasi contaminazione incrociata. 1.5.2. Apparecchiatura/attrezzatura — Presse e matrici (capaci di produrre 10 MPa). — Filtri in policarbonato a pori capillari di 0,2 µm (25 mm di diametro). — Filtro a membrana in esteri misti di cellulosa (EMC) con porosità di 5 µm da utilizzare come filtro di supporto. — Apparecchio di filtrazione in vetro (o sistemi di filtrazione monouso) disegnati per filtri di 25 mm di diametro (per esempio, kit di micro-analisi in vetro Millipore n. XX10 025 00). — Acqua distillata di recente e filtrata attraverso un filtro con porosità di 0,2 µm per eliminare i microrganismi. — Sistema di ricoprimento tramite bombardamento catodico (sputter coater) con sorgente in oro o oro/palladio. — Microscopio elettronico a scansione con una risoluzione che può scendere fino a 10 nm ed un ingrandimento 10 000 ×. — Varie: spatole, lama di bisturi di tipo 24, piccole pinze, supporti (stubs) per SEM, adesivo o nastro adesivo al carbonio, argento colloidale. — Sonda ultrasonica o bagno a ultrasuoni da laboratorio — Una sonda di carotaggio, per prelevare campioni nei materassini (o feltri) di FMA 1.5.3. Procedura 1.5.3.1. Campionamento Per materassini o feltri, si utilizza una sonda di carotaggio da 25 mm per prelevare campioni dall’intero spessore. I prelievi devono essere effettuati ad intervalli uguali su tutta l’ampiezza di una porzione ridotta di tessuto o in zone scelte in modo casuale, se sono disponibili materiali di maggiore lunghezza. La stessa attrezzatura può essere utilizzata per estrarre campioni casuali dalle fibre sciolte. Ove possibile, dovrebbero essere prelevati sei campioni in modo da riflettere le variazioni spaziali nel materiale in massa. I sei campioni devono essere compressi in una pressa da 50 mm di diametro ad una pressione di 10 MPa. Il materiale viene successivamente mescolato con una spatola e compresso di nuovo a 10 MPa. Quindi il materiale viene tolto dalla pressa e conservato in una bottiglia in vetro a chiusura ermetica. 1.5.3.2. Preparazione del campione Se necessario, i leganti organici possono essere eliminati mettendo il campione in muffola a 450 °C per circa un'ora. Utilizzare sistemi di partizione e quartatura per suddividere il campione (l'operazione deve essere realizzata all'interno di una cappa aspirante per polveri). Con una spatola, aggiungere una piccola quantità (< 0,5 g) di campione a 100 ml di acqua distillata di recente e filtrata per mezzo di un filtro a membrana da 0,2 µm (può essere utilizzata acqua ultrapura di diversa origine, a condizione che sia di qualità soddisfacente). Disperdere accuratamente con una sonda ultrasonica a 100 W, regolata in modo da produrre cavitazione. (Se non si dispone di sonda, si utilizzi il metodo seguente: agitare ed invertire ripetutamente per 30 secondi; sottoporre ad ultrasuoni in un bagno ad ultrasuoni da laboratorio per cinque minuti: quindi agitare e invertire ripetutamente per altri 30 secondi). Immediatamente dopo la dispersione delle fibre, prelevare un certo numero di aliquote (per esempio, tre aliquote di 3, 6 e 10 ml) per mezzo di una pipetta ad imboccatura larga (capacità di 2-5 ml). Filtrare sotto vuoto ciascuna aliquota per mezzo di un filtro in policarbonato da 0,2 µm sostenuto da un filtro di supporto in EMC con porosità di 5 µm, utilizzando un imbuto di filtrazione in vetro da 25 mm con un serbatoio cilindrico. Porre circa 5 ml d'acqua distillata filtrata nell'imbuto e inserire lentamente nell'acqua le aliquote con l’aiuto di una pipetta, tenendo la punta della pipetta di sotto del menisco. La pipetta ed il serbatoio devono essere accuratamente puliti dopo l’utilizzo giacché le fibre più fini tendono ad aderire di più sulle superfici. Rimuovere delicatamente il filtro e separarlo dal filtro di supporto prima di metterlo ad asciugare in un contenitore. Operando con movimento rotatorio, tagliare una sezione pari alla metà o a un quarto del deposito filtrato con una lama di bisturi di tipo 24. Fissare accuratamente la sezione tagliata sullo stub per il SEM mediante dischetto adesivo al carbonio o collante al carbonio. L’argento colloidale deve essere applicato almeno in tre punti per migliorare il contatto elettrico tra i bordi del filtro e lo stub. Quando l'adesivo/l’argento colloidale è asciutto, ricoprire la superficie del deposito per mezzo dello sputter coater con uno strato di circa 50 nm d'oro o d'oro/palladio. 1.5.3.3. Taratura e funzionamento del SEM 1.5.3.3.1. Taratura La taratura del SEM deve essere verificata almeno una volta alla settimana (idealmente una volta al giorno) per mezzo di una griglia di taratura certificata. I valori della taratura devono essere confrontati con uno standard certificato e se il valore misurato (SEM) non rientra entro ±2 % del valore certificato, la taratura con il SEM deve essere aggiustata e ricontrollata. Il SEM deve essere in grado di fornire una risoluzione tale da rendere visibile almeno un diametro minimo di 0,2 µm, utilizzando un campione in matrice reale con un ingrandimento di 2 000 ×. 1.5.3.3.2. Modalità operative Il SEM deve essere utilizzato con un ingrandimento di 10 000 (2) in condizioni che offrono una buona risoluzione ed un'immagine accettabile a velocità di scansione ridotta (per esempio, 5 secondi per schermo). Benché le condizioni operative possano variare da un SEM all’altro, per ottenere la migliore visibilità e risoluzione possibile con materiali di peso atomico relativamente basso, occorre utilizzare in generale tensioni d'accelerazione di 5-10 keV con una dimensione dello spot ridotta ed una distanza minima. Quando si applica il metodo della linea trasversale, occorre utilizzare un tilt di 0o per ridurre al minimo la necessità di rimessa a fuoco o, se il SEM ha una base eucentrica, utilizzare la distanza di lavoro eucentrica. Un ingrandimento inferiore può essere utilizzato se il materiale non contiene fibre di piccolo diametro ma fibre con diametri più grandi (> 5 µm). 1.5.3.4. Misurazione 1.5.3.4.1. Esame a debole ingrandimento per valutare il campione Inizialmente, il campione deve essere esaminato con un debole ingrandimento per verificare l’esistenza di agglomerati di grandi fibre e per determinare la densità delle fibre. In caso di eccessiva agglomerazione, si raccomanda di preparare un nuovo campione. Per garantire l'accuratezza delle statistiche, occorre misurare un numero minimo di fibre. È preferibile una densità elevata di fibre, giacché l'esame di campi vuoti richiede tempo e non contribuisce all'analisi. Tuttavia, se il filtro è sovraccarico, può diventare difficile dimensionare tutte le fibre misurabili. Inoltre, le fibre più piccole potrebbero passare inosservate perché nascoste da quelle più grandi. Una densità delle fibre superiore a 150 fibre per millimetro lineare trasversale può comportare una sopravvalutazione del DMGPL. D'altra parte, basse concentrazioni di fibre aumentano il tempo d'analisi. È inoltre spesso più efficiente in termine di costi preparare un campione di una densità vicina al valore ottimale, piuttosto che contare filtri a bassa concentrazione. La densità di fibre ottimale deve corrispondere ad una media di circa una o due fibre conteggiabili per campo visivo ad un ingrandimento di 5 000 ×. Tuttavia, poiché la densità ottimale dipende dalla dimensione (diametro) delle fibre, l'operatore dovrà decidere in base alla propria esperienza se la densità delle fibre è vicina al valore ottimale. 1.5.3.4.2. Ponderazione in base alla lunghezza dei diametri delle fibre Solo le fibre che toccano (o attraversano) una linea (infinitamente) sottile tracciata sullo schermo del SEM sono contate. Per questo motivo viene tracciata una linea orizzontale (o verticale) attraverso il centro dello schermo. In alternativa, si può fissare un unico punto al centro dello schermo e procedere ad una scansione continua in una sola direzione attraverso il filtro. Si misura e registra il diametro di qualsiasi fibra il cui rapporto tra lunghezza e diametro è superiore a 3:1 e che tocca o incrocia tale punto. 1.5.3.4.3. Misurazione delle fibre Si raccomanda di misurare almeno 300 fibre. Ogni fibra è misurata una sola volta, nel punto d'intersezione con la linea o con il punto tracciato sullo schermo (o vicino al punto d'intersezione se i bordi della fibra sono nascosti). Se sono presenti fibre di sezione variabile, deve essere utilizzata una misura rappresentativa del diametro medio della fibra. Si dovrà prestare la massima cura nella definizione del bordo e nella misurazione della distanza più breve tra i bordi delle fibre. La misura può essere fatta direttamente o su immagini o fotografie registrate. Si raccomanda di utilizzare sistemi di misura d'immagine semiautomatici che trasferiscono direttamente i dati in un foglio di calcolo, giacché tale procedimento permette di guadagnare tempo, di evitare errori di trascrizione e di automatizzare i calcoli. Le estremità delle fibre lunghe devono essere verificate con un ingrandimento più debole per assicurare che non ritornino nel campo di visione in cui è effettuata la misurazione e che siano misurate una sola volta. 2. DATI 2.1. TRATTAMENTO DEI RISULTATI In generale, i diametri delle fibre non hanno una distribuzione normale. È tuttavia possibile ottenere una distribuzione che si avvicina a quella normale effettuando una trasformazione logaritmica. Calcolare la media aritmetica (media lnD) e la deviazione standard (DSlnD) dei valori logaritmici in base e (lnD) dei diametri (D) delle n fibre. (1) (2) La deviazione standard è divisa per la radice quadrata del numero di misurazioni effettuate (n) per ottenere l’errore standard (ESlnD). (3) Sottrarre due volte l’errore standard dalla media e calcolare l'esponenziale di questo valore (media meno due errori standard) per ottenere la media geometrica meno due errori standard geometrici. (4) 3. RELAZIONE SULL’ESECUZIONE DELLA PROVA RAPPORTO DI PROVA Il rapporto di prova conterrà almeno le informazioni seguenti: — Il valore del DMGPL -2ES. — Tutte le eventuali modifiche procedurali, in particolare quelle che rischiano di influire sulla precisione e l'affidabilità dei risultati, nonché le relative giustificazioni. 4. BIBLIOGRAFIA 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett e G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) questo valore d’ingrandimento è indicato per le fibre con diametri intorno a 3 µm. Per le fibre con diametro di 6 µm può essere più adatto un ingrandimento di 5 000 ×. (2) Per fibre da 3 µm, cfr. la nota precedente.

ALLEGATO III B.46. IRRITAZIONE CUTANEA IN VITRO: TEST SU UN MODELLO DI EPIDERMIDE UMANA RICOSTITUITA 1. METODO 1.1. INTRODUZIONE Per irritazione cutanea si intende la comparsa di lesioni reversibili della pelle in seguito all’applicazione della sostanza di prova per un massimo di 4 ore (secondo la definizione del Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals — Sistema generale armonizzato di classificazione e di etichettatura dei prodotti chimici (GHS) delle Nazioni Unite) (1). Il presente metodo propone una procedura in vitro che, in funzione delle informazioni ricercate, può consentire di determinare il potere di irritazione cutanea delle sostanze e costituire un test sostitutivo a sé stante nel quadro di una strategia di prova basata sulla forza probante dei dati disponibili (2). Tradizionalmente, la valutazione dell’irritazione cutanea implicava il ricorso ad animali di laboratorio (cfr. metodo B.4) (3). Per via delle preoccupazioni legate al benessere degli animali, il metodo B.4 consente di determinare la corrosione/irritazione cutanea tramite una strategia di prova sequenziale, ricorrendo a metodi in vitro e ex vivo convalidati, per evitare di causare sofferenze agli animali. Tre metodi o linee guida per i test in vitro convalidati [B.40, B.40bis e TG 435 (4, 5, 6)] sono utili per la parte volta a determinare la corrosività nella strategia di prova sequenziale proposta dal metodo B.4. Il presente metodo di prova si basa su modelli di epidermide umana ricostituita che riproducono fedelmente le proprietà biochimiche e fisiologiche degli strati superiori della pelle umana (l’epidermide) nella struttura generale (uso di cheratinociti prelevati da epidermide umana come origine per le cellule, tessuto e citoarchitettura rappresentativi). La procedura descritta qui consente di individuare il rischio di sostanze irritanti corrispondenti alla categoria 2 del sistema GHS. Il presente metodo è costituito inoltre da un insieme di standard di prestazione per la valutazione di metodi simili basati su epidermide umana ricostituita o di varianti di tali metodi (7). Sono stati svolti studi di prevalidazione, ottimizzazione e validazione per due metodi di prova in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) disponibili sul mercato con le denominazioni EpiSkin™ ed EpiDerm™, utilizzando modelli di epidermide umana ricostituita. Questi riferimenti si sono basati sulla frase di rischio R 38. Alcuni aspetti del nuovo calcolo ai fini del sistema GHS sono riportati alla voce 25 della bibliografia. I metodi che presentano prestazioni equivalenti a quelle del metodo EpiSkin™ (metodo di riferimento convalidato 1) sono raccomandati come test a sé stanti per sostituire i test in vivo sui conigli ai fini della classificazione delle sostanze irritanti appartenenti alla categoria 2 del sistema GHS. I metodi che presentano prestazioni equivalenti a quelle del metodo EpiDerm™ (metodo di riferimento convalidato 2) sono raccomandati solo come test di screening o nel quadro di una strategia di test sequenziali basati sulla forza probante dei dati disponibili, per classificare le sostanze irritanti appartenenti alla categoria 2 del sistema GHS. Prima di poter utilizzare a fini normativi un test basato su un modello di epidermide umana ricostituita in vitro proposto per la valutazione dell’irritabilità cutanea, occorre determinarne l’affidabilità, la pertinenza (accuratezza) e i limiti per l’uso proposto, al fine di assicurare che il test sia comparabile con il metodo di riferimento convalidato 1 come previsto dagli standard di prestazione definiti nel presente metodo (cfr. appendice). Due ulteriori metodi in vitro basati sull’epidermide umana ricostituita sono stati convalidati conformemente ai requisiti previsti dal presente metodo e danno risultati simili al metodo di riferimento convalidato 1 (18). Si tratta del metodo EpiDerm™ modificato (metodo di riferimento modificato 2) e del metodo SkinEthic RHE™ (metodo strutturalmente analogo 1). 1.2. DEFINIZIONI Ai fini del presente metodo di prova valgono le seguenti definizioni: Accuratezza: grado di concordanza tra i risultati ottenuti con il metodo e i valori di riferimento comunemente accettati. È una misura dell’efficienza del metodo di prova e un aspetto della pertinenza. Il termine è usato spesso in modo intercambiabile con «concordanza» per indicare la proporzione di risultati corretti di un metodo di prova. Sostanza di controllo del lotto: sostanza di riferimento che induce una vitalità cellulare media del tessuto. Vitalità cellulare: parametro che misura l’attività totale in una popolazione di cellule, per esempio la capacità delle deidrogenasi mitocondriali cellulari di ridurre il colorante vitale MTT [bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ile)-2,5-difeniltetrazolio, tiazolil blu] che, in funzione del parametro misurato e del tipo di test utilizzato, corrisponde al numero totale e/o alla vitalità delle cellule viventi. ET50 : tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità cellulare del 50 % in seguito all’applicazione del marcatore ad una concentrazione specifica e fissa; vedi anche IC50. Percentuale di falsi negativi: percentuale di tutte le sostanze positive falsamente identificate come negative da un metodo di prova. È un indicatore dell’efficienza del metodo. Percentuale di falsi positivi: percentuale di tutte le sostanze negative (non attive) falsamente identificate come positive. È un indicatore dell’efficienza del metodo di prova. Dose infinita: quantità di sostanza in esame applicata alla cute che supera la quantità necessaria per coprire in maniera completa e uniforme la superficie cutanea. GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals): sistema di classificazione delle sostanze e miscele secondo tipi standardizzati e livelli di rischio fisico, sanitario e ambientale, che elabora i relativi elementi di comunicazione, quali pittogrammi, avvertenze, indicazioni di pericolo, consigli di precauzioni e schede informative di sicurezza, per trasmettere informazioni sugli effetti avversi di dette sostanze a tutela delle persone (compresi datori di lavoro, lavoratori, trasportatori, consumatori e personale di pronto intervento) e dell’ambiente (1); il sistema è attuato nell’UE dal regolamento (CE) n. 1272/2008. IC50 : concentrazione alla quale un marcatore riduce la vitalità dei tessuti del 50 % (IC50) dopo un tempo di esposizione fisso; cfr. anche ET50. Standard di prestazione: standard basati su un metodo di riferimento convalidato, che consentono di valutare la comparabilità di un metodo proposto simile sotto il profilo strutturale e funzionale. Detti standard comprendono a) i componenti essenziali del metodo, b) un elenco minimo di sostanze di riferimento scelte tra le sostanze utilizzate per dimostrare l’accettabilità delle prestazioni del metodo di riferimento convalidato e c) in funzione dei risultati ottenuti con il metodo di riferimento convalidato, i livelli comparabili di accuratezza e affidabilità che il metodo proposto dovrebbe ottenere quando viene valutato utilizzando l’elenco minimo di sostanze di riferimento. Affidabilità: misura in cui un metodo può essere riprodotto nel tempo all’interno dello stesso laboratorio o da laboratori diversi utilizzando il medesimo protocollo. È valutata calcolando la riproducibilità intra-laboratorio e inter-laboratorio. Sensibilità: proporzione di tutte le sostanze positive/attive correttamente classificate dal test. Misura l’accuratezza di un metodo di prova che produce risultati ordinabili in categorie ed è un elemento importante per valutare la pertinenza di un metodo. Specificità: proporzione di tutte le sostanze negative/inattive correttamente classificate dal test. Misura l’accuratezza di un metodo di prova che produce risultati ordinabili in categorie ed è un elemento importante per valutare la pertinenza di un metodo. Irritazione cutanea: comparsa di danni reversibili sulla pelle a seguito dell’applicazione della sostanza di prova per una durata massima di 4 ore. L’irritazione cutanea è una reazione locale, non immunogenica, che si manifesta poco dopo la stimolazione (24). Si caratterizza essenzialmente per la reversibilità del processo, che comprende reazioni infiammatorie e la maggior parte dei segni clinici caratteristici dell’irritazione (eritema, edema, prurito e dolore) associati al processo infiammatorio. 1.3. CAMPO DI APPLICAZIONE E LIMITI Uno dei limiti dei test sui modelli di epidermide umana ricostituita che appartengono a questo metodo è che tali test si limitano a classificare le sostanze come irritanti per la pelle secondo la categoria 2 del sistema GHS. Poiché non consentono di classificare le sostanze nella categoria opzionale 3 del sistema GHS, tutte le restanti sostanze non vengono classificate (non vengono assegnate ad alcuna categoria). In funzione delle necessità di regolamentazione e dell’eventuale inclusione, in futuro, di nuovi endpoint, del miglioramento o dello sviluppo di nuovi test strutturalmente analoghi, è possibile che questo metodo richieda revisioni. Il presente metodo consente di identificare il rischio di sostanze irritanti mono-componente (19) ma non fornisce informazioni adeguate in merito alla corrosione cutanea. I gas e gli aerosol non possono essere testati e le miscele non sono ancora state oggetto di uno studio di validazione. 1.4. PRINCIPIO DELLA PROVA La sostanza in esame viene applicata localmente ad un modello tridimensionale di epidermide umana ricostituita, composta da cheratinociti normali prelevati da epidermide umana e messi in coltura per formare un modello multistrato, altamente differenziato, di epidermide umana. Il modello è costituito da uno strato basale, uno strato spinoso e uno strato granuloso organizzati e da uno strato corneo multiplo contenente strati di strutture lamellari lipidiche intercellulari disposte in modo analogo a quelle presenti in vivo. Il principio del metodo che utilizza il modello di epidermide umana ricostituita si basa sull’ipotesi che le sostanze irritanti siano in grado di penetrare nello strato corneo per diffusione e siano citotossiche per gli strati cellulari sottostanti. La vitalità cellulare è misurata tramite conversione ad opera delle deidrogenasi del colorante vitale MTT [bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ile)-2,5-difeniltetrazolio; tiazolil blu, numero EINECS 206-069-5, numero CAS 298-93-1)] in un sale, il blu di formazan, misurato quantitativamente dopo l’estrazione dai tessuti (20). Le sostanze irritanti sono identificate per la loro capacità di diminuire la vitalità cellulare al di sotto di determinati livelli soglia (ossia ≤ 50 % per gli irritanti appartenenti alla categoria 2 del sistema GHS). Le sostanze che danno vitalità cellulare superiore al livello soglia definito non saranno classificate (> 50 %: senza categoria). I sistemi basati su modelli di epidermide umana ricostituita possono essere utilizzati per testare solidi, liquidi, semi-solidi e cere. I liquidi possono essere acquosi o non acquosi e i solidi possono essere solubili o insolubili in acqua. Quando possibile, i solidi dovrebbero essere testati sotto forma di polvere fine. Poiché nei sistemi di test basati su modelli di epidermide umana ricostituita sono state incluse 58 sostanze accuratamente selezionate che rappresentano un ampio spettro di classi chimiche, dovrebbe essere possibile applicare i metodi in modo generale a tutte le classi chimiche (16). La convalida comprende gli irritanti appartenenti alla categoria 2 del sistema GHS. Va notato che gli acidi non corrosivi, le basi, i sali e altre sostanze inorganiche non sono stati inseriti nella convalida e alcune classi note di irritanti organici come gli idroperossidi, i fenoli e i tensioattivi non sono stati inclusi o lo sono stati solo parzialmente. 1.5. DIMOSTRAZIONE DEL RENDIMENTO Prima di utilizzare sistematicamente un metodo convalidato conforme al presente metodo di prova, è consigliabile che i laboratori ne verifichino il rendimento tecnico utilizzando le 10 sostanze elencate nella tabella 1. Per questo metodo, la categoria opzionale 3 del sistema GHS non corrisponde a nessuna categoria. Per metodi nuovi strutturalmente analoghi messi a punto conformemente a questo metodo, simili dal punto di vista strutturale e funzionale ai metodi di riferimento convalidati, o per modifiche di metodi convalidati, occorre applicare gli standard di prestazione descritti in appendice per dimostrare che il nuovo metodo ha affidabilità e accuratezza comparabili prima di utilizzarlo a fini regolamentari. Tabella 1 Sottoinsieme delle sostanze di riferimento elencate in appendice per la verifica del rendimento Sostanza Numero CAS Punteggio in vivo Stato fisico Categoria GHS acido 1-naftalenacetico 86-87-3 0 S Nessuna cat. isopropanolo 67-63-0 0,3 L Nessuna cat. stearato di metile 112-61-8 1 S Nessuna cat. butirrato di eptile 5870-93-9 1,7 L Cat. 3 opzionale salicilato di esile 6259-76-3 2 L Cat. 3 opzionale aldeide ciclamenica 103-95-7 2,3 L Cat. 2 1-bromoesano 111-25-1 2,7 L Cat. 2 metacrilato di butile 97-88-1 3 L Cat. 2 1-metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 3,3 S Cat. 2 eptanale 111-71-7 4 L Cat. 2 1.6. DESCRIZIONE DEL METODO Nei punti seguenti sono descritte le componenti e il protocollo di un test su modello di epidermide umana ricostituita per la valutazione del potere di irritazione cutanea. Il modello può essere costruito, preparato o acquistato sul mercato (per esempio EpiSkin™, EpiDerm™ e SkinEthic RHE™). I protocolli dei metodi standard per i modelli EpiSkin™, EpiDerm™ e SkinEthic RHE™ sono disponibili sul sito [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu](21, 22, 23). I test devono essere svolti come descritto di seguito. 1.6.1. Componenti del modello di epidermide umana ricostituita 1.6.1.1. Condizioni generali del modello Per costruire l’epitelio devono essere utilizzati cheratinociti normali di origine umana. Devono essere presenti molteplici strati di cellule epiteliali vitali (strato basale, strato spinoso, strato granuloso) sotto uno strato corneo funzionale. Lo strato corneo deve presentare molteplici strati con il profilo lipidico necessario per costituire una barriera funzionale solida capace di resistere alla penetrazione rapida dei marcatori citotossici, per esempio sodio dodecil solfato (SDS) o Triton X-100. La funzione di barriera può essere valutata determinando la concentrazione alla quale un marcatore riduce la vitalità dei tessuti del 50 % (IC50) dopo un tempo di esposizione fisso oppure determinando il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità cellulare del 50 % (ET50) dopo l’applicazione del marcatore ad una concentrazione fissa predeterminata. Le proprietà di contenimento del modello devono essere tali da impedire il passaggio delle sostanze presenti attorno allo strato corneo verso i tessuti vitali, che inciderebbe negativamente sulla qualità della modellizzazione dell’esposizione cutanea. Il modello di pelle umana non deve essere stato contaminato da batteri, virus, micoplasmi o funghi. 1.6.1.2. Condizioni funzionali del modello 1.6.1.2.1. Vitalità La vitalità viene determinata di preferenza tramite un test basato sull’MTT (20). La densità ottica (OD) del colorante estratto (solubilizzato) dal tessuto trattato con il controllo negativo (NC) deve essere almeno 20 volte superiore alla densità ottica del solo solvente di estrazione. Il tessuto trattato con il controllo negativo deve essere stabile in coltura (ossia deve presentare misure di vitalità simili) nel corso del periodo di esposizione. 1.6.1.2.2. Funzione barriera Lo strato corneo e la relativa composizione lipidica devono essere sufficienti per resistere alla penetrazione rapida dei marcatori citotossici, come SDS o Triton X-100, valutata tramite i fattori IC50 o ET50. 1.6.1.2.3. Morfologia L’esame istologico della cute/epidermide ricostituita deve essere svolto da personale adeguatamente qualificato che dimostrerà che la struttura è analoga all’epidermide/pelle umana (compreso lo strato corneo multiplo). 1.6.1.2.4. Riproducibilità I risultati del metodo su un dato modello devono mostrare la riproducibilità nel tempo, preferibilmente per mezzo di un’adeguata sostanza del lotto di controllo (benchmark) (cfr. appendice). 1.6.1.2.5. Controlli di qualità (QC) del modello Ogni lotto del modello di epidermide utilizzato deve rispettare determinati criteri di fabbricazione, i più rilevanti dei quali sono quelli relativi alla vitalità (punto 1.6.1.2.1) e alla funzione di barriera (punto 1.6.1.2.2). È opportuno che il fornitore del modello di cute (o il ricercatore qualora si usi un modello prodotto internamente) stabilisca un intervallo di accettabilità (limite superiore e inferiore) per i valori di IC50 o di ET50. Le proprietà di barriera dei tessuti devono essere verificate dal laboratorio dopo aver ricevuto i tessuti. Per una previsione affidabile degli effetti irritanti possono essere considerati accettabili solo i risultati ottenuti con tessuti idonei. A titolo di esempio, nella tabella seguente sono riportati gli intervalli di accettabilità per i metodi di riferimento convalidati. Tabella 2 Esempi di criteri di QC dei lotti Limite di accettabilità inferiore Intervallo di accettabilità medio Limite di accettabilità superiore Metodo di riferimento convalidato 1 (trattamento di 18 ore con SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Metodo di riferimento convalidato 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 ore ET50 = 6,7 ore ET50 = 8,7 ore 1.6.1.3. Applicazione delle sostanze di prova e delle sostanze di controllo Per ogni trattamento e per i controlli deve essere utilizzato un numero sufficiente di repliche di tessuto (almeno tre repliche per prova). Per le sostanze sia liquide che solide occorre applicare una quantità sufficiente della sostanza in esame fino a coprire uniformemente la superficie cutanea evitando nel contempo una dose infinita (cfr. punto 1.2 «Definizioni»), ossia un minimo di 25 μl/cm2 o 25 mg/cm2. Per le sostanze solide, la superficie dell’epidermide deve essere inumidita con acqua deionizzata o distillata prima dell’applicazione, al fine di garantire un buon contatto con la pelle. Quando possibile, i solidi dovrebbero essere testati sotto forma di polvere fine. Al termine del periodo di esposizione, la sostanza di prova deve essere tolta con cura dalla superficie cutanea utilizzando un tampone acquoso o NaCl allo 0,9 %. In funzione del modello di epidermide umana ricostituita utilizzato, il periodo di esposizione può variare da 15 a 60 minuti e la temperatura di incubazione da 20° a 37 °C. Per maggiori dettagli, consultare le procedure operative standard per i tre metodi (21, 22, 23). Occorre utilizzare simultaneamente controlli negativi (NC) e controlli positivi (PC) per ogni studio al fine di dimostrare che la vitalità (NC), la funzione di barriera e la conseguente sensibilità del tessuto (PC) rientrano in un intervallo di accettabilità storico determinato. La sostanza PC consigliata è una soluzione acquosa di SDS al 5 %. Le sostanze NC consigliate sono acqua o un tampone fosfato salino (PBS). 1.6.1.4. Misurazione della vitalità cellulare L’elemento più importante del protocollo di prova è che le misure della vitalità non siano svolte immediatamente dopo l’esposizione alle sostanze in esame bensì dopo un periodo di incubazione post-trattamento sufficientemente lungo dei tessuti risciacquati in un mezzo fresco. Questo periodo consente sia il recupero da effetti irritanti blandi sia la comparsa di effetti citotossici evidenti. Durante la fase di ottimizzazione del test (9, 10, 11, 12, 13) è risultato ottimale un periodo di incubazione post-trattamento di 42 ore, che è quindi stato utilizzato per la validazione dei metodi di riferimento. Il saggio di conversione con MTT è un metodo quantitativo convalidato che dovrebbe essere utilizzato per misurare la vitalità cellulare. È compatibile con l’utilizzo in un modello tridimensionale di tessuto. Il campione di pelle è inserito in una soluzione MTT alla concentrazione adeguata (per esempio, 0,3-1 mg/ml) per 3 ore. Il precipitato di formazan blu che si forma è successivamente estratto dal tessuto con solvente (per esempio isopropanolo o con una soluzione isopropanolo/HCl 95:5) e ne viene misurata la concentrazione determinando la densità ottica a 570 nm con una banda passante massima di ±30 nm. Le proprietà ottiche della sostanza in esame o la sua azione chimica sull’MTT potrebbero interferire con la prova, causando una stima errata della vitalità (perché la sostanza in esame potrebbe impedire o annullare la generazione di colore, oltre a causarla). Questo può verificarsi quando una specifica sostanza non viene completamente rimossa dalla pelle con il risciacquo o quando penetra nell’epidermide. Se la sostanza in esame agisce direttamente sull’MTT, è naturalmente colorata o si colora durante il trattamento del tessuto, devono essere utilizzati controlli supplementari per individuare e correggere qualsiasi interferenza della sostanza di prova con la tecnica di misurazione della vitalità. Per una descrizione dettagliata di come testare la riduzione diretta dell’MTT, consultare il protocollo dei metodi di riferimento convalidati (21, 22, 23). Una colorazione non specifica (NSC) dovuta a queste interferenze non deve superare il 30 % del NC (per le correzioni). Se NSC > 30 % la sostanza in esame è considerata incompatibile con il test. 1.6.1.5. Criteri di accettabilità della prova Per ogni prova svolta utilizzando lotti validi (cfr. punto 1.6.1.2.5), i tessuti trattati con controllo negativo (NC) devono mostrare una densità ottica che rifletta la qualità dei tessuti sia dopo le fasi di spedizione e ricezione, sia durante l’appplicazione del protocollo di irritazione. I valori di OD dei controlli non devono essere inferiori ai limiti inferiori storici stabiliti. Allo stesso modo, i tessuti trattati con il controllo positivo (PC), ossia soluzione acquosa di SDS al 5 %, devono riflettere la sensibilità conservata dai tessuti e la loro capacità di rispondere ad una sostanza irritante nelle condizioni di ogni singola prova (per esempio vitalità ≤ al 40 % per il metodo di riferimento convalidato 1 e ≤ 20 % per il metodo di riferimento convalidato 2). È necessario definire misure correlate e adeguate di variabilità tra le repliche di tessuto (per esempio se vengono usate deviazioni standard, devono essere ≤ 18 %). 2. DATI 2.1. DATI Per ciascun trattamento, i dati ottenuti da singole repliche dei campioni in esame (per esempio i valori di OD e le percentuali di vitalità cellulare calcolate per ogni sostanza in esame, compresa la relativa classificazione) sono presentati sotto forma di tabella, compresi i dati delle prove ripetute, secondo le necessità. Sono inoltre registrati, per ogni prova, i valori medi ± la deviazione standard. Per ogni sostanza testata devono essere segnalate le interazioni osservate tra il reagente MTT e le sostanze in esame colorate. 2.2. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I valori di OD ottenuti per ciascun campione di prova possono essere utilizzati per calcolare la percentuale di vitalità rispetto al controllo negativo, il cui valore è fissato al 100 %. Il valore limite della percentuale di vitalità cellulare in base al quale si stabilisce la distinzione tra sostanze irritanti e sostanze non classificate e le procedure statistiche utilizzate per analizzare i risultati e individuare le sostanze irritanti devono essere chiaramente definiti e documentati e deve esserne dimostrata l’idoneità. I valori limite per la previsione di irritazione associata ai metodi di riferimento convalidati sono riportati di seguito. La sostanza in esame è considerata irritante per la pelle conformemente alla categoria 2 del sistema GHS se: i) la vitalità del tessuto dopo l’esposizione e l’incubazione post-trattamento è inferiore o uguale (≤) al 50 %. La sostanza di prova è considerata come priva di categoria se: ii) la vitalità del tessuto dopo l’esposizione e l’incubazione post-trattamento è superiore (>) al 50 %. 3. RELAZIONE 3.1. RELAZIONE SULL’ESECUZIONE DELLA PROVA La relazione deve comprendere i seguenti dati: Sostanze di prova e sostanze di controllo: — denominazioni chimiche, quali i nomi IUPAC o CAS ed il numero CAS, se noto, — purezza e composizione della sostanza (in percentuale ponderale), — proprietà fisico-chimiche pertinenti per la realizzazione dello studio (per esempio natura fisica, stabilità e volatilità, pH e solubilità in acqua, se nota), — trattamento delle sostanze di prova/controllo prima del test, se del caso (per esempio riscaldamento, frantumazione), — condizioni di conservazione. Giustificazione per la scelta del modello di pelle umana e del metodo utilizzati. Condizioni di prova: — sistema cellulare utilizzato, — informazioni sulla taratura dell’attrezzatura di misurazione e sulla banda passante utilizzate per misurare la vitalità cellulare (per esempio spettrofotometro), — informazioni complete sul modello di pelle utilizzato e sulla sua efficienza. Esse dovrebbero includere (elenco non esauriente): i) vitalità; ii) funzione di barriera; iii) morfologia; iv) riproducibilità e predittività; v) controlli di qualità (QC) del modello, — dettagli del protocollo utilizzato, — dosaggi usati per il test, durata dell’esposizione e del periodo di incubazione post-trattamento, — descrizione di qualsiasi modifica del protocollo sperimentale, — riferimenti a dati storici del modello. Essi dovrebbero includere (elenco non esauriente): i) accettabilità dei dati di QC rispetto ai dati storici del lotto; ii) accettabilità dei valori di controllo positivi e negativi rispetto alle medie e agli intervalli di controllo positivi e negativi, — descrizione dei criteri di valutazione utilizzati, compresa la giustificazione per la scelta del valore o dei valori limite per il modello predittivo. Risultati: — presentazione sotto forma di tabella dei dati ottenuti dai campioni di prova individuali, — descrizione di altri effetti osservati. Discussione dei risultati. Conclusioni. 4. BIBLIOGRAFIA 1. Nazioni Unite (UN) (2007), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), seconda edizione, UN New York e Ginevra, 2007. Disponibile all’indirizzo: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Disponibile all’indirizzo: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Metodo B.4. TOSSICITÀ ACUTA: IRRITAZIONE/CORROSIONE CUTANEA. 4. Metodo B. 40. CORROSIONE CUTANEA IN VITRO: TEST DI RESISTENZA ELETTRICA TRANSCUTANEA (TER). 5. Metodo B. 40 BIS. CORROSIONE CUTANEA IN VITRO: TEST SU MODELLI DI PELLE UMANA. 6. OCSE (2006), Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In vitro Membrane Barrier Test Method, adottato il 19 luglio 2006. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation, disponibile alla voce «Download Study Documents» all’indirizzo: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. e Botham, P., (2001), «A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team», Toxicology in vitro 15, pagg. 57-93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. e Roguet, R., (2002), «Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study», Toxicology in vitro 16, pagg. 765-770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. e Spielmann, H., (2004), «Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests», ALTEX 21, pagg. 107-114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. e Spielmann H., (2005), «The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test», ATLA 33, pagg. 351-367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. e G. Rubinsteen, (2005), «The In vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process», ATLA 33, pagg. 329-249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., Van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. e Worth, A., (2002), «Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2», ATLA 30, pagg. 109-129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. e Zuang, V., (2007), «The ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test», ATLA 35, pagg. 559-601. 15. Hoffmann, S. (2006), ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α, 135 pagg. + allegati, disponibile alla voce «Download Study Documents» all’indirizzo: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. e Zuang V., (2007), «ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals», ATLA 35, pagg. 603-619. 17. J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire, (2007), «In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients», AATEX, Special Issue-proceedings from WC6, vol. 14, pagg. 351-358. 18. Dichiarazione ESAC sul test aggiornato EpiDerm e sul test analogo SkinEthic, 5 novembre 2008. 19. CE (2006), Regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un’Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE, Gazzetta ufficiale dell’Unione europea L 396/1 del 30.12.2006, OPOCE, Lussemburgo. 20. Mosman, T., (1983), «Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays», Journal of Immunological Methods 65, pagg. 55-63. 21. EpiSkin™ SOP, versione 1.6 (gennaio 2005), Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals, disponibile alla voce «Download Study Documents» all’indirizzo: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, versione 5.0 (ottobre 2004), Draft Standard Operating Procedure. In vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200, disponibile alla voce «Download Study Documents» all’indirizzo: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP, sarà disponibile alla voce «Download Study Documents» all’indirizzo: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lammintausta, K. Maibach H.I., (1995), «Irritant contact dermatitis» in Guin J.D., Practical Contact Dermatitis, Mc Graw-Hill, New York, pagg. 7-18. 25. Griesinger C., Barroso J. e Zuang V., ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline, Ispra, 13 novembre 2008. Appendice Valutazione delle caratteristiche di prestazione dei modelli di epidermide umana ricostituita in vitro proposti per le prove di irritazione cutanea INTRODUZIONE Le procedure proposte nel quadro del presente metodo devono essere valutate al fine di determinarne l’affidabilità e l’accuratezza utilizzando sostanze che rappresentano l’intervallo completo dei punteggi di irritazione di Draize. I valori di affidabilità e di accuratezza ottenuti con il procedimento proposto utilizzando le 20 sostanze di riferimento consigliate (tabella 2) devono essere confrontabili con quelli ottenuti tramite il metodo di riferimento convalidato 1 (tabella 3) (1). Gli standard di accuratezza e affidabilità che dovrebbero essere raggiunti sono riportati nei punti II e III seguenti. Le sostanze non classificate e classificate (nella categoria 2 del sistema GHS) che rappresentano classi chimiche pertinenti sono incluse affinché i valori relativi all’affidabilità e le prestazioni (sensibilità, specificità, percentuali di falsi positivi, percentuale di falsi negativi e accuratezza) del metodo proposto possano essere confrontati con quelli del metodo di riferimento convalidato 1. Prima di utilizzarlo per esaminare nuove sostanze occorre determinare l’affidabilità del metodo e la sua capacità di individuare correttamente le sostanze irritanti di categoria 2 secondo il sistema GHS. STANDARD DI PRESTAZIONE Gli standard di prestazione sono costituiti da 3 elementi: I) componenti essenziali del metodo, II) sostanze di riferimento e III) valori definiti di accuratezza e affidabilità (2). I presenti standard di prestazione sono basati sugli standard di prestazione definiti dopo il completamento dello studio di validazione internazionale dei metodi di valutazione dell’irritazione cutanea dell’ECVAM (3). I) Componenti essenziali del metodo di prova Condizioni generali del modello Per costruire l’epitelio devono essere utilizzati cheratinociti normali di origine umana. Devono essere presenti molteplici strati di cellule epiteliali vitali (strato basale, strato spinoso, strato granuloso) sotto uno strato corneo funzionale. Lo strato corneo deve presentare a sua volta molteplici strati con il profilo lipidico necessario per costituire una barriera funzionale solida capace di resistere alla penetrazione rapida dei marcatori citotossici, per esempio SDS o Triton X-100. La funzione di barriera può essere valutata determinando la concentrazione alla quale un marcatore riduce la vitalità dei tessuti del 50 % (IC50) dopo un tempo di esposizione fisso oppure determinando il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità cellulare del 50 % (ET50) dopo l’applicazione del marcatore ad una concentrazione fissa predeterminata. Le proprietà di contenimento del modello devono essere tali da impedire il passaggio delle sostanze presenti attorno allo strato corneo verso i tessuti vitali, che inciderebbe negativamente sulla qualità della modellizzazione dell’esposizione cutanea. Il modello di pelle umana non deve essere stato contaminato da batteri, virus, micoplasmi o funghi. Condizioni funzionali del modello Vitalità La vitalità viene determinata di preferenza tramite un test basato sull’MTT (4). La densità ottica (OD) del colorante estratto (solubilizzato) dal tessuto trattato con il controllo negativo (NC) deve essere almeno 20 volte superiore alla OD del solo solvente di estrazione. Occorre documentare che il tessuto trattato con il NC è stabile in coltura (ossia deve presentare misure di vitalità simili) nel corso del periodo di esposizione. Funzione di barriera Lo strato corneo e la relativa composizione lipidica devono essere sufficienti per resistere alla penetrazione rapida dei marcatori citotossici, come SDS o Triton X-100, valutata tramite i fattori IC50 o ET50. Morfologia L’esame istologico della pelle/epidermide ricostituita deve essere svolto da personale adeguatamente qualificato che dimostrerà che la struttura è analoga all’epidermide/pelle umana (compreso lo strato corneo multiplo). Riproducibilità I risultati del metodo su un dato modello devono mostrare la riproducibilità nel tempo, preferibilmente per mezzo di un’adeguata sostanza del lotto di controllo (riferimento) (I) (cfr. punto 1.2, «Definizioni»). Controlli di qualità (QC) del modello Ogni lotto del modello di epidermide utilizzato deve rispettare determinati criteri di fabbricazione, i più rilevanti dei quali sono quelli relativi alla vitalità e alla funzione di barriera. È opportuno che il fornitore del modello della pelle (o il ricercatore qualora si usi un modello prodotto internamente) stabilisca un intervallo di accettabilità (limite superiore e inferiore) per i valori di IC50 o di ET50. Le proprietà di barriera dei tessuti devono essere verificate dal laboratorio dopo aver ricevuto i tessuti. Per una previsione affidabile degli effetti irritanti possono essere considerati accettabili solo i risultati ottenuti con tessuti idonei. A titolo di esempio, nella tabella seguente sono riportati gli intervalli di accettabilità per i metodi di riferimento convalidati. Tabella 1 Esempi di criteri di QC dei lotti Limite di accettabilità inferiore Intervallo di accettabilità medio Limite di accettabilità superiore Metodo di riferimento convalidato 1 (trattamento di 18 ore con SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Metodo di riferimento convalidato 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 ore ET50 = 6,7 ore ET50 = 8,7 ore II) Sostanze di riferimento Le sostanze di riferimento sono impiegate per determinare se l’affidabilità e l’accuratezza di un nuovo metodo di test in vitro su epidermide umana ricostituita, di cui è stata dimostrata la sufficiente similarità ai metodi di riferimento convalidati o che presentava una modifica minore rispetto ad un metodo di riferimento convalidato, sono comparabili all’affidabilità e all’accuratezza del metodo di riferimento convalidato 1 (1). Le 20 sostanze di riferimento elencate nella tabella 2 comprendono le sostanze che rappresentano diverse classi chimiche di interesse e sostanze classificate nella categoria 2 del sistema GHS. Le sostanze incluse nell’elenco comprendono 10 sostanze appartenenti alla categoria 2, 3 sostanze appartenenti alla categoria opzionale 3 del sistema GHS e 7 sostanze non classificate. Per questo metodo, la categoria 3 del sistema GHS non corrisponde a nessuna categoria. Tali sostanze di riferimento rappresentano il numero minimo di sostanze da utilizzare per valutare l’accuratezza e l’affidabilità di un metodo di prova proposto per valutare l’irritabilità cutanea su epidermide umana ricostituita. Nelle situazioni in cui una delle sostanze elencate non sia disponibile, possono essere utilizzate altre sostanze per le quali esistano adeguati dati di riferimento in vivo. Facoltativamente, è possibile aggiungere all’elenco minimo di sostanze di riferimento altre sostanze che rappresentano classi chimiche diverse e per le quali sono disponibili adeguati dati di riferimento in vivo al fine di valutare più approfonditamente l’accuratezza del metodo proposto. Tabella 2 Sostanze di riferimento per la determinazione dei valori di accuratezza e affidabilità dei modelli di epidermide umana ricostituita per la valutazione dell’irritabilità cutanea Sostanza (1) N. CAS N. EINECS Stato fisico Punteggio in vivo Cat. GHS in vitro Cat. GHS in vivo 1-bromo-4-clorobutano 6940-78-9 230-089-3 L 0 Cat. 2 Nessuna cat. dietil ftalato 84-66-2 201-550-6 L 0 Nessuna cat. Nessuna cat. acido 1-naftalenacetico 86-87-3 201-705-8 S 0 Nessuna cat. Nessuna cat. fenossiacetato di allile 7493-74-5 231-335-2 L 0,3 Nessuna cat. Nessuna cat. isopropanolo 67-63-0 200-661-7 L 0,3 Nessuna cat. Nessuna cat. 4-metil-tio-benzaldeide 3446-89-7 222-365-7 L 1 Cat. 2 Nessuna cat. stearato di metile 112-61-8 203-990-4 S 1 Nessuna cat. Nessuna cat. butirrato di eptile 5870-93-9 227-526-5 L 1,7 Nessuna cat. Cat. 3 opzionale salicilato di esile 6259-76-3 228-408-6 L 2 Nessuna cat. Cat. 3 opzionale fosfato di tri-isobutile 126-71-6 204-798-3 L 2 Cat. 2 Cat. 3 opzionale 1-decanolo 112-30-1 203-956-9 L 2,3 Cat. 2 Cat. 2 aldeide ciclamenica 103-95-7 203-161-7 L 2,3 Cat. 2 Cat. 2 1-bromoesano 111-25-1 203-850-2 L 2,7 Cat. 2 Cat. 2 idrocloruro di 2-clorometil-3,5-dimetil-4-metossipiridina 86604-75-3 434-680-9 S 2,7 Cat. 2 Cat. 2 a-terpineolo 98-55-5 202-680-6 L 2,7 Cat. 2 Cat. 2 disolfuro di di-n-propile 629-19-6 211-079-8 L 3 Nessuna cat. Cat. 2 metacrilato di butile 97-88-1 202-615-1 L 3 Cat. 2 Cat. 2 benzenetiolo, 5-(1,1-dimetiletil)-2-metile 7340-90-1 438-520-9 L 3,3 Cat. 2 Cat. 2 1-metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 431-180-2 S 3,3 Cat. 2 Cat. 2 eptanale 111-71-7 203-898-4 L 4 Cat. 2 Cat. 2 Le sostanze elencate nella tabella 2 forniscono una distribuzione rappresentativa delle 58 sostanze utilizzate nello studio di validazione internazionale dell’ECVAM (1). Detta selezione si basa sui criteri seguenti: — le sostanze sono disponibili sul mercato, — sono rappresentative dell’intera gamma di punteggi di irritabilità di Draize (da non irritante a fortemente irritante), — hanno una struttura chimica ben definita, — sono rappresentative della riproducibilità e della capacità predittiva del metodo convalidato come stabilito dallo studio di validazione dell’ECVAM, — sono rappresentative della funzionalità chimica utilizzata nel processo di validazione, — non sono associate ad un profilo estremamente tossico (per esempio cancerogeno o tossico per la riproduzione) e non comportano costi di smaltimento eccessivi. III) Valori definiti di accuratezza e affidabilità Le prestazioni (sensibilità, specificità, percentuale di falsi negativi, percentuale di falsi positivi e accuratezza) del metodo proposto dovrebbero essere comparabili a quelli del metodo di riferimento convalidato 1 (tabella 3): sensibilità ≥ all’80 %, specificità ≥ al 70 % e accuratezza ≥ al 75 %. Le prestazioni devono essere calcolate utilizzando tutte le classificazioni ottenute per le 20 sostanze dai diversi laboratori partecipanti. In ogni laboratorio, la classificazione di ogni sostanza deve essere ottenuta utilizzando il valore medio relativo alla vitalità nelle diverse prove effettuate (minimo tre prove valide). Tabella 3 Prestazioni del metodo di riferimento convalidato 1 (2) Metodo di prova N. di sostanze Sensibilità Specificità Percentuale di falsi negativi Percentuale di falsi positivi Accura-tezza Metodo di riferimento convalidato 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Metodo di riferimento convalidato 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % L’affidabilità del metodo proposto deve essere comparabile a quella dei metodi di riferimento convalidati. Riproducibilità intra-laboratorio La valutazione della variabilità intra-laboratorio dovrebbe mostrare una concordanza delle classificazioni (categoria 2/nessuna categoria), ottenuta in prove diverse e indipendenti svolte sulle 20 sostanze di riferimento da uno stesso laboratorio, pari o superiore (≥) al 90 %. Riproducibilità inter-laboratorio La valutazione della riproducibilità inter-laboratorio non è essenziale se il metodo proposto deve essere utilizzato in un solo laboratorio. Per i metodi che devono essere trasferiti da un laboratorio all’altro, la concordanza delle classificazioni (categoria 2/nessuna categoria), ottenuta in prove diverse e indipendenti svolte sulle 20 sostanze di riferimento tra almeno tre laboratori, deve essere pari o superiore (≥) all’80 %. BIBLIOGRAFIA 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. e Zuang, V. (2007), «The ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test», ATLA 35, pagg. 559-601. 2. OCSE (2005), Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment, OCSE, Parigi. 3. ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation, disponibile alla voce «Download Study Documents» all’indirizzo http://ecvam.jrc.ec.europa.eu dal 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983), «Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays», Journal of Immunological Methods 65, pagg. 55-63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. e Zuang V., (2007), «ECVAM International Validation Study on In vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals», ATLA 35, pagg. 603-619. (1) Le 20 sostanze di riferimento costituiscono una scelta rappresentativa delle 58 sostanze originariamente utilizzate per convalidare il metodo di riferimento 1 (EpiSkin™). È possibile consultare l’elenco completo delle sostanze in esame e dei criteri di selezione (5). (2) Nella tabella 3 sono riportate le prestazi