DECISIONE DI ESECUZIONE (UE) 2015/1554 DELLA COMMISSIONE

dell'11 settembre 2015

recante modalità di applicazione della direttiva 2006/88/CE per quanto riguarda le prescrizioni in materia di sorveglianza e di metodi diagnostici

[notificata con il numero C(2015) 6188]

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE EUROPEA,

visto il trattato sul funzionamento dell'Unione europea,

vista la direttiva 2006/88/CE del Consiglio, del 24 ottobre 2006, relativa alle condizioni di polizia sanitaria applicabili alle specie animali d'acquacoltura e ai relativi prodotti, nonché alla prevenzione di talune malattie degli animali acquatici (1), in particolare l'articolo 49, paragrafo 3, l'articolo 50, paragrafo 4, l'articolo 57, lettera b), e l'articolo 61, paragrafo 3,

considerando quanto segue:

La direttiva 2006/88/CE stabilisce le misure preventive minime per la sorveglianza e la tempestiva individuazione negli animali acquatici delle malattie comprese nell'elenco contenuto nell'allegato IV di detta direttiva («le malattie elencate») e le misure di lotta da applicarsi in caso di presenza sospetta o confermata di un focolaio delle malattie elencate. Essa stabilisce altresì le prescrizioni da rispettare affinché gli Stati membri o loro zone o compartimenti ottengano lo status di indenne da malattia.

L'eradicazione delle malattie elencate e l'ottenimento da parte di uno Stato membro o una sua zona o un suo compartimento dello status di indenne da malattia dovrebbero fondarsi su identici principi e applicare l'identico approccio scientifico in tutta l'Unione. Per tale motivo è opportuno stabilire a livello dell'Unione prescrizioni specifiche relative ai programmi di eradicazione e di sorveglianza, come anche ai metodi di campionamento e diagnostici che gli Stati membri devono usare affinché l'intero territorio di uno Stato membro o una sua zona o un suo compartimento ottenga lo status di indenne da malattia.

Gli esami di laboratorio da effettuare in caso di presenza sospetta o confermata delle malattie elencate dovrebbero essere identici a livello dell'Unione e rispettare standard e protocolli scientifici identici. In conformità alla direttiva 2006/88/CE è opportuno stabilire specifici metodi e procedure diagnostici che devono essere usati dai laboratori a tal fine designati dall'autorità competente di ogni Stato membro.

Il codice sanitario per gli animali acquatici adottato dall'Organizzazione mondiale per la salute animale (OIE) (nel prosieguo il «codice acquatico») stabilisce standard globali per il miglioramento della salute degli animali acquatici e del benessere dei pesci di allevamento, tra i quali figurano gli standard per la sicurezza del commercio internazionale degli animali acquatici e dei prodotti da essi ottenuti. Diversi capitoli del codice acquatico espongono raccomandazioni relative all'uso di determinate prove diagnostiche. Tali prove, previste dall'OIE, sono stabilite nel manuale di diagnosi delle malattie degli animali acquatici dell'OIE (nel prosieguo il «manuale acquatico»). Al fine di garantire che le prescrizioni dell'Unione in materia di diagnosi delle malattie degli animali acquatici siano coerenti con gli standard internazionali, le norme stabilite nella presente decisione dovrebbero tenere conto degli standard e delle raccomandazioni del codice acquatico.

A tale riguardo il manuale acquatico elenca per molte delle malattie elencate diverse prove e procedure da usare per gli esami di laboratorio. Al fine di uniformare a livello dell'Unione la base scientifica dell'attività diagnostica per le malattie elencate è opportuno scegliere tra le prove e le procedure diagnostiche raccomandate dall'OIE e specificare quali di esse dovrebbero essere obbligatorie per gli esami di laboratorio da eseguire nel corso di programmi di sorveglianza e per escludere o confermare il sospetto della presenza di una delle malattie elencate. Per quanto in alcuni casi permanga la necessità di poter utilizzare metodi e procedure alternativi, sarebbe comunque opportuno fornire le descrizioni ed alcune spiegazioni scientifiche concernenti i casi in cui potrebbero essere applicati metodi alternativi e le relative modalità. Ciò è necessario in particolare per le procedure diagnostiche più particolareggiate.

Al fine di produrre risultati diagnostici precisi e riproducibili è importante che le procedure e i protocolli particolareggiati da usare siano convalidati in conformità alle pertinenti norme di qualità di cui alla direttiva 2006/88/CE, allegato VI, parte I. Per molti dei metodi diagnostici stabiliti nella presente decisione l'uso di kit per le analisi disponibili in commercio è parte essenziale dei protocolli diagnostici e tali kit sono stati convalidati mediante prove accreditate dai laboratori europei di riferimento (EURL) per le malattie corrispondenti. Ai fini della certezza del diritto è opportuno indicare nella presente decisione i nomi commerciali di tali kit per le analisi convalidati disponibili in commercio.

Può risultare difficile a determinati Stati membri conseguire lo status di indenne da malattia per il loro intero territorio o per una loro zona o un compartimento in rapporto ad una o più malattie elencate. In tali casi lo Stato membro può scegliere di non ottenere o non riottenere lo status di indenne da dette malattie elencate. Le misure minime di lotta da applicare qualora lo Stato membro interessato non intenda ottenere o riottenere lo status di indenne da malattia dovrebbero essere identiche a livello dell'Unione e rispettare identici criteri. È quindi opportuno, in conformità alla direttiva 2006/88/CE, stabilire norme particolareggiate per il contenimento di dette malattie elencate, nonché le condizioni minime da soddisfare per la revoca di dette misure di contenimento.

La decisione 2001/183/CE della Commissione (2) stabilisce le prescrizioni relative ai piani di campionamento e ai metodi diagnostici per individuare e confermare la necrosi ematopoietica infettiva e la setticemia emorragica virale comprese nell'elenco. La decisione 2003/466/CE della Commissione (3) reca criteri relativi ai piani di campionamento e ai metodi diagnostici per individuare la presenza dell'anemia infettiva dei salmoni, oltre ai criteri per la suddivisione in zone e la sorveglianza ufficiale da attuare in caso di presenza sospetta o confermata di tale malattia. La decisione 2002/878/CE della Commissione (4) stabilisce le prescrizioni relative ai piani di campionamento e ai metodi diagnostici per individuare e confermare la presenza delle malattie dei molluschi bonamiosi e marteiliosi. Al fine di aggiornare le prescrizioni citate, dette tre decisioni dovrebbero essere sostituite dalla presente decisione. Di conseguenza la decisione 2001/183/CE, la decisione 2002/878/CE e la decisione 2003/466/CE dovrebbero essere abrogate.

HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:

Articolo 1

Oggetto

La presente decisione stabilisce norme riguardanti:

la sorveglianza, le zone cuscinetto, i metodi di campionamento e diagnostici che devono essere usati dagli Stati membri per definire lo stato sanitario degli Stati membri o di loro zone o compartimenti relativamente alle malattie non esotiche di animali acquatici comprese nell'elenco di cui all'allegato IV, parte II, della decisione 2006/88/CE (le «malattie elencate»);

i metodi diagnostici da usare per gli esami di laboratorio in caso di presenza sospetta o confermata delle malattie elencate; e

le misure minime di lotta da applicare in caso di presenza sospetta o confermata di una malattia elencata in uno Stato membro, o in una sua zona o in un suo compartimento, non dichiarato indenne da tale malattia elencata.

Articolo 2

Definizioni

Ai fini della presente decisione si intende per:

a) «setticemia emorragica virale» («VHS»): malattia causata dal virus della setticemia emorragica virale (VHSV), noto anche come virus Egtved, appartenente al genere Novirhabdovirus, famiglia Rhabdoviridae;

b) «necrosi ematopoietica infettiva» («IHN»): malattia causata dal virus della necrosi ematopoietica infettiva (IHNV), appartenente al genere Novirhabdovirus, famiglia Rhabdoviridae;

c) «herpesvirus della carpa koi» («KHVD»): malattia causata dall'herpesvirus della carpa koi (KHV), appartenente alla famiglia Alloherpesviridae. Il nome scientifico è herpesvirus dei ciprinidi 3(CyHV-3);

d) «anemia infettiva del salmone» («ISA»): malattia causata dall'infezione da virus dell'anemia infettiva del salmone (ISAV) con delezione a livello di HPR (highly polymorphic region), appartenente al genere Isavirus, famiglia Orthomyxoviridae;

e) «infezione da Marteilia refringens»: malattia causata da infezione dal protozoo del phylum Paramixea Marteilia refringens;

f) «infezione da Bonamia ostreae»: malattia causata da infezione dal protozoo del phylum Haplosporidia Bonamia ostreae;

g) «malattia dei punti bianchi» («WSD»): malattia causata dal causata dal virus della White Spot Syndrome (sindrome dei punti bianchi — WSSV), virus a DNA a doppia elica del genere Whispovirus, famiglia Nimaviridae.

Articolo 3

Prescrizioni minime in materia di programmi di eradicazione e di sorveglianza

Gli Stati membri garantiscono il rispetto delle norme in materia di programmi di eradicazione e di sorveglianza, di zone cuscinetto, di metodi di campionamento e diagnostici di cui all'allegato I, nonché degli specifici metodi e procedure particolareggiate di cui all'allegato II, ai fini della dichiarazione, revoca o ripristino dello status di indenne, da una o più malattie elencate, di uno Stato membro o una sua zona o un suo compartimento.

Articolo 4

Prescrizioni minime in materia di metodi diagnostici e procedure specifiche

Gli Stati membri garantiscono il rispetto dei metodi di controllo di cui all'allegato I e degli specifici metodi diagnostici e procedure particolareggiate di cui all'allegato II quando si effettuano esami di laboratorio allo scopo di confermare o escludere la presenza di una malattia elencata.

Articolo 5

Misure minime di lotta per il contenimento delle malattie elencate e condizioni minime da soddisfare per la revoca delle misure di contenimento in Stati membri, o loro zone o compartimenti, non dichiarati indenni dalle malattie elencate

Gli Stati membri garantiscono il rispetto delle misure minime di lotta e delle condizioni minime per la revoca delle misure di contenimento di cui all'allegato I quando vengono applicate misure di lotta o vengono revocate misure di contenimento di una o più malattie elencate in uno Stato membro o in una sua zona o un suo compartimento non dichiarato indenne da tali malattie elencate.

Articolo 6

Abrogazioni

La decisione 2001/183/CE, la decisione 2002/878/CE e la decisione 2003/466/CE sono abrogate.

Articolo 7

Data di applicazione

La presente decisione si applica a decorrere dal 1o aprile 2016.

Articolo 8

Destinatari

Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.

(1) GU L 328 del 24.11.2006, pag. 14.

(2) Decisione 2001/183/CE della Commissione, del 22 febbraio 2001, che stabilisce i piani di campionamento e i metodi diagnostici per individuare e confermare alcune malattie dei pesci e che abroga la decisione 92/532/CEE (GU L 67 del 9.3.2001, pag. 65).

(3) Decisione 2003/466/CE della Commissione, del 13 giugno 2003, recante criteri per la suddivisione in zone e la sorveglianza ufficiale da attuare in caso di sospetto o conferma della presenza di anemia infettiva dei salmoni (ISA) (GU L 156 del 25.6.2003, pag. 61).

(4) Decisione 2002/878/CE della Commissione, del 6 novembre 2002, che stabilisce i piani di campionamento e i metodi diagnostici per individuare e confermare la presenza delle malattie dei molluschi bonamiosi (Bonamia ostreae) e marteiliosi (Marteilia refringens) (GU L 305 del 7.11.2002, pag. 57).

(15) Non si applica alle aziende che allevano solo trote iridee (Onchorhynchus mykiss) e/o salmotrota (Salmo trutta) e nelle quali l'apporto di acqua dipende esclusivamente da fonti di acqua dolce che non ospitano salmone atlantico (Salmo salar).

(14) I campioni devono essere raccolti ed esaminati durante due periodi di prova all'anno, ciascuno della durata di un mese, da effettuarsi in primavera e in autunno oppure quando ciò sia opportuno in base a considerazioni pratiche.

(12) I campioni devono essere raccolti, conservati ed esaminati durante due periodi di prova all'anno, ciascuno della durata di un mese, da effettuarsi in primavera e in autunno oppure quando ciò sia opportuno in base a considerazioni pratiche.

(11) Non si applica alle aziende che allevano solo trote iridee (Onchorhynchus mykiss) e/o salmotrota (Salmo trutta) e nelle quali l'apporto di acqua dipende esclusivamente da fonti di acqua dolce che non ospitano salmone atlantico (Salmo salar).

Programma di sorveglianza per Stati membri, zone e compartimenti per il periodo biennale di controllo che precede il riconoscimento dello status di indenne da malattia relativamente a WSD di cui al punto I.2.1.

Qualora l'analisi two-step PCR dia un risultato positivo, questo va corroborato con sequenziamento dell'amplicon prima di attuare le prime misure di lotta di cui all'articolo 28 della direttiva 2006/88/CE, se possibile, in concreto, mettendo in evidenza sintomi patognomonici di WSD negli ospiti sensibili selezionati, mediante istologia e microscopia elettronica a trasmissione.

I campioni di epidermide tegumentaria, dissezionati o contenuti nelle appendici locomotorie, nei pleopodi, nelle parti boccali o nelle branchie dell'animale sottoposto a prova sono fissati in etanolo al 95 % prima della preparazione dei campioni per l'analisi two-step PCR.

sono state rispettate le prescrizioni di cui al punto I.2.2.1, lettere a), b) e c). Qualora il fermo dell'impianto non sia tecnicamente possibile, le aziende interessate saranno soggette ad una misura alternativa che fornisca garanzie quasi simili dell'eliminazione del virus ISA dall'ambiente dell'azienda;

Tali punti di campionamento devono essere ispezionati e soggetti a campionamento a rotazione, coprendo il 50 % dei punti di campionamento ogni anno. Il campionamento deve essere effettuato in conformità alla tabella 6.B. di cui alla sezione II. I campioni devono essere selezionati, preparati ed esaminati in conformità ai metodi diagnostici e di campionamento di cui alla sezione II e gli esami di laboratorio devono aver prodotto risultati negativi per quanto riguarda l'agente della WSD.

Negli Stati membri o loro zone o compartimenti nei quali il numero delle aziende è limitato e la sorveglianza mirata in tali aziende non fornisce sufficienti dati epidemiologici i programmi di sorveglianza per il mantenimento dello status di indenne da malattia comprendono punti di campionamento selezionati come previsto dal punto I.1.

Se è prescritta una sorveglianza mirata per il mantenimento dello stato sanitario di categoria I, a norma dell'articolo 52 della direttiva 2006/88/CE, tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, di detta direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, sono sottoposte a ispezioni sanitarie e campionamento in conformità alla tabella 6.B di cui alla sezione II, tenendo conto del rischio per l'azienda di contrarre la WSD.

I.2.2.2. Prescrizioni per riottenere il riconoscimento dello status di indenne da malattia relativamente a WSD per i compartimenti continentali che comprendono una sola azienda precedentemente dichiarata indenne da WSD

Si procede al ripopolamento solo quando tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette da WSD sono state svuotate, pulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti in conformità al punto I.2.2.1, lettera c).

L'autorità competente può decidere di imporre lo svuotamento, la pulizia, la disinfezione e il fermo degli impianti in altre aziende all'interno delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite. La durata del fermo degli impianti è determinata dall'autorità competente in base ad una valutazione dei rischi caso per caso;

un controllo sanitario; nelle aziende per le quali le prove di cui al punto i) hanno prodotto risultati negativi, le ispezioni sanitarie devono continuare una volta al mese nella stagione in cui è probabile che la temperatura dell'acqua raggiunga il proprio livello massimo annuale, fino a che sia stata revocata la zona riservata alla protezione in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

nelle aree marine: a una zona, circostante la zona riservata alla protezione, in cui le escursioni di marea si sovrappongono; oppure una zona, circostante la zona riservata alla protezione, compresa in un cerchio del raggio di 10 km dal centro della zona riservata alla protezione; oppure un'area equivalente determinata in base a dati appropriati di natura idrodinamica o epidemiologica; oppure

La zona di protezione deve essere stata definita in base ad un'analisi caso per caso, tenendo presenti i fattori agenti sul rischio di diffusione di WSD ai crostacei d'allevamento e selvatici, quali: il numero di morti, il tasso e la distribuzione della mortalità dei crostacei nelle aziende infette da WSD; la distanza delle aziende vicine e la loro densità; le aziende di contatto; le specie presenti nelle aziende; le pratiche di allevamento applicate nelle aziende infette e nelle aziende limitrofe; le condizioni idrodinamiche ed altri fattori di rilevanza epidemiologica individuati.

le misure minime di lotta stabilite al capo V, sezione 4, della direttiva 2006/88/CE devono essere state effettivamente applicate e deve essere stata stabilita una zona di protezione, come previsto all'articolo 32, lettera b), di detta direttiva, che comprenda una zona riservata alla protezione e una zona di sorveglianza, in prossimità delle aziende ufficialmente dichiarate infette da WSD.

se, durante l'attuazione del programma di sorveglianza indicato alla lettera a), viene confermata l'infezione da virus WSS in un'azienda inclusa in detto programma di sorveglianza, e pertanto le viene revocato lo stato sanitario di categoria II, tale azienda può riottenere immediatamente il proprio stato sanitario di categoria II e continuare ad attuare il programma di sorveglianza per ottenere lo status di indenne da malattia senza attuare un programma di eradicazione come indicato al punto I.2.2 purché rispetti le seguenti condizioni:

Le aziende o i punti di campionamento devono essere stati sottoposti a ispezioni sanitarie e prelievo di campioni, per un periodo minimo di due anni consecutivi come indicato alla tabella 6.A della sezione II.

Uno Stato membro, una sua zona o un suo compartimento, con stato sanitario di categoria III, come da allegato III, parte B, della direttiva 2006/88/CE, relativamente a WSD, può ottenere lo stato sanitario di categoria I in relazione a tale malattia elencata tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, di detta direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, risultano conformi alle prescrizioni di cui all'allegato V di detta direttiva e tutte le aziende, nonché, se prescritto dall'allegato V, parte I, punto 2, secondo comma, della direttiva 2006/88/CE, tutti i punti di campionamento di popolazioni selvatiche selezionati in conformità a tale punto, sono stati sottoposti al seguente programma di sorveglianza biennale, che comprende ispezioni sanitarie e il prelievo di campioni da sottoporre a prova.

I.2. Prescrizioni specifiche per il riconoscimento dello stato sanitario di categoria I in relazione a WSD

se sono presenti crostacei deboli o morenti, il prelievo deve comprendere innanzitutto tali soggetti. Se tali crostacei non sono presenti, il prelievo deve comprendere crostacei di coorti di diverse taglie, in particolare esemplari giovani e adulti delle specie sensibili selezionate, rappresentati in modo proporzionale nel campione.

nei fiumi e nei laghi devono essere selezionate una o più delle specie seguenti: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes oppure Orconectes limosus. Se tali specie non sono presenti, il campione deve essere rappresentativo di tutte le altre specie sensibili di decapodi presenti. Data l'ampia gamma di specie ospiti sensibili, gli esemplari ospiti possono essere scelti tra generi o famiglie dei decapodi nei quali la sensibilità è stata dimostrata per via sperimentale o in natura;

negli estuari e nelle aree marine, devono essere selezionate una o più delle specie seguenti: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus oppure specie di gamberi peneidi, ossia Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus, Penaeus semisulcatus. Se tali specie non sono presenti, il campione deve essere rappresentativo di tutte le altre specie sensibili di decapodi presenti. Data l'ampia gamma di specie ospiti sensibili, gli esemplari ospiti possono essere scelti tra generi o famiglie dei decapodi nei quali la sensibilità è stata dimostrata per via sperimentale o in natura;

se nelle unità di produzione sono presenti crostacei deboli o morenti, il prelievo deve comprendere innanzitutto tali soggetti. Se tali crostacei non sono presenti, il prelievo deve comprendere crostacei di coorti di diverse taglie, in particolare esemplari giovani e adulti, delle specie sensibili selezionate, rappresentati in modo proporzionale nel campione;

Il prelievo dei campioni di crostacei da sottoporre a esami di laboratorio deve essere effettuato in qualsiasi periodo in cui è probabile che la temperatura dell'acqua raggiunga il valore massimo annuale. Tale prescrizione relativa alla temperatura dell'acqua si applica anche alle ispezioni sanitarie quando questi sono realizzabili e opportuni.

I. Prescrizioni in materia di programmi di sorveglianza e di eradicazione per il riconoscimento e il mantenimento dello status di indenne da malattia relativamente a WSD e per il contenimento dell'infezione da virus WSS

Programma di sorveglianza per Stati membri, loro zone e compartimenti per il periodo di controllo che precede il riconoscimento dello status di indenne da Bonamia ostreae di cui al punto I.2.1.

L'indagine ufficiale deve comprendere almeno un campionamento di 30 molluschi delle specie sensibili se il sospetto si basa su una relazione sulla mortalità; in caso contrario, di 150 molluschi delle specie sensibili dopo l'inizio del periodo di trasmissione della Bonamia ostreae. Se il periodo di trasmissione non è noto il prelievo inizia in inverno o all'inizio della primavera. I campioni sono esaminati utilizzando i metodi diagnostici di cui al punto i) seguendo i metodi e le procedure diagnostici particolareggiati di cui all'allegato II, parte 5, sezione I.

non vi è stata nessuna conferma di infezione da Bonamia ostreae durante il periodo di due anni successivo al completamento delle misure di cui alle lettere a), b) e c), e i sospetti manifestatisi durante questo periodo sono stati esclusi applicando le procedure di cui al punto II.3.

sono state rispettate le prescrizioni di cui al punto I.2.2, lettere a), b) e c). Qualora il fermo dell'impianto non sia tecnicamente possibile, le aziende interessate saranno soggette ad una misura alternativa che fornisca garanzie quasi simili dell'eliminazione della Bonamia ostreae dall'ambiente dell'azienda:

È possibile mantenere lo status di indenne da malattia relativamente all'infezione da Bonamia ostreae solo se tutti i campioni esaminati con l'applicazione dei metodi diagnostici di cui al punto II.2 producono risultati negativi per Bonamia ostreae e se qualsiasi sospetto della presenza di Bonamia ostreae è escluso in conformità ai metodi diagnostici di cui al punto II.3.

Se è prescritta una sorveglianza mirata per il mantenimento dello stato sanitario di categoria I, a norma dell'articolo 52 della direttiva 2006/88/CE, tutte le aziende o le zone destinate alla molluschicoltura che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, di detta direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento sono sottoposte a ispezioni sanitarie e campionamento in conformità alla tabella 5.B di cui alla sezione II della presente parte, tenendo conto del rischio per tale azienda o zona di contrarre l'infezione da Bonamia ostreae.

tutte le aziende e le zone destinate alla molluschicoltura ufficialmente dichiarate infette e tutte le altre aziende o zone destinate alla molluschicoltura sottoposte al fermo degli impianti entro le zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite sono ripopolate con molluschi provenienti da Stati membri, loro zone e compartimenti con stato sanitario di categoria I relativamente all'infezione da Bonamia ostreae. Si procede al ripopolamento solo quando tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette sono state svuotate, pulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti in conformità al punto I.2.2, lettera c);

L'autorità competente può decidere di imporre lo svuotamento, la pulizia, la disinfezione e il fermo degli impianti in altre aziende o zone destinate alla molluschicoltura, secondo il caso, all'interno delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite. La durata del periodo di fermo degli impianti è determinata dall'autorità competente in base ad una valutazione dei rischi caso per caso;

tutte le aziende e le zone destinate alla molluschicoltura che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE, all'interno della zona riservata alla protezione non ufficialmente dichiarata infetta da Bonamia ostreae devono essere sottoposte ad un'indagine ufficiale che comprenda almeno il prelievo di un campione da sottoporre a prova di 150 molluschi delle specie sensibili dopo l'inizio del periodo di trasmissione della Bonamia ostreae. Se il periodo di trasmissione non è noto il prelievo inizia in inverno o all'inizio della primavera;

La zona di protezione deve essere definita in base ad un'analisi caso per caso, tenendo presenti i fattori agenti sul rischio di diffusione della malattia elencata in oggetto, quali: il numero, il tasso, l'età e la distribuzione della mortalità dei molluschi nell'azienda o nella zona destinata alla molluschicoltura infetta da Bonamia ostreae, compresi i molluschi selvatici; la distanza e la densità delle aziende o zone destinate alla molluschicoltura limitrofe, compresi i molluschi selvatici; la vicinanza a stabilimenti di lavorazione, aziende di contatto o zone destinate alla molluschicoltura; le specie presenti nelle aziende o nelle zone destinate alla molluschicoltura, in particolare le specie sensibili e le specie vettrici; le pratiche di allevamento applicate nelle aziende o nelle zone destinate alla molluschicoltura limitrofe colpite; le condizioni idrodinamiche ed altri fattori di rilevanza epidemiologica individuati.

le misure minime di lotta stabilite al capo V, sezione 3, della direttiva 2006/88/CE devono essere state effettivamente applicate e in particolare deve essere stata stabilita una zona di protezione, come previsto dall'articolo 32, lettera b), di detta direttiva, che comprenda una zona riservata alla protezione e una zona di sorveglianza, in prossimità delle aziende o delle zone destinate alla molluschicoltura ufficialmente dichiarate infette da Bonamia ostreae.

durante detto periodo di due anni le prove di tutti i campioni, effettuate con i metodi diagnostici di cui al punto II.2, devono aver prodotto risultati negativi per la Bonamia ostreae e deve essere stato escluso qualsiasi sospetto di presenza di Bonamia ostreae in conformità ai metodi di campionamento e diagnostici di cui al punto II.3;

le aziende e le zone destinate alla molluschicoltura che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE, devono essere state sottoposte a ispezioni sanitarie, con prelievo di campioni, per un periodo minimo di due anni consecutivi come indicato alla tabella 5.A della presente parte;

I.2. Prescrizioni specifiche per l'ottenimento dello stato sanitario di categoria I in relazione alla Bonamia ostreae

quando il prelievo avviene in zone destinate alla molluschicoltura, si devono includere nel campione molluschi provenienti da un numero sufficiente di punti di campionamento. I fattori principali da tenere in considerazione per la selezione di tali punti di campionamento sono i punti di campionamento dove è stata precedentemente rilevata la Bonamia ostreae, la densità di allevamento, i flussi d'acqua, la presenza di specie sensibili, la presenza di specie vettrici, le caratteristiche batimetriche e le pratiche di gestione. Nel campionamento devono essere compresi i banchi naturali situati all'interno di zone destinate alla molluschicoltura o ad esse limitrofi.

se il campionamento è effettuato in aziende che per la produzione dei molluschi utilizzano acqua proveniente da diverse fonti si devono prelevare molluschi che rappresentino tutte le fonti idriche, in modo tale che il campione sia proporzionalmente rappresentativo di tutte le parti dell'azienda;

se sono presenti molluschi deboli, dalle valve schiuse o morti recentemente ma non decomposti, il prelievo deve comprendere innanzitutto tali soggetti. Se tali molluschi non sono presenti, i molluschi selezionati devono comprendere i molluschi sani di età più avanzata;

se la specie Ostrea edulis è presente nell'azienda, sono selezionate per il campionamento solo ostriche di questa specie. Se la specie Ostrea edulis non è presente i campioni devono essere rappresentativi di tutte le altre specie sensibili presenti;

Le ispezioni sanitarie e, ove opportuno, il campionamento delle unità di produzione sono da eseguire nel periodo dell'anno nel quale la prevalenza della Bonamia ostreae nello Stato membro o nella sua zona o nel suo compartimento è notoriamente ai livelli più alti. Quando tali dati non sono disponibili il campionamento deve essere effettuato in inverno o all'inizio della primavera.

I. Prescrizioni in materia di programmi di sorveglianza o di eradicazione per il riconoscimento e il mantenimento dello status di indenne da malattia relativamente all'infezione da Bonamia ostreae

Programma di sorveglianza per Stati membri, loro zone e compartimenti per il periodo di controllo che precede il riconoscimento dello status di indenne da Marteilia refringens di cui al punto I.2.1.

l'indagine ufficiale deve comprendere almeno un campionamento di 30 molluschi delle specie sensibili se il sospetto di basa su una relazione sulla mortalità; in caso contrario, di 150 molluschi delle specie sensibili dopo l'inizio del periodo di trasmissione della Marteilia refringens. Se il periodo di trasmissione non è noto il prelievo inizia nel periodo successivo a quando la temperatura dell'acqua ha superato i 17 °C;

non vi è stata nessuna conferma di infezione da Marteilia refringens durante il periodo di due anni successivo al completamento delle misure di cui alle lettere a), b) e c) e i sospetti manifestatisi durante questo periodo sono stati esclusi applicando le procedure di cui al punto II.3.

sono state rispettate le prescrizioni di cui al punto I.2.2, lettere a), b) e c). Qualora il fermo dell'impianto non sia tecnicamente possibile, le aziende interessate saranno soggette ad una misura alternativa che fornisca garanzie quasi simili dell'eliminazione della Marteilia refringens dall'ambiente dell'azienda:

È possibile mantenere lo status di indenne solo se per tutti i campioni esaminati con l'applicazione dei metodi diagnostici di cui al punto II.2. si riscontrano risultati negativi per Marteilia refringens e se qualsiasi sospetto di presenza di Marteilia refringens è stato escluso applicando i metodi diagnostici di cui al punto II.3.

Se è prescritta una sorveglianza mirata per il mantenimento dello stato sanitario di categoria I, a norma dell'articolo 52 della direttiva 2006/88/CE, tutte le aziende e le zone destinate alla molluschicoltura che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, sono sottoposte a ispezioni sanitarie e campionamento in conformità alla tabella 4.B di cui alla sezione II, tenendo conto del rischio per tale azienda o zona di molluschicoltura di contrarre la Marteilia refringens.

Si procede al ripopolamento solo quando tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette sono state svuotate, pulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti in conformità al punto I.2.2, lettera c);

L'autorità competente può decidere di imporre lo svuotamento, la pulizia, la disinfezione e il fermo degli impianti in altre aziende o zone destinate alla molluschicoltura, secondo il caso, all'interno delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite. La durata del periodo di fermo degli impianti è determinata dall'autorità competente in base ad una valutazione dei rischi caso per caso;

di quattordici mesi nel caso di aziende e zone destinate alla molluschicoltura con collegamenti illimitati con le acque circostanti, se i molluschi infetti delle specie sensibili e i molluschi delle specie sensibili con legami epidemiologici con l'azienda o la zona destinata alla molluschicoltura infette non sono stati raccolti o rimossi prima del periodo dell'anno in cui la prevalenza di Marteilia refringens è notoriamente massima, oppure, se tale periodo non è noto, se i molluschi delle specie sensibili non sono stati raccolti o rimossi prima del periodo nel quale la temperatura dell'acqua supera i 17 °C.

di due mesi nel caso di aziende e zone destinate alla molluschicoltura con collegamenti illimitati con le acque circostanti, a condizione che i molluschi infetti delle specie sensibili e i molluschi delle specie sensibili con legami epidemiologici con l'azienda o la zona destinata alla molluschicoltura infetta siano stati raccolti o rimossi prima del periodo dell'anno in cui la prevalenza di Marteilia refringens è notoriamente massima, oppure, se tale periodo non è noto, prima del periodo nel quale la temperatura dell'acqua supera i 17 °C;

tutte le aziende e le zone destinate alla molluschicoltura che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE, all'interno della zona riservata alla protezione non dichiarata ufficialmente infetta da Marteilia refringens, devono essere sottoposte ad un'indagine ufficiale che comprenda almeno il prelievo di un campione di 150 molluschi da sottoporre a prova dopo l'inizio del periodo di trasmissione della Marteilia refringens. Se il periodo di trasmissione non è noto il prelievo inizia nel periodo successivo a quando la temperatura dell'acqua ha superato i 17 °C;

La zona di protezione deve essere definita in base ad un'analisi caso per caso, tenendo presenti i fattori agenti sul rischio di diffusione di Marteilia refringens, quali: il numero di morti e la loro età, il tasso e la distribuzione della mortalità dei molluschi nell'azienda o zona destinata alla molluschicoltura infetta da Marteilia refringens, compresi i molluschi selvatici; la distanza e la densità delle aziende o zone destinate alla molluschicoltura limitrofe, comprese quelle con molluschi selvatici; la vicinanza a stabilimenti di lavorazione, aziende di contatto o zone destinate alla molluschicoltura; le specie, in particolare le specie sensibili e le specie vettrici, presenti nelle aziende o nelle zone destinate alla molluschicoltura; le pratiche di allevamento applicate nelle aziende e nelle zone destinate alla molluschicoltura colpite e limitrofe; le condizioni idrodinamiche ed altri fattori di rilevanza epidemiologica individuati.

le misure stabilite al capo V, sezione 3, della direttiva 2006/88/CE devono essere state effettivamente applicate e in particolare deve essere stata stabilita una zona di protezione, come previsto all'articolo 32, lettera b), di detta direttiva, che comprenda una zona riservata alla protezione e una zona di sorveglianza, in prossimità delle aziende o delle zone destinate alla molluschicoltura ufficialmente dichiarate infette da Marteilia refringens.

durante detto periodo di due anni le prove di tutti i campioni, effettuate con i metodi diagnostici di cui al punto II.2, devono aver prodotto risultati negativi per la Marteilia refringens e deve essere stato escluso qualsiasi sospetto di presenza di Marteilia refringens in conformità ai metodi di campionamento e diagnostici di cui al punto II.3;

le aziende o le zone destinate alla molluschicoltura devono essere state sottoposte a ispezioni sanitarie, con prelievo di campioni, per un periodo minimo di due anni consecutivi come indicato alla tabella 4.A della sezione II;

I.2. Prescrizioni specifiche per l'ottenimento dello stato sanitario di categoria I in relazione alla Marteilia refringens

quando il prelievo avviene in zone destinate alla molluschicoltura, si devono includere nel campione molluschi provenienti da un numero sufficiente di punti di campionamento in modo da ottenere un campione proporzionalmente rappresentativo di tutte le parti della zona destinata alla molluschicoltura. I fattori principali da tenere in considerazione per la selezione di tali punti di campionamento sono i punti di campionamento dove è stata precedentemente rilevata la Marteilia refringens, la densità di allevamento, i flussi d'acqua, la presenza di specie sensibili, la presenza di specie vettrici, le caratteristiche batimetriche e le pratiche di gestione. Nel campionamento devono essere compresi i banchi naturali.

se il campionamento è effettuato in aziende di molluschicoltura che utilizzano acqua proveniente da diverse fonti, si devono prelevare molluschi che rappresentino tutte le fonti idriche, in modo tale che il campione sia proporzionalmente rappresentativo di tutte le parti dell'azienda;

se nelle unità di produzione sono presenti molluschi deboli, dalle valve schiuse o morti recentemente, ma non decomposti, il prelievo deve comprendere innanzitutto tali soggetti. In assenza di tali molluschi sono selezionati i molluschi sani di età più avanzata;

se nelle unità di produzione o nella zona di produzione sono presenti Ostrea spp. e Mytilus spp., entrambi i generi devono essere presenti in egual misura nel campione. Se è presente un solo genere tale genere è incluso nei campioni. Se non sono presenti né il genere Ostrea né il genere Mytilus, il campione deve rappresentare tutte le altre specie sensibili presenti;

Le ispezioni sanitarie e, se opportuno, il campionamento per gli esami di laboratorio sono da eseguire nel periodo dell'anno nel quale la prevalenza del parassita nello Stato membro, nella sua zona o nel suo compartimento è notoriamente massima. Quando tali dati non sono disponibili il campionamento deve essere effettuato subito dopo che la temperatura dell'acqua abbia superato i 17 °C.

I. Prescrizioni in materia di programmi di sorveglianza e di eradicazione per l'ottenimento e il mantenimento dello status di indenne da malattia relativamente all'infezione da Marteilia refringens

Programma di sorveglianza per zone e compartimenti per il periodo biennale di controllo che precede l'ottenimento dello status di indennità dall'ISA di cui al punto I.2.1.

La sospetta presenza dell'ISA può essere esclusa se da prove e indagini svolte in un periodo di 12 mesi dall'annuncio del caso sospetto non emergono altre prove della presenza dell'ISA.

se si riscontrano mutamenti clinici macroscopici di tipo patologico, o risultati istopatologici compatibili con l'ISA, i risultati devono essere corroborati mediante rilevamento del virus con due metodi diagnostici che applichino principi indipendenti per il rilevamento, quali RT-qPCR e immunoistochimica in conformità all'allegato II, parte 3.

rilevamento del virus dell'ISA con analisi RT-qPCR, compreso il sequenziamento del gene della proteina HE per verificare la delezione a livello di HPR, e

rilevamento del virus dell'ISA con analisi RT-qPCR, compreso il sequenziamento del gene della proteina HE per verificare la delezione a livello di HPR, e rilevamento del virus dell'ISA nei preparati tissutali mediante anticorpi specifici contro il virus dell'ISA (in particolare immunoistochimica su sezioni fissate o IFAT su impronte di tessuto)

qualora l'analisi RT-qPCR dia un risultato positivo per il virus dell'ISA con delezione a livello di HPR si devono sottoporre a prova altri campioni prima di applicare le prime misure di lotta di cui all'articolo 28 della direttiva 2006/88/CE. Un caso di sospetta infezione da ISA deve essere confermato in conformità ai criteri seguenti usando i metodi e le procedure particolareggiati di cui all'allegato II, parte 3:

un'indagine ufficiale che deve comprendere almeno un'ispezione sanitaria e un prelievo di un campione di 10 pesci morenti, se sono stati riscontrati sintomi clinici o post-mortem compatibili con un'infezione da ISA. Se non sono riscontrati sintomi clinici o post-mortem compatibili con l'ISA, l'ispezione sanitaria deve essere seguita da un campionamento mirato, formando un campione di almeno 30 pesci morenti o morti recentemente di costituzione normale, in conformità al punto I.1. I campioni devono essere sottoposti a prova applicando i metodi diagnostici indicati alla lettera b);

analisi dei campioni con RT-qPCR, compreso il sequenziamento del gene della proteina HE per verificare la delezione a livello di HPR;

Il metodo diagnostico da applicare per l'ottenimento e il mantenimento dello status di indenne dall'ISA, a norma dei punti I.2 e I.3, è l'analisi RT-qPCR, seguita dal sequenziamento dei campioni positivi in conformità ai metodi e alle procedure particolareggiati di cui all'allegato II, parte 3.

non vi è stata nessuna conferma di virus dell'ISA con delezione a livello di HPR durante il periodo di due anni successivo al completamento delle misure di cui alle lettere a), b) e c), e i sospetti manifestatisi durante questo periodo sono stati esclusi applicando le procedure di cui al punto II.3.

siano state rispettate le prescrizioni di cui al punto I.2.2.1, lettere a), b) e c). Qualora il fermo dell'impianto non sia tecnicamente possibile, le aziende interessate saranno sottoposte ad una misura alternativa che fornisca garanzie quasi simili dell'eliminazione del virus ISA dall'ambiente dell'azienda;

Nel determinare la frequenza delle ispezioni sanitarie nei compartimenti con stato sanitario di categoria I relativamente all'ISA, in zone continentali e per i quali lo stato sanitario relativamente all'ISA dipende dallo stato sanitario delle popolazioni di animali acquatici nelle acque naturali circostanti che ospitano salmone atlantico (Salmo salar), il rischio di contrarre l'ISA deve essere considerato elevato.

Se è prescritta una sorveglianza mirata per il mantenimento dello stato sanitario di categoria I, a norma dell'articolo 52 della direttiva 2006/88/CE, tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, di detta direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, sono sottoposte a ispezioni sanitarie e campionamento in conformità alla tabella 3.B (11) di cui alla sezione II della presente parte, tenendo conto del rischio di contrarre l'ISA per tale azienda.

I.2.2.2. Prescrizioni per riottenere lo status di indenne da malattia per i compartimenti continentali comprendenti una sola azienda con stato sanitario di categoria I

Si procede al ripopolamento solo quando tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette sono state svuotate, pulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

L'autorità competente può decidere di imporre lo svuotamento, la pulizia, la disinfezione e il fermo degli impianti in altre aziende all'interno delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite. La durata del periodo di fermo degli impianti per tali aziende è determinata dall'autorità competente in base ad una valutazione dei rischi caso per caso;

tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette da virus dell'ISA con delezione a livello di HPR o da ISA confermata devono essere svuotate, ripulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti per un periodo di almeno tre mesi. Le zone riservate alla protezione e di sorveglianza possono essere revocate quando tutte le aziende all'interno della zona di protezione sono state svuotate, ripulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti per un periodo di almeno sei settimane.

un'ispezione sanitaria; nelle aziende per le quali le prove di cui al punto i) hanno fornito risultati negativi le ispezioni sanitarie continueranno una volta al mese fino alla revoca della zona riservata alla protezione in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

nelle zone costiere: a una zona, circostante la zona riservata alla protezione, in cui le escursioni di marea si sovrappongono; oppure a una zona, circostante la zona riservata alla protezione, compresa in un cerchio del raggio di 10 km dal centro della zona riservata alla protezione; oppure a un'area equivalente determinata in base a dati appropriati di natura idrodinamica o epidemiologica; oppure

Per l'istituzione delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza si applicano le seguenti prescrizioni minime per quanto riguarda la delimitazione geografica:

La zona di protezione deve essere stata definita in base ad un'analisi caso per caso, tenendo presenti i fattori agenti sul rischio di diffusione dell'ISA ai pesci d'allevamento e selvatici, quali: il numero di morti, il tasso e la distribuzione della mortalità dei pesci nelle aziende infette da virus dell'ISA con delezione a livello di HPR o da ISA confermata; la distanza delle aziende vicine e la loro densità; la prossimità a macelli; le aziende di contatto; le specie presenti nelle aziende; le pratiche di allevamento applicate nelle aziende infette e nelle aziende limitrofe; le condizioni idrodinamiche ed altri fattori di rilevanza epidemiologica individuati.

le misure minime di lotta stabilite al capo V, sezione 3, della direttiva 2006/88/CE devono essere state effettivamente applicate e in particolare deve essere stata stabilita una zona di protezione, come previsto dall'articolo 32, lettera b), di detta direttiva, che comprenda una zona riservata alla protezione e una zona di sorveglianza, in prossimità delle aziende ufficialmente dichiarate infette dal virus dell'ISA con delezione a livello di HPR o da ISA confermata.

se, durante l'attuazione del programma di sorveglianza, viene confermata la presenza di ISA in un'azienda inclusa nel programma di sorveglianza, e pertanto a tale azienda viene revocato lo stato sanitario di categoria II, deve essere stato effettuato un programma di eradicazione come da punto I.2.2.

le aziende o i punti di campionamento devono essere stati sottoposti a ispezioni sanitarie e prelievo di campioni, per un periodo minimo di due anni consecutivi come indicato alla tabella 3.A della sezione II;

Uno Stato membro, un sua zona o un suo compartimento con stato sanitario di categoria III relativamente all'ISA, come da allegato III, parte B, della direttiva 2006/88/CE, può ottenere lo stato sanitario di categoria I in relazione a tale malattia elencata quando tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, risultino conformi alle pertinenti prescrizioni di cui all'allegato V di detta direttiva e che tutte le aziende, nonché, se prescritto dall'allegato V, parte I, punto 2, secondo comma, di detta direttiva, tutti i punti di campionamento di popolazioni selvatiche selezionati in conformità a tale punto, siano stati sottoposti al seguente programma di sorveglianza:

I.2. Prescrizioni specifiche per l'ottenimento dello stato sanitario di categoria I in relazione all'ISA

i pesci selezionati devono comprendere soggetti raccolti in modo da assicurare che siano rappresentate in proporzione tutte le unità di produzione, quali gabbie, vasche e stagni, dell'azienda, nonché tutte le classi di età.

se tra le specie sensibili nel sito sono presenti esemplari di salmone atlantico, si deve dare la priorità ai campioni di tale specie. Se nell'azienda non sono presenti esemplari di salmone atlantico si devono raccogliere per il campionamento altre specie sensibili;

vengono selezionati solo pesci morenti o morti recentemente ma non in stato di decomposizione; in particolare, si dà la priorità alla raccolta di pesci che mostrano sintomi di anemia, emorragie o altri sintomi clinici tali da far sospettare disturbi della circolazione;

Tutte le unità di produzione, quali stagni, vasche e gabbie, sono sottoposte a ispezioni sanitarie per rilevare la presenza di pesci morti, deboli o dal comportamento anomalo. Vanno controllate con particolare attenzione le zone in prossimità delle griglie di scarico, dove i soggetti deboli tendono ad accumularsi spinti dalla corrente.

I. Prescrizioni in materia di programmi di sorveglianza e di eradicazione per l'ottenimento e il mantenimento dello status di indenne da malattia relativamente all'infezione da ISA e per il contenimento dell'infezione da virus ISA con delezione a livello di HPR

Programma di sorveglianza al fine di mantenere lo status di indenne da KHVD in Stati membri, loro zone o compartimenti nei quali il numero di aziende è limitato e la sorveglianza mirata in tali aziende non fornisce sufficienti dati epidemiologici, come indicato al punto I.3.

Programma di sorveglianza per zone e compartimenti per il periodo quadriennale di controllo che precede il riconoscimento dello status di indenne da KHVD di cui al punto I.2.1.

Programma di sorveglianza per zone e compartimenti per il periodo biennale di controllo che precede l'ottenimento dello status di indenne da KHVD di cui al punto I.2.1.

l'indagine ufficiale deve comprendere almeno un'ispezione sanitaria e il prelievo di un campione di 10 pesci, se sono stati riscontrati sintomi clinici o post-mortem compatibili con un'infezione da KHV, o di 30 pesci, se non sono stati riscontrati sintomi clinici o post-mortem. I campioni sono esaminati applicando il metodo diagnostico di cui alla lettera b) in conformità ai metodi e alle procedure diagnostici particolareggiati di cui all'allegato II, parte 2, sezione II;

Il metodo diagnostico per l'ottenimento o il mantenimento dello status di indenne da KHVD è la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) unitamente ai metodi e alle procedure diagnostici dettagliati di cui all'allegato II, parte 2, punto II.

siano state rispettate le prescrizioni di cui al punto I.2.2.1, lettere a), b) e c). Qualora il fermo dell'impianto non sia tecnicamente possibile, le aziende interessate saranno sottoposte ad una misura alternativa che fornisca garanzie quasi simili dell'eliminazione del virus KHV dall'ambiente dell'azienda:

I.4. Prescrizioni specifiche per la revoca delle misure di contenimento di cui all'articolo 39 della direttiva 2006/88/CE per l'ottenimento dello stato sanitario di categoria III relativamente a KHVD in Stati membri, loro zone o compartimenti con stato sanitario di categoria V

Tali punti di campionamento devono essere ispezionati e soggetti a campionamento a rotazione, coprendo il 50 % dei punti di campionamento ogni anno. Il campionamento viene effettuato in conformità alla tabella 2.C della sezione III. I campioni devono essere selezionati, preparati ed esaminati come descritto nella sezione II e le analisi di laboratorio devono fornire risultati negativi circa la presenza dell'agente patogeno di KHVD.

Negli Stati membri o loro zone o compartimenti nei quali il numero delle aziende è limitato e la sorveglianza mirata in tali aziende non fornisce sufficienti dati epidemiologici, i programmi di sorveglianza per il mantenimento dello status di indenne comprendono punti di campionamento selezionati come previsto dal punto I.1.

La frequenza delle ispezioni sanitarie nei compartimenti con stato sanitario di categoria I relativamente a KHVD, in zone continentali e comprendenti una o più aziende per le quali lo stato sanitario relativamente a KHVD dipende dallo stato sanitario relativamente a tale malattia elencata delle acque naturali circostanti come previsto dall'allegato V, parte II, punto 2, della direttiva 2006/88/CE, deve corrispondere a quella stabilita per i casi di rischio elevato nella tabella 2.C.

Se è prescritta una sorveglianza mirata per il mantenimento dello stato sanitario di categoria I, a norma dell'articolo 52 della direttiva 2006/88/CE, tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, di detta direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, sono sottoposte a ispezioni sanitarie e campionamento in conformità alla tabella 2.B di cui alla sezione III della presente parte, tenendo conto del rischio per l'azienda di contrarre KHV.

I.2.2.2. Prescrizioni per riottenere lo status di indenne dalla malattia per i compartimenti che comprendono una sola azienda precedentemente dichiarata indenne da KHVD

Si procede al ripopolamento solo quando tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette da KHV sono state svuotate, pulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

L'autorità competente può decidere di imporre lo svuotamento, la pulizia, la disinfezione e il fermo degli impianti in altre aziende all'interno delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite. La durata del periodo di fermo degli impianti per tali aziende è determinata dall'autorità competente in base ad una valutazione dei rischi caso per caso;

un controllo sanitario; nelle aziende per le quali le prove di cui al punto III.2. hanno prodotto risultati negativi; le ispezioni sanitarie proseguiranno una volta al mese durante la stagione in cui è probabile che la temperatura dell'acqua raggiunga > 15 °C fino a che la zona riservata alla protezione sia stata revocata in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

deve essere istituita una zona riservata alla protezione nelle immediate vicinanze di un'azienda ufficialmente dichiarata infetta da KHV che deve corrispondere all'intero bacino idrografico di tale azienda; l'autorità competente può limitare l'estensione della zona a parti del bacino idrografico, purché non risulti compromessa la prevenzione della diffusione di KHVD;

Per l'istituzione delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza si applicano le seguenti prescrizioni minime per quanto riguarda la delimitazione geografica:

La zona di protezione deve essere stata definita in base ad un'analisi caso per caso, tenendo presenti i fattori agenti sul rischio di diffusione di KHVD agli animali d'allevamento e selvatici, quali: il numero di morti, il tasso e la distribuzione della mortalità degli animali nelle aziende infette da KHV; la distanza delle aziende vicine e la loro densità; la prossimità a macelli; le aziende di contatto; le specie presenti nelle aziende; le pratiche di allevamento applicate nelle aziende infette e nelle aziende limitrofe; le condizioni idrodinamiche ed altri fattori di rilevanza epidemiologica individuati.

le misure minime di lotta stabilite al capo V, sezione 4, della direttiva 2006/88/CE devono essere state effettivamente applicate e deve essere stata stabilita una zona di protezione, come previsto dall'articolo 32, lettera b), di detta direttiva, che comprenda una zona riservata alla protezione e una zona di sorveglianza, in prossimità delle aziende ufficialmente dichiarate infette da KHV.

se, durante l'attuazione del programma di sorveglianza indicato al punto a), viene confermata l'infezione da KHV in un'azienda inclusa in detto programma di sorveglianza, e pertanto le viene revocato lo stato sanitario di categoria II, tale azienda può riottenere immediatamente il proprio stato sanitario di categoria II e continuare ad attuare il programma di sorveglianza per ottenere lo status di indenne da malattia senza attuare un programma di eradicazione di cui al punto I.2.2, purché rispetti le seguenti condizioni:

le aziende o i punti di campionamento devono essere stati sottoposti a ispezioni sanitarie, con prelievo di campioni, per un periodo minimo di quattro anni consecutivi come indicato alla tabella 2.B della sezione III.

le aziende o i punti di campionamento devono essere stati sottoposti a ispezioni sanitarie, con prelievo di campioni, per un periodo minimo di due anni consecutivi come indicato alla tabella 2.A della sezione III.

uno Stato membro, una sua zona o un suo compartimento, con stato sanitario di categoria III relativamente a KHVD, può ottenere lo stato sanitario di categoria I se tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, sono conformi alle prescrizioni relative allo status di indenne di cui all'allegato V di detta direttiva e che tutte le aziende, nonché, se prescritto dallo stesso allegato, parte I, punto 2, secondo comma, tutti i punti di campionamento di popolazioni selvatiche selezionati in conformità a tale parte, siano stati sottoposti ad uno dei seguenti programmi di sorveglianza:

i pesci selezionati devono comprendere soggetti raccolti in modo da assicurare che siano rappresentate in proporzione tutte le zone dell'azienda e tutte le classi di età.

se sono presenti soggetti deboli, che presentano un comportamento anomalo o sono morti recentemente ma non in stato di decomposizione, devono essere selezionati tali soggetti;

I. Prescrizioni in materia di programmi di sorveglianza e di eradicazione per l'ottenimento e il mantenimento dello status di indenne da KHVD e per il contenimento dell'infezione da herpesvirus della carpa koi

Programma di sorveglianza per zone e compartimenti per il periodo di controllo biennale di cui al punto I.2.1, lettera a), punto i), che deve precedere l'ottenimento dello status di indenne da VHS o IHN o entrambe.

la presenza di VHS si considera confermata se almeno uno di tali metodi diagnostici produce risultati positivi per il virus VHS. La presenza di IHN si considera confermata se almeno uno di tali metodi diagnostici produce risultati positivi per il virus IHN. La conferma del primo caso di VHS o IHN in Stati membri, loro zone o compartimenti precedentemente non infetti deve essere fondata sull'isolamento convenzionale del virus su culture cellulari o RT-qPCR;

isolamento convenzionale del virus su culture cellulari con sua successiva identificazione per via immunochimica o molecolare;

l'azienda sospetta viene sottoposta ad almeno un'ispezione sanitaria e al prelievo di un campione di 10 pesci, se sono stati riscontrati sintomi clinici o post-mortem compatibili con un'infezione da VHS o IHN o entrambe, o di almeno 30 pesci, se non sono stati riscontrati sintomi clinici o post-mortem. I campioni sono esaminati applicando almeno uno dei metodi diagnostici di cui ai punti i) e ii) in conformità ai metodi e alle procedure diagnostici particolareggiati di cui all'allegato II, parte 1, sezione II:

In conformità ai metodi e alle procedure di diagnosi approvati di cui all'allegato II, parte 1, punto I, per ottenere o mantenere lo status di indenne da VHS o IHN o entrambe il metodo diagnostico da applicare sarà uno dei seguenti:

siano state rispettate le prescrizioni di cui al punto I.2.2.1, lettere a), b) e c). Qualora il fermo dell'impianto non sia tecnicamente possibile, le aziende interessate saranno soggette ad una misura alternativa che fornisca garanzie quasi simili dell'eliminazione dei virus di VHS o IHN o di entrambe dall'ambiente dell'azienda:

I.4. Prescrizioni per la revoca delle misure di contenimento previste dall'articolo 39 della direttiva 2006/88/CE, ossia per il passaggio dallo stato sanitario della categoria V a quello della categoria III

Nel determinare la frequenza delle ispezioni sanitarie nei compartimenti con stato sanitario di categoria I relativamente a VHS o IHN o entrambe, in zone continentali e per i quali lo stato sanitario relativamente a VHS o IHN o entrambe dipende dallo stato sanitario delle popolazioni di animali acquatici nelle acque naturali circostanti come previsto all'allegato V, parte II, punto 2, della direttiva 2006/88/CE, il rischio di VHS o IHN o entrambe deve essere considerato elevato.

Quando è prescritta una sorveglianza mirata per il mantenimento dello stato sanitario di categoria I, come previsto dall'articolo 52 della direttiva 2006/88/CE del Consiglio, tutte le aziende che detengono specie sensibili elencate nell'allegato IV, parte II, di tale direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, sono sottoposte a ispezioni sanitarie e si procede a campionamenti dei pesci come stabilito alla tabella 1.C che figura nella presente parte, sezione II, tenendo presente il grado di rischio dell'azienda per quanto riguarda la diffusione di VHS o IHN o entrambe tali malattie elencate.

Si procede al ripopolamento solo quando tutte le aziende ufficialmente dichiarate infette sono state svuotate, pulite, disinfettate e sottoposte al fermo degli impianti in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

L'autorità competente può decidere di imporre lo svuotamento, la pulizia, la disinfezione e il fermo degli impianti in altre aziende all'interno delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza istituite. La durata del periodo di fermo degli impianti per tali aziende è determinata dall'autorità competente in base ad una valutazione dei rischi caso per caso;

un controllo sanitario: nelle aziende nelle quali gli esami di cui al punto i) hanno prodotto risultati negativi; le ispezioni sanitarie devono proseguire una volta al mese durante il periodo in cui la temperatura dell'acqua è inferiore a 14 °C, tranne quando gli stagni e le gabbie sono coperti di ghiaccio, fino a che la zona riservata alla protezione sia stata revocata in conformità al punto I.2.2.1, lettera c);

nelle zone costiere: a una zona, circostante la zona riservata alla protezione, in cui le escursioni di marea si sovrappongono; oppure a una zona circolare, circostante la zona riservata alla protezione, del raggio di dieci km dal centro della zona riservata alla protezione; oppure a un'area equivalente determinata in base a dati appropriati di natura idrodinamica o epidemiologica;

Per l'istituzione delle zone riservate alla protezione e di sorveglianza si applicano le seguenti prescrizioni minime per quanto riguarda la delimitazione geografica:

La zona di protezione deve essere stata definita in base ad un'analisi caso per caso, tenendo presenti i fattori agenti sul rischio di diffusione della malattia elencata agli animali d'allevamento e selvatici, quali: il numero di morti, il tasso e la distribuzione della mortalità degli animali nelle aziende infette da VHS o IHN o entrambe; la distanza delle aziende vicine e la loro densità; la prossimità a macelli; le aziende di contatto; le specie presenti nelle aziende; le pratiche di allevamento applicate nelle aziende infette e nelle aziende limitrofe; le condizioni idrodinamiche ed altri fattori di rilevanza epidemiologica individuati.

le misure minime di lotta stabilite al capo V, sezione 4, della direttiva 2006/88/CE devono essere state effettivamente applicate e deve essere stata stabilita una zona di protezione, come previsto dall'articolo 32, lettera b), di detta direttiva, che comprenda una zona riservata alla protezione e una zona di sorveglianza, in prossimità delle aziende ufficialmente dichiarate infette da VHS o IHN o entrambe tali malattie elencate.

è un'azienda continentale il cui stato sanitario in relazione a VHS o IHN o entrambe è indipendente dallo stato sanitario delle popolazioni di animali acquatici nelle acque naturali circostanti relativamente a tali malattie elencate, come da allegato V, parte II, punto 3, della direttiva 2006/88/CE;

se, durante l'attuazione del programma di sorveglianza di cui al punto a), viene confermata l'infezione da VHS o IHN o entrambe in un'azienda inclusa in detto programma di sorveglianza, e pertanto le viene revocato lo stato sanitario di categoria II, tale azienda può riottenere immediatamente il proprio stato sanitario di categoria II e continuare ad attuare il programma di sorveglianza per ottenere il riconoscimento dello status di indenne da malattia senza attuare un programma di eradicazione di cui al punto I.2.2, purché rispetti le seguenti condizioni:

le aziende o i punti di campionamento devono essere stati sottoposti a ispezioni sanitarie, con prelievo di campioni, per un periodo minimo di quattro anni consecutivi come indicato alla tabella 1.B della sezione II.

le aziende o i punti di campionamento devono essere stati sottoposti a ispezioni sanitarie, con prelievo di campioni, per un periodo minimo di due anni consecutivi come indicato alla tabella 1.A della sezione II.

uno Stato membro, una sua zona o suo compartimento, di stato sanitario di categoria III di cui all'allegato III, parte B, della direttiva 2006/88/CE, relativamente a VHS o IHN o entrambe, può ottenere lo stato sanitario di categoria I in relazione a tali malattie elencate a condizione che tutte le aziende che detengono specie sensibili, elencate nell'allegato IV, parte II, di detta direttiva, entro lo Stato membro in questione, una sua zona o un suo compartimento, risultino conformi alle prescrizioni di cui all'allegato V di detta direttiva e che tutte le aziende, nonché, se prescritto dall'allegato V, parte I, punto 2, secondo comma di detta direttiva, tutti i punti di campionamento di popolazioni selvatiche selezionati in conformità a tale parte, siano stati sottoposti ad uno dei seguenti programmi di sorveglianza:

i pesci selezionati devono comprendere soggetti raccolti in modo da assicurare che siano rappresentate in proporzione tutte le zone dell'azienda e tutte le classi di età.

se sono presenti soggetti deboli, che presentano un comportamento anomalo o sono morti recentemente ma non in stato di decomposizione, sono selezionati tali soggetti; se per l'allevamento è utilizzata acqua proveniente da diverse fonti, devono essere inclusi nel campione pesci che rappresentino tutte le fonti;

se sono presenti trote iridee, sono selezionati per il campionamento solo pesci di tale specie, tranne qualora siano presenti altre specie sensibili che mostrano i sintomi tipici della VHS o dell'IHN; se non sono presenti trote iridee, i campioni devono essere rappresentativi di tutte le altre specie sensibili presenti;

tutte le unità di produzione, quali stagni, vasche e gabbie, sono soggette a ispezioni sanitarie per rilevare la presenza di pesci morti, deboli o dal comportamento anomalo. Vanno controllate con particolare attenzione le zone in prossimità delle griglie di scarico, dove i soggetti deboli tendono ad accumularsi spinti dalla corrente;

I.1. Prescrizioni generali per le ispezioni sanitarie e il campionamento in relazione a VHS e IHN:

I. Prescrizioni in materia di programmi di sorveglianza e di eradicazione per l'ottenimento e il mantenimento dello status di indenne da VHS e IHN e misure di contenimento di tali malattie elencate

e) «azienda di contatto»: un'azienda che detiene animali acquatici per la quale, in qualsiasi modo, è stata dimostrata, o esiste il forte sospetto, di contaminazione da materiali infettivi provenienti da un'azienda ufficialmente dichiarata infetta.

a) «compartimento continentale»: una o più aziende situate nella parte continentale di uno o più Stati membri, che rientrano in un sistema comune di biosicurezza e contengono una popolazione di animali acquatici con uno specifico stato sanitario in relazione ad una determinata malattia;

i metodi di campionamento e diagnostici da usare per gli esami di laboratorio in caso di sospetta o confermata presenza delle malattie non esotiche elencate all'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE (le «malattie elencate»), come previsto all'articolo 28, lettera a), e articolo 57, lettera b), di detta direttiva;

le prescrizioni in materia di programmi di eradicazione e sorveglianza, a norma dell'articolo 44 della direttiva 2006/88/CE, e di metodi di campionamento e diagnostici da usare per dichiarare lo status di indenne da malattie degli Stati membri, o loro zone o compartimenti, come previsto al capo VII di detta direttiva;

ALLEGATO II

METODI E PROCEDURE DIAGNOSTICI PARTICOLAREGGIATI

I. Introduzione

Il presente allegato stabilisce le procedure particolareggiate per i metodi diagnostici da usare per gli esami di laboratorio nel corso dei programmi di eradicazione e sorveglianza di cui all'allegato I della presente decisione e al fine di confermare o escludere la sospetta presenza delle seguenti malattie non esotiche elencate nell'allegato IV, parte II, della direttiva 2006/88/CE («malattie elencate») a norma dell'articolo 57, lettera b), di detta direttiva:

1. Setticemia emorragica virale (VHS) Parte 1 2. Necrosi ematopoietica infettiva (IHN) Parte 1 3. Herpesvirus della carpa koi (KHVD) Parte 2 4. Anemia infettiva del salmone (ISA) Parte 3 5. Infezione da Marteilia refringens Parte 4 6. Infezione da Bonamia ostreae Parte 5 7. Malattia dei punti bianchi (WSD) Parte 6

II. Definizioni

Ai fini del presente allegato per «terreno di trasporto» si intende un terreno di coltura cellulare con aggiunta di siero fetale bovino al 10 % e 200 I.U. di penicillina, 200 μg di streptomicina e 200 μg di kanamicina per millilitro, o con altri antibiotici di provata efficacia.

PARTE 1

METODI E PROCEDURE DIAGNOSTICI PARTICOLAREGGIATI PER LA SORVEGLIANZA E LA CONFERMA DI INFEZIONI DA IHN E VHS

I. Metodi e procedure diagnostici per la sorveglianza delle infezioni da VHS e IHN

Durante il campionamento e lo svolgimento di esami di laboratorio finalizzati all'ottenimento o al mantenimento dello status di indenne da malattia relativamente a IHN o VHS, di cui all'allegato I, parte 1, sezione I, utilizzando i metodi diagnostici stabiliti in detto allegato, parte 1, punti II.1 e II.2, si applicano i metodi e le procedure diagnostici particolareggiati esposti nei seguenti punti da I.1 a I.6.

I.1. Preparazione e spedizione dei campioni ittici

I.1.1. Tessuti per l'esame virologico su coltura cellulare

Prima della spedizione o del trasferimento dei campioni al laboratorio, si asportano dai pesci, con strumenti di dissezione sterili, frammenti degli organi da esaminare, che vengono posti in provette di plastica sterili contenenti terreno di trasporto.

La quantità di materiale ittico idonea per l'esame virologico su coltura cellulare e l'analisi RT-qPCR dipende dalla taglia del pesce. Quindi nel caso degli avannotti i tessuti da prelevare saranno il pesce intero (se il corpo misura in lunghezza fino a 4 cm), le viscere compreso il rene (se il corpo misura in lunghezza da 4 a 6 cm) oppure, nel caso di pesci di taglia superiore, il rene, la milza, il cuore e/o l'encefalo, nonché il fluido ovarico dei pesci riproduttori nel periodo della fregola.

In una provetta sterile contenente almeno 4 ml di terreno di trasporto si possono raccogliere fluido ovarico, liquido seminale o parti di organi provenienti da un massimo di 10 pesci, che costituiscono un campione composto da un solo pool. In ogni campione il tessuto deve pesare almeno 0,5 grammi (g).

L'esame virologico su coltura cellulare deve iniziare quanto prima, e comunque non più tardi di 48 ore dalla raccolta dei campioni. In casi eccezionali l'esame virologico può iniziare al massimo entro 72 ore dalla raccolta del materiale da esaminare, purché tale materiale sia protetto da terreno di trasporto e possano essere soddisfatti i requisiti di temperatura durante il trasporto.

I.1.2. Campioni per l'analisi con reazione a catena della polimerasi-trascrittasi inversa in tempo reale (RT-PCR o RT-qPCR)

I campioni devono essere prelevati dai pesci secondo la procedura descritta al punto I.1.1 con uno strumento sterile e immessi in una provetta di plastica sterile contenente terreno di trasporto. In una provetta si possono raccogliere tessuti prelevati da 10 pesci al massimo, che costituiscono un campione composto da un solo pool. Se però la quantità di inoculo è limitata, si possono usare tessuti provenienti da massimo cinque pesci. In alternativa si possono raccogliere i campioni in soluzioni stabilizzanti dell'RNA, ad esempio nella proporzione 0,2 g di tessuto/ml di soluzione secondo le raccomandazioni dei fabbricanti; ogni pesce deve però essere trattato individualmente e non va inserito in campioni composti da pool a motivo della piccola quantità di materiale da usare per l'estrazione.

Al laboratorio possono essere inviati anche pesci interi.

I.2. Spedizione dei campioni ittici

Le provette contenenti tessuti ittici in terreno di trasporto per la coltivazione cellulare o l'analisi RT-PCR/RT-qPCR vanno collocate in contenitori isolati, quali ad esempio scatole di polistirolo con pareti spesse, con sufficiente ghiaccio o altri agenti refrigeranti in modo da assicurare la bassa temperatura dei campioni durante il trasporto al laboratorio. Si deve però evitare che i campioni si congelino. La temperatura del campione durante il trasporto non deve mai superare i 10 °C e, all'arrivo, nel contenitore deve ancora trovarsi del ghiaccio oppure uno o più blocchi di refrigerazione devono essere ancora parzialmente o totalmente congelati.

Al laboratorio possono essere inviati anche pesci interi se durante il trasporto si possono soddisfare le condizioni di temperatura di cui al primo comma. I pesci interi devono essere avvolti in carta assorbente per essere poi spediti in sacchetti di plastica. Si possono anche inviare al laboratorio pesci vivi.

I.3. Raccolta di materiale diagnostico supplementare

Previa approvazione del laboratorio diagnostico, possono essere raccolti e preparati anche altri tessuti ittici in vista di ulteriori esami.

I.4. Preparazione dei campioni per l'esame su coltura cellulare e la RT-qPCR

I.4.1. Congelamento in casi eccezionali

In caso di difficoltà pratiche che rendano impossibile trattare i campioni entro 48 ore dalla raccolta dei tessuti è ammesso congelare i campioni tissutali nel terreno di trasporto a – 20 °C o a temperatura inferiore ed eseguire gli esami virologici entro 14 giorni. I tessuti devono però essere congelati e scongelati una sola volta prima dell'esame. È necessario annotare e conservare tutte le informazioni sul motivo del congelamento dei campioni tissutali.

I.4.2. Omogeneizzazione degli organi

In laboratorio, il tessuto contenuto nelle provette viene interamente omogeneizzato (con stomacher, miscelatore o mortaio e pestello con sabbia sterile) e quindi messo in sospensione nel terreno di trasporto originale.

Se il campione è costituito da un pesce intero di lunghezza inferiore a 4 cm, esso deve essere tritato con forbici o bisturi sterili previo asporto della parte del corpo situata dopo l'apertura anale. Se il campione è costituito da un pesce intero di lunghezza compresa tra 4 e 6 cm si prelevano le viscere compreso il rene. Se il campione è costituito da un pesce intero di lunghezza superiore a 6 cm, si prelevano campioni di tessuti secondo le modalità descritte al punto I.1. I campioni tissutali debbono essere tritati con forbici o bisturi sterili, omogeneizzati come descritto al primo comma e messi in sospensione nel terreno di trasporto.

Il rapporto finale tra materiale tissutale e terreno di trasporto deve essere corretto in laboratorio per risultare 1:10.

I.4.3. Centrifugazione dell'omogeneizzato

L'omogeneizzato è centrifugato in una centrifuga refrigerata a temperatura compresa tra 2 °C e 5 °C e sottoposto ad una accelerazione tra 2 000 e 4 000 × g per 15 minuti; il supernatante viene raccolto e può essere trattato per quattro ore a 15 °C o per una notte a temperatura compresa tra 4 e 8 °C con antibiotici. Se il campione è stato trasportato in terreno di trasporto si può omettere il trattamento del supernatante con antibiotici.

In caso di difficoltà pratiche, quali un guasto della stufa termostatica o problemi con le colture cellulari, che rendano impossibile inoculare le cellule entro 48 ore dalla raccolta dei campioni tissutali, è possibile congelare il supernatante a – 80 °C ed eseguire gli esami virologici entro 14 giorni.

Se il supernatante raccolto viene conservato a – 80 °C entro le 48 ore successive al campionamento, esso può essere riutilizzato una sola volta per l'esame virologico.

Prima dell'inoculazione delle cellule il supernatante viene miscelato con parti uguali di un gruppo di antisieri, opportunamente diluiti, dei sierotipi indigeni del virus della necrosi pancreatica infettiva (IPN) e il tutto viene incubato minimo un'ora a 15 °C o massimo 18 ore a 4 °C. Il titolo dell'antisiero deve essere di almeno 1:2 000 in una prova di neutralizzazione delle placche al 50 %.

Il trattamento di tutti gli inoculi con antisiero del virus dell'IPN serve a impedire che si sviluppino nelle colture cellulari inoculate effetti citopatogeni (CPE) provocati dal virus dell'IPN. Si riduce in tal modo la durata degli esami virologici, nonché il numero di casi in cui la comparsa di CPE dovrebbe essere considerata potenzialmente indicativa di virus della VHS o dell'IHN.

Se i campioni provengono da unità di produzione considerate indenni da IPN, si può omettere il trattamento degli inoculi con il relativo antisiero.

I.4.4. Preparazione dei campioni per i programmi di sorveglianza basati su analisi RT-PCR e RT-qPCR

Se i campioni sono stati raccolti in terreno di trasporto si segue la procedura indicata ai punti I.4.2 e I.4.3. Dopo la centrifugazione il supernatante viene raccolto e si estrae il DNA. Se non si procede ad esami ulteriori immediatamente dopo la centrifugazione i campioni sono immediatamente congelati a – 20 °C o a temperatura inferiore.

Per l'analisi dei tessuti ittici conservati in soluzione stabilizzante dell'RNA si procede alle seguenti operazioni supplementari entro i periodi di tempo indicati per i campioni conservati alle diverse temperature:

campioni conservati a 37 °C: un giorno;

campioni conservati a 25 °C: una settimana;

campioni conservati a 4 °C: un mese;

campioni conservati a – 20 °C: senza limite di tempo.

I campioni composti da pool conservati in soluzione stabilizzante dell'RNA vanno trattati come campioni individuali conservati in soluzione stabilizzante dell'RNA. Per i campioni composti da pool conservati in soluzione stabilizzante dell'RNA il quantitativo del campione non deve superare quanto indicato nelle raccomandazioni del fabbricante per l'estrazione con kit per il DNA, come RNeasy Mini kits (Qiagen) o prodotti simili. Se il campione composto da pool contiene una quantità superiore, i kit di estrazione o i metodi devono essere adattati di conseguenza.

I campioni raccolti in soluzioni stabilizzanti dell'RNA non vanno usati per la coltura cellulare.

I.4.5. Campioni composti da pool per analisi RT-qPCR

Dato che i protocolli per RT-qPCR indicati hanno una sensibilità simile o superiore a quella dei metodi di coltura cellulare, è ammesso utilizzare per l'analisi PCR il supernatante proveniente da materiale tissutale omogeneizzato ottenuto da un campione composto da pool di organi (fino a 10 pesci) in terreno di coltura cellulare. Tuttavia, data la quantità molto inferiore di inoculo usata per l'analisi PCR al confronto con la coltura cellulare, tutti i tessuti ittici devono essere omogeneizzati attentamente prima di raccogliere il materiale per l'estrazione.

Si applica lo stesso principio anche se i campioni sono raccolti in soluzione stabilizzante dell'RNA. In tal caso però è spesso difficile raccogliere materiale rappresentativo che può provenire anche da 10 pesci in una sola provetta, per cui il numero di pesci per ogni campione composto da pool viene ridotto a un numero compreso tra 2 e 5.

I.5. Esame virologico su coltura cellulare

I.5.1. Colture cellulari e terreni

La linea cellulare BF-2 (fibroblasto del persico sole) o la linea cellulare RTG-2 (gonade di trota iridea) e cellule di Epithelioma papulosum cyprini (EPC) o di Fathead minnow (pimephales promelas) (FHM) sono coltivate a temperatura da 20 a 30 °C in un terreno adatto, specificamente il terreno di coltura di Eagle (MEM) o sue modifiche, con aggiunta di siero fetale bovino al 10 % e di antibiotici a concentrazioni standard.

Se le cellule sono coltivate in fiale chiuse, il terreno deve essere tamponato con bicarbonato. Il terreno utilizzato per la coltura di cellule in unità aperte può essere tamponato con tris(idrossimetil)amminometano cloridrato (Tris-HCl) (23 mM) e bicarbonato di sodio (6 mM). Il pH deve essere di 7,6 ± 0,2.

Le colture cellulari da utilizzare per l'inoculazione con il materiale tissutale ittico devono essere fresche, normalmente, se possibile, monostrati di colture cellulari di un giorno; è comunque accettabile che abbiano da 4 a 48 ore. Le cellule devono essere in fase di crescita al momento dell'inoculazione.

I.5.2. Inoculazione delle colture cellulari

La sospensione di organi trattata con antibiotici deve essere inoculata nelle colture cellulari in due diluizioni, che sono la diluizione primaria e, in aggiunta, una diluizione 1:10 della precedente, che hanno come esito diluizioni finali del materiale tissutale in terreno di coltura cellulare rispettivamente di 1:100 e 1:1 000, per prevenire interferenze omologhe. Come indicato al punto I.5.1 devono essere inoculate almeno due linee cellulari. Il rapporto tra la dimensione dell'inoculo e il volume del terreno di coltura cellulare dovrebbe approssimarsi a 1:10.

Per ogni diluizione ed ogni linea cellulare si utilizza una superficie cellulare minima di circa 2 cm2, corrispondente ad un pozzetto su una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Si utilizzano ove possibile piastre per colture cellulari.

I.5.3. Incubazione delle colture cellulari

Le colture cellulari inoculate sono incubate alla temperatura di 15 °C per 7-10 giorni. Se il colore del terreno di coltura cellulare vira dal rosso al giallo e indica quindi una acidificazione del terreno, occorre regolare il pH con una soluzione di bicarbonato sterile o sostanze equivalenti, in modo da garantire la sensibilità delle cellule all'infezione virale.

Almeno una volta ogni sei mesi, oppure quando si sospetta una ridotta sensibilità delle cellule, si procede alla titolazione delle scorte congelate dei virus della VHS e dell'IHN per controllare la sensibilità delle colture cellulari all'infezione. Si deve utilizzare ove possibile la procedura di cui alla sezione III.

I.5.4. Microscopia

Le colture cellulari inoculate devono essere controllate regolarmente, almeno 3 volte per settimana, per individuare la comparsa di CPE mediante ingrandimento di 40-150 ×. Qualora si constati chiaramente la presenza di CPE, si inizia immediatamente la procedura di identificazione del virus secondo quanto disposto al punto I.6.

I.5.5. Subcoltivazione

Se dopo 7-10 giorni di incubazione primaria non si sono sviluppati CPE, si effettua una subcoltivazione di cellule colturali fresche, utilizzando una superficie cellulare simile a quella della coltura principale.

7-10 giorni dopo l'inoculazione vengono inserite in un pool, in base alla linea cellulare, alcune aliquote del terreno (supernatante) di tutte le colture o tutti i pozzetti che costituiscono la coltura primaria. Tali pool vengono successivamente inoculati in colture cellulari omologhe non diluite e diluite in proporzione 1:10 (che danno come esito diluizioni finali del supernatante rispettivamente di 1:10 e 1:100) come descritto al punto I.5.2. Alternativamente si possono inoculare aliquote del 10 % del terreno che costituisce la coltura primaria direttamente in un pozzetto contenente una coltura cellulare fresca (subcoltivazione da pozzetto a pozzetto). L'inoculazione può essere preceduta da preincubazione delle diluizioni con l'antisiero del virus IPN, ad una diluizione adeguata come descritto al punto I.4.3.

Le colture inoculate vengono poi incubate per 7-10 giorni alla temperatura di 15 °C, effettuando le osservazioni di cui al punto I.5.4.

Se nei primi 3 giorni di incubazione si sviluppano CPE tossici, si deve eseguire in quella fase una subcoltivazione, ma le cellule devono essere in tal caso incubate per 7 giorni e nuovamente subcoltivate con ulteriore incubazione per altri 7 giorni. Se si sviluppano CPE tossici dopo 3 giorni, le cellule devono essere subcoltivate una volta e incubate per un totale di 14 giorni dall'inoculazione primaria. Negli ultimi 7 giorni di incubazione non deve emergere prova di tossicità.

Se, nonostante il trattamento con antibiotici, si verifica una contaminazione batterica, la subcoltivazione deve essere preceduta da centrifugazione del supernatante (da 2 000 a 4 000 × g) per 15-30 minuti a 2-5 °C e/o da filtraggio del supernatante su filtro di 0,45 μm (membrana a basso assorbimento proteico), o entrambi. Inoltre la subcoltivazione deve seguire le procedure già descritte in caso di CPE tossici al quarto comma del presente punto.

Se non si manifestano CPE la prova può essere dichiarata negativa.

I.6. Identificazione del virus

Se in una coltura cellulare sono stati osservati CPE, il terreno (supernatante) viene raccolto ed esaminato mediante una o più delle seguenti tecniche: saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), immunofluorescenza (IF), neutralizzazione, analisi RT-PCR o RT-qPCR. Se le prove non hanno permesso un'identificazione definitiva del virus entro una settimana, il supernatante deve essere inviato, per l'identificazione immediata, al laboratorio nazionale di riferimento o al laboratorio dell'UE di riferimento per le malattie dei pesci di cui all'allegato VI della direttiva 2006/88/CE.

I.6.1. ELISA

Si deve eseguire un saggio ELISA sandwich per individuare l'isolato del virus. Le piastre per microtitolazione vanno rivestite con 50 μl/pozzetto (0,9 pg) di una soluzione di immunoglobuline (Ig) di sieri anti-virus dell'IHN o anti-virus della VHS di coniglio purificate con proteina A, di qualità riconosciuta, diluite in un tampone di carbonato (pH 9,6) contenente 15 mM di sodio azide e incubate a 4 °C per un periodo compreso tra 18 ore e 2 settimane.

Su una piastra di diluizione ogni campione, contenente 1 % di Triton X-100 e i controlli positivi, deve essere diluito con la soluzione tampone [ossia una soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)-T-BSA, 1 % BSA] a 4 diverse diluizioni: non diluita, 1:4, 1:16, 1:64. Le piastre per saggio ELISA devono essere lavate in PBS contenente 0,05 % di Tween 20 (PBS-T) e 50 μl di ogni diluizione vanno trasferiti dalla piastra di diluizione alla piastra ELISA lavata e rivestita.

Le piastre ELISA devono poi essere incubate 30 minuti a 37 °C. Si devono poi lavare e incubare 30 minuti a 37 °C in presenza di anticorpi monoclonali specifici (ossia MAb IP5B11 per l'identificazione del virus della VHS e Hyb 136-3 per il virus dell'IHN). 50 μl di anticorpi di coniglio antitopo coniugati a perossidasi di rafano (HRP) diluiti a 1:1 000 in PBS-T-BSA sono trasferiti sulla piastra ELISA.

Infine, dopo un nuovo lavaggio, le reazioni sono avviate dall'aggiunta di 50 μl di ortofenilendiammina (OPD) per pozzetto. Le piastre ELISA devono essere incubate per 20 minuti a temperatura ambiente al buio, e la reazione deve essere fermata aggiungendo 100 μl di 0,5 M H2SO4 per pozzetto.

L'assorbanza va monitorata ad una lunghezza d'onda di 492 e 620 nm in un lettore ELISA. I campioni sono dichiarati positivi o negativi dopo aver confrontato i risultati del saggio con i valori di assorbanza dei controlli negativi e positivi. In linea generale i campioni con assorbanza totale (A) < 0,5 per materiale non diluito sono considerati negativi, i campioni i cui valori A sono compresi tra 0,5 e 1,0 sono considerati sospetti e i campioni con valori A > 1,0 sono considerati positivi.

Si possono utilizzare altre versioni del saggio ELISA di analoga provata efficacia in sostituzione della versione qui indicata.

I.6.2. Immunofluorescenza (IF)

L'identificazione degli agenti patogeni elencati virus della VHS e virus dell'IHN si effettua infettando le cellule in piastre «Black» a 96 pozzetti, piastre convenzionali a 24 pozzetti o piastre a coprivetrino a 24 pozzetti. Se il virus dell'IHN o della VHS o entrambi sono individuati infettando cellule su vetrini si applica il protocollo seguente:

a) i vetrini sono seminati con cellule ad una densità che conduca ad una confluenza del 60-90 % dopo 24 ore di coltivazione. Si utilizzano a tale scopo ove possibile cellule EPC a causa della loro forte aderenza alle superfici vetrose, ma si possono usare anche altre linee cellulari, ad esempio BF-2, RTG-2 o FHM. 150 μl di supernatante di coltura cellulare a due diluizioni diverse (1:10 e 1:1 000) sono inoculati in due esemplari su colture monostrato di un giorno e incubati a 15 °C per 24 ore;

b) si deve rimuovere successivamente il terreno di coltura cellulare e i monostrati di cellule infette devono essere fissati con 0,5 ml di soluzione acquosa di acetone ghiacciata (80 % vol:vol). La fissazione avviene sotto cappa da laboratorio per 15 minuti a temperatura ambiente, poi la soluzione di acetone è rimossa e i vetrini asciugati all'aria per almeno 30 minuti. A questo punto le piastre devono essere esaminate immediatamente o conservate a – 20 °C per essere usate in seguito;

c) gli anticorpi monoclonali specifici (ossia MAb IP5B11 per il virus della VHS e Hyb 136-3 per il virus dell'IHN) devono essere diluiti in 0,01 M di PBST, con pH 7,2, alla diluizione raccomandata dal fornitore degli anticorpi monoclonali; da 50 a 100 μl per pozzetto vengono aggiunti al monostrato fissato, e le piastre vengono poi incubate per un'ora a 37 °C in una camera umida;

d) i vetrini sono lavati delicatamente tre volte con PBS contenente 0,05 % Tween-20 (PBS-T), e il tampone viene rimosso completamente dopo l'ultimo risciacquo. Le cellule devono successivamente essere incubate per un'ora a 37 °C con anticorpi anti-immunoglobulina di topo coniugati a isotiocianato di fluoresceina (FITC) o tetrametilrodamina-5-(e 6-)isotiocianato (TRITC), utilizzati come anticorpi primari, diluiti secondo le istruzioni del fornitore prima di ripetere il lavaggio in PBS-T, seguito da asciugatura. Le colture colorate devono essere montate su vetrini con una soluzione fisiologica di glicerolo ed esaminate sotto luce ultravioletta incidente, utilizzando oculari da 10 o da 12 ingrandimenti ed obiettivi da 25 o da 40 con aperture rispettivamente > 0,7 e > 1,3.

In alternativa, sono ammesse altre tecniche di IF (per quanto riguarda le colture cellulari, la fissazione e gli anticorpi di riferimento) purché di analoga provata efficacia.

I.6.3. Neutralizzazione

Le cellule presenti nel supernatante raccolto devono essere eliminate per centrifugazione (tra 2 000 e 4 000 × g) o per filtraggio su membrana (0,45 μm) con membrana a basso assorbimento proteico e il supernatante deve essere diluito nelle proporzioni 1:100 e 1:10 000 nel terreno di coltura cellulare.

Alcune aliquote di almeno due diluizioni del supernatante sono mescolate e inoculate per 60 minuti a 15 °C separatamente con aliquote uguali delle seguenti soluzioni:

a) siero contenente anticorpo specifico del gruppo contro il virus della VHS ad una diluizione di 1:50 (vol:vol);

b) siero contenente anticorpo specifico del gruppo contro il virus dell'IHN ad una diluizione di 1:50 (vol:vol);

c) gruppo di antisieri dei sierotipi indigeni del virus dell'IPN ad una diluizione di 1:50 (vol:vol);

d) solo terreno (controllo positivo).

Almeno due colture cellulari devono essere inoculate con 50 μl ciascuna del miscuglio supernatante-siero di ogni virus e poi incubate a 15 °C. L'apparizione di CPE deve essere osservata come descritto al punto I.5.4.

Ceppi e isolati del virus della VHS che non reagiscono al test di neutralizzazione devono essere identificati con IF o con saggio ELISA

In alternativa sono ammessi altri test di neutralizzazione, purché di analoga provata efficacia.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Preparazione dell'RNA virale

Ogni manipolazione dell'RNA deve avvenire su ghiaccio utilizzando dei guanti.

L'RNA va purificato con il metodo fenolo-cloroformio o per affinità mediante colonnine, secondo le istruzioni del fabbricante. Si posso utilizzare kit disponibili in commercio di estrazione dell'RNA tali da produrre RNA di alta qualità, adatto all'uso con i protocolli RT-PCR descritti in dettaglio più oltre.

L'RNA va rimesso in sospensione in acqua distillata priva di RNAsi (ossia acqua trattata con pirocarbonato di dietile a 0,1 %) o un tampone di eluizione idoneo.

I.6.4.2. RT-PCR

Per la rilevazione del virus dell'IHN sono utilizzati i primer seguenti:

primer forward 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

primer reverse 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Si utilizzano i cicli seguenti (RT-PCR a una fase): 1 ciclo: 50 °C per 30 minuti; 1°Ciclo: 95 °C per 2 minuti; 30 cicli: 95 °C per 30 secondi, 50 °C per 30 secondi, 72 °C per 60 secondi; 1 Ciclo: 72 °C per 7 minuti e macerare a 4 °C.

Per la rilevazione del virus della VHS sono utilizzati i primer seguenti:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Si utilizzano i cicli seguenti (RT-PCR a una fase): 50 °C per 30 minuti, 95 °C per 15 minuti, 35 cicli a 94 °C per 30 secondi, 55 °C per 30 secondi, e 68 °C per 60 secondi. La reazione va poi mantenuta a 68 °C per 7 minuti.

La quantità e la specificità delle reazioni di RT-PCR devono essere valutate con elettroforesi su gel di agarosio all'1,5 % con bromuro di etidio e osservate con transilluminazione UV. Si può osservare un amplicon di PCR di 693 coppie di basi (bp) per il virus dell'IHN. Per il virus della VHS la dimensione è di 505 coppie di basi.

I risultati della PCR possono variare in funzione delle condizioni in cui si utilizza tale tecnica, ossia può rendersi necessaria un'ottimizzazione dei protocolli termici in funzione del termociclatore utilizzato. Possono inoltre presentarsi falsi positivi a causa di un errato appaiamento (annealing) del primer o di contaminazione in laboratorio. Si devono quindi prevedere idonei controlli positivi e negativi e amplicon a sequenza positiva e negativa per evitare dubbi. Per i primer del virus della VHS è prescritta particolare attenzione quando si utilizzano cellule BF-2 in quanto i primer possono reagire con il DNA o l'RNA della linea cellulare e produrre falsi positivi di dimensioni simili. Se si sottopone a prova un supernatante ottenuto da cellule BF-2 tutti i frammenti amplificati con PCR devono essere sequenziati.

I.6.4.3. Rilevamento del virus della VHS mediante RT-qPCR

Per il virus della VHS si deve eseguire l'amplificazione usando i primer e la sonda qui indicati:

primer forward: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

primer reverse: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

e sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR a una fase:

Su ogni piastra trattata devono essere inseriti controlli negativi e positivi. Successione dei cicli: 50 °C per 30 minuti, 95 °C per 15 minuti, 40 cicli a 94 °C per 15 secondi, 60 °C per 40 secondi, e 72 °C per 20 secondi; da adattare se necessario. In alternativa sono ammesse altre versioni dei saggi RT-PCR o RT-qPCR, purché di analoga provata efficacia.

I.6.4.4. Rilevamento del virus dell'IHN mediante RT-qPCR

Per il virus dell'IHN si deve eseguire l'amplificazione usando i primer e la sonda qui indicati:

primer forward: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

primer reverse: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA — 3′;

e sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Two-step RT-qPCR:

Poiché l'analisi si fonda su un'amplificazione in due fasi è necessario prestare particolare attenzione nel manipolare le provette tra una reazione e l'altra in modo da impedire la contaminazione.

Successione dei cicli (dopo la fase RT): 50 °C per 2 minuti, 95 °C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli a 95 °C per 15 secondi e 60 °C per 1 minuto; da adattare se necessario.

In alternativa sono ammesse altre versioni dei saggi RT-PCR o RT-qPCR, purché di analoga provata efficacia.

II. Metodi e procedure diagnostici particolareggiati per confermare o escludere il sospetto di VHS o IHN o entrambe nei casi sospetti

Quando è prescritto un esame di laboratorio per confermare o escludere la presenza di IHN o VHS o entrambe a norma dell'articolo 57, lettera b), della direttiva 2006/88/CE usando i metodi diagnostici di cui all'allegato I, parte 1, punto II.3, si applicano i seguenti metodi e procedure diagnostici particolareggiati:

a) isolamento convenzionale del virus seguito da sua identificazione sierologica, immunochimica o molecolare;

b) rilevamento del virus attraverso RT-PCR o RT-qPCR;

c) altre tecniche diagnostiche quali IFAT, ELISA, RT-PCR, immunoistochimica.

II.1. Isolamento convenzionale del virus e sua successiva identificazione

II.1.1. Selezione dei campioni

Per l'esame si selezionano almeno 10 pesci che presentino sintomi clinici di IHN o VHS.

II.1.2. Preparazione e spedizione dei campioni ittici

La preparazione e la spedizione per l'isolamento convenzionale del virus seguono i metodi e le procedure di cui al punto I.2.

II.1.3. Raccolta di materiale diagnostico supplementare

La raccolta di materiale diagnostico supplementare per l'isolamento convenzionale del virus segue i metodi e le procedure di cui al punto I.3.

II.1.4. Preparazione dei campioni per l'esame su coltura cellulare

La preparazione dei campioni per l'esame su coltura cellulare per l'isolamento convenzionale del virus segue i metodi e le procedure di cui al punto I.4.

II.1.5. Esame virologico su coltura cellulare

L'esame virologico per l'isolamento convenzionale del virus segue i metodi e le procedure di cui al punto I.5.

II.1.6. Identificazione del virus

L'esame virologico per l'isolamento convenzionale del virus segue i metodi e le procedure di cui al punto I.6.

II.2. Rilevamento del virus attraverso RT-qPCR

II.2.1. Selezione dei campioni

La selezione dei campioni per il rilevamento del virus attraverso RT-qPCR segue i metodi e le procedure di cui al punto I.1.2.

II.2.2. Preparazione e spedizione dei campioni ittici

La preparazione e la spedizione per il rilevamento del virus attraverso RT-qPCR seguono i metodi e le procedure di cui al punto I.2.

II.2.3. Raccolta di materiale diagnostico supplementare

La raccolta di materiale diagnostico supplementare per il rilevamento del virus attraverso RT-qPCR segue i metodi e le procedure di cui al punto I.3.

II.2.4. Preparazione dei campioni per RT-qPCR

La preparazione dei campioni per il rilevamento del virus attraverso RT-qPCR segue i metodi e le procedure di cui al punto I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR.

Il rilevamento del virus attraverso RT-qPCR segue i metodi e le procedure di cui ai punti I.6.4.1., I.6.4.3. e I.6.4.4.

II.3. Altre tecniche diagnostiche

Il supernatante, preparato come descritto al punto I.4.3, può essere sottoposto a saggio ELISA, prova di immunofluorescenza indiretta (IFAT) o RT-PCR come indicato rispettivamente ai punti I.6.1, I.6.2 o I.6.4. Il materiale tissutale può essere sottoposto ad esame con altre tecniche diagnostiche quali IFAT su sezioni congelate oppure immunoistochimica su materiale tissutale fissato in formalina. Queste tecniche rapide vanno integrate con un'indagine virologica come da punto II, lettera a), o punto II, lettera b), entro le 48 ore successive alla raccolta dei campioni, qualora:

a) si ottenga un risultato negativo oppure

b) si ottenga un risultato positivo a partire da materi