ALLEGATO I

Schema delle prove da effettuare a norma degli articoli 3, 4, 5 e 7

1. PRINCIPI GENERALI RELATIVI ALLA PRESENZA DELL’ORGANISMO NOCIVO SPECIFICATO

1.1. Si sospetta la presenza dell’organismo nocivo specificato quando si ottiene un risultato positivo nella prima prova di individuazione effettuata sulla pianta specificata o su campioni d’acqua.

1.2. La presenza dell’organismo nocivo specificato è confermata nei seguenti casi: a) quando la prima o la seconda prova di individuazione è un isolamento selettivo che dà luogo a colonie con morfologia tipica e si ottengono risultati positivi in due prove di identificazione effettuate sulle colonie; b) quando la prima e la seconda prova sono prove diverse dall’isolamento selettivo e si ottengono risultati positivi in due prove di identificazione dopo che il campione è stato sottoposto a isolamento selettivo che dà luogo a colonie con morfologia tipica. Una delle due prove di identificazione deve essere una prova di cui al punto 2.2, lettere e), f) e g).

2. PROVE

2.1. Prove di individuazione

Le prove di individuazione sono tali da individuare sistematicamente almeno 104 cellule/ml di sedimento risospeso prelevato da campioni asintomatici.

La seconda prova di individuazione deve basarsi su principi biologici o regioni nucleotidiche differenti rispetto alla prima prova di individuazione.

Le prove di individuazione sono le seguenti:

a) prove di immunofluorescenza, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

b) isolamento dell’organismo nocivo specificato su substrato colturale semiselettivo mSMSA, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

c) PCR tradizionale utilizzando i primer di Pastrik et al. (2002) (1), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

d) PCR in tempo reale TaqMan® utilizzando i primer e le sonde di: i) Weller et al. (2000) (2), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (utilizzando una sonda TaqMan® modificata dalla sonda originale descritta da Weller et al. (2000)], come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (prova NYtor), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iv) Massart et al. (2014) (5), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

e) LAMP (amplificazione isotermica mediata da loop) utilizzando i primer di Lenarčič et al. (2014) (6) (solo per materiale vegetale sintomatico), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

2.2. Prove di identificazione

Le prove di identificazione sono le seguenti:

a) prove di immunofluorescenza, come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

b) PCR tradizionali utilizzando i primer di Pastrik et al. (2002), come descritto dettagliatamente nelle norme diagnostiche internazionali;

c) PCR in tempo reale TaqMan® utilizzando i primer e le sonde di: i) Weller et al. (2000), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; ii) Vreeburg et al. (2016) (utilizzando una sonda TaqMan® modificata dalla sonda originale descritta da Weller et al. (2000)], come descritto dettagliatamente nelle norme diagnostiche internazionali; iii) Vreeburg et al. (2018) (prova NYtor), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali; iv) Massart et al. (2014), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

d) LAMP (amplificazione isotermica mediata da loop) utilizzando i primer di Lenarčič et al. (2014), come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

e) PCR tradizionale multiplex filotipo-specifica [Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)], come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

f) DNA barcoding [Wicker et al. (2007) (9)], come descritto nelle norme diagnostiche internazionali;

g) spettrometria di massa MALDI-TOF [van de Bilt et al. (2018) (10)], come descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

3. DIAGRAMMI DI FLUSSO DEI PROCEDIMENTI

Diagramma di flusso n. 1: procedimento diagnostico per accertare la presenza dell’organismo nocivo specificato in campioni della pianta specificata.

a Per la prima o la seconda prova di individuazione può essere utilizzato l’isolamento. Se si sospetta la presenza dell’organismo nocivo specificato sul substrato colturale, occorre purificare le colonie in modo da ottenere colture pure sulle quali effettuare due prove di identificazione.

b Una delle due prove di identificazione deve essere una prova di cui al punto 2.2, lettere e), f) e g). Per confermare la presenza dell’organismo nocivo sono necessari risultati positivi nelle due prove di identificazione.

c La terza prova di individuazione deve basarsi su principi biologici o regioni nucleotidiche differenti.

Diagramma di flusso n. 2: procedimento diagnostico per accertare la presenza dell’organismo nocivo specificato nei campioni d’acqua.

a Una delle due prove di identificazione deve essere una prova di cui al punto 2.2, lettere e), f) e g). Per confermare la presenza dell’organismo nocivo sono necessari risultati positivi nelle due prove di identificazione.

4. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

4.1. Campioni di tuberi asintomatici

Il campione standard è di 200 tuberi per prova. Il procedimento di laboratorio appropriato per trattare i coni ombelicali al fine di ottenere l’estratto per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato è descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

4.2. Campioni di piante specificate asintomatiche

L’individuazione delle infezioni latenti è effettuata su campioni compositi di segmenti di fusto o piccioli delle foglie. Il procedimento può essere applicato per un massimo di 200 parti di fusto o 200 piccioli delle foglie di piante diverse in un unico campione. Il procedimento di laboratorio appropriato per disinfettare e trattare i segmenti di fusto o di piccioli delle foglie al fine di ottenere l’estratto per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato è descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

4.3. Campioni di materiale sintomatico delle piante specificate

Sono asetticamente rimosse sezioni di tessuto dall’anello vascolare di un tubero di patata o dai fasci vascolari del fusto delle piante specificate che presentano sintomi di avvizzimento. Il procedimento di laboratorio appropriato per trattare tali tessuti al fine di ottenere l’estratto per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato è descritto dettagliatamente nelle norme diagnostiche internazionali.

4.4. Campioni d’acqua di superficie o di ricircolo (compresi le acque reflue o i reflui di lavorazione delle patate)

La prova principale per l’individuazione dell’organismo nocivo specificato in campioni di acque superficiali, acque provenienti da sistemi di ricircolo e campioni di effluenti (industria di trasformazione delle patate) è l’isolamento selettivo. Il procedimento di laboratorio appropriato per il trattamento dei campioni d’acqua è descritto nelle norme diagnostiche internazionali.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002). «Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control», European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). «Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay». Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853-2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). «Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing». Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112-121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). «Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach». EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). «Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay». European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). «Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum». PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). «A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum)». Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19-30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). «How complex is the ‘Ralstonia solanacearum species complex’». In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (a cura di Allen C, Hayward AC & Prior P), pagg. 449-461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). «Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential». Applied and Environmental Microbiology 73, 6790-6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). «Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum». European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5