91/479/CEE: Decisione della Commissione, del 29 luglio 1991, riguardante le norme sanitarie e la certificazione veterinaria per l'importazione di sperma bovino dagli Stati Uniti d'America



Gazzetta ufficiale n. L 258 del 16/09/1991 pag. 0001 - 0017



DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 29 luglio 1991 riguardante le norme sanitarie e la certificazione veterinaria per l'importazione di sperma bovino dagli Stati Uniti d'America (91/479/CEE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea, vista la direttiva 88/407/CEE del Consiglio, del 14 giugno 1988, che stabilisce le esigenze di polizia sanitaria applicabili agli scambi intracomunitari ed alle importazioni di sperma surgelato di animali della specie bovina (1), modificata da ultimo dalla direttiva 90/425/CEE (2), in particolare gli articoli 10 e 11, considerando che gli Stati Uniti d'America figurano nell'elenco, stabilito con decisione 90/14/CEE della Commissione (3), di paesi terzi da cui gli Stati membri autorizzano l'importazione di sperma surgelato di animali della specie bovina; considerando che la situazione sanitaria degli animali negli Stati Uniti d'America risulta essere buona e controllata da servizi veterinari ben strutturati ed organizzati per quanto si riferisce alle malattie trasmissibili attraverso lo sperma; considerando che le competenti autorità veterinarie degli Stati Uniti d'America hanno confermato che il suddetto paese è stato indenne per almeno dodici mesi da peste bovina, afta epizootica e pleuropolmonite essudativa contagiosa dei bovini e che in detto periodo non è stata effettuata alcuna vaccinazione contro tali malattie; considerando che le competenti autorità veterinarie statunitensi si sono impegnate a comunicare alla Commissione ed agli Stati membri, con telex o telefax, al più tardi nelle ventiquattro ore che seguono, la conferma della comparsa di una delle malattie summenzionate o della febbre catarrale o dell'emorragia epizootica, ovvero di qualsiasi modifica dei programmi di vaccinazione relativi alle suddette malattie, oppure, in tempo opportuno, le eventuali proposte di modifica delle norme statunitensi in materia di importazione di animali domestici, del loro sperma o dei loro embrioni; considerando che le competenti autorità veterinarie degli Stati Uniti d'America hanno fornito garanzie sanitarie per quanto si riferisce alla tubercolosi bovina e alla brucellosi equivalenti a quelle applicabili all'interno della Comunità; considerando che le competenti autorità veterinarie statunitensi si sono impegnate a controllare ufficialmente il rilascio di certificati previsti dalla presente decisione e ad assicurare che tutti i relativi certificati, deroghe e analisi di laboratorio sui quali la certificazione può essere stata basata siano conservati su di un registro ufficiale per i dodici mesi successivi alla spedizione dello sperma in questione; considerando che le competenti autorità veterinarie statunitensi si sono impegnate ad autorizzare ufficialmente centri di raccolta destinati all'esportazione di sperma bovino nella Comunità economica europea, come richiesto dall'articolo 9 della direttiva 88/407/CEE; considerando che le competenti autorità veterinarie degli Stati Uniti si sono impegnate a determinare e a comunicare senza indugio alla Commissione delle Comunità europee la data alla quale, per quanto si riferisce a ciascun centro di raccolta, è cessata l'attività delle specie di culicoidi responsabili della trasmissione di febbre catarrale maligna o di malattia emorragica epizootica e la data alla quale essa è ripresa; considerando che le norme sanitarie e la certificazione veterinaria devono essere adeguate alla situazione sanitaria degli animali nel paese terzo in questione; considerando che le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato veterinario permanente, HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE: Articolo 1 Fino al 31 dicembre 1992 gli Stati membri possono autorizzare l'importazione, dagli Stati Uniti d'America, di sperma bovino prelevato da tori che non abbiano dato risultati negativi alla prova della febbre catarrale maligna o a quella della malattia emorragica epizootica prescritta all'allegato I A della presente decisione, a condizione di conformarsi alle disposizioni dell'allegato II A e II B della presente decisione, e assicurano che siffatto sperma non venga immesso nel commercio intracomunitario. La Commissione rivede le disposizioni del presente paragrafo prima della data sopraindicata. Gli Stati membri autorizzano l'importazione, dagli Stati Uniti d'America, di sperma bovino conforme alle condizioni precisate nel certificato di cui all'allegato I A e, se del caso, nel certificato di cui all'allegato I B della presente decisione. Articolo 2 Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione. Fatto a Bruxelles, il 29 luglio 1991. Per la Commissione Ray MAC SHARRY Membro della Commissione (1) GU n. L 194 del 22. 7. 1988, pag. 10. (2) GU n. L 224 del 18. 8. 1990, pag. 29. (3) GU n. L 8 dell'11. 1. 1990, pag. 71. ALLEGATO I A CERTIFICATO DI SANITÀ per l'importazione di sperma di animali della specie bovina dagli Stati Uniti d'America Certificato n. . Paese di raccolta: Stati Uniti d'America Autorità competente: Ministero dell'agricoltura degli Stati Uniti - APHIS I. Identificazione dello sperma >SPAZIO PER TABELLA> II. Origine dello sperma >SPAZIO PER TABELLA> III. Destinazione dello sperma >SPAZIO PER TABELLA> IV. Informazione sanitaria Il sottoscritto veterinario federale certifica che: 1. Nel periodo avente inizio almeno dodici mesi anteriormente alla prima raccolta di sperma e avente termine trenta giorni dopo la raccolta finale, gli Stati Uniti d'America sono stati indenni da peste bovina. 2. Il centro di raccolta autorizzato, nel quale lo sperma di cui sopra è stato raccolto: a) è stato autorizzato dall'autorità veterinaria federale degli Stati Uniti d'America, a condizione che si conformi a tutte le disposizioni del presente paragrafo, all'esportazione di sperma bovino nella Comunità europea; b) è situato al centro di una zona avente un raggio di 50 km in cui, in un periodo avente inizio almeno tre mesi anteriormente alla prima raccolta di cui sopra e avente termine trenta giorni dopo la raccolta finale, non vi sono stati casi di afta epizootica, pleuropolmonite contagiosa dei bovini o stomatite vescicolare contagiosa; c) è stato esente, in un periodo avente inizio almeno tre mesi anteriormente alla prima raccolta di cui sopra e avente termine trenta giorni dopo la raccolta finale, da afta epizootica e brucellosi; d) è stato esente, per un periodo avente inizio almeno trenta giorni anteriormente alla prima raccolta di cui sopra e avente termine trenta giorni dopo la raccolta finale, da rabbia, carbonchio ematico, tubercolosi, leucosi bovina enzootica, o da qualsiasi infezione causata da Trichomonas foetus, Campilobacter foetus, Leptospira canicola, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo o Leptospira icterohaemorrhagica; e) viene sottoposto, almeno due volte all'anno, all'ispezione di un veterinario federale, nel corso della quale vengono considerati e verificati tutti i problemi relativi ai requisiti di cui al presente certificato; f) si trova sotto il controllo permanente di un veterinario del centro in modo tale che: i) gli animali vengano ammessi unicamente dietro autorizzazione espressa del veterinario del centro, previa registrazione di tutti i movimenti di animali da o verso l'esterno, ii) venga registrata la razza, la data di nascita, l'identificazione e gli antecedenti di ciascun bovino del centro nonché di tutte le prove diagnostiche e dei relativi risultati, di tutti i trattamenti e vaccinazioni effettuate sugli animali presenti, iii) l'entrata di persone non autorizzate sia vietata e i visitatori autorizzati debbano soddisfare alle condizioni determinate dal veterinario del centro, iv) venga impiegato soltanto personale tecnicamente competente, opportunamente addestrato nelle procedure di disinfezione e nelle tecniche di igiene relative alla lotta contro la diffusione della malattia; g) contiene soltanto animali della specie bovina, fatta eccezione per altri animali domestici strettamente indispensabili per il normale funzionamento del centro, purchè essi non presentino rischi di infezioni per la specie bovina e a condizione che soddisfino ai requisiti definiti dal veterinario del centro; h) è costruito in modo che: i) gli animali siano fisicamente separati dai locali per la lavorazione e la conservazione dello sperma, e questi ultimi a loro volta siano separati gli uni dagli altri, ii) disponga di un blocco di isolamento per gli animali malati, iii) disponga di locali per la raccolta dello sperma dotati di un vano separato per la pulitura e la disinfezione o sterilizzazione delle apparecchiature, iv) disponga di un locale per il trattamento e di un locale per la conservazione dello sperma (che non devono necessariamente essere nella stessa sede), v) sia evitato il contatto con il bestiame esterno, vi) l'intero centro possa essere rapidamente pulito e disinfettato. Se sono soddisfatti i requisiti di cui sopra, un centro autorizzato di raccolta dello sperma può condividere la stessa sede con uno o più centri di raccolta. 3. I tori presenti nel centro autorizzato durante il periodo di raccolta e di conservazione dello sperma: a) si trovano in detto centro continuativamente fin dal 1o gennaio 1990 e sono stati sottoposti, al loro arrivo, a tutte le prove descritte, con i risultati indicati nel punto 3, lettera d), oppure b) sono stati trasferiti da un centro di raccolta autorizzato senza venire a contatto con animali di stato sanitario inferiore e, se del caso, sono stati trasportati con un mezzo precedentemente lavato e disinfettato, oppure c) sono stati ammessi dietro autorizzazione del veterinario del centro e non hanno manifestato sintomi della malattia, in quanto i) provengono da allevamenti che sono stati dichiarati indenni da tubercolosi dall'autorità veterinaria federale o che sono situati in zone dichiarate indenni da tubercolosi dall'autorità veterinaria federale e che non sono stati mai detenuti in allevamenti di stato inferiore; ii) provengono da allevamenti che sono stati certificati indenni da brucellosi dall'autorità veterinaria federale oppure che sono situati in zone indenni da brucellosi o definiti di classe A dall'autorità veterinaria federale e che non sono stati mai detenuti in allevamenti di stato inferiore; iii) sono: - originari di allevamenti indenni, per almeno tre anni, da qualsiasi traccia di leucosi bovina enzootica, oppure - stati partoriti da vacche sottoposte, nei trenta giorni precedenti l'entrata dei loro vitelli nei locali di isolamento, a una prova sierologica per la ricerca della leucosi bovina enzootica effettuata conformemente alla procedura di cui all'allegato G della direttiva 64/432/CEE del Consiglio, con risultato negativo, oppure - stati sottoposti, entro trenta giorni dall'entrata nei locali di isolamento ufficialmente autorizzato oppure dopo aver raggiunto l'età di due anni, scegliendo tra questi due termini quello successivo, a una prova sierologica per la ricerca della leucosi bovina enzootica conformemente alla procedura di cui all'allegato G della direttiva 64/432/CEE del Consiglio con risultati negativi; iv) sono stati sottoposti, nei trenta giorni precedenti l'ingresso nei locali di isolamento autorizzati, alle seguenti prove con risultati ogni volta negativi: - prova della tubercolina USDA eseguita nella plica caudale; - ricerca sierologica standard USDA della brucellosi in vitro, con un tasso brucellare inferiore a trenta unità internazionali di agglutinazione per ml e una reazione di fissazione del complemento con un risultato inferiore a 20 unità CEE per ml (20 unità ICFT), - ricerca sierologica della leucosi bovina enzootica, secondo la procedura dell'allegato G della direttiva 64/432/CEE del Consiglio; - sieroneutralizzazione o test ELISA per la ricerca, nel siero, degli anticorpi della rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva, - prova di isolamento del virus della diarrea virale del bovini, in campioni di sangue, su colture di cellule sensibili sottoposte ad una ricerca degli anticorpi per fluorescenza o alla prova dell'immunoperossidasi (per gli animali di età inferiore a sei mesi la prova deve essere stata rinviata fino a quell'età), e alle seguenti prove, con risultati ogni volta negativi, salvo nei casi in cui il presente certificato si riferisce allo sperma prelevato e inviato anteriormente al 1o gennaio 1993 e se lo Stato membro importatore ha indicato per iscritto di applicare i termini del paragrafo 1 dell'articolo 1 della decisione 91/479/CEE della Commissione: - prova d'arresto ELISA per la ricerca della febbre catarrale maligna, facendo uso di un anticorpo monoclonale specifico del gruppo ed effettuando detta prova conformemente alla procedura di cui all'allegato IV A della decisione 91/479/CEE della Commissione, - una reazione di immunodiffusione su gel di agar per tutti i sierotipi di malattia emorragica epizootica riscontrati negli Stati Uniti d'America, effettuando detta reazione conformemente alla procedura di cui all'allegato IV B della decisione 91/479/CEE della Commissione, a condizione che tutte o qualcuna delle prove di cui sopra siano state effettuate mentre gli animali si trovavano nei locali di isolamento. Se i risultati di qualche prova per la quale il presente certificato esige un risultato negativo risulta positiva, si considera che il periodo di isolamento di trenta giorni per gli altri tori presenti nei locali non ha avuto inizio finchè l'animale in questione non è stato allontanato dai locali e, se del caso, lo stato di locali indenni da tubercolosi o da brucellosi non è stato ripristinato; v) hanno trascorso, dopo la conclusione delle prove di preisolamento descritte al punto iv) di cui sopra, un periodo di almeno trenta giorni in locali di isolamento ufficialmente riconosciuti che, alla data della loro entrata, erano situati al centro di una zona, del raggio di 10 km, nella quale non si sono manifestati casi di afta epizootica, peste bovina, pleuropolmonite bovina contagiosa o stomatite vescicolosa e che è stata indenne per almeno tre mesi da afta epizootica e brucellosi e per almeno trenta giorni da rabbia, carbonchio ematico, tubercolosi e leucosi bovina enzootica, locali in cui sono stati sottoposti alle seguenti prove con risultati ogni volta negativi: - ricerca sierologica standard USDA in vitro per la brucellosi, con un tasso brucellare inferiore a 30 unità internazionali di agglutinazione per ml, e reazione di fissazione del complemento con un risultato inferiore a 20 unità CEE per ml (20 unità ICFT), - ricerca per immunofluorescenza degli anticorpi o prova colturale per il «Campylobacter foetus» su un campione di materiale prepuziale o di liquido di lavaggio vaginale artificiale, - prova microscopica e colturale per la ricerca di «Trichomonas foetus» su un campione di materiale prepuziale o di liquido di lavaggio vaginale artificiale, - sieroneutralizzazione o test ELISA per la ricerca di anticorpi della rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva, se qualcuna delle prove di cui sopra è risultata positiva, si considera che il periodo di isolamento di trenta giorni non abbia avuto inizio finchè l'animale in questione non è stato allontanato dai locali e, se del caso, lo stato di locali indenni dalla brucellosi non è stato ripristinato, e in cui essi hanno subito un trattamento contro la leptospirosi, con due iniezioni di streptomicina o di diidrostreptomicina o un'associazione delle due, ad un intervallo di quattordici giorni (a 25 mg per kg di peso vivo); d) sono stati sottoposti almeno una volta all'anno alle seguenti prove, con risultati ogni volta negativi: i) prova della tubercolina USDA eseguita nella plica caudale, ii) ricerca sierologica standard USDA della brucellosi in vitro, con un tasso brucellare inferiore a 30 unità internazionali di agglutinazione per ml e una reazione di fissazione del complemento con un risultato inferiore a 20 unità CEE per ml (20 unità ICFT), iii) ricerca sierologica della leucosi bovina enzootica, secondo la procedura dell'allegato G della direttiva 64/432/CEE, iv) sieroneutralizzazione o test ELISA per la ricerca della rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva, a condizione che, per lo sperma raccolto anteriormente al 31 dicembre 1992 e se l'autorità competente dello Stato membro importatore ne ha fornito un'indicazione scritta, lo sperma di tori positivi a una o all'altra di queste prove possa essere accettato; su quest'ultimo deve essere stata eseguita una prova de isolamento del virus o di inoculazione animale per il complesso di malattie di cui sopra con risultato negativo e la prova deve essere stata effettuata il ......... presso il laboratorio ........, v) ricerca per immunofluorescenza degli anticorpi o prova colturale per il «Campylobacter foetus» su un campione di materiale prepuziale o di liquido di lavaggio vaginale artificiale, mentre non è necessaria nessuna prova di questo tipo nel caso di animali che non vengano usati per la produzione di sperma e a condizione che siffatta prova venga effettuata prima di ripristinare il prelievo di sperma, vi) ricerca sierologica dei sierotipi canicola, pomona, grippothyphosa, hardjo e icterohaemorrhagica della Leptospira, ed almeno due volte all'anno alle seguenti prove, con risultati ogni volta negativi, salvo se il presente certificato si riferisce allo sperma prelevato e spedito anteriormente al 1o gennaio 1993 e se l'autorità veterinaria dello Stato membro importatore ha indicato per iscritto di applicare i termini del paragrafo 1 dell'articolo 1 della decisione 91/479/CEE della Commissione: i) prova di arresto ELISA per la ricerca della febbre catarrale maligna, facendo uso di un anticorpo monoclonale specifico del gruppo ed effettuando detta prova conformemente alla procedura di cui all'allegato IV A della decisione 91/479/CEE della Commissione, ii) una reazione di immunodiffusione su gel di agar per tutti i sierotipi di malattia emorragica enzootica riscontrati negli Stati Uniti d'America, effettuando detta reazione conformemente alla procedura di cui all'allegato IV B della decisione 91/479/CEE della Commissione, a condizione che tutte le prove di cui sopra (fatta eccezione per quella della tubercolina) siano effettuate in un laboratorio appositamente autorizzato dall'autorità veterinaria federale degli Stati Uniti d'America. 4. Lo sperma sopra descritto: - viene classificato come esente da febbre catarrale maligna conformemente alla definizione di cui all'allegato II A della decisione 91/479/CEE della Commissione e in particolare al punto 5 (*), oppure - viene classificato come «sottoposto alla prova della febbre catarrale maligna» conformemente, alla definizione di cui all'allegato II B della decisione 91/479/CEE della Commissione e in particolare al punto 2 e se l'autorità veterinaria dello Stato membro importatore ha indicato per iscritto di applicare i termini del paragrafo 1 dell'articolo 1 della decisione 91/479/CEE della Commissione (*) (*) cancellare la dicitura non pertinente ed è stato: a) raccolto, senza ricorrere alle tecniche della elettroeiaculazione o elettrostimolazione, da tori di un centro di raccolta autorizzato: i) che hanno soggiornato continuativamente sul territorio degli Stati Uniti d'America per almeno sei mesi anteriormente alla prima raccolta di sperma sopra descritta e fino alla data della sua spedizione, ii) che, a differenza di quanto disposto in una deroga scritta concessa nei termini del punto 3, lettera d), sub iv) di cui sopra, o dell'articolo 1, paragrafo 1 della decisione 91/479/CEE della Commissione, non hanno dato risultati positivi in nessuna delle prove di cui al presente certificato, iii) che non sono stati usati per la monta mentre si trovavano nel centro di raccolta dello sperma autorizzato, iv) che sono stati tenuti in un centro di raccolta autorizzato per un periodo continuativo di almeno trenta giorni immediatamente prima della raccolta dello sperma, v) che in quel periodo non hanno manifestato i sintomi della malattia; b) trattato in un centro raccolta autorizzato: i) nel quale, durante la raccolta di cui sopra, non è stato trattato sperma diverso da quello di tori di centri autorizzati oppure sperma di tori aventi lo stesso stato sanitario di quelli dei centri autorizzati, a condizione che in quest'ultimo caso siffatto trattamento sia stato eseguito con apparecchiature separate e in periodi diversi da quelli della lavorazione di sperma dei centri autorizzati e che i locali di trattamento siano stati accuratamente puliti e disinfettati prima di essere usati nuovamente per il trattamento di sperma di tori dei centri autorizzati. ii) in condizioni di massima igiene, avendo opportunamente disinfettato o sterilizzato, se del caso, prima dell'impiego, tutte le parti e le apparecchiature che vengono a contatto con i tori donatori o con lo sperma, iii) usando additivi o diluenti nei quali qualsiasi prodotto di origine animale sia stato ottenuto da fonti che non costituiscono alcun rischio sanitario o che sono state trattate, prima dell'impiego, in modo tale da prevenire siffatto rischio; c) protetto mediante aggiunta dei seguenti antibiotici nelle dosi necessarie a produrre le concentrazioni indicate nello sperma diluito finale: non meno di: - 500 Ul/ml di streptomicina, - 500 Ul/ml di penicillina, - 150 ìl/ml di lincomicina, - 300 ìl/ml di spectinomicina, e, immediatamente dopo, tenuto a una temperatura non inferiore a 5 °C (41 ° F) per un periodo non inferiore a 45 minuti, oppure non meno di - 50 ìg/ml di tilosina, - 250 ìg/ml di gentamicina, - 150 ìg/ml di lincomicina, - 300 ìg/ml di spectinomicina, mantenendo il contatto tra l'antibiotico e lo sperma non diluito per almeno 3 minuti alla temperatura alla quale essi sono stati miscelati e mantenendo lo sperma e la frazione non glicerica del diluente a una temperatura non inferiore a 5 °C (41 °F) per almeno 2 ore; d) versato in contenitori singoli («paillettes»), ciascuno contrassegnato con la data della raccolta, la razza e l'identità del toro donatore nonché quella del centro di raccolta autorizzato, a condizione che questi dati, o qualsiasi parte degli stessi, siano stati segnati in codice se è stata messa a disposizione dell'autorità competente dello Stato membro importatore la completa traduzione di siffatto codice e a condizione che vi sia una chiara corrispondenza tra il contrassegno su ciascuna «paillette» e l'identificazione contenuta nel presente certificato; e) conservato in contenitori accuratamente puliti e disinfettati o eventualmente sterilizzati prima dell'impiego, facendo uso di agenti criogeni che non siano stati precedentemente usati per qualsiasi altro prodotto di origine animale, nell'opportuno centro di raccolta sotto il controllo del veterinario del centro per un periodo non inferiore a trenta giorni prima della spedizione; f) non esportato dopo la data in cui abbia dato risultato positivo una prova effettuata su qualsiasi toro del centro diversa da quella della febbre catarrale maligna o della malattia emorragica epizootica di cui al paragrafo 1, dell'articolo 1 della decisione 91/479/CEE della Commissione oppure una prova della rinotracheite bovina infettiva/vulvovaginite pustolosa infettiva come predisposto in una deroga scritta concessa ai termini del punto 3, lettera d), sub iv) di cui sopra o prima che lo stato sanitario del centro sia stato ripristinato; g) spedito in contenitori che siano stati accuratamente puliti e disinfettati o eventualmente sterilizzati prima dell'impiego, usando agenti criogeni non usati precedentemente per altri prodotti di origine animale, e che siano stati sigillati sotto il controllo del veterinario federale prima della spedizione dal centro di raccolta autorizzato. >SPAZIO PER TABELLA> ALLEGATO I B CERTIFICATO SUPPLEMENTARE relativo al trasferimento di sperma da un contenitore a un altro ai fini della spedizione dagli Stati Uniti d'America alla Comunità economica europea Il sottoscritto veterinario federale certifica che lo sperma a cui fanno riferimento i certificati ed i sigilli sottoindicati è stato trasferito, in un centro di raccolta riconosciuto e sotto la mia diretta supervisione, dai contenitori nei quali esso ci è pervenuto, con i sigilli intatti, al contenitore nel quale esso è destinato alla Comunità economica europea. >SPAZIO PER TABELLA> ALLEGATO II A Procedura per classificare come esente da febbre catarrale maligna lo sperma bovino destinato all'esportazione dagli Stati Uniti d'America verso la Comunità economica europea 1. Tutti i bovini di un centro di raccolta autorizzato devono essere sottoposti, prima dell'ingresso nel centro stesso e successivamente a intervalli di sei mesi, ad un saggio di arresto ELISA per la febbre catarrale maligna e ad un test AGID per gli anticorpi di tutti i ceppi del virus della malattia emorragica epizootica dei quali è nota l'esistenza negli Stati Uniti d'America, conformemente ai protocolli di cui all'allegato IV. 2. Un toro che abbia dato risultati negativi alle ultime prove di cui al punto 1 viene definito, ai sensi della presente decisione, come sieronegativo per la febbre catarrale maligna, a meno che o finché il sangue o lo sperma dello stesso non diano risultati positivi a qualcuna delle prove descritte al presente allegato o all'allegato III. 3. Ai fini della presente decisione, per periodo esente da vettori per quanto si riferisce al centro autorizzato di raccolta dello sperma si intende il periodo avente inizio ventuno giorni dopo la data, determinata dal ministero dell'agricoltura degli Stati Uniti e comunicata senza indugio alla direzione del centro autorizzato di raccolta in questione e alla Commissione delle Comunità europee, alla quale qualsiasi attività delle specie di culicoidi atte a trasmettere il virus della febbre catarrale maligna o della malattia emorragica epizootica cessa nella regione nella quale è situato il centro, e avente termine ventuno giorni prima della data, determinata e comunicata nello stesso modo, alla quale l'attività del suddetti culicoidi riprende. 4. Ai fini della presente decisione, per periodo di raccolta dello sperma destinato all'esportazione nella Comunità si intende un periodo non superiore a tre settimane. Se il periodo effettivo di raccolta è superiore alle tre settimane, esso viene diviso in due o più periodi di raccolta, nessuno dei quali superiore a tre settimane e ciascuno dei quali viene considerato come periodo singolo di raccolta per quanto si riferisce all'esecuzione delle prove e delle procedure relative alla febbre catarrale maligna e alla malattia emorragica epizootica descritte nella presente decisione. 5. Lo sperma che rientra in una delle categorie descritte qui di seguito viene classificato come indenne da febbre catarrale maligna ai fini dell'esportazione nella Comunità europea: a) sperma raccolto, durante il periodo esente da vettori, da un toro sieronegativo per la febbre catarrale maligna, quando un campione di sangue del toro in questione, prelevato ventuno giorni dopo la fine del periodo di raccolta è stato sottoposto con risultato negativo al un test ELISA per la febbre catarrale maligna e ad un test AGID per tutti i sierotipi di malattia emorragica epizootica che sono noti negli Stati Uniti d'America, in conformità dei protocolli di cui all'allegato IV; b) sperma raccolto, in un periodo diverso da quello esente da vettori, da un toro sieronegativo alla febbre catarrale maligna quando un campione di sangue dello stesso, prelevato ventuno giorni dopo la fine del periodo di raccolta, è stato sottoposto con risultato negativo ad un test ELISA per la febbre catarrale maligna e ad un test AGID per tutti i sierotipi della malattia emorragica epizootica che sono noti negli Stati Uniti d'America, in conformità dei protocolli di cui all'allegato IV e allorchè i campioni di sangue prelevati dal toro alle date della raccolta dello sperma destinato all'esportazione sono stati sottoposti con risultato negativo al metodo per isolare il virus descritto all'allegato III. ALLEGATO II B Procedura per classificare come «sottoposto alla prova della febbre catarrale maligna» lo sperma bovino destinato all'esportazione dagli Stati Uniti d'America verso la Comunità economica europea 1. Si applicano le definizioni di cui all'allegato II A. 2. Lo sperma che rientra in una delle due categorie descritte qui di seguito viene classificato come sottoposto alla prova della febbre catarrale maligna ai fini dell'esportazione nella Comunità europea. a) sperma raccolto durante il periodo esente da vettori da un toro non sieronegativo alla febbre catarrale maligna allorchè, dal confronto tra un campione di sangue prelevato all'inizio del periodo esente da vettori e un campione prelevato ventuno giorni dopo la fine del periodo di raccolta, non risulta sieroconversione né aumento almeno quadruplo nel livello di anticorpi neutralizzanti il siero di qualsiasi sierotipo del virus della febbre catarrale maligna o della malattia emorragica epizootica che sono noti negli Stati Uniti d'America e allorchè campioni di sangue prelevati dal toro nelle date di raccolta dello sperma destinato all'esportazione nella Comunità sono stati sottoposti con risultato negativo al metodo per isolare il virus descritto all'allegato III; b) sperma raccolto in qualsiasi periodo dell'anno da un toro non sieronegativo allorché, dal confronto tra un campione di sangue prelevato all'inizio del periodo di raccolta e un campione prelevato ventuno giorni dopo la fine dello stesso periodo, non risulta sieroconversione né aumento almeno quadruplo nel livello di anticorpi neutralizzanti il siero di qualsiasi sierotipo della febbre catarrale maligna o della malattia emorragica epizootica che sono noti negli Stati Uniti d'America e allorché campioni di sangue prelevati dal toro nelle date di raccolta dello sperma destinato all'esportazione hanno dato risultato negativo al metodo per isolare il virus descritto all'allegato III. 3. Lo sperma sottoposto alla prova della febbre catarrale maligna deve essere certificato separatamente da quello classificato esente ai termini dell'allegato II A. ALLEGATO III Metodo per isolare il virus della febbre catarrale maligna nel sangue, ai fini dell'esportazione di sperma bovino dagli Stati Uniti d'America nella Comunità economica europea 1. Il sangue viene prelevato dal toro nel giorno di ciascuna raccolta di sperma destinato all'esportazione (di norma due volte alla settimana) e inoculato per via sottocutanea e intradermica in una pecora, della quale sia già stata verificata la sieronegatività, entro quarantotto ore dal prelievo, mediante il saggio d'arresto ELISA. 2. Il sangue destinato all'isolamento del virus viene prelevato dalla pecora due volte alla settimana, per un periodo di tre settimane dalla data della prima inoculazioe di cui al punto 1. 3. Il sangue del toro e della pecora vengono inoculati, entro quarantotto ore dal prelievo, in almeno sei uova di gallina contenenti embrioni di undici giorni. 4. Se non muore nessun embrione, oppure se qualche embrione muore entro due giorni dall'inoculazione senza lesioni specifiche, la prova viene considerata negativa dopo sette giorni. 5. Il materiale prelevato da eventuali embrioni morti tra due e sette giorni viene trasferito in uova di gallina contenenti embrioni di undici giorni, usando almeno sei uova per embrione morto. 6. Se il trasferimento di materiale da un embrione morto provoca una mortalità di embrioni del 50 % o più, la prova viene considerata positiva. Il virus o i virus, dopo l'adattamento alla coltura cellulare, vengono sierotipizzati per confermare la presenza del virus della febbre catarrale maligna. 7. Il siero viene prelevato due volte alla settimana dal toro e una volta alla settimana dalla pecora per un periodo di tre settimane e viene sottoposto al test ELISA bloccante descritto all'allegato IV B, a un test di sieroneutralizzazione per gli anticorpi del virus della febbre catarrale maligna, al test AGID descritto all'allegato IV B e a un test di sieroneutralizzazione per il virus della malattia emorragica epizootica. 8. La pecora viene nuovamente sottoposta ad un test ELISA bloccante ventuno giorni dopo l'ultima inoculazione di sangue del toro. 9. Una sieroconversione oppure un aumento almeno quadruplo del titolo di anticorpi nel toro o nella pecora indicano un'infezione in corso o recente e il test viene considerato positivo. 10. Le prove sierologiche vengono effettuate su tutti i campioni insieme alla fine del periodo di prelievo. 11. L'esportazione dello sperma non viene autorizzata finché non sono state completate tutte le prove con risultati negativi. ALLEGATO IV A Protocollo relativo a un saggio di immunoassorbimento enzimatico bloccante o competitivo eseguito con un anticorpo monoclonale specifico del gruppo per la ricerca degli anticorpi del virus della febbre catarrale maligna SAGGIO COMPETITIVO ELISA PER LA FEBBRE CATARRALE MALIGNA MEDIANTE ANTICORPO MONOCLONALE 3-17-A3 Il saggio ELISA competitivo mediante anticorpo monoclonale 3-17-A3 serve a individuare anticorpi di tutti i sierotipi noti del virus della febbre catarrale maligna (BTV). Il principio su cui si basa la prova consiste nell'interruzione della reazione tra l'antigene BTV e un anticorpo monoclonale specifico del gruppo (3-17-A3) mediante aggiunta di diluizioni del siero da esaminare. Gli anticorpi del BTV presenti nel siero da esaminare bloccano la reattività dell'anticorpo monoclonale (Mab) e riducono lo sviluppo di colore previsto dietro aggiunta di substrato enzimatico. Materiali e reagenti 1. Piastre da microtitolazione a fondo piatto. 2. Antigene: preparato come descritto più sotto. 3. Tampone di arresto: blocking buffer: latte in polvere essiccato «Marvel» al 5 %, Tween-20 allo 0,1 %, (V/V) (fornito come sciroppo di pollossietilensorbitan monolaurato) in PBS. 4. Anticorpo monoclonale: 3-17-A3 (fornito come supernatante di coltura tissulare di ibridoma) conservato a 20 °C o liofilizzato, diluito a 1/50 con tampone di arresto prima dell'uso, diretto contro il polipeptide p7 specifico del gruppo. 5. Coniugato: globulina coniglio anti-topo (adsorbita ed eluita), coniugata con perossidasi di rafano e tenuta al buio a 4 °C. 6. Substrato e cromogeno: 0,2 g di ortofenilendiammina (OPD) sciolta in un tampone costituito da 2,553 g di acido citrico e 4,574 g di idrogenoortofosfato di sodio portato a volume di 500 ml con acqua distillata, suddiviso in aliquote di 25 ml e tenuto al buio a 20 °C, aggiungendo immediatamente prima dell'uso 12 ìl/25 ml di acqua ossigenata (al 30 % p/v). Maneggiare l'OPD con cautela - Indossare guanti di gomma - Sospetto mutageno. 7. Acido solforico 1 molare: 26,6 ml di acido aggiunti a 473,4 ml di acqua distillata. Ricordarsi di aggiungere sempre l'acido all'acqua, mai l'acqua all'acido. 8. Agitatore orbitale. 9. Lettore di piastra ELISA (la prova può essere letta visivamente). Schema della prova: >SPAZIO PER TABELLA> Protocollo di riferimento Controllo in bianco La serie 1 A - H è un controllo in bianco costituito da antigene BTV e coniugato. Essa può essere usata come bianco per il lettore ELISA. Controllo Mab La serie 2 A - H è un controllo dell'anticorpo monoclonale ed è costituita da antigene BTV, anticorpo monoclonale e coniugato. Essa rappresenta un controllo negativo. La media delle letture di densità ottica effettuata su questa serie di controllo rappresenta un valore di inibizione pari allo 0 %. Controllo positivo La serie 3 A - H è un controllo positivo. Essa consiste in antigene BTV, diluizioni di antisiero positivo BTV, Mab e coniugato. Essa sta ad indicare che la prova funziona adeguatamente e che livelli analoghi di inibizione dovrebbero essere ottenuti dalle varie prove. Sieri da esaminare Nello schema sperimentale di cui sopra 18 sieri possono essere analizzati ad un tasso di diluizione di 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16. Ciò fornirà qualche indicazione sul titolo dell'anticorpo nei sieri da esaminare. La gamma di diluizione potrebbe essere ulteriormente estesa per ottenere titoli dei punti finali della diluizione del siero. Alternativamente, per esami sierologici su vasta scala i sieri potrebbero essere analizzati a una singola diluizione (1/4) o a due diluizioni (1/2 e 1/4) come una rapida prova di selezione. Procedimento 1. Diluire l'antigene BTV a una concentrazione pretitolata in PBS, sottoporre brevemente agli ultrasuoni per disperdere il virus aggregato (se gli ultrasuoni non sono disponibili, pipettare vigorosamente) e aggiungere 50 ìl in tutti i pozzetti della piastra ELISA. Picchiettare i bordi della piastra per disperdere l'antigene. 2. Incubare a 37 °C per 60 minuti su un agitatore orbitale. Lavare le piastre tre volte, immergendole e vuotando i pozzetti con PBS non sterile e asciugare su carta assorbente. 3. Aggiungere 50 ìl di tampone bloccante per pozzetto. Aggiungere i sieri da esaminare ed il siero positivo negli opportuni pozzetti e diluire su tutta la piastra usando una pipetta a più canali. Non aggiungere sieri al controllo in bianco o al controllo del Mab. 4. Immediatamente dopo l'aggiunta dei sieri da esaminare, diluire il Mab in tampone bloccante (alla diluizione pretitolata) ed aggiungere 50 ìl a tutti i pozzetti della piastra, eccettuato il controllo in bianco. 5. Incubare a 37 °C per 60 minuti su un agitatore orbitale. Lavare tre volte con PBS e asciugare. 6. Diluire il concentrato di coniglio anti-topo a 1/5000 in tampone bloccante ed aggiungere 50 ìl a tutti i pozzetti della piastra. 7. Incubare a 37 °C per 60 minuti su agitatore orbitale. Lavare tre volte con PBS e asciugare. 8. Sgelare l'OPD e, immediatamente prima dell'uso, aggiungere 12 ìl di acqua ossigenata al 30 % a ogni porzione di 25 ml di OPD. Aggiungere 50 ìl a tutti i pozzetti della piastra. Lasciar sviluppare il colore per circa 10 minuti e interrompere la reazione con acido solforico 1 M (50 ìl per pozzetto). Il colore dovrebbe svilupparsi nei pozzetti di controllo del Mab ed in quei pozzetti che contengono siero nel quale non vi sono anticorpi del BTV. 9. Esaminare e registrare le piastre visivamente oppure facendo uso di un lettore spettrofotometrico. Analisi dei risultati Calcolare la densità ottica (OD) media dai controlli Mab. Essa rappresenta un valore di inibizione dello 0 %. Le densità ottiche (OD) dei sieri di riferimento vengono espresse in percentuali di inibizione con la seguente formula: Percentuali di inibizione = 100 OD in presenza del siero da esaminare OD in assenza del siero da esaminare × 100 Valori di inibizione superiori al 40 %, a una diluizione di siero di 1/4, vengono considerati positivi. La lettura visiva è possibile, dato che una inibizione del 40 % è il valore più basso facilmente apprezzabile dall'occhio. Preparazione dell'antigene ELISA BTV 1. Lavare 10 «roux» di cellule confluenti BHK-21 tre volte con mezzo di Eagle esente da siero ed infettare con siero tipo 1 del virus della febbre catarrale maligna in mezzo di Eagle esente da siero. 2. Incubare a 37 °C ed esaminare quotidianamente l'effetto citopatico (CPE). 3. Quando il CPE è evidente nell'80-90 % dello strato di cellule di ciascun «roux», raccogliere il virus scuotendo dal recipiente eventuali cellule ancora attaccate. 4. Centrifugare a 2 000-3 000 giri al minuto per agglomerare le cellule. 5. Allontanare il supernatante e risospendere le cellule in circa 30 ml di PBS contenente l'1% di «Sarkosyl» e 2 ml di fenolmetilsufonilfluoruro (tampone di lisi). Se le cellule formano un gen, è possibile aggiungere un'aliquota ulteriore di tampone di lisi per ridurre questo effetto. Nota: il fenilmetilsolfonilfluoruro è pericoloso: trattare con estrema cautela. 6. Frantumare le cellule per 60 secondi usando una sonda ultrasonica ad una ampiezza di 30 micron. 7. Centrifugare a 10 000 giri al minuto per 10 minuti. 8. Conservare il supernatante a +4 °C e risospendere l'agglomerato di cellule in 10-20 ml di tampone di lisi. 9. Sottoporre ad ultrasuoni e chiarificare, conservando il supernatante ogni volta, per un totale di tre volte. 10. Raccogliere i supernatanti e centrifugare a 24 000 giri al minuto per 120 minuti a +4 °C sopra uno strato costituito da 5 ml di saccarosio al 40 % (p/v in PBS) usando provette da centrifuga Beckmann da 30 ml ed un rotore SW 28. 11. Eliminare il supernatante, asciugare accuratamente le provette e risospendere l'agglomerato in PBS mediante ultrasuoni. Conservare l'antigene in varie porzioni a 70 °C. Titolazione dell'antigene ELISA del BTV L'antigene ELISA per la febbre catarrale maligna viene titolato mediante ELISA indiretto. Diluizioni doppie di antigene vengono titolate rispetto a una diluizione costante (1/50) di anticorpo monoclonale 3-17-A3. Il metodo è il seguente: 1. Diluire l'antigene BTV in PBS, su tutta la piastra di microtitolazione, in una serie di diluizioni doppie (50 ìl/pozzetto) usando una pipetta a molti canali. 2. Incubare per un'ora a 37 °C su un agitatore orbitale. 3. Lavare le piastre tre volte con PBS. 4. Aggiungere 50 ìl di anticorpo monoclonale 3-17-A3 (diluito a 1/50) in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione. 5. Incubare per un'ora a 37 °C su agitatore orbitare. 6. Lavare tre volte le piastre con PBS. 7. Aggiungere 50 ìl di globulina di coniglio anti-topo coniugata con perossidasi di rafano, diluita a una concentrazione ottimale pretitolata, in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione. 8. Incubare per un'ora a 37 °C su agitatore orbitale. 9. Aggiungere substrato e cromogeno come descritto in precedenza. Arrestare la reazione dopo 10 minuti aggiungendo acido solforico 1 molare (50 ìl/pozzetto). Nella prova competitiva l'anticorpo monoclonale deve essere in eccesso, per cui viene scelta una diluizione di antigene tale da ricadere sulla curva di titolazione (non sulla zona piatta) e da dare approssimativamente una densità ottica di 0,8 dopo 10 minuti. ALLEGATO IV B Protocollo per una reazione di immunodiffusione su gel di agar per la ricerca degli anticorpi della malattia emorragica epizootica La reazione di immunodiffusione su gel di agar viene effettuata secondo il seguente metodo: Materiali e reattivi Antigene L'antigene precipitante viene preparato in un sistema di coltura cellulare capace di sostenere la moltiplicazione rapida di un ceppo di riferimento del virus della malattia emorragica epizootica. Si raccomandano le cellule BHK oppure Vero. L'antigene è presente nel fluido supernatante alla fine dello sviluppo del virus, ma per essere efficace deve essere concentrato da 50 a 100 volte. Tale concentrazione può essere ottenuta con qualsiasi metodo normalmente applicabile alle proteine; il virus dell'antigene può essere inattivato mediante aggiunta di beta-propiolattone allo 0,3 % (v/v). Siero positivo di riferimento Impiegando il siero e l'antigene di riferimento internazionali si produce un siero standard nazionale. Questo viene standardizzato per ricavare le proporzioni ottimali rispetto al siero di riferimento internazionale, liofilizzato e usato in ciascuna prova come siero di riferimento positivo. Siero da esaminare Procedimento Versare agarosio all'1 %, preparato in tampone al borato o al sodio barbital, a pH 8,5-9,0, in una scatola di Petri in modo da ottenere uno spessore minimo di 3,0 mm di agarosio. Praticare nell'agar 7 pozzetti esenti da umidità, ciascuno avente 5,0 mm di diametro. Di questi pozzetti uno deve trovarsi in centro e gli altri sei devono essere sistemati attorno ad esso in un circolo avente un raggio di 3 mm. >INIZIO DI UN GRAFICO> 1 6 2 × 5 3 4 >FINE DI UN GRAFICO> Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard. Riempire i pozzetti periferici 2, 4 e 6 con siero positivo di riferimento, ed i pozzetti 1, 3 e 5 con i sieri da esaminare. Porre in incubazione per 72 ore a temperatura ambiente in camera chiusa ed umida. Interpretazione Il siero in esame è positivo se forma una linea specifica di precipitina con l'antigene e una linea completa di identificazione col siero di riferimento. Un siero in esame è negativo se non forma una linea specifica con l'antigene e se non fa incurvare la linea del siero di riferimento. Le scatole di Petri devono essere esaminate in illuminazione indiretta contro sfondo scuro.