IT Gazzetta ufficiale dell’Unione europea L 54/1

REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE

del 27 gennaio 2009

che fissa i metodi di campionamento e d'analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE ,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

visto il regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004, relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali (1), in particolare l’articolo 11, paragrafo 4, lettere a), b) e c),

considerando quanto segue:

(1) Ai fini dell'applicazione della direttiva 70/373/CEE sono stati adottati e rimangono in vigore, conformemente all'articolo 61, paragrafo 2, del regolamento (CE) n. 882/2004, i seguenti atti normativi: — prima direttiva 71/250/CEE della Commissione, del 15 giugno 1971, che fissa i metodi d'analisi comunitari per controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (2), — seconda direttiva 71/393/CEE della Commissione, del 18 novembre 1971, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (3), — terza direttiva 72/199/CEE della Commissione, del 27 aprile 1972, che fissa i metodi di analisi comunitari per i controlli degli alimenti per gli animali (4), — quarta direttiva 73/46/CEE della Commissione, del 5 dicembre 1972, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (5), — prima direttiva 76/371/CEE della Commissione, del 1o marzo 1976, che fissa i modi comunitari di prelevamento dei campioni per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali (6), — settima direttiva 76/372/CEE della Commissione, del 1o marzo 1976, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (7), — ottava direttiva 78/633/CEE della Commissione, del 15 giugno 1978, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per gli animali (8), — nona direttiva 81/715/CEE della Commissione, del 31 luglio 1981, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali (9), — decima direttiva 84/425/CEE della Commissione, del 25 luglio 1984, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali (10), — direttiva 86/174/CEE della Commissione, del 9 aprile 1986, che fissa il metodo di calcolo del valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame (11), — undicesima direttiva 93/70/CEE della Commissione, del 28 luglio 1993, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo degli alimenti per animali (12), — dodicesima direttiva 93/117/CE della Commissione, del 17 dicembre 1993, che fissa i metodi d'analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali (13), — direttiva 98/64/CE della Commissione, del 3 settembre 1998, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione degli amminoacidi, delle materie grasse grezze e dell'olaquindox negli alimenti per animali e che modifica la direttiva 71/393/CEE (14), — direttiva 1999/27/CE della Commissione, del 20 aprile 1999, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell'amprolium, del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali, che modifica le direttive 71/250/CEE e 73/46/CEE e che revoca la direttiva 74/203/CEE (15), — direttiva 1999/76/CE della Commissione, del 23 luglio 1999, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione del lasalocid sodico negli alimenti per animali (16), — direttiva 2000/45/CE della Commissione, del 6 luglio 2000, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione della vitamina A, della vitamina E e del triptofano negli alimenti per animali (17), — direttiva 2002/70/CE della Commissione, del 26 luglio 2002, che stabilisce i requisiti per la determinazione dei livelli di diossine e PCB diossina-simili nei mangimi (18), — direttiva 2003/126/CE della Commissione, del 23 dicembre 2003, che stabilisce il metodo analitico per la determinazione dei costituenti di origine animale nell'ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali (19).

(2) Dal momento che la direttiva 70/373/CEE è stata sostituita dal regolamento (CE) n. 882/2004 è opportuno sostituire i provvedimenti attuativi di tale direttiva con un regolamento unico. Al contempo vanno adeguate le metodiche tenendo conto degli sviluppi delle conoscenze in campo scientifico e tecnologico. I metodi non più validi per i fini previsti vanno soppressi. È previsto l'aggiornamento a tempo debito delle disposizioni relative al campionamento al fine di tener conto degli ultimi sviluppi nel campo della produzione, dell'immagazzinamento, del trasporto e della commercializzazione degli alimenti per animali, ma è opportuno, per il momento, mantenere le disposizioni vigenti in materia.

(3) Occorre di conseguenza abrogare le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE.

(4) Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

Il prelievo dei campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali, per quanto concerne la determinazione dei costituenti, degli additivi e delle sostanze indesiderabili, eccettuati i residui di pesticidi e i microorganismi, è effettuato secondo i metodi descritti nell'allegato I.

Articolo 2

La preparazione dei campioni per l'analisi e l'espressione dei risultati sono conformi ai metodi indicati nell'allegato II.

Articolo 3

Le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali sono effettuate secondo i metodi indicati nell'allegato III (Metodi di analisi per il controllo della composizione delle materie prime per alimenti per animali e degli alimenti composti), nell'allegato IV (Metodi di analisi per il controllo del contenuto di additivi autorizzati negli alimenti per animali), nell'allegato V (Metodi di analisi per il controllo della presenza di sostanze indesiderabili negli alimenti per animali) e nell'allegato VI (Metodi di analisi per la determinazione dei costituenti di origine animale nell'ambito del controllo ufficiale degli alimenti per animali).

Articolo 4

Il valore energetico degli alimenti composti destinati al pollame è calcolato conformemente al metodo descritto nell'allegato VII.

Articolo 5

I metodi di analisi per il controllo della presenza illecita di additivi il cui uso non è più autorizzato negli alimenti per animali di cui all'allegato VIII sono applicati a fini di conferma.

Articolo 6

Le direttive 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE sono abrogate.

I riferimenti alle direttive abrogate s'intendono fatti al presente regolamento e vanno letti secondo le tavole di concordanza che figurano nell'allegato IX.

Articolo 7

Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Esso si applica a decorrere dal 26 agosto 2009.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, il 27 gennaio 2009. Per la Commissione Androulla VASSILIOU Membro della Commissione

(1) GU L 165 del 30.4.2004, pag. 1; rettifica nella GU L 191 del 28.5.2004, pag. 1.

(2) GU L 155 del 12.7.1971, pag. 13.

(3) GU L 279 del 20.12.1971, pag. 7.

(4) GU L 123 del 29.5.1972, pag. 6.

(5) GU L 83 del 30.3.1973, pag. 21.

(6) GU L 102 del 15.4.1976, pag. 1.

(7) GU L 102 del 15.4.1976, pag. 8.

(8) GU L 206 del 29.7.1978, pag. 43.

(9) GU L 257 del 10.9.1981, pag. 38.

(10) GU L 238 del 6.9.1984, pag. 34.

(11) GU L 130 del 16.5.1986, pag. 53.

(12) GU L 234 del 17.9.1993, pag. 17.

(13) GU L 329 del 30.12.1993, pag. 54.

(14) GU L 257 del 19.9.1998, pag. 14.

(15) GU L 118 del 6.5.1999, pag. 36.

(16) GU L 207 del 6.8.1999, pag. 13.

(17) GU L 174 del 13.7.2000, pag. 32.

(18) GU L 209 del 6.8.2002, pag. 15.

(19) GU L 339 del 24.12.2003, pag. 78.

ALLEGATO I METODI DI CAMPIONAMENTO 1. FINALITÀ E CAMPO D'APPLICAZIONE I campioni destinati al controllo ufficiale degli alimenti per animali sono prelevati secondo le modalità sottoindicate. Tali campioni sono da considerarsi rappresentativi delle partite campionate. 2. PERSONALE ADDETTO AL CAMPIONAMENTO I campioni sono prelevati da personale autorizzato, appositamente designato dagli Stati membri. 3. DEFINIZIONI Partita da campionare: quantità di prodotto costituente un'unità e avente caratteristiche presunte uniformi. Campione elementare: quantità prelevata da un punto della partita campionata. Campione globale: insieme di campioni elementari prelevati da una stessa partita campionata. Campione ridotto: parte rappresentativa del campione globale, ottenuta mediante riduzione di quest'ultimo. Campione finale: parte del campione ridotto o del campione globale omogeneizzato. 4. APPARECCHIATURA 4.1. Gli strumenti necessari per il prelievo dei campioni devono essere costruiti con materiali che non contaminino i prodotti da campionare e possono essere ufficialmente approvati dagli Stati membri. 4.2. Strumenti raccomandati per il prelievo di campioni di alimenti solidi per animali 4.2.1. Campionamento manuale 4.2.1.1. Pala a fondo piatto e a bordi laterali verticali 4.2.1.2. Sonda a lungo setto o a partizioni. Le dimensioni della sonda devono essere adeguate alle caratteristiche della partita (profondità del recipiente, misure del sacco, ecc.) e alla dimensione delle particelle costituenti l'alimento. 4.2.2. Campionamento meccanico Per il prelievo di campioni di alimenti in flusso possono essere utilizzati dispositivi meccanici autorizzati. 4.2.3. Divisore Per i prelievi di campioni elementari nonché per la preparazione di campioni ridotti e di campioni finali possono essere utilizzati strumenti che servono a dividere i campioni in parti approssimativamente uguali. 5. REQUISITI QUANTITATIVI 5.A. Per il controllo delle sostanze o dei prodotti ripartiti in modo uniforme negli alimenti per animali 5.A.1. Partita da campionare L'entità della partita da campionare deve essere tale da consentire il prelievo di campioni in ogni sua parte. 5.A.2. Campioni elementari 5.A.2.1. Alimenti alla rinfusa: Numero minimo di campioni elementari: 5.A.2.1.1. partite di peso non superiore a 2,5 t sette 5.A.2.1.2. partite di peso superiore a 2,5 t √ di 20 volte il numero di tonnellate costituenti la partita da campionare (1), con un massimo di 40 campioni elementari 5.A.2.2. Alimenti in confezioni: Numero minimo di confezioni da campionare (2): 5.A.2.2.1. Confezioni di contenuto superiore a 1 kg: 5.A.2.2.1.1. partite costituite da 1-4 confezioni tutte le confezioni 5.A.2.2.1.2. partite costituite da 5-16 confezioni quattro 5.A.2.2.1.3. partite costituite da oltre 16 confezioni √ del numero di confezioni costituenti la partita da campionare (1), per un massimo di 20 confezioni 5.A.2.2.2. Confezioni di contenuto pari o inferiore a 1 kg quattro 5.A.2.3. Alimenti liquidi o semiliquidi: Numero minimo di recipienti da campionare (2): 5.A.2.3.1. Recipienti di contenuto superiore a 1 litro: 5.A.2.3.1.1. partite costituite da 1-4 recipienti tutti i recipienti 5.A.2.3.1.2. partite costituite da 5-16 recipienti quattro 5.A.2.3.1.3. partite costituite da oltre 16 recipienti √ del numero di recipienti costituenti la partita da campionare (1), per un massimo di 20 recipienti 5.A.2.3.2. Recipienti di contenuto pari o inferiore a un litro quattro 5.A.2.4. Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali: Numero minimo di formellati o mattonelle da campionare (2): un formellato o una mattonella per partita di 25 unità, per un massimo di quattro formellati o mattonelle 5.A.3. Campione globale È richiesto un solo campione globale per partita. La massa totale dei campioni elementari destinati a costituire il campione globale non è inferiore ai seguenti quantitativi: 5.A.3.1. Alimenti alla rinfusa 4 kg 5.A.3.2. Alimenti in confezioni: 5.A.3.2.1. confezioni di contenuto superiore a 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. confezioni di contenuto pari o inferiore a 1 kg peso del contenuto di quattro confezioni d'origine 5.A.3.3. Alimenti liquidi o semiliquidi: 5.A.3.3.1. recipienti di contenuto superiore a un litro 4 litri 5.A.3.3.2. recipienti di contenuto pari o inferiore a un litro volume del contenuto di quattro recipienti d'origine 5.A.3.4. Alimenti minerali in formellati o mattonelle di sali minerali: 5.A.3.4.1. di peso unitario superiore a 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. di peso unitario pari o inferiore a 1 kg peso di quattro formellati o mattonelle d'origine 5.A.4. Campioni finali Dopo riduzione, se necessaria, si ottengono dal campione globale campioni finali. È richiesta l'analisi di almeno un campione finale. La massa del campione finale destinato all'analisi non deve essere inferiore ai seguenti quantitativi: Alimenti solidi 500 g Alimenti liquidi o semiliquidi: 500 ml 5.B. Per il controllo delle sostanze o dei prodotti indesiderabili che possono essere distribuiti in modo non uniforme negli alimenti come le aflatossine, l'ergotina di segale, il ricino, la crotalaria nelle materie prime per alimenti per animali (3) 5.B.1. Partita da campionare: cfr. punto 5.A.1. 5.B.2. Campioni elementari 5.B.2.1. Alimenti alla rinfusa: cfr. punto 5.A.2.1. 5.B.2.2. Alimenti in confezioni: Numero minimo di confezioni da campionare: 5.B.2.2.1. partite costituite da 1-4 confezioni tutte le confezioni 5.B.2.2.2. partite costituite da 5-16 confezioni quattro 5.B.2.2.3. partite costituite da oltre 16 confezioni √ del numero di confezioni costituenti la partita da campionare (1) con un massimo di 40 confezioni 5.B.3. Campione globale Il numero di campioni globali varia secondo la dimensione della partita. Il numero minimo di campioni globali per partita è indicato di seguito. Il peso totale dei campioni elementari destinati a costituire il campione globale non deve risultare inferiore a 4 kg 5.B.3.1. Alimenti alla rinfusa Peso della partita in tonnellate: Numero minimo di campioni globali per partita: fino a 1 1 più di 1 e fino a 10 2 più di 10 e fino a 40 3 più di 40 4 5.B.3.2. Alimenti confezionati Quantità di alimenti confezionati costituenti la partita da campionare in numero di confezioni: Numero minimo di campioni globali per partita: da 1 a 16 1 da 17 a 200 2 da 201 a 800 3 più di 800 4 5.B.4. Campioni finali Dopo riduzione, se necessaria, si ottengono dal campione globale campioni finali. Per ciascun campione globale è richiesta l'analisi di almeno un campione finale. Il peso del campione finale destinato all'analisi non deve essere inferiore a 500 g. 6. ISTRUZIONI RELATIVE AI PRELIEVI, ALLA FORMAZIONE E AL CONDIZIONAMENTO DEI CAMPIONI 6.1. Indicazioni generali Prelevare e formare i campioni quanto più rapidamente possibile prendendo le precauzioni necessarie per evitare qualsiasi alterazione o contaminazione del prodotto. Le superfici, i recipienti e gli strumenti impiegati devono essere puliti e asciutti. 6.2. Campioni elementari 6.2.A Destinati al controllo delle sostanze o dei prodotti ripartiti in modo uniforme nell'alimento I campioni elementari vanno prelevati a caso dall'insieme della partita da campionare e devono risultare d'entità approssimativamente uguale. 6.2.A.1. Alimenti alla rinfusa Dividere simbolicamente la partita da campionare in un numero di parti approssimativamente uguali. Scegliere a caso un numero di parti corrispondente al numero di campioni elementari di cui al punto 5.A.2 e prelevare almeno un campione da ciascuna parte. Eventualmente, procedere al campionamento al momento della messa in movimento della partita (carico o scarico). 6.2.A.2. Alimenti in confezioni Prelevare con una sonda o pala una parte del contenuto di ciascuna confezione da campionare secondo quanto indicato al punto 5.A.2. Eventualmente vuotare separatamente le confezioni. Se necessario, schiacciare i grumi separatamente per ciascun campione globale (togliendoli eventualmente dalla massa e riunendo quindi il tutto). 6.2.A.3. Alimenti liquidi o semiliquidi omogenei o omogeneizzabili Dal numero prescritto di recipienti da campionare selezionati secondo quanto indicato al punto 5.A.2, prelevare una parte del contenuto di ciascun recipiente, se necessario, dopo omogeneizzazione. I campioni elementari possono eventualmente essere prelevati al momento del travaso del prodotto. 6.2.A.4. Alimenti liquidi o semiliquidi non omogeneizzabili Dal numero prescritto di recipienti da campionare selezionati secondo quanto indicato al punto 5.A.2, prelevare i campioni a diversi livelli. I campioni possono essere prelevati anche al momento del travaso del prodotto, dopo eliminazione delle prime frazioni. In entrambi i casi, il volume totale dei prelievi non deve essere inferiore a 10 litri. 6.2.A.5. Alimenti minerali formellati o mattonelle di sali minerali Dal numero prescritto di formellati o mattonelle da campionare selezionati secondo quanto indicato al punto 5.A.2, prelevare una parte da ciascuno di essi. 6.2.B. Destinati al controllo delle sostanze o dei prodotti indesiderabili che possono essere distribuiti in modo non uniforme negli alimenti per animali come le aflatossine, l'ergotina di segale, il ricino, la crotalaria presenti nelle materie prime per alimenti per animali Dividere idealmente la partita in un numero di parti approssimativamente uguali corrispondente a quello dei campioni globali di cui al punto 5.B.3. Se tale numero è superiore a 1, ripartire il numero totale dei campioni elementari di cui al punto 5.B.2 in modo approssimativamente uguale tra le diverse parti. Prelevare quindi quantità approssimativamente uguali (4) in modo che la massa totale dei campioni relativi a ciascuna parte non sia inferiore al quantitativo minimo di 4 kg necessario per ciascun campione globale. Non riunire i campioni elementari provenienti da parti diverse. 6.3. Formazione dei campioni globali 6.3.A. Destinati al controllo delle sostanze o dei prodotti ripartiti in modo uniforme negli alimenti per animali Riunire i campioni elementari per costituire un solo campione globale. 6.3.B. Destinati al controllo delle sostanze o dei prodotti indesiderabili che possono essere distribuiti in modo non uniforme negli alimenti come le aflatossine, l'ergotina di segale, il ricino, la crotalaria nelle materie presenti prime per alimenti per animali Riunire i campioni elementari prelevati da ciascuna frazione della partita per ottenere il numero di campioni globali previsti al punto 5.B.3, avendo cura di annotare la provenienza di ciascun campione globale. 6.4. Formazione dei campioni finali Mescolare con cura ciascun campione globale per ottenere un campione omogeneo (5). Se necessario ridurre, a tal fine, il campione globale a 2 kg o a due litri (campione ridotto), con l'aiuto eventualmente di un divisore meccanico o con il metodo della suddivisione in quarti. Formare, quindi, almeno tre campioni finali di massa o di volume approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui ai punti 5.A.4 o 5.B.4. Introdurre ciascun campione in un recipiente idoneo. Prendere tutte le precauzioni del caso per evitare qualsiasi modifica alla composizione del campione o qualsiasi contaminazione o alterazione fortuita durante il trasporto o l'immagazzinaggio. 6.5. Condizionamento dei campioni finali Sigillare ed etichettare i recipienti o le confezioni (l'etichetta deve essere incorporata nel sigillo) in modo che non possano essere aperti senza violare il sigillo. 7. VERBALI DEL CAMPIONAMENTO Per ogni operazione di campionamento va redatto un verbale che permetta di identificare in modo univoco la partita campionata. 8. DESTINAZIONE DEI CAMPIONI Per ciascuna partita trasmettere il più rapidamente possibile almeno un campione finale a uno dei laboratori incaricati dell'analisi con le indicazioni necessarie all'analisi stessa. (1) Se il risultato è un numero decimale si arrotonda al numero intero superiore. (2) Per confezioni o recipienti di contenuto pari o inferiore a 1 kg o un litro, nonché per formellati o mattonelle di sali minerali di peso unitario non superiore a 1 kg, il campione elementare è dato dal contenuto di una confezione o di un recipiente d'origine, di un formellato o di una mattonella. (3) Per il controllo delle aflatossine, dell'ergotina di segale, del ricino, della crotalaria negli alimenti completi e complementari si applicano i metodi di cui al punto 5.A. (4) Nel caso degli alimenti in confezioni, prelevare con una sonda o pala una parte del contenuto delle confezioni da campionare, eventualmente dopo averle vuotate separatamente. (5) Se necessario, schiacciare i grumi separatamente per ciascun campione globale (togliendoli eventualmente dalla massa e riunendo quindi il tutto).

ALLEGATO II DISPOSIZIONI GENERALI RELATIVE AI METODI DI ANALISI DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI A. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LE ANALISI 1. Finalità Le modalità qui di seguito descritte riguardano la preparazione per l'analisi dei campioni finali, trasmessi ai laboratori di controllo dopo essere stati prelevati conformemente alle diposizioni di cui all'allegato I. La preparazione di questi campioni deve assicurare che le aliquote di sostanza previste dai metodi di analisi siano omogenee e rappresentative dei campioni finali. 2. Precauzioni necessarie Le modalità di preparazione dei campioni sono scelte in funzione dei metodi di analisi impiegati. È pertanto di fondamentale importanza assicurare la coerenza delle modalità prescelte con il metodo di analisi applicato. Effettuare tutte le operazioni in modo da evitare, nei limiti del possibile, di contaminare il campione o di modificarne le composizione. Effettuare le triturazioni, le miscelazioni e le setacciature con la massima rapidità, esponendo al minimo il campione all'aria e alla luce. Evitare l'impiego di mulini o trituratori suscettibili di riscaldare eccessivamente il campione. Per gli alimenti particolarmente sensibili al calore si raccomanda la triturazione manuale. Assicurarsi altresì che l'apparecchiatura in se stessa non costituisca una fonte di contaminazione da oligoelementi. Se il campione non può essere preparato senza variazione sensibile del contenuto di umidità, quest'ultimo va determinato prima e dopo la preparazione, secondo il metodo di dosaggio dell'umidità previsto nell'allegato III, parte A. 3. Procedimento Suddividere il campione in adeguati sottocampioni da analizzare e a cui fare riferimento, utilizzando metodi di frazionamento appropriati quali le palate alternate o un ripartitore fisso o rotante. Il metodo del cono e della quartatura è sconsigliato in quanto può dar luogo a sottocampioni con un elevato errore di ripartizione. Conservare il campione di riferimento in un recipiente appropriato pulito e asciutto, a chiusura ermetica, e preparare i sottocampioni da analizzare di peso non inferiore a 100 g secondo le modalità indicate di seguito. 3.1. Alimenti che possono essere macinati direttamente Salvo diversa indicazione specifica nei metodi di analisi, setacciare la totalità del campione su un setaccio a maglie quadrate di un millimetro di lato (conforme alla raccomandazione ISO R565) eventualmente dopo averlo frantumato. Evitare ogni frantumazione superflua. Mescolare il campione setacciato e raccoglierlo in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolare di nuovo, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare. 3.2. Alimenti che possono essere macinati dopo essiccazione Salvo diversa indicazione specifica nei metodi di analisi, essiccare il campione, in modo da portarne il contenuto di umidità ad un livello compreso tra l'8 e il 12 %, applicando il procedimento di preessiccazione indicato al punto 4.3 del metodo di dosaggio dell'umidità menzionato nell'allegato III, parte A. Procedere quindi come indicato al punto 3.1. 3.3. Alimenti liquidi o semiliquidi Raccogliere il campione in un recipiente appropriato pulito e asciutto, provvisto di chiusura ermetica. Mescolarlo accuratamente, immediatamente prima di prelevare la quantità da analizzare. 3.4. Altri alimenti Se il campione non può essere preparato secondo uno dei procedimenti di cui sopra, applicare qualsiasi altro procedimento di preparazione che consenta di ottenere quantità da analizzare omogenee e rappresentative dei campioni finali. 4. Conservazione e immagazzinamento dei campioni Conservare i campioni a una temperatura tale da non alterare la loro composizione. Per i campioni destinati all'analisi di vitamine o di sostanze particolarmente sensibili alla luce, utilizzare recipienti in vetro scuro. B. DISPOSIZIONI CONCERNENTI I REATTIVI E L'APPARECCHIATURA DA UTILIZZARE NEI METODI DI ANALISI 1. Tutti i reattivi, in mancanza di altre indicazioni, devono essere puri per analisi (p.a.). Per l'analisi degli oligoelementi, la purezza dei reattivi deve essere controllata con una prova in bianco. A seconda del risultato ottenuto, può rendersi necessaria una purificazione supplementare dei reattivi. 2. Per le operazioni di dissoluzione, diluizione, risciacquo o lavaggio, menzionate nei metodi di analisi senza indicazioni riguardo alla natura del solvente o del diluente, deve essere utilizzata acqua. Di norma, l'acqua deve essere demineralizzata o distillata. In casi particolari, indicati nei metodi di analisi, deve essere sottoposta a procedimenti specifici di purificazione. 3. Tenuto conto dell'abituale equipaggiamento dei laboratori di controllo, l'apparecchiatura descritta nei metodi di analisi si limita agli strumenti e agli apparecchi speciali o rispondenti a prescrizioni d'uso specifiche. Detto materiale deve essere pulito, soprattutto per le determinazioni di quantità minime di sostanze. C. APPLICAZIONE DEI METODI DI ANALISI ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI 1. Procedura di estrazione Diversi metodi determinano una procedura di estrazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di estrazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato un'efficienza di estrazione, per la matrice analizzata, equivalente a quella della procedura indicata nel metodo. 2. Procedura di purificazione Diversi metodi determinano una procedura di purificazione specifica. In linea di massima, è possibile applicare procedure di purificazione diverse da quella indicata nel metodo, a condizione che abbiano dimostrato di produrre risultati, per la matrice analizzata, equivalenti a quelli prodotti dalla procedura indicata nel metodo. 3. Comunicazione del metodo di analisi applicato Per determinare le sostanze presenti negli alimenti per animali si applica, di norma, un solo metodo d'analisi. Qualora siano previsti più metodi, nel bollettino d'analisi deve essere specificato il metodo applicato dal laboratorio di controllo. 4. Numero di determinazioni Il risultato indicato nel bollettino d'analisi è il valore medio ottenuto in base ad almeno due determinazioni, effettuate su aliquote distinte di sostanza, la cui ripetibilità sia soddisfacente. Tuttavia, qualora si analizzino sostanze indesiderabili, se il risultato della prima determinazione risulta nettamente inferiore (> 50 %) al valore della specifica oggetto di controllo, non è necessario procedere a ulteriori determinazioni, a condizione che si applichino le procedure appropriate in materia di qualità. Se, nel controllare il titolo dichiarato di una sostanza o di un dato ingrediente, da una prima determinazione questo risulta essere esatto (ossia, lo scarto tra il risultato dell'analisi e il titolo dichiarato rientra in un margine di variazione accettabile), non è necessario ripetere la determinazione, purché siano rispettati gli opportuni controlli di qualità. In alcuni casi il margine di variazione accettabile è definito da uno specifico atto legislativo, ad esempio la direttiva 79/373/CEE del Consiglio (1). 5. Comunicazione dei risultati dell'analisi Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite nel metodo di analisi con un numero appropriato di cifre significative e, ove necessario, corretto in funzione del contenuto di umidità del campione finale prima della sua preparazione. 6. Incertezza delle misurazioni e tasso di recupero in caso di analisi di sostanze indesiderabili Per quanto riguarda le sostanze indesiderabili ai sensi della direttiva 2002/32/CE, comprese le diossine e i PCB di tipo diossina, un prodotto destinato all'alimentazione animale è considerato non conforme al tasso massimo fissato quando il risultato d'analisi è giudicato superiore al tasso massimo, tenuto conto dell'incertezza di misura estesa e della correzione per il recupero. Al fine di valutare la conformità, si utilizzano la concentrazione risultante dall'analisi, corretta per il fattore di recupero, e l'incertezza di misura estesa sottratta. Tale procedura è applicabile unicamente nei casi in cui il metodo d'analisi consenta la stima dell'incertezza di misura e della correzione per il fattore di recupero (non è possibile, ad esempio, in caso di analisi microscopica). Il risultato dell'analisi è riportato come segue (quando il metodo d'analisi consente di valutare l'incertezza di misura e il tasso di recupero): a) corretto per il recupero, indicando il tasso di recupero. La correzione non è necessaria nel caso in cui il tasso di recupero sia compreso tra 90 e 110 %; b) nella forma «x +/- U», dove x è il risultato dell'analisi e U l'incertezza di misura estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che dà un livello di affidabilità del 95 % circa. Tuttavia, qualora il risultato dell'analisi risulti molto inferiore (> 50 %) al valore della specifica oggetto di controllo, e a condizione che si rispettino le procedure appropriate in materia di qualità e l'analisi serva unicamente a verificare la conformità alle norme giuridiche pertinenti, il risultato d'analisi può essere presentato senza correzioni per il recupero e, in questo caso, il tasso di recupero e l'incertezza della misura possono essere omessi. (1) GU L 86 del 6.4.1979, pag. 30.

ALLEGATO III METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO DELLA COMPOSIZIONE DELLE MATERIE PRIME PER ALIMENTI PER ANIMALI E DEGLI ALIMENTI COMPOSTI A. DETERMINAZIONE DELL'UMIDITÀ 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità degli alimenti per animali. Nel caso degli alimenti contenenti sostanze volatili, ad esempio acidi organici, va osservato che oltre al contenuto di umidità si rileva anche un'importante presenza di materie volatili. Il metodo non riguarda l'analisi dei prodotti lattieri in quanto materie prime per alimenti per animali, delle sostanze minerali e miscele essenzialmente composte di sostanze minerali, l'analisi dei grassi e oli vegetali, né quella dei semi e frutti oleaginosi. 2. Principio Il campione è sottoposto a essiccazione in condizioni ben definite, varianti in funzione della natura dell'alimento. La perdita di peso è determinata per pesata. È necessario procedere a una preessiccazione quando si tratta di alimenti solidi aventi un elevato contenuto di umidità. 3. Apparecchiatura 3.1. Mulino da laboratorio costruito in materiale non assorbente l'umidità, facile a pulirsi, che permetta una macinazione rapida e uniforme senza provocare un sensibile riscaldamento, eviti al massimo il contatto con l'aria in ambiente esterno e risponda ai requisiti di cui ai punti 4.1.1 e 4.1.2 (ad esempio micromacinatori a martelli o a raffreddamento ad acqua, mulini a coni smontabili, macinatori a movimento lento o a dischi dentati). 3.2. Bilancia analitica (precisione 1 mg). 3.3. Recipienti asciutti, di vetro o di metallo inossidabile, provvisti di coperchi a chiusura ermetica; superficie utile che permetta di ottenere una ripartizione della quantità di prodotto su cui si opera dell'ordine di 0,3 g/cm2. 3.4. Stufa isotermica (± 2 °C) a riscaldamento elettrico, adeguatamente ventilata, capace di assicurare una regolazione rapida della temperatura (1). 3.5. Stufa a vuoto a riscaldamento elettrico regolabile munita di pompa a olio e di un dispositivo per l'introduzione di aria calda disidratata o di un agente disidratante (ad esempio ossido di calcio). 3.6. Essiccatore a piastra in metallo o in porcellana, spessa, perforata, contenente un efficace disidratante. 4. Procedimento Nota: Le operazioni descritte in questo capitolo debbono essere effettuate immediatamente dopo l'apertura degli imballaggi contenenti i campioni. Le analisi vanno eseguite almeno due volte. 4.1. Preparazione 4.1.1. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.1.2 e 4.1.3 Prelevare almeno 50 g di campione. Se necessario macinare o dividere in particelle di grandezza appropriata in modo da evitare ogni variazione del contenuto di umidità (cfr. punto 6). 4.1.2. Cereali e semole Prelevare almeno 50 g di campione. Macinare in particelle di cui almeno la metà passi per un setaccio a maglie di 0,5 mm e non lasci più del 10 % di residuo su un setaccio a maglie rotonde di 1 mm di diametro. 4.1.3. Alimenti liquidi o pastosi, alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse Prelevare almeno 25 g di campione, pesati con l'approssimazione di 10 mg, e aggiungere una quantità appropriata di sabbia anidra, pesare con l'approssimazione di 10 mg e mescolare sino a ottenere un prodotto omogeneo. 4.2. Essiccazione 4.2.1. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati ai punti 4.2.2 e 4.2.3 Tarare, con la precisione di 1 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 103 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per quattro ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 103 oC. Rimettere il coperchio sul recipiente, estrarre quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg. Nel caso di alimenti costituiti essenzialmente da sostanze grasse, lasciare essiccare per altri 30 minuti nella stufa a 130 oC. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità. 4.2.2. Cereali, farine, semole e semolini Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, 5 g circa di prodotto macinato e ripartirlo uniformemente. Porre il recipiente, senza coperchio, nella stufa preriscaldata a 130 °C. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Lasciare essiccare per due ore a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 130 oC. Rimettere il coperchio sul recipiente, estrarre quest'ultimo dalla stufa, lasciare raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg. 4.2.3. Alimenti composti contenenti più del 4 % di saccarosio o lattosio: materie prime per mangimi quali carrube, prodotti a base di cereali idrolizzati, germi di malto, fettucce di barbabietola, «solubili» di pesce e zuccheri; alimenti composti contenenti più del 25 % di sali minerali con acqua di cristallizzazione. Tarare, con la precisione di 0,5 mg, un recipiente (3.3), provvisto di coperchio. Pesare nel recipiente tarato, con l'approssimazione di 1 mg, circa 5 g di prodotto e ripartirli uniformemente. Porre il recipiente, privo del coperchio, nella stufa a vuoto (3.5) preriscaldata a una temperatura di 80-85 oC. Per evitare che la temperatura della stufa scenda troppo, introdurre il recipiente nel più breve tempo possibile. Portare la pressione a 100 Torr e lasciare essiccare a questa pressione per quattro ore in corrente d'aria secca e calda, o mediante un disidratante (300 g circa per 20 campioni). In quest'ultimo caso interrompere la connessione con la pompa a vuoto quando è raggiunta la pressione prescritta. Misurare la durata dell'essiccazione a partire dal momento in cui la stufa ha nuovamente raggiunto la temperatura di 80-85 oC. Riportare poi con precauzione la stufa alla pressione atmosferica. Aprire la stufa, coprire immediatamente il recipiente con il coperchio, estrarlo dalla stufa, lasciarlo raffreddare per 30-45 minuti nell'essiccatore (3.6) e pesare con l'approssimazione di 1 mg. Essiccare per altri 30 minuti nella stufa a vuoto, alla temperatura di 80-85 oC, e pesare di nuovo. La differenza tra le due pesate non deve superare lo 0,1 % di umidità. 4.3. Preessiccazione 4.3.1. Alimenti per animali diversi da quelli menzionati al punto 4.3.2 Gli alimenti solidi, il cui contenuto di umidità è elevato e rende difficile la macinazione, devono essere preessiccati nel modo indicato di seguito. Pesare, con l'approssimazione di 10 mg, 50 g di prodotto non macinato (un grossolano spezzettamento può essere effettuato, se necessario, nel caso di alimenti compressi o agglomerati) in un recipiente appropriato (ad esempio, una piastra di alluminio di 20 × 12 cm con bordo di 0,5 cm). Lasciar essiccare in una stufa alla temperatura di 60-70 oC, sino a che il contenuto di umidità sia portato a un valore compreso tra l'8 e il 12 %. Togliere dalla stufa, lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per un'ora e pesare con l'approssimazione di 10 mg. Macinare subito dopo come indicato al punto 4.1.1 ed effettuare l'essiccazione come indicato ai punti 4.2.1 o 4.2.3 secondo la natura dell'alimento. 4.3.2. Cereali I cereali in granella aventi una percentuale di umidità superiore al 17 % debbono essere preessiccati nel modo indicato di seguito. Pesare, con l'approssimazione di 10 mg, 50 g di cereali in granella non moliti in un recipiente appropriato (ad esempio una piastra di alluminio di 20 × 12 cm con bordo di 0,5 cm). Lasciare essiccare in una stufa per 5-7 minuti alla temperatura di 130 oC. Togliere dalla stufa, lasciar raffreddare il prodotto non coperto nel laboratorio per due ore e pesare con l'approssimazione di 10 mg. Molire subito dopo come indicato al punto 4.1.2 ed effettuare l'essiccazione come indicato al punto 4.2.2. 5. Calcolo dei risultati Il contenuto di umidità (X), espresso in percentuale del campione, è dato dalle seguenti formule: 5.1. Essiccazione senza preessiccazione dove m = peso iniziale, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, m0 = peso, in grammi, del campione essiccato. 5.2. Essiccazione con preessiccazione dove m = peso iniziale, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, m1 = peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, dopo la preessiccazione, m2 = peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, dopo la macinazione o frantumazione, m0 = peso, in grammi, del campione essiccato. 5.3. Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera lo 0,2 % di umidità (valore assoluto). 6. Osservazione Qualora sia necessario procedere alla macinazione e questa comporti una variazione nel contenuto di umidità del prodotto, i risultati dell'analisi dei componenti dell'alimento devono essere corretti in funzione del contenuto di umidità del campione iniziale. B. DETERMINAZIONE DELL'UMIDITA NEI GRASSI E NEGLI OLI ANIMALI E VEGETALI 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di umidità (acqua ed altre materie volatili) dei grassi e degli oli animali e vegetali. 2. Principio Il campione viene sottoposto ad essiccazione a 103 oC fino a cessazione della diminuzione di massa (la perdita di peso tra due pesate consecutive deve essere inferiore o pari a 1 mg). La perdita di peso è determinata per pesata. 3. Apparecchiatura 3.1. Recipiente a fondo piano, di materiale resistente alla corrosione, diametro da 8 a 9 cm, altezza di 3 cm circa. 3.2. Termometro con bulbo rinforzato e camera di espansione all'estremità superiore, tarato da circa 80 oC ad almeno 110 oC , lunghezza di 10 cm circa. 3.3. Bagno di sabbia o piastra elettrica riscaldante. 3.4. Essiccatore, contenente un efficace disidratante. 3.5. Bilancia per analisi. 4. Procedimento Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 20 g circa del campione omogeneizzato nel recipiente (3.1), essiccato e tarato, contenente il termometro (3.2). Riscaldare sul bagno di sabbia o sulla piastra riscaldante (3.3), agitando continuamente con il termometro, in modo da far salire la temperatura a 90 oC in circa 7 minuti. Ridurre l'intensità del riscaldamento secondo la frequenza con la quale le bolle risalgono dal fondo del recipiente. La temperatura non deve superare i 105 oC. Continuare ad agitare raschiando il fondo del recipiente sino a quando non si formano più bolle. Per assicurare l'eliminazione completa dell'umidità, riscaldare più volte a 103 ± 2 oC, raffreddando a 93 oC tra i riscaldamenti successivi. Lasciare quindi raffreddare nell'essiccatore (3.4) sino a temperatura ambiente e pesare. Ripetere l'operazione fino a quando la perdita di peso tra due pesate consecutive non supera i 2 mg. Nota Un aumento del peso del campione dopo i ripetuti riscaldamenti indica un'ossidazione del grasso. In questo caso, calcolare il risultato basandosi sulla pesata effettuata immediatamente prima che il peso abbia incominciato ad aumentare. 5. Calcolo dei risultati Il contenuto di umidità, espresso in percentuale del campione, è dato dalla seguente formula: dove m = peso, in grammi, della quantità di prodotto sottoposta all'analisi, m1 = peso, in grammi, del recipiente con il suo contenuto prima del riscaldamento, m2 = peso, in grammi, del recipiente con il suo contenuto dopo il riscaldamento. I risultati inferiori allo 0,05 % debbono recare la dicitura «meno di 0,05 %». Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele, effettuate sullo stesso campione, non deve oltrepassare lo 0,05 % in valore assoluto. C. DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI PROTEINE GREGGE 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto in proteine gregge degli alimenti per animali a partire dal contenuto di azoto, dosato secondo il metodo di Kjeldahl. 2. Principio Il campione viene mineralizzato in acido solforico in presenza di un catalizzatore. La soluzione acida è alcalinizzata con una soluzione d'idrossido di sodio. L'ammoniaca viene isolata per distillazione e raccolta in una quantità determinata di acido solforico, il cui eccesso è titolato con una soluzione standard d'idrossido di sodio. In alternativa, l'ammoniaca liberatasi viene distillata in un eccesso di soluzione di acido borico e successivamente titolata con una soluzione di acido cloridrico o acido solforico. 3. Reattivi 3.1. Solfato di potassio. 3.2. Catalizzatore: ossido rameico (II) CuO o solfato di rame (II) pentaidrato CuSO4 5H2 O. 3.3. Zinco in granuli. 3.4. Acido solforico, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Acido solforico, soluzione volumetrica, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Acido solforico, soluzione volumetrica standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Indicatore rosso di metile: sciogliere 300 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo, σ = 95-96 % (v/v). 3.9. Soluzione d'idrossido di sodio (è possibile usare quello di purezza tecnica), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Idrossido di sodio, soluzione standard volumetrica, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Idrossido di sodio, soluzione volumetrica standard, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Pietra pomice in granulati, lavata con acido cloridrico e calcinata. 3.13. Acetanilide (p.f. = 114 oC, contenuto N = 10,36 %). 3.14. Saccarosio (esente da azoto). 3.15. Acido borico (H3BO3). 3.16. Soluzione d'indicatore rosso di metile: sciogliere 100 mg di rosso di metile in 100 ml di etanolo o metanolo. 3.17. Soluzione di verde di bromocresolo: sciogliere 100 mg di verde di bromocresolo in 100 ml di etanolo o metanolo. 3.18. Soluzione di acido borico (da 10 g/l a 40 g/l a seconda dell'apparecchiatura utilizzata) Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale vanno aggiunti alle soluzioni di acido borico gli indicatori rosso di metile e bromocresolo. Nella preparazione di 1 litro di soluzione di acido borico, prima di portare a volume, aggiungere 7 ml di soluzione d'indicatore rosso metile (3.16) e 10 ml di soluzione di verde di bromocresolo (3.17). A seconda dell'acqua utilizzata, il pH della soluzione di acido borico può variare da una partita all'altra. Per ottenere una prova in bianco positiva è spesso necessario un trattamento con una piccola quantità di alcali. Nota.: L'aggiunta di circa 3-4 ml di NaOH (3.11) a 1 litro di soluzione di acido borico a 10 g/l dà in genere buoni risultati. Conservare la soluzione a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce e da sorgenti di fumi di ammoniaca. 3.19. Acido cloridrico, soluzione volumetrica standard, c(HCl) = 0,10 mol/l. Nota.: Si possono utilizzare altre concentrazioni di soluzioni volumetriche (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 e 3.19) a condizione di apportare le necessarie correzioni nei calcoli. Le concentrazioni sono espresse sempre in cifre a quattro decimali. 4. Apparecchiatura Apparecchi per mineralizzazione, distillazione e titolazione secondo il metodo di Kjeldahl. 5. Procedimento 5.1. Mineralizzazione Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 1 g del campione e introdurlo nel pallone dell'apparecchio di mineralizzazione. Aggiungere 15 g di solfato di potassio (3.1), una quantità appropriata di catalizzatore (3.2) [da 0,3 g a 0,4 g di ossido rameico, oppure da 0,9 g a 1,2 g di solfato di rame (II) pentaidrato], 25 ml di acido solforico (3.4) e, se necessario, frammenti di pietra pomice (3.12). Mescolare. Riscaldare il pallone prima moderatamente, agitando di tanto in tanto, se necessario, fino a carbonizzazione della massa e a scomparsa della schiuma; quindi scaldare più intensamente sino a ebollizione regolare del liquido. Il riscaldamento è adeguato se l'acido bollendo si condensa sulle pareti del pallone. Evitare che le pareti si surriscaldino e che particelle organiche vi aderiscano. Quando la soluzione diventa limpida e di colore verde pallido prolungare l'ebollizione ancora per due ore. Lasciare quindi raffreddare. 5.2. Distillazione Aggiungere con precauzione un quantitativo d'acqua sufficiente a sciogliere completamente i solfati. Lasciar raffreddare. Aggiungere quindi, se necessario, qualche granulo di zinco (3.3). Procedere secondo il punto 5.2.1 o 5.2.2. 5.2.1. Distillazione in acido solforico Introdurre nel matraccio collettore dell'apparecchio di distillazione 25 ml misurati esattamente di acido solforico (3.5 o 3.7, a seconda del presunto contenuto di azoto) e qualche goccia di indicatore al rosso di metile (3.8). Collegare il pallone di mineralizzazione al refrigerante dell'apparecchio di distillazione e immergere l'estremità di quest'ultimo per almeno 1 cm nel liquido del matraccio collettore (cfr. osservazione al punto 8.3). Versare lentamente nel pallone 100 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.9) senza provocare una perdita di ammoniaca (cfr. osservazione al punto 8.1). Scaldare il pallone fino a distillazione completa dell'ammoniaca. 5.2.2. Distillazione in acido borico Quando la titolazione del contenuto di ammoniaca del distillato è realizzata manualmente, si applica il metodo indicato di seguito. Quando l'unità di distillazione è interamente automatizzata, anche per quanto riguarda la titolazione del tenore di ammoniaca del distillato, seguire le istruzioni d'uso di tale unità fornite dal fabbricante. Collocare un matraccio collettore contenente 25-30 ml della soluzione di acido borico (3.18) alla bocca d'uscita del refrigerante in modo che il tubo di evacuazione si trovi al di sotto della superficie dell'eccesso di soluzione di acido borico. Regolare l'unità di distillazione per ottenere 50 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.9). Far funzionare l'unità di distillazione conformemente alle istruzioni fornite dal fabbricante ed eliminare l'ammoniaca liberatasi per distillazione aggiungendo la soluzione di idrossido di sodio. Raccogliere il distillato nella soluzione di acido borico. La quantità di distillato (tempo di distillazione in corrente di vapore) dipende dal tenore di azoto nel campione. Seguire le indicazioni fornite dal fabbricante. Nota: In un'unità di distillazione semiautomatica l'aggiunta di eccesso di idrossido di sodio e la distillazione in corrente di vapore avvengono automaticamente. 5.3. Titolazione Procedere conformemente al punto 5.3.1 o 5.3.2. 5.3.1. Acido solforico Titolare l'eccesso di acido solforico nel matraccio collettore per mezzo di una soluzione d'idrossido di sodio (3.10 o 3.11) secondo la concentrazione dell'acido solforico usato, sino a raggiungere il punto finale. 5.3.2. Acido borico Titolare il contenuto del matraccio collettore con la soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (3.19) o con la soluzione volumetrica standard di acido solforico (3.6) per mezzo di una buretta e leggere la quantità di soluzione titolata utilizzata. Quando è applicato il metodo di determinazione colorimetrica del punto finale, si raggiunge il punto finale all'apparire della prima traccia di colore rosa nel contenuto. Valutare il contenuto della buretta con l'approssimazione di 0,05 ml. La visualizzazione del punto finale può essere facilitata per mezzo di un rivelatore fotometrico. È possibile farlo automaticamente per mezzo di un'unità di distillazione in corrente di vapore a titolazione automatica. Seguire le istruzioni del fabbricante relative al funzionamento dell'unità di distillazione o del distillatore titolatore, a seconda dei casi. Nota: Quando è utilizzato un sistema di titolazione automatica, con soluzione di acido borico all'1 % (3.18), la titolazione inizia non appena avviene la distillazione. In caso di utilizzo di un'unità di distillazione interamente automatica, anche la titolazione automatica dell'ammoniaca può essere eseguita applicando il metodo di determinazione del punto finale per mezzo di un sistema di titolazione potenziometrica del pH. In questo caso si ricorre ad un titolatore automatico con pH-metro, tarato in maniera appropriata entro una gamma di valori compresa tra pH 4 e pH 7 conformemente ai normali metodi di taratura del pH in laboratorio. Il punto finale in pH della titolazione è raggiunto a pH 4,6, che corrisponde al punto di inflessione (o di flesso) della curva di titolazione. 5.4. Prova in bianco Per confermare che i reattivi sono esenti da azoto, effettuare una prova in bianco (mineralizzazione, distillazione e titolazione) sostituendo il campione con 1 g di saccarosio (3.14). 6. Calcolo dei risultati I calcoli sono effettuati conformemente ai punti 6.1 o 6.2. 6.1. Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.1 Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente: dove V0 = volume (ml) di NaOH (3.10 o 3.11) usato nella prova in bianco; V1 = volume (ml) di NaOH (3.10 o 3.11) usato nella titolazione del campione; c = concentrazione (mol/l) dell'idrossido di sodio (3.10 o 3.11); m = peso (g) del campione. 6.2. Calcolo per la titolazione conformemente al punto 5.3.2 6.2.1. Titolazione con acido cloridrico Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente: dove m = peso (g) della quantità di sostanza sottoposta all'analisi; c = concentrazione (mol/l) della soluzione volumetrica standard di acido cloridrico (3.19); V0 = volume (ml) di acido cloridrico usato nella prova in bianco; V1 = volume (ml) di acido cloridrico usato per la quantità di sostanza sottoposta all'analisi. 6.2.2. Titolazione con acido solforico Calcolare il tenore di proteine gregge, espresso in percentuale di peso, con la formula seguente: dove m = peso (g) della quantità di sostanza sottoposta all'analisi; c = concentrazione (mol/l) della soluzione volumetrica standard di acido solforico (3.6); V0 = volume (ml) di acido solforico usato per la prova in bianco; V1 = volume (ml) di acido solforico (3.6) usato per la quantità di sostanza sottoposta all'analisi. 7. Verifica del metodo 7.1. Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare: — lo 0,2 % in valore assoluto per i contenuti di proteine gregge inferiori al 20 %; — l'1,0 % rispetto al valore più elevato, per i contenuti di proteine gregge compresi fra il 20 e il 40 %; — lo 0,4 % in valore assoluto per i contenuti di proteine gregge superiori al 40 %. 7.2. Precisione Eseguire l'analisi (mineralizzazione, distillazione e titolazione) su 1,5-2,0 g di acetanilide (3.13) in presenza di 1 g di saccarosio (3.14); 1 g di acetanilide consuma 14,80 ml di acido solforico (3.5). Il recupero deve essere almeno del 99 %. 8. Osservazioni 8.1. L'apparecchiatura può essere di tipo manuale, semiautomatico o automatico. Se l'apparecchio richiede un travasamento tra mineralizzazione e distillazione, il travasamento deve essere effettuato senza perdite. Se il pallone dell'apparecchio di distillazione non è provvisto di un imbuto separatore, aggiungere la soluzione d'idrossido di sodio immediatamente prima di collegare il pallone al refrigerante, lasciando colare lentamente il liquido lungo le pareti. 8.2. Se il prodotto mineralizzato si solidifica, ricominciare la determinazione usando un quantitativo di acido solforico (3.4) superiore a quello indicato sopra. 8.3. Per i prodotti poveri di sostanze azotate, il volume di acido solforico (3.7) da introdurre nel matraccio collettore può essere ridotto, se necessario, a 10 o 15 ml e portato a 25 ml con acqua. 8.4. Per analisi ordinarie possono essere applicati metodi alternativi per determinare le proteine gregge, ma il metodo di Kjeldahl descritto in questa parte C costituisce il metodo di riferimento. L'equivalenza tra i risultati ottenuti con il metodo alternativo (ad esempio, il metodo Dumas) e quelli del metodo di riferimento va dimostrata per ciascuna matrice singolarmente. Dato che i risultati ottenuti con un metodo diverso, anche dopo verifica dell'equivalenza, possono deviare leggermente da quelli ottenuti con il metodo di riferimento, è necessario indicare nella relazione di analisi il metodo utilizzato per la determinazione delle proteine gregge. D. DETERMINAZIONE DELL'UREA 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di urea negli alimenti per animali. 2. Principio Il campione è messo in sospensione nell'acqua in presenza di un chiarificante. La sospensione è filtrata. Il contenuto di urea del filtrato è determinato, dopo aggiunta di 4-dimetilamminobenzaldeide (4-DMAB), misurando la densità ottica alla lunghezza d'onda di 420 nm. 3. Reattivi 3.1. Soluzione di 4-dimetilamminobenzaldeide: sciogliere 1,6 g di 4-DMAB in 100 ml di etanolo al 96 % e aggiungere 10 ml di acido cloridrico (ρ20 1,19 g/ml). Questo reattivo si conserva soltanto per due settimane. 3.2. Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 21,9 g di acetato di zinco, Zn(CH3COO)2 2H2O e 3 g di acido acetico glaciale. Portare a 100 ml con acqua. 3.3. Soluzione di Carrez II: sciogliere nell'acqua 10,6 g di ferrocianuro di potassio, K4 Fe (CN)6 3H2O. Portare a 100 ml con acqua. 3.4. Carbone attivo non assorbente urea (eseguire un controllo). 3.5. Urea, soluzione allo 0,1 % (p/v). 4. Apparecchiatura 4.1. Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri per minuto. 4.2. Provette: 160 × 16 mm, a tappo smerigliato. 4.3. Spettrofotometro. 5. Procedimento 5.1. Analisi del campione Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 2 g del campione ed introdurli con 1 g di carbone attivo (3.4) in un matraccio tarato da 500 ml. Aggiungere 400 ml di acqua e 5 ml di soluzione di Carrez I (3.2), agitare per circa 30 secondi e aggiungere 5 ml di soluzione di Carrez II (3.3). Mescolare per mezz'ora mediante l'agitatore rotativo a capovolgimento. Portare a volume con acqua, agitare e filtrare. Prelevare 5 ml di filtrati limpidi ed incolori, introdurli nei tubi da prova con tappo smerigliato, aggiungere 5 ml di soluzione di 4-DMAB (3.1) e mescolare. Porre i tubi in bagnomaria a 20 oC (+/- 4 oC). Dopo 15 minuti, misurare la densità ottica della soluzione del campione con lo spettrofotometro a 420 nm rispetto alla soluzione della prova in bianco dei reattivi. 5.2. Curva di taratura Prelevare volumi di 1, 2, 4, 5 e 10 ml della soluzione di urea (3.5), introdurli in matracci tarati da 100 ml e portare a volume con acqua. Prelevare 5 ml di ciascuna soluzione aggiungendo ogni volta 5 ml di soluzione di 4-DMAB (3.1), mescolare e misurare la densità ottica, come indicato dianzi, rispetto ad una soluzione testimone contenente 5 ml di 4-DMAB e 5 ml d'acqua, esente da urea. Tracciare la curva di taratura. 6. Calcolo dei risultati Determinare la quantità d'urea, nella parte di campione sottoposta all'analisi, servendosi della curva di taratura. Esprimere il risultato in percentuale del campione. 7. Osservazioni 7.1. Per contenuti di urea superiori al 3 %, ridurre la quantità di campione da sottoporre all'analisi a 1 g o diluire la soluzione originale, per non avere più di 50 mg d'urea in 500 ml. 7.2. Per bassi tenori di urea, aumentare la quantità di campione da sottoporre all'analisi fino a quando il filtrato resta limpido ed incolore. 7.3. Quando il prodotto contiene composti azotati semplici, ad esempio amminoacidi, si effettua la misurazione della densità ottica a 435 nm. E. DETERMINAZIONE DELLE BASI AZOTATE VOLATILI I. PER MICRODIFFUSIONE 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili, espresse in ammoniaca, degli alimenti per gli animali. 2. Principio Il campione viene estratto con acqua, la soluzione viene chiarificata e filtrata. Le basi azotate volatili sono spostate per mezzo di una soluzione di carbonato di potassio per microdiffusione, raccolte in una soluzione di acido borico e titolate con acido solforico. 3. Reattivi 3.1. Soluzione al 20 % (p/v) di acido tricloroacetico. 3.2. Indicatore: sciogliere 33 mg di verde di bromocresolo e 65 mg di rosso di metile in 100 ml d'etanolo al 95-96 % (v/v). 3.3. Soluzione di acido borico: in un pallone tarato da 1 litro, sciogliere 10 g d'acido borico in 200 ml d'etanolo al 95-96 % (v/v) e 700 ml d'acqua. Aggiungere 10 ml di indicatore (3.2). Mescolare e aggiustare, se necessario, il colore della soluzione al rosso chiaro mediante aggiunta di una soluzione d'idrossido di sodio. 1 ml di questa soluzione consente di fissare al massimo 300 μg di ammoniaca. 3.4. Soluzione satura di carbonato di potassio: sciogliere 100 g di carbonato di potassio in 100 ml d'acqua portata all'ebollizione. Lasciar raffreddare e filtrare. 3.5. Acido solforico 0,01 mol/l. 4. Apparecchiatura 4.1. Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto 4.2. Celle di Conway (cfr. figura), in vetro o in materia plastica. 4.3. Microburette, graduate a 1/100 ml. 5. Procedimento Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 10 g di sostanza e porli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d'acqua. Mescolare o agitare il pallone, nell'agitatore rotativo, per 30 minuti. Aggiungere 50 ml della soluzione d'acido tricloroacetico (3.1), portare a volume con acqua, agitare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe. Prelevare con una pipetta 1 ml della soluzione di acido borico (3.3) nell'incavo centrale della cella Conway e, nella corona della cella, 1 ml del filtrato ottenuto dal campione. Coprire parzialmente con il coperchio ingrassato. Lasciar scolare rapidamente nella corona periferica 1 ml della soluzione satura di carbonato di potassio (3.4) e chiudere ermeticamente il coperchio. Agitare con precauzione la cella facendola rotare su un piano orizzontale in modo da assicurare la miscelazione dei due reattivi. Mantenere l'apparecchio per almeno quattro ore alla temperatura ambiente o per un'ora a 40 oC. Titolare le basi volatili nella soluzione d'acido borico con la soluzione di acido solforico (3.5) per mezzo di una microburetta (4.3). Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento, in assenza del campione da analizzare. 6. Calcolo dei risultati 1 ml di H2SO40,01 mol/l corrisponde a 0,34 mg di ammoniaca. Esprimere il risultato in percentuale del campione. Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera: — il 10 %, in valore relativo, per i contenuti di ammoniaca inferiori a 1,0 %, — lo 0,1 %, in valore assoluto, per i contenuti di ammoniaca uguali o superiori all'1,0 %. 7. Osservazione Se il contenuto di ammoniaca del campione è superiore allo 0,6 %, diluire il filtrato iniziale. CONWAY CELL Scale 1/1 II. PER DISTILLAZIONE 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo consente di determinare il contenuto di basi azotate volatili, espresse in ammoniaca, delle farine di pesce non contenenti, praticamente, urea. Il metodo è applicabile unicamente a contenuti di ammoniaca inferiori a 0,25 %. 2. Principio Il campione viene estratto con acqua, la soluzione è chiarificata e filtrata. Le basi azotate volatili sono portate/spostate all'ebollizione per aggiunta di ossido di magnesio e raccolte in una quantità determinata d'acido solforico il cui eccesso viene titolato di ritorno con una soluzione d'idrossido di sodio. 3. Reattivi 3.1. Soluzione al 20 % (p/v) di acido tricloroacetico. 3.2. Ossido di magnesio. 3.3. Emulsione antischiuma (ad esempio, silicone). 3.4. Acido solforico 0,05 mol/l. 3.5. Soluzione di idrossido di sodio (0,1 mol/l). 3.6. Soluzione allo 0,3 % (v/v) di rosso di metile in etanolo al 95-96 % (v/v). 4. Apparecchiatura 4.1. Agitatore rotativo a capovolgimento: circa 35-40 giri al minuto. 4.2. Apparecchio per distillazione del tipo Kjeldahl. 5. Procedimento Pesare, con l'approssimazione di 1 mg, 10 g di sostanza e introdurli in un pallone tarato da 200 ml con 100 ml d'acqua. Mescolare o agitare il pallone, nell'agitatore rotativo, per 30 minuti. Aggiungere 50 ml della soluzione d'acido tricloroacetico (3.1), portare a volume con acqua, agitare vigorosamente e filtrare su un filtro a pieghe. Prelevare una quantità di filtrato limpido in funzione del presunto contenuto di basi azotate volatili (100 ml sono generalmente sufficienti). Diluire a 200 ml e aggiungere 2 g di ossido di magnesio (3.2) e qualche goccia di emulsione antischiuma (3.3). La soluzione deve risultare alcalina alla cartina tornasole, altrimenti aumentare la quantità di ossido di magnesio (3.2). Procedere conformemente ai punti 5.2 e 5.3 del metodo di analisi per la determinazione del contenuto di proteine gregge (parte C del presente allegato). Effettuare una prova in bianco applicando lo stesso procedimento, in assenza del campione da analizzare. 6. Calcolo dei risultati 1 ml di H2SO4 0,05 mol/l corrisponde a 1,7 mg di ammoniaca. Esprimere il risultato in percentuale del campione. Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non supera, in valore relativo, il 10 % di ammoniaca. F. DETERMINAZIONE DEGLI AMMINOACIDI (TRIPTOFANO ESCLUSO) 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo serve per determinare gli amminoacidi liberi (sia di sintesi che naturali) e totali (legati a peptidi e liberi) negli alimenti per animali mediante un analizzatore di amminoacidi. Il metodo è applicabile ai seguenti amminoacidi: cist(e)ina, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, acido aspartico, acido glutammico, glicina, istidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina. Il metodo non distingue gli amminoacidi dai loro sali e non può distinguere la forma D degli amminoacidi dalla forma L; esso non è adatto per la determinazione del triptofano né degli analoghi idrossilati degli amminoacidi. 2. Principio 2.1. Amminoacidi liberi Gli amminoacidi liberi sono estratti con acido cloridrico diluito. Le macromolecole azotate coestratte vengono fatte precipitare con acido solfosalicilico e vengono rimosse per filtrazione. La soluzione filtrata viene portata a pH 2,20. Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm. 2.2. Amminoacidi totali La scelta della procedura dipende dagli amminoacidi oggetto dell'analisi. Cist(e)ina e metionina devono essere ossidate ad acido cisteico e al metionina sulfone prima dell'idrolisi. La tirosina deve essere determinata in idrolizzati di campioni non ossidati. Tutti gli altri amminoacidi elencati al punto 1 possono essere determinati sia nel campione ossidato sia in quello non ossidato. L'ossidazione viene eseguita a 0 oC con una miscela di acido performico e di fenolo. L'eccesso del reagente di ossidazione viene decomposto con metabisolfito di sodio. Il campione ossidato o non ossidato è idrolizzato con acido cloridrico (3.20) per 23 ore. L'idrolizzato è regolato a pH 2,20. Gli amminoacidi sono separati mediante cromatografia a scambio ionico e determinati per reazione con la ninidrina e con rivelazione fotometrica a 570 nm (440 nm per la prolina). 3. Reattivi Usare acqua bidistillata o di qualità equivalente (conduttività < 10 μS). 3.1. Perossido d'idrogeno, p (p/p) = 30 %. 3.2. Acido formico, p (p/p) = 98-100 %. 3.3. Fenolo. 3.4. Metabisolfito di sodio. 3.5. Idrossido di sodio. 3.6. Acido 5-solfosalicilico diidrato. 3.7. Acido cloridrico, densità circa 1,18 g/ml. 3.8. Citrato trisodico diidrato. 3.9. 2,2'-Tiodietanolo (tiodiglicole). 3.10. Cloruro di sodio. 3.11. Ninidrina. 3.12. Etere di petrolio, intervallo di ebollizione: 40-60 oC. 3.13. Norleucina o altro composto adatto ad essere utilizzato come standard interno. 3.14. Azoto gassoso (< 10 ppm di ossigeno). 3.15. 1-Ottanolo. 3.16. Amminoacidi. 3.16.1. Sostanze di riferimento elencate al punto 1. Composti puri non contenenti acqua di cristallizzazione. Essiccare sotto vuoto su P2O5 o H2SO4 per una settimana prima dell'uso. 3.16.2. Acido cisteico. 3.16.3. Metionina sulfone. 3.17. Soluzione di idrossido di sodio, c = 7,5 mol/l: sciogliere 300 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro. 3.18. Soluzione di idrossido di sodio, c = 1 mol/l: sciogliere 40 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro. 3.19. Soluzione di acido formico-fenolo: miscelare 889 g di acido formico (3.2) con 111 g d'acqua e aggiungere 4,73 g di fenolo (3.3). 3.20. Miscela di idrolisi, c = HCl 6 mol/l contenente 1 g di fenolo: aggiungere 1 g di fenolo (3.3) a 492 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua. 3.21. Miscela di estrazione, c = HCl 0,1 mol/l contenente 2 % di tiodiglicole: introdurre 8,2 ml di HCl (3.7) in circa 900 ml d'acqua e miscelare, aggiungere 20 ml di tiodiglicolo (3.9) e portare a 1 litro con acqua (non miscelare direttamente le sostanze di cui ai punti 3.7 e 3.9). 3.22. Acido 5-solfosalicilico: β = 6 %: sciogliere 60 g di acido 5-solfosalicilico (3.6) in acqua e portare a 1 litro con acqua. 3.23. Miscela di ossidazione (acido performico-fenolo): miscelare 0,5 ml di perossido di idrogeno (3.1) con 4,5 ml di soluzione di acido formico e fenolo (3.19) in un piccolo becher. Tenere in incubazione a 20-30 oC per un'ora per ottenere acido performico; lasciare raffreddare su un bagno di acqua gelata (15 min) prima di aggiungere il campione. Attenzione: evitare il contatto con la pelle e indossare indumenti di protezione. 3.24. Tampone citrato, c = Na+ 0,2 mol/l, pH 2,20: sciogliere 19,61 g di citrato di sodio (3.8), 5 ml di tiodiglicole (3.9), 1 g di fenolo (3.3) e 16,50 ml di HCl (3.7) in cira 800 ml d'acqua. Portare il pH a 2,20. Portare a 1 litro con acqua. 3.25. Tamponi di eluizione preparati conformemente alle prescrizioni relative all'analizzatore (4.9). 3.26. Reattivo alla ninidrina preparato conformemente alle prescrizioni relative all'analizzatore (4.9). 3.27. Soluzioni standard di amminoacidi. Conservare queste soluzioni a temperatura inferiore a 5 oC. 3.27.1. Soluzione madre standard di amminoacidi (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml di ciascuno in acido cloridrico. Reperibile in commercio. 3.27.2. Soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone, c = 1,25 μmol/ml. Sciogliere 0,2115 g di acido cisteico (3.16.2) e 0,2265 g di metionina sulfone (3.16.3) in tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato da 1 litro e portare a volume con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 12 mesi. Questa soluzione non viene utilizzata se la soluzione madre standard (3.27.1) contiene acido cisteico e metionina sulfone. 3.27.3. Soluzione madre standard, ad esempio norleucina, c = 20 μmol/ml. Sciogliere 0,6560 g di norleucina (3.13) in tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato e portare a 250 ml con tampone citrato. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 6 mesi. 3.27.4. Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idrolizzati, c = 5 nmol/50 μl di acido cisteico e metionina sulfone e c = 10 nmol/50 μl di altri amminoacidi. Sciogliere 2,2 g di cloruro di sodio (3.10) in un becher da 100 ml con 30 ml di tampone citrato (3.24). Aggiungere 4,00 ml di soluzione madre standard di amminoacidi (3.27.1), 4,00 ml di soluzione madre standard di acido cisteico e metionina sulfone (3.27.2) e, se del caso, 0,50 ml di soluzione madre standard dello standard interno (3.27.3). Portare il pH a 2,20 con idrossido di sodio (3.18). Trasferire quantitativamente in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con tampone citrato (3.24) e miscelare. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 3 mesi. Cfr. anche le osservazioni al punto 9.1. 3.27.5. Soluzione di taratura degli amminoacidi standard da usarsi con idrolizzati preparati secondo quanto prescritto al punto 5.3.3.1 e destinati all'uso con estratti (5.2). Preparare la soluzione di taratura secondo quanto indicato al punto 3.27.4, ma senza cloruro di sodio. Conservare a temperatura inferiore a 5 oC al massimo per 3 mesi. 4. Apparecchiatura 4.1. Pallone a fondo arrotondato da 100 o 250 ml provvisto di refrigerante a ricadere. 4.2. Flacone di vetro borosilicatico da 100 ml con tappo a vite e guarnizione di gomma/teflon (ad esempio Duran, Schott) utilizzabile in stufa. 4.3. Stufa a ventilazione forzata con regolazione della temperatura avente una precisione superiore a ± 2 oC. 4.4. pH-metro (a tre cifre decimali). 4.5. Filtro a membrana, da 0,22 μm. 4.6. Centrifuga. 4.7. Evaporatore rotante sotto vuoto. 4.8. Agitatore meccanico o mescolatore magnetico. 4.9. Analizzatore di amminoacidi o apparecchiatura HPLC provvista di colonna a scambio ionico, dispositivo per ninidrina, derivatizzatore post-colonna e rivelatore fotometrico. La colonna deve essere riempita di resine polistireniche sulfonate in grado di separare gli amminoacidi uno dall'altro e da altri prodotti reattivi alla ninidrina. Il flusso del tampone e del reattivo di ninidrina è garantito da pompe il cui grado di stabilità di portata è ±0,5 % nell'intervallo tra l'analisi della soluzione di taratura e l'analisi del campione. Con alcuni analizzatori di amminoacidi si possono utilizzare metodi di idrolisi in cui l'idrolizzato presenta una concentrazione di sodio di c = 0,8 mol/l e contiene tutto l'acido formico residuo dalla fase di ossidazione. Altri apparecchi non consentono una separazione soddisfacente di certi amminoacidi se l'idrolizzato contiene troppo acido formico e/o presenta elevate concentrazioni di ioni sodio. In questo caso il volume dell'acido è ridotto a circa 5 ml mediante evaporazione dopo l'idrolisi e prima della regolazione del pH. L'evaporazione è eseguita sotto vuoto a temperatura non superiore a 40 oC. 5. Procedimento 5.1. Preparazione del campione Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all'aria ad una temperatura non superiore a 50 oC o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (3.12) prima di essere triturati. 5.2. Determinazione degli amminoacidi liberi negli alimenti per animali e nelle premiscele Pesare con l'approssimazione di 0,2 mg una quantità appropriata (1-5 g) del campione preparato (5.1) in una beuta e aggiungere 100,0 ml di miscela di estrazione (3.2.1). Agitare la miscela per 60 minuti con un agitatore o meccanico o miscelatore magnetico (4.8). Lasciar depositare il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher da 100 ml. Aggiungere 5,0 ml di soluzione di acido solfosalicilico (3.22) sempre agitando e continuare ad agitare con agitatore magnetico per 5 minuti. Filtrare o centrifugare il surnatante per rimuovere eventuali precipitati. Introdurre 10,0 ml della soluzione risultante in un becher da 100 ml e portare il pH a 2,20 con una soluzione di idrossido di sodio (3.18), trasferire in un matraccio tarato di volume appropriato utilizzando tampone citrato (3.24) e portare a volume con la soluzione tampone (3.24). Se si usa uno standard interno, aggiungere 1,00 ml di standard interno (3.27.3) ogni 100 ml di soluzione finale e portare a volume con la soluzione tampone (3.24). Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4. Se gli estratti non vengono cromatografati lo stesso giorno, conservarli a temperatura inferiore a 5 oC. 5.3. Determinazione degli amminoacidi totali 5.3.1. Ossidazione Pesare, con l'approssimazione di 0,2 mg, da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1) in: — un pallone a fondo arrotondato da 100 ml (4.1) per l'idrolisi in sistema aperto (5.3.2.3), o — un pallone a fondo arrotondato da 250 ml (4.1) se è richiesta una bassa concentrazione di sodio, o — un flacone da 100 ml dotato di tappo a vite (4.2) per l'idrolisi in sistema chiuso (5.3.2.4). La porzione di campione pesata deve avere un contenuto d'azoto di circa 10 mg e un contenuto di umidità non superiore a 100 mg. Introdurre il pallone o il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio e raffreddare a 0 oC; aggiungere 5 ml di miscela di ossidazione (3.23) e miscelare con una spatola di vetro con un estremità ricurva. Sigillare il pallone o flacone contenente la spatola con una pellicola impermeabile all'aria, introdurre il bagno di acqua e ghiaccio contenente il contenitore sigillato in un frigorifero a 0 oC e lasciarvelo per 16 ore. Dopo 16 ore togliere dal frigorifero e decomporre l'eccesso di reagente di ossidazione mediante l'aggiunta di 0,84 g di bisolfito di sodio (3.4). Procedere come indicato al punto 5.3.2.1. 5.3.2. Idrolisi 5.3.2.1. Idrolisi dei campioni ossidati Aggiungere al campione ossidato, preparato conformemente al punto 5.3.1, 25 ml di miscela di idrolisi (3.20) avendo cura di risciacquare eventuali residui di campione che aderiscono alle pareti del recipiente e alla spatola. Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, a seconda del metodo di idrolisi utilizzato. 5.3.2.2. Idrolisi dei campioni non ossidati Pesare in un pallone a fondo arrotondato da 100 ml o 250 ml (4.1) o in un flacone da 100 ml con tappo a vite (4.2) (con l'approssimazione di 0,2 mg) una quantità da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1). La porzione di campione pesata deve avere un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere con cautela 25 ml di miscela di idrolisi (3.20) e miscelare con il campione. Procedere come indicato al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4. 5.3.2.3. Idrolisi, sistema aperto Aggiungere 3 biglie di vetro alla miscela (preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2) contenuta nel pallone e far bollire a ricadere per 23 ore a ebollizione continua. Al completamento dell'idrolisi, risciacquare il refrigerante con 5 ml di tampone citrato (3.24). Togliere il pallone e farlo raffreddare in un bagno di ghiaccio. Procedere come indicato al punto 5.3.3. 5.3.2.4. Idrolisi, sistema chiuso Introdurre il flacone contenente la miscela, preparata conformemente al punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2, in un forno (4.3) a 110 oC. Durante la prima ora, allo scopo di evitare un accumulo di pressione in conseguenza dello sviluppo di sostanze gassose e di evitare un'esplosione, porre il tappo a vite sopra al recipiente senza chiuderlo. Dopo un'ora, chiudere il recipiente con il tappo e lasciarlo nel forno (4.3) per 23 ore. Al completamento dell'idrolisi, togliere il flacone dal forno, aprire con cautela il tappo del flacone e introdurre il flacone in un bagno di acqua e ghiaccio. Lasciar raffreddare. Secondo la procedura usata per la regolazione del pH (5.3.3), trasferire quantitativamente il contenuto del flacone in un becher da 250 ml o in un pallone a fondo tondo da 250 ml utilizzando tampone citrato (3.24). Procedere come indicato al punto 5.3.3. 5.3.3. Regolazione del pH Procedere, conformemente al punto 5.3.3.1 o 5.3.3.2, alla regolazione del pH, in funzione della tolleranza al sodio dell'analizzatore di amminoacidi (4.9). 5.3.3.1. Per sistemi cromatografici (4.9) che richiedono una bassa concentrazione di sodio. Quando si impiegano analizzatori di amminoacidi che richiedono una bassa concentrazione di sodio (quando il volume dell'acido deve essere ridotto), è consigliabile utilizzare una soluzione madre standard interna (3.27.3). In questo caso aggiungere 2,00 ml della soluzione standard interna (3.27.3) all'idrolizzato prima dell'evaporazione. Aggiungere 2 gocce di 1-ottanolo (3.15) all'idrolizzato ottenuto conformemente alla procedura di cui al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4. Utilizzando un evaporatore rotante (4.7), ridurre il volume a 5-10 ml sotto vuoto a 40 oC. Se il volume viene ridotto accidentalmente a meno di 5 ml, scartare l'idrolizzato e ricominciare l'analisi. Portare il pH a 2,20 con soluzione di idrossido di sodio (3.18) e procedere conformemente al punto 5.3.4. 5.3.3.2. Per tutti gli altri analizzatori di amminoacidi (4.9) Neutralizzare parzialmente gli idrolizzati ottenuti conformemente al punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4, aggiungendovi con cautela, sempre agitando, 17 ml di soluzione di idrossido di sodio (3.17), facendo attenzione che la temperatura rimanga al di sotto di 40 oC. Portare il pH a 2,20 a temperatura ambiente utilizzando la soluzione di idrossido di sodio di cui al punto 3.17 e, infine, una soluzione di idrossido di sodio conforme al punto 3.18. Procedere conformemente al punto 5.3.4. 5.3.4. Soluzione del campione per cromatografia Trasferire quantitativamente l'idrolizzato portato a pH 2,20 (5.3.3.1 o 5.3.3.2) con tampone citrato (3.24) in un matraccio tarato da 200 ml e portare a volume con tampone (3.24). Se non è stato ancora utilizzato uno standard interno, aggiungerne 2,00 ml (3.27.3) e portare a volume con tampone citrato (3.24). Miscelare accuratamente. Procedere alla fase della cromatografia (5.4). Se le soluzioni del campione non vengono cromatografate nello stesso giorno, conservarle a temperatura inferiore a 5 oC. 5.4. Cromatografia Prima della cromatografia, portare l'estratto (5.2) o l'idrolizzato (5.3.4) a temperature ambiente. Agitare la miscela e filtrarne una quantità appropriata attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm (4.5). La soluzione limpida risultante viene sottoposta a cromatografia a scambio ionico utilizzando un analizzatore di amminoacidi (4.9). L'iniezione può venire eseguita manualmente o automaticamente. È importante iniettare sempre la stessa quantità (±0,5 %) di soluzione nella colonna per l'analisi degli standard e dei campioni, salvo quando si usa uno standard interno; inoltre i rapporti sodio/amminoacidi nello standard e nelle soluzioni del campione devono essere il più possibile simili. La frequenza delle iniezioni della soluzione di taratura dipende dalla stabilità del reattivo ninidrina e del sistema analitico. La soluzione standard o del campione è diluita con tampone citrato (3.24) in misura tale che l'area del picco della soluzione standard sia compresa Fra il 30 % e il 200 % dell'area del picco dell'amminoacido nel campione. La cromatografia degli amminoacidi varierà leggermente secondo il tipo di analizzatore impiegato e la resina usata. Il sistema scelto deve essere in grado di separare gli amminoacidi uno dall'altro e dalle sostanze reattive alla ninidrina. Nel corso dell'operazione, il sistema cromatografico deve dare una risposta lineare alle variazioni delle quantità di amminoacidi introdotti in colonna. Durante la fase di cromatografia, quando si analizza una soluzione equimolare (degli amminoacidi sottoposti a determinazione), si applicano i rapporti di altezza valle/picco citati più avanti. La soluzione equimolare deve contenere almeno il 30 % del carico massimo di ciascun amminoacido che può essere determinato con precisione tramite il sistema di analisi degli amminoacidi (4.9). Per la separazione treonina-serina, il rapporto di altezza valle/picco del più basso dei due amminoacidi che si sovrappongono sul cromatogramma non deve superare 2/10 [se la determinazione viene effettuata solo su cist(e)ina, metionina, treonina e lisina, una insufficiente separazione di picchi adiacenti influirà sfavorevolmente sulla determinazione]. Per tutti gli altri amminoacidi la separazione deve essere maggiore di 1/10. Il sistema deve poter separare la lisina da «artefatti di lisina» e dall'ornitina. 6. Calcolo dei risultati Determinare le aree del picco del campione e della soluzione standard per ogni singolo amminoacido e calcolare la quantità (X) in g di amminoacido per kg di campione secondo la seguente formula: Se si usa uno standard interno moltiplicare per: A = area del picco dell'idrolizzato o dell'estratto B = area del picco della soluzione standard di taratura C = area del picco dello standard interno nell'idrolizzato o nell'estratto D = area del picco dello standard interno, soluzione standard di taratura M = peso molecolare dell'amminoacido determinato c = concentrazione dello standard in μmol/ml m = peso del campione in g (corretto al peso originale se essiccato o sgrassato) V = ml totali di idrolizzato (5.3.4) o ml del volume di diluizione totale calcolati dell'estratto (6.1). La cistina e la cisteina sono determinate entrambe sotto forma di acido cisteico negli idrolizzati di campione ossidato, ma calcolate come cistina (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) utilizzando un peso molecolare di 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). La metionina è determinata come metionina sulfone negli idrolizzati del campione ossidato, ma calcolata come metionina utilizzando il peso molecolare della metionina (149,21 g/mol). La metionina libera aggiunta viene determinata dopo estrazione sotto forma di metionina; per il calcolo si usa lo stesso valore M. 6.1. Il volume della diluizione totale degli estratti (F) per la determinazione degli amminoacidi liberi (5.2) è calcolato come segue: V = volume dell'estratto finale. 7. Valutazione del metodo Il metodo è stato testato nel 1990, nel corso di un confronto internazionale tra laboratori sulla base di quattro diversi alimenti per animali (alimento composto per suini, alimento composto per polli da ingrasso, concentrato proteico, premiscela). Le medie e le deviazioni standard ottenute dopo l'eliminazione dei risultati anomali figurano nelle seguenti tabelle: Medie in g/kg Materiale di riferimento Amminoacido Treonina Cist(e)ina Metionina Lisina Alimento composto per suini 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Alimento composto per polli da ingrasso 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Concentrato proteico 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiscela 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = numero di laboratori partecipanti. 7.1. Ripetibilità La ripetibilità (espressa come «deviazione standard entro il laboratorio») del confronto tra laboratori è presentata nelle seguenti tabelle: Deviazione standard entro il laboratorio (Sr) in g/kg Materiale di riferimento Amminoacido Treonina Cist(e)ina Metionina Lisina Alimento composto per suini 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Alimento composto per polli da ingrasso 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Concentrato proteico 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiscela 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = numero di laboratori partecipanti.

Coefficiente di variabilità (%) per la deviazione standard entro il laboratorio (Sr) Materiale di riferimento Amminoacido Treonina Cist(e)ina Metionina Lisina Alimento composto per suini 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Alimento composto per polli da ingrasso 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Concentrato proteico 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiscela 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = numero di laboratori partecipanti. 7.2. Riproducibilità I risultati relativi alla deviazione standard tra laboratori ottenuti dal confronto tra laboratori figurano nelle seguenti tabelle: Deviazione standard tra laboratori (Sr) in g/kg Materiale di riferimento: Amminoacido Treonina Cist(e)ina Metionina Lisina Alimento composto per suini 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Alimento composto per polli da ingrasso 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Concentrato proteico 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiscela 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = numero di laboratori partecipanti.

Coefficiente di variabilità (%) per la deviazione standard tra laboratori (Sr) Materiale di riferimento: Amminoacido Treonina Cist(e)ina Metionina Lisina Alimento composto per suini 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Alimento composto per polli 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Concentrato proteico 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiscela 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = numero di laboratori partecipanti. 8. Utilizzo di materiali di riferimento La corretta applicazione del metodo può essere verificata ripetendo le misurazioni dei materiali di riferimento certificati, se disponibili. Si raccomanda di effettuare la taratura con una soluzione di taratura certificata di amminoacidi. 9. Osservazioni 9.1. A causa delle differenze tra gli analizzatori di amminoacidi, le concentrazioni finali delle soluzioni di taratura degli amminoacidi standard (cfr. punti 3.27.4 e 3.27.5) e dell'idrolizzato (cfr. punto 5.3.4) sono considerate valori indicativi. Per tutti gli amminoacidi va verificato il range della risposta lineare dell'apparecchiatura. La soluzione standard è diluita con tampone citrato per ottenere aree dei picchi al centro del range. 9.2. Se si fa uso di apparecchi per cromatografia liquida ad alta prestazione per analizzare gli idrolizzati, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate conformemente alle raccomandazioni del fabbricante. 9.3. L'applicazione del metodo agli alimenti per animali contenenti cloruro in misura superiore all'1 % (concentrato, alimenti a base di minerali, alimenti integrativi) potrebbe comportare una sottostima della metionina; va previsto pertanto un trattamento speciale. G. DETERMINAZIONE DEL TRIPTOFANO 1. Finalità e campo d'applicazione Il metodo serve per la determinazione del triptofano totale e libero negli alimenti per animali. Esso non distingue la forma D dalla forma L. 2. Principio Per la determinazione del triptofano totale, il campione è idrolizzato in ambiente alcalino con una soluzione satura di idrossido di bario e riscaldato a 110 oC per 20 ore. A idrolisi avvenuta, viene aggiunto lo standard interno. Per la determinazione del triptofano libero, il campione è estratto in ambiente moderatamente acido in presenza dello standard interno. Il triptofano e lo standard interno nell'idrolizzato e nell'estratto sono determinati per HPLC per mezzo di un rivelatore a fluorescenza. 3. Reattivi 3.1. Usare acqua bidistillata o di qualità equivalente (conduttività < 10 μS/cm). 3.2. Sostanza di riferimento (standard): triptofano (purezza/contenuto ≥ 99 %) essiccato sotto vuoto su pentossido di fosforo. 3.3. Standard interno: α-metil-triptofano (purezza/contenuto ≥ 99 %), essiccato sotto vuoto su pentossido di fosforo. 3.4. Idrossido di bario ottaidrato (prestare attenzione a non esporre eccessivamente il Ba(OH)2.8 H2O all'aria, per evitare la formazione di BaCO3, che potrebbe disturbare la determinazione) (cfr. osservazione al punto 9.3). 3.5. Idrossido di sodio. 3.6. Acido ortofosforico, p (p/p) = 85 %. 3.7. Acido cloridico, ρ20 1,19 g/ml. 3.8. Metanolo, di qualità HPLC. 3.9. Etere di petrolio, punto di ebollizione tra 40 e 60 oC. 3.10. Soluzione di idrossido di sodio, c = 1 mol/l: sciogliere 40,0 g di NaOH (3.5) in acqua e portare a 1 litro con acqua (3.1). 3.11. Acido cloridrico, c = 6 mol/l: prelevare 492 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua. 3.12. Acido cloridrico, c = 1 mol/l: prelevare 82 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua. 3.13. Acido cloridrico, c = 0,1 mol/l: prelevare 8,2 ml di HCl (3.7) e portare a 1 litro con acqua. 3.14. Acido ortofosforico, c = 0,5 mol/l: prelevare 34 ml di acido ortofosforico (3.6) e portare a 1 litro con acqua (3.1). 3.15. Soluzione concentrata di triptofano (3.2), c = 2,50 μmol/ml: in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0,2553 g di triptofano (3.2) in acido cloridrico (3.13) e portare a volume con acido cloridrico (3.13). Conservare a - 18 oC al massimo per quattro settimane. 3.16. Soluzione concentrata di standard interno, c = 2,50 μmol/ml: in un matraccio tarato da 500 ml sciogliere 0,2728 g di α-metil-triptofano (3.3) in acido cloridrico (3.13) e portare a volume con acido cloridrico (3.13). Conservare a - 18 oC al massimo per quattro settimane. 3.17. Soluzione madre di taratura di triptofano e di standard interno: prelevare 2,00 ml di soluzione concentrata di triptofano (3.15) e 2,00 ml di soluzione concentrata di standard interno (α-metil-triptofano) (3.16). Diluire con acqua (3.1) e metanolo (3.8) a circa lo stesso volume e a circa la stessa concentrazione di metanolo (10-30 %) dell'idrolizzato finito. Questa soluzione deve essere preparata al momento, prima dell'uso. Proteggere dalla luce solare diretta durante la preparazione. 3.18. Acido acetico 3.19. 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo. 3.20. Etanolammina p (p/p) > 98 %. 3.21. Soluzione di 1 g di 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo (3.19) in 100 ml di metanolo (3.8). 3.22. Fase mobile per HPLC: 3,00 g di acido acetico (3.18) + 900 ml di acqua (3.1) +50,0 ml di soluzione (3.21) di 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo (3.19) in metanolo (3.8) (1 g/100 ml); regolare il pH a 5,00 utilizzando etanolammina (3.20); portare a 1 000 ml con acqua (3.1). 4. Apparecchiatura 4.1. Apparecchiatura HPLC con rilevatore spettrofluorimetrico. 4.2. Colonna per cromatografia liquida, 125 mm × 4 mm, C18, particelle di riempimento 3 μm, o equivalente. 4.3. pH-metro. 4.4. Matraccio di polipropilene, capacità 125 ml, a collo largo e coperchio a vite. 4.5. Filtro a membrana, da 0,45 μm. 4.6. Autoclave, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7. Agitatore meccanico o mescolatore magnetico. 4.8. Miscelatore Vortex. 5. Procedimento 5.1. Preparazione dei campioni Il campione viene triturato in modo che possa passare attraverso un vaglio da 0,5 mm. I campioni molto umidi devono essere essiccati all'aria a una temperatura non superiore a 50 oC o liofilizzati prima di essere triturati. I campioni ad alto tenore di grassi sono estratti con etere di petrolio (3.9) prima di essere triturati. 5.2. Determinazione del triptofano libero (estratto) In una beuta pesare (con l'approssimazione di 1 mg) una quantità adeguata (1-5 g) del campione preparato (5.1); aggiungere 100,0 ml di acido cloridrico (3.13) e 5,00 ml di soluzione concentrata di standard interno (3.16). Agitare o miscelare per 60 minuti con un agitatore meccanico o magnetico (4.7). Lasciare che si depositi il sedimento e pipettare 10,0 ml della soluzione surnatante in un becher. Aggiungere 5 ml di acido orto-fosforico (3.14). Portare il pH al valore 3 utilizzando idrossido di sodio (3.10). Aggiungere sufficiente metanolo (3.8) per ottenere una concentrazione compresa tra il 10 e il 30 % di metanolo nel volume finale. Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia [approssimativamente lo stesso volume della soluzione madre di taratura (3.17)]. Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0,45 μm (4.5) prima dell'iniezione nella colonna HPLC. Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4. Proteggere la soluzione madre e gli estratti dalla luce solare diretta. Se non è possibile analizzare gli estratti nello stesso giorno, questi devono essere conservati a 5 oC al massimo per 3 giorni. 5.3. Determinazione del triptofano totale (idrolizzato). Pesare (con l'approssimazione di 0,2 mg) da 0,1 a 1 g del campione preparato (5.1) nel matraccio di polipropilene (4.4). La porzione di campione pesata ha un contenuto di azoto di circa 10 mg. Aggiungere 8,4 g di idrossido di bario (ottaidrato) (3.4) e 10 ml di acqua. Miscelare con un miscelatore Vortex (4.8) o con agitatore magnetico (4.7). Lasciare il magnete rivestito di teflon nella miscela. Sciacquare le pareti del recipiente con 4 ml di acqua. Porre il coperchio a vite e chiudere il matraccio senza stringere. Trasferire in una autoclave (4.6) con acqua bollente e vapore per 30-60 minuti. Chiudere l'autoclave e metterla in funzione a 110 (± 2) oC per 20 ore. Prima di aprire l'autoclave, ridurre la temperatura poco al di sotto di 100 oC. Per evitare la cristallizzazione del Ba(OH)2 8H2O, aggiungere alla miscela calda 30 ml di acqua a temperatura ambiente. Scuotere o agitare non violentemente. Aggiungere 2,00 ml di soluzione concentrata di standard interno (α-metil-triptofano) (3.16). Lasciare raffreddare i recipienti in un bagno di acqua e ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere quindi 5 ml di acido orto-fosforico (3.14). Tenere il recipiente nel bagno di refrigerazione e neutralizzare con HCl (3.11) sempre agitando; regolare quindi il pH a 3,0 utilizzando HCl (3.12). Aggiungere una quantità sufficiente di metanolo per ottenere una concentrazione compresa tra 10 e 30 % di metanolo nel volume finale. Trasferire in un matraccio tarato di volume adeguato e diluire con acqua sino al volume necessario per la cromatografia (ad esempio, 100 ml). L'aggiunta di metanolo non provoca precipitazione. Filtrare alcuni ml della soluzione con un filtro a membrana da 0,45 μm (4.5) prima dell'iniezione nella colonna HPLC. Procedere alla fase della cromatografia secondo quanto indicato al punto 5.4. Proteggere la soluzione madre e gli idrolizzati dalla luce solare diretta. Se non è possibile analizzare gli idrolizzati il giorno stesso, questi devono essere conservati a 5 oC al massimo per 3 giorni. 5.4. Determinazione HPLC Le seguenti condizioni di eluizione isocratica sono proposte a titolo indicativo; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti (cfr. anche osservazioni 9.1 e 9.2): Colonna per cromatografia liquida (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, particelle di riempimento 3 μm o equivalente. Temperatura della colonna: temperatura ambiente Fase mobile (3.22): 3,00 g di acido acetico (3.18) + 900 ml di acqua (3.1) +50,0 ml di soluzione (3.21) di 1,1,1-trichloro-2-metil-2-propanolo (3.19) in metanolo (3.8) (1 g/100 ml); regolare il pH a 5,00 per mezzo di etanolammina (3.20); portare a 1 000 ml con acqua (3.1) Velocità di efflusso: 1 ml/min Durata totale dell'eluizione: circa 34 min Lunghezza d'onda di rivelazione: eccitazione: 280 nm, emissione: 356 nm Volume di iniezione: 20 μl 6. Calcolo dei risultati Calcolare la quantità di triptofano (X), espressa in g, per 100 g di campione secondo la seguente formula: A = area del picco dello standard interno, soluzione madre di taratura (3.17) B = area del picco del triptofano, estratto (5.2) o idrolizzato (5.3) V1 = volume in ml (2 ml) di soluzione concentrata di triptofano (3.15) aggiunta alla soluzione di taratura (3.17) c = concentrazione in μmol/ml (= 2,50) di soluzione concentrata di triptofano (3.15) aggiunta alla soluzione di taratura (3.17) V2 = volume in ml della soluzione concentrata di standard interno (3.16) aggiunta all'estrazione (5.2) (= 5,00 ml) o all'idrolizzato (5.3) (= 2,00 ml) C = area del picco dello standard interno, dell'estratto (5.2) o dell'idrolizzato (5.3) D = area del picco del triptofano, soluzione madre di taratura (3.17) V3 = volume in ml (= 2,00 ml) della soluzione concentrata dello standard interno (3.16) aggiunto alla soluzione madre di taratura (3.17) m = peso del campione in g (corretto al peso iniziale se essiccato e/o sgrassato) M = peso molecolare del triptofano (= 204,23 g/mol) 7. Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni, effettuate in parallelo sullo stesso campione, non deve superare il 10 % del valore ottenuto più elevato. 8. Risultati di uno studio collaborativo È stato organizzato uno studio collaborativo a livello comunitario (quarta intercomparazione) nel corso del quale dodici laboratori hanno analizzato tre campioni al fine di convalidare il metodo di idrolisi. Ogni campione è stato analizzato cinque volte. I risultati sono stati i seguenti: Campione 1 Alimento per suini Campione 2 Alimento per suini con aggiunta di L-triptofano Campione 3 Alimento concentrato per suini L 12 12 12 n 50 55 50 Media [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2 L = numero di laboratori che hanno trasmesso risultati n = numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier (valori aberranti identificati in base al test di Cochran-Dixon) sr = deviazione standard della ripetibilità SR = deviazione standard della riproducibilità r = ripetibilità R = riproducibilità CVr = coefficiente di variazione della ripetibilità, in % CVR = coefficiente di variazione della riproducibilità, in %. È stato organizzato un altro studio collaborativo a livello comunitario (terza intercomparazione), in cui tredici laboratori hanno analizzato due campioni al fine di convalidare il metodo di estrazione del triptofano libero. Ogni campione è stato analizzato cinque volte. I risultati sono stati i seguenti: Campione 4 Miscela di frumento e soia Campione 5 Miscela di frumento e soia (= campione 4) con aggiunta di triptofano (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Media [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11 L = numero di laboratori che hanno trasmesso risultati n = numero di risultati individuali considerati una volta eliminati gli outlier (valori aberranti identificati in base al test di Cochran-Dixon) sr = deviazione standard della ripetibilità SR = deviazione standard della riproducibilità r = ripetibilità R = riproducibilità CVr = coefficiente di variazione della ripetibilità, in % CVR = coefficiente di variazione della riproducibilità, in %. È stato effettuato un altro studio di intercomparazione comunitario in cui sono stati analizzati quattro campioni da 7 laboratori ai fini della certificazione del triptofano per idrolisi. Ogni campione è stato analizzato cinque volte. I risultati sono stati i seguenti: Campione 1 Alimento composto per suini (CRM 117) Campione 2 Farina di pesce a basso tenore di grassi (CRM 118) Campione 3 Farina di soia (CRM 119) Campione 4 Latte scremato in polvere (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Media [g/kg] 2,064 8,80