3)

Sono aggiunti i seguenti capitoli: «B.49. TEST DEL MICRONUCLEO IN VITRO CON CELLULE DI MAMMIFERO INTRODUZIONE 1. Il test del micronucleo in vitro (MNvit) è un test di genotossicità effettuato per rilevare la presenza di micronuclei (MN) nel citoplasma delle cellule durante l’interfase. I micronuclei possono formarsi a partire da frammenti cromosomici acentrici (ossia privi di centromero) o da cromosomi interi che non sono in grado di migrare ai poli durante l’anafase (una fase della divisione cellulare). Il saggio rileva l’attività delle sostanze con proprietà clastogeniche e aneugeniche (sostanze e miscele) (1) (2) nelle cellule che hanno iniziato la divisione cellulare durante o dopo l’esposizione alla sostanza sperimentale. Il presente metodo di prova (TM) permette il ricorso a protocolli sperimentali con e senza citocalasina B (citoB), un inibitore della polimerizzazione dell’actina. L’aggiunta di citoB prima della mitosi oggetto dello studio consente l’individuazione e l’analisi selettiva della frequenza dei micronuclei nelle cellule che hanno completato una mitosi, perché tali cellule sono binucleate (3) (4). Il presente metodo di prova permette altresì di ricorrere a protocolli senza blocco della citocinesi, purché si possa dimostrare che la popolazione cellulare analizzata si sia già avviata alla mitosi. 2. Oltre al saggio MNvit per individuare le sostanze (sostanze e miscele) che inducono la formazione di micronuclei, anche il ricorso a un blocco della citocinesi, alla marcatura immunochimica dei cinetocori o all’ibridazione con sonde centromero- o telomero-specifiche [ibridazione fluorescente in situ (FISH)] può fornire informazioni sui meccanismi di danno cromosomico e formazione di micronuclei (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Le procedure di marcatura e ibridazione possono essere impiegate quando si osserva un incremento della formazione di micronuclei e lo sperimentatore desidera stabilire se tale aumento è la conseguenza di eventi clastogenici e/o aneugenici. 3. I micronuclei rappresentano danni che sono trasmessi alle cellule figlie, mentre le aberrazioni cromosomiche verificatesi nelle cellule in metafase potrebbero non essere trasmesse. Poiché nelle cellule in interfase è possibile valutare i micronuclei in maniera relativamente obiettiva, il personale del laboratorio deve soltanto stabilire se le cellule hanno avviato o meno la divisione cellulare e quante di esse contengono un micronucleo. Di conseguenza, i preparati possono essere valutati con relativa rapidità e l’analisi può essere automatizzata, il che permetterebbe di valutare migliaia anziché centinaia di cellule per trattamento, e quindi di accrescere la potenza del saggio. Infine, poiché i micronuclei possono formarsi anche da cromosomi ritardatari, c’è la possibilità di individuare agenti che inducono aneuploidia, che solitamente è difficile esaminare tramite i tradizionali test sulle aberrazioni cromosomiche (cfr. la linea guida OCSE Test Guideline 473, capitolo B.10 del presente allegato) (17). Tuttavia, il saggio MNvit non permette di distinguere le sostanze che inducono polipoidia da quelle che causano clastogenicità senza il ricorso a tecniche speciali come la FISH, descritta al punto 2. 4. Il saggio MNvit è un metodo in vitro che in genere utilizza cellule umane o animali (di roditori). Il saggio offre una base completa per studiare il potenziale di danno cromosomico in vitro, poiché permette di rilevare agenti sia aneugeni sia clastogeni. 5. Il saggio MNvit è robusto ed efficace per vari tipi cellulari, con o senza ricorso a citoB. Sono numerosi i dati a sostegno della validità del saggio MNvit con diverse linee cellulari di roditori (CHO, V79, CHL/IU e L5178Y) e di linfociti umani (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Tra questi si annoverano, in particolare, gli studi internazionali di convalida coordinati dalla Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) e le relazioni dell’International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Le informazioni disponibili sono anche state riesaminate nell’ambito di uno studio di convalida retrospettivo basato sul peso dell’evidenza condotto dal Centro europeo per la convalida di metodi alternativi (ECVAM) della Commissione europea, mentre la validità scientifica del metodo di prova è stata riconosciuta dal comitato scientifico consultivo dell’ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). È stato descritto l’uso di cellule umane della linea linfoblastoide TK6 (35), di cellule HepG2 (36) (37) e di cellule embrionali primarie di criceto siriano (38), sebbene tali cellule non siano state utilizzate in studi di convalida. DEFINIZIONI 6. Le definizioni usate figurano nell’allegato 1. CONSIDERAZIONI INIZIALI 7. I saggi in vitro richiedono in generale l’uso di una fonte esogena di attivazione metabolica, a meno che le cellule non siano metabolicamente competenti per quanto riguarda le sostanze in esame. Il sistema esogeno di attivazione metabolica non simula perfettamente le condizioni in vivo. Si deve prestare inoltre attenzione al fine di evitare condizioni che porterebbero a risultati positivi artefatti, che non riflettono una mutagenicità intrinseca, e che possono avere origine da cambiamenti marcati di pH o di osmolalità, o da elevati livelli di citotossicità (39) (40) (41). Se, aggiungendo la sostanza sperimentale, si verifica un cambiamento di pH del mezzo, il pH deve essere aggiustato, preferibilmente tamponando la soluzione pronta per l’uso affinché tutti i volumi rimangano gli stessi per tutte le concentrazioni testate e per tutti i controlli. 8. Per esaminare l’induzione di micronuclei è fondamentale che sia avvenuta la mitosi sia nelle colture trattate che in quelle non trattate. Lo stadio più informativo per il conteggio dei micronuclei è quello che si riscontra nelle cellule che hanno completato una mitosi durante o dopo il trattamento con la sostanza sperimentale. PRINCIPIO DEL METODO 9. Le colture di cellule umane o di mammifero sono esposte alla sostanza sperimentale con e senza una fonte esogena di attivazione metabolica, a meno che non si utilizzino cellule con un’adeguata capacità metabolizzante. Ogni test dovrà comprendere controlli con solventi/veicoli e controlli positivi trattati in parallelo. 10. Durante o dopo l’esposizione alla sostanza sperimentale, le cellule sono coltivate per un periodo sufficiente a consentire che il danno cromosomico o del fuso porti alla formazione di micronuclei nelle cellule in interfase. Per l’induzione di aneuploidia, la sostanza sperimentale dovrebbe solitamente essere presente durante la mitosi. Le cellule in interfase coltivate e colorate sono analizzate per rilevare la presenza di micronuclei. Idealmente, si dovrebbero contare micronuclei soltanto nelle cellule che hanno completato la mitosi durante l’esposizione alla sostanza sperimentale o nell’eventuale periodo successivo all’esposizione. Nelle colture trattate con un inibitore della citocinesi questo risultato si ottiene prendendo in considerazione soltanto le cellule binucleate. In assenza di un inibitore della citocinesi è importante dimostrare che le cellule analizzate hanno avviato la divisione cellulare durante o dopo l’esposizione alla sostanza sperimentale. Per tutti i protocolli è essenziale dimostrare che la proliferazione cellulare è avvenuta sia nelle colture trattate che nei controlli; inoltre, nelle colture in cui si è riscontrata la presenza di micronuclei (o in colture parallele) dev’essere valutata l’entità della citotossicità o della citostasi indotta dalla sostanza sperimentale. DESCRIZIONE DEL METODO Preparazioni 11. Possono essere usati linfociti del sangue periferico umano primario coltivato (5) (19) (42) (43) e una serie di linee cellulari di roditori quali CHO, V79, CHL/IU e L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). L’uso di altre linee cellulari e di altri tipi di cellule deve essere giustificato in base alla loro dimostrata prestazione nel saggio, così come descritta nella sezione sui criteri di accettabilità. Poiché la frequenza generale dei micronuclei influenzerà la sensibilità del saggio, si raccomanda di utilizzare tipi cellulari con una frequenza bassa e stabile di formazione di micronuclei. 12. I linfociti del sangue periferico umano devono essere prelevati da individui giovani (circa 18-35 anni di età), sani, non fumatori, che non siano stati esposti di recente a sostanze chimiche genotossiche o a radiazioni. Se si raccolgono cellule da più donatori, il numero dei donatori dev’essere indicato. La frequenza dei micronuclei aumenta con l’età e questa tendenza è più marcata nelle donne rispetto agli uomini (44); occorre tener conto di tali elementi nella selezione delle cellule dei donatori. Terreni e condizioni di coltura 13. Per mantenere le colture devono essere garantiti terreni e condizioni di incubazione adeguati (recipienti per coltura, concentrazione di CO2, temperatura e umidità). Si controlli periodicamente la stabilità del numero modale dei cromosomi e l’assenza di contaminazione da micoplasma nelle linee cellulari stabilizzate e nei ceppi; non si usino ceppi contaminati o che presentano modifiche del numero modale dei cromosomi. Dovrebbero essere note la durata normale del ciclo cellulare e le condizioni di coltura utilizzate nel laboratorio di prova. Se si ricorre al metodo dell’inibizione della citocinesi, la concentrazione dell’agente inibitore dev’essere ottimizzata per lo specifico tipo cellulare e deve essere dimostrata la sua capacità di produrre un buon numero di cellule binucleate per l’analisi. Preparazione delle colture 14. Linee cellulari stabilizzate e ceppi: le cellule provenienti da colture primarie vengono inoculate in un terreno di coltura ad una densità tale da impedire che le colture raggiungano la confluenza in monostrati, e che le colture in sospensione non raggiungano una densità eccessiva prima della raccolta, e incubate a 37 °C. 15. Linfociti: sangue intero trattato con un anticoagulante (ad esempio, eparina) o linfociti isolati sono posti in un terreno di coltura contenente un mitogeno (ad esempio, fitoemoagglutinina, PHA) prima dell’esposizione alla sostanza sperimentale e a citoB. Attivazione metabolica 16. Se si utilizzano cellule prive di un’adeguata capacità di attivazione metabolica endogena si deve ricorrere a sistemi di attivazione metabolica esogeni. Il sistema più comunemente usato è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattori (S9) ricavata dal fegato di roditori trattati con induttori enzimatici, come Aroclor 1254 (45) (46) o una combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (46) (47) (48) (49). Quest’ultima combinazione è conforme alla Convenzione di Stoccolma sugli inquinanti organici persistenti (50) e al regolamento (CE) n. 850/2004 relativo agli inquinanti organici persistenti (66), e ha dimostrato di essere tanto efficace quanto Aroclor 1254 nell’indurre ossidasi a funzione mista (46) (47) (48) (49). La frazione S9 viene di solito usata a concentrazioni comprese tra 1 e 10 % (v/v) nel terreno di coltura. Le condizioni del sistema di attivazione metabolica dipendono dalla classe chimica della sostanza in esame. In alcuni casi può essere opportuno utilizzare varie concentrazioni della frazione post-mitocondriale. 17. Linee cellulari modificate mediante ingegneria genetica che esprimono enzimi attivatori specifici nell’uomo o nel roditore possono eliminare la necessità di ricorrere a un sistema di attivazione metabolica esogeno e possono essere usate nel saggio. In questi casi la scelta delle linee cellulari deve essere scientificamente motivata (ad esempio, in base all’importanza delle ossidasi a funzione mista nel metabolismo della sostanza in esame (51) e della loro capacità di reagire ai clastogeni e agli aneugeni noti (cfr. la sezione sui criteri di accettabilità). Si deve riconoscere che la sostanza sperimentale non può essere metabolizzata dall’ossidasi o dalle ossidasi a funzione mista espresse; in tal caso, i risultati negativi non indicherebbero che la sostanza sperimentale non causa la formazione di micronuclei. Sostanza in esame/Preparazione 18. Le sostanze solide devono essere poste in soluzione in adeguati solventi o veicoli e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule. Le sostanze liquide possono essere aggiunte direttamente alla coltura e/o diluite prima del trattamento. Le sostanze gassose o volatili devono essere testate modificando adeguatamente i protocolli standard (trattamento in contenitori sigillati) (52) (53). Si usino preparati recenti della sostanza, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è accettabile. Condizioni di esperimento Solventi/veicoli 19. Il solvente/veicolo non deve reagire chimicamente con la sostanza in esame e deve essere compatibile con la sopravvivenza delle cellule e con l’azione di S9 alla concentrazione usata. L’uso di solventi/veicoli poco noti (ad esempio, acqua, terreno di coltura cellulare, dimetilsolfossido) è ammesso purché suffragato da dati che ne provino la compatibilità con la sostanza sperimentale e l’assenza di tossicità genetica. Si raccomanda di prendere in primo luogo in considerazione, se possibile, l’uso di un solvente/veicolo acquoso. Uso di citoB come inibitore della citocinesi 20. Una delle considerazioni più importanti riguardo alla prestazione del saggio MNvit è garantire che le cellule contate abbiano completato la micosi durante il trattamento o nell’eventuale periodo di incubazione successiva al trattamento. La citocalasina B è l’agente più diffusamente usato per bloccare la citocinesi, poiché inibisce l’aggregazione dell’actina e, di conseguenza, impedisce la separazione delle cellule figlie dopo la mitosi, portando alla formazione di cellule binucleate (5) (54) (55). Il conteggio dei micronuclei, pertanto, può essere limitato alle cellule che si sono avviate alla mitosi durante o dopo il trattamento. L’effetto della sostanza sperimentale sulla proliferazione cellulare può essere misurato simultaneamente. La citocalasina B deve essere usata come inibitore della citocinesi quando si impiegano linfociti umani, perché la durata del ciclo cellulare può variare tra le colture e tra donatori e perché non tutti i linfociti rispondono alla PHA. Nei test su linee cellulari sono stati utilizzati altri metodi per stabilire se le cellule sottoposte a conteggio si sono divise; tali metodi sono descritti di seguito (cfr. il punto 26). 21. Per ciascun tipo cellulare il laboratorio deve determinare la concentrazione adeguata di citocalasina B per ottenere la frequenza ottimale di cellule binucleate nelle colture di controllo con solvente/veicolo. La concentrazione adeguata di citocalasina B è solitamente compresa tra 3 e 6 μg/ml. Misurazione della proliferazione cellulare e della citotossicità e scelta delle concentrazioni di esposizione 22. Nel determinare la concentrazione massima di sostanza da testare si devono evitare concentrazioni che hanno la capacità di produrre risposte positive artefatte tra cui le concentrazioni che causano eccessiva citotossicità, precipitazione nel terreno di coltura e variazioni marcate di pH o osmolalità (39) (40) (41). 23. La proliferazione cellulare deve essere misurata per garantire che le cellule trattate si sono avviate alla mitosi durante il saggio e che i trattamenti sono condotti ad adeguati livelli di citotossicità (cfr. il punto 29). La citotossicità deve essere determinata con e senza attivazione metabolica nelle cellule che richiedono attivazione metabolica sulla base dell’aumento relativo delle conte cellulari (RICC) o del raddoppiamento relativo della popolazione (RPD) (cfr. l’appendice 2 per le formule), a meno che non si ricorra alla citocalasina B. In tal caso, la citotossicità può essere determinata sulla base dell’indice di replicazione (RI) (cfr. l’appendice 2 per la formula). 24. Il trattamento di colture con citoB e la misurazione delle frequenze relative di cellule mononucleate, binucleate e multinucleate nella coltura rappresentano un metodo accurato per la quantificazione dell’effetto sulla proliferazione cellulare e dell’attività citotossica o citostatica di un trattamento (5), e garantiscono che siano conteggiate soltanto le cellule che hanno iniziato la divisione durante o dopo il trattamento. 25. Negli studi con citoB, la citostasi/citotossicità può essere quantificata sulla scorta dell’indice che misura la cinetica della proliferazione cellulare (CBPI) (5) (26) (56) o può essere ottenuto dall’indice di replicazione di almeno 500 cellule per coltura (cfr. l’appendice 2 per le formule). Se per valutare la proliferazione è usata la citocalasina B, si deve determinare un CBPI o un indice di replicazione a partire da almeno 500 cellule per coltura. Queste misurazioni, tra le altre, possono essere utilizzate per stimare la citotossicità confrontando valori nelle colture trattate e nei controlli. La valutazione di altri marcatori di citotossicità (ad esempio, confluenza, numero di cellule, apoptosi, necrosi, conteggio in metafase) può fornire informazioni utili. 26. Negli studi condotti senza citoB occorre dimostrare che le cellule contate nella coltura hanno avviato il processo di divisione durante o in seguito al trattamento con la sostanza sperimentale, per evitare che si producano falsi negativi. Tra i metodi usati per assicurare che siano contate le cellule in fase di divisione vi sono l’incorporazione e il successivo rilevamento di bromodeossiuridina (BrdU) per individuare le cellule che si sono replicate (57), la formazione di cloni quando cellule da linee cellulari permanenti sono trattate e contate in situ su un vetrino per microscopio (indice di proliferazione, PI) (25) (26) (27) (28) o la misurazione del raddoppiamento relativo della popolazione (RPD) o dell’aumento relativo della conta cellulare (RICC) o altri metodi dimostrati (16) (56) (58) (59) (cfr. l’appendice 2 per le formule). La valutazione di altri marcatori di citotossicità o citostasi (ad esempio, confluenza, numero di cellule, apoptosi, necrosi, conteggio in metafase) può fornire informazioni utili. 27. Si usino almeno tre concentrazioni analizzabili. A tal fine può essere necessario eseguire l’esperimento utilizzando un maggior numero di concentrazioni strettamente intervallate e analizzando la formazione di micronuclei nelle concentrazioni che forniscono un intervallo di citotossicità adeguato. Una strategia alternativa consiste nell’eseguire un test di citotossicità preliminare per ridurre l’intervallo di tossicità del test definitivo. 28. La concentrazione più elevata deve puntare a produrre una tossicità pari a 55 ± 5 %. Livelli più elevati possono indurre danni cromosomici come effetto secondario di citotossicità (60). In caso di sostanze citotossiche, le concentrazioni selezionate per il saggio devono andare dalla citotossicità 55 ± 5 % ad una tossicità assente o modica. 29. Se non si osserva citotossicità o non si rileva la presenza di un precipitato, la concentrazione massima di prova dovrebbe essere pari a 0,01 M, 5 mg/mL o 5 μl/mL (si scelga il valore più basso). Le concentrazioni scelte per l’analisi cioè devono essere di norma separate al massimo da un fattore compreso tra 0 e più di 10. Per sostanze che esibiscono una curva concentrazione-risposta a forte inclinazione potrebbe essere necessario intervallare più frequentemente le concentrazioni della sostanza, affinché si possano contare anche le colture che ricadono nell’intervallo di tossicità moderata o bassa. 30. Per sostanze difficilmente solubili, la dose massima, se non limitata dalla citotossicità, dovrebbe essere la concentrazione più bassa in cui sia visibile la precipitazione minima nelle colture, purché questa non interferisca con la valutazione. La valutazione della precipitazione dev’essere fatta sulla base di tecniche quali la microscopia ottica, rilevando il precipitato che persiste o appare durante la coltura (al termine del trattamento). Controlli 31. Ogni test dovrà comprendere controlli positivi e con solvente o veicolo trattati in parallelo, con e senza attivazione metabolica. 32. I controlli positivi sono necessari per dimostrare la capacità delle cellule usate, e del protocollo sperimentale, di individuare clastogeni e aneugeni, e di affermare la capacità metabolica del preparato S9. Come controlli positivi si utilizzino induttori noti della formazione di micronuclei, a livelli ai quali ci si attende un aumento modesto ma riproducibile rispetto ai valori normali, che dimostri la sensibilità del test. La concentrazione del controllo positivo deve essere tale che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente al lettore l’identità dei vetrini codificati. 33. Per dimostrare sia la competenza metabolica sia la capacità del test di rilevare i clastogeni dev’essere usato un clastogeno che esige attivazione metabolica (ad esempio, ciclofosfamide; benzo[a]pirene). Si possono usare altre sostanze per i controlli positivi, se giustificate. Poiché in alcune condizioni sperimentali o in determinate linee cellulari taluni controlli positivi che richiedono l’attivazione metabolica possono essere attivi senza attivazione metabolica esogena, la necessità dell’attivazione metabolica, e dell’attività del preparato S9, dev’essere testata nella linea cellulare selezionata e alle concentrazioni selezionate. 34. Attualmente, non sono noti aneugeni che richiedono l’attivazione metabolica per la loro attività genotossica (16). I controlli positivi attualmente accettati per l’attività aneugenica sono, per esempio, colchicina e vinblastina. Possono essere usate altre sostanze chimiche, se inducono la formazione di micronuclei esclusivamente o prevalentemente mediante attività aneugenica. Per evitare la necessità di due controlli positivi (per clastogenicità e aneugenicità) senza attivazione metabolica, il controllo per l’aneugenicità può essere utilizzato come controllo positivo senza S9, e il controllo per la clastogenicità può essere impiegato per valutare l’adeguatezza del sistema di attivazione metabolica usato. Nelle cellule che non necessitano di S9 possono essere usati controlli positivi sia per la clastogenicità che per l’aneugenicità. I controlli positivi raccomandati figurano nell’appendice 3. 35. Si può prendere in considerazione l’uso di sostanze di una classe chimica correlata, se sono disponibili sostanze adeguate. Tutti i controlli positivi utilizzati devono essere adeguati per il tipo cellulare e per le condizioni di attivazione. 36. Per ogni fase di raccolta si effettuino anche controlli con solvente o veicolo. Si proceda inoltre a controlli negativi non trattati (senza solvente/veicolo), salvo che dati precedenti pubblicati o di laboratorio provino che il solvente scelto non induce effetti genotossici o altri effetti nocivi alle concentrazioni utilizzate. PROCEDURA Calendario del trattamento 37. Per massimizzare la probabilità di individuare un aneugeno o un clastogeno in azione in un determinato stadio del ciclo cellulare è importante che quantitativi sufficienti di cellule siano trattati con la sostanza sperimentale in tutte le fasi dei cicli cellulari. Il calendario di trattamento per le linee cellulari e per le colture cellulari primarie, pertanto, può differire in parte da quello previsto per i linfociti, che per avviare il ciclo cellulare necessitano di una stimolazione mitogenica (cfr. i punti 41-43) (16). 38. Considerazioni teoriche, unitamente ai dati pubblicati, (18) indicano che la maggior parte degli aneugeni e dei clastogeni sarà rilevata entro un periodo di trattamento breve di 3 fino a 6 ore, con o senza S9, cui seguirà la rimozione della sostanza sperimentale e un periodo di crescita di 1,5–2,0 cicli cellulari (6). Le cellule sono campionate in un lasso di tempo pari a circa 1,5–2,0 volte la durata normale (ossia senza trattamento) del ciclo cellulare, dopo l’inizio o alla fine del trattamento stesso (cfr. la tabella 1). I tempi di campionamento o di recupero possono essere estesi se è noto o si sospetta che la sostanza sperimentale incide sulla durata del ciclo cellulare (ad esempio, se si sperimentano analoghi nucleosidici). 39. In considerazione della potenziale tossicità dei preparati S9 per le cellule di mammifero coltivate, l’esposizione al trattamento è estesa di 1,5–2,0 cicli cellulari normali soltanto in assenza di S9. In caso di estensione il trattamento con la sostanza sperimentale può essere effettuato con o senza citoB. Queste alternative permettono di gestire situazioni in cui vi siano timori per le potenziali interazioni tra la sostanza sperimentale e citoB. 40. I calendari di trattamento suggeriti figurano nella tabella 1. Si tratta di calendari generici che possono essere modificati in base alla stabilità o alla reattività della sostanza sperimentale ovvero alle particolari caratteristiche di crescita delle cellule utilizzate. Tutti i trattamenti devono iniziare e terminare nel momento di crescita esponenziale delle cellule. I calendari sono illustrati in maniera più dettagliata ai punti 41-47. Tabella 1 Trattamento delle cellule e fasi di raccolta per il saggio MNvit Linfociti, cellule primarie e linee cellulari trattate con citoB + S9 Trattare per 3-6 ore con S9; rimuovere S9 e terreno di coltura; aggiungere nuovo terreno e citoB; procedere alla raccolta a distanza di 1,5–2,0 cicli cellulari normali. – S9 Breve esposizione Trattare per 3-6 ore; rimuovere il terreno di coltura; aggiungere nuovo terreno e citoB; procedere alla raccolta a distanza di 1,5–2,0 cicli cellulari normali. – S9 Esposizione Prolungata Opzione A: trattare per 1,5–2 cicli cellulari normali con citoB; procedere alla raccolta al termine del periodo di esposizione. Opzione B: trattare per 1,5–2,0 cicli cellulari normali; asportare la sostanza sperimentale; aggiungere nuovo terreno e citoB; procedere alla raccolta dopo 1,5–2,0 cicli cellulari normali. Linee cellulari trattate senza citoB (medesimo calendario di trattamento descritto sopra, a eccezione dell’aggiunta di citoB) Linfociti, cellule primarie e linee cellulari con citoB 41. Per i linfociti, l’approccio più efficiente è iniziare l’esposizione alla sostanza sperimentale a distanza di 44-48 ore dopo la stimolazione con PHA, quando la sincronizzazione del ciclo sarà scomparsa (5). Nel saggio iniziale, le cellule sono trattate per 3 fino a 6 ore con la sostanza sperimentale, con o senza S9. Il terreno di coltura viene rimosso e sostituito con nuovo terreno contenente citoB; si procede alla raccolta quando è trascorso un periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare normale. 42. Se entrambi i test iniziali del trattamento breve (3-6 ore) sono negativi o ambigui, si ricorre a un’ulteriore esposizione successiva con S9. In tal caso sono possibili due opzioni, entrambe accettabili. Tuttavia, potrebbe essere più appropriato seguire l’opzione A per i linfociti stimolati se la crescita esponenziale risulta in calo a distanza di 96 ore dalla stimolazione. Inoltre, nell’opzione B le colture cellulari non devono aver raggiunto la confluenza prima dell’ultimo campionamento. — Opzione A: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 1,5–2,0 cicli cellulari normali; si procede alla raccolta al termine del periodo di trattamento. — Opzione B: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 1,5–2,0 cicli cellulari normali. Il terreno di coltura è rimosso e sostituito con nuovo terreno; si procede alla raccolta quando è trascorso un ulteriore periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare normale. 43. Le cellule primarie e le linee cellulari devono essere trattate in maniera analoga ai linfociti, salvo che non è necessario ricorrere alla stimolazione con PHA per 44-48 ore. Le cellule diverse dai linfociti devono essere esposte in maniera tale che, al momento della conclusione dello studio, le cellule si trovino ancora in una fase di crescita esponenziale. Linee cellulari senza citoB 44. Le cellule sono trattate per 3-6 ore, in presenza o in assenza di S9. Il terreno di coltura è rimosso e sostituito con nuovo terreno; si procede alla raccolta quando è trascorso un periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare normale. 45. Se entrambi i test iniziali del trattamento breve (3-6 ore) sono negativi o ambigui, si ricorre a un’ulteriore esposizione successiva con (senza S9). In tal caso sono possibili due opzioni, entrambe accettabili: — Opzione A: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 1,5–2,0 cicli cellulari normali; si procede alla raccolta al termine del periodo di trattamento. — Opzione B: le cellule sono trattate con la sostanza sperimentale per 1,5–2,0 cicli cellulari normali. Il terreno di coltura è rimosso e sostituito con nuovo terreno; si procede alla raccolta quando è trascorso un ulteriore periodo equivalente a 1,5–2,0 volte la durata del ciclo cellulare normale. 46. Nei monostrati possono essere presenti cellule mitotiche (identificabili perché di forma tonda e in fase di distacco dalla superficie) al termine del trattamento di 3-6 ore. Poiché tali cellule mitotiche si staccano facilmente, potrebbero andare perdute al momento della rimozione del terreno di coltura. Tali cellule vanno raccolte con una certa attenzione quando le colture vengono lavate e vanno riposte nuovamente nelle colture per evitare di perdere cellule in mitosi, e quindi a rischio di formazione di micronuclei, al momento della raccolta. Numero di colture 47. Per ogni concentrazione di sostanza sperimentale e per le colture dei controlli negativi e con solvente/veicolo si utilizzino colture doppie. Se è possibile dimostrare, a partire da dati di laboratorio pregressi, una variazione minima tra colture doppie, si potrebbe ricorrere a colture singole. In tal caso, si raccomanda di analizzare un maggior numero di concentrazioni. Raccolta delle colture e preparazione dei vetrini 48. Per ogni coltura si procede a una raccolta e a un’elaborazione separate. Per la preparazione delle cellule può essere necessario un trattamento ipotonico, che tuttavia si può evitare se, con altri mezzi, è possibile ottenere un’adeguata diffusione delle cellule. Possono essere usate tecniche diverse per la preparazione dei vetrini, purché siano garantiti preparati cellulari di elevata qualità per il conteggio. Il citoplasma cellulare può essere conservato per consentire il rilevamento dei micronuclei e (con il metodo di inibizione della citocinesi) l’individuazione affidabile di cellule binucleate. 49. I vetrini possono essere colorati con tecniche diverse, per esempio con il metodo Giemsa o tinture fluorescenti che si legano al DNA (59). L’uso di un colorante specifico per il DNA [ad esempio, arancio di acridina (61) o Hoechst 33258 più pironina-Y (62)] può eliminare alcuni degli artefatti dovuti all’uso di un colorante non specifico per il DNA. Per individuare i contenuti (cromosoma/frammento cromosomico) dei micronuclei possono essere usati anche anticorpi anticinetocore, FISH con sonde di DNA pancentromerico o marcatura in situ mediante primer specifici per DNA pancentromerico, unitamente a un’adeguata colorazione del DNA, se interessa acquisire informazioni sui meccanismi di formazione dei micronuclei (15)(16). Possono infine essere usati altri metodi per distinguere i clastogeni dagli aneugeni, purché sia stata dimostrata la loro efficacia. Analisi 50. Tutti i vetrini, compresi quelli del solvente/veicolo e dei controlli, devono essere codificati indipendentemente prima dell’esame al microscopio. In alternativa, i campioni codificati possono essere esaminati mediante un sistema convalidato e automatizzato di analisi citometrica o di analisi per immagini. 51. Nelle colture trattate con citoB, le frequenze dei micronuclei devono essere analizzate in almeno 2 000 cellule binucleate per concentrazione (almeno 1 000 cellule binucleate per coltura; due colture per concentrazione). Se si utilizza un’unica coltura, dalla stessa devono essere contate almeno 2 000 cellule binucleate per concentrazione. Se per il conteggio è disponibile un numero sostanzialmente inferiore a 1 000 cellule binucleate per coltura, o a 2 000 cellule se si usa un’unica coltura, per ogni concentrazione, e se non si rileva un aumento significativo dei micronuclei, il saggio dev’essere ripetuto con più cellule o con una concentrazione meno tossica, a seconda di quale opzione sia più appropriata. Si deve prestare attenzione a non conteggiare cellule binucleate con forme irregolari o che evidenzino due nuclei di dimensioni marcatamente diverse; le cellule binucleate non possono inoltre essere confuse con cellule multinucleate a scarsa diffusione. Le cellule contenenti più di due nuclei principali non devono essere considerate per la ricerca di micronuclei, poiché la frequenza di riferimento dei micronuclei può essere superiore in queste cellule (63) (64). Il calcolo delle cellule mononucleate è accettabile se è dimostrato che la sostanza sperimentale interferisce con l’attività della citoB. 52. Nelle linee cellulari testate senza trattamento con citoB, i micronuclei devono essere contati in almeno 2 000 cellule per concentrazione (almeno 1 000 cellule per coltura; due colture per concentrazione). Se si utilizza soltanto una coltura per concentrazione, da tale coltura devono essere contate almeno 2 000 cellule. 53. Nei trattamenti con citoB dev’essere determinato un CBPI o un RI per valutare la proliferazione cellulare (cfr. l’appendice 2) a partire da almeno 500 cellule per coltura. Al contrario, nei trattamenti effettuati senza citoB, è fondamentale dimostrare che le cellule inserite nel conteggio sono in fase di proliferazione, come si è detto ai punti 24-27. Criteri di accettabilità 54. Un laboratorio che propone di utilizzare il saggio MNvit descritto nel presente metodo di prova deve dimostrare la propria capacità di individuare con affidabilità e accuratezza le sostanze chimiche con un’attività aneugenica e clastogenica nota, con e senza attivazione metabolica, oltre che le sostanze chimiche negative note, con l’impiego delle sostanze di riferimento riportate nell’appendice 3. Come prova della sua capacità di eseguire il presente metodo di prova correttamente, il laboratorio deve dimostrare che le cellule conteggiate per la formazione di micronuclei hanno portato a termine una divisione nucleare se il test è condotto senza l’impiego di citoB. 55. Si raccomanda di utilizzare le sostanze elencate nell’appendice 3 come sostanze di riferimento. Possono essere incluse sostanze alternative o aggiuntive, purché la loro attività sia nota e inducano la formazione di micronuclei mediante gli stessi meccanismi d’azione, e qualora si dimostri che tali sostanze sono rilevanti per le sostanze chimiche che saranno testate con la procedura MNvit. Tra le motivazioni addotte può figurare uno studio di convalida che utilizza un’ampia varietà di sostanze o incentrato su uno spettro più ridotto in base alla classe chimica della sostanza sperimentale o al meccanismo che produce il danno. 56. Dal controllo con solvente/veicolo e dalle colture non trattate devono emergere frequenze di formazione di micronuclei basse e coerenti in maniera riproducibile (normalmente 5-25 micronuclei/1 000 cellule per i tipi cellulari individuati al punto 11). Altri tipi cellulari possono avere gamme di risposta diverse, che devono essere determinate al momento della convalida ai fini di un loro impiego nel saggio MNvit. I dati provenienti dai controlli negativi, positivi e con solvente devono essere utilizzati per fissare range di controllo storici. Tali valori vanno considerati per decidere in merito all’adeguatezza dei controlli positivi e negativi paralleli per un esperimento. 57. Se si propongono per il saggio modifiche di modesta entità al protocollo (ad esempio, uso di tecniche di conteggio automatizzate anziché manuali, uso di un nuovo tipo cellulare), l’efficacia di tali modifiche dev’essere dimostrata prima di considerare adatto all’uso il protocollo modificato. Per dimostrare l’efficacia è necessario dimostrare che i principali meccanismi di rottura cromosomica e di perdita o acquisizione di materiale cromosomico possono essere rilevati e che è possibile ottenere risultati positivi e negativi appropriati per la classe della sostanza in esame, o per la più ampia gamma di sostanze in esame. DATI E RELAZIONE Trattamento dei risultati 58. Se si ricorre alla tecnica dell’inibizione della citocinesi, per valutare l’induzione di micronuclei si usano soltanto le frequenze di cellule binucleate con micronuclei (indipendentemente dal numero di micronuclei per cellula). Il conteggio del numero di cellule con uno, duo o più micronuclei non è obbligatorio, anche se potrebbe fornire informazioni utili. 59. Per tutte le colture di controllo trattate e per quelle con solvente/veicolo si determini in parallelo la citotossicità e/o la citostasi (58). Nell’eventualità in cui si ricorra al metodo dell’inibizione della citocinesi, per tutte le colture trattate e per i controlli dev’essere calcolato il CBPI o l’RI quale misurazione del ritardo del ciclo cellulare. Nei trattamenti senza citoB si utilizza l’RPD o il RICC o il PI (cfr. l’appendice 2). 60. Devono essere forniti dati sulle singole colture. Tutti i dati devono essere riportati sinteticamente in una tabella. 61. Le sostanze chimiche che inducono formazione di micronuclei nel saggio MNvit possono avere questo effetto come conseguenza dell’induzione della rottura cromosomica, della perdita di cromosomi o di entrambi tali eventi. Si può ricorrere a un’ulteriore analisi con anticorpi anticinetocore, sonde centromero-specifiche in situ o altri metodi per stabilire se il meccanismo di induzione di micronuclei è dovuto a un’attività clastogenica e/o aneugenica. Valutazione e interpretazione dei risultati 62. Non è richiesta la verifica di una risposta chiaramente positiva o negativa mediante test ulteriori. I risultati ambigui possono essere chiariti attraverso l’analisi di altre 1 000 cellule prelevate da tutte le colture per evitare la perdita di cecità. Se questo approccio non risolve l’ambiguità, occorre ricorrere a test ulteriori. Negli esperimenti di follow-up è bene considerare l’opportunità di variare i parametri dello studio in base a una serie ampliata o limitata di condizioni, a seconda dei casi. Tra i parametri che potrebbero essere modificati si annoverano l’intervallazione delle concentrazioni sperimentali, la durata del trattamento e la raccolta delle cellule, e/o le condizioni di attivazione metabolica. 63. Vari criteri permettono di determinare se un risultato è positivo, ad esempio un aumento correlato alla concentrazione o un aumento statisticamente significativo del numero di cellule che presentano micronuclei. Si consideri per prima cosa la rilevanza dei risultati dal punto di vista biologico. Il fatto di stabilire se i valori osservati rientrano o trascendono l’intervallo storico dei controlli può fornire informazioni importanti per la valutazione della significatività biologica della risposta. Si possono usare metodi statistici adeguati come ausilio nella valutazione dei risultati sperimentali (65), ma i risultati delle prove statistiche dovrebbero essere analizzati alla luce del rapporto dose-risposta. Si deve infine tener conto della riproducibilità e dei dati storici. 64. La maggior parte degli esperimenti fornirà risultati chiaramente positivi o negativi, ma occasionalmente i dati ottenuti non consentiranno di formulare un giudizio definitivo sull’azione della sostanza in esame. I risultati possono rimanere ambigui o dubbi nonostante l’esperimento venga ripetuto più volte. 65. Risultati positivi del saggio MNvit indicano che una sostanza induce rottura cromosomica o perdita di materiale cromosomico nelle cellule germinali della specie sottoposta a test. Risultati negativi indicano che, nelle condizioni del test, la sostanza in esame non induce rotture cromosomiche e/o acquisizione o perdita di materiale cromosomico nelle cellule germinali della specie sottoposta a test. Relazione sul saggio 66. La relazione sul saggio deve contenere perlomeno le seguenti informazioni, se pertinenti per l’esecuzione dello studio: Sostanza chimica di prova — dati di identificazione e numeri CAS e CE; — caratteristiche fisiche e purezza; — proprietà fisico-chimiche rilevanti per l’esecuzione dello studio; — reattività della sostanza sperimentale al solvente/veicolo o al terreno di coltura cellulare; Solvente/veicolo — motivazione della scelta del solvente/veicolo; — solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/veicolo; Cellule — tipo e origine delle cellule usate; — adeguatezza del tipo cellulare usato; — assenza di micoplasmi, se del caso; — informazioni sulla durata del ciclo cellulare, sui tempi di raddoppiamento o sull’indice di proliferazione; — se si utilizzano linfociti, sesso, età e numero dei donatori di sangue, se del caso; — se si utilizzano linfociti, precisazione in merito all’esposizione di sangue intero o di singoli linfociti; — numero di passaggi in coltura, se del caso; — metodi usati per la conservazione delle colture cellulari, se del caso; — numero modale di cromosomi; — durata del normale ciclo cellulare (controlli negativi); Condizioni di prova — identità dell’inibitore della citocinesi (ad esempio, citoB), se impiegato, e la sua concentrazione oltre che la durata di esposizione delle cellule; — criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture, compresi i dati sulla citotossicità e sui limiti di solubilità, se disponibili; — composizione del terreno di coltura, concentrazione di CO2, se del caso; — concentrazioni della sostanza in esame; — concentrazione (e/o volume) del veicolo e della sostanza di prova aggiunti; — temperatura e tempo di incubazione; — durata del trattamento; — momento della raccolta dopo il trattamento; — densità delle cellule al momento dell’inoculazione, se del caso; — tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica, compresi i criteri di accettabilità; — controlli positivi e negativi; — metodi di preparazione dei vetrini e tecniche di colorazione utilizzati; — criteri di identificazione dei micronuclei; — numeri di cellule analizzate; — metodi di misura della citotossicità; — eventuali informazioni supplementari pertinenti per la citotossicità; — criteri in base ai quali i risultati sono considerati positivi, negativi o ambigui; — metodo o metodi di analisi statistica usati; — metodi, come l’uso di anticorpi anticinetocore, per stabilire se i micronuclei contengono cromosomi interi o frammenti, se del caso; Risultati — metodo di misurazione della citotossicità impiegato, ad esempio CBPI o RI, se si ricorre al metodo dell’inibizione della citocinesi; RICC, RPD o PI, se non si ricorre a metodi di inibizione della citocinesi; altre osservazioni, se del caso, ad esempio confluenza cellulare, apoptosi, necrosi, conta in metafase, frequenza di cellule binucleate; — segni di precipitazione; — dati sul pH e sull’osmolalità del terreno di trattamento, se determinati; — definizione delle cellule accettabili per l’analisi; — distribuzione delle cellule mononucleate, binucleate e multinucleate, se si utilizza un metodo di inibizione della citocinesi; — numero di cellule con micronuclei, indicato separatamente per ciascuna coltura trattata e di controllo, e indicazione relativa alla loro origine (se da cellule binucleate o mononucleate), se del caso; — relazione concentrazione-risposta, se possibile; — dati sui controlli negativi (solvente/veicolo) e positivi (concentrazioni e solventi) paralleli; — precedenti dati sui controlli negativi (solvente/veicolo) e positivi, con variazioni, medie e deviazioni standard e con l’indicazione dell’intervallo di confidenza (ad esempio, 95 %); — analisi statistica; valori p, se noti; Discussione dei risultati Conclusioni BIBLIOGRAFIA (1) Kirsch-Volders, M. 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(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184. (60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247. (64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75. (65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pagg. 463-467. (66) Regolamento (CE) n. 850/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004, relativo agli inquinanti organici persistenti e che modifica la direttiva 79/117/CEE, GU L 229 del 30.4.2004, pag. 5. Appendice 1 Definizioni Aneugeno: qualsiasi sostanza o processo che, interagendo con le componenti del ciclo mitotico e meiotico di divisione cellulare, determina aneuploidia nelle cellule o negli organismi. Aneuploidia: qualsiasi deviazione dal normale numero diploide (o aploide) di cromosomi da parte di uno o più cromosomi, ma non dell’intero corredo di cromosomi (poliploidia). Apoptosi: morte cellulare programmata caratterizzata da una serie di fasi che portano alla disintegrazione delle cellule in particelle legate alla membrana, le quali vengono poi eliminate mediante fagocitosi o “shedding” (clivaggio dei ricettori di membrana). Proliferazione cellulare: aumento del numero di cellule dovuto alla divisione mitotica delle cellule. Centromero: regione del DNA di un cromosoma in cui la coppia dei cromatidi è mantenuta unita e sulla quale sono localizzati fianco a fianco i due cinetocori. Clastogeno: qualsiasi sostanza o processo in grado di provocare aberrazioni nella struttura di un cromosoma in popolazioni di cellule o organismi. Citocinesi o citodieresi: il processo di divisione cellulare immediatamente successivo alla mitosi e che porta alla formazione di due cellule figlie, ciascuna contenente un nucleo. Indice di proliferazione cellulare (CBPI): la proporzione di cellule in fase di seconda divisione nella popolazione trattata rispetto al controllo (cfr. l’appendice 2 per la formula). Citostasi: inibizione della crescita cellulare (cfr. l’appendice 2 per la formula). Citotossicità: effetti dannosi a carico della struttura o della funzione cellulare che in ultima istanza provocano la morte della cellula. Genotossico: termine generico che comprende tutti i tipi di danno a carico del DNA o dei cromosomi, tra cui rotture, riarrangiamenti degli addotti, alterazioni, aberrazioni cromosomiche e aneuploidia. Non tutti i tipi di effetti genotossici determinano alterazioni cromosomiche o danni permanenti ai cromosomi. Cellule in interfase: cellule non ancora approdate alla fase mitotica. Cinetocore: una struttura proteica che si forma nel centromero di un cromosoma e alla quale si agganciano i microtubuli del fuso durante la divisione cellulare, consentendo un movimento ordinato dei cromosomi delle cellule figlie verso i poli di queste ultime. Micronuclei: piccoli nuclei, distinti e soprannumerari rispetto al principale nucleo delle cellule, prodotti durante la telofase della mitosi o della meiosi da frammenti residui di cromosomi o da cromosomi interi. Mitosi: divisione del nucleo cellulare, solitamente suddivisa in profase, prometafase, metafase, anafase e telofase. Indice mitotico: il rapporto tra cellule in metafase e il numero totale di cellule osservate in una popolazione cellulare; un’indicazione del grado di proliferazione cellulare di una popolazione. Mutageno: un fattore in grado di provocare mutazioni ereditarie delle sequenze di coppie di basi del DNA nei geni o della struttura dei cromosomi (aberrazioni cromosomica). Non disgiunzione: incapacità della coppia di cromatidi di separarsi e di migrare in due cellule figlie distinte in fase di divisione, con la conseguenza che una cellula figlia presenterà un numero anomalo di cromosomi. Poliploidia: aberrazioni numeriche dei cromosomi che interessa l’intero corredo cromosomico di cellule o organismi, a differenza dall’aneuploidia, che invece interessa un solo cromosoma o più cromosomi, ma non l’intero corredo cromosomico. Indice di proliferazione (PI): metodo per la misurazione della citotossicità nel caso in cui non si utilizzi citoB (cfr. l’appendice 2 per la formula). Aumento relativo della conta cellulare (Relative Increase in Cell Count, RICC): metodo per la misurazione della citotossicità nel caso in cui non si utilizzi citoB (cfr. l’appendice 2 per la formula). Raddoppiamento relativo della popolazione (Relative Population Doubling, RPD): metodo per la misurazione della citotossicità nel caso in cui non si utilizzi citoB (cfr. l’appendice 2 per la formula). Indice di replicazione (RI): la proporzione dei cicli di divisione cellulare completati in una coltura trattata rispetto al controllo, durante il periodo di esposizione e il recupero (cfr. l’appendice 2 per la formula). Sostanza di prova (o sostanza sperimentale): qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. Appendice 2 Formule per la valutazione della citotossicità 1. Nei trattamenti con citoB, la valutazione della tossicità deve basarsi sull’indice di proliferazione cellulare (CBPI) o sull’indice di replicazione (RI) (16) (58). Il CBPI indica la media dei cicli cellulari per singola cellula durante il periodo di esposizione alla citoB e può essere usato per calcolare la proliferazione cellulare. L’RI indica il numero relativo di nuclei nelle colture trattate rispetto ai controlli e può essere usato per calcolare la % di citostasi: % citostasi = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} e: T = coltura di trattamento con la sostanza chimica C = coltura di controllo con veicolo dove: Quindi, un CBPI pari a 1 (tutte le cellule sono mononucleate) equivale a una percentuale di citostasi del 100 %. Citostasi = 100 – RI T = colture trattate C = colture di controllo 2. Quindi, un RI del 53 % significa che, rispetto al numero di cellule che si sono divise per formare cellule binucleate e multinucleate nella coltura di controllo, nella coltura trattata soltanto il 53 % si è avviato alla divisione, ossia si ha una percentuali di citostasi pari al 47 %. 3. Nei trattamenti senza citoB, si raccomanda di valutare la citotossicità in base all’aumento relativo delle conte cellulari (RICC) o al raddoppiamento relativo della popolazione (RPD) (58), poiché entrambi i metodi tengono conto della proporzione di popolazione cellulare che è andata incontro a divisione. dove: Raddoppiamento della popolazione = [logaritmo (numero di cellule dopo il trattamento ÷ numero di cellule iniziale)] ÷ logaritmo 2 4. Quindi, un RICC o un RPD del 53 % indica una citotossicità/citostasi del 47 %. 5. Con un indice di proliferazione (PI) è possibile valutare la citotossicità contando il numero di cloni consistenti in 1 cellula (cl1), 2 cellule (cl2), da 3 a 4 cellule (cl4) e da 5 a 8 cellule (cl8) 6. Il PI è stato usato come parametro di citotossicità valido e affidabile anche per le linee cellulari coltivate in situ in assenza di citoB (25) (26) (27) (28). Appendice 3 Sostanze di riferimento raccomandate per la valutazione della prestazione (16) Categoria Sostanza CAS CE 1. Clastogeni attivi senza attivazione metabolica Citosina arabinoside 147-94-4 205-705-9 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 2. Clastogeni che richiedono attivazione metabolica Benzo(a)pirene 50-32-8 200-028-5 Ciclofosfamide 50-18-0 200-015-4 3. Aneugeni Colchicina 64-86-8 200-598-5 Vinblastina 143-67-9 205-606-0 4. Sostanze negative Di-2-etilesilftalato 117-81-7 204-211-0 Acido nalidixico 389-08-2 206-864-7 Pirene 129-00-0 204-927-3 Cloruro di sodio 7647-14-5 231-598-3 B.50. SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA: LOCAL LYMPH NODE ASSAY: DA INTRODUZIONE 1. Le linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche (OCSE Guidelines for the Testing of Chemicals) e i metodi di prova dell’UE vengono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici, delle mutevoli esigenze in materia di regolamentazione, e di considerazioni relative al benessere degli animali. Il primo metodo di prova (TM) (B.42) per la determinazione dell’irritazione cutanea nel topo, denominato Local Lymph Node Assay (LLNA; OCSE Test Guideline 429), è stato rivisto (1). Sono state pubblicate informazioni dettagliate sulla validazione dell’LLNA nonché una revisione delle attività a queste associate (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Nell’LLNA si utilizzano timidina o iodina marcate con traccianti radioisotopici per misurare la proliferazione dei linfociti; di conseguenza, quando l’acquisizione, l’impiego o lo smaltimento della radioattività risultano problematici, il ricorso al saggio è limitato. L’LLNA: DA (sviluppato da Daicel Chemical Industries, Ltd.) è una variante non radioattiva del metodo LLNA, che quantifica il contenuto di adenosina trifosfato (ATP) tramite bio-luminescenza utilizzandolo come indicatore della proliferazione linfocitaria. Il saggio LLNA: DA è stato convalidato, rivisto e raccomandato da un gruppo internazionale di esperti scientifici indipendenti, che lo considerano utile per l’individuazione di sostanze chimiche che provocano o non provocano sensibilizzazione cutanea, con alcuni limiti (10) (11) (12) (13). Il presente metodo di prova è stato concepito per valutare il potenziale di sensibilizzazione cutanea delle sostanze chimiche (sostanze e miscele) negli animali. Il capitolo B.6 del presente allegato e la linea guida dell’OCSE “Test Guideline 406” utilizzano saggi sui porcellini d’India, segnatamente il saggio di massimizzazione sui porcellini d’India e il saggio di Buehler (14). L’LLNA (capitolo B.42 del presente allegato; OCSE Test Guideline 429) e le sue due varianti non radioattive, LLNA: DA (capitolo B.50 del presente allegato; OCSE Test Guideline 442 A) e LLNA: BrdU-ELISA (capitolo B.51 del presente allegato; OCSE Test Guideline 442 B), offrono tutti un vantaggio rispetto ai saggi sui porcellini d’India in B.6 e OCSE Test Guideline 406 (14) in termini di riduzione e perfezionamento dell’utilizzo di animali. 2. Simile all’LLNA, l’LLNA: DA studia la fase di induzione della sensibilizzazione cutanea e fornisce dati quantitativi adeguati per una valutazione dose-risposta. Inoltre, la capacità del saggio di individuare sensibilizzanti cutanei senza la necessità di ricorrere a marcatori radioattivi per il DNA elimina il potenziale di esposizione professionale alla radioattività e le problematiche correlate allo smaltimento dei rifiuti. Ciò a sua volta può giustificare un accresciuto impiego dei topi per l’individuazione dei sensibilizzanti cutanei, che potrebbe ridurre ulteriormente l’uso dei porcellini d’India per testare il potenziale di sensibilizzazione cutanea (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14). DEFINIZIONI 3. Le definizioni usate figurano nell’appendice 1. CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI 4. Il saggio LLNA: DA è una variante del metodo LLNA da usarsi per identificare le potenziali sostanze chimiche che provocano sensibilizzazione cutanea, con alcuni limiti specifici. Ciò non significa necessariamente che l’LLNA: DA vada usato in tutti i casi in sostituzione del metodo LLNA o dei test sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14), ma piuttosto che il saggio ha gli stessi meriti e può essere utilizzato in alternativa, poiché i risultati positivi e negativi ottenuti con questo metodo non richiedono generalmente un’ulteriore conferma (10) (11). Prima di effettuare lo studio, il laboratorio che esegue il test deve consultare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza di prova, tra cui l’identità e la struttura chimica, le proprietà chimiche-fisiche, i risultati di eventuali altri test di tossicità in vitro o in vivo eseguiti sulla sostanza e i dati tossicologici su sostanze strutturalmente affini. Queste informazioni devono essere considerate per stabilire l’adeguatezza del saggio LLNA: DA per la sostanza in questione [data l’incompatibilità di talune limitate tipologie di sostanze chimiche LLNA: DA (cfr. il punto 5)] e servono a scegliere la dose. 5. L’LLNA: DA è un metodo in vivo e, di conseguenza, non elimina l’impiego di animali nella valutazione dell’attività allergizzante da contatto. Essa ha però il potenziale di ridurre il numero di animali necessari a tale scopo rispetto ai saggi sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14). Inoltre, l’LLNA: DA rappresenta un significativo miglioramento (minor sofferenza e dolore fisico) del modo in cui vengono usati gli animali per gli studi sull’allergia da contatto perché, diversamente dal metodo B.6 e dalla linea guida OCSE Test Guideline 406, l’LLNA: DA non richiede la stimolazione di reazioni di ipersensibilità cutanea indotte da provocazione. Nonostante i vantaggi dell’LLNA: DA rispetto al metodo B.6 e alla linea guida OCSE Test Guideline 406 (14), occorre riconoscere che esistono alcune limitazioni che possono rendere necessario l’impiego del metodo B.6 o della linea guida OCSE Test Guideline 406 [ad esempio, i test con alcuni metalli, risposte falsi positivi con alcuni irritanti cutanei (tra cui alcune sostanze della categoria dei tensioattivi) (6) (1 e capitolo B.42 del presente allegato), la solubilità della sostanza di prova]. Inoltre, le classi di sostanze chimiche o le sostanze contenenti gruppi funzionali che hanno dimostrato di agire da potenziali fattori di confondimento (16) possono richiedere l’uso dei saggi sui porcellini d’India (B.6; OCSE Test Guideline 406) (14). Si raccomanda di applicare anche all’LLNA: DA (10) i limiti che sono stati individuati per l’LLNA (1, e capitolo B.42 del presente allegato). Inoltre, l’uso del metodo LLNA: DA potrebbe non essere appropriato per la sperimentazione di sostanze che interferiscono con i livelli di ATP (ad esempio, sostanze che funzionano come inibitori degli ATP) o che non permettono un’accurata misurazione degli ATP intracellulari (ad esempio, presenza di enzimi che degradano gli ATP, presenza di ATP extracellulari nel linfonodo). A parte tali limiti già rilevati, l’LLNA: DA dovrebbe essere adatto per la sperimentazione di qualsiasi sostanza chimica, a meno che tale sostanza non possieda delle proprietà che possono interferire con l’accuratezza del saggio. Inoltre, non andrebbe esclusa la possibilità di produrre risultati positivi borderline nel caso in cui si ottengano valori per l’indice di stimolazione (SI) compresi tra 1,8 e 2,5 (cfr. i punti 31-32). Tale considerazione è basata sulla banca dati di validazione di 44 sostanze e l’uso di un SI ≥ 1,8 (cfr. il punto 6) nelle quali l’LLNA: DA ha correttamente individuato tutti i 32 sensibilizzanti dell’LLNA, ma ha erroneamente identificato tre delle 12 sostanze non sensibilizzanti dell’LLNA con valori SI compresi tra 1,8 e 2,5 (risultato borderline positivo) (10). Tuttavia, poiché lo stesso insieme di dati è stato usato per definire i valori SI e per calcolare le proprietà predittive del test, i risultati menzionati potrebbero essere una stima in eccesso delle reali proprietà predittive. PRINCIPIO DEL METODO 6. Il principio fondamentale che sta alla base dell’LLNA: DA è che i sensibilizzanti inducono una proliferazione di linfociti nel linfonodo responsabile del drenaggio della zona di applicazione della sostanza chimica. Tale proliferazione è proporzionale alla dose e alla potenza dell’allergene applicato e costituisce un semplice mezzo per ottenere una misurazione quantitativa della sensibilizzazione. Tale proliferazione è misurata confrontando la proliferazione media in ogni gruppo sperimentale con la proliferazione media nei controlli trattati con veicolo (VC). Occorre determinare il rapporto fra la proliferazione media nel gruppo trattato e quella del gruppo parallelo trattato con veicolo, definito “Indice di Stimolazione” (SI), che deve essere ≥ 1,8 prima che una sostanza sperimentale possa ulteriormente valutata come potenziale sensibilizzante cutaneo. Le procedure qui descritte si basano sulla misurazione del contenuto di ATP tramite bioluminescenza (tecnica nota per il conteggio delle cellule vive) (17) per rilevare un aumento del numero di cellule in fase di proliferazione nei linfonodi auricolari responsabili del drenaggio (18) (19). Il metodo della bioluminescenza utilizza l’enzima luciferasi per catalizzare la formazione di luce da ATP e luciferina in base alla seguente reazione: ATP + Luciferina + O 2 Ossiluciferina + AMP + PPi + CO 2 + Luce L’intensità della luce emessa è linearmente correlata alla concentrazione di ATP ed è misurata mediante un luminometro. Il saggio luciferina-luciferasi è un metodo sensibile per la quantificazione degli ATP usato in un’ampia varietà di applicazioni (20). DESCRIZIONE DEL SAGGIO Selezione delle specie animali 7. La specie di elezione per questo saggio è il topo. Gli studi di validazione per l’LLNA: DA sono stati condotti esclusivamente con il ceppo CBA/J, che pertanto è considerato il ceppo da preferire (12) (13). Vanno usate femmine di topo, giovani adulte, nullipare e non gravide. All’inizio dello studio, gli animali devono avere un’età compresa fra 8 e 12 settimane e la variazione ponderale degli animali deve essere minima e non superare il 20 % del peso medio. In alternativa, è possibile usare altri ceppi ed esemplari di sesso maschile quando vengano prodotti dati sufficienti a dimostrare che nella risposta LLNA: DA non esistono differenze significative per il ceppo e/o il genere. Condizioni di alloggio e alimentazione 8. I topi devono essere sistemati in gruppi (21), a meno che non venga fornita una giustificazione scientifica adeguata per la sistemazione dei topi in gabbie singole. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). Sebbene l’umidità relativa debba raggiungere almeno il 30 % e preferibilmente non superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti, occorre puntare a un valore del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 ore d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata di acqua potabile. Preparazione degli animali 9. Gli animali vanno selezionati in maniera randomizzata, marcati per consentire l’identificazione individuale (ma non mediante marchi per orecchio) e tenuti nelle loro gabbie per almeno cinque giorni prima del’inizio del dosaggio, per permetterne l’acclimatazione alle condizioni di laboratorio. Prima dell’inizio del trattamento, tutti gli animali vanno esaminati per accertarsi che non presentino lesioni cutanee visibili. Preparazione delle soluzioni 10. Le sostanze solide devono essere poste in soluzione o in sospensione in solventi/veicolo e, se necessario, diluite prima dell’applicazione su un orecchio del topo. Le sostanze liquide possono essere applicate direttamente o diluite prima del dosaggio. Le sostanze chimiche insolubili, come quelle solitamente presenti nei dispositivi medici, dovrebbero essere sottoposte a un’esagerata procedura di estrazione in un solvente adeguato per individuare tutti i componenti estraibili per la sperimentazione prima dell’applicazione a un orecchio del topo. Le sostanze di prova devono essere preparate quotidianamente, salvo qualora siano disponibili dati sulla stabilità che dimostrino che la conservazione è accettabile. Controllo dell’affidabilità 11. Si utilizzano sostanze chimiche per i controlli positivi (PC) per dimostrare che il saggio è stato eseguito in modo adeguato, rispondendo con una sensibilità appropriata e riproducibile a una sostanza sperimentale sensibilizzante per la quale l’entità della risposta SIA ben caratterizzata. Si raccomanda l’inclusione di una sostanza di controllo parallela, che dimostri la competenza del laboratorio nel condurre il saggio con successo e che consenta di valutare la riproducibilità e la compatibilità all’interno del laboratorio e tra laboratori diversi. Alcune autorità di regolamentazione richiedono inoltre l’uso di un controllo positivo per ciascuno studio; si invitano pertanto gli utilizzatori a consultare le autorità competenti prima di eseguire l’LLNA: DA. Di conseguenza, è auspicabile l’uso routinario di una sostanza di controllo parallela onde evitare la necessità di condurre ulteriori esperimenti su animali per soddisfare obblighi che potrebbero emergere dall’impiego periodico di un controllo positivo (cfr. il punto 12). Il controllo positivo dovrebbe produrre una risposta positiva all’LLNA: DA a un livello di esposizione che si ritiene provochi un aumento dell’indice di stimolazione SI ≥ 1,8 rispetto al gruppo di controllo negativo (NC). La dose per il controllo positivo va scelta in modo che non provochi eccessiva irritazione cutanea o tossicità sistemica e che l’induzione sia riproducibile m non eccessiva (ad esempio, un SI > 10 sarebbe eccessivo). Le sostanze di elezione sono un 25 % di esilcinnamaldeide (CAS 101-86-0) e un 25 % di eugenolo (CAS 97-53-0,) in acetone: olio d’oliva (4:1, v/v). Possono verificarsi occasioni in cui, con adeguata giustificazione, è possibile usare altre sostanze di controllo che rispondono ai criteri di cui sopra. 12. Se da un lato si raccomanda l’inclusione di un gruppo di controllo positivo, possono esservi situazioni in cui l’esame periodico (ossia a intervalli ≤ 6 mesi) della sostanza di controllo può essere appropriato nel caso di laboratori che effettuano l’LLNA: DA regolarmente (ossia con una frequenza non inferiore a una volta al mese) e che hanno a disposizione una banca dati con informazioni storiche consolidate sui controlli positivi, che dimostra la capacità del laboratorio di ottenere risultati accurati e riproducibili con le sostanze di controllo. Un’adeguata competenza nella conduzione dell’LLNA: DA può essere dimostrata senza difficoltà producendo risultati positivi coerenti con i controlli positivi in almeno 10 saggi indipendenti effettuati in un periodo di tempo ragionevole (ossia meno di un anno). 13. Un gruppo di controllo positivo parallelo deve essere incluso ogni volta che viene introdotta una modifica procedurale nell’LLNA: DA (ad esempio, una modifica del personale qualificato, dei materiali e/o dei reagenti usati per il metodo di prova, delle attrezzature impiegate per il metodo di prova, dell’origine degli animali sperimentali), e tali modifiche devono essere documentate nelle relazioni del laboratorio. Nel valutare la necessità di creare una nuova banca dati storica per documentare la coerenza dei risultati sui controlli positivi occorre prendere in considerazione le conseguenze che tali modifiche producono sull’adeguatezza della banca dati pregressa. 14. Gli esaminatori devono essere consapevoli del fatto che la decisione di condurre uno studio sui controlli positivi con cadenza periodica anziché in parallelo ha ripercussioni sull’adeguatezza e sull’accettabilità dei risultati negativi ottenuti senza un controllo positivo parallelo nell’intervallo compreso tra ciascuno studio periodico sul controllo positivo. Per esempio, se in uno studio periodico sui controlli positivi si ottiene un risultato falso negativo, i risultati negativi ottenuti sulle sostanze sperimentali nell’intervallo tra l’ultimo studio periodico accettabile e lo studio periodico sul controllo positivo ritenuto inaccettabile possono essere messi in dubbio. Le implicazioni di questi risultati devono essere considerate con estrema attenzione al momento di stabilire se includere controlli positivi paralleli o se condurre soltanto studi periodici sui controlli positivi. Si deve inoltre valutare la possibilità di utilizzare un numero di animali inferiore nel gruppo di controlli positivi paralleli, qualora ciò sia scientificamente giustificato e se il laboratorio dimostra, sulla scorta di dati storici specifici per il laboratorio, che è possibile ricorrere a un numero di topi inferiore (22). 15. Sebbene la sostanza di controllo positivo vada sottoposta a saggi nel veicolo che è noto per la sua capacità di provocare una risposta coerente (ad esempio, acetone: olio d’oliva; 4:1, v/v), è possibile che si verifichino alcune situazioni normative nelle quali sarà necessario eseguire il saggio anche in un veicolo non standard (formulazione clinicamente/chimicamente pertinente) (23). Se il controllo positivo parallelo è testato in un veicolo diverso rispetto alla sostanza in esame, si deve inserire per il controllo positivo parallelo un VC distinto. 16. Nei casi in cui si valutano sostanze sperimentali di una specifica classe chimica o nell’ambito di una specifica gamma di risposte, la presenza di sostanze di riferimento può essere utile anche per dimostrare che il metodo di prova funziona correttamente per rilevare il potenziale di irritazione cutanea di queste tipologie di sostanze. Le sostanze di riferimento appropriate devono avere le seguenti proprietà: — somiglianza strutturale e funzionale con la classe della sostanza in esame; — caratteristiche fisiche/chimiche note; — dati di supporto provenienti dall’LLNA: DA; — dati di supporto provenienti da altri modelli animali e/o dall’uomo. PROCEDURA DI PROVA Numero di animali e livelli di dose 17. Ogni gruppo di saggi comprende almeno quattro animali, sui quali si saggiano almeno tre concentrazioni della sostanza sperimentale, più un gruppo di controllo negativo parallelo trattato solo con il veicolo della sostanza sperimentale e un controllo positivo (parallelo o recente, secondo la politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-15). Si deve valutare l’opportunità di testare dosi multiple del controllo positivo, soprattutto se quest’ultimo è sottoposto ad esame con modalità intermittente. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali dei gruppi di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. 18. La selezione della dose e del veicolo è basata sulle raccomandazioni contenute nelle voci bibliografiche (2) e (24). Le dosi consecutive si selezionano normalmente da una concentrazione appropriata tra le seguenti: 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, 1 %, 0,5 % ecc. La selezione della concentrazione usata va accompagnata da adeguate motivazioni scientifiche. Ove disponibili, occorre tener conto dei dati tossicologici esistenti (ad esempio, tossicità acuta e irritazione cutanea) e delle informazioni strutturali e fisico-chimiche sulla sostanza sperimentale d’interesse (e/o sulle sostanze strutturalmente affini), nel selezionare le tre concentrazioni consecutive in modo che la concentrazione più elevata massimizzi l’esposizione, evitando al contempo la tossicità sistemica e/o l’eccessiva irritazione cutanea locale (24) (25). In assenza di tali informazioni può essere necessario effettuare un saggio iniziale preliminare (cfr. i punti 21-24). 19. Il veicolo non deve interferire o condizionare il risultato del saggio e va selezionato con l’obiettivo di massimizzare la solubilità per ottenere la concentrazione più elevata possibile, producendo al contempo una soluzione/sospensione adatta all’applicazione della sostanza di prova. I veicoli raccomandati sono acetone: olio d’oliva (4:1 v/v), N,N-dimetilformammide, metiletilcheton, glicole propilenico e dimetilsulfossido (6), ma è possibile utilizzarne anche altri, fornendo una sufficiente motivazione scientifica. In alcune situazioni può rendersi necessario l’uso di un solvente clinicamente pertinente o la formulazione nella quale la sostanza è posta in commercio, come controllo ulteriore. Occorre prestare particolare cura per assicurare che i materiali idrofili vengano incorporati in un sistema veicolare che inumidisce la pelle e non scorre via immediatamente, includendo solventi adeguati (ad esempio, 1 % Pluronic® L92). Vanno pertanto evitati i veicoli completamente acquosi. 20. L’elaborazione dei linfonodi da singoli topi consente di valutare la variabilità interanimale e permette di effettuare un confronto statistico della differenza tra le misurazioni raccolte con la sostanza sperimentale e quelle con il gruppo VC (cfr. il punto 33). Inoltre, è possibile valutare la possibilità di ridurre il numero di topi nel gruppo di controllo positivo soltanto quando si raccolgono risultati individuali per ciascun animale (22). Tra l’altro, alcune autorità di regolamentazione impongono l’obbligo di raccogliere risultati individuali per ciascun animale. La regolare raccolta di dati individuali per singolo animale offre il vantaggio, dal punto di vista del benessere degli animali, di evitare di replicare i test, il che sarebbe invece indispensabile se i risultati sulla sostanza sperimentale raccolti originariamente con una modalità (ad esempio, raccogliendo dati aggregati) fossero successivamente considerati dalle autorità di regolamentazione assieme ad altri requisiti (ad esempio, dati individuali). Saggio preliminare 21. In assenza di informazioni per determinare la dose più elevata da testare (cfr. il punto 18), è necessario eseguire un saggio preliminare, che consenta di definire il livello di doser appropriato per l’LLNA: DA. Scopo del saggio preliminare è fornire informazioni orientative per la selezione della dose massima di utilizzo nel principale studio LLNA: DA, nel caso in cui non siano disponibili informazioni sulla concentrazione che induce tossicità sistemica (cfr. il punto 24)/o eccessiva irritazione cutanea locale (cfr. il punto 23) La dose massima utilizzata nel saggio deve corrispondere al 100 % della sostanza sperimentale per i liquidi o la concentrazione massima possibile per i solidi o le sospensioni. 22. Il saggio preliminare è condotto in condizioni identiche allo studio LLNA: DA, con la differenza che la proliferazione dei linfonodi non è valutata e che può essere utilizzato un numero inferiore di animali per gruppi di saggi. Si suggerisce di ricorrere a uno o due animali per gruppo di saggi. Tutti i topi sono sottoposti quotidianamente a osservazioni per la ricerca di eventuali segni clinici di tossicità sistemica o irritazione locale nel sito di applicazione. Il peso è registrato prima del saggio e prima della sua conclusione (giorno 8). Entrambe le orecchie dei topi sono esaminate per individuare segni di eritema e l’esito dell’ispezione è registrato sulla scorta della tabella 1 (25). Lo spessore dell’orecchio si misura con un apposito misuratore (ad esempio, un micrometro digitale o un micrometro Peacock Dial) il giorno 1 (prima della somministrazione della dose), il giorno 3 (circa 48 ore dopo la prima somministrazione), il giorno 7 (24 ore prima della conclusione dello studio) e il giorno 8. Inoltre, il giorno 8 lo spessore dell’orecchio potrebbe essere calcolato misurando il peso di parti di orecchio prelevate con biopsia eseguita dopo la morte dell’animale per eutanasia. Un’irritazione cutanea eccessiva a livello locale è indicata da un punteggio ≥ 3 e/o da un aumento dello spessore dell’orecchio ≥ 25 % in un qualsiasi giorno di misurazione (26) (27). La dose più elevata selezionata per lo studio LLNA: DA principale sarà la dose immediatamente inferiore nella serie di concentrazioni utilizzate per il saggio preliminare (cfr. il punto 18) che non induce tossicità sistemica e/o irritazione cutanea eccessiva a livello locale. Tabella 1 Scala di valutazione dell’eritema Osservazioni Punteggio Nessun eritema 0 Eritema di lieve entità (appena visibile) 1 Eritema ben visibile 2 Eritema da moderato a grave 3 Eritema grave (rosso barbabietola) con formazione di escare che impedisce di valutare l’entità della lesione 4 23. Oltre all’aumento del 25 % dello spessore dell’orecchio (26) (27), per individuare le sostanze irritanti nell’LLNA è stato anche utilizzato un aumento statisticamente significativo dello spessore dell’orecchio nei topi trattati rispetto ai controlli (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tuttavia, se è vero che possono verificarsi aumenti statisticamente significativi dello spessore dell’orecchio, altrettanto certo è che quando sono inferiori al 25 % non sono stati associati, nello specifico, a un’eccessiva irritazione (30) (31) (32) (33) (34). 24. Le seguenti osservazioni cliniche possono indicare tossicità sistemica (35) se usate nell’ambito di una valutazione integrata e, pertanto, possono suggerire la dose massima da utilizzare nell’LLNA: DA principale: alterazioni della funzione del sistema nervoso (ad esempio, piloerezione, atassia, tremori e convulsioni); variazioni del comportamento (ad esempio, aggressività, cambiamenti delle attività di toelettatura, marcato cambiamento nel livello di attività); variazioni dei pattern respiratori (ossia variazioni della frequenza e dell’intensità della respirazione come dispnea, boccheggiamento e rantoli) e variazioni nel consumo di cibo e acqua. Inoltre, nella valutazione vanno presi in considerazione segni di letargia e/o assenza di reattività e qualsiasi altro segno di sofferenza e dolore fisico non lieve o momentaneo, o una riduzione ponderale > 5 % dal giorno 1 al giorno 8, oltre che la mortalità. Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia (36). Protocollo sperimentale dello studio principale 25. Il protocollo sperimentale del saggio è il seguente: — Giorno 1: Identificare e registrare il peso di ciascun animale singolarmente e riportare eventuali elementi emersi dall’osservazione clinica. Applicare una soluzione acquosa all’1 % di laurilsolfato di sodio (SLS) sulla parte posteriore di entrambe le orecchie utilizzando un pennello intinto nella soluzione SLS per coprire la parte di orecchio interessata con quattro-cinque pennellate. Un’ora dopo il trattamento con SLS, applicare 25 μL della diluizione appropriata della sostanza sperimentale, del solo veicolo o del controllo positivo (parallelo o recente, a seconda della politica di laboratorio adottata in considerazione dei punti 11-15), sulla parte posteriore di entrambe le orecchie. — Giorni 2, 3 e 7: Ripetere il trattamento con soluzione acquosa all’1 % di SLS e la procedura di applicazione eseguita il giorno 1. — Giorni 4, 5 e 6: Nessun trattamento. — Giorno 8: Registrare il peso di ciascun animale ed eventuali elementi emersi dall’osservazione clinica. Circa 24-30 ore dopo l’inizio dell’applicazione il giorno 7, sottoporre gli animali a eutanasia. Asportare i linfonodi auricolari drenanti di entrambe le orecchie e porli in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per ciascun animale separatamente. I particolari e i diagrammi relativi all’identificazione e alla dissezione dei linfonodi si trovano nella bibliografia (22). Per un ulteriore controllo della risposta cutanea locale nello studio principale possono essere inclusi nel protocollo altri parametri come il punteggio relativo all’eritema o le misurazioni dello spessore dell’orecchio (ottenute utilizzando un micrometro o mediante ear punch weight determinations all’autopsia. Preparazione delle sospensioni cellulari 26. Da ciascun topo si prepara una singola sospensione di cellule linfonodali asportate bilateralmente inserendo i linfonodi tra due vetrini ed esercitando una leggera pressione per schiacciare i linfonodi. Dopo essersi accertati di aver ottenuto un sottile strato di tessuto, aprire i vetrini. Porre il tessuto rimasto sui due vetrini in sospensione in una soluzione salina tampone fosfato (PBS): reggere un angolo di ciascun vetrino sopra la piastra di Petri e sciacquare con la soluzione, raschiando il tessuto dal vetrino con apposito raschietto. Poiché i linfonodi dei controlli negativi sono piccoli, è importante effettuare queste operazioni con attenzione per evitare di provocare effetti artificiali sui valori dell’indice di stimolazione. Per sciacquare i due vetrini è necessario un volume complessivo di soluzione PBS pari a 1 mL. La sospensione di linfonodi nella piastra di Petri dev’essere delicatamente omogeneizzata con il raschietto. Raccogliere 20 μL della sospensione con una micropipetta, facendo attenzione a non prelevare la membrana visibile a occhio nudo, e successivamente miscelare il tessuto prelevato con 1,98 mL di soluzione PBS fino a ottenere un campione di 2 mL. Preparare un secondo campione di 2 mL seguendo la medesima procedura, in modo da predisporre due campioni per ciascun animale. Determinazione della proliferazione delle cellule (misurazione del contenuto di ATP nei linfociti) 27. Gli aumenti del contenuto di ATP nei linfonodi si misurano con il metodo luciferina/luciferasi avvalendosi di un kit ATP, che misura la bioluminescenza nelle unità di luminescenza relative (RLU). La durata del saggio, dal momento della soppressione dell’animale alla misurazione del contenuto di ATP per ciascun animale, dev’essere mantenuta uniforme, entro un arco temporale di circa 30 minuti, poiché si ritiene che il contenuto di ATP diminuisca gradualmente nel tempo dopo la morte dell’animale (12). Pertanto, la serie di procedure compresa tra l’escissione dei linfonodi auricolari e la misurazione degli ATP dev’essere ultimata entro 20 minuti, secondo il calendario prefissato che è lo stesso per ciascun animale. La luminescenza ATP si misura in ciascun campione di 2 mL in modo da raccogliere per ogni animale un totale di due misure ATP. In questo modo si determina la luminescenza ATP media, che verrà usata per i successivi calcoli (cfr. il punto 30). OSSERVAZIONI Osservazioni cliniche 28. Ogni topo va osservato attentamente almeno una volta al giorno per individuare eventuali segni clinici di irritazione locale nel punto di applicazione o di tossicità sistemica. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematicamente e riportate singolarmente per ciascun topo. I piani di controllo devono includere criteri per individuare prontamente gli esemplari che esibiscono tossicità sistemica, eccessiva irritazione cutanea a livello locale o corrosione cutanea per eutanasia (36). Peso corporeo 29. Come illustrato al punto 25, all’inizio del saggio e al momento della soppressione programmata degli animali per eutanasia occorre individuare il peso dei singoli esemplari. CALCOLO DEI RISULTATI 30. I risultati vengono espressi, per ciascun gruppo di trattamento, mediante l’indice di stimolazione (SI) medio. L’indice di stimolazione si ottiene dividendo i valori medi dell’RLU per topo calcolati per ogni gruppo di trattamento, compreso il controllo positivo, per la media dell’RLU per topo per il gruppo di controllo trattato con veicolo/solvente. Quindi l’SI medio per i controlli trattati con veicolo è uno. 31. Il processo decisionale rispetto a una risposta positiva prevede un indice di stimolazione SI ≥ 1,8 (10). Tuttavia, per determinare se un risultato borderline (ossia un valore SI compreso tra 1,8 e 2,5) è dichiarato positivo (2) (3) (37), possono anche essere utilizzati la potenza del rapporto dose-risposta, la significatività statistica e la coerenza del solvente/veicolo oltre che le risposte dei controlli positivi. 32. Nel caso di una risposta positiva borderline con un valore SI compreso tra 1,8 e 2,5, per confermare che tali risultati sono positivi gli utilizzatori potrebbero voler prendere in considerazione informazioni aggiuntive come il rapporto dose-risposta, le prove di tossicità sistemica o irritazione eccessiva e, se del caso, la significatività statistica oltre che i valori SI (10). Inoltre, è necessario tener conto di diverse proprietà della sostanza sperimentale, in particolare se ha un rapporto strutturale con noti sensibilizzanti cutanei, se causa eccessiva irritazione cutanea nel topo, nonché la natura del rapporto dose-risposta rilevato. Queste e altre considerazioni sono illustrate in dettaglio in altra sede (4). 33. La raccolta di dati a livello di singolo animale consentirà di eseguire un’analisi statistica della presenza e del grado di rapporto dose-risposta nei dati. Una qualsiasi analisi statistica potrebbe comprendere una valutazione del rapporto dose-risposta oltre che confronti debitamente aggiustati di gruppi sperimentali (ad esempio, confronti parallelizzati tra gruppo dosato e gruppo trattato con veicolo/solvente parallelo). Le analisi statistiche possono includere, ad esempio, la regressione lineare o il test di William per valutare l’andamento della dose-risposta, e il test di Dunnett per confronti parallelizzati. Nella scelta di un metodo adeguato di analisi statistica, lo sperimentatore deve essere consapevole di possibili ineguaglianze delle varianze e di altri problemi correlati che possono richiedere una trasformazione dei dati o un’analisi statistica non parametrica. In ogni caso lo sperimentatore potrebbe dover calcolare l’SI e svolgere analisi statistiche con e senza determinati punti (talvolta denominati “aberranti”). DATI E RELAZIONE Dati 34. I dati vanno riassunti sotto forma di tabella, evidenziando i valori RLU medi individuali, il valore RLU medio per ciascun animale, il termine di errore associato (ad esempio, SD, SEM) e l’indice di stimolazione medio per ciascun g