10)

sono aggiunti i capitoli C.27, C.28, C.29 e C.30: «C.27. PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDE IN ACQUA-SEDIMENTO CON SEDIMENTO ADDIZIONATO INTRODUZIONE 1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 218 (2004) ed è inteso a valutare gli effetti di un’esposizione prolungata a sostanze chimiche su larve di Chironomus sp., un dittero che vive nei sedimenti di acqua dolce. Tiene conto anche dei protocolli per le prove di tossicità su Chironomus riparius e Chironomus tentans messi a punto in Europa (1) (2) (3) e in Nord America (4) (5) (6) (7) (8) e sottoposti a prove interlaboratorio (1) (6) (9). È possibile utilizzare anche altre specie ben documentate, ad esempio Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Questo metodo prevede che l’esposizione alla sostanza in esame avvenga a mezzo di sedimenti addizionati. La scelta dello scenario d’esposizione dipende dalla finalità della prova. Lo scenario che consiste nell’addizionare i sedimenti con la sostanza in esame è inteso a simulare il persistere di livelli cumulativi della sostanza. In questo sistema sperimentale sedimento-acqua è il sedimento ad essere addizionato. 3. In genere le sostanze da saggiare su organismi che vivono nei sedimenti persistono a lungo in questo comparto. Questi organismi possono essere esposti per diverse vie. L’importanza relativa di ogni via d’esposizione e il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all’effetto tossico globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame. Per le sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) oppure per le sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, l’ingestione di alimenti contaminati può costituire una via d’esposizione importante. Per non sottovalutare la tossicità delle sostanze altamente lipofile, si può considerare l’opportunità di aggiungere alimenti al sedimento prima di applicare la sostanza in esame. Il presente metodo, per tenere conto di tutte le possibili vie di esposizione, prevede un’esposizione a lungo termine: la prova dura da 20 a 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e da 28 a 65 giorni per C. tentans. Se occorrono dati a breve termine per un fine specifico, ad esempio studiare gli effetti di una sostanza chimica instabile, è possibile ritirare dopo dieci giorni di prova le repliche supplementari allestite nell’ambito dello stesso impianto sperimentale. 4. Gli endpoint misurati sono il numero totale di adulti comparsi e il tempo intercorso fino alla loro comparsa. Se occorrono dati a breve termine, si consiglia di effettuare dopo dieci giorni le misurazioni relative alla sopravvivenza e alla crescita delle larve, utilizzando le eventuali repliche supplementari. 5. Si raccomanda di usare un sedimento artificiale, che presenta numerosi vantaggi rispetto a quello naturale: — riduce la variabilità sperimentale in quanto costituisce una “matrice standardizzata” riproducibile, ed elimina la necessità di trovare delle fonti di sedimenti pulite e incontaminate, — consente di effettuare le prove in qualsiasi momento dell’anno, senza che occorra tenere conto della variabilità stagionale dei sedimenti, e non richiede di essere trattato prima delle prove per eliminare la fauna indigena; riduce inoltre i costi associati alla raccolta sul terreno di quantità sufficienti di sedimento per le prove di routine, — è possibile mettere a confronto e classificare le sostanze in base alla loro tossicità. 6. L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo. PRINCIPIO DELLA PROVA 7. Si espongono dei chironomidi al primo stadio larvale a un intervallo di concentrazioni della sostanza in esame in un sistema sedimento-acqua. La sostanza in esame è aggiunta al sedimento e le larve al primo stadio vengo in seguito introdotte nei becher dove le concentrazioni sedimento-acqua sono state stabilizzate. Le percentuali di emergenza e crescita dei chironomidi sono misurate alla fine della prova. La sopravvivenza e il peso delle larve possono essere misurati anche dopo 10 giorni, se necessario (utilizzando le eventuali repliche supplementari). Questi dati sono analizzati tramite un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x dell’emergenza, della sopravvivenza o della crescita delle larve (ad esempio CE15, CE50 ecc.), oppure mediante verifica di un’ipotesi statistica per determinare un valore NOEC/LOEC. Nel secondo caso occorre confrontare i valori degli effetti con i valori di controllo per mezzo di prove statistiche. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME 8. È necessario conoscere l’idrosolubilità e la tensione di vapore della sostanza in esame, il coefficiente di ripartizione misurato o calcolato nel sedimento e la sua stabilità nell’acqua e nel sedimento. Occorre inoltre disporre di un metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, di cui devono essere noti e riportati nella relazione l’accuratezza e il limite di rivelabilità. È anche utile conoscere la formula strutturale e la purezza della sostanza in esame, come pure il suo destino chimico (ad esempio, dissipazione, degradazione abiotica e biotica ecc.). Ulteriori orientamenti per saggiare le sostanze con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa l’esecuzione delle prove sono contenuti in (12). SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO 9. Per assicurarsi che il protocollo e le condizioni di prova siano affidabili si possono saggiare regolarmente delle sostanze di riferimento. Tra i tossici di riferimento utilizzati con successo in prove interlaboratorio e studi di validazione vi sono: lindano, trifluralin, pentaclorofenolo, cloruro di cadmio e cloruro di potassio (1) (2) (5) (6) (13). VALIDITÀ DELLA PROVA 10. Perché il test sia valido devono realizzarsi le seguenti condizioni: — l’emergenza nei controlli deve arrivare almeno al 70 % alla fine del test (1) (6), — per quanto riguarda C. riparius e C. yoshimatsui, l’emergenza allo stadio adulto nei recipienti di controllo deve avvenire tra i 12 e i 23 giorni successivi alla loro introduzione nei recipienti; per C. tentans il periodo va da 20 a 65 giorni, — alla fine della prova, si devono misurare il pH e la concentrazione dell’ossigeno disciolto in ogni recipiente. La concentrazione dell’ossigeno deve essere almeno il 60 % del suo valore di saturazione in aria (ASV) alla temperatura applicata e il pH dell’acqua sovrastante deve essere compreso tra 6 e 9 in tutti i recipienti di prova, — la temperatura dell’acqua non deve variare di oltre ± 1.0 °C e può essere regolata per mezzo di un camera isotermica, nel qual caso la temperatura ambiente dovrà essere periodicamente confermata, a congrui intervalli di tempo. DESCRIZIONE DEL METODO Recipienti di prova 11. Lo studio è condotto in becher di vetro da 600 ml, di 8 cm di diametro. Possono essere utilizzati anche altri recipienti, purché garantiscano profondità sufficiente ad accogliere il sedimento e l’acqua sovrastante. La superficie del sedimento deve essere tale da offrire uno spazio da 2 a 3 cm2 per larva. La profondità dello strato sedimentario e la profondità dell’acqua sovrastante devono essere in un rapporto di 1:4. I recipienti e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con il sistema di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte (ad esempio Teflon). Selezione delle specie 12. La specie che conviene utilizzare per la prova è Chironomus riparius. Si può utilizzare anche Chironomus tentans, anche se è più difficile da manipolare e richiede un periodo di prova più lungo. Si può utilizzare anche Chironomus yoshimatsui. Metodi di coltura di Chironomus riparius figurano nell’appendice 2. Sono reperibili informazioni anche sulle condizioni di coltura delle altre specie: Chironomus tentans (4) e Chironomus yoshimatsui (11). Occorre identificare la specie prima dell’avvio della sperimentazione, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati coltivati dal laboratorio che esegue la sperimentazione. Sedimento 13. Utilizzare di preferenza sedimento artificiale (detto anche sedimento formulato). Se si sceglie di utilizzare un sedimento naturale, occorre caratterizzarlo, almeno quanto a pH e tenore di carbonio organico (la determinazione di altri parametri, come il rapporto C/N e la granulometria è altrettanto raccomandata), e assicurarsi che sia esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in competizione con i chironomidi o consumarli. Prima di impiegare un sedimento naturale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia inoltre di farlo riposare per sette giorni alle stesse condizioni in cui verrà realizzata la prova. Per questo test si consiglia di utilizzare il sedimento artificiale basato su quello di cui al metodo di prova C.8 (14) e costituito secondo la seguente formula (1) (15) (16): a) 4-5 % (peso secco) di torba, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0. È importante utilizzare torba sotto forma di polvere, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata unicamente all’aria; b) 20 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %); c) 75-76 % (peso secco) di sabbia quarzosa (composta in prevalenza da sabbia fine, con oltre il 50 % delle particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 μm); d) aggiunta di acqua deionizzata fino ad ottenere un tenore di umidità totale della miscela compreso tra 30 e 50 %; e) aggiunta di carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO3) per aggiustare il pH della miscela finale a 7,0 ± 0,5. Il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % (± 0,5 %), ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, come indicato in a) e c). 14. La provenienza di torba, argilla caolinica e sabbia deve essere nota. Occorre verificare che i componenti del sedimento non siano contaminati da sostanze chimiche (es.: metalli pesanti, composti organoclorurati o organo fosforati ecc.). L’appendice 3 contiene un esempio per la preparazione del sedimento artificiale. È possibile mescolare componenti secchi, se si può dimostrare che con l’aggiunta di acqua sovrastante non si verifica alcuna separazione dei componenti del sedimento (es. particelle di torba che galleggiano) e che la torba o il sedimento sono sufficientemente condizionati. Acqua 15. Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate alle appendici 2 e 4 sono considerate adatte per le prove. È possibile utilizzare come acqua di allevamento e acqua di prova ogni tipo di acqua idonea, quali acqua naturale (di superficie o freatica), ricostituita (cfr. appendice 2) o di rubinetto non clorata, se i chironomidi riescono a sopravvivervi per la durata della coltura e della prova senza manifestare segni di stress. All’inizio della prova, il pH dell’acqua di prova dev’essere compreso tra 6 e 9 e la durezza totale non dev’essere superiore a 400 mg/l (come CaCO3). Utilizzare, però, un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt M4 non può essere usato). Utilizzare lo stesso tipo di acqua nel corso di tutta la prova. Misurare le caratteristiche della qualità dell’acqua elencate nell’appendice 4 almeno due volte l’anno o quando si sospetta che possano essere cambiate significativamente. Soluzioni madre — sedimenti addizionati 16. I sedimenti addizionati — alla concentrazione desiderata — vengono generalmente preparati aggiungendo una soluzione della sostanza in esame direttamente al sedimento. La soluzione madre della sostanza in esame dissolta in acqua deionizzata viene mescolata con il sedimento artificiale ricorrendo a un laminatoio, a un miscelatore per mangimi oppure a mano. Se scarsamente solubile in acqua, la sostanza in esame può essere disciolta nel minor volume possibile di un solvente organico idoneo (per esempio esano, acetone, cloroformio). La soluzione ottenuta va poi mischiata con 10 g di sabbia quarzosa fine per ciascun recipiente di prova. Il solvente va lasciato evaporare e deve essere completamente eliminato dalla sabbia; la sabbia va poi mescolata alla quantità di sedimento necessaria per un becher. Per solubilizzare, disperdere o emulsionare la sostanza in esame, si possono impiegare soltanto agenti che volatilizzano rapidamente. Occorre tener conto, al momento di preparare il sedimento, della sabbia contenuta nella sostanza in esame e nella miscela di sabbia (il sedimento, quindi, va preparato utilizzando meno sabbia). Fare attenzione a che la sostanza in esame aggiunta al sedimento sia perfettamente e omogeneamente distribuita al suo interno. Se necessario, analizzare dei sottocampioni per verificare il grado di omogeneità. DISEGNO SPERIMENTALE 17. Il disegno comprende la selezione del numero delle concentrazioni di prova, e dell’intervallo fra esse, del numero di recipienti per ciascun livello di concentrazione e del numero di larve per recipiente. È qui descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della CE, la stima della NOEC e per l’esecuzione di una prova limite. Disegno per l’analisi di regressione 18. La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE15, CE50) e l’intervallo di concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un effetto interessante devono essere contemplati dalle concentrazioni incluse nella prova. In genere la precisione e, in particolare, la validità della stima delle concentrazioni con effetto (CEX) saranno maggiori quando la concentrazione con effetto rientra nell’intervallo di concentrazioni da testare. Bisogna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione efficace più debole o al di sopra della concentrazione massima. È utile condurre una prova preliminare di determinazione dell’intervallo di concentrazioni per delimitare le concentrazioni su cui imperniare la prova (cfr. paragrafo 27). 19. Se si deve stimare la CEX occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, allestendo tre repliche per ciascuna concentrazione. In ogni caso, per ottenere una buona stima del modello, è consigliabile utilizzare un numero sufficiente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva dose/risposta sia poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito se si aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte diverse. L’aumento del numero di repliche o la riduzione degli intervalli tra le concentrazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova. Il numero delle repliche sarà maggiore se si deve stimare la percentuale di sopravvivenza e la crescita delle larve dopo 10 giorni. Disegno per la stima di una NOEC/LOEC 20. Se occorre stimare la LOEC o la NOEC si saggeranno cinque concentrazioni con almeno quattro repliche, e il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere superiore a due. Il numero di repliche deve essere tale da garantire una potenza statistica che consenta di rilevare una differenza del 20 % con l’unità di controllo, a un grado di significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto riguarda la velocità di sviluppo, è in genere appropriata un’analisi della varianza (ANOVA), come ad esempio il test di Dunnett o il test di Williams (17) (18) (19) (20). Per il tasso di emergenza si può utilizzare il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione secondo Bonferroni) o il test di Mantel-Haenszel. Prova limite 21. Se la prova preliminare di determinazione dell’intervallo delle concentrazioni non ha prodotto alcun effetto, si può condurre una prova limite (una concentrazione di prova e un controllo). Lo scopo della prova limite è quello di condurre un test con una concentrazione sufficientemente alta da consentire ai responsabili delle decisioni di escludere eventuali effetti tossici della sostanza in esame; il limite va fissato a una concentrazione la cui comparsa è improbabile in tutte le situazioni. Si raccomanda un rapporto di 1 000 mg/kg (peso secco). Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli organismi trattati che per quelli di controllo. Occorre dimostrare che la potenza statistica è sufficiente per rilevare una differenza del 20 % con gli organismi di controllo, a un grado di significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto concerne la risposta in termini di velocità di sviluppo e peso, il test t costituisce un metodo statistico adatto se i dati rispettano le condizioni imposte da questo test (normalità, varianze omogenee). In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey. Quanto al tasso di emergenza, il test esatto di Fisher è appropriato. PROCEDURA Condizioni di esposizione Preparazione del sistema sedimento addizionato-acqua 22. Per l’applicazione della sostanza in esame (14), si raccomanda l’uso del processo di addizione descritto nel metodo di prova C.8: Tossicità per i lombrichi. I sedimenti addizionati vengono posti nei recipienti e viene aggiunta acqua sovrastante per produrre un rapporto volumetrico sedimento-acqua di 1:4 (cfr. paragrafi 11 e 15). La profondità dello strato sedimentario dev’essere tra 1,5 e 3 cm. Per evitare la separazione degli ingredienti del sedimento e la risospensione delle particelle fini durante l’aggiunta dell’acqua, si può ricoprire il sedimento con un disco di plastica durante l’operazione di riempimento della colonna d’acqua, per poi ritirarlo a operazione completata. Possono essere utilizzati anche altri dispositivi. 23. I recipienti così allestiti devono essere coperti (ad esempio, da piastre di vetro). Nel corso della prova si provvederà, se necessario, ad aggiungere l’acqua necessaria a mantenere il volume originario per compensare l’evaporazione, avendo cura di utilizzare acqua distillata o deionizzata per evitare l’accumulo di sali. Stabilizzazione 24. Una volta che il sedimento addizionato sovrastato da uno strato d’acqua è stato preparato, è preferibile lasciare che la sostanza in esame si ripartisca tra la fase acquosa e il sedimento (3) (4) (6) (13); di preferenza, ciò dovrebbe avvenire nelle stesse condizioni di temperatura e aerazione utilizzate nella prova. Il tempo di equilibratura può durare alcune ore, dei giorni o, in rari casi, fino a 4 o 5 settimane, a seconda del sedimento e della sostanza chimica. Non occorre attendere il raggiungimento dell’equilibrio, perché molte sostanze rischiano di degradarsi nel corso di questo periodo, ma è raccomandato un tempo di attesa di 48 ore. Al termine di questo periodo di equilibratura, occorre misurare la concentrazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, almeno alla concentrazione massima e a una più bassa (cfr. paragrafo 38). Tali misurazioni analitiche della sostanza in esame consentono di calcolare il bilancio di massa e di esprimere i risultati in funzione delle concentrazioni misurate. Introduzione degli organismi di prova 25. Quattro o cinque giorni prima di introdurre gli organismi nei recipienti, si prelevano dalle colture ammassi di uova e le si depositano in recipienti piccoli con il mezzo di coltura. Si può utilizzare il mezzo vecchio prelevato dalla coltura madre o un mezzo fresco. In quest’ultimo caso, si aggiunge una piccola quantità di cibo, ad esempio alghe verdi e/o qualche goccia di filtrato di una sospensione di mangime per pesci in fiocchi (cfr. appendice 2). Si devono utilizzare solo ammassi di uova appena deposti. Di solito le larve compaiono qualche giorno dopo la deposizione delle uova (da 2 a 3 giorni per Chironomus riparius a 20 oC e da 1 a 4 giorni per Chironomus tentans a 23 oC e Chironomus yoshimatsui a 25 oC) e la loro crescita avviene in quattro stadi, ciascuno di una durata compresa tra 4 e 8 giorni. Questa prova si applica al primo stadio larvale (2-3 oppure 1-4 giorni dopo la schiusa). È possibile verificare lo stadio di sviluppo dei moscerini in base alle dimensioni della capsula cefalica (6). 26. In ciascun recipiente contenente il sedimento addizionato e l’acqua si depositano, per mezzo di una pipetta smussata, venti larve al primo stadio scelte a caso. L’aerazione dell’acqua deve essere interrotta per 24 ore dal momento dell’introduzione delle larve nei recipienti (cfr. paragrafi 24 e 32). In base al disegno sperimentale adottato (cfr. paragrafi 19 e 20), il numero di larve utilizzate per concentrazione è almeno 60 per la stima puntuale della CE e 80 per la determinazione della NOEC. Concentrazioni di prova 27. Può essere utile effettuare una prova preliminare per determinare la gamma delle concentrazioni per la prova vera e propria. A tal fine si utilizza una serie di concentrazioni della sostanza in esame molto intervallate tra loro. Applicando la stessa densità superficiale di chironomidi prevista per la prova vera e propria, i chironomidi sono esposti ad ogni concentrazione della sostanza in esame per un periodo che consenta di stimare le concentrazioni di prova adeguate e non è necessaria alcuna replica. 28. Le concentrazioni di prova per la prova vera e propria sono decise in funzione dell’esito del saggio di determinazione dell’intervallo di concentrazione. Occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, scelte in base a quanto indicato nei paragrafi 18-20. Controlli 29. La prova prevede l’allestimento di recipienti di controllo, senza la sostanza in esame ma con il sedimento, e un congruo numero di repliche (cfr. paragrafi 19-20). Se la sostanza in esame è stata applicata mediante un solvente (cfr. paragrafo 16), si deve aggiungere un recipiente di controllo che contenga sedimento e solvente. Sistema di prova 30. Si impiegano sistemi statici. I sistemi semistatici oppure a flusso, con rinnovo intermittente o continuo dell’acqua sovrastante, possono essere utilizzati in casi eccezionali, ad esempio se le specifiche della qualità dell’acqua diventano inadeguate per gli organismi in esame oppure influiscono sull’equilibrio chimico (nel caso in cui, ad esempio, i livelli di ossigeno disciolto si abbassino troppo, la concentrazione degli escreti aumenti eccessivamente o i minerali prodotti dalla lisciviazione del sedimento alterino il pH e/o la durezza dell’acqua). È tuttavia sufficiente e preferibile ricorrere ad altri metodi di miglioramento della qualità dell’acqua sovrastante, come l’areazione. Cibo 31. Le larve devono essere nutrite, di preferenza ogni giorno o almeno tre volte la settimana. Durante i primi 10 giorni la dieta giornaliera ritenuta adeguata per le larve in questo stadio consiste in 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg per C. yoshimatsui) pro capite di mangime per pesci (sospensione acquosa o finemente macinato, del tipo Tetra-Min o Tetra-Phyll; cfr. appendice 2). Può essere necessario aumentare leggermente la dose per le larve più vecchie: 0,5-1 mg per larva al giorno dovrebbe essere sufficiente per il resto della prova. Si diminuirà la razione di mangime di tutti gli organismi trattati e dei controlli se si osserva la comparsa di funghi o il decesso di organismi di controllo. Se non si riesce ad arrestare lo sviluppo fungino occorre ripetere la prova. Se la prova verte su sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) o sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza e alla crescita naturale degli organismi può essere incorporata al sedimento artificiale prima del periodo di stabilizzazione. In tal caso il mangime per pesci è sostituito con alimenti vegetali, ad esempio 0,5 % (peso secco) di foglie finemente macinate di ortica (Urtica dioica), gelso (Morus alba), trifoglio bianco (Trifolium repens), spinacio (Spinacia oleracea) o di altro materiale vegetale (Cerophyl o alfa cellulosa). Condizioni di incubazione 32. L’acqua sovrastante dei recipienti è sottoposta a una moderata aerazione, di preferenza a partire da 24 ore dopo l’introduzione delle larve e fino alla fine della prova (avendo cura che la concentrazione di ossigeno disciolto non scenda sotto il 60 % del valore di saturazione dell’aria). L’aria è insufflata tramite pipette Pasteur in vetro fissate a 2-3 cm sopra lo strato di sedimento (nella misura di una o poche bolle al secondo). Se la sostanza in esame è volatile, va eventualmente considerato di sopprimere l’aerazione. 33. La prova è effettuata a una temperatura costante di 20 °C (± 2 °C). Per C. tentans e C. yoshimatsui la temperatura consigliata è, rispettivamente, di 23 °C e 25 °C (± 2 °C). Il fotoperiodo è di 16 ore e l’intensità luminosa compresa tra 500 e 1 000 lux. Durata dell’esposizione 34. L’esposizione ha inizio con l’introduzione delle larve nei recipienti trattati e di controllo. La prova dura 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e 65 giorni per C. tentans. Se i moscerini emergono prima, la prova può concludersi dopo almeno cinque giorni dall’emergenza dell’ultimo adulto di controllo. Osservazioni Emergenza 35. Si deve determinare il tempo di sviluppo e il numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate. 36. I recipienti vanno osservati almeno tre volte la settimana, per verificare che non presentino attività anomala (abbandono del sedimento, movimenti natatori insoliti ecc.) rispetto a quelli di controllo. Durante il periodo della prevista emergenza è necessario contare tutti i giorni i moscerini emersi e registrare il sesso e il numero di quelli completamente emersi. Una volta identificati, i moscerini sono tolti dai recipienti. Ogni ammasso di uova deposto prima della fine della prova deve essere registrato e poi tolto per impedire l’introduzione di nuove larve nel sedimento. Va registrato anche il numero delle pupe visibili che non sono riuscite ad emergere. L’appendice 5 contiene indicazioni su come misurare l’emergenza. Crescita e sopravvivenza 37. Se occorre rilevare i dati sulla sopravvivenza e la crescita della larve dopo 10 giorni, si allestiscono recipienti supplementari all’inizio della prova da usare successivamente. Il sedimento di questi recipienti supplementari è setacciato con un setaccio da 250 μm per trattenere le larve. La morte è determinata da due criteri: l’immobilità o l’assenza di reazione a uno stimolo meccanico. Anche le larve non recuperate devono essere contate tra i decessi (è possibile che le larve morte all’inizio della prova siano state degradate da microbi). Dopo avere determinato il peso secco (senza ceneri) delle larve sopravvissute per ogni recipiente, si calcola il peso secco individuale medio per recipiente. Per determinare a quale stadio si trovano le larve sopravvissute si possono misurare le dimensioni della capsula cefalica di ogni individuo. Misurazioni analitiche Concentrazione della sostanza in esame 38. Prima di iniziare la prova (cioè prima di introdurre le larve), occorre prelevare campioni di sedimento da almeno uno dei recipienti per ciascun trattamento, per determinare analiticamente la concentrazione nel sedimento della sostanza in esame. Occorre analizzare, come minimo, dei campioni dell’acqua sopranatante, dell’acqua interstiziale e del sedimento all’inizio della prova (cfr. paragrafo 24) e alla fine, e ciò per la concentrazione massima e per una più bassa. La concentrazione della sostanza in esame ci informa sul comportamento/ripartizione della sostanza nel sistema acqua-sedimento. 39. Quando si effettuano misurazioni intermedie (ad esempio, al settimo giorno) e se l’analisi richiede campioni voluminosi che non possono essere prelevati dai recipienti senza influire sull’impianto sperimentale, le determinazioni analitiche sono praticate su campioni prelevati da recipienti supplementari trattati allo stesso modo (anche contenenti organismi di prova) ma non utilizzati per le osservazioni biologiche. 40. Per isolare l’acqua interstiziale si raccomanda di centrifugare i campioni, ad esempio, a 10 000 g e a 4oC per 30 minuti. Se però è dimostrato che la sostanza in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione. In alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile analizzare le concentrazioni nell’acqua interstiziale. Parametri fisici e chimici 41. Il pH e la temperatura dei recipienti devono essere debitamente misurati (cfr. paragrafo 10). All’inizio e alla fine della prova è necessario misurare la durezza dell’acqua e il tenore di ammoniaca nei controlli e in un recipiente trattato alla concentrazione massima. DATI E RELAZIONE Trattamento dei risultati 42. Scopo di questa prova è determinare l’effetto della sostanza in esame sulla velocità di sviluppo e sul numero totale di moscerini moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi oppure, nel caso della prova a 10 giorni, gli effetti sulla sopravvivenza e sul peso delle larve. Se nulla indica che i due sessi presentano differenze statistiche di sensibilità, ai fini dell’analisi statistica i risultati ottenuti sui maschi e sulle femmine possono essere raggruppati. Le differenze di sensibilità tra i sessi possono essere valutate statisticamente tramite, ad esempio, il test χ2-r x 2. La sopravvivenza delle larve e il peso secco individuale medio per recipiente devono essere determinati dopo 10 giorni, se del caso. 43. Le concentrazioni con effetto espresse (basate sul peso secco), sono calcolate di preferenza sulla base delle concentrazioni dei sedimenti misurate all’inizio della prova (cfr. paragrafo 38). 44. Per effettuare una stima puntuale della CE50 o di qualsiasi altra CEX, le statistiche per recipiente possono essere usate alla stregua di repliche. Quando si calcola un intervallo di confidenza per una qualsiasi CEX occorre tener conto della variabilità tra i recipienti oppure dimostrare che tale variabilità è di entità trascurabile. Quando il modello è adattato mediante il metodo dei minimi quadrati, è necessario trasformare le statistiche per recipiente al fine di aumentare l’omogeneità della varianza. I valori della CEX devono però essere calcolati dopo che il risultato è stato ritrasformato nel suo valore originario. 45. Se l’analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC mediante verifica di un’ipotesi, la variabilità tra i recipienti deve essere presa in considerazione, ad esempio mediante un’analisi ANOVA gerarchica. In situazioni dove non sussistono tutti i consueti presupposti per l’ANOVA si possono invece utilizzare test più robusti (21). Tasso di emergenza 46. I tassi di emergenza sono dati di tipo quantale e possono essere analizzati con il test di Cochran-Armitage applicato in modo regressivo se si ipotizza un rapporto dose-risposta monotonico e i tassi di emergenza corroborano questa ipotesi. In caso contrario, si può utilizzare un test esatto di Fisher o un test di Mantel-Haenszel con correzione dei valori p secondo Bonferroni-Holm. Se si osserva che la variabilità tra le repliche alla stessa concentrazione è maggiore di quanto una distribuzione binomiale indicherebbe (variazione spesso denominata “extrabinomiale”), si applicherà un test più robusto (Cochran-Armitage o Fisher esatto) come proposto alla nota (21). Si determina la somma dei moscerini emersi per recipiente (ne) e la si divide per il numero di larve introdotte (na): dove: ER = tasso di emergenza ne = numero di moscerini emersi per recipiente na = numero di larve introdotte per recipiente 47. Un’alternativa più adatta ai campioni di grandi dimensioni, in presenza di varianza extrabinomiale, consiste nel trattare il tasso di emergenza come una risposta continua e adottare procedure quali il test di William, se si ipotizza che il rapporto dose-risposta sia monotonico e se i dati del tasso di emergenza corroborano tale ipotesi. Conviene utilizzare il test di Dunnett quando l’ipotesi di monotonicità è infondata. Ai fini di questa analisi un campione è considerato di grandi dimensioni quando il numero di moscerini emersi e il numero dei non emersi sono entrambi superiori a cinque per replica. 48. Prima di applicare i metodi ANOVA, occorre dapprima trasformare i valori del tasso di emergenza (ER) per la radice quadrata dell’arcoseno oppure secondo Freeman-Tukeylper ottenere una distribuzione prossima a quella normale e livellare le varianze. Il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione Bonferroni) oppure il test di Mantel-Haenszel possono essere impiegati quando si utilizzano delle frequenze assolute. La trasformazione con la radice quadrata dell’arcoseno consiste nel calcolare la funzione inversa del seno (seno-1) della radice quadrata del tasso di emergenza (ER). 49. Per i tassi di emergenza, i valori della CEX sono calcolati con un’analisi di regressione [oppure probit (22), logit, Weibull, appositi software commerciali ecc.]. Se l’analisi di regressione è inconcludente (ad esempio, quando vi sono meno di due risposte parziali), si fa ricorso ad altri metodi non parametrici quali la media mobile o una semplice interpolazione. Velocità di sviluppo 50. Il tempo medio di sviluppo è il tempo medio intercorso tra l’introduzione delle larve (giorno 0 della prova) e l’emergenza della coorte sperimentale di moscerini (per calcolare il tempo reale di sviluppo si deve tenere conto dell’età delle larve al momento dell’introduzione). La velocità di sviluppo è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo (unità: 1/giorno) e consiste nella parte di sviluppo larvale che avviene quotidianamente. Per valutare la tossicità nei sedimenti si preferisce far riferimento alla velocità di sviluppo perché, rispetto al tempo di sviluppo, ha una varianza più bassa e valori più omogenei e più prossimi a una distribuzione normale. È anche per questo che si possono applicare test parametrici potenti, più adatti alla velocità di sviluppo che al tempo di sviluppo. Se la velocità di sviluppo è trattata come risposta continua, i valori della CEX possono essere stimati avvalendosi dell’analisi di regressione [ad esempio (23) (24)]. 51. Per i test statistici seguenti, il numero di moscerini osservati il giorno x è considerato essere emerso a metà dell’intervallo tra il giorno x e il giorno x - l (l = lunghezza dell’intervallo di osservazione, di solito 1 giorno). La velocità media di sviluppo per recipiente (x) è calcolata come segue: dove: : velocità media di sviluppo per recipiente i : indice dell’intervallo di osservazione m : numero massimo di intervalli di osservazione : numero di moscerini emersi nell’intervallo di osservazione i ne : numero totale di moscerini emersi alla fine dell’esperimento (= ) xi : velocità di sviluppo dei moscerini emersi nell’intervallo i dove: dayi : giorno dell’osservazione (contato a partire dall’applicazione) li : lunghezza dell’intervallo d’osservazione i (espressa in giorni, di solito 1 giorno) Relazione sulla prova 52. La relazione sulla prova deve contenere almeno le seguenti informazioni: Sostanza in esame: — natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (idrosolubilità, tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel suolo (o nel sedimento, se disponibile), stabilità nell’acqua ecc.), — dati di identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula strutturale, numero CAS ecc.) compresi purezza e metodo di analisi per la quantificazione della sostanza in esame. Specie in esame: — animali utilizzati: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento, — informazioni sulla manipolazione degli ammassi di uova e delle larve, — età degli animali al momento della loro introduzione nei recipienti di prova. Condizioni sperimentali: — sedimento utilizzato (specificare se naturale o artificiale), — se il sedimento è naturale: ubicazione e descrizione del sito di campionamento del sedimento e, se possibile, cronistoria della contaminazione; caratteristiche: pH, tenore di carbonio organico, rapporto C/N e granulometria (se del caso). — preparazione del sedimento artificiale: ingredienti e caratteristiche (tenore di carbonio organico, pH, tenore di umidità ecc., all’inizio della prova), — preparazione dell’acqua per la prova (se l’acqua è ricostituita) e caratteristiche (concentrazione dell’ossigeno, pH, conduttività, durezza ecc., all’inizio della prova), — spessore del sedimento e profondità dell’acqua sovrastante, — volume dell’acqua sovrastante e dell’acqua interstiziale; peso del sedimento umido, con acqua interstiziale e senza, — recipienti di prova (materiale e dimensioni), — metodo per l’addizione della sostanza al sedimento: concentrazioni utilizzate nella prova, numero di repliche e, se del caso, solventi utilizzati, — fase di stabilizzazione del sistema sedimento addizionato-acqua: durata e condizioni, — condizioni di incubazione: temperatura, fotoperiodo e intensità luminosa, aerazione (frequenza e intensità), — informazioni dettagliate sull’alimentazione, che comprendono il tipo di mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione. Risultati: — concentrazioni di prova, nominali e concentrate, e risultati di tutte le analisi condotte per determinare la concentrazione della sostanza in esame nel recipiente di prova, — qualità dell’acqua nei recipienti di prova, ossia pH, temperatura, ossigeno disciolto, durezza e ammoniaca, — aggiunta di acqua per sostituire quella eventualmente evaporata, — numero di moscerini maschi e femmine emersi, per ciascun recipiente e ciascun giorno, — numero di larve non emerse come moscerini, per recipiente, — peso secco individuale medio delle larve, per recipiente e, se del caso, per stadio larvale, — percentuale di emergenza per replica e per concentrazione (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), — velocità media di sviluppo dei moscerini completamente emersi, per replica e per concentrazione somministrata (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), — stime degli endpoint di tossicità, ad esempio per CEX (e relativi intervalli di confidenza), NOEC e/o LOEC, nonché metodi statistici utilizzati per determinarli, — discussione dei risultati comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute allo scostamento dal presente metodo di prova. BIBLIOGRAFIA (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canadàs biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OCSE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Capitolo C.8 del presente allegato, Tossicità per i lombrichi. (15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Appendice 1 DEFINIZIONI Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni: Sedimento artificiale: sintetico o formulato, miscela di materiali utilizzati per simulare le componenti fisiche di un sedimento naturale. Acqua sovrastante: acqua posta sopra il sedimento nel recipiente di prova. Acqua interstiziale: acqua che occupa lo spazio tra il sedimento e le particelle di terreno. Sedimento addizionato: sedimento al quale è stata aggiunta la sostanza in esame. Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. Appendice 2 Indicazioni per l’allevamento di Chironomus riparius 1. Le larve di Chironomus possono essere allevate in cristallizzatori o in grandi recipienti. Il fondo del recipiente è ricoperto di un sottile strato di sabbia di quarzo dello spessore di circa 5-10 mm. Anche il Kieselguhr (ad esempio l’articolo 8117 di Merck) ha dato prova di essere un substrato idoneo (nel qual caso ne basta uno strato ancora più sottile, di pochi millimetri). Si aggiunge acqua di qualità adeguata ad un’altezza di vari centimetri, avendo cura di mantenere questo livello iniziale aggiungendo acqua in caso di evaporazione per prevenire il disseccamento. L’acqua può essere rinnovata completamente, se necessario. Fornire un’aerazione moderata. I recipienti di allevamento devono essere situati in apposite gabbie per impedire la fuga degli adulti emergenti. La gabbia dev’essere sufficientemente grande per consentire agli adulti emersi di sfarfallare, condizione imprescindibile per la copulazione (dimensioni minime: 30 × 30 × 30 cm). 2. Le gabbie devono essere tenute a temperatura ambiente, oppure a una temperatura costante di 20 ± 2 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce (a un’intensità luminosa di circa 1 000 lux) e 8 ore di buio. Secondo le informazioni disponibili, un’umidità relativa dell’aria inferiore a 60 % può impedire la riproduzione. Acqua di diluizione 3. Può essere utilizzata qualsiasi acqua naturale o sintetica di qualità adeguata. Normalmente viene utilizzata acqua di pozzo, acqua di rubinetto non clorata e mezzi artificiali (come Elendt M4 o M7, si veda di seguito). L’acqua deve essere aerata prima dell’uso. Se necessario, si può rinnovare l’acqua di allevamento versando o sifonando l’acqua usata dai recipienti, facendo attenzione a non distruggere i tubi delle larve. Alimentazione delle larve 4. Le larve di Chironomus sono nutrite con mangime per pesci in fiocchi (Tetra Min®, Tetra Phyll® o altra marca registrata equivalente), in dose giornaliera di circa 250 mg per recipiente. Il mangime può essere somministrato sotto forma di polvere macinata secca o sospensione acquosa: si aggiunge 1,0 g di fiocchi a 20 ml di acqua di diluizione e si agita la miscela per renderla omogenea. La dieta a base di questo preparato consiste in 5 ml al giorno per recipiente (agitare prima dell’uso). La dose può essere più abbondante per le larve più vecchie. 5. L’alimentazione è adattata in funzione della qualità dell’acqua. Se il mezzo di coltura diventa torbido, occorre somministrare meno mangime. Le quantità di mangime somministrate vanno controllate scrupolosamente: se scarse faranno migrare le larve verso la colonna d’acqua, se in eccesso intensificheranno l’attività microbica e abbasseranno la concentrazione di ossigeno. La conseguenza, in entrambi i casi, potrebbe essere l’inibizione della crescita degli organismi. 6. Nell’allestire i nuovi recipienti di allevamento è possibile aggiungere anche alcune cellule di alghe verdi (come Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Alimentazione degli adulti emersi 7. Alcuni ricercatori suggeriscono, come mezzo di alimentazione per gli adulti emersi, un tampone di ovatta imbevuto di una soluzione satura di saccarosio. Emergenza 8. Alla temperatura di 20 ± 2 °C gli adulti iniziano ad emergere dai recipienti di allevamento delle larve dopo circa 13-15 giorni. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate. Ammassi di uova 9. Dal momento in cui si osserva la presenza di adulti nelle gabbie di allevamento, occorre controllare tre volte la settimana, in tutti i recipienti, se sono stati depositati ammassi gelatinosi di uova. Se presenti, gli ammassi di uova devono essere rimossi con cura e trasferiti in un recipiente piccolo contenente un campione dell’acqua di allevamento. Essi sono utilizzati per allestire un nuovo recipiente di allevamento (ad esempio, 2-4 ammassi per recipiente) oppure per eseguire prove di tossicità. 10. Le larve al primo stadio compaiono di norma dopo 2-3 giorni. Allestimento di nuovi recipienti di coltura 11. Una volta avviate le colture, dovrebbe essere possibile allestire un nuovo recipiente per la coltura di larve a cadenza settimanale o meno spesso, secondo quanto richiesto dalla prova, ritirando i recipienti vecchi dopo che i moscerini adulti sono emersi. Questo sistema permette di ottenere regolarmente una quota di adulti con un’organizzazione minima. Preparazione delle soluzioni di prova M4 e M7 12. Il mezzo M4 è stato descritto da Elendt (1990). Il mezzo M7 è preparato come l’M4 tranne per le sostanze indicate nella tabella 1, le cui concentrazioni nel mezzo M7 sono quattro volte inferiori rispetto al mezzo M4. Una pubblicazione sul mezzo M7 è in preparazione (Elendt, comunicazione personale). La soluzione di prova non deve essere preparata secondo le istruzioni di Elendt e Bias (1990), perché le concentrazioni di NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 e K2HPO4 indicate per la preparazione delle soluzioni madre non sono adatte. Preparazione del mezzo M7 13. Ciascuna soluzione madre (I) è preparata separatamente e a partire da queste soluzioni madri (I) si prepara la soluzione madre combinata (II) (cfr. tabella 1). Per preparare il mezzo M7 mescolare 50 ml di soluzione madre combinata (II) con i quantitativi di ogni soluzione madre con macronutrienti indicati nella tabella 2 e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata. Per preparare una soluzione madre vitaminica, aggiungere tre vitamine all’acqua deionizzata, come indicato nella tabella 3, e versare 0,1 ml della soluzione madre combinata di vitamine al mezzo M7 finale poco prima dell’uso La soluzione di vitamine combinate è conservata in congelatore in piccole aliquote. Aerare e stabilizzare il mezzo. BIBLIOGRAFIA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. Tabella 1 Soluzioni madre di oligoelementi per i mezzi M4 e M7 Soluzioni madre (I) Quantità (mg) per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata Preparazione della soluzione madre combinata (II): mescolare le quantità seguenti (ml) di soluzioni madre (I) e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata Concentrazioni finali nelle soluzioni di prova (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tabella 2 Soluzioni madre di macronutrienti per i mezzi M4 e M7 Quantità per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata (mg) Quantità di soluzione madre di macronutrienti aggiunta per preparare i mezzi M4 e M7 (ml/l) Concentrazioni finali delle soluzioni di prova M4 e M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tabella 3 Soluzione madre vitaminica per i mezzi M4 e M7. Le tre soluzioni di vitamine sono mescolate in modo da formare un’unica soluzione madre vitaminica. Quantità per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata (mg) Quantità di soluzione madre vitaminica aggiunta per preparare i mezzi M4 e M7 (ml/l) Concentrazioni finali delle soluzioni di prova M4 e M7 (mg/l) Tiamina cloridrato 750 0,1 0,075 Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075 BIBLIOGRAFIA Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on LIFE History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Appendice 3 PREPARAZIONE DEL SEDIMENTO ARTIFICIALE Composizione del sedimento Il sedimento è preparato come illustrato nella tabella sottostante: Componente Caratteristiche % di sedimento peso secco Torba Torba di sfagno, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0, priva di residui visibili di piante, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata all’aria 4-5 Sabbia di quarzo Granulometria: > 50 % delle particelle ha dimensioni comprese tra 50 e 200 μm 75-76 Argilla caolinica Tenore di caolinite ≥ 30 % 20 Carbonio organico Regolato aggiungendo torba e sabbia 2 (± 0,5) Carbonato di calcio CaCO3, in polvere, chimicamente puro 0,05-0,1 Acqua Conduttività ≤ 10 μS/cm 30-50 Preparazione Far essiccare all’aria e macinare finemente la torba. Preparare una sospensione della quantità richiesta di polvere di torba in acqua deionizzata utilizzando un omogeneizzatore ad alte prestazioni. Aggiustare il pH della sospensione a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. Conservare per almeno due giorni la sospensione a temperatura di 20 ± 2 °C agitandola leggermente per stabilizzare il pH e favorire il costituirsi di una flora microbica stabile. Misurare nuovamente il pH, che deve essere pari a 6,0 ± 0,5. Successivamente mescolare la sospensione di torba con gli altri componenti (sabbia e argilla caolinica) e con acqua deionizzata, fino ad ottenere un sedimento omogeneo con tenore in acqua pari al 30-50 % del peso secco del sedimento. Misurare ancora una volta il pH della miscela finale e aggiustare a 6,5-7,5 con CaCO3 se necessario. Prelevare campioni del sedimento per determinare il peso secco e il tenore di carbonio organico. Prima di impiegare il sedimento artificiale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia di conservarlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui si realizzerà la prova. Conservazione I componenti secchi destinati alla preparazione del sedimento artificiale possono essere conservati in luogo fresco e asciutto, a temperatura ambiente. Il sedimento artificiale (umido) non può essere conservato prima del suo impiego per la prova, ma deve essere utilizzato subito dopo il periodo di riposo di 7 giorni che ne conclude la preparazione. BIBLIOGRAFIA Capitolo C.8 del presente allegato. Tossicità per i lombrichi. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Appendice 4 Caratteristiche chimiche di un’acqua di diluizione accettabile Sostanza Concentrazioni Particolato < 20 mg/l Carbonio organico totale < 2 mg/l Ammoniaca non ionizzata < 1 μg/l Durezza espressa come CaCO3 < 400 mg/l (17) Cloro residuo < 10 μg/l Pesticidi organofosforati totali < 50 ng/l Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati < 50 ng/l Cloro organico totale < 25 ng/l Appendice 5 Indicazioni per monitorare l’emergenza delle larve di chironomidi A partire dal 20o giorno fino alla fine della prova, in cima ai becher si collocano contenitori “trappola”. Un esempio di trappola è raffigurato nell’immagine sottostante. A: reticella di nylon B: contenitore di plastica capovolto C: becher senza beccuccio D: aperture ricoperte di reticella attraverso cui si effettua il ricambio dell’acqua E: acqua F: sedimento C. 28. PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDI IN SEDIMENTO-ACQUA CON ACQUA ADDIZIONATA INTRODUZIONE 1. Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 219 (2004) ed è inteso a valutare gli effetti di un’esposizione prolungata a sostanze chimiche su larve di Chironomus sp., un dittero che vive nei sedimenti di acqua dolce. Si basa principalmente sulla linea guida della BBA che utilizza un sistema sperimentale sedimento-acqua con terreno artificiale, in cui l’esposizione avviene nella colonna d’acqua (1) e tiene conto anche dei protocolli per le prove di tossicità su Chironomus riparius e Chironomus tentans messi a punto in Europa e in Nord America (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) e sottoposti a prove interlaboratorio (1) (6) (9). È possibile utilizzare anche altre specie ben documentate, ad esempio Chironomus yoshimatsui (10 (11). 2. Questo metodo prevede che l’esposizione alla sostanza in esame avvenga a mezzo d’acqua addizionata. La scelta dello scenario d’esposizione dipende dalla finalità della prova. Lo scenario d’esposizione, che consiste nell’addizionare alla colonna d’acqua la sostanza in esame, è inteso a simulare la dispersione di pesticidi nebulizzati e copre il picco iniziale di concentrazioni nell’acqua interstiziale. È utile anche per altri tipi di esposizione (fuoriuscite di sostanze chimiche, ad esempio), tranne quando i processi di accumulo hanno durata superiore a quella della prova. 3. In genere le sostanze da saggiare su organismi che vivono nei sedimenti persistono a lungo in questo comparto. L’esposizione di questi organismi può avvenire per diverse vie. L’importanza relativa di ogni via d’esposizione e il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all’effetto tossico globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame. Per le sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) oppure per le sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, l’ingestione di alimenti contaminati può costituire una via d’esposizione importante. Per non sottovalutare la tossicità delle sostanze altamente lipofile, si può considerare l’opportunità di aggiungere cibo al sedimento prima di applicare la sostanza in esame. Il presente metodo, per tenere conto di tutte le possibili vie di esposizione, prevede un’esposizione a lungo termine: la prova dura da 20 a 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e da 28 a 65 giorni per C. tentans. Se si ha bisogno di dati a breve termine per un fine specifico, ad esempio studiare gli effetti di sostanze chimiche instabili, è possibile ritirare dopo dieci giorni di prova le repliche supplementari allestite nell’ambito dello stesso impianto sperimentale. 4. Gli endpoint misurati sono il numero totale di adulti emersi e il tempo intercorso fino alla loro emergenza. Se occorrono dati a breve termine, si raccomanda di effettuare dopo dieci giorni le misurazioni relative alla sopravvivenza e alla crescita delle larve, utilizzando le eventuali repliche supplementari. 5. Si raccomanda di usare un sedimento artificiale, che presenta numerosi vantaggi rispetto a quello naturale: — riduce la variabilità sperimentale in quanto costituisce una “matrice standardizzata” riproducibile, ed elimina la necessità di trovare delle fonti di sedimenti pulite e incontaminate, — consente di effettuare le prove in qualsiasi momento dell’anno, senza che occorra tenere conto della variabilità stagionale dei sedimenti, e non richiede di essere trattato prima delle prove per eliminare la fauna indigena; riduce inoltre i costi associati alla raccolta sul terreno di quantità sufficienti di sedimento per le prove di routine, — consente di mettere a confronto e classificare le sostanze in base alla loro tossicità: i dati sulla tossicità ricavati da prove con sedimenti naturali e artificiali sono comparabili per varie sostanze chimiche (2). 6. L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo. PRINCIPIO DEL METODO 7. Si espongono dei chironomidi al primo stadio larvale a un intervallo di concentrazioni della sostanza in esame in un sistema sedimento-acqua. La prova inizia introducendo le larve al primo stadio nei becher contenenti il sistema sedimento-acqua e aggiungendo successivamente all’acqua la sostanza in esame. La percentuale di emergenza e la velocità di sviluppo dei chironomidi sono misurate alla fine della prova. Dopo 10 giorni, se necessario, si misurano anche la sopravvivenza e il peso delle larve (utilizzando eventuali repliche supplementari). Questi dati sono analizzati tramite un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x dell’emergenza, della sopravvivenza o della crescita delle larve (ad esempio CE15, CE50 ecc.), oppure mediante verifica di un’ipotesi statistica per determinare un valore LOEC/NOEC. Nel secondo caso occorre confrontare i valori degli effetti con i valori di controllo per mezzo di prove statistiche. INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME 8. È necessario conoscere l’idrosolubilità e la tensione di vapore della sostanza in esame, il coefficiente di ripartizione misurato o calcolato nel sedimento e la sua stabilità nell’acqua e nel sedimento. Occorre inoltre avvalersi di un metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, di cui devono essere noti e riportati nella relazione l’accuratezza e il limite di rivelabilità. È anche utile conoscere la formula strutturale e la purezza della sostanza in esame, come pure il suo destino chimico (ad esempio, dissipazione, degradazione abiotica e biotica ecc.). Ulteriori orientamenti per saggiare le sostanze con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa l’esecuzione delle prove sono contenuti in (12). SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO 9. Per assicurarsi che il protocollo e le condizioni di prova siano affidabili si possono saggiare regolarmente delle sostanze di riferimento. Tra i tossici di riferimento utilizzati con successo in prove interlaboratorio e studi di validazione vi sono: lindano, trifluralin, pentaclorofenolo, cloruro di cadmio e cloruro di potassio (1) (2) (5) (6) (13). VALIDITÀ DELLA PROVA 10. Perché la prova sia valida devono realizzarsi le seguenti condizioni: — alla fine della prova l’emergenza nei controlli deve essere almeno pari al 70 % (1) (6), — per quanto riguarda C. riparius e C. yoshimatsui, l’emergenza allo stadio adulto nei recipienti di controllo deve avvenire tra i 12 e i 23 giorni successivi alla loro introduzione nei recipienti; per C. tentans il periodo va da 20 a 65 giorni, — alla fine della prova, si devono misurare il pH e la concentrazione dell’ossigeno disciolto in ogni recipiente. La concentrazione dell’ossigeno deve essere almeno il 60 % del suo valore di saturazione in aria (ASV) alla temperatura applicata e il pH dell’acqua sovrastante deve essere compreso tra 6 e 9 in tutti i recipienti di prova, — la temperatura dell’acqua non deve variare di oltre ± 1,0 °C e può essere regolata per mezzo di una camera isotermica, nel qual caso la temperatura ambiente dovrà essere periodicamente confermata, a congrui intervalli di tempo. DESCRIZIONE DEL METODO Recipienti di prova 11. Lo studio è condotto in becher di vetro da 600 ml, di 8 cm di diametro. Possono essere utilizzati anche altri recipienti, purché garantiscano profondità sufficiente ad accogliere il sedimento e l’acqua sovrastante. La superficie del sedimento deve essere tale da offrire uno spazio da 2 a 3 cm2 per larva. Lo spessore dello strato sedimentario e la profondità dell’acqua sovrastante devono essere in rapporto 1:4. I recipienti e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con il sistema sperimentale devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte (ad esempio Teflon). Selezione delle specie 12. La specie che meglio si presta a questa prova è Chironomus riparius. Chironomus tentans è altrettanto adatto, sebbene sia più difficile da manipolare e richieda un periodo di prova più lungo. Si può utilizzare anche Chironomus yoshimatsui. Le istruzioni sul metodo di allevamento di Chironomus riparius figurano nell’appendice 2. Sono reperibili informazioni anche sulle condizioni di allevamento delle altre specie: Chironomus tentans (4) e Chironomus yoshimatsui (11). Occorre identificare la specie prima dell’avvio della sperimentazione, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati coltivati dal laboratorio che esegue la sperimentazione. Sedimento 13. Si utilizza di preferenza sedimento artificiale. Se si sceglie di utilizzare un sedimento naturale, occorre caratterizzarlo, almeno quanto a pH e tenore di carbonio organico (la determinazione di altri parametri, come il rapporto C/N e la granulometria è altrettanto raccomandata), e assicurarsi che sia esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in competizione con i chironomidi o consumarli. Prima di impiegare un sedimento naturale in una prova di tossicità su chironomidi, si raccomanda inoltre di mantenerlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui verrà realizzata la prova. Per questo test si raccomanda di utilizzare il sedimento artificiale basato su quello di cui al metodo di prova C.8 (14) e costituito secondo la seguente formula (1) (15) (16): a) 4-5 % (peso secco) di torba, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0. È importante utilizzare torba sotto forma di polvere, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata unicamente all’aria; b) 20 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %); c) 75-76 % (peso secco) di sabbia di quarzo (composta in prevalenza da sabbia fine, con oltre il 50 % delle particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 μm); d) aggiunta di acqua deionizzata fino ad ottenere un tenore di umidità totale della miscela compreso tra 30 % e 50 %; e) aggiunta di carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO3) per aggiustare il pH della miscela finale a 7,0 ± 0,5. f) il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % (± 0,5 %), ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, come indicato in a) e c). 14. Il luogo di provenienza di torba, argilla caolinica e sabbia deve essere noto. Occorre verificare che i componenti del sedimento non siano contaminati da sostanze chimiche (ad esempio, metalli pesanti, composti organoclorurati, composti organofosforici ecc.). Un esempio di preparazione del sedimento artificiale figura nell’appendice 3. I componenti possono anche essere mescolati allo stato secco, purché si dimostri che dopo l’aggiunta dell’acqua sovrastante non si separino (ad esempio, particelle di torba in sospensione) e che la torba o il sedimento sono condizionati a sufficienza. Acqua 15. Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate nelle appendici 2 e 4 per un’acqua di diluizione accettabile sono considerate adatte per la prova. È possibile utilizzare come acqua di coltura e acqua di diluizione qualsiasi acqua naturale (di superficie o freatica), acqua ricostituita (cfr. appendice 2) o acqua di rubinetto non clorata se i chironomidi sopravvivono durante l’allevamento e la prova senza manifestare segni di stress. All’inizio della prova il pH dell’acqua di prova deve situarsi tra 6 e 9 e la sua durezza complessiva non superare 400 mg/l di CaCO3. Se però si sospetta che vi sia un’interazione tra gli ioni che determinano la durezza e la sostanza in esame, occorre utilizzare un’acqua meno dura (in tal caso il mezzo Elendt M4 non è idoneo). Lo stesso tipo di acqua deve essere impiegato per tutta la prova. Le caratteristiche della qualità dell’acqua indicate nell’appendice 4 vanno misurate almeno due volte l’anno oppure quando si sospetta che abbiano subito un’alterazione significativa. Soluzioni madre — Acqua addizionata 16. Le concentrazioni sperimentali sono calcolate in base alle concentrazioni della colonna d’acqua, ossia l’acqua sovrastante il sedimento. Le soluzioni di prova alle concentrazioni prescelte vanno in genere preparate per diluizione di una soluzione madre. Le soluzioni madre devono preferibilmente essere preparate solubilizzando la sostanza nel mezzo di prova. In alcuni casi può rendersi necessario l’uso di solventi o disperdenti per ottenere una soluzione madre di adeguata concentrazione. Tra i solventi che si possono usare vi sono: acetone, etanolo, metanolo, etere monometilico del glicol etilenico, etere dimetilico del glicol etilenico, dimetilformammide e glicol trietilenico. Disperdenti utilizzabili sono Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulosa 0,01 % e HCO-40. La concentrazione dell’agente solubilizzante nel mezzo di prova finale deve essere minima (ossia ≤ 0,1 ml/l) e identica in tutti i trattamenti. Qualora si utilizzi un agente solubilizzante, questo non deve avere effetti significativi sulla sopravvivenza né effetti negativi visibili sulle larve di chironomide, effetti che si ricavano dall’osservazione del recipiente di controllo trattato con solo solvente. L’uso di questi materiali dovrebbe tuttavia essere evitato il più possibile. DISEGNO SPERIMENTALE 17. Il disegno sperimentale comprende la selezione del numero delle concentrazioni della sostanza in esame e dell’intervallo fra esse, il numero di recipienti per ciascun livello di concentrazione e il numero di larve per recipiente. È qui descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della CE, la stima della NOEC e per l’esecuzione di una prova limite. Come impostazione sperimentale, l’analisi di regressione è da preferirsi alla verifica di un’ipotesi. Disegno per l’analisi di regressione 18. La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE15, CE50) e l’intervallo delle concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un effetto d’interesse devono rientrare tra le concentrazioni incluse nella prova. In genere la precisione e, in particolare, la validità della stima delle concentrazioni che determinano un effetto (CEX) saranno maggiori quando la concentrazione con effetto rientra nell’intervallo delle concentrazioni da testare. Bisogna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione efficace minima o al di sopra di quella massima. È utile condurre una prova preliminare di determinazione dell’intervallo delle concentrazioni per delimitare quelle su cui impostare la prova (cfr. paragrafo 27). 19. Se si deve stimare la CEX occorre saggiare almeno cinque concentrazioni e allestire tre repliche per ciascuna concentrazione. In ogni caso, per ottenere una buona stima del modello, è consigliabile utilizzare un numero sufficiente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva dose/risposta sia poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito se si aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte diverse. L’aumento del numero di repliche o la riduzione degli intervalli delle concentrazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova. Il numero delle repliche sarà maggiore se si deve stimare la percentuale di sopravvivenza e crescita delle larve dopo 10 giorni. Disegno per la stima di una NOEC/LOEC 20. Se occorre stimare la LOEC/NOEC si saggeranno cinque concentrazioni con almeno quattro repliche, e il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere superiore a due. Il numero di repliche deve essere tale da garantire una potenza statistica che consenta di rilevare una differenza del 20 % con gli organismi di controllo, applicando una significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto riguarda la velocità di sviluppo, è in genere appropriata un’analisi della varianza (ANOVA), come ad esempio il test di Dunnett o il test di Williams (17) (18) (19) (20). Per il tasso di emergenza si può utilizzare il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione secondo Bonferroni) o il test di Mantel-Haenszel. Prova limite 21. Se la prova preliminare per determinare l’intervallo delle concentrazioni non ha prodotto alcun effetto, si può condurre una prova limite (una concentrazione di prova e un controllo). Scopo della prova limite è di indicare che la concentrazione tossica della sostanza in esame è superiore alla concentrazione limite saggiata. Per questo metodo di prova non è possibile raccomandare una concentrazione precisa, che è lasciata alla discrezione dei regolatori. Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli organismi trattati che per quelli di controllo. Occorre dimostrare che la potenza statistica è sufficiente per rilevare una differenza del 20 % con il controllo, applicando una significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto concerne la risposta in termini di velocità di sviluppo e peso, il test t costituisce un metodo statistico idoneo se i dati rispettano le condizioni imposte da questo test (normalità, varianze omogenee). In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey. Quanto al tasso di emergenza, il test esatto di Fisher è appropriato. PROCEDURA Condizioni di esposizione Preparazione del sistema addizionato acqua-sedimento 22. Si deposita nei recipienti una congrua quantità di sedimento artificiale (cfr. paragrafi 13-14 e appendice 3), in modo da formare uno strato di almeno 1,5 cm. Si aggiunge acqua fino ad un’altezza di 6 cm (cfr. paragrafo 15). Il rapporto tra spessore del sedimento e profondità dell’acqua non deve essere superiore a 1:4 e lo strato di sedimento non deve oltrepassare i 3 cm. Il sistema sedimento-acqua è posto in moderata aerazione per sette giorni prima di introdurvi gli organismi di prova (cfr. paragrafo 14 e appendice 3). Per evitare la separazione degli ingredienti del sedimento e la risospensione delle particelle fini durante l’aggiunta dell’acqua, si può ricoprire il sedimento con un disco di plastica durante l’operazione di riempimento della colonna d’acqua per poi ritirarlo a operazione completata. Possono essere utilizzati anche altri dispositivi. 23. I recipienti così allestiti devono essere coperti (ad esempio, da piastre di vetro). Nel corso della prova si provvederà, se necessario, ad aggiungere l’acqua necessaria a mantenere il volume originario per compensare l’evaporazione, avendo cura di utilizzare acqua distillata o deionizzata per evitare l’accumulo di sali. Introduzione degli organismi di prova 24. Quattro o cinque giorni prima di introdurre gli organismi nei recipienti, si prelevano dagli allevamenti ammassi di uova e li si depositano in recipienti piccoli contenenti mezzo di coltura. Si può utilizzare il mezzo vecchio prelevato dalla coltura madre o un mezzo fresco. In quest’ultimo caso, si aggiunge una piccola quantità di cibo, ad esempio alghe verdi e/o qualche goccia di filtrato di una sospensione di mangime per pesci in fiocchi (cfr. appendice 2). Si devono utilizzare solo ammassi di uova appena deposti. Di solito le larve compaiono qualche giorno dopo la deposizione delle uova (da 2 a 3 giorni per Chironomus riparius a 20 oC e da 1 a 4 giorni per Chironomus tentans a 23 C e Chironomus yoshimatsui a 25 oC) e la loro crescita avviene in quattro stadi, ciascuno di una durata compresa tra 4 e 8 giorni. Questa prova si esegue al primo stadio larvale (2-3 oppure 1-4 giorni dopo la schiusa). È possibile verificare lo stadio di sviluppo dei moscerini in base alle dimensioni della capsula cefalica (6). 25. In ciascun recipiente contenente il sistema addizionato sedimento-acqua si distribuiscono casualmente, per mezzo di una pipetta smussata, venti larve al primo stadio. L’aerazione dell’acqua deve essere interrotta per 24 ore dal momento dell’introduzione delle larve nei recipienti (cfr. paragrafi 24 e 32). In base al disegno sperimentale adottato (cfr. paragrafi 19 e 20), il numero di larve utilizzate per concentrazione è almeno 60 per la stima puntuale della CE e 80 per la determinazione della NOEC. 26. Ventiquattr’ore dopo avere introdotto le larve, la sostanza da saggiare è aggiunta nella colonna d’acqua sovrastante e i recipienti vengono di nuovo sottoposti a moderata aerazione. Piccoli volumi della soluzione contenente la sostanza in esame sono iniettati con un pipetta sotto la superficie dell’acqua. In seguito si mescola delicatamente l’acqua sovrastante, con la dovuta cautela per evitare la risospensione del sedimento. Concentrazioni di prova 27. Può essere utile effettuare una prova preliminare per determinare la gamma delle concentrazioni per la prova vera e propria. A tal fine si utilizza a una serie di concentrazioni della sostanza in esame molto intervallate tra loro. Applicando la stessa densità superficiale di chironomidi prevista per la prova vera e propria, i chironomidi sono esposti ad ogni concentrazione della sostanza in esame per un periodo che consenta di stimare le concentrazioni di prova adeguate e non è necessaria alcuna replica. 28. Le concentrazioni sperimentali per la prova vera e propria sono decise in funzione dell’esito della prova di determinazione dell’intervallo di concentrazione. Occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, scelte in base a quanto indicato nei paragrafi 18-20. Controlli 29. La prova prevede l’allestimento di recipienti di controllo, senza la sostanza in esame ma con il sedimento, e un congruo numero di repliche (cfr. paragrafi 19-20). Se la sostanza in esame è stata applicata mediante un solvente (cfr. paragrafo 16), si deve aggiungere un recipiente di controllo che contenga sedimento e solvente. Sistema di prova 30. Si impiegano sistemi statici. I sistemi semistatici oppure a flusso, con rinnovo intermittente o continuo dell’acqua sovrastante, possono essere utilizzati in casi eccezionali, ad esempio se le specifiche della qualità dell’acqua diventano inadeguate per gli organismi in esame oppure influiscono sull’equilibrio chimico (nel caso in cui, ad esempio, i livelli di ossigeno disciolto si abbassino troppo, la concentrazione degli escreti aumenti eccessivamente o i minerali prodotti dalla lisciviazione del sedimento alterino il pH e/o la durezza dell’acqua). È tuttavia sufficiente e preferibile ricorrere ad altri metodi di miglioramento della qualità dell’acqua sovrastante, come l’aerazione. Alimentazione 31. Le larve devono essere nutrite, di preferenza ogni giorno o almeno tre volte la settimana. Durante i primi 10 giorni l’alimentazione giornaliera ritenuta adeguata per le larve giovani consiste in 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg per C. yoshimatsui) pro capite di mangime per pesci (sospensione acquosa o finemente macinato, del tipo Tetra-Min o Tetra-Phyll; cfr. appendice 2). Può essere necessario aumentare leggermente la dose per le larve più vecchie: 0,5-1 mg per larva al giorno dovrebbe essere sufficiente per il resto della prova. Si diminuirà la razione di cibo di tutti gli organismi trattati e dei controlli se si osserva la comparsa di funghi o il decesso di organismi di controllo. Se non si riesce ad arrestare lo sviluppo fungino occorre ripetere la prova. Se la prova verte su sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) o sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza e alla crescita naturale degli organismi può essere incorporata al sedimento artificiale prima del periodo di stabilizzazione. In tal caso il mangime per pesci è sostituito con alimenti vegetali, ad esempio 0,5 % (peso secco) di foglie finemente macinate di ortica (Urtica dioica), gelso (Morus alba), trifoglio bianco (Trifolium repens), spinacio (Spinacia oleracea) o di altro materiale vegetale (Cerophyl o alfa cellulosa). Condizioni di incubazione 32. L’acqua sovrastante dei recipienti è sottoposta a una moderata aerazione, di preferenza a partire da 24 ore dopo l’introduzione delle larve e fino alla fine della prova (avendo cura che la concentrazione di ossigeno disciolto non scenda sotto il 60 % del suo valore di saturazione dell’aria). L’aria è insufflata tramite pipette Pasteur in vetro fissate a 2-3 cm sopra lo strato di sedimento (nella misura di una o poche bolle al secondo). Se la sostanza in esame è volatile, va eventualmente considerato di non aerare il sistema. 33. La prova è effettuata a una temperatura costante di 20 °C (± 2 °C). Per C. tentans e C. yoshimatsui la temperatura raccomandata è, rispettivamente, di 23 °C e 25 °C (± 2 °C). Il fotoperiodo è di 16 ore e l’intensità luminosa compresa tra 500 e 1 000 lux. Durata dell’esposizione 34. L’esposizione ha inizio con l’introduzione delle larve nei recipienti trattati e di controllo. La prova dura 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e 65 giorni per C. tentans. Se i moscerini emergono prima, la prova può concludersi dopo almeno cinque giorni dall’emergenza dell’ultimo adulto di controllo. OSSERVAZIONI Emergenza 35. Si deve determinare il tempo di sviluppo e il numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate. 36. I recipienti vanno osservati almeno tre volte la settimana, per verificare che non presentino attività anomala (abbandono del sedimento, movimenti natatori insoliti ecc.) rispetto a quelli di controllo. Durante il periodo della prevista emergenza è necessario contare tutti i giorni i moscerini emersi e registrare il sesso e il numero di quelli completamente emersi. Una volta identificati, i moscerini sono tolti dai recipienti. Ogni ammasso di uova deposto prima della fine della prova deve essere registrato e poi tolto per impedire l’introduzione di nuove larve nel sedimento. Va registrato anche il numero delle pupe visibili che non sono riuscite ad emergere. L’appendice 5 contiene indicazioni su come misurare l’emergenza. Crescita e sopravvivenza 37. Se occorre rilevare i dati sulla sopravvivenza e la crescita della larve dopo 10 giorni, si allestiscono recipienti supplementari all’inizio della prova da usare successivamente. Il sedimento di questi recipienti supplementari è setacciato con un setaccio da 250 μm per trattenere le larve. La morte è determinata da due criteri: l’immobilità o l’assenza di reazione a uno stimolo meccanico. Anche le larve non recuperate devono essere contate tra i decessi (è possibile che le larve morte all’inizio della prova siano state degradate da microbi). Dopo avere determinato il peso secco (senza ceneri) delle larve sopravvissute per ogni recipiente, si calcola il peso secco individuale medio per recipiente. Per determinare a quale stadio si trovano le larve sopravvissute si possono misurare le dimensioni della capsula cefalica di ogni individuo. Misurazioni analitiche Concentrazione della sostanza in esame 38. Occorre analizzare, come minimo, dei campioni dell’acqua sovrastante, dell’acqua interstiziale e del sedimento all’inizio della prova (di preferenza un’ora dopo l’applicazione della sostanza in esame) e alla fine, e ciò per la concentrazione massima e per una più bassa. La concentrazione della sostanza in esame ci informa sul comportamento/ripartizione della sostanza nel sistema acqua-sedimento. Dato che il prelievo di campioni di sedimento all’inizio della prova può perturbare l’impianto sperimentale (rimozione di larve, ad esempio), è opportuno usare dei recipienti supplementari per effettuare i rilievi analitici all’inizio ed eventualmente durante la prova (cfr. paragrafo 39). Non è necessario analizzare il sedimento se la ripartizione della sostanza in esame tra l’acqua e il sedimento è stata chiaramente determinata con uno studio acqua/sedimento condotto in condizioni analoghe (ad esempio, rapporto sedimento/acqua, tipo di applicazione, tenore di carbonio organico nel sedimento). 39. Quando si effettuano misurazioni intermedie (ad esempio, al settimo giorno) e se l’analisi richiede campioni voluminosi che non possono essere prelevati dai recipienti senza influire sull’impianto sperimentale, le determinazioni analitiche sono praticate su campioni prelevati dai recipienti supplementari trattati allo stesso modo (anche contenenti gli organismi di prova) ma non utilizzati per le osservazioni biologiche. 40. Per isolare l’acqua interstiziale si raccomanda di centrifugare i campioni, ad esempio, a 10 000 g e a 4oC per 30 minuti. Se però è dimostrato che la sostanza in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione. In alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile analizzare le concentrazioni nell’acqua interstiziale. Parametri fisici e chimici 41. Il pH, l’ossigeno disciolto nell’acqua di prova e la temperatura dei recipienti devono essere debitamente misurati (cfr. paragrafo 10). All’inizio e alla fine della prova è necessario misurare la durezza dell’acqua e il tenore di ammoniaca nei controlli e in un recipiente trattato alla concentrazione massima. DATI E RELAZIONE Trattamento dei risultati 42. Scopo di questa prova è determinare l’effetto della sostanza in esame sulla velocità di sviluppo e sul numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi oppure, nel caso della prova a 10 giorni, gli effetti sulla sopravvivenza e sul peso delle larve. Se nulla indica che i due sessi presentano differenze statistiche di sensibilità, ai fini dell’analisi statistica i risultati ottenuti sui maschi e sulle femmine possono essere raggruppati. Le differenze di sensibilità tra i sessi possono essere valutate statisticamente tramite, ad esempio, il test χ2-r x 2. La sopravvivenza delle larve e il peso secco individuale medio per recipiente devono essere determinati dopo 10 giorni, se del caso. 43. Le concentrazioni con effetto, espresse come concentrazioni nell’acqua sovrastante, sono calcolate di preferenza sulla base delle concentrazioni misurate all’inizio della prova (cfr. paragrafo 38). 44. Per effettuare una stima puntuale della CE50 o di qualsiasi altra CEX, le statistiche per recipiente possono essere usate alla stregua di repliche. Quando si calcola un intervallo di confidenza per una qualsiasi CEX occorre tener conto della variabilità tra i recipienti oppure dimostrare che tale variabilità è di entità trascurabile. Quando il modello è adattato mediante il metodo dei minimi quadrati, è necessario trasformare le statistiche per recipiente al fine di aumentare l’omogeneità della varianza. I valori della CEX devono però essere calcolati dopo che il risultato è stato ritrasformato nel suo valore originario. 45. Se l’analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC mediante la verifica di ipotesi, la variabilità tra i recipienti deve essere presa in considerazione, ad esempio con un’analisi ANOVA gerarchica. In situazioni dove non sussistono tutti i consueti presupposti per l’ANOVA si possono invece utilizzare test più robusti (21). Tasso di emergenza 46. I tassi di emergenza sono dati di tipo quantale e possono essere analizzati con il test di Cochran-Armitage applicato in modo regressivo se si ipotizza un rapporto dose-risposta monotonico e i tassi di emergenza corroborano questa ipotesi. In caso contrario, si può utilizzare un test esatto di Fisher o un test di Mantel-Haenszel con correzione dei valori p secondo Bonferroni-Holm. Se si osserva che la variabilità tra le repliche alla stessa concentrazione è maggiore di quanto una distribuzione binomiale indicherebbe (variazione spesso denominata “extrabinomiale”), si applicherà un test più potente (Cochran-Armitage o Fisher esatto) come proposto in (21). 47. Si determina la somma dei moscerini emersi per recipiente (ne) e la si divide per il numero di larve introdotte (na): dove: TE = tasso di emergenza ne = numero di moscerini emersi per recipiente na = numero di larve introdotte per recipiente 48. Un’alternativa più adatta ai campioni di grandi dimensioni, in presenza di varianza extrabinomiale, consiste nel trattare il tasso di emergenza come una risposta continua e adottare procedure quali il test di William, se si ipotizza che il rapporto dose-risposta sia monotonico e se i dati del tasso di emergenza corroborano tale ipotesi. Conviene utilizzare il test di Dunnett quando l’ipotesi di monotonicità è infondata. Ai fini di questa analisi un campione è considerato di grandi dimensioni quando il numero di moscerini emersi e il numero dei non emersi sono entrambi superiori a cinque per replica. 49. Prima di applicare i metodi ANOVA, occorre trasformare i valori del TE per la radice quadrata dell’arcoseno oppure secondo Freeman-Tukeylper ottenere una distribuzione prossima a quella normale e livellare le varianze. Il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione Bonferroni) oppure il test di Mantel-Haenszel possono essere impiegati quando si utilizzano delle frequenze assolute. La trasformazione con la radice quadrata dell’arcoseno consiste nel calcolare la funzione inversa del seno (seno-1) della radice quadrata del TE. 50. Per i tassi di emergenza, i valori della CEX sono calcolati con un’analisi di regressione [oppure probit (22), logit, Weibull, appositi software commerciali ecc.]. Se l’analisi di regressione è inconcludente (ad esempio, quando vi sono meno di due risposte parziali), si fa ricorso ad altri metodi non parametrici quali media mobile o interpolazione lineare. Velocità di sviluppo 51. Il tempo medio di sviluppo è il tempo medio intercorso tra l’introduzione delle larve (giorno 0 della prova) e l’emergenza della coorte sperimentale di moscerini (per calcolare il tempo reale di sviluppo si deve tenere conto dell’età delle larve al momento dell’introduzione). La velocità di sviluppo è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo (unità: 1/giorno) e consiste nella parte di sviluppo larvale che avviene quotidianamente. Per valutare la tossicità nei sedimenti si preferisce far riferimento alla velocità di sviluppo perché, rispetto al tempo di sviluppo, ha una varianza più bassa e valori più omogenei e più prossimi a una distribuzione normale. È anche per questo che si possono applicare test parametrici potenti, più adatti alla velocità di sviluppo che al tempo di sviluppo. Se la velocità di sviluppo è trattata come risposta continua, i valori della CEX possono essere stimati avvalendosi dell’analisi di regressione (ad esempio (23) (24)]. 52. Per i test statistici seguenti, il numero di moscerini osservati il giorno x è considerato essere emerso a metà dell’intervallo tra il giorno x e il giorno x - l (l = lunghezza dell’intervallo di osservazione, di solito 1 giorno). La velocità media di sviluppo per recipiente (x) è calcolata come segue: dove: : velocità media di sviluppo per recipiente i : indice dell’intervallo di osservazione m : numero massimo di intervalli di osservazione : numero di moscerini emersi nell’intervallo di osservazione i ne : numero totale di moscerini emersi alla fine dell’esperimento (= ) xi : velocità di sviluppo dei moscerini emersi nell’intervallo i dove: giornoi : giorno dell’osservazione (contato a partire dall’applicazione) li : lunghezza dell’intervallo d’osservazione i (espressa in giorni, di solito 1 giorno) Relazione sulla prova 53. La relazione sulla prova deve contenere almeno le seguenti informazioni: Sostanza in esame: — natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (idrosolubilità, tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel terreno — o nel sedimento, se noto —, stabilità nell’acqua ecc.), — identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula strutturale, numero CAS ecc.), purezza e metodo di analisi per la quantificazione della sostanza in esame. Specie in esame: — animali utilizzati: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento, — informazioni sulla manipolazione degli ammassi di uova e delle larve, — età degli animali al momento della loro introduzione nei recipienti di prova. Condizioni sperimentali: — sedimento utilizzato, ossia se naturale o artificiale, — per il sedimento naturale, ubicazione e descrizione del sito di campionamento e, se possibile, cronistoria della contaminazione; caratteristiche: pH, tenore di carbonio organico, rapporto C/N e granulometria (se del caso), — preparazione del sedimento artificiale: ingredienti e caratteristiche (tenore di carbonio organico, pH, umidità ecc. all’inizio della prova), — preparazione dell’acqua (se si utilizza acqua artificiale) e caratteristiche (concentrazione di ossigeno, pH, conduttività, durezza ecc. all’inizio della prova), — spessore del sedimento e profondità dell’acqua sovrastante, — volume dell’acqua sovrastante e dell’acqua interstiziale; peso del sedimento umido con e senza acqua interstiziale, — recipienti di prova (materiale e dimensioni), — metodo di preparazione delle soluzioni madre e delle concentrazioni in esame, — applicazione della sostanza in esame: concentrazioni utilizzate, numero di repliche e impiego di eventuali solventi, — condizioni d’incubazione: temperatura, fotoperiodo, intensità luminosa, aerazione (frequenza e intensità), — informazioni dettagliate sull’alimentazione, che comprendano il tipo di mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione. Risultati: — concentrazioni nominali sperimentali, concentrazioni sperimentali misurate e risultati di tutte le analisi condotte per determinare la concentrazione della sostanza in esame nel recipiente di prova, — qualità dell’acqua nei recipienti, ossia pH, temperatura, ossigeno disciolto, durezza e tenore di ammoniaca, — sostituzione dell’eventuale acqua evaporata nel corso della prova, — numero di moscerini maschi e femmine emersi, al giorno, per recipiente, — numero di larve non emerse come moscerini per recipiente, — peso secco individuale medio delle larve per recipiente, e per stadio larvale, se del caso, — percentuale di emergenza per replica e per concentrazione (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), — velocità media di sviluppo dei moscerini completamente emersi per replica e per concentrazione somministrata (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), — stime degli endpoint di tossicità, ad esempio CEX (e relativi intervalli di confidenza), NOEC e/o LOEC, e metodi statistici impiegati per determinarle, — discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute allo scostamento dal presente metodo di prova. BIBLIOGRAFIA (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). 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Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Appendice 1 DEFINIZIONI Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni: Sedimento artificiale, sintetico o formulato: una miscela di materiali usati per simulare i componenti fisici di un sedimento naturale. Acqua sovrastante: l’acqua al di sopra del sedimento nel recipiente di prova. Acqua interstiziale o soluzione circolante: l’acqua che occupa lo spazio tra il sedimento e le particelle di terreno. Acqua addizionata: l’acqua utilizzata per la prova alla quale è stata aggiunta la sostanza in esame. Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata utilizzando il presente metodo di prova. Appendice 2 Indicazioni per l’allevamento di Chironomus riparius 1. Le larve di Chironomus possono essere allevate in cristallizzatori o in grandi recipienti. Il fondo del recipiente è ricoperto di un sottile strato di sabbia di quarzo dello spessore di circa 5-10 mm. Anche il Kieselguhr (ad esempio l’articolo 8117 di Merck) ha dato prova di essere un substrato idoneo (nel qual caso basta uno strato ancora più sottile di pochi millimetri). Si aggiunge acqua di qualità adeguata ad un’altezza di vari centimetri, avendo cura di mantenere questo livello iniziale aggiungendo acqua in caso di evaporazione per prevenire il disseccamento. L’acqua può essere rinnovata completamente, se necessario. Fornire un’aerazione moderata. I recipienti di coltura devono essere situati in apposite gabbie per impedire la fuga degli adulti via via che emergono. La gabbia deve essere sufficientemente grande per consentire agli adulti emersi di sfarfallare, condizione imprescindibile per la copulazione (dimensioni minime: 30 × 30 × 30 cm). 2. Le gabbie devono essere tenute a temperatura ambiente, oppure a una temperatura costante di 20 ± 2 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce (a un’intensità luminosa di circa.1 000 lux) e 8 ore di buio. Da alcuni studi si è appreso che un’umidità relativa dell’aria inferiore a 60 % può impedire la riproduzione. Acqua di diluizione 3. Può essere utilizzata qualsiasi acqua naturale o sintetica di qualità adeguata. Di solito si impiega acqua di pozzo, acqua di rubinetto non clorata e mezzi artificiali (come Elendt M4 o M7, si veda di seguito). L’acqua deve essere aerata prima dell’uso. Se necessario, si può rinnovare l’acqua di coltura versando o sifonando l’acqua usata dai recipienti facendo attenzione a non distruggere i tubi delle larve. Alimentazione delle larve 4. Le larve di Chironomus sono nutrite con mangime per pesci in fiocchi (Tetra Min®, Tetra Phyll® o altra marca registrata equivalente), in dose giornaliera di circa 250 mg per recipiente. Il mangime può essere somministrato sotto forma di polvere macinata secca o in sospensione acquosa: aggiungere 1,0 g di fiocchi a 20 ml di acqua di diluizione e agitare la miscela per renderla omogenea. La dieta a base di questo preparato può consistere in 5 ml al giorno per recipiente (agitare prima dell’uso). La dose può essere più abbondante per le larve più vecchie. 5. L’alimentazione è adattata in funzione della qualità dell’acqua. Se il mezzo di coltura diventa torbido, occorre somministrare meno mangime. Le quantità di mangime introdotte nei recipienti vanno controllate scrupolosamente: se scarse faranno migrare le larve verso la colonna d’acqua, se