ALLEGATO I

Metodi di prova per l’individuazione e l’identificazione dell’organismo nocivo specificato di cui all’articolo 3, paragrafo 2

1. Prova mediante spore

Per l’individuazione e l’identificazione sono utilizzati sporangi estivi e spore a riposo, ottenuti dal terreno dopo la setacciatura o direttamente dal materiale vegetale.

2. Metodi di individuazione

Per l’estrazione dal terreno delle spore dell’organismo nocivo specificato è utilizzato uno dei seguenti metodi:

a) il metodo di setacciatura del terreno descritto da Pratt (1976) (1);

b) il metodo di setacciatura del terreno descritto da van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) la tecnica di centrifugazione zonale per l’analisi high-throughput dei campioni, descritta da Wander et al. (2007) (3).

3. Metodo di identificazione

Dopo l’estrazione le spore dell’organismo nocivo specificato sono identificate mediante uno dei seguenti metodi:

a) identificazione morfologica al microscopio ottico con un ingrandimento di 100x-400x;

b) PCR tradizionale utilizzando i primer sulla base di Lévesque et al. (2001) (4) e di van den Boogert et al. (2005) (5);

c) PCR in tempo reale utilizzando i primer e le sonde secondo van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) PCR in tempo reale utilizzando i primer e le sonde secondo Smith et al. (2014) (7).

4. Vitalità delle spore a riposo

La vitalità delle spore a riposo può essere determinata mediante un esame microscopico o un saggio biologico. La vitalità degli sporangi può essere determinata mediante un esame microscopico degli sporangi montati in lattofenolo o in acqua (Przetakiewicz 2015) (8). Gli sporangi con contenuto granuloso o con protoplasma leggermente arrotondato possono essere considerati vitali. Quelli permanentemente plasmolizzati o privi di contenuto visibile sono considerati morti.

In alternativa, o in caso di dubbio, può essere effettuato un saggio biologico, come descritto all’allegato IV, punto 3.

5. Determinazione dei patotipi

Per la determinazione dei patotipi sono necessarie escrescenze fresche.

L’inoculo per la prova è prodotto con uno dei seguenti metodi:

a) il metodo di SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), che consiste nei due seguenti passaggi: i) produzione di inoculo Il tessuto di escrescenze vecchie (scure) è ridotto in pezzi più piccoli ed essiccato all’aria a temperatura ambiente fino a che non diventa duro. Il tessuto indurito è macinato, manualmente o meccanicamente. Il materiale macinato è setacciato a secco, raccogliendo la frazione da 25 a 75 μm, e quindi estratto con il metodo del cloroformio di Pratt (1976)1; ii) produzione di escrescenze fresche Circa 10 mg di spore a riposo estratte sono spruzzati sulla superficie di 10 ml di acqua distillata sterile in una piccola piastra di Petri di plastica e incubati al buio a 20 °C fino alla germinazione. I tuberi di patata con piccoli germogli di lunghezza compresa tra 1 e 2 mm sono posti in contenitori di plastica trasparenti, rivestiti con carta bibula umida con i germogli marcati rivolti verso l’alto. I germogli sono circondati con un anello di vaselina sciolta utilizzando una siringa. L’anello deve essere ininterrotto e sufficientemente alto da trattenere la sospensione di spore senza che vi siano perdite. I 10 ml di spore a riposo germinanti sono diluiti ulteriormente a 20 ml con acqua sterile e posti all’interno degli anelli utilizzando una pipetta o una bottiglia spremibile fino a che il germoglio non è completamente sommerso dalla sospensione di spore. I contenitori di plastica sono chiusi con coperchi e incubati per 4 giorni a 10 °C, dopodiché i contenitori sono aperti, l’inoculo e gli anelli di vaselina sono rimossi e i contenitori sono spostati in una serra nebulizzata a una temperatura di 15-18 °C (16 ore di luce);

b) metodo di Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c) metodo di Potoček et al. (1991) (10);

d) metodo di Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble e Glynne 1970 (13)).

Per la determinazione di tutti i patotipi di cui è nota la rilevanza per l’Unione [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) e 38(Nevşehir)], è utilizzata una prova differenziale per rilevare l’infezione con diverse varietà della pianta specificata, come indicato nella tabella. La prova per rilevare l’infezione è effettuata secondo il protocollo di cui alla lettera d) (metodo di Glynne-Lemmerzahl).

Sensibilità selettiva delle cultivar di patata per la determinazione dei patotipi di S. endobioticum

Cultivar Patotipi di S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R «S»: suscettibile «R»: resistente *: indica una debole suscettibilità della varietà all’organismo nocivo S. endobioticum («presenza di placche di sori non necrotici senza formazione di escrescenze»).

(1) Pratt MA. 1976. «A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil». Annals of Applied Biology 82: 21-29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. «Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents». EPPO Bulletin 35: 25-31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. «A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil». European Journal of Plant Pathology 119: 165-174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001). «Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart». Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200-201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. «Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease». European Journal of Plant Pathology 113: 47-57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. «Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants». European Journal of Plant Pathology 126: 129-133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. «Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil». Phytopathology 104: 422-432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. «The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. from Poland». American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. «Testing potatoes for wart resistance». Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114-115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. «Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic». Ochrana Rostlin 27: 191-205.

(11) Glynne MD. 1925. «Infection experiments with wart disease of potatoes». Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34-60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. «A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance». Züchter 2: 288-297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. «Wart disease of potatoes». FAO Plant Protection Bulletin 18: 125-135.