Decisione della Commissione

del 21 febbraio 2002

recante modifica dell'allegato D della direttiva 90/426/CEE del Consiglio in ordine alle prove per la diagnosi della peste equina

[notificata con il numero C(2002) 556]

(Testo rilevante ai fini del SEE)

(2002/160/CE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

vista la direttiva 90/426/CEE del Consiglio, del 26 giugno 1990, relativa alle condizioni di polizia sanitaria che disciplinano i movimenti di equidi e le importazioni di equidi in provenienza dai paesi terzi(1), modificata da ultimo dalla decisione 2001/298/CE(2), in particolare l'articolo 23,

considerando quanto segue:

(1) L'allegato D della direttiva 90/426/CEE descrive la prova della fissazione del complemento da eseguire per diagnosticare la peste equina.

(2) Nel novembre 2000 il Laboratorio comunitario di riferimento di Algete, in Spagna, ha accolto la riunione annuale dei laboratori nazionali di riferimento per la peste equina degli Stati membri dell'Unione europea. Nel corso della riunione è stata fornita la prova scientifica del fatto che il test di fissazione del complemento attualmente descritto nell'allegato D della direttiva 90/426/CEE presenta gravi inconvenienti, in particolare perché permette di rivelare la presenza di anticorpi solo dopo un'infezione o vaccinazione recenti. Inoltre, in quasi tutti i laboratori della Comunità e nei principali paesi esportatori il test suddetto è stato sostituito dalla moderna metodica Elisa.

(3) Le prove di laboratorio accettate su scala internazionale per l'individuazione di anticorpi contro il virus della peste equina sono descritte nel Manuale sulle norme per le prove diagnostiche e i vaccini(3) dell'Ufficio internazionale delle epizoozie. L'attuale edizione fa tuttavia riferimento a una sola delle prove Elisa disponibili.

(4) È pertanto opportuno modificare l'allegato D della direttiva 90/426/CEE per tener conto degli sviluppi tecnici e delle norme approvate a livello internazionale.

(5) Le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato veterinario permanente,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:

Articolo 1

L'allegato D della direttiva 90/426/CEE è sostituito dal testo dell'allegato della presente decisione.

Articolo 2

Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.

Fatto a Bruxelles, il 21 febbraio 2002.

Per la Commissione

David Byrne

Membro della Commissione

(1) GU L 224 del 18.8.1990, pag. 42.

(2) GU L 102 del 12.4.2001, pag. 63.

(3) Capitolo 2.1.11, quarta edizione 2000.

ALLEGATO

"ALLEGATO D

Peste equina

DIAGNOSI

I reagenti necessari per la metodica immunoenzimatica (ELISA) di seguito riportata sono disponibili presso il Laboratorio comunitario di riferimento oppure presso i laboratori di riferimento dell'OIE per la peste equina.

1. TECNICA ELISA COMPETITIVA PER L'INDIVUAZIONE DI ANTICORPI NEI CONFRONTI DEL VIRUS DELLA PESTE EQUINA (AHSv) (PROVA OBBLIGATORIA)

La tecnica ELISA competitiva è usata per evidenziare la presenza di anticorpi specifici nei confronti del virus AHS nei sieri degli equidi di ogni specie. Il siero policlonale di cavia anti AHSv iperimmune nei confronti del virus della peste equina (in appresso, antisiero di cavia) è gruppo specifico ed è in grado di reagire con tutti i sierotipi conosciuti di AHSv.

La metodica si basa sul fatto che il siero in esame possa impedire il legame tra l'antigene AHSv e l'antisiero di cavia. Gli anticorpi anti-AHSv se presenti nel siero in esame andranno a competere con quelli dell'antisiero di cavia determinando una riduzione della reazione colorimetrica (dopo l'aggiunta di anti-IgG di cavia coniugati con un enzima e di substrato). Il siero in esame può essere saggiato singolarmente alla diluizione di 1:5 (metodo del test puntuale) o può essere titolato con diluizioni in serie (metodo di titolazione del siero). Si considerano positivi quei campioni che danno valori di inbizione superiori al 50 %.

Il protocollo operativo di seguito descritto è quello utilizzato dal laboratorio di riferimento regionale per la peste equina di Pirbright nel Regno Unito.

1.1. Procedura

1.1.1. Preparazione delle piastre

1.1.1.1. Far adsorbire le piastre ELISA con antigene AHSv estratto da colture cellulari infette e diluito in una soluzione tampone di carbonato/bicarbonato a pH 9,6. Incubare le piastre per una notte a 4 °C.

1.1.1.2. Lavare le piastre tre volte, riempiendo e svuotando i pozzetti con tampone fosfato (PBS), a pH 7,2-7,4, ed infine asciugarle su di un tampone di carta bibula.

1.1.2. Pozzetti di controllo

1.1.2.1. Nella colonna 1 dispensare 50 μl per pozzetto di siero positivo partendo dalla diluizione 1:5 e diluendo per raddoppio fino a 1/640, utilizzando come diluente una soluzione (tampone di bloccaggio) composta da 0,05 % (v/v) di Tween 20,5 % (w/v) polvere di latte scremato (Cadbury's MarvelTM) e 1 % (v/v) di siero di bovino adulto in PBS.

1.1.2.2. Dispensare 50 μl del siero di controllo negativo alla diluizione di 1/5 (10 μl di siero + 40 μl di tampone di bloccaggio) nei pozzetti A e B della colonna 2.

1.1.2.3. Dispensare 100 μl di tampone di bloccaggio nei pozzetti C e D della colonna 2 (bianco).

1.1.2.4. Dispensare 50 μl di tampone di bloccaggio nei pozzetti E, F, G e H della colonna 2 (controllo del siero iperimmune).

1.1.3. Metodo del test puntuale

1.1.3.1. Aggiungere una diluizione 1:5 di ogni siero nel tampone di bloccaggio ai pozzetti delle colonne dal numero 3 a 12 (10 μl di siero + 40 μl di soluzione bloccaggio).

oppure

1.1.4. Metodo di titolazione

1.1.4.1. Preparare una serie di diluizioni per raddoppio di ogni campione in esame (da 1:5 a 1:640) in soluzione di bloccaggio e quindi dispensare 50 μl di ciascuna diluizione negli otto pozzetti (A-H) delle colonne da 3 a 12.

quindi

1.1.5. Aggiungere 50 μl di antisiero di cavia, diluito in tampone di bloccaggio, in tutti i pozzetti della piastra ELISA tranne in quello del bianco (a questo punto tutti i pozzetti contengono un volume di 100 μl).

1.1.5.1. Incubare per un'ora alla temperatura di 37 °C in un agitatore di piastra.

1.1.5.2. Lavare le piastre tre volte e asciugare su carta bibula come descritto nel paragrafo 1.1.1.

1.1.5.3. Aggiungere 50 μl di siero di coniglio anticavia coniugato con perossidasi di rafano (HRP) prediluito in tampone di bloccaggio.

1.1.5.4. Incubare per un'ora alla temperatura di 37 °C in un agitatore di piastra.

1.1.5.5. Lavare le piastre tre volte e asciugare su carta bibula come come descritto nel paragrafo 1.1.1.

1.1.6. Cromogeno

Preparare la soluzione di cromogeno ODP (ODP = ortofenildiammina) secondo le istruzioni della ditta produttrice (0,4 mg/ml in acqua distillata sterile) subito prima dell'uso. Aggiungere substrato (perossido di idrogeno = H2O2) fino ad arrivare a una concentrazione finale di 0,05 % (v/v) (1/2000 di una soluzione di H2O2 al 30 %). Dispensare 50 μl della soluzione di OPD in ogni pozzetto e lasciare le piastre per 10 minuti a temperatura ambiente. Arrestare la reazione aggiungendo in ogni pozzetto 50 μl di acido solforico (H2SO4)1M.

1.1.7. Lettura

Leggere mediante lettura spettrofotometrica usando un filtro a 492 nm.

1.2. Espressione dei risultati

1.2.1. Usando un programma informatico stampare i valori di densità ottica (OD) e di percentuale di inibizione (PI) dei sieri di prova e di controllo a partire dal valore medio registrato nei quattro pozzetti del controllo del siero iperimmune di cavia. I dati espressi in valori OD e PI si utilizzano per stabilire se la prova è da ritenere valida. I limiti di controllo superiori (LCS) e inferiori (LCI) del siero iperimmune di cavia devono essere compresi tra i valori 1,4 e 0,4 di OD, rispettivamente. Il titolo del controllo positivo, che si basa su una percentuale di inibizione del 50 %, dovrebbe corrispondere a 1:240 (compreso tra 1:120 e 1:480). Qualora i controlli non rispettino i suddetti criteri, i risultati non possono essere presi in considerazione. Se il titolo del controllo positivo, tuttavia, è superiore a 1:480 ed i campioni di prova continuano ad essere negativi, in tal caso i campioni di prova negativi possono essere accettati.

I pozzetti contenenti il siero di controllo negativo in duplicato e i pozzetti del bianco in duplicato dovrebbero registrare valori IP compresi tra + 25 % e - 25 %, e tra + 95 % e + 105 %, rispettivamente. Quando si ottengono valori non compresi entro questi limiti, vuol dire che si è in presenza di un elevata colorazione di fondo di natura aspecifica che non invalida la prova.

1.2.2. Il valore soglia che discrimina un siero positivo da uno negativo (cut-off) è PI 50 %. Un siero che ha una PI superiore a 50 % del siero iperimmune di cavia è considerato positivo mentre uno che ha una PI inferiore al 50 % è considerato negativo.

I campioni che registrano valori PI al di sotto o al di sopra della soglia nei pozzetti in doppio sono da considerarsi dubbi e possono essere nuovamente analizzati con una prova secondo il metodo puntuale e di titolazione. I campioni positivi possono essere titolati per valutare il grado di positività.

Schema metodo qualitativo

>SPAZIO PER TABELLA>

C -= controllo negativo.

C += controllo positivo.

CC= controllo di cavia.

Schema metodo quantitativo

>SPAZIO PER TABELLA>

C -= controllo negativo.

C += controllo positivo.

CC= controllo di cavia.

2. PROVA ELISA INDIRETTA PER L'EVIDENZIAZIONE DI ANTICORPI NEI CONFRONTI DEL VIRUS DELLA PESTE EQUINA (AHSv) (PROVA OBBLIGATORIA)

La prova descritta è conforme a quella riportata nel capitolo 2.1.11 del Manuale sulle norme per le prove diagnostiche ed i vaccini dell'OIE, quarta edizione del 2000.

L'impiego come antigene della proteina ricombinante VP7, stabile e non infettiva conferisce a questa prova elevati livelli di sensibilità, specificità, accuratezza e sicurezza.

2.1. Procedura

2.1.1. Fase solida

2.1.1.1. Far adsorbire le piastre ELISA con la proteina VP7 ricombinante derivata dal sierotipo 4 del virus della peste equina (AHSv-4), diluita in tampone carbonato/bicarbonato, a pH 9,6. Incubare le piastre per una notte alla temperatura di 4 °C.

2.1.1.2. Lavare le piastre per cinque volte con acqua distillata contenente 0,01 % (v/v) di Tween 20 (soluzione di lavaggio). Scuotere piano le piastre su materiale assorbente per eliminare ogni residuo di lavaggio.

2.1.1.3. Saturare le piastre dispensando in ogni pozzetto 200 μl di tampone fosfato (PBS) contenente 5 % (w/v) di polvere di latte scremato (latte scremato in polvere Nestlé TM) e lasciare un'ora a 37 °C.

2.1.1.4. Eliminare la soluzione di saturazione e scuotere piano le piastre su materiale assorbente.

2.1.2. Campioni di prova

2.1.2.1. Dispensare i campioni di siero da saggiare ed i sieri di controllo positivi e negativi, precedentemente diluiti 1:25 in PBS con l'aggiunta di 5 % (w/v) di latte scremato in polvere e 0,05 % (v/v) di Tween 20, in quantità di 100 μl per pozzetto. Incubare per 1 ora alla temperatura di 37 °C.

Per la prova di titolazione, creare serie di diluizione per raddoppio a partire dalla diluizione 1:25 e dispensare, nella quantità di 100 μl per pozzetto, un siero per ogni colonna della piastra. Eseguire la stessa operazione per i controlli negativo e positivo. Incubare per 1 ora alla temperature di 37 °C.

2.1.2.2. Lavare le piastre come descritto al punto 2.1.1.2.

2.1.3. Coniugato

2.1.3.1. Aggiungere in ogni pozzetto 100 μl di gamma globulina anti-cavallo coniugata con perossidasi di rafano (HRP) diluita in PBS + 5 % di latte + 0,05 % di Tween 20, a pH 7,2. Incubare per 1 ora alla temperatura di 37 °C.

2.1.3.2. Lavare le piastre come descritto al punto 2.1.1.2.

2.1.4. Cromogeno/Substrato

2.1.4.1. Aggiungere in ogni pozzetto 200 μl di soluzione di cromogeno/substrato [10 ml di 80,6 mM di DMAB (dimetilamminobenzaldeide) + 10 ml di 1,56 mM di MBTH (3-metil-2-benzotiazolina idrazone idrocloruro) + 5 μl H2O2).

Bloccare dopo circa 5-10 minuti (prima che il controllo negativo inizi a colorarsi) la reazione colorimetrica aggiungendo 50 μl di H2SO4 3N.

Possono essere usati altri cromogeni come ABTS (2,2'-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico]), TMB (tetrametil benzidina), o OPD (orto-fenildiammina).

2.1.4.2. Leggere le piastre a 600 nm (o 620 nm).

2.2. Interpretazione dei risultati

2.2.1. Determinare il valore soglia (cut-off) aggiungendo 0,6 al valore di assorbanza del controllo negativo (0,6 è la deviazione standard ottenuta testando un gruppo di 30 sieri negativi).

2.2.2. I campioni di prova che danno valori di assorbanza (densità ottica) inferiori al valore soglia sono da considerarsi negativi.

2.2.3. I campioni di prova che danno valori di assorbanza (densità ottica) superiori al valore soglia sono da considerarsi positivi.

2.2.4. I campioni di prova che danno valori di assorbanza (densità ottica) intermedi sono da considerarsi dubbi e si deve applicare un altro metodo per confermare i risultati.

3. PROVA ELISA BLOCCANTE PER L'INDIVIDUAZIONE DI ANTICORPI DEL VIRUS DELLA PESTE EQUINA (AHSv) (PROVA OBBLIGATORIA)

Il test ELISA bloccante è usato per evidenziare la presenza di anticorpi specifici del virus AHSv nei sieri di ogni specie sensibile. La VP7 è la principale proteina antigenica del virus della peste equina e si conserva nei 9 sierotipi. Dato che anche l'anticorpo monoclonale è diretto contro la VP7, il saggio sarà caratterizzato da un elevato livello di sensibilità e specificità. L'antigene ricombinante VP7, inoltre, è del tutto innocuo e garantisce pertanto un'elevata sicurezza.

Alla base della prova vi è la mancata reazione tra la proteina ricombinante VP7, adsorbita alla piastra ELISA, ed il suo anticorpo monoclonale specifico. Gli anticorpi anti-AHSv, se presenti nel siero in esame, bloccheranno la reazione tra antigene ed anticorpo monoclonale determinando una riduzione della reazione colorimetrica.

La prova ELISA, di seguito descritta, è quella utilizzata dal laboratorio comunitario di riferimento per la peste equina ad Algete in Spagna.

3.1. Procedura

3.1.1. Piastre ELISA

3.1.1.1. Far adsorbire le piastre ELISA con la proteina VP7 ricombinante da AHSv-4, diluita in tampone carbonato/bicarbonato (pH 9,6). Incubare le piastre per una notte alla temperatura di 4 °C.

3.1.1.2. Lavare le piastre 5 volte con soluzione salina tamponata a fosfato contenente 0,05 % (v/v) di Tween 20 (PBST).

3.1.1.3. Stabilizzare la piastra con soluzione stabilizzante (per poterla conservare a lungo a + 4 °C senza perdita di attività) ed asciugare su materiale adsorbente.

3.1.2. Campioni di prova e controlli

3.1.2.1.

>SPAZIO PER TABELLA>

3.1.2.2.

>SPAZIO PER TABELLA>

3.1.3. Coniugato

Aggiungere a ciascun pozzetto 50 μl di Mab (anticorpo monoclonale specifico VP7) coniugato con perossidasi del rafano (HRP), precedentemente diluito, e mescolare delicatamente per avere una miscela omogenea. Incubare per 30 minuti alla temperatura di 37 °C.

3.1.4. Lavare le piastre 5 volte con PBST e asciugare come indicato più sopra.

3.1.5. Cromogeno/Substrato

Aggiungere in ogni pozzetto 100 μl di soluzione di cromogeno/substrato (1ml di ABTS (2,2'-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico]) 5 mg/ml + 9 ml di tampone substrato (fosfato-citrato 0,1M a pH 4 contenente 0,03 % di H2O2) ed incubare 10 minuti a temperatura ambiente. La colorazione viene arrestata aggiungendo ad ogni pozzetto 100 μl di una soluzione al 2 % (w/v) di SDS (sodio dodecilsolfato).

3.1.6. Lettura

Leggere i risultati con un lettore ELISA usando un filtro a 405 nm.

3.2. Interpretazione dei risultati

3.2.1. Validazione della prova

I risultati sono da considerare validi se la densità ottica (OD) del controllo negativo (NC) ha un valore superiore a 1,0 e la OD del controllo positivo (PC) è inferiore a 0,2.

3.2.2. Calcolo del valore soglia (cut-off)

Limite positivo=

>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>

Limite negativo=

>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>

dove NC è la OD del controllo negativo e PC è la OD del controllo positivo.

3.2.3. Interpretazione dei risultati

Si considerano positivi nei confronti del virus della peste equina quei campioni che hanno un valore di OD inferiore al limite positivo.

Si considerano negativi quelli che presentano un valore di OD superiore al limite negativo.

Quei campioni i cui valori di OD sono compresi tra il limite negativo ed il positivo sono da considerarsi dubbi. In questo caso è necessario prelevare altri campioni dagli animali a distanza di 2-3 settimane dal primo prelievo."