Regolamento (CEE) n. 72/77 della Commissione, del 13 gennaio 1977, recante modifica del regolamento (CEE) n. 1470/68 relativo al prelievo ed alla riduzione dei campioni nonché alla determinazione del tenore in olio, impurità ed umidità dei semi oleosi



Gazzetta ufficiale n. L 012 del 15/01/1977 pag. 0011 - 0024

edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 7 pag. 0218

edizione speciale greca: capitolo 03 tomo 16 pag. 0215

edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 7 pag. 0218

edizione speciale spagnola: capitolo 03 tomo 11 pag. 0104

edizione speciale portoghese: capitolo 03 tomo 11 pag. 0104



++++ REGOLAMENTO ( CEE ) N . 72/77 DELLA COMMISSIONE del 13 gennaio 1977 recante modifica del regolamento ( CEE ) n . 1470/68 relativo al prelievo ed alla riduzione dei campioni nonchù alla determinazione del tenore in olio , impurità ed umidità dei semi oleosi LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE , visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea , visto il regolamento n . 136/66/CEE del Consiglio , del 22 settembre 1966 , relativo all ' attuazione di un ' organizzazione comune dei mercati nel settore dei grassi ( 1 ) , modificato da ultimo dal regolamento ( CEE ) n . 1707/73 ( 2 ) , in particolare l ' articolo 26 , paragrafo 3 , considerando che è opportuno definire un metodo idoneo per determinare con precisione il tenore in acido erucico dei semi di colza e di ravizzone ; che , a tal fine , occorre modificare il regolamento ( CEE ) n . 1470/68 della Commissione , del 23 settembre 1968 , relativo al prelievo ed alla riduzione dei campioni nonchù alla determinazione del tenore in olio , impurità ed umidità dei semi oleosi ( 3 ) , modificato da ultimo dal regolamento ( CEE ) n . 3025/75 ( 4 ) ; considerando che le misure previste dal presente regolamento sono conformi al parere del comitato di gestione per i grassi , HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO : Articolo 1 Al regolamento ( CEE ) n . 1470/68 è aggiunto il seguente articolo 2 ter : « La determinazione del tenore in acido erucico di cui all ' articolo 4 del regolamento n . 282/67/CEE è effettuata secondo il metodo definiti nell ' allegato VI del presente regolamento . I semi di colza e ravizzone aventi il tenore massimo in acido erucico di cui all ' articolo 3 , paragrafo 2 , primo trattino , del regolamento n . 282/67/CEE sono quelli il cui olio , estratto in conformità del metodo definito nell ' allegato VI , titolo I , contiene al massimo il 15,0 % di acido erucico ( C 22 ) , calcolato secondo lo stesso metodo definito all ' allegato VI , titoli II e III » Articolo 2 Il regolamento ( CEE ) n . 1470/68 è completato mediante aggiunta dell ' allegato VI riportato nell ' allegato del presente regolamento . Articolo 3 Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla sua pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee . Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri . Fatto a Bruxelles , il 13 gennaio 1977 . Per la Commissione Il Vicepresidente Finn GUNDELACH ( 1 ) GU n . 172 del 30 . 9 . 1966 , pag . 6025/66 . ( 2 ) GU n . L 175 del 29 . 6 . 1973 , pag . 5 . ( 3 ) GU n . L 239 del 28 . 9 . 1968 , pag . 2 . ( 4 ) GU n . L 300 del 20 . 11 . 1975 , pag . 5 . ALLEGATO VI METODO DI ANALISI COMUNITARIO PER LA DETERMINAZIONE DEL TENORE DI ACIDO ERUCICO NEI SEMI PRESI IN CONSEGNA ALL ' INTERVENTO I . Preparazione del campione II . Preparazione degli esteri metilici degli acidi grassi III . Gascromatografia degli esteri metilici degli acidi grassi I . PREPARAZIONE DEI CAMPIONI 1 . Tanto il prelievi dei campioni dei semi , quanto la riduzione dei campioni per laboratorio in campioni per analisi , quanto infine la determinazione del tenore oleoso sul prodotto tal quale vengono effettuati secondo i metodi definiti rispettivamente agli allegati I , II e V del regolamento ( CEE ) n . 1470/68 . 2 . Preparazione del campione di olio estratto dai semi sottoposti a campionatura . 2.1 . Il campione è fluido e perfettamente limpido : prima di effettuare i prelievi , agitare il campione per motivi di precauzione . 2.2 . Il campione è fluido , ma torbido , oppure contiene un deposito : porre il campione in stufa , ad una temperatura di 50 ° C . Quando il campione ha raggiunto questa temperatura , agitarlo vigorosamente e lasciarlo decantare . Filtrare su carta , nella stufa , mantenendo la temperatura a 30 ° C . Il filtrato deve essere limpido . 2.3 . Il campione è solido : sistemarlo nella stufa mantenuta ad una temperatura di 10 ° C superiore a quella del punto di fusione presunto . Operare come al paragrafo 2.1 ( se campione fuso è limpido ) e come al paragrafo 2.2 ( se campione fuso è torbido oppure se contiene un deposito ) . II . PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI 1 . PREAMBOLO I presenti metodi riguardano la trasformazione delle sostanze di origine animale e vegetale , nonchù quella degli acidi grassi di ogni provenienza , in esteri metilici degli acidi grassi . Gli esteri metilici ottenute possono essere impiegati in diversi metodi che richiedono una siffatta trasformazione : gascromatografia , cromatografia su strato sottile , spettrofotometrica infrarosso ,... 2 . CAMPO D ' APPLICAZIONE I metodi descritti si applicano alle sostanze grasse di origine animale e vegetale . I metodi descritti al punto 3 si applicano alla preparazione degli esteri metilici degli acidi grassi aventi almeno 6 atomi di carbonio . In presenza di acidi grassi C6 e C8 e nel caso della preparazione di esteri destinati alla gascromatografia , è necessario non allontanare il solvente dalla soluzione di esteri metilici . Il metodo generale 3.1 può fornire erronei nei seguenti casi : - composti a funzioni ossigenate secondarie ( idrossica , idroperossica , chetonica , epossidica ) , - composti a funzione ciclopropanica e ciclopropenica , - composti polinsaturi coniugati e composti acetilenici , - cere , e in questo caso è preferibile usare uno dei metodi descritti al punto 3.2 . Tuttavia , le sostanze grasse contenenti siffatte funzioni in proporzioni molto basse ( olio di cotone , ed esempio ) possono essere analizzate secondo il paragrafo 3.1 . I fosfolipidi possono essere analizzati previa saponificazione ed esterificazione degli acidi grassi . L ' insaponificabile non viene eliminato e , se è presente in quantità rilevante , può interferire nelle analisi successive ( nota 1 ) . 3 . METODI DI PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI AD ALMENO 6 ATOMI DI CARBONIO Al paragrafo 3.1 , viene indicato un metodo generale di preparazione degli esteri metilici con l ' impiego del trifluoruro di boro e che deve essere usato di preferenza . Quando non è possibile far uso di questo metodo , al paragrafo 3.2 vengono descritti metodi sostitutivi . 3.1 . Metodo generale al trifluoruro di boro 3.1.1 . Principio Saponificazione dei glicediri , poi liberazione e esterificazione degli acidi grassi in presenza di trifluoruro di boro . 3.1.2 . Materiale - Palloni da 50 e da 100 ml a tappo smerigliato ; - Refrigerante diritto , di 20-30 cm di lunghezza con smerigliatura adattabile sul pallone ; - Regolatore di ebollizione esente da grassi ; - Tubatura per gorgoglio dell ' azoto ; - Pipetta graduata , della capacità di almeno 10 ml e peretta per pipetta oppure pipetta automatica ; -Provette a tappo smerigliato ; - Imbuti separatori da 250 ml . 3.1.3 . Reattivi - Soluzione metanolica di idrossido di sodio , circa 0,5 N : sciogliere 2 g di idrossido di sodio in 100 ml di metanolo non contenente più do 0,5 % ( m/m ) d ' acqua . Quando la soluzione dev ' essere usata per un periodo alquanto prolungato , si forma un pò di carbonato di sodio ( precipitato bianco ) che non influisce sulla preparazione degli esteri metilici ; - Soluzione metanolica di trifluoruro di boro , con tenore compreso tra 12 e 15 % ( m/m ). ( In commercio esistono soluzioni al 14 e al 50 % ) ( nota 2 ) Avvertenza : Il trifluoruro di boro è un composto Tossico . Per questo motivo si sconsiglia di prepararsi da soli la soluzione partendo da trifluoruro di boro e da matanolo ( nota 3 ) ; - Eptano , per cromatografia ( nota 2 , nota 4 ) ; - Etere di petrolio ridistillato ( P.e . 40 - 60° C ) , numero di bromo inferiore a 1 , esente da residuo , oppure esano ( nota 2 ) ; - Solfato di sodio anidro ; - Soluzione acquosa satura di cloruro di sodio ; - Rosso di metile , in soluzione allo 0,1 % ( m/v ) in etanolo al 60 % ( v/v ) ; - azoto , contenente meno di 5 mg di ossigeno per kg . 3.1.4 . Metodo operativo Effettuare le operazioni che seguono di preferenza sotto cappa , a causa delle proprietà tossiche del trifluoruro di boro . Lavare tutta la vetreria con acqua immediatamente dopo l ' uso . In presenta di oli e di acidi grassi con più di due doppi legami , si raccomanda di eliminare l ' aria contenuta nel metanolo e nel pallone facendo gorgogliare azoto per qualche minuto . Preparare il campione secondo« I . Preparazione dei campioni » . Non è necessaria una pesata esatta . La quantità delle sostanza da analizzare dev ' essere conosciuta unicamento per scegliere le dimensioni del pallone ed i quantitativi di reagenti , secondo la tabella seguente : Sostanza da analizzare mg * Pallone ml * NaOH 0,5 N ml * Soluzione metanolica di Bf , ml * 100 - 250 * 50 * 4 * 5 * 250 - 500 * 50 * 6 * 7 * 500 - 750 * 100 * 8 * 9 * 750 - 1000 * 100 * 10 * 12 * Nel caso in cui gli esteri metilici destinati all ' analisi gascromatografica , la sostanza da analizzare sarà du preferenza di circa 350 mg . Qualora essa fosse scarsa , sarà opportuno prendere precauzioni affinchè il campione prelevato sia rappresentativo ( nota 5 ) . 3.1.4.1 . Per gli oli ed i grassi Introdurre la sostanza da analizzare preparata nel pallone . Aggiungere il quantitativi indicato della soluzione metanolica di idrossido di sodio ed un regolatore di ebollizione . Adattare il refrigerante sul pallone . Portare ad ebollizione a ricadere fino a scomparsa delle goccioline di sostanza grassa ( questa operazione può durate 5-10 minuti , ma in taluni casi eccezionali può superare i 10 minuti ) . Nella miscela in corso di ebollizione aggiungere la quantit indicata della soluzione metanolica di trifluoruro di boro attraverso l ' estremità superiore del refrigerante e facendo suo della pipetta graduata munita di peretta oppure della pipetta automatica . Continuare l ' ebollizione per due minuti . Aggiungere alla miscela bollente 2-5 ml di eptano ( nota 4 ) attraverso l ' estremità superiore del refrigerante ( la quantità di eptano è senza importanza per la reazione ) e far bollire per un minuto . Allontanare dal pallone la fonte di calore , poi il refrigerante . Aggiungere un pò della soluzione satura di cloruro di sodio ed agitare dolcemente il pallone più volte , mediante rotazione . Continuare ad aggiungere soluzione satura di cloruro di sodio per far giungere il livello del liquido al collo del pallone . Trasferire circa 1 ml dello strato superiore ( soluzione eptanica ) in una provetta smerigliata ed aggiungere la quantità di solfato di sodio anidro necessaria per eliminare le tracce d ' acqua . Nel caso che la sostanza da analizzare, sia di 350 mg , la soluzione ottenuta contiene circa 5-10 % di esteri metilici e può essere iniettata direttamente nella colonna gascromatografica . Negli altri casi , diluire la soluzione eptanica per ottenere una concentrazione di 5-10 % in esteri metilici ( nota 6 ) . Per ottenere la totalità degli esteri anidri trasferire la soluzione salina e la fase eptanica in un imbuto separatore da 250 ml . Decantare . Estrarre la soluzione salina con 50 ml di etere di petrolio ( P.e.40 - 60 ° C ) o di esano . Ripetere una seconda volta l ' estrazione . Riunire la fase eptanica ed i due estratti e lavarli con porzioni di 20 ml d ' acqua fino a scomparsa dell ' acidità ( indicatore : rosso di metile ) . Essiccare con solfato di sodio anidro ed evapore il solvente a bagnomaria in corrente d ' azoto ( nota 6 , nota 7 ) . Per quantitativi di sostanza da analizzare inferiore a 500 mg , è preferibile ridurre proporzionalmente i volumi di solvente e d ' acqua . 3.1.4.2 . Per gli acidi grassi Se il campione è costituito unicamente da acidi , la saponificazione non viene effettuata . Introduire il quantitativo voluto di acidi grassi preparati nel pallone . Aggiungere il quantitativo prescritto della soluzione metanolica di trifluoruro di boro . Portare ad ebollizione per due minuti . Procedere quindi come indicato nel paragrafo 3.1.4.1 , dal punto : « Aggiungere alla miscela bollente ...» , 3.2 . Metodi sostitutivi che non fanno uso di trifluoruro di boro 3.2.1 . Per le sostanza grasse neutre ( I . A . < 2 ) 3.2.1.1 . Principio Metanolisi dei gliceridi in ambiente alcalino . 3.2.1.2 . Materiale - Agitatore che consenta di agitare rapidamente e dispositivo di riscaldamento adeguato ( ad esempio , agitatore magnetico riscaldante ) ; - Beuta conica o pallone da 100 ml , a collo smerigliato ; - Tubatura per gorgoglio d ' azoto ; - Refrigerante che possa essere adattato sulla beuta conica o sul pallone ; - Regolatore di ebollizione , esente da grassi ; - Imbuti separatori da 125 ml ; - Beuta conica , ad apertura stretta , da 50 ml . 3.2.1.3 . Reattivi - Metanolo , che non contenga più di 0,5 % ( m/m ) d ' acqua ; - Soluzione metanolica di idrossido di potassio circa N : sciogliere 5,6 g di idrossido di potassio in 100 ml di metanolo che non contenga più dello 0,5 % ( m/m ) di acqua ; - Eptano per cromatografia ( nota 2 , nota 4 ) ; - solfato di sodio anidro ; - Azoto contenente meno di 5 mg di ossigeno per kg . 3.2.1.4 . Metodo operativo In presenza di oli che contengono acidi con più di due doppi legami si raccomanda di eliminare l ' aria contenuta nel metanolo e nel pallone facendo gorgogliare azoto per qualche minuto . Preparare il campione . In una beuta conica o in un pallone da 100 ml introdurre circa 4 g ( nota 5 ) della sostanza grassa preparata . Aggiungere circa 40 ml di metanolo 0,5 ml della soluzione di idrossido di potassio ed un regolatore de ebollizione . Mettere sotto refrigerante a ricadere e portare ad ebollizione . La soluzione deve diventare limpida . La reazione si conclude in genere dopo circa 5-10 minuti . Nel caso di oli del tipo « olio di ricino » , la limpidezza non è un criterio di reazione ( nota 8 ) . Raffreddare in corrente d ' acqua e travasare in un imbuto separatore da 125 ml . Sciacquare la beuta e il pallone con 20 ml di eptano ( nota 4 ) e versali nell ' separatore . Aggiungere circa 40 ml d ' acqua e agitare e far decantare . Gli esteri di riuniscono nella fase eptanica superiore . Estrarre la fase acquosa una seconda volta con 20 ml di eptano . Riunire i due estratti e lavare due volte con 20 ml d ' acqua . Dopo la decantazione , essicare su solfato di sodio anidro la soluzione di esteri , filtrare su cotone ed evaporare eventualmente fino a 20 ml il solvente in bagnomaria bollente facendo gorgogliare azoto in una beuta conica da 50 ml ( nota 6 , nota 7 ) . 3.2.2 . Per le sostanza grasse acide ( I.a > 2 ) e per gli acidi grassi 3.2.2.1 . Principio Per le sostanza grasse acide , neutralizzazione degli acidi grassi liberi , metanolisi alcalina dei gliceridi , poi esterificazione degli acidi grassi in ambiente acido . Per gli acidi grassi , esterificazione in ambiente acido . 3.2.2.2 . Materiale - Agitatore rapido e dispositivo di riscaldamento adeguato ( ad esempio , agitatore magnetico riscaldante ) ; - beuta conica o pallone di 250 ml a collo smerigliato ; - Tubatura per gorgoglio d ' azoto ; - Refrigerante che possa essere adattato sulla beuta conica o sul pallone ; - Regolarizzatore di ebollizione , esente da grassi ; - Imbuti separatori da 250 ml ; - beuta conica , ad apertura stretta , da 100 ml . 3.2.2.3 . Reattivi - Soluzione di metilato di sodio ottenuta sciogliendo i g di sodio in 100 ml di metanolo che non contenga oltre le 0,5 % ( m/m ) d ' acqua ; - Soluzione metanolica di acido cloridrico anidro circa N [( vedi osservazioni 3.2.2.6 a ) e b )] ; - Eptano , per cromatografia ( nota 2 , nota 4 ) ; - Solfato di sodio anidro ; - Azoto , contenente meno di 5 mg di ossigeno per kg . 3.2.2.4 . Metodo per le sostanze grasse acide In presenza di oli contenenti acidi a più di sue doppi legami , si raccomanda di eliminare l ' aria contenuta nel metalono e nel pallone facendo gorgoliare azoto per qualche minuto . Preparare il campione secondo « I . Preparazione del campione » . In una beuta conica o in un pallone da 250 ml introdurre circa a g ( nota 5 ) della sostanza grassa preparata . Aggiungere 40 ml della soluzione di metilato di sodio ( vedi osservazione 3.2.2.6 c ) . Mettere sotto refrigerante a ricadere , agitare e portare ad ebollizione . La soluzione deve diventare limpida . Il che si verifica generalmente dopo una decina di minuti . La reazione è praticamente terminata dopo 15 minuti . Introdurre quindi nella beuta o nel pallone almeno 50 ml della soluzione cloridrica , poi portare nuovamente ad ebollizione per 10 minuti ( vedi osservazione 3.2.2.6 d ) . Raffreddare in corrente d ' acqua , aggiungere quindi nella beuta o nel pallone 100 ml d ' acqua , poi versare la miscela in un imbuto , separatore da 250 ml ed aggiungere 30 ml di eptano ( nota 4 ) . Agitare energicamente e lasciare decantare fino alla separazione completa delle due fasi . Raccogliere la fase eptanica . Estrarre la fase acquosa una seconda volta con 30 ml di eptano . Riunire i due estratti eptanici e lavarli più volte con acqua fino a reazione neutra . Dopo decantazione essicare su solfato di sodio . Filtrare su cotone ed evaporare eventualmente fino a 20 ml il solvente in bagnomaria bollente facendo gorgogliare azoto , in una beuta conica da 100 ml ( nota 6 , nota 7 ) . 3.2.2.5 . Metodo operativo per gli acidi grassi Per gli acidi , è necessario usare il seguente metodo operativo semplificato . In presenza di acidi grassi contenenti acidi a più di due doppi legami , si raccomanda di eliminare l ' aria contenuta nel metanolo e nel pallone facendo gorgogliare azoto per qualche minuto . Preparare il campione secondo « I . Preparazione del campione » . In una beuta conica o in pallone da 250 ml introdurre circa 4 g ( nota 5 ) della sostanza grassa preparata . Introdurre 50 ml della soluzione cloridrica ed un regolatore di ebollizione , adattare il refrigerante poi portare ad ebollizione per 10 minuti . Raffreddare in corrente d ' acqua , aggiungere quindi nella beuta o nel pallone 100 ml d ' acqua , poi versare la miscela in un imbuto separatore da 250 ml ed aggiungere 30 ml di eptano ( nota 4 ) . Agitare energicamente e lasciar decantare fino a completa separazione delle due fasi . Travasare la fase acquosa ed estraria una seconda volta con 30 ml di eptano . Riunire i due estratti eptanici e lavarli più volte con acqua fino a neutralità . Dopo la decantazione , essicare su solfato di sodio . Filtrare su cotone ed evaporare fino a 20 ml il solvente in bagnomaria bollente facendo gorgogliare azoto in una beuta conica da 100 ml ( nota 6 , nota 7 ) . 3.2.2.6 . Osservazioni a ) In laboratorio , è facile preparare piccoli quantitativi di acido cloridrico gassoso anidro per semplice spostamento dalla sua soluzione commerciale ( d = 1,18 ) aggiungendogli acido solforico concentrato ( d = 1,84 ) poco a poco . Il gas che si libera viene semplicemente disidratato facendolo gorgogliare in acido solforico . Dato che il metanolo è molto avido di gas cloridrico è bene prendere tutte le precauzioni d ' uso per lo scioglimento , ad esempio effettuando l ' introduzione del gas mediante un piccolo imbuto rovesciato che arriva fino all ' affioramento del livello del metanolo . Inoltre è possibile preparare anticipatamente quantitativi notevoli di soluzioni metanoliche cloridriche che si conservano perfettamente in flaconi smerigliati conservati all ' oscurità . b ) È possibile usare acidi solforico metanolico circa N invece dell ' acido cloridrico metanolico , ma la durata dell ' esterificazione dev ' essere di almeno 20 minuti e i precipitati di solfato di sodio ostacolano l ' ebollizione e impongono la filtrazione o l ' uso di un agitatore magnetico . c ) Prima di introdurre la sostanza da analizzare , è possibile altresi versare 40 ml di metanolo ed aggiungere 0,4 g di sodio , il che corrisponde alla preparazione estemporanea di una soluzione di metilato di sodio . d ) Nel caso di sostanze grasse molto acide , tenendo conto del quantitativo relativamente elevato di metilato di sodio , si ha un precipitato di cloruro di sodio che può provocare qualche schizzo durante l ' ebollizione che segue . È possibile filtrare il precipitato , ma ciò non è necessario a causa della breve durata del riscaldamento raccomandato . 4 . METODI SPECIALI PER LA PREPARAZIONE DEGLI ESTERI METILICI GRASSI AVENTI ALMENO 4 ATOMI DI CARBONIO 4.1 . Principio Gli esteri metilici vengono ottenuti facendo reagire una sostanza grassa con una soluzione metanolica di idrossido di potassio in una fase intermedia , prima che abbia luogo la saponificazione . 4.2 . Campo di applicazione Il metodo è principalmente destinato alla preparazione degli esteri metilici che devono essere analizzati mediante gascromatografia . Il metodo non si applica alle sostanze grasse acide ( numero d ' acidità > 2 ) . 4.3 . Materiale - Provette a tappo smerigliato da circa 20 ml ; - Beute tarate da 50 e da 100 ml ; - Pipette graduate da 1 ml ( o più ) ; - provette graduate da 10 ml . 4.4 . Reattivi - Soluzione metanolica di idrossido di potassio circa 2 N : sciogliere 11,2 g di idrossido di potassio in 100 ml di metanolo che non contenga più di 0,5 % ( m/m ) d ' acqua ; - Eptano , per cromatografia ( nota 2 , nota 4 ) : - Soluzione di riferimento I : in una beuta tarata da 50 ml pesare con l ' approssimazione di 0,1 mg 1 g di pentanoato di metile e portare a volume con eptano ; - Soluzione di riferimento II : in una beuta tarata da 100 ml pesare con l ' approssimazione di 0,1 mg 200 mg di pentanoato di metile e portare a volume con eptano . 4.5 . Metodo operativo Se è richiesto l ' ulteriore dosaggio dell ' acido butirrico mediante gascromatografia , si deve usare una soluzione di riferimento : la soluzione di riferimento I se il tenore presunto in acido butirrico è superiore all ' 1 % , la soluzione di riferimento II se quest ' ultimo è inferiore all 1 % . Qualora sia richiesta la determinazione della composizione in acidi grassi mediante gascromatografia , non è necessario esare una soluzione di riferimento . Preparare il campione secondo « I . Preparazione del campione » . In una provetta a tappo smerigliato di circa 20 ml pesare con l ' approssimazione di 1 mg 1 g del campione preparato . Aggiungere 10 ml di eptano con le provetta graduata . Con una pipetta graduata aggiungere 1,0 della soluzione di riferimento opportuna . Nota : Se non è richiesto il dosaggio dell ' acido butirrico non è necessario pesare il campione con l ' approssimazione di 1 mg nù aggiungere la soluzione di riferimento . Aggiungere 0,5 ml della soluzione metanolica di idrossido di potassio circa 2 N e mescolare il contenuto della provetta agitandola più volte finchù questo ultimo non diventa limpido . Ciò richiede 20 secondi . Quasi subito dopo questa chiarificazione , la soluzione diventa nuovamente torbida a seguito della separazione del glicerolo . La decantazione del glicerolo avviene rapidamente . Decantare lo strato superiore contenente gli esteri metilici . 5 . Note 1 . Se l ' insaponificabile è d ' ostacolo , diluire con acqua la soluzione ottenuta dopo saponificazione ed eliminare l ' insaponificabile mediante estrazione con ossido di etilène , esano od etere di petrolio nelle condizioni classiche . Acidificare la soluzione saponosa acquosa e separare gli acidi grassi . Preparare gli esteri metilici di questi ultimi secondo i procedimenti 3.1.4.2 oppure 3.2.3.5 . 2 . Al momento della gascromatografia degli esteri metilici , taluni reattivi , e soprattutto le soluzioni metanoliche di trifluoruro di boro , possono portare alla compara di picchi parassiti ( nella ragione C20 - C22 per le soluzioni metanoliche di trifluoruro di boro ) . Successivamente , ciascun nuovo , lotto di reattivo deve essere sperimentato preparando esteri metilici dell ' acido oleico puro , poi cromatografando questi ultimi . Se compare un picco parassita , il reattivo impiegato deve essere eliminato . I diversi reattivi non devono portare a picchi interferenti con quelli degli esteri metilici di acidi grassi nel corso della gascromatografia . 3 . Se è assolutamente indispensabile preparare una soluzione metanolica di trifluoruro di boro , a partire da trifluoruro di boro gassoso operare come segue : tarare beuta di 2 litri contenenti 1 litro di metanolo . Raffreddare in bagnomaria ghiacciato . Tenendo la beuta dentro il bagnomaria , far gorgogliare BF3 proveniente da una bombola a gas convogliandolo attraverso un tubo di vetro metanolo fino ad assorbimento di 125 g , operando sotto cappa . Far passare la corrente di BF3 nel tubo di vetro prima di immergere questo ultimo nel metanolo e fino al momento di ritirarlo , allo scopo di prevenire il riflusso del liquido nel sistema di espansione del gas . Il gas non dovrebbe ; defluendo troppo rapidamente dalla beuta , dare fumo bianco . Il reattivo è stabilire per due anni . 4 . L ' eptano ( miscela i isomeri C7 puri controllati per via gascromatografica ) può essere sostituito con esano in essenza di acidi grassi ad almeno 20 atomi di carbonio . 5 . Se non si dispone della quantità di sostanza da analizzare prevista , quest ' ultima può essere ridotta a 10 mg ed anche meno , a condizione di diminuire proporzionalmente i volumi di reattivi e la capacità della apparecchiatura . 6 . Di preferenza , gli esteri metilici devono essere analizzati il più rapidamente possibile . Se è necessario , la soluzione eptanica contenente gli esteri metilici può essere conservata in gas e in frigorifero . Per una conservazione di lunga durata , è sospicabile proteggere gli esteri metilici contro l ' autossidazione aggiungendo alla soluzione un antiossidande ad una concentrazione che non interferisca nelle analisi successive , ad esempio 0,0005 % ( m/v ) di B.H.T . ( di t-butil-2,6 metil-4 fenolo ) . Se è necessario , gli esteri metilici anidri e senza solvente possono eventualmente essere conservati 24 ore sotto gas inerte in frigorifero oppure più a lungo in tubo chiuso sotto vuoto in congelatore . 7 . Vi è il rischio di perdere una parte degli esteri metilici più volatili se l ' eliminazione del solvente è prolungata o se la corrente di azoto è troppo vigorosa . Per la spettrofotometria infrarossa , questa eliminazione di solvente deve essere la più completa possibile . Per ma gascromatografia è preferibile non eliminare il solvente . 8 . Nel caso di oli del tipo « olio di ricino » , la limpidezza non è un criterio di reazione . III . GASCROMATOGRAFIA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI 1 . PREAMBOLO Il presente metodo intende impartire direttive generali per le determinazione gascromatografica della composizione qualitativa a quantitativa di una miscela di esteri metilici di acidi grassi ottenuta secondo il titolo II . Gli acidi grassi polimerizzati non sono analizzabili col presente metodo . Le prescrizioni fornite riguardano la consueta attrezzatura per gascromatografia , con colonna di riempimento e rivelatore a ionizzazione di fiamma ( nota 1 ) . 2 . MATERIALE 2.1 . Apparecchiatura per gascromatografia È idonea ogni apparechiatura che garantisca l ' efficacia e la risoluzione definite al paragrafo 4.1.2 . 2.1.1 . Dispositivo di iniezione Il dispositivo deve avere il più basso volume morto possibile . Salvo il caso di impossibilità materiale , esso sarà portato a una temperatura superiore di 25-50 ° C a quella della colonna . 2.1.2 . Stufa La stufa deve essere in grado di portare le colonne a una temperatura di almeno 220 ° C e di mantenere la temperatura scelta con l ' approssimazione di 1 ° C . Qualora vengano usate condizioni programmate , si Consiglio di scegliere un apparecchio a doppia colonna . 2.1.3 . Colonna 2.1.3.1 . Tubo Tubo in materiale inerte nei confronti delle sostanza : vetro o , in sua mancanza , acciaio inossidabile ( nota 2 ) . Lunghezza : 1-3 m . Una colonna relativamente corta sarà usata presenti acidi grassi a catena lunga ( > C20 ) . Nel caso della determinazione degli acidi a C4 e C6 , si raccomanda di usare una colonna di 2 m . Diametro interno : 2-4 mm . 2.1.3.2 . Riempimento Supporto : terra di diatomee lavata con acidi e silanizzata o qualsiasi altro supporto inerte idoneo , con una stretto intervallo granulometrico ( 25 m tra 125 e 200 m ) , dove il valore medio è legato al diametro interno e alla lunghezza della colonna . Fase stazionaria : fase polare di tipo poliestere ( P.e . polisuccinato di dietilenglicole , polisuccinato di butandiolo , poliadipato di etilenglicole ) , o qualsiasi altra fase che risponda alle esigenze seguenti ( P.e . cianosilicone ) . Il tasso di impregnazione darà compreso tra 5 e 20 % . Per talune separazioni , potranno essere usate fasi apolari . 2.1.3.3 . Condizionamento Dopo aver disinserito , se possibile , la colonna dal rivelatore , portare la stufa dell ' apparecchio a 10 ° al di sopra della temperatura di lavoro e mantenere la colonna testù preparata in corrente di gas inerte di 20 - 60 ml/min almeno 16 ore a questa temperatura , poi per 2 ore ad una temperatura di 195 ° C . 2.1.4 . Rivelatore Di preferenza , il rivelatore sarà tale da poter essere portato a una temperatura superiore a quella della colonna . I particolari operativi precisati qui di seguito riguardano l ' uso di un rivelatore a ionizzazione di fiamma ( nota 1 ) . 2.2 . Siringa Siringa di 10 l a massimo , divisa in decimi di l . 2.3 . Registratore Quando la curva registrata viene usata per calcolare la composizione della miscela analizzata , il registratore deve essere un apparecchio elettronico di grande precisione . Le caratteristiche del registratore devono essere compatibili con l ' apparecchiatura usata : - velocità di riposta inferiore a 1,5 sec . , di preferenza a 1 sec . ( la velocità di riposta è il tempo necessario affinchù la punta scrivente del registratore vada da 0 al 90 % al momento dell ' introduzione momentanea di un segnale di 100 % ) ; - larghezza della carta : minimo 25 cm ; - velocità di svolgimento della carta : 25-150 cm/h . 2.4 . Integratore o calcolatore ( facoltativo ) L ' uso di un integratore elettronico o di un calcolatore consente un calcolo rapido e preciso . Quest ' ultimo deve fornire una riposta lineare , avere una sensibilità sufficiente e la correzione della deviazione della linea di base deve essere soddisfacente . 3 . REATTIVI - gas vettore : gas inerte ( azoto , elio , argo ... ) molto ben disidratato e contenente meno di 10 ppm di ossigeno ; - gas ausiliari : idrogeno al 99,9 % minimo e non contenente prodotti , aria od ossigeno non contenente prodotti organici ; - prodotti di taratura : miscela di esteri metilici o esteri di un olio di composizione nota , se possibile vicina a quella della sostanza grassa da analizzare . 4 . METODO OPERATIVO 4.1 . Registrazione dell ' apparecchio 4.1.1 . Determinazione delle condizioni ottimali di lavoro Per scegliere le condizioni di lavoro , è necessario tener conto delle seguenti varianti : - lunghezza e diametro della colonna ; - natura e quantità della fase stazionaria ; - temperatura della colonna ; - erogazione del gas vettore ; - risoluzione suspicata ; - quantità della sostanza da analizzare ; - durata dell ' analisi . La quantità della sostanza da analizzare sarà scelta in modo che il complesso rivelatore-elettrometro fornisca una risposta lineare . In generale , i seguenti valori saranno quelli che danno i risultati, desiderati , e cioù numero di piatti teorici per lo stearato di metile almeno eguale a 2 000 ed eluizione di quest ' ultimo in circa 15 minuti : Diametro interno della colonna * Velocità del gas vettore * 2 mm * 15-25 ml/min * 3 mm * 20-40 ml/min * 4 mm * 40-60 ml/min * Concentrazione della fase stazionaria * Temperatura * 5 per cento * 175 ° C * 10 per cento * 180 ° C 15 per cento * 185 ° C * 20 per cento * 185 ° C * Quando l ' apparecchio lo consente , l ' iniettore sarà a una temperatura prossima ai 200 ° C ed il rivelatore a una temperatura eguale o superiore a quella della colonna . L ' erogazione di idrogeno del rilevatore a ionizzazione di fiamma è in generale di circa la metà di quella del gas vettore ; quella dell ' ossigeno è 5-10 volte quella dell ' idrogeno . 4.1.2 . Determinazione dell ' efficacia e della risoluzione Effettuare l ' analisi di una miscela di stearato e di oleato di metile in proporzioni sensibilmente equivalenti ( ed esempio , esteri metilici del burro di cacao ) . L ' entità della sostanza da analizzare , la temperatura della colonna e l ' erogazione del gas vettore saranno scelti in modo che il massimo del picco dello stearato di metile sia registrato circa 15 minuti dopo il pocco del solvente e che questo picco corrisponda a circa i 3/4 della scala totale . Calcolare il numero di piatti teorici n ( efficacia ) con la formula : vedi G.U e la risoluzione R con la formula : vedi G.U 4.2 . Analisi La sostanza da analizzare sarà di 0,1-2 l della soluzione eptanica degli esteri metilici ottenute secondo il titolo II . Nel caso di esteri esenti da solvente , farne una soluzione al 10 % circa in eptano e iniettare 0,1-1 l di quest ' ultimo . Per le ricerca di costituenti presenti allo stato di tracce , la quantità di sostanza da analizzare potrà essere aumentata ( fino a 10 volte ) ; nei casi consueti le condizioni operative saranno quelle di cui al punto 4.1.1 . Tuttavia sarà possibile operare con una temperatura di colonna più bassa nel caso in cui sia necessario dosare acidi grassi inferiori a C12 , o più elevata qualora sia necessario dosare acidi grassi superiori a C20 . Eventualmente è possibile operare in temperatura programmata precedenti . Ad esempio , se il campione a 100 ° C ( o a 50-60 ° C se è presente l ' acido butirrico ) e programmare immediatamente di 4-8° C/min fino alla temperatura ottimale . In taluni casi i due procedimenti possono essere combinati : dopo il periodo di programmazione di temperatura, continuare l ' eluizione a temperatura costante fino ad eluizione di tutti i costituenti . Se l ' apparecchio non può funzionare a temperatura programmata , operare a due temperature fisse da 100 ° C e 195 ° C . Se necessario , si raccomanda di eseguire un ' analisi su due fasi fisse di polarità diverse per verificare l ' assenza di picchi mascherati , ad esempio per gli oli di pesce , oppure nel caso della presenza simultanea di C18:3 e C20:0 o di C18:3 e di C18:2 coniugati . 5 . ESPRESSIONE DEI RISULTATI 5.1 . Analisi qualitativa In condizioni operative identiche a quelle della prova , analizzare la miscela di riferimento , di composizione nota , e determinare le distanze di ritenzione ( o i tempi di ritenzione ) per gli acidi costitutivi . Tracciare le curve che danno il logaritmo della distanza di ritenzione ( o del tempo , di ritenzione ) in funzione del numero di atomi di carbonio ; in condizioni isotermiche e per esteri a catena diritta e tasso di insaturazione fisso , queste curve tracciate su carta semilogaritmica devono essere rette sensibilmente parallele . Per la prova , identificare i picchi facendo riferimento alle suddette rette , all ' occorrenza interpolando . È necessario evitare condizioni operative tali che esistano « picchi mascherati » , cioè che due costituenti non possano essere distinti a seguito di una risoluzione insufficiente . 5.2 . Analisi quantitativa 5.2.1 . Determinazione della composizione Usare il metodo di normalizzazione interno ( salvo eccezioni ) , cioè ammettere che la totalità dei costituenti presenti nel campione è rappresentata sul cromatogramma , dunque che la somma delle aree di picchi rappresenta 100 per conto dei costituenti ( eluizione totale ) . Se l ' apparecchiatura contiene un ' integratore , usare le cifre fornite da quest ' ultimo . Nel caso contrario , determinare l ' area di ciascun picco per triangolazione moltiplicando l ' altezza di quest ' ultimo per la sua larghezza a metà altezza , tenendo eventualmente conto diverse attenuazioni usate durante la registrazione . 5.2.1.1 . Caso generale In assenza di importanti costituenti inferiori a C8 , calcolare il tenore in costituente , espresso in percentuale di esteri metilici , determinando la percentuale rapprentata dall ' area del picco corrispondente rispetto alla somma delle aree della totalità dei picchi : Vedi G.U . 5.2.1.2 . Uso dei fattori di correzione In taluni casi , soprattutto in presenta di acidi inferiori a C8 o di acidi a funzioni secondarie e quando si fa uso dei rivelatori a conducibilità termica , è necessario far intervenire fattori di correzione per convertire le percentuali delle aree e dei picchi in percentuali in massa dei costituenti . Determinare i fattori di correzione mediante un cromatogramma ottenuto da un miscela di riferimento di esteri metilici di composizione esattamente nota in condizioni operative identiche a quelle della prova . Per la suddetta miscela di riferimento : vedi G.U . Il cromatogrammma ottenuto dalla miscela di riferimento permette di calcolare quanto segue : vedi G.U . Dove : Vedi G.U . Abitualmente , i fattori di correzione vengono ricondotti a K16 = 1 e i fattori relativi diventano : Vedi G.U . Per il campione , il tenore di ciascun costituente è dato da : Vedi G.U . espresso in esteri metilici . 5.2.1.3 . Uso di uno standard interno In taluni casi ( soprattutto dosaggio degli acidi C4 e C6 e dosaggio degli acidi nel caso in cui tutti gli acidi grassi non siano eluiti ) , è necessario usare uno standard interno ( rispettivamente C5 e C15 o C17 ) e seguito determinare il fattore di correzione dello standard interno . Vedi G.U . m5 = massa dello standard interno in mg ; m = massa del campione in mg ; K5 = fattore di correzione dello standard interno ; A5 = area dei picco corrispondente allo standard interno ; A1 = area del picco corrispondente al composto i . 5.2.2 . Espressione dei risultati Esprimere il risultato con : 3 cifre significative al di sopra del 10 per cento , 2 cifre significative tra l ' 1 e il 10 per cento , 1 cifra significativa al di sotto dell ' 1 per cento , cioè in ogni caso con una cifra dopo la virgola . 5.2.3 . Ripetibilità La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate lo stesso giorno con lo stesso apparecchio dalla stessa persona e sugli stessi esteri e per i costituenti presenti a più del 5 % non deve eccedere , in valore relativo , 3 per conto relativo del valore determinato , con un massimo assoluto dell ' 1 per cento . Per i costituenti presenti a meno del 5 % , la ripetibilità diventa rapidamente meno buona in valore relativo quando il tenore diminuisce . 5.2.4 . Riproducibilità La differenza tra i risultati ottenuti in due laboratori diversi per i costituenti presenti in misura superiore al 5 per cento non deve superare in valore relativo 10 per cento del valore determinato , con un massimo assoluto di 3 per cento . Per i costituenti presenti in misura inferiore al 5 per cento , la riproducibilità diventa rapidamente meno buona in valore relativo quando il tenore diminuisce . 6 . NOTE 1 . Può essere usato un apparecchio di gascromatografia con un rivelatore a conducibilità a termica ( catarometro ) . Le condizioni descritte devono allora essere modificate come segue : Tubo : * lunghezza 2 - 4 m - diametro interno 4 mm ; * Supporto : * granulometria tra 160 e 200 m ; * Tasso di impregnazione : * 15 - 25 per conto ; * Gas vettore : * elio , o in sua mancanza , idrogeno , col tenore in ossigeno più debole possibile ; * * niente gas ausiliari ; * temperatura dell ' iniettore : * 40° C - 60° C superiore a quello della colonna ; * Temperatura della colonna : * 180° C - 200° C ; * Erogazione dei gas vettori : * generalmente compresa tra 60 e 80 ml/min ; * Quantitativi iniettati : * generalmente tra 0,5 e 2 l . * Per l ' analisi quantitativa , tener conto dei fattori di correzione definiti al paragrafo 5.2.1.2 . 2 . Se sono presenti costituenti poliinsaturi a più di tre doppi legami , un tubo in acciaio inossidabile può provocare decomposizioni di questi ultimi .