6.

A VII. melléklet helyébe a következő szöveg lép: „VII. MELLÉKLET A 2-GLICERIL MONOPALMITÁT SZÁZALÉKÁNAK MEGHATÁROZÁSA 1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET Ez a módszer a palmitinsav-tartalom meghatározásának analitikus eljárását írja le a trigliceridek 2-pozícióján, a 2-gliceril monopalmitát százalékának értékelésének segítségével. A módszer a szobahőmérsékletű (20 °C), folyékony növényi olajokra alkalmazható. 2. ALAPELV Az előkészítés után az olajminta reakcióba lép a pankreatin-lipázzal: a triglicerid molekula 1- és 3-pozícióján végbemenő részleges és specifikus hidrolízis nyomán elválasztódnak a 2-pozíción lévő monogliceridek. A monoglicerid-frakción belül a 2-gliceril monopalmitát százalékát – a szililesedés után – kapilláris gázkromatográfia segítségével határozzuk meg. 3. BERENDEZÉS ÉS LABORATÓRIUMI ESZKÖZÖK 3.1. 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombik 3.2. 100, 250 és 300 ml térfogatú főzőpoharak 3.3. 21–23 mm belső átmérőjű, 400 mm hosszú kromatográfiás üvegoszlop összesütött üveglemezzel a csapnál 3.4. 10, 50, 100 és 200 ml térfogatú kalibrált kémcsövek 3.5. 100 és 250 ml térfogatú gömbölyű fenekű lombik 3.6. Forgó párologtató 3.7. 10 ml térfogatú, kúpos aljú centrifugakémcső csiszolt üvegdugóval 3.8. Laboratóriumi centrifuga 10 és 100 ml térfogatú kémcsövekkel 3.9. A hőmérsékletet 40 °C + 0,5 °C-on tartó termosztát 3.10. 1 és 2 ml térfogatú mérőpipetták 3.11. 1 ml-es fecskendő 3.12. 100 μl-es mikrofecskendő 3.13. 1 000 ml-es tölcsér 3.14. Gázkromatográf kapilláris oszloppal, az alábbiakból álló, közvetlenül az oszlopra történő injektálásra alkalmas»on column« rendszerrel, valamint a kiválasztott hőmérsékletet 1 °C pontossággal tartó kemencével felszerelve 3.15. Közvetlenül az oszlopba vezetett, »on column« hideg befecskendező rendszer 3.16. Lángionizációs detektor és elektrométer 3.17. Regisztráló-integrátor berendezés az elektrométerrel történő használatra, amelynek a válaszideje nem haladja meg az egy másodpercet, és változtatható papírsebességű 3.18. Üvegből vagy ömlesztett szilícium-dioxidból készült, 8–12 méter hosszúságú, 0,25–0,32 mm belső átmérőjű, 5 % 0,10–0,30 μm rétegvastagságú metil-polisziloxánnal vagy fenil-metil-polisziloxánnal bélelt kapilláris oszlop, amely 370 °C-on használható 3.19. 10 μl-es, legalább 7,5 cm hosszú mikrofecskendő keményített tűvel, közvetlenül az oszlopra történő injektáláshoz. 4. REAGENSEK 4.1. 0,063 és 0,200 mm közötti szemcsenagyságú szilikagél (70/280 mesh), a következőképpen elkészítve: helyezze a szilikagélt egy porcelán csészébe, 160 °C-os kemencében szárítsa ki 4 órán keresztül, majd hagyja kihűlni szobahőmérsékleten egy szárítóban. Adjon hozzá a szilikagél súlya 5 %-ának megfelelő vízmennyiséget a következőképpen: egy 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban mérjen le 152 g szilikagélt, adjon hozzá 8 g desztillált vizet, dugaszolja be, majd óvatosan rázza fel, hogy a víz egyenletesen oszoljon el. Felhasználás előtt hagyja állni legalább 12 óráig. 4.2. n-hexán (kromatográfiai minőségű) 4.3. Izopropanol 4.4. Izopropanol, vízoldat 1/1 (V/V) 4.5. Pankreatin lipáz. A felhasznált lipáznak 2,0 és 10 lipáz egység/mg lipáztevékenységet kell mutatnia (Kereskedelmi forgalomban is kaphatók 2 és 10 lipáz egység/enzim mg lipáztevékenységet mutató pankreatin lipázok.) 4.6. Tris-hidroximetilaminometán-pufferoldat: 1 M vizes oldatát állítsa be pH 8 értékűre koncentrált HCl (sósav) (1/1 V/V) hozzáadásával (ellenőrizze potenciométerrel) 4.7. Nátrim-kolát (enzim minőségű), 0,1 %-os vizes oldat (ezt az oldatot az elkészítését követő 2 héten belül fel kell használni) 4.8. Kalcium-klorid, 22 %-os vizes oldat 4.9. Dietil-éter kromatográfiához 4.10. Kifejlesztőoldat: n-hexán/dietil-éter keverék (87/13) (V/V) 4.11. Nátrium-hidroxid, (súlyra) 12 %-os oldat 4.12. Fenolftalein, 1 %-os etanol oldat 4.13. Vivőgáz: hidrogén vagy hélium, gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú 4.14. Segédgázok: hidrogén, minimum 99 %-os, nedvességtől és szerves szennyeződésektől mentes, illetve levegő, szintén gázkromatográfiai felhasználáshoz megfelelő tisztaságú 4.15. Szilanizációs reagensek: 9/3/1 (V/V/V) arányú piridin-hexametildiszilizin-trimetilkloroszilán keverék. A használatra kész oldatok kereskedelmi forgalomban kaphatók; egyéb szilanizációs reagensek is felhasználhatók, mint például N, 0–bis (trimetilszilil) trifluoroacetamid + 1 % trimetilkloroszilán azonos térfogatú víztelen piridinnel való keveréshez. 4.16. Referenciaminták: tiszta monogliceridek, vagy olyan monoglicerid-keverékek, amelyeknek ismert, a mintához hasonló százalékos összetételük van. 5. ELJÁRÁS 5.1. A minta előkészítése 5.1.1. A 3 %-nál kisebb szabad savasságú olajokat nem szükséges semlegesíteni a szilikagéllel elvégzett oszlopkromatográfia előtt. A 3 %-nál nagyobb szabad savasságú olajokat az 5.1.1.1. pontnak megfelelően semlegesíteni kell. 5.1.1.1. Töltsön az 1 000 ml-es tölcsérbe (3.13.) 50 g olajat és 200 ml n-hexánt. Adjon hozzá 100 ml izopropanolt, és az olaj 5 %-kal megemelt szabad savasságának megfelelő mennyiségű 12 %-os nátrium-hidroxid oldatot (4.11.). Egy percen keresztül rázza erőteljesen. Adjon hozzá 100 ml desztillált vizet, majd rázza fel ismét, ezután hagyja leülepedni. A leválasztást követően távolítsa el az alsó szappanréteget. Távolítsa el az esetleges többi réteget (nyálka, oldhatatlan anyag) is. Mossa át a semlegesített olaj hexánoldatát többször 50–60 ml 1/1 (V/V) izopropanol/víz oldatban (4.4.), amíg a fenolftalein rózsaszín árnyalata el nem tűnik. A hexán nagyobbik részét távolítsa el vákuum alatt végzett bepárlással (használjon például forgó párologtatót), és töltse át az olajat egy 100 ml-es gömbölyű lombikba (3.5.). Szárítsa ki az olajat vákuumban, amíg az oldószer teljesen el nem távozik. Az eljárás végén az olaj savasságának 0,5 %-nál alacsonyabbnak kell lennie. 5.1.2. A fent leírtak szerint előkészített olajból 1,0 g-ot töltsön egy 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikba (3.1.), és oldja fel 10 ml kifejlesztőoldatban (4.10.). Hagyja leülepedni az oldatot legalább 15 percen keresztül, a szilikagéllel végzett oszlop-kromatográfia előtt. Ha az oldat zavaros, centrifugázza ki, a kromatográfiához szükséges optimális feltételeket teremtve. (Használatra kész, 500 mg-os SPE szilikagél hüvelyek is felhasználhatók a célra). 5.1.3. A kromatográfiás oszlop előkészítése Öntsön az oszlopba (3.3.) megközelítőleg 30 ml kifejlesztőoldatot (4.10.), helyezzen az oszlop alsó felébe üvegrúd segítségével egy vattadarabot; nyomkodja meg, hogy a levegő távozzon belőle. Egy főzőpohárban készítsen szuszpenziót, 25 g szilikagélt (4.1.) megközelítőleg 80 ml kifejlesztőoldatban feloldva, és egy tölcsér segítségével öntse az oszlopba. Ellenőrizze, hogy az egész szilikagél be lett töltve az oszlopba; mossa át a kifejlesztőoldattal (4.10.), nyissa ki a csapot, és hagyja, hogy a folyadék szintje érjen fel megközelítőleg 2 mm-rel a szilikagél felső szintje fölé. 5.1.4. Oszlopkromatográfia Egy 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban (3.1.) mérjen le pontosan 1,0 g, az 5.1. pontnak megfelelően előkészített mintát. Oldja fel a mintát 10 ml kifejlesztőoldatban (4.10.). Az így kapott oldatot öntse az 5.1.3. pontnak megfelelően előkészített kromatográfiás oszlopba. Kerülje az oszlop felszínének mozgatását. Nyissa meg a csapot, és hagyja átfolyni a mintaoldatot, amíg az el nem éri a szilikagél szintjét. Fejlessze ki 150 ml kifejlesztőoldattal. Állítsa a térfogatáramot 2 ml/percre (úgy, hogy körülbelül 60–70 perc alatt 150 ml oldat folyjon át az oszlopba). Az eluátumot fogja fel egy előzetesen lemért, 250 ml térfogatú gömbölyű lombikban. Vákuum alatt párologtassa el az oldószert, az utolsó nyomokat nitrogénáram segítségével távolítva el. Mérje le a gömbölyű lombikot, és számítsa ki a kinyert kivonatot. (Használatra kész SPE szilikagél hüvelyek használata esetén a következőképpen járjon el: Öntsön 1 ml oldatot (5.1.2.) az előzetesen 3 ml n-hexánnal előkészített hüvelyekbe.) Az átmosás után fejlessze ki az oldatot 4 ml 9/1 (V/V) arányú n-hexán/dietil-éter keverékkel. Fogja fel az eluátumot egy 10 ml térfogatú kémcsőben, és párologtassa el nitrogénáram segítségével a teljes kiszáradásig. A kiszárított maradékot tegye ki a pankreatin-lipáz hatásának (5.2.). Rendkívül fontos, hogy SPE hüvelyen való áthaladás előtt, illetve után egyaránt ellenőrizze a zsírsavösszetételt). 5.2. Hidrolízis pankreatin-lipázzal 5.2.1. Mérjen a centrifugakémcsőbe 0,1 g, az 5.1. pontnak megfelelően előkészített olajat. Adjon hozzá 2 ml pufferoldatot (4.6.), 0,5 ml nátrium-kolát-oldatot (4.7.) és 0,2 ml kalcium-klorid-oldatot; minden hozzáadás után alaposan rázza fel a keveréket. Zárja le a kémcsövet a csiszolt dugóval, majd tegye a 40 ± 0,5 °C hőmérsékleten tartott termosztátba (4.17.). 5.2.2. Adjon hozzá 20 mg lipázt, rázza fel alaposan (kerülje a dugó benedvesedését), majd tegye a kémcsövet a termosztátba pontosan 2 percre. Ezután vegye ki, rázza fel erőteljesen pontosan 1 percig, és hagyja kihűlni. 5.2.3. Adjon hozzá 1 ml dietil-étert, zárja le a dugóval és erőteljesen rázza fel, majd centrifugálás után az éteroldatot mikrofecskendő segítségével öntse át egy tiszta és száraz kémcsőbe. 5.3. A szilanizált származékok és a gázkromatográfia előkészítése 5.3.1. Egy mikrofecskendő segítségével töltsön 100 μl oldatot (5.2.3.) egy 10 ml térfogatú kúpos fenekű kémcsőbe. 5.3.2. Enyhe nitrogénárammal párologtassa el az oldószert, adjon hozzá 200 μl szilanizációs reagenst (4.15.), dugaszolja be a kémcsövet, és hagyja ülepedni 20 percig. 5.3.3. A 20 perc leteltével adjon hozzá 1–5 ml n-hexánt (a kromatográfiai körülmények függvényében): az így kapott oldat készen áll a gázkromatográfiás eljárásra. 5.4. Gázkromatográfia Az üzemi körülmények a következők: — az injektor hőmérséklete (oszlopra szerelt »on column« injektor): az oldószer forráspontjánál (68 °C) alacsonyabb, — a detektor hőmérséklete: 350 °C, — az oszlop hőmérséklete: a kemence hőmérsékletének programozása: 1 percig 60 °C, percenként 15 °C-kal emelve 180 °C-ig, majd percenként 5 °C-kal 340 °C-ig, majd 13 percig 340 °C, — vivőgáz: hidrogén vagy hélium, az 1. ábrán tükröződő felbontáshoz szükséges lineáris sebességre beállítva. A C54 triglicerid retenciós idejének 40 ± 5 percnek kell lennie (lásd a 2. ábrát). (A fent leírt üzemi körülmények tájékoztató jellegűek. Minden esetben optimalizálni kell őket a kívánt felbontás elérése érdekében. A 2-gliceril monopalmitátnak megfelelő csúcs minimális magasságának a regisztráló berendezés skálája 10 %-ának kell lennie), — a befecskendezett anyag mennyisége: 0,5–1 μl n-hexán oldat (5 ml) (5.3.3.). 5.4.1. A csúcsok azonosítása Az egyes monogliceridek azonosítását a retenciós idők alapján, és az azonos körülmények között analizált standard monoglicerid-keverékek retenciós idejével összehasonlítva kell elvégezni. 5.4.2. Mennyiségi értékelés Az egyes csúcsok területét elektronikus integrálással számítsa ki. 6. AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE A gliceril monopalmitát százalékát az ehhez tartozó csúcs területe, illetve az összes monoglicerid csúcsok területének összege közötti arány alapján számítsa ki (lásd a 2. ábrát), a következő képlet alapján: ahol: Ax = a gliceril monopalmitáthoz tartozó csúcs területe ΣA = az összes monogliceridcsúcs területének összege Az eredményt egy tizedesjegy pontosságig kell megadni. 7. ANALÍZIS JEGYZŐKÖNYV Az analízis jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia: — a fenti módszerre való hivatkozás, — a minta maradéktalan azonosításához szükséges mindenfajta információ, — az analízis eredménye, — a fenti módszertől, akár az érintett felek döntéséből, akár egyéb okból kifolyólag történő mindennemű eltérés, — a laboratórium részletes azonosítása, az analízis időpontja és az analízisért felelős személyek aláírása. 1. ábra A 20 % észterezett olajjal (100 %) kevert finomított olívaolajra kifejtett lipázhatás nyomán keletkezett szilanizációs reakciótermékek kromatogramja. 2. ábra Kromatogram: (A) nem észterezett olívaolaj, a lipázreakció után; a szilanizáció után; ilyen körülmények között (8–12 m-es kapilláris oszlop) a viaszfrakció a digliceridfrakcióval egy időben, vagy kevéssel utána eluálódik. A lipázreakció után a triglicerid-tartalom nem haladhatja meg a 15 %-ot. Kromatogram: (B) észterezett olaj a lipázreakció után; a szilanizáció után; ilyen körülmények között (8–12 m-es kapilláris oszlop) a viaszfrakció a digliceridfrakcióval egy időben, vagy kevéssel utána eluálódik. A lipázreakció után a triglicerid-tartalom nem haladhatja meg a 15 %-ot. 8. MEGJEGYZÉSEK 1. megjegyzés: A LIPÁZ ELKÉSZÍTÉSE Kielégítő lipázaktivitású lipázok kaphatók kereskedelmi forgalomban, de lehetséges laboratóriumi elkészítésük is a következők szerint: Hűtsön le 5 kg friss sertés-hasnyálmirigyet 0 °C hőmérsékletre. Távolítsa el a környező szilárd zsiradékot és a kötőszövetet, majd dörzsölje szét egy keverőgépben, hogy pépes folyadékot kapjon. A keverővel keverje össze a pépet 2,5 l vízmentes acetonnal 4–6 órán keresztül, majd centrifugálja. Extrahálja a maradékot még háromszor, azonos mennyiségű acetonnal, majd két alkalommal aceton és dietil-éter 1/1 (V/V) keverékével, majd kétszer dietil-éterrel. Szárítsa a maradékot in vacuo 48 órán keresztül, hogy stabil port kapjon, amely hűtőszekrényben és nedvességtől védve hosszan tárolható. 2. megjegyzés: A LIPÁZ AKTIVITÁSÁNAK BEÁLLÍTÁSA Készítsen olívaolaj-emulziót a következőképpen: Megfelelő keverőben 10 percen keresztül rázza össze a 165 ml 100 g/l-es gumiarábikum-oldatból, 15 g jégzúzalékból és 20 ml előzetesen semlegesített olívaolajból álló keveréket. Egy főzőpohárba tegyen 10 ml-t ebből az emulzióból, majd ezután 0,3 ml 0,2 g/ml-es nátrium-kolát oldatot és 20 ml desztillált vizet. Tegye a főzőpoharat egy 37 °C hőmérsékleten tartott termosztátba; helyezze bele egy pH-mérő elektródáit és egy keverőspirált. Egy büretta segítségével cseppenként adagoljon nátrium-hidroxid-oldatot (0,1 N), amíg a pH-érték 8,3 nem lesz. Adjon hozzá megfelelő mennyiséget a lipáz vizes szuszpenziójából (0,1 g/ml lipáz). Amint a pH-mérő 8,3-at mutat, indítsa el a stopperórát, és olyan sebességgel csepegtesse a nátrium-hidroxid-oldatot, hogy a 8,3 pH-érték megmaradjon. Minden percben olvassa le a felhasznált lúgoldat térfogatát. A megfigyeléseket rögzítse grafikonon, az időértékeket használva abszcisszaként, az állandó pH-érték fenntartásához szükséges 0,1 N-es lúgoldat ml-ben kifejezett térfogatát pedig ordinátaként. Lineáris grafikont kell kapnia. A felhasznált por lipáz egység/mg-ban kifejezett aktivitása a következő képlettel határozható meg: ahol: A a lipáz egység/mg-ban kifejezett aktivitása, V a percenként felhasznált nátrium-hidroxid-oldat ml-ek száma (a grafikonból kiszámítva), N a nátrium-hidroxid-oldat moláris koncentrációja, m a lipáz por vizsgált mennyiségének tömege mg-ban. A lipázegység definíciója a következő: az az enzimmennyiség, amely percenként 10 μ–savekvivalenst szabadít fel.”;