I. MELLÉKLET

Vizsgálati program a 3., 4., 5. és 7. cikk alapján elvégzendő vizsgálatokhoz

1. A MEGHATÁROZOTT KÁROSÍTÓ JELENLÉTÉRE VONATKOZÓ ÁLTALÁNOS ELVEK

1.1. A meghatározott károsító jelenlétének gyanúja akkor áll fenn, ha a meghatározott növényen vagy a vízmintákon végzett első kimutatási vizsgálat pozitív eredményt ad.

1.2. A meghatározott károsító jelenléte a következő esetekben nyer megerősítést: a) ha az első vagy a második kimutatási vizsgálat tipikus morfológiájú telepeket eredményező szelektív izoláció és két, a telepeken végzett azonosítási vizsgálat pozitív eredményt ad; b) ha az első és a második vizsgálat a szelektív izolációs vizsgálattól eltérő vizsgálat, és két azonosítási vizsgálat pozitív eredményt ad, miután a mintán tipikus morfológiájú telepeket eredményező szelektív izolációt végeztek. E két azonosítási vizsgálat közül az egyiknek a 2.2. pont e), f) és g) pontjában említett vizsgálatok valamelyikének kell lennie.

2. VIZSGÁLATOK

2.1. Kimutatási vizsgálat

A kimutatási vizsgálatoknak biztosítaniuk kell a tünetmentes mintákból nyert újraszuszpendált pellet 1 ml-ében legalább 104 sejt következetes kimutatását.

A második kimutatási vizsgálatnak az első kimutatási vizsgálattól eltérő biológiai elveken vagy eltérő nukleotid régiókon kell alapulnia.

A kimutatási vizsgálatok a következők:

a) a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírt fluoreszkáló ellenanyagpróbák;

b) a meghatározott károsító izolálása a félig szelektív módosított SMSA tápközegben, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

c) hagyományos PCR-vizsgálat Pastrik et al. (2002) primerek (1) alkalmazásával, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

d) TaqMan® valós idejű PCR-tesztek, a következő primerek és próbák alkalmazásával: i. Weller et al. (2000) (2), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; ii. Vreeburg et al. (2016) (3) (TaqMan® próba alkalmazásával, amelyet módosítottak a Weller et al. (2000) által leírt eredeti próbához képest), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iii. Vreeburg et al. (2018) (4) (úgynevezett NYtor teszt), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iv. Massart et al. (2014) (5), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

e) LAMP-vizsgálat (loop-mediated isothermal amplification; hurokközvetített izotermikus amplifikáció) Lenarčič et al. (2014) (6) primerek alkalmazásával (csak tüneteket mutató növényi anyagok esetében), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint.

2.2. Azonosítási vizsgálatok

Az azonosítási vizsgálatok a következők:

a) fluoreszkáló ellenanyagpróbák, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

b) hagyományos PCR-vizsgálatok Pastrik et al. (2002) primerek alkalmazásával, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban részletesen leírtak szerint;

c) TaqMan® valós idejű PCR-tesztek, a következő primerek és próbák alkalmazásával: i. Weller et al. (2000), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; ii. Vreeburg et al. (2016) (TaqMan® próba alkalmazásával, amelyet módosítottak a Weller et al. (2000) által leírt eredeti próbához képest), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban részletesen leírtak szerint; iii. Vreeburg et al. (2018) (úgynevezett NYtor teszt), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iv. Massart et al. (2014), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

d) LAMP-vizsgálat (loop-mediated isothermal amplification; hurokközvetített izotermikus amplifikáció) vizsgálat Lenarčič et al. (2014) primerek alkalmazásával, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

e) filotípusspecifikus hagyományos multiplex PCR-vizsgálat (Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

f) DNS vonalkódolás (Wicker et al. (2007) (9)), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

g) MALDI-TOF tömegspektrometria (van de Bilt et al. (2018) (10)), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint.

3. AZ ELJÁRÁSOK FOLYAMATÁBRÁI

1. folyamatábra: Diagnosztikai eljárás a meghatározott károsító jelenlétének a meghatározott növény mintáiban történő kimutatására.

a Első vagy második kimutatási vizsgálatként izolálás alkalmazható. Ha feltételezhető a meghatározott károsító jelenléte a tápközegben, a telepeket meg kell tisztítani tiszta tenyészetek nyerése céljából, amelyeken két azonosítási vizsgálatot kell végezni.

b E két azonosítási vizsgálat közül az egyiknek a 2.2. pont e), f) és g) pontjában említett vizsgálatok valamelyikének kell lennie. A károsító jelenlétének megerősítéséhez a két azonosítási vizsgálat pozitív eredménye szükséges.

c A harmadik kimutatási vizsgálatnak eltérő biológiai elveken vagy eltérő nukleotid régiókon kell alapulnia.

2. folyamatábra: Diagnosztikai eljárás a meghatározott károsító vízmintákban történő kimutatására.

a E két azonosítási vizsgálat közül az egyiknek a 2.2. pont e), f) és g) pontjában említett vizsgálatok valamelyikének kell lennie. A károsító jelenlétének megerősítéséhez a két azonosítási vizsgálat pozitív eredménye szükséges.

4. A MINTA ELŐKÉSZÍTÉSE

4.1. Tünetmentes gumókból vett minták

A standard mintának vizsgálatonként 200 gumót kell tartalmaznia. A nemzetközi diagnosztikai szabványok ismertetik a megfelelő laboratóriumi eljárást, melynek során a köldökrészből vett darabokat feldolgozzák kivonat kinyerése céljából a meghatározott károsító kimutatásához.

4.2. Tünetmentes meghatározott növényekből vett minták

Látens fertőzések kimutatását szárdarabok vagy levélnyelek egyesített mintáin kell elvégezni. Az eljárás különböző növényekből származó legfeljebb 200 szárdarabra vagy 200 levélnyélre alkalmazható. A nemzetközi diagnosztikai szabványok ismertetik a szárdarabok vagy levélnyelek fertőtlenítésére és feldolgozására szolgáló megfelelő laboratóriumi eljárást, a meghatározott károsító kimutatásához szükséges kivonat kinyerése céljából.

4.3. A meghatározott növények tüneteket mutató anyagából vett minták

Steril körülmények között szövetrészeket kell kimetszeni a burgonyagumó edénynyalábgyűrűjéből vagy a hervadás tüneteit mutató meghatározott növények szárában lévő edénynyalábkötegekből. A nemzetközi diagnosztikai szabványok teljeskörűen ismertetik az ilyen szövetek feldolgozására szolgáló megfelelő laboratóriumi eljárást, a meghatározott károsító kimutatásához szükséges kivonat kinyerése céljából.

4.4. Felszíni víztestből vagy visszavezetett vízből vett minták (beleértve a burgonya-feldolgozásból vagy a szennyvízhálózatból származó mintákat)

A szelektív izolálás a fő vizsgálati módszer a meghatározott károsítónak a felszíni víztestből, a visszaforgató rendszerekből származó vízből és a szennyvizekből (burgonyafeldolgozó ipar) vett mintákban történő kimutatására. A nemzetközi diagnosztikai szabványok ismertetik a vízminták feldolgozására szolgáló megfelelő laboratóriumi eljárást.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the „Ralstonia solanacearum species complex”. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), pp. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.