8.

A B. rész a következő fejezetekkel egészül ki: „B.63 REPRODUKCIÓS/FEJLŐDÉSI TOXICITÁSI SZŰRŐVIZSGÁLAT BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 421. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. A vegyi anyagok vizsgálatának OECD-iránymutatásait időszakonként felülvizsgálják a tudományos fejlődés fényében. A szűrővizsgálatról szóló eredeti 421. irányelvet 1995-ben fogadták el egy „előzetes reprodukciós toxicitási szűrővizsgálat” protokollja alapján, amelyet két, 1990-ben Londonban (1) és 1992-ben Tokióban (2) megrendezett szakértői találkozón vitattak meg. 2. Az OECD által 1998-ban indított, a meglévő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, valamint az endokrin rendszert esetlegesen károsító anyagok kiszűrésére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati iránymutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenység (3) folyományaként e vizsgálati módszert frissítették az endokrin rendszert károsító anyagok tekintetében releváns végpontokkal. Az OECD 407. iránymutatását (Rágcsálókon végzett 28 napos, ismételt dózisú orális toxicitási vizsgálat, e melléklet B.7. fejezete) például 2008-ban továbbfejlesztették olyan paraméterek bevezetésével, amelyek alkalmasak a vizsgálati vegyi anyagok endokrin rendszerre gyakorolt hatásának kimutatására. A 421. vizsgálati iránymutatást abból a célból frissítették, hogy azokba a szűrővizsgálatokat érintő vizsgálati iránymutatásokba, amelyek expozíciós időszakai lefedik a fejlődés egyes érzékeny szakaszait (prenatális vagy korai posztnatális időszakokat), bekerüljenek bizonyos, az endokrin rendszert károsító anyagok tekintetében releváns végpontok. 3. Az endokrin rendszert károsító anyagok kiválasztott további releváns végpontjait, amelyek részét képezik a 443. vizsgálati iránymutatásnak is (Kibővített egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat, e melléklet B.56. fejezete), belefoglalták a 421. vizsgálati iránymutatásba azon megvalósíthatósági tanulmány alapján, amely a belefoglalásukkal kapcsolatos tudományos és szakmai kérdésekkel, valamint a vizsgálati terv belefoglalásukhoz szükséges lehetséges módosításaival foglalkozott (4). 4. E vizsgálati módszer célja, hogy korlátozott információkat szolgáltasson a vizsgálati vegyi anyagoknak a hím és női szaporodási teljesítményre, azon belül az ivarmirigyek működésére, a párzási viselkedésre, a fogantatásra, a konceptus fejlődésére és az ellésre gyakorolt hatásairól. A módszer nem képezi a meglévő B.31., B.34., B.35. és B.56. vizsgálati módszer alternatíváját, és nem helyettesíti azokat. ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK 5. Ez a szűrővizsgálati módszer arra használható, hogy kiindulási pontként szolgáló információkat nyújtson a szaporodásra és/vagy a fejlődésre gyakorolt hatásokról, akár a vegyi anyagokra jellemző toxikológiai tulajdonságok felmérésének korai szakaszában, akár az aggodalomra okot adó vegyi anyagok esetében. Használható emellett olyan létező vegyi anyagok kezdeti szűrővizsgálatainak részeként, amelyekről nem vagy csak csekély mértékben állnak rendelkezésre toxikológiai adatok, továbbá szélesebb körű reprodukciós/fejlődési vizsgálatok dózistartomány-kereső vizsgálataként és egyéb releváns esetekben. A vizsgálatok elvégzése során a klinikai tüneteknek, mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjainak felismeréséről, értékeléséről és használatáról szóló 19. OECD-iránymutatásban (5) ismertetett vezérelveket és szempontokat kell követni. 6. Ez a vizsgálati módszer nem nyújt teljes körű tájékoztatást a szaporodás és a fejlődés minden vonatkozásáról. Alkalmazhatósága különösen a prenatális expozíció posztnatális tüneteinek, valamint a posztnatális expozíció során előidézett hatások kimutatása tekintetében korlátozott. A dóziscsoportokat alkotó állatok viszonylag csekély száma, a végpontok szelektivitása, valamint a vizsgálat rövid időtartama (és egyéb okok) miatt ez a módszer nem szolgáltat bizonyítékot annak végleges megállapítására, hogy az adott vegyi anyag nem gyakorol hatást. Ezen túlmenően, más reprodukciós/fejlődési toxicitási vizsgálatokból nyert adatok hiányában a pozitív eredmények a veszély kezdeti értékelésére használhatók, illetve hozzájárulnak a további vizsgálatok szükségességére és időzítésére vonatkozó döntésekhez. 7. Az endokrin rendszerrel kapcsolatos paraméterek alkalmazásával kapott eredményeket az OECD endokrin rendszert károsító anyagok vizsgálatára és értékelésére vonatkozó fogalmi keretének összefüggésében kell értelmezni (6). Ebben a fogalmi keretben az OECD továbbfejlesztett 421. vizsgálati iránymutatása a 4. szinten helyezkedik el, mint olyan in vivo vizsgálat, amely az endokrin rendszer releváns végpontjaira gyakorolt káros hatásokról szolgáltat adatokat. Egy endokrin jel önmagában azonban még nem tekinthető elegendő bizonyítéknak arra, hogy a vizsgálati vegyi anyag az endokrin rendszert károsító anyag lenne. 8. Ez a vizsgálati módszer a vizsgálati vegyi anyag orális adagolását feltételezi. Más beadási mód alkalmazása esetén szükség lehet a módszer kiigazítására. 9. A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. 10. A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza. A VIZSGÁLAT ELVE 11. A vizsgálati vegyi anyagot fokozatosan növekvő dózisokban kell adagolni hím és nőstény állatok több csoportjának. A hímeket legalább négy hétig kell kezelni, egészen a tervezett elpusztításukat megelőző napig (ez az időtartam magában foglalja a pároztatást megelőző minimum két hetet, a párzási időszakot, valamint a pároztatást követő mintegy két hetes időszakot). Tekintettel a hímek pároztatást megelőző rövid kezelési időszakára, előfordulhat, hogy a termékenység nem kifejezetten érzékeny mutatója a heretoxicitásnak. Ezért a heréken mindenképpen részletes szövettani vizsgálatot kell végezni. A pároztatást megelőző kéthetes kezelési időszak és az azt követően a párzással/termékenységgel kapcsolatban tett megfigyelések, az összesen legalább négy hétig tartó kezelés, majd a hím ivarmirigyek részletes kórszövettani vizsgálata összességében elegendőnek bizonyulnak ahhoz, hogy kimutatható legyen a hím termékenységre és spermatogenezisre gyakorolt hatások többsége. 12. A nőstényeket a vizsgálat teljes időszaka alatt kezelni kell. Ez magában foglalja a párzást megelőző két hetes időszakot (amelynek célja, hogy lefedjen legalább két teljes ivari ciklust), a fogantatáshoz szükséges változó időtartamot, a vemhesség időszakát, az ellést követő legalább tizenhárom napot és a tervezett elpusztítást megelőző napig tartó további kezelést. 13. Az akklimatizációt és az ivari ciklus kezelés előtti felmérését követően megkezdett vizsgálat időtartama a nőstények teljesítményétől függően megközelítőleg 63 nap [legalább 14 napos pároztatás előtti időszak, (legfeljebb) 14 napos párzási időszak, 22 napos vemhesség és 13 napos szoptatás]. 14. Az adagolási időszakban az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése érdekében minden nap gondosan megfigyelik. A vizsgálati időszak során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncolják, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is elpusztítják és felboncolják. A MÓDSZER LEÍRÁSA Az állatfaj kiválasztása 15. Ezt a vizsgálati módszert patkányok használatára tervezték. Ha az e vizsgálati módszerben meghatározott paramétereket más rágcsálófajon vizsgálják, a döntést részletesen indokolni kell. Az OECD (e melléklet B.7. fejezetének megfelelő) 407. vizsgálati iránymutatása alapján végzett nemzetközi validációs programban a patkány volt az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatására használt egyetlen faj. Nem szabad olyan törzseket alkalmazni, amelyek kevéssé termékenyek, vagy amelyekben magas a fejlődési defektusok előfordulási gyakorisága. Korábban vizsgálatban még részt nem vett, egészséges szűz állatokat kell használni. A kísérleti állatokat faj, törzs, nem, súly és kor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át. Ha a vizsgálatot egy hosszú távú vagy teljes generáción ál tartó vizsgálat előzetes kísérleteként végzik, ajánlatos mindkét vizsgálathoz ugyanabból a törzsből való, azonos eredetű állatokat használni. Az állatok tartása és etetése 16. Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonatkozó helyi szabványoknak. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 22°C-nak (±3°C) kell lennie. Noha a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és az – a takarítás időtartamától eltekintve – lehetőség szerint nem haladhatja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés igénye is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmánnyal adják be. 17. Az állatok azonos nemű egyedekből álló kisebb csoportokban tartandók; ha tudományos szempontból indokolt, az állatok egyedileg is elhelyezhetők. Ketrecben való csoportos elhelyezés esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható. A pároztatást erre a célra alkalmas ketrecekben kell végezni. A vemhes nőstényeket egyedileg kell elhelyezni, és el kell látni az alom kialakításához használt (fészeképítő) anyaggal. A szoptató nőstények és utódaik számára külön ketrecet kell biztosítani. 18. Rendszeresen ellenőrizni kell, hogy a takarmány nem tartalmaz-e szennyező anyagokat. A takarmányból egy mintát a jelentés véglegesítéséig meg kell őrizni. Az állatok előkészítése 19. Egészséges, fiatal, ivarérett állatokat osztunk véletlenszerűen a kontroll- és kezelt csoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. Az állatokat az egyedi azonosíthatóság céljából megjelölik, és a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napig a ketrecükben tartják a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából. A dózisok előkészítése 20. A vizsgálati vegyi anyagot ajánlatos orálisan adagolni, kivéve ha más beadási módot tartanak megfelelőbbnek. Orális adagolás esetén a vizsgálati vegyi anyag beadása általában gyomorszondával történik; a vizsgálati vegyi anyagok azonban beadhatók a takarmánnyal vagy az ivóvízzel is. 21. A vizsgálati vegyi anyagot szükség esetén alkalmas vivőanyagban feloldják vagy szuszpendálják. Lehetőség szerint elsősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más vivőanyagokban elkészített oldatot. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. Meg kell határozni továbbá azt is, hogy a vizsgálati vegyi anyag mennyire stabil és homogén az adott vivőanyagban. ELJÁRÁS Az állatok száma és neme 22. Az egyes csoportok kiindulási létszámát ajánlatos 10 hím és 12–13 nőstény egyedben meghatározni. Az expozíciót megelőzően felmérik a nőstények ivari ciklusát, és a szokásos 4–5 naptól eltérő időtartamú ciklussal rendelkező állatokat nem használják a vizsgálatban; ezért célszerű néhány plusz nőstényről gondoskodni, hogy végül maradjon csoportonként 10 nőstény. Ha nem mutatkoznak jelentős toxikus tünetek, ezzel a létszámmal várhatóan csoportonként legalább 8 vemhes nőstény biztosítható, ami a vemhes nőstények csoportonkénti elfogadható számának alsó határértéke. A cél az, hogy megfelelő mennyiségű vemhesség és utód jöjjön létre ahhoz, hogy érdemileg fel lehessen mérni a vizsgálati vegyi anyag hatását a termékenységre, a vemhességre, az anyai és a szopási viselkedésre, valamint az F 1 utódnemzedék növekedésére és fejlődésére a fogantatástól az ellést követő 13. napig. Adagolás 23. Általánosan 3 kezelt csoportot és egy kontrollcsoportot alkalmaznak. A dózisok alapulhatnak az akut toxicitási vizsgálatok adatain vagy az ismételt dózisú vizsgálatok eredményein. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgálati vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket. Ha a vizsgálati vegyi anyag beadásához vivőanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak a vivőanyagból a felhasznált legnagyobb mennyiséget kell kapnia. 24. A dózisok kiválasztásánál figyelembe veszik a toxicitásra és (toxiko)kinetikára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. Emellett ügyelni kell arra is, hogy érzékenység tekintetében különbségek lehetnek a vemhes és nem vemhes állatok között. A legmagasabb dózist úgy kell kiválasztani, hogy az toxikus tüneteket keltsen, de ne okozzon halált vagy súlyos szenvedést a kísérleti állatoknak. Ezt követően úgy kell csökkenő sorrendben kiválasztani a kisebb dózisokat, hogy meg lehessen határozni a dózissal összefüggő válaszokat, illetve a legkisebb dózisnál a nem észlelhető káros hatások szintjét (NOAEL). A csökkenő dózisok beállításához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, a dózisok közötti nagyon nagy intervallumok (például 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran előnyben részesítendő egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása. 25. Ha általános toxicitást (például testsúlycsökkenést, a májra, a szívre, a tüdőre vagy a vesére kifejtett hatásokat stb.) vagy egyéb, nem feltétlenül toxikus reakcióra utaló változásokat (például csökkent táplálékfogyasztást, májmegnagyobbodást) figyelnek meg, az endokrin rendszer szempontjából érzékeny végpontok tekintetében megfigyelt hatások értelmezésekor óvatosan kell eljárni. Határérték-vizsgálat 26. Ha egy egyetlen, legalább 1 000 mg/testtömeg-kg/nap orális dózis felhasználásával végzett, vagy táplálékkal vagy ivóvízzel történő beadás esetén a táplálékban vagy ivóvízben ezzel egyenértékű százalékos arány alkalmazásával történő és az itt ismertetett eljárások szerint lefolytatott vizsgálat nem idéz elő észlelhető toxikus hatást, és ha a szerkezet tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, a teljes, több dózist átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthető. Határérték-vizsgálatot kell minden esetben alkalmazni, kivéve, ha a humán expozíció magasabb orális dózis alkalmazását teszi szükségessé. Más típusú beadási módok, így például inhalálás vagy dermális alkalmazás esetén a vizsgálati vegyi anyag fizikai-kémiai tulajdonságai gyakran előre jelezhetik a lehetséges koncentráció maximumát. A dózisok beadása 27. Az állatoknak a vizsgálati vegyi anyagot heti hét napon át, naponta adagolják. Ha a vizsgálati vegyi anyagot szondán át adagolják, lehetőleg egyetlen adagban kell gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanülön át beadni. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. A térfogat nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt, kivéve vizes oldatok esetében, amikor 2 ml/100 g testtömegarány is alkalmazható. A magasabb koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy korrozív vizsgálati vegyi anyagok kivételével a koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének változásait, hogy a mennyiség valamennyi dózisnál konstans legyen. 28. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vizsgálati vegyi anyagok esetében fontos annak biztosítása, hogy a vizsgálati vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a táplálékkal együtt adják be, vagy állandó koncentrációban (ppm) keverik be, vagy az állat testsúlyától függő, állandó nagyságú dózisban adagolják; a kiválasztott alternatívát meg kell nevezni. A gyomorszondával bejuttatott vizsgálati vegyi anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló időszakában kell beadni, és legalább hetente újra be kell állítani ahhoz, hogy az állat testtömegéhez viszonyítva állandó értéken lehessen tartani. A kísérleti program 29. Az adagolást mindkét nem esetében legalább 2 héttel a pároztatás előtt el kell kezdeni, miután az állatok legalább öt napon keresztül akklimatizálódtak, és (egy kéthetes kezelés előtti időszak során) ellenőrizték, hogy a nőstények ivari ciklusa megfelel-e a normál ciklusidőnek. A vizsgálatot úgy kell időzíteni, hogy az ivari ciklus értékelése röviddel a teljes ivarérettség elérését követően megkezdődjön. Ez az egyes laboratóriumokban használt különféle patkánytörzsek függvényében némileg változó, a Sprague-Dawley törzsbe tartozó patkányok esetében például 10 hetes korukban, a Wistar-törzsbe tartozók esetében pedig 12 hetes korukban következik be. Az utódokkal rendelkező anyaállatokat az ellést követő 13. napon vagy röviddel azután el kell pusztítani. A születés napja (vagyis amikor lezárul az ellés) a post-partum 0. napja. Azokat a nőstényeket, amelyek semmi jelét nem mutatják annak, hogy párosodtak volna, a párzási időszak utolsó napját követő 24–26 nappal el kell pusztítani. Az adagolást a párzási időszakban sem szabad abbahagyni egyik nem esetében sem. A hímeket a párzási időszakot követően továbbra is kezelni kell, legalább a minimális, 28 napos adagolási időszak végéig. Ezt követően leölik, vagy ha úgy ítélik megfelelőnek, megtartják azokat, és egy esetleges második pároztatás céljából tovább folytatják kezelésüket. 30. Az anyaállatok napi szintű kezelését folytatni kell a vemhesség teljes időszakán át egészen a post-partum 13. napjáig vagy az elpusztításukat megelőző napig. Azon vizsgálatoknál, amelyek keretében a vizsgálati vegyi anyagot inhalálás vagy dermális alkalmazás útján adják be, a kezelést folytatni kell legalább a vemhesség 19. napjáig, majd a lehető leghamarabb, de legkésőbb a 4. posztnatális napon újra kell kezdeni. 31. A kísérleti ütemterv ábráját a 2. függelék tartalmazza. A pároztatási eljárás 32. Rendes esetben e vizsgálat során 1:1 (egy hím-egy nőstény) pároztatást kell alkalmazni. Ettől abban az esetben lehet eltekinteni, ha a hímek közül elpusztul valamelyik. A nőstényt egy adott hímmel kell összerakni, és addig kell együtt hagyni azokat, amíg meg nem győződtek a párzás megtörténtéről, vagy 2 hét el nem telik. Minden reggel meg kell vizsgálni, hogy a nőstényben észlelhető-e sperma vagy a hüvelydugó. A vemhesség 0. napja definíció szerint az a nap, amikor a párosodás tényét megerősítették (hüvelydugó vagy sperma figyelhető meg a nőstényben). Ha a pároztatás sikertelen volt, fontolóra lehet venni a nőstények újrapároztatását egy azonos csoportbeli és már sikeresen pároztatott hímmel. Az alom mérete 33. Az ellés utáni negyedik napon az egyes almok egyedszáma a létszám fölötti kölykök véletlenszerű eltávolításával módosítható, hogy almonként az eredmény – amennyire lehetséges – a használt patkánytörzsre jellemző ivaronkénti négy vagy öt utód legyen. Két létszám feletti kölyöktől vérmintát kell venni, egybe kell gyűjteni és fel kell használni a T4 szérumszintek meghatározásához. A kölykök szelektív, például a testtömeg vagy az anogenitális távolság (AGD) alapján történő eltávolítása nem elfogadható. Ha a hím és nőstény utódok száma nem teszi lehetővé a nemenként négy vagy öt azonos nemű utódot tartalmazó almok kialakítását, részleges kiegyenlítés is elfogadható (például hat hím és négy nőstény). Amennyiben az alom egyedszáma a selejtezési célérték (almonként 8 vagy 10 utód) alá csökkenne, nem kell eltávolítani kölyköket. Ha az alom mérete csupán eggyel haladja meg a selejtezési célértéket, csak egy kölyköt távolítanak el, és attól vesznek vért a T4 szérumszintek esetleges értékelésekhez. 34. Ha nem igazítják ki az alom egyedszámát, az ellést követő 4. napon almonként két kölyköt elpusztítanak, és vérmintát vesznek tőlük a pajzsmirigyhormonok szérumkoncentrációjának méréséhez. Lehetőség szerint az almonkénti két kölyök nőstény legyen, hogy maradjanak hímek az emlőbimbó-visszamaradás megállapításához, kivéve abban az esetben, ha a nőstény utódok eltávolítása miatt nem maradna nőstény a vizsgálat végi értékeléshez. Amennyiben az egyedszám az almonkénti 8 vagy 10 utód alá esne (a használt patkánytörzsre jellemző szokásos alommérettől függően), nem kell eltávolítani kölyköket. Ha az alom egyedszáma csupán eggyel haladja meg az alom szokásos méretét, csak egy kölyköt távolítanak el, és attól vesznek vért a T4 szérumszintek esetleges értékelésekhez. Megfigyelések élő állatban Klinikai megfigyelések 35. A vizsgálat teljes időtartama alatt általános klinikai megfigyeléseket legalább naponta kell végezni, vagy gyakrabban, ha toxicitás jelei figyelhetők meg. A megfigyeléseket lehetőleg mindig a nap azonos időszakában/időszakaiban kell végezni, figyelembe véve azt is, hogy a várt hatások a dózis beadása után mikor érik el a maximumukat. Feljegyzést kell készíteni a lényeges magatartászavarokról, az elhúzódó vagy nehéz ellés jeleiről, valamint a toxikus hatásra utaló minden egyéb tünetről, beleértve a mortalitást is. A feljegyzéseknek tartalmazniuk kell a toxicitási tünetek fellépésének időpontját, mértékét és időtartamát. Testtömeg és táplálék-/vízfogyasztás 36. A hímek és nőstények testsúlyát meg kell mérni az adagolás első napján, majd ezt követően legalább hetente és a vizsgálat végén meg kell ismételni a mérést. A nőstényeket a vemhesség alatt a 0., 7., 14. és 20. napon kell megmérni, továbbá az ellést követő 24 órán belül (a post-partum 0. vagy 1. napján) és legalább a post-partum 4. és 13. napján. A megfigyeléseket minden egyes felnőtt állat esetében külön-külön kell rögzíteni. 37. A pároztatás előtt, valamint a vemhesség és a szoptatás ideje alatt a takarmányfogyasztást legalább hetente kell mérni. A párzási időszak során nem kell feltétlenül mérni a takarmányfogyasztást. Ha a vizsgálati vegyi anyagot az ivóvízzel adagolják, ezen időszakok során a vízfogyasztást is mérni kell. Ivari ciklus 38. A kezelés megkezdése előtt ellenőrizni kell az ivari ciklust, hogy szabályos ciklussal rendelkező nőstények kerüljenek kiválasztásra a vizsgálathoz (lásd a 22. pontot). Emellett napi szinten kell vizsgálni a hüvelyi kenetet is, a kezelési időszak kezdetétől mindaddig, amíg be nem bizonyosodik, hogy megtörtént a párzás. Ha felmerül a lehetősége annak, hogy az adagolás megkezdése olyan akut stresszhatást idéz elő, amely módosíthatja az ivari ciklust, a laboratóriumok eljárhatnak úgy is, hogy két hétig kezelik a vizsgált állatokat, majd a pároztatás előtti időszakban legalább két hétig naponta hüvelyi kenetet vesznek az ivari ciklus ellenőrzéséhez, amelyet a párzási időszak során is folyamatosan figyelemmel kísérnek egészen a párzás megtörténtéig. A hüvelyi/méhnyaki sejtvétel során Ügyelni kell arra, hogy meg ne sérüljön a nyálkahártya, mert az álvemhességet idézhet elő (7) (8). Az utódok paraméterei 39. A vemhesség nulladik napjától számítandó terhességi (gesztációs) időszakról feljegyzést kell készíteni. Az ellés után minden almot a lehető leghamarabb meg kell vizsgálni a kölykök számának és ivarának, a halvaszületések, élveszületések és fejletlen egyedek (a megfelelő kontrollcsoportba tartozó kölyköknél jelentősen kisebb utódok) számának, valamint a súlyos rendellenességek jelenlétének megállapításához. 40. Az élő kölyköket meg kell számolni, nemüket meg kell állapítani, és az almok egyedeinek súlyát meg kell mérni a születést követő 24 órán belül (a post-partum 0. vagy 1. napján) és legalább a post-partum 4. és 13. napján. A 35. pontban említett megfigyelések mellett az utódok minden rendellenes viselkedéséről be kell számolni. 41. Az anogenitális távolságot (AGD) minden utódon legalább egy alkalommal meg kell mérni a 0. és 4. posztnatális nap között. A kölykök testtömegét azon a napon kell megmérni, amikor az AGD-t is mérik, és az AGD-t normálni kell a kölykök méretére, ami lehetőleg a testtömeg köbgyöke (9). Az OECD 151. vizsgálati iránymutatásának (10) ajánlása szerint a hím utódok emlőbimbóinak/emlőbimbóudvarainak számát meg kell számolni a 12. vagy 13. posztnatális napon. Klinikai biokémiai vizsgálatok 42. Vérmintákat egy meghatározott helyről kell venni, az alábbi ütemezés szerint: — almonként legalább két kölyöktől a születést követő 4. napon, amennyiben azt az utódok száma lehetővé teszi (lásd a 33–34. pontot), — az összes anyaállattól és almonként legalább két kölyöktől a vizsgálat végét jelentő 13. napon, és — az összes felnőtt hímtől a vizsgálat végén, A vérmintákat megfelelő körülmények között tárolják. A 13 napos utódoktól és a felnőtt hímektől vett vérminták alapján értékelik a pajzsmirigyhormon (T4) szérumszinteket. Szükség esetén a T4 további értékeléséhez felhasználhatók az anyaállatoktól és a 4 napos utódoktól vett vérminták. Ha a vizsgálat szempontjából lényeges, más hormonok is mérhetők. A pajzsmirigyhormon analízisekhez almonként egyesíteni lehet a kölyköktől vett vérmintákat. A pajzsmirigyhormonokra (T4 és TSH) vonatkozó mérésekhez lehetőleg a teljes vérmintát kell használni. 43. A hormonok meghatározásának variabilitását és az azzal kapott abszolút koncentrációt az alábbi tényezők befolyásolhatják: — az elpusztítás időpontja, tekintettel a hormonkoncentrációk nap folyamán tapasztalható ingadozására, — az állatot érő indokolatlan stressz elkerülése érdekében alkalmazott elpusztítási mód, amely hatással lehet a hormonkoncentrációkra, — a hormonmeghatározásokhoz alkalmazott, standard görbéjük tekintetében esetlegesen eltérő vizsgálati készletek. 44. A kifejezetten hormon-meghatározási célra szánt plazmamintákat a nap hasonló időpontjában kell gyűjteni. A kereskedelmi fogalomban kapható különböző vizsgálati készletek eltérő számszerű értékeket adnak a hormonkoncentrációk elemzése során. Patológia Makroszkópos boncolás 45. A vizsgálat során bekövetkező elpusztítás vagy elhullás időpontjában makroszkóposan meg kell vizsgálni a felnőtt állatokban az esetleges rendellenességeket vagy patológiás elváltozásokat. Külön figyelmet kell szentelni a szaporítószerveknek. A beágyazódási helyek számát fel kell jegyezni. A boncolás napjának reggelén meg kell vizsgálni a hüvelyi kenetet az ivari ciklus aktuális szakaszának meghatározásához, hogy lehetővé váljon a korreláció felállítása a petefészkek kórszövettanával. 46. Az összes hím felnőtt állat heréit és mellékheréit, prosztatáját és ondóhólyagjait a koaguláló mirigyekkel egy egységként meg kell tisztítani minden rátapadt szövettől, és a kiszáradás megelőzése érdekében a boncolást követően a lehető legrövidebb időn belül meg kell mérni nedves tömegüket. Ezen túlmenően további szervtömegmérések végezhetők hímeknél a végbélemelő és a bulbocavernosus izomra, a Cowper-mirigyekre és a glans penisre, nőstényeknél a páros petefészekre (nedves tömeg) és a méhre (valamint a méhnyakra) kiterjedőleg; ha ezeket a szerveket is bevonják a mérésbe, tömegüket a boncolás után lehető leghamarabb meg kell határozni. 47. Az elhullott és a post-partum 13. napján vagy röviddel azután elpusztított utódokat legalább külsőleg alaposan meg kell vizsgálni, hogy láthatók-e rajtuk súlyos rendellenességek. Különös figyelmet kell szentelni a külső ivarszervek vizsgálatának, és ezen belül a rendellenes fejlődés jeleinek. A 13. napon almonként 1 hím és 1 nőstény utód pajzsmirigyét meg kell őrizni. 48. Ezenfelül meg kell őrizni az összes felnőtt állat petefészkeit, heréit, a járulékos ivarszerveket (a méhet és a méhnyakat, a mellékheréket, a prosztatát és az ondóhólyagokat a koaguláló mirigyekkel), a pajzsmirigyet, valamint a makroszkópos vizsgálat során léziókat mutató szerveket. A herék és mellékherék rutinvizsgálatához a formalinos fixálás használata nem ajánlott. E szövetek elfogadható vizsgálati módszere a Bouin-féle vagy a módosított Davidson-féle fixáló használata (11). A tunica albugineán a fixálószer gyors bejutása érdekében tűvel óvatosan sekély szúrást lehet ejteni a szerv mindkét végén. Kórszövettan 49. Részletes szövettani vizsgálatot kell végrehajtani a legmagasabb dózissal kezelt csoportba és a kontrollcsoportba tartozó állatok petefészkein, heréin és mellékheréin (különös figyelmet fordítva a spermatogenezis szakaszaira és a here intersticiális sejtjeinek felépítésére). Amennyiben szükséges, vizsgálni lehet az utódoktól és a felnőtt állatoktól származó egyéb megőrzött szerveket, például a pajzsmirigyet. A pajzsmirigy súlya a fixálást követően is meghatározható. A megtisztítás a szövetkárosodás elkerülése érdekében ez esetben is igen óvatosan, kizárólag a fixálást követően végzendő el. A szövetkárosodás veszélyeztetheti a kórszövettani elemzést. Ha a legmagasabb dózissal kezelt csoport egyedei esetében elváltozások figyelhetők meg, a vizsgálatokat a többi, más dózissal kezelt csoport egyedeire is ki kell terjeszteni. A kórszövettani iránymutatás (11) további információkat tartalmaz az endokrin szövetek boncolásával, fixálásával, metszeteinek elkészítésével és kórszövettani vizsgálatával kapcsolatban. ADATOK ÉS JELENTÉS Adatok 50. Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett minden adatot táblázatos formában is össze kell foglalni, amelyben minden egyes vizsgálati csoport esetében fel kell tüntetni az állatok számát a vizsgálat kezdetén, a vizsgálat során elpusztult vagy humánus okok miatt exterminált állatok számát, az elhullások és a humánus okok miatti elpusztítások időpontját, a termékeny állatok számát, a vemhes nőstények számát, a toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ezen belül bármely toxikus tünet megjelenésének időpontját, valamint ezek időtartamát és súlyosságát, a kórszövettani elváltozások típusait és az almokra vonatkozó minden idevágó adatot. A 3. mellékletben közzéteszünk egy, a reprodukciós/fejlődési hatások értékelése során nagyon hasznosnak bizonyult táblázatos formájú, összefoglaló jelentést. 51. A vizsgálat korlátozott terjedelme miatt a „szignifikancia” felmérésére szolgáló vizsgálatok formájában végzett statisztikai elemzések számos végpont, különösen a reprodukciós végpontok szempontjából csekély jelentőséggel bírnak. Amennyiben statisztikai elemzésekre támaszkodnak, még a vizsgálat megkezdése előtt olyan módszert kell választani, amelyik megfelel a vizsgált változók eloszlásának. Az anogenitális távolság és az emlőbimbó-visszamaradás statisztikai elemzésének az utódokra vonatkozó egyedi adatokon kell alapulnia, ugyanakkor figyelembe kell vinni az alom által gyakorolt hatásokat. Ahol megfelelő, az elemzés egysége az alom. A kölykök testsúlyára vonatkozó statisztikai elemzésnek a kölykök egyedi adatain kell alapulnia, ugyanakkor figyelembe kell vinni az alom által gyakorolt hatásokat. A csoportok alacsony egyedszáma miatt az esetleg rendelkezésre álló (pl. az alomméretre vonatkozó) korábbi kontrolladatok szintén hasznos segítséget nyújthatnak a vizsgálat értelmezéséhez. Az eredmények értékelése 52. E toxicitási vizsgálat eredményeit a megfigyelt hatások, valamint a boncolási és mikroszkópos eredmények szempontjából kell értékelni. Az értékelés során ki kell térni a vizsgálati vegyi anyag dózisa és a rendellenességek, ezen belül a súlyos léziók, az azonosított célszervek, a terméketlenség, a klinikai rendellenességek, a csökkent reproduktív teljesítmény és egyedszám, a testtömegváltozások, a mortalitásra gyakorolt hatások és egyéb toxikus hatások megléte vagy hiánya, illetve gyakorisága és súlyossága közötti összefüggésekre. 53. A hímek rövid kezelési időszaka miatt a hímekre gyakorolt reprodukciós hatások felmérése során figyelembe kell venni a herék és mellékherék kórszövettanát, valamint a termékenységre vonatkozó adatokat. A szaporodásra/fejlődésre (pl. alomméretre, anogenitális távolságra, emlőbimbó-visszamaradásra, T4 szérumszintekre) vonatkozólag rendelkezésre álló történeti kontrolladatok szintén hasznos segítséget nyújthatnak a vizsgálat értelmezéséhez. 54. A minőség-ellenőrzéshez javasolt történeti kontrolladatokat gyűjteni, a számszerű adatokhoz pedig kiszámítani a variációs együtthatót, különösen az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatásával összefüggő paraméterek tekintetében. Ezek az adatok felhasználhatók összehasonlítási célokra a tényleges vizsgálatok kiértékelése során. Vizsgálati jelentés 55. A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia: Vizsgálati vegyi anyag: — eredet, gyártási szám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll; — a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert; Egy összetevőből álló anyag: — fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok; — kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek: — amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai révén jellemezve. Vivőanyag (ha van): — a vivőanyag megválasztásának indokolása, ha az nem víz. Kísérleti állatok: — használt faj/törzs; — az állatok száma, kora és neme; — az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.; — az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetekor; — patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása. Vizsgálati körülmények: — a dózisok kiválasztásának indokolása; — a vizsgálati vegyi anyag formulázásával/a takarmány előkészítésével, az elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitásával kapcsolatos adatok; — a vizsgálati vegyi anyag beadására vonatkozó részletek; — átszámítás a vizsgálati vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez alkalmazható; — a táplálék és víz minőségére vonatkozó részletek; — a selejtezés során a kölykök kiválasztására használat randomizálási eljárás részletes leírása, ha sor került selejtezésre. Eredmények: — testsúly és annak változásai; — táplálék- és vízfogyasztásra vonatkozó adatok, ha rendelkezésre állnak; — a toxikus reakciók adatai nemenként és dózisonként, beleértve a termékenységet, a gesztációs időt és a toxicitás egyéb tüneteit is; — a vemhesség időtartama; — a szaporodásra, az utódokra, a posztnatális növekedésre stb. gyakorolt toxikus vagy egyéb hatások; — a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és időtartama (a változások visszafordíthatók-e vagy sem); — normális vagy abnormális ivari ciklust mutató felnőtt nőstények száma és a ciklus időtartama; — az élveszületések száma és a beágyazódás utáni veszteség; — utódok testsúlyadatai; — az összes utód anogenitális távolsága (és az AGD-mérés napján rögzített testsúlyuk); — emlőbimbó-visszamaradás a hím utódoknál; — pajzsmirigyhormonok szintje 13 napos kölyköknél és felnőtt hímeknél (és ha mérték, az anyaállatoknál és 4 napos kölyköknél); — a szemmel jól látható rendellenességeket mutató utódok száma, a külső nemi szervek makroszkopikus értékelése, a fejletlen utódok száma; — a vizsgálat során bekövetkezett elhullás ideje, illetve hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét; — a beágyazódások száma, az alomméret és az almokban lévő egyedek méréskor rögzített testsúlya; — a testtömeg az elpusztításkor, valamint a szülők szervtömegadatai; — boncolási eredmények; — a kórszövettani leletek részletes ismertetése; — felszívódási adatok (ha vannak); — adott esetben az eredmények statisztikai feldolgozása. Az eredmények értékelése. Következtetések Az eredmények értelmezése 56. Ez a vizsgálat az ismételt dózisok útján történő kezeléssel összefüggésben kimutatható reprodukciós/fejlődési toxicitás értékelésére szolgál (lásd az 5. és a 6. pontot). Jelezheti a további vizsgálatok szükségességét, és iránymutatást nyújt a későbbi vizsgálatok kialakításához. A szaporodási és fejlődési eredmények értelmezésével kapcsolatban az OECD 43. iránymutatását kell alkalmazni (12). A rágcsálókon végzett endokrin és reprodukciós vizsgálatok szövettani értékeléséről szóló 106. OECD-iránymutatás (11) olyan információkkal szolgál az (endokrin) szervek és a hüvelyi kenet előkészítéséről és értékeléséről, amelyek segítséget nyújthatnak e vizsgálati iránymutatáshoz. SZAKIRODALOM (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic and Cooperation and Development, Paris. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Kérésre elérhető a Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezetnél, Párizs. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Kérésre elérhető a Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezetnél, Párizs. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. 1. függelék FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK (LÁSD MÉG: OECD 150. IRÁNYMUTATÁSA (6)) Androgenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében természetes androgén hormonokhoz (például a tesztoszteronhoz) hasonló hatást fejtsen ki. Antiandrogenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes androgén hormonok (például a tesztoszteron) hatását gátolja. Antiösztrogenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes ösztrogén hormonok (például a 17ß-ösztradiol) hatását gátolja. Antitiroid hatás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes pajzsmirigyhormon (például a T3) hatását gátolja. Vegyi anyag: anyag vagy keverék. Fejlődési toxicitás: reprodukciós toxicitás kifejeződése az utódokban pre-, peri-, posztnatális, szerkezeti vagy funkcionális rendellenességek formájában. Adagolás: általános fogalom, amely a dózist, valamint az adagolás gyakoriságát és időtartamát foglalja magában. Dózis: a vizsgálati vegyi anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálati vegyi anyag súlyának és a kísérleti állat egységnyi testsúlyának napi hányadosaként (például mg/testsúlykilogramm/nap), vagy a takarmányban lévő állandó koncentrációként fejezik ki. Nyilvánvaló toxicitás: általános fogalom, amely a toxicitás vizsgálati vegyi anyag beadását követően kialakuló egyértelmű tüneteire vonatkozik. E tüneteknek elegendőnek kell lenniük a veszély értékeléséhez, továbbá olyan szintet kell képviselniük, amelynél a beadott dózis növelése várhatóan a toxicitás súlyos jeleinek kialakulásához és valószínű mortalitáshoz vezet. Termékenységkárosodás: a hím vagy női szaporodási funkciók vagy képesség terén jelentkező rendellenességeket jelenti. Anyai toxicitás: a vemhes nőstényeket érő káros hatások, amelyek történhetnek specifikusan (közvetlen hatás) vagy nem specifikusan (közvetett hatás). NOAEL: a „no-observed-adverse-effect level” (nem észlelhető káros hatásszint) rövidítése. Ez a legmagasabb dózis, amelynél még nem figyelhetők meg a kezelés okozta káros hatások. Ösztrogenitás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes ösztrogén hormonokhoz (például a 17ß-ösztradiolhoz) hasonló hatást fejtsen ki. Reprodukciós toxicitás: az utódoknál jelentkező káros hatásokat és/vagy a hím vagy női szaporodási funkciók vagy képesség csökkenését jelenti. Vizsgálati vegyi anyag: az e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék. Tiroid hatás: egy vegyi anyag azon képessége, hogy emlősállatok szervezetében a természetes pajzsmirigyhormonhoz (például a T3-hoz) hasonló hatást gyakoroljon. Validáció: tudományos folyamat, amelynek célja egy adott vizsgálati módszer működési követelményeinek és korlátjainak jellemzése, valamint megbízhatóságának és egy adott célhoz kapcsolódó relevanciájának igazolása. 2. függelék A KÍSÉRLETI ÜTEMTERV ÁBRÁJA, AMELY JELZI A VIZSGÁLAT TELJES 14 NAPOS PÁRZÁSI IDŐSZAKON ALAPULÓ MAXIMÁLIS IDŐTARTAMÁT 3. függelék TÁBLÁZATOS ÖSSZEFOGLALÓ JELENTÉS A SZAPORODÁSRA/FEJLŐDÉSRE GYAKOROLT HATÁSOKRÓL MEGFIGYELÉSEK ÉRTÉKEK Adagolás (egységek) 0 (kontroll) ... ... ... ... Kezdő párok (Sz) Ivari ciklus (legalább az átlagos időtartam és az irreguláris ciklusok gyakorisága) Bizonyítottan párosított nőstények (Sz) Vemhességet elért nőstények (Sz) Fogantatás napja 1–5. (Sz) Fogantatás napja 6–...( (21) ) (Sz) Vemhesség ≤ 21 nap (Sz) Vemhesség = 22 nap (Sz) Vemhesség ≥ 23 nap (Sz) Élve született utódokkal rendelkező anyaállatok (Sz) Post-partum 4. napján élő utódokkal rendelkező anyaállatok (Sz) Beágyazódások/anyaállat (átlag) Élő utódok/anyaállat az ellésnél (átlag) Élő utódok/anyaállat a 4. napon (átlag) Ivararány (h/n) az ellésénél (átlag) Ivararány (h/n) a 4. napon (átlag) Alom egyedsúlya az ellésnél (átlag) Alom egyedsúlya a 4. napon (átlag) Utódok súlya születéskor (átlag) Utódok súlya az AGD-mérés időpontjában (hímek átlaga, nőstények átlaga) Utódok AGD-értéke ugyanazon a posztnatális napon, születés – 4. nap (hímek átlaga, nőstények átlaga, posztnatális nap feljegyzése) Utódok súlya a 4. napon (átlag) Hím utódok emlőbimbó-visszamaradása a 13. napon (átlag) Utódok súlya a 13. napon (átlag) RENDELLENES UTÓDOK Anyaállatok 0-val Anyaállatok 1-gyel Anyaállatok ≥ 2-vel UTÓDOK ELVESZTÉSE Prenatális/poszt-implantációs időszak (beágyazódások mínusz élveszületések száma) Anyaállatok 0-vel Anyaállatok 1-gyel Anyaállatok 2-vel Anyaállatok ≥ 3-mal Posztnatális időszak (élveszületések mínusz a 13. posztnatális napon élők száma) Anyaállatok 0-vel Anyaállatok 1-gyel Anyaállatok 2-vel Anyaállatok ≥ 3-mal B.64. KOMBINÁLT ISMÉTELT DÓZISÚ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÉS REPRODUKCIÓS/FEJLŐDÉSI TOXICITÁSI SZŰRŐVIZSGÁLAT BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 422. vizsgálati iránymutatásában (2016) leírt módszerrel. A vegyi anyagok vizsgálatának OECD-iránymutatásait időszakonként felülvizsgálják a tudományos fejlődés fényében. A szűrővizsgálatról szóló eredeti 422. vizsgálati iránymutatást 1996-ban fogadták el a „kombinált ismételt dózisú és reprodukciós/fejlődési szűrővizsgálat” protokollja alapján, amelyet két, 1990-ben Londonban (1) és 1992-ben Tokióban (2) megrendezett szakértői találkozón vitattak meg. 2. Ez a vizsgálati módszer két vizsgálatot ötvöz, egyfelől egy reprodukciós/fejlődési toxicitási szűrővizsgálatot, amely részben a már létező és nagy mennyiségben előállított vegyi anyagokra vonatkozó eredeti módszer alkalmazása során a tagállamokban szerzett tapasztalatokon, részben a pozitív kontrollanyagokkal végzett kísérletekben szerzett ismereteken alapul (3) (4), másfelől egy ismételt dózisú toxicitási vizsgálatot, amely összhangban áll az OECD 407. vizsgálati iránymutatásával (Rágcsálókon végzett 28 napos, ismételt dózisú orális toxicitási tanulmány, e melléklet B.7. fejezete). 3. Az OECD által 1998-ban indított, a meglévő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, valamint az endokrin rendszert esetlegesen károsító anyagok kiszűrésére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati iránymutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenység (5) folyományaként e vizsgálati módszert frissítették az endokrin rendszert károsító anyagok tekintetében releváns végpontokkal. Ebben az összefüggésben az (e melléklet B.7. fejezetének megfelelő) 407. vizsgálati iránymutatást 2008-ban továbbfejlesztették olyan paraméterekkel, amelyek alkalmasak a vizsgálati vegyi anyagok endokrin rendszerre gyakorolt hatásának kimutatására. A 422. vizsgálati iránymutatást abból a célból frissítették, hogy azokba a szűrővizsgálatokat érintő vizsgálati iránymutatásokba, amelyek expozíciós időszakai lefedik a fejlődés egyes érzékeny szakaszait (prenatális vagy korai posztnatális időszakokat), bekerüljenek bizonyos, az endokrin rendszert károsító anyagok tekintetében releváns végpontok. 4. Az endokrin rendszert károsító anyagok tekintetében releváns kiválasztott végpontokat, amelyek részét képezik a 443. vizsgálati iránymutatásnak is (Kibővített egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat, amely e melléklet B.56. fejezetének felel meg), belefoglalták a 422. vizsgálati iránymutatásba azon megvalósíthatósági tanulmány alapján, amely a belefoglalásukkal kapcsolatos tudományos és szakmai kérdésekkel, valamint a vizsgálati terv belefoglalásukhoz szükséges lehetséges módosításaival foglalkozott (6). 5. E vizsgálati módszer célja, hogy korlátozott információkat szolgáltasson a vizsgálati vegyi anyagoknak a hím és női szaporodási teljesítményre, azon belül az ivarmirigyek működésére, a párzási viselkedésre, a fogantatásra, a konceptus fejlődésére és az ellésre gyakorolt hatásairól. A módszer nem képezi a meglévő B.31., B.34., B.35. és B.56. vizsgálati módszer alternatíváját, és nem helyettesíti azokat. ALAPVETŐ MEGFONTOLÁSOK 6. Egy vizsgálati vegyi anyag toxikus jellemzőinek értékelése és felmérése során az ismételt dózisú orális toxicitást azután lehet meghatározni, hogy az akut vizsgálatok kezdeti eredményei már rendelkezésre állnak. Ez a vizsgálat ismereteket szolgáltat azokról a lehetséges egészségügyi veszélyekről, amelyek egy viszonylag korlátozott időszakon keresztül ismétlődő expozíció következtében alakulhatnak ki. A módszer egy alapvető, ismételt dózisú toxicitási vizsgálatot foglal magában, amely a 90 napos vizsgálatot nem igénylő vegyi anyagok esetén (például abban az esetben, ha az előállított mennyiség nem halad meg bizonyos határértékeket), vagy egy hosszú távú vizsgálat előzetes vizsgálataként alkalmazható. A vizsgálatok elvégzése során a klinikai tüneteknek, mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjainak felismeréséről, értékeléséről és használatáról szóló 19. OECD-iránymutatásban (7) ismertetett vezérelveket és szempontokat kell követni. 7. A módszer magában foglal továbbá egy reprodukciós/fejlődési toxicitási vizsgálatot, ezért használható arra is, hogy kiindulási pontként szolgáló információkat nyújtson a hím és női szaporodási teljesítményre, azon belül az ivarmirigyek működésére, a párzási viselkedésre, a fogantatásra, a konceptus fejlődésére és az ellésre gyakorolt lehetséges hatásokról, akár a vegyi anyagokra jellemző toxikológiai tulajdonságok felmérésének korai szakaszában, akár az érintett vegyi anyagok esetében. Ez a vizsgálati módszer nem nyújt teljes körű tájékoztatást a szaporodás és a fejlődés minden vonatkozásáról. Alkalmazhatósága különösen a prenatális expozíció posztnatális tüneteinek, valamint a posztnatális expozíció során esetlegesen előidézett hatásoknak a kimutatása tekintetében korlátozott. A végpontok szelektivitása, a vizsgálat rövid időtartama (és egyéb okok) miatt ez a módszer nem szolgáltat bizonyítékot annak végleges megállapítására, hogy az adott vegyi anyag nem gyakorol hatást a szaporodásra/fejlődésre. Ezen túlmenően, más reprodukciós/fejlődési toxicitási vizsgálatokból nyert adatok hiányában a pozitív eredmények a veszély kezdeti értékelésére használhatók, illetve hozzájárulnak a további vizsgálatok szükségességére és időzítésére vonatkozó döntésekhez. 8. Az endokrin rendszerrel kapcsolatos paraméterek alkalmazásával kapott eredményeket az OECD endokrin rendszert károsító anyagok vizsgálatára és értékelésére vonatkozó fogalmi keretének összefüggésében kell értelmezni (8). Ebben a fogalmi keretben az OECD továbbfejlesztett 422. vizsgálati iránymutatása a 4. szinten helyezkedik el, mint olyan in vivo vizsgálat, amely az endokrin rendszer releváns végpontjaira gyakorolt káros hatásokról szolgáltat adatokat. Egy endokrin jel önmagában azonban még nem tekinthető elegendő bizonyítéknak arra, hogy a vizsgálati vegyi anyag az endokrin rendszert károsító anyag lenne. 9. A vizsgálati módszer emellett hangsúlyt fektet a neurológiai hatásokra mint különleges végpontra, valamint az állatok gondos klinikai megfigyelésének jelentőségére a lehető legtöbb információ megszerzése érdekében. A módszer segítségével azonosíthatók a neurotoxikus hatással rendelkező vegyi anyagok, ami aztán további alaposabb, ilyen irányú kutatást indokolhat. Mindezek mellett a módszer alapinformációkkal szolgálhat az immunológiai hatásokkal kapcsolatban is. 10. Más szisztémás toxicitási, reprodukciós/fejlődési toxicitási, neurotoxicitási és/vagy immunotoxicitási vizsgálatokból nyert adatok hiányában a pozitív eredmények a veszély kezdeti értékelésére használhatók, illetve hozzájárulnak a további vizsgálatok szükségességére és időzítésére vonatkozó döntésekhez. A vizsgálat különösen hasznosnak bizonyulhat, ha az OECD szűrővizsgálati információs adatkészletének (SIDS) részeként alkalmazzák olyan létező vegyi anyagok értékelésére, amelyekről nem vagy csak csekély mértékben állnak rendelkezésre toxikológiai adatok, továbbá helyettesíthet két különálló vizsgálatot: az OECD 407. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű (e melléklet B.7. fejezetében ismertetett) ismételt dózisú toxicitási vizsgálatot és az OECD 421. vizsgálati iránymutatásával egyenértékű (e melléklet B.63. fejezetében ismertetett) reprodukciós/fejlődési toxicitási vizsgálatot. Használható ezenkívül szélesebb körű reprodukciós/fejlődési vizsgálatok dózistartomány-kereső vizsgálataként és egyéb releváns esetekben. 11. Általában feltételezhető, hogy érzékenység tekintetében különbségek vannak a vemhes és nem vemhes állatok között. Következésképpen a két vizsgálat külön-külön történő elvégzéséhez képest e kombinált vizsgálat keretében bonyolultabb lehet meghatározni olyan dózisokat, amelyek egyaránt alkalmasak az általános szisztémás toxicitás és a specifikus reprodukciós/fejlődési toxicitás felmérésére. Emellett előfordulhat, hogy az önállóan végzett ismételt dózisú vizsgálathoz viszonyítva a vizsgálati eredmények nehezebben értelmezhetők az általános szisztémás toxicitás szempontjából, különösen akkor, ha a vizsgálat során nem egy időben értékelik a szérumra és a kórszövettanra vonatkozó paramétereket. A kombinált szűrővizsgálat összetettebb jellege miatt annak végrehajtása jelentős tapasztalatot kíván a toxicitási vizsgálatok terén. xxxMásfelől viszont – amellett, hogy kevesebb számú kísérleti állat részvételét igényli – a kombinált vizsgálat hatékonyabb eszközt nyújthat a szaporodásra/fejlődésre gyakorolt közvetlen hatásoknak a másodlagos, egyéb (szisztémás) hatásoktól való elkülönítéséhez. 12. Ebben a vizsgálatban az adagolási időszak hosszabb az ismételt dózisú vizsgálat szokásos 28 napos időtartamánál. Ugyanakkor csoportonként mindkét nemből kevesebb állat szükséges a vizsgálathoz ahhoz képest, mint amikor a reprodukciós/fejlődési toxicitási vizsgálat mellett végezik el a hagyományos 28 napos, ismételt dózisú vizsgálatot. 13. Ez a vizsgálati módszer a vizsgálati vegyi anyag orális adagolását feltételezi. Más beadási mód alkalmazása esetén szükség lehet a módszer kiigazítására. 14. A vizsgálati módszer tervezett szabályozási célt szolgáló adatgenerálás érdekében, keveréken történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e erre a célra, és ha igen, miért. Ilyen megfontolások nem szükségesek, ha létezik a keverék vizsgálatára vonatkozó szabályozási követelmény. 15. A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza. A VIZSGÁLAT ELVE 16. A vizsgálati vegyi anyagot fokozatosan növekvő dózisokban kell adagolni hím és nőstény állatok több csoportjának. A hímeket legalább négy hétig kell kezelni, egészen a tervezett leölésüket megelőző napig (ez az időtartam magában foglalja a pároztatást megelőző minimum két hetet, a párzási időszakot, valamint a pároztatást követő mintegy két hetes időszakot). Tekintettel a hímek pároztatást megelőző rövid kezelési időszakára, előfordulhat, hogy a termékenység nem kifejezetten érzékeny mutatója a heretoxicitásnak. Ezért a heréken mindenképpen részletes szövettani vizsgálatot kell végezni. A pároztatást megelőző kéthetes kezelési időszak és az azt követően a párzással/termékenységgel kapcsolatban tett megfigyelések, az összesen legalább négy hétig tartó kezelés, majd a hím ivarmirigyek részletes kórszövettani vizsgálata összességében elegendőnek bizonyulnak ahhoz, hogy kimutatható legyen a hím termékenységre és spermatogenezisre gyakorolt hatások többsége. 17. A nőstényeket a vizsgálat teljes időszaka alatt kezelni kell. Ez magában foglalja a párzást megelőző két hetes időszakot (amelynek célja, hogy lefedjen legalább két teljes ivari ciklust), a fogantatáshoz szükséges változó időtartamot, a vemhesség időszakát, az ellést követő legalább tizenhárom napot és a tervezett elpusztítást megelőző napig tartó további kezelést. 18. Az akklimatizációt és az ivari ciklus kezelés előtti felmérését követően megkezdett vizsgálat időtartama a nőstények teljesítményétől függően megközelítőleg 63 nap [legalább 14 napos pároztatás előtti időszak, (legfeljebb) 14 napos párzási időszak, 22 napos vemhesség és 13 napos szoptatás]. 19. Az adagolási időszakban az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése érdekében minden nap gondosan megfigyelik. A vizsgálat során elpusztult, illetve leölt állatokat felboncolják, illetőleg a vizsgálat befejezése után a túlélő állatokat is leölik és felboncolják. A MÓDSZER LEÍRÁSA Az állatfaj kiválasztása 20. Ezt a vizsgálati módszert patkányok használatára tervezték. Ha ebben a 422. vizsgálati iránymutatásban meghatározott paramétereket más rágcsálófajon vizsgálják, a döntést részletesen indokolni kell. A 407. vizsgálati iránymutatás alapján végzett nemzetközi validációs programban a patkány volt az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatására használt egyedüli faj. Nem szabad olyan törzseket alkalmazni, amelyek kevéssé termékenyek vagy amelyekben magas a fejlődési defektusok előfordulási gyakorisága. Korábban vizsgálatban még részt nem vett, egészséges szűz állatokat kell használni. A kísérleti állatokat faj, törzs, nem, súly és kor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok tömege közötti eltérésnek minimálisnak kell lennie és nem haladhatja meg az ivaronkénti átlag ± 20 %-át. Ha a vizsgálatot egy hosszú távú vagy teljes generáción ál tartó vizsgálat előzetes kísérleteként végzik, ajánlatos mindkét vizsgálathoz ugyanabból a törzsből való, azonos eredetű állatokat használni. Az állatok tartása és etetése 21. Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonatkozó helyi szabványoknak. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérsékletének 22°C-nak (±3 °) kell lennie. A relatív páratartalomnak legalább 30 %-nak kell lennie, és a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgálati vegyi anyaggal való megfelelő keveredés igénye is befolyásolhatja, ha a vizsgálati vegyi anyagot a takarmánnyal adják be. 22. Az állatok azonos nemű egyedekből álló kisebb csoportokban tartandók; ha tudományos szempontból indokolt, az állatok egyedileg is elhelyezhetők. Ketrecben való csoportos elhelyezés esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható. A pároztatást erre a célra alkalmas ketrecekben kell végezni. A vemhes nőstényeket egyedileg kell elhelyezni, és el kell látni az alom kialakításához használt (fészeképítő) anyaggal. A szoptató nőstények és utódaik számára külön ketrecet kell biztosítani. 23. Rendszeresen ellenőrizni kell, hogy a takarmány nem tartalmaz-e szennyező anyagokat. A takarmányból egy mintát a jelentés véglegesítéséig meg kell őrizni. Az állatok előkészítése 24. Az egészséges, fiatal, ivarérett állatokat véletlenszerű kiválasztás útján kell a kezelési csoportokba és ketrecekbe osztani. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek a ketrec elhelyezéséből adódó esetleges hatások. Az állatokat az egyedi azonosíthatóság céljából megjelölik, és a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napig a ketrecükben tartják a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából. A dózisok előkészítése 25. A vizsgálati vegyi anyagot ajánlatos orálisan adagolni, kivéve ha más beadási módot tartanak megfelelőbbnek. Orális adagolás esetén a vizsgálati vegyi anyag beadása általában gyomorszondával történik; a vizsgálati vegyi anyagok azonban beadhatók a takarmánnyal vagy az ivóvízzel is. 26. A vizsgálati vegyi anyagot szükség esetén alkalmas vivőanyagban feloldják vagy szuszpendálják. Lehetőség szerint elsősorban vizes oldatot/emulziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más vivőanyagokban elkészített oldatot. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. Meg kell határozni továbbá azt is, hogy a vizsgálati vegyi anyag mennyire stabil és homogén az adott vivőanyagban. ELJÁRÁS Az állatok száma és neme 27. Az egyes csoportok kiindulási létszámát ajánlatos 10 hím és 12–13 nőstény egyedben meghatározni. Az expozíciót megelőzően felmérik a nőstények ivari ciklusát, és a szokásos 4–5 naptól eltérő időtartamú ciklussal rendelkező állatokat nem használják a vizsgálatban; ezért célszerű néhány plusz nőstényről gondoskodni, hogy végül maradjon csoportonként 10 nőstény. Ha nem mutatkoznak jelentős toxikus tünetek, ezzel a létszámmal várhatóan csoportonként legalább 8 vemhes nőstény biztosítható, ami a vemhes nőstények csoportonkénti elfogadható számának alsó határértéke. A cél az, hogy megfelelő mennyiségű vemhesség és utód jöjjön létre ahhoz, hogy érdemileg fel lehessen mérni a vizsgálati vegyi anyag hatását a termékenységre, a vemhességre, az anyai és a szopási viselkedésre, valamint az F 1 utódnemzedék növekedésére és fejlődésére a fogantatástól az ellést követő 13. napig. Ha időközi leölést terveznek, a csoport létszámát a kísérlet során leölni szándékozott állatok számával meg kell növelni. Meg kell fontolni egy további, ivaronként öt állatból álló kísérő csoport alkalmazását a kontrollcsoportban és a legnagyobb adaggal kezelt csoportban, amelyen a kezelés időszakát követően legalább 14 napig megfigyelhető a szisztémás toxikus hatás visszafordíthatósága, tartóssága vagy késleltetett kialakulása. A kísérő csoportba tartozó állatok nem vesznek részt a pároztatásban, ezért nem használhatók a reprodukciós/fejlődési toxicitás értékelésére. Adagolás 28. Általánosan 3 kezelt csoportot és egy kontrollcsoportot alkalmaznak. Ha nem állnak rendelkezésre megfelelő általános toxikológiai adatok, az alkalmazandó dózisok meghatározása céljából tartománybehatároló vizsgálat végezhető (azonos törzsből való, azonos eredetű állatokon). A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgálati vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket. Ha a vizsgálati vegyi anyag beadásához vivőanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportnak a vivőanyagból a felhasznált legnagyobb mennyiséget kell kapnia. 29. A dózisok kiválasztásánál figyelembe veszik a toxicitásra és (toxiko)kinetikára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. Emellett ügyelni kell arra is, hogy érzékenység tekintetében különbségek lehetnek a vemhes és nem vemhes állatok között. A legmagasabb dózist úgy kell kiválasztani, hogy az toxikus tüneteket keltsen, de ne okozzon halált vagy nyilvánvaló szenvedést a kísérleti állatoknak. Ezután az adagokat fokozatosan csökkentik, azzal a céllal, hogy kimutassák az adagolási szinttől függő hatásokat, illetve a legalacsonyabb adagolási szinten a káros hatások hiányát. Sokszor bizonyul optimálisnak a kettő–négyszeres intervallum alkalmazása, a nagyon nagy intervallumok (pl. több mint 10-szeres szorzófaktor) alkalmazása helyett pedig gyakran célszerű egy negyedik vizsgálati csoportot beiktatni. 30. Ha általános toxicitást (például testsúlycsökkenést, a májra, a szívre, a tüdőre vagy a vesére kifejtett hatásokat stb.) vagy egyéb, nem feltétlenül toxikus reakcióra utaló változásokat (például csökkent táplálékfogyasztást, májmegnagyobbodást) figyelnek meg, az endokrin rendszer szempontjából érzékeny végpontok tekintetében megfigyelt hatások értelmezésekor óvatosan kell eljárni. Határérték-vizsgálat 31. Ha egy egyetlen, legalább 1 000 mg/testtömeg-kg/nap orális dózis felhasználásával végzett, vagy táplálékkal vagy ivóvízzel történő beadás esetén a táplálékban vagy ivóvízben ezzel egyenértékű (a testsúly alapján végzett számításokon alapuló) százalékos arány alkalmazásával történő és az itt ismertetett eljárások szerint lefolytatott vizsgálat nem idéz elő észlelhető toxikus hatást, és ha a szerkezet tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, a teljes, több dózist átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthető. A határérték-vizsgálat alkalmazandó, kivéve, ha az emberi expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja. Más típusú beadási módok, így például inhalálás vagy dermális alkalmazás esetén a vizsgálati vegyi anyag fizikai-kémiai tulajdonságai gyakran előre jelezhetik az expozíció lehetséges maximumát. A dózisok beadása 32. Az állatoknak a vizsgálati vegyi anyagot heti hét napon át, naponta adagolják. Ha a vizsgálati vegyi anyagot szondán át adagolják, lehetőleg egyetlen adagban kell gyomorszondán vagy megfelelő intubációs kanülön át beadni. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. A térfogat nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt, kivéve vizes oldatok esetében, amikor 2 ml/100 g testtömegarány is alkalmazható. A magasabb koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy korrozív vizsgálati vegyi anyagok kivételével a koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgálati vegyi anyag mennyiségének változásait, hogy a mennyiség valamennyi dózisnál konstans legyen. 33. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vizsgálati vegyi anyagok esetében fontos annak biztosítása, hogy a vizsgálati vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizsgálati vegyi anyagot a táplálékkal együtt adják be, vagy állandó koncentrációban (ppm) keverik be, vagy az állat testsúlyától függő, állandó nagyságú dózisban adagolják; a kiválasztott alternatívát meg kell nevezni. A gyomorszondával bejuttatott vizsgálati vegyi anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló időszakában kell beadni, és legalább hetente újra be kell állítani ahhoz, hogy az állat testtömegéhez viszonyítva állandó értéken lehessen tartani. Ha a kombinált vizsgálatot egy hosszan tartó vagy teljes generáción át tartó toxicitási vizsgálat előkísérleteként végzik, a két vizsgálatban azonos étrendet alkalmaznak. A kísérleti program 34. Az adagolást mindkét ivar esetében 2 héttel a pároztatás előtt el kell kezdeni, miután az állatok legalább öt napon keresztül akklimatizálódtak, és (egy kéthetes kezelés előtti időszak során) ellenőrizték, hogy a nőstények ivari ciklusa megfelel-e a normál ciklusidőnek. A vizsgálatot úgy kell időzíteni, hogy az ivari ciklus értékelése röviddel a teljes ivarérettség elérését követően megkezdődjön. Ez az egyes laboratóriumokban használt különféle patkánytörzsek függvényében némileg változó, a Sprague-Dawley törzsbe tartozó patkányok esetében például 10 hetes korukban, a Wistar-törzsbe tartozók esetében pedig 12 hetes korukban következik be. Az utódokkal rendelkező anyaállatokat az ellést követő 13. napon vagy röviddel azután el kell pusztítani. Annak érdekében, hogy a vérvétel előtti éjszaka koplaljanak az anyaállatok (ha ez a kiválasztott módszer), nem feltétlenül szükséges ugyanazon a napon elpusztítani az anyaállatot és utódait. A születés napja (vagyis amikor lezárul az ellés) a post-partum 0. napja. Azokat a nőstényeket, amelyek semmi jelét nem mutatják annak, hogy párosodtak volna, a párzási időszak utolsó napját követő 24–26 nappal el kell pusztítani. Az adagolást a párzási időszakban sem szabad abbahagyni egyik nem esetében sem. A hímeket a párzási időszakot követően továbbra is kezelni kell, legalább a minimális, 28 napos adagolási időszak végéig. Ezt követően leölik, vagy ha úgy ítélik megfelelőnek, megtartják azokat, és egy esetleges második pároztatás céljából tovább folytatják kezelésüket. 35. Az anyaállatok napi szintű kezelését folytatni kell a vemhesség teljes időszakán át egészen a post-partum 13. napjáig vagy az elpusztításukat megelőző napig. Azon vizsgálatoknál, amelyek keretében a vizsgálati vegyi anyagot inhalálás vagy dermális alkalmazás útján adják be, a kezelést folytatni kell legalább a vemhesség 19. napjáig, majd a lehető leghamarabb, de legkésőbb a 4. posztnatális napon (PNN) újra kell kezdeni. 36. Amennyiben vizsgálatot követő megfigyelés céljából létrehoztak kísérő csoportot, a csoportba tartozó állatok nem vesznek részt a pároztatásban. Ezeket az állatokat az anyaállatok első tervezett leölését követően még legalább 14 napig tartják kezelés nélkül, hogy megfigyeljék a toxikus hatások késleltetett előfordulását, fennmaradását vagy visszafordíthatóságát. 37. A kísérleti ütemterv ábráját a 2. függelék tartalmazza. Ivari ciklus 38. A kezelés megkezdése előtt ellenőrizni kell az ivari ciklust, hogy szabályos ciklussal rendelkező nőstények kerüljenek kiválasztásra a vizsgálathoz (lásd a 27. pontot). Emellett napi szinten kell vizsgálni a hüvelyi kenetet is, a kezelési időszak kezdetétől mindaddig, amíg be nem bizonyosodik, hogy megtörtént a párzás. Ha felmerül a lehetősége annak, hogy az adagolás megkezdése olyan akut stresszhatást idéz elő, amely módosíthatja az ivari ciklust, a laboratóriumok eljárhatnak úgy is, hogy két hétig kezelik a vizsgálati állatokat, majd a pároztatás előtti időszakban legalább két hétig naponta hüvelyi kenetet vesznek az ivari ciklus ellenőrzéséhez, amelyet a párzási időszak során is folyamatosan figyelemmel kísérnek egészen a párzás megtörténtéig. A hüvelyi/méhnyaki sejtvétel során ügyelni kell arra, hogy meg ne sérüljön a nyálkahártya, mert az álvemhességet idézhet elő (8) (9). A pároztatási eljárás 39. Rendes esetben e vizsgálat során 1:1 (egy hím-egy nőstény) pároztatást kell alkalmazni. Ettől abban az esetben lehet eltekinteni, ha a hímek közül elpusztul valamelyik. A nőstényt egy adott hímmel kell összerakni, és addig kell együtt hagyni azokat, amíg meg nem győződtek a párzás megtörténtéről, vagy 2 hét el nem telik. Minden reggel meg kell vizsgálni, hogy a nőstényben észlelhető-e sperma vagy a hüvelydugó. A vemhesség 0. napja definíció szerint az a nap, amikor a párosodás tényét megerősítették (hüvelydugó vagy sperma figyelhető meg a nőstényben). Ha a pároztatás sikertelen volt, fontolóra lehet venni a nőstények újrapároztatását egy azonos csoportbeli és már sikeresen pároztatott hímmel. Az alom mérete 40. Az ellés utáni negyedik napon az egyes almok egyedszáma a létszám fölötti kölykök véletlenszerű eltávolításával módosítható, hogy almonként az eredmény – amennyire lehetséges – a használt patkánytörzsre jellemző ivaronkénti négy vagy öt utód legyen. Két létszám feletti kölyöktől vérmintát kell venni, egybe kell gyűjteni és fel kell használni a T4 szérumszintek meghatározásához. A kölykök szelektív, például a testtömeg vagy az anogenitális távolság (AGD) alapján történő eltávolítása nem elfogadható. Ha a hím és nőstény utódok száma nem teszi lehetővé a nemenként négy vagy öt azonos nemű utódot tartalmazó almok kialakítását, részleges kiegyenlítés is elfogadható (például hat hím és négy nőstény). Amennyiben az alom egyedszáma a selejtezési célérték (almonként 8 vagy 10 utód) alá csökkenne, nem kell eltávolítani kölyköket. Ha az alom mérete csupán eggyel haladja meg a selejtezési célértéket, csak egy kölyköt távolítanak el, és attól vesznek vért a T4 szérumszintek esetleges értékelésekhez. 41. Ha nem igazítják ki az alom egyedszámát, az ellést követő 4. napon almonként két kölyköt elpusztítanak, és vérmintát vesznek tőlük a pajzsmirigyhormonok szérumkoncentrációjának méréséhez. Lehetőség szerint az almonkénti két kölyök nőstény legyen, hogy maradjanak hímek az emlőbimbó-visszamaradás megállapításához, kivéve abban az esetben, ha a nőstény utódok eltávolítása miatt nem maradna nőstény a vizsgálat végi értékeléshez. Amennyiben az egyedszám az almonkénti 8 vagy 10 utód alá esne (a használt patkánytörzsre jellemző szokásos alommérettől függően), nem kell eltávolítani kölyköket. Ha az alom egyedszáma csupán eggyel haladja meg az alom szokásos méretét, csak egy kölyköt távolítanak el, és attól vesznek vért a T4 szérumszintek esetleges értékelésekhez. Megfigyelések 42. Naponta legalább egyszer, lehetőleg minden nap ugyanazon időpont(ok)ban általános klinikai megfigyelést kell végezni, figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Fel kell jegyezni a kísérleti állatok klinikai állapotát. Naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot morbiditás és mortalitás szempontjából. 43. Az első expozíció előtt egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), azt követően pedig legalább hetente egyszer az összes szülőt részletes klinikai vizsgálatoknak kell alávetni. E megfigyeléseket azokon a ketreceken kívül, ahol egyébként tartják őket, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a nap hasonló időszakában végzik el. A megfigyeléseket gondosan feljegyzik; lehetőleg a vizsgálatot végző laboratórium által meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti körülmények közötti eltérések, és hogy a megfigyeléseket lehetőleg olyan megfigyelők végezzék, akik nem tudnak a kezelésről. A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a bőr, a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, szőrzet felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében megfigyelhető változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre adott reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztereotip viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés), az elhúzódó vagy nehéz ellés, illetve bármilyen bizarr viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (10). 44. A vizsgálat során egy alkalommal minden csoportból véletlenszerűen kiválasztott öt hímen és öt nőstényen meg kell figyelni a különféle (pl. hallószervi, vizuális, proprioceptív) ingerekre adott szenzoros reaktivitást (8) (9) (11), meg kell mérni a fogóerőt (12) és értékelni kell a motoros aktivitást (13). A követendő eljárásokkal kapcsolatban további részletek a vonatkozó szakirodalomban találhatók. Ettől függetlenül a hivatkozottaktól eltérő alternatív eljárások is alkalmazhatók. A hímek esetében ezeket a funkcionalitási megfigyeléseket az adagolási időszak vége felé, röviddel tervezett leölésük előtt, de még a hematológiai és klinikai kémiai célú vérvételt megelőzően kell elvégezni (lásd az 53–56. pontot és az 1. lábjegyzetet). A nőstényeknek fiziológiai szempontból hasonló állapotban kell lenniük a funkcionalitási vizsgálatok során, ezért célszerű vizsgálatukat röviddel tervezett leölésük előtt, a szoptatás utolsó hetében elvégezni (pl. a 6–13. szoptatási napon). Törekedni kell arra, hogy az anyaállatok és kölykeik a lehető legrövidebb ideig legyenek elválasztva egymástól. 45. A vizsgálat vége felé esedékes, egyszeri funkcionalitási megfigyelések elhagyhatók, ha a vizsgálatot egy azt követő (90 napos) szubkrónikus vagy hosszú távú vizsgálat előzetes tanulmányaként végzik. Ebben az esetben a funkcionalitási megfigyeléseket az utóbbi vizsgálat részeként kell elvégezni. Másrészt az ismételt dózisú vizsgálat során végzett funkcionalitási megfigyelések adatainak megléte segítheti az azt követő szubkrónikus vagy hosszú távú vizsgálat során a dózisok kiválasztását. 46. Kivételes esetekben a funkcionalitási megfigyelések elhagyhatók azon csoportoknál is, amelyek egyébként olyan mértékű toxicitási tüneteket mutatnak, hogy az jelentős mértékben megzavarná a funkcionalitási vizsgálat eredményeit. 47. A vemhesség nulladik napjától számítandó terhességi (gesztációs) időszakról feljegyzést kell készíteni. Az ellés után minden almot a lehető leghamarabb meg kell vizsgálni a kölykök számának és ivarának, a halvaszületések, élveszületések és fejletlen egyedek (a megfelelő kontrollcsoportba tartozó kölyköknél jelentősen kisebb utódok) számának, valamint a súlyos rendellenességek jelenlétének megállapításához. 48. Az élő kölyköket meg kell számolni, nemüket meg kell állapítani, és az almok egyedeinek súlyát meg kell mérni a születést követő 24 órán belül (a post-partum 0. vagy 1. napján) és legalább a post-partum 4. és 13. napján. A szülőkön végzett (43. és 44. pontban említett) megfigyelések mellett az utódok minden rendellenes viselkedéséről be kell számolni. 49. Az anogenitális távolságot (AGD) minden utódon legalább egy alkalommal meg kell mérni a 0. és 4. posztnatális nap között. A kölykök testtömegét azon a napon kell megmérni, amikor az AGD-t is mérik, és az AGD-t normálni kell a kölykök méretére, ami lehetőleg a testtömeg köbgyöke (14). Az OECD 151. vizsgálati iránymutatásának (15) ajánlása szerint a hím utódok emlőbimbóinak/emlőbimbóudvarainak számát meg kell számolni a 12. vagy 13. posztnatális napon. Testtömeg és táplálék-/vízfogyasztás 50. A hímek és nőstények testsúlyát meg kell mérni az adagolás első napján, majd ezt követően legalább hetente és a vizsgálat végén meg kell ismételni a mérést. A nőstényeket a vemhesség alatt a 0., 7., 14. és 20. napon kell megmérni, továbbá az ellést követő 24 órán belül (a post-partum 0. vagy 1. napján) és legalább a post-partum 4. és 13. napján. A megfigyeléseket minden egyes felnőtt állat esetében külön-külön kell rögzíteni. 51. A pároztatás előtt, valamint a vemhesség és a szoptatás ideje alatt a takarmányfogyasztást legalább hetente kell mérni. A párzási időszak során nem kell feltétlenül mérni a takarmányfogyasztást. Ha a vizsgálati vegyi anyagot az ivóvízzel adagolják, ezen időszakok során a vízfogyasztást is mérni kell. Hematológia 52. A vizsgálat során egy alkalommal minden csoportból véletlenszerűen kiválasztott öt hímen és öt nőstényen el kell végezni az alábbi hematológiai vizsgálatokat: hematokrit, hemoglobin koncentrációk, vörösvértestszám, retikulocitaszám, leukocitaszám (teljes és differenciált vérkép), trombocitaszám és a véralvadási idő/képesség mérése. Ha a vizsgálati vegyi anyagról vagy annak vélt metabolitjairól ismert vagy feltételezhető, hogy oxidáló tulajdonságokkal rendelkeznek, az említett vizsgálatokon kívül többek között a methemoglobin-koncentrációt és a Heinz-testek előfordulását is meg kell határozni. 53. A vérmintákat egy megnevezett helyről kell levenni. A nőstényeknek fiziológiai szempontból hasonló állapotban kell lenniük a vérvétel során. A vemhesség kialakulásának eltérő időpontjából adódó gyakorlati nehézségek elkerülése érdekében a nőstényektől a pároztatás előtti időszak végén is vehető vérminta ahelyett, hogy közvetlenül az állatok elaltatása előtt vagy az elaltatási folyamat részeként vennék le a mintát. A hímektől viszont célszerű közvetlenül az állatok végleges elaltatása előtt vagy az elaltatási folyamat részeként vérmintát venni. Alternatív megoldásként a hímektől is vehető vér a pároztatás előtti időszak végén, amennyiben a nőstények esetén is ez az időpont került kiválasztásra. 54. A vérmintákat megfelelő feltételek mellett kell tárolni. Klinikai biokémiai vizsgálatok 55. A szövetekben jelentkező fontosabb toxikus hatások és különösen a vesékre és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek meghatározását az egyes csoportokból kiválasztott öt hím és öt nőstény vérmintáján végzik el. A vérvétel előtti éjszaka ajánlatos az állatokat koplaltatni ( 22 ) . A vérplazma- és vérszérum-meghatározások során vizsgálandó elemek: nátrium, kálium, vércukor, összkoleszterin, karbamid, kreatinin, összprotein és albumin, továbbá legalább két, a májsejti hatásokat jelző enzim (pl. alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz és szorbitol dehidrogenáz) és epesavak. Bizonyos körülmények között hasznos információk nyerhetők további (májból vagy máshonnan származó) enzimek, valamint a bilirubin méréséből. 56. Vérmintákat egy meghatározott helyről kell venni, az alábbi ütemezés szerint: — almonként legalább két kölyöktől a születést követő 4. napon, amennyiben azt az utódok száma lehetővé teszi (lásd a 40–41. pontot), — az összes anyaállattól és almonként legalább két kölyöktől a vizsgálat végét jelentő 13. napon, és — az összes felnőtt hímtől a vizsgálat végén. A vérmintákat megfelelő körülmények között tárolják. A 13 napos utódoktól és a felnőtt hímektől vett vérminták alapján értékelik a pajzsmirigyhormon (T4) szérumszinteket. Szükség esetén a T4 további értékeléséhez felhasználhatók az anyaállatoktól és a 4 napos utódoktól vett vérminták. Ha a vizsgálat szempontjából lényeges, más hormonok is mérhetők. A pajzsmirigyhormon analízisekhez almonként egyesíteni lehet a kölyköktől vett vérmintákat. A pajzsmirigyhormonokra (T4 és TSH) vonatkozó mérésekhez lehetőleg a teljes vérmintát kell használni. 57. Kiegészítésként, a vizsgálat utolsó hetében, amikor a vizeletet előre meghatározott időpontokban gyűjtik, az alábbi vizeletminta-vizsgálatokat lehet elvégezni az egyes csoportokból véletlenszerűen kiválasztott öt hím tekintetében: megjelenés, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, fehérjék, glukóz és vér/vérsejtek. 58. Ezeken túlmenően megfontolható az általános szöveti roncsolódás szérummarkereinek vizsgálata. Más vizsgálatokat is elvégeznek, ha a vizsgálati vegyi anyagnak ismert vagy feltételezhető hatása van a kapcsolódó anyagcsere-folyamatokra; ilyen pl. a kalcium, a foszfát, éhgyomorra mért triglicerid és glukóz, egyes hormonok, a methemoglobin és a kolinészteráz mérése. Ezeket eseti alapon kell meghatározni. 59. A hormonok meghatározásának variabilitását és az azzal kapott abszolút koncentrációt az alábbi tényezők befolyásolhatják: — az elpusztítás időpontja, tekintettel a hormonkoncentrációk nap folyamán tapasztalható ingadozására, — az állatot érő indokolatlan stressz elkerülése érdekében alkalmazott elpusztítási mód, amely hatással lehet a hormonkoncentrációkra, — a hormonmeghatározásokhoz alkalmazott, standard görbéjük tekintetében esetlegesen eltérő vizsgálati készletek. 60. A kifejezetten hormon-meghatározási célra szánt plazmamintákat a nap hasonló időpontjában kell gyűjteni. A kereskedelmi fogalomban kapható különböző vizsgálati készletek eltérő számszerű értékeket adnak a hormonkoncentrációk elemzése során. 61. Ha a rendelkezésre álló kiinduló adatok nem bizonyulnak elegendőnek, megfontolandó a hematológiai és klinikai biokémiai változók meghatározása az adagolás kezdete előtt, lehetőség szerint az állatok egy, a kísérleti csoportokba nem tartozó csoportjánál. Nőstények esetében az adatok szoptató anyaállatokról kell származzanak. PATOLÓGIA Makroszkópos boncolás 62. A vizsgálatokba bevont összes ivarérett állatot teljes körű, beható autopsziának kell alávetni, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. Külön figyelmet kell szentelni a szaporítószerveknek. A beágyazódási helyek számát fel kell jegyezni. A boncolás napján meg kell vizsgálni a hüvelyi kenetet az ivari ciklus aktuális szakaszának meghatározásához, hogy lehetővé váljon a korreláció felállítása a női szaporítószervek kórszövettanával. 63. Az összes hím felnőtt állat heréit és mellékheréit, prosztatáját és ondóhólyagjait a koaguláló mirigyekkel egy egységként meg kell tisztítani minden rátapadt szövettől, és a kiszáradás megelőzése érdekében a boncolást követően a lehető legrövidebb időn belül meg kell mérni nedves tömegüket. Ezen túlmenően további szervtömegmérések végezhetők hímeknél a végbélemelő és a bulbocavernosus izomra, a Cowper-mirigyekre és a glans penisre, nőstényeknél a páros petefészekre (nedves tömeg) és a méhre (valamint a méhnyakra) kiterjedőleg; ha ezeket a szerveket is bevonják a mérésbe, tömegüket a boncolás után lehető leghamarabb meg kell határozni. Meg kell őrizni az összes felnőtt állat petefészkeit, heréit, mellékheréit, a járulékos ivarszerveket, valamint a makroszkópikus léziókat mutató szerveket. 64. Ezenfelül a későbbi tervezett kórszövettani vizsgálatok szempontjából leginkább megfelelő fixálószerben meg kell őrizni valamennyi felnőtt hím és nőstény, továbbá minden alomból egy hím és egy nőstény 13 napos kölyök pajzsmirigyét. A pajzsmirigy súlya a fixálást követően is meghatározható. A megtisztítás a szövetkárosodás elkerülése érdekében ez esetben is igen óvatosan, kizárólag a fixálást követően végzendő el. A szövetkárosodás veszélyeztetheti a kórszövettani elemzést. A vérmintákat egy megnevezett helyről kell venni, közvetlenül az állatok végleges elaltatása előtt vagy aközben, és azokat megfelelő körülmények között kell tárolni (lásd a 56. pontot). 65. Ezen túlmenően (a haldokló és/vagy a vizsgálat vége előtt elaltatott egyedeken kívül) minden csoportból véletlenszerűen kiválasztott legalább öt felnőtt hím és nőstény máját, veséit, mellékveséit, csecsemőmirigyét, lépét, agyát és szívét megtisztítják minden rátapadt szövettől, és a kiszáradás megelőzése érdekében a boncolást követő lehető legrövidebb időn belül megmérik nedves tömegüket. Az alábbi testszöveteket konzerválni kell a szövetek típusa és a szándékolt későbbi kórszövettani vizsgálatok szempontjából legmegfelelőbb fixálószerben: szövetet, amelyen van makroszkopikus lézió, az agyat (jellemző részeket, mint pl. a nagyagy, a kisagy, a nyúltagyi híd), a gerincvelőt, a szemet, a gyomrot, a vékony- és vastagbelet (beleértve a Payer-plakkot), a májat, a veséket, a mellékveséket, a lépet, a szívet, a csecsemőmirigyet, a légcsövet és a tüdőket (utóbbit először megtöltik fixálószerrel, és úgy merítik alá), az ivarmirigyeket (heréket és petefészkeket), a járulékos nemi szerveket (a méhet és a méhnyakat, a mellékheréket, a prosztatát és az ondóhólyagokat a koaguláló mirigyekkel), a hüvelyt, a húgyhólyagot, a nyirokcsomókat (a legközelebbi elvezető nyirokcsomó mellett a laboratórium tapasztalata alapján másik nyirokcsomót is vételezni kell (16)), a perifériás idegeket (csípő vagy sípcsont környéki), lehetőleg az izomzathoz közeli helyről véve, a vázizomzatot és csontot a csontvelővel együtt (metszetet és/vagy egy, friss csontvelőből felszívott mintát). A herék fixálását javasolt Bouin- vagy módosított Davidson-féle fixálószerbe merítéssel végezni (16) (17) (18); e szövetek esetében formalinos fixálás használata nem ajánlott. A tunica albugineán a fixálószer gyors bejutása érdekében tűvel óvatosan sekély szúrást lehet ejteni a szerv mindkét végén. A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet is, amely a vizsgálati vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszervnek tekinthető. 66. Az alábbi szövetek értékes információkat nyújthatnak az endokrin rendszerre gyakorolt hatásokról: ivarmirigyek (petefészkek és herék), járulékos ivarszervek (méh és méhnyak, mellékherék, ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel, a prosztata dorzolaterális és ventrális része), hüvely, agyalapi mirigy, hím emlőmirigy és mellékvese. A hím emlőmirigyek elváltozásairól nem áll rendelkezésre kellő dokumentáció, azonban ez a paraméter igen érzékeny lehet az ösztrogénhatású anyagokra. A 65. pontban nem szereplő szervek/szövetek megfigyelése nem kötelező. 67. Az elhullott és a post-partum 13. napján vagy röviddel azután elpusztított utódokat legalább külsőleg alaposan meg kell vizsgálni, hogy láthatók-e rajtuk súlyos rendellenességek. Különös figyelmet kell szentelni a külső ivarszervek vizsgálatának, és ezen belül a rendellenes fejlődés jeleinek. Kórszövettan 68. A kontrollcsoport és a magas dózissal kezelt csoport kiválasztott egyedeinek tartósított szerveit és szöveteit teljes kórszövettani vizsgálatnak vetik alá (különös figyelmet fordítva a hím ivarmirigyek spermatogenezisének szakaszaira és a here intersticiális sejtfelépítésének kórszövettanára). Szükség esetén vizsgálni lehet az utódoktól és a fennmaradó felnőtt állatoktól származó pajzsmirigyet. Ha a magas dózissal kezelt csoport egyedei esetében a kezelésnek tulajdonítható elváltozások figyelhetők meg, e vizsgálatokat ki kell terjeszteni más dózissal kezelt csoportok egyedeire is. A kórszövettani iránymutatás (10) további információkat tartalmaz az endokrin szövetek boncolásával, fixálásával, metszeteinek elkészítésével és kórszövettani vizsgálatával kapcsolatban. 69. Minden makroszkopikus léziót meg kell vizsgálni. A NOAEL értelmezéséhez segítséget nyújthat más dózissal kezelt csoportokból származó célszervek vizsgálata, különösen azokból, amelyekben a kezelés állítólag nem járt káros hatással. 70. Kísérő csoport használata esetén azon szerveken és szöveteken kell kórszövettani vizsgálatot végezni, amelyeknél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozásokat lehetett kimutatni. ADATOK ÉS JELENTÉS Adatok 71. Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett minden adatot táblázatos formában is össze kell foglalni, amelyben minden egyes vizsgálati csoport esetében fel kell tüntetni az állatok számát a vizsgálat kezdetén, a vizsgálat során elpusztult vagy humánus okok miatt elaltatott állatok számát, az elhullások és az eutanáziák időpontját, a termékeny állatok számát, a vemhes nőstények számát, a toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ezen belül bármely toxikus tünet megjelenésének időpontját, valamint ezek időtartamát és súlyosságát, a kórszövettani elváltozások típusait és az almokra vonatkozó minden idevágó adatot. A 3. mellékletben közzéteszünk egy, a reprodukciós/fejlődési hatások értékelése során nagyon hasznosnak bizonyult, táblázatos formájú összefoglaló jelentést. 72. A számszerű eredményeket lehetőség szerint megfelelő és általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A hatás dózistartomány mentén történő összehasonlításaival kiküszöbölhető a több t-próba alkalmazása. A statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell megválasztani. Az anogenitális távolság és az emlőbimbó-visszamaradás statisztikai elemzésének az utódokra vonatkozó egyedi adatokon kell alapulnia, ugyanakkor figyelembe kell vinni az alom által gyakorolt hatásokat. Ahol megfelelő, az elemzés egysége az alom. A kölykök testsúlyára vonatkozó statisztikai elemzésnek a kölykök egyedi adatain kell alapulnia, ugyanakkor figyelembe kell vinni az alom által gyakorolt hatásokat. A vizsgálat korlátozott terjedelme miatt a „szignifikancia” felmérésére szolgáló vizsgálatok formájában végzett statisztikai elemzések számos végpont, különösen a reprodukciós végpontok szempontjából csekély jelentőséggel bírnak. A legelterjedtebb módszerek némelyike – különösen a központi érték mérésére szolgáló paraméteres próbák – nem megfelelők. Amennyiben statisztikai elemzésekre támaszkodnak, még a vizsgálat megkezdése előtt olyan módszert kell választani, amelyik megfelel a vizsgált változók eloszlásának. Az eredmények értékelése 73. E toxicitási vizsgálat eredményeit a megfigyelt hatások, valamint a boncolási és mikroszkópos eredmények szempontjából kell értékelni. Az értékelés során ki kell térni a vizsgálati vegyi anyag dózisa és a rendellenességek, ezen belül a súlyos léziók, az azonosított célszervek, a terméketlenség, a klinikai rendellenességek, a csökkent reproduktív teljesítmény és egyedszám, a testtömegváltozások, a mortalitásra gyakorolt hatások és egyéb toxikus hatások megléte vagy hiánya, illetve gyakorisága és súlyossága közötti összefüggésekre. 74. A hímek rövid kezelési időszaka miatt a hímekre gyakorolt reprodukciós hatások felmérése során figyelembe kell venni a herék és mellékherék kórszövettanát, valamint a termékenységre vonatkozó adatokat. A szaporodásra/fejlődésre (pl. alomméretre, anogenitális távolságra, emlőbimbó-visszamaradásra, T4 szérumszintekre) vonatkozólag rendelkezésre álló korábbi kontrolladatok szintén hasznos segítséget nyújthatnak a vizsgálat értelmezéséhez. 75. A minőség-ellenőrzéshez javasolt történeti kontrolladatokat gyűjteni, a számszerű adatokhoz pedig kiszámítani a variációs együtthatót, különösen az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatásával összefüggő paraméterek tekintetében. Ezek az adatok felhasználhatók összehasonlítási célokra a tényleges vizsgálatok kiértékelése során. Vizsgálati jelentés 76. A vizsgálati jelentésnek a következőket kell tartalmaznia: Vizsgálati vegyi anyag: — eredet, gyártási szám, felhasználási határidő, ha rendelkezésre áll; — a vizsgálati vegyi anyag stabilitása, ha ismert; Egy összetevőből álló anyag: — fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok; — kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-névvel, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet alapján, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonosítója stb. alapján Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek: — amennyiben lehetséges, az összetevők kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai révén jellemezve . Vivőanyag (ha van): — a vivőanyag kiválasztásának indokolása, ha az nem víz. Kísérleti állatok: — használt faj/törzs; — az állatok száma, kora és neme; — az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.; — az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetekor; — patkánytól eltérő faj alkalmazásának indokolása. Vizsgálati körülmények: — a dózisok kiválasztásának indokolása; — a vizsgálati vegyi anyag formulázásával/a takarmány előkészítésével, az elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitásával kapcsolatos adatok; — a vizsgálati vegyi anyag beadására vonatkozó részletek; — átszámítás a vizsgálati vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez alkalmazható; — a táplálék és víz minőségére vonatkozó részletek; — a selejtezés során a kölykök kiválasztására használat randomizálási eljárás részletes leírása, ha sor került selejtezésre. Eredmények: — testsúly és annak változásai; — táplálék- és vízfogyasztásra vonatkozó adatok, ha alkalmazható; — a toxikus reakciók adatai nemenként és dózisonként, beleértve a termékenységet, a gesztációs időt és a toxicitás egyéb — tüneteit is; — a vemhesség időtartama; a szaporodásra, az utódokra, a posztnatális növekedésre stb. gyakorolt toxikus vagy egyéb hatások; — a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és időtartama (a változások visszafordíthatók-e vagy sem); — az érzékszervi aktivitás, a szorítási erősség és a motoros aktivitás értékelése; — hematológiai vizsgálatok eredményei, a megfelelő viszonyítási értékekkel; — a klinikai biokémiai vizsgálatok eredményei, a megfelelő viszonyítási értékekkel; — normális vagy abnormális ivari ciklust mutató felnőtt nőstények száma és a ciklus időtartama; — az élveszületések száma és a beágyazódás utáni veszteség; — a szemmel látható rendellenességeket mutató kölykök száma; a külső nemi szervek makroszkopikus értékelése, a fejletlen utódok száma; — a vizsgálat során bekövetkezett elhullás ideje, illetve hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét; — a beágyazódások száma, az alomméret és az almokban lévő egyedek méréskor rögzített testsúlya; — utódok testsúlyadatai; — az összes utód anogenitális távolsága (és az AGD-mérés napján rögzített testsúlyuk); — emlőbimbó-visszamaradás a hím utódoknál; — pajzsmirigyhormonok szintje 13 napos kölyköknél és felnőtt hímeknél (az anyaállatoknál és 4 napos kölyköknél, ha mérték); — a testtömeg az elpusztításkor, valamint a szülők szervtömegadatai; — boncolási eredmények; — a kórszövettani leletek részletes ismertetése; — felszívódási adatok (ha vannak); — adott esetben az eredmények statisztikai feldolgozása. Az eredmények értékelése. Következtetések Az eredmények értelmezése 77. Ez a vizsgálat az ismételt dózisok útján történő kezeléssel összefüggésben kimutatható reprodukciós/fejlődési toxicitás értékelésére szolgál. Különösen mivel mind az általános toxicitási, mind a reprodukciós/fejlődési végpontokra hangsúlyt fektetnek, a vizsgálat eredményei lehetővé teszik az általános toxicitás hiányában is fellépő reprodukciós/fejlődési hatások megkülönböztetését azoktól, amelyek csak a szülőkre is toxikus szintek mellett fejeződnek ki (lásd a 7–11. pontot). Jelezheti a további vizsgálatok szükségességét, és iránymutatást nyújthat a későbbi vizsgálatok kialakításához. A szaporodási és fejlődési eredmények értelmezésével kapcsolatban az OECD 43. iránymutatását kell alkalmazni (19). A rágcsálókon végzett endokrin és reprodukciós vizsgálatok szövettani értékeléséről szóló 106. OECD-iránymutatás (16) olyan információkkal szolgál az (endokrin) szervek és a hüvelyi kenet előkészítéséről és értékeléséről, amelyek segítséget nyújthatnak e vizsgálati módszerhez. SZAKIRODALOM (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Kérésre elérhető a Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezetnél, Párizs (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Kérésre elérhető a Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezetnél, Párizs (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89-95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, kérésre elérhető a Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezetnél, Párizs (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383–390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (16) OECD (2009).Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106) Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (17) Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524-533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, Párizs. 1. függelék FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK (LÁSD MÉG AZ OECD 150. IRÁNYM