10.

A melléklet a következő C.27., C.28., C.29. és C.30. fejezettel egészül ki: „C.27. SZENNYEZETT ÜLEDÉKKEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 218. vizsgálati iránymutatásában (2004) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer célja a kétszárnyúak rendjébe tartozó édesvízi üledéklakó árvaszúnyoglárvák vegyi anyagoknak való tartós kitettsége hatásainak az értékelése. A Chironomus riparius és Chironomus tentans árvaszúnyog fajokkal végzett toxicitás vizsgálati protokollokon alapul, amelyeket Európában (1)(2)(3) és Észak-Amerikában (4)(5)(6)(7)(8) dolgoztak ki, és körvizsgálatnak vetettek alá (1)(6)(9). Más jól dokumentált árvaszúnyog fajok, például Chironomus yoshimatsui (10)(11) is használhatók. 2. A vizsgálati módszer által alkalmazott expozíciós forgatókönyv az üledék szennyezése a vizsgált anyaggal. A megfelelő expozíciós forgatókönyv a vizsgálat tervezett felhasználásától függ. Az üledékszennyezési forgatókönyv az üledékben tartósan jelen lévő vegyi anyagok felhalmozódását hivatott szimulálni. Ennél az expozíciós elrendezésnél a szennyezett üledék egy üledékből és vízből álló vizsgálati elrendezés részét képezi. 3. Az anyagok, amelyek üledéklakó organizmusokra gyakorolt hatását vizsgálni kell, általában hosszú ideig maradnak ebben a környezetben. Az üledéklakó organizmusok többféle módon lehetnek kitéve ezeknek az anyagoknak. Az egyes expozíciós útvonalak viszonylagos fontossága és a teljes toxikus hatás egyes expozíciós útvonalaknak tulajdonítható részének kialakulásához szükséges időtartam az érintett vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Az erősen adszorbeálódó (például log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok esetében fontos expozíciós útvonal lehet a szennyezet táplálék megemésztése. Az erősen lipofil anyagok toxicitása alulbecsülésének elkerülése érdekében megfontolandó, hogy a táplálékot a vizsgált anyaggal való szennyezést megelőzően az üledékbe keverjük. Az itt bemutatott vizsgálati módszer a tartós kitettségre épül, amely azt a célt szolgálja, hogy valamennyi lehetséges expozíciós útvonal figyelembe vehető legyen. A vizsgálat időtartama a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 20–28 nap, a C. tentans esetében 28–65 nap. Ha egy meghatározott célra – például egy instabil vegyület hatásainak a vizsgálatára – rövid távú adatok kellenek, a felesleges ismétlések tíz nap után eltávolíthatók. 4. A mért végpontok a kikelt kifejlett példányok száma és a kikeléshez szükséges idő. Ha kiegészítő rövid távú adatokra van szükség, akkor a lárvák túlélésének és fejlődésének mérését csak a tíznapos időszak eltelte után ajánlott megkezdeni, megfelelő számú ismétlést alkalmazva. 5. Mesterséges üledék használata ajánlott. A mesterséges üledék számos előnnyel rendelkezik a természetes üledékkel szemben: — a kísérlet változékonysága kisebb, mivel a mesterséges üledék egy reprodukálható »szabványosított közeget« biztosít, és nem kell szennyezésmentes, tiszta üledékforrást keresni, — a vizsgálatok bármikor elkezdhetők anélkül, hogy a vizsgálathoz használt üledék szezonális változékonyságát figyelembe kellene venni, és az üledéket nem kell előzetes kezelésnek alávetni a honos fauna eltávolítása végett; a mesterséges üledék alkalmazása a rutinvizsgálatokhoz szükséges mennyiségű üledék terepen történő gyűjtésével kapcsolatos költségeket is csökkenti, — a mesterséges üledék alkalmazása lehetővé teszi a különböző anyagok toxicitásának összehasonlítását és ennek megfelelő rangsorolását. 6. A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza. A VIZSGÁLAT ELVE 7. Első fejlődési szakaszban lévő árvaszúnyoglárvákat teszünk ki a vizsgált vegyi anyag különböző koncentrációinak üledék-víz elrendezésekben. Az üledéket a vizsgált anyaggal szennyezzük, majd első fejlődési szakaszban lévő lárvákat helyezünk a kísérleti edényekbe, amelyekben az üledék és víz koncentrációját előzőleg stabilizáltuk. Az árvaszúnyoglárvák kikelésének és fejlődésének ütemét a vizsgálat végén mérjük. Szükség esetén 10 nap elteltével is mérhetjük a lárvák túlélését és súlyát (megfelelő számú ismétlést alkalmazva). A kapott adatokból regressziós modell segítségével megbecsüljük azt a koncentrációt, amely a kikelésnek vagy a lárvák túlélésének, illetve fejlődésének x %-os csökkenését okozná (például EC15, EC50, stb.), vagy statisztikai hipotézisvizsgálattal meghatározzuk a megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt, illetve a megfigyelhető hatást okozó legkisebb koncentrációt (NOEC/LOEC). Az utóbbi esetben a hatást okozó értékeket statisztikai vizsgálatok segítségével össze kell hasonlítani a kontroll értékekkel. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK 8. Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát, páranyomását, mért vagy számított megoszlását az üledékben, valamint stabilitását vízben és az üledékben. Rendelkezni kell egy megbízható analitikai módszerrel a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásához a fedővízben, a pórusvízben és az üledékben, amelynek pontossága és kimutatási határa ismert és dokumentált. Hasznos információ a vizsgált anyag szerkezeti képlete és kémiai tisztasága. Ugyancsak hasznos információ, hogy milyen kémiai folyamatokon megy keresztül a vizsgált anyag (például disszipáció, nem biológiai és biológiai lebomlás, stb.). A vizsgálat elvégzését megnehezítő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkező anyagok vizsgálatára vonatkozóan a szakirodalom (12) nyújt további tájékoztatást. REFERENCIA-VEGYIANYAGOK 9. A vizsgálati protokoll és a vizsgálati körülmények megbízhatóságának megerősítése céljából rendszeres időközönként érdemes referencia-vegyianyagokkal elvégezni a vizsgálatot. Körvizsgálatokban és validálási vizsgálatokban eredményesen használt mérgező referenciaanyagok például a következők: lindane, trifluralin, pentaklórfenol, kadmium-klorid és a kálium-klorid (1)(2)(5)(6)(13). A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE 10. A következő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen: — A lárvák kikelésének aránya a kontroll edényekben legalább 70 % a vizsgálat végén (1)(6). — A kontroll edényekben 12–23 nappal a behelyezést követően kell megjelenniük a kifejlett C. riparius és C. yoshimatsui példányoknak; a C. tentans esetében ehhez 20–65 nap szükséges. — A vizsgálat végén mindegyik edényben meg kell mérni a pH-t és az oldott oxigén koncentrációját. Az oxigénkoncentrációnak a levegő alkalmazott hőmérséklet melletti telítettségi értéke (ASV) legalább 60 százalékának kell lennie, a fedővíz pH-értékének pedig minden edényben a 6–9 tartományon belülre kell esnie. — a víz hőmérséklete legfeljebb ± 1,0 °C-kal változhat. A vízhőmérséklet szabályozásának egyik lehetséges módja, hogy a vizsgálatot állandó hőmérsékletű helyiségben végezzük, amely esetben a helyiség hőmérsékletét megfelelő időközönként ellenőrizni kell. A MÓDSZER LEÍRÁSA Vizsgálati edények 11. A vizsgálatot 600 ml-es üvegedényekben végezzük, amelyek átmérője 8 cm. Amennyiben az üledék és a fedővíz megfelelő mélysége biztosított, ettől eltérő edények is alkalmazhatók. Lárvánként 2–3 cm2 nagyságú üledékfelületet kell biztosítani. Az üledékréteg és a fedővíz mélységének aránya 1:4 legyen. A vizsgálati edényeknek és a vizsgálati elrendezéssel érintkező egyéb készülékeknek teljes mértékben üvegből vagy más kémiailag semleges anyagból (például teflon) kell készülniük. A fajok kiválasztása 12. A vizsgálatot lehetőleg a Chironomus riparius fajjal végezzük. Chironomus tentans is alkalmazható, de nehezebben kezelhető, és hosszabb vizsgálati időszakot igényel. Chironomus yohimatsui szintén használható. A 2. függelékben részletezett tenyésztési módszerek a Chironomus riparius fajra vonatkoznak. A szakirodalomban más fajok – úgymint a Chironomus tentans (4) és a Chironomus yoshimatsui (11) – tenyésztési körülményeire vonatkozó tudnivalók is megtalálhatók. A vizsgálat megkezdése előtt ellenőrzésképpen fajmeghatározást kell végezni, de ha a példányok saját tenyészetből származnak, akkor ezt nem szükséges minden vizsgálat előtt megtenni. Üledék 13. Lehetőleg mesterséges üledék (más néven formulázott, kevert vagy műüledék) használata ajánlott. Ha azonban mégis természetes üledéket használunk, akkor azt jellemezni kell (legalább a pH-t és a szerves széntartalmat meg kell határozni, de más paraméterek, például a C/N arány és a szemcseszerkezet vizsgálata is ajánlott), és mentesnek kell lennie mindenféle szennyezéstől, valamint az árvaszúnyoggal versengő vagy az azt fogyasztó egyéb organizmusoktól. Az árvaszúnyoglárvákkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott továbbá a természetes üledéket az elkövetkező vizsgálat során uralkodókkal megegyező körülmények között hét napon keresztül kondicionálni. E vizsgálat során az alábbi, a C.8. vizsgálati módszerben (14) alkalmazott mesterséges talajon alapuló mesterséges üledék alkalmazása ajánlott (1)(15)(16): a) 4–5 % (száraz tömeg) tőzeg, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5–6,0 értékhez; fontos, hogy por alakú, finomra őrölt (részecskeméret ≤ 1 mm) és kizárólag levegőn szárított tőzeget használjunk. b) 20 % (száraz tömeg) kaolinagyag (lehetőleg 30 % feletti kaolinit tartalommal). c) 75–76 % (száraz tömeg) kvarchomok (túlnyomó részben finom homok, amely részecskéinek több mint 50 százaléka 50 és 200 μm közötti szemcsemérettel rendelkezik). d) Annyi ionmentesített víz, amely ahhoz szükséges, hogy végtermékként 30-50 % nedvességtartalmú keveréket kapjunk. e) A végtermékként kapott üledékkeverék pH-jának 7,0 ± 0,5 értékre történő beállításához szükséges mennyiségű vegytiszta minőségű kalcium-karbonát (CaCO3). A végtermékként kapott keveréknek 2 % (± 0,5 %) szerves széntartalommal kell rendelkeznie, amelyet az a) és c) pont szerinti megfelelő mennyiségű tőzeg és homok hozzáadásával érünk el. 14. A tőzegnek, a kaolinagyagnak és a homoknak ismert forrásból kell származnia. Ellenőrizni kell, hogy az üledék összetevőiben nem fordulnak elő kémiai szennyeződések (például nehézfémek, szerves klórvegyületek, szerves foszforvegyületek, stb.) A mesterséges üledék elkészítésének egy példáját a 3. függelék mutatja be. Száraz összetevők keverése is elfogadott, amennyiben bizonyítható, hogy a fedővíz hozzáadását követően az üledék nem esik szét összetevőire (például a vízben lebegő tőzegrészecskékre), és a tőzeget vagy az üledéket megfelelően kondicionáltuk. Víz 15. Az elfogadható hígítóvíz 2. és 4. függelékben felsorolt kémiai tulajdonságaival rendelkező bármely víz alkalmas a vizsgálathoz. Tenyésztővízként és kísérleti vízként bármely alkalmas víz, természetes víz (felszíni vagy talajvíz), mesterséges víz (lásd a 2. függeléket) vagy klórtalanított csapvíz elfogadható, amelyben az árvaszúnyoglárvák a tenyésztés és a vizsgálat időszaka alatt életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. A vizsgálat kezdetén a vizsgálathoz alkalmazott víz pH-értékének 6 és 9 között kell lennie, keménysége pedig nem haladhatja meg a 400 mg/l CaCO3 értéket. Ennél lágyabb vizet kell azonban alkalmazni akkor, ha gyanítható, hogy a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között kölcsönhatás alakul ki (és ezért ebben az esetben az Elendt-féle M4 közeg nem alkalmazható). A vizsgálat teljes időtartama alatt ugyanazt a víztípust kell használni. A 4. függelékben felsorolt vízminőségi jellemzőket évente legalább kétszer kell mérni, illetve minden olyan alkalommal, amikor fennáll a gyanúja annak, hogy e jellemzők jelentős mértékben megváltoztak. Törzsoldatok – szennyezett üledékek 16. A választott koncentrációjú szennyezett üledéket általában úgy készítjük, hogy a vizsgált anyag oldatát közvetlenül az üledékhez adjuk. A vizsgált anyag ionmentesített vízben oldott törzsoldatát hengerszék vagy tápkeverő segítségével vagy kézzel elkeverjük a mesterséges üledékkel. Ha a vizsgált anyag rosszul oldódik vízben, akkor a célnak megfelelő, lehető legkisebb mennyiségű szerves oldószerben (például hexán, aceton vagy kloroform) oldhatjuk. Ezt követően az oldatot vizsgálati edényenként 10 g finom kvarchomokkal elkeverjük. Az oldószert hagyjuk elpárologni, hogy teljes mértékben eltávozzon a homokból; majd a homokot összekeverjük a vizsgálati edényenként szükséges megfelelő mennyiségű üledékkel. A vizsgált anyag oldódásának megkönnyítéséhez, diszpergálásához vagy emulgeálásához csak gyorsan párolgó szer használható. Nem szabad elfelejteni, hogy az üledék elkészítése során a vizsgált anyag és a homok keverékéből származó homokot is figyelembe kell venni (azaz az üledéket kevesebb homokkal kell készíteni). Biztosítani kell az üledékhez adott vizsgált anyag egyenletes eloszlását az üledékben. Szükség esetén részminták analizálásával határozzuk meg a homogenitás fokát. A VIZSGÁLAT MEGTERVEZÉSE 17. A vizsgálat megtervezése a vizsgálat során alkalmazott koncentrációk számának és osztásközének, az egyes koncentrációkkal használt edények számának, valamint a lárvák edényenkénti számának a megválasztását jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra tekintettel kell megtervezni. Az EC pontnak és a NOEC becslésének, valamint a határérték-vizsgálatnak a megtervezését ismertetjük. A regressziós analízis megtervezése 18. A vizsgálat során alkalmazott koncentrációknak le kell fedniük a hatáskoncentrációt (például EC15, EC50) és azt a koncentrációtartományt, amelyen belül a vizsgált anyag érdeklődésre számot tartó hatással rendelkezik. A hatáskoncentráció becsléseknek (ECx) a pontossága és különösképpen az érvényessége általában jobb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentrációtartományon belül helyezkedik el. A lehető legkisebb pozitív koncentrációnál jóval alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációnál jóval magasabb értékek extrapolálását kerülni kell. Az alkalmazandó koncentrációtartomány kiválasztásához hasznos lehet előzetes behatároló vizsgálatot végezni (lásd 27. bekezdés). 19. Az ECx becsléséhez legalább öt koncentrációt kell vizsgálni, és mindegyik koncentráció esetében három ismétlést kell alkalmazni. A jó modellbecslés lehetővé tétele érdekében minden esetben tanácsos elegendő vizsgálati koncentrációt használni. A rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek (kivételt képeznek azok az esetek, amikor a dózis-válasz görbe lapos). Az eltérő választ kiváltó vizsgálati koncentrációk számának emelkedése esetén az egyes kezeléseknél alkalmazott ismétlésszám csökkenthető. Az ismétlésszám növelése vagy a vizsgálat során alkalmazott koncentráció intervallum szűkítése általában a konfidencia intervallum csökkenéséhez vezet. A lárvák tíznapos túlélési arányának és fejlődési sebességének a becslése esetén további ismétlések szükségesek. A NOEC/LOEC becslésének megtervezése 20. A LOEC vagy a NOEC becsléséhez öt koncentrációt kell vizsgálni legalább négy ismétlést alkalmazva úgy, hogy a rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek. Az ismétlések számának elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel kimutasson egy statisztikai próba. A fejlődési ütem esetében általában varianciaanalízist (ANOVA), például Dunnett vagy Williams próbát (17)(18)(19)(20) lehet alkalmazni. Ha a kikelési arányt vizsgáljuk, akkor a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni-féle korrekcióval) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk. Határérték-vizsgálat 21. Határérték-vizsgálatot akkor lehet végezni (egy vizsgálati és egy kontroll koncentrációval), ha az előzetes behatároló vizsgálat során nem voltak megfigyelhető hatások. A határérték-vizsgálat célja annak a koncentrációnak a meghatározása, amely elég nagy ahhoz, hogy az elvégzett vizsgálat lehetővé tegye a döntéshozók számára a vizsgált anyag lehetséges toxikus hatásainak a kizárását, és annak a határértéknek a megállapítását, amelyen túli koncentrációknak az előfordulása semmilyen esetben sem várható. Az ajánlott koncentráció 1 000 mg/kg (száraz tömeg). Általában mind a kezelés, mind a kontroll esetében legalább hat ismétlés szükséges. Bizonyítni kell, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel képes kimutatni egy statisztikai próba. Metrikus válasz (fejlődési ütem és súly) esetén alkalmas statisztikai módszer a t-próba, ha az adatok az alkalmazási feltéteknek (normalitás, szóráshomogenitás) megfelelnek. Ha a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenlő szórásnégyzeteket feltételező t-próba vagy egy nemparaméteres próba, például a Wilcoxon-Mann-Whithey próba alkalmazható. A kikelési arány esetében a Fisher-féle egzakt próba a megfelelő. ELJÁRÁS Expozíciós körülmények A szennyezett üledék – víz elrendezés előállítása 22. Az üledék vizsgált anyaggal való szennyezését a »C.8: Toxicitás földigilisztákra« című vizsgálati módszernél leírt eljárás szerint ajánlott elvégezni (14). A szennyezett üledéket elhelyezzük az edényekben, majd felöntjük vízzel úgy, hogy az üledék és a fedővíz mennyiségének az aránya 1:4 legyen (lásd a 11. és a 15. bekezdést). Az üledékrétegnek 1,5–3 cm mélynek kell lennie. Annak elkerülése érdekében, hogy a vizsgálathoz használt víz hozzáadása során az üledék összetevőire essen szét, és a finom anyag a vízrétegben felkavarodjon, az üledéket letakarhatjuk egy műanyag lappal, miközben a vizet ráöntjük, amelyet közvetlenül a felöntést követően eltávolítunk. Erre a célra más eszközök is alkalmasak lehetnek. 23. A vizsgálati edényeket le kell fedni (például üveglappal). Az eredeti vízszint fenntartása érdekében a vizsgálat során pótoljuk az elpárolgott vizet, ha szükséges. A sófelhalmozódás elkerülése végett desztillált vagy ionmentesített vizet használjunk. Stabilizálódás 24. A vízzel fedett szennyezett üledék előállítását követően hagyjuk, hogy a vizsgált anyag a vízfázisból az üledékbe kerüljön, és abban eloszoljon (3)(4)(6)(13). Ez lehetőleg a vizsgálat során alkalmazottal megegyező hőmérsékleti és levegőztetési viszonyok mellett történjen. Az ekvilibrációs idő üledék és vegyi anyag specifikus, tartama óráktól napokig terjedhet, de ritka esetekben több (4–5) hetet is igénybe vehet. Mivel ez alatt az idő alatt számos vegyi anyag lebomolhat, az egyensúlyi állapot beálltának megvárása helyett 48 órás ekvilibrációs időszak alkalmazása ajánlott. Ezen ekvilibrációs idő elteltével mérjük meg a vizsgált anyagnak legalább a legnagyobb és a legalacsonyabb koncentrációját a fedővízben, a pórusvízben és az üledékben (38. bekezdés). Ezek a vizsgált anyagra vonatkozó analitikai meghatározások lehetővé teszik a tömegegyensúly kiszámítását és az eredmények mért koncentrációk alapján történő kifejezését. A vizsgálathoz használt organizmusok hozzáadása 25. A vizsgálathoz használt organizmusok vizsgálati edényekbe történő behelyezése előtt négy-öt nappal helyezzük a tenyészetből gyűjtött petecsomókat tenyésztőközeget tartalmazó kisméretű edényekbe. A törzstenyészetből vett vagy frissen készített tenyésztőközeg egyaránt használható. Ez utóbbi használata esetén adjunk a tenyésztőközeghez kis mennyiségű táplálékot, például zöldalgát és/vagy finomra őrölt pehely formájú haleledelből készített szuszpenzió szüredékéből néhány cseppet (lásd a 2. függeléket). Csak frissen lerakott petecsomókat szabad használni. A lárvák általában néhány nappal a peterakást követően kezdenek kikelni (a Chironomus riparius esetében ez 20 °C-on 2–3 nap, a Chironomus tentans és a Chironomus yoshimatui esetében pedig 23 °C-on, illetve 25 °C-on 1–4 nap). A lárvák fejlődése négy, egyenként 4–8 napig tartó szakaszra osztható. A vizsgálathoz az első fejlődési szakaszban lévő lárvákat kell gyűjteni (2–3 vagy 1–4 nappal a kikelést követően). Az árvaszúnyoglárvák fejlődési szakaszát a fejszélesség alapján ellenőrizhetjük (6). 26. Mindegyik szennyezett üledéket és vizet tartalmazó vizsgálati edénybe húsz darab, tetszőlegesen kiválasztott lárvát helyezünk egy tompa végű pipetta segítségével. A lárvák vizsgálati edénybe helyezésének ideje alatt állítsuk le a víz levegőztetését, és a behelyezést követő 24 órás időszakon keresztül hagyjuk így (lásd a 25. és a 32. bekezdést). Az alkalmazott vizsgálati tervnek (lásd a 19. és a 20. bekezdést) megfelelően az EC pont becsléséhez legalább 60, a NOEC meghatározásához 80 lárvát használjunk koncentrációnként. A vizsgálathoz használt koncentrációk 27. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációk meghatározásához hasznos lehet behatároló vizsgálatot végezni. E célra a vizsgált anyag koncentrációinak nagy osztásközű sorozatát használjuk. Annak érdekében, hogy az egy árvaszúnyoglárvára jutó felület megfeleljen a vizsgálat végleges változatában alkalmazandó lárvasűrűségnek, a lárvákat annyi ideig tesszük ki a vizsgált anyag egyes koncentrációinak, amely lehetővé teszi a megfelelő vizsgálati koncentrációk becslését anélkül, hogy ismétlésekre lenne szükség. 28. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációkat a behatároló vizsgálat eredménye alapján határozzuk meg. Legalább öt, a 18–20. bekezdésben leírt módszerrel kiválasztott koncentrációt kell használni. Kontroll edények 29. A vizsgálat során a megfelelő ismétlésszám (lásd a 19–20. bekezdést) biztosításához szükséges számú – a vizsgált anyaggal nem szennyezett üledéket tartalmazó – kontroll edényt kell alkalmazni. Ha a vizsgált anyag bevitele oldószer segítségével történt (lásd a 16. bekezdést), akkor az oldószer hatásainak az ellenőrzése céljára külön kontroll edények szükségesek. Vizsgálati elrendezés 30. Statikus elrendezést alkalmazunk. Kivételes esetekben – például ha a vízminőségi jellemzők nem felelnek meg a vizsgálathoz használt organizmusoknak, vagy befolyásolják a kémiai egyensúlyt (például túlságosan lecsökken az oldott oxigénszint, túlságosan megnő a kiválasztási termékek koncentrációja, vagy ásványi anyagok lúgozódnak ki az üledékből és hatást gyakorolnak a víz pH-jára és/vagy keménységére) – félstatikus vagy átfolyó rendszerű, a fedővíz szakaszos vagy folyamatos cseréjét lehetővé tévő vizsgálati elrendezések is alkalmazható. Mindazonáltal a fedővíz minőségének javítására szolgáló módszerek, így például a levegőztetés, általában elégségesek, és előnyben részesítendők. Táplálék 31. A lárvákat lehetőség szerint naponta vagy legalább hetente háromszor kell etetni. Az első 10 napban a fiatal lárvák számára megfelelőnek tűnik naponta lárvánként 0,25–0,5 mg (a C. yoshimatui esetében 0,35–0,5 mg) haleledelt adni (amely lehet vizes szuszpenzió vagy finomra őrölt eledel, például Tetra-Min vagy Tetra-Phyll; a részleteket lásd a 2. függelékben). Az idősebb lárváknak valamivel több táplálékra lehet szükségük: a vizsgálat hátralevő részében lárvánként naponta 0,5–1 mg mennyiségnek elegendőnek kell lennie. Gombaképződés vagy a lárvák pusztulása esetén a táplálékadagot valamennyi kísérleti és kontroll edényben csökkenteni kell. Ha a gombák szaporodása nem állítható meg, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni. Erősen adszorbeálódó (példáull log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok vizsgálata esetén az organizmusok túlélésének és természetes fejlődésének biztosításához szükséges mennyiségű táplálékot még a stabilizálódás időszaka előtt a mesterséges üledékbe keverhetjük. Erre a célra haleledel helyett növényi anyagot használjunk (például 0,5 % (száraz tömeg) finomra őrölt nagy csalán (Urtica dioica), fehér eperfa (Morus alba), fehér here (Trifolium repens), paraj (Spinacia oleracea) levelet vagy más növényi anyagot (Cerophyl vagy alfa-cellulóz) adhatunk az üledékhez). Inkubációs körülmények 32. A lárvák vizsgálati edényekbe történő behelyezését követően lehetőleg 24 órán keresztül finoman levegőztessük a fedővizet, és a vizsgálat egész időtartama alatt biztosítsunk gyenge levegőztetést (ügyelve arra, hogy az oldott oxigén koncentrációja ne süllyedjen a levegő telítettségi érték (ASV) 60 százaléka alá. A levegőt az üledékréteg fölött 2–3 cm-rel rögzített üveg Pasteur pipettán keresztül vezessük be (másodpercenként egy vagy néhány buborék). Illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén megfontolandó, hogy az üledék-víz elrendezés levegőztetésétől eltekintsünk. 33. A vizsgálatot 20 °C (± 2 °C) állandó hőmérséklet mellett hajtsuk végre. C. tentans használata esetén 23 °C, a C. yoshimatui esetében pedig 25 °C az ajánlott hőmérséklet (± 2 °C). 16 órás fényperiódust alkalmazzunk, 500–1 000 lux fényintenzitással. Expozíciós időtartam 34. A kitétel a lárvák szennyezett üledéket tartalmazó, illetve kontroll edényekbe történő behelyezésekor veszi kezdetét. A maximális expozíciós időtartam a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 28 nap, C. tentans használata esetén 65 nap. Ha az árvaszúnyogok előbb kikelnek, akkor a vizsgálatot legalább öt nappal azt követően lehet befejezni, hogy a kontroll edényekben az utolsó kifejlett példány megjelent. Megfigyelések Kikelés 35. Meg kell határozni a fejlődési időt és a kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számát. A hímek tollas csápjukról könnyen felismerhetők 36. A kísérleti edényekben legalább hetente háromszor kell ellenőrizni a kontroll edényekben megfigyelhetőhöz képest rendellenesnek értékelhető viselkedést (például üledék elhagyása, szokatlan úszás). A kikelés várható időszaka alatt naponta meg kell számolni a kikelt árvaszúnyogokat. Naponta fel kell jegyezni a kikelt kifejlett egyedek nemét és számát. Az azonosítást követően az árvaszúnyogokat ki lehet engedni az edényekből. A vizsgálat befejezése előtt lerakott petecsomókat dokumentálni kell, és az új lárvák üledékbe kerülésének megelőzése érdekében el kell távolítani. Fel kell jegyezni továbbá a ki nem kelt bábok megfigyelhető számát. A kikelés méréséhez az 5. függelék nyújt útmutatást. Fejlődés és túlélés 37. Ha a lárvák 10 napos túlélési és fejlődési adatait is be kell mutatni, akkor már a vizsgálat kezdetétől fogva a későbbiekben használható kiegészítő kontroll edényeket kell alkalmazni. Az ezekből származó üledéket átszitáljuk egy 250 μm-es szitán, amelyen a lárvák fennmaradnak. Az elhullás kritériumai a mozdulatlanság, illetve a mechanikai ingerekre adott válasz hiánya. A hiányzó lárvákat is elhullottnak kell tekinteni (a vizsgálat elején elpusztult lárvákat a mikroorganizmusok már lebonthatták). Meghatározzuk a túlélő lárvák edényenkénti (elhullott lárvák maradványai nélküli) száraz tömegét, majd kiszámítjuk az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét. A túlélő lárvák fejlődési szakaszának a meghatározása is hasznos; ezt a fejszélesség mérése segítségével tehetjük meg. Analitikai mérések A vizsgált anyag koncentrációja 38. A vizsgálat megkezdése (azaz a lárvák behelyezése) előtt kezelésenként legalább egy edényből vegyünk ömlesztett üledék mintát a vizsgált anyag koncentrációjának analitikai meghatározásához az üledékben. A fedővíz, a pórusvíz és az üledék legnagyobb és legkisebb koncentrációnál vett mintáit ajánlott legalább a vizsgálat kezdetén és végén analizálni (lásd a 24. bekezdést). A vizsgált anyag így meghatározott koncentrációja tájékoztatást nyújt a vizsgált anyag viselkedéséről/megoszlásáról a víz-üledék elrendezésben. 39. Ha a vizsgálat közben is végzünk méréseket (például a 7. napon), és az analízishez nagy minták szükségesek, amelyek nem gyűjthetők a kísérleti edényekből anélkül, hogy a mintavétel a vizsgálati elrendezésre hatással lenne, az analitikai meghatározásokat ugyanolyan kezelésnek alávetett (a vizsgálathoz használt organizmusokat is beleértve), de a biológiai megfigyelések céljára nem használt, külön vizsgálati edényekből származó mintákon kell elvégezni 40. A pórusvíz elkülönítésére ajánlott módszer például a 10 000 g intenzitással történő centrifugálás 4 °C-on 30 percig. Szűrést is lehet alkalmazni, amennyiben bizonyított, hogy szűrő nem adszorbeálja a vizsgált anyagot. Ha a minta mérete túl kicsi, akkor előfordulhat, hogy nem analizálható a koncentráció a pórusvízben. Fizikai és kémiai paraméterek 41. A kísérleti edények pH-ját és hőmérsékletét megfelelő módon kell mérni (lásd a 10. bekezdést). A vizsgálat kezdetén és végén a legnagyobb koncentrációnál meg kell mérni a víz keménységét és ammónia tartalmát a kontroll edényekben és egy kísérleti edényben. ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS Az eredmények kezelése 42. E vizsgálat célja a vizsgált anyag kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számára és fejlődési ütemére, illetve 10 napos vizsgálat esetében a lárvák túlélésére és súlyára gyakorolt hatásainak a meghatározása. Ha semmi nem utal a nemek statisztikailag eltérő érzékenységére, akkor a hímekre és a nőstényekre vonatkozó eredmények a statisztikai elemzés céljára összevonhatók. Az érzékenység nemek közötti különbségének statisztikai megítélésére például a χ2-r x 2 próba alkalmazható. Szükség esetén 10 nap elteltével meg kell határozni a lárvák túlélését és az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét. 43. A száraz tömeg alapján meghatározott és kifejezett hatáskoncentrációkat lehetőleg a vizsgálat kezdetén mért üledékkoncentrációk alapján kell kiszámítani (lásd a 38. bekezdést). 44. Az EC50 vagy bármely más ECx pontbecsléséhez az edényenkénti statisztikákat valódi ismétléseknek kell tekinteni. Bármely ECx konfidencia intervallumának a kiszámítása során vagy figyelembe kell venni az edények közötti eltéréseket, vagy ki kell mutatni, hogy az eltérés elhanyagolható mértékű. Ha a modell mérési pontokhoz illesztéséhez a legkisebb négyzetek módszerét használjuk, akkor a szóráshomogenitás javítása érdekében az edényenkénti statisztikákat transzformálni kell. Az ECx értékeket az eredeti válaszértékekre való visszatranszformálás után kell kiszámítani. 45. Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC hipotézisvizsgálattal történő meghatározása, az edények közötti eltérések figyelembevételére például hierarchikus varianciaanalízist (nested ANOVA) kell végezni. Alternatívaként ennél robosztusabb próbák (21) is helyénvalók lehetnek olyan esetekben, amikor az ANOVA szokásos alapfeltevései nem teljesülnek. Kikelési arány 46. A kikelési arányok kvantális adatok, amelyek a Cochran-Armitage próbával elemezhetők a lefelé lépegető eljárást alkalmazva, amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és az adatok ennek az elvárásnak megfelelnek. Ha ez nem így van, akkor a Fisher-féle egzakt próbát vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk a p-értékek Bonferroni- vagy Holm-féle eljárással történő korrekciójával. Ha az ugyanazon koncentrációhoz tartozó ismétlések közötti eltérések bizonyítottan nagyobbak, mint amit a binomiális eloszlás indokolna (amelyet gyakran »extra-binomiális« variációnak neveznek), akkor egy robusztus Cochran-Armitage vagy Fisher-féle egzakt próbát kell alkalmazni, mint amilyet például a (21) javasol. Meg kell határozni az egy edényre jutó kikelt árvaszúnyogok számát (ne), majd el kell osztani a behelyezett lárvák számával (na): ahol: ER = kikelési arány ne = kikelt árvaszúnyogok egy edényre jutó száma na = behelyezett lárvák egy edényre jutó száma 47. Egy másik, legfőképp nagy minták és extra-binomiális variáció esetén alkalmazható lehetőség, hogy a kikelési arányt folyamatos változóként kezeljük, és amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és ez az elvárás összhangban áll a kapott ER adatokkal, a Williams próbához hasonló eljárást alkalmazunk. Ha a monotonitás nem áll fenn, a Dunnett próbát lehet alkalmazni. A nagy mintát itt úgy értelmezzük, hogy az egy ismétlésre (edényre) jutó kikelt és nem kikelt árvaszúnyogok száma egyaránt meghaladja az ötöt. 48. Az ANOVA módszerek alkalmazásához az ER értékeket először négyzetgyök arkusz-szinusz vagy Freeman-Tukey transzformáció segítségével átalakítjuk, hogy a normálishoz közeli eloszlást kapjunk, és a szórásokat kiegyenlítsük. Abszolút gyakoriságok esetén a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk. A négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció az ER négyzetgyökének az arkusz szinuszát (sin–1) adja. 49. A kikelési arányok meghatározásához regressziós analízissel (vagy például probit (22), logit, Weibull, kereskedelmi forgalomban kapható megfelelő szoftverrel stb.) számítjuk ki az ECx értékeket. Ha a regressziós analízis alkalmatlannak bizonyul (például kettőnél kevesebb részleges válasz esetén), más nemparaméteres módszert, például mozgóátlag-módszert vagy egyszerű interpolációt használunk. Fejlődési ütem 50. Az átlagos fejlődési idő a lárvák kísérleti edényekbe történő behelyezésétől (a vizsgálat 0. napjától) az árvaszúnyogok kikeléséig tartó átlagos időtartamot jelenti. (A valódi fejlődési idő kiszámításához figyelembe kell venni a lárvák életkorát a behelyezés időpontjában). A fejlődési ütem a fejlődési idő reciproka (egysége: 1/nap), és a lárvafejlődés egy napra eső részét fejezi ki. Az ilyen jellegű üledék-toxicitási vizsgálatok értékeléséhez inkább a fejlődési ütemet használjuk, mivel kisebb a szórása, homogénebb és a normálishoz közelebb álló eloszlást mutat, mint a fejlődési idő. Ennélfogva a fejlődési ütem hatásosabb paraméteres vizsgálati eljárások alkalmazását teszi lehetővé, mint a fejlődési idő. A folyamatos változónak tekintett fejlődési ütemhez tartozó ECx értékek becslésére regressziós analízist használunk (például (23), (24)). 51. A következő statisztikai próbákhoz feltételezzük, hogy az x. ellenőrzési napon megfigyelt számú árvaszúnyog az x. nap és az x–1. nap (l = az ellenőrzések közötti intervallum hossza, általában 1 nap) közötti időintervallum közepén kelt ki. Az egy edényre jutó átlagos fejlődési ütemet a következő képlet szerint számítjuk ki: ahol: : egy edényre jutó átlagos fejlődési ütem i : ellenőrzési intervallum indexe m : ellenőrzési intervallumok maximális száma : az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok száma ne : kikelt árvaszúnyogok száma összesen a kísérlet végén (= ) xi : az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok fejlődési üteme ahol: dayi : ellenőrzési nap (a behelyezés óta eltelt napok száma) li : az i ellenőrzési intervallum hossza (napokban kifejezve, általában 1 nap) Vizsgálati jegyzőkönyv 52. A vizsgálati jegyzőkönyvnek legalább a következő információkat kell tartalmaznia: Vizsgált anyag: — fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok (vízoldékonyság, páranyomás, talajra (vagy ha rendelkezésre áll, az üledékre) vonatkozó megoszlási hányados, stabilitás vízben, stb.), — kémiai azonosító adatok (közönséges név, kémiai név, szerkezeti képlet, CAS-szám, stb.,) beleértve a kémiai tisztaságot és a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásának analitikai módszerét. A vizsgálathoz felhasznált faj: — a vizsgálathoz felhasznált állatok: faj, tudományos elnevezés, az organizmusok származása és tenyésztési körülményei, — a petecsomók és a lárvák kezelésére vonatkozó információk, — a vizsgálathoz felhasznált állatok életkora az edényekbe történő behelyezésükkor. Vizsgálati körülmények: — az alkalmazott üledék, azaz természetes vagy mesterséges üledék, — természetes üledék esetén az üledékminta gyűjtésének helye és a mintavételi hely leírása, beleértve lehetőség szerint a szennyezés történetét; jellemzők: pH, szerves széntartalom, C/N arány és szemcseszerkezet (ha indokolt), — a mesterséges üledék előállítása: összetevők és jellemzők (szerves széntartalom, pH, nedvességtartalom, stb. a vizsgálat kezdetén), — a vizsgálathoz használt víz előállítása (mesterségesen készített víz esetén) és jellemzői (oxigénkoncentráció, pH, vezetőképesség, keménység, stb. a vizsgálat kezdetén), — az üledék és a fedővíz mélysége, — a fedővíz és a pórusvíz mennyisége; a nedves üledék tömege pórusvízzel és pórusvíz nélkül, — vizsgálati edények (anyag és méret), — az üledékszennyezés módszere: alkalmazott vizsgálati koncentrációk, ismétlésszám és esetlegesen használt oldószer, — a szennyezett üledék-víz elrendezés stabilizálódása és egyensúlyi fázisa: időtartam és körülmények, — inkubációs körülmények: hőmérséklet, fényciklus és intenzitás, levegőztetés (gyakoriság és intenzitás), — a táplálásra vonatkozó információk, beleértve a táplálék típusát, elkészítését, mennyiségét és a táplálás rendjét. Eredmények: — a névleges vizsgálati koncentrációk, a mért vizsgálati koncentrációk és a kísérleti edények vizsgált anyag koncentrációjának a meghatározására használt analízisek eredményei, — a víz minősége a vizsgálati edényekben, azaz pH, hőmérséklet, oldott oxigén, vízkeménység és ammóniatartalom, — az elpárolgott víz pótlása a vizsgálati edényekben, ha pótoljuk, — a kikelt hím és nőstény árvaszúnyogok egy edényre és napra eső száma, — ki nem kelt lárvák egy edényre jutó száma, — a lárvák egy edényre és – adott esetben – egy fejlődési szakaszra jutó átlagos száraz tömege, — ismétlésenkénti és vizsgálati koncentrációnkénti százalékos kikelés (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen), — kikelt kifejlett árvaszúnyogok ismétlésenkénti és kezelési arányonkénti átlagos fejlődési üteme (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen), — toxicitási végpontok – például ECx (és a hozzá tartozó konfidencia intervallum), NOEC és/vagy LOEC – becsült értékei, valamint a meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek, — az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszertől való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását. SZAKIRODALOM (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Kultúra methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) E melléklet C.8. vizsgálati módszere: Toxicitás földigilisztákra. (15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. (16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. 1. függelék FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK E vizsgálati módszer alkalmazásában a következő fogalommeghatározások alkalmazandók: Mesterséges üledék vagy formulázott, kevert vagy műüledék: a természetes üledék fizikai összetevőinek az imitálására használt anyagok keveréke. Fedővíz: a vizsgálati edényben az üledék felé kerülő víz. Pórusvíz vagy szemcseközi víz: az üledék és a talaj szemcséi közötti helyet kitöltő víz. Szennyezett üledék: a vizsgált vegyi anyaggal szennyezett üledék. Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék. 2. függelék Ajánlások a Chironomus riparius tenyésztéséhez 1. Az árvaszúnyoglárvákat kristályosító csészékben vagy nagyobb edényekben tenyésztjük. Az edény aljára szórjunk vékony réteg (kb. 5–10 mm) kvarchomokot. A szilikagél (például Merck, cikkszám: 8117) is megfelelő szubsztrátumnak bizonyult (ebből vékonyabb, pár milliméternyi réteg is elegendő). Ezt követően töltsünk néhány centiméternyi megfelelő vizet az edénybe. A vízszint fenntartása és a kiszáradás megelőzése érdekében szükség szerint pótoljuk az elpárolgott vizet. Cserélhetjük is a vizet, ha kell. Biztosítsunk gyenge levegőztetést. A lárvatenyésztő edényeket tartsuk egy megfelelő ketrecben, amelyből a kikelő kifejlett példányok nem tudnak kiszökni. A ketrecben legyen elég hely a kikelt kifejlett példányoknak a mozgásra, mert ellenkező esetben nem fognak párosodni (minimum kb. 30 × 30 × 30 cm). 2. A ketreceket tartsuk szobahőmérsékleten vagy 20 ± 2 °C állandó hőmérsékletű helyiségben, 16 órán keresztül világosban (fényintenzitás kb. 1 000 lux) és 8 órán keresztül sötétben. Dokumentálták, hogy a 60 % RH alatti légnedvesség gátolhatja a szaporodást. Hígítóvíz 3. Bármilyen alkalmas természetes vagy művíz használható. Általában kútvizet, klórtalanított csapvizet vagy mesterséges közeget (például Elendt-féle M4 vagy M7 közeget, lásd lentebb) használunk. Használat előtt a vizet levegőztetni kell. Szükség esetén cserélhetjük a tenyésztéshez használt vizet. Ehhez a használt vizet öntsük le vagy szívjuk ki a tenyésztő edényekből ügyelve arra, hogy a lárvák által épített lakócsöveket el ne pusztítsuk. A lárvák táplálása 4. Az árvaszúnyoglárvákat pehely formájú haleledellel (Tetra Min®, Tetra Phyll® vagy hasonló, védett márkájú haltáppal) etessük, amelyből naponta körülbelül 250 mg-ot adjunk minden edényhez porrá őrölve szárazon vagy vizes szuszpenzióban, amelynek az elkészítéséhez 1,0 g pehely formájú haleledelt keverjünk el 20 ml hígítóvízben úgy, hogy homogén keveréket kapjunk. Ebből a készítményből naponta 5 ml-t adjunk minden edényhez (használat előtt felrázandó). Az idősebb lárvák kaphatnak ennél többet. 5. A táplálék mennyiségét a vízminőséghez kell igazítani. Ha a tenyésztőközeg zavarossá válik, akkor csökkenteni kell a mennyiséget. Az adott táplálék mennyiségét szigorú ellenőrzés alatt kell tartani. Ha túl kevés a táplálék, akkor a lárvák a vízrétegbe vándorolnak, ha túl sok, akkor fokozódik a mikrobatevékenység és csökken az oxigénkoncentráció. Mindkét körülmény a fejlődési ütem lassulását okozhatja. 6. Az újonnan létesített tenyésztő edényekhez zöldalga (például Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) sejtek is adhatók. A kikelt kifejlett példányok táplálása 7. Egyes kísérletek szerint a kikelt kifejlett példányok számára egy telített cukoroldatba mártott vattakorong szolgálhat táplálékként. Kikelés 8. 20 ± 2 °C hőmérsékleten a kifejlett példányok körülbelül 13–15 nap elteltével kezdenek megjelenni a lárvatenyésztő edényekben. A hímek tollas csápjuk alapján könnyen megkülönböztethetők. Petecsomók 9. Miután a kifejlett példányok megjelentek a tenyésztőketrecben, a lárvatenyésztő edényekben hetente háromszor ellenőrizni kell a lerakott zselatinszerű petecsomókat, amelyeket gondosan el kell távolítani, és át kell helyezni egy tenyésztővíz-mintát tartalmazó kisméretű edénybe. A petecsomókat új tenyészetek létrehozására (például 2–4 petecsomó/edény) vagy toxicitási vizsgálatok céljára használjuk fel. 10. Az első fejlődési szakaszban lévő lárváknak 2–3 napon belül kell kikelniük. Új tenyészetek létesítése 11. A stabil tenyészetekből hetente vagy – a vizsgálati követelményektől függően – ritkábban friss lárvatenyészetek hozhatók létre, miközben a régebbi edényeket a kifejlett árvaszúnyogok megjelenését követően eltávolítjuk. Ezzel a rendszerrel minimális kezelést igénylő módon biztosítható a kifejlett példányok rendszeres utánpótlása. A vizsgálathoz használt »M4« és »M7« oldatok előállítása 12. Az »M4« közeg leírása Elendt (1990) munkájában megtalálható. Az »M7« közeg ugyanúgy készül, mint az »M4«, azzal a különbséggel, hogy az 1. táblázatban feltüntetett anyagok koncentrációja az »M7« esetében négyszer alacsonyabb, mint az »M4« készítésekor. Az »M7« közegről szóló publikáció előkészületben van (Elendt, személyes közlés). A vizsgálathoz használt oldatot azért nem Elendt és Bias (1990) szerint kell előállítani, mert a törzsoldatok elkészítéséhez megadott NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 és K2HPO4 koncentrációk nem megfelelők. Az »M7« közeg előállítása 13. Az (I) törzsoldatok mindegyikét külön kell elkészíteni, majd az (I) törzsoldatokból egy (II) kombinált törzsoldatot készítünk (lásd az 1. táblázatot). Az »M7« közeg előállításához a (II) kombinált törzsoldat 50 ml-ét és az egyes makrotápanyagok törzsoldatainak a 2. táblázatban megadott mennyiségeit ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk. Vitamin-törzsoldatot készítünk, amelyhez három vitamint ionmentesített vízhez adunk a 3. táblázatban meghatározottak szerint, majd röviddel a felhasználás előtt az »M7« közeghez adunk 0,1 ml-t a kombinált vitamin törzsoldatból. (A vitamin-törzsoldatot kis aliquot részekben, fagyasztott állapotban kell tartani). A közeget levegőztetni és stabilizálni kell. SZAKIRODALOM BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. 1. táblázat Nyomelemek törzsoldatai az M4 és M7 közeghez (I) törzsoldatok Ion-mentesített vízzel 1 literre hígított mennyiség (mg) A (II) kombinált törzsoldat előállításához az (I) törzsoldatok következő mennyiségeit (ml) elegyítjük és ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk Végleges koncentráció a vizsgálathoz használt oldatban (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

2. táblázat Makrotápanyagok törzsoldatai az M4 és M7 közeghez Ion-mentesített vízzel 1 literre hígított mennyiség (mg) Makrotápanyagok törzsoldatainak M4 és M7 közeg előállításához használt mennyisége (ml/l) Végleges koncentráció a vizsgálathoz használt M4 és M7 oldatban (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

3. táblázat Vitamin-törzsoldatok az M4 és M7 közeghez. A három vitaminoldatból egyetlen kombinált vitamin-törzsoldatot készítünk Ion-mentesített vízzel 1 literre hígított mennyiség (mg) Vitamin- törzsoldat M4 és M7 közeg előállításához használt mennyisége (ml/l) Végleges koncentráció a vizsgálathoz használt M4 és M7 oldatban (mg/l) Tiamin-hidroklorid 750 0,1 0,075 Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 SZAKIRODALOM Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Kultúrad in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Kultúra Conditions on LIFE History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. 3. függelék MESTERSÉGES ÜLEDÉK KÉSZÍTÉSE Az üledék összetétele A mesterséges üledék összetétele a következő: Összetevő Jellemzők Üledék száraz tömegének %-a Tőzeg Tőzegmoha, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5-6,0 értékhez, és nem tartalmaz látható növénymaradványokat, finomra őrölve (részecskeméret ≤ 1 mm) és levegőn szárítva 4 - 5 Kvarchomok Szemcseméret: a részecskék több mint 50 százaléka a 50–200 μm tartományban 75 - 76 Kaolinit agyag Kaolinit tartalom ≥ 30 % 20 Szerves szén Tőzeg és homok hozzáadásával beállítva 2 (± 0,5) Kalcium-karbonát Porított, vegytiszta CaCO3 0,05 - 0,1 Víz Vezetőképesség ≤ 10 μS/cm 30 - 50 Elkészítés A levegőn szárított tőzeget finom porrá őröljük. Nagyteljesítményű homogenizáló készülék segítségével ionmentesített vízzel szuszpenziót készítünk a szükséges mennyiségű tőzegporból. A szuszpenzió pH-ját CaCO3 hozzáadásával beállítjuk 5,5 ± 0,5 értékre. A pH és a mikrobiológiai összetétel stabilizálása végett 20 ± 2 °C hőmérsékleten lassú keveréssel legalább két napig kondicionáljuk a szuszpenziót. Az ezt követően ismét megmért pH-nak 6,0 ± 0,5 értéket kell mutatnia. Ezek után a szuszpenziót összekeverjük a többi összetevővel (homok és kaolinagyag), valamint az ionmentesített vízzel úgy, hogy az üledék száraz tömegének 30–50 százaléka közötti víztartalommal rendelkező, homogén üledéket kapjunk. A végtermékként kapott keverék pH-ját ismételten megmérjük, és szükség esetén CaCO3 hozzáadásával beállítjuk 6,5–7,5 értékre. Az üledékből vett minta alapján meghatározzuk a száraz tömeget és a szerves széntartalmat. Ezt követően az árvaszúnyogokkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott a mesterséges üledéket hét napig a vizsgálatban használni kívántakkal megegyező körülmények között kondicionálni. Tárolás A mesterséges üledék előállításához használt száraz összetevők száraz, hűvös helyen, szobahőmérsékleten tárolhatók. Az összeállított (nedves) üledék a vizsgálatban való felhasználás előtt nem tárolható. Az előállításának záró lépését képező 7 napos kondicionálási időszakot követően azonnal fel kell használni. SZAKIRODALOM E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. 4. függelék Az elfogadható hígítóvíz kémiai tulajdonságai Anyag Koncentráció Szemcsés anyag < 20 mg/l Összes szerves szén < 2 mg/l Ionizálatlan ammónia < 1 μg/l Keménység CaCO3 koncentrációban kifejezve < 400 mg/l (17) Maradék klór < 10 μg/l Összes szerves foszfort tartalmazó növényvédő szer < 50 ng/l Összes szerves klórt tartalmazó növényvédő szer plusz poliklórozott bifenilek < 50 ng/l Összes szerves klór < 25 ng/l 5. függelék Útmutató az árvaszúnyoglárvák kikelésének figyelemmel kíséréséhez A vizsgálati edényekre csapdákat helyezünk a kikelt példányok számára. A csapdák a 20. naptól a vizsgálat végéig szükségesek. Ezek egy példáját mutatja be az alábbi ábra: A: nylon háló B: fejjel lefelé fordított műanyagpohár C: vizsgálati edény, kiöntő nélkül D: hálós vízcserélő nyílás E: víz F: üledék C.28. SZENNYEZETT VÍZZEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 219. vizsgálati iránymutatásában (2004) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer célja a kétszárnyúak rendjébe tartozó édesvízi üledéklakó árvaszúnyoglárvák vegyi anyagoknak való tartós kitettsége hatásainak az értékelése. Főként a BBA mesterséges talajjal és vízoszlopban való expozíciós forgatókönyvvel végzett üledék-víz vizsgálati elrendezésre vonatkozó iránymutatásán alapul (1). Figyelembe veszi továbbá a Chironomus riparius és Chironomus tentans árvaszúnyog fajokkal végzett toxicitás vizsgálati protokollokat, amelyeket Európában és Észak-Amerikában (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) dolgoztak ki, és körvizsgálatnak vetettek alá (1)(6)(9). Más jól dokumentált árvaszúnyog fajok, például Chironomus yoshimatsui (10)(11) is használhatók. 2. A vizsgálati módszer által alkalmazott expozíciós forgatókönyv a víz szennyezése. A megfelelő expozíciós forgatókönyv a vizsgálat tervezett felhasználásától függ. A vízoszlopban való expozíción alapuló forgatókönyv a vízoszlop szennyezését foglalja magában, amely a növényvédő szerek permetezéssel történő vízbe jutását hivatott szimulálni, és a pórusvízben mérhető kezdeti csúcskoncentrációkra terjed ki. A vizsgálat időtartamánál hosszabb ideig tartó felhalmozódással járó folyamatok kivételével más típusú expozíciók (többek között a vegyi anyagok kiömlése) esetén is hasznos. 3. Az anyagok, amelyek üledéklakó organizmusokra gyakorolt hatását vizsgálni kell, általában hosszú ideig maradnak ebben a környezetben. Az üledéklakó organizmusok többféle módon lehetnek kitéve ezeknek az anyagoknak. Az egyes expozíciós útvonalak viszonylagos fontossága és a teljes toxikus hatás egyes expozíciós útvonalaknak tulajdonítható részének kialakulásához szükséges időtartam az érintett vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Az erősen adszorbeálódó (például log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok esetében fontos expozíciós útvonal lehet a szennyezet táplálék megemésztése. Az erősen lipofil anyagok toxicitása alulbecsülésének elkerülése érdekében megfontolandó, hogy a táplálékot a vizsgált anyaggal való szennyezést megelőzően az üledékbe keverjük. Az itt bemutatott vizsgálati módszer a tartós kitettségre épül, amely azt a célt szolgálja, hogy valamennyi lehetséges expozíciós útvonal figyelembe vehető legyen. A vizsgálat időtartama a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 20–28 nap, a C. tentans esetében 28–65 nap. Ha egy meghatározott célra – például instabil vegyületek hatásainak a vizsgálatára – rövid távú adatok kellenek, a felesleges ismétlések tíz nap után eltávolíthatók. 4. A mért végpontok a kikelt kifejlett példányok száma és a kikeléshez szükséges idő. Ha kiegészítő rövid távú adatokra van szükség, akkor a lárvák túlélésének és fejlődésének mérését csak a tíznapos időszak eltelte után ajánlott megkezdeni, megfelelő számú ismétlést alkalmazva. 5. Mesterséges üledék használata ajánlott. A mesterséges üledék számos előnnyel rendelkezik a természetes üledékkel szemben: — a kísérlet változékonysága kisebb, mivel a mesterséges üledék egy reprodukálható »szabványosított közeget« biztosít, és nem kell szennyezésmentes, tiszta üledékforrást keresni, — a vizsgálatok bármikor elkezdhetők anélkül, hogy a vizsgálathoz használt üledék szezonális változékonyságát figyelembe kellene venni, és az üledéket nem kell előzetes kezelésnek alávetni a honos fauna eltávolítása végett; a mesterséges üledék alkalmazása a rutinvizsgálatokhoz szükséges mennyiségű üledék terepen történő gyűjtésével kapcsolatos költségeket is csökkenti, — a mesterséges üledék alkalmazása lehetővé teszi a különböző anyagok toxicitásának összehasonlítását és ennek megfelelő rangsorolását: a természetes és a mesterséges üledékkel végzett vizsgálatokból származó toxicitási adatok számos vegyi anyag esetében összehasonlíthatók voltak (2). 6. A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza. A VIZSGÁLAT ELVE 7. Első fejlődési szakaszban lévő árvaszúnyoglárvákat teszünk ki a vizsgált anyag különböző koncentrációinak üledék-víz elrendezésekben. A vizsgálat kezdetén első fejlődési szakaszban lévő lárvákat helyezünk az üledék-víz elrendezést tartalmazó vizsgálati edényekbe, majd ezt követően a vizsgált anyaggal szennyezzük a vizet. Az árvaszúnyoglárvák kikelésének és fejlődésének ütemét a vizsgálat végén mérjük. Szükség esetén 10 nap elteltével is mérhetjük a lárvák túlélését és súlyát (megfelelő számú ismétlést alkalmazva). A kapott adatokból regressziós modell segítségével megbecsüljük azt a koncentrációt, amely a kikelésnek vagy a lárvák túlélésének, illetve fejlődésének x %-os csökkenését okozná (például EC15, EC50, stb.), vagy statisztikai hipotézisvizsgálattal meghatározzuk a megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt, illetve a megfigyelhető hatást okozó legkisebb koncentrációt (NOEC/LOEC). Az utóbbi esetben a hatást okozó értékeket statisztikai vizsgálatok segítségével össze kell hasonlítani a kontroll értékekkel. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK 8. Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát, páranyomását, mért vagy számított megoszlását az üledékben, valamint stabilitását vízben és az üledékben. Rendelkezni kell egy megbízható analitikai módszerrel a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásához a fedővízben, a pórusvízben és az üledékben, amelynek pontossága és kimutatási határa ismert és dokumentált. Hasznos információ a vizsgált anyag szerkezeti képlete és kémiai tisztasága. Ugyancsak hasznos információ, hogy milyen kémiai folyamatokon megy keresztül a vizsgált anyag (például disszipáció, nem biológiai és biológiai lebomlás, stb.). A vizsgálat elvégzését megnehezítő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkező anyagok vizsgálatára vonatkozóan a szakirodalom (12) nyújt további tájékoztatást. REFERENCIA-VEGYIANYAGOK 9. A vizsgálati protokoll és a vizsgálati körülmények megbízhatóságának megerősítése céljából rendszeres időközönként érdemes referencia-vegyianyagokkal elvégezni a vizsgálatot. Körvizsgálatokban és validálási vizsgálatokban eredményesen használt mérgező referenciaanyagok például a következők: lindane, trifluralin, pentaklórfenol, kadmium-klorid és a kálium-klorid (1)(2)(5)(6)(13). A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE 10. A következő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen: — A lárvák kikelésének aránya a kontroll edényekben legalább 70 % a vizsgálat végén (1)(6). — A kontroll edényekben 12–23 nappal a behelyezést követően kell megjelenniük a kifejlett C. riparius és C. yoshimatsui példányoknak; a C. tentans esetében ehhez 20–65 nap szükséges. — A vizsgálat végén mindegyik edényben meg kell mérni a pH-t és az oldott oxigén koncentrációját. Az oxigénkoncentrációnak a levegő alkalmazott hőmérséklet melletti telítettségi értéke (ASV) legalább 60 %-ának kell lennie, a fedővíz pH-értékének pedig minden edényben a 6–9 tartományon belülre kell esnie. — a víz hőmérséklete legfeljebb ± 1,0 °C-kal változhat. A vízhőmérséklet szabályozásának egyik lehetséges módja, hogy a vizsgálatot állandó hőmérsékletű helyiségben végezzük, amely esetben a helyiség hőmérsékletét megfelelő időközönként ellenőrizni kell. A MÓDSZER LEÍRÁSA Vizsgálati edények 11. A vizsgálatot 600 ml-es üvegedényekben végezzük, amelyek átmérője 8 cm. Amennyiben az üledék és a fedővíz megfelelő mélysége biztosított, ettől eltérő edények is alkalmazhatók. Lárvánként 2–3 cm2 nagyságú üledékfelületet kell biztosítani. Az üledékréteg és a fedővíz mélységének aránya 1:4 legyen. A vizsgálati edényeknek és a vizsgálati elrendezéssel érintkező egyéb készülékeknek teljes mértékben üvegből vagy más kémiailag semleges anyagból (például teflon) kell készülniük. A fajok kiválasztása 12. A vizsgálatot lehetőleg a Chironomus riparius fajjal végezzük. Chironomus tentans is alkalmazható, de nehezebben kezelhető, és hosszabb vizsgálati időszakot igényel. Chironomus yohimatsui szintén használható. A 2. függelékben részletezett tenyésztési módszerek a Chironomus riparius fajra vonatkoznak. A szakirodalomban más fajok – úgymint a Chironomus tentans (4) és a Chironomus yoshimatsui (11) – tenyésztési körülményeire vonatkozó tudnivalók is megtalálhatók. A vizsgálat megkezdése előtt ellenőrzésképpen fajmeghatározást kell végezni, de ha a példányok saját tenyészetből származnak, akkor ezt nem szükséges minden vizsgálat előtt megtenni. Üledék 13. Lehetőleg mesterséges üledék (más néven formulázott, kevert vagy műüledék) használata ajánlott. Ha azonban mégis természetes üledéket használunk, akkor azt jellemezni kell (legalább a pH-t és a szerves széntartalmat meg kell határozni, de más paraméterek, például a C/N arány és a szemcseszerkezet vizsgálata is ajánlott), és mentesnek kell lennie mindenféle szennyezéstől, valamint az árvaszúnyoggal versengő vagy az azt fogyasztó egyéb organizmusoktól. Az árvaszúnyoglárvákkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott továbbá a természetes üledéket az elkövetkező vizsgálat során uralkodókkal megegyező körülmények között hét napon keresztül kondicionálni. E vizsgálat során az alábbi, a C.8. vizsgálati módszerben (14) alkalmazott mesterséges talajon alapuló mesterséges üledék alkalmazása ajánlott (1)(15)(16): a) 4–5 % (száraz tömeg) tőzeg, amelynek pH-ja a lehető legközelebb esik az 5,5–6,0 értékhez; fontos, hogy por alakú, finomra őrölt (részecskeméret ≤ 1 mm) és kizárólag levegőn szárított tőzeget használjunk. b) 20 % (száraz tömeg) kaolinagyag (lehetőleg 30 % feletti kaolinit tartalommal). c) 75–76 % (száraz tömeg) kvarchomok (túlnyomó részben finom homok, amely részecskéinek több mint 50 %-a 50 és 200 μm közötti szemcsemérettel rendelkezik). d) Annyi ionmentesített víz, amely ahhoz szükséges, hogy végtermékként 30-50 % nedvességtartalmú keveréket kapjunk. e) A végtermékként kapott üledékkeverék pH-jának 7,0 ± 0,5 értékre történő beállításához szükséges mennyiségű vegytiszta minőségű kalcium-karbonát (CaCO3). f) A végtermékként kapott keveréknek 2 % (±0,5 %) szerves széntartalommal kell rendelkeznie, amelyet az a) és c) pont szerinti megfelelő mennyiségű tőzeg és homok hozzáadásával érünk el. 14. A tőzegnek, a kaolinagyagnak és a homoknak ismert forrásból kell származnia. Ellenőrizni kell, hogy az üledék összetevőiben nem fordulnak elő kémiai szennyeződések (például nehézfémek, szerves klórvegyületek, szerves foszforvegyületek, stb.) A mesterséges üledék elkészítésének egy példáját a 3. függelék mutatja be. Száraz összetevők keverése is elfogadott, amennyiben bizonyítható, hogy a fedővíz hozzáadását követően az üledék nem esik szét összetevőire (például a vízben lebegő tőzegrészecskékre), és a tőzeget vagy az üledéket megfelelően kondicionáltuk. Víz 15. Az elfogadható hígítóvíz 2. és 4. függelékben felsorolt kémiai tulajdonságaival rendelkező bármely víz alkalmas a vizsgálathoz. Tenyésztővízként és kísérleti vízként bármely alkalmas víz, természetes víz (felszíni vagy talajvíz), mesterséges víz (lásd a 2. függeléket) vagy klórtalanított csapvíz elfogadható, amelyben az árvaszúnyoglárvák a tenyésztés és a vizsgálat időszaka alatt életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. A vizsgálat kezdetén a vizsgálathoz alkalmazott víz pH-értékének 6 és 9 között kell lennie, keménysége pedig nem haladhatja meg a 400 mg/l CaCO3 értéket. Ennél lágyabb vizet kell azonban alkalmazni akkor, ha gyanítható, hogy a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között kölcsönhatás alakul ki (és ezért ebben az esetben az Elendt-féle M4 közeg nem alkalmazható). A vizsgálat teljes időtartama alatt ugyanazt a víztípust kell használni. A 4. függelékben felsorolt vízminőségi jellemzőket évente legalább kétszer kell mérni, illetve minden olyan alkalommal, amikor fennáll a gyanúja annak, hogy e jellemzők jelentős mértékben megváltoztak. Törzsoldatok – szennyezett víz 16. A vizsgálathoz használt koncentrációk kiszámítása a vízoszlopban, azaz az üledék feletti vízrétegben mérhető koncentrációk alapján történik. A vizsgálathoz használt, választott koncentrációjú oldatokat általában törzsoldat hígításával készítjük. A törzsoldatokat lehetőség szerint a vizsgált anyag vizsgálathoz használt közegben való feloldásával kell elkészíteni. Egyes esetekben oldószer vagy diszpergálószer használatára lehet szükség a megfelelő töménységű törzsoldat előállításához. Alkalmas oldószerek például a következők: aceton, etanol, metanol, etilénglikol-dimetiléter, dimetilformamid és trietilén-glikol. A felhasználható diszpergálószerek: Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz (0,01 %-os) és HCO-40. Az oldódást segítő szer csak minimális (azaz ≤ 0,1 ml/l) koncentrációban lehet jelen a végtermékként kapott, vizsgálathoz használandó közegben, és minden kezeléshez ugyanazt a szert kell használni. Az oldódást segítő szer nem lehet jelentős hatással a túlélésre, és nem lehet látható hátrányos hatása az árvaszúnyoglárvákra a csak oldószerrel kezelt kontrollcsoporttal végzett vizsgálat által feltártak alapján. A VIZSGÁLAT MEGTERVEZÉSE 17. A vizsgálat megtervezése a vizsgálat során alkalmazott koncentrációk számának és osztásközének, az egyes koncentrációkkal használt edények számának, valamint a lárvák edényenkénti számának a megválasztását jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra tekintettel kell megtervezni. Az EC pontnak és a NOEC becslésének, valamint a határérték-vizsgálatnak a megtervezését ismertetjük. A hipotézisvizsgálat elsődleges módszere a regressziós analízis. A regressziós analízis megtervezése 18. A vizsgálat során alkalmazott koncentrációknak le kell fedniük a hatáskoncentrációt (például EC15, EC50) és azt a koncentrációtartományt, amelyen belül a vizsgált anyag érdeklődésre számot tartó hatással rendelkezik. A hatáskoncentráció becsléseknek (ECx) a pontossága és különösképpen az érvényessége általában jobb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentrációtartományon belül helyezkedik el. A lehető legkisebb pozitív koncentrációnál jóval alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációnál jóval magasabb értékek extrapolálását kerülni kell. Az alkalmazandó koncentrációtartomány kiválasztásához hasznos lehet előzetes behatároló vizsgálatot végezni (lásd 27. bekezdés). 19. Az ECx becsléséhez legalább öt koncentrációt kell vizsgálni, és mindegyik koncentráció esetében három ismétlést kell alkalmazni. A jó modellbecslés lehetővé tétele érdekében minden esetben tanácsos elegendő vizsgálati koncentrációt használni. A rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek (kivételt képeznek azok az esetek, amikor a dózis-válasz görbe lapos). Az eltérő választ kiváltó vizsgálati koncentrációk számának emelkedése esetén az egyes kezeléseknél alkalmazott ismétlésszám csökkenthető. Az ismétlésszám növelése vagy a vizsgálat során alkalmazott koncentráció intervallum szűkítése általában a konfidencia intervallum csökkenéséhez vezet. A lárvák tíznapos túlélési arányának és fejlődési sebességének a becslése esetén további ismétlések szükségesek. A NOEC/LOEC becslésének megtervezése 20. A LOEC/NOEC becsléséhez öt koncentrációt kell vizsgálni legalább négy ismétlést alkalmazva úgy, hogy a rákövetkező koncentráció legfeljebb kétszerese legyen az előzőnek. Az ismétlések számának elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel kimutasson egy statisztikai próba. A fejlődési ütem esetében általában varianciaanalízist (ANOVA), például Dunnett vagy Williams próbát (17)(18)(19)(20) lehet alkalmazni. Ha a kikelési arányt vizsgáljuk, akkor a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni-féle korrekcióval) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk. Határérték-vizsgálat 21. Határérték-vizsgálatot akkor lehet végezni (egy vizsgálati és egy kontroll koncentrációval), ha az előzetes behatároló vizsgálat során nem voltak megfigyelhető hatások. A határérték-vizsgálat célja annak jelzése, hogy a vizsgált anyagra vonatkozó toxikus érték nagyobb, mint a vizsgált koncentrációs határérték. Ennél a vizsgálati módszernél nem lehet meghatározni az ajánlott koncentrációt; ez a szabályozók megítélésétől függ. Általában mind a kezelés, mind a kontroll esetében legalább hat ismétlés szükséges. Bizonyítni kell, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelelő valószínűséggel képes kimutatni egy statisztikai próba. Metrikus válasz (fejlődési ütem és súly) esetén alkalmas statisztikai módszer a t-próba, ha az adatok az alkalmazási feltéteknek (normalitás, szóráshomogenitás) megfelelnek. Ha a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenlő szórásnégyzeteket feltételező t-próba vagy egy nemparaméteres próba, például a Wilcoxon-Mann-Whithey próba alkalmazható. ELJÁRÁS Expozíciós körülmények A szennyezett víz – üledék elrendezés előállítása 22. A vizsgálati edényekbe megfelelő mennyiségű mesterséges üledéket (lásd a 3. függelék 13–14. bekezdéseit) helyezünk úgy, hogy az üledékréteg legalább 1,5 cm legyen. 6 cm mélységig vizet adunk hozzá (lásd a 15. bekezdést). Az üledékréteg és a víz mélységének az aránya legfeljebb 1:4 lehet, és az üledékréteg mélysége nem haladhatja meg a 3 cm-t. A vizsgálathoz használt organizmusok behelyezése előtt hét napon keresztül finoman levegőztessük az üledék-víz elrendezés (lásd a 14. bekezdést és a 3. függeléket). Annak elkerülése érdekében, hogy a vizsgálathoz használt víz hozzáadása során az üledék összetevőire essen szét, és a finom anyag a vízrétegben felkavarodjon, az üledéket letakarhatjuk egy műanyag lappal, miközben a vizet ráöntjük, amelyet közvetlenül a felöntést követően eltávolítunk. Erre a célra más eszközök is alkalmasak lehetnek. 23. A vizsgálati edényeket le kell fedni (például üveglappal). Az eredeti vízszint fenntartása érdekében a vizsgálat során pótoljuk az elpárolgott vizet, ha szükséges. A sófelhalmozódás elkerülése végett desztillált vagy ionmentesített vizet használjunk. A vizsgálathoz használt organizmusok hozzáadása 24. A vizsgálathoz használt organizmusok vizsgálati edényekbe történő behelyezése előtt négy-öt nappal helyezzük a tenyészetből gyűjtött petecsomókat tenyésztőközeget tartalmazó kisméretű edényekbe. A törzstenyészetből vett vagy frissen készített tenyésztőközeg egyaránt használható. Ez utóbbi használata esetén adjunk a tenyésztőközeghez kis mennyiségű táplálékot, például zöldalgát és/vagy finomra őrölt pehely formájú haleledelből készített szuszpenzió szüredékéből néhány cseppet (lásd a 2. függeléket). Csak frissen lerakott petecsomókat szabad használni. A lárvák általában néhány nappal a peterakást követően kezdenek kikelni (a Chironomus riparius esetében ez 20 °C-on 2–3 nap, a Chironomus tentans és a Chironomus yoshimatui esetében pedig 23 °C-on, illetve 25 °C-on 1–4 nap). A lárvák fejlődése négy, egyenként 4–8 napig tartó szakaszra osztható. A vizsgálathoz az első fejlődési szakaszban lévő lárvákat kell gyűjteni (2–3 vagy 1–4 nappal a kikelést követően). Az árvaszúnyoglárvák fejlődési szakaszát a fejszélesség alapján ellenőrizhetjük (6). 25. Mindegyik szennyezett üledéket és vizet tartalmazó vizsgálati edénybe húsz darab, tetszőlegesen kiválasztott lárvát helyezünk egy tompa végű pipetta segítségével. A lárvák vizsgálati edénybe helyezésének ideje alatt állítsuk le a víz levegőztetését, és a behelyezést követő 24 órás időszakon keresztül hagyjuk így (lásd a 24. és a 32. bekezdést). Az alkalmazott vizsgálati tervnek (lásd a 19. és a 20. bekezdést) megfelelően az EC pont becsléséhez legalább 60, a NOEC meghatározásához 80 lárvát használjunk koncentrációnként. 26. Huszonnégy órával a lárvák behelyezését követően a vizsgált anyaggal szennyezzük a fedővíz-réteget, és ismét gyenge levegőztetést biztosítunk. Pipettával kis mennyiséget juttatunk a vízfelszín alá a vizsgált anyag oldatából. Ezt követően a fedővizet gondosan megkeverjük, ügyelve arra, hogy az üledék ne kavarodjon fel. A vizsgálathoz használt koncentrációk 27. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációk meghatározásához hasznos lehet behatároló vizsgálatot végezni. E célra a vizsgált anyag koncentrációinak nagy osztásközű sorozatát használjuk. Annak érdekében, hogy az egy árvaszúnyoglárvára jutó felület megfeleljen a vizsgálat végleges változatában alkalmazandó lárvasűrűségnek, a lárvákat annyi ideig tesszük ki a vizsgált anyag egyes koncentrációinak, amely lehetővé teszi a megfelelő vizsgálati koncentrációk becslését anélkül, hogy ismétlésekre lenne szükség. 28. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációkat a behatároló vizsgálat eredménye alapján határozzuk meg. Legalább öt, a 18–20. bekezdésben leírt módszerrel kiválasztott koncentrációt kell használni. Kontroll edények 29. A vizsgálat során a megfelelő ismétlésszám (lásd a 19–20. bekezdést) biztosításához szükséges számú – csak üledéket, a vizsgált anyagot viszont nem tartalmazó – kontroll edényt kell alkalmazni. Ha a vizsgált anyag bevitele oldószer segítségével történt (lásd a 16. bekezdést), akkor az oldószer hatásainak az ellenőrzése céljára külön kontroll edények szükségesek. Vizsgálati elrendezés 30. Statikus elrendezést alkalmazunk. Kivételes esetekben – például ha a vízminőségi jellemzők nem felelnek meg a vizsgálathoz használt organizmusoknak, vagy befolyásolják a kémiai egyensúlyt (például túlságosan lecsökken az oldott oxigénszint, túlságosan megnő a kiválasztási termékek koncentrációja, vagy ásványi anyagok lúgozódnak ki az üledékből és hatást gyakorolnak a víz pH-jára és/vagy keménységére) – félstatikus vagy átfolyó rendszerű, a fedővíz szakaszos vagy folyamatos cseréjét lehetővé tévő vizsgálati elrendezések is alkalmazható. Mindazonáltal a fedővíz minőségének javítására szolgáló módszerek, így például a levegőztetés, általában elégségesek, és előnyben részesítendők. Táplálék 31. A lárvákat lehetőség szerint naponta vagy legalább hetente háromszor kell etetni. Az első 10 napban a fiatal lárvák számára megfelelőnek tűnik naponta lárvánként 0,25–0,5 mg (a C. yoshimatui esetében 0,35–0,5 mg) haleledelt adni (amely lehet vizes szuszpenzió vagy finomra őrölt eledel, például Tetra-Min vagy Tetra-Phyll; a részleteket lásd a 2. függelékben). Az idősebb lárváknak valamivel több táplálékra lehet szükségük: a vizsgálat hátralevő részében lárvánként naponta 0,5–1 mg mennyiségnek elegendőnek kell lennie. Gombaképződés vagy a lárvák pusztulása esetén a táplálékadagot valamennyi kísérleti és kontroll edényben csökkenteni kell. Ha a gombák szaporodása nem állítható meg, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni. Erősen adszorbeálódó (például log Kow > 5) vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépülő anyagok vizsgálata esetén az organizmusok túlélésének és természetes fejlődésének biztosításához szükséges mennyiségű táplálékot még a stabilizálódás időszaka előtt a mesterséges üledékbe keverhetjük. Erre a célra haleledel helyett növényi anyagot használjunk (például 0,5 % finomra őrölt nagy csalán (Urtica dioica), fehér eperfa (Morus alba), fehér here (Trifolium repens), paraj (Spinacia oleracea) levelet vagy más növényi anyagot (Cerophyl vagy alfa-cellulóz) adhatunk az üledékhez). Inkubációs körülmények 32. A lárvák vizsgálati edényekbe történő behelyezését követően lehetőleg 24 órán keresztül finoman levegőztessük a fedővizet, és a vizsgálat egész időtartama alatt biztosítsunk gyenge levegőztetést (ügyelve arra, hogy az oldott oxigén koncentrációja ne süllyedjen a levegő telítettségi érték (ASV) 60 %-a alá. A levegőt az üledékréteg fölött 2–3 cm-rel rögzített üveg Pasteur pipettán keresztül vezessük be (másodpercenként egy vagy néhány buborék). Illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén megfontolandó, hogy az üledék-víz elrendezés levegőztetésétől eltekintsünk. 33. A vizsgálatot 20 °C (± 2 °C) állandó hőmérséklet mellett hajtsuk végre. C. tentans használata esetén 23 °C, a C. yoshimatui esetében pedig 25 °C az ajánlott hőmérséklet (± 2 °C). 16 órás fényperiódust alkalmazzunk, 500–1 000 lux fényintenzitással. Expozíciós időtartam 34. A kitétel a lárvák szennyezett vizet tartalmazó, illetve kontroll edényekbe történő behelyezésekor veszi kezdetét. A maximális expozíciós időtartam a C. riparius és a C. yoshimatsui esetében 28 nap, C. tentans használata esetén 65 nap. Ha az árvaszúnyogok előbb kikelnek, akkor a vizsgálatot legalább öt nappal azt követően lehet befejezni, hogy a kontroll edényekben az utolsó kifejlett példány megjelent. MEGFIGYELÉSEK Kikelés 35. Meg kell határozni a fejlődési időt és a kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számát. A hímek tollas csápjukról könnyen felismerhetők 36. A kísérleti edényekben legalább hetente háromszor kell ellenőrizni a kontroll edényekben megfigyelhetőhöz képest rendellenesnek értékelhető viselkedést (például üledék elhagyása, szokatlan úszás). A kikelés várható időszaka alatt naponta meg kell számolni a kikelt árvaszúnyogokat. Naponta fel kell jegyezni a kikelt kifejlett egyedek nemét és számát. Az azonosítást követően az árvaszúnyogokat ki lehet engedni az edényekből. A vizsgálat befejezése előtt lerakott petecsomókat dokumentálni kell, és az új lárvák üledékbe kerülésének megelőzése érdekében el kell távolítani. Fel kell jegyezni továbbá a ki nem kelt bábok megfigyelhető számát. A kikelés méréséhez az 5. függelék nyújt útmutatást. Fejlődés és túlélés 37. Ha a lárvák 10 napos túlélési és fejlődési adatait is be kell mutatni, akkor már a vizsgálat kezdetétől fogva a későbbiekben használható kiegészítő kontroll edényeket kell alkalmazni. Az ezekből származó üledéket átszitáljuk egy 250 μm-es szitán, amelyen a lárvák fennmaradnak. Az elhullás kritériumai a mozdulatlanság, illetve a mechanikai ingerekre adott válasz hiánya. A hiányzó lárvákat is elhullottnak kell tekinteni (a vizsgálat elején elpusztult lárvákat a mikroorganizmusok már lebonthatták). Meghatározzuk a túlélő lárvák edényenkénti (elhullott lárvák maradványai nélküli) száraz tömegét, majd kiszámítjuk az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét. A túlélő lárvák fejlődési szakaszának a meghatározása is hasznos; ezt a fejszélesség mérése segítségével tehetjük meg. Analitikai mérések A vizsgált anyag koncentrációja 38. A fedővíz, a pórusvíz és az üledék legnagyobb és legkisebb koncentrációnál vett mintáit legalább a vizsgálat kezdetén (lehetőleg egy órával a vizsgált anyaggal történő szennyezést követően) és végén analizálni kell. A vizsgált anyag így meghatározott koncentrációja tájékoztatást nyújt a vizsgált anyag viselkedéséről/megoszlásáról a víz-üledék elrendezésben. Mivel a vizsgálat kezdetén történő mintavétel az üledékből hatással lehet a vizsgálati elrendezésre (például a vizsgálathoz használt lárvák eltávolítása révén), külön kísérleti edényeket kell használni az analitikai meghatározások vizsgálat kezdetén és adott esetben a vizsgálat során (lásd a 39. bekezdést) történő elvégzéséhez. Az üledékre vonatkozó mérések nem feltétlenül szükségesek abban az esetben, ha a vizsgált anyag megoszlása a víz és az üledék között egyértelműen meghatározható egy – például az üledék vízhez viszonyított aránya, a szennyezés típusa, az üledék szerves széntartalma tekintetében – összehasonlítható körülmények között végzett víz/üledék vizsgálat segítségével. 39. Ha a vizsgálat közben is végzünk méréseket (például a 7. napon), és az analízishez nagy minták szükségesek, amelyek nem gyűjthetők a kísérleti edényekből anélkül, hogy a mintavétel a vizsgálati elrendezésre hatással lenne, az analitikai meghatározásokat ugyanolyan kezelésnek alávetett (a vizsgálathoz használt organizmusokat is beleértve), de a biológiai megfigyelések céljára nem használt, külön vizsgálati edényekből származó mintákon kell elvégezni 40. A pórusvíz elkülönítésére ajánlott módszer például a 10 000 g intenzitással történő centrifugálás 4 °C-on 30 percig. Szűrést is lehet alkalmazni, amennyiben bizonyított, hogy szűrő nem adszorbeálja a vizsgált anyagot. Ha a minta mérete túl kicsi, akkor előfordulhat, hogy nem analizálható a koncentráció a pórusvízben. Fizikai és kémiai paraméterek 41. A vizsgálathoz használt víz pH-ját és oldott oxigén koncentrációját, valamint a kísérleti edények hőmérsékletét megfelelő módon kell mérni (lásd a 10. bekezdést). A vizsgálat kezdetén és végén a legnagyobb koncentrációnál meg kell mérni a víz keménységét és ammónia tartalmát a kontroll edényekben és egy kísérleti edényben. ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVVEZETÉS Az eredmények kezelése 42. E vizsgálat célja a vizsgált anyag kikelt kifejlett hím és nőstény árvaszúnyogok összes számára és fejlődési ütemére, illetve 10 napos vizsgálat esetében a lárvák túlélésére és súlyára gyakorolt hatásainak a meghatározása. Ha semmi nem utal a nemek statisztikailag eltérő érzékenységére, akkor a hímekre és a nőstényekre vonatkozó eredmények a statisztikai elemzés céljára összevonhatók. Az érzékenység nemek közötti különbségének statisztikai megítélésére például a χ2-r x 2 próba alkalmazható. Szükség esetén 10 nap elteltével meg kell határozni a lárvák túlélését és az egyedek egy edényre eső átlagos száraz tömegét. 43. A fedővízben mért koncentrációkként kifejezett hatáskoncentrációkat lehetőleg a vizsgálat kezdetén mért koncentrációk alapján kell kiszámítani (lásd a 38. bekezdést). 44. Az EC50 vagy bármely más ECx pontbecsléséhez az edényenkénti statisztikákat valódi ismétléseknek kell tekinteni. Bármely ECx konfidencia intervallumának a kiszámítása során vagy figyelembe kell venni az edények közötti eltéréseket, vagy ki kell mutatni, hogy az eltérés elhanyagolható mértékű. Ha a modell mérési pontokhoz illesztéséhez a legkisebb négyzetek módszerét használjuk, akkor a szóráshomogenitás javítása érdekében az edényenkénti statisztikákat transzformálni kell. Az ECx értékeket az eredeti válaszértékekre való visszatranszformálás után kell kiszámítani. 45. Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC hipotézisvizsgálattal történő meghatározása, az edények közötti eltérések figyelembevételére például hierarchikus varianciaanalízist (nested ANOVA) kell végezni. Alternatívaként ennél robosztusabb próbák (21) is helyénvalók lehetnek olyan esetekben, amikor az ANOVA szokásos alapfeltevései nem teljesülnek. Kikelési arány 46. A kikelési arányok kvantális adatok, amelyek a Cochran-Armitage próbával elemezhetők a lefelé lépegető eljárást alkalmazva, amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és az adatok ennek az elvárásnak megfelelnek. Ha ez nem így van, akkor a Fisher-féle egzakt próbát vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk a p-értékek Bonferroni- vagy Holm-féle eljárással történő korrekciójával. Ha az ugyanazon koncentrációhoz tartozó ismétlések közötti eltérések bizonyítottan nagyobbak, mint amit a binomiális eloszlás indokolna (amelyet gyakran »extra-binomiális« variációnak neveznek), akkor egy robusztus Cochran-Armitage vagy Fisher-féle egzakt próbát kell alkalmazni, mint amilyet például a (21) javasol. 47. Meg kell határozni az egy edényre jutó kikelt árvaszúnyogok számát (ne), majd el kell osztani a behelyezett lárvák számával (na): ahol: ER = kikelési arány ne = kikelt árvaszúnyogok egy edényre jutó száma na = behelyezett lárvák egy edényre jutó száma 48. Egy másik, legfőképp nagy minták és extra-binomiális variáció esetén alkalmazható lehetőség, hogy a kikelési arányt folyamatos változóként kezeljük, és amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és ez az elvárás összhangban áll a kapott ER adatokkal, a Williams próbához hasonló eljárást alkalmazunk. Ha a monotonitás nem áll fenn, a Dunnett próbát lehet alkalmazni. A nagy mintát itt úgy értelmezzük, hogy az egy ismétlésre (edényre) jutó kikelt és nem kikelt árvaszúnyogok száma egyaránt meghaladja az ötöt. 49. Az ANOVA módszerek alkalmazásához az ER értékeket először négyzetgyök arkusz-szinusz vagy Freeman-Tukey transzformáció segítségével átalakítjuk, hogy a normálishoz közeli eloszlást kapjunk, és a szórásokat kiegyenlítsük. Abszolút gyakoriságok esetén a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk. A négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció az ER négyzetgyökének az arkusz szinuszát (sin–1) adja. 50. A kikelési arányok meghatározásához regressziós analízissel (vagy például probit (22), logit, Weibull, kereskedelmi forgalomban kapható megfelelő szoftverrel) számítjuk ki az ECx értékeket. Ha a regressziós analízis alkalmatlannak bizonyul (például kettőnél kevesebb részleges válasz esetén), más nemparaméteres módszert, például mozgóátlag-módszert vagy egyszerű interpolációt használunk. Fejlődési ütem 51. Az átlagos fejlődési idő a lárvák kísérleti edényekbe történő behelyezésétől (a vizsgálat 0. napjától) az árvaszúnyogok kikeléséig tartó átlagos időtartamot jelenti. (A valódi fejlődési idő kiszámításához figyelembe kell venni a lárvák életkorát a behelyezés időpontjában). A fejlődési ütem a fejlődési idő reciproka (egysége: 1/nap), és a lárvafejlődés egy napra eső részét fejezi ki. Az ilyen jellegű üledék-toxicitási vizsgálatok értékeléséhez inkább a fejlődési ütemet használjuk, mivel kisebb a szórása, homogénebb és a normálishoz közelebb álló eloszlást mutat, mint a fejlődési idő. Ennélfogva a fejlődési ütem hatásosabb paraméteres vizsgálati eljárások alkalmazását teszi lehetővé, mint a fejlődési idő. A folyamatos változónak tekintett fejlődési ütemhez tartozó ECx értékek becslésére regressziós analízist használunk (például (23)(24)). 52. A következő statisztikai próbákhoz feltételezzük, hogy az x. ellenőrzési napon megfigyelt számú árvaszúnyog az x. nap és az x–1. nap (l = az ellenőrzések közötti intervallum hossza, általában 1 nap) közötti időintervallum közepén kelt ki. Az egy edényre jutó átlagos fejlődési ütemet (x) a következő képlet szerint számítjuk ki: ahol: : egy edényre jutó átlagos fejlődési ütem i : ellenőrzési intervallum indexe m : ellenőrzési intervallumok maximális száma : az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok száma ne : kikelt árvaszúnyogok száma összesen a kísérlet végén (= ) xi : az i ellenőrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok fejlődési üteme ahol: dayi : ellenőrzési nap (a behelyezés óta eltelt napok száma) li : az i ellenőrzési intervallum hossza (napokban kifejezve, általában 1 nap) Vizsgálati jegyzőkönyv 53. A vizsgálati jegyzőkönyvnek legalább a következő információkat kell tartalmaznia: Vizsgált anyag: — fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok (vízoldékonyság, páranyomás, talajra (vagy ha rendelkezésre áll, az üledékre) vonatkozó megoszlási hányados, stabilitás vízben, stb.), — kémiai azonosító adatok (közönséges név, kémiai név, szerkezeti képlet, CAS-szám, stb.,) beleértve a kémiai tisztaságot és a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásának analitikai módszerét. A vizsgálathoz felhasznált faj: — a vizsgálathoz felhasznált állatok: faj, tudományos elnevezés, az organizmusok származása és tenyésztési körülményei, — a petecsomók és a lárvák kezelésére vonatkozó információk, — a vizsgálathoz felhasznált állatok életkora az edényekbe történő behelyezésükkor. Vizsgálati körülmények: — az alkalmazott üledék, azaz természetes vagy mesterséges üledék, — természetes üledék esetén az üledékminta gyűjtésének helye és a mintavételi hely leírása, beleértve lehetőség szerint a szennyezés történetét; jellemzők: pH, szerves széntartalom, C/N arány és szemcseszerkezet (ha indokolt), — a mesterséges üledék előállítása: összetevők és jellemzők (szerves széntartalom, pH, nedvességtartalom, stb. a vizsgálat kezdetén), — a vizsgálathoz használt víz előállítása (mesterségesen készített víz esetén) és jellemzői (oxigénkoncentráció, pH, vezetőképesség, keménység, stb. a vizsgálat kezdetén), — az üledék és a fedővíz mélysége, — a fedővíz és a pórusvíz mennyisége; a nedves üledék tömege pórusvízzel és pórusvíz nélkül, — vizsgálati edények (anyag és méret), — a törzsoldatok előállításának módszere és a vizsgálathoz használt koncentrációk, — a vizsgált anyag bevitele: alkalmazott vizsgálati koncentrációk, ismétlésszám és esetlegesen használt oldószer, — inkubációs körülmények: hőmérséklet, fényciklus és intenzitás, levegőztetés (gyakoriság és intenzitás), — a táplálásra vonatkozó információk, beleértve a táplálék típusát, elkészítését, mennyiségét és a táplálás rendjét. Eredmények: — a névleges vizsgálati koncentrációk, a mért vizsgálati koncentrációk és a kísérleti edények vizsgált anyag koncentrációjának a meghatározására használt analízisek eredményei, — a víz minősége a vizsgálati edényekben, azaz pH, hőmérséklet, oldott oxigén, vízkeménység és ammóniatartalom, — az elpárolgott víz pótlása a vizsgálati edényekben, ha pótoljuk, — a kikelt hím és nőstény árvaszúnyogok egy edényre és napra eső száma, — ki nem kelt lárvák egy edényre jutó száma, — a lárvák egy edényre és – adott esetben – egy fejlődési szakaszra jutó átlagos száraz tömege, — ismétlésenkénti és vizsgálati koncentrációnkénti százalékos kikelés (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen), — kikelt kifejlett árvaszúnyogok ismétlésenkénti és kezelési arányonkénti átlagos fejlődési üteme (hím és nőstény árvaszúnyogok együttesen), — toxicitási végpontok – például ECx (és a hozzá tartozó konfidencia intervallum), NOEC és/vagy LOEC – becsült értékei, valamint a meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek, — az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszertől való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását. SZAKIRODALOM (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Kultúra methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra. (15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. (16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. 1. függelék FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK E módszer alkalmazásában a következő fogalommeghatározások alkalmazandók: Mesterséges üledék vagy formulázott, kevert vagy műüledék: a természetes üledék fizikai összetevőinek az imitálására használt anyagok keveréke. Fedővíz: a vizsgálati edényben az üledék felé kerülő víz. Pórusvíz vagy szemcseközi víz: az üledék és a talaj szemcséi közötti helyet kitöltő víz. Szennyezett víz: a vizsgált vegyi anyaggal szennyezett víz. Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék. 2. függelék Ajánlások a Chironomus riparius tenyésztéséhez 1. Az árvaszúnyoglárvákat kristályosító csészékben vagy nagyobb edényekben tenyésztjük. Az edény aljára szórjunk vékony réteg (kb. 5–10 mm) kvarchomokot. A szilikagél (például Merck, cikkszám: 8117) is megfelelő szubsztrátumnak bizonyult (ebből vékonyabb, pár milliméternyi réteg is elegendő). Ezt követően töltsünk néhány centiméternyi megfelelő vizet az edénybe. A vízszint fenntartása és a kiszáradás megelőzése érdekében szükség szerint pótoljuk az elpárolgott vizet. Cserélhetjük is a vizet, ha kell. Biztosítsunk gyenge levegőztetést. A lárvatenyésztő edényeket tartsuk egy megfelelő ketrecben, amelyből a kikelő kifejlett példányok nem tudnak kiszökni. A ketrecben legyen elég hely a kikelt kifejlett példányoknak a mozgásra, mert ellenkező esetben nem fognak párosodni (minimum kb. 30 × 30 × 30 cm). 2. A ketreceket tartsuk szobahőmérsékleten vagy 20 ± 2 °C állandó hőmérsékletű helyiségben, 16 órán keresztül világosban (fényintenzitás kb. 1 000 lux) és 8 órán keresztül sötétben. Dokumentálták, hogy a 60 % RH alatti légnedvesség gátolhatja a szaporodást. Hígítóvíz 3. Bármilyen alkalmas természetes vagy művíz használható. Általában kútvizet, klórtalanított csapvizet vagy mesterséges közeget (például Elendt-féle M4 vagy M7 közeget, lásd lentebb) használunk. Használat előtt a vizet levegőztetni kell. Szükség esetén cserélhetjük a tenyésztéshez használt vizet. Ehhez a használt vizet öntsük le vagy szívjuk ki a tenyésztő edényekből ügyelve arra, hogy a lárvák által épített lakócsöveket el ne pusztítsuk. A lárvák táplálása 4. Az árvaszúnyoglárvákat pehely formájú haleledellel (Tetra Min®, Tetra Phyll® vagy hasonló, védett márkájú haltáppal) etessük, amelyből naponta körülbelül 250 mg-ot adjunk minden edényhez porrá őrölve szárazon vagy vizes szuszpenzióban, amelynek az elkészítéséhez 1,0 g pehely formájú haleledelt keverjünk el 20 ml hígítóvízben úgy, hogy homogén keveréket kapjunk. Ebből a készítményből naponta 5 ml-t adjunk minden edényhez (használat előtt felrázandó). Az idősebb lárvák kaphatnak ennél többet. 5. A táplálék mennyiségét a vízminőséghez kell igazítani. Ha a tenyésztőközeg zavarossá válik, akkor csökkenteni kell a mennyiséget. Az adott táplálék mennyiségét szigorú ellenőrzés alatt kell tartani. Ha túl kevés a táplálék, akkor a lárvák a vízrétegbe vándorolnak, ha túl sok, akkor fokozódik a mikrobatevékenység és csökken az oxigénkoncentráció. Mindkét körülmény a fejlődési ütem lassulását okozhatja. 6. Az újonnan létesített tenyésztő edényekhez zöldalga (például Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) sejtek is adhatók. A kikelt kifejlett példányok táplálása 7. Egyes kísérletek szerint a kikelt kifejlett példányok számára egy telített cukoroldatba mártott vattakorong szolgálhat táplálékként. Kikelés 8. 20 ± 2 °C hőmérsékleten a kifejlett példányok körülbelül 13–15 nap elteltével kezdenek megjelenni a lárvatenyésztő edényekben. A hímek tollas csápjuk alapján könnyen megkülönböztethetők. Petecsomók 9. Miután a kifejlett példányok megjelentek a tenyésztőketrecben, a lárvatenyésztő edényekben hetente háromszor ellenőrizni kell a lerakott zselatinszerű petecsomókat, amelyeket gondosan el kell távolítani, és át kell helyezni egy tenyésztővíz-mintát tartalmazó kisméretű edénybe. A petecsomókat új tenyészetek létrehozására (például 2–4 petecsomó/edény) vagy toxicitási vizsgálatok céljára használjuk fel. 10. Az első fejlődési szakaszban lévő lárváknak 2–3 napon belül kell kikelniük. Új tenyészetek létesítése 11. A stabil tenyészetekből hetente vagy – a vizsgálati követelményektől függően – ritkábban friss lárvatenyészetek hozhatók létre, miközben a régebbi edényeket a kifejlett árvaszúnyogok megjelenését követően eltávolítjuk. Ezzel a rendszerrel minimális kezelést igénylő módon biztosítható a kifejlett példányok rendszeres utánpótlása. A vizsgálathoz használt »M4« és »M7« oldatok előállítása 12. Az »M4« közeg leírása Elendt (1990) munkájában megtalálható. Az »M7« közeg ugyanúgy készül, mint az »M4«, azzal a különbséggel, hogy az 1. táblázatban feltüntetett anyagok koncentrációja az »M7« esetében négyszer alacsonyabb, mint az »M4« készítésekor. Az »M7« közegről szóló publikáció előkészületben van (Elendt, személyes közlés). A vizsgálathoz használt oldatot azért nem Elendt és Bias (1990) szerint kell előállítani, mert a törzsoldatok elkészítéséhez megadott NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 és K2HPO4 koncentrációk nem megfelelők. Az »M7« közeg előállítása 13. Az (I) törzsoldatok mindegyikét külön kell elkészíteni, majd az (I) törzsoldatokból egy (II) kombinált törzsoldatot készítünk (lásd az 1. táblázatot). Az »M7« közeg előállításához a (II) kombinált törzsoldat 50 ml-ét és az egyes makrotápanyagok törzsoldatainak a 2. táblázatban megadott mennyiségeit ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk. Vitamin-törzsoldatot készítünk, amelyhez három vitamint ionmentesített vízhez adunk a 3. táblázatban meghatározottak szerint, majd röviddel a felhasználás előtt az »M7« közeghez adunk 0,1 ml-t a kombinált vitamin törzsoldatból. (A vitamin-törzsoldatot kis aliquot részekben, fagyasztott állapotban kell tartani). A közeget levegőztetni és stabilizálni kell. 1. táblázat Nyomelemek törzsoldatai az M4 és M7 közeghez (I) törzsoldatok Ion-mentesített vízzel 1 literre hígított mennyiség (mg) A (II) kombinált törzsoldat előállításához az (I) törzsoldatok következő mennyiségeit (ml) elegyítjük és ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk Végleges koncentráció a vizsgálathoz használt oldatban (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18)