I. MELLÉKLET

A 3. cikk (2) bekezdésében említett, a meghatározott károsító kimutatására és azonosítására szolgáló vizsgálati módszerek

1. Spórákkal végzett vizsgálat

A kimutatás és azonosítás nyári sporangiumok és nyugvó spórák használatával történik, amelyeket szitálást követően a talajból vagy közvetlenül a növényi anyagból nyernek.

2. Kimutatási módszerek

A meghatározott károsító spóráinak talajból történő kivonásához a következő módszerek egyikét kell alkalmazni:

a) a Pratt által leírt talajszitálási módszer (1976) (1);

b) a van Leeuwen et al. által leírt talajszitálási módszer (2005) (2);

c) a Wander et al. által leírt, nagy mennyiségű minta feldolgozására szolgáló zonális centrifugálási technika (2007) (3).

3. Azonosítási módszerek

A kivonást követően a meghatározott károsító spóráit a következő módszerek egyikével kell azonosítani:

a) morfológiai azonosítás fénymikroszkóp alatt, 100–400-szoros nagyítás mellett;

b) hagyományos PCR-vizsgálat primerek alkalmazásával, Lévesque et al. (2001) (4) és van den Boogert et al. (2005) (5) alapján;

c) valós idejű PCR primerek és próbák alkalmazásával, van Gent-Pelzer et al. (2010) (6) alapján;

d) valós idejű PCR primerek és próbák alkalmazásával, Smith et al. (2014) (7) alapján.

4. A nyugvó spórák életképessége

A nyugvó spórák életképessége mikroszkópos vizsgálattal vagy biológiai teszttel határozható meg. A sporangiumok életképessége a laktofenolba vagy vízbe helyezett sporangiumok mikroszkopikus vizsgálatával határozható meg (Przetakiewicz 2015) (8). A szemcséket tartalmazó vagy kissé lekerekített formájú protoplazmával rendelkező sporangiumok életképesnek tekinthetők. A tartósan plazmolizált vagy látható tartalommal nem rendelkező sporangiumokat elpusztultnak kell tekinteni.

Alternatívaként vagy kétség esetén a IV. melléklet 3. pontjában leírt biológiai teszt is elvégezhető.

5. A patotípusok meghatározása

A patotípusok meghatározásához friss rákos részekre van szükség.

A vizsgálathoz szükséges inokulumot a következő módszerek egyikével kell előállítani:

a) a SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture) módszere, amely a következő két lépésből áll: i. inokulum előállítása Öreg (barna) rákszövetet kisebb darabokra törnek, majd szobahőmérsékleten levegőn szárítják, amíg megkeményedik. A kemény szövetet kézzel vagy géppel megőrlik. Az őrölt anyagot szárazon szitálják, melynek során összegyűjtik a 25–75 μm-es frakciót, majd Pratt kloroformos módszerével (1976)1 extrahálják; ii. friss rákos részek előállítása Körülbelül 10 mg kivont nyugvó spórát 10 ml steril desztillált víz felszínére szórnak egy kis méretű Petri-csészében, majd sötétben, 20 °C-on inkubálják csírázásig. A kb. 1–2 mm hosszú, kis csírákkal rendelkező burgonyagumókat nedves tissue-papírral bélelt átlátszó műanyag dobozokba helyezik úgy, hogy a megjelölt csírák felfelé nézzenek. A csírák köré fecskendő segítségével felolvasztott vazelinból gyűrűt vonnak. A gyűrűnek összefüggőnek és elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy a spóraszuszpenziót megtartsa anélkül, hogy az kiszivárogna. A 10 ml mennyiségű csírázó nyugvó spórákat steril vízzel 20 ml-re hígítják, majd pipetta vagy nyomópalack segítségével a gyűrűkön belülre viszik úgy, hogy a csírát teljesen elfedje a spóraszuszpenzió. A műanyag dobozokat fedéllel lefedik, és 4 napig 10 °C-on inkubálják, majd a dobozokat felnyitják, az inokulumot és a vazelingyűrűket eltávolítják, és a dobozokat párásított üvegházba viszik, ahol 15–18 °C-on tartják (16 óra fény);

b) Spiekermann & Kothoff módszere (1924) (9);

c) Potoček et al. módszere (1991) (10);

d) Glynne-Lemmerzahl módszere (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)). Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34–60.

Az Unió számára ismerten releváns összes patotípus (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) and 38(Nevşehir)) meghatározásához a meghatározott növény különböző fajtáival végzett differenciáló fertőzési vizsgálatot kell alkalmazni a táblázatban foglaltaknak megfelelően. A fertőzési vizsgálatot a d) pontban említett protokoll szerint kell elvégezni (Glynne-Lemmerzahl-módszer).

Burgonyafajták szelektív érzékenysége az S. endobioticum patotípusok meghatározásához

Fajta S. endobioticum patotípusok 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S”: Fogékony „R”: Ellenálló *: A fajta kis fokú fogékonyságát jelzi az S. endobioticummal szemben („nem elhalt spóracsoportok jelenléte rák kialakulása nélkül”).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21–29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25–31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165–174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47–57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129–133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422–432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704–708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114–115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191–205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 – 60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288–297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125–135.