A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE

(2008. május 30.)

a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek megállapításáról

(EGT-vonatkozású szöveg)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezéséről szóló, 2006. december 18-i 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletre (1) és különösen annak 13. cikke (3) bekezdésére,

mivel:

ELFOGADTA EZT A RENDELETET:

1. cikk

Az 1907/2006/EK rendelet céljából alkalmazandó vizsgálati módszereket e rendelet melléklete állapítja meg.

2. cikk

A Bizottság szükség esetén felülvizsgálja az e rendeletben foglalt vizsgálati módszereket a gerinces állatokon végzett kísérletek helyettesítése, számának csökkentése és finomítása érdekében.

3. cikk

A 67/548/EGK irányelv V. mellékletére történő hivatkozásokat az e rendeletre való hivatkozásként kell értelmezni.

4. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában történő kihirdetését követő napon lép hatályba.

(1) HL L 396., 2006.12.30., 1. o., helyesbítve: HL L 136., 2007.5.29., 3. o.

(2) HL 196., 1967.8.16., 1. o. A legutóbb a 2006/121/EK európai parlamenti és tanácsi irányelvvel (HL L 396., 2006.12.30., 850. o., helyesbítve: HL L 136., 2007.5.29., 281. o.) módosított irányelv – frissítésre kerül a megfelelő hivatkozásokkal, amint közzéteszik a műszaki fejlődéshez történő 30. hozzáigazításról szóló dokumentumot.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

A nyomásátalakító és a fűtőrendszer felszerelése után, de még a hasadótárcsa behelyezése előtt, a berendezést úgy kell tartani, hogy a gyújtódugó alul legyen. Egy üveg főzőpohárban egy keverőbot segítségével a vizsgálandó folyadékból 2,5 g-ot össze kell keverni 2,5 g száraz cellulózzal (14) . Biztonsági okokból a keverést úgy kell végezni, hogy a vizsgálatot végző személy és a keverék között legyen egy biztonsági védőlemez. Ha a keverék a keverés vagy betöltés során meggyullad, nincs szükség további vizsgálatokra. A keveréket kisebb adagokban és ütögetve a nyomástartó edénybe kell tölteni, vigyázva arra, hogy a keverék a gyújtótekercs körül gyűljön össze, és megfelelően érintkezzen azzal. Fontos, hogy a betöltés során a tekercs ne torzuljon, mivel ez hibás eredményekhez vezethet (15) . Ezt követően be kell tenni a hasadótárcsát a helyére, majd szorosan be kell csavarozni a tartódugót. A megtöltött edényt a hasadótárcsával felfelé a robbantó állványra kell helyezni, amelyet egy megfelelő, fémborítású füstkamrában vagy robbantókamrában kell elhelyezni. Az áramforrást a gyújtódugó külső csatlakozóihoz kell kapcsolni, és 10 A áramot kell rákapcsolni. A keverés megkezdése és az áram bekapcsolása között nem telhet el 10 percnél hosszabb idő.

Meg kell adni a két három párhuzamossal végzett kísérlet vizes extraktumainak egyedi TOC-értékeit és valamennyi kísérlet átlagértékét, tömeg per az oldat térfogata (tipikusan mgC/l) és tömeg per kiindulási mintatömeg (tipikusan mgC/g) egységekben is kifejezve.

Mind a három lombik eredményeit és az átlagértékeket is meg kell adni, és tömeg per az oldat térfogatban (tipikusan mg/l), vagy tömeg per polimerminta-tömegben (tipikusan mg/g) kell kifejezni. Továbbá a minta tömegvesztését (számítása: az oldott anyag tömege osztva a kiindulási minta tömegével) is meg kell adni. Ki kell számolni a relatív standard deviációkat (RSD). Egyedi számokat kell megadni a teljes anyagra (polimer + alapvető adalékok stb.) és csak a polimerre (azaz az ilyen adalékok levonása után).

Rendszerint szükség van egyrészt a szennyező anyagok és az adalékanyagok, másrészt a kis molekulatömegű fajták közti mennyiségi megkülönböztetésre. Gravimetriás meghatározásnál vizsgált anyag használata nélküli vakpróba elvégzése is szükséges, hogy a kísérleti eljárásból származó maradékokkal is el lehessen számolni.

ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel töltött oszlopon való áthaladásakor valósul meg. Kis molekulák be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és elsőként eluálódnak. A közepes méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és később eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidrodinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára.

Amiya S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, pp. 2139–2146.

Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weighs, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Copper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25–52.

ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd. Edn., John Wiley, New York.

ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polistyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel töltött oszlopon való áthaladásakor valósul meg. Kis molekulák be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és elsőként eluálódnak. A közepes méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és később eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidrodinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára.

NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H. Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6–13 and 30–42.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

Szilárd anyagok esetében az egyes vizsgálatok során használandó anyag mennyiségét kétszakaszos száraz futtatási eljárás segítségével határozzák meg. Egy kitáralt csövet, amelynek előzőleg megmérték az önsúlyát, megtöltenek 9 cm3 anyaggal, és az anyagot tömörítik a cső teljes keresztmetszetére ható 80 N erővel. Biztonsági okokból vagy olyan esetekben, ahol összenyomással változtatható a minta fizikai alakja, más töltési eljárások is használhatók; például ha az anyag nagyon érzékeny a súrlódásra, a tömörítés nem megfelelő. Amennyiben az anyag összenyomható, addig folytatják a további anyagbevitelt és tömörítést, amíg a cső felső vége alatt 55 mm-re van feltöltve. Meghatározzák a cső 55 mm-es szintjéig a feltöltéshez használt össztömeget, és hozzáadnak két további adagot, mindkettőt 80 N erővel tömörítve. Ezután szükség szerint, tömörítéssel hozzáadnak vagy kivesznek anyagot úgy, hogy a töltési szint a cső felső végétől 15 mm-re legyen. A második száraz futtatást, az első száraz futtatásban megállapított teljes tömeg egyharmadának tömörített mennyiségével kezdik el. Hozzáadnak két további ilyen adagot 80 N tömörítéssel, és a csőben az anyagszintet a cső felső végétől 15 mm-re állítják be, szükség szerint anyag hozzáadásával vagy elvételével. A második száraz futtatásban meghatározott anyagmennyiséget használják minden egyes vizsgálathoz; a megtöltést három egyenlő mennyiségben hajtják végre, mindegyiket 9 cm3-re sűrítik össze olyan erővel, amely ehhez szükséges. (Ez megkönnyíthető menetes gyűrűk segítségével.)

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendation on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

Adagoló szivattyúk segítségével ismert koncentrációjú, levegőbe kevert gázt visznek be az üveghengerbe. Szikrát vezetnek a keveréken keresztül, és megfigyelik, hogy elválik-e a láng a gyújtóforrástól és terjed-e önállóan. A gázkoncentrációt 1 térfogatszázalékos lépésekben változtatják, amíg be nem következik a gyulladás a fentieknek megfelelően.

NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

ahol fi a különböző molekularész állandói, Fj a korrekciós kifejezések és ai, bj a megfelelő előfordulási gyakoriság. Kísérleti Pow értékekből atomos és csoportfragmentálási értékek jegyzékét és Fj korrekciós kifejezések (úgynevezett „tényezők”) jegyzékét határozták meg a fokozatos megközelítés módszerével. A korrekciós kifejezéseket több különböző osztályba sorolták be (a) (c). Viszonylag bonyolult és időigényes minden szabály és korrekciós kifejezés figyelembevétele. Szoftvercsomagokat fejlesztettek ki (b).

J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.

C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.

NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 971, vol. 71, 525.

O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band 1/1, 223–339.

J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.

W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12,219. (1981).

Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – A Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, Kalifornia, 91711. címről szerezhető be.

C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

A t0 holtidő valamely homológ sor (például n-alkil-metil-ketonok) vagy kromatográffal nem késleltetett szerves vegyületek (például tiokarbamid vagy formamid) segítségével határozható meg. A t0 holtidőnek homológ sor segítségével végrehajtott számításához valamely homológ sornak legalább hét tagját fecskendezik be, és meghatározzák a megfelelő holtidőt. Felrajzolják a tr (n c + 1) alapretenciós időt a tr(n c) függvényében, és meghatározzák a következő regressziós egyenletet:

NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I, chapter XIV.

Lásd az ISO 304 és NF T 73-060 szabványokat (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Lásd az ISO 304 és NF T 73-060 szabványokat (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

Lásd az ISO 304 és NF T 73-060 szabványokat (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).

ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 10 Pa – Static method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I.

A manométerhez higany használható a normál légnyomástól 102 Pa-ig terjedő mérési tartományban, míg szilikonfolyadék és ftalát a 102 Pa-tól lefelé a 10 Pa-ig terjedő tartományban. Fűthető membrán manométerek 10-1 Pa alatt is használhatók. Léteznek más nyomásmérők is, amelyek 10 Pa alatt használhatók.

A készülék a minta hőmérsékletének szabályozására és a hőmérséklet mérésére egy mintatároló tartályból, valamint egy fűtő- és hűtőrendszerből áll. A készülék a nyomás beállítására és mérésére szolgáló eszközt is tartalmaz. A működési alapelveket a 2a. és 2b. ábra mutatja be.

Determination of the density of soils

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pycnometric method

Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pycnometric method

Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method

Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)

Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer

Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)

Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)

Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)

Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)

Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 x 10–6 m2 s–1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)

Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)

Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100 x l0–6 m2 s–1 at 15 oC)

Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)

Liquid chemical products; determination of density at 20 oC

Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

Testing of mineral oils and related materials; determination of density

Testing of plastics and elastomers; determination of density

Specific gravity and density of plastics by displacement

Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method

Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics

Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method

Part III: Use and test

Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.

R. Weissberger ed, Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part 1.

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of distillation characteristics

Method for determination of distillation of petroleum products

Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, part I, Chapter VIII.

A mintacsőbe egy, az alsó vége fölött körülbelül 1 cm-rel leforrasztott kapilláris csövet helyeznek be (forrási kapilláris). A vizsgált anyagot addig töltik be, hogy a kapilláris leforrasztott szakasza a folyadék felszíne alatt legyen. A forrási kapillárist tartalmazó mintacsövet a hőmérőhöz rögzítik egy gumiszalaggal, vagy oldalról egy tartóval rögzítik (lásd a 2. ábrát):

Standard test method for pour point of petroleum oils

Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis

Method for the determination of the freezing point

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)

Method for the determination of crystallizing point

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

Testing methods for melting point of chemical products

Method for the determination of melting point and/or melting range

Standard test method for relatíve initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I, chapter VII.

B. RÉSZ: MÓDSZEREK A TOXICITÁS ÉS EGYÉB EGÉSZSÉGÜGYI HATÁSOK MEGHATÁROZÁSÁRA

TARTALOMJEGYZÉK

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS

B.1a. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – RÖGZÍTETT DÓZISÚ ELJÁRÁS

B.1b. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY MÓDSZER

B.2. AKUT TOXICITÁS (INHALÁCIÓ)

B.3. AKUT TOXICITÁS (DERMÁLIS)

B.4. AKUT TOXICITÁS: BŐRIRRITÁCIÓ/BŐRKORRÓZIÓS HATÁS

B.5. AKUT TOXICITÁS: SZEMIRRITÁCIÓ/SZEMKORRÓZIÓS HATÁS

B.6. A BŐR ÉRZÉKENNYÉ TÉTELE

B.7. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ (28 NAPOS) TOXICITÁSVIZSGÁLAT (ORÁLIS)

B.8. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ (28 NAPOS) TOXICITÁS (INHALÁCIÓ)

B.9. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ (28 NAPOS) TOXICITÁS (DERMÁLIS)

B.10. MUTAGENITÁS – KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK IN VITRO VIZSGÁLATA EMLŐSÖKÖN

B.11. MUTAGENITÁS – KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK IN VIVO VIZSGÁLATA EMLŐSÖKÖN

B.12. MUTAGENITÁS – IN VIVO EMLŐS ERITROCITA MIKRONUKLEUSZ VIZSGÁLAT

B.13/14. MUTAGENITÁS: REVERZ MUTAGENITÁSI VIZSGÁLAT BAKTÉRIUMOKKAL

B.15. MUTAGENITÁSVIZSGÁLAT ÉS A RÁKKELTŐ HATÁS SZŰRÉSE GÉNMUTÁCIÓ VIZSGÁLATA SACCHAROMYCES CEREVISIAE -BEN

B.16. MITOTIKUS REKOMBINÁCIÓ-VIZSGÁLAT SACHAROMYCES CEREVISIAE - BEN

B.17. MUTAGENITÁS – IN VITRO GÉNMUTÁCIÓ VIZSGÁLAT EMLŐSSEJTEKEN

B.18. DNS-KÁROSODÁS ÉS -REPARÁCIÓ – NEM TERVEZETT DNS-SZINTÉZIS (UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS, UDS) – EMLŐSSEJTEK IN VITRO

B.19. IN VITRO EMLŐSSEJTTESTVÉR-KROMATIDKICSERÉLŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE, SCE) VIZSGÁLAT

B.20. NEMHEZ KÖTÖTT RECESSZÍV LETÁLIS VIZSGÁLAT DROSOPHILA MELANOGASTERBEN

B.21. IN VITRO EMLŐSSEJT-TRANSZFORMÁCIÓS VIZSGÁLATOK

B.22. DOMINÁNS LETÁLIS VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON

B.23. EMLŐS SPERMIOGONIÁLIS KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉG VIZSGÁLAT

B.24. EGÉRFOLT- (SPOT) TESZT

B.25. EGÉREN VÉGZETT ÖRÖKLETES TRANSZLOKÁCIÓS VIZSGÁLAT

B.26. SZUBKRÓNIKUS ORÁLIS TOXICITÁSI VIZSGÁLAT, RÁGCSÁLÓKON VÉGZETT 90 NAPOS, ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ ORÁLISTOXICITÁS-VIZSGÁLAT

B.27. SZUBKRÓNIKUSORÁLIS-TOXICITÁSI VIZSGÁLAT, 90 NAPOS, ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ ORÁLISTOXICITÁSI VIZSGÁLAT NEM RÁGCSÁLÓKON

B.28. SZUBKRÓNIKUS DERMÁLIS TOXICITÁSVIZSGÁLAT 90 NAPOS, ISMÉTELT DERMÁLIS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓFAJOKON

B.29. SZUBKRÓNIKUS INHALÁCIÓS TOXICITÁSVIZSGÁLAT 90 NAPOS, ISMÉTELT INHALÁCIÓS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓFAJOKON

B.30. KRÓNIKUS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

B.31. PRENATÁLIS FEJLŐDÉSI TOXICITÁSVIZSGÁLAT

B.32. A RÁKKELTŐ HATÁS VIZSGÁLATA

B.33. A KRÓNIKUS TOXICITÁS ÉS A RÁKKELTŐ HATÁS EGYÜTTES VIZSGÁLATA

B.34. EGYGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

B.35. KÉTGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

B.36. TOXIKOKINETIKAI VIZSGÁLAT

B.37. SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT AKUT KÉSLELTETETT NEUROTOXICITÁS

B.38. SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT KÉSLELTETETT NEUROTOXOCITÁS-VIZSGÁLAT, 28 NAPOS ISMÉTELT ADAGOLÁS ESETÉN

B.39. NEM ÜTEMEZETT DNS-SZINTÉZIS (UDS) IN VIVO VIZSGÁLAT EMLŐS MÁJSEJTEKKEL

B.40. IN VITRO BŐRKORRÓZIÓ: TRANSZKUTÁN ELEKTROMOS REZISZTENCIA VIZSGÁLAT (TER)

B.40 A. IN VITRO BŐRKORRÓZIÓ: EMBERI BŐRMODELLEN VÉGZETT VIZSGÁLAT

B.41. IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOXICITÁS-VIZSGÁLAT

B.42. BŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZSGÁLATI MÓDSZER

B.43. NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKBAN

B.44. BŐRÖN ÁT TÖRTÉNŐ FELSZÍVÓDÁS: IN VIVO MÓDSZER

B.45. BŐRÖN ÁT TÖRTÉNŐ FELSZÍVÓDÁS: IN VITRO MÓDSZER

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS

A. A VIZSGÁLT ANYAG JELLEMZÉSE

A vizsgált anyag összetételét – beleértve a főbb szennyező anyagokat és a lényeges fizikaikémiai tulajdonságait, ill. az anyag stabilitását – a toxicitás-vizsgálat megkezdése előtt ismerni kell.

A vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságai döntő fontosságúak az adagolási mód kiválasztásánál, az egyes vizsgálatok megtervezésénél, a vizsgált anyag kezelésénél és tárolásánál.

A vizsgált anyagnak (amennyiben lehetséges, a legfontosabb szennyezésekkel együtt) az adagolási közegben és a biológiai anyagban történő mennyiségi és minőségi vizsgálatára vonatkozó analitikai módszer kifejlesztése megelőzi a vizsgálatok megkezdését.

Az azonosításra, a fizikai-kémiai tulajdonságok meghatározására, a tisztaságra és a vizsgált anyag viselkedésére vonatkozó összes információnak szerepelnie kell a vizsgálati jelentésben.

B. AZ ÁLLATOK GONDOZÁSA

A környezeti feltételek szigorú szabályozása és az állatoknak a fajnak megfelelő gondozása nagyon lényeges a toxicitásvizsgálatoknál.

i. Tartási körülmények

A kísérleti állatok elhelyezésének környezeti körülményit az adott faj igényeihez kell igazítani. Patkányok, egerek és tengerimalacok számára a megfelelő körülmények: 22 ± 3 oC szobahőmérséklet, 30–70 százalékos relatív páratartalom mellett; míg nyulak számára a megfelelő körülmények: 20 ± 3 oC hőmérséklet, 30–70 százalékos relatív páratartalom.

Néhány kísérleti eljárás különösen érzékeny a hőmérsékleti hatásokra, ezekben az esetekben a megfelelő környezeti körülményekre vonatkazó részleteket a vizsgálati módszer leírása tartalmazza. A toxikus hatások kutatása során, a hőmérsékletet és a páratartalmat minden esetben figyelni és rögzíteni kell és meg kell adni a vizsgálati jelentésben.

A világítás mesterséges, a világos és sötét szakaszok 12 óránként váltják egymást. A világításra vonatkozó adatokat feljegyzik és megadják a vizsgálati jelentésben.

Hacsak a módszer leírásában más nem szerepel, az állatok egyenként tartandók, vagy kis, azonos nemű egyedekből álló csoportokban összezárhatók; csoportos tartás esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható.

Az állatkísérletekről szóló jelentésében fontos megadni az állatok ketrecének típusát és az egyes ketrecekben tartott állatok számát, a vegyszer hatásának kitett időszak és az azt követő megfigyelés alatt egyaránt.

ii. Etetési körülmények

Az alkalmazott tápláléknak meg kell felelnie a vizsgált fajnak megfelelő, a táplálkozástudomány által meghatározott követelményeknek. Amikor a vizsgált anyagokat az állatok táplálékában adják be, akkor a tápértéket az anyag és a táplálék összetevőinek kölcsönhatása csökkentheti. Egy ilyen kölcsönhatás lehetőségét figyelembe kell venni a vizsgálat eredményeinek értelmezése során. Hagyományos laboratóriumi táplálás alkalmazható korlátozás nélküli ivóvízellátással. A táplálék típusának kiválasztását befolyásolhatja, hogy a tápláléknak és a vizsgált anyagnak a megfelelő keverékét kell biztosítani, ha ilyen módon adagolják a vizsgált anyagot.

A táplálék olyan szennyezései, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a toxicitást, nem lehetnek jelen zavaró nagyságú koncentrációban.

C. ALTERNATÍV VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Az Európai Unió elkötelezett olyan alternatív módszerek kifejlesztése és jóváhagyása támogatására, amelyek az ismereteket ugyanolyan szinten biztosítják, mint a jelenlegi állatkísérletek, azonban kevesebb állatot használnak fel, kevesebb szenvedést okoznak az állatoknak vagy teljesen kiküszöbölik az állatok alkalmazását.

Ilyen módszerek alkalmazását (amint elérhetővé válnak), ahol csak lehet, meg kell fontolni, a veszély jellemzésével, az azt követő osztályozással, címkézéssel és az anyag belső tulajdonságaiból adódó veszély jelölésével kapcsolatos eljárásokban.

D. KIÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS

A vizsgálatok kiértékelésekor és értelmezésekor figyelembe kell venni azt, hogy az állati és az in vitro vizsgálatok eredményét milyen mértékben lehet közvetlenül kiterjeszteni az emberre, és ezért az emberre káros hatás bizonyítékait, ahol rendelkezésre állnak, fel lehet használni a vizsgálati eredmények megerősítésére.

E. SZAKIRODALOM

Ezeknek a módszereknek a többségét a Vizsgálati irányelvek elnevezésű OECD-program keretében fejlesztették ki, és azokat a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat alapelveivel összhangban kell alkalmazni, az „adatok kölcsönös elfogadásának” széles körű biztosítása érdekében.

További tájékoztatás található az OECD-irányelvekben megadott szakirodalom jegyzékekben, illetve az egyéb helyeken kiadott vonatkozó irodalomban.

B.1a. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – RÖGZÍTETT DÓZISÚ ELJÁRÁS

1. MÓDSZER

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD TG 420 (2001) módszerrel.

1.1. BEVEZETÉS

Az akut toxicitás megállapítására szolgáló hagyományos módszerek esetében a vizsgálat végpontját az állatok elpusztulása jelenti. A Brit Toxikológiai Társaság 1984-ben új megközelítést javasolt az akut toxicitás vizsgálatára, amely egy sor rögzített nagyságú dózis beadásán alapul (1). Ennél a megközelítésnél nem az állatok elpusztulása jelenti a vizsgálat végpontját, hanem a rögzített nagyságú dózisok valamelyikénél megfigyelt egyértelmű mérgezési tünetekre támaszkodtak. Az Egyesült Királyságban (2) és nemzetközileg (3) végzett in vivo validálási vizsgálatok után az eljárást 1992-ben hagyták jóvá mint vizsgálati módszert. Ezt követően egy vizsgálati sorozat (4)(5)(6) keretében matematikai modellek segítségével megvizsgálták a rögzített dózisú eljárás statisztikai tulajdonságait. Az in vivo és a modellvizsgálatok együttesen igazolták, hogy az eljárás reprodukálható, kevesebb kísérleti állatra van szükség hozzá, és kevesebb szenvedést okoz, mint a hagyományos módszerek, továbbá hasonló módon képes minősíteni az anyagokat, mint az egyéb akut toxicitási vizsgálati módszerek.

Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelelőbb vizsgálati módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (7) található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz az 1Ba. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezésével kapcsolatosan.

A módszer egyik alapelve, hogy a fő vizsgálatban csak közepesen toxikus dózisokat alkalmaznak, és hogy kerülni kell az olyan dózisok alkalmazását, amelyek várhatóan letálisak. Nincs szükség továbbá olyan dózisok alkalmazására sem, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullás közelében lévő állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni őket a vizsgálati eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (8) találhatók.

A módszer adatokat szolgáltat az anyag veszélyes tulajdonságairól és lehetővé teszi, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok besorolására szolgáló Globálisan harmonizált rendszer (Globally Harmonised System, GHS) szerint minősítsék és sorolják be (9).

A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei; szerkezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai és az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyőződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elősegíti majd a megfelelő kezdődózis kiválasztását.

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Akut orális toxicitás: a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán belül többszöri dózisának szájon át történő beadását követően jelentkező káros hatások.

Késleltetett elhullás: egy állat 48 órán belül nem hull el, illetve nem tűnik elhullásközeli állapotban lévőnek, de később, a 14 napos megfigyelési időszak során elpusztul.

Dózis: a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében (pl. mg/kg) fejezik ki.

Nyilvánvaló toxicitás: a vizsgálandó anyag beadását követően jól látható mérgezési tüneteket leíró általános kifejezés (a példákat lásd a (3) hivatkozásban), amelynél a következő legmagasabb rögzített dózis esetében a legtöbb állatnál súlyos fájdalom vagy súlyos szorongás tartós jelei, elhullásközeli állapot (az ezzel kapcsolatos kritériumok a Humane Endpoints Guidance Documentben (8) szerepelnek), vagy valószínű elhullás várható.

GHS: Globálisan harmonizált osztályozási rendszer vegyi anyagokhoz és keverékekhez. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakértői Bizottsága (fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek közötti program a vegyi anyagok helyes kezelésére (Interorganisation Programme of the Sound Management of Chemicals, IOMC) koordinál.

Közeli elhullás: amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés időpontja előtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekvőhelyzet és a remegés. (A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)).

LD50: (közepes letális dózis): a vizsgálandó anyag statisztikailag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD50-értéket a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.

Határdózis: egy, a vizsgálhatóság felső határánál lévő dózis (2 000 vagy 5 000 mg/kg).

Elhullásközeli állapot: az esetleges kezelés ellenére is az elhullás közelében lévő állapot vagy túlélésre való képtelenség. (A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)).

Megjósolható elhullás: a kísérlet tervezett vége előtt, a jövőben egy ismert időpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. (A további részleteket lásd Humane Endpoints Guidance Documentben (8)).

1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Azonos ivarba tartozó állatok csoportjainak egy lépcsőzetes eljárás során 5, 50, 300 és 2 000 mg/kg-os rögzített dózisok alkalmazásával kell beadni a vizsgálandó anyagot (kivételes esetben egy további, 5 000 mg/kg-os rögzített dózis is alkalmazható; lásd az 1.6.2. szakaszt). A kiindulási dózist a dózisbehatároló vizsgálat alapján kell megválasztani úgy, hogy az várhatóan mérgezési tüneteket eredményezzen, de ne okozzon súlyos mérgezést vagy elhullást. A fájdalomhoz, szenvedéshez és közeli elhulláshoz társuló klinikai tüneteket és állapotot részletesen egy külön OECD Útmutató (8) ismerteti. A mérgezési tünetek megjelenésétől vagy az elhullás bekövetkeztétől vagy ezek elmaradásától függően további állatcsoportok is kezelhetők magasabb vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az eljárást folytatni kell, amíg meg nem találják azt a dózist, amely nyilvánvaló toxicitást vagy legfeljebb egy elhullást okoz, vagy ha a legmagasabb dózisnál nem figyelnek meg semmilyen hatást, vagy ha a legalacsonyabb dózisnál elhullanak állatok.

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE

1.4.1. Az állatfaj kiválasztása

A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általában nőstényeket használnak (7). Ennek az az oka, hogy a hagyományos LD50-vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekintése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhető különbség, a nőstények általában valamivel érzékenyebbek (10). Azonban ha a szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzékenysége valószínűsíthető, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfelelően meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik.

Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ± 20 %-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától.

1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei

A kísérleti állatokat 22 oC (± 3 oC) hőmérsékletű helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az egy ketrecben lévő állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az ne zavarja az egyes állatok megfigyelését.

1.4.3. Az állatok előkészítése

Az állatokat véletlenszerűen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani őket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez.

1.4.4. A dózisok előkészítése

A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Azonban ha folyékony végterméket vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követő kockázatértékelés szempontjából megfelelőbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítatlanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes szabályozó hatóságok ezt írják elő. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretétől függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömegarány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázásakor – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmadsorban esetlegesen más vivőanyagokban elkészített oldatok. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás előtt rövid idővel kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabilitása az alkalmazás időtartama alatt.

1.5. ELJÁRÁS

1.5.1. A dózisok beadása

A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy megfelelő intubációs kanülön át történő táplálással kell beadni. Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkalmazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó időtartam alatt kisebb részletekben is beadható.

A kezelés előtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A koplaltatási időszakot követően meg kell mérni az állatok testtömegét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni -patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás időtartamától függően menet közben szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak.

1.5.2. Dózisbehatároló vizsgálat

A dózisbehatároló vizsgálat célja, hogy ki lehessen választani a megfelelő kezdődózist a fő vizsgálathoz. A vizsgálandó anyagot az 1. függelékben bemutatott folyamatábra szerint egymás után kell beadni egy-egy állatnak. A dózisbehatároló vizsgálat akkor fejeződik be, amikor meghozható a döntés a fő vizsgálatban alkalmazandó kezdődózisról (vagy ha a legalacsonyabb rögzített dózisnál elhullás történik).

A dózisbehatároló vizsgálatban a kezdődózist a következő rögzített dózisok közül választják ki: 5, 50, 300 és 2 000 mg/kg aszerint, hogy a lehetőleg ugyanezzel az anyaggal vagy szerkezetileg rokon anyagokkal kapott in vivo vagy in vitro adatok alapján várhatóan melyik eredményez nyilvánvaló toxicitást. Ilyen információk hiányában a kezdődózist 300 mg/kg-ban kell megállapítani.

Az egyes állatok kezelése között legalább 24 órának el kell telnie. Minden állatot legalább 14 napig megfigyelés alatt kell tartani.

Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét jogszabályi követelmény indokolja, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 5 000 mg/kg-os felső rögzített dózis alkalmazását (lásd a 3. függeléket). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2 000–5 000 mg/kg tartomány) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószínűsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelenőséggel bírnak az emberi vagy állati egészség, illetve a környezet védelme szempontjából.

Olyan esetekben, amikor a dózisbehatároló vizsgálatban a legalacsonyabb rögzített dózissal (5 mg/kg) kezelt állat elhullik, az általános eljárás szerint be kell fejezni a vizsgálatot és az anyagot a GHS 1. kategóriába kell besorolni (ahogyan az az 1. függelékben látható). Ha azonban szükség van a besorolás további megerősítésére, az alábbiak szerinti opcionális kiegészítő eljárás alkalmazható. Egy második állatnak is beadjuk az 5 mg/kg-os dózist. Ha ez is elhullik, akkor az megerősíti a GHS 1. kategóriába való besorolást, és a vizsgálatot azonnal be kell fejezni. Ha a második állat életben marad, akkor legfeljebb három további állaton kell elvégezni az 5 mg/kg-os dózissal történő vizsgálatot. Mivel nagy az elhullás kockázata, az állatok kímélete érdekében egymás után kell őket kezelni. Az egyes állatok kezelése között eltelt időt úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen annak megállapítására, hogy az előzőleg kezelt állat valószínűleg életben marad. Ha egy második állat is elhullik, azonnal be kell fejezni a kezeléseket, és több állatnak már nem szabad beadni az anyagot. Mivel a második elhullás bekövetkezte miatt (függetlenül attól, hogy a vizsgálatok befejezéséig hány állatot kezeltek) az „A” eredményhez jutnak (legalább 2 elhulláseset), a 2. függelék 5 mg/kg-os rögzített dózisánál érvényes besorolási szabályt kell követni (ha legalább 2 elhullás történt, akkor 1. kategória, ha legfeljebb 1 elhullás történt, akkor 2. kategória). A 4. függelékben pedig azzal kapcsolatos útmutatást tartalmaz, hogy az új GHS bevezetéséig az anyagokat hogyan kell az EU-rendszer szerinti kategóriákba besorolni.

1.5.3. Fő vizsgálat

1.5.3.1. Az állatok száma és a dózisok

A kezdődózissal történő vizsgálat utáni teendőket a 2. függelékben található folyamatábra mutatja. Három lehetséges alternatíva létezik: vagy le kell állítani a vizsgálatot, és be kell sorolni az anyagot a megfelelő veszélyességi kategóriába, vagy magasabb rögzített dózissal kell folytatni a vizsgálatot, vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az állatok védelme érdekében azonban a fő vizsgálatban már nem szabad olyan dózissal kísérletezni, amely a dózisbehatároló vizsgálatban elhullást okozott (lásd a 2. függeléket). A tapasztalatok azt mutatják, hogy a kezdődózissal végzett vizsgálatok legvalószínűbb eredménye, hogy az anyagot be lehet valamilyen kategóriába sorolni és nincs szükség további vizsgálatokra.

Általában összesen öt-öt, azonos ivarú állatnak kell beadni az egyes vizsgált dózisokat. Ebből az öt állatból egyet a dózisbehatároló vizsgálat során kezelnek az adott dózissal, és ehhez járul a további négy állat (kivéve abban a szokatlan esetben, ha a fő vizsgálatban használt dózist nem alkalmazták a dózisbehatároló vizsgálatban).

Az egyes dózisok vizsgálata közötti időtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének időpontja, időtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következő dózissal történő kezelését nem szabad megkezdeni mindaddig, amíg meg nem bizonyosodtak arról, hogy az előzőleg kezelt állatok életben maradnak. Szükség esetén ajánlott ez egyes dózisokkal való kezelések között 3 vagy 4 napos szünetet tartani, hogy meg lehessen figyelni a késleltetett toxicitást. Ennek időtartama szükség esetén – pl. nem meggyőző válasz esetében –módosítható.

Ha egy felső, 5 000 mg/kg-os dózis alkalmazást is tervbe vesznek, a 3. függelékben vázolt eljárást kell követni (lásd még az 1.6.2. szakaszt).

1.5.3.2. Határérték-vizsgálat

Határérték-vizsgálatot elsősorban olyan helyzetekben kell végezni, ha a kísérletet végzőnek olyan információi vannak, amelyek szerint a vizsgálandó anyag valószínűleg nem toxikus, azaz csak a hatósági határértékdózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhető információ, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a fő vizsgálatot kell elvégezni.

Ezen iránymutatás céljára határérték-vizsgálatként a normál eljárás alkalmazásával történő, 2 000 mg/kg-os (vagy kivételes esetben 5 000 mg/kg-os) kezdődózissal végzett dózisbehatároló vizsgálat, majd ezt követően további négy állat ugyanezzel a dózissal történő kezelése szolgál.

1.6. MEGFIGYELÉSEK

Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, legalább az első 30 percben, azután az első 24 órában rendszeres időközönként, amelynek során különös figyelemmel kell őket kísérni az első 4 órában, majd ezt követően naponta, összesen 14 napon át, kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálatból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés időtartamát azonban nem szabad mereven meghatározni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és időtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megszűnésének időpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek inkább késleltetve jelentkeznek (11). Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort vesznek fel.

Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szükség. Meg kell figyelni a bőr és a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma előfordulására is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alapelveket és követelményeket is figyelembe kell venni (8). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lévő állatokat, illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját is.

1.6.1. Testtömeg

Röviddel a vizsgálandó anyag beadása előtt és legalább egy héttel utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtömeg-változást ki kell számítani és fel kell jegyezni. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus módon exterminálni kell őket.

1.6.2. Kórbonctani vizsgálat

Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni (azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden állat esetében az összes makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegyezni. A kezdődózis beadása után legalább 24 óráig túlélő állatok esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos információk nyerhetők.

2. ADATOK

Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy minden vizsgálati csoportra vonatkozóan mutassa a csoportban lévő kísérleti állatok számát, valamint azoknak a számát, amelyeknél mérgezési tünetek láthatók, amelyek a vizsgálat során elhullottak vagy humánus módon exterminálásra kerültek, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.

3. JELENTÉS

3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS

A vizsgálati jelentésnek megfelelő módon a következő információkat kell tartalmaznia:

Vizsgálandó anyag: — fizikai megjelenés, tisztaság és ha releváns, a fizikai-kémiai tulajdonságok (ezen belül az izomerizáció is), — azonosító adatok, ezen belül a CAS-szám.

Vivőanyag (szükség esetén): — ha a vivőanyag nem víz, akkor ennek indoklása.

Kísérleti állatok: — az alkalmazott faj/törzs, — az állatok mikrobiológiai státusza, feltéve, hogy ismert, — az állatok száma, életkora és ivara (ezen belül adott esetben annak oka, hogy nőstények helyett miért hímeket alkalmaztak), — az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.

Kísérleti körülmények: — a vizsgálandó anyag formulázására vonatkozó információk, ezen belül a beadott anyag fizikai formájával kapcsolatos adatok, — a vizsgálandó anyag beadására vonatkozó információk, ezen belül a beadott térfogat és a beadás időpontja, — a táplálék és a víz minősége (ezen belül a takarmány típusa/forrása, a víz forrása), — a kezdődózis kiválasztásának indoklása.

Eredmények: — a válaszadatok és a dózisok táblázatos formában történő megadása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és elhullt állatokra; a hatások jellege, súlyossága és időtartama), — a testtömegadatok és a testtömegváltozások táblázatos formában történő megadása, — az egyes állatok testtömege a dózis beadásának napján, azt követően hetente, valamint az elhullás vagy exterminálás időpontjában, — a tervezett exterminálás előtti elhullás napja és ideje, — a mérgezési tünetek megjelenése és időbeli lefolyása, valamint esetleges visszafordíthatósága minden egyes állatra vonatkozóan, — a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.

Az eredmények diszkussziója és értelmezése.

Következtetések.

4. HIVATKOZÁSOK

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I. Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33,223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

1. FÜGGELÉK A DÓZISBEHATÁROLÓ VIZSGÁLAT FOLYAMATÁBRÁJA

2. FÜGGELÉK: A FŐ VIZSGÁLAT FOLYAMATÁBRÁJA

3. FÜGGELÉK A VÁRHATÓAN 2 000 MG/KG FELETTI LD50-ÉRTÉKKEL RENDELKEZŐ VIZSGÁLANDÓ ANYAGOK VIZSGÁLATOK NÉLKÜLI OSZTÁLYOZÁSÁNAK KRITÉRIUMAI Az 5. veszélyességi kategória kritériumait úgy állapították meg, hogy lehetővé tegyék azoknak a vizsgálandó anyagoknak a meghatározását, amelyek akut toxicitási kockázata viszonylag alacsony, de bizonyos körülmények között veszélyt jelenthetnek az érzékeny populációkra. Az ilyen anyagok orális vagy dermális LD50-értéke várhatóan 2 000 és 5 000 mg/kg közötti tartományban van, vagy ezzel egyenértékű dózisoknak megfelelő az egyéb beadási módok esetében. A vizsgálandó anyagokat az alábbi esetekben lehet a 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg veszélyességi kategóriába (GHS 5. kategória) sorolni: a) ha a 2. függelékben bemutatott, az elhullási gyakoriságon alapuló vizsgálati sémák bármelyike szerint ebbe a kategóriába kell sorolni; b) ha hitelt érdemlő bizonyíték van már arra, hogy az anyag LD50-értéke az 5. kategóriában megadott tartományba esik; vagy más állatkísérletek vagy humán toxikus hatások akut jellegű humán egészségügyi veszélyt jeleznek; c) adatok extrapolálásával, becslésével vagy mérésével, ha egy veszélyesebb osztályba való besorolás nem indokolt, és — hitelt érdemlő információk állnak rendelkezésre, amelyek emberben jelentős toxikus hatásokra utalnak, vagy — a legfeljebb a 4. kategóriának megfelelő értékekkel elvégzett, orális beadási móddal történő vizsgálatok során elhullás történt, vagy — ha legfeljebb a 4. kategóriának megfelelő értékekkel elvégzett vizsgálat alapján a szakértők véleménye megerősíti a toxicitás szignifikáns klinikai tüneteit, kivéve a hasmenést, szőrmeredezést vagy gondozatlan megjelenést, vagy — ha a szakértők véleménye megerősíti azokat a hitelt érdemlő információkat, amelyek más állatkísérletekben tapasztalt szignifikáns akut hatásokat valószínűsítenek. 2 000 MG/KG FELETTI DÓZISOKKAL TÖRTÉNŐ VIZSGÁLAT Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha ezt konkrét jogszabályi követelmény indokolja, tervbe lehet venni egy további felső, 5 000 mg/kg-os rögzített dózis alkalmazást. Az állatok jólétének védelme iránti igényt elismerve nem ajánlott az 5 000 mg/kg-os dózis alkalmazása, és csak akkor szabad fontolóra venni, ha nagy a valószínűsége, hogy az ilyen vizsgálatok eredményei közvetlen jelentőséggel bírnak az állati vagy emberi egészség védelme szempontjából (9). Dózisbehatároló vizsgálat Az 1. függelékben bemutatott lépcsőzetes eljárás során irányadó döntési szabályokat ki lehet terjeszteni úgy, hogy 5 000 mg/kg-os dózisszintet is lehessen alkalmazni. Ha tehát a dózisbehatároló vizsgálathoz 5 000 mg/kg-os kezdődózist alkalmaznak, az „A” eredmény (elhullás) esetén egy második állatnak 2 000 mg/kg-os dózist kell beadni. „B” vagy „C” eredmény esetén (nyilvánvaló toxicitás vagy nincs toxicitás) a fő vizsgálatban 5 000 mg/kg-os kezdődózis is alkalmazható. Hasonló módon, ha az 5 000 mg/kg-os dózistól eltérő kezdődózist alkalmaznak, a 2 000 mg/kg-os dózis alkalmazásakor kapott „B” vagy „C” eredmény esetén a vizsgálatot 5 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni. Ha ezt követően az „A” eredményhez jutnak, a fő vizsgálatban 2 000 mg/kg-os kezdődózist kell alkalmazni, „B” vagy „C” eredmény esetén pedig 5 000 mg/kg-os kezdődózist. Fő vizsgálat A 2. függelékben bemutatott lépcsőzetes eljárás során irányadó döntési szabályokat ki lehet terjeszteni úgy, hogy 5 000 mg/kg-os dózisszintet is lehessen alkalmazni. Ha tehát a fő vizsgálathoz 5 000 mg/kg-os kezdődózist alkalmaznak, az „A” eredmény (> 2 elhullás) esetén egy második csoportnak 2 000 mg/kg-os dózist kell beadni. „B” eredmény (nyilvánvaló toxicitás és/vagy < 1 elhullás) vagy „C” eredmény (nincs toxicitás) esetén az anyagot a GHS rendszer szerint be nem soroltnak kell tekinteni. Hasonló módon, ha az 5 000 mg/kg-os dózistól eltérő kezdődózist alkalmaznak, a 2 000 mg/kg-os dózis alkalmazásakor kapott „C” eredmény esetén a vizsgálatot 5 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni. Ha ezt követően az „A” eredményhez jutnak, az anyagot a GHS 5. kategóriába kell sorolni, „B” vagy „C” eredmény esetén pedig be nem soroltnak kell tekinteni.

4. FÜGGELÉK B.la. VIZSGÁLATI MÓDSZER Útmutató az EU-rendszer szerinti besoroláshoz a Globálisan harmonizált osztályozási rendszer (GHS) teljes körű bevezetéséig tartó átmeneti időszakban (a (8) hivatkozásból)

B.1b. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY MÓDSZER

1. MÓDSZER

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD TG 423 (2001) módszerrel.

1.1. BEVEZETÉS

Az itt ismertetett akut toxikus osztály módszer (1) egy lépcsőzetes eljárás, amelyben lépésenként három azonos ivarú állatot használnak. Az elhullási aránytól és/vagy az állatok elhullásközeli állapotától függően átlagosan 2–4 lépésre lehet szükség a vizsgálandó anyag akut toxicitásának megítéléséhez. Az eljárás reprodukálható, nagyon kevés állatot kell használni hozzá, és hasonló módon lehet vele minősíteni az anyagokat, mint a többi akut toxicitás vizsgálati módszerrel. Az akut toxikus osztály módszer rögzített dózisokkal végzett biometriai vizsgálatokon (2)(3)(4)(5) alapul, amelyek megfelelően el vannak választva egymástól, hogy lehetővé tegyék az anyag besorolási és veszélyfelmérési célokra történő minősítését. Az 1996-ban jóváhagyott módszert széles körben validálták a szakirodalomból vett in vivo LD50-adatokkal szemben mind nemzeti (6), mind pedig nemzetközi (7) szinten.

Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelelőbb vizsgálati módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (8) található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz a B.1c. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezésével kapcsolatosan.

Nincs szükség a vizsgálandó anyagok olyan dózisokban történő alkalmazására, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullásközeli állapotban lévő állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni őket az eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (9) találhatók.

A módszer előre meghatározott dózisok alkalmazásán alapul, és a kapott eredmények lehetővé teszik, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok besorolására szolgáló Globálisan harmonizált rendszer (GHS) szerint minősítsük és soroljuk be (10).

A módszer elvben nem alkalmas az LD50 pontos kiszámítására, de lehetővé teszi azoknak az expozíciós tartományoknak a meghatározását, amelyeknél letalitás várható, mivel a fő végpont ebben a vizsgálatban is az állatok egy részének elhullása. Ez a módszer csak akkor teszi lehetővé az LD50-érték meghatározását, ha legalább két dózis 0 %-nál magasabb, de 100 %-nál alacsonyabb elhullási arányt eredményez. A vizsgálandó anyagtól függetlenül az előre meghatározott dózisok alkalmazása és a kifejezetten a különféle állapotokban megfigyelt állatok számához kötődő besorolás növeli a laboratóriumok által készített jelentések egységességét és a vizsgálatok ismételhetőségét.

A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei; szerkezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai; valamint az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyőződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elősegíti majd a legmegfelelőbb kezdődózis kiválasztását.

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Akut orális toxicitás: a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán belül többszöri dózisának szájon át történő beadását követően jelentkező káros hatások.

Késleltetett elhullás: egy állat 48 órán belül nem hull el vagy nem tűnik elhullásközeli állapotban lévőnek, de később, a 14 napos megfigyelési időszak során elpusztul.

Dózis: a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.

GHS: Globálisan harmonizált osztályozási rendszer vegyi anyagokhoz és keverékekhez. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakértői Bizottsága (fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek Közötti Program a Vegyi Anyagok Helyes Kezelésére (IOMC) koordinál.

Közeli elhullás: amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés időpontja előtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekvőhelyzet és a remegés. (A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)).

LD 50 (közepes letális orális dózis): a vizsgálandó anyag statisztikailag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD50-értéket a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.

Határdózis: egy, a vizsgálhatóság felső határánál lévő dózis (2 000 vagy 5 000 mg/kg).

Elhullásközeli állapot: az esetleges kezelés ellenére is elhullás közelében lévő állapot vagy túlélésre való képtelenség. (A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)).

Megjósolható elhullás: a kísérlet tervezett vége előtt, a jövőben egy ismert időpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. (A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)).

1.3. A VIZSGÁLAT ELVE

A vizsgálat alapelve, hogy a lépésenként minimális számú állatot alkalmazó lépcsőzetes eljárás alapján elegendő információ nyerhető a vizsgálandó anyag akut toxicitásáról ahhoz, hogy be lehessen azt sorolni. Az anyagot szájon át és a meghatározott dózisok egyikét alkalmazva adják be a kísérleti állatok egy csoportjának. Az anyagot lépcsőzetes eljárással vizsgálják, ahol minden lépésben három azonos ivarú (általában nőstény) állatot használnak. A kezelt állatokban az anyaggal összefüggő elhullás vagy annak hiánya határozza meg a következő lépést, azaz:

— nincs szükség további vizsgálatra,

— további három állat vizsgálata történik ugyanazzal a dózissal,

— további három állat vizsgálata történik a következő nagyobb vagy kisebb dózissal.

A vizsgálati eljárás további részletei az 1. függelékben találhatók. A módszer alkalmazásával döntést lehet hozni arról, hogy a vizsgálandó anyag a rögzített LD50-határértékek segítségével megállapított toxicitási osztályok melyikébe sorolható be.

1.4. A MÓDSZER ISMERTETÉSE

1.4.1. Az állatfaj kiválasztása

A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általában nőstényeket használnak (9). Ennek az az oka, hogy a hagyományos LD50-vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekintése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhető különbség, a nőstények általában valamivel érzékenyebbek (11). Azonban ha a szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzékenysége valószínűsíthető, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfelelően meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik.

Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ± 20 %-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától.

1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei

A kísérleti állatokat 22 oC (± 3 oC) hőmérsékletű helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az egy ketrecben lévő állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az ne zavarja az egyes állatok megfigyelését.

1.4.3. Az állatok előkészítése

Az állatokat véletlenszerűen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani őket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez.

1.4.4. A dózisok előkészítése

A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Ha azonban egy folyékony végterméket vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követő kockázatértékelés szempontjából megfelelőbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítatlanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes hatóságok ezt írják elő. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretétől függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömegarány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázása tekintetében – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmadsorban esetlegesen más vivőanyagokban elkészített oldatok. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás előtt rövid idővel kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabilitása az alatt az alkalmazás időtartama alatt.

1.5. ELJÁRÁS

1.5.1. A dózisok beadása

A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy megfelelő intubációs kanülön át történő táplálással kell beadni. Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkalmazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó időtartam alatt kisebb részletekben is beadható.

A kezelés előtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A koplaltatási időszakot követően meg kell mérni az állatok testtömegét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni –patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás időtartamától függően menet közben szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak.

1.5.2. Az állatok száma és a dózisok

Minden lépésben három állatot kell alkalmazni. A kezdődózist az 5, 50, 300 és 2 000 mg/testtömeg-kg-os négy rögzített dózis közül kell kiválasztani. Azt a dózist kell kezdődózisként kiválasztani, amelyiknél a legvalószínűbb, hogy a kezelt állatok egy részénél elhullást okoz. Az 1. függelékben látható folyamatábrák ismertetik az egyes kezdődózisok esetén követendő eljárást. A 4. függelék pedig azzal kapcsolatosan ad iránymutatást, hogy a GHS bevezetéséig hogyan kell az EU-rendszer szerint elvégezni a besorolást.

Ha a rendelkezésre álló információ alapján a legmagasabb kezdődózis (2 000 mg/testtömeg-kg) valószínűleg nem okoz elhullást, akkor határérték-vizsgálatot kell végezni. Ha a vizsgálandó anyagról nincs információ, állatjóléti okokból a 300 mg/testtömeg-kg-os kezdődózis alkalmazása javasolt.

Az egyes dózisok vizsgálata közötti időtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének időpontja, időtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következő dózissal történő kezelését nem szabad megkezdeni mindaddig, amíg meg nem győződnek arról, hogy az előzőleg kezelt állatok életben maradnak.

Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét szabályozási hatósági követelmények indokolják, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 5 000 mg/kg-os felső dózis alkalmazását (lásd a 2. függeléket). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2 000–5 000 mg/kg) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószínűsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelenőséggel bírnak az emberi vagy állati egészség vagy a környezet védelme szempontjából.

1.5.3. Határérték-vizsgálat

Határérték-vizsgálatot elsősorban olyan helyzetekben kell végezni, ha a kísérletet végzőnek olyan információi vannak, amelyek szerint a vizsgálandó anyag valószínűleg nem toxikus, azaz csak a hatósági határértékdózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban információ hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhető, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a fő vizsgálatot kell elvégezni.

Végezhető határérték-vizsgálat egyetlen, 2 000 mg/testtömeg-kg-os dózissal, összesen hat (lépésenként három-három) állat alkalmazásával. Kivételes esetben végezhető határértékvizsgálat egyetlen, 5 000 mg/kg-os dózissal is, amikor összesen három állatot alkalmaznak (lásd a 2. függeléket). A vizsgálandó anyaggal összefüggő elhullás esetén szükséges lehet a következő alacsonyabb dózissal tovább folytatni a vizsgálatokat.

1.6. MEGFIGYELÉSEK

Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, legalább az első 30 percben, azután az első 24 órában rendszeres időközönként, amelynek során különös figyelemmel kell őket kísérni az első 4 órában, majd ezt követően naponta, összesen 14 napon át, kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálatból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés időtartamát azonban nem szabad mereven meghatározni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és időtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megszűnésének időpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek inkább késleltetve jelentkeznek (12). Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell úgy, hogy minden állat esetében önálló adatsort kell felvenni.

Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szükség. Meg kell figyelni a bőr és a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma előfordulására is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alapelveket és követelményeket is figyelembe kell venni (9). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lévő állatokat, illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját is.

1.6.1. Testtömeg

Röviddel a vizsgálandó anyag beadása előtt és legalább egy héttel utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtömegváltozást ki kell számítani, és rögzíteni kell. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus módon exterminálni kell őket.

1.6.2. Kórbonctani vizsgálat

Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni (azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden egyes állat esetében minden makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegyezni. A kezdődózis beadása után legalább 24 óráig túlélő állatok esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos információk nyerhetők.

2. ADATOK

Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy minden vizsgálati csoportra vonatkozóan mutassa a csoportban lévő kísérleti állatok számát, valamint azoknak a számát, amelyeknél mérgezési tünetek láthatók, amelyek a vizsgálat során elhullottak, vagy amelyeket humánus módon extermináltak, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.

3. JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek megfelelő módon a következő információkat kell tartalmaznia:

Vizsgálandó anyag: — fizikai megjelenés, tisztaság és ha releváns, a fizikai-kémiai tulajdonságok (ezen belül az izomerizáció is), — azonosító adatok, ezen belül a CAS-szám.

Vivőanyag (ha szükséges): — ha a vivőanyag nem víz, akkor ennek indoklása.

Kísérleti állatok: — az alkalmazott faj/törzs, — az állatok mikrobiológiai státusza, feltéve, hogy ismert, — az állatok száma, életkora és ivara (ezen belül adott esetben annak indoklása, hogy nőstények helyett miért hímeket alkalmaztak), — az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.

Kísérleti körülmények: — a vizsgálandó anyag formulázására vonatkozó információk, ezen belül a beadott anyag fizikai formájával kapcsolatos adatok, — a vizsgálandó anyag beadására vonatkozó információk, ezen belül a beadott térfogat és a beadás időpontja, — a táplálék és a víz minősége (ezen belül a takarmány típusa/forrása, a víz forrása), — a kezdődózis kiválasztásának indoklása.

Eredmények: — a válaszadatok és a dózisok táblázatos formában történő megadása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató, ezen belül elhullt állatokra; a hatások jellege, súlyossága és időtartama), — a testtömegadatok és a testtömegváltozások táblázatos formában történő megadása, — az egyes állatok testtömege a dózis beadásának napján, azt követően hetente, valamint az elhullás vagy exterminálás időpontjában, — a tervezett exterminálás előtti elhullás napja és ideje, — a mérgezési tünetek megjelenése és időbeli lefolyása, valamint esetleges visszafordíthatósága minden egyes állatra vonatkozóan, — a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.

Az eredmények diszkussziója és értelmezése.

Következtetések.

4. HIVATKOZÁSOK

(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86

(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method- An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FRF.html]

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

1. FÜGGELÉK AZ EGYES KEZDŐDÓZISOK ESETÉBEN KÖVETENDŐ ELJÁRÁS ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK Minden egyes kezdődózis esetén az ebben a függelékben bemutatott megfelelő vizsgálati sémák határozzák meg a követendő eljárást. — 1A. függelék: a kezdődózis 5 mg/testtömeg-kg, — 1B. függelék: a kezdődózis 50 mg/testtömeg-kg, — 1C. függelék: a kezdődózis 300 mg/testtömeg-kg, — 1D. függelék: a kezdődózis 2 000 mg/testtömeg-kg. A humánus módon exterminált vagy elhullott állatok számától függően a vizsgálati eljárás a jelzett nyilakat követi 1A. FÜGGELÉK VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 5 MG/TESTTÖMEG-KG KEZDŐDÓZIS ESETÉN 1B. Függelék VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 50 MG/TESTTÖMEG-KG KEZDŐDÓZIS ESETÉN 1C. FÜGGELÉK VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 300 MG/TESTTÖMEG-KG KEZDŐDÓZIS ESETÉN 1D. FÜGGELÉK VlZSGÁLATI ELJÁRÁS 2 000 MG/TESTTÖMEG-KG KEZDŐDÓZIS ESETÉN

2. FÜGGELÉK A VÁRHATÓAN 2 000 MG/KG FELETTI LD50-ÉRTÉKKEL RENDELKEZŐ VIZSGÁLANDÓ ANYAGOK VIZSGÁLATOK NÉLKÜLI OSZTÁLYOZÁSÁNAK KRITÉRIUMAI Az 5. veszélyességi kategória kritériumait úgy állapították meg, hogy tegyék lehetővé azoknak a vizsgálandó anyagoknak a meghatározását, amelyek akut toxicitási kockázata viszonylag alacsony, de bizonyos körülmények között veszélyt jelenthetnek az érzékeny populációkra. Az ilyen anyagok orális vagy dermális LD50-értéke várhatóan 2 000 és 5 000 mg/kg közötti tartományban található, vagy ezzel egyenértékű dózisoknak megfelelő az egyéb beadási módok esetében. A vizsgálandó anyagokat az alábbi esetekben kell a 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg veszélyességi kategóriába (GHS 5. kategória) sorolni: a) ha az 1A–1D. függelékben bemutatott, az elhullási gyakoriságon alapuló vizsgálati sémák bármelyike szerint ebbe a kategóriába kell sorolni; b) ha hitelt érdemlő bizonyíték van már arra, hogy az anyag LD50-értéke az 5. kategóriában megadott tartományba esik; vagy más állatkísérletek vagy humán toxikus hatások szerint a humán egészségügyi veszély akut jellegű; c) adatok extrapolálásával, becslésével vagy mérésével, ha egy veszélyesebb osztályba való besorolás nem indokolt, és — hitelt érdemlő információk emberben jelentős toxikus hatásokra utalnak, vagy — a legfeljebb 4. kategóriának megfelelő értékekkel elvégzett orális beadási móddal történő vizsgálatok során elhullás történt, vagy — ha a legfeljebb 4. kategóriának megfelelő értékekkel elvégzett vizsgálat alapján a szakértők véleménye megerősíti a toxicitás szignifikáns klinikai tüneteit, kivéve a hasmenést, szőrmeredezést vagy gondozatlan megjelenést, vagy — ha a szakértők véleménye megerősíti azokat a hitelt érdemlő információkat, amelyek más állatkísérletekben tapasztalt szignifikáns akut hatásokat valószínűsítenek. 2 000 MG/KG FELETTI DÓZISOKKAL TÖRTÉNŐ VIZSGÁLAT Az állatok jólétének védelme iránti igényt elismerve nem ajánlott, hogy állatokat az 5. kategória tartományában (5 000 mg/kg) vizsgálják, és csak akkor szabad fontolóra venni, ha nagy a valószínűsége, hogy az ilyen vizsgálatok eredményei közvetlen jelentőséggel bírnak az állati vagy emberi egészség védelme szempontjából (10). Nem szabad további vizsgálatokat végezni ennél magasabb dózisokkal. Ha vizsgálatot kell végezni, csak egy lépés (azaz három állat), az 5 000 mg/kg-os dózis alkalmazása szükséges. Ha az első kezelt állat elhullik, akkor az 1. függelékben bemutatott folyamatábrának megfelelően a kezelést a 2 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni. Ha az első állat életben marad, két további állatot kell kezelni. Ha a három állat közül csak egy hullik el, az LD50-érték várhatóan meghaladja az 5 000 mg/kg-ot. Ha mindkét állat elhullik, akkor a vizsgálatot a 2 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni.

3. FÜGGELÉK B1c. VIZSGÁLATI MÓDSZER: Útmutató az EU-rendszer szerinti besoroláshoz a Globálisan harmonizált osztályozási rendszer (GHS) teljes körű bevezetéséig tartó átmeneti időszakban (a (8) hivatkozásból)

B.2. AKUT TOXICITÁS (INHALÁCIÓ)

1. MÓDSZER

1.1. BEVEZETÉS

Hasznos, ha előzetes információk állnak rendelkezésre az anyag részecskeméret-eloszlásáról, gőznyomásáról, olvadáspontjáról, forráspontjáról és robbanásveszélyességéről (ha van ilyen).

Lásd az Általános bevezetés B. részét (A).

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Lásd az Általános bevezetés B. részét (B).

1.3. REFERENCIAANYAGOK

Nincsenek.

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Több kísérleti állatcsoportot tesznek ki a vizsgált anyag hatásának meghatározott időtartamig, fokozatosan változó koncentrációkban úgy, hogy csoportonként egyetlen koncentrációt használnak. Ezt követően megfigyelik a hatások és a halálesetek előfordulását. A vizsgálat során elpusztult állatokat és a vizsgálat végéig életben maradó állatokat is fel kell boncolni.

A súlyos és tartós betegség, illetve fájdalom jeleit mutató állatokat kíméletes módon el lehet pusztítani. A vizsgált anyagokat nem szabad olyan módon adagolni, amelyről ismert, hogy jelentős szenvedést és fájdalmat okoz maró vagy irritatív tulajdonsága miatt.

1.5. MINŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK

Nincsenek.

1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA

1.6.1. Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napig a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással csoportokba kell osztani. A szimulált expozíció csak akkor szükséges, ha ezt az alkalmazott expozíciós berendezés típusa indokolja.

A szilárd vizsgált anyagokat lehet, hogy mikronizálni kell azért, hogy megfelelő méretű részecskék álljanak rendelkezésre.

Szükség esetén vivőanyag alkalmazható a vizsgált anyag megfelelő koncentrációjának kialakítására a levegőben, ebben az esetben használni kell egy vivőanyag-kontrollcsoportot. Ha az adagolás megkönnyítésére vivőanyagot vagy más segédanyagot használnak, meg kell bizonyosodni arról, hogy azok nem rendelkeznek toxikus hatással. Ehhez szükség szerint korábbi vizsgálatokból származó adatokat is fel lehet használni.

1.6.2. Vizsgálati körülmények

1.6.2.1. A kísérlethez felhasznált állatok

Ellenjavallat hiányában a patkány az előnyben részesítendő állatfajta. Kísérleti célokra tenyésztett, laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. A vizsgálat kezdetén mindkét nem esetében az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan, az átlagértéktől maximum ± 20 %-kal térhet el egymástól.

1.6.2.2. Az állatok száma és neme

Minden koncentrációhoz legalább 10 rágcsálót (5 hímet és 5 nőstényt) kell felhasználni. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek.

Megjegyzés: A rágcsálóknál magasabb rendű állatokkal végrehajtott akuttoxicitás-vizsgálatokban meg kell fontolni kisebb számú állat használatának lehetőségét. A dózisokat gondosan kell kiválasztani, és minden erőfeszítést meg kell tenni arra, hogy azok ne lépjék túl a közepesen toxikus dózisokat. Ilyen vizsgálatoknál el kell kerülni a vizsgált anyag letális dózisának beadását.

1.6.2.3. Expozíciós koncentrációk

E szinteknek elegendő számúnak, legalább háromnak, és megfelelően elosztottnak kell lenniük ahhoz, hogy a vizsgált csoportokban toxikus hatások és halálozási arányok egész sorát hozzák létre. Az adagoknak elegendőnek kell lenniük a koncentráció-halálozás görbe létrehozására, és ahol lehetséges, lehetővé kell tenniük az LC50 elfogadható meghatározását.

1.6.2.4. Határérték-vizsgálat

Ha öt hím és öt nőstény kísérleti állat 5 mg/l gáz vagy folyadékaeroszol vagy szilárd anyag (vagy ahol ez nem lehetséges, a vizsgált anyag fizikai vagy kémiai tulajdonságai miatt, beleértve a robbanásveszélyt is, a maximálisan elérhető koncentráció) hatásának való négyórás kitettség után 14 napon belül nem észlelnek a vizsgált anyaggal kapcsolatos halálozást, akkor nincs szükség további vizsgálatra.

1.6.2.5. Expozíciós időtartam

Az expozíció időtartamának négy órának kell lennie.

1.6.2.6. Berendezés

A kísérlethez olyan inhalációs berendezést kell használni, amely óránként legalább tizenkét alkalommal légcserét tesz lehetővé a dinamikus légmozgás fenntartása érdekében, azért hogy megfelelő oxigéntartalmat és egyenletesen eloszlatott expozíciós atmoszférát lehessen biztosítani. Ha kamrát használnak, annak kialakítása révén a lehető legkisebbre kell csökkenteni a kísérleti állatok zsúfoltságát, és lehetővé kell tenni a lehető legnagyobb mértékű expozíciót a vizsgált anyag belégzése útján. Általános szabályként a kamrai atmoszféra stabilitásának biztosítása érdekében a kísérleti állatok teljes térfogata nem haladhatja meg a vizsgálati kamra térfogatának 5 %-át. Végezhetők csak az orron és szájon át, vagy csak a fejen át, illetve az egész testen keresztül megvalósuló egyedi expozíciós kamrai vizsgálatok; az első két módszer előnye, hogy minimalizálja a vizsgált anyag egyéb úton történő felvételének lehetőségét.

1.6.2.7. Megfigyelési időszak

A megfigyelési időszaknak legalább 14 napnak kell lennie. Azonban a megfigyelés időtartamát nem kell szigorúan értelmezni. Ezt a toxikus reakciók megjelenésének módja, a tünetek megjelenésének időpontja és a felépülési időtartam hosszúsága alapján kell meghatározni; ebből következően szükség esetén ezen időszak meghosszabbítható. Fontos az az időpont, amikor a toxicitás jelei megjelennek és eltűnnek, valamint a halál bekövetkezésének ideje, különösen, ha tendencia figyelhető meg a halál késedelmes bekövetkezésére.

1.6.3. A kísérlet végrehajtása

Közvetlenül az expozíciót megelőzően meg kell mérni az állatok tömegét, majd az egyenletes kamrai koncentráció beállása után az állatokat ki kell tenni a kijelölt készülékben a vizsgált koncentráció hatásának négy órán át. A kiegyenlítődési időnek rövidnek kell lennie. A vizsgálatokat 22 ± 3 oC állandó hőmérsékleten kell végezni. Ideális esetben a relatív páratartalmat 30 és 70 % között kell tartani, de bizonyos körülmények között (például aeroszolok vizsgálatakor) ez a gyakorlatban nem mindig kivitelezhető. A kamrán belül enyhe negatív nyomás (például ≤ 5 víz mm) fenntartása megakadályozza a vizsgált anyag kiszivárgását a környezetbe. Az állatok nem kaphatnak sem takarmányt, sem vizet az expozíció folyamán. A vizsgálati légkör létrehozásához és figyeléséhez megfelelő rendszereket kell használni. A rendszernek biztosítania kell, hogy a lehető leggyorsabban létrejöjjenek a stabil expozíciós körülményeké. A kamrát úgy kell tervezni és működtetni, hogy fennmaradjon a kamrán belül a vizsgálati légkör homogén eloszlása.

A következő paramétereket kell mérni, illetve figyelemmel kísérni:

a) a légáramlás sebessége (folyamatosan);

b) az anyag tényleges koncentrációja, amit az expozíció során a belégzési zónában legalább háromszor meg kell mérni (egyes légkörök esetében pl. ha aeroszolok magas koncentrációban vannak jelen, gyakoribb megfigyelésre is szükség lehet). Az expozíciós időszak folyamán a koncentráció nem változhat a középérték ± 15 %-át meghaladó mértékben. Aeroszolok esetében azonban ez az érték nem biztos, hogy elérhető, ekkor elfogadható lehet egy ennél szélesebb tartomány. Aeroszolok esetében, amilyen gyakran csak szükséges (vizsgált csoportonként legalább egyszer) részecskeméret-elemzést kell végrehajtani;

c) a hőmérséklet és a páratartalom, ha lehetséges, folyamatosan.

Az expozíció ideje alatt és azt követően az állatokat rendszeresen meg kell figyelni és a leleteket rögzíteni kell; külön feljegyzést kell vezetni minden egyes állatról. Az első nap során gyakran kell végrehajtani a megfigyeléseket. Minden munkanapon legalább egyszer gondos klinikai vizsgálatot kell végrehajtani, más megfigyeléseket naponta kell végezni, azon megfelelő tevékenységek végrehajtása mellett, amelyek célja a vizsgálatban részt vevő állatok elvesztésének minimálissá tétele, ilyen például a holtan talált állatok boncolása vagy lehűtése, vagy a gyenge, illetve haldokló állatok elkülönítése és elpusztítása.

A megfigyeléseknek ki kell terjednie a bőr és a szőrzet, a szem és a nyálkahártya, valamint a légző- és keringési rendszer, a vegetatív és a központi idegrendszeri funkciók, valamint a szomatomotoros aktivitás és viselkedési minta változásaira. Külön figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma megfigyelésére. A halál időpontját a lehető legpontosabban kell feljegyezni. Az állatok súlyát egyenként, az expozíció után hetente és halálozáskor meg kell állapítani.

A vizsgálat során elpusztult állatokat és a vizsgálat befejezéséig életben maradt állatokat fel kell boncolni, különös figyelmet szentelve a felső és alsó légútban bekövetkező minden változásnak. Fel kell jegyezni minden jelentős patológiás elváltozást. Amennyiben szükséges, szövetmintákat kell venni a kórszövettani vizsgálathoz.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, megadva minden egyes csoporthoz az állatok számát a vizsgálat kezdetekor, az egyes állatok halálának időpontját, a toxicitás más jeleit mutató állatok számát, a toxikus hatások leírását és a boncolási leleteket. Ki kell számítani és fel kell jegyezni a tömegváltozásokat, ha az állat egy napnál tovább maradt életben. A vizsgált anyaggal összefüggő szenvedés és fájdalom miatt humánusan elpusztított állatok halálát az anyaggal kapcsolatos halálként kell feljegyezni. Az LC50 valamely elismert módszer segítségével határozható meg. Az értékelésnek tartalmaznia kell – amennyiben ez lehetséges – a dózis és a rendellenességek fellépése és súlyossága közötti kapcsolatot, ideértve a magatartási rendellenességeket, a klinikai tüneteket, a jelentős sérüléseket, testsúlyváltozásokat, halálozást és minden más toxikológiai hatást is.

3. VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

— használt fajt, törzset, az állatok származását, a tartási körülményeket, az étrendet,

— a vizsgálati körülményeket: az expozíciós készülék leírását, beleértve a készülék konstrukcióját, típusát, méreteit, a levegőforrást, az aeroszolok előállítására szolgáló rendszert, a légkondicionálás módszerét, az állatoknak a vizsgálati kamrában való elhelyezését. A hőmérsékletet, a levegő páratartalmát, és adott esetben az aeroszol koncentráció stabilitását, illetve részecskeméret-eloszlás meghatározására használt berendezéseket szintén le kell írni.

Expozíciós adatok:

Ezen adatokat táblázatos formában kell közölni, az átlagértékek és az azoktól való eltérés megjelölésével. A következő adatokra van szükség:

a) légáram sebessége az inhalációs készülékben;

b) hőmérséklet és a levegő páratartalma;

c) névleges koncentráció (az inhalációs készülékbe helyezett vizsgált anyag összmennyisége osztva a levegő térfogatával);

d) vivőanyag jellege (ha van);

e) tényleges koncentráció a belégzési zónában;

f) a tömegfelező aerodinamikai átmérő („Mass Median Aerodynamic Diameter” MMAD) és a geometrikus standard deviáció („Geometric Standard Deviation” GSD);

g) a kiegyenlítődés időtartama;

h) az expozíciós időtartam; — az adatok táblázatos összefoglalása nem és koncentráció szerint (azaz a vizsgálat során elhullott vagy elpusztított állatok száma; a toxicitás jeleit mutató állatok száma; az exponált állatok száma), — az anyag adagolása során vagy azt követően bekövetkező halál időpontja, az állatok humánus elpusztításának okai és kritériumai, — minden megfigyelés, — a megfigyelési időszak végén (az alkalmazott számítási módszer megadásával) meghatározott LC50-érték mindkét nemnél, — az LC50-hez tartozó 95 %-os konfidenciaintervallum (ahol ez megadható), — dózis/mortalitás görbe és ennek meredeksége (ahol ezt megengedi a meghatározás módszere), — boncolási leletek, — a kórszövettani vizsgálatok eredményei, — az eredmények kiértékelése (különleges figyelmet kell szentelni annak a hatásnak, amelyet a vizsgálat során az állatok humánus megölése gyakorolhat a kiszámított LC50-értékre), — az eredmények értelmezése.

3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS

Lásd az Általános bevezetés B. részét (D).

4. SZAKIRODALOM

Lásd az Általános bevezetés B. részét (E)

B.3. AKUT TOXICITÁS (DERMÁLIS)

1. MÓDSZER

1.1. BEVEZETÉS

Lásd az Általános bevezetés B. részét (A).

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Lásd az Általános bevezetés B. részét (B).

1.3. REFERENCIAANYAGOK

Nincsenek.

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

A vizsgált anyagot naponta, a bőrre kell adagolni fokozatos adagokban több kísérleti állatcsoportnak, csoportonként egy adagot használva. Ezt követően megfigyelik a hatásokat és a halálesetek előfordulását. A vizsgálat során elpusztult állatokat és a vizsgálat végéig életben maradó állatokat is fel kell boncolni.

A súlyos és tartós betegség, illetve fájdalom jeleit mutató állatokat humánus módon el lehet pusztítani. A vizsgált anyagokat nem szabad olyan módon adagolni, amelyről ismert, hogy jelentős szenvedést és fájdalmat okoz maró vagy irritatív tulajdonsága miatt.

1.5. MINŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK

Nincsenek.

1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA

1.6.1. Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napig a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással csoportokba kell osztani. A vizsgálat előtt körülbelül 24 órával el kell távolítani a szőrzetet az állatok törzsének hátulsó területéről nyírással vagy borotválással. A szőrzet nyírásakor vagy borotválásakor óvatosan kell eljárni, nehogy olyan bőrsérülést okozzanak, ami a felszívódást befolyásolhatja. A testfelület legalább 10 %-át szabaddá kell tenni a vizsgált anyag alkalmazásához. Ha szilárd anyagot vizsgálnak, amelyet adott esetben porítani is lehet, az anyagot vízzel kellően át kell nedvesíteni, vagy szükség esetén vivőanyagot kell alkalmazni annak biztosítására, hogy jól tapadjon a bőrhöz. Vivőanyag használatakor figyelembe kell venni a vivőanyag hatását a vizsgált anyag bőrbe való behatolására. A folyékony vizsgált anyagokat rendszerint hígítás nélkül kell adagolni.

1.6.2. Vizsgálati körülmények

1.6.2.1. A kísérlethez felhasznált állatok

Kifejlett patkány vagy nyúl használható. Más faj is használható, de azok használatát meg kell indokolni. Kísérleti célokra tenyésztett, laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya minimálisan, az átlagértéktől maximum ± 20 %-kal térhet el egymástól.

1.6.2.2. Az állatok száma és neme

Minden koncentrációnál legalább öt állatot kell vizsgálni. Az állatoknak azonos neműnek kell lenniük. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Amennyiben rendelkezésre áll olyan információ, amely szerint valamelyik nem lényegesen érzékenyebben reagál, akkor ilyen nemű állatokat kell alkalmazni.

Megjegyzés: A rágcsálóknál magasabb rendű állatokkal végrehajtott akuttoxicitás-vizsgálatokban meg kell fontolni kisebb számú állat használatának lehetőségét. A dózisokat gondosan kell kiválasztani, és minden erőfeszítést meg kell tenni arra, hogy azok ne lépjék túl a közepesen toxikus dózisokat. Ilyen vizsgálatoknál el kell kerülni a vizsgált anyag letális dózisának beadását.

1.6.2.3. Dózisok

E szinteknek elegendő számúaknak, legalább háromnak, és megfelelően elosztottnak kell lenniük ahhoz, hogy a vizsgált csoportokban toxikus hatások és halálozási arányok egész sorát hozzák létre. Minden irritatív vagy maró hatást figyelembe kell venni a dózisok megállapításakor. Az adatoknak elegendőnek kell lenniük a koncentráció/hatás görbe létrehozására, és ahol lehetséges, lehetővé kell tenniük az LD50 elfogadható meghatározását.

1.6.2.4. Határérték-vizsgálat

A határérték-vizsgálatot el lehet végezni egyetlen, legalább 2 000 mg/testsúly kg dózissal adagolt 5 hím és 5 nőstény rágcsálóból álló csoporttal a fent leírt eljárások végrehajtásával. Ha a vizsgált anyaggal kapcsolatos halálozás figyelhető meg, akkor szükség lehet a teljes körű vizsgálat elvégzésére.

1.6.2.5. Megfigyelési időszak

A megfigyelési időszaknak legalább 14 napnak kell lennie. Azonban a megfigyelés időtartamát nem kell szigorúan értelmezni. Ezt a toxikus reakciók megjelenésének módja, a tünetek megjelenésének időpontja és a felépülési időtartam hosszúsága alapján kell meghatározni; ebből következően ezen időtartam szükség esetén meghosszabbítható. Fontos az az időpont, amikor a toxicitás jelei megjelennek és eltűnnek, valamint a halál bekövetkezésének ideje, különösen, ha tendencia figyelhető meg a halál késedelmes bekövetkezésére.

1.6.3. A kísérlet végrehajtása

Az állatokat egyesével kell a ketrecekben elhelyezni. A vizsgált anyagot a testfelület megközelítőleg 10 %-át kitevő felületen egyenletesen elosztva kell felvinni az állat bőrére. Erősen mérgező anyagoknál a felület lehet ennél kisebb, de a felület lehető legnagyobb részét a lehető legvékonyabb és legegyenletesebb bevonattal kell ellátni.

A 24 órás expozíció ideje alatt a vizsgált anyagot a bőrrel porózus gézkötés és nem irritáló ragtapasszal kell érintkezésben tartani. A vizsgált területet megfelelő módon be kell fedni, azért hogy megmaradjon rajta a vizsgált anyag és a gézkötés, és az állatok ne nyalhassák le a vizsgált anyagot. Mozgásgátló szerkezeteket lehet használni annak megakadályozására, hogy az állat a vizsgált anyagot lenyelje, de a teljes immobilizáció mint módszer nem javasolt.

Az expozíciós idő leteltével a maradék vizsgált anyagot lehetőség szerint el kell távolítani a bőr felületének vízzel vagy más megfelelő módon történő megtisztítása útján.

A megfigyeléseket szisztematikusan fel kell jegyezni. Külön fel