A Bizottság kilencedik irányelve

(1981. július 31.)

a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról

(81/715/EGK)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb Görögország csatlakozási okmányával módosított, a takarmányok hatósági ellenőrzésénél alkalmazandó közösségi mintavételi és analitikai módszerek bevezetéséről szóló, 1970. július 20-i 70/373/EGK [1] tanácsi irányelvre és különösen annak 2. cikkére,

mivel az említett irányelv előírja, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzését, amelynek célja a takarmányok minőségére és összetételére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezésekből eredő követelmények betartásának ellenőrzése, közösségi mintavételi és analitikai módszerek alkalmazásával kell végrehajtani;

mivel a legutóbb az 1981. július 30-i irányelvvel módosított 71/250/EGK [2], 71/393/EGK [3], 72/199/EGK [4], 73/46/EGK [5], 74/203/EGK [6], 75/84/EGK [7], 76/372/EGK [8] és 78/633/EGK [9] bizottsági irányelvek már számos közösségi analitikai módszert meghatároztak; mivel az azóta eltelt időben, az adott területen elért fejlődés következtében ajánlatos egy kilencedik módszersorozat elfogadása;

mivel az ebben az irányelvben előírt intézkedések összhangban vannak a Takarmányok Állandó Bizottsága véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A tagállamok előírják, hogy a takarmányok avoparcin és monensin-nátrium tartalmára vonatkozó, a hatósági ellenőrzések keretében végzett analitikai vizsgálatokat a mellékletben leírt módszereknek megfelelően kell végrehajtani.

2. cikk

A tagállamok, legkésőbb 1981. december 1-ig hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek, és erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

3. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1981. július 31-én.

a Bizottság részéről

az elnök

Gaston Thorn

[1] HL L 170., 1970.8.3., 2. o.

[2] HL L 155., 1971.7.12., 13. o.

[3] HL L 279., 1971.12.20., 7. o.

[4] HL L 123., 1972.5.29., 6. o.

[5] HL L 83., 1973.3.30., 21. o.

[6] HL L 108., 1974.4.22., 7. o.

[7] HL L 32., 1975.2.5., 26. o.

[8] HL L 102., 1976.4.15., 8. o.

[9] HL L 206., 1978.7.29., 43. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

1. AZ AVOPARCIN MEGHATÁROZÁSA AGARDIFFÚZIÓVAL

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A módszer az avoparcin takarmányokban és előkeverékekben történő meghatározására szolgál. A meghatározás alsó határértéke 2 mg/kg (2 ppm). Poliéter-antibiotikumok jelenléte interferenciát okozhat a meghatározás során.

2. VIZSGÁLATI ALAPELV

A mintát aceton, víz és sósav keverékével extraháljuk. A kivonat antibiotikus aktivitását az avoparcin Bacillus subtilis-szel beoltott agar táptalajon mutatott diffúziójának mérésével határozzuk meg. A diffúziót a mikroorganizmus gátlási zónáinak kialakulása mutatja. Az említett zónák átmérője az alkalmazott antibiotikum-koncentrációk tartományában egyenesen arányos az antibiotikum koncentrációjának logaritmusával.

3. MIKROORGANIZMUS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Törzstenyészet fenntartása

Ferde táptalajt (4.1.) tartalmazó kémcsöveket beoltunk Bacillus subtilis-szel és egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. A tenyészetet hűtőszekrényben körülbelül 4 °C-on tároljuk. Havonta újra beoltjuk.

3.2. Spóraszuszpenzió készítése [1]

2-3 ml steril vízzel válasszuk le a telepeket a nemrég készített ferde agartáptalajról (3.1.). Ezzel a szuszpenzióval oltsunk be 300 ml, Roux-palackban lévő táptalajt (4.1.) és inkubáljuk 30 °C-on három-öt napig. Miután mikroszkóp alatt ellenőriztük a spóraképződés mértékét, 15 ml etanollal (4.2.) válasszuk le a telepeket, és alaposan keverjük össze. Ezt a szuszpenziót 4 °C körüli hőmérsékleten legalább öt hónapig eltarthatjuk.

4. TÁPTALAJ ÉS REAGENSEK

4.1. Táptalaj [2]

Pepton | 6,0 g |

Tripton | 4,0 g |

Húskivonat | 3,0 g |

Élesztőkivona | 1,5 g |

Glükóz | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Víz | 1000 ml |

pH 6,5 (sterilizálás után). | |

4.2. Etanol 20 % (v/v): hígítsunk fel 200 ml etanolt 800 ml vízzel.

4.3. Sósav, d: 1,18-1,19.

4.4. Nátrium-hidroxid, 2 M oldat.

4.5. Foszfátpuffer, 0,1 M:

Kálium-dihidrogén-foszfát, KH2PO4: 13,6 g.

Töltsük fel vízzel 1000 ml-re.

Állítsuk be a pH-t 4,5-re.

4.6. Aceton/víz/sósav keveréke (4.3.): 65/32,5/2,5 (v/v/v).

4.7. Standard anyag: ismert aktivitású avoparcin-szulfát.

5. STANDARD OLDATOK

A foszfátpufferben (4.5.) oldjuk fel a standard anyag (4.7.) gondosan kimért 10 mg mennyiségét, majd ezzel a pufferoldattal hígítsuk tovább, amíg olyan törzsoldatot kapunk, amely milliliterenként 100 μg avoparcint tartalmaz. Lezárt lombikban, 4 °C-on tárolva ez az oldat hét napig stabil marad.

5.1. Előkeverékek esetében

Ebből a törzsoldatból pufferrel (4.5.) végzett egymás utáni hígításokkal készítsük el a következő oldatokat:

S8 | 4,0 μg/ml |

S4 | 2,0 μg/ml |

S2 | 1,0 μg/ml |

S1 | 0,5 μg/ml |

5.2. Takarmányok esetében

A törzsoldatból pufferrel (4.5.) végzett egymás utáni hígításokkal készítsük el a következő oldatokat:

S8 | 2,0 μg/ml |

S4 | 1,0 μg/ml |

S2 | 0,5 μg/ml |

S1 | 0,25 μg/ml |

6. A KIVONAT ÉS A VIZSGÁLATI OLDATOK ELKÉSZÍTÉSE

6.1. Előkeverékek

10 mg pontossággal mérjünk akkora mennyiségű mintát, amely 10-100 mg avoparcint tartalmaz. Tegyük át egy 100 ml-es mérőlombikba 60 ml keverékkel (4.6.) együtt, és mechanikus rázógéppel 15 percig rázassuk. Ellenőrizzük a pH-t, és adott esetben, állítsuk be 2-re sósavval (4.3.). Töltsük fel a lombikot a keverékkel (4.6.) és keverjük össze alaposan. Egy részét megfelelő szűrőpapíron (pl. Whatman No 1) szűrjük át, az első 5 ml leszűrt anyagot elöntve. Vegyünk egy aliquot részét, és nátrium-hidroxid-oldattal (4.4.) állítsuk be a pH-t 4,5-re. Hígítsuk fel ezt az oldatot a pufferrel (4.5.), hogy a várt avoparcin-koncentráció 4 μg/ml legyen (= U8).

Ebből az oldatból pufferrel (4.5.) végzett egymást követő hígításokkal (1 + 1) készítsük el az U4 (várt tartalom: 2 μg/ml), U2 (várt tartalom: 1 μg/ml), és U1 (várt tartalom: 0,5 μg/ml) oldatokat.

6.2. Takarmányok

A mintából mérjünk ki 50 g mennyiséget és 100 ml keverékkel (4.6.) 30 percig rázassuk mechanikus rázógépen. Centrifugálással derítsük a kivonatot (zárt centrifugacsöveket használva), majd vegyünk egy aliquot részt a tisztított kivonatból (lásd a lenti táblázatot), és állítsuk be a pH-t 4,5-re nátrium-hidroxid-oldattal (4.4.). Hígítsuk fel ezt az aliquot részt pufferrel (4.5.), hogy megkapjuk az U8–oldatot (lásd a lenti táblázatot).

Ebből az oldatból pufferrel (4.5.) végzett egymást követő hígításokkal (1 + 1) készítsük el az U4 (várt tartalom: 1 μg/ml), U2 (várt tartalom: 0,5 μg/ml), és U1 (várt tartalom: 0,25 μg/ml) oldatokat.

Vélt avoparcin-tartalom (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

A minta súlya (g (± 0, 1 g)) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

A keverék (4.6.) térfogata (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

A derített kivonat térfogata (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Végső térfogat (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

Az U8 várt koncentrációja (μg/ml) | 2 | körülbelül 2 | 2 | körülbelül 2 | 2 | 2 |

7. VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

7.1. A vizsgálati táptalaj beoltása

A vizsgálati táptalajt (4.1.) oltsuk be a spóraszuszpenzióval (3.2.) 50 - 60 °C-on. A vizsgálati táptalajt (4.1.) tartalmazó tálcákon előzetesen elvégzett próbák segítségével határozzuk meg a spóraszuszpenzió azon menyiségét, amely a legnagyobb és legtisztább gátlási zónákat adja az avoparcin különböző koncentrációi mellett.

7.2. A tálcák előkészítése

Az agardiffúziót tálcákon hajtjuk végre a standard oldat négy koncentrációjával (S8, S4, S2, S1), és a vizsgálati oldat négy koncentrációjával (U8, U4, U2, U1). A kivonat és a standard oldatok négy-négy koncentrációját minden tálcára egyaránt fel kell vinni. Ennek megfelelően olyan tálcákat válasszunk, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy legalább nyolc, 10-13 mm átmérőjű és középpontjukkal egymástól nem kevesebb, mint 30 mm-re lévő lyukat lehessen készíteni az agar táptalajon. A tesztet olyan tálcákon is el lehet végezni, amelyek egy üveglapból és az arra ráhelyezett 200 mm átmérőjű és 20 mm magas alumínium vagy műanyag gyűrűből állnak.

Öntsük a tálcákra a 7.1. szerint beoltott táptalaj (4.1.) olyan menyiségét, amely körülbelül 2 mm vastagságú réteget képez (60 ml egy 200 mm átmérőjű tálcákon). Hagyjuk, amíg egyenletes eloszlásban megszilárdul, majd fúrjuk bele a lyukakat, és helyezzük beléjük a vizsgálati és a standard oldat pontosan kimért mennyiségeit (0,10-0,15 ml között lyukanként, az átmérőtől függően). Minden koncentrációt legalább négyszer alkalmazzunk, hogy minden meghatározás 32 gátlási zóna értékeléséhez legyen kötve.

7.3. Inkubálás

A tálcákat 16-18 óráig inkubáljuk 30 °C-on.

8. ÉRTÉKELÉS

Mérjük meg a zónák átmérőjét 0,1 mm-es pontossággal. Jegyezzük fel a mérések átlagait minden koncentráció esetén féllogaritmusos papíron, amely a koncentrációk logaritmusát a gátlási zónák átmérőjéhez viszonyítva mutatja. Szerkesszük meg a "legjobban illeszkedő" vonalakat a standard oldat és a kivonat esetében egyaránt, például az alább megadottak szerint.

A következő képlet használatával határozzuk meg a standard legalacsonyabb szinthez (SL) tartozó "legjobban illeszkedő" pontot:

SL =

10

A következő képlet használatával határozzuk meg a standard legmagasabb szinthez (SH) tartozó "legjobban illeszkedő" pontot:

SH =

10

Hasonlóképpen számítsuk ki a kivonat "legjobban illeszkedő" legalacsonyabb (UL) és legmagasabb (UH) pontjait, a fenti képletekben S1, S2, S4 és S8 helyére U1, U2, U4 és U8 behelyettesítésével.

A kiszámított SL- és SH-értékeket jegyezzük fel ugyanarra a milliméterpapírra, majd kössük össze őket, hogy megkapjuk a standard oldat "legjobban illeszkedő" vonalát. Hasonlóképpen vigyük fel az UL- és az UH-értékeket is, majd kössük össze őket, hogy megkapjuk a kivonat "legjobban illeszkedő" vonalát.

Interferencia hiányában a vonalaknak párhuzamosnak kell lenniük. Gyakorlati szempontból a vonalakat párhuzamosnak tekinthetjük, ha az (SH-SL) és az (UH-UL) értékek nem térnek el 10 %-nál nagyobb mértékben az átlagértéküktől.

Ha a vonalakat nem párhuzamosak, az U1 és S1 vagy az U8 és S8 elvethető, és az SL, SH, UL és UH értékeket az alternatív képlettel számolhatjuk, amely alternatív "legjobban illeszkedő" vonalakat ad:

a′)SL = 5S1 + 2S2 – S46 | vagy | 5S2 + 2S4 – S86 |

b′)SH = 5S4 + 2S2 – S16 | vagy | 5S8 + 2S4 – S26 |

és hasonlóképpen számolhatjuk az UL- és UH-értékeket is. Az alternatív "legjobban illeszkedő" vonalak párhuzamosságát is az előzőekhez hasonlóan ellenőrizni kell. Azt a tényt, hogy az eredményt három szintből számoltuk, jelezni kell a zárójelentésben.

Ha a vonalak párhuzamosnak tekinthetőek, a relatív aktivitás logaritmusát (log. A) a következő képlet segítségével számítjuk ki:

Négy szint esetén

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

− S

− S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Három szint esetén

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

4 × 0,401U4 + S4 − U1 − S1

vagy

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

8 × 0,401U8 + S8 − U2 − S2

Valódi aktivitás = feltételezett aktivitás x relatív aktivitás.

Ha a relatív aktivitás a 0,5 - 2,0 sávon kívül esik, ismételjük meg a vizsgálatot a kivonatkoncentrációk, vagy ha ez nem lehetséges, a standard oldatok megfelelő kiigazításával. Ha a relatív aktivitást nem lehet a kívánt sávon belülre hozni, minden kapott eredményt hozzávetőlegesnek kell tekinteni és ezt a zárójelentésben meg kell jegyezni

Ha a vonalak nem tekinthetőek párhuzamosnak, ismételjük meg a meghatározást. Ha a párhuzamosságot továbbra sem sikerül elérni, a meghatározást nem kielégítőnek kell tekinteni.

9. ISMÉTELHETŐSÉG

Ugyanazon személy által, ugyanazon a mintán végzett két meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

- a 2 mg/kg-ot abszolút értékben, ha az avoparcintartalom 2 és 10 mg/kg között van,

- a legmagasabb értékhez viszonyított 20 %-ot 10 - 25 mg/kg tartalom esetén,

- az 5 mg/kg-ot abszolút értékben, ha a tartalom 25 és 50 mg/kg között van,

- a legmagasabb értékhez viszonyított 10 %-ot 50 mg/kg feletti tartalom esetén.

2. A MONENZIN-NÁTRIUM MEGHATÁROZÁSA AGARDIFFÚZIÓVAL

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A módszer a monenzin-nátrium meghatározására szolgál takarmányokban és előkeverékekben. A meghatározás alsó határértéke 10 mg/kg (10 ppm) [3].

2. VIZSGÁLATI ALAPELV

A mintát 90 %-os metanollal extraháljuk. A kivonatot a minta monenzin-nátrium-tartalma szerint megfelelő eljárásoknak vetjük alá. Az antibiotikus aktivitást a monenzin-nátrium Bacillus subtilis baktériummal beoltott agar táptalajon mutatott diffúziójának mérésével határozzuk meg. A diffúziót a mikroorganizmus gátlási zónáinak kialakulása mutatja. Az említett zónák átmérője egyenesen arányos az antibiotikum koncentrációjának logaritmusával az alkalmazott antibiotikumkoncentrációk tartományában. Nátrium-ionok jelenléte a vizsgálati rendszer érzékenységét csökkenti.

3. MIKROORGANIZMUS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Törzstenyészet fenntartása

Ferde táptalajt (4.1.) tartalmazó kémcsöveket Bacillus subtilis-szel oltunk be és egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. A tenyészetet hűtőszekrényben körülbelül 4 °C-on tároljuk. Havonta újra beoltjuk.

3.2. Spóraszuszpenzió készítése [4]

2-3 ml steril vízzel válasszuk le a telepeket egy nemrég készített ferde agar táptalajról (3.1.). Ezzel a szuszpenzióval oltsunk be 300 ml, Roux-palackban lévő táptalajt (4.1.) és inkubáljuk három-öt napig 30 °C-on. Miután mikroszkóp alatt ellenőriztük a spóraképződés mértékét, 15 ml 20 %-os etanollal (4.3.) válasszuk le a telepeket, és keverjük össze alaposan. Ezt a szuszpenziót legalább öt hónapig eltarthatjuk 4 °C körüli hőmérsékleten.

4. TÁPTALAJ ÉS REAGENSEK

4.1. Táptalaj [5]

Tripton | 10,0 g |

Élesztőkivonat | 3,0 g |

Húskivonat | 1,5 g |

Glükóz | 1,0 g |

Agar (minőségtől függően) | 10,0 - 20,0 g |

Víz | 1000 ml |

pH 6,5 (sterilizálás után) | |

4.2. Vizsgálati táptalaj

Glükóz | 10,0 g |

Élesztőkivonat | 2,5 g |

Dikálium-hidrogén-foszfát, K2HPO4 | 0,69 g |

Kálium-dihidrogén-foszfát, KH2PO4 | 0,45 g |

Agar (minőségtől függően) | 10,0 - 20,0 g |

Víz | 1000 ml |

pH 6 (sterilizálás után) | |

4.3. Etanol 20 % (v/v): hígítsunk fel 200 ml etanolt 800 ml vízzel.

4.4. Metanol, vízmentes.

4.5. Metanol 90 % (v/v): hígítsunk fel 900 ml metanolt (4.4.) 100 ml vízzel.

4.6. Metanol 50 % (v/v): hígítsunk fel 500 ml metanolt (4.4.) 500 ml vízzel.

4.7. Alumínium-oxid, granulált (alcoa F, 20 szem; aktív alumínium UGI: F. Lancaster and Co., vagy azzal egyenértékű).

4.8. Standard anyagok: ismert aktivitású monenzin-nátrium (pl. International Laboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK Surrey KT15 3NB).

5. ESZKÖZÖK

5.1. Rotációs vákuumbepárló, 250 ml-es gömblombikkal.

5.2. Kromatográfiás üvegcső, belső átmérője: 25 mm, hossza: 400 mm, egyik végén 2 mm átmérőjű nyílással.

5.3. Kromatográfiás üvegcső, belső átmérője: 11 mm, hossza: körülbelül 300 mm, egyik végén 2 mm átmérőjű nyílással.

6. STANDARD OLDATOK

A metanolban (4.4.) oldjuk fel a standard anyag (4.8.) gondosan kimért mennyiségét, majd hígítsuk tovább, amíg olyan törzsoldatot kapunk, amely 800 μg monenzin-nátriumot tartalmaz milliliterenként. Lezárt lombikban, 4 °C-on tárolva ez az oldat két hétig stabil marad.

Ebből a törzsoldatból 50 %-os metanollal (4.6.) végzett egymás utáni hígításokkal készítsük el a következő oldatokat:

S8 | 8,0 μg/ml |

S4 | 4,0 μg/ml |

S2 | 2,0 μg/ml |

S1 | 1,0 μg/ml |

7. KIVONAT KÉSZÍTÉSE

7.1. Extrahálás

7.1.1. Előkeverékek

Mérjünk ki 2 g mennyiségű mintát, adjunk hozzá 100 ml 90 %-os metanolt (4.5.), homogenizáljuk és néhány percig centrifugáljuk. A felülúszó oldatot 50 %-os metanollal (4.6.) hígítsuk fel, hogy a várt monenzin-nátrium-tartalom 8 μg/ml legyen (= U8).

7.1.2. Takarmányok, amelyek monezin-nátrium tartalma nem kevesebb 50 ppm-nél

A mintából mérjünk ki 10 - 20 g mennyiséget, adjunk hozzá 100 ml 90 %-os metanolt (4.5.), 15 percig homogenizáljuk, majd hagyjuk leülepedni.

Helyezzünk vattadugót egy üvegcső (5.2.) keskenyebbik végébe, és adjunk hozzá alumínium-oxidot (4.7.) finoman tömörítve, amíg az oszlop eléri a 75 - 80 mm-es magasságot.

Öntsük rá a kivonatot az alumínium-oxid-oszlopra és gyűjtsük össze a szűrletet. A szűrletből 30 ml-t hígítsunk fel 50 ml vízzel. Végezzünk egymást követő hígításokat 50 %-os metanollal, hogy a várt monenzin-nátrium-tartalom 8 μg/ml legyen (= U8).

7.1.3. 50 ppm-nél kevesebb (de legalább 10 ppm) monenzin-nátriumot tartalmazó takarmányok

Mérjünk ki 10-20 g mennyiségű mintát, adjunk hozzá 100 ml 90 %-os metanolt (4.5.), 15 percig homogenizáljuk. Centrifugáljuk, amíg kitisztul.

20 ppm monenzin-nátriumot tartalmazó minta esetében vegyünk 40 ml felülúszó folyadékot. Egy 10 ppm tartalmú mintánál 80 ml-t vegyünk és vákuum alatt rotációs bepárlón (5.1.), 40 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten a teljes kiszáradásig pároljuk be. A maradékanyagot oldjuk fel 10 ml 90 %-os metanolban (4.5.).

Helyezzünk vattadugót egy üvegcső (5.3.) keskenyebbik végébe, és adjunk hozzá alumínium-oxidot (4.7.) finoman tömörítve, amíg az oszlop eléri a 75-80 mm-es magasságot.

Öntsük rá a maradékanyag metanolos oldatát az alumínium-oxid-oszlopra és gyűjtsük össze a szűrletet. Mossuk át az oszlopot 10 ml 90 %-os metanollal (4.5.) és elegyítsük a mosófolyadékot a szűrlettel.

Az oldatot vákuum alatt rotációs bepárlón (5.1.), 40 °C alatti hőmérsékleten a teljes kiszáradásig pároljuk be. A maradékanyagot oldjuk fel 10 ml vízmentes metanolban (4.4.), és töltsük fel 20 ml-re vízzel. Az oldatot legalább öt percig centrifugáljuk 4000 r/percen. Végezzünk egymást követő hígításokat 50 %-os metanollal (4.6.), hogy a várt monenzin-nátrium-tartalom 8 μg/ml legyen (= U8).

7.2. Vizsgálati oldatok

Az U8–oldatból 50 %-os metanollal (4.6.) végzett egymást követő hígításokkal (1+1) készítsük el az U4 (várt tartalom: 4 μg/ml), U2 (várt tartalom: 2 μg/ml), és U1 (várt tartalom: 1 μg/ml) oldatokat.

8. VIZSGÁLATI ELJÁRÁS

8.1. A vizsgálati táptalaj beoltása

A vizsgálati táptalajt (4.2.) oltsuk be a spóraszuszpenzióval (3.2.) 50 - 60 oC-on. A vizsgálati táptalajon (4.2.) előzetesen elvégzett próbák segítségével határozzuk meg a spóraszuszpenzió azon mennyiségét, amely a legnagyobb és legtisztább gátlási zónákat adja a monenzin-nátrium különböző koncentrációi mellett.

8.2. A tálcák előkészítése

Az agardiffúziót tálcákon végezzük a standard oldat négy koncentrációjával (S8, S4, S2, S1), és a vizsgálati oldat négy koncentrációjával (U8, U4, U2, U1). A kivonat és a standard oldatok négy-négy koncentrációját minden tálcára egyaránt fel kell vinni. Ennek megfelelően olyan tálcákat válasszunk, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy legalább nyolc, 10-13 mm átmérőjű és középpontjukkal egymástól nem kevesebb, mint 30 mm-re lévő lyukat lehessen készíteni az agar táptalajon. A tesztet olyan tálcákon is el lehet végezni, amelyek egy üveglapból és az arra ráhelyezett 200 mm átmérőjű és 20 mm magas alumínium vagy műanyag gyűrűből állnak.

Öntsük a tálcákra a 8.1. szerint beoltott értékmérő táptalaj (4.2.) olyan mennyiségét, amely körülbelül 2 mm vastagságú réteget képez (60 ml egy 200 mm átmérőjű tálcán). Hagyjuk, amíg egyenletes eloszlásban megszilárdul, majd fúrjuk bele a lyukakat, és helyezzük beléjük a vizsgálati és a standard oldat pontosan kimért mennyiségeit (0,10-0,15 ml között lyukanként, az átmérőtől függően). Minden koncentrációt legalább négyszer alkalmazzunk, hogy minden meghatározás 32 gátlási zóna értékeléséhez legyen kötve.

8.3. Inkubálás

A tálcákat 35-37 °C-on körülbelül 18 óráig inkubáljuk.

9. ÉRTÉKELÉS

Mérjük meg a zónák átmérőjét 0,1 mm-es pontossággal. Jegyezzük fel a középértékeket minden koncentráció esetén féllogaritmusos papíron, amely a koncentrációk logaritmusát a gátlási zónák átmérőjéhez viszonyítva mutatja. Szerkesszük meg a "legjobban illeszkedő" vonalakat a standard oldat és a kivonat esetében egyaránt, például az alább megadottak szerint.

A következő képlet használatával határozzuk meg a standard legalacsonyabb szinthez (SL) tartozó "legjobban illeszkedő" pontot:

SL =

10

A következő képlet használatával határozzuk meg a standard legmagasabb szinthez (SH) tartozó "legjobban illeszkedő" pontot:

SH =

10

Hasonlóképpen számítsuk ki a kivonat "legjobban illeszkedő" legalacsonyabb (UL) és legmagasabb (UH) pontjait, a fenti képletekben S1, S2, S4 és S8 helyére U1, U2, U4 és U8 behelyettesítésével.

A kiszámított SL- és SH-értékeket jegyezzük fel ugyanarra a milliméterpapírra, majd kössük össze őket, hogy megkapjuk a standard oldat "legjobban illeszkedő" vonalát. Hasonlóképpen vigyük fel az UL- és az UH-értékeket is, majd kössük össze őket, hogy megkapjuk a kivonat "legjobban illeszkedő" vonalát.

Interferencia hiányában a vonalaknak párhuzamosnak kell lenniük. Gyakorlati szempontból a vonalakat párhuzamosnak tekinthetjük, ha az (SH-SL) és az (UH-UL) értékek nem térnek el 10 %-nál nagyobb mértékben az átlagértéküktől.

Ha a vonalakat nem találjuk párhuzamosnak, az U1 és S1 vagy az U8 és S8 elvethető, és az SL, SH, UL és UH értékeket az alternatív képlettel számolhatjuk, amely alternatív "legjobban illeszkedő" vonalakat ad:

a')SL = 5S1 + 2S2 − S46 | vagy | 5S2 + 2S4 − S86 |

b')SH = 5S4 + 2S2 − S16 | vagy | 5S8 + 2S4 − S26 |

és hasonlóképpen számolhatjuk az UL- és UH-értékeket is. Az alternatív "legjobban illeszkedő" vonalak párhuzamosságát is az előzőekhez hasonlóan ellenőrizni kell. Azt a tényt, hogy az eredményt három szintből számoltuk, jelezni kell a zárójelentésben.

Ha a vonalak párhuzamosnak tekinthetőek, a relatív aktivitás logaritmusát (log. A) a következő képlet segítségével számítjuk ki:

Négy szint esetén

log A =

U

+ U

+ U

+ U

− S

− S

− S

− S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Három szint esetén

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

4 × 0,401U4 + S4 − U1 − S1

vagy

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

8 × 0,401U8 + S8 − U2 − S2

Valódi aktivitás = feltételezett aktivitás x relatív aktivitás.

Haa relatív aktivitás a 0,5-2,0 sávon kívül esik, ismételjük meg a vizsgálatot a kivonat-koncentrációk, vagy ha ez nem lehetséges, a standard oldatok megfelelő kiigazításával. Ha a relatív aktivitást nem lehet a kívánt sávon belülre hozni, minden kapott eredményt hozzávetőlegesnek kell tekinteni és ezt a zárójelentésben meg kell jegyezni.

Ha a vonalak nem tekinthetőek párhuzamosnak, ismételjük meg a meghatározást. Ha a párhuzamosságot továbbra sem sikerül elérni, a meghatározást nem kielégítőnek kell tekinteni.

10. ISMÉTELHETŐSÉG

Ugyanazon személy által, ugyanazon a mintán végzett két meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

- a monenzin-nátrium-tartalom legmagasabb értékéhez viszonyított 20 %-ot 10-25 mg/kg tartalom esetén,

- az 5 mg/kg-ot abszolút értékben, ha a tartalom 25 és 50 mg/kg között van,

- a legmagasabb értékhez viszonyított 10 %-ot 50 mg/kg feletti tartalom esetén.

[1] Más módszerek is használhatók, ha azokról megállapították, hogy hasonló spóraszuszpenziókat eredményeznek.

[2] Bármely kereskedelemben kapható táptalaj használható, amely hasonló összetételű és ezzel megegyező eredményeket ad.

[3] 1 mg monenzin-nátrium 1000 UK egységnek felel meg.

[4] Más módszerek is használhatók, ha azokról megállapították, hogy hasonló spóraszuszpenziókat eredményeznek.

[5] Bármely kereskedelemben kapható táptalaj használható, amely hasonló összetételű és ezzel megegyező eredményeket ad.

--------------------------------------------------