Hivatalos Lap L 248 , 30/09/1996 o. 0001 - 0230



A Bizottság 96/54/EK irányelve (1996. július 30.) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonkettedik hozzáigazításáról (EGT vonatkozású szöveg) AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre, tekintettel a legutóbb a 94/69/EK bizottsági [1] irányelvvel módosított, a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1967 június 27-i 67/548/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 28. cikkére, mivel a 67/548/EGK irányelv I. melléklete tartalmaz egy listát a veszélyes anyagokról, osztályozásukról, címkézésükről, (ahol értelmezhető) koncentrációhatárokkal való jellemzésükről és egyéb paramétereikről, annak céljából, hogy az egészségi és környezeti kockázat értékelhető legyen; mivel az I. mellékletben közölt veszélyes anyagok listáját a jelenlegi tudományos és műszaki kutatások eredményeihez hozzá kell igazítani; mivel ezért a korábbi I. mellékletet előszavát módosítani szükséges, hogy az tartalmazza a készítmények címkézésére vonatkozó megjegyzéseket; mivel szükséges a szerves anyagok egy új csoportjának a B. táblázatba való beillesztése; mivel az I. mellékletben található lista a veszélyes anyagokról tartalmaz olyan anyagokat is, amelyek tekintetében Ausztria, Finnország és Svédország csatlakozási okmánya alapján lehetősége van Ausztriának és Svédországnak az osztályozásra és címkézésre vonatkozó előírásoktól átmenetileg eltérni; mivel a csatlakozási okmány rendelkezik ezen anyagok osztályozására és címkézésére vonatkozó előírások felülvizsgálatáról; mivel ennek megfelelően szükség volt egyes anyagok osztályozásának felülvizsgálatára; mivel a 67/548/EGK irányelv III. melléklete tartalmazza a veszélyes anyagok és készítmények veszélyeinek/kockázatainak jellegére utaló tájékoztatást (R-mondatok); mivel be kell vezetni egy jelzést, amely bizonyos anyagok és készítmények belélegzésekor fennálló veszélyre figyelmeztet; mivel a 67/548/EGK irányelv V. melléklete megállapítja az anyagok és készítmények fizikai-kémiai tulajdonságainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására szolgáló módszereket; mivel szükséges e mellékletet a műszaki fejlődéshez hozzáigazítani; mivel a 67/548/EGK irányelv VI. melléklete útmutatót tartalmaz veszélyes anyagok és készítmények osztályozásához és címkézéséhez; mivel be kell vezetni az egészséget a belélegzéskor veszélyeztető anyagokra és készítményekre vonatkozó kritériumokat; mivel módosítani kell az érzékenységet okozó anyagok és készítmények kritériumait; mivel a propán, bután és a cseppfolyósított petróleum gáz (LPG) tartályának címkézésére kritériumokat kell bevezetni; mivel ezen irányelv rendelkezései összhangban vannak a veszélyes anyagok és készítmények kereskedelme technikai akadályainak felszámolásáról szóló irányelveknek a műszaki fejlődéshez történő hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével, ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET: 1. cikk A 67/548/EGK irányelv a következőképpen módosul: 1. Az I. melléklet a következőképpen módosul: a) Az előszó 4. megjegyzése helyébe a következő megjegyzés lép: "4. megjegyzés: Ezen anyagokat tartalmazó készítményeket ártalmas anyagként, R65-el kell osztályozni, ha a IV. melléklet 3.2.3. szakaszában megadott kritériumoknak megfelelnek."; b) a következő 5. megjegyzéssel egészül ki a szöveg: "5. megjegyzés A gázhalmazállapotú készítmények koncentrációhatára térfogatszázalékban kifejezett."; c) a 67/548/EGK irányelv I. melléklete előszavának B. táblázatába a következő, szerves anyagokkal kapcsolatos speciális osztályozással egészül ki: +++++ TIFF +++++ d) ezen irányelv I. mellékletében közölt tételek a megfelelő tételek helyébe lépnek; e) ezen irányelv II. mellékletének tételeivel egészül ki a szöveg; f) a következő sorszámú tételeket el kell hagyni: 008-002-00-3 612-045-00-9 648-011-00-5 648-025-00-1 648-157-00-X 648-158-00-5 648-159-00-0 649-192-00-3 g) ezen irányelv III. mellékletében közölt tételekben az "R 22"-es hivatkozás helyébe az "R 65"-ös lép. 2. A III. melléklet a következő R-mondattal egészül ki: +++++ TIFF +++++ 3. Az V. melléklet B. része a következőképpen módosul: a) A toxicitás meghatározásának módszerei című B. rész címének és általános bevezetésének helyébe ezen irányelv IV.A. mellékletének szövege lép; b) a B. fejezet 1a) pontja szerint ezen irányelv IV.B. mellékletével egészül ki a szöveg; c) ezen irányelv IV.C. melléketének szövege a B.6. fejezet helyébe lép; d) ezen irányelv IV.D. melléketének szövege a B.7. fejezet helyébe lép; e) a szöveg ezen irányelv IV.E. melléketével egészül ki. 4. A VI. melléklet ezen irányelv V. mellékete szövegének megfelelően módosul. 2. cikk (1) A tagállamok a (2) bekezdést figyelembe véve legkésőbb 1998. május 31-ig hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti, és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. (2) A tagállamok legkésőbb 1997. október 31-ig hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti, és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ezen irányelv V. melléklete F., I. és J. pontjának megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. (3) Amikor a tagállamok elfogadják az (1) és (2) bekezdésben említett rendelkezéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg. 3. cikk Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba. 4. cikk Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei. Kelt Brüsszelben, 1996. július 30-án. a Bizottság részéről Ritt Bjerregaard a Bizottság tagja [1] HL L 381., 1994.12.31., 1. o. [2] HL L 196., 1967.8.16., 1. o. -------------------------------------------------- ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III Index szám +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- IV. A. MELLÉKLET " B. RÉSZ: MÓDSZEREK A TOXICITÁS ÉS EGYÉB EGÉSZSÉGÜGYI HATÁSOK MEGHATÁROZÁSÁRA ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS: B. RÉSZ A. ÉRTELMEZŐ MEGJEGYZÉSEK Ezen általános bevezetés alkalmazásakor a következő számozás alkalmazandó: B.15. Génmutáció – Saccharomyces cerevisiae B.16. Mitotikus rekombináció – Saccharomyces cerevisiae B.17. Emlős sejtek in vitro génmutációs vizsgálata B.18. DNS sérülés és javítás – nem tervezett DNS-szintézis – emlős sejteken in vitro B.19. In vitro testvér kromatida kicserélődés vizsgálat B.20. Nemhez kötött recesszív letális mutáció vizsgálat a Drosophila melanogasterben B.21. In vitro emlőssejt-transzformációs vizsgálat B.22. Domináns letális vizsgálat rágcsálókon B.23. Emlőscsírasejtek in vivo citogenetikai vizsgálata B.24. Egérbundafolt-vizsgálat B.25. Transzlokációs vizsgálat egereken B.26. Szubkrónikus orális toxicitás-vizsgálat: 90 napos, rágcsáló fajok felhasználásával végzett vizsgálat B.27. Szubkrónikus orális toxicitás-vizsgálat: 90 napos, nem rágcsáló fajok felhasználásával végzett vizsgálat B.28. Szubkrónikus toxicitás-vizsgálat bőrön át történő adagolással: 90 napos, rágcsáló fajok felhasználásával végzett vizsgálat B.29. Szubkrónikus toxicitás-vizsgálat inhalációs adagolással: 90 napos, rágcsáló fajok felhasználásával végzett vizsgálat B.30. Krónikus toxicitás-vizsgálat B.31. Teratogenitás vizsgálata – rágcsáló és nem rágcsáló fajokon B.32. Karciogenitás vizsgálat B.33. Összetett, krónikus toxicitás/karciogenitás vizsgálat B.34. Reprodukciós toxicitás-vizsgálat egy nemzedék alatt B.35. Reprodukciós toxicitás-vizsgálat két nemzedék alatt B.36. Toxikokinetika B. ÁLTALÁNOS MEGHATÁROZÁSOK AZ E MELLÉKLETBEN HASZNÁLT VIZSGÁLATI MÓDSZEREK FOGALMAIHOZ i. Akut toxicitás: azokat az ártalmas hatásokat jelenti, amelyek adott időtartamon belül lépnek fel (általában 14 nap), az anyag egyetlen dózisának beadása után. ii. Nyilvánvaló toxicitás: a vizsgált anyag beadását követően jól látható mérgezési tüneteket leíró általános meghatározás. Ezt a leírást úgy kell megadni, hogy segítségével értékelhető legyen a veszély és jelezze azt, hogy a beadott dózis növekedése esetén súlyos mérgezési tünetek kifejlődése, illetve a lehetséges halálozás várható. iii. Dózis: a vizsgált anyag beadott mennyisége. A dózis mennyiségét tömegben (gramm vagy milligramm), vagy a vizsgált anyag és a vizsgált állat súlyának hányadosában (pl. milligramm anyag/testsúly kilogramm), vagy állandó táplálékbeli koncentráció formájában (ppm, vagy milligramm/táplálékkilogramm) fejezik ki. iv. Legnagyobb nem halálos dózis (discriminating dose): a négy adott (előre meghatározott) adagolási szint közül a legmagasabb, amelynek beadása még nem okoz a vizsgált anyaggal összefüggő halált (beleértve az állatvédelmi okokból való elpusztítást is). v. Adagolás: általános meghatározás, ami a dózist, az adagolás gyakoriságát és időtartamát tartalmazza. vi. LD50 (közepes halálos dózis): a vizsgált anyag statisztikailag megállapított egyszeri olyan dózisa, amely várhatóan a vizsgált állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD50 érték a vizsgált anyag tömegének és a kísérleti állat tömegének hányadosában kifejezett (milligramm/kilogramm). vii. LC50 (középes halálos koncentráció): az anyag statisztikailag megállapított koncentrációja, amely várhatóan, az expozíció alatt, vagy az után meghatározott időn belül a vizsgált állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LC50 érték a vizsgált anyag tömege és a levegő standard térfogatának hányadosaként (milligramm/liter) kifejezett. viii. NOAEL: a "nem észlelhető kedvezőtlen hatás szint" (no observed adverse effect level) rövidítése, és azt a legmagasabb adagolási szintet vagy koncentrációt jelöli, amelynél nem észlelhető a kezeléssel összefüggésben lévő kedvezőtlen hatás. ix. Toxicitás ismételt adagolásnál/szubkrónikus toxicitás: összefoglalja a kísérleti állatoknál fellépő ártalmas hatásokat, amelyeket egy vegyi anyag ismétlődő, napi adagolása, vagy expozíciója okoz. A vizsgálat időtartama rövid, tekintettel a kísérleti állatok várhatóan rövid élettartamára. x. Maximális elviselhető dózis (MTD): az a legnagyobb dózis, amely kiváltja a toxicitás tüneteit az állatokon, de nem befolyásolja jelentősen a túlélést a vizsgálat során. xi. Bőrirritáció: gyulladásos elváltozások a bőrön a vizsgált anyag alkalmazását követően. xii. Szemirritáció: elváltozások a szemben a vizsgált anyagnak a szem felületén való alkalmazása után. xiii. Bőr érzékennyé tétele: (allergén kontakt dermatitis) a vizsgált anyagra adott, az immunrendszer által irányított bőrreakció. xiv. Bőr kimaródás: visszafordíthatatlan szövetkárosodás a bőrön a vizsgált anyag 3 perc és 4 óra közötti időtartamú alkalmazását követően. xv. Toxikokinetika: a vizsgált anyag felszívódásának, eloszlásának, metabolizmusának és kiválasztásának vizsgálata. xvi. Felszívódás: az a folyamat, amely során a beadott anyag bejut a szervezetbe. xvii. Kiválasztás: az a folyamat, amely során a beadott anyag és/vagy annak bomlástermékei elhagyják a szervezetet. xviii. Eloszlás: az a folyamat, amely során a felszívódott anyag és/vagy annak bomlástermékei eloszlanak a testben. xiv. Metabolizmus: az a folyamat, amely során a szervezetben a beadott anyag szerkezete enzimatikus vagy nem enzimatikus folyamatban megváltozik. B.I. Akut toxicitás, toxicitás ismételt adagolásnál/szubkrónikus toxicitás és krónikus toxicitás Egy anyag akut toxicitásának valamint valamely szervre vagy a szervezetre gyakorolt toxicitás kiértékelése számos toxicitás-vizsgálat segítségével végezhető el (B.1-B.5 módszerek), amelyek alapján egy egyszeres dózist követő toxikus hatás jellege előzetesen megállapítható. Az anyag toxicitásától függően, határérték-vizsgálati eljárás vagy a teljes LD50 elvégzésének lehetőségét lehet mérlegelni, még abban az esetben is, ha az inhalációs toxicitáshoz nem határozható meg határérték-vizsgálat, mert nem lehetett az egyszeri belélegzés expozíció határértékét megállapítani. Meg kell fontolni azokat a módszereket, amelyekben a lehető legkevesebb állatot alkalmazzák, és amelyek minimálisra csökkentik az állatok szenvedését, mint például a rögzített dózisú módszer (B.1 bisz módszer) és az akut toxikus osztály módszer (B.1 trisz módszer). Az 1. szintű vizsgálat esetében egy másik fajon végzett tanulmány teheti teljessé az első tanulmányból levont következtetéseket. Ebben az esetben egy szabványos vizsgálati módszer alkalmazható, vagy a módszert kisebb számú állathoz kell megfelelően hozzáigazítani. Az ismételt adagolással végzett toxicitás-vizsgálat (B.7., B.8. és B.9. módszer) értékeli a toxikus hatásokat az ismételt expozíció esetén. Kiemelt fontosságú az állatok alapos klinikai megfigyelése, a lehető legtöbb adat összegyűjtése érdekében. E vizsgálatok segítenek a toxikus hatások célszerveinek, illetve a toxikus és nem toxikus dózisok meghatározásában. E szempontoknak további, alaposabb kutatására lehet szükséges a hosszú távú tanulmányok során (B.26.–B.30. és B.33. módszer). B.II. Mutagenitás, genotoxicitás A mutagenitás a sejtek vagy szervezetek génállományának mennyiségében, vagy szerkezetében bekövetkező állandó, örökölhető változások indukciójára vonatkozik. Ezek a változások, "mutációk" létrejöhetnek egyetlen génen, egy génszakaszon, géncsoporton, vagy az egész kromoszómán. Az egész kromoszómát érintő hatások lehetnek szerkezetiek és/vagy számszerűek. Egy anyag mutagén hatása in vitro vizsgálatokkal megbecsülhető baktériumokban a gén (pont) mutáció tekintetében (B.13./14. módszer) és/vagy az emlős sejtek kromoszóma-szerkezeti elváltozására vonatkozóan (B.10. módszer). In vivo eljárások is elfogadhatóak, mint pl. a mikronukleusz-vizsgálat (B.12. módszer) vagy a csontvelősejtek metafázis analízise (B.11. módszer). Mindazonáltal ellenjavaslat hiányában az in vitro módszerek mindenképpen előnyben részesülnek. A mutagenitás tanulmányozására vagy a rákkeltő hatás előzetes kiszűrésére további vizsgálatok lehetnek szükségesek nagyobb termelési mennyiség esetében és/vagy a kockázat felbecslésére. Ezek a vizsgálatok számos célra szolgálnak: az alapvizsgálatok eredményeinek alátámasztására; az alapadatoknál nem vizsgált végpontok tanulmányozására; ill. mélyebbre ható, komolyabb in vivo vizsgálat elvégzésére. E célok érdekében a B.15.–B.25. módszerek eukarióta rendszereken végzett in vivo és in vitro vizsgálatokat is magukban foglalják, illetve nagy számban tartalmaznak biológiai végpontokat is. Ezek a vizsgálatok tájékoztatást adnak a pontmutációról és az olyan szervezetekben lévő egyéb végpontokról, amelyek összetettebbek, mint az alapvizsgálatok során alkalmazott baktériumok. Általános szabály, hogy egy további mutagenitás-vizsgálati program beindítása esetén azt úgy tervezik meg, hogy további lényeges tájékoztatást adjon a vizsgált anyag mutagén és/vagy rákkeltő hatásával kapcsolatosan. Az, hogy a megadott vizsgálatok közül melyik a megfelelő egy adott esetben, számos tényezőtől függ: például az anyag kémiai és fizikai jellemzőitől, az elsőként elvégzett baktérium- és citogenetikai vizsgálatok eredményétől, az anyagcsereprofiltól, egyéb toxicitás-vizsgálatok eredményeitől és az anyag ismert alkalmazásaitól. A vizsgálatok menetrendjének szigorú ütemezése a fentiek értelmében és annak a fényében, hogy tényezők sokasága lehet megfontolás tárgya, nem ésszerű. A vizsgálati stratégia vonatkozásában néhány általános alapelvet megállapít a 93/67/EGK irányelv, de világos előírások a kockázatértékelés tekintetében technikai iránymutatásokban találhatók, amelyek rugalmasabban kezelhetőek és az adott egyedi körülményekhez illeszthetők. A további vizsgálatok módszerei azonban alább meg vannak adva, a genetikai végpont alapján csoportosítva: Tanulmányok a gén (pont)mutációk vizsgálatára a) Direkt vagy reverz mutáció vizsgálatok eukarióta mikroorganizmusok felhasználásával (Saccharomyces cerevisiae) (B.15. módszer) b) In vitro vizsgálatok emlős sejteken, a direkt mutációk tanulmányozása érdekében (B.17. módszer) c) Nemhez kötött recesszív letális mutáció vizsgálat a Drosophila melanogasteren (B.20. módszer) d) In vivo vizsgálat szomatikus (testi) sejteken:, egérbundafolt-vizsgálat (B.24. módszer) Kromoszóma-rendellenességeket vizsgáló tanulmányok a) Citogenetikus in vivo vizsgálat emlősökön; fontolóra kell venni a csontvelősejtek metafázisának in vivo elemzését akkor, ha azt nem végezték el az első vizsgálatok során (B.11. módszer). Lehetséges továbbá a csírasejtek in vivo citogenetikus vizsgálata (B.23. módszer). b) Citogenetikus in vitro vizsgálat emlőssejteken amennyiben azt nem végezték el az első vizsgálatok során (B.10. módszer). c) Domináns letális vizsgálat rágcsálókon (B.22. módszer). d) Örökölhető transzlokációs vizsgálat egereken (B.25. módszer). Genotoxikus hatások – a DNS-re gyakorolt hatások A genetikai anyagot potenciálisan veszélyeztető, a mutagenitással nem feltétlenül összekapcsolódó hatásként meghatározott genotoxicitás kimutatható a DNS károsításának előidézése által, a mutáció közvetlen bizonyítéka nélkül. Az ilyen vizsgálatokhoz alkalmasak lehetnek az eukarióta mikroorganizmusokat vagy emlőssejteket alkalmazó következő módszerek: a) Mitotikus rekombináció – Saccharomyces cerevisiae esetében (B.16. módszer) b) DNS sérülés és javítás – nem tervezett DNS-szintézis – emlőssejteken in vitro (B.18. módszer) c) In vitro testvérkromatida-kicserélődési vizsgálat emlőssejteken (B.19. módszer) Alternatív módszerek a lehetséges karcinogén hatás vizsgálatára Rendelkezésre áll az emlőssejtek transzformációs vizsgálata, amellyel mérhető egy anyag azon képessége, hogy morfológiai és kórszövettani változásokat okozzon a sejtkultúrákban, amelyek feltehetően kapcsolatba hozhatók a rosszindulatú transzformációval – in vivo. (B.21. módszer). Számos különböző sejttípus és transzformációs körülmény alkalmazható ezen vizsgálatokhoz. Örökölhető hatások kockázatának becslése emlősök esetében Rendelkezésre állnak módszerek a gén(pont)mutáció örökölhető hatásainak mérésére az emlősöknél, pl. a speciális génlokusz vizsgálat egereken, amelynek az a célja, hogy felismerhető legyen a csírasejt-mutáció az első nemzedékben, (nem része ennek a mellékletnek), vagy a kromoszóma-rendellenességek vizsgálata, pl. örökölhető transzlokációs vizsgálat egereken (B.25. módszer). Ilyen módszerek alkalmazhatóak egy anyag emberekre ható potenciális genetikai kockázatának megállapítása során. Mindazonáltal ezeknek a vizsgálatoknak az összetettségét figyelembe véve, és a szükséges állatok nagy számát tekintve, különösen a speciális génlokusz vizsgálatnál egerekkel, nyomós indokok szükséges ezeknek a vizsgálatoknak a lefolytatására. B.III. Rákkeltő hatás A kémia anyagok genotoxikus vagy nem genotoxikus rákkeltő anyagként jellemezhetők, a hatásuk feltételezett folyamata szerint. Első nyomravezető adat lehet egy anyag genotoxikus karcinogén tulajdonságaival kapcsolatban a mutagenitás/genotoxicitás-vizsgálat. További információ nyerhető az ismételt adagolású toxicitás-vizsgálatból, valamint a szubkrónikus és krónikus toxicitás-vizsgálatból. Az ismételt adagolású (B.7.) módszer szerinti toxicitás-vizsgálat és a hosszabb időtartamú ismételt adagolású tanulmányok magukba foglalják a kórszövettani változások értékelését, amelyek az ismételt adagolás során tapasztalhatóak, pl. hiperplázia egyes szövetekben, amik fontosak lehetnek. Ezek a vizsgálatok és a szerzett toxikokinetikai ismeretek segíthetnek azoknak az anyagoknak a meghatározásában, amelyek rákkeltő hatással rendelkezhetnek. Ezeknek a vegyületeknek további, mélyebbre ható vizsgálata szükséges lehet a karciogenitás vizsgálata során (B.32. módszer), vagy gyakran egy összetett krónikus toxicitás/karciogenitás vizsgálat során (B.33. módszer). B.IV. Reprodukciós toxicitás A reprodukciós toxicitás többféle módon állapítható meg, pl. a férfi és női szaporodási funkcióra ill. -képességre gyakorolt befolyás alapján, amit a "fertilitásra gyakorolt hatás" formájában azonosítanak, vagy a leszármazottak által nem örökölhető káros hatások kiváltása alapján, amit a "fejlődési toxicitás" formájában határoznak meg, ami tartalmazza a teratogenitást és a szoptatás tartama alatti hatásokat is. Teratogenitás tanulmányozása, mint a fejlődési toxicitás-vizsgálatok része (B.31. módszer), elsődlegesen a szájon át történő beadás esetére összpontosít. Emellett más adagolási módok is alkalmazhatók a vizsgált anyag fizikai tulajdonságaitól, vagy az emberi expozíció valószínű útjától függően. Ezekben az esetekben a vizsgálati módszert megfelelően alkalmazzák, figyelembe véve a 28 napos vizsgálati módszer mindenkori kritériumait. Ahol háromnemzedékes reprodukciós (fertilizációs) vizsgálat szükséges, ott a kétnemzedékes reprodukciós vizsgálatot (B.35 módszer) ki lehet terjeszteni a harmadik nemzedékre. B.V. Neurotoxicitás A neurotoxicitás többféle módon állapítható meg, pl. a központi vagy a perifériás idegrendszer működésbeli és/vagy biokémiai elváltozásai alapján. A neurotoxicitással kapcsolatos előzetes következtetések levonhatók az akut toxicitás-vizsgálatokból. Az ismételt adagolású toxicitás-vizsgálat (B.7. módszer) tartalmazza a neurotoxikus hatások értékelését. Az állatok alapos klinikai megfigyelésének szükségessége hangsúlyos a lehető legtöbb adat összegyűjtése érdekében. A módszer azt a célt szolgálja, hogy a potenciálisan neurotoxikus hatásokkal járó anyagok kiszűrése lehetővé váljon, és azokat esetleg beható vizsgálatoknak lehessen alávetni. Ezen túlmenően fontos megvizsgálni az anyagok speciális neurotoxikus hatások kiváltására vonatkozó képességét, mert ezek más toxicitás-vizsgálatok során esetleg nem felfedezhetők. Például egyes szerves foszforvegyületek a megfigyelések szerint késleltetett neurotoxicitáshoz vezethetnek, és a B.37. és B.38. módszer szerint egyszeri vagy ismételt adagolásos vizsgálattal kutathatók. B.VI. Immuntoxicitás Az immuntoxicitás többféle módon állapítható meg, pl. az immunszupresszióval és/vagy az immunrendszer reagálóképességének fokozásával eredő túlérzékenységgel, vagy kiváltott autoimmunitással. Az ismételt adagolású toxicitás-vizsgálat (B.7. módszer) tartalmazza az immuntoxikus hatások vizsgálatát. A módszer azt a célt szolgálja, hogy az immuntoxikus tulajdonságokkal rendelkező anyagok kiszűrése lehetővé váljon, és esetleg beható vizsgálatoknak lehessen őket alávetni. B.VII. Toxikokinetika A toxikokinetikai vizsgálatok segítenek a toxicitási adatok értelmezésében és kiértékelésében. Ezek a vizsgálatok a vizsgálandó kémiai anyagok toxicitásának egyes aspektusait világítják meg, és ennek a vizsgálatnak az eredménye támpontot adhat a további toxicitás-vizsgálatok megtervezéséhez. Nem cél minden esetben minden tényező meghatározása. Csak nagyon ritkán van szükség az összes toxikokinetikai vizsgálat (felszívódás, kiválasztás, eloszlás és metabolizmus) végrehajtására. Egyes vegyületek esetében adott körülmények között érdemes a vizsgálati sorozatban változásokat bevezetni, vagy pedig egyszeres adagolású vizsgálat elvégzése is elég lehet (B.36. módszer). A kémiai szerkezeti adatok (SAR) és a fizikai-kémiai tulajdonságok ugyancsak utalhatnak az adott adagolási mód, az anyagcsere-folyamatok és a szövetekben való eloszlás által meghatározott felszívódási jellemzőkre. Az előzetes toxikológiai és toxikokinetikai vizsgálatokból is származnak információk a toxikokinetikai tulajdonságokra. C. A VIZSGÁLT ANYAG JELLEMZÉSE A vizsgált anyag összetételét – beleértve a főbb szennyező-anyagokat és a lényeges fizikai-kémiai tulajdonságait, ill. az anyag stabilitását – a toxicitás-vizsgálat megkezdése előtt ismerni kell. A vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságai döntő fontosságúak az adagolási mód kiválasztásánál, az egyes vizsgálatok megtervezésénél, a vizsgált anyag kezelésénél és tárolásánál. A vizsgált anyagnak (amennyiben lehetséges, a legfontosabb szennyezésekkel együtt) az adagolási közegben és a biológiai anyagban történő mennyiségi és minőségi vizsgálatára vonatkozó analitikai módszer kifejlesztése megelőzi a vizsgálatok megkezdését. Az azonosításra, a fizikai-kémiai tulajdonságok meghatározására, a tisztaságra és a vizsgált anyag viselkedésére vonatkozó összes információnak szerepelnie kell a vizsgálati jelentésben. D. AZ ÁLLATOK GONDOZÁSA A környezeti feltételek szigorú szabályozása és az állatoknak a fajnak megfelelő gondozása nagyon lényeges a toxicitás-vizsgálatoknál. i. Tartási körülmények A kísérleti állatok elhelyezésének környezeti körülményit az adott faj igényeihez kell igazítani. Patkányok, egerek és tengerimalacok számára a megfelelő körülmények: 22±3oC szobahőmérséklet, 30–70 százalékos relatív páratartalom mellett; míg nyulak számára a megfelelő körülmények: 20±3oC hőmérséklet, 30–70 százalékos relatív páratartalom. Néhány kísérleti eljárás különösen érzékeny a hőmérsékleti hatásokra, ezekben az esetekben a megfelelő környezeti körülményekre vonatkazó részleteket a vizsgálati módszer leírása tartalmazza. A toxikus hatások kutatása során, a hőmérsékletet és a páratartalmat minden esetben figyelni és rögzíteni kell és meg kell adni a vizsgálati jelentésben. A világítás mesterséges, a világos és sötét szakaszok 12 óránként váltják egymást. A világításra vonatkozó adatokat feljegyzik és megadják a vizsgálati jelentésben. Hacsak a módszer leírásában más nem szerepel, az állatok egyenként tartandók, vagy kis, azonos nemű egyedekből álló csoportokban összezárhatók; csoportos tartás esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható. Az állatkísérletekről szóló jelentésében fontos megadni az állatok ketrecének típusát és az egyes ketrecekben tartott állatok számát, a vegyszer hatásának kitett időszak és az azt követő megfigyelés alatt egyaránt. ii. Etetési körülmények Az alkalmazott tápláléknak meg kell felelnie a vizsgált fajnak megfelelő, a táplálkozástudomány által meghatározott követelményeknek. Amikor a vizsgált anyagokat az állatok táplálékában adják be, akkor a tápértéket az anyag és a táplálék összetevőinek kölcsönhatása csökkentheti Egy ilyen kölcsönhatás lehetőségét figyelembe kell venni a vizsgálat eredményeinek értelmezése során. Hagyományos laboratóriumi táplálás alkalmazható korlátozás nélküli ivóvízellátással. A táplálék típusának kiválasztását befolyásolhatja, hogy a tápláléknak és a vizsgált anyagnak a megfelelő keverékét kell biztosítani, ha ilyen módon adagolják a vizsgált anyagot. A táplálék olyan szennyezései, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a toxicitást, nem lehetnek jelen zavaró nagyságú koncentrációban. E. ÁLLATVÉDELEM A vizsgálati módszer kidolgozása során megfelelő figyelmet kell fordítani az állatok védelmére. Néhány példa a következőkben röviden le van írva, de ez a lista nem részletes. A pontos megfogalmazást és/vagy körülményeket az egyes módszerek szövegében lehet megtalálni. - Az akut orális toxicitás meghatározására két módszer áll rendelkezésre: a "Rögzített dózisú módszer" és az "Akut toxikus osztály módszer". A "Rögzített dózisú módszer" nem alkalmazza a halált mint különös végpontot, és kevesebb állatra van szükség hozzá. Az "Akut toxikus osztály módszer" átlagosan 70 százalékkal kevesebb állatot alkalmaz, mint a B.1. módszer szerinti akut orális toxicitás-vizsgálat. Mindkét módszer kevesebb szenvedéssel és fájdalommal jár, mint a hagyományos eljárások. - A vizsgálathoz felhasznált állatok száma a tudományosan elfogadható minimumra csökkentett: a B.1. és B.3. módszerek alkalmazása során csak 5 azonos nemű állatot vizsgálnak dózisszintenként; csak 10 állatot (valamint a negatív ellenőrző csoportban csak 5 állatot) használnak a bőr érzékennyé tételének meghatározásához a B.6. módszer szerinti tengerimalac legerősebb ingerlési vizsgálatban; a pozitív ellenőrző csoporthoz szükséges állatok száma ugyancsak csökkent az in vivo mutagenitás vizsgálatokban (B.11. és B.12. módszer). - Az állatok a vizsgálatok során fájdalomnak és szenvedésnek vannak kitéve: a súlyos és tartós fájdalom jeleit mutató állatokat az állatvédelem szabályainak megfelelő módon a vizsgálat befejezése előtt el lehet pusztítani; a vizsgált anyagok olyan dózisaival, amelyek közismerten jelentős szenvedést és fájdalmat okoznak maró vagy irritatív tulajdonságuk miatt, nem szükséges vizsgálatot végrehajtani (B.1., B.2. és B.3. módszer). - E kísérletek szempontjából nézve túlzottan nagy dózissal történő kísérletezés elkerülhető határérték-vizsgálatok elvégzésével, ez nemcsak az akut toxicitás-vizsgálatokra vonatkozik (B. 1., B.2. és B.3. módszer), hanem az in vivo mutagenitás vizsgálatokra is (B.11. és B.12. módszer). - Amennyiben elegendő tudományos bizonyíték áll rendelkezésre lehetséges az, hogy az irritatív hatásokat kutató vizsgálatot egyátalán ne folytassák le, vagy azt egyetlen kísérleti állatra korlátozzák. Ilyen tudományos bizonyítékok alapjául szolgálhatnak a vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságai, más, már elvégzett vizsgálatok eredményei és a jóváhagyott in vitro vizsgálatok eredményei. Például ha a bőrön történő adagolással elvégzett akut toxicitás-vizsgálat végrehajtása az anyag határérték-vizsgálati adagolásával történik (B.3. módszer), és nem észleltek bőrirritációt, akkor e terület további vizsgálata (B.4. módszer) szükségtelen lehet; azokat az anyagokat, amelyek a bőrvizsgálatok tanúsága szerint maró hatásúak, vagy erősen irritatívak (B.4. módszer) nem kell a szemet ingerlő hatás tekintetében vizsgálni (B.5 módszer). F. ALTERNATÍV VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Az Európai Unió tudományos célja olyan alternatív módszerek kifejlesztése és jóváhagyása, amelyek az ismereteket ugyanolyan szinten biztosítják, mint a jelenlegi állatkísérletek, azonban kevesebb állatot használnak fel, kevesebb szenvedést okoznak az állatoknak vagy teljesen kiküszöbölik az állatok alkalmazását. Ilyen módszerek alkalmazását (amint elérhetővé válnak), ahol csak lehet, meg kell fontolni, a veszély jellemzésével, az azt követő osztályozással, címkézéssel és az anyag belső tulajdonságaiból adódó veszély jelölésével kapcsolatos eljárásokban. G. KIÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS A vizsgálatok kiértékelésekor és értelmezésekor figyelembe kell venni azt, hogy az állati és az in vitro vizsgálatok eredményét milyen mértékben lehet közvetlenül kiterjeszteni az emberre, és ezért az emberre káros hatás bizonyítékait, ahol rendelkezésre állnak, fel lehet használni a vizsgálati eredmények megerősítésére. Ezek az eredmények felhasználhatók az új és a meglévő vegyi anyagok osztályozására és címkézésére az emberi egészségre való hatással kapcsolatosan, támaszkodva a vegyi anyagok jellemző tulajdonságaira, amelyeket ezekkel a módszerekkel megállapítottak és mennyiségileg jellemeztek. A VI. mellékletnek az osztályozásra és a címkézésre vonatkozó megfelelő kritériumai vonatkoznak a vizsgálati jegyzőkönyvnek azokra a végpontjaira is, amelyeket ezek a vizsgálati módszerek tartalmaznak. Ezeket az eredményeket fel lehet használni a kockázat értékelési tanulmányok során, új és meglévő vegyi anyagokhoz; az ezeknek a céloknak megfelelő vizsgálati startégiák a megfelelő iránymutatásokban találhatók. H. SZAKIRODALOM Ezeknek a módszereknek a többségét a Vizsgálati irányelvek elnevezésű OECD-program keretében fejlesztették ki, és azokat a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat alapelveivel összhangban kell alkalmazni, az "adatok kölcsönös elfogadásának" széles körű biztosítása érdekében. További tájékoztatás található az OECD-irányelvekben megadott szakirodalom jegyzékekben, illetve az egyéb helyeken kiadott vonatkozó irodalomban. " -------------------------------------------------- IV. B. MELLÉKLET " B.1. trisz AKUT TOXICITÁS (ORÁLIS) AKUT TOXICITÁS OSZTÁLY MÓDSZER 1. MÓDSZER 1.1. Bevezetés Az akut toxicitás osztály módszere tájékoztatást nyújt mind a veszély becsléséhez, mind a veszély osztályozásához. A módszer három előre meghatározott dózist használ, amelyek úgy vannak kialakítva, hogy a vizsgálat eredményei alapján az anyagot osztályozni lehessen. Az e vizsgálati módszerben megadott eljárás emellett lehetőséget ad három további, előre meghatározott (tartalék)dózis kiválasztására, amelyek vagy alternatív lehetőségként használhatók meghatározott döntési helyzetekben, vagy további vizsgálat lehetőségét adják. Bármely (tartalék)dózis használata megfontolás tárgya lehet, amikor a vizsgálat finomítása válik kívánatossá vagy szükségessé. Ennél a módszernél meghatározott kezdeti dózisokat alkalmaznak. Az LD50 pontos értékének meghatározása nem cél. A módszer lehetővé teszi annak az expozíciós tartománynak a meghatározását, amikor halálozás várható, mivel az állatok egy része esetében ebben a vizsgálatban továbbra is a halál a vizsgálat jellemző végpontja. A vizsgálat eredményei lehetőséget biztosítanak a VI. melléklet szerinti kritériumok alapján történő osztályozáshoz. A folyamat szekvenciális jellege miatt a vizsgálat időtartama hosszabb lehet, mint a B.1.-ben leírt eljárásé. E módszernek a legfontosabb előnye, hogy alkalmazásához kevesebb állatra van szükség, mint akár az akut toxicitás (orális) (B.1.) akár a rögzített dózisú módszer (B.1. bis) esetében. Lásd továbbá a B. rész Általános bevezetését. 1.2. Fogalommeghatározások Lásd az Általános bevezetés B: részét. 1.3. A vizsgálati módszer alapelve Az anyagot szájon át adagolják a kísérleti állatok egy csoportjának, a meghatározott dózisok egyike szerint. Az anyagot lépésenként vizsgálják az eljárás folyamán, minden lépésben három azonos nemű állatot használva. Nem szükséges előzetes dózisbehatároló-vizsgálatot végezni. Az anyag hatására az adott lépésben alkalmazott adagolással összefüggésben bekövetkező halálozás, vagy annak hiánya határozza meg a következő lépést: - nincs szükség további vizsgálatra, - a következő lépést azonos adagolással hajtják végre, azonban ellentétes nemű állatokon, - a következő lépést a következő nagyobb vagy kisebb adaggal hajtják végre. 1.4. A vizsgálati módszer leírása 1.4.1. Előkészületek A véletlenszerűen kiválasztott egészséges, fiatal, felnőtt állatokat az egyedi azonosíthatóság céljából meg kell jelölni, és legalább öt napig a ketrecükben kell őket tartani a vizsgálat megkezdése előtt, a laboratóriumi körülményekhez való hozzászoktatás céljából. Az állatokat el lehet helyezni csoportosan nemek ill. adagolás szerint, de az egy ketrecben tartott állatok száma nem akadályozhatja az egyes állatok külön-külön történő megfigyelését. A vizsgált anyagot egyszeri dózisban adják be az állatoknak gyomorszonda vagy errre a célra alkalmas intubációs kanül segítségével. Ha szükséges, akkor a vizsgált anyagot valamely alkalmas oldószerben feloldják vagy szuszpendálják. Ha lehetséges, elsősorban a vizes oldat/szuszpenzió használata javasolt, másodikként az olajos (pl. kukoricaolaj) oldat/szuszpenzió használata javasolt, és ezt követheti a másfajta oldószerekben történő feloldás. Ha az oldószer nem vizes, akkor az oldószer toxikus tulajdonságainak ismertnek kell lenniük, vagy ha azok nem ismertek, akkor a toxikus tulajdonságokat a vizsgálat előtt meg kell határozni. Az állatok a vizsgált anyag beadása előtt nem kaphatnak táplálékot (pl. patkányokat egész éjszaka, egereket 3–4 óráig koplaltatni kell); a vizet nem szabad megvonni. 1.4.2. Vizsgálati körülmények 1.4.2.1. A kísérlethez felhasznált állatok Ellenjavaslat hiányában a patkány a javasolt rágcsáló faj. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek és vemhesek. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan térjen el egymástól és a nemenkénti átlagos értéktől legfeljebb ±20 %-al különbözhet. 1.4.2.2. Az állatok száma és neme Minden lépésben három azonos nemű állatot alkalmaznak. Az első lépésben bármelyik nemű állatok vizsgálhatók. 1.4.2.3. Adagolási szintek A kezdő dózist a három előre meghatározott dózis közül választják ki, amelyek 25, 200 és 2000 mg/kg testsúly vizsgált anyag adagolását jelentik. Kezdő dózisnak azt az adagot választják, amelyik legvalószínűbben okoz halált, legalább a kezelt állatok egy része esetében. A kezdő adagolástól függően alkalmazható az 1. mellékletben megadott valamelyik eljárás folyamatábrája. A kezdő dózis és a nem kiválasztásához minden elérhető információt figyelembe kell venni, beleértve a szerkezethatás viszonyról rendelkezésre álló ismereteket is. Ha a rendelkezésre álló ismeretek alapján a halálozás a legnagyobb dózis (2000 mg/kg testsúly) esetén is valószínűtlen, akkor határérték-vizsgálatot kell végezni. Ha a vizsgált anyagról semmiféle ismeretek nem állnak rendelkezésre, akkor állatvédelmi okokból ajánlatos a 200mg/kg testsúly kezdeti dózist alkalmazni. Egyes esetekben kívánatos lehet a három előre meghatározott dózis (25, 200, 2000 mg/kg testsúly) alkalmazásával kapott ismereteknél részletesebb információk megszerzése. Ezen esetekben mérlegelni lehet három további előre meghatározott dózis, az 5 mg/kg testsúly, az 50 mg/kg testsúly és az 500 mg/kg testsúly alkalmazását további vizsgálatok során. A vizsgált anyagok olyan dózisait, amelyek közismerten jelentős szenvedést és fájdalmat okoznak maró vagy irritatív tulajdonságuk folytán, nem szükséges beadni. A kezelési fázisok közötti időtartam hosszúságát a mérgezési tünetek jelentkezésének kezdő időpontja, azok súlyossága és időtartama határozza meg. A másik nemű állatokkal, vagy a következő dózissal való kísérletezést akkor lehet megkezdeni, amikor az előző kezelés túlélési aránya megbízhatóan meghatározható. 1.4.2.4. Határérték-vizsgálat A 2000 mg/kg testsúly vizsgálati szinten határérték-vizsgálatot lehet végezni három állaton, mindkét nem esetében. Ha az anyaggal összefüggésben halálozások történtek, akkor további vizsgálatot lehet folytatni 200 mg/kg testsúly (vagy 500 mg/kg testsúly) adagolással. 1.4.2.5. Megfigyelés A megfigyelési időszak általánosan 14 nap, azon állatok kivételével, amelyekkel való kísérletezést a vizsgálat vége előtt befejezik, vagy ugyanezen okokból elpusztítják őket, vagy amelyek elpusztulnak. Mindazonáltal a megfigyelés tartama nincsen mereven rögzítve, függ a toxikus reakciók fajtájától, a toxikus tünetek jelentkezésének időpontjától és a felépülési időtartam hosszától. A megfigyelési időszakot meg lehet hosszabbítani, amennyiben erre szükség van. Az az időpont, amikor a toxikus tünetek fellépnek és ismételten megszűnnek, nagyon fontos, különösen, ha a toxikus tünetek késleltetett jelentkezése megfigyelhető. Minden megfigyelést módszeresen feljegyeznek, oly módon, hogy minden állatról külön feljegyzést vezetnek. 1.4.3. A kísérlet végrehajtása Az állatok testsúlyát a koplaltatás befejezését követően, de a vizsgált anyag beadása előtt, megmérik. A vizsgált anyag beadása után a táplálékot további 3-4 órára vissza lehet tartani. Ha a dózist adott időtartamon belül részletekben adják be, szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak, függően az időtartam hosszától. Az egy alkalmommal beadható folyadék legnagyobb mennyisége a vizsgált állat méretétől függ. Rágcsálók esetében a beadott folyadék térfogata általában ne haladja meg az 1 ml/100 g testsúly értéket; vizes oldatok esetében azonban a 2 ml/100 g testsúly mennyiség beadását is mérlegelni lehet. A vizsgálatok között a térfogat változását a legkisebbre csökkentik, a koncentráció esetenkénti beállításával biztosítják az egyes dózisszintek esetében az azonos térfogatot. Ha egyetlen dózisban nem lehetséges beadni a vizsgált anyagot, akkor több kisebb dózisban lehet azt megtenni 24 órán belül. A vizsgálati eljárás részletei az 1. mellékletben találhatók. 1.4.3.1. Általános megfigyelések Gondos klinikai megfigyeléseket végeznek a vizsgált anyag adagolásának napján legalább kétszer, vagy többször, ha az állatoknak a kezelésre adott reakciói ezt indokolják, és legalább egyszer az ezt követő napokban. A haldokló vagy súlyos és tartós szenvedés és fájdalom jeleit mutató állatokat a vizsgálat vége előtt el kell pusztítani. Azokat az állatokat, amelyeket állatvédelmi okokból a vizsgálat vége előtt elpusztítottak, ugyanolyan módon veszik figyelembe, mint azokat, amelyek a kezelés hatására elpusztultak. Azon állatok esetében, amelyeket állatvédelmi okokból a vizsgálat vége előtt elpusztítottak, illetve amelyek elpusztultak, a halál beálltának időpontját, amennyire pontosan csak lehet, feljegyzik. További megfigyelés szükséges, ha az állatok továbbra is mutatnak toxikus tüneteket. A megfigyeléseknek tartalmazni kell az esetleges elváltozásokat a bőrön, a szőrzeten, a szemeken és a nyálkahártyán, továbbá a légzőszerveken, a keringési rendszeren, a vegetatív és a központi idegrendszeren, a testmozgató tevékenységeken és a viselkedésben. Figyelmet fordítanak az esetleges reszketés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma megfigyelésére. Minden megfigyelést módszeresen feljegyeznek, oly módon, hogy minden egyes állatról külön feljegyzést vezetnek. 1.4.3.2. Testsúly Minden állatot közvetlenül a vizsgált anyag beadása előtt lemérnek, ezt követően pedig legalább heti rendszerességgel. A tömegváltozást kiszámítják és feljegyzik. A vizsgálat végén a túlélő állatokat megmérik és elpusztítják. 1.4.3.3. Autopszia Minden állat testét, beleértve azokat, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy azokat, amlyeket vizsgálatból kivontak és elpusztítottak, fel kell boncolni. Minden állat esetében az összes makroszkópikus patológikus elváltozását feljegyzik. Azon állatok esetében, amelyek 24 órával, vagy ennél tovább túlélték a vizsgálatot, érdemes mérlegelni a patológikus elváltozásokat mutató szervek mikroszkópikus vizsgálatát, mert ez hasznos információkkal szolgálhat. 2. ADATOK Rögzíteni kell az adatokat minden egyes állattal kapcsolatban. Ezenfelül minden adatot táblázat formájában kell összesíteni. A táblázat tartalmazza minden vizsgálati csoport esetén a felhasznált állatok számát, a toxikus tüneteket mutató állatok számát, a vizsgálat során elpusztult vagy állatvédelmi okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok halálának időpontját, a toxikus hatások és ezek időbeli lefolyásának ill. a reverzibilitás leírását, valamint a boncolási megfigyeléseket. Az eredmények osztályozás céljából végzett értelmezéséhez általános iránymutatás található a 2. mellékletben. 3. JELENTÉS Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – a következő információkat tartalmazza: Vizsgált fajok - faj/fajta, - az állatok mikrobiológiai állapota (amennyiben ismert), - az állatok száma, kora és neme, - az állatok eredete, tartási körülmények, étrend stb., - az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor, az azt követő hetekben, majd a vizsgálat végén. Vizsgálati körülmények - az alkalmazott oldószer kiválasztásának indoklása, ha az nem víz, - a vizsgált anyag adagolására vonatkozó részletek, beleértve a dózis térfogatát és beadásának időpontját, - táplálék és a víz minőségére vonatkozó részletek (beleértve a táplálék típusát/forrását, vízforrást), - a kezdő dózis kiválasztásának indoklása. Eredmények - az adatok jegyzéke nem és dózisszint szerint, minden állatra vonatkozóan (azaz toxikus tüneteket mutató állatok száma, beleértve az elhullást, valamint a hatások természetét, súlyosságát és időtartamát), - a toxikus tünetek megjelenésének időpontja és azok visszafordíthatósága az egyes állatok tekintetében, - boncolási megfigyelések és bármilyen kórszövettani jelenség az egyes állatokon, ha tapasztalható. Az eredmények tárgyalása Összefoglaló megállapítások 4. SZAKIRODALOM Ez a módszer megfelel az OECD TG 423-nak. 1. MELLÉKLET VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 1. Az 1.4.2.3. pontban foglaltak szerint kezdő dózisként azt a mennyiséget kell alkalmazni, amelyiknél a halál valószínűleg bekövetkezik, legalább az állatok egy része esetében. A kezdő dózis kiválasztásánál a következő információkat kell figyelembe venni: - a vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságaira vonatkozó adatok, - szerkezet–hatás összefüggésre vonatkozó adatok, - minden adat más toxicitás-vizsgálatokból; és - a vizsgált anyag várható felhasználása. 2. Minden kezdő dózis esetében ezen mellékletben közölt mintát kell figyelembe venni. Az állatvédelmi okokból elpusztított és a vizsgálat befejezése előtt elpusztult állatok számától függően a vizsgálati eljárás a megfelelő nyilak mentén halad tovább. 3. Ha 25 mg/kg testsúly vagy 200 mg/kg testsúly vizsgált anyag kezdő dózisként való adagolása esetén csak egy állat pusztul el a második vizsgált nem esetében, akkor az rendes körülmények között a vizsgálat befejezését jelenti. Ha azonban nem mutatkoztak toxikus tünetek a másik öt állaton, akkor a boncolás során mérlegelni kell, hogy az elhullás esetleg nem a vizsgált anyaggal volt összefüggésben. Ilyen esetben a vizsgálatot a következő nagyobb dózisszinten kell folytatni. 4. Ha a 2000 mg/kg testsúly dózis mellett nemenként egy állat pusztul el, akkor az LD50 értéke 2000 mg/kg testsúly felett várható. Mindazonáltal, mivel ez határeseti eredmény, a nemenként megmaradt két állatra gyakorolt hatást gondosan meg kell vizsgálni, és a jellegzetes, világos toxikus tünetek ezeknek az állatoknak az esetében könnyen a 2000mg/kg testsúly vagy az alatti értékű LD50-hez tartozó osztályba soroláshoz vezethetnek. Esetleg további, ezzel a dózissal végzett vizsgálatra lehet szükség. 5. Az eljárás lehetővé teszi további három előre meghatározott vizsgálati szint alkalmazását (2. lehetőség). Ez a lehetőség alkalmazható egyéb dózis kiválasztásához, egy adott döntési helyzetben, vagy további vizsgálathoz a tényleges vizsgálat elvégzése után (1. lehetőség). Az 1. lehetőség szerinti vizsgálati eljárás vastag nyilakkal van jelölve, a 2. lehetőség szerinti vizsgálati eljárást vékony nyilak mutatják. a) Vizsgálati eljárás 25 mg/kg testsúly kezdő dózis esetén +++++ TIFF +++++ b) Vizsgálati eljárás 200 mg/kg testsúly kezdő dózis esetén +++++ TIFF +++++ c) Vizsgálati eljárás 2000 mg/kg testsúly kezdő dózis esetén +++++ TIFF +++++ 2. MELLÉKLET AZ 1. LEHETŐSÉG SZERINTI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK ÉRTELMEZÉSE Az e mellékletben szereplő "vizsgálat befejezése" keret alatti szürkén kitöltött keretek mutatják meg az osztályozáshoz szükséges határértékeket. Az 1. lehetőség szerinti vizsgálati eljárást követve a megfelelő nyilat kell követni lefelé, amíg az eléri a megfelelő szürkével kitöltött keretet. a) Az 1. lehetőség szerinti vizsgálat eredményeinek értelmezése Kezdő dózis: 25 mg/kg testsúly +++++ TIFF +++++ b) Az 1. lehetőség szerinti vizsgálat eredményeinek értelmezése Kezdő dózis: 200 mg/kg testsúly +++++ TIFF +++++ c) Az 1. lehetőség szerinti vizsgálat eredményeinek értelmezése Kezdő dózis: 2000 mg/kg testsúly +++++ TIFF +++++ " -------------------------------------------------- IV. C. MELLÉKLET " B.6. A BŐR ÉRZÉKENNYÉ TÉTELE 1. MÓDSZER 1.1. Bevezetés Megjegyzések: Az érzékenységnek, illetve a vizsgálatok azon képességének, hogy felderítik az emberek bőrét potenciálisan érzékennyé tevő anyagokat, nagy jelentősége van a toxicitás közegészségügyi osztályozási rendszerében. Nincs olyan vizsgálati eljárás, amely a potenciálisan az emberi bőrt érzékennyé tevő összes anyagot megfelelően kimutatja, illetve amely az összes anyag tekintetében megfelelően alkalmazható. Az anyag fizikai tulajdonságait, beleértve a bőrön való áthatolás képességét és egyéb tényezőket is, meg kell fontolni egy vizsgálat kiválasztása során. Kétféle vizsgálatot dolgoztak ki tengerimalacokhoz: az egyik a hatásjavító típusú vizsgálat, amelyikben az allergiás állapot esetleges előidézése FCA-ban (Freunds Complete Adjuvant) való feloldás vagy szuszpendálás segítségével történik; a másik a nem hatásjavító típusú vizsgálat. A hatásjavító típusú vizsgálatok valószínűleg pontosabbak egyes anyagok emberek bőrén érzékenységet előidéző hatásának előrejelzésére, mint azok a módszerek, amelyek nem alkalmazzák az FCA-t, ezért ezek a módszerek előnyben részesülnek. A tengerimalac legerősebb ingerlési vizsgálata (Guinea-Pig Maximisation Test, GMPT) széles körben alkalmazott hatásjavító típusú vizsgálat. Bár számos másik módszer is alkalmazható egy anyag lehetséges, a bőrt érzékennyé tevő hatásának megállapítására, a GPMT a leginkább javasolt hatásjavító típusú módszer. Sok vegyianyagosztály esetében a nem hatásjavító vizsgálatok (amelyek közül a leginkább javasolt a Bühler-vizsgálat) az általános vélemény szerint kevésbé érzékenyek. Egyes esetekben megfelelő indokok állnak fenn a külsőleg történő adagolással végzett Bühler-vizsgálat választásához, a bőrbe befecskendezéses GPMT vizsgálat alkalmazása helyett. A Bühler-vizsgálat alkalmazását tudományosan indokolni kell. Az alábbi módszer ismerteti a GPMT és a Bühler-vizsgálatot. Más módszerek is alkalmazhatók, ha alkalmazásuk jóváhagyott és tudományosan alátámasztottak. Amennyiben egy elismert szűrővizsgálat pozitív eredményt ad, a vizsgált anyagot potencionális érzékenyítőként kell megjelölni. További vizsgálatot tengerimalacokkal nem szükséges végezni. Azonban, ha negatív eredményt ad a szűrő vizsgálat, akkor az itt leírt eljárásnak megfelelően kell a vizsgálatot a tengerimalacokkal elvégezni. Lásd továbbá a B. rész Általános bevezetését. 1.2. Fogalommeghatározások Bőr érzékennyé tétele: (allergén kontakt dermatitis) a vizsgált anyagra adott, az immunrendszer által irányított bőrválasz. Embereknél a válasz jellemző tünetei: viszketés, bőrpirosság, ödéma, kiütés, hólyag, vagy ezen jelenségek valamilyen kombinációja. Más fajoknál a reakciók különbözhetnek, és esetleg csak bőrpirosság és ödéma jelentkezik. Indukciós expozíció: kísérleti eljárás, amikor a kísérlet alanyát kiteszik egy vizsgált anyag hatásának, azzal a céllal, hogy túlérzékeny állapotot idézzenek elő. Indukciós fázis: legalább egyhetes időtartam az indukciós expozíciót követően, ami alatt a túlérzékeny állapot kialakulhat. Kiváltó expozíció: kísérleti expozíció, amikor az előzetesen kezelt kísérleti állatot kiteszik a vizsgált anyag hatásának az indukciós időszak után azzal a céllal, hogy meghatározzák túlérzékeny módon reagál-e. 1.3. Referenciaanyagok A kísérleti eljárás érzékenységet és megbízhatóságát felmérik minden hat hónapban, olyan anyagok felhasználásával, amelyeknek ismerten gyenge, vagy közepes bőrérzékenyítő hatásuk van. Helyesen lefolytatott vizsgálat esetén, hatásjavító vizsgálatban legalább 30 százalékban, nem hatásjavító vizsgálat esetén legalább 15 százalékban jelentkeznie kell a gyenge/közepes válasznak. A következő anyagok alkalmazása javasolt: CAS-szám | EINECS-szám | EINECS-megnevezés | közismert név | 101-86-0 | 202-983-3 | alfa-Hexilfahéjaldehid | α-hexil-cinnamaldehid | 149-30-4 | 205-736-8 | Benzotiazol-2-tiol (2-Merkaptobenztiazol) | kaptax | 94-09-7 | 202-303-5 | benzokain | nordkain | Meghatározott körülmények között megfelelő indoklással olyan más ellenőrző anyagokat is fel lehet használni, amelyek megfelelnek a fenti követelményeknek. 1.4. A vizsgálati módszer alapelve A kísérleti állatokat először alávetik a vizsgált anyag hatásának intradermális befecskendezés és/vagy epidermális adagolás útján (indukciós expozíció). Egy 10–14 napos pihentetési időszak után (indukciós fázis), amely alatt az immunválasz kifejlődhet, a kísérleti állatok megkapják a kiváltó dózist. A kísérleti állatoknak a kiváltó expozícióra adott reakciójának kiterjedtségét és mértékét összehasonlítják a kontrollcsoport tagjainak reakciójával, amelyeket látszólagos indukciónak vetettek alá, és amelyek megkapták a kiváltó expozíciót. 1.5. A vizsgálati módszerek leírása Ha a vizsgált anyag eltávolítása szükségesnek tűnik, akkor azt víz, vagy valamilyen megfelelő oldószer alkalmazásával hajtható végre, a létrejött reakció, vagy az epidermisz épségének befolyásolása nélkül. 1.5.1. Tengerimalac legerősebb ingerlési vizsgálata (GPMT) 1.5.1.1. Előkészületek Az egészséges, fiatal felnőtt albinó tengerimalacokat a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napon át a laboratóriumi körülményekhez kell szoktatni. A vizsgálat előtt véletlenszerűen kiválasztják, és a kezelési csoportokba osztják az állatokat. A szőrzet eltávolítását nyírással, borotválással vagy esetleg kémiai szőrtelenítéssel végzik, az alkalmazott vizsgálati eljárástól függően. Gondosan el kell kerülni a bőr felhorzsolását. Az állatok tömegét megmérik a vizsgálat kezdete előtt és a befejezését követően. 1.5.1.2. Vizsgálati körülmények 1.5.1.2.1. Kísérleti állatok Kísérleti célokra általánosan használt, laboratóriumban szaporított albinó tengerimalacokat alkalmaznak. 1.5.1.2.2. Az állatok száma és neme Hím és nőstény egyedek egyaránt használhatók. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Legalább 10 állatot kell alkalmazni a kezelt csoportban és 5-öt a kontrollcsoportban. Ha kevesebb, mint 20 tengerimalacot használtak a vizsgálati csoportban és kevesebb mint 10-et a kontrollcsoportban, és nem lehet azt a következtetést levonni, hogy a vizsgált anyag érzékenységet okoz, akkor a kísérleti állatok számát legalább 20-ra, a kontrollcsoportban lévő állatok számát legalább 10-re növelve, további kísérlet elvégzése célszerű. 1.5.1.2.3. Adagolási szintek Az indukciós expozícióhoz felhasznált vizsgált anyag koncentrációja legyen megfelelően elviselhető és a lehető legmagasabb, ami még csak gyenge közepes bőrirritációt okoz. A kiváltó expozíciónál alkalmazott koncentráció a legmagasabb, még nem irritatív dózis legyen. Ha szükséges, akkor a megfelelő koncentrációk két vagy három állat alkalmazásával végzett elővizsgálattal meghatározhatók. Megfontolandó az FCA-val kezelt állatok e célra való felhasználása. 1.5.1.3. A kísérlet végrehajtása 1.5.1.3.1. Indukció Kezelt csoport, 0-dik nap Három pár injekció beadása intradermálisan, 0,1 ml térfogattal, a váll környékére, amelyet előzőleg megtisztítottak a szőrzettől, olyan módon, hogy minden párból egy a középvonal egyik, egy a másik oldalára esik. Injekció 1. 1:1 keverék (v/v) FCA/víz, vagy fiziológiás sóoldat. Injekció 2. a vizsgált anyag, megfelelő vivőanyagban, a kiválasztott koncentrációban. Injekció 3. a vizsgált anyag a kiválasztott koncentrációban, amelyet FCA/víz vagy, fiziológiás sóoldat 1:1 keverékében (v/v) készítenek el. A harmadik injekciónál a vízben oldható anyagokat feloldják a vizes fázisban, mielőtt az FCA-val összekevernék. A vizes fázis hozzáadása előtt a zsírban oldódó, illetve az oldhatatlan anyagokat szuszpendálják FCA-ban. A vizsgált anyag végső koncentrációja megegyezik a 2. injekció során alkalmazottal. A 1. és a 2. injekciót egymáshoz közel adják be a fejhez legközelebbre, míg a harmadikat a vizsgálati terület farok felé eső részén kell beadni. Kontrollcsoport, 0-dik nap Három pár injekció beadása 0,1 ml térfogattal, ugyanarra a helyre, mint a kezelés alatt álló állatoknál. Injekció 1. 1:1 keverék (v/v) FCA/víz, vagy fiziológiás sóoldat. Injekció 2. hígítatlan vivőanyag. Injekció 3. 50 % m/v vivőanyag-készítmény FCA/víz, vagy fiziológiás sóoldat 1:1 keverékében (v/v). Kezelt és kontrollcsoport, 5–7. nap Körülbelül 24 órával a helyi indukciós-alkalmazás megkezdése előtt, ha az anyag nem irritatív hatású, a vizsgálati területet rövid szőrzetnyírás és/vagy borotválás után 0,5 ml 10 százalékos nátrium-lauril-szulfát vazelines elegyével kezelik, a helyi irritáció kiváltása érdekében. Kezelt csoport, 6–8. nap A vizsgálati felületet ismét megtisztítják a szőrzettől. Egy szűrőpapírt (2x4 cm) telítenek a vizsgált anyag alkalmas vivőanyaggal képzett oldatával, azt alkalmazzák a vizsgált felületen, és azzal szigetelő kötés alkalmazásával, 48 órán keresztül szoros érintkezésben tartják. A vivőanyag kiválasztását indokolni kell. Szilárd anyagokat finomra porítják, és a megfelelő vivőanyaggal elegyítik. A folyadékok adott esetben hígítás nélkül is alkalmazhatóak. Kontrollcsoport, 6–8. nap A vizsgálati felületet ismét megtisztítják a szőrzettől. A vivőanyagot önmagában viszik fel azonos eljárással a vizsgált felületre, és azzal szigetelő kötés alkalmazásával, 48 órán keresztül szoros érintkezésben tartják. 1.5.1.3.2. Kiváltás Kezelt és kontrollcsoport, 20–22. nap A hasszéleket megtisztítják a szőrzettől, mind a kezelt, mind a kontrollcsoport esetében. Egy tapaszt, vagy egy tokot helyeznek fel az állatok hasának egyik szélére, amelyet megtöltenek a vizsgált anyaggal, és ha lehetséges, akkor egy tokot vagy egy tapaszt alkalmaznak, helyeznek fel a másik hasszélen, amelyet megtöltenek a vivőanyaggal. A tapaszokat szigetelő kötés segítségével, 24 órán keresztül szoros érintkezésben tartják a bőrrel. 1.5.1.3.3. Megfigyelés és értékelés: kezelt és kontrollcsoport - a tapasz eltávolítása után, hozzávetőleg 21 órával a felületet megtisztítják és rövidre nyírják és/vagy leborotválják, és szőrtelenítik, ha szükséges, - nagyjából 3 órával később (hozzávetőleg 48 órával a kiváltó expozíció kezdete után) megfigyelik és feljegyzik a bőrreakciót a függelékben megadott fokozatoknak megfelelően;, - hozzávetőleg 24 órával ez után a megfigyelés után egy második megfigyelést is végeznek (72 órával a kísérlet kezdete után) és ezt is feljegyzik. Javasolt a kezelt és a kontrollállatok vakpróbával történő megfigyelése. Ha szükséges az első kiváltás eredményeinek pontosítása, akkor – szükség esetén – egy második kiváltás (azaz újbóli kiváltás) alkalmazása megfontolandó egy új kontrollcsoporton, hozzávetőleg egy héttel az első után. Újbóli kiváltást az eredeti kontrollcsoporton is végre lehet hajtani. Minden bőrreakciót és minden észlelhető leletet, beleértve a szisztémás reakciókat, amelyek az indukció és a kiváltás hatására jönnek létre, megfigyelnek és feljegyeznek a Magnusson/Kligman-féle értékelési skála szerint (lásd: Függelék). Egyéb eljárások (pl. kórszövettani vizsgálatok, a bőrön található ráncok mélységének mérése) is elvégezhetők, a kétséges reakciók tisztázása érdekében. 1.5.2. Bühler-vizsgálat 1.5.2.1. Előkészületek Az egészséges, fiatal felnőtt albinó tengerimalacokat a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napon át a laboratóriumi körülményekhez kell szoktatni. A vizsgálat előtt véletlenszerűen kiválasztják, és a kezelési csoportokba osztják az állatokat. A szőrzet eltávolítását nyírással, borotválással vagy esetleg kémiai szőrtelenítéssel végzik, az alkalmazott vizsgálati eljárástól függően. Gondosan el kell kerülni a bőr felhorzsolását. Az állatok tömegét megmérik a vizsgálat kezdete előtt és a befejezését követően. 1.5.2.2. Vizsgálati körülmények 1.5.2.2.1. Kísérleti állatok Kísérleti célokra általánosan használt, laboratóriumban szaporított albinó tengerimalacokat alkalmaznak. 1.5.2.2.2. Az állatok száma és neme Hím és nőstény egyedek egyaránt használhatók. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Legalább 20 állatot kell alkalmazni a kezelt csoportban és 10-et a kontrollcsoportban. 1.5.1.2.3. Adagolási szintek Az indukciós expozícióhoz felhasznált vizsgált anyag koncentrációja legyen a lehető legmagasabb, ami gyenge, ill. nem túl erős bőrirritációt okoz. A kiváltó expozíciónál alkalmazott koncentráció a legmagasabb, még nem irritatív dózis legyen. Ha szükséges, akkor a megfelelő koncentrációk két vagy három állat alkalmazásával végzett előzetes vizsgálattal meghatározhatók. Vízoldékony vizsgálati anyagoknál célszerű vizet, vagy nem irritatív hatású felszínkezelő oldatot használni vivőanyagként. Más vizsgált anyagokhoz 80 % etanol/víz ajánlott az indukcióhoz, és aceton a kiváltáshoz. 1.5.2.3. A kísérlet végrehajtása 1.5.2.3.1. Indukció Kezelt csoport, 0-dik nap Az egyik hasszélt megtisztítják a szőrzettől (rövidre nyírják). Egy tapaszt helyeznek fel, amelyet teljesen telítenek a megfelelő vivőanyagban elegyített vizsgálati anyaggal (a vivőanyag kiválasztását indokolni kell, folyékony vizsgált anyagok felvihetők adott esetben hígítás nélkül is). A vizsgálati tapaszt felhelyezik a vizsgálat felületre, és egy megfelelő szigetelő tapasszal, vagy tokkal, szigetelő kötés segítségével 6 órán keresztül érintkezésben tartják a kísérleti állat bőrével. A vizsgálati tapasznak szigetelőnek kell lennie. Egy kerek vagy négyzet alakú vattakötés alkalmas, aminek legalább 4–6 cm2 területűnek kell lennie. A zártság biztosítására megfelelő leszorító eszköz alkalmazása javasolt. Ha pólyát alkalmaznak, akkor bizonyos körülmények között további expozícióra lehet szükség. Kontrollcsoport, 0-dik nap Az egyik hasszélt megtisztítják a szőrzettől (rövidre nyírják). A vivőanyagot önmagában helyezik fel, azonos módon, mint ahogy az a kezelt csoportnál történik. A vizsgálati tapaszt felhelyezik a vizsgálat felületre, és egy megfelelő szigetelő tapasszal, vagy tokkal, szigetelő kötés segítségével 6 órán keresztül érintkezésben tartják a kísérleti állat bőrével. Kezelt és kontrollcsoport, 6–8. és 13–15. nap A 0-dik napon végzettel megegyező eljárást kell végrehajtani, ugyanazon a vizsgálati felületen (szőrnyírás, ha szükséges) ugyanazon a hasszélen a 6–8. napon és megismételve a 13–15. napon. 1.5.2.3.2. Kiváltás Kezelt és kontrollcsoport, 27–29. nap A kezeletlen hasszélt megtisztítják a szőrzettől (rövidre nyírják), mind a kezelt mind a kontrollcsoport esetében. Egy szigetelőtapaszt, vagy egy tokot helyeznek fel a kezelt és kontrollcsoportba tartozó állatok hátsó, kezeletlen hasszélére, amelyet megtöltenek a megfelelő mennyiségű, legnagyobb de nem irratív koncentrációjú vizsgált anyaggal. Adott esetben csak vivőanyaggal átitatott szigetelőtapaszt vagy -tokot helyeznek fel a kezelt és a kontrollcsoportba tartozó állatok elülső, kezeletlen hasszélére. A tapaszt vagy tokot megfelelő kötés segítségével, 6 órán keresztül szoros érintkezésben tartják a kísérleti állat bőrével. 1.5.2.3.3. Megfigyelés és értékelés - a tapasz eltávolítása után hozzávetőleg 21 órával a felületet megtisztítják a szőrzettől, - hozzávetőleg 3 órával később (körülbelül 30 órával a kiváltó tapasz alkalmazása után) a bőr reakcióját megfigyelik és feljegyzik a függelékben megadott fokozatoknak megfelelően, - hozzávetőleg 24 órával ezen megfigyelés után (nagyjából 54 órával a kiváltó tapasz alkalmazása után) a bőr reakcióját ismét megfigyelik és feljegyzik. Javasolt a kezelt és a kontrollállatok vakpróbával történő megfigyelése. Ha szükséges az első kiváltás eredményeinek pontosítása, akkor – szükség esetén – egy második kiváltás (azaz újbóli kiváltás) alkalmazása megfontolandó egy új kontrollcsoporton, hozzávetőleg egy héttel az első után. Újbóli kiváltást az eredeti kontrollcsoporton is végre lehet hajtani. Minden bőrreakciót és minden észlelhető leletet, beleértve a szisztémás reakciókat, amelyek az indukció és a kiváltás hatására jönnek létre, megfigyelnek és feljegyeznek a Magnusson/Kligman-féle értékelési skála szerint (lásd: Függelék). Egyéb eljárások (pl. kórszövettani vizsgálatok, a bőrön található ráncok mélységének mérése) is elvégezhetők a kétséges reakciók tisztázása érdekében. 2. ADATOK (GPMT ÉS BÜHLER VIZSGÁLATOK) Minden adatot táblázat formájában összesítenek, amely tartalmazza minden állat tekintetében az egyes megfigyelési időpontok alkalmával észlelt bőrreakciókat. 3. ZÁRÓVIZSGÁLATI JELENTÉS (GPMT ÉS BÜHLER VIZSGÁLAT) Ha szűrő próbát végeznek a tengerimalac-vizsgálat előtt [pl. helyi nyirokcsomó-próba (LLNA), egérfüldaganat-vizsgálat (MEST)], akkor vizsgálat leírását ill. az irodalmi hivatkozásokat, beleértve az eljárás részleteit is meg kell adni a kapott eredményekkel és a vizsgált és az összehasonlító anyaggal együtt. Vizsgálati jelentés (GPMT és Bühler vizsgálatok) A vizsgálati jelentésben – amennyiben lehetséges – az alábbi információknak kell szerepelniük: Kísérleti állatok: - az alkalmazott tengerimalac-törzs, - az állatok száma, életkora és neme, - az állatok eredete, tartási körülmények, étrend stb., - az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor. Vizsgálati körülmények: - az állat azon testrészének előkészítése, ahová felhelyezik a vizsgált anyagot, - a felhasznált tapasz típusának és a tapaszolási eljárásnak a részletes leírása, - az előzetes vizsgálat eredménye, a vizsgálatban alkalmazandó indukciós és kiváltó koncentrációra vonatkozó következtetésekkel együtt, - a vizsgált anyag előkészítésének, alkalmazásának és eltávolításának részletei, - a vivőanyag kiválasztásának indoklása, - a vivő és a vizsgált anyag koncentrációja az indukciós és a kiváltó eljárásban, és a két eljárás során összesen felhasznált vizsgált anyag mennyisége. Eredmények: - a legutolsó, a vizsgálat érzékenységét és megbízhatóságát ellenőrző eljárás (ld. 1.3) eredményeinek összefoglalása, beleértve az ehhez felhasznált anyagokra, koncentrációkra és vivőanyagra vonatkozó információkat is, - az egyes állatok megfigyelésének eredményei, beleértve az értékelő rendszerre vonatkozó adatokat, - a megfigyelt hatások jellegének és fokozatának részletes leírása, - bármely kórszövettani megfigyelés. Az eredmények tárgyalása. Összefoglaló megállapítások. 4. HIVATKOZÁSOK Ez a módszer megfelel az OECD TG 406-nak. Függelék TÁBLÁZAT: Magnusson/Kligman-féle értékelési skála a kiváltó tapaszos vizsgálatra adott reakciók értelmezéséhez 0 = | nincs látható változás | 1 = | enyhe, vagy foltos bőrpirosság | 2 = | mérsékelt és összefüggő bőrpirosság | 3 = | élénk bőrpirosság és duzzanat | " -------------------------------------------------- IV. D. MELLÉKLET " B.7. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ (28 NAPOS) TOXICITÁS-VIZSGÁLAT (ORÁLIS) 1. MÓDSZER 1.1. Bevezetés Lásd az Általános bevezetés B. részét. 1.2. Fogalommeghatározások Lásd az Általános bevezetés B. részét. 1.3. A vizsgálati módszer elve A vizsgált anyagot naponta, szájon át adják be több kísérleti állatcsoportnak, csoportonként más-más adagolási szinten, 28 napon keresztül. A szer beadása időszakában az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése érdekében gondosan megfigyelik. Az elpusztult, illetve az elpusztított állatokat felboncolják, illetőleg a vizsgálat befejezése után a túlélő állatokat is elpusztítják és felboncolják. Ez a módszer nagy hangsúlyt fektet a neurológiai hatásokra mint különleges végpontra, és az állatok gondos klinikai megfigyelésének jelentőségére a lehető legtöbb információ megszerzése érdekében. A módszer segítségével kiszűrhetők a neurotoxikus hatással rendelkező vegyi anyagok, ami aztán további alaposabb, ilyen irányú kutatást indokolhat. Mindezek mellett a módszer adatokkal szolgálhat az immunológiai és a szaporítószervekre gyakorolt toxikus hatásokkal kapcsolatban is. 1.4. A vizsgálati módszer leírása 1.4.1. Előkészületek Egészséges, fiatal, felnőtt állatokat véletlenszerűen kezelt, illetve kontrollcsoportokba osztanak be. A ketreceiket olyan módon helyezik el, hogy az elhelyezésükből adódó lehetséges hatásokat minimumra lehessen csökkenteni. Minden állatot megjelölnek az egyedi azonosíthatóság céljából, és a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napig a ketrecükben tartják, a laboratóriumi körülményekhez való hozzászoktatás céljából. A vizsgált anyagot gyomorszondán át, az állatok táplálékába, vagy az ivóvízbe keverve adják be. A szájon át történő beadás módszerét a tanulmány céljától valamint a vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságaitól függően választják meg. Szükség esetén a vizsgált anyagot feloldják vagy szuszpendálják alkalmas vivőanyagban, ha csak lehetséges, elsősorban a vizes oldat/szuszpenzió használata javasolt, másodsorban az olajos oldat/emulzió (pl. kukoricaolaj) alkalmazása jöhet számításba, és ezt követheti a másfajta vivőanyagokban való feloldás. Amennyiben nem víz a vivőanyag, akkor a vivőanyag toxikus tulajdonságainak ismertnek kell lenniük. A vizsgált anyag stabilitását a vivőanyagban meghatározzák. 1.4.2. Vizsgálati körülmények 1.4.2.1. A kísérlethez felhasznált állatok A javasolt faj a patkány, de a rágcsálók más fajai is felhasználhatók. Kísérleti célokra általánosan használt, laboratóriumi törzsekből származó fiatal, egészséges, felnőtt állatokat alkalmaznak. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Az adagolást az elválasztás után a lehető legrövidebb időn belül célszerű elkezdeni, de mindenképpen az állatok 9 hetes kora előtt. A vizsgálat kezdetén, az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan térjen el egymástól, és a nemenkénti átlagos értéktől maximum ± 20 %-al különbözhet. Ha az ismételt adagolású (orális) vizsgálatot egy hosszabb távú vizsgálat előzetes tanulmányaként végzik, akkor javasolt mindkét vizsgálathoz ugyanabból a törzsből való, azonos erdetű állatokat használni. 1.4.2.2. Az állatok száma és neme Minden egyes adagolási szinthez legalább 10 állatot (5 hímet és 5 nőstényt) alkalmaznak. Ha időközi elpusztítást terveznek, akkor a csoport létszámát a kísérlet során elpusztítani szándékozott állatok számával megnövelik. Ezenkívül egy 10 állatból álló (5 állat nemenként) kísérő csoportot is lehet kezelni a legnagyobb dózissal, 28 napon át. Ezt a csoportot meg lehet figyelni a toxikus hatások reverzibilitása, tartós volta vagy késleltetett előfordulása tekintetében, 14 napon át. Ezzel egyidejűleg egy 10 kontrollállatból álló (5 állat nemenként) ún. kísérő csoport is alkalmaznak. 1.4.2.3. Adagolási szintek Általánosan 3 kezelt csoportot és egy kontrollcsoportot alkalmaznak. A vizsgált anyaggal való kezeléstől eltekintve a kontrollcsoportban lévő állatokat a kezelt csoportba beosztottakkal azonos bánásmódban részesítik. Ha vivőanyagot használnak a vizsgált anyag beadásához, akkor a kontrollcsoport a vivőanyagot a legnagyobb alkalmazott mennyiségben kapja. Ha a rendelkezésre álló adatok kiértékelése alapján 1000 mg/kg testsúly/nap esetén nem várhatóak hatások, akkor határérték-vizsgálatot lehet végezni. Ha nem állnak rendelkezésre megfelelő adatok, akkor dózisbehatároló-vizsgálatot lehet végezni az alkalmazandó dózisok meghatározása céljából. Az adagolási szintek kiválasztásánál figyelembe veszik a vizsgált, vagy azzal rokon anyagok toxicitására és (toxiko)kinetikájára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. A legmagasabb dózist úgy választják ki, hogy az toxikus tüneteket keltsen, de ne okozzon halált, vagy súlyos szenvedést a kísérleti állatoknak. Ezután az adagokat fokozatosan csökkentik, azzal a céllal, hogy bemutassák az adagolási szinttől függő hatásokat és a nem észlelhető kedvezőtlen hatásszintet (NOAEL). A csökkenő dózisok beállításához gyakran kétszeres–négyszeres hosszúságú időszakok bizonyulnak optimálisnak, és sokszor tanácsos egy negyedik kezelt csoport alkalmazása, nagyon nagy dózisbeli különbség (pl. több mint 10-szeres) alkalmazásával. A táplálékkal, vagy ivóvízzel adagolt anyagok esetében fontos biztosítani, hogy a vizsgált anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt és a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal együtt adják be, akkor vagy állandó koncentrációban (ppm) keverik be, vagy az állat testsúlyától függő, állandó nagyságú dózisban adagolják. A kiválasztott módszert megjelölik. Gyomorszondán át történő adagolás esetén a dózist mindennap azonos időpontban adják be, mennyiségét a kísérleti állat testsúlyához igazítják, és azonos mennyiséget adnak be minden alkalommal. Ha az ismételt adagolású vizsgálatot egy hosszú távú vizsgálat előtanulmányaként végzik, akkor a két kísérletben azonos étrendet alkalmaznak. 1.4.2.4. Határérték-vizsgálat Ha a kísérlet során a legalább 1000 mg/kg testsúly/nap adagolási szint ill. a táplálékban, vagy ivóvízben beadott anyagmennyiség megfelelő koncentrációja (a testsúly alapján végzett számítások szerint), és az e vizsgálat lefolytatására előírt eljárás betartása mellett a vizsgált anyag nem okoz észlelhető toxikus hatásokat, és ha a szerkezet tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthető. A határérték-vizsgálat alkalmazható, kivéve ha emberi expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja. 1.4.2.5. Megfigyelési időszak A megfigyelési időszak 28 nap. A kísérő csoportban lévő állatokat, amelyekkel további megfigyeléseket terveznek, még legalább 14 napig tartják kezelés nélkül, hogy a toxikus hatások késleltetett előfordulását, vagy megmaradását, vagy visszafordíthatóságát megfigyeljék. 1.4.3. A kísérlet végrehajtása A kísérleti állatoknak a vizsgált anyagot 28 napon keresztül heti hét napon át, naponta adagolják. Bármely más adagolási rendszer – pl. heti öt nap – célszerűségét indokolni kell. Ha a vizsgált anyagot gyomorszondán át adják be, akkor ennek vagy egy megfelelő intubációs kanülnek a segítségével egyetlen adagban juttatják be a szert. Az egy alkalommal beadható folyadék legnagyobb mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. E mennyiség nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúly grammot, kivéve a vizes oldatok esetében, amikor 2 ml/100 testsúly gramm adható. A magasabb koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró anyagok kivételével, a koncentráció megfelelő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy valamennyi adagolási szinten konstans mennyiséget lehessen adagolni a kísérleti állatoknak. 1.4.3.1. Megfigyelések Általános klinikai megfigyelést végeznek naponta legalább egyszer, lehetőleg minden nap ugyanabban/ugyanazokban az időpont(ok)ban, figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsidőszakát. Feljegyezik a kísérleti állatok klinikai kórállapotát. Naponta legalább kétszer, rendszerint a nap elején és végén, megvizsgálják az összes állatot, hogy nem mutatják-e a morbiditás és mortalitás jeleit. A haldokló állatokat és súlyosan szenvedő, vagy fájdalommal küszködő állatokat az állatvédelmi előírásoknak megfelelően elpusztítják, majd felboncolják. A vizsgált anyag hatásának való első expozíció előtt legalább egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), azt követően hetente egyszer az összes állatot részletes klinikai vizsgálatoknak vetik alá. E megfigyeléseket azokon a ketreceken kívül, ahol egyébként tartják őket, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a nap hasonló időszakában végzik el. A megfigyeléseket gondosan feljegyezik, lehetőleg a vizsgálatokat végző laboratórium által meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Lépéseket tesznek annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálati körülmények változását a lehető legkisebbre csökkentsék. A megfigyeléseket lehetőség szerint olyan megfigyelők végzik, akik nem tájékozottak a kezelésről. A feljegyzett észlelések térjenek ki a bőr, a bunda, a szemek és a nyálkahártyák állapotának, a vizelet- és ürülék-kiválasztása és az autonóm mozgások (pl. könnyezés, szőrzet felborzolódása, pupilla mérete, szokatlan légzési ritmusok) változásaira. A testtartás, a járás bizonytalansága, a kezelésre való reagálás, valamint a rángásos és görcsös mozgások, sztereotip viselkedés (pl. túlzott mosdás, körben rohangálás), vagy bármilyen szokatlan viselkedésmód (pl. öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is feljegyzik. A megfigyelés negyedik hetében különböző típusú ingerekre (hallószervi, vizuális, önérzékelési ingerek) mutatott reakciókat vizsgálják, ill. felmérik a fogás/szorítás erejét és a motoros tevékenységeket. A követendő eljárások további részletei a megfelelő szakirodalomban találhatók. (lásd Általános bevezetés B. részét). A megfigyelés negyedik hetében abba lehet hagyni a szervezet működésével kapcsolatos (funkcionális) megfigyeléseket, ha a tanulmányt azt követő szubkrónikus toxicitás-vizsgálat (90 napos) előzetes tanulmányaként végzik. Ebben az esetben a szervezet működésével kapcsolatos megfigyeléseket az utóbbi vizsgálat során végzik el. Másrészt e megfigyelések elvégzése az ismételt adagolású tanulmányban segíti az azt követő szubkrónikus toxicitás-vizsgálat során a dózisok kiválasztását. Kivételes esetekben a szervezet működésével kapcsolatos (funkcionális) megfigyeléseket el lehet hagyni azoknál a csoportoknál is, amelyek olyan mértékű egyéb toxicitási tüneteket mutatnak, amelyek jelentősen befolyásolnák a szervezet működésével kapcsolatos megfigyeléseket. 1.4.3.2. Testsúly és táplálék-/vízfogyasztás Minden állatot hetente legalább egyszer lemérnek. A táplálék- és vízfogyasztást is hetente legalább egyszer mérik. Amennyiben a vizsgált anyagot az ivóvízzel adják be, akkor az ivóvíz fogyasztását is hetente legalább egyszer lemérik. 1.4.3.3. Hematológiai vizsgálatok A vizsgálati időszak végén a következő hematológiai vizsgálatokat végzik el: hematokrit, hemoglobin-koncentráció, vörösvértest-szám, teljes és differenciált vérkép, trombocitaszám és a véralvadási idő/képesség mérése. A vérmintákat egy megnevezett helyről veszik, közvetlenül az állatok elpusztítása előtt, vagy aközben, és azokat megfelelő körülmények között tárolják. 1.4.3.4. Klinikai biokémiai vizsgálatok A szövetekben jelentkező fontosabb toxikus hatások, és különösen a vesékre és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek meghatározását közvetlenül az állatok elpusztítása előtt vagy annak részeként elvégzett vérvétel során szerzett mintán végzik el (eltekintve a haldokló és/vagy időközben elpusztított egyedektől). A vérvétel előtti éjszaka ajánlatos az állatokat koplaltatni [1]. A vérplazma és vérszérum meghatározások során vizsgálandó elemek: nátrium, kálium, vércukor, összkoleszterin, karbamid, kreatinin, összprotein és albumin, továbbá több mint két, a májsejti hatásokat jelző enzim (pl. alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, alkáli foszfatáz, gamma-glutamil-transzpeptidáz és szorbitol dehidrogenáz). További enzimek vizsgálatát (májjal vagy más szervekkel kapcsolatosakat) és az epesavak mérését, amelyek bizonyos körülmények között hasznos információkkal szolgálhatnak, szintén be lehet vonni a vizsgálatok körébe. Lehetőség van a következő vizeletvizsgálatok végrehajtására a tanulmány utolsó hetében: küllem, mennyiség, ozmolalitás, vagy fajsúly, pH-érték, fehérje, glükóz, és vér/vérsejtek. Ezeken túlmenően megfontolható az általános szöveti roncsolódás szérummarkereinek vizsgálata. Más vizsgálatokat is elvégeznek, ha a vizsgált anyagnak ismert vagy feltételezhető hatása van a kapcsolódó anyagcsere-folyamatokra; ilyen pl. a kalcium, a foszfát, éhgyomorra mért triglicerid, egyes hormonok, a methemoglobin és a kolinészteráz mérése. Ezeket az értékeket az egyes besorolási osztályokhoz tartozó vegyi anyagokra nézve, vagy eseti alapon célszerű meghatározni. Rugalmas hozzáállásra van szükség, amely vizsgált fajtól és az adott vizsgált anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ. Ha a rendelkezésre álló kiinduló adatok nem bizonyulnak elegendőnek, akkor megfontolandó a hematológiai és klinikai biokémiai változók meghatározása az adagolás kezdete előtt. 1.4.3.5. Autopszia A vizsgálatokba bevont összes állatot teljes körű, beható boncolásnak vetik alá, ideértve a következők alapos vizsgálatát: a test külső felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg és a hasüreg, és ezek tartalma. Az összes állat máját, veséit, mellékveséit, heréit és mellékheréit, csecsemőmirigyét, lépét, agyát és szívét megtisztítják minden rátapadt szövettől, és a boncolást követően a lehető legrövidebb időn belül megmérik azokat a kiszáradás megelőzése érdekében. Az alábbi testszöveteket mind a szövetek típusának megállapítása, mind pedig a szándékolt későbbi kórszövettani vizsgálatok szempontjából célszerű fixálni: szövetet, amin van makroszkópikus változás, az agyat (jellemző részeket, mint pl. a nagyagy, a kisagy, a nyúltagyi híd), a gerincvelőt, a gyomrot, a vékony- és vastagbelet (beleértve a Payer-plakkot), a májat, a veséket, a mellékveséket, a lépet, a szívet, a csecsemőmirigyet, a pajzsmirigyet, a légcsövet és a tüdőket (utóbbit először megtöltik fixáló szerrel, és úgy merítik alá), az ivarmirigyeket, a járulékos nemi szerveket (pl. a méhet, a prosztatát), a húgyhólyagot, nyirokcsomókat (egyet lehetőleg a vizsgált anyag beadási útvonalába eső, egyet pedig egy attól távoli helyről véve, a szisztémás hatások vizsgálata érdekében), a perifériás idegeket (csípő vagy sípcsont környéki), lehetőleg az izomzathoz közeli helyről véve, egy metszetet a csontvelőből (és/vagy egy, friss csontvelőből felszívott mintát). A klinikai és más jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szükségesnek tűnhet. A fentieken túl megőriznek minden olyan más szervet is, amelyek a vizsgált anyag ismert tulajdonságai alapján valószínűleg célszerveknek tekinthetők. 1.4.3.6. Kórszövettani vizsgálatok A tartósított szerveket és szöveteket mind a kontrollcsoport, mind a magas dózissal kezelt csoport összes egyede esetében teljes kórszövettani vizsgálatnak vetik alá. Ha a magas dózissal kezelt csoport egyedei esetében a kezelésnek tulajdonítható elváltozások figyelhetők meg, ezt a vizsgálatot az összes többi, különböző dózissal kezelt csoport egyedeire is kiterjesztik. Minden makroszkópikus sérülést megvizsgálnak. Ún. kísérő csoport használata esetén az egyedek azon szerveit és szöveteit vizsgálják meg, amelyeknél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozásokat lehetett kimutatni. 2. ADATOK Minden egyes állattal kapcsolatban rögzítik az adatokat. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában összegezik, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani állatvédelmi okokból a kísérlet során, valamint az elpusztulás és az elpusztítás időpontját; hány egyed mutatta toxicitás jeleit, a megfigyelt toxicitás jeleinek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, időtartamát és súlyosságát, a sérült állatok számát, a sérülések típusát és az egyes sérülés-típusokat mutató állatok százalékos arányát. Ahol lehetséges, a nyers adatokat megfelelő, általánosan elfogadott statisztikai módszerrel értékelik ki. A statisztikai módszert már a vizsgálat tervezésének idején kiválasztják. 3. ZÁRÓVIZSGÁLATIJELENTÉS Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – tartalmazza a következő információkat: Kísérleti állatok: - felhasznált állatok faja és törzse, - az állatok száma, életkora és neme, - az állatok eredete, tartási körülmények, étrend stb., - az egyes állatok súlya a vizsgálat kezdetekor, majd hetente és a vizsgálat végén. Vizsgálati körülmények: - a vivőanyag kiválasztásának indoklása, ha az nem víz, - az adagolási szintek kiválasztásának indokai, - a vizsgált anyag előkészítésére/az elért koncentrációra, a készítmény stabilitására és homogenitására vonatkozó adatok, - a vizsgált anyag beadására vonatkozó adatok, - átszámítás a vizsgált anyagnak a táplálékban/ivóvízben meglévő koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez alkalmazható, - a táplálék és az ivóvíz minőségére vonatkozó adatok. Eredmények: - testsúly és annak változásai, - táplálék-/vízfogyasztásra vonatkozó adatok, ha alkalmazható, - toxikus reakcióra vonatkozó adatok, nemek és adagolási szint szerinti csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit, - a megfigyelt klinikai tünetek természete, súlyossága és tartama (reverzibilisek vagy nem), - érzékszervek működése, szorítás erőssége, motoros tevékenységek értékelése, - hematológiai vizsgálatok eredményei, a megfelelő viszonyítási értékekkel, - klinikai biokémiai vizsgálatok eredményei, a megfelelő viszonyítási értékekkel, - a kísérleti állatok testsúlya az elpusztításkor és a szerveik tömege, - boncolási leletek, - az összes kórszövettani lelet részletes leírása, - reszorbciós adatok, ha rendelkezésre állnak, - az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható. Az eredmények tárgyalása. Összefoglaló megállapítások. 4. HIVATKOZÁSOK Ez a módszer megfelel az OECD TG 407-nek. " [1] A szérum és a plazma vizsgálatok, de főleg a glükóz meghatározása miatt, ajánlatos a vizsgálat előtti éjszaka koplaltatni az állatokat. Ennek fő indoka az, hogy ha a vizsgálatokat megelőző koplaltatás nélkül végzik, akkor a kapott eredmények meglehetősen válzatosak lennének, ami így a kevésbé jellegzetes hatások felismerését és értelmezését megnehezítené. Más oldalról megközelítve a kérdést, azt is el kell ismerni, hogy a koplaltatás befolyásolja a kísérleti állatok (rendes) anyagcseréjét, különösen azon tanulmányok esetében, ahol a vizsgált anyagot a táplálékkal adagolják és így következik be az expozíció. Ha mégis az éjszakai koplaltatás mellett döntenek, akkor a tanulmány negyedik hetében, a funkcionális megfigyeléseket követően meg kell határozni a klinikai biokémiai paramétereket. -------------------------------------------------- IV. E. MELLÉKLET " B.37. SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT AKUT KÉSLELTETETT NEUROTOXICITÁS 1. MÓDSZER 1.1. Bevezetés Az egyes anyagok toxikus hatásainak felbecslése és kiértékelése során fontos azt figyelembe venni, hogy az anyagok egyes osztályai bizonyos típusú neurotoxicitást okozhatnak, amelyet esetleg nem lehet bebizonyítani más típusú toxicitás-vizsgálatokkal, de szükséges a vizsgálata. Egyes foszfororganikus vegyületek a korábbi megfigyelések szerint késleltetett neurotoxikus hatásokat okoznak, ezek azok az anyagok, amelyeknek az e (alábbiakban ismertett) módszer szerinti vizsgálata szóba jöhet. In vitro szűrő vizsgálatokat lehet alkalmazni azoknak az anyagoknak a meghatározása céljából, amelyek késleltetett polyneuropathiát okozhatnak; mindazonáltal az in vitro vizsgálatok negatív eredménye nem biztosíték arra, hogy az anyag nem idegméreg. Lásd az Általános bevezetés B. részét. 1.2. Fogalommeghatározások A foszfororganikus vegyületekhez tartoznak azok a telítetlen foszfororganikus észterek, a tioészterek vagy a szerves foszforsavak, a foszfonsavak és a foszforamid-savak anhidridjei, illetve a rokon foszfortiosav, foszfontiosav vagy foszfortioamid-sav, továbbá egyéb anyagok, amelyek ebbe a vegyületosztályba tartoznak és olykor megfigyelhető késleltetett neurotoxicitást okozhatnak. Késleltetett neurotoxicitás az a tünetcsoport, amely a hosszan késleltetett végtagmozgási zavarokkal (ataxia), a gerincvelő és a környéki (perifériás) idegek távoli kötődéseivel és az idegszövetben lévő neuropathiás cél-észterázok (NTE) gátlásával vagy öregedésével kapcsolatos. 1.3. Referenciaanyagok Egy referenciaanyagot meg lehet vizsgálni egy pozitív kontrollcsoport segítségével azzal a céllal, hogy bemutassák, hogy laboratóriumi vizsgálati körülmények között a kísérleti fajok reakciója nem változik lényegesen. Példa egy széleskörűen alkalmazott idegméregre a tri-o-tolil-foszfát (CAS 78-30-8, EINECS 210-103-5, CAS-elnevezése: Foszforsav-trisz(4-metilfenil)-észter, más néven Trikrezil-foszfát. 1.4. A vizsgálati módszer elve A vizsgált anyagot egy dózisban, szájon keresztül adják be házityúkoknak, amelyeket szükség esetén megóvtak az akut kolinerg hatásoktól. Az állatokat 21 napon keresztül figyelik meg viselkedési rendellenességek, ataxia és paralízis szempontjából. A biokémiai paramétereket, különösen a neuropathiás cél-észterázok (NTE) gátlását minden csoportból véletlenszerűen kiválasztott tyúkokon mérik, általában az adagolás után 24–48 órával. Az adagolás után 21 nappal az életben maradt tyúkokat elpusztítják, és egyes idegszövetek kórszövettani vizsgálatát elvégzik. 1.5. A vizsgálati módszer leírása 1.5.1 Előkészületek Egészséges, fiatal, felnőtt tyúkokkal kísérleteznek, amelyek mentesek a zavaró vírusos betegségektől és gyógykezeléstől, továbbá nincs járászavaruk; az állatokat véletlenszerűen kezelt és kontrollcsoportba osztják és a vizsgálat megkezdése előtt legalább öt napig hagyják őket a laboratóriumi körülményekhez alkalmazkodni. Olyan ketrecet vagy karámot használnak, amely elég nagy ahhoz, hogy lehetővé tegye a tyúkok szabad mozgását és a járáskép könnyű megfigyelését. A vizsgált anyagot orálisan adják be, gyomorszonda segítségével, vagy zselatin kapszulák alkalmazásával vagy egyéb hasonló eljárással. A folyadékokat hígítás nélkül vagy megfelelő vivőanyagban, pl. kukoricaolajban feloldva adják be; a szilárd anyagokat lehetőség szerint feloldják, mivel a zselatin kapszulába helyezett nagy mennyiségű szilárd anyag esetleg nem szívódik fel teljesen. Amennyiben nem víz a vivőanyag, akkor a vivőanyag toxikus tulajdonságainak ismertnek kell lenniük, eltérő esetben e tulajdonságokat a vizsgálat megkezdése előtt meghatározzák. 1.5.2. Vizsgálati körülmények 1.5.2.1. A kísérlethez felhasznált állatok A fiatal felnőtt, 8–12 hónapos házi tojótyúk (Gallus gallus domesticus) használata ajánlott. A szokásos méretű fajtákat használják, olyan tyúkokat, amelyeket szabad mozgást biztosító körülmények között tenyésztettek. 1.5.2.2. Az állatok száma és neme A kezelt csoport mellett mind vivőanyagos kontrollcsoportot, mind pozitív kontrollcsoportot vizsgálnak. A vivőanyagos kontrollcsoportban lévő állatokat a vizsgált anyag beadásától eltekintve a kezelt csoportba beosztottakkal azonos bánásmódban részesítik. Az egyes csoportokban lévő állatok számát oly módon határozzák meg, hogy legalább hat madarat el lehessen pusztítani a biokémiai paraméterek meghatározásokhoz (hármat-hármat a két külön megfigyelési időpontban); továbbá hat madár túlélje a 21 napos megfigyelési időszakot, mert ezeken patológiai vizsgálatokat végeznek majd. A pozitív kontrollcsoportot lehet egyidejűleg vizsgálni, vagy ez lehet egy korábbi, már vizsgált kontrollcsoport is. Ez a csoport legalább hat tyúkból áll, amelyeket egy ismert, késleltetett hatású idegméreggel kezelnek. Az állatok közül hármat biokémiai, hármat patológiai vizsgálatok céljára szánnak. A korábbi adatok rendszeres aktualizálása javasolt. Új pozitív kontrolladatokat vesznek fel, ha a vizsgálat lefolytatásának valamilyen fontos eleme (pl. származás, táplálék, tartási körülmények) megváltozik a vizsgálatot végző laboratóriumban. 1.5.2.3. Adagolási szintek Az előzetes tanulmány során megfelelő számú állatnak és adagolási csoportnak a fő kísérletben alkalmazott dózist adagolják. Csekély számú kísérleti állat elhullása általában szükséges ebben az előzetes tanulmányban, a fő vizsgálat megfelelő dózisszintjeinek kiválasztásához. Az akut kolinerg hatások miatt bekövetkező elhullások megakadályozása érdekében atropint vagy egyéb olyan védő hatóanyagot alkalmazhatnak, amely közismerten nem befolyásolja a késleltetett neurotoxikus hatásokat. Többféle vizsgálati módszer alkalmazható a vizsgált anyag legnagyobb nem halálos dózisának meghatározásához (lásd B.1.bisz módszer). A tyúkokra vonatkozó korábbi adatok vagy egyéb toxikológiai adatok is hasznosnak bizonyulhatnak a dózis kiválasztása során. A fő vizsgálat során alkalmazott vizsgált anyag dózisa az előzetes dózis-behatároló vizsgálat eredményeinek figyelembevételével meghatározott lehető legmagasabb legyen, 2000 mg/kg testsúly felső határ mellett. Esetleg előforduló időközbeni elhullás nem gátolhatja meg a szükséges mennyiségű állat túlélését a biokémiai (hat) és a szövettani (hat) vizsgálatokhoz a 21. napon. Az akut kolinerg hatások miatt bekövetkező elhullást atropinnal vagy egyéb védő hatóanyag alkalmazásával kerülik el, amely bizonyított módon nem gyakorol befolyást a késleltetett neurotoxikus hatásokra. 1.5.2.4. Határérték-vizsgálat Ha a kísérlet során a legalább 2000 mg/kg testsúly/nap adagolási szint ill. az e vizsgálat lefolytatására előírt eljárás betartása mellett a vizsgált anyag nem okoz észlelhető toxikus hatásokat, és ha a szerkezet tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthető. A határérték-vizsgálat alkalmazható, kivéve ha emberi expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja. 1.5.2.5. Megfigyelési időszak A megfigyelési időszak 21 nap. 1.5.3. A kísérlet végrehajtása Az akut kolinerg hatások miatt bekövetkező elhullás megakadályozása érdekében alkalmazott védő anyag beadása után a vizsgált anyagot egyszeri dózisban adják be. 1.5.3.1. Megfigyelések A megfigyelés mindjárt közvetlenül az expozíció után megkezdődik. Az első 2 napon minden tyúkot többször gondosan megfigyelnek, majd ezt követően 21 napon keresztül vagy a tervezett elpusztításig, legalább naponta egyszer. A toxicitás minden tünetét gondosan feljegyzik, beleértve a viselkedési rendellenesség kialakulásának időpontját, típusát, súlyosságát és tartamát. A végtagok mozgási zavarát (ataxia) skálán mérik, amely legalább négy szintet tartalmaz, továbbá a bénulást (paralízis) is feljegyzik. Hetente legalább kétszer kiveszik a ketrecből azokat a tyúkokat, amelyeket patológiai vizsgálatoknak szándékoznak alávetni és egy meghatározott időre fokozott motoros tevékenységet váltanak ki (pl. létramászás), hogy már a legkisebb jelentkező toxikus hatások megfigyelhetőségét megkönnyítsék. A haldokló állatokat és súlyosan szenvedő, vagy fájdalommal küszködő állatokat az állatvédelmi előírásoknak megfelelően elpusztítják, majd felboncolják. 1.5.3.2. Testsúly Minden tyúkot lemérnek közvetlenül a vizsgált anyag beadása előtt, majd ezután legalább hetente egyszer. 1.5.3.3. Biokémiai vizsgálatok Minden kezelt és vivőanyag kontrollcsoportból hat tyúkot, a pozítiv kontrollcsoportból hármat (ha egyidejűleg ezt a csoportot is vizsgálják) véletlenszerűen kiválasztanak és a vizsgált anyag beadása után pár nappal elpusztítanak, azért hogy az agyat és a lumbális gerincvelőt preparálják, és abban a neuropathiás cél-észteráz (NTE) gátló aktivitást megmérik. Ezen túlmenően hasznos lehet az ülőideg kikészítése és abban a neuropathiás cél-észteráz (NTE) gátló aktivitásának megmérése. Általában három madarat pusztítanak el mind a kezelt csoportokban, mind a negatív kontrollcsoportban az utolsó dózis után 24 órával és másik hármat 48 órával később, a pozitív kontrollcsoportból származó három kísérleti állatot 24 órával később pusztítják el. Ha az intoxikáció klinikai tüneteinek megfigyeléséből (pl. a kolinerg tünetek időbeli jelentkezésének megfigyeléséből) arra lehet következtetni, hogy a toxikus hatóanyag kifejezetten lassan hat, akkor ajánlatos mind a három állattól két alakalommal 24–72 órával a vizsgált anyag adagolását követően szövetmimtákat venni. Acetil-kolin észteráz (AChE) elemzését is el lehet végezni ezeken a mintákon, ha az célszerűnek tűnik. Figyelembe kell azonban venni az AChE spontán újraaktiválódását, amely in vivo előfordulhat és így az anyag AChE gátló hatásának alulértékelését okozhatja. 1.5.3.4. Autopszia Minden (a tervezett módon és a haldoklás miatt állatvédelmi okokból elpusztított) állat agyát és gerincvelőjét boncolásnak vetik alá. 1.5.3.5. Kórszövettani vizsgálat A vizsgálati időszakot túlélő és azon állatok idegszöveteit, amelyeket nem biokémiai kísérleteknek vetnek alá, mikroszkóppal megvizsgálják. A szöveteket perfúziós módszerrel természetes helyzetben (in situ) tartósítják. A metszetek tartalmazzák a kisagyat (középső hosszanti szinten), a nyúltagyat, a gerincvelőt és a környéki (perifériás) idegeket. Gerincvelő metszeteket a felső nyaki, a középső mellkasi és az ágyékkeresztcsonti szakaszból veszik. A környéki idegi metszeteket a sípcsonti ideg és gyomorizomhoz tartó elágazásaiból és az ülőidegből veszik. A metszeteket megfestik a megfelelő mielinre és axonra érzékeny festékkel. Először elvégzik a mikroszkópos vizsgálatot minden állat tartósított szövetein a kontroll- és a legnagyobb adagolású csoportnál. Ha bizonyítható a hatás a legnagyobb adagolású csoportnál, akkor elvégzik a mikroszkópos vizsgálatot a középső és az alacsony adagolású csoport állatainak szövetein is. 2. ADATOK Az ebben a módszerben a kiválasztott végpontokon kapott negatív eredmények (biokémia, kórszövettan és viselkedési megfigyelések) általános esetben nem igényelnek további vizsgálatot a késleltetett neurotoxicitás vonatkozásában. Bizonytalan vagy nem meggyőző eredmények esetén szükség lehet további vizsgálatokra. Minden egyes állattal kapcsolatban rögzítik az adatokat. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában összegzik. Ebből a kísérleti állatok minden csoportja tekintetében kiderül: a kísérlethez felhasznált álltok száma a vizsgálat elején, a sérült állatok száma, viselkedési vagy biokémiai hatások, a sérülések ill. hatások típusa, súlyossága és az egyes sérüléseket vagy hatásokat mutató állatok százalékos eloszlása, típus és súlyosság szerint csoportosítva. E vizsgálat eredményeit az egyes kezelt és kontrollcsoportok tekintetében viselkedési, biokémiai és kórszövettani hatások gyakorisága, súlyossága, korrelációja, valamint bármely más megfigyelt hatás alapján értékelik ki. A számszerű eredményeket megfelelő, általánosan elfogadott statisztikai módszerekkel értékelik ki. Az alkalmazott statisztikai módszereket a vizsgálat tervezése során választják ki. 3. ZÁRÓVIZSGÁLATIJELENTÉS Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – tartalmazza a következő információkat: Kísérleti állatok - a felhasznált állatok faja, - az állatok száma és életkora, - az állatok eredete, tartási körülmények stb., - az egyes állatok súlya a vizsgálat kezdetekor. Vizsgálati körülmények - a vizsgált anyag előkészítésére, stabilitására és homogenitás