A Bizottság 73/46/EGK negyedik irányelve

(1972. december 5.)

a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel az 1972. július 20-i 72/275/EGK irányelvvel [1] módosított, a takarmányok hatósági ellenőrzésénél alkalmazandó közösségi mintavételi és analitikai módszerek bevezetéséről szóló, 1970. július 20-i tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 2. cikkére,

mivel az említett irányelv előírja, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzését, amelynek célja a takarmányok minőségére és összetételére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási intézkedésekből eredő kötelezettségek betartásának ellenőrzése, közösségi mintavételi és analitikai módszerek alkalmazásával kell végrehajtani;

mivel az 1971. június 15-i 71/250/EGK [3], az 1971. november 18-i 71/393/EGK [4] és az 1972. április 27-i 72/199/EGK [5] irányelv már számos közösségi analitikai módszert meghatározott; mivel az azóta eltelt időben, az adott területen történt előrehaladás következtében tanácsos egy negyedik módszersorozat elfogadása;

mivel az ezen irányelvben előírt intézkedések összhangban vannak a Takarmányok Állandó Bizottsága véleményével;

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A tagállamok előírják, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló, az állati és növényi zsírok és olajok nedvességtartalmára, valamint a takarmányok magnézium- és nyersrost-tartalmára vonatkozó analitikai vizsgálatokat ezen irányelv I. mellékletében leírt módszerek szerint kell végrehajtani.

Az 1971. június 15-i 71/250/EGK első bizottsági irányelv mellékletének 1. részében (Bevezetés) megállapított általános rendelkezéseket kell alkalmazni ezen irányelv I. mellékletében leírt módszerek esetében.

2. cikk

A tagállamok előírják, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló, a retinol- (A-vitamin), a tiamin- (aneurin, B1 vitamin), az aszkorbinsav- és a dehidro-aszkorbinsav-tartalomra vonatkozó analitikai vizsgálatokat ezen irányelv II. mellékletében leírt módszerek szerint kell végrehajtani.

Az 1971. június 15-i 71/250/EGK első bizottsági irányelv mellékletének 1. részében (Bevezetés) megállapított általános rendelkezéseket kell alkalmazni ezen irányelv II. mellékletében leírt módszerek esetében, a analizálandó minta előkészítésére vonatkozó rész kivételével.

3. cikk

A tagállamok legkésőbb 1974. január 1-jéig hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

4. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1972. december 5-én.

a Bizottság részéről

S. L. Mansholt

az elnök

[1] HL L 171., 1972.7.29., 39. o.

[2] HL L 170., 1970.8.3., 2. o.

[3] HL L 155., 1971.7.12., 13. o.

[4] HL L 279., 1971.12.20., 7. o.

[5] HL L 123., 1972.5.29., 6. o.

--------------------------------------------------

I. MELLÉKLET

1. AZ ÁLLATI ÉS NÖVÉNYI ZSÍROK ÉS OLAJOK NEDESSÉGTARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi az állati és növényi zsírok és olajok víz- és illóanyag-tartalmának meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát 103 °C-on, a tömegállandóság eléréséig szárítjuk. A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg.

3. Eszközök

3.1. Rozsdamentes anyagból készült, 809 cm átmérőjű és körülbelül 3 cm magas, lapos fenekű edény.

3.2. rögzített üveggömbbel és a felső végén kiterjedési csővel rendelkező higany-hőmérő, amely körülbelül 80–110 °C-ig beosztású és körülbelül 10 cm hosszú.

3.3. Homokfürdő vagy elektromos főzőlap.

3.4. Hatékony szárítóközeget tartalmazó exszikkátor.

3.5. Analitikai mérleg.

4. A vizsgálat módja

Mérjünk ki mg pontossággal 20 g homogenizált mintát a hőmérőt (3.2.) tartalmazó száraz, lemért edénybe (3.1.). A hőmérővel folyamatosan kevergetve hevítsük a homokfürdőn vagy a főzőlapon (3.3.) úgy, hogy a hőmérséklet körülbelül 7 perc alatt érje el a 90 °C-ot.

Csökkentsük a hőt, ügyelve az edény aljáról felszálló buborékok gyakoriságára. A hőmérséklet nem haladhatja meg a 105 °C-ot. Folytassuk az edény alján lévő anyag keverését, amíg a buborékképződés le nem áll.

A teljes kiszárítás érdekében hevítsük az edényt néhányszor 103 ± 2 °C-ra, miközben két hevítés között 93 °C-ra hűtjük tartalmát. Ezután hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni az exszikkátorban (3.4.), és mérjük le. Ismételjük addig a műveletet, amíg a két egymást követő mérés közötti tömegveszteség már nem haladja meg a 2 mg-ot.

Megjegyzés:

A minta tömegének növekedése a többszöri hevítést követően a zsír oxidációját jelzi, ebben az esetben az eredményt a tömeg növekedését közvetlenül megelőző mérés alapján kell kiszámítani.

5. Az eredmény kiszámítása

A mintára vonatkoztatott, százalékosan kifejezett nedvességtartalmat a következő képlettel lehet kiszámítani:

·

M

ahol:

M0 = a vizsgált minta tömege, grammban;

M1 = az edény hevítés előtti tömege, grammban, a tartalmával együtt;

M2 = az edény hevítés utáni tömege, grammban, a tartalmával együtt;

A 0,05 %-nál kisebb eredményeket a "0,05 %-nál kisebb" megnevezéssel kell feljegyezni.

Megismételhetőség

Az ugyanazon mintán, párhuzamosan végzett két meghatározás eredményeként kapott nedvességtartalmak eltérésének abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,05 %-ot.

2. A MAGNÉZIUM MEGHATÁROZÁSA

– atomabszorpciós spektrofotometriával –

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányokban található magnézium mennyiségének meghatározását. E módszer különösen alkalmas az 5 %-nál alacsonyabb magnéziumtartalom meghatározására.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát hamvasztjuk és hígított sósavban feloldjuk. Ha a minta nem tartalmaz szerves anyagokat, akkor közvetlenül hígított sósavban oldjuk fel. Az oldatot felhígítjuk, és magnéziumtartalmát atomabszorpciós spektrofotometriával, 285,2 nm hullámhosszon, standardoldatokhoz viszonyítva határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. Sósav, a.t. d: 1,16

3.2. Tömény sósav, a.t. d: 1,19

3.3. Magnéziumszalag vagy -drót vagy szobahőmérsékleten szárított magnézium-szulfát-heptahidrát.

3.4. Stronciumsó-oldat (klorid vagy nitrát) 2,5 (w/v) % stronciumtartalommal (= 76,08 g SrCl26 H2O, a.t. vagy 60,38 g Sr(NO3)2, a.t.).

3.5. Magnézium standardoldat: mérjünk ki mg pontossággal 1 g magnéziumot, amelynek oxidbevonatát ezt megelőzőleg óvatosan eltávolítottuk, vagy egyenérték tömegű (10,143 g) magnézium-szulfát-heptahidrátot (3.3.). Helyezzük egy1000 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá 80 ml sósavat (3.1.), hagyjuk feloldódni és töltsük fel 1000 ml-re vízzel. Ennek az oldatnak 1 ml-re 1,000 mg magnéziumot tartalmaz.

4. Eszközök

4.1. Platina, kvarc vagy porcelán hamvasztótégelyek.

4.2. Szabályozható hőmérsékletű elektromos égetőkemence.

4.3. Atomabszorpciós spektrofotométer.

5. A vizsgálat módja

5.1. A mintaoldat elkészítése

5.1.1. Kizárólag ásványi anyagokból álló takarmányok

Mérjünk ki mg pontossággal 5 g mintát egy 250–300 ml vízzel töltött 500 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 40 ml sósavat (3.1.), forraljuk fel, és 30 percig tartsuk a folyadékot enyhe forrásban. Hagyjuk kihűlni, töltsük fel jelig vízzel, keverjük össze, és egy száraz, redős szűrőn keresztül szűrjük át egy száraz főzőpohárba. A szűrlet első 30 ml-ét öntsük el. Szilicium-dioxid jelenlétében kezeljünk 5 g mintát megfelelő mennyiségű (15–30 ml) sósavval (3.2.), vízfürdőn pároljuk szárazra és helyezzük át egy 105 °C-os kemencébe, egy órára. Folytassuk a műveletet az 5.1.2. pont harmadik mondatától.

5.1.2. Túlnyomórészt ásványi anyagokból álló takarmányok

Mérjünk ki mg pontossággal 5 g mintát egy hamvasztótégelybe és égetőkemencében hamvasszuk 550 °C-on addig, amíg széntartalmú részecskéktől mentes hamu keletkezik, majd hagyjuk kihűlni. A szilicium-dioxid eltávolítása céljából adjunk a hamuhoz megfelelő mennyiségű (15–30 ml) sósavat (3.2.), vízfürdőn pároljuk szárazra és helyezzük át egy 105 °C-os kemencébe, egy órára. Kezeljük a maradékot 10 ml sósavval (3.1.) és meleg vizet használva, helyezzük át egy 500 ml-es mérőlombikba. Hagyjuk kihűlni és töltsük fel a jelig vízzel. Keverjük össze, és egy száraz, redős szűrőn keresztül szűrjük át egy száraz főzőpohárba. A szűrlet első 30 ml-ét öntsük el.

5.1.3. Túlnyomórészt szerves anyagokból álló takarmányok

Mérjünk ki mg pontossággal 5 g mintát egy hamvasztótégelybe, és égetőkemencében hamvasszuk 550 °C-on addig, amíg széntartalmú részecskéktől mentes hamu keletkezik. Kezeljük a hamut 5 ml sósavval (3.2.), pároljuk szárazra vízfürdőn, és azután a szilicium-dioxid oldhatatlanná tétele céljából szárítsuk egy óráig kemencében 105 °C-on. Kezeljük a hamut 5 ml sósavval (3.1.), és meleg vizet használva helyezzük át egy 250 ml-es mérőlombikba, forraljuk fel, hagyjuk kihűlni és töltsük fel a jelig vízzel. Keverjük össze, és egy száraz, redős szűrőn keresztül szűrjük át egy száraz főzőpohárba. A szűrlet első 30 ml-ét öntsük el.

5.2. Atomabszorpciós mérés

A standard oldat (3.5.) vízzel történő hígításával készítsünk legalább 5, növekvő koncentrációjú referenciaoldatot a spektrofotométer optimális mérési tartományának megfelelően. Adjunk mindegyik oldathoz 10 ml stronciumsó-oldatot (3.4.), és azután töltsük fel vízzel 100 ml-re. Hígítsuk fel vízzel az 5.1.1., 5.1.2. vagy 5.1.3. pont szerint nyert szűrlet aliquot részét annyira, hogy a magnézium koncentrációja a referenciaoldatok koncentrációhatárain belül legyen. Ezen oldat sósav-koncentrációja nem haladhatja meg a 0,4 N-t. Adjunk hozzá 10 ml stronciumsó-oldatot (3.4.), és azután töltsük fel vízzel 100 ml-re. Mérjük meg a meghatározandó oldat és a referenciaoldatok abszorpcióját 285,2 nm hullámhosszon.

6. Az eredmény kiszámítása

A referenciaoldatokhoz viszonyítva számítsuk ki a mintában lévő magnézium mennyiségét. Az eredményt a mintára vonatkoztatva, százalékosan fejezzük ki.

Megismételhetőség

Az ugyanazon a mintán párhuzamosan végzett két meghatározás eredménye közötti különbség relatív értékben nem haladhatja meg az 5 %-ot.

3. A NYERSROST MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányokban előforduló, hagyományosan nyersrostnak nevezett, savas és lúgos közegben oldhatatlan, zsírmentes szerves anyagok mennyiségének meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A szükség esetén zsírtalanított mintát többször egymás után, meghatározott koncentrációjú kénsav és kálium-hidroxid forrásban lévő oldataival kezeljük. A maradékot azbeszt jelenlétében szűréssel elválasztjuk, kimossuk, megszárítjuk, lemérjük és 900 °C-on elhamvasztjuk. A hamvasztásból eredő tömegveszteség megegyezik a vizsgált minta nyersrost-tartalmával.

3. Reagensek

3.1. 0,26 N kénsav.

3.2. Kezelt azbeszt: adjunk a Gooch-tégelyben használttal megegyező típusú azbeszthez, az azbeszt tömegének körülbelül az ötszörösét kitevő sósavoldatot (1 térfogat sósav, d: 1,19 sósav + 3 térfogat víz). Forraljuk a keveréket körülbelül 45 percig, hagyjuk kihűlni és egy Buchner-szűrőtölcséren szűrjük át. Mossuk ki a maradékot először vízzel, amíg a sósav eltűnik a mosóvízből, azután mossuk acetonnal (3.6.). Szárítsuk meg az azbesztet a szárítókemencében, és azután hamvasszuk két órán keresztül 900 °C-on. Hagyjuk kihűlni, és tartsuk lezárt lombikban. Az ilyen módon kezelt azbeszt több alkalommal használható. Az azbesztnek meg kell felelnie az 5. pontban megadott, vakpróbára vonatkozó előírásnak.

3.3. Habzásgátló emulzió (pl. szilícium).

3.4. 0,23 N kálium-hidroxid oldat.

3.5. 0,5 N sósav.

3.6. Aceton.

3.7. Dietiléter.

4. Eszközök

4.1. Legalább 600 ml űrtartalmú főzőpoharak, mérőjellel a 200 ml-es szintnél.

4.2. Körülbelül 80 mm átmérőjű és körülbelül 4 mm vastagságú porcelánkorongok, amelyeken körülbelül 32, egyenként körülbelül 4 mm átmérőjű lyuk van.

4.3. Körülbelül 2 literes, gumidugós, a 800 ml-es szintnél mérőjellel ellátott és 120 mm átmérőjű üvegtölcsérekkel felszerelt vákuumlombikok.

4.4. Körülbelül 40 mm átmérőjű és 4 mm vastagságú szűrőlemezek a tölcsér (4.3.) kúpjába illeszkedő ferde széllel, amelyeken körülbelül 16 darab körülbelül 4 mm átmérőjű lyuk található, és ezek körülbelül 1 mm szemnagyságú dróthálóval vannak borítva. Mind a lemezek, mind a drótháló legyen rezisztens a savakkal és lúgokkal szemben.

4.5. Platina vagy kvarc hamvasztótégelyek.

4.6. Szabályozható hőmérsékletű elektromos kemence.

4.7. Exszikkátor.

4.8. Azbesztszűrő: szuszpendáljunk 2,0 g azbesztet (3.2.) 100 ml vízben.

Szűrjünk vákuumban a vákuum-lombik (4.3.) tölcsérébe helyezett dróthálóval borított szűrőlapon (4.4.) át. Gyűjtsük össze a szűrletet, és szűrjük át még egyszer ugyanazon a szűrőn. A szűrletet öntsük el.

5. A vizsgálat módja

Mérjünk ki mg pontossággal 3 g mintát és 2 g kezelt azbesztet (3.2.) egy főzőpohárba (4.1.), adjunk hozzá 200 ml kénsavat (3.1.) és néhány csepp habzásgátló emulziót (3.2.). Gyorsan forraljuk fel, és hagyjuk forrásban pontosan 30 percig. Az állandó térfogat megtartása érdekében fedjük le a főzőpoharat egy hűtőeszközzel, például egy 500 ml-es gömblombikkal, amelyben hideg víz kering. Körülbelül 50 ml hideg víz hozzáadásával állítsuk le a forrást, és vákuumban azonnal szűrjük keresztül az oldatot a 4.8. pont szerint, korábban elkészített azbesztszűrőn.

Mossuk ki a maradékot 5 adag, körülbelül 100 ml-es nagyon forró vízzel úgy, hogy végül 800 ml szűrletet kapjunk. Öntsük át a maradékot teljes mennyiségben a főzőpohárba (4.1.), amelyhez először egy porcelánkorongot (4.2.) csatlakoztatunk a forrás szabályozása érdekében. Adjunk hozzá 200 ml kálium-hidroxid oldatot (3.4.). Gyorsan forraljuk fel és hagyjuk forrásponton pontosan 30 percig. Adjunk hozzá körülbelül 50 ml hideg vizet, és vákuum alatt azonnal szűrjük át a 4.8. pont szerint korábban elkészített friss azbesztszűrőn. Mossuk a maradékot nagyon forró vízzel, amíg a mosóvíz semlegessé nem válik (ellenőrizzük lakmuszpapírral), majd mossuk háromszor acetonnal (3.6.) (összesen körülbelül 100 ml acetonnal).

A maradékot teljes mennyiségben öntsük át egy hamvasztótégelybe (4.5.), szükség esetén zúzzuk szét és 130 °C-on szárítsuk a tömegállandóság eléréséig szárítókemencében.

Hagyjuk kihűlni az exszikkátorban (4.7.) és gyorsan mérjük le.

Helyezzük a hamvasztótégelyt az égetőkemencébe (4.6.), és 900 °C-on hamvasszuk 30 percig. Hagyjuk kihűlni az exszikkátorban (4.7.) és gyorsan mérjük le.

Végezzünk vakpróbát, ugyanazt az eljárást alkalmazva, mint a kezelt azbeszt esetén, de a minta nélkül. A 6 g azbeszt elhamvasztásából eredő tömegveszteség nem haladhatja meg a 10 mg-ot.

6. Az eredmény kiszámítása

A mintára vonatkoztatott, százalékosan kifejezett nyersrosttartalom az alábbi képélettel adható meg:

·100

3

ahol:

a = a meghatározás során végzett hamvasztás utáni tömegveszteség;

b = a vakpróba során végzett hamvasztás utáni tömegveszteség.

Megismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két, párhuzamosan meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

abszolút értékben a 0,3-at, 10 %-nál alacsonyabb nyersrosttartalom esetében;

relatív értékben a 3 %-ot, 10 %-os vagy annál magasabb nyersrosttartalom esetében.

7. Észrevételek

7.1. A 10 %-nál több olajat és zsírt tartalmazó takarmányokat az analízis előtt dietiléterrel (3.7.) zsírtalanítani kell. Ehhez helyezzük a vizsgált mintát (3 g, mg pontossággal kimérve) egy azbesztszűrőre (4.8.). Borítsuk be három alkalommal körülbelül 50 ml dietiléterrel, és minden alkalommal vákuum alatt óvatosan szűrjük le. Öntsük át a zsírtalanított mintát és az azbesztet teljes mennyiségben egy főzőpohárba (4.1.), és folytassuk az analízist az 5. pont szerint.

7.2. A közvetlenül nem extrahálható olajat és zsírt tartalmazó takarmányokat a 7.1. pont szerint zsírtalanítani kell, majd a savmaradéknak a maradékanyagból történő kimosása után még egy alkalommal zsírtalanítani kell.

Ehhez mossuk ki az említett savmaradékot a maradékanyagból háromszor acetonnal (3.6.) (összesen 100 milliliterrel), majd háromszor 50 ml dietiléterrel (3.7.). Ezután a maradékanyagot teljes mennyiségben öntsük át egy főzőpohárba (4.1.), és folytassuk az analízist az 5. pont második bekezdése szerint (kálium-hidroxid oldattal történő kezelés).

7.3. Kalciumban gazdag takarmány esetében (több mint 2 % kalcium), helyezzük a vizsgált mintát (3 g, mg pontossággal kimérve) egy főzőpohárba (4.1.) 100 ml 0,5 Ν sósavval együtt (3.5.), és hagyjuk állni 5 percig hűvös helyen. Azonnal szűrjük le, és mossuk át hideg vízzel. Szűrési segédanyagként használjunk a kénsavban történő forralásra előírt 2,0 g azbesztet. Ha a szűrés nehéznek bizonyulna, akkor hígítsuk fel a szuszpenziót acetonnal (3.6.). Ezután folytassuk a műveletet az 5. pont szerint.

--------------------------------------------------

II. MELLÉKLET

1. A RETINOL (A-VITAMIN) MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok, koncentrátumok és előkeverékek retinoltartalmának (A-vitamin) meghatározását. A meghatározás alsó méréshatára 10000 NE/kg az erősen színezett takarmányokban és 4000 NE/kg az egyéb takarmányokban [1]. A termékek, feltételezett retinoltartalmuk szerint, két csoportba sorolhatók:

A.csoport: 200000 NE/kg retinoltartalom alatt;

B.csoport: 200000 NE/kg vagy magasabb retinoltartalom.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát, még melegen, kálium-hidroxid oldattal hidrolizáljuk etanolos közegben és antioxidáns jelenlétében vagy nitrogén atmoszféra alatt. A keveréket 1,2-diklór-etánnal extraháljuk. A kivonatot bepároljuk, és petroléterrel kezeljük. Az oldatot alumínium-oxid oszlopkromatográfiával mérjük (a B. csoportba tartozó termékek esetében a kromatográfia csakbizonyosesetekben szükséges). Az A. csoportba tartozó termékek esetében a retinolt a Carr-Price reakció szerinti színezett komplex képződését követően, 610 nm hullámhosszon spektrofotometriával határozzuk meg; a B. csoportba tartozó termékek esetében a meghatározás 325 nm hullámhosszúságú UV spektrofotometriával történik.

3. Reagensek

a) mind az A., mind a B. csoportba tartozó termékek analíziséhez

3.1. 96 %-os (v/v) etanol.

3.2. 10 %-os (w/v) a.t. nátrium-aszkorbát oldat, vagy

3.3. Tisztított nitrogén.

3.4. 50 %-os (w/v) a.t. kálium-hidroxid oldat.

3.5. 1 N a.t. kálium-hidroxid oldat.

3.6. 0,5 N a.t. kálium-hidroxid oldat.

3.7. 1,2-diklór-etán, a.t.

3.8. Petroléter, forráspont-tartomány: 30–50 °C. Szükség esetén a következők szerint tisztítsuk: keverjünk 1000 ml petroléterbe 20 ml-es adagokban koncentrált kénsavat, amíg a sav színtelen nem marad. Távolítsuk el a savat, és mossuk a petrolétert többször egymás után 500 ml vízzel, kétszer 250 ml 10 %-os (w/v) nátrium-hidroxid oldattal és háromszor 500 ml vízzel. Távolítsuk el a vizes réteget, szárítsuk a petrolétert 1 órán át aktív szén és vízmentes nátrium-szulfát fölött, majd szűrjük és pároljuk be.

3.9. Alumínium-oxid, Brockmann szerint hitelesítve: hamvasszuk 8 órán át 750 °C-on, hűtsük le exszikkátorban, és tartsuk egy csiszolt üvegdugóval ellátott sötét üvegben. A kromatográfiás felhasználás előtt a következő módon nedvesítsük: helyezzünk egy sötét üvegbe 10 g alumínium-oxidot és 0,7 ml vizet, zárjuk le a dugóval, és rázatás közben havítsük 5 percig forrásban lévő vízfürdőben. Hagyjuk kihűlni. Ellenőrizzük az így elkészített alumínium aktivitását ismert mennyiségű retinolnak (3.17.) (kb. 500 NE) az 5.3. és 5.4. pontban leírt eljárással történő lemérésével és visszanyerési próbával.

3.10. 1-es aktivitási fokozatú bázikus alumínium-oxid (Woelm, Merck vagy azokkal egyenértékű).

3.11. Tiszta dietiléter. Távolítsuk el a peroxidokat és a maradék vizet bázikus alumínium-oxid oszlopon (3.10.) végzett kromatográfiával. (25 g alumínium-oxid/250 ml dietiléter.)

3.12. Petroléter oldatok (3.8.) 4, 8, 12, 16 és 20 %-os (v/v) dietiléterrel (3.11.).

3.13. A.t. nátrium-szulfidból készített, 0,5 mólos nátrium-szulfid oldat 70 %-os (v/v) glicerinben.

b) kizárólag az A. csoportba tartozó termékek analizálására

3.14. Kristályosítható benzol, a.t.

3.15. Kloroform, a.t. Távolítsuk el az etanolt, a foszgént és a maradék vizet bázikus alumínium-oxid oszlopon (3.10.) végzett kromatográfiával (50 g alumínium-oxid/200 ml kloroform; ajánlott az eluátum első 50 milliliterét még egyszer átengedni a kromatográfoszlopon).

3.16. Carr-Price reagens: keverjünk össze körülbelül 25 g a.t. (exszikkátorban tartott) antimon-trikloridot 100 ml kloroformmal (3.15.), amíg az oldat telítődik. Az antimon-triklorid kis mértékű leülepedése nem okoz problémát. Adjunk hozzá 2 ml a.t. ecetsav-anhidridet. Tartsuk hűtőben csiszolt üvegdugós sötét üvegpalackban. Az oldat több hétig eláll.

3.17. Retinol – spektrofotometriával hitelesített.

c) kizárólag a B. csoportba tartozó termékek analizására

3.18. Izopropanol, a kromatográfiához.

4. Eszközök

4.1. Vízfürdő.

4.2. Vákuum-bepárló készülék, különböző méretű gömblombikokkal.

4.3. Kromatográfiás üvegcsövek (hosszúság: 300 mm; belső átmérő: kb. 13 mm).

4.4. Spektrofotométer 10 mm-es küvettákkal. Az UV tartományban végzett méréshez kvarc küvetták szükségesek.

4.5. 365 nm hullámhosszon is üzemelő UV lámpák.

5. A vizsgálat módja

Megjegyzés:

Az összes műveletet közvetlen fénytől elzárva kell végezni, szükség esetén sötétített üvegeszközök használatával.

5.1. A vizsgálati minta

A finomra őrölt mintából a feltételezett retinoltartalom arányában mérjünk ki egy vizsgálati mintát, azaz:

0,1–1,0 g-ot a koncentrátumok esetében (magasabb, mint 20000 NE/g tartalom);

3,0–5,0 g-ot az előkeverékek esetében (400 és 20000 NE/g tartalom);

10–20 g-ot az ásványi keverékek esetében;

30 g-ot az A. csoportba tartozó termékek esetében.

A vizsgálati mintát azonnal helyezzük egy 500 ml-es csiszolt üvegdugós lombikba.

5.2. Hidrolízis és extrahálás [2]

Egymás után adjunk a vizsgálati mintához 40 ml etanolt (3.1.), 2 ml nátrium-aszkorbát oldatot (3.2.) [3], 10 ml kálium-hidroxid oldatot (3.4.) és 2 ml nátrium-szulfid oldatot (3.13.).

Hevítsük 30 percig 70–80 °C-on, visszafolyós hűtő alatt, majd vízáram alatt hagyjuk hűlni. Adjunk hozzá 50 ml etanolt (3.1.) és 100 ml 1,2-diklór-etánt (3.7.) (pipettával). Erősen rázzuk össze, majd öntsük át a felülúszó folyadékot egy dekantáló tartályba. Töltsünk a tartályba 150 ml kálium-hidroxid oldatot (3.5.), rázzuk 30 másodpercig és hagyjuk állni, amíg a rétegek szét nem válnak. Gyűjtsük össze a diklór-etán réteget (az alsó réteg) egy dekantáló tartályba, adjunk hozzá 40 ml kálium-hidroxid oldatot (3.6.), rázzuk 10 másodpercig, és hagyjuk állni, amíg a rétegek szét nem válnak. Gyűjtsük össze a diklór-etán réteget egy dekantáló tartályba és mossuk 6-8 alkalommal 40 ml-es vízadagokkal, amíg lúgmentessé nem válik (fenolftalein-próba). Gyűjtsük össze a diklór-etán réteget, és szűrőpapírcsíkok segítségével távolítsuk el a maradék vizet.

Pároljuk szárazra az oldat aliquot részét vákuum alatt, 40 °C-os vízfürdőben. A maradékot gyorsan 5 ml petroléterrel (3.8.) kezeljük.

Az A csoportba tartozó termékek esetében végezzük el az 5.3.1. pont szerinti kromatográfiás vizsgálatot.

A B csoportba tartozó termékek esetében öntsük át az oldatot egy 50 ml-es mérőlombikba, töltsük fel a jelig petroléterrel (3.8.), keverjük össze és az 5.4.2. pont szerint mérjük meg az optikai sűrűséget.

5.3. Kromatográfia

5.3.1. Az A. csoportba tartozó termékek

Töltsük fel a kromatográfiás csövet (4.3.) 200 mm magasságig 10 g alumínium-oxiddal, amelyet előzőleg petroléterrel (3.8.) mostunk össze (3.9.). Helyezzük a csőbe az 5.2. pont szerint kapott oldatot, és azonnal adjunk hozzá 20 ml petrolétert (3.8.). Eluáljuk egymás után a petroléter 4, 8, 12, 16 és 20 %-os dietiléteres (3.12.) oldatainak 10 ml-es adagjaival, nyomás alatt vagy részleges vákuumban, másodpercenként 2–3 csepp átfolyási sebesség mellett.

Először a karotin eluálódik [4]. A retinol általában a 20 %-os dietil-éter tartalmú petroléter oldattal (3.12.) eluálódik. Az elúciót UV fény segítségével követjük nyomon (az oszlop rövid megvilágítása a higanylámpával). A retinol fluoreszkáló része tisztán elkülönül az azt követő sárga xantofill zónáktól. Gyűjtsük össze retinolt tartalmazó eluátum frakcióját egy Erlenmeyer-lombikba.

5.3.2. A B csoportba tartozó termékek

A kromatográfiát csak akkor kell elvégezni, ha az 5.4.2. pont szerint végzett optikai sűrűségmérések nem felelnek meg az 5.4.2. pontban meghatározott követelményeknek.

Ha szükség van kromatográfiás vizsgálatra, akkor helyezzük az oldat, körülbelül 500 NE retinolt tartalmazó aliquot részét az 5.2. pont szerint kapott petroléterben a kromatográfiás oszlopra, és végezzük el a kromatográfiás vizsgálatot az 5.3.1. pont szerint.

5.4. Az optikai sűrűség mérése

5.4.1. Az A csoportba tartozó termékek

Vákuum alatt pároljuk szárazra az 5.3.1. pont szerint kapott retinolt tartalmazó eluátumot. A maradékot kezeljük 2 ml benzollal (3.14.). Vegyünk ebből az oldatból 0,3 ml-t és adjunk hozzá 3 ml Carr-Price reagenst (3.16.). Az oldat bekékül. Mérjük meg az optikai sűrűséget a spektrofotométerrel, 610 nm hullámhosszon, pontosan 30 másodperccel a reakció megkezdődése után. Határozzuk meg a retinoltartalmat a Carr-Price reagenssel kezelt, növekvő standard retinol koncentrációjú benzololdatok alapján megrajzolt standard görbe alapján [2–16 NE retinolstandard (3.17.)/0,3 ml benzol (3.14.) + 3 ml Carr-Price reagens (3.16.)]. A standard görbét rendszeresen és gyakran kell ellenőrizni a standard oldattal és frissen készített Carr-Price reagenssel.

5.4.2. A B csoportba tartozó termékek

Vegyünk az 5.2. pont szerint nyert petroléterben lévő oldatból, körülbelül 200 NE retinolt tartalmazó aliquot részt. Vákuum alatt pároljuk szárazra, és a maradékot kezeljük 25 ml izopropanollal (3.18). Mérjük meg az optikai sűrűséget spektrofotométerrel, 325, 310 és 334 nm hullámhosszon. Az abszorpciós maximum 325 nanométernél van. Az oldat retinoltartalmát a következőképpen kell kiszámítani:

[E325 · 18,30 = NE retinol/ml]

Azonban az optikai sűrűségek aránya

[E310 : E325 és E334 : E325]

legyen 6 : 7 = 0,857.

Ha ezeknek az arányoknak valamelyike észrevehetően különbözik ettől az értéktől (< 0,830 vagy > 0,880), akkor az optikai sűrűségmérést megelőzően az 5.3.2. pont szerinti kromatográfiás mérést kell végezni. Ha a kromatográfiás mérést követően végzett optikai sűrűségmérés azt mutatja, hogy a fent említett arányok még mindig észrevehetően eltérnek a 0,857 értéktől (< 0,830 vagy > 0,880), akkor a meghatározást az A. csoport termékei esetében előírt módszer szerint kell elvégezni.

6. Az eredmények kiszámítása

A minta retinoltartalmát a vizsgálati minta tömegének és az analízis során végzett hígítások figyelembevételével számítsuk ki. Az eredményt a takarmány, a koncentrátum vagy az előkeverék kilogrammonkénti retinoltartalmára vonatkoztatva, NE-ben kell kifejezni.

Megismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

- relatív értékben a 20 %-ot, 75000 NE/kg-nál kisebb retinoltartalom esetében,

- a 15000 NE-t, 75000 és 150000 NE/kg közötti retinoltartalom esetében,

- relatív értékben a 10 %-ot, 150000 és 250000 NE/kg közötti retinoltartalom esetében,

- a 25000 NE-t, 250000 és 500000 NE/kg közötti retinoltartalom esetében,

- relatív értékben az 5 %-ot, a 500000 NE/kg feletti retinoltartalom esetében.

2. A TIAMIN MEGHATÁROZÁSA (B1 – VITAMIN, ANEURIN)

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a tiamin (B1 – vitamin, aneurin) mennyiségének meghatározását takarmányokban, koncentrátumokban és előkeverékekben. A meghatározás alsó méréshatára 5 ppm.

2. Vizsgálati alapelv

Az oldatot meleg állapotában hígított kénsavval kezeljük, majd ezután enzimatikus hidrolízist végzünk rajta. A kapott oldaton lúgos oxidációt végzünk. A keletkező tiokrómot izobutanollal extraháljuk és fluorimetriával határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. 100 μg/ml tiamin standard oldat: oldjunk fel 112,3 mg, előzőleg vákuum alatt, a tömegállandóság eléréséig szárított tiamin-hidrokloridot 1000 ml 0,2 N kénsavban (3.2.). Ha hűvös, sötét helyen tároljuk, ez az oldat egy hónapig eláll.

3.2. 0,2 N kénsav.

3.3. Tiszta nátrium-biszulfit.

3.4. 20 %-os (w/v) a.t. kálium-ferricianid oldat.

3.5. 25 %-os (w/v) a.t. kálium-hidroxid oldat.

3.6. Oxidáló keverék: keverjünk össze 2 ml kálium-ferricianid oldatot (3.4.) és 48 ml kálium-hidroxid oldatot (3.5.). Ez a keverék legfeljebb 4 óráig használható.

3.7. Izobutanol a.t.

3.8. 2,5 N nátrium-acetát oldat.

3.9. Proteázt, foszfatázt és amilázt tartalmazó multienzim-készítmény (pl. Clarase).

3.10. 96 %-os (v/v) etanol.

4. Eszközök

4.1. Vízfürdő

4.2. Centrifuga (3500 rpm) 30–50 ml-es csiszolt üvegdugós csövekkel.

4.3. Fluoriméter.

5. A vizsgálat módja

5.1. Enzimatikus hidrolízis

Helyezzünk két 250 ml-es mérőlombikba (A. és B.) azonos mennyiségű, körülbelül 100 μg tiamint tartalmazó, finomra őrölt mintát és 125 ml kénsavat (3.2.). Csak az A lombikhoz adjunk még 1,0 ml standardoldatot (3.1.) (belső standard).

Rázzuk össze alaposan a lombikokat, helyezzük őket forrásban lévő vízfürdőbe, és időnként összerázva tartsuk ott 15 percig. Hagyjuk hűlni körülbelül 45 °C-ig. Adjunk mindkét lombikhoz 20 ml nátrium-acetát oldatot (3.8.) és 0,5 g multienzim-készítményt (3.9.), majd hagyjuk állni szobahőmérsékleten 20 percig. Adjunk hozzá 20 ml nátrium-acetát oldatot (3.8.), töltsük fel a jelig vízzel, homogenizáljuk és szűrjük le. Miután kiöntöttük az első 15 millilitert, gyűjtsük össze az A- és B-szűrleteket. Készítsük el a következő oldatokat:

5.1.1. T-referenciaoldat

Helyezzünk egy centrifugacsőbe (4.2.) 5 ml A-szűrletet és körülbelül 10 mg nátrium-biszulfitot (3.3.). Merítsük a csövet forrásban lévő vízfürdőbe 15 percre, majd hagyjuk szobahőmérsékletűre hűlni.

5.1.2. A- (belső standard) és B (minta)-oldatok

Helyezzünk 5 ml A-szűrletet egy centrifugacsőbe (4.2.) és 5 ml B-szűrletet egy másik centrifugacsőbe (4.2.).

5.2. Oxidálás

Adjunk a T-, az A- és a B-oldatokhoz 5 ml oxidáló keveréket (3.6.), majd egy perccel később 10 ml izobutanolt (3.7.). Zárjuk le a csöveket és alaposan rázzuk 5 másodpercig. Hagyjuk állni egy percig és centrifugáljuk a rétegek szétválása érdekében. Minden egyes csőből öntsünk a felülúszó izobutanol rétegből 5 millilitert a 25 ml-es mérőlombikok mindegyikébe, töltsük fel a jelig etanollal (3.10.) és homogenizáljuk (= T-, A- és B-kivonatok).

5.3. A fluoreszcencia mérése

Végezzünk méréseket azon a hullámhosszon, amelyen a fluoriméter optimálisan reagál a tiokróm fluoreszcenciájára. Sugárkezeljük körülbelül 365 nm hullámhosszon.

Állítsuk be a készüléket nullára a T-kivonat felhasználásával. Mérjük meg az A- és B-kivonatok fluoreszcenciájának intenzitását.

6. Az eredmények kiszámítása

A minta mg/kg-ban kifejezett tiamintartalma a következő képlet segítségével számítható ki:

c

ahol:

a = az A-kivonat fluoreszcenciájának intenzitása (belső standard);

b = a B-kivonat fluoreszcenciájának intenzitása (minta);

c = a vizsgálati minta grammban kifejezett tömege;

d = a vizsgálati mintához adott tiamin μg-ban kifejezett mennyisége (belső standard).

Ismételhetőség

Az ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

relatív értékben a 10 %-ot, 500 mg/kg alatti tiamintartalom esetén, és

relatív értékben az 5 %-ot, 500 mg/kg-os vagy annál magasabb tiamintartalom esetén.

3. AZ ASZKORBINSAV ÉS A DEHIDRO-ASZKORBINSAV MEGHATÁROZÁSA

(C-VITAMIN)

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi az aszkorbinsav és a dehidro-aszkorbinsav (C-vitamin) összes mennyiségének meghatározását takarmányokban, koncentrátumokban és előkeverékekben. A meghatározás alsó méréshatára 5 ppm. A termékek, feltételezett C-vitamin tartalmuk alapján két csoportba sorolhatók:

A. csoport: 10 g/kg-nál alacsonyabb tartalom;

B. csoport: 10 g/kg-os vagy annál magasabb tartalom.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát hígított metafoszforsav oldatban szuszpendáljuk és kloroformmal extraháljuk. A vizes fázist 2,6-diklórfenol-indofenol oldattal kezeljük az aszkorbisav dehidro-aszkorbinsavvá alakítása céljából, majd 2,4-dinitrofenilhidrazin oldattal kezeljük. A képződő hidrazont etil-acetát, jégecetsav és aceton keverékével extraháljuk. Az oldatot szilikagél-oszlopos kromatográfiás vizsgálatot végzünk, az eluátumot szárazra pároljuk és a maradékot hígított kénsavban oldjuk fel. Az oldat optikai sűrűségét 509 nm-es hullámhosszon, spektrofotométerrel mérjük meg.

Az A. csoportba tartozó termékek esetében az oszlopkromatográfiából származó eluátumot vékonyréteg-kromatográfiának vetjük alá a hidrazon leválasztása céljából.

3. Reagensek

3.1. L-aszkorbinsav 0,05 %-os standard oldata: oldjunk fel 50 mg a.t. L-aszkorbinsavat körülbelül 20 ml metafoszforsav oldatban (3.2.) és töltsük fel vízzel 100 ml-re. Közvetlenül a felhasználás előtt készítsük el.

3.2. 10 %-os (w/v) metafoszforsav oldat: mozsárban történt őrlés után oldjunk fel vízben 200 g a.t. metafoszforsavat és töltsük fel vízzel 2000 ml-re. Tároljuk 4 °C-on. Ez az oldat egy hétig stabil.

3.3. Kloroform a.t.

3.4. 0,5 %-os (w/v) a.t. 2,6-diklórfenol-indofenol oldat. Közvetlenül a felhasználás előtt készítsük el.

3.5. Szűrési segédanyag (S. és S. No. 121 vagy azzal egyenértékű).

3.6. 2 %-os (w/v) 2,4-dinitrofenilhidrazin savas oldata: oldjunk fel 2 g 2,4-dinitrofenilhidrazint 100 ml hígított kénsavban (25 ml a.t. kénsav, d: 1,84, vízzel felhígítva és feltöltve 100 ml-re). Hűvös helyen tárolva ez az oldat egy hétig áll el.

3.7. Nitrogén, vagy

3.8. Szén-dioxid.

3.9. a.t. etil-acetát/jégecetsav/a.t. aceton 96/2/2 térfogat arányú keveréke.

3.10. a.t. diklór-metán/jégecetsav 97/3 térfogat arányú keveréke.

3.11. Szilikagél, szemcseméret: 0,05–0,2 mm.

3.12. Stahl-osztályú H szilikagél, vékonyréteg-kromatográfiához.

3.13. Hígított kénsav: öntsünk 105 ml vizet egy 200 ml-es mérőlombikba, töltsük felajelig a.t. kénsavval, d: 1,84.

3.14. Eluáló oldószer a vékonyréteg-kromatográfiához: keverjünk össze 75 ml a.t. dietilétert, 25 ml a.t. etil-acetátot és 4,0 ml 96 %-os (w/v) a.t. ecetsavat. Frissítsük az oldatot 2–3 kromatográfiás mérés után.

4. Eszközök

4.1. Termosztáttal felszerelt, 20 °C-ra beállított vízfürdő.

4.2. Centrifuga (3500 rpm) 40–50 ml-es csiszolt üvegdugós csövekkel.

4.3. Rotációs vákuum-bepárló, 250 ml-es lombikokkal.

4.4. Kromatográfiás üvegcsövek (hosszúság: 100 mm, belső átmérő: 20 mm), zsugorított koronggal (pl. Allihn-csövek).

4.5. Spektrofotométer vagy koloriméter 10 mm-es cellájú szűrőkkel.

4.6. Vékonyréteg-kromatográfiára szolgáló berendezés, szilikagél lemezekkel (3.12.), amelyek 0,5–0,6 mm mélységig vannak bevonva. (Az előregyártott lemezek megfelelőek.) Szárítsuk a lemezeket 2,5-3 óráig a szárítókemencében 120–130 °C -on. Hagyjuk kihűlni, majd a felhasználás előtt legalább 24 óráig tartsuk exszikkátorban.

4.7. 120–130 °C-ra beállított szárítókemence.

5. A vizsgálat módja

5.1. Extrahálás

Helyezzün két (A. és B.), 250 ml-es mérőlombikba (csiszolt üvegdugús) azonos mennyiségű, finomra aprított, körülbelül 200 μg C-vitamint tartalmazó mintát. Csak az A lombikhoz adjunk még 0,4 ml standard oldatot (3.1.) és finoman rázva keverjük el (belső standard).

Adjunk mindkét lombikhoz 30 ml kloroformot (3.3.) és 25 ml metafoszforsav oldatot (3.2.) 4 °C-on. Rövid ideig rázzuk, majd hagyjuk állni 10–15 percig. Adjunk hozzá 25 ml vizet, zárjuk le a lombikokat, rázzuk alaposan 10 másodpercen át, majd hagyjuk állni 10–15 percig a vízfürdőben (4.1.). Centrifugáljuk, hogy a vizes fázis elváljon a kloroform fázistól. A műveleteket egyidejűleg végezzük, az A. (belső standard) és a B. vizes kivonatokon, a következőkben leírtak szerint.

5.2. Oxidálás

Pipettázzunk át 40 ml-t az 5.1. pont szerint nyert felülúszó vizes oldatból (enyhén zavaros) egy csiszolt üvegdugóval ellátott kémcsőbe, adjunk hozzá 0,5–1 ml 2,6-diklórfenol-indofenol oldatot (3.4.) és keverjük össze. Vörös elszíneződés jelentkezik, aminek legalább 15 percig meg kell maradnia. Ezután adjunk hozzá körülbelül 300 mg szűrési segédanyagot (3.5.), rázzuk össze és szűrjük át egy száraz, redőzött szűrőn. A szűrletnek nem kell szükségszerűen tisztának lennie.

5.3. Reakció 2,4-dinitrofenilhidrazinnal és hidrazon extrahálás

Pipettázzunk át az 5.2. pont szerint kapott szűrletből 10 ml-t egy centrifugacsőbe (4.2.), adjunk hozzá 2 ml 2,4-dinitrofenilhidrazin oldatot (3.6.) és keverjük össze. Futtassunk gyorsan nitrogén (3.7.) vagy széndioxid (3.8.) áramot a csőbe, zárjuk le a csövet és merítsük a vízfürdőbe (4.1.) körülbelül 15 órára (egy éjszakára).

Ezek után adjunk hozzá 3 ml vizet, 20 ml etil-acetát/jégecetsav/aceton keveréket (3.9.) és körülbelül 800 mg szűrési segédanyagot (3.5.). Zárjuk le a csövet, rázzuk alaposan 30 másodpercig és centrifugáljuk. Helyezzünk 15 ml-t a felülúszó fázisból egy bepárló csészébe, és csökkentett nyomáson pároljuk be a rotációs bepárlóban (4.3.), amíg olajos maradék nem keletkezik. Oldjuk a maradékot 2 ml etil-acetát/jégecetsav/aceton keverékben (3.9.), 50 °C-on újrahevítve, hagyjuk kihűlni, adjunk hozzá 10 ml diklór-metán/jégecetsav keveréket (3.10.) és keverjük össze.

5.4. Oszlopkromatográfia

Töltsünk fel egy kromatográfiás csövet (4.4.) 30 mm-es szintig diklór-metán/jégecetsav keverékkel (3.10.). Szuszpendáljunk (alaposan felrázva) 5 g szilikagélt (3.11.) 30 ml diklór-metán/jégecetsav keverékben (3.10.); öntsük a szuszpenziót a csőbe. Hagyjuk állni, majd sűrítsük nitrogén alatt (3.7.) alacsony nyomáson. Dekantáljuk a csőbe az 5.3. pont szerint nyert oldatot, öblítsük ki a lombikot kis mennyiségű diklór-metán/jégecetsav keverékkel (3.10.) és dekantáljuk a csőbe, majd töltsük fel az utóbbit a keverékkel (3.10.) és folytassuk az oszlop mosását ugyanazzal a keverékkel (3–4 alkalommal, 5 ml-es adaggal) addig, amíg színtelen eluátumot nem kapunk. Az eluátum sárga színű részét öntsük le.

Eluáljuk az oszlop tetején lévő vöröses zónát etil-acetát/jégecetsav/aceton keverékkel (3.9.), gyűjtsük össze az eluátumot és pároljuk szárazra.

5.4.1. Az A. csoportba tartozó termékek (10 g/kg-nál alacsonyabb C-vitamin tartalom) esetében, oldjuk fel a maradékot 2,0 ml etil-acetát/jégecetsav/aceton keverékben (3.9.) és azonnal végezzük el az 5.5. pontban leírtak szerint a vékonyréteg-kromatográfiát.

5.4.2. A B. csoportba tartozó termékek (10 g/kg vagy annál magasabb C-vitamin tartalom) esetében kezeljük az olajos maradékot 4,0 ml hígított kénsavval (3.13.), rázzuk alaposan össze, hogy a maradék teljesen feloldódjon, és mérjük meg az optikai sűrűséget az 5.6. pontban leírtak szerint.

5.5. Vékonyréteg-kromatográfia

A következőkben leírt műveleteket kétszer végezzük el. A vékonyréteg-kromatográfiához helyezzünk vonalban a lemezre 0,5 ml-t az 5.4.1. pont szerint nyert oldatból (4.6.). Az oldószer (3.14.) segítségével végezzünk feltárást legalább 20 percen keresztül egy oldószergőzzel telített tartályban, amíg a rózsaszín hidrazon zóna tisztán el nem különül. Hagyjuk a levegőn száradni. Jelöljük meg a rózsaszín zóna határát, spatula segítségével kaparjuk le a zónát, és a port, teljes mennyiségben tegyük egy kromatográfiás csőbe (4.4.).

Eluáljuk egymás után először 2 ml és utána kétszer, 1,5 ml etil-acetát/jégecetsav/aceton keverékkel (3.9.). Gyűjtsük az eluátumot egy kis lombikba (az utolsó résznek színtelennek kell lennie). Pároljuk szárazra, az olajos maradékot kezeljük 4,0 ml hígított kénsavval (3.13.), rázzuk alaposan össze, hogy a maradék teljesen feloldódjon, és mérjük meg az optikai sűrűséget.

5.6. Az optikai sűrűség mérése

20–30 perccel azután, hogy maradékot kénsavban feloldottuk, mérjük meg az optikai sűrűséget spektrofotométerrel, 509 nm hullámhosszon. A hígított kénsavval (3.13.) összehasonlítva végezzük el a méréseket.

5.7. Vakpróba

Ugyanazon eljárást alkalmazva végezzünk vakpróbát, de a minta nélkül.

6. Az eredmények kiszámítása

A minta kilogrammonkénti C-vitamin tartalmát, grammban kifejezve a következő képlet segítségével kapjuk meg:

·2

·10d

ahol:

a = a vakpróbaminta optikai sűrűsége;

b = a belső standard oldat optikai sűrűsége;

c = a mintaoldat optikai sűrűsége;

d = a vizsgálati minta tömege, grammban.

Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két, párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

relatív értékben a 10 %-ot, 10 g/kg-nál alacsonyabb C-vitamin tartalom esetében és

relatív értékben az 5 %-ot, 10 g/kg vagy annál magasabb C-vitamin tartalom esetében.

[1] 1 NE = 0,3 μg retinol

[2] A csomósodásra vagy duzzadásra hajlamos tejalapú takarmányok és tejtermékek esetében az 5.2. pont első és második bekezdésében megadott mennyiséghez képest kétszer akkora mennyiségű reagenst használjunk.

[3] Nem kell nátrium-aszkorbátot hozzáadni, ha a hidrolízist nitrogén atmoszférában hajtjuk végre.

[4] A karotintartalom 450 nm hullámhosszon végzett optikai sűrűségméréssel határozható meg;E 1 %1 cm = 2600

--------------------------------------------------