A Bizottság határozata

(2002. február 21.)

a 90/426/EGK tanácsi irányelv D. mellékletének az afrikai lópestis diagnosztikai vizsgálata tekintetében történő módosításáról

(az értesítés a C(2002) 556. számú dokumentummal történt)

(EGT vonatkozású szöveg)

(2002/160/EK)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb a 2001/298/EK határozattal [1] módosított, a lófélék mozgására és harmadik országból történő behozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételekről szóló, 1990. június 26-i 90/426/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 23. cikkére,

mivel:

(1) A 90/426/EGK irányelv D. melléklete ismerteti az afrikai lópestis diagnosztizálására szolgáló komplementkötési próbát.

(2) A spanyolországi Algetében található közösségi referencialaboratórium rendezte 2000 novemberében az EU tagállamok afrikai lópestissel foglalkozó nemzeti referencialaboratóriumainak éves közgyűlését. E gyűlésen tudományos bizonyítékokkal támasztották alá, hogy a 90/426/EGK irányelv D. mellékletében jelenleg ismertetett komplementkötési próba csak erős korlátozással használható, különösen azért, mert csak friss fertőzés vagy vakcinázás után alkalmas az ellenanyagok kimutatására. Ezenkívül a vizsgálatot a gyakorlatban már a Közösség szinte valamennyi laboratóriumában, sőt a jelentős exportáló országok laboratóriumainak többségében is korszerű ELISA-próbák váltották fel.

(3) A Nemzetközi Állatjárványügyi Hivatal (Office International des Epizooties, OIE) által kiadott A diagnosztikai vizsgálatok és a vakcinák szabványainak kézikönyve [3] (Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines) ismerteti az afrikai lópestis vírusával szemben termelt ellenanyagok kimutatására nemzetközileg elfogadott laboratóriumi vizsgálatokat; a legutóbbi kiadás azonban csak a rendelkezésre álló ELISA-próbák egyikét említi.

(4) Ezért a műszaki fejlődés és a nemzetközileg elfogadott szabványok figyelembevétele érdekében szükségesnek látszik a 90/426/EGK irányelv D. mellékletének módosítása.

(5) Az e határozatban előírt intézkedések összhangban állnak az Állat-egészségügyi Állandó Bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT A HATÁROZATOT:

1. cikk

A 90/426/EGK irányelv D. mellékletének helyébe e határozat melléklete lép.

2. cikk

Ennek a határozatnak a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 2002. február 21-én.

a Bizottság részéről

David Byrne

a Bizottság tagja

[1] HL L 102., 2001.4.12., 63. o.

[2] HL L 224., 1990.8.18., 42. o.

[3] 2.1.11. fejezet, 2000. évi negyedik kiadás.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

D. MELLÉKLET

AFRIKAI LÓPESTIS

DIAGNÓZIS

Az alábbiakban ismertetett ELISA-próbához (enzyme-linked immunosorbent assay) szükséges reagensek beszerezhetőek az Európai Közösség referencialaboratóriumából vagy az OIE afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriumaiból.

1. AZ AFRIKAI LÓPESTIS VÍRUSÁVAL (ALPV) SZEMBEN TERMELT ELLENANYAGOK KIMUTATÁSÁRA SZOLGÁLÓ KOMPETITÍV ELISA-PRÓBA (ELŐÍRT VIZSGÁLAT)

A kompetitív ELISA-próbát specifikus ALPV-ellenanyagok bármely lóféle szérumából történő kimutatására használják. A széles spektrumú, poliklonális, anti-ALPV tengerimalac immunszérum (a továbbiakban: "tengerimalac-antiszérum") szerocsoport-specifikus, és alkalmas az ALP-vírus valamennyi ismert szerotípusának kimutatására.

A vizsgálat működési elve az ALPV-antigén és a tengerimalac-antiszérum közötti reakcióba – a vizsgálandó szérumminta hozzáadásával – való beavatkozáson alapul. A vizsgálandó szérummintában lévő ALPV-ellenanyagok versengeni fognak a tengerimalac-antiszérumban lévőkkel, ami a várható színintenzitás csökkenését eredményezi (az enzimmel jelzett anti-tengerimalac ellenanyag és szubsztrát hozzáadása után). A szérum vizsgálható 1:5 arányú egyszeri hígításban (színreakció-módszer), vagy titrálható (szérumtitrálásos módszer) a hígítási szélsőértékek eléréséhez. Az 50 %-nál nagyobb inhibíciós értékek pozitívnak tekinthetők.

A következőkben ismertetett vizsgálati protokollt az egyesült királyságbeli Pirbrightban található, afrikai lópestissel foglalkozó regionális referencialaboratóriumban alkalmazzák.

1.1. Vizsgálati eljárás

1.1.1. A lemezek előkészítése

1.1.1.1. Vonjuk be az ELISA-lemezeket a fertőzött sejttenyészetből kivont és 9,6 pH értékű karbonát/bikarbonát pufferoldattal hígított ALPV-antigénnel. Inkubáljuk az ELISA-lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on.

1.1.1.2. Mossuk ki a lemezeket háromszor úgy, hogy a lyukakat teleöntjük 7,2–7,4 pH-értékű, foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS), majd kiöntjük azt. Ezután itatóspapíron a nedvességet felszívatva megszárítjuk.

1.1.2. Kontroll-lyukak

1.1.2.1. A pozitív kontrollszérumot kétszeres hígítási sorban blokkoló pufferoldatban (0,05 % [v/v] Tween-20-at, 5,0 % [w/v] sovány tejport [Cadbury’s MarvelTM] és 1 % [v/v] felnőtt szarvasmarha szérumot tartalmazó PBS) titráljuk, 1:5 aránytól 1:640 arányig végig az első oszlopban úgy, hogy lyukanként 50 μl térfogatot kapjunk.

1.1.2.2. A negatív kontrollszérumból adjunk 50 μl-t 1:5 hígításban (10 μl szérum + 40 μl blokkoló pufferoldat) a második oszlop A és B lyukához.

1.1.2.3. Adjunk lyukanként 100 μl blokkoló pufferoldatot a második oszlop C és D lyukához (vak kontroll).

1.1.2.4. Adjunk 50 μl blokkoló pufferoldatot a második oszlop E, F, G és H lyukához (tengerimalacantiszérum-kontroll).

1.1.3. Színreakció-módszer

1.1.3.1. Adjuk a blokkoló pufferoldatban 1:5 arányban hígított egyes vizsgálandó szérumokat a 3–12. oszlop két-két lyukához (10 μl szérum + 40 μl blokkoló pufferoldat).

vagy

1.1.4. Szérumtitrálásos módszer

1.1.4.1. Készítsünk mindegyik vizsgálandó mintából kétszeres hígítási sort (1:5-től 1:640-ig) a blokkoló pufferoldatban, egy-egy oszlop nyolc (3–12.) lyukában.

ezután

1.1.5. Adjunk 50 μl – előzetesen blokkoló pufferoldatban hígított – tengerimalac-antiszérumot az ELISA-lemez mindegyik lyukához, kivéve a vak kontrollokhoz (ekkor valamennyi lyuk 100 μl végleges térfogatot tartalmaz).

1.1.5.1. Inkubáljuk egy órán át 37 °C-on forgó keverőben.

1.1.5.2. Mossuk ki a lemezeket háromszor, és a korábbihoz hasonlóan szárítsuk meg.

1.1.5.3. Adjunk 50 μl, előzetesen blokkoló pufferoldatban hígított nyúl anti-tengerimalac torma-peroxidáz (HRP) konjugátumot mindegyik lyukhoz.

1.1.5.4. Inkubáljuk egy órán át 37 °C-on forgó keverőben.

1.1.5.5. Mossuk ki a lemezeket háromszor, és a korábbihoz hasonlóan szárítsuk meg.

1.1.6. Kromogén

Készítsük el a kromogén-OPD (OPD = orto-fenildiamin) oldatot a gyártó útmutatója szerint (0,4 mg/ml steril desztillált vízben) közvetlenül felhasználás előtt. Adjuk hozzá a szubsztrátot (hidrogén-peroxid = H2O2), amivel megkapjuk a 0,05 %-os (v/v) végső koncentrációt (30 %-os H2O2-oldat 1:2000 arányban). Adjunk az OPD-oldatból 50 μl-t mindegyik lyukhoz, és hagyjuk a lemezeket 10 percre szobahőmérsékleten a munkaasztalon. A reakciót lyukanként 50 μl 1M kénsav (H2SO4) hozzáadásával állítsuk le.

1.1.7. Leolvasás

Olvassuk le spektrofotométerrel 492 nm-en.

1.2. Az eredmények értékelése

1.2.1. Megfelelő szoftver segítségével nyomtassuk ki az optikai denzitás (OD) értékeit, valamint a százalékos inhibíciót (PI) a vizsgálandó és a kontrollszérumra, a négy tengerimalac-antiszérum kontroll-lyukban mért középérték alapján. Az OD- és PI-értékben kifejezett adatok alkalmasak annak meghatározására, hogy a vizsgálat eredménye az elfogadható határértékeken belül van-e. A tengerimalacantiszérum-kontroll esetében az OD értékének felső kontroll-határértéke (upper control limits – UCL) 1,4, az alsó (lower control limits – LCL) pedig 0,4. A végpont titernek a pozitív kontrollszérum esetében 50 %-os PI-t alapul véve 1:240-nek kell lennie (1:120–1:480 tartományon belül). A fenti kritériumoknak nem megfelelő lemezek nem értékelhetők ki. Ha azonban a pozitív kontrollszérum titere nagyobb 1:480-nál, és a vizsgált minták így is negatívak, akkor a negatív vizsgált minták elfogadhatók.

A negatív kontrollszérumot tartalmazó kettős lyukaknak + 25 % és – 25 % közötti PI-értékeket kell mutatniuk, a vak kontrollt tartalmazó kettős lyukaknak pedig + 95 % és + 105 % közöttit. Ha ezeken a határokon kívül eső értéket kapunk, a lemez még felhasználható, de ez annak a jele, hogy háttérszíneződés történik.

1.2.2. A diagnosztikai küszöbérték ("cut-off" érték) a vizsgált szérum esetében 50 % (PI 50 %). Az 50 %-nál magasabb PI-értéket mutató mintákat pozitívként, az 50 %-nál alacsonyabb PI-értéket mutató mintákat pedig negatívként értékeljük.

Azok a minták, amelyek a kettős lyukak küszöbértékénél magasabb vagy alacsonyabb értéket mutatnak, kétesnek tekintendők. Ezeket újra vizsgálhatjuk színreakcióval és titrálással. A pozitív mintákat is titrálhatjuk a pozitivitás mértékének megállapításához.

Színreakció elrendezése

– kont. = negatív kontrollszérum

+ kont. = pozitív kontrollszérum

TM kont. = tengerimalacantiszérum-kontroll

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |

+ kont. | vizsgált szérumok | | | | | | | | | |

A | 1:5 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |

B | 1:10 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |

C | 1:20 | vak | | | | | | | | | | |

D | 1:40 | vak | | | | | | | | | | |

E | 1:80 | TM kont. | | | | | | | | | | |

F | 1:160 | TM kont. | | | | | | | | | | |

G | 1:320 | TM kont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

H | 1:640 | TM kont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Vizsgált szérumok

– kont. = negatív kontrollszérum

+ kont. = pozitív kontrollszérum

TM kont. = tengerimalacantiszérum-kontroll

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |

+ kont. | vizsgált szérumok | | | | | | | | | |

A | 1:5 | – kont. | 1:5 | | | | | | | | | 1:5 |

B | 1:10 | – kont. | 1:10 | | | | | | | | | 1:10 |

C | 1:20 | vak | 1:20 | | | | | | | | | 1:20 |

D | 1:40 | vak | 1:40 | | | | | | | | | 1:40 |

E | 1:80 | TM kont. | 1:80 | | | | | | | | | 1:80 |

F | 1:160 | TM kont. | 1:160 | | | | | | | | | 1:160 |

G | 1:320 | TM kont. | 1:320 | | | | | | | | | 1:320 |

H | 1:640 | TM kont. | 1:640 | | | | | | | | | 1:640 |

2. AZ AFRIKAI LÓPESTIS VÍRUSÁVAL (ALPV) SZEMBEN TERMELT ELLENANYAGOK KIMUTATÁSÁRA SZOLGÁLÓ INDIREKT ELISA-PRÓBA (ELŐÍRT VIZSGÁLAT)

Az alábbiakban ismertetett vizsgálat összhangban áll az OIE A diagnosztikai vizsgálatok és a vakcinák szabványainak kézikönyve 2000. évi negyedik kiadásának 2.1.11. fejezetében ismertetett vizsgálattal.

A rekombináns VP7-fehérjét az ALP-vírus elleni ellenanyagok kimutatásánál nagy érzékenységű és specificitású antigénként használják. További előnye, hogy stabil és nem fertőző.

2.1. Vizsgálati eljárás

2.1.1. Szilárd fázis

2.1.1.1. Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.

2.1.1.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.1.1.3. Blokkoljuk a lemezeket foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS) és 5 % (w/v) sovány tej (Nestlé Dry Skim MilkTM) lyukanként 200 μl-nyi keverékével egy órán át 37 °C-on.

2.1.1.4. Távolítsuk el a blokkoló oldatot, és finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz.

2.1.2. Vizsgálandó minták

2.1.2.1. A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:25 arányban PBS, 5 % (w/v) sovány tej és 0,05 % (v/v) Tween-20 lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Titráláshoz készítsünk kétszeres hígítási sort 1:25 aránytól kezdve (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

2.1.2.2. Mossuk ki a lemezeket a 2.1.1.2. lépésben ismertetett módszerrel.

2.1.3. Konjugátum

2.1.3.1. Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, PBS, 5 % tej és 0,05 % Tween-20 7,2 pH értékű keverékében hígított torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-ló gamma-globulint. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

2.1.3.2. Mossuk ki a lemezeket a 2.1.1.2. lépésben ismertetett módszerrel.

2.1.4. Kromogén/szubsztrát

2.1.4.1. Adjunk mindegyik lyukhoz 200 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil-aminobenzaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).

A színképződést kb. 5–10 perccel később 50 μl 3N H2SO4 hozzáadásával állítjuk le (mielőtt a negatív kontrollszérum elszíneződne).

Más kromogének is alkalmazhatók, mint pl. az ABTS (2,2’-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), TMB (tetra-metil benzidin) vagy az OPD (orto-fenildiamin).

2.1.4.2. Olvassuk le a lemezeket 600 (vagy 620) nm-en.

2.2. Az eredmények értékelése

2.2.1. A küszöbértéket úgy számítjuk ki, hogy 0,6-ot hozzáadunk a negatív kontroll értékéhez (0,6 a standard szórás 30 negatív szérumból származtatva).

2.2.2. A küszöbértéknél alacsonyabb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat negatívnak tekintjük.

2.2.3. A küszöbérték + 0,15-nél nagyobb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat pozitívnak tekintjük.

2.2.4. A köztes abszorpciós értéket mutató vizsgált minták kétesnek tekintendők, ezért egy második technikát kell alkalmazni az eredmények megerősítéshez.

3. AZ AFRIKAI LÓPESTIS VÍRUSÁVAL (ALPV) SZEMBEN TERMELT ELLENANYAGOK KIMUTATÁSÁRA SZOLGÁLÓ BLOKKOLÓ ELISA-PRÓBA (ELŐÍRT VIZSGÁLAT)

A blokkoló ELISA-próba specifikus ALPV-ellenanyagok bármely fogékony faj szérumából történő kimutatására szolgál. A VP7 az ALPV legfontosabb antigén vírusfehérjéje, amely a kilenc szerotípuson belül megmarad. Mivel a monoklonális ellenanyag (mea) a VP7 ellen is irányul, a próba érzékenysége és specificitása magas fokú. Ezenkívül a rekombináns VP7-antigén teljesen ártalmatlan, ezért nagy biztonsággal használható.

A vizsgálat elve a rekombináns VP7 – mint az ELISA-lemezhez kötött antigén – és a konjugált, VP7-specifikus mea közötti reakció megszakításán alapul. A vizsgálandó szérumban lévő ellenanyagok gátolják az antigén és a mea közötti reakciót, ami a színintenzitás csökkenését fogja eredményezni.

Az alábbiakban ismertetett vizsgálatot az Európai Közösségnek a spanyolországi Algetében található, afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriumában végzik.

3.1. Vizsgálati eljárás

3.1.1. ELISA-lemezek

3.1.1.1. Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.

3.1.1.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST).

3.1.1.3. A lemezeket stabilizálóoldattal kezelve stabilizáljuk (a 4 °C-on történő hosszú távú, aktivitáscsökkenés nélküli tárolás érdekében), és nedvszívó anyagon kiszárítjuk.

3.1.2. Vizsgálandó minták és kontrollok

Szűréshez: | a vizsgálandó szérumokat és a kontrollokat közvetlenül a lemezen 1:10 arányban hígítjuk PBST-ben lyukanként 100 μl végső térfogatra. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk. |

Titráláshoz: | kétszeres hígítási sort készítünk a vizsgálandó szérumokból és a pozitív kontrollokból (lyukanként 100 μl-t) 1:10 aránytól 1:1280 arányig nyolc lyukban. A negatív kontrollt 1:10 hígításban vizsgáljuk. |

3.1.2.1. 3.1.2.2. 3.1.3. Konjugátum

Mindegyik lyukhoz 50 μl előzetesen hígított torma-peroxidázzal (HRP) konjugált mea-t (VP7-specifikus monoklonális ellenanyagot) adunk és finoman homogénre keverjük. 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.

3.1.4. A lemezeket ötször kimossuk PBST-vel és a fentihez hasonlóan kiszárítjuk.

3.1.5. Kromogén/szubsztrát

Mindegyik lyukhoz hozzáadunk 100 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (1 ml ABTS (2,2’-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), 5 mg/ml, + 9 ml szubsztrát puffer (0,1 M 4 pH-értékű, 0,03 % H2O2-t tartalmazó foszfát-citrát puffer), és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A színképződést lyukanként 100 μl 2 % (w/v) SDS (nátrium-dodecil-szulfát) hozzáadásával állítjuk le.

3.1.6. Leolvasás

Olvassuk le ELISA-leolvasóban 405 nm-en.

3.2. Az eredmények értékelése

3.2.1. A próba validációja

A vizsgálat érvényes, ha a negatív kontroll (NK) optikai denzitása (OD) 1,0-nál nagyobb, a pozitív kontroll (PK) OD-a pedig 0,2-nél kisebb.

3.2.2. Küszöbérték-számítás

Pozitív küszöbérték NK -

NK - PK x 0,3

Negatív küszöbérték NK -

NK - PK x 0,2

ahol NK a negatív kontroll OD-a, PK pedig a pozitív kontroll OD-a.

3.2.3. Az eredmények értékelése

A pozitív küszöbértéknél kisebb OD-t mutató minták ALPV-ellenanyagokra pozitívnak tekintendőek.

A negatív küszöbértéknél nagyobb OD-t mutató minták ALPV-ellenanyagokra negatívnak tekintendőek.

Az e két érték közötti OD-t mutató minták kétesnek tekintendők, ezért az állatoktól két-három héttel később új mintát kell venni.

--------------------------------------------------