A bizottság 98/73/EK irányelve (1998. szeptember 18.) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonnegyedik hozzáigazításárólEGT vonatkozású szöveg.



Hivatalos Lap L 305 , 16/11/1998 o. 0001 - 0181

CS.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

ET.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

HU.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

LT.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

LV.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

MT.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

PL.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

SK.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316

SL.ES fejezet 13 kötet 21 o. 139 - 316



A bizottság 98/73/EK irányelve (1998. szeptember 18.) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonnegyedik hozzáigazításáról (EGT vonatkozású szöveg) AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA, tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre, tekintettel a legutóbb a 97/69/EK bizottsági irányelvvel módosított [1], a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1967. június 27-i 67/548/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 28. cikkére, mivel a 67/548/EGK irányelv I. melléklete tartalmaz egy, a veszélyes anyagokat felsoroló listát, minden egyes anyag osztályozásának és címkézésének részleteivel együtt; mivel a jelenlegi tudományos és műszaki ismeretek azt mutatják, hogy felül kell vizsgálni és ki kell egészíteni az e mellékletben közölt veszélyes anyagok listáját; mivel a 67/548/EGK irányelv V. melléklete tartalmazza a veszélyes anyagok és készítmények fizikai-kémiai tulajdonságainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására szolgáló módszereket; mivel e mellékletet a műszaki fejlődéshez kell hozzáigazítani; mivel ezen irányelv előírásai összhangban vannak a veszélyes anyagok és készítmények kereskedelme technikai akadályainak felszámolásáról szóló irányelveknek a műszaki fejlődéshez történő hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével, ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET: 1. cikk A 67/548/EGK irányelv a következőképpen módosul: 1. Az I. melléklet a következőképpen módosul: a) ezen irányelv I. mellékletének tételei a 67/548/EGK irányelv I. mellékletének megfelelő tételei helyébe lépnek; b) ezen irányelv II. mellékletének tételeivel egészül ki a 67/548/EGK irányelv I. melléklete. 2. Az V. melléklet a következőképpen módosul: a) ezen irányelv III. A., III. B. és III. C. mellékletének szövegével egészül ki a 67/548/EGK irányelv V. mellékletének A. része; b) ezen irányelv III. D. mellékletének szövegével egészül ki a 67/548/EGK irányelv V. mellékletének C. része. 2. cikk A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek legkésőbb 1999. október 31-ig megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre,vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját tagállamok határozzák meg. 3. cikk Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő 20. napon lép hatályba. 4. cikk Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei. Kelt Brüsszelben, 1998. szeptember 18-án. a Bizottság részéről Ritt Bjerregaard a Bizottság tagja [1] HL L 343., 1997.12.13., 19. o. [2] HL 196., 1967.8.16., 1. o. -------------------------------------------------- ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- III. A. MELLÉKLET A.18. A POLIMEREK SZÁMÁTLAG SZERINTI MOLEKULATÖMEGE ÉS MOLEKULATÖMEG-ELOSZLÁSA 1. MÓDSZER E Gél Permeációs Kromatográfiás módszer megfelel az OECD TG 118-nak (1996). Az alapelvek és további technikai információk az 1. hivatkozásban találhatók. 1.1. Bevezetés Mivel a polimerek tulajdonságai olyan változatosak, lehetetlen egyetlen módszert leírni, pontosan felsorolva az elválasztás és kiértékelés feltételeit, amelyek lefednek minden, a polimerek elválasztásánál előforduló eshetőséget és különlegességet. Különösen a komplex-polimer rendszereknél gyakran nem használható a Gél Permeációs Kromatográfia (GPC). Amennyiben a GPC nem használható, a molekulatömeg más módszerekkel határozható meg (ld. melléklet). Ilyen esetekben meg kell adni a használt módszer valamennyi részletét és igazolását. A leírt módszer az 55672 DIN szabványon alapul (1). Ebben a DIN szabványban található részletes információ a kísérletek kivitelezéséről és az adatkiértékelésről. Amennyiben a kísérleti körülmények módosítása szükséges, a változtatásokat igazolni kell. Más szabvány is használható, amennyiben teljes körű hivatkozással rendelkezik. A leírt módszer kalibrációra ismert polidiszperzitású polisztirol mintákat használ, és esetleg módosítani kell, hogy megfelelő legyen bizonyos polimereknél, pl.: vízben oldható és hosszú láncú elágazó polimerek. 1.2. Fogalommeghatározások és mértékegységek Az Mn számátlag molekulatömeget és az Mw tömegátlag molekulatömeget az alábbi egyenletekkel lehet meghatározni: +++++ TIFF +++++ ahol Hi a detektorjel szintje az alapvonaltól Vi retenciós térfogatra Mi a polimerfrakció molekulatömege Vi retenciós térfogatnál, és n az adatpontok száma. A molekulatömeg eloszlásának szélességét, ami a rendszer diszperzitásának mértéke, az Mw/Mn arány adja meg. 1.3. Referenciaanyagok Kalibrációt kell készíteni, mert a GPC relatív módszer. Keskeny eloszlású, lineárisan felépített, ismert Mn és Mw átlagos molekulatömegű, és ismert molekulatömeg eloszlású polisztirol standardokat használnak e célra. Az ismeretlen minta molekulatömegének meghatározására a kalibrációs görbe csak akkor használható, amennyiben a minta és a standardok elválasztásának körülményei azonos módon lettek kiválasztva. A molekulatömeg és az elúciós térfogat között meghatározott kapcsolat csak az adott kísérlet sajátos körülményei között érvényes. A körülmények magukban foglalják mindenek felett a hőmérsékletet, az oldószert (vagy oldószerkeveréket), a kromatográfiás feltételeket és az elválasztó oszlopot vagy oszlopokat. A minta így meghatározott molekulatömegei relatív értékek és "polisztirol ekvivalens molekulatömeg"-ként írták le őket. Ez azt jelenti, hogy a minta és a standard szerkezeti és kémiai különbségeitől függően a molekulatömegek kisebb-nagyobb mértékben eltérhetnek az abszolút értéktől. Amennyiben más standardokat használtak, pl. polietilén-glikol, polietilén-oxid, polimetil-metakrilát, poliakrilsav, azt meg kell indokolni. 1.4. A vizsgálati módszer elve A minta molekulatömeg-eloszlása és az átlagos molekulatömegek (Mn, Mw) GPC-vel meghatározhatók. A GPC a folyékony kromatográfia speciális típusa, aminél a minta az egyes alkotók hidrodinamikai térfogata szerint választódik el (2). Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel töltött oszlopon való áthaladásakor valósul meg. Kis molekulák be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és elsőként eluálódnak. A közepes méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és később eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidrodinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára. Ideális helyzetben az elválasztást teljesen a molekulafajták mérete szabja meg, de a gyakorlatban nehéz elkerülni valamely abszorpciós hatás közrehatását. A nem egyenletes oszlopfeltöltés és a holt térfogat ronthatja a helyzetet (2). A detektálás megvalósul pl. a törésmutatóval vagy az UV-elnyeléssel, és egyszerű eloszlási görbét eredményez. Azonban ahhoz, hogy a tényleges molekulatömeg-értékeket a görbéhez lehessen rendelni, az oszlopot kalibrálni kell ismert molekulatömegű és ideális esetben nagyjából hasonló szerkezetű polimerek, pl. különböző polisztirol standardok futtatásával. Tipikusan Gauss-görbe kapható, néha a kis molekulatömeg oldalán kis farokkal eltorzítva, a függőleges tengely a különböző eluált molekulafajták tömeg szerinti mennyiségét, a vízszintes tengely a molekulatömeg logaritmusát mutatja. 1.5. Minőségi követelmények Az elúciós térfogat reprodukálhatósága (relatív standard deviáció, RSD) 0,3 %-nál jobb kell, hogy legyen. Az analízis megkövetelt reprodukálhatóságát belső standarddal való korrekcióval kell biztosítani, amennyiben a kromatogramot az idő függvényében értékelik ki, és nem felel meg a fent említett követelménynek (1). A polidiszperzitás függ a standardok molekulatömegétől. Polisztirol standardoknál a tipikus értékek: Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 | 2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 | Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 | (Mp a standard molekulatömege a csúcsmaximumnál) 1.6. A vizsgálati módszer leírása 1.6.1. A standard polisztirol oldatok készítése A polisztirol standardokat óvatosan keverve oldják fel a választott eluensben. A gyártó ajánlásait számításba kell venni az oldatok készítésénél. A választott standardok koncentrációja különböző faktoroktól függ, pl. injektált térfogat, az oldat viszkozitása, és az elemző detektor érzékenysége. A túltöltés elkerülése érdekében a maximális injektált térfogatot az oszlop hosszához kell igazítani. 30 cm × 7,8 mm-es oszlopú GPC-vel történő analitikai elválasztásoknál a jellemző injektált térfogat rendesen 40 és 100 μl között van. Nagyobb térfogat is elképzelhető, de nem lépheti túl a 250 μl-t. Az oszlop aktuális kalibrációja előtt meg kell határozni az injektált térfogat és a koncentráció optimális arányát. 1.6.2. A mintaoldat elkészítése Elvben a mintaoldatok elkészítésére is ugyanezek a követelmények érvényesek. A mintát megfelelő oldószerben pl. tetrahidrofurán (THF) óvatos rázással oldják fel. Semmilyen körülmények között sem szabad ultrahangos fürdőben feloldani. Amennyiben szükséges, az oldat tisztítható 0,2-2 μm-es pórusméretű membránszűrővel. A feloldatlan részecskék jelenlétét, amik nagy molekulatömegű fajták miatt fordulhatnak elő, fel kell jegyezni a végleges jelentésben. A feloldott részecskék tömegszázalékának meghatározására megfelelő módszert kell alkalmazni. Az oldatot 24 órán belül fel kell használni. 1.6.3. Készülék - oldószer tartály, - gáztalanító (szükség szerint), - pumpa, - rezgéscsillapító (szükség szerint), - injektáló rendszer, - kromatográfiás oszlopok, - detektor, - áramlásmérő (szükség szerint), - adat rögzítő-feldolgozó, - hulladéktároló. Biztosítani kell, hogy a GPC rendszer inert legyen a használt oldószerekkel szemben (pl. THF oldószernél acél kapillárisok használata). 1.6.4. Injektáló és oldószerszállító rendszer A minta oldatának meghatározott térfogatát automata adagolóval, vagy kézzel töltik az oszlopra egy pontosan meghatározott zónába. Amennyiben kézzel végzik, a fecskendő dugattyújának túl gyors benyomása vagy kihúzása a megfigyelt molekulatömeg-eloszlásban változásokat okozhat. Az oldószert szállító rendszernek, amennyire csak lehet, lüktetésmentesnek kell lenni, ideálisan rezgéscsillapítót magában foglalva. Az áramlási sebesség 1 ml/perc nagyságrendű. 1.6.5. Oszlop A mintától függően a polimert egy egyszerű, vagy több, sorba kötött oszlopot használva jellemeznek. Számos meghatározott tulajdonságokkal (pl. pórusméret, szelektivitási határérték) rendelkező porózus oszlopanyag elérhető a kereskedelemben. Az elválasztó gél vagy az oszlophossz megválasztása a minta tulajdonságaitól (pl. hidrodinamikai térfogatok, molekulatömeg-eloszlás) és az elválasztás sajátos körülményeitől, pl. oldószer, hőmérséklet és áramlási sebesség, is függ (1) (2) (3). 1.6.6. Elméleti tányérszám Az elválasztásra használt oszlopot vagy oszlopkombinációt az elméleti tányérszámmal kell jellemezni. A THF eluáló oldószer esetében ez magában foglalja etil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldat töltését ismert hosszúságú oszlopra. Az elméleti tányérszámot a következő egyenlet adja meg: N = 5.54 , vagy N = 16 ahol N az elméleti tányérszám Ve az elúciós térfogat a csúcsmaximumnál W az alapvonal csúcsszélesség W1/2 a csúcsszélesség félmagasságnál. 1.6.7. Az elválasztás hatékonysága Az elméleti tányérszámon kívül, ami a sávszélességet meghatározó mennyiség, az elválasztás hatékonyságának is van szerepe, amit a kalibrációs görbe meredeksége határoz meg. Egy oszlop elválasztási hatékonyságát a következő kapcsolat adja meg: e,M – e, ≥ 6,0 cm3cm2 ahol Ve, Mx az Mx molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata Ve, (10Mx) a 10-szer nagyobb molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata. A rendszer felbontása általában így definiált: R = 2× × M /M 1 ahol Ve1, Ve2 két polisztirol standard elúciós térfogata a csúcsmaximumnál W1, W2 az alapvonal csúcsszélességei M1, M2 a molekulatömegek a csúcsmaximumnál (10-es faktorral térjenek el). Az oszloprendszerre az R-értéknek nagyobbnak kell lennie, mint 1,7 (4). 1.6.8. Oldószerek Minden oldószernek nagy tisztaságúnak kell lennie (THF-ből 99,5 %-os tisztaságút használnak). Az oldószertartálynak (inertgáz-atmoszférában, amennyiben szükséges) elég nagynak kell lenni az oszlop kalibrálásához és néhány mintaanalízishez. Az oldószert gáztalanítani kell, mielőtt a pumpával az oszlopra juttatják. 1.6.9. Hőmérsékletszabályozás A kritikus belső komponensek (injektáló hurok, oszlopok, detektor, csövezés) hőmérsékletét állandó és az oldószerválasztásnak megfelelő értéken kell tartani. 1.6.10. Detektor A detektor célja az oszlopról eluált minta koncentrációjának mennyiségi rögzítése. A csúcsok szükségtelen szélesedésének elkerülésére a detektorcella küvetta térfogatának a lehető legkisebbnek kell lenni. Nem lehet nagyobb 10 μl-nél, kivéve a fényszórási és viszkozitás detektoroknál. A detektálásra differenciális törésmutató-mérést szokás használni. Azonban, ha a minta vagy az elúciós oldószer sajátos tulajdonságai megkövetelik, más detektortípusok is használhatók, pl. UV/látható fény, IR, viszkozitás detektor stb. 2. ADATOK ÉS JELENTÉS 2.1. Adatok A DIN szabványra (1) kell hivatkozni a részletes értékelési követelménynél éppúgy, mint az adatgyűjtéssel és -feldolgozással kapcsolatos követelményeknél. Minden mintánál két független kísérletet kell végezni. Külön-külön kell azokat elemezni. Mn-t, Mw-t, Mw/Mn-t, és Mp-t meg kell adni minden mérésnél. Fontos egyértelműen jelezni, hogy a mért értékek a használt standard molekulatömegével ekvivalens relatív értékek. A retenciós térfogatok, vagy a retenciós idők (lehetőleg belső standardot használva korrigáltak) meghatározása után a log Mp értékek (Mp a kalibráló standard csúcsmaximuma) lesznek ábrázolva egyikük függvényében. Molekulatömeg-dekádonként legalább két kalibrációs pont szükséges, és legalább öt mérési pont kell a teljes görbéhez, aminek le kell fedni a minta becsült molekulatömegét. A kalibrációs görbe kis molekulatömegű végpontját n-hexil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldott anyag definiálja. A számátlag és a tömegátlag molekulatömeget általában elektronikus adatfeldolgozással, az 1.2. pont képletei alapján határozzák meg. A kézi digitalizálás esetében az ASTM D 3536-91 használható (3). Az eloszlási görbét táblázat, vagy ábra (differenciális frekvencia, vagy összeg százalék a log M függvényében) formájában kell megadni. Grafikus ábrázolásnál egy molekulatömeg-dekádnak általában kb. 4 cm szélesnek kell lenni, a csúcsmaximumnak pedig kb. 8 cm magasnak kell lenni. Integrális eloszlási görbék esetében az ordinátában a különbségnek 0 és 100 % között kb. 10 cm-esnek kell lenni. 2.2. Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: 2.2.1. Vizsgált anyag - elérhető információk a vizsgált anyagról (azonosság, adalékanyag, szennyező anyag), - a mintakezelés, megfigyelések, problémák leírása. 2.2.2. Műszerezettség - eluens tartály, inert gáz, az eluens gáztalanítása, az eluens összetétele, szennyezők, - pumpa, rezgéscsillapító, injektáló rendszer, - elválasztó oszlopok (a gyártó, az oszlop jellemzőiről minden információ, mint pórusméret, az elválasztó anyag fajtája stb., a használt oszlopok száma, hossza, és elrendezése), - az oszlop (vagy oszlopkombináció) elméleti tányérszáma, elválasztás hatékonysága (a rendszer felbontása), - információ a csúcsok szimmetriájáról, - oszlophőmérséklet, hőmérséklet-szabályozás módja, - detektor (mérési elv, típus, küvettatérfogat), - áramlásmérő, amennyiben használva lett (gyártó, mérési elv), - adatrögzítő és -feldolgozó rendszer (hardver és szoftver). 2.2.3. A rendszer kalibrálása - a kalibrációs görbék megalkotásához használt módszer részletes leírása, - információk a módszer minőségi követelményeiről (pl. korrelációs együttható, eltérés négyzetösszege stb.), - információk minden, a kísérleti eljárás és az adatok kiértékelése és feldolgozása során alkalmazott extrapolációról, feltételezésről és közelítésről, - a kalibrációs görbék megalkotásához használt minden mérést dokumentálni kell egy táblázatban, amely minden kalibrációs pont esetében az alábbiakat tartalmazza: - a minta neve, - a minta gyártója, - az Mp, Mn, Mw, és Mw/Mn, standardok jellemző értékei, ahogy azokat a gyártó rendelkezésre bocsátotta, vagy az azt követő mérésekből következnek, a meghatározási módszer részleteivel együtt, - injektálási térfogat és koncentráció, - a kalibrációhoz használt Mp érték, - a csúcsmaximumoknál mért elúciós térfogat, vagy korrigált retenciós idő, - a csúcsmaximumnál számított Mp, - a számított Mp és a kalibrációs érték százalékos hibája. 2.2.4. Kiértékelés: - időn alapuló kiértékelés: a megkövetelt reprodukálhatóság biztosítására használt módszerek (korrekciós módszer, belső standard stb.), - információ arról, hogy a kiértékelés az elúciós térfogat, vagy a retenciós idő alapján történt, - információ a kiértékelés korlátairól, amennyiben nem elemeztek egy csúcsot teljesen, - a kiegyenlítési módszerek leírása, amennyiben használva lettek, - minta-előállítási és -előkezelési eljárások, - feloldatlan részecskék jelenléte, amennyiben voltak, - injektálási térfogat (μl) és injektálási koncentráció (mg/ml), - az ideális GPC profiltól való eltéréshez vezető hatásokat jelző megfigyelések, - a vizsgálati eljárások minden módosításának részletes leírása, - a hibatartományok részletei, - az eredmények értelmezésére vonatkozó bármely egyéb információ és megfigyelés. 3. IRODALOMJEGYZÉK (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, 1. rész. (2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polistyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. -------------------------------------------------- III. B. MELLÉKLET A.19. POLIMEREK KIS MOLEKULATÖMEG-TARTALMA 1. MÓDSZER Ez a gél permeációs kromatográfiás módszer az OECD TG 119-nek megfelelője (1996). Az alapelvek és további technikai információk az 1. hivatkozásban találhatók. 1.1. Bevezetés mivel a polimerek tulajdonságai olyan változatosak, lehetetlen egyetlen módszert leírni, pontosan felsorolva az elválasztás és kiértékelés feltételeit, amelyek lefednek minden, a polimerek elválasztásánál előforduló eshetőséget és különlegességet. Különösen a komplex-polimer rendszereknél gyakran nem használható a gél permeációs kromatográfia (GPC). Amennyiben a GPC nem használható, a molekulatömeg más módszerekkel határozható meg (ld. melléklet). Ilyen esetekben meg kell adni a használt módszer valamennyi részletét és igazolását. A leírt módszer az 55672 DIN szabványon alapul (1). Ebben a DIN szabványban található részletes információ a kísérletek kivitelezéséről és az adatkiértékelésről. Amennyiben a kísérleti körülmények módosítása szükséges, a változtatásokat igazolni kell. Más szabvány is használható, ha teljes körű hivatkozással rendelkezik. A leírt módszer ismert polidiszperzitású polisztirol kalibrációs mintákat használ, és esetleg módosítani kell, hogy megfelelő legyen bizonyos polimereknél, pl.: vízben oldható és hosszú láncú elágazó polimerek. 1.2. Fogalommeghatározások és mértékegységek A kis molekulatömeget önkényesen 1000 dalton alattiként definiálták. Az Mn számátlag molekulatömeg és az Mw tömegátlag molekulatömeg a következő egyenletekkel lehet meghatározni: +++++ TIFF +++++ ahol Hi a detektorjel szintje az alapvonaltól Vi retenciós térfogatra Mi a polimerfrakció molekulatömege Vi retenciós térfogatnál, és n az adatpontok száma. A molekulatömeg eloszlásának szélességét, ami a rendszer diszperzitásának mértéke, az Mw/Mn arány adja meg. 1.3. Referenciaanyagok Kalibrációt kell készíteni, mert a GPC relatív módszer. Keskeny eloszlású, lineárisan felépített, ismert Mn és Mw átlagos molekulatömegű, és ismert molekulatömeg eloszlású polisztirol standardokat használnak e célra. Az ismeretlen minta molekulatömegének meghatározására a kalibrációs görbe csak akkor használható, amennyiben a minta és a standardok elválasztásának körülményei azonos módon lettek kiválasztva. A molekulatömeg és az elúciós térfogat között meghatározott kapcsolat csak az adott kísérlet sajátos körülményei között érvényes. A körülmények magukban foglalják mindenek felett a hőmérsékletet, az oldószert (vagy oldószerkeveréket), a kromatográfiás feltételeket és az elválasztó oszlopot vagy oszlopokat. A minta így meghatározott molekulatömegei relatív értékek és "polisztirol ekvivalens molekulatömeg"-ként írták le őket. Ez azt jelenti, hogy a minta és a standard szerkezeti és kémiai különbségeitől függően a molekulatömegek kisebb-nagyobb mértékben eltérhetnek az abszolút értéktől. Amennyiben más standardokat használtak, pl. polietilén-glikol, polietilén-oxid, polimetil-metakrilát, poliakrilsav, azt meg kell indokolni. 1.4. A vizsgálati módszer elve A minta molekulatömeg-eloszlása és az átlagos molekulatömegek (Mn, Mw) GPC-vel meghatározhatók. A GPC a folyékony kromatográfia speciális típusa, aminél a minta az egyes alkotók hidrodinamikai térfogata szerint választódik el (2). Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel töltött oszlopon való áthaladásakor valósul meg. Kis molekulák be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és elsőként eluálódnak. A közepes méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és később eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidrodinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára. Ideális helyzetben az elválasztást teljesen a molekulafajták mérete szabja meg, de a gyakorlatban nehéz elkerülni valamely abszorpciós hatás közrehatását. A nem egyenletes oszlopfeltöltés és a holt térfogat ronthatja a helyzetet (2). A detektálás megvalósul pl. a törésmutatóval vagy az UV-elnyeléssel, és egyszerű eloszlási görbét eredményez. Azonban ahhoz, hogy a tényleges molekulatömeg-értékeket a görbéhez lehessen rendelni, az oszlopot kalibrálni kell ismert molekulatömegű és ideális esetben nagyjából hasonló szerkezetű polimerek, pl. különböző polisztirol standardok futtatásával. Tipikusan Gauss-görbe kapható, néha a kis molekulatömeg oldalán kis farokkal eltorzítva, a függőleges tengely a különböző eluált molekulafajták tömeg szerinti mennyiségét mutatja, a vízszintes tengely a molekulatömeg logaritmusát. A kis molekulatömeg tartalmat ebből a görbéből származtatjuk. A számítás csak akkor lehet pontos, amennyiben az alacsony molekulatömegű fajták a polimerre, mint egészre ekvivalensen, tömeg szerinti alapon hatnak vissza. 1.5. Minőségi követelmények Az elúciós térfogat reprodukálhatósága (relatív standard deviáció, RSD) 0,3 %-nál jobb kell, hogy legyen. Az analízis megkövetelt reprodukálhatóságát belső standarddal való korrekcióval kell biztosítani, amennyiben a kromatogramot az idő függvényében értékelik ki, és nem felel meg a fent említett követelménynek (1). A polidiszperzitás függ a standardok molekulatömegétől. Polisztirol standardoknál a tipikus értékek: Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 | 2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 | Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 | (Mp a standard molekulatömege a csúcsmaximumnál) 1.6. A vizsgálati módszer leírása 1.6.1. A standard polisztirol oldatok készítése A polisztirol standardokat óvatosan keverve oldják fel a választott eluensben. A gyártó ajánlásait számításba kell venni az oldatok készítésénél. A választott standardok koncentrációja különböző faktoroktól függ, pl. injektált térfogat, az oldat viszkozitása, és az elemző detektor érzékenysége. A túltöltés elkerülése érdekében a maximális injektált térfogatot az oszlop hosszához kell igazítani. 30 cm × 7,8 mm-es oszlopú GPC-vel történő analitikai elválasztásoknál a jellemző injektált térfogat rendesen 40 és 100 μl között van. Nagyobb térfogat is elképzelhető, de nem lépheti túl a 250 μl-t. Az oszlop aktuális kalibrációja előtt meg kell határozni az injektált térfogat és a koncentráció optimális arányát. 1.6.2. A mintaoldat készítése Elvben a mintaoldatok elkészítésére is ugyanezek a követelmények érvényesek. A mintát megfelelő oldószerben, pl. tetrahidrofurán (THF), óvatos rázással oldják fel. Semmilyen körülmények között sem szabad ultrahangos fürdőben feloldani. Amennyiben szükséges, az oldat tisztítható 0,2-2 μm-es pórusméretű membránszűrővel. A feloldatlan részecskék jelenlétét, amik nagy molekulatömegű fajták miatt fordulhatnak elő, fel kell jegyezni a végleges jegyzőkönyvben. A feloldott részecskék tömegszázalékának meghatározására megfelelő módszert kell alkalmazni. Az oldatot 24 órán belül fel kell használni. 1.6.3. A szennyező anyag- és adalékanyagtartalom korrekciója Rendszerint szükséges az M < 1000 fajta tartalmának korrekciója a nem polimer fajtájú jelen lévő komponensek (pl. szennyezőanyagok, és/vagy adalékanyagok) járulékára, kivéve, ha a mért tartalom már < 1 %. Ezt a polimer oldat, vagy a GPC eluátum közvetlen analízisével érik el. Amennyiben az oszlopon való áthaladás után az eluátum túl híg a további analízishez, töményíteni kell. Szükséges lehet az eluátum beszáradásig való párologtatása és újraoldása. Az eluátum töményítésének olyan körülmények között kell történnie, amelyek biztosítják, hogy az eluátumban nem történik változás. A GPC lépés utáni eluátumkezelés függ a mennyiségi meghatározás használt analítikus módszerétől. 1.6.4. Készülék A GPC készülék a következő komponensekből áll: - oldószer tartály, - gáztalanító (szükség szerint), - pumpa, - rezgéscsillapító (szükség szerint), - injektáló rendszer, - kromatográfiás oszlopok, - detektor, - áramlásmérő (szükség szerint), - adatrögzítő, -feldolgozó, - hulladéktároló. Biztosítani kell, hogy a GPC rendszer inert legyen a használt oldószerekkel szemben (pl. THF oldószernél acél kapillárisok használata). 1.6.5. Injektáló és oldószerszállító rendszer A minta oldatának meghatározott térfogatát automata adagolóval, vagy kézzel töltik az oszlopra egy pontosan meghatározott zónába. Amennyiben kézzel végzik, a fecskendő dugattyújának túl gyors benyomása vagy kihúzása a megfigyelt molekulatömeg-eloszlásban változásokat okozhat. Az oldószert szállító rendszernek, amennyire csak lehet, lüktetésmentesnek kell lenni, ideálisan rezgéscsillapítót magában foglalva. Az áramlási sebesség 1 ml/perc nagyságrendű. 1.6.6. Oszlop A mintától függően a polimert egy egyszerű, vagy több, sorba kötött oszlopot használva jellemeznek. Számos meghatározott tulajdonságokkal (pl. pórusméret, kizárási határérték) rendelkező porózus oszlopanyag elérhető a kereskedelemben. Az elválasztó gél vagy az oszlophossz megválasztása a minta tulajdonságaitól (pl. hidrodinamikai térfogatok, molekulatömeg-eloszlás) és az elválasztás sajátos körülményeitől, pl. oldószer, hőmérséklet és áramlási sebesség, is függ (1) (2) (3). 1.6.7. Elméleti tányérszám Az elválasztásra használt oszlopot vagy oszlopkombinációt az elméleti tányérszámmal kell jellemezni. A THF eluáló oldószer esetében ez magában foglalja Etil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldat töltését ismert hosszúságú oszlopra. Az elméleti tányérszámot a következő egyenlet adja meg: N = 5.54 , vagy N = 16 ahol N az elméleti tányérszám Ve az elúciós térfogat a csúcsmaximumnál W az alapvonal csúcsszélesség W1/2 a csúcsszélesség félmagasságnál. 1.6.8. Az elválasztás hatékonysága Az elméleti tányérszámon kívül, ami a sávszélességet meghatározó mennyiség, az elválasztás hatékonyságának is van szerepe, amit a kalibrációs görbe meredeksége határoz meg. Egy oszlop elválasztási hatékonyságát a következő kapcsolat adja meg: e,M – e, ≥ 6,0 cm3cm2 ahol Ve, Mx az Mx molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata Ve, (10 Mx) a 10-szer nagyobb molekulatömegű polisztirol elúciós térfogata. A rendszer felbontása általában így definiált: R = 2× × M /M 1 ahol Ve1, Ve2 két polisztirol standard elúciós térfogata a csúcsmaximumnál W1, W2 az alapvonal csúcsszélességei M1, M2 a molekulatömegek a csúcsmaximumnál (10-es faktorral térjenek el). Az oszloprendszerre az R-értéknek nagyobbnak kell lennie mint 1,7 (4). 1.6.9. Oldószerek Minden oldószernek nagy tisztaságúnak kell lennie (THF-ből 99,5 %-os tisztaságút használnak). Az oldószertartálynak (inertgáz-atmoszférában, amennyiben szükséges) elég nagynak kell lenni az oszlop kalibrálásához és néhány mintaanalízishez. Az oldószert gáztalanítani kell, mielőtt a pumpával az oszlopra juttatják. 1.6.10. Hőmérsékletszabályozás A kritikus belső komponensek (injektáló hurok, oszlopok, detektor, csövezés) hőmérsékletét állandó és az oldószerválasztásnak megfelelő értéken kell tartani. 1.6.11. Detektor A detektor célja az oszlopról eluált minta koncentrációjának mennyiségi rögzítése. A csúcsok szükségtelen szélesedésének elkerülésére a detektorcella küvettatérfogatának a lehető legkisebbnek kell lenni. Nem lehet nagyobb 10 μl-nél, kivéve a fényszórási és viszkozitás detektoroknál. A detektálásra differenciális törésmutató mérést szokás használni. Azonban, ha a minta vagy az elúciós oldószer sajátos tulajdonságai megkövetelik, más detektortípusok is használhatók, pl. UV/látható fény, IR, viszkozitás detektor stb. 2. ADATOK ÉS JELENTÉS 2.1. Adatok A DIN szabványra (1) kell hivatkozni a részletes értékelési követelménynél éppúgy, mint az adatgyűjtéssel és -feldolgozással kapcsolatos követelményeknél. Minden mintánál két független kísérletet kell végezni. Külön-külön kell azokat elemezni. Minden esetben elengedhetetlen a mintával azonos körülmények között kezelt vakpróbákból származó adatokat is meghatározni. Fontos egyértelműen jelezni, hogy a mért értékek a használt standard molekulatömegével ekvivalens relatív értékek. A retenciós térfogatok, vagy a retenciós idők (lehetőleg belső standardot használva korrigáltak) meghatározása után a log Mp értékek (Mp a kalibráló standard csúcsmaximuma) lesznek ábrázolva egyikük függvényében. Molekulatömeg-dekádonként legalább két kalibrációs pont szükséges, és legalább öt mérési pont kell a teljes görbéhez, aminek le kell fedni a minta becsült molekulatömegét. A kalibrációs görbe kis molekulatömegű végpontját n – hexil-benzol, vagy más megfelelő nem poláris oldott anyag definiálja. A görbének az 1000 – nél kisebb molekulatömegeknek megfelelő részét a szennyező és adalékanyagoknak megfelelően határozták meg és korrigálták. Az elúciós görbéket általában elektronikus adatfeldolgozás útján értékelik ki. A kézi digitalizálás esetében az ASTM D 3536-91 használható (3). Amennyiben az oszlopon visszamaradt bármilyen nem oldható polimer, molekulatömege valószínűleg nagyobb az oldható frakcióénál, és amennyiben ezt figyelmen kívül hagyják, az az alacsony molekulatömeg-tartalom túlbecsülését eredményezi. A kis molekulatömeg-tartalmú nem oldható polimer korrekciójára vonatkozó útmutatás a mellékletben található. Az eloszlási görbét táblázat vagy ábra (differenciális frekvencia, vagy összegszázalék a log M függvényében) formájában kell megadni. Grafikus ábrázolásnál egy molekulatömeg-dekádnak általában kb. 4 cm szélesnek kell lenni, a csúcsmaximumnak pedig kb. 8 cm magasnak kell lenni. Integrális eloszlási görbék esetében az ordinátában a különbségnek 0 és 100 % között kb. 10 cm-esnek kell lenni. 2.2. Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: 2.2.1. Vizsgált anyag - elérhető információk a vizsgált anyagról (azonosság, adalékanyagok, szennyezőanyagok), - a mintakezelés, megfigyelések, problémák leírása. 2.2.2. Műszerezettség - eluens tartály, inert gáz, az eluens gáztalanítása, az eluens összetétele, szennyezők, - pumpa, rezgéscsillapító, injektáló rendszer, - elválasztó oszlopok (a gyártó, az oszlop jellemzőiről minden információ, mint pórusméret, az elválasztó anyag fajtája stb., a használt oszlopok száma, hossza, és elrendezése), - az oszlop (vagy oszlopkombináció) elméleti tányérszáma, elválasztás hatékonysága (a rendszer felbontása), - információ a csúcsok szimmetriájáról, - oszlophőmérséklet, hőmérséklet-szabályozás módja, - detektor (mérési elv, típus, küvettatérfogat), - áramlásmérő, amennyiben használva lett (gyártó, mérési elv), - adatrögzítő és -feldolgozó rendszer (hardver és szoftver). 2.2.3. A rendszer kalibrálása - a kalibrációs görbék megalkotásához használt módszer részletes leírása, - információk a módszer minőségi követelményeiről (pl. korrelációs együttható, eltérés négyzetösszege stb.), - információk minden, a kísérleti eljárás és az adatok kiértékelése és feldolgozása során alkalmazott extrapolációról, feltételezésről és közelítésről, - a kalibrációs görbék megalkotásához használt minden mérést dokumentálni kell egy táblázatban, amely minden kalibrációs pont esetében az alábbiakat tartalmazza: - a minta neve, - a minta gyártója, - az Mp, Mn, Mw, és Mw/Mn, standardok jellemző értékei, ahogy azokat a gyártó rendelkezésre bocsátotta, vagy az azt követő mérésekből következnek, a meghatározási módszer részleteivel együtt, - injektálási térfogat és koncentráció, - a kalibrációhoz használt Mp érték, - a csúcsmaximumoknál mért elúciós térfogat, vagy korrigált retenciós idő, - a csúcsmaximumnál számított Mp, - a számított Mp és a kalibrációs érték százalékos hibája. 2.2.4. Információ a kis molekulatömegű polimer tartalomról - az analízishez használt módszerek és a kísérletek kivitelezési módjának leírása, - információ a teljes mintára vonatkozó kis molekulatömegű frakciók százalékos (w/w) tartalmáról, - információ a teljes mintára vonatkozó szennyező-, adalékanyagokról, és más nem polimer frakcióról, tömegszázalékban kifejezve. 2.2.5. Kiértékelés: - időn alapuló kiértékelés: a megkövetelt reprodukálhatóság biztosítására használt módszerek (korrekciós módszer, belső standard stb.), - információ arról, hogy a kiértékelés az elúciós térfogat, vagy a retenciós idő alapján történt, - információ a kiértékelés korlátairól, amennyiben nem elemeztek egy csúcsot teljesen, - a kiegyenlítési módszerek leírása, amennyiben használva lettek, - minta-előállítási és minta-előkezelési eljárások, - feloldatlan részecskék jelenléte, amennyiben voltak, - injektálási térfogat (μl) és injektálási koncentráció (mg/ml), - az ideális GPC profiltól való eltéréshez vezető hatásokat jelző megfigyelések, - a vizsgálati eljárások minden módosításának részletes leírása, - a hibatartományok részletei, - az eredmények értelmezésre vonatkozó bármely egyéb információ és megfigyelés. 3. IRODALOMJEGYZÉK (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, 1. rész. (2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. -------------------------------------------------- III. C. MELLÉKLET A.20. POLIMEREK OLDÓDÁS/EXTRAKCIÓ VISELKEDÉSE VÍZBEN 1. MÓDSZER A leírt módszer megfelel az OECD TG 120-nak (1997). Az alapelvek és további technikai információk az 1. hivatkozásban találhatók. 1.1. Bevezetés Bizonyos polimereknél, pl. emulziós polimereknél, kezdeti előkészítő munkára lehet szükség, mielőtt az alább leírt módszert használni lehetne. A módszer nem alkalmazható folyékony polimerek és a vizsgálati körülmények között vízzel reagáló polimerek esetében. Amennyiben a módszer nem praktikus, vagy nem lehetséges, az oldódási/extrakciós viselkedés más módszerekkel is vizsgálható. Ilyen esetben meg kell adni a használt módszer minden részletét és igazolását. 1.2. Referenciaanyagok Nincsenek. 1.3. A vizsgálati módszer elve A polimerek vizes közegben való oldódási/extrakciós viselkedése lombik módszerrel (ld. A.6 oldhatóság vízben, lombik módszer) határozható meg, az alább leírt módosításokkal. 1.4. Minőségi követelmények Nincsenek. 1.5. A vizsgálati módszer leírása 1.5.1. Berendezés A következő berendezés szükséges a módszerhez: - aprító eszköz, pl. őrlőmalom ismert méretű részecskék előállítására, - rázókészülék, hőmérséklet-szabályozási lehetőséggel, - membránszűrő-rendszer, - megfelelő analitikai berendezés, - standardizált szűrők. 1.5.2 Mintakészítés Egy reprezentatív mintát először 0,125 és 0,25 mm közötti részecske méretűre kell csökkenteni megfelelő szűrőket használva. A minta stabilitásához vagy az őrlési folyamatnál szükség lehet hűtésre. Gumiszerű anyagok folyékonynitrogén-hőmérsékleten apríthatók (1). Amennyiben a megkövetelt részecskeméret-frakció nem érhető el, a részecskeméretet annyira le kell csökkenteni, amennyire csak lehetséges, és jegyzőkönyvezni kell az eredményt. A jegyzőkönyvben fel kell tüntetni az aprított minta vizsgálat előtti tárolási módját. 1.5.3. Eljárás A vizsgált anyagból három 10 g-os mintát kell bemérni egyenként, három üvegdugós edénybe, és 1000 ml vizet kell adni mindegyikhez. Amennyiben 10 g polimer kezelése kivihetetlen, a következő legnagyobb kezelhető mennyiséget kell használni, és a víz mennyiségét ehhez igazítani. Az edényeket szorosan le kell zárni és 20 °C-on felrázni. Állandó hőmérsékleten működni képes rázó vagy keverő eszközt kell használni. 24 órás időtartam elteltével az edények tartalmát centrifugálni vagy szűrni kell, és a polimer koncentrációját a tiszta vizes fázisban megfelelő analitikai módszerrel meg kell határozni. Amennyiben a vizes fázishoz nincs megfelelő analitikai módszer, a teljes oldhatóság/extrahálhatóság megbecsülhető a szűrési maradék, vagy centrifugálási csapadék száraz tömegéből. Rendszerint szükség van egyrészt a szennyezőanyagok és az adalékanyagok, másrészt a kis molekulatömegű fajták közti mennyiségi megkülönböztetésre. Gravimetriás meghatározásnál vizsgált anyag használata nélküli vakpróba elvégzése is szükséges, hogy a kísérleti eljárásból származó maradékokkal is el lehessen számolni. A polimerek oldódási/extrakciós viselkedésének meghatározása vízben 37 °C-on 2-es és 9-es pH-nál, a 20 °C-on történő kísérlet leírása szerint végezhető. A pH értékek alkalmas pufferek vagy megfelelő savak és bázisok, mint sósav, ecetsav, analitikai tisztaságú nátrium-, vagy káliumhidroxid, vagy NH3 hozzáadásával állíthatók be. A használt analitikai módszertől függően egy vagy két vizsgálatot kell elvégezni. Amennyiben a vizes fázis polimertartalmának közvetlen analízisére megfelelő sajátos módszerek állnak rendelkezésre, egy, a fent leírtak szerinti vizsgálatnak kielégítőnek kell lenni. Amennyiben ilyen módszerek nem állnak rendelkezésre és a polimer oldódási/extrakciós viselkedésének meghatározása csak a vizes extraktum teljes szervesszén-tartalmának (TOC) meghatározásával végzett közvetett analízisre korlátozott, még egy további vizsgálatot kell elvégezni. Ezt a további vizsgálatot is háromszor kell elvégezni, 10-szer kisebb polimermintákkal és az első vizsgálatban használttal azonos vízmennyiséggel. 1.5.4. Analízis 1.5.4.1. Egy mintamérettel végzett vizsgálat A vizes fázisú polimer komponenseinek közvetlen analízisére módszerek állhatnak rendelkezésre. Alternatív lehetőségként megfontolható az oldott/extrahált polimerkomponensek közvetett analízise a teljes oldhatórész-tartalom meghatározásával és a nem polimerspecifikus komponensekre vonatkozó korrekcióval. A vizes fázis analízise az összes polimerfajta esetében lehetséges: vagy elegendően érzékeny módszerrel, pl. - TOC, CO2-ot fejlesztő perszulfát vagy dikromát feltárással, amit IR-rel, vagy kémiai analízissel történő becslés követ, - atomabszorpciós spektrometria (AAS), vagy induktív csatolású plazmaemissziós (ICP) ekvivalense szilícium, vagy fémtartalmú polimereknél, - UV abszorpció vagy spektrofluorimetria aril polimereknél, - LC-MS alacsony molekulatömegű mintáknál, vagy a vizes extraktum száradásig történő vákuumpárologtatásával és a maradék spektroszkópiás (IR, UV, stb.) vagy AAS/ICP analízisével. Amennyiben a vizes fázis ily módon történő analízise nem kivitelezhető, a vizes kivonatot vízzel nem vegyíthető szerves oldószerrel, pl. klórozott szénhidrogénnel kell extrahálni. Az oldószert ezután el kell párologtatni, és a maradékot a fentiek szerint, a megadott polimertartalomnak megfelelően kell analizálni. Bármilyen szennyezőként vagy adalékként azonosított komponenst ebben a maradékban le kell vonni a polimerre magára jellemző oldódási/extrakciós fok meghatározásának céljából. Amennyiben ezen anyagok viszonylag nagy mennyisége vannak jelen, szükséges lehet a maradékot például HPLC vagy GC analízisnek alávetni annak érdekében, hogy megkülönbözethetők legyenek a szennyezők a jelen lévő monomer és monomerszármazék-fajtáktól, és így az utóbbiak valódi tartalma meghatározható legyen. Néhány esetben elegendő lehet a szerves oldószer egyszerű száradásig történő elpárologtatása és a száraz maradék lemérése. 1.5.4.2. Két különböző mintamérettel végzett vizsgálat Minden vizes extraktum TOC-ra nézve analizált. A minta nem oldódott/nem extrahált részén gravimetriás meghatározást végeznek. Amennyiben az egyes edények tartalmának centrifugálása vagy szűrése után polimer maradékok maradnak az edény falához tapadva, az edényt a szűrlettel kell öblíteni, amíg az edény megtisztul minden látható maradéktól. Ezt követően a szűrletet újra centrifugálják, vagy szűrik. A szűrőn, vagy a centrifugacsőben maradó maradékok 40 °C-on vákuumban szárítják és lemérik. A szárítást állandó tömeg eléréséig kell folytatni. 2. ADATOK 2.1. Egy mintamérettel végzett vizsgálat Mind a három lombik eredményeit és az átlagértékeket is meg kell adni, és tömeg per az oldat térfogatban (tipikusan mg/l), vagy tömeg per polimerminta-tömegben (tipikusan mg/g) kell kifejezni. Továbbá a minta tömegvesztését (számítása: az oldott anyag tömege osztva a kiindulási minta tömegével) is meg kell adni. Ki kell számolni a relatív standard deviációkat (RSD). Egyedi számokat kell megadni a teljes anyagra (polimer + alapvető adalékok, stb.) és csak a polimerre (azaz az ilyen adalékok levonása után). 2.2. Két különböző mintamérettel végzett vizsgálat Meg kell adni a két három párhuzamossal végzett kísérlet vizes extraktumainak egyedi TOC értékeit és valamennyi kísérlet átlagértékét, tömeg per az oldat térfogata (tipikusan mgC/l) és tömeg per kiindulási mintatömeg (tipikusan mgC/g) egységekben is kifejezve. Amennyiben nincs különbség a nagy és kis minta/víz arány eredményeiben, ez azt jelezheti, hogy valamennyi extrahálható komponens tényleg extrahálva lett. Ebben az esetben a közvetlen analízis általában nem szükséges. A maradékok egyedi tömegeit meg kell adni és a minták kiindulási tömegének százalékában kell kifejezni. Átlagokat kísérletenként kell számolni. A 100 és a talált százalék különbsége az eredeti mintában lévő oldható és extrahálható anyag százalékát képviseli. 3. JELENTÉS 3.1. Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésben az alábbi információkat kell tartalmazni: 3.1.1. Vizsgált anyag - a vizsgált anyagról rendelkezésre álló információk (azonosság, adalékok, szennyezők, alacsony molekulatömegű fajok tartalma). 3.1.2. Kísérleti körülmények - a használt eljárások és kísérleti körülmények leírása, - az analitikai és detektálási módszerek leírása. 3.1.3. Eredmények - oldhatósági/extrahálhatósági eredmények mg/l-ben; a különböző oldatokbeli extrakciós tesztek egyedi és átlagértékei, polimertartalom és szennyezőanyagok, adalékanyagok stb. szerint bontva, - oldhatósági/extrahálhatósági eredmények mg/polimer g-ban, - a vizes extraktumok TOC értékei, az oldott anyag tömege és a számolt százalékok, amennyiben mérik, - az egyes minták pH-ja, - információ a vakpróba értékekről, - irodalmi hivatkozások a vizsgált anyag kémiai instabilitásról a vizsgálati és az analitikai eljárás alatt, amennyiben szükséges, - valamennyi, az eredmények értelmezéséhez fontos információ. 4. IRODALOMJEGYZÉK (1) DIN 5377 (1976) Zerkleinerung von Kunstofferzeugnissen für Prüfzwecke. -------------------------------------------------- III. D. MELLÉKLET C.13. BIOKONCENTRÁCIÓ VIZSGÁLATA: ÁTFOLYÁSOS HALVIZSGÁLAT 1. MÓDSZER Ez a biokoncentrációs módszer megfelel az OECD TG 305-nek (1996). 1.1. Bevezetés Ez a módszer a különböző anyagoknak a halakban található, átfolyásos körülmények közötti biokoncentrációs potenciáljának jellemzésére szolgáló eljárást ír le. Bár az átfolyásos vizsgálatot előnyben kell részesíteni, félstatikus rendszerek is megengedhetők, feltéve, hogy az érvényességi követelményeknek megfelel. A módszer elegendő részlettel szolgál a vizsgálat kivitelezéséhez, miközben kellő szabadságot enged a kísérlet kialakításának adaptálására az egyes laboratóriumok körülményeihez és a vizsgálati anyagok változó jellemzőihez. A módszer leghatékonyabban 1,5-6,0 log Pow értékkel rendelkező stabil szerves vegyi anyagokra alkalmazható (1), de még alkalmazható erőteljesen lipofil anyagokra (log Pow > 6,0). Az előre becsülhető biokoncentrációs tényező (BCF), amit néha KB – ként is jelölnek, az ilyen erősen lipofil anyagokra feltehetően nagyobb lesz, mint a laboratóriumi kísérletekből várt állandósult biokoncentrációs tényező (BCFSS) értéke. A kb. 9,0-ig terjedő log Pow értékkel rendelkező szerves vegyi anyagok előre becsült biokoncentrációs tényezője Bintein és mtsai egyenletével kapható meg (2). A biokoncentrációs potenciált jellemző paraméterekhez tartozik a felvételi sebességi állandó (k1), a tisztulási sebességi állandó (k2) és a BCFSS. A radioaktívan jelzett vizsgálati anyagok megkönnyíthetik a víz- és halminták analízisét, és felhasználhatók annak eldöntésére, hogy kell-e bomlástermék-azonosítást és -kvantifikálást végezni. Amennyiben valamennyi radioaktív maradékot megmérték (például égetéssel, vagy szövetfeloldással), a BCF a kiindulási vegyületen, bármely visszatartott metaboliton és az asszimilált szénen is alapul. Valamennyi radioaktív maradékon alapuló BCF-eket ezért nem lehet közvetlenül összehasonlítani csak a kiindulási vegyület sajátos kémiai analíziséből nyert BCF-fel. Radioaktív jelzési vizsgálatoknál kiürülési fázis alkalmazható a kiindulási vegyületre alapozott BCF meghatározása céljából, és a fő metabolitok jellemezhetők, amennyiben szükségesnek minősül. Az anyagmetabolizmus-vizsgálatot a biokoncentráció vizsgálattal kombinálni is lehet a szövetekben levő maradékok analízise és azonosítása révén. 1.2. Fogalommeghatározások és mértékegységek A biokoncentráció/bioakkumuláció a vizsgált anyag koncentrációjának növekedése egy szervezetben/en (meghatározott szöveteiben/n) a vizsgált anyagnak a környező közegben lévő koncentrációjához viszonyítva. A biokoncentrációs tényező (BCF, vagy KB) a vizsgált anyag halban/on, vagy meghatározott szöveteiben/n (Cf, μg/g [ppm]) lévő koncentrációja az akkumulációs vizsgálat felvételi fázisának bármely időpontjában és a vegyszer környező közegben lévő koncentrációjának hányadosa a (Cw, μg/ml [ppm]). Az állandósult biokoncentrációs tényező (BCFSS, vagy KB) nem változik jelentősen egy hosszabb időtartam során, amely alatt a vizsgált anyag koncentrációja állandó a környező közegben. Plató, vagy állandósult állapot látható a halban mért vizsgált anyag (Cf) időfüggő ábráján, amennyiben a görbe párhuzamos az időtengellyel, és Cf három egymást követő, legalább két nap különbséggel vett mintában ± 20 %-on belül vannak az analízisek egymáshoz képest, és nincs számottevő különbség a három mintavételi periódus között. Összevont minták analízisénél legalább négy egymást követő analízis szükséges. Olyan vizsgált anyagoknál, amelyek felvétele lassú, sokkal megfelelőbbek a hétnapos időközök. A biokoncentrációs tényezőket, amelyeket kinetikus koncentrációs tényezőnek (BCFk) neveznek, közvetlenül a kinetikai sebességállandókból (k1/k2) számolják. Az oktanol-víz megoszlási együttható (Pow) a vegyi anyag n-oktanolban és vízben, egyensúlyban mért oldhatóságának aránya (A.8 módszer), Kow-vel is jelölik. A vegyi anyag vízi szervezetekbeli biokoncentrációs potenciálja jelzésére a Pow logaritmusát használják. Az expozíciós, vagy felvételi fázis az az időtartam, amíg a hal érintkezik a vizsgált anyaggal. A felvételi sebességi állandó (k1) a vizsgált anyag koncentrációjának – halban/on (vagy meghatározott szöveteiben/n) való – növekedési sebességét definiáló numerikus érték, az expozíciós idő alatt (k1 1/nap-ban van kifejezve). Az expozíció utáni, vagy tisztulási (ürülési) fázis a kísérleti halból (vagy meghatározott szövetéből) a vizsgált anyagot tartalmazó közegből az anyagot nem tartalmazó közegbe történő kiürülésének (vagy nettó ürülése) időtartama. A tisztulási (ürülési) sebességi állandó (k2) a vizsgált anyag koncentrációjának a halban (vagy meghatározott szöveteiben) való csökkenési sebességét definiáló numerikus érték, a kísérleti halnak a kísérleti anyagot tartalmazó közegből az anyagot nem tartalmazó közegbe való áthelyezését követően (k2 1/nap-ban van kifejezve). 1.3. A vizsgálati módszer elve A vizsgálat két fázisból áll: az expozíciós (felvételi) és az expozíció utáni (tisztulási) fázisból. A felvételi fázis alatt az egy fajhoz tartozó halak különálló csoportjai a vizsgált anyag legalább két koncentrációjával érintkeznek. Ezután átkerülnek a vizsgált anyagot nem tartalmazó közegbe tisztulási fázisra. A tisztulási fázis mindig szükséges, kivéve, ha az anyag felvétele a felvételi fázis alatt elhanyagolható volt (pl. a BCF kisebb 10-nél). A vizsgált anyag koncentrációját a halban/on (vagy meghatározott szövetében/n) a vizsgálat mindkét fázisa alatt figyelemmel kísérik. A két kísérleti koncentráción túlmenően, a halak egy kontrollcsoportját azonos körülmények között tartják – leszámítva a vizsgált anyag hiányát – annak érdekében, hogy a biokoncentráció által okozott ártalmas hatások a megfelelő kontrollcsoporthoz legyenek viszonyíthatók, és meghatározható legyen a vizsgált anyag háttér-koncentrációja. A felvételi fázis 28 napig tart, kivéve, ha az egyensúly bizonyítottan már korábban beáll. A 3. melléklet egyenletével lehet következtetni a felvételi fázis hosszára és az állandósult állapot eléréséhez szükséges időre. A tisztulási periódus ezután a hal egy másik tiszta, ugyanolyan közeget, de vizsgált anyagot nem tartalmazó edénybe való áthelyezésével kezdődik. Amennyiben lehetséges, a biokoncentrációs tényezőt lehetőleg az állandósult állapotban a halban (Cf) és vízben mért (Cw) koncentráció arányaként (BCFSS) is, továbbá a felvételi (k1) és tisztulási (k2) sebességi állandó arányával, elsőrendű kinetikát feltételezve, kinetikai biokoncentrációs tényezőként (BCFk) kell kiszámítani. Amennyiben nyilvánvalóan nem elsőrendű a kinetika, összetettebb modelleket kell alkalmazni (5. melléklet). Amennyiben 28 nap alatt nem áll be az állandósult állapot, a felvételi fázist meg kell hosszabbítani az állandósult állapot eléréséig, vagy 60 napra, amelyik előbb következik be; ezután kezdődik a tisztulási fázis. A felvételi sebességi állandót, a tisztulási (ürülési) sebességi állandót (vagy állandókat, amennyiben összetettebb modellt alkalmaztak), a biokoncentrációs tényezőt, és amennyiben lehetséges, e paraméterek mindegyike esetében a konfidenciahatárokat, a halban és a vízben mért vizsgáltanyag-koncentrációt legjobban leíró modell szerint számítják ki. A BCF a hal teljes nedves tömegének függvényeként van kifejezve. Különleges célokra azonban meghatározott szövetek és szervek (pl. izom, máj) is használhatók, amennyiben a hal elég nagy, illetve ha a hal ehető (filé) és nem ehető (zsiger) részekre osztható. Mivel számos szerves anyagnál egyértelmű kapcsolat van a biokoncentrációs potenciál és a lipofilitás között, ezért ugyanilyen kapcsolat van a kísérleti hal lipidtartalma és az ilyen anyagok megfigyelt biokoncentrációja között is. Ezért a nagy lipofilitású (azaz log Pow > 3) anyagokra kapott vizsgálati eredmények változatosságának e forrása csökkentéséhez a biokoncentrációt a teljes testtömegen kívül a lipidtartalom vonatkozásában is ki kell fejezni. Amennyiben megvalósítható, a lipidtartalmat ugyanazon a biológiai anyagon kell meghatározni, mint amit a vizsgált anyag koncentrációjának meghatározására használtak. 1.4. A vizsgált anyagra vonatkozó információk A biokoncentrációs vizsgálat elvégzése előtt a vizsgált anyagról az alábbi adatokra van szükség: a) oldhatóság vízben; b) oktanol-víz megoszlási együttható Pow (Kow-vel is jelölik, az A.8-ban megadott HPLC módszerrel meghatározva); c) hidrolízis; d) fototranszformáció vízben nap- vagy szimulált napsugárzásnál és a biokoncentrációs vizsgálatnál alkalmazott sugárzási feltételek mellett e) felületi feszültség (azaz olyan anyagoknál, ahol Pow-t nem lehet meghatározni); f) gőznyomás; g) gyors biológiai lebonthatóság (adott esetben). További megkövetelt információ a vizsgálat során használt halfajokra kifejtett toxicitás, lehetőleg az aszimptotikus (azaz az időtől független) LC50. Legyen ismert pontosságú és érzékenységű analitikai módszer a vizsgált anyag kvantifikálására a vizsgált oldatokban és a biológiai anyagban, a mintakészítés és tárolás részleteivel együtt. A vizsgált anyag vízben és halszövetekben érvényes analitikai kimutatási határának is ismertnek kell lenni. Amennyiben 14C-vel jelzett vizsgált anyagot használnak, ismerni kell a szennyező anyagokhoz tartozó százalékos radioaktivitást. 1.5. A vizsgálat érvényessége Az alábbi feltételeknek kell teljesülniük a vizsgálat érvényességéhez: - a hőmérsékletingadozás kisebb ± 2 °C-nál, - az oldott oxigén koncentrációja nem eshet 60 %-os telítettség alá, - a kamrákban a vizsgált anyag koncentrációját a felvételi fázisban mért értékek átlagának ± 20 %-án belül kell tartani, - a vizsgálat végén a kontroll és a kezelt halak mortalitásának és egyéb káros hatásoknak/betegségeknek 10 %-nál kisebbnek kell lenni; amennyiben a vizsgálat több hétig vagy hónapig tart, a pusztulásnak, vagy más ártalmas hatásnak a halak mindkét csoportjában kisebbnek kell lenni havi 5 %-nál, és nem haladhatja meg a 30 %-ot összesen. 1.6. Referenciavegyületek Az ismert biokoncentrációs potenciálú referenciavegyületek használata hasznos lehet a kísérleti eljárások ellenőrzése során, amennyiben elvárt. Bár meghatározott anyagok még nem ajánlhatók. 1.7. A vizsgálati módszer leírása 1.7.1. Eszközök A vizsgálat során kerülni kell az olyan anyagok használatát, amelyek oldódhatnak, szorbeálódhatnak, vagy kimosódhatnak az eszközökből, és ártalmasak lehetnek a halakra. Szabványos, kémiailag inert anyagból készült, a töltési sebességnek megfelelő térfogatú négyszögletes vagy hengeres tartályok használhatók. A puha műanyag-csövek használatát minimalizálni kell. Teflon (R), rozsdamentes acél és/vagy üvegcsövek használata ajánlott. A tapasztalatok alapján szükséges lehet a nagy abszorpciós együtthatójú anyagok, mint szintetikus piretroidok esetében, szilanizált üveg használata. Ilyen esetekben a felszerelést használat után el kell dobni. 1.7.2. Víz A kísérletekhez általában természetes vizet kell használni, amely nem szennyezett, és állandó minőségű. A hígításra használt víz minőségének lehetővé kell tennie a választott halfajok túlélését az akklimatizációs és a kísérleti időszakok alatt anélkül, hogy bármilyen rendellenes külső megjelenés vagy viselkedés jelentkezne. Ideális esetben a vizsgált fajok bizonyítottan képesek túlélni, fejlődni és szaporodni a hígító vízben (pl. laboratóriumi tenyészetben, vagy életciklusra vonatkozó toxicitás vizsgálatnál). A vizet legalább a pH-val, keménységgel, valamennyi szilárd anyaggal, összes szerves szénnel, és lehetőleg ammónium-, nitrit tartalommal és alkalitással, és tengeri fajoknál sótartalommal is jellemezni kell. A halak optimális jólétéhez fontos paraméterek teljesen ismertek, de az 1. melléklet megadja számos paraméter esetében az ajánlott maximális koncentrációt a vizsgált édes- és tengervízre. A kísérleti időszak alatt a víznek állandó minőségűnek kell lenni. A pH értékének 6,0 és 8,5 között kell lenni, de egy adott vizsgálat során ± 0, 5 pH egységnyi tartományon belül kell maradnia. Analízis céljából időközönként mintákat kell venni, annak érdekében, hogy a hígítóvíz ne befolyásolhassa hátrányosan a vizsgálati eredményeket (például a vizsgált anyag komplexálásával), vagy ne legyen káros hatással a halállomány állapotára. Nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), főbb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), peszticidek (pl. összes szerves foszforvegyület és összes szerves klórpeszticidek), összes szerves szén és szuszpendált szilárd anyag meghatározását el kell végezni, például háromhavonta, amennyiben a hígítóvíz ismerten viszonylag állandó minőségű. Amennyiben legalább egy éven keresztül állandónak bizonyul a vízminőség, a vizsgálatot ritkábban és nagyobb időközönként is el lehet végezni (pl. minden hat hónapban). A hígítóvíz természetes részecske- és a teljes szervesszén-tartalmának (TOC) is a lehető legalacsonyabbnak kell lenni, hogy a vizsgált anyag ne abszorbeálódjon szerves anyagon, ami csökkenthetné a biológia elérhetőségét (4). A maximális elfogadható érték 5 mg/l szemcsés anyagok esetében (szárazanyag 0,45 μm-es szűrőn nem jut át) és 2 mg/l az összes szerves szén esetében (ld. 1. melléklet). A vizet szűrni kell felhasználás előtt, amennyiben szükséges. A kísérleti halaktól (ürülék) és a táplálékmaradékból származó szerves széntartalom járulékának a lehető legkisebbnek kell lenni a vízben. A vizsgálat során a kísérleti edényben a szerves szén koncentrációja nem haladhatja meg a vizsgált anyagból származó szerves szén koncentrációját és, amennyiben alkalmazták, az oldószer koncentrációját 10 mg/l-nél nagyobb mértékben (± 20 %). 1.7.3. Vizsgált oldat A vizsgált anyagból megfelelő koncentrációjú törzsoldat készül. A törzsoldatot célszerű a vizsgált anyagnak egyszerűen a hígítóvízbe keverésével vagy összerázással elkészíteni. Az oldószerek vagy diszpergálószerek (oldódást segítő szerek) használata nem ajánlott; néhány esetben azonban alkalmazhatók megfelelő töménységű törzsoldat készítése érdekében. A felhasználható oldószerek: etanol, metanol, etilén-glikol-metil-éter, etilénglikol-dimetil-éter, dimetil-formamid, és trietilén-glikol. A felhasználható diszpergálószerek: Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz 0,01 % és HCO-40. Gondosan kell eljárni a biológiailag könnyen lebontható szerek használata esetén, mivel átfolyásos vizsgálatokban baktériumnövekedés révén problémát okozhatnak. A vizsgált anyag radioaktívan is jelölhető, és a legnagyobb tisztaságúnak kell lenni (pl. lehetőleg > 98 %). Átfolyásos vizsgálatokban a vizsgált anyag törzsoldatát folyamatosan adagoló és hígító rendszerre (pl. állandó áramlási sebességet biztosító pumpa, szabályozható hígítórendszer, telítőrendszer) van szükség a kísérleti koncentrációk kísérleti kamrákba juttatásához. Az egyes tartályok esetében a napi öt térfogatcsere a megengedhető. Az átfolyásos mód részesül előnyben, amennyiben nem alkalmazható (pl. ha a vizsgált szervezetekre károsan hat), fél-statikus módszer használható, feltéve, hogy az érvényességi követelmények teljesülnek. A törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét legalább naponta a vizsgálat előtt és után 48 órával ellenőrizni kell. Az ellenőrzés magában foglalja az áramlási sebesség meghatározását az egyes kísérleti tartályokban, és biztosítja, hogy ne változzon 20 %-nál nagyobb mértékben sem az egyes kamrákban, sem azok között. 1.7.4. A fajok megválasztása A fajok megválasztásánál fontos követelmény, hogy könnyen és megfelelő méretben elérhetők, és a laboratóriumban kielégítő körülmények között tarthatók legyenek. A halfajok megválasztásának egyéb követelményei közé tartozik a fontosság rekreációs, kereskedelmi, ökológiai szempontból éppúgy, mint az összehasonlítható érzékenység, múltbeli sikeres használat stb. Az ajánlott fajok a 2. mellékletben találhatók. Más fajok is használhatók, de a kísérleti eljárást esetleg át kell dolgozni a megfelelő vizsgálati körülmények biztosításához. A fajok és a kísérleti módszer megválasztásának indoklását fel kell tüntetni a jelentésben. 1.7.5. A halak tartása Legalább két hétig a vizsgálat során alkalmazott hőmérsékletű vízben akklimatizálják a törzspopulációt, és kielégítő, a vizsgálat alatt használttal megegyező típusú étrenden tartják őket. 48 órás betelepítési időszak után a mortalitást jegyzőkönyvezni kell, és az alábbi követelményeket kell alkalmazni: - amennyiben a mortalitás a populáció 10 %-ánál nagyobb hét nap alatt: az egész halállományt ki kell cserélni, - mortalitás a populáció 5-10 %-a hét nap alatt: további hét napig kell akklimatizálni, - mortalitás a populáció 5 %-ánál kisebb hét nap alatt: a tételt kell elfogadni – ha a második hét nap alatt a mortalitás 5 %-nál több, az egész tételt ki kell selejtezni. Beteg és rendellenesen fejlődött halak nem használhatók a vizsgálathoz. Minden beteg haltól meg kell szabadulni. A kísérletet megelőző két hétben és a kísérlet alatt a halak nem kaphatnak kezelést betegségre. 1.8. A vizsgálat elvégzése 1.8.1. Elővizsgálat Hasznos lehet elővizsgálatokat végezni a vizsgálati körülmények optimalizására a döntő vizsgálathoz, pl. a vizsgált anyag koncentrációjának, a felvételi és tisztulási fázisok megválasztására. 1.8.2. Az expozíció körülményei 1.8.2.1. A felvételi fázis időtartama A felvételi fázis időtartamának előrejelzése előzetes tapasztalatból (pl. előző vizsgálatból, vagy akkumulációhoz kapcsolódó vegyi anyagból), vagy bizonyos, a vizsgált anyag vízben való oldhatósága, vagy oktanol/víz megoszlási együtthatója ismeretét felhasználó tapasztalati kapcsolatokból nyerhető (ld. 3. melléklet). A felvételi fázis 28 napig tart, kivéve, ha igazolható, hogy az egyensúly korábban beállt. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 28 nap alatt, a felvételi fázist ki kell terjeszteni további méréseket végezve, amíg az állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 60 napig. 1.8.2.2. A tisztulási fázis időtartama A felvételi fázis időtartamának a fele rendszerint elég az anyag megfelelő (pl. 95 %-os) csökkenéséhez (ld. 3. mellékletet a becslés magyarázatához). Amennyiben a 95 %-os csökkenéshez szükséges idő aránytalanul hosszú, meghaladja például a felvételi fázis hosszának kétszeresét (azaz több mint 56 nap), rövidebb időtartam is használható (azaz amíg a vizsgált anyag koncentrációja kisebb lesz az állandósult állapotú koncentráció 10 %-ánál). Az elsőrendű kinetikát eredményező egyrekeszes hal-modellnél összetettebb felvételi és tisztulási fázissal rendelkező anyagoknál azonban az ürülési sebességi állandó meghatározására azonban hosszabb tisztulási fázis is megengedett. Az időtartamot azonban az a periódus szabhatja meg, ami után a halban a vizsgált anyag koncentrációja az analitikai detektálási határ fölött marad. 1.8.2.3. A kísérleti halak száma A halak számát koncentrációnként úgy választják ki, hogy mintánként legalább négy hal álljon rendelkezésre minden mintavételnél. Amennyiben komolyabb statisztikai számításokat akarunk végezni, mintánként több hal szükséges. Amennyiben kifejlett halakat használnak, rögzíteni kell, hogy hímeket és nőstényeket milyen arányban használnak a kísérletben. Amennyiben mindkét nemet használják, dokumentálni kell, hogy az expozíció kezdete előtt a két nem között a lipidtartalom különbsége jelentéktelen; szükséges lehet az összes hím és az összes nőstény hal egybegyűjtése. Mindegyik vizsgálatban hasonló tömegű halakat kell kiválasztani, a legkisebbek ne legyenek kisebbek a legnagyobb hal tömegének kétharmadánál. Ugyanabba a korcsoportba tartozzanak, és a származásuk is azonos legyen. Mivel a halak tömege és kora időnként jelentős hatással lehet a BCF értékekre (1), ezeket a részleteket pontosan rögzíteni kell. Ajánlott az átlagtömeg becslése érdekében a vizsgálat előtt a halpopuláció egy mintacsoportját lemérni. 1.8.2.4. Feltöltés A halak méretéhez viszonyítva nagy mennyiségű vizsgálati oldatot kell használni annak érdekében, hogy minimalizálni lehessen a vizsgálat kezdetén a halak hozzáadásával okozott Cw és az oldott oxigén koncentrációjának csökkenést. Fontos, hogy a feltöltési sebesség a használt kísérleti fajnak megfelelő legyen. Minden esetben 0,1-1,0 g hal (nedves tömeg) per liter víz per nap az ajánlott feltöltési sebesség. Akkor használható nagy töltési sebesség, amennyiben igazolt, hogy a vizsgált anyag megkövetelt koncentrációja fenntartható ± 20 %-os határon belül, és hogy az oldott oxigén koncentrációja nem esik 60 %-os telítettség alá. A megfelelő feltöltési rendszerek kiválasztásánál a halfajok természetes életterét kell figyelembe venni. A fenéken élő halak például nagyobb alapterületű akváriumot igényelnek, mint a nyíltvízi halfajok. 1.8.2.5. Táplálás Az akklimatizációs és kísérleti időszak alatt a halakat megfelelő, ismert lipid- és összfehérjetartalmú táplálékkal kell etetni, az egészségük megőrzéséhez és a testtömegük fenntartásához elegendő mennyiségben. A halak az akklimatizációs és kísérleti időszakban naponta kapnak enni, testtömegük körülbelül 1–2 %-ának megfelelő mennyiségben; ez a legtöbb halfaj esetén a lipidkoncentrációt viszonylag állandó szinten tartja a vizsgálat alatt. A táplálék mennyiségét újra kell számolni, például hetente egyszer, hogy egy állandó szinten legyen tartható a testtömeg és a lipidkoncentráció. Ennek kiszámításához az egyes tartályokban a halak tömege a tartályból legújabban vett halminta tömegéből becsülhető meg. A tartályban maradó halak nem mérhetők le. A kísérleti tartályból a maradék eledelt és az ürüléket az etetést követően (30 perc–1 óra) naponta szívócsövön keresztül el kell távolítani. A vizsgálat alatt a tartályokat a lehető legtisztábban kell tartani, hogy a szervesanyag-koncentráció a lehető legkisebb legyen, mivel a szerves szén jelenléte korlátozhatja a vizsgált anyag biológiai elérhetőségét (1). Miután sok táplálék hallisztből származik, a táplálék vizsgáltanyag-tartalmát is vizsgálni kell. A táplálék peszticid- és nehézfémanalízise is kívánatos. 1.8.2.6. Fény és hőmérséklet A fényperiódus rendszerint 12-16 órás, és a fajok számára megfelelő hőmérsékletet (± 2 °C) kell biztosítani (ld. 2. melléklet). A megvilágítás típusának és jellemzőinek ismertnek kell lenni. Figyelmet kell fordítani a vizsgáltanyag – a vizsgálat besugárzási körülményei közötti – lehetséges fotoátalakulására. Megfelelő megvilágítást kell használni, hogy a fény hatására nem természetes bomlástermékek lehetőleg ne keletkezzenek. Néhány esetben megfelelő lehet a 290 nm alatti UV sugárzást kiszűrő ernyő használata. 1.8.2.7. Kísérleti koncentrációk Átfolyási körülmények között legalább két koncentrációt kell készíteni. Általában a nagyobb (vagy legmagasabb) vizsgált anyag-koncentráció akut aszimptotikus LC50 értékének körülbelül 1 %-ánál és a használt analitikai módszerre vonatkozó vízben elérhető detektálási határnál legalább tízszer nagyobb legyen. A legnagyobb kísérleti koncentráció az akut (96 órás)/krónikus LC50 aránnyal is megosztható legyen (néhány vegyi anyag esetében a megfelelő arány 3-100 lehet). Amennyiben lehetséges, a többi koncentráció(ka)t úgy kell megválasztani, hogy a fenti értéktől 10-es faktorral különbözzön. Amennyiben ez nem lehetséges az 1 %-os LC50 követelmény és az analitikai határ miatt, 10-nél kisebb faktor is használható, vagy fontolóra kell venni 14C-vel jelzett vizsgált anyag használatát. A vizsgált anyag oldhatósága feletti koncentrációt nem szabad használni. Amennyiben szolubilizáló anyagot használnak, annak koncentrációja nem lehet nagyobb 0,1 ml/l-nél, és minden kísérleti tartályban azonosnak kell lennie. Ismerni kell, hogy mennyivel járul hozzá a kísérleti víz teljes szervesszén-tartalmához. Mindent meg kell tenni azonban az ilyen anyagok használatának elkerülése érdekében. 1.8.2.8. Kontrollok A vizsgált sorozat mellett a hígítóvíz-kontrollt, és adott esetben, egy szolubilizálószert tartalmazó kontrollt is be kell állítani, feltéve, hogy biztosított, hogy a szernek nincs hatása a halakra. Amennyiben ez nem áll fenn, mindkét kontrollt el kell végezni. 1.8.3. A vízminőség mérésének gyakorisága A vizsgálat során minden edényben mérni kell az oldott oxigént, TOC-t, pH-t és hőmérsékletet. A kontrollokban és a nagyobb (vagy legnagyobb) koncentrációjú edényben mérni kell a teljes keménységet és (adott esetben) a sótartalmat. Az oldott oxigént és (adott esetben) a sótartalmat legalább háromszor kell mérni a felvételi periódusban – annak elején, közepén és a végén – és egyszer egy héten a tisztulási periódusban. TOC-t a vizsgálat kezdetén (a felvételi fázis előtt 24 és 48 órával) a halak bevitele előtt, és a felvételi és tisztulási fázis alatt pedig legalább hetente egyszer kell mérni. A hőmérsékletet naponta, pH-t a periódusok kezdetén és végén, keménységet vizsgálatonként egyszer kell mérni. A hőmérsékletet ajánlott folyamatosan mérni, legalább egy edényben. 1.8.4. Hal- és vízmintavételezés és analízis 1.8.4.1. Mintavételezési ütemterv A kísérleti tartályokból a vizsgált anyag koncentrációjának meghatározásához a halak bevitele előtt, valamint a felvételi és a tisztulási fázis alatt kell mintát venni. Vízmintát legalább a halmintával egy időben és etetés előtt kell venni. A felvételi fázis alatt meg kell határozni a vizsgált anyag koncentrációját az érvényességi követelmények teljesülésének ellenőrzése céljából. A felvételi fázis alatt legalább ötször, a tisztulási fázis alatt legalább négyszer kell halmintát venni. Mivel egyes esetekben e mintaszámok alapján nehéz pontosan megbecsülni a BCF értékét, különösen, ha egyszerű elsőrendűtől eltérő tisztulási kinetika mutatkozik, tanácsos mindkét periódusban gyakrabban mintát venni (ld. 4. melléklet). A külön minták tárolására és elemzésére csak akkor kerül sor, ha az elemzés első sorozata alkalmatlannak bizonyul a BCF kívánt pontosságú kiszámítására. Az elfogadható mintavételi ütemterv egy példája a 4. mellékletben található. Más feltételezett Pow értékkel más ütemtervet is gyorsan ki lehet dolgozni a 95 %-os felvétel expozíciós idejének kiszámolásával. A mintavételezést a felvételi fázisban addig kell folytatni, amíg az állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 28 napig. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 28 nap alatt, a mintavételezést addig kell folytatni, amíg beáll az állandósult állapot, de legfeljebb 60 napig. A tisztulási fázis megkezdése előtt a halak átkerülnek a tiszta tartályokba. 1.8.4.2. Mintavételezés és mintakészítés Az analízishez a vízmintákat, például inert csövön keresztül, a kísérleti tartály középső pontjából veszik. Mivel a vizsgált anyag biológiailag nem elérhető részét a biológiailag elérhetőtől nem mindig lehet centrifugálással vagy szűréssel elválasztani, (főleg erősen lipofil vegyszerek esetén, azaz log Pow > 5 vegyszereknél) (1) (5), a mintákon nem lehet ezen eljárásokat alkalmazni. Ehelyett a tartályokat minél tisztábban kell tartani, és a teljes szervesszén-tartalmat a felvételi és tisztulási fázis alatt is figyelemmel kell kísérni. Minden mintavételezéskor megfelelő számú halat (általában legalább négyet) kell kivenni a kísérleti kamrákból. A mintahalakat gyorsan le kell öblíteni vízzel, "szárazra" törölni, azonnal megölni a legmegfelelőbb és humánus módszerrel, ezt követően lemérni. A lebomlás vagy egyéb veszteségek elkerülése érdekében a halakat és a vizet lehetőleg rögtön mintavételezés után kell analizálni, és a vizsgálat előrehaladtával megközelítőleg ki kell számolni a felvételi és a tisztulási sebességet. Az azonnali analízis lehetővé teszi annak kiküszöbölését is, hogy egy platót késve ismerjenek fel. Az azonnali analízis meghiúsulása esetén a mintákat megfelelő módszerrel tárolják. A vizsgálat kezdete előtt a különböző vizsgált anyagok tárolásának megfelelő módszeréről információkat kell szerezni – például mélyhűtés, 4 °C-on tartás, tárolás időhossza, extrakció stb. 1.8.4.3. Az analitikai módszer minősége mivel az egész eljárást alapvetően a vizsgált anyaghoz használt analitikai módszer pontossága és érzékenysége határozza meg, kísérlettel ellenőrizni kell a kémiai analízis pontosságát és reprodukálhatóságát, és a vizsgált anyag vízből és halakból való visszanyerését. Azt is ellenőrizni kell, hogy a vizsgált anyag ne legyen észlelhető a használt hígító vízben. Cw és Cf vizsgálatból kapott értékét korrigálni kell – szükség szerint – visszanyeréssel és a kontrollok háttérértékével. A hal- és vízmintákkal végig úgy kell bánni, hogy minimális legyen a szennyezés és a (pl. a mintavevő eszköz adszorpciójából eredő) veszteség. 1.8.4.4. Halminta analízise Amennyiben a vizsgálat során radioaktívan jelzett anyagokat használtak, mérhető az össz-radioaktivitás (a kiindulási vegyületét és metabolitokét együttesen), vagy a minták megtisztíthatók úgy, hogy a kiindulási vegyület külön analizálható legyen. A fő metabolitokat állandósult állapotban, vagy a felvételi fázis végén (amelyik előbb bekövetkezik) szintén lehet jellemezni. Amennyiben az összes mért radioaktívitás százalékában kifejezett BCF ≥ 1000 %, tanácsos lehet, sőt bizonyos vegyszer-kategóriáknál, pl. peszticideknél erősen ajánlott, az állandósult állapotban a halszövetekben a teljes maradék 10 %-át meghaladó mennyiségű bomlástermékek azonosítása és kvantifikálása. Amennyiben a meghatározást elvégezték a halszövetben, el kell végezni a vízben is. A vizsgált anyag koncentrációját rendszerint meg kell határozni minden lemért halban. Amennyiben ez nem lehetséges, az egyes mintavételi alkalmakkor egyesíthetők a minták, de az összesítés korlátozza az adatokra alkalmazható statisztikai eljárások számát. Amennyiben a statisztikai eljárás megkívánja, akkor a kívánt egyesítési eljárást és az ehhez szükséges halak számát a vizsgálati módszerben rögzíteni kell (6) (7). BCF-et a teljes nedves tömeg függvényeként, és az erősen lipofil anyagok esetében a lipidtartalom függvényeként is ki kell fejteni. A hal lipidtartalmát amennyiben lehetséges, minden mintavételi alkalommal meg kell határozni. A lipidtartalom meghatározására megfelelő módszereket kell alkalmazni (3. melléklet, 8. és 2. hivatkozás). Szabványmódszerként a kloroform/metanol extrakciós technika ajánlott (9). A különböző módszerek nem adnak azonos értékeket (10), ezért fontos megadni a használt módszer részleteit. Amenynyiben lehetséges, a lipid analízisét a vizsgált anyag analíziséhez készítettel azonos extraktumon kell elvégezni, mert a lipideket gyakran el kell távolítani az extraktumból, mielőtt kromatográfiásan elemezhetők lennének. A hal lipidtartalma (mg/kg nedves tömeg) a kísérlet végén nem térhet el a kezdeti értéktől ± 25 %-nál jobban. A szövet szárazanyag-tartalmát szintén rögzíteni kell, hogy a lipidkoncentráció átváltható legyen nedves állapotban mértről száraz állapotban mértre. 2. ADATOK 2.1. Az eredmények kezelése A vizsgált anyag felvételi görbéje a felvételi fázisban a halban/on (vagy meghatározott szövetben/en) mért koncentrációt az idő függvényében, aritmetikus skálán ábrázolják. Amennyiben a görbe platót ér el, vagyis megközelítőleg párhuzamos az időtengellyel, az állandósult BCFSS a következő képlet alapján számolható: C állandósult állapotban C állandósult állapotban átlag Amennyiben nem következett be az állandósult állapot, a BCFSS kielégítő pontossággal kiszámolható az "állandósult állapot" – ból, az egyensúly 80 %-ánál (1,6/k2) vagy 95 %-ánál (3,0/k2). A koncentrációs faktort (BCFk) is meghatározzák a két elsőrendű kinetikai állandó k1/k2 arányaként. A tisztulási sebességi állandó (k2) rendszerint a tisztulási görbéből határozható meg (azaz a halban a vizsgált anyag koncentrációjának csökkenése az idő függvényében). A felvételi sebességi állandó (k1) ezután kiszámolható az adott k2 és a Cf egy, a felvételi görbéből levezetett értékéből (ld. 5. mellékletet is). A BCFk és a k1, k2 sebességi állandók kiszámításának megfelelő módszere a számítógéppel végzett nem lineáris paraméterbecslő módszer használata (11). Grafikus módszerek is használhatók k1 és k2 kiszámítására. Amennyiben a tisztulási görbe nyilvánvalóan nem elsőrendű, összetettebb modelleket kell használni (ld. a 3. melléklet hivatkozásait), és biostatisztikus tanácsát kell kikérni. 2.2. Az eredmények értelmezése Amennyiben a vizsgált oldatok koncentrációi az analitikai módszer detektálási határához közeli szinten vannak, az eredményeket óvatosan kell értelmezni. Az egyértelműen definiált felvételi és tisztulási görbe megbízható biokoncentrációs adatokat jelez. A két kísérleti koncentrációnál a felvételi/tisztulási állandók ingadozásának 20 % alatt kell lenni. A két alkalmazott kísérleti koncentráció felvételi/tisztulási sebességének jelentős különbségét rögzíteni kell, és meg kell adni rá a lehetséges magyarázatokat. A jól megtervezett vizsgálatokból kapott BCF-ek konfidenciahatára általában megközelíti a ± 20 %-ot. 3. JELENTÉS A kísérleti jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: 3.1. Vizsgált anyag - fizikai tulajdonság, és adott esetben, fizikai-kémiai tulajdonságok, - kémiai jellemzők (a szervesszén-tartalmat is beleértve, amennyiben szükséges), - amennyiben radioaktívan jelzett, a jelzett atom(ok) pontos helyzete, és a szennyezőkhöz kapcsolódó radioaktivitás százaléka. 3.2. Vizsgált fajok - tudományos név, törzs, származás, bármilyen előkezelés, akklimatizálás, kor, mérettartomány stb. 3.3. Vizsgálati körülmények - használt vizsgálati eljárás (pl. átfolyásos, vagy félsztatikus), - a használt megvilágítás típusa és jellemzői, és időtartama, - vizsgálat kialakítása (pl. a kísérleti tartályok száma és mérete, víztérfogat-csere sebessége, párhuzamos minták száma, halak száma mintánként, kísérleti koncentrációk száma, a felvételi és a tisztulási fázis hossza, hal- és vízminták mintavételi gyakorisága), - törzsoldatok előállításának módszere és a megújítás gyakorisága (amennyiben használták, meg kell adni a szolubilizálószert, koncentrációját és hogy a kísérleti víz szervesszén-tartalmához mennyiben járult hozzá), - a névleges vizsgálati koncentrációk, a kísérleti edényben mért értékek átlaga és ezek standard deviációja, és a kiszámítás módszere, - a hígítóvíz eredete, bármely előkezelés leírása, minden olyan eredmény, amely igazolja, hogy a hígítóvíz megfelel a kísérleti hal igényeinek, és a víz jellemzői: pH, keménység, hőmérséklet, oldottoxigén koncentrációja, maradék klór szintek (amennyiben mérték), összes szerves szén, szuszpendált szilárd anyagok, a vizsgált közeg sótartalma (amennyiben lehetséges), és bármilyen egyéb elvégzett mérés, - vízminőség a kísérleti edényekben, pH, keménység, TOC, hőmérséklet és oldott oxigén koncentráció, - a táplálásra vonatkozó részletes információk (például a táplálék fajtája, eredete, összetétele – legalább a lipid- és fehérjetartalom, amennyiben lehetséges, az etetések számát és az adott táplálék mennyisége), - információk a hal- és vízminták kezeléséről, beleértve az előállítás részleteit, tárolást, extrakciót és analitikai eljárásokat (és pontosságot) a vizsgált anyag és lipidtartalom vonatkozásában (amennyiben mérték). 3.4. Eredmények - minden elvégzett előzetes vizsgálat eredménye, - a kontrollhalak és az egyes expozíciós kamrákban lévő halak mortalitása, és bármely megfigyelt rendellenes viselkedés, - a halak lipidkoncentrációja (amennyiben a kísérlet alkalmával meghatározták), - a halakban a vizsgált vegyi anyag felvételét és tisztulását mutató görbék (minden mért adatot feltüntetve), az állandósult állapotig eltelt idő, - Cf és Cw (standard deviációval és tartománnyal, adott esetben) minden mintavételi időpontra (Cf μg/g teljes nedves testtömeg, vagy meghatározott szövetei, pl. lipid tömegében (ppm) kifejezve, és Cw μg/ml-ben (ppm). A kontrollsorozat Cw értékei (a hátteret is rögzíteni kell), - az állandósult biokoncentrációs tényező (BCFSS) és/vagy kinetikus koncentrációs tényező (BCFk) és, adott esetben, a felvételi és tisztulási (ürülési) sebességi állandók 95 %-os konfidenciahatárai (valamennyit az állat teljes tömegére vagy meghatározott szöveteire, és amennyiben mérték, a teljes lipidtartalomra vonatkoztatva kell megadni), valamennyi használt kísérleti koncentrációnál a konfidenciahatárok és standard deviációk (ahogy megfelelőbb) és a számítás/adatelemzés módszerei, - amennyiben radioaktívan jelzett anyagokat használtak, és amennyiben szükséges, bármely kimutatott metabolit akkumulációja bemutatható, - bármi szokatlan dolog a vizsgálattal kapcsolatban, bármilyen eltérés ezektől az eljárásoktól, és bármely más vonatkozó információ. A "detektálási határon belül nem kimutatott" eredményeket előzetes vizsgálati módszer fejlesztéssel és kísérlettervezéssel kell minimalizálni, mert az ilyen eredmények nem használhatók sebességi állandók számolásához. 4. IRODALOMJEGYZÉK (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumlation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. (2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. (3) OECD Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. (5) US EPA 822-R-94–002 (1994). Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumlation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J. F. (ed.) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. (9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. (10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flo-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final Report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022–84 (reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Mollucsc. --------------------------------------------------