A Bizottság nyolcadik irányelve

(1978. június 15.)

a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról

(78/633/EGK)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb a csatlakozási okmánnyal módosított, a takarmányok hatósági ellenőrzésénél alkalmazandó közösségi mintavételi és analitikai módszerek bevezetéséről szóló, 1970. július 20-i 70/373/EGK bizottsági irányelvre [1] és különösen annak 2. cikkére,

mivel az említett irányelv előírja, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzését, amelynek célja a takarmányok minőségére és összetételére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezésekből eredő követelmények betartásának ellenőrzése, közösségi mintavételi és analitikai módszerek alkalmazásával kell végrehajtani;

mivel az 1971. június 15-i 71/250/EGK [2], az 1971. november 18-i 71/393/EGK [3], az 1972. április 27-i 72/199/EGK [4], az 1972. december 5-i 73/46/EGK [5], az 1974. március 25-i 74/203/EGK [6], az 1974. december 20-i 75/84/EGK [7] és az 1976. március 1-i 76/372/EGK [8] bizottsági irányelvek már számos közösségi analitikai módszert meghatároztak; mivel az azóta eltelt időszakban, az adott területen mutatkozó előrehaladás miatt ajánlatos egy nyolcadik módszersorozat elfogadása;

mivel az ebben az irányelvben előírt intézkedések összhangban vannak a Takarmányok Állandó Bizottsága véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

(1) A tagállamok előírják, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló, azok cinkbacitracin-, flavofoszfolipol-, vas-, réz-, mangán- és cinktartalmára vonatkozó analitikai vizsgálatokat ezen irányelv mellékletében ismertetett módszerek szerint kell végrehajtani.

(2) A vizsgálandó minta előkészítésével foglalkozó rész kivételével, a 71/250/EGK első irányelv mellékletének 1. részében (Bevezetés) megállapított általános rendelkezéseket kell alkalmazni ezen irányelv mellékletében ismertetett módszerek esetében.

2. cikk

A tagállamok legkésőbb 1979. január 1-ig hatályba léptetik azon törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

3. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1978. június 15-én.

a Bizottság részéről

Finn Gundelach

alelnök

[1] HL L 170., 1970.8.3., 2. o.

[2] HL L 155., 1971.7.12., 13. o.

[3] HL L 279., 1971.12.20., 7. o.

[4] HL L 123., 1972.5.29., 6. o.

[5] HL L 83., 1973.3.30., 21. o.

[6] HL L 108., 1974.4.22., 7. o.

[7] HL L 32., 1975.2.5., 26. o.

[8] HL L 102., 1976.4.15., 8. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

1. A CINKBACITRACIN AGAR TÁPTALAJON, DIFFÚZIÓ ÚTJÁN TÖRTÉNŐ MEGHATÁROZÁSA

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A módszer a takarmányokban, koncentrátumokban és előkeverékekben lévő cinkbacitracin meghatározására szolgál. A meghatározás alsó méréshatára 5 mg/kg (5 ppm) [1]. A módszer nem alkalmazható interferáló anyagok, elsősorban nagy mennyiségű réz és aszkorbinsav jelenlétében.

2. VIZSGÁLATI ALAPELV

A mintát 2 pH-értéken metanol/víz/sósav keverékével extraháljuk. A kivonat pH-értékét 6,5-re növeljük, (szükség esetén) koncentráljuk és hígítjuk. Antibiotikum-aktivitását úgy határozzuk meg, hogy egy Micrococcus luteusszal (más néven M. flavus) beoltott agar táptalajban megmérjük a cinkbacitracin diffúziójának mértékét. A diffúziót a mikroorganizmus gátlási zónáinak képződése jelzi. E zónák átmérője egyenesen arányos az antibiotikum-koncentrációnak, az alkalmazott antibiotikum-koncentrációk tartománya feletti logaritmusával.

3. MIKROORGANIZMUS: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240

3.1. A törzstenyészet fenntartása

Oltsunk át Micrococcus luteus-t ferde agar táptalajra (4.1.). 30–37 °C-on, 24 órán keresztül inkubáljuk, tároljuk hűtőszekrényben körülbelül 4 °C-on és kéthetente oltsuk át ferde agarra.

3.2. A baktérium-szuszpenzió elkészítése [2]

2–3 ml nátrium-klorid oldat segítségével (4.3.) gyűjtsük be a szaporulatot egy nemrég elkészített ferde agarról (3.1.). E szuszpenzióval oltsunk be 250 ml Roux-lombikban lévő táptalajt (4.1.), és inkubáljuk 30–37 °C-on, 18–20 órán keresztül. Gyűjtsük be a szaporulatot 25 ml nátrium-klorid oldatban (4.3.) és keverjük össze. Hígítsuk fel a szuszpenziót 1:10 arányban nátrium-klorid oldattal (4.3.). A szuszpenziónak, 650 nm-en, 1 cm-es mérőcellában, nátrium-klorid oldat ellenében (4.3.) mérve, körülbelül 75 % fényáteresztésűnek kell lennie.

4. TÁPTALAJOK ÉS REAGENSEK

4.1. Alap táptalaj [3]

Húspepton | 6,0 g |

Tripton | 4,0 g |

Élesztőkivonat | 3,0 g |

Húskivonat | 1,5 g |

Glükóz | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Víz | 1000 ml |

Sterilizálás utáni pH-érték: 6,5–6,6 | |

4.2. Vizsgálati táptalaj [4]

Tripton | 10,0 g |

Élesztőkivonat | 3,0 g |

Húskivonat | 1,5 g |

Glükóz | 1,0 g |

Agar | 20,0 g |

"Tween 80" | 1 ml |

Víz | 1000 ml |

Sterilizálás utáni pH-érték: 6,5 | |

4.3. 0,8 %-os (w/v) nátrium-klorid oldat: oldjunk fel 8 g a.t. nátrium-kloridot vízben, és hígítsuk 1000 ml-re; sterilizáljuk.

4.4. Tiszta metanol/víz/sósav, a.t. (d: 1,18–1,19) keveréke: 80/17,5/2,5 (v/v/v).

4.5. Foszfátpuffer, pH 6,5

Kálium-hidrogén-foszfát K2HPO4, a.t. (22,15 g).

Kálium-dihidrogén-foszfát KH2PO4, a.t. (27,85 g).

Vízzel 1000 ml-re feltöltve.

4.6. Sósav, a.t. (d: 1,18–1,19).

4.7. Sósav, a.t. (0,1 N).

4.8. 1 N nátrium-hidroxid oldat, a.t.

4.9. 0,04 %-os (w/v) brómkrezol-lila oldat: oldjunk fel 0,1 g brómkrezol-lilát 18,5 ml, 0,01 N nátrium-hidroxid oldatban. Töltsük fel vízzel 250 ml-re, és keverjük össze.

4.10. Standard anyag: ismert aktivitású cinkbacitracin (NE-ben).

5. STANDARD OLDATOK

Mérjünk ki 1050 NE-nek megfelelő mennyiségű standard cinkbacitracint (4.10.) (a megadott aktivitásérték szerint). Adjunk hozzá 5 ml 0,1 N sósavat (4.7.) és hagyjuk állni 15 percig. Adjunk hozzá 30 ml vizet, állítsuk be pH-ját 4,5-re, pH 6,5-ös foszfátpuffer segítségével (4.5.) (körülbelül 4 ml), töltsük fel vízzel 50 ml-re, és alaposan keverjük el (1 ml = 21 NE).

Ebből az oldatból készítsük el a következő oldatokat, 6,5 pH-jú foszfátpufferrel (4.5.) történő többszöri hígítással:

S8 | 0,42 | NE/ml |

S4 | 0,21 | NE/ml |

S2 | 0,105 | NE/ml |

S1 | 0,0525 | NE/ml |

6. A KIVONAT ELKÉSZÍTÉSE

6.1. Extrahálás

6.1.1. Koncentrátumok, előkeverékek és ásványi takarmányok

Mérjünk ki 2,0–5,0 g mintát, adjunk hozzá 30 ml keveréket (4.4.), és rázzuk rövid ideig. Ellenőrizzük, hogy a pH-értéke körülbelül 2 legyen. Rázzuk 10 percig, adjunk hozzá 30 ml, 6,5 pH-jú foszfátpuffert (4.5.) és rázzuk 15 percig. Hígítsuk foszfátpufferrel (4.5.), hogy megkapjuk a várt 0,42 NE/ml (= U8) cinkbacitracin tartalmat.

6.1.2. Fehérjekoncentrátumok

Mérjünk ki 10,0 g mintát, adjunk hozzá 50 ml keveréket (4.4.), és rázzuk rövid ideig. Ellenőrizzük, hogy a pH-értéke körülbelül 2 legyen. Rázzuk 10 percig, adjunk hozzá 50 ml, 6,5 pH-jú foszfátpuffert (4.5.) és rázzuk 15 percig. Hígítsuk foszfátpufferrel (4.5.), hogy megkapjuk a várt 0,42 NE/ml (= U8) cinkbacitracin tartalmat.

6.1.3. Egyéb takarmányok

Mérjünk ki 10,0 g mintát (5 mg/kg-os várt cinkbacitracin tartalom esetén 20,0 g-ot), adjunk hozzá 25 ml keveréket (4.4.), és homogenizáljuk kb. 10 percig. Adjunk hozzá 25 ml, 6,5 pH-jú foszfátpuffert (4.5.), rázzuk 15 percig, majd centrifugáljuk. Vegyünk el 20 ml-t a felülúszó oldatból, és állítsuk be a pH-t 6,5-re, 1 N nátrium-hidroxid-oldat segítségével (4.8.), a brómkrezol-lila oldatot indikátorként használva (4.9.). Párologtassuk rotációs bepárlóban kb. 4 ml-re, 35 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten. Hígítsuk fel a maradékot vízzel, hogy a várt 0,42 NE/ml (= U8) cinkbacitracin tartalmat kapjuk.

6.2. Vizsgálati oldatok

Az U8 oldatból készítsünk U4 (várt tartalom: 0,21 NE/ml), U2 (várt tartalom: 0,105 NE/ml) és U1 (várt tartalom: 0,0525 NE/ml) oldatokat foszfátpufferrel (4.5.) történő többszöri hígítás (1 + 1 arányban) segítségével.

7. A VIZSGÁLAT MÓDJA

7.1. A vizsgálati táptalaj beoltása

Oltsuk be a vizsgálati táptalajt (4.2.) kb. 50 °C-on a baktérium-szuszpenzióval (3.2.). Vizsgálati táptalajt (4.2.) tartalmazó tálcákon végzett előzetes vizsgálatok segítségével határozzuk meg a baktérium-szuszpenziónak azt a mennyiségét, amely a legnagyobb és legtisztább gátlási zónákat adja a cinkbacitracin különböző koncentrációival.

7.2. A tálcák előkészítése

Az agaron történő diffúziót a négy standardoldat-koncentrációt (S8, S4, S2, S1) és a négy vizsgálatioldat-koncentrációt (U8, U4, U2, U1) tartalmazó tálcákon végezzük. Mind a négy kivonat koncentrációt és standard oldatot rá kell helyezni egy-egy tálcára. Ahhoz, hogy ez kivitelezhető legyen, válasszunk elég nagy tálcákat, amelyekben elfér legalább nyolc, egyenként 10–13 mm átmérőjű lyuk, amelyek központja legalább 30 mm-re van egymástól az agar táptalajban. A próbát el lehet végezni egy 200 mm átmérőjű és 20 mm magas megmunkált alumínium vagy műanyag karimagyűrűvel ellátott üveglemez-tálcán is.

Öntsünk a tálcára annyi, a 7.1. pontban ismertetett módon beoltott táptalajt (4.2.), hogy az kb. 2 mm vastag réteget képezzen (50 ml-t egy 200 mm átmérőjű tálcára). Engedjük egyenletesen eloszlani, fúrjuk ki a lyukakat, és helyezzük beléjük a pontosan kimért mennyiségű vizsgálati és standard oldatokat (az átmérőtől függően 0,10 és 0,15 ml közötti mennyiséget lyukanként).

Mindegyik koncentrációt legalább négyszer vigyük fel, így mindegyik meghatározás 32 gátlási zóna értékelésén alapulhat.

7.3. Inkubálás

Inkubáljuk a tálcákat 16–18 órán át 28–30 °C-on.

8. ÉRTÉKELÉS

Mérjük meg a gátlási zónák átmérőjét, 0,1 mm-es pontossággal. Vigyük fel az egyes koncentrációkon mért mérések átlagát egy féllogaritmikus függvénydiagram-papírra, amely a gátlási zónák átmérőjével arányosan mutatja a koncentrációk logaritmusát. Rajzoljuk fel mind a standard oldat, mind a kivonat regressziós vonalát, például az alább feltüntetett módon.

A következő képlet segítségével határozzuk meg a "regressziós" pontot a standard lagalacsonyabb érték (SL) meghatározására:

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

A következő képlet segítségével határozzuk meg a "regressziós" pontot a standard legmagasabb érték (SH) meghatározására:

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Hasonló módon határozzuk meg a "regressziós" pontokat a kivonat legalacsonyabb értékének (UL) és legmagasabb értékének (UH) meghatározására, a fenti képletben az S1, S2, S4 és S8 jelöléseket az U1, U2, U4 és U8 jelölésekkel behelyettesítve.

Vigyük fel a kiszámított SL és SH értékeket ugyanarra a függvénydiagram-papírra és kössük össze őket, hogy megkapjuk a standard oldat "regressziós" vonalát. Hasonló módon, vigyük fel az UL és UH értékeket és kössük össze őket, hogy megkapjuk a kivonat "regressziós" vonalát.

Amennyiben nem áll fenn semmilyen interferencia, a vonalaknak párhuzamosan kell futniuk. Gyakorlati szempontból a vonalak párhuzamosnak tekinthetőek, ha az (SH-SL) és (UH-UL) értékek legfeljebb 10 %-os mértékben térnek el átlagértékeiktől.

Ha a vonalak nem futnak párhuzamosan, akkor vagy az U1 és S1, vagy az U8 és S8 figyelmen kívül hagyható, az SL, SH, UL és UH pedig más képleteket alkalmazva számítható ki, amelyek alternatív "regressziós" vonalakat adnak meg:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

és ehhez hasonlóan az UL és UH esetében. Az alternatív regressziós vonalak párhuzamosságát az előzőhöz hasonlóan kell ellenőrizni. A zárójelentésben meg kell említeni, hogy az eredményt három tényező alapján végzett kalkulációval számítottuk ki.

Ha a vonalak párhuzamosnak tekinthetőek, számítsuk ki a relatív aktivitás logaritmusát (lg A) a következő képletek segítségével.

Négy tényező esetén

lg A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Három tényező esetén

lg A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

vagy

lg A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Tényleges aktivitás = feltételezett aktivitás × relatív aktivitás.

Ha a vonalak nem tekinthetőek párhuzamosnak, ismételjük meg a meghatározást. Ha a párhuzamosságot ezután sem sikerült elérni, a relatív aktivitás logaritmusát (lg A) a c) képlet segítségével számoljuk ki. A kapott eredményt azonban csak hozzávetőlegesnek szabad tekinteni, és ezt fel kell tüntetni a zárójelentésben.

9. ISMÉTELHETŐSÉG

Az ugyanazon analitikus által, ugyanazon a mintán végzett két meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

a 20 %-ot, a minták 5 és 25 mg/kg koncentráció közötti cinkbacitracin-tartalmának legmagasabb értékeire vonatkoztatva;

az 5 mg/kg-ot, abszolút értékben, ha a minták tartalma 25 és 50 mg/kg koncentráció között van;

a 10 %-ot, a minták 50 mg/kg feletti tartalmának legmagasabb értékeire vonatkoztatva.

2. A FLAVOFOSZFOLIPOL AGAR TÁPTALAJON, DIFFÚZIÓ ÚTJÁN TÖRTÉNŐ MEGHATÁROZÁSA

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A módszer a takarmányokban, koncentrátumokban és előkeverékekben található flavofoszfolipol meghatározására szolgál. A meghatározás alsó méréshatára 1 mg/kg (1 ppm).

2. VIZSGÁLATI ALAPELV

A mintát hígított metil-alkohollal, visszafolyós hűtő alatt hevítve extraháljuk. Centrifugálás után, a kivonatot ioncserélő gyantával történő kezeléssel derítjük (szükség esetén), majd hígítjuk. Antibiotikus aktivitását a flavofoszfolipol, Staphylococcus aureusszal beoltott agar táptalajon végbemenő diffúziójának mérésével határozzuk meg. A diffúziót a mikroorganizmus gátlási zónáinak képződése jelzi. E zónák átmérője egyenes arányos az antibiotikum-koncentrációnak az alkalmazott antibiotikum-koncentrációk tartománya feletti logaritmusával.

3. A MIKROORGANIZMUS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. A törzstenyészet fenntartása

Oltsunk Staphylococcus aureusszal ferde agar táptalajt (4.1.). 37 °C-on, 24 órán keresztül inkubáljuk, tároljuk hűtőszekrényben kb. 4 °C-on, és havonta oltsuk át ferde agarra.

3.2. A baktérium-szuszpenzió elkészítése [5]

Tegyünk félre két, törzstenyészetet tartalmazó (3.1.) csövet és hetente oltsuk át őket. 37 °C-on, 24 órán keresztül inkubáljuk, és tároljuk hűtőszekrényben kb. 4 °C-on.

A vizsgálat megkezdése előtt 24 órával, oltsunk be ezzel a szaporulattal kettő–négy, ferde agar táptalajt (4.1.) tartalmazó csövet. 37 °C-on, 16–18 órán keresztül inkubáljuk. Készítsük el a szaporulat szuszpenzióját nátrium-klorid oldatban (4.3.). A szuszpenziónak, 578 nm-en mérve, 1 cm-es mérőcellában, nátrium-klorid oldat ellenében (4.3.) körülbelül 40 %-os fényáteresztésűnek kell lennie.

4. TÁPTALAJOK ÉS REAGENSEK

4.1. Alaptáptalaj [6]

Húspepton | 6,0 g |

Tripton | 4,0 g |

Élesztőkivonat | 3,0 g |

Húskivonat | 1,5 g |

Glükóz | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Víz | 1000 ml |

Sterilizálás utáni pH: 6,5 | |

4.2. Vizsgálati táptalaj

4.2.1. Alapréteg [7]

Húspepton | 6,0 g |

Élesztőkivonat | 3,0 g |

Húskivonat | 1,5 g |

Agar | 10,0 g |

Víz | 1000 ml |

Sterilizálás utáni pH: 6,5 | |

4.2.2. Oltási réteg

Mint a 4.1 pontban, 2,0 g szilikon habzásgátló emulzió [8] hozzáadásával.

4.3. 0,4 %-os (w/v) nátrium-klorid oldat: oldjunk fel 4 g nátrium-kloridot a.t. vízben, és hígítsuk fel 1000 ml-re; sterilizáljuk.

4.4. Tiszta metil-alkohol.

4.5. 50 %-os (v/v) metil-alkohol: hígítsunk fel 500 ml metil-alkoholt (4.4.) 500 ml vízzel.

4.6. 80 %-os (v/v) metil-alkohol: hígítsunk fel 800 ml metil-alkoholt (4.4.) 200 ml vízzel.

4.7. Trisz-hidroximetil-aminometán, a.t.

4.8. Kálium-klorid 1,5 %-os (w/v) metil-alkoholos oldata: oldjunk fel 1,5 g a.t. kálium-kloridot 20 ml vízben, töltsük fel metil-alkohollal (4.4.) 100 ml-re.

4.9. Kationcserélő: Dowex 50 W × 8, 20–50 szemnagyságú, Na-típusú (Serva kat. 41600-as számú) vagy ezzel egyenértékű.

4.10. Anioncserélő: Dowex 1 × 2, 50–100 szemnagyságú, Cl-típusú (Serva kat. 41010-es számú) vagy ezzel egyenértékű. Használat előtt tartsa 12–14 óráig 80 %-os metil-alkoholban (4.6.).

4.11. Üvegvatta.

4.12. pH indikátorpapír (pH 6,6–8,1).

4.13. Aszkorbinsav.

4.14. Standard anyag: ismert aktivitású flavofoszfolipol.

5. ESZKÖZÖK

5.1. Kromatográfiás üvegcső, belső átmérője 9 mm, hossza 150–200 mm, szűkített alsó részénél elzárócsappal, felső részénél üvegcsiszolattal (ami összeköti a csepegtetőtölcsérrel [5.2.]) ellátott.

5.2. 250 ml-es csepegtetőtölcsér, elzárócsappal és üvegcsiszolattal.

5.3. 250 ml-es Erlenmeyer-lombik üvegcsiszolattal.

5.4. Visszafolyós hűtő üvegcsiszolattal.

6. STANDARD OLDATOK

Oldjunk fel egy pontosan kimért mennyiségű standard anyagot (4.14.) 50 %-os metil-alkoholban (4.5.) és hígítsuk fel úgy, hogy 100 μg/ml flavofoszfolipolt tartalmazó törzsoldatot kapjunk. Lezárt lombikokban, 4 °C-on tárolva az oldat két hónapig stabil marad.

Ezen törzsoldatból, 50 %-os metil-alkohollal (4.5.) történő többszöri hígítással készítsük el a következő oldatokat:

S8 | 0,2 | μg/ml |

S4 | 0,1 | μg/ml |

S2 | 0,05 | μg/ml |

S1 | 0,025 | μg/ml |

7. A KIVONAT ELKÉSZÍTÉSE

7.1. Extrahálás

7.1.1. Koncentrátumok, előkeverékek és ásványi takarmányok

Mérjünk ki 2,0–5,0 g mintát, és adjunk hozzá kb. 150 mg aszkorbinsavat (4.13.). Homogenizáljuk 150 ml 50 %-os metil-alkohollal (4.5.) egy Erlenmeyer-lombikban (5.3.), és kb. 400 mg trisz-hidroximetil-aminometán (4.7.) segítségével állítsuk be a pH-t 8,1–8,2-re. Ellenőrizzük a pH-t indikátorpapírral (4.12.). Hagyjuk állni 15 percig, azután újra állítsuk be a pH-t trisz-hidroximetil-aminometánnal (4.7.) 8,1–8,2-re, majd forraljuk 10 percig visszafolyós hűtő alatt (5.4.), állandó keveréssel. Hagyjuk lehűlni, centrifugáljuk a keveréket, és dekantáljuk a kivonatot.

7.1.2. Egyéb takarmányok

Mérjünk ki egy legalább 30 μg flavofoszfolipolt tartalmazó, 5,0–30,0 g tömegű mintát. Homogenizáljuk 150 ml 50 %-os metil-alkohollal (4.5.) egy Erlenmeyer-lombikban (5.3.), és kb. 400 mg trisz-hidroximetil-aminometán (4.7.) segítségével állítsuk be a pH-t 8,1–8,2-re. Ellenőrizzük a pH-t indikátorpapírral (4.12.). Hagyjuk állni 15 percig, azután újra állítsuk be a pH-t trisz-hidroximetil-aminometánnal (4.7.) 8,1–8,2-re, majd forraljuk 10 percig visszafolyós hűtő alatt (5.4.), állandó keveréssel. Hagyjuk kihűlni, centrifugáljuk a keveréket, és dekantáljuk a kivonatot.

7.2. Derítés (a vizsgálat ezen szakasza koncentrátumok, előkeverékek és ásványi takarmányok esetében elhagyható)

Keverjünk össze 110 ml kivonatot 11 g kationcserélővel (4.9.), forraljuk egy percig visszafolyós hűtő alatt (5.4.), állandó keveréssel. Válasszuk le a kationcserélőt centrifugálással vagy szűréssel. Keverjünk össze 100 ml kivonatot 150 ml metil-alkohollal (4.4.), majd tároljuk az oldatot 12–15 óráig 4 °C-on. Szűrjük le még hidegen a flokkulens anyagot.

Helyezzünk egy üvegvatta dugót (4.11.) az üvegcső aljára (5.1.), öntsünk a csőbe 5 ml anioncserélőt (4.10.) és mossuk az oszlopot 100 ml, 80 %-os metil-alkohollal (4.6.). A csepegtetőtölcsér (5.2.) segítségével öntsünk át az oszlopba legalább 100 ml szűrletet, amely várhatóan 16 μg flavofoszfolipolt tartalmaz (30 g-os takarmányminta esetében, 1 ppm-nél 200 ml-t). Adott esetben, mielőtt az oszlopba töltenénk, hígítsuk a szűrletet 80 %-os metil-alkohollal (4.6.), hogy a várt 16 μg/100 ml koncentrációjú flavofoszfolipol-tartalmat kapjuk. Állítsuk be az átfolyási sebességet kb. 2 ml/perc értékre. Öntsük el a szüredéket. Ezután mossuk az oszlopot 50 ml, 80 %-os metil-alkohollal (4.6.) és öntsük el a szüredéket.

Eluáljuk a flavofoszfolipolt kálium-klorid metil-alkoholos oldatával (4.8.), az átfolyási sebességet kb. 2 ml/perc értéken tartva. Vegyünk fel 50 ml eluátumot egy mérőlombikban, adjunk hozzá 30 ml vizet, és keverjük össze. Ezen oldat flavofoszfolipol-tartalmának 0,2 μg/ml-nek kell lennie (= U8).

7.3. Vizsgálati oldatok

Adott esetben (pl. a derítés kihagyása esetén), hígítsuk a 7.1.1. pontban kapott kivonatot 50 %-os metil-alkohollal (4.5.), hogy a várt 0,2 μg/ml koncentrációjú flavofoszfolipol-tartalmat kapjuk(= U8).

Az U8 oldatból, 50 %-os metil-alkohollal (4.5.) történő többszöri hígítás útján (1 + 1 arányban), készítsük el az U4 (várt tartalom: 0,1 μg/ml), az U2 (várt tartalom: 0,05 μg/ml) és az U1 (várt tartalom: 0,025 μg/ml) oldatokat.

8. A VIZSGÁLAT MÓDJA

8.1. A vizsgálati táptalaj beoltása

Oltsuk be baktérium-szuszpenzióval (3.2.) a vizsgálati táptalajt (4.2.2.) kb. 50 °C-on. A vizsgálati táptalajt (4.2.2.) tartalmazó tálcákon végzett előzetes vizsgálatokkal határozzuk meg a bakterium-szuszpenziónak azt a mennyiségét, amely a legnagyobb és legtisztábban látható gátlási zónákat adja a flavofoszfolipol különböző koncentrációival (kb. 30 ml/liter).

8.2 A tálcák előkészítése

Az agaron végbemenő diffúziót a négyféle koncentrációjú standard oldatot (S8, S4, S2, S1) és a négyféle koncentrációjú vizsgálati oldatot (U8, U4, U2, U1) tartalmazó tálcákon végezzük. Ezt a négyféle koncentrációban meglévő kivonatot és standard oldatot minden egyes tálcán el kell helyezni. Ezért olyan tálcákat válasszunk, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy az agar táptalajon legalább nyolc, egymástól minimum 30 mm távolságra lévő, egyenként 10–13 mm átmérőjű lyuk elférjen rajtuk. A vizsgálat elvégezhető olyan üveglemez tálcákon is, amelyeket egy 200 mm átmérőjű és 20 mm magas megmunkált alumínium vagy műanyag karimagyűrű szegélyez.

Öntsünk a tálcákra annyi táptalajt (4.2.1.), hogy az kb. 1,5 mm vastagságú réteget képezzen (45 ml-t egy 200 mm átmérőjű tálcára). Engedjük egyenletesen eloszlani, helyezzünk rá egy újabb, a 8.1. pontban leírt módon beoltott táptalajréteget (4.2.2.), hogy kb. 1 mm vastag réteget képezzen (30 ml-t egy 200 mm átmérőjű tálcán). Engedjük ismét egyenletesen eloszlani, fúrjunk lyukakat, és helyezzük el bennük a pontosan kimért mennyiségű vizsgálati és standard oldatokat (az átmérőtől függően 0,10 és 0,15 ml közötti mennyiséget lyukanként).

Minden egyes koncentrációt legalább négyszer vigye fel, így mindegyik meghatározás 32 gátlási zóna értékelésén alapulhat.

8.3. Inkubálás

Inkubálja a tálcákat 16–18 órán át 28–30 °C-on.

9. ÉRTÉKELÉS

Mérjük meg a gátlási zónák átmérőjét, 0,1 mm-es pontossággal. Az egyes koncentrációkon végzett mérések átlagát vigyük fel egy féllogaritmikus függvénydiagram-papírra, amely a gátlási zónák átmérőjével arányosan mutatja a koncentrációk logaritmusát. Szerkesszük meg mind a standard oldat, mind a kivonat regressziós egyenesét, például az alábbiak szerint.

A következő képlet segítségével határozzuk meg a standard legalacsonyabb értékéhez (SL) tartozó regressziós pontot:

SL =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

810

SH =

7 S

+ 4 S

+ S

- 2 S

110

Hasonló módon, határozzuk meg a kivonat legalacsonyabb (UL) és legmagasabb értékéhez (UH) tartozó regresz- sziós pontokat, úgy, hogy a fenti képletben az S1, S2, S4 és S8 jelöléseket az U1, U2, U4 és U8 jelölésekkel helyettesítjük.

Vigyük fel a kiszámított SL és SH értékeket ugyanarra a függvénydiagram-papírra, és kössük össze őket, hogy megkapjuk a standard oldathoz tartozó regressziós egyenest. Hasonló módon, vigyük fel az UL és UH értékeket és kössük össze őket, hogy megkapjuk a kivonathoz tartozó regressziós egyenest.

Amennyiben nem áll fenn semmilyen interferencia, a vonalaknak párhuzamosan kell futniuk. Gyakorlati szempontból a vonalak párhuzamosnak tekinthetőek, ha az (SH-SL) és (UH-UL) értékek legfeljebb 10 %-os mértékben térnek el átlagértéküktől.

Amennyiben a vonalak nem futnak párhuzamosan, akkor vagy az U1 és S1, vagy az U8 és S8 figyelmen kívül hagyható, az SL, SH, UL és UH pedig más képleteket alkalmazva számítható ki, amelyek alternatív regressziós egyeneseket adnak meg:

SL =

5 S

+ 2 S

- S

6

SH =

5 S

+ 2 S

- S

6

és ehhez hasonlóan az UL és UH esetében. Az alternatív regressziós egyenesek párhuzamosságát az előzőhöz hasonlóan kell ellenőrizni. A zárójelentésben meg kell említeni, hogy az eredmény három érték alapján lett kiszámítva.

Ha a vonalak párhuzamosnak tekinthetőek, a következő képlet segítségével számítsuk ki a relatív aktivitás logaritmusát (lg A).

Négy tényező esetén

lg A =

× 0,602

U

+ U

+ S

+ S

- U

- U

- S

- S

2

Három tényező esetén

lg A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

1

vagy

lg A =

× 0,401

U

+ S

- U

- S

2

Tényleges aktivitás = feltételezett aktivitás × relatív aktivitás.

Ha a vonalak nem tekinthetőek párhuzamosnak, ismételjük meg a meghatározást. Ha a párhuzamosságot ezután sem sikerül elérni, számoljuk ki a relatív aktivitás logaritmusát (lg A) a c) képlet segítségével. A kapott eredmény azonban csak hozzávetőlegesnek tekinthető, és ezt fel kell tüntetni a zárójelentésben.

10. ISMÉTELHETŐSÉG

Ugyanazon analitikus által, ugyanazon a mintán végzett két meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

a 0,5 mg/kg értéket, abszolút értékben, 1–2 mg/kg flavofoszfolipol-tartalmom esetén;

a 25 %-ot, 2–10 mg/kg közötti koncentráció legmagasabb értékeire vonatkoztatva;

a 20 %-ot, 10–25 mg/kg közötti koncentráció legmagasabb értékeire vonatkoztatva;

az 5 mg/kg értéket, abszolút értékben, 25–50 mg/kg közötti koncentráció esetén;

a 10 %-ot, 50 mg/kg feletti koncentráció legmagasabb értékeire vonatkoztatva.

3. A VAS, RÉZ, MANGÁN ÉS CINK NYOMELEMEK MEGHATÁROZÁSA

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A módszer lehetővé teszi a vas, réz, mangán és cink nyomelemek takarmányokban történő meghatározását. A meghatározás alsó méréshatárai a következők:

vas (Fe): 20 mg/kg

réz (Cu): 10 mg/kg

mangán (Mn): 20 mg/kg

cink (Zn): 20 mg/kg

2. VIZSGÁLATI ALAPELV

Az esetleg jelen lévő szerves anyag roncsolása után, a mintát sósavban oldjuk. A vas, réz, mangán és cink nyomelemeket, megfelelő hígítás után, atomabszorpciós spektrometriával határozzuk meg.

3. REAGENSEK

Előzetes megjegyzések

A reagensek és az analitikai oldatok elkészítéséhez használt víznek a meghatározás alá eső kationoktól mentesnek kell lennie, amelyet vagy boroszilikát üveg, illetve kvarc lepárlókészülékben történő kétszeres desztillálással, vagy ioncserélő gyantával végzett kétszeres kezeléssel állíthatunk elő.

A reagenseknek legalább analitikai tisztaságúaknak (a.t.) kell lenniük. A meghatározandó elemektől való mentességet vakpróbával kell ellenőrizni. Szükség esetén, a reagenseket tovább kell deríteni.

Az alább leírásra kerülő standard oldatok helyett használhatunk olyan kereskedelmi forgalomban lévő standard oldatokat is, amelyek garantált minőségűek és ezt felhasználásuk előtt le is ellenőrizték.

3.1. Sósav, a.t. (d: 1,19).

3.2. Sósav, a.t. (6 N).

3.3. Sósav, a.t. (0,5 N).

3.4. 38–40 %-os (v/v) fluorsav, amelynek vastartalma kevesebb mint 1 mg Fe/liter és a bepárlás utáni maradék kevesebb mint 10 mg (mint szulfát)/liter.

3.5. Kénsav, a.t. (d: 1,84).

3.6. Hidrogén-peroxid, a.t. (megközelítőleg 100 térfogat oxigén [30 tömegszázalék]).

3.7. Standard vasoldat (1000 μg Fe/ml) a következőképpen elkészítve: oldjunk fel 1 g a.t. vashuzalt 200 ml 6 N sósavban (3.2.), adjunk hozzá 16 ml hidrogén-peroxidot (3.6.), és töltsük fel vízzel 1 literre.

3.7.1. Standard vas-munkaoldat (100 μg Fe/ml), amelyet a standard oldat (3.7.) vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával készítünk el.

3.8. Standard rézoldat (1000 μg Cu/ml) a következőképpen elkészítve: oldjunk fel 1 g (a.t.) porított rezet 25 ml 6 N sósavban (3.2.), adjunk hozzá 5 ml hidrogén-peroxidot (3.6.), és töltsük fel vízzel 1 literre.

3.8.1. Standard réz-munkaoldat (10 μg Cu/ml), amelyet a standard oldat (3.8.) vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával, majd az így kapott oldatnak vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával készítünk el.

3.9. Standard mangánoldat (1000 μg Mn/ml) a következőképpen elkészítve: oldjunk fel 1 g (a.t.) porított mangánt 25 ml 6 N sósavban (3.2.), és töltsük fel vízzel 1 literre.

3.9.1. Standard mangán-munkaoldat (10 μg Mn/ml), amelyet a standard oldat (3.9.) vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával, majd az így kapott oldatnak vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával készítünk el.

3.10. Standard cinkoldat (1000 μg Zn/ml) a következőképpen elkészítve: oldjunk fel 1 g (a.t.) cinkszalagot vagy -fóliát 25 ml 6 N sósavban (3.2.), és töltsük fel vízzel 1 literre.

3.10.1. Standard cink-munkaoldat (10 μg Zn/ml), amelyet a standard oldat (3.10.) vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával, majd az így kapott oldat vízzel, 1 + 9 arányban történő hígításával készítünk el.

3.11. Lantán-klorid oldat a következőképpen elkészítve: oldjunk fel 12 g lantán-oxidot 150 ml vízben, adjunk hozzá 100 ml 6 N sósavat (3.2.), és töltsük fel vízzel 1 literre.

4. ESZKÖZÖK

4.1. Hőmérséklet-szabályozóval és regisztrálókészülékkel ellátott tokos kemence.

4.2. Magas rezisztenciájú boroszilikát üvegeszközök. Ajánlatos kimondottan nyomelemek meghatározására szolgáló eszközöket használni.

4.3. Platinatégely és (választás szerint) kvarctégely.

4.4. Atomabszorpciós spektrofotométer, amely érzékenység és pontosság vonatkozásában a kívánt tartományban megfelel a módszer követelményeinek.

5. A VIZSGÁLAT MÓDJA

5.1. Szerves anyagot tartalmazó minták

5.1.1. Hamvasztás és az oldatok előkészítése az analízisre [9]

i. Helyezzünk egy 0,2 mg pontossággal kimért, 5–10 g tömegű mintát kvarc- vagy platinatégelybe (4.3.) (lásd a b) megjegyzést), szárítsuk ki kemencében 105 °C-on, majd rakjuk be a tégelyt a hideg tokos kemencébe (4.1.). Zárjuk a kemencét (lásd a c) megjegyzést) és fokozatosan emeljük a hőmérsékletet kb. 90 perc alatt 450–475 °C-ra. Tartsuk ezt a hőmérsékletet 4–16 óráig (pl. egész éjszaka), hogy eltávozzanak a széntartalmú anyagok, majd nyissuk ki a kemencét, és hagyjuk kihűlni (lásd a d) megjegyzést).

Mossuk a tégelyt kb. 5 ml sósavval (3.1.), amit aztán lassan és óvatosan öntsünk a főzőpohárba (CO2-képződés miatt heves reakció léphet fel). Adjuk hozzá cseppenként a sósavat (3.1.) addig kevergetve, amíg a pezsgés meg nem szűnik. Párologtassuk el belőle a nedvességet, időnként üvegbottal megkeverve.

Ezután adjunk a maradékanyaghoz 15 ml, 6 N sósavat (3.2.), majd kb. 120 ml vizet. Keverjük meg az üvegbottal, amit a főzőpohárban hagyunk, és fedjük be a főzőpoharat egy kémlelőüveggel. Lassan forraljuk és tartsuk forrásponton addig, amíg a hamu feloldódása befejeződik. Szűrjük le hamumentes szűrőpapíron, és vegyük fel a szűrletet egy 250 ml-es mérőlombikban. Mossuk a főzőpoharat és a szűrőt 5 ml, forró 6 N sósavval (3.2) és kétszer forrásban lévő vízzel. Töltsük fel a mérőlombikot jelig vízzel (a HCl-koncentráció kb. 0,5 N).

ii. Ha a szűrőben lévő maradékanyag feketének látszik (szén), tegyük vissza a kemencébe, és hamvasszuk újra 450–475 °C-on. Ez a hamvasztás, amely csak pár órát vesz igénybe (kb. három–öt órát), akkor fejeződik be, amikor a hamu fehérnek vagy majdnem fehérnek tűnik. Oldjuk fel a maradékanyagot kb. 2 ml sósavval (3.1.), párologtassuk el belőle a nedvességet és adjunk hozzá 5 ml, 6 N sósavat (3.2.). Hevítsük, szűrjük az oldatot mérőlombikba, és töltsük fel a mérőlombikot jelig vízzel (a HCl-koncentráció kb. 0,5 N).

Megjegyzések:

a) A nyomelemek meghatározásakor fontos odafigyelni a – főleg a cink, réz és vas képezte – szennyeződés jelentette kockázatokra. Ezért a minták előkészítésére használt eszközöknek mentesnek kell lennie ezen fémektől.

A szennyeződés általános kockázatának csökkentése érdekében, dolgozzunk pormentes környezetben, gondosan tisztított eszközökkel és alaposan elmosott üvegedényekkel. Különösen a cink meghatározása érzékeny a szennyeződések számos típusára, pl. az üvegkészítményektől, a reagensektől, a portól, stb. származókra.

b) Az elhamvasztandó minta tömege a takarmány hozzávetőleges nyomelem-tartalma alapján számítható ki, az alkalmazott spektrofotométer érzékenységéhez viszonyítva. Egyes, kevés nyomelemet tartalmazó takarmányok esetén 10–20 g-os mintát kell venni, és a végső oldatot csak 100 ml-re kell feltölteni.

c) A hamvasztást zárt kemencében kell elvégezni, levegő vagy oxigén befúvatása nélkül.

d) A pirométer által jelzett hőmérséklet nem lépheti túl a 475 °C-ot.

5.1.2. Spektrofotometriás meghatározás

5.1.2.1. A kalibráló oldatok elkészítése

Minden egyes meghatározandó elemhez készítsünk a 3.7.1., 3.8.1., 3.9.1. és 3.10.1. pontban megadott standard munkaoldatokból egy kalibrálóoldat-sorozatot, úgy, hogy minden egyes kalibráló oldatnak a HCl-koncentrációja kb. 0,5 N és (vas, mangán és cink esetében) a lantán-klorid koncentrációja 0,1 %-os (w/v) lantánnal egyenértékű legyen. A kiválasztott nyomelem-koncentrációknak az alkalmazott spektrofotométer érzékenységi tartományán belül kell lenniük. Az alábbi táblázatok példákon keresztül mutatják a kalibráló oldat-sorozatok egy mintasorozatát; az alkalmazott spektrofotométer típusától és érzékenységi tartományától függően, adott esetben más koncentrációkat kell kiválasztani.

Vas

μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

standard munkaoldat, ml-ben (3.7.1.) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

(1 ml = 100 μg Fe) + ml 6 N HCl (3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantán-klorid oldat (3.11.), töltsük fel vízzel 100 ml-re. |

Réz

μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 0,1 |

standard munkaoldat, ml-ben (3.8.1.) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |

Töltsük fel vízzel 100 ml-re. |

Mangán

μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |

standard munkaoldat, ml-ben (3.9.1.) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantán-klorid oldat (3.11.), töltsük fel vízzel 100 ml-re. |

Cink

μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |

standard munkaoldat, ml-ben (3.10.1.) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |

+ ml 6 N HCl (3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |

+ 10 ml lantán-klorid oldat (3.11.), töltsük fel vízzel 100 ml-re. |

5.1.2.2. Az oldat előkészítése az analízisre

A réz meghatározásához az 5.1.1. pont szerint elkészített oldatot általában közvetlenül fel lehet használni. Ha mégis korrigálni kell koncentrációját a kalibrálóoldat-sorozaton belül, egy aliquot részt pipettázzunk egy 100 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel jelig 0,5 N sósavval (3.3.).

A vas, mangán és cink meghatározásához pipettázzunk egy aliquot részt az 5.1.1. pont szerint elkészített oldatból egy 100 ml-es mérőlombikba, adjunk hozzá 10 ml lantán-klorid oldatot (3.11.), és töltsük fel jelig 0,5 N sósavval (3.3.) (lásd még az Észrevételek. 8. pontját).

5.1.2.3. Vakpróba

A vakpróba során a módszer összes meghatározott lépését el kell végezni, azzal a különbséggel, hogy a mintaanyagot elhagyjuk.

A "0" kalibráló oldatot nem szabad vakoldatként használni.

5.1.2.4. Az atomabszorpció mérése

Mérjük meg a kalibráló oldatok és az analizálandó oldat atomabszorpcióját oxidáló, levegő-acetilén láng alkalmazásával, a következő hullámhosszokon:

Fe : 248,3 nm

Cu : 324,8 nm

Mn : 279,5 nm

Zn : 213,8 nm

Minden mérést négyszer végezzünk el.

5.2. Ásványi takarmányok

Ha a minta nem tartalmaz szerves anyagot, az előzetes hamvasztás szükségtelen. Folytassuk a műveletet az 5.1.1.i. pont második bekezdésétől. A fluorsavval végzett bepárlás elhagyható.

6. AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA

Egy kalibrációs görbe segítségével, számoljuk ki az analizálandó oldat nyomelem-koncentrációját, az eredményt a minta kilogrammonkénti nyomelemtartalmára vonatkoztatva, milligrammban adjuk meg (ppm).

7. ISMÉTELHETŐSÉG

Az ugyanazon analitikus által, ugyanazon a mintán végzett, két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

- az 5 mg/kg-ot, abszolút értékben, a vizsgált nyomelemtartalom legfeljebb 50 mg/kg értéke esetén,

- a legmagasabb érték 10 %-át a vizsgált nyomelemtartalom 50 és 100 mg/kg koncentráció közötti értéke esetén,

- a 10 mg/kg-ot, abszolút értékben, a vizsgált nyomelemtartalom 100 és 200 mg/kg közötti értéke esetén,

- a legmagasabb érték 5 %-át, a vizsgált nyomelemtartalom 200 mg/kg feletti értéke esetén.

8. ÉSZREVÉTEL

P

· 2, a lantán-klorid oldat (3.11.) az analizálandó oldathoz és a kalibrációs oldatokhoz való hozzáadása elhagyható.

[1] 1 mg takarmányminőségű cink-bacitracin 42 nemzetközi egységnek (NE) felel meg.

[2] Más módszerek is használhatók, feltéve, ha megállapították, hogy hasonló baktérium-szuszpenziókat lehet előállítani velük.

[3] Bármely hasonló összetételű, kereskedelemben kapható táptalaj használható, amely azonos eredményt ad.

[4] Bármely hasonló összetételű, kereskedelemben kapható táptalaj használható, amely azonos eredményt ad.

[5] Más módszerek is használhatók, feltéve, ha megállapították, hogy hasonló baktérium-szuszpenziókat lehet előállítani velük.

[6] Bármely hasonló összetételű, kereskedelemben kapható táptalaj használható, amely hasonló eredményt ad, pl. oxoid antibiotikumos táptalaj 1 (CM 327) 3-as számú (L 13) oxoid agar hozzáadásával.

[7] Bármely hasonló összetételű, kereskedelemben kapható táptalaj használható, amely hasonló eredményt ad, pl. oxoid antibiotikumos táptalaj 2 (CM 335) 3-as számú (L 13) oxoid agar hozzáadásával.

[8] Pl. SE 2 a Wacker Chemie GmbH-tól, München.

[9] A zöldtakarmányok (akár frissen, akár szárítva) nagy mennyiségű növényi eredetű kovasavat tartalmazhatnak, amely nyomelemeket tarthat vissza, ezért el kell távolítani. Az ilyen takarmányokból vett minták esetén ezért a következő, módosított módszert kell követni.Végezzük el az 5.1.1.i. pontjában ismertetett műveletet a szűrésig. Az oldhatatlan maradékot tartalmazó szűrőpapírt mossuk át kétszer forrásban lévő vízzel, és helyezzük egy platinatégelybe (4.3.). Égessük el a tokos kemencében (4.1.) 550 °C alatti hőmérsékleten, amíg az összes széntartalmú anyag teljesen el nem tűnik. Hagyjuk kihűlni, adjunk hozzá pár csepp vizet, ezt követően 10–15 ml fluorsavat (3.4.), és párologtassuk el belőle a nedvességet kb. 150 °C-on. Ha valamennyi kovasav maradt a maradékanyagban, oldjuk fel újra pár milliliter fluorsavban (3.4.) és párologtassuk el belőle a nedvességet. Adjunk hozzá öt csepp kénsavat (3.5.) és melegítsük addig, amíg megszűnik a fehér füst képződése. Miután hozzáadtunk 5 ml 6 N sósavat (3.2.) és kb. 30 ml vizet, melegítsük meg és szűrjük le az oldatot egy 250 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel vízzel jelig (a HCl-koncentráció kb. 0,5 N). Folytassuk a meghatározást az 5.1.3 ponttól.

--------------------------------------------------