A Bizottság 2004/73/EK irányelve

(2004. április 29.)

a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonkilencedik hozzáigazításáról

(EGT vonatkozású szöveg)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1967. június 27-i 67/548/EGK tanácsi irányelvre [1] és különösen annak 28. cikkére,

mivel:

(1) A 67/548/EGK irányelv I. melléklete tartalmazza a veszélyes anyagok, valamint az egyes anyagok vonatkozásában az osztályozási és címkézési eljárások sajátosságainak felsorolását. E listát frissíteni kell az időközben bejelentett új, valamint további, már létező anyagok besorolása érdekében, továbbá hozzá kell igazítani a műszaki fejlődéshez, így például egyes anyagokra meg kell határozni a környezetvédelmi koncentrációhatárokat. Ennek megfelelően egyes anyagok tételeit törölni kell, más tételeket pedig fel kell osztani, mivel a besorolás már nem vonatkozik az adott tétel alatt felsorolt összes anyagra. Módosítani kell továbbá az 1,3-butadiént tartalmazó anyagok címkézését, hogy az tükrözze, hogy az irányelv ezen anyagot mutagénként is besorolja.

(2) A 67/548/EGK irányelv V. melléklete megállapítja az anyagok és készítmények fizikai-kémiai tulajdonságainak, valamint toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározására szolgáló módszereket. E mellékletet módosítani kell annak érdekében, hogy a kísérleti célokra felhasznált állatok számát a kísérleti és egyéb tudományos célokra felhasznált állatok védelmére vonatkozó tagállami törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1986. november 24-i 86/609/EGK tanácsi irányelvnek [2] megfelelően minimálisra lehessen csökkenteni. Ennek megfelelően a B.1., B.4., B.5., B.31. és B.35. fejezetben a szubkrónikus orális toxicitásra előírt módszereket felül kell vizsgálni. Ezenkívül az V. mellékletet ki kell egészíteni a B.42. fejezettel, hogy a szubkrónikus orális toxicitás vizsgálatára rendelkezésre álljon egy finomított módszer is. Végül ki kell még egészíteni az V. mellékletet a fizikai-kémiai tulajdonságokról szóló A.21. fejezettel, a szubkrónikus orális toxicitásról szóló B.43. fejezettel és a környezeti toxicitásról szóló C.21.–C.24. fejezettel, hogy ezáltal lehetővé váljon olyan tulajdonságok meghatározása is, amelyeket az V. mellékletben szereplő módszerek eddig nem fedtek le kielégítő mértékben.

(3) Ezen irányelv rendelkezései összhangban vannak a veszélyes anyagok és készítmények kereskedelme technikai akadályainak felszámolásáról szóló irányelveknek a műszaki fejlődéshez történő hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A 67/548/EGK tanácsi irányelv a következőképpen módosul:

1. Az I. melléklet a következőképpen módosul:

a) az előszóban szereplő K. megjegyzés helyébe az ezen irányelv 1.A. mellékletében szereplő szöveg lép;

b) az ezen irányelv 1.B. mellékletében szereplő tételeknek megfelelő tételek helyébe az említett mellékletben szereplő szöveg lép;

c) a melléklet a 67/548/EGK irányelv I. mellékletében felsorolt tételek sorrendjének megfelelően az ezen irányelv 1.C. mellékletében szereplő tételekkel egészül ki;

d) a 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 és 613-130-00-3 indexszámú tételeket el kell hagyni;

e) a 048-002-00-0 indexszámú tétel helyébe az ezen irányelv 1.D. mellékletében szereplő 048-002-00-0 és 048-011-00-X indexszámú tételek lépnek;

f) a 609-006-00-3 indexszámú tétel helyébe az ezen irányelv 1.D. mellékletében szereplő 609-006-00-3 és 609-065-00-5 indexszámú tételek lépnek;

g) a 612-039-00-6 indexszámú tétel helyébe az ezen irányelv 1.D. mellékletében szereplő 612-039-00-6 és 612-207-00-9 indexszámú tételek lépnek.

2. Az V. melléklet a következőképpen módosul:

a) az A.21. fejezet az ezen irányelv 2.A. mellékletében szereplő szöveggel egészül ki;

b) a B.1.a. fejezet helyébe az ezen irányelv 2.B. mellékletében szereplő szöveg lép;

c) a B.1.b. fejezet helyébe az ezen irányelv 2.C. mellékletében szereplő szöveg lép;

d) a B.4. fejezet helyébe az ezen irányelv 2.D. mellékletében szereplő szöveg lép;

e) a B.5. fejezet helyébe az ezen irányelv 2.E. mellékletében szereplő szöveg lép;

f) a B.31. fejezet helyébe az ezen irányelv 2.F. mellékletében szereplő szöveg lép;

g) a B.35. fejezet helyébe az ezen irányelv 2.G. mellékletében szereplő szöveg lép;

h) a melléklet B.42. és B.43. fejezetként az ezen irányelv 2.H. mellékletében szereplő szöveggel egészül ki;

i) a melléklet C.21.-C.24. fejezetként az ezen irányelv 2.I. mellékletében szereplő szöveggel egészül ki.

2. cikk

(1) A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek legkésőbb 2005. október 31-ig megfeleljenek. Haladéktalanul közlik a Bizottsággal e rendelkezések szövegét, valamint a Bizottság számára megküldik az említett rendelkezések és az irányelv közötti korrelációs táblázatot. Amikor a tagállamok elfogadják ezeket a rendelkezéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg.

(2) A tagállamok közlik a Bizottsággal nemzeti joguknak azokat a főbb rendelkezéseit, amelyeket az ezen irányelv által szabályozott területen fogadnak el.

3. cikk

Ez az irányelv az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

4. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 2004. április 29-én.

a Bizottság részéről

Margot Wallström

a Bizottság tagja

[1] HL 196., 1967.8.16., 1. o. A legutóbb a 2001/591/EK rendelettel (HL L 225., 2001.1.8., 1. o.) módosított irányelv.

[2] HL L 358., 1986.12.18., 1. o. A legutóbb a 2003/65/EK európai parlamenti és tanácsi irányelvvel (HL L 230., 2003.9.16., 32. o.) módosított irányelv.

--------------------------------------------------

1.A. MELLÉKLET

"K. megjegyzés:

A karcinogénként vagy mutagénként való osztályozást nem kell alkalmazni, ha kimutatható, hogy az anyag 0,1 tömegszázaléknál kevesebb 1,3-butadiént (EINECS-szám: 203-450-8) tartalmaz. Ha az anyag nincs karcinogénként vagy mutagénként osztályozva, úgy legalább a (2-)9-16 S-mondatokat kell alkalmazni. E megjegyzés az I. mellékletben szereplő bizonyos összetett kőolajszármazékokra vonatkozik."

--------------------------------------------------

2A. MELLÉKLET

A21. OXIDÁLÓ TULAJDONSÁGOK (FOLYADÉKOK)

1. MÓDSZER

1.1. BEVEZETÉS

Ezzel a vizsgálati módszerrel egy folyékony anyag azon képességét mérhetjük, hogy milyen mértékben képes egy éghető anyag égésének sebességét vagy intenzitását növelni, vagy olyan keveréket képezni egy éghető anyaggal, amely spontán öngyulladásra képes, ha a két anyagot alaposan összekeverik. A módszer az oxidáló folyadékok vizsgálatára szolgáló ENSZ-módszeren (1) alapul, illetve egyenértékű azzal. Mivel azonban az A21. módszer elsősorban arra szolgál, hogy kielégítse a 67/548 irányelv követelményeit, csak egyetlen referenciaanyaggal kell az összehasonlítást elvégezni. Más referenciaanyagok vizsgálatára és összehasonlítására akkor lehet szükség, ha a vizsgálatok eredményeit várhatóan más célokra használják fel [1].

Nem kell elvégezni ezt a vizsgálatot, ha a szerkezeti képlet alapján kétségkívül megállapítható, hogy az anyag nem képes exoterm reakcióba lépni egy éghető anyaggal.

Hasznos, ha a vizsgálat elvégzése előtt rendelkezünk előzetes információkkal az anyag potenciális robbanásveszélyességi tulajdonságairól.

Nem alkalmazható a vizsgálat szilárd anyagokra, gázokra, robbanásveszélyes vagy erősen tűzveszélyes anyagokra vagy szerves peroxidokra.

Előfordulhat, hogy nem kell elvégezni ezt a vizsgálatot, ha az oxidáló folyadékok vizsgálatára szolgáló ENSZ-módszerrel (1) már megvizsgálták az anyagot, és rendelkezésre állnak ennek eredményei.

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS EGYSÉGEK

"Átlagos nyomásemelkedési idő": az a mért átlagos idő, amely alatt a vizsgált keverék nyomása a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2070 kPa-ra emelkedik.

1.3. REFERENCIAANYAG

Referenciaanyagként 65 tömegszázalékos vizes salétromsav (analitikai minőségű) szükséges [2].

Adott esetben, ha a vizsgáló előre tudja, hogy a vizsgálat eredményeit végül más célokra használhatják [3], célszerű lehet további referenciaanyagokat is megvizsgálni [4].

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

A vizsgálandó folyadékot 1:1 tömegarányban összekeverjük rostos cellulózzal és nyomástartó edénybe tesszük. Ha a keverés vagy betöltés során spontán öngyulladás lép fel, nincs szükség további vizsgálatra.

Ha nem lép fel spontán öngyulladás, az egész vizsgálatot el kell végezni. A keveréket a nyomástartó edényben hevíteni kell, majd meg kell mérni, hogy átlagosan mennyi idő szükséges ahhoz, hogy a nyomás a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2070 kPa-ra emelkedjen. Ezt kell azután összehasonlítani a referenciaanyag(ok) és cellulóz 1:1 arányú keverékével kapott átlagos nyomásemelkedési idővel.

1.5. MINŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK

Egyetlen anyagon elvégzett öt kísérletben egyik eredmény sem térhet el 30 %-nál nagyobb mértékben a számtani átlagtól. Az átlaghoz képest 30 %-nál nagyobb eltérést mutató eredményeket el kell vetni, tökéletesíteni kell a keverési és betöltési eljárást, majd meg kell ismételni a vizsgálatot.

1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA

1.6.1. Előkészítés

1.6.1.1. Az éghető anyag

Éghető anyagként 50–250 μm szálhosszúságú és 25 μm [5] átlagos szálátmérőjű száraz, rostos cellulózt kell használni. Maximum 25 mm vastag rétegben, 105 °C-on, 4 órán át, tömegállandóságig kell szárítani, majd lehűlésig, illetve felhasználásig nedvszívó anyag jelenlétében a szárítóberendezésben kell tartani. A száraz cellulóz víztartalmának a száraz tömeg 0,5 %-a alatt kell lennie [6]. Ennek eléréséhez szükség esetén hosszabb szárítási időt kell alkalmazni [7]. A vizsgálat során ugyanazt a tétel cellulózt kell használni.

1.6.1.2. A berendezés

1.6.1.2.1. A nyomástartó edény

Szükség van egy nyomástartó edényre. Az edény henger alakú, acél nyomástartó edény, amelynek hossza 89 mm, külső átmérője pedig 60 mm (lásd az 1. ábrát). A két ellentétes oldalon sík felület van kialakítva (itt az edény keresztmetszeti mérete 50 mm-re csökken), amely megkönnyíti a kezelést, amikor becsavarják a gyújtódugót és a szellőződugót. Az edényen átmenő 20 mm átmérőjű furatot az egyik végén 19 mm mélységben kibővítik, és abba 1"-os csőmenetet (British Standard Pipe = BSP) vagy azzal egyenértékű metrikus menetet vágnak. A nyomáselvezető, amely egy oldalág, a nyomástartó edény ívelt falába van becsavarozva, 35 mm-re az edény egyik végétől, és 90o-os szögben a megmunkált sík felülethez képest. Az erre a célra szolgáló menetes furat 12 mm mély, és ½"-os csőmenettel (vagy ezzel egyenértékű metrikus menettel) van ellátva az oldalág végén levő menetnek megfelelően. Ha szükséges, a gáztömörség érdekében egy inert tömítés is beilleszthető. A 6 mm átmérőjű átmenő furattal ellátott oldalág 55 mm-re nyúlik ki a nyomástartó edényből. Az oldalág végén a furat fel van bővítve, és csavarmenettel van ellátva membrános nyomásátalakító számára. Bármilyen nyomásmérő eszköz alkalmazható, feltéve, hogy ellenáll a forró gázoknak vagy bomlástermékeknek, és legfeljebb 5 ms alatt képes 690–2070 kPa nyomásemelkedést érzékelni.

A nyomástartó edénynek az oldalágtól távolabbi vége gyújtódugóval van lezárva, amelyben két elektróda van, amelyek közül az egyik szigetelve van a dugó testétől, a másik pedig azzal elektromosan érintkezik. A nyomástartó edény másik vége egy hasadótárcsával van lezárva (hasadó nyomása körülbelül 2200 kPa), amelyet egy 20 mm-es furattal ellátott rögzítődugó tart a helyén. Szükség esetén a gáztömörség biztosítására a gyújtódugóhoz inert tömítés alkalmazható. A használat során a szerelvényt egy állványzat (2. ábra) tartja megfelelő helyzetben. Ez általában egy 235 mm × 184 mm × 6 mm méretű lágyacél alaplapból és egy 185 mm hosszúságú 70 mm × 70 mm × 4 mm-es zárt szelvényből áll.

A zárt szelvény egyik végén a két szemben levő oldalból egy-egy szakaszt kivágnak úgy, hogy két lapos lábrész jöjjön létre, amely felett 86 mm hosszúságban megmarad az érintetlen zárt szelvény. Ezeknek a lapos részeknek a végét a zárt szelvény hossztengelyéhez képest 60o-os szögben levágják és az alaplaphoz hegesztik. A zárt szelvény felső végén az egyik oldalba 22 mm széles és 46 mm mély hornyot vágnak úgy, hogy ha a nyomástartó edény szerelvényt a gyújtódugóval lefelé a zárt szelvénybe belehelyezik, az oldalág a horonyba illeszkedik. Távtartóként 30 mm széles és 6 mm vastag acéldarabot hegesztenek a zárt szakasz alul levő belső felületére. Két ellentétes oldalon egy-egy 7 mm-es füles csavar rögzíti a nyomástartó edényt a helyén. Egy-egy 12 mm széles és 6 mm vastag acélszalag van hozzáhegesztve a két lapos lábhoz a zárt szakasz alsó végénél, amely a nyomástartó edényt alulról támasztja meg.

1.6.1.2.2. A gyújtórendszer

A gyújtórendszer 25 cm hosszú, 0,6 mm átmérőjű és 3,85 ohm/m ellenállású Ni/Cr huzalból áll. A huzalt egy 5 mm átmérőjű rúd segítségével tekercs alakúra kell csavarni, és a gyújtódugóban lévő elektródákhoz kell kapcsolni. A tekercset a 3. ábrán bemutatottak valamelyikének megfelelően kell kialakítani. Az edény alja és a gyújtótekercs alja közötti távolságnak 20 mm-nek kell lennie. Ha az elektródák nem állíthatók, a gyújtóhuzalnak a tekercs és az edény alja közötti végeit kerámiaköpennyel kell szigetelni. A huzalt egy legalább 10 A-t szolgáltató állandó áramú tápegységgel kell fűteni.

1.6.2. A vizsgálat elvégzése [8]

A nyomásátalakító és a fűtőrendszer felszerelése után, de még a hasadótárcsa behelyezése előtt, a berendezést úgy kell tartani, hogy a gyújtódugó alul legyen. Egy üveg főzőpohárban egy keverőbot segítségével a vizsgálandó folyadékból 2,5 g-ot össze kell összekeverni 2,5 g száraz cellulózzal [9]. Biztonsági okokból a keverést úgy kell végezni, hogy a vizsgálatot végző személy és a keverék között legyen egy biztonsági védőlemez. Ha a keverék a keverés vagy betöltés során meggyullad, nincs szükség további vizsgálatokra. A keveréket kisebb adagokban és ütögetve a nyomástartó edénybe kell tölteni, vigyázva arra, hogy a keverék a gyújtótekercs körül gyűljön össze és megfelelően érintkezzen azzal. Fontos, hogy a betöltés során a tekercs ne torzuljon, mivel ez hibás eredményekhez vezethet [10]. Ezt követően be kell tenni a hasadótárcsát a helyére, majd szorosan be kell csavarozni a tartódugót. A megtöltött edényt a hasadótárcsával felfelé a robbantó állványra kell helyezni, amelyet egy megfelelő, fémborítású füstkamrában vagy robbantókamrában kell elhelyezni. Az áramforrást a gyújtódugó külső csatlakozóihoz kell kapcsolni, és 10 A áramot kell rákapcsolni. A keverés megkezdése és az áram bekapcsolása között nem telhet el 10 percnél hosszabb idő.

A nyomásátalakító által létrehozott jelet megfelelő rendszerrel rögzíteni kell, amely lehetővé teszi mind az eredmény kiértékelését, mind pedig a nyomás változásának folyamatos rögzítését az idő függvényében (pl. egy szalagos íróműszerhez kapcsolt tranziens íróműszer). A keveréket addig kell hevíteni, amíg a hasadótárcsa el nem törik, vagy legalább 60 másodpercig. Ha a hasadótárcsa nem törik el, meg kell várni, amíg a keverék lehűl, majd a megfelelő óvintézkedések betartásával, az esetleges nyomásnövekedésre számítva, óvatosan szét kell szerelni a berendezést. A vizsgálandó anyaggal és a referenciaanyaggal vagy referenciaanyagokkal is öt kísérletet kell végezni. Fel kell jegyezni azt az időt, amely alatt a nyomás a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2070 kPa-ra emelkedik. Ki kell számítani az átlagos nyomásemelkedési időt.

Bizonyos esetekben az anyagok olyan (vagy túl magas vagy túl alacsony) nyomásemelkedést idézhetnek elő, amelyet nem az anyag oxidáló tulajdonságait jellemző kémiai reakciók okoznak. Ilyen esetekben szükség lehet arra, hogy a vizsgálatot cellulóz helyett egy inert anyaggal, pl. kovafölddel megismételjük, és így tisztázzuk a reakció jellegét.

2. ADATOK

Nyomásemelkedési idő mind a vizsgálandó anyag, mind a referenciaanyag(ok) esetében.

Nyomásemelkedési idő az inert anyaggal végzett vizsgálat esetén, ha ilyen is történt.

2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE

Mind a vizsgálandó anyag, mind a referenciaanyag(ok) esetében ki kell számítani az átlagos nyomásemelkedési időt.

Ki kell számítani az átlagos nyomásemelkedési időt az inert anyaggal végzett vizsgálat esetén (ha ilyen is történt).

Az 1. táblázatban a kapott eredményekre láthatunk példát.

1. táblázat

Példák az eredményekre [14]

Anyag [13] | Átlagos nyomásemelkedési idő cellulózzal készített 1:1 arányú keverékben (ms) |

Ammónium-dikromát, telített vizes oldat | 20800 |

Kalcium-nitrát, telített vizes oldat | 6700 |

Vas(III)-nitrát, telített vizes oldat | 4133 |

Lítium-perklorát, telített vizes oldat | 1686 |

Magnézium-perklorát, telített vizes oldat | 777 |

Nikkel-nitrát, telített vizes oldat | 6250 |

Salétromsav, 65 % | 4767 [11] |

Perklórsav, 50 % | 121 [11] |

Perklórsav, 55 % | 59 |

Kálium-nitrát, 30 %-os vizes oldat | 26690 |

Ezüst-nitrát, telített vizes oldat | – [12] |

Nátrium-klorát, 40 %-os vizes oldat | 2555 [11] |

Nátrium-nitrát, 45 %-os vizes oldat | 4133 |

Inert anyag | |

Víz: cellulóz | – [12] |

3. JELENTÉS

3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS

A vizsgálati jelentésnek a következő információkat kell tartalmaznia:

- a vizsgált anyag neve, összetétele, tisztasága stb.,

- a vizsgált anyag koncentrációja,

- a cellulóz szárítására alkalmazott módszer,

- az alkalmazott cellulóz víztartalma,

- a mérések eredményei,

- az inert anyaggal kapott vizsgálatok eredményei, ha történt ilyen,

- a számított átlagos nyomásemelkedési idők,

- az ettől a módszertől való bármely eltérés és annak okai,

- az eredmények értékelése szempontjából lényeges összes egyéb információ.

3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE [15]

A vizsgálatok eredményeit a következők alapján kell értelmezni:

a) a vizsgált anyagból és cellulózból készített keverékben fellép-e spontán öngyulladás; és

b) a nyomásnak a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2070 kPa-ra való emelkedéséhez szükséges átlagos idő összehasonlítása a referenciaanyag(ok) esetén mért értékekkel.

Oxidáló hatásúnak kell tekinteni egy folyékony anyagot, ha:

a) cellulózzal alkotott 1:1 tömegarányú keverékében spontán öngyulladás lép fel; vagy

b) cellulózzal alkotott 1:1 tömegarányú keverékében a átlagos nyomásemelkedési idő kisebb vagy egyenlő a 65 tömegszázalékos vizes salétromsav és cellulóz 1:1 tömegarányú keverékében mérttel.

A téves pozitív eredmények elkerülése érdekében az eredmények értelmezésekor szükség esetén figyelembe kell venni a folyadék inert anyaggal történő vizsgálatakor kapott eredményeket is.

4. HIVATKOZÁSOK

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

+++++ TIFF +++++

A nyomástartó edény

(A) A nyomástartó edény háza

(B) A hasadótárcsát tartó dugó

(C) (Gyújtódugó

(D) Lágyólom alátétlemez

(E) Hasadótárcsa

(F) Oldalág

(G) Nyomásátalakító fej

(H) Alátétlemez

(J) Szigetelt elektróda

(K) Földelt elektróda

(L) Szigetelés

(M) Acélkúp

(N) Horony a tömítőgyűrű részére

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

(A) Gyújtótekercs

(B) Szigetelés

(C) Elektródák

(D) Gyújtódugó

Megjegyzés:

a fenti elrendezések bármelyike alkalmazható.

[1] Ahogyan például az ENSZ szállítási rendeleteinek keretében.

[2] A savat a vizsgálat előtt titrálni kell annak érdekében, hogy ellenőrizzük a koncentrációját.

[3] Ahogyan például az ENSZ szállítási rendeleteinek keretében.

[4] Pl. 50 w/w %-os perklórsav és 40 w/w %-os nátrium-klorát kerül használatra az (1) hivatkozásban.

[5] Pl. Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalógusszám: 4021 050.

[6] (Pl.) Karl-Fisher titrálással ellenőrizve.

[7] Ez a víztartalom szintén elérhető (pl.) 24 órás 105 °C-on vákuum alatt történő melegítéssel.

[8] Az oxidálószerek cellulózzal készített keverékeit potenciálisan robbanásveszélyesnek kell tekinteni, és ennek megfelelő óvatossággal kell kezelni.

[9] A gyakorlatban ez úgy érhető el, hogy a vizsgálandó folyadékból és a cellulózból a kísérlethez szükségesnél nagyobb mennyiségben készítjük el az 1:1 arányú keveréket, majd 5 ± 0,1 g-ot teszünk belőle a nyomástartó edénybe. A keveréket minden egyes kísérlethez frissen kell elkészíteni.

[10] Különösen kerülni kell, hogy a tekercs egymással szomszédos menetei egymáshoz érjenek.

[11] Laboratóriumok közötti összehasonlító vizsgálatokból kapott átlagérték.

[12] Nem érte el a 2070 kPa-os maximális nyomást.

[13] A telített oldatokat 20 °C-on kell elkészíteni.

[14] Az ENSZ szállítási rendszer szerinti osztályozást lásd az (1) hivatkozásban.

[15] Az ENSZ szállítási rendeletek szerinti, több referenciaanyaggal mért eredmények értelmezéséhez lásd az (1) hivatkozást.

--------------------------------------------------

2B. MELLÉKLET

B1a. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – RÖGZÍTETT DÓZISÚ ELJÁRÁS

1. MÓDSZER

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD TG 420 (2001) módszerrel.

1.1. BEVEZETÉS

Az akut toxicitás megállapítására szolgáló hagyományos módszerek esetében a vizsgálat végpontját az állatok elpusztulása jelenti. A Brit Toxikológiai Társaság 1984-ben új megközelítést javasolt az akut toxicitás vizsgálatára, amely egy sor rögzített nagyságú dózis beadásán alapul (1). Ennél a megközelítésnél nem az állatok elpusztulása jelenti a vizsgálat végpontját, hanem a rögzített nagyságú dózisok valamelyikénél megfigyelt egyértelmű mérgezési tünetekre támaszkodtak. Az Egyesült Királyságban (2) és nemzetközileg (3) végzett in vivo validálási vizsgálatok után az eljárást 1992-ben hagyták jóvá mint vizsgálati módszert. Ezt követően egy vizsgálati sorozat (4)(5)(6) keretében matematikai modellek segítségével megvizsgálták a rögzített dózisú eljárás statisztikai tulajdonságait. Az in vivo és a modell vizsgálatok együttesen igazolták, hogy az eljárás reprodukálható, kevesebb kísérleti állatra van szükség hozzá, és kevesebb szenvedést okoz, mint a hagyományos módszerek, továbbá hasonló módon képes minősíteni az anyagokat, mint az egyéb akut toxicitási vizsgálati módszerek.

Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelelőbb vizsgálati módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (7) található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz az 1Ba. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezésével kapcsolatosan.

A módszer egyik alapelve, hogy a fő vizsgálatban csak közepesen toxikus dózisokat alkalmaznak, és hogy kerülni kell az olyan dózisok alkalmazását, amelyek várhatóan letálisak. Nincs szükség továbbá olyan dózisok alkalmazására sem, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullás közelében lévő állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni őket a vizsgálati eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (8) találhatók.

A módszer adatokat szolgáltat az anyag veszélyes tulajdonságairól és lehetővé teszi, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok besorolására szolgáló Globálisan harmonizált rendszer (Globally Harmonised System, GHS) szerint minősítsék és sorolják be (9).

A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei; szerkezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai és az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyőződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elősegíti majd a megfelelő kezdődózis kiválasztását.

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

"Akut orális toxicitás": a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán belül többszöri dózisának szájon át történő beadását követően jelentkező káros hatások.

"Késleltetett elhullás": egy állat 48 órán belül nem hull el, illetve nem tűnik elhullásközeli állapotban lévőnek, de később, a 14 napos megfigyelési időszak során elpusztul.

"Dózis": a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (pl. mg/kg) fejezik ki.

"Nyilvánvaló toxicitás": a vizsgálandó anyag beadását követően jól látható mérgezési tüneteket leíró általános kifejezés [a példákat lásd a (3) hivatkozásban], amelynél a következő legmagasabb rögzített dózis esetében a legtöbb állatnál súlyos fájdalom vagy súlyos szorongás tartós jelei, elhullásközeli állapot [az ezzel kapcsolatos kritériumok a Humane Endpoints Guidance Documentben (8) szerepelnek], vagy valószínű elhullás várható.

"GHS": Globálisan harmonizált osztályozási rendszer vegyi anyagokhoz és keverékekhez. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakértői Bizottsága (fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek közötti program a vegyi anyagok helyes kezelésére (Interorganisation Programme of the Sound Management of Chemicals, IOMC) koordinál.

"Közeli elhullás": amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés időpontja előtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekvőhelyzet és a remegés. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)].

"LD50": (közepes letális dózis): a vizsgálandó anyag statisztikailag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD50-értéket a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.

"Határdózis": egy, a vizsgálhatóság felső határánál lévő dózis (2000 vagy 5000 mg/kg).

"Elhullásközeli állapot": az esetleges kezelés ellenére is az elhullás közelében lévő állapot vagy túlélésre való képtelenség. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)].

"Megjósolható elhullás": a kísérlet tervezett vége előtt, a jövőben egy ismert időpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. [A további részleteket lásd Humane Endpoints Guidance Documentben (8)].

1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

Azonos ivarba tartozó állatok csoportjainak egy lépcsőzetes eljárás során 5, 50, 300 és 2000 mg/kg-os rögzített dózisok alkalmazásával kell beadni a vizsgálandó anyagot (kivételes esetben egy további, 5000 mg/kg-os rögzített dózis is alkalmazható; lásd az 1.6.2 szakaszt). A kiindulási dózist a dózisbehatároló vizsgálat alapján kell megválasztani úgy, hogy az várhatóan mérgezési tüneteket eredményezzen, de ne okozzon súlyos mérgezést vagy elhullást. A fájdalomhoz, szenvedéshez és közeli elhulláshoz társuló klinikai tüneteket és állapotot részletesen egy külön OECD Útmutató (8) ismerteti. A mérgezési tünetek megjelenésétől vagy az elhullás bekövetkeztétől vagy ezek elmaradásától függően további állatcsoportok is kezelhetők magasabb vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az eljárást folytatni kell, amíg meg nem találják azt a dózist, amely nyilvánvaló toxicitást vagy legfeljebb egy elhullást okoz, vagy ha a legmagasabb dózisnál nem figyelnek meg semmilyen hatást, vagy ha a legalacsonyabb dózisnál elhullanak állatok.

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE

1.4.1. Az állatfaj kiválasztása

A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általában nőstényeket használnak (7). Ennek az az oka, hogy a hagyományos LD50-vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekintése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhető különbség, a nőstények általában valamivel érzékenyebbek (10). Azonban ha a szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzékenysége valószínűsíthető, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfelelően meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik.

Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ± 20 %-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától.

1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei

A kísérleti állatokat 22 °C (± 3 °C) hőmérsékletű helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az egy ketrecben lévő állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az ne zavarja az egyes állatok megfigyelését.

1.4.3. Az állatok előkészítése

Az állatokat véletlenszerűen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani őket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez.

1.4.4. A dózisok előkészítése

A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Azonban ha folyékony végterméket vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követő kockázatértékelés szempontjából megfelelőbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítatlanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes szabályozó hatóságok ezt írják elő. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretétől függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömeg-arányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömeg-arány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázásakor – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmadsorban esetlegesen más vivőanyagokban elkészített oldatok. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás előtt rövid idővel kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabilitása az alkalmazás időtartama alatt.

1.5. ELJÁRÁS

1.5.1. A dózisok beadása

A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy megfelelő intubációs kanülön át történő táplálással kell beadni. Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkalmazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó időtartam alatt kisebb részletekben is beadható.

A kezelés előtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A koplaltatási időszakot követően meg kell mérni az állatok testtömegét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni – patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás időtartamától függően menet közben szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak.

1.5.2. Dózisbehatároló vizsgálat

A dózisbehatároló vizsgálat célja, hogy ki lehessen választani a megfelelő kezdődózist a fő vizsgálathoz. A vizsgálandó anyagot az 1. mellékletben bemutatott folyamatábra szerint egymás után kell beadni egy-egy állatnak. A dózisbehatároló vizsgálat akkor fejeződik be, amikor meghozható a döntés a fő vizsgálatban alkalmazandó kezdődózisról (vagy ha a legalacsonyabb rögzített dózisnál elhullás történik).

A dózisbehatároló vizsgálatban a kezdődózist a következő rögzített dózisok közül választják ki: 5, 50, 300 és 2000 mg/kg aszerint, hogy a lehetőleg ugyanezzel az anyaggal vagy szerkezetileg rokon anyagokkal kapott in vivo vagy in vitro adatok alapján várhatóan melyik eredményez nyilvánvaló toxicitást. Ilyen információk hiányában a kezdődózist 300 mg/kg-ban kell megállapítani.

Az egyes állatok kezelése között legalább 24 órának el kell telnie. Minden állatot legalább 14 napig megfigyelés alatt kell tartani.

Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét jogszabályi követelmény indokolja, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 5000 mg/kg-os felső rögzített dózis alkalmazását (lásd a 3. mellékletet). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2000–5000 mg/kg tartomány) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószínűsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelenőséggel bírnak az emberi vagy állati egészség, illetve a környezet védelme szempontjából.

Olyan esetekben, amikor a dózisbehatároló vizsgálatban a legalacsonyabb rögzített dózissal (5 mg/kg) kezelt állat elhullik, az általános eljárás szerint be kell fejezni a vizsgálatot és az anyagot a GHS 1. kategóriába kell besorolni (ahogyan az az 1. mellékletben látható). Ha azonban szükség van a besorolás további megerősítésére, az alábbiak szerinti opcionális kiegészítő eljárás alkalmazható. Egy második állatnak is beadjuk az 5 mg/kg-os dózist. Ha ez is elhullik, akkor az megerősíti a GHS 1. kategóriába való besorolást, és a vizsgálatot azonnal be kell fejezni. Ha a második állat életben marad, akkor legfeljebb három további állaton kell elvégezni az 5 mg/kg-os dózissal történő vizsgálatot. Mivel nagy az elhullás kockázata, az állatok kímélete érdekében egymás után kell őket kezelni. Az egyes állatok kezelése között eltelt időt úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen annak megállapítására, hogy az előzőleg kezelt állat valószínűleg életben marad. Ha egy második állat is elhullik, azonnal be kell fejezni a kezeléseket, és több állatnak már nem szabad beadni az anyagot. Mivel a második elhullás bekövetkezte miatt (függetlenül attól, hogy a vizsgálatok befejezéséig hány állatot kezeltek) az "A" eredményhez jutnak (legalább 2 elhulláseset), a 2. melléklet 5 mg/kg-os rögzített dózisánál érvényes besorolási szabályt kell követni (ha legalább 2 elhullás történt, akkor 1. kategória, ha legfeljebb 1 elhullás történt, akkor 2. kategória). A 4. mellékletben pedig azzal kapcsolatos útmutatást tartalmaz, hogy az új GHS bevezetéséig az anyagokat hogyan kell az EU-rendszer szerinti kategóriákba besorolni.

1.5.3. Fő vizsgálat

1.5.3.1. Az állatok száma és a dózisok

A kezdődózissal történő vizsgálat utáni teendőket a 2. mellékletben található folyamatábra mutatja. Három lehetséges alternatíva létezik: vagy le kell állítani a vizsgálatot, és be kell sorolni az anyagot a megfelelő veszélyességi kategóriába, vagy magasabb rögzített dózissal kell folytatni a vizsgálatot, vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az állatok védelme érdekében azonban a fő vizsgálatban már nem szabad olyan dózissal kísérletezni, amely a dózisbehatároló vizsgálatban elhullást okozott (lásd a 2. mellékletet). A tapasztalatok azt mutatják, hogy a kezdődózissal végzett vizsgálatok legvalószínűbb eredménye, hogy az anyagot be lehet valamilyen kategóriába sorolni és nincs szükség további vizsgálatokra.

Általában összesen öt-öt, azonos ivarú állatnak kell beadni az egyes vizsgált dózisokat. Ebből az öt állatból egyet a dózisbehatároló vizsgálat során kezelnek az adott dózissal, és ehhez járul a további négy állat (kivéve abban a szokatlan esetben, ha a fő vizsgálatban használt dózist nem alkalmazták a dózisbehatároló vizsgálatban).

Az egyes dózisok vizsgálata közötti időtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének időpontja, időtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következő dózissal történő kezelését nem szabad megkezdeni mindaddig, amíg meg nem bizonyosodtak arról, hogy az előzőleg kezelt állatok életben maradnak. Szükség esetén ajánlott ez egyes dózisokkal való kezelések között 3 vagy 4 napos szünetet tartani, hogy meg lehessen figyelni a késleltetett toxicitást. Ennek időtartama szükség esetén – pl. nem meggyőző válasz esetében – módosítható.

Ha egy felső, 5000 mg/kg-os dózis alkalmazást is tervbe vesznek, a 3. mellékletben vázolt eljárást kell követni (lásd még az 1.6.2 szakaszt).

1.53.2. Határérték-vizsgálat

Határérték-vizsgálatot elsősorban olyan helyzetekben kell végezni, ha a kísérletet végzőnek olyan információi vannak, amelyek szerint a vizsgálandó anyag valószínűleg nem toxikus, azaz csak a hatósági határérték-dózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhető információ, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a fő vizsgálatot kell elvégezni.

Ezen iránymutatás céljára határérték-vizsgálatként a normál eljárás alkalmazásával történő, 2000 mg/kg-os (vagy kivételes esetben 5000 mg/kg-os) kezdődózissal végzett dózisbehatároló vizsgálat, majd ezt követően további négy állat ugyanezzel a dózissal történő kezelése szolgál.

1.6. MEGFIGYELÉSEK

Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, legalább az első 30 percben, azután az első 24 órában rendszeres időközönként, amelynek során különös figyelemmel kell őket kísérni az első 4 órában, majd ezt követően naponta, összesen 14 napon át, kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálatból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés időtartamát azonban nem szabad mereven meghatározni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és időtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megszűnésének időpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek inkább késleltetve jelentkeznek (11). Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében önálló adatsort vesznek fel.

Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szükség. Meg kell figyelni a bőr és a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma előfordulására is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alapelveket és követelményeket is figyelembe kell venni (8). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lévő állatokat, illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját is.

1.6.1. Testtömeg

Röviddel a vizsgálandó anyag beadása előtt és legalább egy héttel utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtömeg-változást ki kell számítani és fel kell jegyezni. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus módon exterminálni kell őket.

1.6.2. Kórbonctani vizsgálat

Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni (azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden állat esetében az összes makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegyezni. A kezdődózis beadása után legalább 24 óráig túlélő állatok esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos információk nyerhetők.

2. ADATOK

Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy minden vizsgálati csoportra vonatkozóan mutassa a csoportban lévő kísérleti állatok számát, valamint azoknak a számát, amelyeknél mérgezési tünetek láthatók, amelyek a vizsgálat során elhullottak vagy humánus módon exterminálásra kerültek, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.

3. JELENTÉS

3.1 VIZSGÁLATI JELENTÉS

A vizsgálati jelentésnek megfelelő módon a következő információkat kell tartalmaznia:

Vizsgálandó anyag:

- fizikai megjelenés, tisztaság és ha releváns, a fizikai-kémiai tulajdonságok (ezen belül az izomerizáció is),

- azonosító adatok, ezen belül a CAS-szám.

Vivőanyag (szükség esetén):

- ha a vivőanyag nem víz, akkor ennek indoklása.

Kísérleti állatok:

- az alkalmazott faj/törzs,

- az állatok mikrobiológiai státusza, feltéve, hogy ismert,

- az állatok száma, életkora és ivara (ezen belül adott esetben annak oka, hogy nőstények helyett miért hímeket alkalmaztak),

- az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.

Kísérleti körülmények:

- a vizsgálandó anyag formulázására vonatkozó információk, ezen belül a beadott anyag fizikai formájával kapcsolatos adatok,

- a vizsgálandó anyag beadására vonatkozó információk, ezen belül a beadott térfogat és a beadás időpontja,

- a táplálék és a víz minősége (ezen belül a takarmány típusa/forrása, a víz forrása),

- a kezdődózis kiválasztásának indoklása.

Eredmények:

- a válaszadatok és a dózisok táblázatos formában történő megadása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és elhullt állatokra; a hatások jellege, súlyossága és időtartama),

- a testtömeg-adatok és a testtömeg-változások táblázatos formában történő megadása,

- az egyes állatok testtömege a dózis beadásának napján, azt követően hetente, valamint az elhullás vagy exterminálás időpontjában,

- a tervezett exterminálás előtti elhullás napja és ideje,

- a mérgezési tünetek megjelenése és időbeli lefolyása, valamint esetleges visszafordíthatósága minden egyes állatra vonatkozóan,

– a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.

Az eredmények diszkussziója és értelmezése.Következtetések.

4. HIVATKOZÁSOK

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

--------------------------------------------------

2C. MELLÉKLET

"B1c. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY MÓDSZER

1. MÓDSZER

Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD TG 423 (2001) módszerrel.

1.1. BEVEZETÉS

Az itt ismertetett akut toxikus osztály módszer (1) egy lépcsőzetes eljárás, amelyben lépésenként három azonos ivarú állatot használnak. Az elhullási aránytól és/vagy az állatok elhullásközeli állapotától függően átlagosan 2–4 lépésre lehet szükség a vizsgálandó anyag akut toxicitásának megítéléséhez. Az eljárás reprodukálható, nagyon kevés állatot kell használni hozzá, és hasonló módon lehet vele minősíteni az anyagokat, mint a többi akut toxicitás vizsgálati módszerrel. Az akut toxikus osztály módszer rögzített dózisokkal végzett biometriai vizsgálatokon (2)(3)(4)(5) alapul, amelyek megfelelően el vannak választva egymástól, hogy lehetővé tegyék az anyag besorolási és veszélyfelmérési célokra történő minősítését. Az 1996-ban jóváhagyott módszert széles körben validálták a szakirodalomból vett in vivo LD50-adatokkal szemben mind nemzeti (6), mind pedig nemzetközi (8) szinten.

Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelelőbb vizsgálati módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (8) található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz az 1Bc. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezésével kapcsolatosan.

Nincs szükség a vizsgálandó anyagok olyan dózisokban történő alkalmazására, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullásközeli állapotban lévő állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni őket az eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segítő iránymutatás, valamint az elhullás közelében lévő vagy súlyosan szenvedő állatok exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (9) találhatók.

A módszer előre meghatározott dózisok alkalmazásán alapul, és a kapott eredmények lehetővé teszik, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok besorolására szolgáló Globálisan harmonizált rendszer (GHS) szerint minősítsük és soroljuk be (10).

A módszer elvben nem alkalmas az LD50 pontos kiszámítására, de lehetővé teszi azoknak az expozíciós tartományoknak a meghatározását, amelyeknél letalitás várható, mivel a fő végpont ebben a vizsgálatban is az állatok egy részének elhullása. Ez a módszer csak akkor teszi lehetővé az LD50-érték meghatározását, ha legalább két dózis 0 %-nál magasabb, de 100 %-nál alacsonyabb elhullási arányt eredményez. A vizsgálandó anyagtól függetlenül az előre meghatározott dózisok alkalmazása és a kifejezetten a különféle állapotokban megfigyelt állatok számához kötődő besorolás növeli a laboratóriumok által készített jelentések egységességét és a vizsgálatok ismételhetőségét.

A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálat eredményei; szerkezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai; valamint az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyőződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elősegíti majd a legmegfelelőbb kezdődózis kiválasztását.

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

"Akut orális toxicitás": a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán belül többszöri dózisának szájon át történő beadását követően jelentkező káros hatások.

"Késleltetett elhullás": egy állat 48 órán belül nem hull el vagy nem tűnik elhullásközeli állapotban lévőnek, de később, a 14 napos megfigyelési időszak során elpusztul.

"Dózis": a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.

"GHS": Globálisan harmonizált osztályozási rendszer vegyi anyagokhoz és keverékekhez. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakértői Bizottsága (fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek Közötti Program a Vegyi Anyagok Helyes Kezelésére (IOMC) koordinál.

"Közeli elhullás": amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés időpontja előtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekvőhelyzet és a remegés. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)].

"LD50 (közepes letális orális dózis)": a vizsgálandó anyag statisztikailag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD50-értéket a vizsgálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömeg-egységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.

"Határdózis": egy, a vizsgálhatóság felső határánál lévő dózis (2000 vagy 5000 mg/kg).

"Elhullásközeli állapot": az esetleges kezelés ellenére is elhullás közelében lévő állapot vagy túlélésre való képtelenség. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)].

"Megjósolható elhullás": a kísérlet tervezett vége előtt, a jövőben egy ismert időpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. [A további részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)].

1.3. A VIZSGÁLAT ELVE

A vizsgálat alapelve, hogy a lépésenként minimális számú állatot alkalmazó lépcsőzetes eljárás alapján elegendő információ nyerhető a vizsgálandó anyag akut toxicitásáról ahhoz, hogy be lehessen azt sorolni. Az anyagot szájon át és a meghatározott dózisok egyikét alkalmazva adják be a kísérleti állatok egy csoportjának. Az anyagot lépcsőzetes eljárással vizsgálják, ahol minden lépésben három azonos ivarú (általában nőstény) állatot használnak. A kezelt állatokban az anyaggal összefüggő elhullás vagy annak hiánya határozza meg a következő lépést, azaz:

- nincs szükség további vizsgálatra,

- további három állat vizsgálata történik ugyanazzal a dózissal,

- további három állat vizsgálata történik a következő nagyobb vagy kisebb dózissal.

A vizsgálati eljárás további részletei az 1. mellékletben találhatók. A módszer alkalmazásával döntést lehet hozni arról, hogy a vizsgálandó anyag a rögzített LD50-határértékek segítségével megállapított toxicitási osztályok melyikébe sorolható be.

1.4. A MÓDSZER ISMERTETÉSE

1.4.1. Az állatfaj kiválasztása

A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általában nőstényeket használnak (9). Ennek az az oka, hogy a hagyományos LD50-vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekintése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhető különbség, a nőstények általában valamivel érzékenyebbek (11). Azonban ha a szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzékenysége valószínűsíthető, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfelelően meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik.

Általánosan használt laboratóriumi törzsekből származó egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell alkalmazni. Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ± 20 %-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától.

1.4.2. Az állatok tartásának és etetésének körülményei

A kísérleti állatokat 22 °C (± 3 °C) hőmérsékletű helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az egy ketrecben lévő állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az ne zavarja az egyes állatok megfigyelését.

1.4.3. Az állatok előkészítése

Az állatokat véletlenszerűen kell kiválasztani, majd egyedi azonosítóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése előtt legalább 5 napig a ketrecükben kell tartani őket, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez.

1.4.4. A dózisok előkészítése

A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Ha azonban egy folyékony végterméket vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követő kockázatértékelés szempontjából megfelelőbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítatlanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes hatóságok ezt írják elő. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretétől függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömeg-arányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömeg-arány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázása tekintetében – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmadsorban esetlegesen más vivőanyagokban elkészített oldatok. A víztől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a vivőanyag toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás előtt rövid idővel kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabilitása az alatt az alkalmazás időtartama alatt.

1.5. ELJÁRÁS

1.5.1. A dózisok beadása

A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy megfelelő intubációs kanülön át történő táplálással kell beadni. Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkalmazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó időtartam alatt kisebb részletekben is beadható.

A kezelés előtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A koplaltatási időszakot követően meg kell mérni az állatok testtömegét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni – patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás időtartamától függően menet közben szükség lehet arra, hogy az állatoknak táplálékot és vizet adjanak.

1.5.2. Az állatok száma és a dózisok

Minden lépésben három állatot kell alkalmazni. A kezdődózist az 5, 50, 300 és 2000 mg/testtömeg-kg-os négy rögzített dózis közül kell kiválasztani. Azt a dózist kell kezdődózisként kiválasztani, amelyiknél a legvalószínűbb, hogy a kezelt állatok egy részénél elhullást okoz. Az 1. mellékletben látható folyamatábrák ismertetik az egyes kezdődózisok esetén követendő eljárást. A 4. melléklet pedig azzal kapcsolatosan ad iránymutatást, hogy a GHS bevezetéséig hogyan kell az EU-rendszer szerint elvégezni a besorolást.

Ha a rendelkezésre álló információ alapján a legmagasabb kezdődózis (2000 mg/testtömeg-kg) valószínűleg nem okoz elhullást, akkor határérték-vizsgálatot kell végezni. Ha a vizsgálandó anyagról nincs információ, állatjóléti okokból a 300 mg/testtömeg-kg-os kezdődózis alkalmazása javasolt.

Az egyes dózisok vizsgálata közötti időtartamot a mérgezési tünetek megjelenésének időpontja, időtartama és súlyossága határozza meg. Az állatok következő dózissal történő kezelését nem szabad megkezdeni mindaddig, amíg meg nem győződnek arról, hogy az előzőleg kezelt állatok életben maradnak.

Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét szabályozási hatósági követelmények indokolják, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 5000 mg/kg-os felső dózis alkalmazását (lásd a 2. mellékletet). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2000–5000 mg/kg) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószínűsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelenőséggel bírnak az emberi vagy állati egészség vagy a környezet védelme szempontjából.

1.5.3. Határérték-vizsgálat

Határérték-vizsgálatot elsősorban olyan helyzetekben kell végezni, ha a kísérletet végzőnek olyan információi vannak, amelyek szerint a vizsgálandó anyag valószínűleg nem toxikus, azaz csak a hatósági határérték-dózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban információ hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhető, figyelembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a fő vizsgálatot kell elvégezni.

Végezhető határérték-vizsgálat egyetlen, 2000 mg/testtömeg-kg-os dózissal, összesen hat (lépésenként három-három) állat alkalmazásával. Kivételes esetben végezhető határérték-vizsgálat egyetlen, 5000 mg/kg-os dózissal is, amikor összesen három állatot alkalmaznak (lásd a 2. mellékletet). A vizsgálandó anyaggal összefüggő elhullás esetén szükséges lehet a következő alacsonyabb dózissal tovább folytatni a vizsgálatokat.

1.6. MEGFIGYELÉSEK

Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, legalább az első 30 percben, azután az első 24 órában rendszeres időközönként, amelynek során különös figyelemmel kell őket kísérni az első 4 órában, majd ezt követően naponta, összesen 14 napon át, kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálatból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés időtartamát azonban nem szabad mereven meghatározni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és időtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megszűnésének időpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek inkább késleltetve jelentkeznek (12). Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell úgy, hogy minden állat esetében önálló adatsort kell felvenni.

Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szükség. Meg kell figyelni a bőr és a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma előfordulására is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alapelveket és követelményeket is figyelembe kell venni (9). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lévő állatokat, illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehető legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás időpontját is.

1.6.1. Testtömeg

Röviddel a vizsgálandó anyag beadása előtt és legalább egy héttel utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtömeg-változást ki kell számítani, és rögzíteni kell. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus módon exterminálni kell őket.

1.6.2. Kórbonctani vizsgálat

Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni (azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden egyes állat esetében minden makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegyezni. A kezdődózis beadása után legalább 24 óráig túlélő állatok esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos információk nyerhetők.

2. ADATOK

Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy minden vizsgálati csoportra vonatkozóan mutassa a csoportban lévő kísérleti állatok számát, valamint azoknak a számát, amelyeknél mérgezési tünetek láthatók, amelyek a vizsgálat során elhullottak, vagy amelyeket humánus módon extermináltak, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, időbeli lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.

3. JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek megfelelő módon a következő információkat kell tartalmaznia:

Vizsgálandó anyag:

- fizikai megjelenés, tisztaság és ha releváns, a fizikai-kémiai tulajdonságok (ezen belül az izomerizáció is),

- azonosító adatok, ezen belül a CAS-szám.

Vivőanyag (ha szükséges):

- ha a vivőanyag nem víz, akkor ennek indoklása.

Kísérleti állatok:

- az alkalmazott faj/törzs,

- az állatok mikrobiológiai státusza, feltéve, hogy ismert,

- az állatok száma, életkora és ivara (ezen belül adott esetben annak indoklása, hogy nőstények helyett miért hímeket alkalmaztak),

- az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.

kísérleti körülmények:

- a vizsgálandó anyag formulázására vonatkozó információk, ezen belül a beadott anyag fizikai formájával kapcsolatos adatok,

- a vizsgálandó anyag beadására vonatkozó információk, ezen belül a beadott térfogat és a beadás időpontja,

- a táplálék és a víz minősége (ezen belül a takarmány típusa/forrása, a víz forrása),

- a kezdődózis kiválasztásának indoklása.

Eredmények:

- a válaszadatok és a dózisok táblázatos formában történő megadása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató, ezen belül elhullt állatokra; a hatások jellege, súlyossága és időtartama),

- a testtömeg-adatok és a testtömeg-változások táblázatos formában történő megadása,

- az egyes állatok testtömege a dózis beadásának napján, azt követően hetente, valamint az elhullás vagy exterminálás időpontjában,

- a tervezett exterminálás előtti elhullás napja és ideje,

- a mérgezési tünetek megjelenése és időbeli lefolyása, valamint esetleges visszafordíthatósága minden egyes állatra vonatkozóan,

- a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.

Az eredmények diszkussziója és értelmezése.

Következtetések.

4. HIVATKOZÁSOK

(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86

(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FRF.html]

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."

--------------------------------------------------

2D. MELLÉKLET

B4. AKUT TOXICITÁS: BŐRIRRITÁCIÓ/BŐRKORRÓZIÓS HATÁS

1. MÓDSZER

Ez a módszer egyenértékű az OECD TG 404 (2002) módszerrel.

1.1. BEVEZETÉS

Ennek a továbbfejlesztett módszernek a kidolgozása során külön figyelmet szenteltek az állatjóléti szempontokkal kapcsolatos lehetséges javító beavatkozásoknak és a vizsgálandó anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló összes információ kiértékelésének, hogy ezáltal elkerülhető legyen a laboratóriumi állatokon történő szükségtelen kísérletezés. A módszer ajánlást fogalmaz meg arra nézve, hogy az anyag korrorróziós vagy irritáló hatásának vizsgálatára előírt in vivo kísérlet elvégzése előtt el kell végezni a rendelkezésre álló adatok bizonyító erejének elemzését (weight-of-the-evidence analysis). Ha nem áll rendelkezésre elegendő adat, akkor ezek mennyisége lépcsőzetes vizsgálatok alkalmazásával növelhető (1). A vizsgálati stratégia részét képezi validált és elfogadott in vitro vizsgálatok végzése, amelyek a módszerhez csatolt mellékletben kerülnek ismertetésre. Emellett javasolt, hogy – ahol lehet – a kiindulási in vivo vizsgálat során az állatra ne egyszerre, hanem időben egymás után helyezzék fel a három teszttapaszt.

A tudományos ésszerűség és az állatok kímélete érdekében nem szabad in vivo vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg az anyag potenciális korróziós/bőrirritáló hatására vonatkozó összes rendelkezésre álló adaton el nem végezték azok bizonyító erejének elemzését. Ilyen adatok az embereken és/vagy laboratóriumi állatokon elvégzett vizsgálatok eredményei, a szerkezetileg rokon anyagok vagy elegyeik korróziós/irritáló hatásaival kapcsolatos bizonyítékok, az anyag erős savasságát vagy lúgosságát igazoló adatok (2)(3), valamint a validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo vizsgálatokból kapott eredmények (4)(5)(5a). Az elemzésnek csökkentenie kell az in vivo bőrkorróziós/bőrirritációs vizsgálatok iránti igényt azoknak az anyagoknak az esetében, amelyekre az említett két végpont tekintetében más vizsgálatokból elegendő bizonyíték áll rendelkezésre.

A preferált lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amely validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo korróziós/irritációs vizsgálatok elvégzését is magában foglalja, a módszerhez csatolt mellékletben kerül ismertetésre. A stratégiát egy OECD-munkaértekezlet (6) résztvevői dolgozták ki, javasolták egyhangúlag, majd fogadták el mint a Globálisan harmonizált rendszer (GHS) a vegyi anyagok osztályozására (7) ajánlott vizsgálati stratégiáját. Az in vivo vizsgálatok elvégzése előtt ezt a vizsgálati stratégiát javasolt követni. Új anyagok esetében ez az ajánlott lépcsőzetes vizsgálati megközelítés a tudományos szempontból megfelelő adatok gyűjtésére az anyag korróziós/irritáló hatásaival kapcsolatosan. Ismert anyagok esetében, ha nem áll rendelkezésre elegendő adat a bőrkorróziós/bőrirritáló hatásokról, ennek a stratégiának az alkalmazásával kell pótolni a hiányzó adatokat. Megfelelően meg kell indokolni az ettől eltérő vizsgálati stratégia vagy eljárás alkalmazását, vagy ha úgy döntenek, hogy nem használják a lépcsőzetes vizsgálati megközelítést.

Ha a korróziós vagy irritáló hatásokat nem lehet meghatározni az adatok bizonyító erejének elemzésével, a lépcsőzetes vizsgálati stratégiával összhangban fontolóra kell venni in vivo vizsgálatok elvégzését (lásd a mellékletben).

1.2 FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

"Bőrirritáció": a vizsgálandó anyag alkalmazását követően 4 órán belül megjelenő, visszafordítható bőrkárosodás.

"Bőrkorróziós hatás": a vizsgálandó anyag alkalmazását követően négy órán belül megjelenő, visszafordíthatatlan bőrkárosodás, azaz a felhámon át az irhára is átterjedő látható szövetelhalás. A korróziós reakciót fekélyek, vérzés, véres var, illetve a 14 napos megfigyelési időszak végén a bőr kifehéredése miatti elszíneződések, teljesen szőrtelen területek és hegek jellemzik. A problémás léziók kiértékelése érdekében fontolóra kell venni kórszövettani vizsgálatok elvégzését.

1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísérleti állat bőrén; a vizsgált állat nem kezelt bőrfelületei szolgálnak kontrollként. Az irritáció/korrózió mértékét meghatározott időközönként kell ellenőrizni és értékelni, továbbá a hatások teljes kiértékelése érdekében részletesebben is ismertetni. A vizsgálat időtartamának elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy meg lehessen határozni a megfigyelt hatások visszafordíthatóságát vagy visszafordíthatatlanságát.

A vizsgálat bármely fázisában tartós súlyos szorongás és/vagy fájdalom jeleit mutató állatokat humánus módon exterminálni kell, és az anyagot ennek megfelelően kell értékelni. Az elhullás közelében lévő és súlyosan szenvedő állatok humánus módon történő exterminálásáról szóló döntéssel kapcsolatos kritériumok a (8) hivatkozásban találhatók.

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE

1.4.1. Az in vivo vizsgálat előkészítése

1.4.1.1. Az állatfaj kiválasztása

A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell alkalmazni. Más fajok alkalmazását megfelelően indokolni kell.

1.4.1.2. Az állatok előkészítése

A vizsgálat előtt körülbelül 24 órával el kell távolítani az állat szőrzetét úgy, hogy teljesen le kell nyírni az állat törzsének dorzális területét. Vigyázni kell arra, hogy eközben ne dörzsöljék ki az állat bőrét, és csak olyan állatokat szabad alkalmazni, amelyek bőre ép és egészséges.

Egyes nyúltörzsek szőrzete sűrű foltokban nő, amelyek az év egyes szakaszaiban még szembetűnőbbek. Nem szabad vizsgálati területként használni az ilyen sűrű szőrzetnövekedéssel jellemzett részeket.

1.4.1.3. Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Az állatokat egyedileg kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének 20 °C (± 3 °C)-nak kell lennie. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett.

1.4.2. A vizsgálati eljárás

1.4.2.1. A vizsgálandó anyag alkalmazása

A vizsgálandó anyagot egy kis (körülbelül 6 cm2-es) bőrterületre kell kijuttatni, majd egy géztapasszal le kell takarni, és nem irritáló ragasztószalaggal kell a helyén rögzíteni. Olyan esetekben, amikor a közvetlen alkalmazás nem megoldható (pl. folyadékok vagy egyes masszák esetében), a vizsgálandó anyagot először a géztapaszra kell felvinni, és azután azt kell a bőrre tenni. Az expozíciós idő tartamára a tapaszt lazán kell a bőrre rögzíteni egy megfelelő félig záró kötés alkalmazásával. Amennyiben a vizsgálandó anyagot a tapaszra viszik fel, úgy kell a bőrre rögzíteni, hogy megfelelő legyen a kontaktus, és az anyag egyenletesen oszoljon el a bőrön. Gondoskodni kell arról, hogy az állat ne férjen hozzá a tapaszhoz és ne nyelje le vagy lélegezze be a vizsgálandó anyagot.

A folyékony vizsgálandó anyagokat általában hígítatlanul kell alkalmazni. Szilárd anyagok vizsgálatakor (amelyeket szükség esetén porrá lehet őrölni) a vizsgálandó anyagot a lehető legkisebb, de a bőrrel való megfelelő kontaktus biztosításához elegendő mennyiségű vízzel (vagy ha szükségesm, más megfelelő vivőanyaggal) meg kell nedvesíteni. Ha víztől eltérő vivőanyagot alkalmaznak, a vivőanyag legfeljebb minimális mértékben befolyásolhatja a vizsgálandó anyag által gyakorolt irritáló hatást.

Ha megoldható, az általában 4 órás expozíciós idő végén az adott esetben megmaradt vizsgálandó anyagot vízzel vagy más megfelelő oldószerrel el kell távolítani, de vigyázni kell arra, hogy ezzel ne legyenek hatással a meglévő válaszreakciókra vagy a felhám épségére.

1.4.2.2. A dózisok

A vizsgálati helyre 0,5 ml folyadékot vagy 0,5 g szilárd anyagot vagy masszát kell felvinni.

1.4.2.3. Kiindulási vizsgálat (in vivo bőrirritációs/bőrkorróziós vizsgálat egy állat felhasználásával)

Nyomatékosan ajánlott, hogy az in vivo vizsgálatot először egy állaton végezzék el, különösen akkor, ha az anyag gyaníthatóan korróziós hatású. Ez összhangban áll a lépcsőzetes vizsgálati stratégiával (lásd az 1. mellékletet).

Ha az adatok bizonyító erejének elemzése alapján az anyag korróziós hatásúnak minősül, nincsen szükség további állatkísérletekre. A legtöbb gyaníthatóan korróziós hatású anyag esetében általában szükségtelen további in vivo vizsgálatokat végezni. Ha azonban nincs elegendő bizonyíték, és emiatt indokoltnak látszik a további adatgyűjtés, az alábbi eljárás alkalmazásával korlátozott állatkísérletek végezhetők: az állatra egymást követően legfeljebb három tapaszt kell felhelyezni. Az első tapaszt három perc után el kell távolítani, és ha nem láthatók súlyos bőrreakciók, a második tapaszt is fel kell helyezni, majd egy óra elteltével ezt is el kell távolítani. Ha a megfigyelések ebben a szakaszban azt mutatják, hogy humánusan megengedhető az expozíció négy órára történő meghosszabbítása, egy harmadik tapaszt is fel lehet helyezni, majd négy óra múlva eltávolítani és kiértékelni a válaszreakciót.

Ha a három egymás utáni expozíció bármelyike után korróziós hatást tapasztalható, a vizsgálatot azonnal be kell fejezni. Ha az utolsó tapasz eltávolítása után sem figyelhető meg korróziós hatás, az állatot 14 napon át meg kell figyelni, kivéve, ha előbb jelentkezik korróziós hatás.

Azokban az esetekben, amikor a vizsgálandó anyag várhatóan nem okoz korróziós hatást, de irritáló lehet, négy órára kell felhelyezni egyetlen tapaszt egy állatra.

1.4.2.4. Ellenőrző vizsgálat (in vivo bőrirritációs/bőrkorróziós vizsgálat további állatok alkalmazásával)

Ha a kiindulási vizsgálat során nem figyelhető meg korróziós hatás, legfeljebb további két állaton egy-egy tapasz és négyórás expozíciós idő alkalmazásával meg kell erősíteni az irritációt vagy a negatív válaszreakciókat. Ha a kiindulási vizsgálat során irritációs választ figyeltek meg, az ellenőrző vizsgálatok lépcsőzetesen is elvégezhetők, vagy úgy, hogy két további állatot egyszerre kezelnek. Abban a kivételes esetben, ha nem végeznek kiindulási vizsgálatot, két vagy három állatot lehet kezelni egy-egy tapasszal, amelyet négy óra után távolítanak el. Ha két állatot használnak, és mindkettő ugyanolyan válaszreakciót mutat, nincs szükség további vizsgálatokra. Egyéb esetben egy harmadik állatot is be kell vonni a vizsgálatba. A nem egyértelmű válaszokat esetleg további állatok alkalmazásával kell értékelni.

1.4.2.5. Megfigyelési időszak

A megfigyelési időszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen a megfigyelt hatások visszafordíthatóságának teljes kiértékelésére. A vizsgálatot azonban azonnal meg kell szakítani, ha az állat tartósan súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutatja. A hatások visszafordíthatóságának meghatározásához az állatokat a tapaszok eltávolítása után legfeljebb 14 napig meg kell figyelni. Ha a visszafordíthatóság a 14 napos időszak vége előtt bebizonyosodik, a kísérletet ekkor kell befejezni.

1.4.2.6. Klinikai megfigyelések és a bőrreakciók értékelése

Minden állatnál meg kell vizsgálni a bőrpír (eritéma) vagy vizenyő (ödéma) jeleit, továbbá a tapasz eltávolítása után 60 perccel, majd 24, 48 és 72 órával értékelni kell a válaszreakciókat. Az egy állattal végzett kiindulási vizsgálatban a vizsgálati területet a tapasz eltávolítása után azonnal is meg kell vizsgálni. A bőrreakciókat a csatolt táblázatban megadottak szerint kell értékelni és jegyzőkönyvezni. Ha 72 óránál sem irritációként, sem korrózióként nem értékelhető bőrkárosodás látható, a hatások visszafordíthatóságának meghatározásához szükség lehet arra, hogy a megfigyeléseket a 14. napig folytassák. Az irritáció megfigyelésén kívül minden lokális toxikus hatást, mint például a bőr zsírtartalmának csökkentését, és bármely káros szisztémás hatást (pl. a mérgezés klinikai tüneteire és a testtömegre gyakorolt hatást) részletesen le kell írni, és fel kell jegyezni. A nem egyértelmű eredmények tisztázása érdekében fontolóra kell venni kórszövettani vizsgálatok elvégzését is.

A bőrreakciók értékelése elkerülhetetlenül szubjektív. A bőrreakciók értékelésének harmonizálása és a vizsgáló laboratóriumok, illetve a megfigyelésekben és azok értékelésében részt vevők segítése érdekében a megfigyeléseket végző személyzetet megfelelően ki kell képezni az alkalmazott értékelő rendszer (lásd a csatolt táblázatot) használatára. Hasznos lehet egy, a bőrirritációk és más léziók értékelését ismertető, illusztrált útmutató is (9).

2. ADATOK

2.1. AZ EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA

A végleges vizsgálati jelentésben a vizsgálatok eredményeit táblázatos formában kell összefoglalni, amelynek a 3.1 szakaszban felsorolt tételek mindegyikét tartalmaznia kell.

2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE

A bőrirritációs pontszámokat a léziók jellegével és súlyosságával, illetve visszafordíthatóságával vagy visszafordíthatatlanságával összefüggésben kell értékelni. Az egyes pontszámok nem jelentenek abszolút normát egy anyag irritációs tulajdonságai tekintetében, mivel a vizsgálandó anyag egyéb hatásait is értékelni kell. Az egyes pontszámokat ehelyett referenciaértékeknek kell tekinteni, amelyeket a vizsgálat során tett összes egyéb megfigyeléssel együttesen kell értékelni.

Az irritációs válaszok értékelésekor figyelembe kell venni a bőrléziók visszafordíthatóságát. Ha az olyan válaszok, mint a szőrhiány (korlátozott területen), kóros elszarusodás (hiperkeratózis), a szövetszaporodás (hiperplázia) vagy a hámlás a 14 napos megfigyelési időszak végére sem múlnak el, a vizsgálandó anyagot irritálónak kell tekinteni.

3. JELENTÉS

3.1 VIZSGÁLATI JELENTÉS

A vizsgálati jelentésnek a következő információkat kell tartalmaznia:

Az in vivo vizsgálatok indoklása: a korábban rendelkezésre álló vizsgálati adatok, ezen belül a lépcsőzetes vizsgálati stratégia során nyert adatok bizonyító erejének elemzése:

- a korábbi vizsgálatból rendelkezésre álló adatok ismertetése,

- a vizsgálati stratégia egyes szakaszaiban nyert adatok,

- az elvégzett in vitro vizsgálatok, ezen belül az eljárások, illetve a vizsgálandó anyaggal és a referenciaanyagokkal a kapott eredmények részleteinek ismertetése,

- az adatok bizonyító erejének elemzése az in vivo vizsgálat elvégzéséhez.

Vizsgálandó anyag:

- azonosító adatok (pl. CAS-szám; eredet; tisztaság; ismert szennyezők; tételszám),

- fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. pH, illékonyság, oldhatóság, stabilitás),

- elegy esetén annak összetétele és az egyes komponensek egymáshoz viszonyított aránya.

Vivőanyag:

- megjelölés, (adott esetben) koncentráció, alkalmazott térfogat,

- a vivőanyag megválasztásának indoklása.

Kísérleti állatok:

- az alkalmazott faj/törzs, adott esetben az albínó nyúltól eltérő faj alkalmazásának indoklása,

- az állatok száma ivaronként,

- az egyes állatok testtömege a vizsgálat előtt és után,

- életkor a vizsgálat kezdetén,

- az állatok származása, tartásuk körülményei, takarmánya stb.

Kísérleti körülmények:

- a tapasz helyének előkészítésére alkalmazott technika,

- a tapasz anyagának és a felhelyezési technika részletes ismertetése,

- a vizsgálandó anyagból előállított készítménynek, az alkalmazás és az eltávolítás a részletes ismertetése.

Eredmények:

- az irritációs/korróziós válaszok pontszámainak táblázatos formában történő megadása minden egyes állatra és minden egyes mérési időpontra vonatkozóan,

- az összes megfigyelt lézió ismertetése,

- a megfigyelt irritáció vagy korrózió jellegének és mértékének, illetve az esetleges kórszövettani eredmények leíró jellegű ismertetése,

- a bőrirritáción és korróziós hatáson kívüli egyéb káros hatások (pl. a bőr zsírtartalmának csökkenése) és szisztémás hatások ismertetése.

Az eredmények diszkussziója.

4. HIVATKOZÁSOK

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.

(5a) B40. vizsgálati módszer, Bőrkorrózió.

(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 - 24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Kérésre az OECD Titkárságon rendelkezésre áll.]

I. TÁBLÁZAT: A BŐRREAKCIÓK ÉRTÉKELÉSE

Bőrpír (eritéma) és pörkképződés

Nincs bőrpír … | 0 |

Nagyon enyhe bőrpír (alig észlelhető) … | 1 |

Jól kifejezett bőrpír … | 2 |

Közepes-súlyos mértékű bőrpír … | 3 |

Pörkképződésig fokozódó súlyos bőrpír (céklavörös szín), amely lehetetlenné teszi a bőrpír osztályozását … | 4 |

Lehetséges maximum: 4 |

Vizenyőképződés

Nincs vizenyő … | 0 |

Nagyon enyhe vizenyő (alig észlelhető) … | 1 |

Enyhe vizenyő (a terület szélei az egyértelmű kiemelkedések miatt jól kifejezettek) … | 2 |

Közepes súlyosságú vizenyő (körülbelül 1 mm-re emelkedik ki) … | 3 |

Súlyos vizenyő (több mint 1 mm-re emelkedik ki és nagyobb, mint az expozíciós terület) … | 4 |

Lehetséges maximum: 4 |

A nem egyértelmű válaszokat kórszövettani vizsgálattal lehet tisztázni.

--------------------------------------------------

2E. MELLÉKLET

B5. AKUT TOXICITÁS: SZEMIRRITÁCIÓ/SZEMKORRÓZIÓS HATÁS

1. MÓDSZER

Ez a módszer egyenértékű az OECD TG 405 (2002) módszerrel.

1.1. BEVEZETÉS

Ennek a továbbfejlesztett módszernek a kidolgozása során külön figyelmet szenteltek a vizsgálandó anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló összes információ kiértékelése révén lehetségessé váló javító beavatkozásoknak, hogy ezáltal elkerülhető legyen a laboratóriumi állatokon történő szükségtelen kísérletezés, és így tiszteletben lehessen tartani az állatjóléti szempontokat is. A módszer ajánlást fogalmaz meg arra nézve, hogy az anyag akut szemkorróziós vagy szemirritáló hatásának vizsgálatára előírt in vivo kísérlet elvégzése előtt el kell végezni a rendelkezésre álló adatok bizonyító erejének elemzését (1). Ha nem áll rendelkezésre elegendő adat, akkor ajánlott lépcsőzetes vizsgálatok alkalmazásával bővíteni ezeket (2)(3). A vizsgálati stratégia részét képezi validált és elfogadott in vitro vizsgálatok végzése, amelyek a vizsgálati módszer mellékleteként kerülnek ismertetésre. Ajánlott továbbá, hogy az in vivo szemvizsgálatok tervbevétele előtt a szemkorróziós hatás előrejelzésére végezzenek in vivo bőrirritációs/bőrkorróziós vizsgálatot.

A tudományos ésszerűség és az állatok kímélete érdekében nem szabad in vivo vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg az anyag potenciális szemkorróziós/irritáló hatására vonatkozó összes rendelkezésre álló adatra vonatkozóan el nem végezték az adatok bizonyító erejének elemzését. Ilyen adatok az embereken és/vagy laboratóriumi állatokon elvégzett vizsgálatok eredményei, a szerkezetileg rokon anyagok vagy elegyeik korróziós/irritáló hatásaival kapcsolatos tények, az anyag erős savasságát vagy lúgosságát igazoló adatok (4)(5), valamint a validált és elfogadott in vitro vagy ex vivo bőrkorróziós és bőrirritációs vizsgálatokból kapott eredmények (6)(6a). Előfordulhat, hogy a vizsgálatokat már az adatok bizonyító erejének elemzése előtt elvégezték vagy éppen annak eredményeként végzik el.

Bizonyos anyagok esetében az ilyen elemzés annak a szükségét jelezheti, hogy el kell végezni az anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának in vivo vizsgálatát. Minden ilyen esetben, az in vivo szemvizsgálat alkalmazásának tervbevétele előtt először lehetőleg el kell végezni, és ki kell értékelni egy in vivo vizsgálatot az anyag bőrre gyakorolt hatásainak meghatározására a B4. vizsgálati módszer (7) alkalmazásával. Az adatok bizonyító erejének elemzése és a lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazása csökkenti az in vivo szemkorróziós/szemirritációs vizsgálatok szükségességét azoknak az anyagoknak az esetében, amelyekhez más vizsgálatokból elegendő bizonyíték áll rendelkezésre. Ha a lépcsőzetes stratégia alkalmazásával nem határozható meg a szemkorróziós/irritációs potenciál, még az in vivo bőrkorróziós és irritációs vizsgálat elvégzése után sem, elvégezhető egy in vivo szemkorróziós/szemirritációs vizsgálat.

A preferált lépcsőzetes vizsgálati stratégia, amely magában foglalja validált in vitro vagy ex vivo korróziós/irritációs vizsgálatok elvégzését is, az e vizsgálati módszerhez csatolt mellékletben kerül ismertetésre. A stratégiát egy OECD-munkaértekezlet (8) résztvevői dolgozták ki, javasolták egyhangúlag, majd fogadták el mint a Globálisan harmonizált rendszer (GHS) a vegyi anyagok osztályozására (9) ajánlott vizsgálati stratégiáját. Az in vivo vizsgálatok elvégzése előtt ezt a vizsgálati stratégiát javasolt követni. Új anyagok esetében ez az ajánlott lépcsőzetes vizsgálati megközelítés az anyag korróziós/irritáló hatásaira vonatkozó, tudományos szempontból megfelelő adatok gyűjtésére. Ismert anyagok esetében, ha nem áll rendelkezésre elegendő adat a szemkorróziós/szemirritáló és bőrkorróziós/bőrirritáló hatásokról, ennek a stratégiának az alkalmazásával kell pótolni a hiányzó adatokat. Megfelelően meg kell indokolni, ha ettől eltérő vizsgálati stratégiát vagy eljárást alkalmaznak, vagy ha úgy döntenek, hogy nem használják a lépcsőzetes vizsgálati megközelítést.

1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

"Szemirritáció": a vizsgálandó anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül teljes mértékben visszafordítható szemelváltozások.

"Szemkorróziós hatás": a vizsgálandó anyagnak a szem elülső felszínén történő alkalmazását követően megjelenő és az alkalmazástól számított 21 napon belül nem teljes mértékben visszafordítható szövetkárosodások a szemben, vagy súlyos fizikai látóképesség-romlás.

1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE

A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísérleti állat egyik szemén; a másik, nem kezelt szem szolgál kontrollként. A szemirritáció/szemkorrózió mértékét meghatározott időközönként a kötőhártya, szaruhártya és szivárványhártya lézióinak pontozásával kell kiértékelni. A hatások teljes kiértékelése érdekében részletesen ismertetni kell a szemre gyakorolt egyéb hatásokat és a káros szisztémás hatásokat is. A vizsgálat időtartamának elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy meg lehessen határozni a hatások visszafordíthatóságát vagy visszafordíthatatlanságát.

A vizsgálat bármely fázisában tartósan súlyos szorongás és/vagy fájdalom jeleit mutató állatokat humánus módon exterminálni kell, és az anyagot ennek megfelelően kell értékelni. Az elhullás közelében lévő és súlyosan szenvedő állatok humánus módon történő exterminálásáról szóló döntéssel kapcsolatos kritériumok a (10) hivatkozásban találhatók.

1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE

1.4.1. Az in vivo vizsgálat előkészítése

1.4.1.1. Az állatfaj kiválasztása

A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal felnőtt állatokat kell alkalmazni. Más fajok alkalmazását megfelelően indokolni kell.

1.4.1.2. Az állatok előkészítése

A vizsgálat előtt legfeljebb 24 órával a vizsgálatra előzetesen kiválasztott kísérleti állat mindkét szemét meg kell vizsgálni. Nem szabad olyan állatot használni, amely szemirritációt, szemhibákat vagy korábban szerzett szaruhártya-sérülést mutat.

1.4.1.3. Az állatok tartásának és etetésének körülményei

Az állatokat egyedileg kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti helyiség hőmérsékletének 20 °C (± 3 °C)-nak kell lennie. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett.

1.4.2. Vizsgálati eljárás

1.4.2.1. A vizsgálandó anyag alkalmazása

A vizsgálandó anyagot az alsó szemhéj óvatos elhúzása után az állat egyik szemének kötőhártyazsákjába kell bejuttatni. Ezt követően körülbelül egy másodpercig óvatosan össze kell fogni a szemhéjakat, hogy az anyag ki ne essen vagy folyjon. A másik, nem kezelt szem kontrollként szolgál.

1.4.2.2. Öblögetés

A kísérleti állatok szemét a vizsgálandó anyag becseppentése után legalább 24 órán át nem szabad kimosni, kivéve szilárd anyagok alkalmazása esetén (lásd 1.4.2.3.2. szakasz), illetve ha azonnali korróziós hatás vagy irritáció tapasztalható. Ha szükségnek tűnik, 24 óra múlva ki lehet mosni az állatok szemét.

Nem javasolt kontrollcsoport alkalmazása a mosás hatásának vizsgálatára, kivéve, ha az tudományosan indokolt. Ha kontrollcsoport szükséges, akkor ehhez két nyulat kell használni. A mosás körülményeit, pl. a mosás időpontját, a mosóoldat összetételét és hőmérsékletét, a mosás időtartamát és sebességét, valamint az alkalmazott térfogatot részletesen dokumentálni kell.

1.4.2.3. A dózisok

1.4.2.3.1. Folyadékok vizsgálata

Folyadékok vizsgálata esetén 0,1 ml-es dózist kell alkalmazni. Pumpás spray-ket nem szabad az anyag közvetlenül a szembe való permetezésére használni. A sprayt ki kell fújni, és tartalmát egy edényben össze kell gyűjteni, mielőtt 0,1 ml-t az állat szemébe cseppentenének.

1.4.2.3.2. Szilárd anyagok vizsgálata

Szilárd anyagok, masszák és szemcsés anyagok vizsgálata esetén az alkalmazott mennyiségnek 0,1 ml térfogatúnak kell lennie, illetve tömege nem haladhatja meg a 100 g-ot. A vizsgálandó anyagot finom porrá kell őrölni és térfogatmérés előtt óvatosan össze kell tömöríteni, pl. úgy, hogy a mérőedényt megkocogtatják. Amennyiben az első megfigyelési időpontban vagy a kezelés után 1 órával azt tapasztalják, hogy a szilárd vizsgálandó anyagot a fiziológiai mechanizmusok nem távolították el a kísérleti állat szeméből, a szemet sóoldattal vagy desztillált vízzel ki lehet öblögetni.

1.4.2.3.3. Aeroszolok vizsgálata

Ajánlatos minden pumpás spray tartalmát és aeroszolt összegyűjteni, mielőtt a szembe cseppentenék. Az egyetlen kivételt ez alól a túlnyomásos aeroszolos flakonokban lévő anyagok képezik, amelyeket a párolgás miatt nem lehet összegyűjteni. Ilyen esetekben az állat szemét nyitva kell tartani, és a vizsgálandó anyagot úgy kell a szembe juttatni, hogy a flakont 10 cm távolságban közvetlenül a szem előtt tartva és körülbelül egy másodpercig működtetve egyszer belefújnak az állat szemébe. A spray nyomásától és tartamától függően a távolság ettől eltérő is lehet. Vigyázni kell arra, hogy a spray nyomása ne okozzon szemkárosodást. Megfelelő esetekben szükség lehet arra is, hogy a spray okozta "mechanikai" szemkárosodás lehetőségét is vegyék figyelembe.

Az aeroszol dózisát úgy lehet megbecsülni, hogy a vizsgálatot az alábbiak szerint szimulálják. Az anyagot mérőpapírra permetezik egy olyan, közvetlenül a papír elé helyezett nyíláson keresztül, amelynek mérete megegyezik a nyúl szemének méretével. A papír tömegének növekedését használják fel a szembe permetezett mennyiség közelítő becslésére. Illékony anyagok esetében a dózist úgy lehet megbecsülni, hogy vizsgálandó anyag eltávolítása előtt és után is megmérik a befogadó edény tömegét.

1.4.2.4. Kiindulási vizsgálat (in vivo szemirritációs/szemkorróziós vizsgálat egy állat alkalmazásával)

Ahogyan az a lépcsőzetes vizsgálati stratégiában (lásd 1. melléklet) is kifejtésre kerül, nyomatékosan ajánlott, hogy az in vivo vizsgálatot először egy állaton végezzék el, különösen akkor, ha az anyag gyaníthatóan korróziós hatású.

Ha e vizsgálat eredményei szerint az ismertetett eljárás alkalmazásával az anyag korróziós hatású vagy súlyosan irritálja a szemet, nem szabad további szemirritációs vizsgálatokat végezni.

1.4.2.5. Helyi érzéstelenítőszerek

Esetenként helyi érzéstelenítőszerek is alkalmazhatók. Ha az adatok bizonyító erejének elemzése szerint az anyag fájdalmat okozhat, vagy ha a kiindulási vizsgálat alapján fájdalmas reakció várható, a vizsgálandó anyag becseppentése előtt helyi érzéstelenítőszer alkalmazható. A helyi érzéstelenítőszer típusát, koncentrációját és dózisát körültekintően kell megválasztani, hogy alkalmazása miatt nehogy megváltozzon a vizsgálandó anyag által kiváltott reakció. A kontrollszemet ugyanígy érzésteleníteni kell.

1.4.2.6. Ellenőrző vizsgálat (in vivo szemirritációs vizsgálat további állatok alkalmazásával)

Ha a kiindulási vizsgálat során nem figyelhető meg korróziós hatás, legfeljebb további két állat alkalmazásával ellenőrizni kell az irritációs vagy negatív válaszreakciókat. Ha a kiindulási vizsgálat során súlyos irritációs választ figyeltek meg, amely valószínűsíti, hogy az ellenőrző vizsgálatban erőteljes (visszafordíthatatlan) hatás jelentkezhet, ajánlatos az ellenőrző vizsgálatot lépcsőzetesen, egyszerre egy állat alkalmazásával végezni ahelyett, hogy a két további állatot egyszerre kezelnének. Ha a második állat korróziós vagy súlyos, irritáló hatásokat jelez, nem szabad folytatni a vizsgálatokat. A gyenge vagy közepes mértékű irritáció megerősítéséhez további állatok vizsgálatára lehet szükség.

1.4.2.7. Megfigyelési időszak

A megfigyelési időszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy elegendő legyen a megfigyelt hatások mértékének és visszafordíthatóságának teljes kiértékelésére. A vizsgálatot azonban azonnal meg kell szakítani, ha az állat tartósan súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutatja (9). A hatások visszafordíthatóságának meghatározásához az állatokat általában a vizsgálandó anyag alkalmazása után 21 napig kell megfigyelni. Ha a visszafordíthatóság a 21 napos időszak vége előtt bebizonyosodik, a kísérletet ekkor be kell fejezni.

1.4.2.7.1. Klinikai megfigyelések és a bőrreakciók értékelése

A szemeket a vizsgálandó anyag alkalmazása után 1, 24, 48 és 72 órával kell megvizsgálni. Ha már megvan a döntő információ, az állatokat nem szabad a szükségesnél hosszabb ideig a kísérletben tartani. A tartósan súlyos fájdalmat vagy szorongást mutató állatokat haladéktalanul és humánus módon exterminálni kell, és az anyagot ennek megfelelő kell értékelni. A vizsgálandó anyag becseppentése után az alábbi szemléziókat mutató állatokat humánus módon exterminálni kell: szaruhártya perforálódás vagy jelentős mértékű szaruhártya-fekélyesdés, ezen belül staphyloma (a szaruhártya rendellenes kidomborodása); vér jelenléte a szem elülső szemzugában; 48 órán át tartó negyedfokú szaruhártya-homály; a fényreflex 72 órán át tartó hiánya (másodfokú szivárványhártya-válaszreakció); a kötőhártya fekélyesedése; a kötőhártyában vagy a pislogóhártyában jelentkező szövetelhalás; vagy pörkképződés. Erre azért van szükség, mert az ilyen léziók általában nem visszafordíthatók.

A szemléziókat nem mutató állatokat legkorábban a becseppentés után 3 nappal lehet exterminálni.

Az enyhe vagy közepes léziókat mutató állatokat legalább addig megfigyelés alatt kell tartani, amíg a léziók meg nem szűnnek, vagy legfeljebb 21 napig, amikor a vizsgálatot be kell fejezni. A 7., 14. és 21. napon kell megfigyeléseket végezni a léziók állapotának és visszafordíthatóságának vagy visszafordíthatatlanságának meghatározására.

Minden egyes vizsgálatkor minősíteni kell, és fel kell jegyezni a szemreakciókat (kötőhártya-, szaruhártya- és szivárványhártya-reakciók) (I. táblázat). A szem bármely egyéb lézióját (pl. pannus, elszíneződés) vagy a káros szisztémás hatásokat is fel kell jegyezni.

A reakciók vizsgálatát megkönnyítheti egy binokuláris kézi nagyító, egy kézi vo