A Bizottság irányelve

(1987. november 18.)

a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő kilencedik hozzáigazításáról

(88/302/EGK)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb a 79/831/EGK irányelvvel [1] a hatodik alkalommal módosított, a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1967. június 27-i 67/548/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 19. cikkére,

mivel a 67/548/EGK irányelv 3. cikkének (1) bekezdése előírja az anyagok és készítmények fizikai és kémiai tulajdonságainak, toxicitásának, valamint ökotoxicitásának az V. mellékletben ismertetett módszerekkel történő meghatározását;

mivel a 67/548/EGK irányelv 3. cikkének (2) bekezdése előírja, hogy valamely anyag vagy készítmény környezetre gyakorolt tényleges, illetve esetleges veszélyeit a VII. és VIII. mellékletben foglalt rendelkezések alapján kell felmérni;

mivel a 84/449/EGK bizottsági irányelv [3] által bevezetett változat V. melléklete jelenleg csak a VII. mellékletben felsorolt jellemzők vizsgálati módszereit tartalmazza, ezért szükség van olyan vizsgálati módszerek rendelkezésre bocsátására is, amelyek viszont a VIII. mellékletben felsorolt jellemzőkre vonatkoznak;

mivel ezen irányelv rendelkezései összhangban vannak a veszélyes anyagok és készítmények kereskedelme technikai akadályainak felszámolásáról szóló irányelveknek a műszaki fejlődéshez történő hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A 67/548/EGK irányelv V. melléklete ezen irányelv mellékletének a szövegével egészül ki.

2. cikk

A tagállamok legkésőbb 1988. december 31-ig elfogadják és kihirdetik azokat az intézkedéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek, és erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. Az intézkedéseket legkésőbb 1989. június 30-tól alkalmazzák.

3. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1987. november 18-án.

a Bizottság részéről

Stanley Clinton Davis

a Bizottság tagja

[1] HL L 259., 1979.10.15., 10. o.

[2] HL 196., 1967.8.16., 1/67. o.

[3] HL L 251., 1984.9.19., 1. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

Az e mellékletben ismertetett vizsgálati módszerek a 79/831/EGK irányelv VIII. mellékletében felsorolt egyes toxikológiai és ökotoxikológiai tulajdonságok meghatározására szolgálnak. A VIII. melléklet 1., illetve 2. szakaszának megfelelő vizsgálati módszerek e jogszabályban ismertetésre kerülnek, de az egyes vizsgálatok a különböző szinteken betöltött szerepük szerint nincsenek osztályozva.

TARTALOM

B. RÉSZ: a toxicitás meghatározására szolgáló módszerek … | 93 |

Általános bevezetés: B. rész … | 93 |

Szubkrónikus orális toxicitásvizsgálat: 90 napos, ismételt orális adagolású vizsgálat rágcsáló fajokon … | 97 |

Szubkrónikus orális toxicitásvizsgálat: 90 napos, ismételt orális adagolású vizsgálat nem rágcsáló fajokon … | 101 |

Szubkrónikus dermális toxicitásvizsgálat: 90 napos, ismételt dermális adagolású vizsgálat rágcsáló fajokon … | 105 |

Szubkrónikus inhalációs toxicitásvizsgálat: 90 napos, ismételt inhalációs adagolású vizsgálat rágcsáló fajokon … | 109 |

Teratogenitási vizsgálat rágcsáló és nem rágcsáló fajokon … | 113 |

Krónikus toxicitásvizsgálat … | 116 |

A rákkeltő hatás vizsgálata … | 121 |

A krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás együttes vizsgálata … | 126 |

Egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat … | 132 |

Kétgenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat … | 136 |

Toxikokinetikai vizsgálat … | 140 |

Mutagenitásvizsgálat és a rákkeltő hatás szűrése: … | 144 |

–Génmutáció vizsgálata Sacharomyces cerevisiae-ben … | 144 |

–Mitotikus rekombináció-vizsgálat Sacharomyces cerevisiae-ben … | 147 |

–In vitro emlőssejtgénmutáció-vizsgálat … | 150 |

–DNS-károsodás és -reparáció – nem tervezett DNS-szintézis (unscheduled DNA synthesis, UDS) – emlőssejtek in vitro… | 153 |

–In vitro emlőstestvérkromatidkicserélődés- (sister chromatid exchange, SCE) vizsgálat … | 157 |

–Nemhez kötött recesszív letális vizsgálat Drosophila melanogasterben … | 160 |

–In vitro emlőssejt-transzformációs vizsgálatok … | 162 |

–Domináns letális vizsgálat rágcsálókon … | 165 |

–In vivo emlőscsírasejt-citogenetika … | 168 |

–Egérfolt- (spot) teszt … | 171 |

–Egéren végzett örökletes transzlokációs vizsgálat … | 174 |

C. RÉSZ: Az ökotoxicitás meghatározásának módszerei … | 177 |

Általános bevezetés: C. rész … | 177 |

Növekedésgátlási vizsgálat algákon … | 178 |

Toxicitás földigilisztákra: Mesterséges talajban végzett vizsgálat … | 184 |

Biológiai lebomlás: Zahn–Wellens vizsgálat … | 188 |

Biológiai lebomlás: Eleveniszap-szimulációs vizsgálat … | 195 |

Biológiai lebomlás: Eleveniszap-légzésgátlási vizsgálat … | 207 |

Biológiai lebomlás: Módosított SCAS-vizsgálat … | 212 |

B. RÉSZ: A TOXICITÁS MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS: B. RÉSZ

HOSSZÚ TÁVÚ KÍSÉRLETEK

Szubkrónikus, krónikus toxicitás- és karcinogenitás-vizsgálat

A vizsgált anyag és a kezelésre használt keverék jellemzése

Bármely toxicitási vizsgálat megkezdése előtt ismerni kell a vizsgált anyag összetételét, beleértve a jelentősebb szennyeződéseket és a fontosabb fizikokémiai tulajdonságokat, többek között a stabilitást.

A vizsgált anyag fizikokémiai tulajdonságai fontos információkkal szolgálnak az adagolás módjára, a szubkrónikus, krónikus és karcinogenitás-vizsgálatok megtervezésére, valamint a vizsgált anyagok kezelésének és tárolásának módjára vonatkozóan.

A kémiai szerkezettel és a fizikokémiai tulajdonságokkal kapcsolatos információ arról is tájékoztatást adhat, hogy a szándékolt adagolási mód szerint milyenek az abszorpciós viszonyok és a metabolikus, illetve szöveti eloszlás lehetőségei. Korábbi toxicitási és toxikokinetikai vizsgálatokból a toxikokinetikai paraméterekre vonatkozóan is rendelkezésre állhatnak kiegészítő információk.

A vizsgálatot egy olyan analitikai módszer kifejlesztésének kell megelőznie, amellyel a vizsgált anyag (és ahol lehet, főbb szennyezői) mind mennyiségileg, mind pedig minőségileg meghatározható az adagolási közegben és a biológiai anyagban.

Kísérleti állatok: a faj és a törzs kiválasztása

Mivel az állatokat élettartamuk egy jelentős részében kezelni akarjuk, a vizsgálatokhoz általában könnyen tartható és viszonylag rövid életű kísérleti fajokat szoktak választani. Igen kívánatos, hogy a kísérleti törzsnél – hasonló körülmények között történő tartás esetén – a spontán megbetegedések és daganatok előfordulásának gyakorisága ismert legyen.

A felhasznált törzsek legyenek jól ismertek és veleszületett rendellenességektől mentesek. A beltenyésztett törzsek és az F1 jelzésű hibridek használata ebből a szempontból jár némi előnnyel, ám ha elegendő mennyiségű háttéradat áll rendelkezésre a nem beltenyésztett törzsekről, és ha az állatok egymással közeli kapcsolatban álló állományokból származnak, akkor ez utóbbiak is elfogadhatóak.

Az állatok tartása, étrendje és vízellátása

Az állatkísérleteket és vizsgálatokat a nemzeti jogszabályoknak megfelelően kell végezni, és figyelembe kell venni a humánus megfontolásokat, valamint az állatvédelem területén bekövetkezett nemzetközi fejlődést is.

A környezeti körülmények szigorú ellenőrzése és a helyes állatgondozási technika elengedhetetlen ahhoz, hogy értelmezhető eredmények szülessenek. Az ismételt adagolással végzett vizsgálatok eredményeit nagymértékben befolyásolhatják az olyan tényezők, mint a tartási körülmények, az inkurrens betegségek, a gyógyszeres kezelés, a levegő, a víz, a takarmány, illetve az alom szennyezettsége és az állattartó létesítmény általános körülményei. Általános szabály, hogy ismerni kell a kémiai sterilizálóknak a vizsgálatra gyakorolt hatását is.

Az állatok étrendjének meg kell felelnie a szóban forgó állatfaj táplálkozási követelményeinek, és az ételben nem lehet olyan szennyeződés, amely befolyásolhatja a vizsgálat végeredményét. A rágcsálókat ad libitum kell takarmányozni és itatni, az élelmet legalább hetente egyszer cserélve. Jelenleg háromféle takarmányozási módszer használatos: a hagyományos, a szintetikus és a különféle speciális összetételű étrendek.

Bármelyiket is választjuk, a beszállító köteles időről időre ellenőrizni az alaptakarmány tápértékét és a benne található szennyezettség szintjét, és minden adag leszállításakor ezen információt a laboratórium tudomására hozza. Az alkalmazott étrend hatásának az anyagcserére, a daganatképződésre, valamint az állatok élettartamára vonatkozóan ismertnek kell lennie.

Az alaptakarmányt a kísérleti laboratórium is megvizsgálhatja mind az összetételre, mind a véletlenszerű szennyeződésekre nézve, beleértve a rákkeltő anyagokat is. Ha ez megtörtént, az elemzések eredményét meg kell őrizni, és csatolni kell minden egyes vizsgált anyagról készült záró vizsgálati jelentéshez.

Azon szokásos étrendi elemek, amelyekről tudjuk, hogy befolyásolják a daganatok képződését (például antioxidánsok, telítetlen zsírsavak, szelén), nem lehetnek káros mértékű koncentrációban jelen. Számos, a táplálékban általánosan előforduló szennyező anyagra a rákkeltő képesség meghatározását esetleg befolyásoló hatása miatt kiemelt figyelmet kell fordítani; ilyenek a peszticid-szermaradványok, a szerves klórvegyületek, a policiklikus aromás szénhidrogének, az ösztrogének, a nehézfémek, a nitrózaminok, valamint a mykotoxinok.

Ha a vizsgált anyagot vízzel vagy a takarmánnyal adják be, a stabilitási vizsgálatok elvégzése elengedhetetlen. Megfelelően elvégzett stabilitási és homogenitási vizsgálatokra van szükség az ismételt adagolású vizsgálatok elvégzését megelőzően, hogy megállapítható legyen a takarmánykészítés és a szükséges ellenőrzés gyakorisága.

Ha a takarmányt sterilizálásnak vetik alá, ismerni kell az eljárás hatását a vizsgált anyagra, valamint a táp összetevőire. Ha észlelhető ilyen jellegű befolyás, akkor el kell végezni a megfelelő módosításokat.

A karcinogenitás (a rákkeltő hatást vizsgáló) vizsgálatok során a vizsgálatot végzőknek tudniuk kell az ivóvízben esetlegesen jelen lévő szennyező anyagokról. Az emberi fogyasztásra engedélyezett víz legtöbb esetben megfelel; az összetételére vonatkozó információnak rendelkezésre kell állnia.

Előfordulhat, hogy a vizsgált anyag koncentrációját a takarmányban az állatok növekedésének megfelelően esetleg változtatni kell, hogy a testsúlyukhoz képest viszonylag állandó adagot kapjanak belőle.

A kontroll és a vizsgálati anyagot tartalmazó étrend tápértéke minél közelebb kell, hogy legyen egymáshoz. Ezért figyelembe kell venni a takarmányhoz kevert vizsgált anyag tápértékét is. A tapasztalat azt mutatja, hogy az alacsony tápértékű vizsgált anyagok 5 %-os arányig nem zavarják meg jelentősen a takarmány tápértékét.

1. Inhalációs vizsgálatok

Nincs határérték-vizsgálat, mert nem lehetséges egységes inhalációs expozíciós határértéket meghatározni.

2. Teratogenitási vizsgálat

A vizsgálati módszer alapvetően a szájon át történő adagoláson alapul. Ettől eltérő utakat is igénybe lehet venni a bejuttatáshoz, a vizsgált anyag fizikokémiai jellemzőitől és az emberi expozíció valószínű módjától függően. Ilyen esetekben a vizsgálati módszert a 28 napos vizsgálati módszer megfelelő elemeinek figyelembevételével kell átalakítani.

3. Toxikokinetikai vizsgálatok

A toxikokinetikai vizsgálatok a toxicitási adatok értelmezését és értékelését segítik elő. E vizsgálatok a vizsgált vegyi anyag toxicitásának sajátos aspektusait hivatottak megvilágítani, és eredményeik elősegíthetik a későbbi toxicitási vizsgálatok megtervezését. Azt, hogy minden esetben valamennyi paramétert meg kell-e határozni, nem lehet előre látni. Csak ritka esetben szükséges valamennyi toxikokinetikai vizsgálat (felszívódás, kiürülés, eloszlás, metabolizmus) elvégzése. Egyes vegyületeknél ajánlatos a vizsgálatok sorrendjét megváltoztatni vagy csupán egyetlen dózissal végezni a meghatározást.

Fogalommeghatározások

Toxikokinetika: | a vizsgált anyagok felszívódásának, kiürülésének, eloszlásának és metabolizmusának vizsgálata; |

Felszívódás: | az(ok) a folyamat(ok), amely(ek) révén a beadott anyag a szervezetbe kerül; |

Kiürülés: | az(ok) a folyamat(ok), amely(ek) révén a beadott anyag és/vagy annak bomlástermékei a szervezetből eltávoznak; |

Eloszlás: | az(ok) a folyamat(ok), amely(ek) révén a beadott anyag és/vagy annak bomlástermékei a szervezetben szétoszlanak; |

Metabolizmus: | az(ok) a folyamat(ok), amely(ek) révén a beadott anyagok a szervezetben enzimatikus vagy nem enzimatikus reakciók következtében szerkezetileg átalakulnak. |

4. Akut és szubakut vizsgálatok egy második kísérleti állatfaj esetében

Valamely második fajon végzett vizsgálat célja, hogy kiegészítse az első állatfajon végzett kísérlet eredményeiből levont következtetéseket.

A második fajon végzett vizsgálatok esetén a már ismertetett vizsgálati módszer alkalmazható vagy adaptálható kisebb számú állatra.

5. Fertilitási vizsgálatok

Ha háromgenerációs szaporodási vizsgálatra van szükség, a két nemzedékre vonatkozó szaporodási vizsgálatokkal kapcsolatosan leírt módszert ki lehet terjeszteni a harmadik nemzedékre is.

6. Mutagenitásvizsgálatok

Kiegészítő mutagenitási vizsgálatok a karcinogenitás szempontjából végzett szűrővizsgálatokat is beleértve

Az irányelv VIII. melléklete kiegészítő vizsgálatokat tartalmaz a mutagenitás további vizsgálatára, illetve a rákkeltő hatás előszűrésére. Az e szakaszban leírt módszerek általában mindkét szempont vizsgálatára alkalmasak.

Bevezetés

Valamely anyag mutagenitási vizsgálatának kiinduló mérése baktériumok génmutációit (pontmutáció) és emlőssejtek in vitro vagy in vivo citogenetikai károsodását kimutató próbákból áll; az ilyen alapvizsgálatokra alkalmas módszereket korábban már ismertettük. E szakasz olyan kiegészítő vizsgálatokat foglal magában, amelyek az alapvizsgálatok során kapott eredmények igazolására és/vagy kiterjesztésére alkalmasak, és amelyeket számos célból végezhetünk:

1. az alapvizsgálat eredményeinek megerősítése;

2. az alapvizsgálat során nem vizsgált végpontok kimutatása;

3. in vivo vizsgálatok kezdeményezése vagy kiterjesztése.

E célokból az ismertetett vizsgálatok mind in vitro, mind pedig in vivo eukarióta rendszereket, valamint biológiai végpontok egy szélesebb tartományát is tartalmazzák. A vizsgálatok információt nyújtanak az alapvizsgálatok során használt baktériumoknál összetettebb élő szervezetekben kialakuló pontmutációkról is, továbbá bővítik ismereteinket arról, hogy egy anyag milyen mértékben képes kromoszóma-rendellenességek kiváltására.

A pontmutáció és a kromoszómaaberráció mellett más, végpontok kimutatására alkalmas vizsgálatok is ismertetésre kerülnek. Ezek kiegészítő tájékoztatással szolgálnak, és szükség szerint felhasználhatók a vizsgálati programban.

Általános alapelv, hogy amennyiben további mutagenitási vizsgálatok programját mérlegeljük, azokat úgy kell megtervezni, hogy releváns kiegészítő információkat adjanak a vizsgált anyag esetleges mutagén és/vagy karcinogén hatásáról.

Az, hogy az adott körülmények között milyen vizsgálatok lehetnek ténylegesen megfelelőek, számos tényezőtől függ, beleértve az anyag fizikokémiai jellemzőit, az alap bakteriális és citogenetikai vizsgálatok eredményeit, az anyag metabolitikus jellemzőit, egyéb toxicitási vizsgálatok eredményeit és az anyag ismert felhasználási céljait. Nem helyes a vizsgálatok kiválasztási rendjét szigorúan előírni, tekintettel a figyelembe veendő tényezők sokféleségére. Ennek ellenére van néhány általános alapelv, amely útmutatásul szolgálhat. Ha valamely vizsgálat az alapvizsgálatoknál pozitív eredménnyel zárult, akkor a kiegészítő vizsgálatnak legalább egy olyan módszert magában kell foglalnia, amely ugyanazon genetikai végpont kimutatására képes. Ha az alapvizsgálat mindkét vizsgálata negatív volt, kiegészítésként szokásos esetben egy génmutációs és egy kromoszóma-rendellenesség kimutatására alkalmas vizsgálatot kell elvégezni. Helyénvaló lehet (az alábbiakban felsorolt) ún. indikátorvizsgálatokból további adatokat nyerni.

Az ilyen jellegű vizsgálati módszereket az alábbiakban fő genetikai végpontjuk alapján csoportosítottuk.

A gén- (pont) mutációk kimutatására alkalmas vizsgálatok

Annak további vizsgálatára, hogy egy adott anyag képes-e gén- (pont) mutációk kiváltására, az alábbi vizsgálatok valamelyike lehet alkalmas:

a) Eukarióta mikroorganizmusok (Saccharomyces cerevisiae) előre, illetve hátra haladó mutációs vizsgálata.

b) Előre/oda mutáció in vitro vizsgálata emlőssejtekben.

c) A Drosophila melanogaster nemhez kötött recesszív letális mutációjának kimutatási próbája.

d) In vivo testi sejt mutációvizsgálata: egérfolt- (spot) vizsgálat.

Kromoszóma-rendellenességek kimutatására irányuló vizsgálatok

Annak további vizsgálatára, hogy valamely anyag képes-e kromoszóma-rendellenességet kiváltani, az alábbi vizsgálatok valamelyike lehet alkalmas:

a) Emlősök in vivo citogenetikai vizsgálata

Csontvelősejtek in vivo metafáziselemzése jöhet szóba, ha azt a kezdeti vizsgálatok (alapvizsgálatok) részeként még nem végezték el. Ezenkívül az emlőscsírasejtek citogenetikai vizsgálata is elvégezhető;

b) In vitro citogenetikai vizsgálatok emlőssejtben, ha azokat a kezdeti vizsgálatok (alapvizsgálatok) részeként még nem végezték el;

c) Domináns letális mutációvizsgálatok rágcsálókon.

d) Örökölhető transzlokációs vizsgálat egéren.

A DNS-re gyakorolt hatás indikátoros vizsgálata

Rendelkezésünkre állnak olyan módszerek, amelyek a DNS-re gyakorolt hatásról adnak bizonyos információkat, de amelyek végpontja nem mutagén esemény. E vizsgálatok kiegészítésül szolgálhatnak a mutagenitási vizsgálatokkal kapott eredményekhez, és hasznosak lehetnek ezek értelmezésében. Ha az említett módszerekre van szükség, az alábbi módszerek valamelyike lehet megfelelő eukarióta mikroorganizmusok vagy emlőssejtek felhasználásával:

a) mitotikus rekombináció Saccharomyces cerevisiae-n;

b) DNS-károsodás és -reparáció – nem tervezett DNS-szintézis – emlőssejteken (in vitro);

c) In vitro testvérkromatid-kicserélődés emlőssejteken.

A rákkeltő potenciál megítélésének egyéb indikátoros vizsgálatai

Emlőssejt-transzformációs próbák is léteznek, amelyek az anyagnak azt a képességét mérik, hogy sejtkultúrában milyen mértékben változtatja meg azokat a morfológiai és funkcionális jellemzőket, amelyek in vivo valószínűleg a malignus transzformációban játszanak szerepet. Különböző típusú sejteket és transzformációs kritériumokat is fel lehet használni.

Emlősökre gyakorolt örökölhető hatások kockázatértékelése

Vannak olyan módszerek, amelyek a gén- (pont) mutációk (az egérspecifikus lokuszvizsgálat [1]), illetve kromoszóma-rendellenességek (az örökölhető transzlokációs vizsgálat egéren) következtében kialakuló örökölhető hatások vizsgálatára alkalmasak emlősállatokon. Ilyen módszereket akkor alkalmazhatunk, amikor meg akarjuk becsülni, mekkora esetleges genetikai veszélyt jelent valamely anyag az emberre. Az ilyen vizsgálatok meglehetős bonyolultsága és a szükséges állatlétszám nagysága miatt azonban – különösen a specifikus lokuszvizsgálat esetében – a vizsgálat elvégzése előtt annak szükségességét alaposan meg kell indokolni.

SZUBKRÓNIKUS ORÁLIS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

90 NAPOS, ISMÉTELT ORÁLIS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓ FAJOKON

1. MÓDSZER

1.1. Bevezetés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.2. Fogalommeghatározások

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.3. Referenciaanyagok

Nincsenek.

1.4. A vizsgálati módszer elve

A vizsgált anyagot naponta orálisan (szájon át), lépcsőzetesen emelkedő adagokban adjuk be több kísérleti állatcsoportnak, 90 napon keresztül. A vizsgálati időszak alatt az állatokat naponta kell vizsgálni a toxikus tünetek észlelése érdekében. A vizsgálat ideje alatt elpusztult állatokat fel kell boncolni, a vizsgálat lezárásakor pedig a túlélő állatokat is el kell pusztítani, és fel kell boncolni.

1.5. Minőségi követelmények

Nincsenek.

1.6. A vizsgálati módszer leírása

Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani.

A vizsgált anyagokat a táplálékkal, gyomorszondán át, kapszulában vagy ivóvízben lehet beadni. A vizsgált anyagokat valamennyi állatnak azonos módszerrel kell adagolni a vizsgálat teljes időtartama alatt. Ha az adagolás megkönnyítésére vivőanyagot vagy más adalékanyagot használunk, meg kell bizonyosodni arról, hogy azok nem rendelkeznek toxikus hatással. Ehhez szükség szerint korábbi vizsgálatokból származó adatokat is fel lehet használni.

Vizsgálati körülmények

A kísérlethez felhasznált állatok

Ha nincs ellenjavallat, patkányt kell kísérleti állatnak használni. Fiatal, egészséges, ivarérett, kísérleti célokra tenyésztett laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni, az adagolást pedig ideális esetben az állatok hathetes kora előtt kell megkezdeni, de nyolchetes koruknál semmiképpen sem később. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan térjen el egymástól, az átlagos értéktől maximum ± 20 %-kal különbözhet. Ha a szubkrónikus orális vizsgálatot valamely hosszan tartó vizsgálat előkísérleteként végezzük el, mindkét vizsgálathoz ugyanazon fajt, illetve kísérleti állattörzset kell felhasználni.

Az állatok száma és neme

Minden adagolási szinthez legalább 20 állatot (10 hímet és 10 nőstényt) kell felhasználni. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Ha időközi elpusztítást terveznek, akkor a létszámot annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése előtt el szándékoznak pusztítani. Ezenkívül még egy 20 fős (nemenként 10 állat) kísérő állatcsoportot is kezelhetünk a legnagyobb dózissal 90 napon át, amelynek állatain a kezelés után 28 nappal megfigyelhetjük a toxikus hatás visszafordíthatóságát, elhúzódó vagy késve fellépő voltát.

Dózisszintek

Legalább három dózisszintet és egy egyidejű kontrollt kell használni. A vizsgált anyaggal történő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lévő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati csoportok állataival. Olyan esetekben, amikor az adagolás megkönnyítésére vivőanyagot alkalmazunk, a kontrollcsoportot ugyanúgy kell a vivőanyaggal megetetni, mint a kezelt csoportokat, és ugyanannyi vivőanyagot kell kapniuk, mint a legnagyobb adaggal kezelt csoportnak. A legnagyobb adagot úgy kell kiválasztani, hogy annak hatására jelentkezzenek a toxicitás jelei, de elhullások lehetőleg ne, vagy csak minimális mértékben legyenek. A legkisebb adaggal kezelt csoportban nem lehetnek toxikus hatásra utaló jelek. Ha használható becslés áll rendelkezésre az emberi expozícióra vonatkozóan, a legkisebb adagnak ennél nagyobbnak kell lennie. Kedvező esetben a középső adaggal kezelt csoportnál minimális toxikus hatás észlelhető. Ha egynél több közbeeső dózist alkalmazunk, akkor azokat úgy kell kiválasztani, hogy fokozódó toxikus hatást váltsanak ki.

Az alacsony és közbeeső dózisú, illetve a kontrollcsoportban az elpusztult állatok száma minimális legyen, hogy az eredmények értelmezhető értékelése lehetséges legyen.

Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal adják be, annak vagy állandó legyen a koncentrációja a tápban (ppm vagy mg/kg, a takarmányra számítva), vagy az állat testsúlyára számított állandó adagot kell használni; az e módszertől való eltérést meg kell indokolni. A gyomorszondán át beadott anyag napi adagját mindennap ugyanabban az időben kell beadni. Az adagokat rendszeres időközönként (hetente vagy kéthetente) ismételten be kell állítani, hogy az állatok testsúlyához viszonyított mennyiséget fenn lehessen tartani.

Határérték-vizsgálat

Ha a fentebb ismertetett módszer szerint elvégzett, 90 napos vizsgálat napi 1000 mg/testsúlykilogramm vagy – ha a lehetséges emberi expozíció mértéke ismert – ennél magasabb dózisban semmilyen toxikus hatást nem vált ki, a további vizsgálatok szükségtelennek tekinthetők. Alacsony toxicitású anyagoknál fontos biztosítani, hogy – ha azokat a takarmánnyal adják be – sem a vizsgált anyag adagolt mennyisége, sem más tulajdonságai nem befolyásolják a rendes táplálkozási feltételeket.

Megfigyelési időszak

Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni, és a toxikus hatások megjelenését, súlyosságát és időtartamát rögzíteni kell. Fel kell jegyezni az elpusztulás időpontját és azt az időpontot, amikor a toxikus hatások jelei mutatkozni kezdenek, illetve elmúlnak.

A kísérlet végrehajtása

Ideális esetben a vizsgált anyagot heti hét alkalommal kell az állatoknak beadni, 90 napon keresztül. A kísérő csoportokban a nyomon követő megfigyelésekre kiválasztott állatokat további 28 napig kell tartani kezelés nélkül, hogy a toxikus hatás visszafordíthatóságát, illetve elhúzódását ki lehessen mutatni.

A ketrecben tartott állatok megfigyelésekor a bőr- és szőrelváltozásokra, a szemek és a nyálkahártyák változásaira, a légzési, a keringési rendszerre, az autonóm és a központi idegrendszer működésére, a szomatomotoros tevékenységekre, valamint a viselkedési mintákra kell figyelemmel lenni. Hetente mérni kell a takarmányfogyasztást (és a vízfogyasztást is, ha a vizsgált anyagot az ivóvízzel adagoljuk), valamint az állatok súlyát.

Az állatok rendszeres megfigyelésére azért van szükség, hogy megelőzhető legyen a kísérleti állatok kannibalizmus, szöveti autolízis, illetve rossz elhelyezés következtében történő elhullása. A vizsgálati időszak végeztével a kísérő csoportban lévő állatok kivételével minden túlélő állatot fel kell boncolni. A haldokló állatokat eltávolításuk után el kell pusztítani, és fel kell boncolni.

Az alábbi vizsgálatokat rendszeresen el kell végezni az összes állaton, beleértve a kontrollcsoport egyedeit is:

a) Lehetőleg minden állatot, de legalább a legnagyobb adaggal kezelt és a kontrollcsoportban lévő állatokat szemvizsgálatnak kell alávetni szemtükör vagy ezzel egyenértékű, megfelelő készülék segítségével az expozíciót megelőzően és a vizsgálat végeztével. Ha a szemen elváltozás észlelhető, akkor minden állatot meg kell vizsgálni.

b) A vizsgálati időszak végén hematológiai vizsgálatokat kell végezni: a hematokrit értéket, a hemoglobin-koncentrációt, a vörösvértestszámot, teljes és a minőségi fehérvérsejtszámot, az alvadási képességet, beleértve az alvadási időt, a protrombin időt, a tromboplasztin időt, illetve a trombocitaszámot kell mérni.

c) A vizsgálati időszak végeztével a vérmintákat klinikai-kémiai vizsgálatoknak is alá kell vetni. Fontos megvizsgálni az elektrolit-egyensúlyt, a szénhidrát-anyagcserét, a máj-, illetve a vesefunkciót. Az egyes vizsgálatok kiválasztását a vizsgált anyag hatásmechanizmusával kapcsolatos megfigyelések befolyásolják. Javasolt meghatározni: a kalcium, a foszfor, a klorid, a nátrium, a kálium szintjét, éhgyomorra kell mérni a glükózszintet (az adott fajra jellemző és megfelelő éheztetési idő után); a szérum glutaminsav szőlősav transzamináz (GPT) [2], a szérum glutaminsav oxálsav transzamináz (GOT) [3], az ornitin dekarboxiláz, a gamma glutamil-transzpeptidáz, a karbamid nitrogén, az albumin, a kreatinin, az összes bilirubin és az összes szérumfehérje szintjét szintén meg kell határozni. További meghatározások, amelyekre a pontos toxicitás értékeléséhez még szükség lehet: lipid-elemzés, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin és a kolineszteráz-aktivitás mérése. Ahol a megfigyelt hatások vizsgálatának kiterjesztéséhez szükséges, további klinikai-kémiai vizsgálatokat is lehet végezni.

d) Vizeletelemzésre általában nincs szükség, csak akkor, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás ezt indokolja.

Ha a korábbi kísérletekből származó adatok nem megfelelőek, mérlegelendő a hematológiai és klinikai-kémiai paraméterek meghatározása az adagolás megkezdése előtt.

Autopszia

Minden állaton teljes körű makroszkópos boncolást kell végezni, amely a test külső felületének, a testnyílásoknak, valamint a koponya-, mell- és hasüregnek, illetve a bennük található szerveknek a feltárásából és vizsgálatából áll. A májat, a veséket, a mellékveséket és a heréket a kimetszés után minél előbb még nedvesen le kell mérni, a kiszáradás elkerülése miatt.

Az alábbi szerveket kell megfelelő közegben tartósan tárolni egy esetleges későbbi kórszövettani vizsgálat céljaira: valamennyi olyan szerv, amelyen makroszkopikus elváltozás található, az agy – beleértve a nyúltagy, a híd, a kisagykéreg, a nagyagykéreg és az agyalapi mirigy metszeteit, a pajzsmirigy és a mellékpajzsmirigy, bármilyen jelenlevő csecsemőmirigy, a légcső és a tüdő, a szív, az aorta, (a nyálmirigyek), a máj, a lép, a vesék, a mellékvesék, a hasnyálmirigy, az ivarmirigyek, a méh, (a járulékos nemi szervek), (a bőr), a nyelőcső, a gyomor, a patkóbél, az éhbél, a csípőbél, a vakbél, a vastagbél, a végbél, a húgyhólyag, a reprezentatív nyirokcsomók, (a női emlőmirigy), (a combizomzat), a perifériás idegek, a szegycsont a csontvelővel, (a szemek), (a combcsont az ízületi felülettel együtt), (a gerincoszlop három szinten – nyaki, mellkasközéptáji és ágyéki csigolyáknál) és az extraordinális könnymirigy. A zárójelben említett szöveteket csak akkor kell megvizsgálni, ha célszervként szerepelnek, illetve ha a toxicitás tünetei ezt indokolják.

Kórszövettani vizsgálatok

a) Teljes körű kórszövettani vizsgálatot kell végezni a kontrollcsoport és a legnagyobb adaggal kezelt csoport állatainak szervein és szövetein.

b) Az összes olyan szervet, amelyen makroszkopikus elváltozás található, meg kell vizsgálni.

c) A többi dóziscsoport állatainak célszerveit is meg kell vizsgálni.

d) A legkisebb, illetve közepes dózissal kezelt csoportok állatainak tüdejét kórszövettani vizsgálatnak kell alávetni a fertőzés jeleit keresve, ez ugyanis az állat egészségi állapotának alkalmas értékelésére szolgál. E csoportoknál a máj és a vese kórszövettani vizsgálatát is meg kell fontolni. E csoportok állatainál további kórszövettani vizsgálatokra rutinszerűen nincs szükség, de minden esetben vizsgálatokat kell végezni az olyan szerveken, amelyek az elváltozás jeleit mutatták a legnagyobb dózissal kezelt csoportban.

e) Ha kísérő csoportot is használunk, azokon a szöveteken és szerveken, amelyek a kezelt csoportokban elváltozásokat mutattak, itt is el kell végezni a kórszövettani vizsgálatokat.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások egyes típusait; illetve az elváltozást mutató állatok százalékos arányát. Az eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.

3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

- használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, étrend,

- vizsgálati körülmények,

- adagolás (beleértve a vivőanyagot is, ha van) és koncentrációk,

- a toxikus reakciók nemenként és dózisonként,

- lehetőség szerint az a szint, amikor még nincs toxikus hatás,

- az elpusztulás ideje a vizsgálat során, illetve, hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét,

- a toxikus és más hatások leírása,

- az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének időpontja és a megfigyelést követő változásuk,

- a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos adatok,

- szemészeti leletek,

- az elvégzett hematológiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye,

- az elvégzett klinikai-kémiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye (beleértve az esetleges vizeletelemzés eredményeit is),

- boncolási leletek,

- a kórszövettani vizsgálatok eredményének részletes ismertetése,

- az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,

- az eredmények megvitatása,

- az eredmények értelmezése.

3.2. Értékelés és értelmezés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

SZUBKRÓNIKUS ORÁLIS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

90 NAPOS, ISMÉTELT ORÁLIS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT NEM RÁGCSÁLÓ FAJOKON

1. MÓDSZER

1.1. Bevezetés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.2 Fogalommeghatározások

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.3. Referenciaanyagok

Nincsenek.

1.4. A vizsgálati módszer elve

A vizsgált anyagot naponta orálisan (szájon át), fokozatos adagokban adjuk be több kísérleti állatcsoportnak (nem rágcsálóknak), 90 napon keresztül. A vizsgálati időszak alatt az állatokat naponta kell vizsgálni a mérgezés jeleinek észlelése érdekében. A vizsgálat ideje alatt elpusztult állatokat is el kell pusztítani, és fel kell boncolni, a vizsgálat lezárásakor pedig a túlélő állatokat is fel kell boncolni.

1.5. Minőségi követelmények

Nincsenek.

1.6. A vizsgálati módszer leírása

Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani.

A vizsgált anyagokat a táplálékkal vagy kapszulában lehet beadni. Más adagolási módszerek is elfogadhatók. A vizsgált anyagokat valamennyi állatnak azonos módszerrel kell adagolni a vizsgálat teljes időtartama alatt. Ha az adagolás megkönnyítésére vivőanyagot vagy más adalékanyagot használunk, meg kell bizonyosodni arról, hogy azok nem rendelkeznek toxikus hatással. Ehhez szükség szerint korábbi vizsgálatokból származó adatokat is fel lehet használni.

Vizsgálati körülmények

A kísérlethez falhasznált állatok

A leggyakrabban használt nem rágcsáló kísérleti állatfaj a kutya, lehetőség szerint egy meghatározott fajta. Más nem rágcsáló faj is használható. Egészséges és fiatal állatokat kell használni – kutya esetében az életkor az adagolás megkezdésekor négy–hat hónap között legyen, de kilenc hónapnál semmiképpen sem lehetnek idősebbek. Ha a szubkrónikus orális vizsgálatot valamely hosszú távú vizsgálat előzményeként végezzük, mindkét vizsgálathoz ugyanazon fajt, illetve kísérleti állattörzset kell felhasználni.

Az állatok száma és neme

Minden adagolási szinthez legalább nyolc állatot (négy hímet és négy nőstényt) kell felhasználni. A vizsgálat végén megmaradó állatok számának elegendőnek kell lennie a toxikus hatások értelmezhető értékeléséhez.

Adagolási szintek (dózisok)

Legalább három adagolási szintet (dózist) és egy kontrollt kell használni. A vizsgált anyaggal történő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lévő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati csoportok állataival. A legnagyobb adagot úgy kell kiválasztani, hogy annak hatására jelentkezzenek a toxicitás jelei, de elhullások ne legyenek. A legkisebb adaggal kezelt csoportban nem lehetnek a toxicitásra utaló jelek. Ha használható becslés áll rendelkezésre az emberi expozícióra vonatkozóan, a legkisebb adagnak ennél nagyobbnak kell lennie. Kedvező esetben a középső adaggal kezelt csoportnál minimális toxikus hatás észlelhető. Ha egynél több közbeeső dózist alkalmazunk, akkor azokat úgy kell kiválasztani, hogy fokozódó toxikus hatást váltsanak ki.

A legalacsonyabb és a közepes adaggal kezelt csoportban, valamint a kontrollcsoportban lehetőleg ne pusztuljanak el az állatok.

Alacsony toxicitású anyagoknál fontos annak biztosítása, hogy ha azt a takarmánnyal adjuk be, a vizsgált anyag alkalmazott mennyisége ne zavarja meg a normális táplálkozást.

Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal adjuk be, annak vagy állandó legyen a koncentrációja a tápban (ppm vagy mg/kg, a takarmányra számítva), vagy az állat testsúlyára számított állandó adagot használjunk; az e módszertől való eltérést meg kell indokolni.

Amennyiben az anyagot közvetlenül, pl. egy kapszulában adjuk be, akkor annak mindennap ugyanabban az időben kell megtörténnie. Az adagokat hetente ismételten be kell állítani, hogy az állatok testsúlyához viszonyított mennyiséget fenn lehessen tartani. Ha a szubkrónikus vizsgálatot valamely hosszú távú vizsgálat előzményeként végzik, akkor mindkét vizsgálathoz hasonló étrendet kell alkalmazni.

Határérték-vizsgálat

Ha a fentebb ismertetett módszer szerint elvégzett, 90 napos vizsgálat napi 1000 mg/testsúlykilogramm vagy – ha a lehetséges emberi expozíció mértéke ismert – ennél magasabb dózisban semmilyen toxikus hatást nem vált ki, a további vizsgálatok szükségtelennek tekinthetők. Alacsony toxicitású anyagoknál fontos biztosítani, hogy – ha azokat a takarmánnyal adják be – se a vizsgált anyag adagolt mennyisége, se más tulajdonságai ne befolyásolják a rendes táplálkozási feltételeket.

Megfigyelési időszak

Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni, és a toxikus hatások megjelenését, súlyosságát és időtartamát rögzíteni kell. Fel kell jegyezni az elpusztulás időpontját és azt az időpontot, amikor a toxikus hatások jelei mutatkozni kezdenek, illetve elmúlnak.

A kísérlet végrehajtása

Ideális esetben a vizsgált anyagot heti hét alkalommal kell az állatoknak beadni, 90 napon keresztül. Ha azonban az anyagot elsősorban gyakorlati megfontolások miatt nem a takarmánnyal adjuk be, a heti öt napon át tartó adagolás is elfogadhatónak tekinthető.

Az állatok megfigyelése kiterjed, de nem korlátozódik a bőr- és szőrelváltozásokra, a szemek és a nyálkahártyák változásaira, valamint a légzési, a keringési rendszerre, az autonóm és a központi idegrendszer működésére, a szomatomotoros tevékenységekre, valamint a viselkedési mintákra. Hetente mérni kell a takarmányfogyasztást (és a vízfogyasztást is, ha a vizsgált anyagot az ivóvízzel adagoljuk), valamint az állatok súlyát.

Alapos klinikai vizsgálatokat kell naponta az állatokon elvégezni, valamint meg kell tenni a megfelelő óvintézkedéseket azért, hogy a kísérleti állatok vizsgálat során történő elpusztulását a lehető legkisebbre csökkentsük. Az expozíciós időszak végeztével minden túlélő állatot fel kell boncolni. A haldokló állatokat eltávolításuk után el kell pusztítani, és fel kell boncolni.

Az alábbi vizsgálatokat rendszeresen el kell végezni az összes állaton, beleértve a kontrollcsoport egyedeit is:

a) Lehetőleg minden állatot, de legalább a legnagyobb adaggal kezelt és a kontrollcsoportban lévő állatokat szemvizsgálatnak kell alávetni szemtükör vagy ezzel egyenértékű, megfelelő készülék segítségével a vizsgált anyag beadása előtt és a vizsgálat végeztével. Ha a szemen elváltozás észlelhető, akkor minden állatot meg kell vizsgálni.

b) A hematológiai vizsgálat részeként a vizsgálati időszak kezdetén, azt követően vagy havi rendszerességgel, vagy a vizsgálati idő felének leteltét követően, majd a vizsgálat lezárásakor mérni kell a hematokrit-értéket, a hemoglobin-koncentrációt, a vörösvértestszámot, a minőségi- és a teljes fehérvérsejtszámot, az alvadási képességet, beleértve az alvadási időt, a protrombin időt, a tromboplasztin időt, illetve a trombocitaszámot.

c) A vizsgálati időszak kezdetén, azt követően vagy havi rendszerességgel, vagy a vizsgálati idő felének leteltét követően, majd a vizsgálat lezárásakor a vérmintákat klinikai kémiai vizsgálatoknak is alá kell vetni. A következő vizsgálatokat kell elvégezni: elektrolit-egyensúly, szénhidrát-anyagcsere, máj-, illetve vesefunkció vizsgálata. Az egyes vizsgálatok kiválasztását a vizsgált anyag hatásmechanizmusával kapcsolatos megfigyelések befolyásolják. Javasolt meghatározni: a kalcium, a foszfor, a klorid, a nátrium, a kálium szintjét, éhgyomorra kell mérni a glükóz szintjét (az adott fajra jellemző és megfelelő éheztetési idő után), a szérum glutaminsav szőlősav transzamináz (GPT) [4], a aszérum glutaminsav oxálsav transzamináz (GOT) [5], az ornitin dekarboxiláz, a gamma glutamil-transzpeptidáz, a karbamid nitrogén, az albumin, a kreatinin, az összes bilirubin és az összes szérumfehérje szintjét szintén meg kell határozni. További meghatározások, amelyekre a pontos toxicitásértékeléshez még szükség lehet: lipidelemzés, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin és kolineszteráz-aktivitás mérése. Ahol a megfigyelt hatások vizsgálatának kiterjesztéséhez szükséges, további klinikai-kémiai vizsgálatokat is lehet végezni. A nem rágcsáló fajokat a vérvétel előtt bizonyos ideig (24 óránál nem tovább) éheztetni kell.

d) Vizeletelemzésre általában nincs szükség, csak akkor, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás ezt indokolja.

Autopszia

Minden állaton teljes körű makroszkópos boncolást kell végezni, amely a test külső felületének, a testnyílásoknak, valamint a koponya-, mell- és hasüregnek, illetve a bennük található szerveknek a feltárásából és vizsgálatából áll. A májat, a veséket, a mellékveséket és a heréket a kimetszés után minél előbb még nedvesen le kell mérni, a kiszáradás elkerülése miatt.

Az alábbi szerveket kell megfelelő közegben tartósan tárolni egy esetleges későbbi kórszövettani vizsgálat céljaira: valamennyi olyan szerv, amelyen makroszkópikus elváltozás található, az agy – beleértve a nyúltagy, a híd, a kisagykéreg, a nagyagykéreg és az agyalapi mirigy metszeteit, a pajzsmirigy és a mellékpajzsmirigy, bármilyen jelenlevő csecsemőmirigy, (légcső) és a tüdő, a szív, az aorta, a nyálmirigyek, a máj, a lép, a vesék, a mellékvesék, a hasnyálmirigy, az ivarmirigyek, a méh, (a járulékos nemi szervek), (a bőr), az epehólyag, a nyelőcső, a gyomor, a patkóbél, az éhbél, a csípőbél, a vakbél, a vastagbél, a végbél, a húgyhólyag, a reprezentatív nyirokcsomók, (a női emlőmirigy), (a combizomzat), a perifériás idegek, a szegycsont a csontvelővel, (a szemek), (a combcsont az ízületi felülettel együtt), (a gerincoszlop három szinten – nyaki, mellkasközéptáji és ágyéki csigolyáknál) és az extraordinális könnymirigy. A zárójelben említett szöveteket csak akkor kell megvizsgálni, ha célszervként szerepelnek, illetve ha a toxicitás tünetei ezt indokolják.

Kórszövettani vizsgálatok

Teljes körű kórszövettani vizsgálatot kell végezni a kontrollcsoport és a legnagyobb adaggal kezelt csoport állatainak szervein és szövetein. A többi csoportban további kórszövettani vizsgálat azokon a szerveken szükséges, amelyek a legnagyobb adaggal kezelt csoportokban elváltozásokat mutattak, illetve amelyek esetében a klinikai megfigyelések ennek szükségességét jelzik.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások egyes típusait, illetve az elváltozást mutató állatok százalékos arányát. Az eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.

3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

- használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, étrend,

- vizsgálati körülmények,

- adagolás (beleértve a vivőanyagot is, ha van) és koncentrációk,

- a toxikus reakciók nemenként és dózisonként,

- lehetőség szerint az a szint, amikor még nincs toxikus hatás,

- az elpusztulás ideje a vizsgálat során, illetve, hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét,

- a toxikus és más hatások leírása (különös tekintettel a klinikai leletekre),

- az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének időpontja és a megfigyelést követő változásuk,

- a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos adatok,

- szemészeti leletek,

- az elvégzett hematológiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye,

- az elvégzett klinikai-kémiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye (beleértve az esetleges vizeletelemzés eredményeit is),

- boncolási leletek,

- a kórszövettani vizsgálatok eredményének részletes ismertetése,

- az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,

- az eredmények megvitatása,

- az eredmények értelmezése.

3.2. Értékelés és értelmezés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

SZUBKRÓNIKUS DERMÁLIS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

90 NAPOS, ISMÉTELT DERMÁLIS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓ FAJOKON

1. MÓDSZER

1.1. Bevezetés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.2. Fogalommeghatározások

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.3. Referenciaanyagok

Nincsenek.

1.4. A vizsgálati módszer elve

A vizsgált anyagot naponta a bőrre adagoljuk, fokozatosan növekvő dózisokban több kísérleti állatcsoportnak, 90 napon keresztül. A vizsgálati időszak alatt az állatokat naponta kell vizsgálni a mérgezés jeleinek észlelése érdekében. A vizsgálat ideje alatt elpusztult állatokat fel kell boncolni, a vizsgálat lezárásakor pedig a túlélő állatokat is el kell pusztítani, és fel kell boncolni.

1.5. Minőségi követelmények

Nincsenek.

1.6. A vizsgálati módszer leírása

Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat tartási és táplálási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani. A vizsgálat megkezdése előtt nem sokkal a törzs háti felületén le kell nyírni az állatok szőrét. Borotválni is lehet, de azt a vizsgálat megkezdése előtt megközelítőleg 24 órával kell elvégezni. A vizsgálat során általában ismételt nyírás és borotválás szükséges, rendszerint heti időközönként. A nyírás vagy borotválás során gondosan ügyelni kell arra, hogy a bőrt ne sértsük meg. A testfelület legalább 10 %-át szabaddá kell tenni a vizsgált anyag alkalmazásához. Az állat testsúlyát is tekintetbe kell venni, amikor a megtisztítandó felületről, illetve a fedőkötés méretéről döntünk. Ha szilárd anyagot vizsgálunk, amelyet adott esetben porítani is lehet, az anyagot vízzel kellően át kell nedvesíteni, vagy szükség esetén vivőanyagot kell alkalmazni annak biztosítására, hogy a bőrrel megfelelő módon érintkezzen. A folyékony vizsgálati anyagokat rendszerint hígítás nélkül kell adagolni. Az adagolás heti öt-hét alkalommal történik.

Vizsgálati körülmények

A kísérlethez felhasznált állatok

Kifejlett patkány, nyúl vagy tengerimalac használható. Más faj is használható, de azok használatát meg kell indokolni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan térjen el egymástól, az átlagos értéktől maximum ± 20 %-kal különbözhet. Ha a szubkrónikus dermális vizsgálatot valamely hosszú távú vizsgálat előzetes vizsgálataként végezzük, mindkét vizsgálathoz ugyanazon fajt, illetve kísérleti állattörzset kell felhasználni.

Az állatok száma és neme

Minden adagolási szinthez legalább 20 egészséges bőrű állatot (10 hímet és 10 nőstényt) kell felhasználni. A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Ha időközi elpusztítást tervezünk, akkor a létszámot annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése előtt el akarunk pusztítani. Ezenkívül még egy 20 fős (nemenként 10 állat) kísérő állatcsoportot is kezelhetünk a legnagyobb adaggal 90 napon át, amelyeknek állatain a kezelés után 28 nappal megfigyelhetjük a toxikus hatás visszafordíthatóságát, elhúzódó vagy késve fellépő voltát.

Adagolási szintek (dózisok)

Legalább három adagolási szintet (dózist) és egy kontrollt kell használni, illetve egy vivőanyagkontrollt, ha van vivőanyag. Az expozíciós idő legalább napi hat óra legyen. A vizsgált anyagot mindennap hasonló időpontban kell alkalmazni, az alkalmazott mennyiséget pedig meghatározott időközönként (hetente vagy kéthetente) hozzá kell igazítani az állatok növekedéséhez, hogy az állatok testsúlyához viszonyított mennyiséget fenn lehessen tartani. A vizsgált anyaggal történő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lévő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati csoportok állataival. Olyan esetekben, amikor az adagolás megkönnyítésére vivőanyagot alkalmazunk, a kontrollcsoportot ugyanúgy kell a vivőanyaggal kezelni, mint a kezelt csoportokat, és ugyanannyi vivőanyagot kell kapniuk, mint a legnagyobb adaggal kezelt csoportnak. A legnagyobb adagot úgy kell kiválasztani, hogy abban jelentkeznie kell a toxikus hatásnak, de elhullások lehetőleg ne, vagy csak minimális mértékben legyenek. A legkisebb adaggal kezelt csoportban nem lehetnek a toxicitásra utaló jelek. Ha használható becslés áll rendelkezésre az emberi expozícióra vonatkozóan, a legkisebb adagnak ennél nagyobbnak kell lennie. Kedvező esetben a középső adaggal kezelt csoportnál minimális toxikus hatás észlelhető. Ha egynél több közbeeső dózist alkalmazunk, akkor azokat úgy kell kiválasztani, hogy fokozódó toxikus hatást váltsanak ki. Az alacsony és közbeeső dózisú, illetve a kontrollcsoportban az elpusztult állatok száma minimális legyen, hogy az eredmények értelmezhető értékelése lehetséges legyen.

Ha a vizsgált anyag alkalmazása súlyos bőrirritációt okoz, a koncentrációt csökkenteni kell, ami az egyéb toxikus hatások mértékének csökkenésével vagy eltűnésével járhat a legnagyobb adaggal kezelt csoportban. Ha a bőr súlyosan károsodott, szükségessé válhat a vizsgálat leállítása és egy új vizsgálat megkezdése kisebb koncentrációk mellett.

Határérték-vizsgálat

Ha az előzetes vizsgálat során napi 1000 mg/testsúlykilogrammal adagolt vizsgált anyag vagy – ha a lehetséges emberi expozíció mértéke ismert – ennél magasabb dózis semmilyen toxikus hatást nem vált ki, a további vizsgálatok szükségtelennek tekinthetők.

Megfigyelési időszak

Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni a toxikus hatások megjelenésének észlelése érdekében. Fel kell jegyezni az elpusztulás időpontját, valamint azt az időpontot, amikor a toxikus hatás jelei mutatkozni kezdenek, illetve elmúlnak.

A kísérlet végrehajtása

Az állatokat egyesével kell a ketrecekben elhelyezni. Ideális esetben a vizsgált anyagot heti hét alkalommal kell az állatoknak beadni, 90 napon keresztül.

A kísérő csoportokban a nyomon követő megfigyelésekre kiválasztott állatokat további 28 napig kell tartani kezelés nélkül, hogy a toxikus hatás visszafordíthatóságát, illetve elhúzódását ki lehessen mutatni. Az anyaggal való érintkezés ideje napi hat óra.

A vizsgált anyagot a testfelület megközelítőleg 10 %-át kitevő felületen egyenletesen elosztva kell felvinni az állat bőrére. Erősen mérgező anyagoknál a felület lehet ennél kisebb, de a felület lehető legnagyobb részét a lehető legvékonyabb és legegyenletesebb bevonattal kell ellátni.

Az expozíció ideje alatt a vizsgált anyagot a bőrrel egy lyukacsos gézlap segítségével és nem irritáló ragasztószalaggal kell érintkezésben tartani. A vizsgált területet megfelelő módon be kell fedni azért, hogy megmaradjon rajta a vizsgált anyag és a gézkötés, és az állatok ne nyalhassák le a vizsgált anyagot. Mozgásgátló szerkezeteket lehet használni annak megakadályozására, hogy az állat a vizsgált anyagot lenyelje, de a teljes immobilizáció mint módszer nem javasolt.

Az expozíciós idő leteltével a maradék vizsgált anyagot lehetőség szerint el kell távolítani a bőr felületének vízzel vagy más megfelelő módon történő megtisztítása útján.

Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni, és a toxikus hatások megjelenését, súlyosságát és időtartamát rögzíteni kell. A ketrecben tartott állatok megfigyelésekor a bőr- és szőrelváltozásokra, a szemek és a nyálkahártyák változásaira, valamint a légzési, a keringési rendszerre, az autonóm és a központi idegrendszer működésére, a szomatomotoros tevékenységekre, valamint a viselkedési mintákra kell figyelemmel lenni. Hetente mérni kell a takarmányfogyasztást, valamint az állatok súlyát. Az állatok rendszeres megfigyelésére azért van szükség, hogy megelőzzük a kísérleti állatok kannibalizmus, szöveti autolízis, illetve rossz elhelyezés következtében történő elhullását. A vizsgálati időszak végeztével a kísérő csoportban lévő állatok kivételével minden túlélő állatot fel kell boncolni. A haldokló állatokat eltávolításuk után el kell pusztítani, és fel kell boncolni.

Az alábbi vizsgálatokat rendszeresen el kell végezni az összes állaton, beleértve a kontrollcsoport egyedeit is:

a) Lehetőleg minden állatot, de legalább a legnagyobb adaggal kezelt és a kontrollcsoportban lévő állatokat szemvizsgálatnak kell alávetni szemtükör vagy ezzel egyenértékű, megfelelő készülék segítségével az expozíciót megelőzően és a vizsgálat végeztével. Ha a szemen elváltozás észlelhető, akkor minden állatot meg kell vizsgálni.

b) A hematológiai vizsgálat részeként a vizsgálati időszak végeztével mérni kell a hematokrit-értéket, a hemoglobin-koncentrációt, a vörösvértestszámot, a minőségi- és a teljes fehérvérsejtszámot, az alvadási képességet, beleértve az alvadási időt, a protrombin időt, a tromboplasztin időt, illetve a trombocitaszámot.

c) A vizsgálati időszak végeztével a vérmintákat klinikai-kémiai vizsgálatoknak is alá kell vetni. Fontos megvizsgálni az elektrolit-egyensúlyt, a szénhidrát-anyagcserét, a máj-, illetve a vesefunkciót. Az egyes vizsgálatok kiválasztását a vizsgált anyag hatásmechanizmusával kapcsolatos megfigyelések befolyásolják. Javasolt meghatározni: a kalcium, a foszfor, a klorid, a nátrium, a kálium szintjét, éhgyomorra kell mérni a glükózszintet (az adott fajra jellemző és megfelelő éheztetési idő után), a szérum glutaminsav szőlősav transzamináz (GPT) [6], a szérum glutaminsav oxálsav transzamináz (GOT) [7], az ornitin dekarboxiláz, a gamma glutamil-transzpeptidáz, a karbamid nitrogén, az albumin, a kreatinin, az összes bilirubin és az összes szérumfehérje szintjét szintén meg kell határozni. További meghatározások, amelyekre a pontos toxicitás értékeléséhez még szükség lehet: lipidelemzés, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin- és kolineszteráz-aktivitás mérése.

Ahol a megfigyelt hatások vizsgálatának kiterjesztéséhez szükséges, további klinikai-kémiai vizsgálatokat is lehet végezni.

d) Vizeletelemzésre általában nincs szükség, csak akkor, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás ezt indokolja.

Ha a korábbi kísérletekből származó adatok nem megfelelőek, mérlegelendő a hematológiai és klinikai-kémiai paraméterek meghatározása az adagolás megkezdése előtt.

Autopszia

Minden állaton teljes körű makroszkópos boncolást kell végezni, amely a test külső felületének, a testnyílásoknak, valamint a koponya-, mell- és hasüregnek, illetve a bennük található szerveknek a feltárásából és vizsgálatából áll. A májat, a veséket, a mellékveséket és a heréket a kimetszés után minél előbb még nedvesen le kell mérni, a kiszáradás elkerülése miatt. Az alábbi szerveket kell megfelelő közegben tartósan tárolni egy esetleges későbbi kórszövettani vizsgálat céljaira: valamennyi olyan szerv, amelyen makroszkopikus elváltozás található, az agy – beleértve a nyúltagy, a híd, a kisagykéreg, a nagyagykéreg és az agyalapi mirigy metszeteit, a pajzsmirigy és a mellékpajzsmirigy, bármilyen jelen levő csecsemőmirigy, a légcső és a tüdő, a szív, az aorta, (a nyálmirigyek), a máj, a lép, a vesék, a mellékvesék, a hasnyálmirigy, az ivarmirigyek, a méh, (a járulékos nemi szervek), az epehólyag, ha megtalálható, a nyelőcső, a gyomor, a patkóbél, az éhbél, a csípőbél, a vakbél, a vastagbél, a végbél, a húgyhólyag, a reprezentatív nyirokcsomók, (a női emlőmirigy), (a combizomzat), a perifériás idegek, (a szemek), (a szegycsont a csontvelővel), (a combcsont az ízületi felülettel együtt), (a gerincoszlop három szinten – nyaki, mellkasközéptáji és ágyéki csigolyáknál), valamint (a szemüregen kívüli könnymirigyek). A zárójelben említett szöveteket csak akkor kell megvizsgálni, ha célszervként szerepelnek, illetve, ha a toxicitás tünetei ezt indokolják.

Kórszövettani vizsgálatok

a) Teljes körű kórszövettani vizsgálatot kell végezni a kontrollcsoport és a legnagyobb adaggal kezelt csoport állatainak bőrén, szervein és szövetein.

b) Az összes olyan szervet, amelyen makroszkopikus elváltozás található, meg kell vizsgálni.

c) A többi dóziscsoport állatainak célszerveit is meg kell vizsgálni.

d) Ha patkányokat használunk, a kis, illetve közepes dózissal kezelt csoportok állatainak tüdejét kórszövettani vizsgálatnak kell alávetni a fertőzés jeleit keresve, ez ugyanis az állat egészségi állapotának alkalmas értékelésére szolgál. E csoportok állatainál további kórszövettani vizsgálatokra rutinszerűen nincs szükség, de minden esetben vizsgálatokat kell végezni az olyan szerveken, amelyek az elváltozás jeleit mutatták a legnagyobb dózissal kezelt csoportban.

e) Ha kísérő csoportot is használunk, azokon a szöveteken és szerveken, amelyek a kezelt csoportokban elváltozásokat mutattak, itt is el kell végezni a kórszövettani vizsgálatokat.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások egyes típusait, illetve az elváltozást mutató állatok százalékos arányát. Az eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.

3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

- használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, étrend,

- vizsgálati körülmények,

- adagolás (beleértve a vivőanyagot is, ha van) és koncentrációk,

- a toxikus reakciók nemenként és dózisonként,

- lehetőség szerint az a szint, amikor még nincs toxikus hatás,

- az elpusztulás ideje a vizsgálat során, illetve, hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét,

- a toxikus és más hatások leírása,

- az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének időpontja és a megfigyelést követő változásuk,

- a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos adatok,

- szemészeti leletek,

- az elvégzett hematológiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye,

- az elvégzett klinikai-kémiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye (beleértve az esetleges vizeletelemzés eredményeit is),

- boncolási leletek,

- a kórszövettani vizsgálatok eredményének részletes ismertetése,

- az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,

- az eredmények megvitatása,

- az eredmények értelmezése.

3.2. Értékelés és értelmezés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

SZUBKRÓNIKUS INHALÁCIÓS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

90 NAPOS, ISMÉTELT INHALÁCIÓS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓ FAJOKON

1. MÓDSZER

1.1. Bevezetés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.2. Fogalommeghatározások

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.3. Referenciaanyagok

Nincsenek.

1.4. A vizsgálati módszer elve

Több kísérleti állatcsoportot naponta, meghatározott ideig kezelünk a vizsgált anyaggal, fokozatosan növelt koncentrációkban, csoportonként egy koncentráció felhasználásával, 90 napon keresztül. Ha vivőanyagot alkalmazunk a vizsgált anyag megfelelő koncentrációjának kialakításához a levegőben, a vivőanyaghoz is kell kontrollcsoportot beállítani. A vizsgálati időszak alatt az állatokat naponta vizsgálni kell a mérgezés jeleinek észlelése érdekében. A vizsgálat ideje alatt elpusztult állatokat fel kell boncolni, a vizsgálat lezárásakor pedig a túlélő állatokat is el kell pusztítani és fel kell boncolni.

1.5. Minőségi követelmények

Nincsenek.

1.6. A vizsgálati módszer leírása

Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani. Szükség esetén vivőanyag alkalmazható a vizsgált anyag megfelelő koncentrációjának kialakítására a levegőben. Ha az adagolás megkönnyítésére vivőanyagot vagy más adalékanyagot használunk, meg kell bizonyosodni arról, hogy azok nem rendelkeznek toxikus hatással. Ehhez szükség szerint korábbi vizsgálatokból származó adatokat is fel lehet használni.

Vizsgálati körülmények

A kísérlethez felhasznált állatok

Ha nincs ellenjavallat, patkányt kell kísérleti állatnak használni. Fiatal, egészséges, ivarérett, kísérleti célokra tenyésztett laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan térjen el egymástól, az átlagos értéktől legfeljebb ± 20 %-kal különbözhet. Ha a szubkrónikus inhalációs vizsgálatot valamely hosszú távú vizsgálat előzményeként végezzük el, mindkét vizsgálathoz ugyanazon fajt, illetve kísérleti állattörzset kell felhasználni.

Az állatok száma és neme

Valamennyi expozíciós koncentrációszinthez legalább 20 állatot kell felhasználni (10 hímet és 10 nőstényt). A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Ezenkívül még egy 20 fős (nemenként 10 állat) kísérő állatcsoportot is lehet kezelni a legnagyobb adaggal 90 napon át, amelynek állatain a kezelés után 28 nappal megfigyelhetővé válik a toxikus hatás visszafordíthatósága, elhúzódó vagy késve fellépő volta.

Expozíciós koncentrációszintek

Legalább három koncentrációt és egy kontrollt, illetve vivőanyagkontrollt kell használni (a legnagyobb koncentrációhoz tartozó vivőanyag-koncentrációval), ha vivőanyagot is alkalmaznak. A vizsgált anyaggal történő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lévő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati csoportok állataival. A legnagyobb adagot úgy kell kiválasztani, hogy annak hatására az azzal kezelt csoportban jelentkezzenek a toxikus hatások, de elhullások lehetőleg ne, vagy csak minimális mértékben legyenek. A legkisebb adagot úgy kell kiválasztani, hogy az ne okozzon toxikus tüneteket. Ha használható becslés áll rendelkezésre az emberi expozícióra vonatkozóan, a legkisebb adagnak ennél nagyobbnak kell lennie. Kedvező esetben a középső adaggal kezelt csoportnál minimális toxikus hatás észlelhető. Ha egynél több közbeeső dózist alkalmaznak, akkor azokat úgy kell kiválasztani, hogy fokozódó toxikus hatást váltsanak ki. Az alacsony és közbeeső dózissal kezelt csoportokban, illetve a kontrollcsoportban az elpusztult állatok száma minimális legyen, hogy az eredmények értelmezhető értékelése lehetséges legyen.

Expozíciós idő

Az expozíció napi időtartama a kamra koncentrációjának kiegyenlítését követően hat óra. Különleges követelmények esetén ettől eltérő expozíciós idők is alkalmazhatók.

Berendezés

A kísérlethez olyan inhalációs berendezést kell használni, amely óránként legalább tizenkét alkalommal légcserét tesz lehetővé a dinamikus légmozgás fenntartása érdekében azért, hogy megfelelő oxigéntartalmat és egyenletesen eloszlatott expozíciós atmoszférát lehessen biztosítani. Ha kamrát használnak, annak kialakítása révén a lehető legkisebbre kell csökkenteni a vizsgálati állatok zsúfoltságát, és lehetővé kell tenni a lehető legnagyobb mértékű expozíciót a vizsgált anyag belégzése útján. Általános szabályként a kamra atmoszférája stabilitásának biztosítása érdekében a vizsgálati állatok teljes térfogata nem haladhatja meg a vizsgálati kamra térfogatának 5 %-át. Végezhetők csak az orron és szájon át vagy csak a fejen át, illetve az egész testen keresztül megvalósuló egyedi expozíciós kamrai vizsgálatok; az első két módszer előnye, hogy minimalizálja a vizsgált anyag egyéb úton történő felvételének lehetőségét.

Megfigyelési időszak

A vizsgálati állatokat a teljes kezelési és gyógyulási időszak alatt naponta meg kell figyelni a toxicitás jeleinek észlelése érdekében. Fel kell jegyezni az elpusztulás időpontját és azt az időpontot, amikor a toxikus hatások jelei mutatkozni kezdenek, illetve elmúlnak.

A kísérlet végrehajtása

Ideális esetben heti öt-hét alkalommal teszik ki az állatokat a vizsgált anyag hatásának, 90 napon keresztül. A kísérő csoportokban a nyomon követő megfigyelésekre kiválasztott állatokat további 28 napig kell tartani kezelés nélkül, hogy a toxikus hatás visszafordíthatóságát, illetve elhúzódását ki lehessen mutatni. A vizsgálatokat 22 ± 3 °C állandó hőmérséklet mellett kell végezni. Ideális esetben a relatív páratartalmat 30 és 70 % között kell tartani, de bizonyos körülmények között (például aeroszolok vizsgálatakor) ez a gyakorlatban nem mindig kivitelezhető. A belégzési időszak alatt az állatok nem kaphatnak sem takarmányt, sem vizet.

Megfelelő analitikai koncentrációszabályozási rendszerrel kiegészített, dinamikus inhalációs rendszert kell alkalmazni. A megfelelő inhalációs koncentráció kialakításához javasolt a próbavizsgálat elvégzése. A légáramlást úgy kell beállítani, hogy az egész kamrában azonos expozíciós körülményeket biztosítson. A rendszernek biztosítania kell, hogy a kívánt expozíciós körülmények a lehető leggyorsabban kialakíthatók legyenek.

A következő paramétereket kell mérni, illetve figyelemmel kísérni:

a) a (folyamatos) légáramlás sebessége;

b) az anyag tényleges koncentrációja a belégzési zónában. A napi expozíciós időszak folyamán a koncentráció nem változhat a középérték ± 15 %-át meghaladó mértékben. Porok és aeroszolok esetében azonban ez az érték nem biztos, hogy elérhető, ezért itt szélesebb tartomány is elfogadható. A napi koncentrációt a vizsgálat teljes időtartama alatt lehetőség szerinti állandó értéken kell tartani. A kísérlet megtervezésekor részecskeméret-elemzést kell végezni az aeroszolkoncentráció stabilitásának meghatározására. Az expozíció során az elemzést olyan gyakran el kell végezni, amilyen gyakran szükséges, azért, hogy a részecskeeloszlás állandóságát ellenőrizni tudjuk.

c) hőmérséklet és páratartalom;

d) az expozíció ideje alatt és azt követően az állatokat rendszeresen kell megfigyelni, és a leleteket rögzíteni kell; minden állatról egyedi feljegyzés készül. Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni, és a toxikus hatások megjelenését, súlyosságát és időtartamát rögzíteni kell. A ketrecben tartott állatok megfigyelésekor a bőr- és szőrelváltozásokra, a szemek és a nyálkahártyák változásaira, a légzési, a keringési rendszerre, az autonóm és a központi idegrendszer működésére, a szomatomotoros tevékenységekre, valamint a viselkedési mintákra kell figyelemmel lenni. Heti gyakorisággal mérni kell a takarmányfogyasztást és az állatok súlyát. Az állatok rendszeres megfigyelésére azért van szükség, hogy megelőzzük a kísérleti állatok kannibalizmus, szöveti autolízis, illetve rossz elhelyezés következtében történő elhullását. A vizsgálati időszak végeztével a kísérő csoportban lévő állatok kivételével minden túlélő állatot fel kell boncolni. A haldokló állatokat eltávolításuk után el kell pusztítani, és fel kell boncolni.

Az alábbi vizsgálatokat rendszeresen el kell végezni az összes állaton, beleértve a kontrollcsoport egyedeit is:

a) Lehetőleg minden állatot, de legalább a legnagyobb adaggal kezelt és a kontrollcsoportban lévő állatokat szemvizsgálatnak kell alávetni szemtükör vagy ezzel egyenértékű, megfelelő készülék segítségével az expozíciót megelőzően és a vizsgálat végeztével. Ha a szemen elváltozás észlelhető, akkor minden állatot meg kell vizsgálni.

b) A vizsgálati időszak végén hematológiai vizsgálatokat kell végezni: a hematokrit-értéket, a hemoglobin koncentrációt, a vörösvértestszámot, a minőségi- és a teljes fehérvérsejtszámot, az alvadási képességet, beleértve az alvadási időt, a protrombin időt, a tromboplasztin időt, illetve a trombocitaszámot kell mérni.

c) A vizsgálati időszak végeztével a vérmintákat klinikai-kémiai vizsgálatoknak is alá kell vetni. Fontosnak megvizsgálni az elektrolit-egyensúlyt, a szénhidrát-anyagcserét, a máj-, illetve a vesefunkciót. Az egyes vizsgálatok kiválasztását a vizsgált anyag hatásmechanizmusával kapcsolatos megfigyelések befolyásolják. Javasolt meghatározni: a kalcium, a foszfor, a klorid, a nátrium, a kálium szintjét, éhgyomorra kell mérni a glükóz szintjét (az adott fajra jellemző és megfelelő éheztetési idő után); a szérum glutaminsav szőlősav transzamináz (GPT) [8], a szérum glutaminsav oxálsav transzamináz (GOT) [9], az ornitin dekarboxiláz, a gamma glutamil-transzpeptidáz, a karbamid nitrogén, az albumin, a kreatinin, az összes bilirubin és az összes szérumfehérje szintjét szintén meg kell határozni. További meghatározások, amelyekre a pontos toxicitás értékeléséhez még szükség lehet: lipidelemzés, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin- és kolineszteráz-aktivitás mérése. Ahol a megfigyelt hatások vizsgálatának kiterjesztéséhez szükséges, további klinikai-kémiai vizsgálatokat is lehet végezni.

d) Vizeletelemzésre általában nincs szükség, csak akkor, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás ezt indokolja.

Ha a korábbi kísérletekből származó adatok nem megfelelőek, mérlegelendő a hematológiai és klinikai-kémiai paraméterek meghatározása az adagolás megkezdése előtt.

Autopszia

Minden állaton teljes körű makroszkópos boncolást kell végezni, amely a test külső felületének, a testnyílásoknak, valamint a koponya-, mell- és hasüregnek, illetve a bennük található szerveknek a feltárásából és vizsgálatából áll. A májat, a veséket, a mellékveséket és a heréket a kimetszés után minél előbb még nedvesen le kell mérni, a kiszáradás elkerülése miatt. Az alábbi szerveket kell megfelelő közegben tartósan tárolni egy esetleges későbbi kórszövettani vizsgálat céljaira: valamennyi olyan szerv, amelyen makroszkopikus elváltozás található, a tüdőket teljesen és sértetlenül kell eltávolítani, megmérni, majd megfelelő fixálóanyaggal konzerválni azért, hogy a szerkezete épen maradjon (megfelelő módszernek tekinthető a fixáló anyagnak a tüdőn való átáramoltatása), az orr és a garat szövetei, az agy – beleértve a nyúltagy, a híd, a kisagykéreg, a nagyagykéreg, és az agyalapi mirigy metszeteit, a pajzsmirigy és a mellékpajzsmirigy, bármilyen jelen levő csecsemőmirigy, a légcső és a tüdő, a szív, az aorta, a nyálmirigyek, a máj, a lép, a vesék, a mellékvesék, a hasnyálmirigy, az ivarmirigyek, a méh, (a járulékos nemi szervek), (bőr) epehólyag (ha van), a nyelőcső, a gyomor, a patkóbél, az éhbél, a csípőbél, a vakbél, a vastagbél, a végbél, a húgyhólyag, a reprezentatív nyirokcsomók, (a női emlőmirigy), (a combizomzat), a perifériás idegek, (szemek), a szegycsont a csontvelővel, (a szemek), (a combcsont az ízületi felülettel együtt), (a gerincoszlop három szinten – nyaki, mellkasközéptáji és ágyéki csigolyáknál). A zárójelben említett szöveteket csak akkor kell megvizsgálni, ha célszervként szerepelnek, illetve, ha a toxicitás tünetei ezt indokolják.

Kórszövettani vizsgálatok

a) Teljes körű kórszövettani vizsgálatot kell végrehajtani a kontrollcsoport és a legnagyobb adaggal kezelt csoport állatainak légzőszervein, valamint egyéb szervein és szövetein.

b) Az összes olyan szervet, amelyen makroszkopikus elváltozás található, meg kell vizsgálni.

c) A többi dóziscsoport állatainak célszerveit is meg kell vizsgálni.

d) Az alacsony és középső dózissal kezelt csoportok állatainak tüdejét kórszövettani vizsgálatnak kell alávetni azért, hogy az állatok egészségi állapota felmérhető legyen. E csoportok állatainál további kórszövettani vizsgálatokra rutinszerűen nincs szükség, de minden esetben vizsgálatokat kell végezni az olyan szerveken, amelyek az elváltozás jeleit mutatták a legnagyobb dózissal kezelt csoportban.

e) Ha kísérő csoportot is használunk, azokon a szöveteken és szerveken, amelyek a kezelt csoportokban elváltozásokat mutattak, itt is el kell végezni a kórszövettani vizsgálatokat.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások egyes típusait, illetve az elváltozást mutató állatok százalékos arányát. Az eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.

3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

- használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, étrend,

- vizsgálati körülmények:

Az expozíciós készülék leírása: beleértve a készülék konstrukcióját, típusát, méreteit, a levegő forrását, a részecskék és aeroszolok előállítására szolgáló rendszert, a klímarendszert, az elhasznált levegő kezelésének módját, az állatoknak a vizsgálati kamrában való elhelyezését. A hőmérsékletet, a levegő páratartalmát, és adott esetben az aeroszolkoncentráció stabilitását, illetve a részecskenagyságot le kell írni.

Expozíciós adatok: ezeket táblázatos formában kell közölni, az átalagértékek és az azoktól való eltérés megjelölésével. A következő adatokat kell tartalmazniuk:

a) légáram sebessége az inhalációs készülékben;

b) hőmérséklet és a levegő páratartalma;

c) névleges koncentráció (az inhalációs készülékbe helyezett vizsgált anyag összmennyisége osztva a levegő térfogatával);

d) vivőanyag jellege (ha van);

e) tényleges koncentráció a belégzési zónában;

f) átlagos részecskenagyság (amennyiben szükséges),

- a toxikus reakciók nemenként és dózisonként,

- lehetőség szerint az a szint, amikor még nincs toxikus hatás,

- az elpusztulás ideje a vizsgálat során, illetve, hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét,

- a toxikus és más hatások leírása,

- az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének időpontja és a megfigyelést követő változásuk,

- a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos adatok,

- szemészeti leletek,

- az elvégzett hematológiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye,

- az elvégzett klinikai-kémiai vizsgálatok és azok valamennyi eredménye (beleértve az esetleges vizeletelemzés eredményeit is),

- boncolási leletek,

- a kórszövettani vizsgálatok eredményének részletes ismertetése,

- az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,

- az eredmények megvitatása,

- az eredmények értelmezése.

3.2. Értékelés és értelmezés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

TERATOGENITÁSI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓ ÉS NEM RÁGCSÁLÓ FAJOKON

1. MÓDSZER

1.1. Bevezetés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.2 Fogalommeghatározások

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.3. Referenciaanyagok

Nincsenek.

1.4. A vizsgálati módszer elve

A vizsgált anyagot naponta orálisan (szájon át), fokozatos adagokban vagy koncentrációkban kell beadni több, vemhes vizsgálati állatcsoportnak, legalább a vemhességi időszaknak azon szakaszában, amikor a szervek kifejlődnek, 90 napon keresztül. Nem sokkal az ellés várt időpontja előtt az anyaállatokat el kell pusztítani, a méhet el kell távolítani, és tartalmát meg kell vizsgálni. A vizsgálati módszer az embrionális és magzati toxicitás vizsgálatára alkalmas.

1.5. Minőségi követelmények

Nincsenek.

1.6. A vizsgálati módszer leírása

Előkészületek

Egészséges, fiatal, fejlett, hasonló méretű és korú fiatal, szűz állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani, majd bizonyítottan termékeny hímekkel kell pároztatni azokat. A megtermékenyített nőstényeket véletlenszerű kiválasztással kezelt csoportokba osztjuk be.

A megtermékenyítés természetes vagy mesterséges úton egyaránt végezhető. A vizsgált anyagot a beágyazódás után hamarosan kell elkezdeni napi gyakorisággal adagolni a nőstényeknek, és azt folytatni szükséges a szervek kifejlődésének teljes időszakán keresztül. Az ellés előtt egy nappal a magzatokat a méh kivétele útján el kell távolítani, és meg kell vizsgálni a szervek, illetve a csontváz rendellenességeit, beleértve a növekedésben való visszamaradást, a késleltetett csontképződést és a bélvérzéseket.

Vizsgálati körülmények

A kísérlethez felhasznált állatok

A leggyakrabban használt fajok a patkány, az egér, a hörcsög és a nyúl. A legalkalmasabb a patkány és a nyúl. A vizsgálatokhoz a szokásos laboratóriumi törzseket használjuk. Az alkalmazott törzsnek megfelelő termékenységgel kell rendelkeznie, és a teratogén hatásokkal szembeni érzékenységének ismertnek kell lennie. Az állatokat egyesével kell elhelyezni a ketrecekben.

Az állatok száma és neme

Minden adagolási szinthez legalább 20 vemhes patkányt, hörcsögöt, illetve egeret vagy 12 nyulat alkalmazzunk. A cél az, hogy megfelelő számú almot, illetve utódot hozzunk létre az anyag teratogén potenciáljának felméréséhez.

Adagolási szintek (dózisok)

Legalább három adagolási szintet (dózist) és egy kontrollt kell használni. Ha a vizsgált anyagot vivőanyag segítségével adagolják, a vivőanyagra is kell egy kontrollcsoportot használni. Ha vivőanyagot is használnak, annak ismerni kell a toxikológiai jellemzőit; nem lehet teratogén, illetve nem lehet hatással a szaporodásra. A vizsgált anyaggal történő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lévő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati csoportok állataival. Ha a vizsgált anyag biológiai, illetve fizikokémiai tulajdonságai lehetővé teszik, a legnagyobb adaggal kezelt csoportban ugyan jelentkeznie kell enyhe toxikus hatásnak az anyaállatokon, például enyhe súlyveszteségnek, de 10 %-nál több elhullás lehetőleg ne legyen e csoportban sem. A legalacsonyabb adaggal kezelt csoportban nem lehetnek felismerhető, a vizsgált anyaggal összefüggésben lévő jelek. A közbeeső csoportok adagjainak nagyságát a legkisebb és legnagyobb adag között pontosan középen kell kijelölni.

Határérték-vizsgálat

Alacsony toxicitású vizsgálati anyagoknál, ha a napi 1000 mg/testsúlykilogramm adagolás nem eredményez embrionális toxicitást vagy teratogenitást, a további vizsgálatok szükségtelennek tekinthetők.

Expozíciós idő

A vizsgálat nulladik napja az a nap, amikor a hüvelyi dugó és/vagy a sperma megfigyelhető (ha lehetséges). Az adagolási időszaknak ki kell terjednie a szervképződési időszakra. Ez a patkány és az egér esetében 6–15 nap, a hörcsögnél 6–14 nap, a nyúlnál 6–18 nap. Ha a nulladik nap alapja a párzás megfigyelése vagy a mesterséges megtermékenyítés, a fent megadott napokat egy nap hozzáadásával kell korrigálni. Választhatóan az adagolási időszak is meghosszabbítható, megközelítőleg a várt ellési nap előtti utolsó napig.

Megfigyelési időszak

Legalább naponta egyszer gondos klinikai vizsgálatokat kell végezni. Az állatok napi megfigyelése azért is szükséges, hogy minél kevesebb állat pusztuljon el a vizsgálat időtartama alatt.

A kísérlet végrehajtása

A vizsgált anyagot szájon át vagy gyomorszondával kell beadni. A vizsgált anyagot naponta megközelítőleg azonos időben kell beadni.

A nőstény vizsgálati állatokat naponta kell kezelni a vizsgált anyaggal, az egész vizsgálat ideje alatt. A vizsgált anyag adagolásának elején az adag nagyságát lehet a nőstények testsúlyához viszonyítani, vagy – tekintettel a vemhesség során tapasztalható gyors súlynövekedésre – az állatokat időközönként lehet mérni, és az adagot ennek megfelelően a legutóbbi súlymeghatározás szerint kell beállítani. A toxicitásra utaló jeleket meg kell figyelni, és fel kell jegyezni megjelenésük időpontját, súlyosságát és az időtartamot. A vetélés vagy koraszülés jeleit mutató nőstényeket el kell pusztítani, és alapos makroszkópos vizsgálatnak kell alávetni. A kezelés utáni megfigyelési időszakot megközelítőleg az ellés előtti utolsó napig kell folytatni; a cél a vemhességi időszak legnagyobb részének lefedése, lehetőleg el kell azonban kerülni az eredmények értékelésének bizonytalanságait a természetes ellést követően felmerülő komplikációk eredményeként. A ketrecben tartott állatok megfigyelésekor a bőr- és szőrelváltozásokra, a szemek és a nyálkahártyák változásaira, valamint a légzési, a keringési rendszerre, az autonóm és a központi idegrendszer működésére, a szomatomotoros tevékenységekre, valamint a viselkedési mintákra kell figyelemmel lenni. Hetente mérni kell a takarmányfogyasztást (és a vízfogyasztást is, ha a vizsgált anyagot az ivóvízzel adagoljuk), valamint az állatok súlyát.

Autopszia

Minden anyaállatot, amely a vizsgálat alatt, illetve azt követően elpusztul, makroszkóposan alaposan meg kell vizsgálni anatómiai elváltozások, illetve olyan patológiai elváltozások szempontjából, amelyek befolyással lehettek a vemhességre. Közvetlenül a halál után el kell távolítani a méhet, és annak tartalmát meg kell vizsgálni magzati vagy embrionális elhalálozás, valamint az élő magzatok száma szempontjából. Rendszerint megbecsülhető a méhen belüli elhalás ideje, ha ilyen előfordul. Patkányban és nyúlban meg lehet számolni a sárgatesteket is. Meg kell állapítani a magzatok nemét, és egyedileg meg kell mérni azokat, súlyukat fel kell jegyezni, és ebből átlagos magzati súlyt kell számolni. Az eltávolítást követően minden magzatot egyedileg külső vizsgálatnak kell alávetni. Patkányok, egerek és hörcsögök esetében az alom egyharmadát, legfeljebb felét preparálni kell, meg kell vizsgálni azokat a csontváz elváltozásai szempontjából, míg az almok fennmaradó részénél megfelelő módszerek alkalmazásával meg kell vizsgálni a lágy szövetek elváltozásait. A nyulaknál minden egyes magzatot gondos boncolással vizsgáljunk meg zsigeri elváltozások, majd a csontváz eltérései szempontjából.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások egyes típusait, illetve az elváltozást mutató állatok százalékos arányát. Az eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.

3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

- használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, étrend,

- vizsgálati körülmények,

- adagolás (beleértve a vivőanyagot is, ha van) és koncentrációk,

- a toxikus reakciók dózisonként,

- lehetőség szerint az a szint, amikor még nincs toxikus hatás,

- az elpusztulás ideje a vizsgálat során, illetve, hogy az állatok megélték-e a vizsgálat végét,

- a toxikus és más hatások leírása,

- az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének időpontja és a megfigyelést követő változásuk,

- a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos adatok,

- a vemhesség időtartama és az alommal kapcsolatos adatok (történeti adatok is),

- magzati adatok (élő/halva születés, nem, a lágyszövet vagy a csontváz elváltozásai),

- alomadatok (élő/halva születés, nem, a lágyszövet és csontváz elváltozásai almonként),

- az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,

- az eredmények megvitatása,

- az eredmények értelmezése.

3.2. Értékelés és értelmezés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

KRÓNIKUS TOXICITÁSVIZSGÁLAT

1. MÓDSZER

1.1. Bevezetés

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.2. Fogalommeghatározások

Lásd az Általános bevezetés B. részét.

1.3. Referenciaanyagok

Nincsenek.

1.4. A vizsgálati módszer elve

A vizsgált anyagot rendszerint heti hét alkalommal, a megfelelő módon, fokozatos adagokban kell beadni több, nem rágcsáló vizsgálati állatcsoportnak, élettartamuk jelentős részén keresztül. Az expozíció alatt és után az állatokat a toxikus hatás jeleinek észlelése érdekében naponta meg kell vizsgálni.

1.5. Minőségi követelmények

Nincsenek.

1.6. A vizsgálati módszer leírása

Előkészületek

Az állatokat a vizsgálat előtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése előtt véletlenszerű kiválasztással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani.

Vizsgálati körülmények

A kísérlethez felhasznált állatok

Ajánlott faj a patkány. A korábban végzett vizsgálatok eredményeire alapozva egyéb, rágcsáló vagy nem rágcsáló fajokat is lehet használni. Fiatal, egészséges, ivarérett, kísérleti célokra tenyésztett laboratóriumi állattörzsekből származó állatokat kell alkalmazni, az adagolást pedig a szoptatás utáni elválasztást követően minél előbb meg kell kezdeni.

A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehetőleg csak minimálisan térjen el egymástól, az átlagos értéktől legfeljebb ± 20 %-kal különbözhet. Ha a szubkrónikus orális vizsgálatot valamely hosszú távú vizsgálat előzményeként végzik, mindkét vizsgálathoz ugyanazon fajt, illetve kísérleti állattörzset kell felhasználni.

Az állatok száma és neme

Rágcsálók esetében minden adagolási szinthez, valamint a hozzájuk tartozó kontrollcsoporthoz legalább 40 állatot kell felhasználni (20 hímet és 20 nőstényt). A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Ha időközi elpusztítást tervezünk, akkor a létszámot annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése előtt el akarunk pusztítani.

Nem rágcsáló fajoknál kisebb létszámú, de nemenként és csoportonként legalább négyfős csoportok is elfogadhatók.

Adagolási szintek (dózisok) és expozíciós gyakoriság

Legalább három adagolási szintet (dózist) és egy kontrollcsoportot kell használni. A legnagyobb adagot úgy kell kiválasztani, hogy annak hatására a kezelt csoportban jelentkezzenek a toxicitás jelei, de ne legyen túlzott mértékű elhullás. A legkisebb adagot úgy kell kiválasztani, hogy az ne okozzon toxikus tüneteket.

A közbeeső csoportok adagjainak nagyságát a legkisebb és legnagyobb adag között pontosan középen kell kijelölni.

Az adagolási szintek kiválasztásánál figyelembe kell venni a korábbi kísérletekből származó adatokat.

Az expozíciót rendszerint naponta ismételjük. Ha a vizsgált anyagot ivóvízzel adjuk be, illetve a takarmányba keverjük, akkor azoknak folyamatosan az állatok rendelkezésére kell állniuk.

Kontrollcsoportok

A vizsgált anyaggal történő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lévő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati csoportok állataival.

Különleges körülmények között, például aeroszolokat is alkalmazó inhalációs vizsgálatban vagy nem ismert biológiai aktivitással rendelkező emulzióképző anyag szájon át történő adagolásakor egy kezeletlen kontrollcsoportra is szükség van, amelynek állatai nem kerülnek kapcsolatba a vivőanyaggal.

Az adagolás módja

Az adagolás két fő módon történhet: szájon át, illetve belélegeztetéssel. Az adagolás módjának megválasztása függ a vizsgált anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, valamint az emberi expozíció valószínűsített módjától.

A dermális adagolás alkalmazása jelentős gyakorlati problémákat vet fel. A bőrön át történő felszívódás révén kialakuló krónikus szisztémás toxicitásra vonatkozóan rendszerint következtetni lehet valamely más adagolási mód, például az orális adagolás eredményeiből, valamint korábbi, a bőrön át történő felszívódást vizsgáló egyéb vizsgálatok tapasztalataiból.

Vizsgálatok orális adagolással

Ha a vizsgált anyag felszívódik a gyomor-bél rendszerből, és ha a táplálékfelvétel az esetleges emberi expozíció egyik módja, akkor a szájon át történő adagolás a választandó módszer, hacsak ellenjavallata nincs.

Az állatok az anyagot a takarmánnyal, az ivóvízben oldva, illetve kapszulában kapják.

Ideális esetben az anyagot naponta kell adagolni a hét mind a hét napján, miután az ötnapos rendszerű adagolás gyógyulással vagy a toxikus tünetek megszűnésével járhat a kimaradó időszakban, és így befolyásolhatja az eredményeket és azok értékelését. Ám főként gyakorlati megfontolások alapján az ötnapos adagolási hét is elfogadhatónak tekintendő.

Vizsgálatok inhalációs adagolással

Miután a belégzéses vizsgálatok sokkal összetettebb technikai problémákat jelentenek, mint az adagolás más módjai, az adagoláshoz itt sokkal részletesebb útmutatást adunk. Azt is megjegyezzük, hogy bizonyos körülmények között a közvetlen légcsőbe juttatás (instilláció) is érvényes módszer lehet.

A hosszú távú expozíció alapja rendszerint az emberi expozíció modellezése, ami két lehetőséget jelent. Az egyik lehetőségnek megfelelően a kamra-koncentráció kiegyenlítődését követően naponta hat órán keresztül lélegeztetik be az állatokkal a vizsgált anyagot heti öt napon keresztül (szakaszos expozíció), a másik lehetőség pedig a környezeti expozíciónak jobban megfelelő módszer, azaz napi 22–24 órán át, a hét minden napján végzett belélegeztetés (folyamatos expozíció), amelybe körülbelül egyórás napi megszakítás is beletartozik, mindennap ugyanazon időben, amikor az állatok megkapják a takarmányt, és amikor a kamrát karbantartjuk. Az állatok általában mindkét esetben állandó koncentrációnak vannak kitéve. A szakaszos és a folyamatos expozíció közötti alapvető különbség az, hogy az előbbiben van egy 17–18 órás időszak, amikor az állatok regenerálódhatnak a napi adag hatását követően, amelyet a hétvégeken egy még ennél is hosszabb regenerációs időszak követ.

A szakaszos, illetve folyamatos expozíció közötti választás a vizsgálat céljától és a szimulálni kívánt emberi helyzettől függ. Mindazonáltal figyelembe kell venni bizonyos technikai nehézségeket. Ilyen például, hogy a folyamatos expozíció előnyeit csökkentheti az ehhez szükséges itatás és etetés nehézsége, valamint a bonyolultabb (ugyanakkor megbízhatóbb) aeroszol- és páraképző berendezések, illetve a megfigyelő technikák igénye.

Expozíciós kamrák

A kísérlethez olyan inhalációs berendezést kell használni, amely óránként legalább tizenkét alkalommal légcserét tesz lehetővé a dinamikus légmozgás fenntartása érdekében, azért, hogy megfelelő oxigéntartalmat és egyenletesen eloszlatott expozíciós atmoszférát lehessen biztosítani. A kontroll és az expozíciós kamrák tervezésének, felépítésének azonosnak kell lennie, hogy a körülmények a vizsgált anyag belélegeztetését kivéve minden tekintetben összehasonlíthatók legyenek. A kamrában általában enyhe negatív nyomást kell fenntartani, hogy a vizsgált anyag ne szivároghasson ki a környezetbe. Ha kamrát használnak, annak kialakítása révén a lehető legkisebbre kell csökkenteni a kísérleti állatok zsúfoltságát. Általános szabályként a kamrai atmoszféra stabilitásának biztosítása érdekében a kísérleti állatok teljes térfogata nem haladhatja meg a vizsgálati kamra térfogatának 5 %-át.

A következő méréseket és ellenőrzéseket kell elvégezni:

i. Légáramlás: a légkamrán keresztül áramló levegő sebességét lehetőség szerint folyamatosan kell mérni;

ii. Koncentráció: a napi expozíciós időszak alatt a vizsgált anyag koncentrációjának változása nem haladhatja meg a középérték ± 15 %-át;

iii. Hőmérséklet és páratartalom: rágcsálóknál a vizsgálatokat 22 ± 2 °C kamrai hőmérsékleten és 30–70 % közötti relatív páratartalom mellett kell végezni, kivéve, amikor a vizsgált anyagot víz segítségével oszlatjuk el a kamra légterében. Lehetőleg mindkét értéket folyamatosan figyelemmel kell kísérni;

iv. A részecske nagyságának mérése: a folyékony és szilárd aeroszolt alkalmazó légkamrák légterében meg kell határozni a részecskék megoszlását. Az aeroszolrészecskéknek a felhasznált állatok számára belélegezhető nagyságúaknak kell lenniük. A légkamra mintáit az állatok légzési zónájából kell venni. A légminta legyen az állattal belélegeztetett részecske megoszlására nézve reprezentatív, és gravimetrikusan az összes szuszpendált aeroszolt képviselje még akkor is, ha azok nagy része nem lélegezhető be az állat számára. A részecske méretének meghatározását a kísérleti rendszer kialakítása során gyakran el kell végezni az aeroszol stabilitásának ellenőrzésére, azután pedig olyan gyakran, amilyen mértékben szükséges a belélegeztetés során, hogy megfelelően meghatározhassuk az állatok expozíciójára alkalmazott részecskemegoszlás állandóságát.

A vizsgálat időtartama

Az adagolás időtartama nem lehet kevesebb 12 hónapnál.

A kísérlet végrehajtása

Megfigyelések

Naponta legalább egyszer minden állatot gondos klinikai vizsgálatnak kell alávetni. További napi megfigyelések is szükségesek, azért, hogy a vizsgálat során elhullott állatok száma a lehető legkevesebb legyen, például az elpusztult állatokat fel kell boncolni, vagy hűtve kell tárolni, illetve a gyenge vagy haldokló állatokat el kell különíteni, vagy el kell pusztítani. Gondos megfigyeléseket kell végezni valamennyi toxikus hatás megjelenésének és előrehaladásának észlelése, valamint a kannibalizmus, az autolízis, illetve betegség miatt bekövetkező veszteségek csökkentése érdekében.

A klinikai tüneteket, beleértve az idegrendszeri és szemészeti elváltozásokat, valamint a halálozást, minden állatnál fel kell jegyezni. Fel kell jegyezni a toxikus állapot kialakulásának kezdetét és előrehaladásának részleteit, a feltételezett daganatokat is beleértve.

Az állatok testsúlyát az első 13 hét során egyedileg, hetente kell mérni, ezt követően négyhetente legalább egyszer. A táplálkozást heti egy alkalommal kell ellenőrizni az első 13 hétben, majd megközelítőleg háromhavonta, hacsak az állatok egészségi állapota vagy testsúlyváltozása másként nem indokolja.

Hematológiai vizsgálat

A harmadik, illetve a hatodik hónap elteltével, majd ezt követően megközelítőleg félévente, valamint a vizsgálat végén valamennyi nem rágcsáló állatnál, valamint csoportonként/nemenként 10 patkánynál valamennyi vizsgálati csoportnál a levett vérmintákból hematológiai vizsgálatot (például hemoglobin-tartalom, hematokrit-érték, vörösvérsejtszám, teljes fehérvérsejtszám, trombocitaszám, illetve egyéb alvadási paraméterek) kell végezni. Ha lehetséges, minden mintát minden alkalommal ugyanattól a patkánytól kell venni. Ezenkívül a nem rágcsálóktól vizsgálat előtti mintát is kell venni.

Ha a klinikai megfigyelések az állatok egészségének romlására utalnak a vizsgálat során, az érintett állatoknál kvantitatív vérképvizsgálatot is kell végezni.

Szintén kvantitatív vérképvizsgálatot kell végezni a legnagyobb adaggal kezelt állatoknál és a kontrollcsoportban. A második legnagyobb adaggal kezelt csoportnál e vizsgálatot csak akkor kell elvégezni, ha jelentős különbség van a kontroll- és a legnagyobb adaggal kezelt csoport között, illetve ha a kórbonctani eredmények ezt indokolják.

Vizeletvizsgálat

Valamennyi nem rágcsáló állatnál és csoportonként/nemenként 10 patkánynál valamennyi vizsgálati csoportnál, lehetőség szerint ugyanazon patkányoktól, ugyanolyan időközönként, a vérvizsgálattal egy időben vizeletmintát is kell venni a vizeletvizsgálathoz. Egyedileg vagy rágcsálók esetében nemenként és csoportonként összesített mintákból az alábbi meghatározásokat kell elvégezni:

- külső megjelenés: térfogat és sűrűség, állatonként,

- fehérje, glükóz, keton, vér (szemikvantitatív meghatározás),

- az üledék mikroszkópos vizsgálata (szemikvantitatív meghatározás).

Klinikai kémia

Valamennyi nem rágcsáló állatnál és csoportonként/nemenként 10 patkánynál valamennyi vizsgálati csoportnál, lehetőség szerint minden alkalommal ugyanazon patkányoktól, megközelítőleg hathavonta, illetve a vizsgálati időszak végeztével vérmintákat kell venni klinikai kémiai vizsgálatok céljaira. Ezenkívül a nem rágcsálóktól vizsgálat előtti mintát is kell venni. A mintákból plazmát kell készíteni, és az alábbi meghatározásokat kell elvégezni:

- összfehérje-koncentráció,

- albuminkoncentráció,

- májfunkciós vizsgálatok (például alkalikusfoszfatáz-aktivitás, szérum glutaminsav szőlősav transzamináz [GPT] [10], szérum glutaminsav oxálsav transzamináz [GOT] [11] aktivitása), gamma glutamil-transzpeptidáz, ornitin dekarboxiláz,

- szénhidrát-anyagcsere, például éhgyomorra mért vércukorszint,

- vesefunkciós vizsgálatok, például karbamid a vérben.

Autopszia

Minden állaton teljes körű makroszkópos boncolást kell végezni, beleértve azokat is, amelyek a vizsgálat során pusztultak el, illetve amelyeket betegség miatt kellett elpusztítani. Az elpusztítás előtt az állatoktól kvantitatív vérképvizsgálat céljából vérmintát kell venni. Valamennyi szabad szemmel látható elváltozást, daganatot, illetve daganatgyanús elváltozást meg kell őrizni. Meg kell kísérelni a makroszkópos és mikroszkópos elváltozások közötti összefüggések feltárását.

Az összes szervet és szövetet el kell tenni későbbi kórszövettani vizsgálat céljaira. Ez rendszerint a következő szövetekre és szervekre vonatkozik: agy [12] (a nyúltagy/híd, a kisagykéreg, a nagyagykéreg), az agyalapi mirigy, a pajzsmirigy (a mellékpajzsmiriggyel együtt), a csecsemőmirigy, a tüdő (a légcsővel együtt), a szív, az aorta, a nyálmirigyek, a máj [13], a lép, a vesék [14], a mellékvesék [15], a nyelőcső, a gyomor, a patkóbél, az éhbél, a csípőbél, a vakbél, a vastagbél, a végbél, a méh, a húgyhólyag, a nyirokcsomók, a hasnyálmirigy, az ivarmirigyek [16], a járulékos nemi szervek, a női emlőmirigy, a bőr, az izomzat, a perifériás idegek, a gerincvelő (nyaki, háti, ágyéki), a szegycsont a csontvelővel és a combcsont (az ízületi felülettel együtt), valamint a szemek. A tüdő és a húgyhólyag megőrzésére a legjobb módszer a fixálóval való feltöltés. A tüdő folyadékkal való feltöltése az inhalációs vizsgálatoknál a megfelelő kórszövettani vizsgálat előfeltétele. Különleges, például inhalációs vizsgálatoknál a teljes légzőrendszert vizsgálni kell, az orral, a garattal és a gégefővel együtt.

Ha más klinikai vizsgálatok is történnek, a fenti eljárásokból nyert információknak a mikroszkópos vizsgálatokat megelőzően kell rendelkezésre állniuk, mert a patológus számára lényeges információkkal szolgálhatnak.

Kórszövettani vizsgálatok

Minden látható elváltozást, különösen a bármely szerven található daganatokat és más sérüléseket, mikroszkópos vizsgálatnak kell alávetni. Ezenkívül az alábbi eljárásokat ajánljuk:

a) Valamennyi tartósított szerv és szövet mikroszkópos vizsgálata az alábbi kísérleti állatoknál talált elváltozások teljes és részletes leírásával:

1. valamennyi, a vizsgálat során elhullott vagy leölt állat;

2. a nagy adaggal kezelt csoport és a kontrollcsoport valamennyi állata;

b) A vizsgált anyag által okozott, illetve feltehetően okozott rendellenességet mutató szervek és szövetek esetében az alacsonyabb adaggal kezelt csoportoknál is kell szövettani vizsgálatot végezni;

c) Ha a vizsgálat eredménye az állatok rendes élettartamának lényeges rövidülését mutatja, illetve olyan hatásokat jelez, amelyek valamely toxikus választ befolyásolhatnak, a fent leírtak szerint az eggyel kisebb adaggal kezelt csoportnál is el kell végezni a vizsgálatot;

d) A vizsgálat során felhasznált állatoknál normál körülmények között, hasonló laboratóriumi tartás mellett is előforduló elváltozásokkal kapcsolatos információ, vagyis a történeti kontrolladatok ismerete elengedhetetlenül szükséges ahhoz, hogy a kezelt állatokban megfigyelt változások jelentőségét helyesen értelmezzük.

2. ADATOK

Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások egyes típusait, illetve az elváltozást mutató állatok százalékos arányát. Az eredményeket megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.

3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS

3.1. Vizsgálati jelentés

A vizsgálati jelentésnek lehetőség szerint az alábbi információkat kell tartalmaznia:

- használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, étrend,

- vizsgálati körülmények,

Az expozíciós készülék leírása:

beleértve a készülék konstrukcióját, típusát, méreteit, a levegő forrását, a részecskék és aeroszolok előállítására szolgáló rendszert, a klímarendszert, az elhasznált levegő kezelésének módját, az állatoknak a vizsgálati kamrában való elhelyezését. A hőmérsékletet, a levegő páratartalmát és adott esetben az aeroszolkoncentráció stabilitását, illetve a részecskenagyságot le kell írni.

Expozíciós adatok: ezeket táblázatos formában kell közölni, az átalagértékek és az azoktól való eltérés megjelölésével.

A következő adatokat kell tartalmazniuk:

a) légáram sebessége az inhalációs készülékben;

b) hőmérséklet és a levegő páratartalma;

c) névleges koncentráció (az inhalációs