MELLÉKLET

A 440/2008/EK rendelet melléklete a következőképpen módosul:

A melléklet a következő B.53., B.54., B.55., B.56., B.57. és B.58. fejezettel egészül ki:

„B.53. FEJLŐDÉSI NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT

BEVEZETÉS

1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 426. vizsgálati iránymutatásában (2007) leírt módszerrel. Az OECD szaporodási és fejlődési toxicitási munkacsoportja 1995 júniusában, Koppenhágában megvitatta, hogy frissíteni kell a reprodukciós és fejlődési toxicitásra vonatkozó, meglévő OECD vizsgálati iránymutatásokat, és új iránymutatásokat kell kidolgozni a még le nem fedett végpontokra (1). A munkacsoport azt javasolta, hogy a fejlődési neurotoxicitásra vonatkozó vizsgálati iránymutatást az amerikai EPA útmutató alapján kell összeállítani, amelyet azóta módosítottak (2). 1996 júniusában egy második konzultációs találkozót tartottak Koppenhágában, hogy útmutatót adjanak a Titkárság számára a fejlődési neurotoxicitásra vonatkozó új vizsgálati iránymutatás vázlatának összeállításához, beleértve a főbb elemekre, például az állatfaj kiválasztására, az adagolási időszakra, a tesztelési időszakra, a megvizsgálandó végpontokra, és az eredmények értékelésének kritériumaira vonatkozó részleteket. Az amerikai neurotoxicitási kockázatértékelési irányelv 1998-ban jelent meg (3). 2000 októberében egymás után egy OECD szakértői konzultációs értekezletet és egy ILSI Risk Science Institute workshopot, valamint 2005-ben Tokióban egy szakértői konzultációs találkozót tartottak. Ezeket a találkozókat abból a célból tartották, hogy megvitassák a jelenlegi vizsgálati iránymutatással kapcsolatos tudományos és technikai kérdéseket, és az üléseken (4) (5) (6) (7) hozott javaslatokat figyelembe vették a vizsgálati módszer kifejlesztése során. A vizsgálati módszer végrehajtására, értelmezésére és a használt terminológiára vonatkozó további információk megtalálhatók a reproduktív toxicitási vizsgálatokról és értékelésükről szóló 43. számú (8) és a neurotoxicitási vizsgálatokról szóló 20. számú (9) OECD irányelvben.

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK

2. Számos vegyi anyagról ismert, hogy fejlődési neurotoxikus hatást fejt ki emberben és más fajokban (10) (11) (12) (13). A vegyi anyag toxikus tulajdonságainak felmérése és értékelése céljából a potenciális fejlődési neurotoxicitás meghatározására lehet szükség. A fejlődési neurotoxicitási vizsgálatok célja, hogy adatokat – beleértve a dózis-válasz jellemzést – szolgáltassanak az utódok fejlődő idegrendszerére gyakorolt potenciális funkcionális és morfológiai hatásokról, amelyek a méhen belüli és a korai életszakaszban történt expozíció következtében esetlegesen felmerülhetnek.

3. A fejlődési neurotoxicitási vizsgálatot el lehet elvégezni külön vizsgálatként, be lehet építeni a reprodukciós toxicitási és/vagy felnőtt neurotoxicitási vizsgálatba (pl. B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16) vizsgálati módszerek), vagy ki lehet vele egészíteni a prenatális fejlődési toxicitási vizsgálatot (pl. B.31 (17) vizsgálati módszer). Amikor a fejlődési neurotoxicitási vizsgálat be van építve vagy hozzá van kapcsolva egy másik vizsgálathoz, elengedhetetlen mindkét vizsgálati típus integritásának megőrzése. A vizsgálatok során meg kell felelni a laboratóriumi állatok kutatásokban történő használatára vonatkozó jogszabályoknak, illetve kormányzati és intézményi iránymutatásoknak (pl. 18).

4. A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése előtt a vizsgált vegyi anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk a vegyi anyag megjelölése és szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, a vegyi anyaggal elvégzett in vitro vagy in vivo toxicitási vizsgálatok eredményei; szerkezetileg rokon vegyi anyagok toxikológiai adatai és a vegyi anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggyőződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szempontjából, és elősegíti majd a megfelelő kezdődózis kiválasztását.

A VIZSGÁLAT ELVE

5. A vizsgált vegyi anyagot vemhesség és szoptatás alatt adjuk be az állatoknak. Az anyaállatokat a vemhes és szoptató nőstényekre gyakorolt hatások értékelése céljából teszteljük, illetve az anyaállatok összehasonlító információval is szolgálhatnak (az anyaállatok összehasonlítása az utódokkal). Az utódokat a neurotoxicitási értékeléshez véletlenszerűen választjuk ki az almokból. Az értékelés egyrészt a súlyos neurológiai és viselkedési rendellenességek észlelését célzó megfigyelésekből áll, beleértve a fizikai fejlődés, a viselkedési egyedfejlődés, a motoros aktivitás, a motoros és szenzoros funkció, másrészt a tanulás és a memória értékelését, valamint az agytömeg és a neuropatológia posztnatális fejlődés és felnőttkor során történő értékeléséből.

6. Amikor a vizsgálati módszert külön vizsgálatként hajtjuk végre, a csoportokban rendelkezésre álló további állatokat fel lehet használni meghatározott idegrendszeri, neuropatológiai, neurokémiai vagy elektrofiziológiai eljárásokhoz, amelyek kiegészíthetik a vizsgálati módszer által ajánlott vizsgálatokból kapott adatokat (16) (19) (20) (21). A kiegészítő eljárások különösen akkor lehetnek hasznosak, ha az empirikus megfigyelés, a várható hatások, illetve a hatásmechanizmus egy bizonyos típusú neurotoxicitásra utalnak. Ezeket a kiegészítő eljárásokat az anyaállatokban és az utódokban egyaránt használni lehet. Ezen kívül ex vivo vagy in vitro eljárások is használhatók, mindaddig, amíg ezek az eljárások nem változtatják meg az in vivo eljárások integritását.

ELŐKÉSZÜLET A VIZSGÁLATHOZ

Az állatfaj kiválasztása

7. Az elsődleges vizsgálandó faj a patkány, de más faj is használható, ha megfelelő. Megjegyzendő azonban, hogy a vizsgálati módszerben meghatározott vemhességi és posztnatális napok az általánosan használt patkánytörzsekre vonatkoznak, és összehasonlítható időtartamokat kell választani, ha másik állatfajt vagy szokatlan törzset használunk. Más állatfaj használatát toxikológiai, farmakokinetikai és/vagy más adatokkal kell megindokolni. Az indoklásnak tartalmaznia kell a rendelkezésre álló fajspecifikus posztnatális idegrendszeri és neuropatológiai értékeléseket. Ha volt olyan korábbi vizsgálat, amely aggodalomra adott okot, meg kell fontolni az abban alkalmazott faj/törzs használatát. Mivel a különböző patkánytörzsek teljesítőképessége eltérő, bizonyítani kell, hogy a használatra kiválasztott törzs megfelelő termékenységgel és válaszképességgel rendelkezik. Az egyéb fajoknak a fejlődési neurotoxicitás kimutatásával kapcsolatos megbízhatóságát és érzékenységét dokumentumokkal kell alátámasztani.

Tartási és etetési körülmények

8. A kísérleti állatokat 22 ± 3 °C hőmérsékletű helyiségben kell tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. A párzás előtt és a vizsgálat időtartama alatt meg lehet fordítani a fényciklust annak érdekében, hogy a funkcionális és viselkedési végpontok értékelését a sötét periódus alatt lehessen elvégezni (piros fény alatt), vagyis abban az időszakban, amikor az állatok rendszerint aktívak (22). A világos-sötét ciklus bármilyen megváltoztatásának magában kell foglalnia egy megfelelő akklimatizációs időt ahhoz, hogy az állatok alkalmazkodjanak az új ciklushoz. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiségű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány és a víz típusát fel kell jegyezni, és mindkettőt meg kell vizsgálni szennyező anyagokra.

9. Az állatok egyedileg vagy azonos ivarú egyedekből álló kisebb csoportokban is tarthatók. A pároztatást erre a célra alkalmas ketrecekben kell végezni. Miután meggyőződtek a párzás megtörténtéről, vagy a vemhesség 15. napjánál nem később a pároztatott nőstényeket egyedileg kell elhelyezni ellető vagy fialtató ketrecekben. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Az ellés közeledtével a pároztatott nőstények számára megfelelő és meghatározott fészekrakó anyagot kell biztosítani. Jól ismert, hogy a vemhesség során a nem megfelelő bánásmód vagy a stressz nem kívánatos kimenetelekhez vezethet, ideértve a prenatális veszteségeket és a megváltozott magzati és posztnatális fejlődést. A kezeléssel nem összefüggő tényezők miatti magzati veszteség kivédése érdekében az állatokkal óvatosan kell bánni a vemhesség alatt, valamint kerülni kell a külső tényezők, így például a túlzott külső zaj miatti stresszt.

Az állatok előkészítése

10. A laboratóriumi körülményekhez hozzászoktatott, korábban vizsgálatban még részt nem vett, egészséges állatokat kell használni, kivéve, ha a vizsgálatot beépítjük egy másik vizsgálatba (lásd a 3. bekezdést). A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, testtömeg és életkor szerint kell jellemezni. Minden állatot egyedi azonosító számmal kell ellátni. Amennyire csak megoldható, az állatok az összes vizsgálati csoportban legyenek azonos testtömegűek és korúak, illetve a vizsgálatban részt vevő fajra és törzsre jellemző normál tartományba essenek. Minden dózishoz még egyszer sem ellett, fiatal felnőtt nőstényeket kell használni. Gondosan ügyelni kell arra, hogy testvéreket nem szabad pároztatni. A vemhesség 0. napja az, amikor hüvelydugó és/vagy sperma észlelhető. Megfelelő akklimatizációs időt (pl. 2–3 nap) kell biztosítani, ha meghatározott ideje vemhes állatokat vásárolnak a szállítótól. A pároztatott nőstényeket megkülönböztetés nélkül kell a kontroll- és a kezelési csoportokba beosztani, és a lehetőségekhez mérten egyenletesen kell elosztani a csoportok között (pl. ajánlott a rétegzett random eljárás, amely egyenletes eloszlást biztosít a csoportok között, például a testtömeg alapján). Az azonos hímmel pároztatott nőstényeket egyenletesen kell szétosztani a különböző csoportokban.

ELJÁRÁS

Az állatok száma és neme

11. Minden kísérleti és kontrollcsoportnak elegendő számú vemhes, a vizsgált vegyi anyaggal kezelendő nőstényt kell tartalmaznia, hogy megfelelő számú utódot termeljenek a neurotoxicitási értékeléshez. Összesen 20 alom használata ajánlott minden dózisszinthez. A párhuzamos és lépcsőzetes csoport adagolási tervek akkor használhatók, ha a csoportonkénti teljes alomszámot elértük, és megfelelő statisztikai modelleket alkalmazunk az ismétlések elszámolására.

12. A 4. posztnatális napon (PND) vagy azt megelőzően (az ellés napja a PND 0) minden alom méretét ki kell igazítani az extra kölykök véletlenszerű kiválasztás útján történő kiküszöbölésével, és egységes alomméretet kell kialakítani minden alomban (23). Az alom mérete nem haladhatja meg a használt rágcsálótörzsre jellemző átlagos alomméretet (8–12). Az almoknak a lehetőségekhez mérten azonos számú hím és nőstény kölyökből kell állniuk. A kölykök szelektív eltávolítása, pl. a testtömeg alapján, nem elfogadható. Az almok standardizálása (selejtezés) után és a funkcionális végpontok vizsgálatát megelőzően az elválasztás előtti vagy elválasztás utáni vizsgálatra szánt kölyköket egyedi azonosítóval kell ellátni a kölykök azonosítására alkalmas bármely humánus módszer használatával (pl. 24).

Az állatok besorolása a funkcionális és viselkedési tesztekbe, az agytömeg mérésébe és a neuropatológiai értékelésekbe

13. A vizsgálati módszer különböző megközelítéseket tesz lehetővé az in utero és a szoptatás útján kezelt állatoknak a funkcionális és viselkedési tesztekhez, a szexuális éréshez, az agytömeg meghatározásához és a neuropatológiai értékeléshez való hozzárendelése tekintetében (25). Egyéb, az idegrendszeri funkciót (pl. szociális viselkedés) értékelő, illetve neurokémiai vagy neuropatológiai vizsgálatokat lehet hozzáadni eseti elbírálás alapján, amíg ezek az eredetileg előírt vizsgálatok integritását nem veszélyeztetik.

14. Minden egyes dóziscsoportból kölyköket kell kiválasztani és hozzárendelni a 4. posztnatális napon (PND 4) vagy azt követően elvégzendő végpont-értékelésekhez. A kölykök kiválasztását úgy kell elvégezni, hogy minden alomból mindkét nem minden adagolási csoportban lehetőleg egyenlő arányban képviselve legyen az összes tesztben. A motoros aktivitás vizsgálata során ugyanazokat a hím és nőstény kölyökpárokat kell megvizsgálni az elválasztást megelőző minden életkorban (lásd a 35. bekezdést). Az egyéb vizsgálatok során azonos vagy különböző hím és nőstény párokat lehet hozzárendelni a különböző viselkedési tesztekhez. Különböző kölykök hozzárendelése lehet szükséges az elválasztott kölykök és a felnőtt egyedek kognitív funkciójának vizsgálataihoz annak érdekében, hogy kiküszöbölhető legyen az életkor és a korábbi képzés zavaró hatása ezekre a mérésekre (26) (27). Az elválasztáskor (PND 21) a vizsgálatra ki nem választott kölykök humánus módon eltávolíthatók. A kölykök elosztásának minden módosítását fel kell jegyezni. A statisztikai mértékegység az alom (vagy az anyaállat) és nem a kölyök.

15. A kölykök különböző módokon sorolhatók be az elválasztás előtti és elválasztás utáni vizsgálatokba, a kognitív tesztekbe, a patológiai vizsgálatokba, stb. (lásd az 1. ábrát az általános elrendezéssel és az 1. függeléket a besorolási példákkal). Az állatok javasolt minimális száma az elválasztás előtti és elválasztás utáni vizsgálatok egyes dóziscsoportjaiban a következő:

Klinikai megfigyelések és testtömeg Minden állat Részletes klinikai megfigyelések 20/nem (1/nem/alom) Agytömeg (fixálás után) PND 11-22 10/nem (1/alom) Agytömeg (fixálatlan) ~ PND 70 10/nem (1/alom) Neuropatológia (immerziós vagy perfúziós fixálás) PND 11-22. 10/nem (1/alom) Neuropatológia (perfúziós fixálás) PND ~70. 10/nem (1/alom) Nemi érés 20/nem (1/nem/alom) Egyéb fejlődési tájékozódási pontok (választható) Minden állat Viselkedési egyedfejlődés 20/nem (1/nem/alom) Motoros aktivitás 20/nem (1/nem/alom) Motoros és szenzoros funkció 20/nem (1/nem/alom) Tanulás és memória 10/nem (1) (1/alom)

Adagolás

16. Legalább három dózisszintet és egy párhuzamos kontrollt kell alkalmazni. A dózisszinteket úgy kell megválasztani, hogy biztosítsák a kiváltott toxikus hatások fokozatosságát. Hacsak a vegyi anyag fizikai-kémiai jellege vagy biológiai tulajdonságai nem szabnak ennek határt, a legmagasabb adagolási szintet úgy kell megválasztani, hogy némi anyai toxicitást is kiváltson (pl. klinikai tünetek, csökkent testtömegnövekedés (legfeljebb 10 %) és/vagy dózis-korlátozó toxicitásra utaló bizonyíték a célszervben). A magas dózist 1 000 mg/ttkg/nap értékre lehet korlátozni, néhány kivételtől eltekintve. Például a várható humán expozíció magasabb dózis alkalmazását teheti szükségessé. Alternatívaként előzetes vizsgálatokat vagy előzetes dózisbehatároló vizsgálatokat kell végezni, hogy meghatározzuk az alkalmazandó legmagasabb dózist, amelynek minimális fokú anyai toxicitást is ki kell váltania. Ha a vizsgált vegyi anyagról standard fejlődési toxicitási vizsgálatban vagy előzetes vizsgálatban kimutatták, hogy fejlődési toxicitást okoz, legmagasabb dózisként azt a maximális dózist kell választani, amely az utódokban nem vált ki túlzott toxicitást, in utero vagy neonatális elhullást, illetve fejlődési rendellenességeket, mivel ezek kizárják a neurotoxicitás értelmezhető értékelését. A legalacsonyabb dózist úgy kell megválasztani, hogy semmilyen anyai vagy fejlődési toxicitásra utaló tünetet ne okozzon, ideértve a neurotoxicitást is. Fokozatosan csökkenő dózisszinteket kell választani azzal a céllal, hogy demonstrálni lehessen a dózisfüggő hatásokat és a megfigyelhető káros hatást nem okozó szintet (NOAEL), illetve a kimutatási határ közelében lévő dózisokat, amelyek lehetővé teszik a benchmark dózis meghatározását. A csökkenő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, a dózisok közötti nagyon nagy intervallumok (pl. 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazása esetén pedig gyakran előnyös egy negyedik dóziscsoport beiktatása is.

17. A dózisszintek megválasztásakor figyelembe kell venni mind a rendelkezésre álló összes toxicitási adatot, mind a vizsgált vegyi anyag vagy a rokon anyagok metabolizmusával vagy toxikokinetikájával kapcsolatos további információkat. Ezek az információk segíthetik az adagolási rend megfelelőségének igazolását is. A kölyköknek történő közvetlen adagolást az expozíció és farmakokinetikai információk alapján kell mérlegelni (28) (29). A közvetlen adagolásos vizsgálatok előtt gondosan mérlegelni kell az előnyöket és a hátrányokat (30).

18. A kísérő kontrollcsoport egy placebóval kezelt kontrollcsoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag beadásához vivőanyagot használnak, akkor egy vivőanyaggal kezelt kontrollcsoport. Minden állatnak ugyanolyan térfogatú vizsgált vegyi anyagot vagy vivőanyagot kell beadni a testtömeg alapján. Ha a beadás megkönnyítése érdekében vivőanyagot vagy más adalékot alkalmazunk, a következő jellemzőket kell figyelembe venni: a vizsgált vegyi anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszatartására gyakorolt hatások; a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatások, amelyek megváltoztathatják annak toxikus jellemzőit; valamint az állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. A vivőanyag nem okozhat olyan hatásokat, amelyek zavarhatják a vizsgálat értelmezését, nem okozhat idegrendszeri toxicitást, és nem lehet hatással a reprodukcióra vagy a fejlődésre. Újfajta vivőanyagok esetében a vivőanyaggal kezelt kontrollcsoporton felül egy placebóval kezelt kontrollcsoportot is be kell iktatni. A kontrollcsoport(ok)ba tartozó állatokat ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lévőket.

A dózisok beadása

19. A vizsgált vegyi anyagot és a vivőanyagot olyan úton kell beadni, amely a leginkább megközelíti a lehetséges emberi expozíciót, valamint amely a kísérleti állatok vonatkozásában rendelkezésre álló anyagcsere és eloszlási információkon alapul. A beadás általában szájon át történik (pl. gyomorszonda, táplálék, ivóvíz), de egyéb módok (pl. bőr, inhaláció) is használhatók az anyag jellegétől és a várható vagy ismert emberi expozíciós utaktól függően (további útmutatás a 43. iránymutatásban található (8)). A választott beadási módra vonatkozó döntést indokolni kell. A vizsgált vegyi anyagot minden nap körülbelül ugyanabban az időpontban kell beadni.

20. Az egyes állatoknak beadandó dózist általában a legutóbbi testtömegmérés eredménye alapján kell meghatározni. A vemhesség utolsó harmadában azonban óvatosan kell eljárni a dózis beállításakor. Ha túlzott toxicitást észlelünk a kezelt anyaállatokban, akkor azokat humánus módon exterminálni kell.

21. A vizsgált vegyi anyagot vagy vivőanyagot minimálisan naponta kell beadni a pároztatott nőstényeknek az implantáció időpontjától (GD 6) kezdve a szoptatás egész időtartama alatt (PND 21) annak érdekében, hogy a kölyköket kitegyék a vizsgált vegyi anyagnak a pre- és posztnatális idegrendszeri fejlődés időszaka alatt. Azt az életkort, amikor az adagolás megkezdődik, illetve az adagolás időtartamát és gyakoriságát módosítani lehet, ha a bizonyítékok egy olyan kísérleti elrendezést támasztanak alá, amely relevánsabb az emberi expozíció szempontjából. Az adagolási időtartamokat hozzá kell igazítani az egyéb állatfajokhoz, hogy biztosítani lehessen az expozíciót az agy fejlődésének minden korai időszakában (ami egyenértékű az emberi agy prenatális és korai posztnatális növekedésével). Az adagolás indulhat a vemhesség kezdetétől (GD 0), habár figyelembe kell venni, hogy a vizsgált vegyi anyag preimplantációs veszteséget okozhat. Az adagolásnak a vemhesség 6. napján (GD 6) történő megkezdésével elkerülhető ez a kockázat, ebben az esetben azonban a 0. és 6. GD közötti fejlődési szakaszok kezelése elmarad. Ha a laboratórium külső forrásból adott időben pároztatott állatokat vásárol, akkor az adagolás megkezdése nem kivitelezhető a pároztatás napján (GD 0), és így a GD 6 jó kezdőnap lehet. A vizsgáló laboratóriumnak az adagolási rendet a vizsgált vegyi anyag hatásaira vonatkozó lényeges információk, a korábbi tapasztalatok és a logisztikai szempontok alapján kell megállapítania; ez magában foglalhatja az adagolásnak az elválasztás utáni időszakra történő kiterjesztését is. Nem kezelhetők az ellés napján azok az állatok, amelyek még nem teljesen ellették meg az utódaikat. Általában azt feltételezzük, hogy a kölykök expozíciója az anyatej útján fog megtörténni; meg kell azonban fontolni a kölykök közvetlen kezelését is azokban az esetekben, ahol hiányoznak az utódok folyamatos expozícióját alátámasztó bizonyítékok. Folyamatos expozícióra utaló bizonyítékok nyerhetők pl. a farmakokinetikai információkból, az utódokban jelentkező toxicitásból vagy a biomarkerek változásaiból (28).

MEGFIGYELÉSEK

Az anyaállatok megfigyelése

22. Az anyaállatok egészségi állapotát legalább naponta egyszer gondosan meg kell figyelni, ideértve a megbetegedéseket és elhullásokat.

23. A kezelési és megfigyelési időszak során rendszeresen részletesebb klinikai megfigyeléseket is végezni kell (legalább kétszer a vemhességi adagolási időszak alatt és kétszer a laktációs adagolási periódus alatt), dózisszintenként legalább tíz anyaállatban. Az állatokat az otthonul szolgáló ketrecen kívül olyan képzett technikusnak kell megfigyelnie, aki nincs tisztában az állatok kezelésének részleteivel és standardizált eljárásokat alkalmaz annak érdekében, hogy az állatokat érő stresszt és a megfigyelő elfogultságát minimalizálni, a megfigyelők közti megbízhatóságot pedig maximalizálni lehessen. Ahol lehetséges, célszerű, hogy egy adott vizsgálat megfigyeléseit ugyanaz a technikus végezze.

24. A megfigyelt tüneteket fel kell jegyezni. Ha megoldható, a megfigyelt tünetek erősségét is fel kell jegyezni. A klinikai megfigyelések többek között a bőr, a szőrzet, a szemek, a nyálkahártyák változásaira, szekrétumok és autonóm aktivitás megjelenésére (pl. könnyezés, szőrmeredezés, pupillaméret, szokatlan légzési mintázat és/vagy szájon át történő légzés, szokatlan vizelés vagy székletürítés) irányuljanak.

25. Rögzíteni kell továbbá a testhelyzettel, aktivitási szinttel (pl. a standard terület csökkent vagy fokozott felderítése) és a mozgáskoordinációval kapcsolatos összes szokatlan választ is. A járás (pl. kacsázás, ataxia), a testtartás (pl. púpos tartás) és a megfogásra, elhelyezésre vagy más környezeti ingerekre adott reakció megváltozását, valamint a rángásos vagy görcsös mozgásokat, görcsös vonaglásokat, remegéseket, sztereotípiákat (pl. túlzott tisztálkodást, szokatlan fejmozgásokat, ismétlődő körbejárást), bizarr viselkedést (pl. harapást vagy túlzott nyalogatást, öncsonkítást, hátrafelé menést, hangadást) vagy agressziót is fel kell jegyezni.

26. A toxicitás tüneteit gondosan fel kell jegyezni, beleértve kialakulásuk napját és időpontját, a súlyosságot és az időtartamot.

27. Az állatokat a vizsgálat időtartama alatt legalább hetente egyszer meg kell mérni az adagoláskor, illetve az ellés napján vagy annak környékén, valamint a 21. posztnatális napon (PND 21) is (elválasztás). A gyomorszondával végzett vizsgálatok esetében az anyaállatokat legalább hetente kétszer kell megmérni. A dózist szükség esetén minden egyes testtömeg-meghatározás alkalmával be kell állítani. A táplálékfogyasztást legalább hetente kell mérni a vemhesség és a szoptatás alatt. A vízfogyasztást is legalább hetente kell mérni, ha az expozíció a vízellátáson keresztül történik.

Az utódok megfigyelése

28. Minden utódot legalább naponta gondosan meg kell figyelni a toxikus hatások, valamint a morbiditás és mortalitás észlelése céljából.

29. A kezelési és megfigyelési időszak során részletesebb klinikai megfigyeléseket is végezni kell az utódokon. Az utódokat (nemenként és almonként legalább 1 kölyköt) képzett technikusnak kell megvizsgálnia, aki nincs tisztában az állatok kezelésével és standardizált eljárásokat alkalmaz annak érdekében, hogy a megfigyelő elfogultságát minimalizálni, a megfigyelők közti megbízhatóságot pedig maximalizálni lehessen. Ahol lehetséges, célszerű, hogy a megfigyeléseket ugyanaz a technikus végezze. A megfigyelt fejlődési fázisnak megfelelően legalább a 24. és 25. bekezdésben leírt végpontokat ellenőrizni kell.

30. A toxicitás utódokban jelentkező minden tünetét gondosan fel kell jegyezni, beleértve a kialakulás napját és időpontját, a súlyosságot és az időtartamot.

Testi és fejlődési tájékozódási pontok

31. Az elválasztás előtti fejlődési tájékozódási pontok (pl. fülkagyló kitárulása, szem kinyílása, metszőfog előtörése) erősen korrelálnak a testtömeggel (30) (31). A testi fejlődés legjobb mutatója a testtömeg lehet. A fejlődési tájékozódási pontok mérése ezért csak akkor ajánlott, ha van korábbi bizonyíték arra, hogy ezek a végpontok további információkat nyújtanak. A fenti paraméterek értékelésének időzítése az 1. táblázatban látható. A várható hatásoktól és a kezdeti mérések eredményeitől függően tanácsos lehet további időpontokat hozzáadni, vagy a méréseket más fejlődési szakaszokban elvégezni.

32. A testi fejlődés értékelésekor célszerű a posztnatális életkor helyett a posztkoitális életkort használni (33). Ha a kölyköket az elválasztás napján vizsgáljuk, akkor ajánlott ezt a vizsgálatot a tényleges elválasztás előtt elvégezni, hogy kiküszöbölhető legyen az elválasztással járó stressz zavaró hatása. Ezenkívül a kölykök elválasztás utáni vizsgálatára nem kerülhet sor az elválasztást követő két napban.

1. táblázat

A testi és fejlődési tájékozódási pontok és a funkcionális/viselkedési végpontok értékelésének ütemezése (2)

Életkori szakaszok Végpontok Elválasztás előtt (3) Serdülőkor (3) Fiatal ivarérett egyedek (3) Testi és fejlődési tájékozódási pontok Testtömeg és klinikai megfigyelések hetente (4) legalább minden két hétben legalább minden két hétben Agytömeg PND 22 (5) befejezéskor Neuropatológia PND 22 (5) befejezéskor Nemi érés — szükség szerint — Egyéb fejlődési tájékozódási pontok (6) szükség szerint — — Funkcionális/viselkedési végpontok Viselkedési egyedfejlődés legalább két mérés Motoros aktivitás (beleértve a habituációt) 1-3 alkalommal (7) — egyszer Motoros és szenzoros funkció — egyszer egyszer Tanulás és memória — egyszer egyszer

33. Az élő kölyköket meg kell számolni és a nemüket meg kell állapítani pl. vizuális vizsgálattal vagy az anogenitális távolság mérésével (34) (35), illetve az alomban lévő valamennyi kölyköt egyenként meg kell mérni a születéskor vagy nem sokkal azt követően, valamint legalább hetente egyszer a szoptatási időszak alatt, és azt követően legalább kéthetente egyszer. A szexuális érés értékelése céljából a hüvelykinyílás (36) vagy fitymaelválás (37) jelentkezésekor almonként legalább egy hím és egy nőstény korát és testtömegét meg kell határozni.

Viselkedési egyedfejlődés

34. A kiválasztott viselkedések egyedfejlődését a megfelelő életkorban, almonként és ivaronként legalább egy kölykön kell mérni, ugyanazokat a kölyköket használva valamennyi vizsgálati napon az összes értékelt viselkedés vizsgálatára. A mérési napokat egyenletesen kell elosztani ebben az időszakban, hogy meghatározható legyen az adott magatartás egyedfejlődésének normál vagy a kezeléssel összefüggő változása (38). Néhány példa azokra a viselkedésekre, amelyek egyedfejlődését értékelni lehet: felegyenesedési reflex, negatív geotaxis és motoros aktivitás (38) (39) (40).

Motoros aktivitás

35. A motoros aktivitást (41) (42) (43) (44) (45) az elválasztás előtti időszakban és felnőtt korban egyaránt monitorozni kell. Az elválasztás idején történő vizsgálat tekintetében lásd a 32. bekezdést. A vizsgálatnak elegendő ideig kell tartania ahhoz, hogy demonstrálni lehessen a tesztmenet alatti habituációt a nem kezelt kontrollok esetében. Erősen ajánlott a motoros aktivitás használata a viselkedési egyedfejlődés értékelésére. Ha a viselkedési egyedfejlődés vizsgálatára használjuk, akkor a vizsgálathoz ugyanazokat az állatokat kell használni minden elválasztás előtti tesztmenet esetén. A vizsgálatnak elég gyakorinak kell lennie ahhoz, hogy értékelni lehessen a tesztmenet alatti habituáció egyedfejlődését (44). Ehhez három vagy több időpontra lehet szükség az elválasztást megelőzően, az elválasztás napját is beleértve (pl. PND 13, 17, 21). Ugyanezen állatok vagy alomtársaik vizsgálatára felnőtt korban is sort kell keríteni, a vizsgálat befejezésének időpontja környékén (pl. PND 60-70). Vizsgálatot további napokon is lehet végezni, amennyiben szükséges. A motoros aktivitást olyan automatizált aktivitásrögzítő készülékkel kell monitorozni, amely egyaránt képes észlelni az aktivitás növekedését és csökkenését (vagyis a kiindulási aktivitás az eszközzel mérve ne legyen olyan alacsony, hogy kizárja az aktivitás csökkenésének kimutatását, és ne legyen olyan magas, hogy kizárja az aktivitás növekedésének kimutatását). Minden eszközt olyan standard eljárásokkal kell bevizsgálni, amelyek a lehető legnagyobb mértékben garantálják a különböző eszközök folyamatos és megbízható működését. A kezelési csoportokat a lehetséges mértékben kiegyensúlyozottan kell szétosztani a készülékek között. Minden állatot egyedileg kell megvizsgálni. A kezelési csoportokat ellensúlyozni kell a vizsgálati időpontok között, hogy kiküszöbölhető legyen az aktivitás cirkadián ritmusának zavaró hatása. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti körülmények közötti eltérések és ne legyenek szisztematikus összefüggésben a kezeléssel. Változók, amelyek hatással lehetnek a viselkedés számos mutatójára, beleértve a motoros aktivitást is: zajszint, a vizsgálati ketrec mérete és alakja, hőmérséklet, relatív páratartalom, fényviszonyok, szagok, az otthoni ketrec vagy új vizsgálati ketrec használata és zavaró környezeti tényezők.

Motoros és szenzoros funkció

36. A motoros és szenzoros funkciót legalább egyszer részletesen meg kell vizsgálni a serdülő időszakban és egyszer a fiatal felnőtt időszakban is (pl. PND 60-70). Az elválasztás idején történő vizsgálatra vonatkozóan lásd a 32. bekezdést. Elegendő vizsgálatot kell végezni annak érdekében, hogy megfelelő kvantitatív mintavételre kerüljön sor a szenzoros módozatok (pl. szomato-szenzoros, vesztibuláris) és a motoros funkciók (pl. erő, koordináció) értékeléséhez. Néhány példa a motoros és szenzoros funkció vizsgálataira: extenzor tolóerő válasz (46), felegyenesedési reflex (47) (48), riasztó hanghatásokhoz való hozzászokás (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54), kiváltott potenciálok (55).

Tanulási és memóriatesztek

37. Az asszociatív tanulási és memóriatesztet az elválasztás után (pl. 25 ± 2 nap) és fiatal felnőttkorban (PND 60 és idősebb) kell elvégezni. Az elválasztás idején történő vizsgálat tekintetében lásd a 32. bekezdést. Ebben a két fejlődési szakaszban ugyanazt a vizsgálatot vagy különböző vizsgálatokat is lehet végezni. Az elválasztott és felnőtt patkányok esetében a tanulási és memóriavizsgálatok kiválasztásakor bizonyos fokú rugalmasság megengedett. A vizsgálatokat azonban úgy kell kialakítani, hogy azok megfeleljenek két kritériumnak. Egyrészt a tanulást egy több ismételt tanulási próba vagy szakasz során kialakuló változásként, vagy – az egyetlen próbát tartalmazó vizsgálatokban – egy olyan feltételre hivatkozva kell értékelni, amely a tanulási tapasztalat nem asszociatív hatását szabályozza. Másrészt a vizsgálatoknak az eredeti tanulás (akvizíció) mellett tartalmazniuk kell némi memóriamérést is (rövidtávú vagy hosszú távú), de ezt a memóriamérést az ugyanebből a vizsgálatból nyert akvizíció hiányában nem kell jelenteni. Amennyiben a tanulási és memóriatesztek kimutatják a vizsgált vegyi anyag hatását, mérlegelni kell további vizsgálatok elvégzését az érzékszervi, motivációs és/vagy a motoros képességek változásain alapuló alternatív értelmezések kizárása érdekében. A fenti két kritérium mellett ajánlott a tanulási és memóriatesztet a vizsgálat alatt álló vegyi anyag osztályával szemben igazolt érzékenység alapján kiválasztani, amennyiben ilyen információ rendelkezésre áll a szakirodalomban. Ilyen információ hiányában néhány példa azokra a vizsgálatokra, amelyeket átalakíthatók úgy, hogy megfeleljenek a fenti szempontoknak: passzív elkerülés (43) (56) (57), »delayed-matching-to-position« vizsgálat felnőtt patkányok (58) és napos patkányok esetén (59), olfaktorikus kondicionálás (43) (60), Morris-féle vízi labirintus (61) (62) (63), Biel- vagy Cincinnati-labirintus (64) (65), radiális kar labirintus (66), T-labirintus (43), menetrend-vezérelt viselkedés megszerzése és megtartása (26) (67) (68). Az elválasztott (26) (27) és a felnőtt patkányok esetében (19) (20) az irodalom további vizsgálatokat ír le.

Post mortem vizsgálat

38. Az anyaállatokat az utódok leválasztása után lehet elaltatni.

39. Az utódok neuropatológiai értékelését a 22. posztnatális napon (PND 22) vagy egy korábbi, a 11. és 22. posztnatális nap (PND 11 és PND 22) közötti időpontban, valamint a vizsgálat befejezésekor humánusan exterminált állatokból származó szöveteken kell elvégezni. A 22. posztnatális napon (PND 22) elpusztított utódok esetében az agyi szöveteket kell értékelni; a vizsgálat befejezésekor elpusztított állatok esetében a központi idegrendszeri (CNS) és a perifériás idegrendszeri (PNS) szövetmintákat is ki kell értékelni. A 22. posztnatális napon (PND 22) vagy korábban elpusztított állatokat immerzióval vagy perfúzióval lehet fixálni. A vizsgálat befejezésekor elpusztított állatokat perfúzióval kell fixálni. A szövetminták előkészítésének valamennyi lépése során, az állatok perfúziójától kezdve a szövetminták kimetszésén és a szövetek feldolgozásán át a metszetek festéséig, kiegyensúlyozott elrendezést kell alkalmazni úgy, hogy minden tételnek minden dóziscsoportból tartalmaznia kell reprezentatív mintákat. A neuropatológiára vonatkozó további útmutatás az OECD 20. iránymutatásában található (9), lásd még (103).

A szövetminták feldolgozása

40. A már a boncolás során nyilvánvaló súlyos rendellenességeket fel kell jegyezni. A szövetmintáknak az idegrendszer összes főbb régióját reprezentálniuk kell. A szövetmintákat megfelelő fixálóban kell tartani és a publikált standard szövettani protokolloknak megfelelően kell feldolgozni (69) (70) (71) (103). A paraffin-beágyazás elfogadható a központi idegrendszerből és a perifériás idegrendszerből származó szövetek esetében, de fixálás után ajánlott lehet az ozmium használata epoxi-beágyazással kombinálva, amennyiben magasabb felbontásra van szükség (pl. perifériás idegek esetében, ha perifériás neuropátia gyanúja merül fel és/vagy a perifériás idegek morfometriai analízise céljából). A morfometriai analízis céljára gyűjtött agyszöveteket minden dózisszinten egyidejűleg kell a megfelelő közegbe ágyazni annak érdekében, hogy elkerüljék a zsugorodási műtermékek kialakulását, amelyek a fixálószerben való hosszabb tároláshoz társulhatnak (6).

Neuropatológiai vizsgálatok

41. A kvalitatív vizsgálat céljai:

i. a neuropatológiai változásokat mutató régiók beazonosítása az idegrendszeren belül;

ii. a vizsgált vegyi anyaggal történt expozícióból eredő neuropatológiai elváltozások típusainak meghatározása; és

iii. a neuropatológiai változások súlyossági tartományának meghatározása.

A neuropatológiai elváltozások kimutatása céljából a szövetminták reprezentatív szövettani metszeteinek mikroszkópos vizsgálatát megfelelően képzett patológusnak kell elvégeznie. Minden neuropatológiai elváltozáshoz hozzá kell rendelni egy szubjektív fokot, amely az elváltozás súlyosságát jelzi. A hematoxilin-eozin festés elegendő lehet a 22. posztnatális napon (PND 22) vagy korábban humánusan exterminált állatok agyi metszeteinek kiértékelésére. A vizsgálat befejezésekor elpusztított állatokból származó központi és perifériás idegrendszeri metszetek esetében azonban a myelin festés (pl. Luxol Fast Blue/krezilibolya) vagy az ezüst festés (pl. Bielschowsky- vagy Bodians-festés) ajánlott. Figyelembe véve a patológus szakmai értékelését és a megfigyelt elváltoztatások jellegét, egyéb festési módszerek alkalmazása is megfelelőnek tekinthető bizonyos típusú elváltozások azonosítása és jellemzése céljából (pl. gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) vagy lektin hisztokémia a gliális és mikrogliális elváltozások értékelésére (72), fluoro-jade festés a nekrózis kimutatására (73) (74), vagy ezüst festés a specifikus idegi degeneráció kimutatására (75)).

42. Morfometriai (mennyiségi) értékelést kell végezni, mivel ezek az adatok segíthetnek a kezeléssel összefüggő hatások kimutatásában és értékes segítséget nyújtanak az agy tömegében vagy morfológiájában a kezeléssel összefüggésben kialakuló különbségek értelmezése során (76) (77). Az idegszöveti mintát úgy kell levenni és előkészíteni, hogy az lehetővé tegye a morfológiai értékelést. A morfometriai értékelések közé tartozik például a specifikus agyi régiók lineáris vagy területi mérése (78). A lineáris vagy területi mérések megbízható mikroszkopikus tájékozódási pontok alapján gondosan kiválasztott homológ metszetek használatát követelik meg (6). Sztereológiát lehet használni a kezelések egyes paraméterekre, mint például bizonyos neuroanatómiai régiók térfogatára vagy sejtjeinek számára gyakorolt hatásainak azonosítására (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43. Az agyakat meg kell vizsgálni a kezeléssel összefüggő neuropatológiai elváltozásokra és megfelelő mintákat kell venni minden nagyobb agyi régióból (pl. szaglóhagymák, cerebrális cortex, hippocampus, bazális ganglionok, thalamus, hypothalamus, középagy (tectum, tegmentum, és agyi pedunculusok), híd, nyúltvelő, kisagy) az alapos vizsgálat érdekében. Fontos, hogy a metszeteket az összes állat esetében ugyanabban a síkban kell készíteni. A vizsgálat befejezésekor humánusan elpusztított felnőtt egyedek esetében a gerincvelő és a perifériás idegrendszer reprezentatív részeiből kell mintát venni. A vizsgált területeknek magukban kell foglalniuk a szemet a látóideggel és a retinával, a gerincvelőt a nyaki és ágyéki megvastagodásnál, a dorzális és ventrális ideggyökérrostokat, a proximális ülőideget, a proximális sípcsonti ideget (a térdnél) és a sípcsonti ideg lábikraizom-ágait. A gerincvelőből és a perifériás idegekből készített metszeteknek mind keresztirányú vagy haránt irányú, mind hosszanti metszeteket tartalmazniuk kell.

44. A neuropatológiai értékelésnek a celluláris elváltozások (pl. neuronális vakuolizáció, degeneráció, nekrózis) és a szöveti elváltozások (pl. gliózis, leukocita infiltráció, cisztaképződés) vizsgálata mellett magában kell foglalnia az idegrendszert ért fejlődési károsodások vizsgálatát is (6) (85) (86) (87) (88) (89). Ebben a tekintetben fontos, hogy a kezeléssel összefüggő hatásokat meg kell különböztetni a normális fejlődési eseményektől, amelyek az állat elpusztításának időpontjában zajló fejlődési szakaszban előfordulhatnak (90). A fejlődési károsodásokat jelző jelentős elváltozások közé tartoznak egyebek között:

— a szaglóhagymák, a nagyagy és a kisagy bruttó méretének és alakjának megváltozása,

— a különböző agyi régiók relatív méretének változásai, beleértve a régiók méretének a normális körülmények között átmeneti sejtpopulációk vagy axonális projekciók elvesztése vagy fennmaradása miatti csökkenését vagy növekedését (pl. a kisagy külső germinális rétege, corpus callosum),

— a proliferáció, migráció és differenciálódás elváltozásai, amelyet a túlzott mértékű apoptózist vagy nekrózist mutató területek, az ektópiás, dezorientált vagy hibás alakulású neuronok klaszterei vagy szétszórt populációi, illetve az agykérgi struktúrák különböző rétegeinek relatív méretében kialakult módosulások jeleznek,

— a myelinizációs minták elváltozásai, beleértve a myelinhüvelyes struktúrák méretének csökkenését vagy megváltozott festődését,

— hydrocephalusra utaló bizonyíték, különösen a kamrák megnagyobbodása, az agyi vízvezeték szűkülete és az agyféltekék elvékonyodása.

A neuropatológiai elváltozások dózis-válasz összefüggéseinek elemzése

45. A kvalitatív és kvantitatív neuropatológiai analízisek céljára az alábbi többlépcsős eljárás ajánlott. Először a magas dózissal kezelt csoport metszeteit összehasonlítjuk a kontrollcsoport metszeteivel. Ha a magas dózissal kezelt csoportból származó állatokban nem található bizonyíték neuropatológiai elváltozásokra, nincs szükség további analízisre. Ha neuropatológiai elváltozások találhatók a magas dózissal kezelt csoportban, meg kell vizsgálni a közepes és az alacsony dózissal kezelt csoportokból származó állatokat. Ha a magas dózissal kezelt csoportot elhullás vagy más zavaró toxicitás miatt fel kell számolni, a magas és a közepes dózissal kezelt csoportokat meg kell vizsgálni neuropatológiai elváltozásokra. Ha a neurotoxicitás bármilyen jele mutatkozik a kisebb dózissal kezelt csoportokban, neuropatológiai analízist kell végezni. Ha a kvalitatív vagy kvantitatív vizsgálat során a kezeléssel összefüggő neuropatológiai elváltozások mutatkoznak, valamennyi dóziscsoport valamennyi állatának értékelése alapján meg kell határozni az előfordulás dózisfüggését, a léziók vagy morfológiai elváltozások gyakoriságát és súlyossági fokát. Az agy neuropatológiai elváltoztatást mutató valamennyi régióját be kell vonni ebbe az értékelésbe. A léziók minden típusa esetében be kell mutatni az egyes súlyossági fokok meghatározására használt jellemzőket, megjelölve azokat a jellemzőket, amelyek alapján különbséget tettünk az egyes fokozatok között. Az egyes léziók gyakoriságát és súlyosságát fel kell jegyezni, és statisztikai elemzést kell végezni a dózis-hatás összefüggés értékelése céljából. Kóddal ellátott metszetek használata ajánlott (91).

ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS

Adatok

46. Az adatokat külön-külön és táblázatos formában összesítve is jegyzőkönyvezni kell, minden egyes vizsgált csoport esetében megjelenítve az elváltozások típusát és az egyes elváltozásokat mutató anyaállatok, utódok (nem szerint) és almok számát. Ha az utódoknál közvetlen posztnatális expozíciót végeztünk, az útvonalat, valamint az expozíció időtartamát és időszakát is jegyzőkönyvezni kell.

Az eredmények értékelése és értelmezése

47. A fejlődési neurotoxicitási vizsgálat tájékoztatást nyújt egy vegyi anyaggal az in utero és a korai posztnatális fejlődés során történt ismételt expozíció hatásairól. Mivel mind az általános toxicitási, mind pedig a fejlődési neurotoxicitási végpontokra hangsúlyt fektetnek, a vizsgálat eredményei lehetővé teszik az általános anyai toxicitás hiányában is fellépő idegfejlődési hatások megkülönböztetését azoktól, amelyek az anyaállatra is csak toxikus szintek mellett fejeződnek ki. A vizsgálati elrendezésen belüli bonyolult összefüggések, a statisztikai elemzés, illetve az adatok biológiai jelentősége miatt a fejlődési neurotoxicitási adatok megfelelő értelmezéséhez szakértői értékelésre van szükség (107) (109). A vizsgálati eredmények értelmezéséhez a bizonyítékok súlyán alapuló megközelítést kell alkalmazni (20) (92) (93) (94). A viselkedési vagy morfológiai eredmények mintázatait, ha vannak ilyenek, valamint a dózis-válaszra utaló bizonyítékokat meg kell vitatni. A fejlődési neurotoxicitás értékelése szempontjából lényeges valamennyi vizsgálatból származó adatokat bele kell foglalni kell ebbe a jellemzésbe, beleértve az emberi epidemiológiai vizsgálatokat vagy esettanulmányokat, illetve az állatkísérleteket (pl. toxikokinetikai adatok, szerkezet-hatás információk és egyéb toxicitási vizsgálatok adatai). Ez magában foglalja a vizsgált vegyi anyag dózisai és a neurotoxikus hatás jelenléte vagy hiánya, gyakorisága és mértéke (nemenként) közötti kapcsolatot (20) (95).

48. Az adatok értékelésének tartalmaznia kell a biológiai és a statisztikai szignifikancia diszkusszióját. A statisztikai elemzést olyan eszköznek kell tekinteni, amely inkább segíti, mintsem meghatározza az adatok értelmezését. Egyedül a statisztikai szignifikancia hiánya alapján nem lehet a kezeléssel összefüggő hatás hiányára vonatkozó következtetést levonni, és egyedül a statisztikai szignifikancia alapján nem lehet a kezeléssel összefüggő hatásra sem következtetni. Az esetleges hamis negatív eredmények és a »negatív tények bizonyításának« nehézségei elleni védekezés érdekében tárgyalni kell a rendelkezésre álló pozitív és történeti kontroll adatokat, különösen akkor, ha nem mutatkoztak kezeléssel összefüggő hatások (102) (106). A hamis pozitív eredmények valószínűségét az adatok teljes statisztikai értékelésének fényében kell tárgyalni (96). Az értékelésnek tartalmaznia kell a megfigyelt neuropatológiai és viselkedési változások közötti kapcsolatot, ha van ilyen.

49. Minden eredményt elemezni kell a kísérleti elrendezésnek megfelelő statisztikai modellekkel (108). A paraméteres és nem paraméteres elemzés közötti választást meg kell indokolni, figyelembe véve olyan tényezőket, mint például az adatok jellege (transzformált vagy nem), eloszlása, valamint a kiválasztott statisztikai elemzési módszer relatív robusztussága. A vizsgálat céljának és elrendezésének útmutatóul kell szolgálnia a statisztikai elemzési módszer kiválasztásakor, hogy minimalizálni lehessen az I-es típusú (hamis pozitív) és a II-es típusú (hamis negatív) hibákat (96) (97) (104) (105). Az egyszerre többet ellő fajokat használó fejlődési vizsgálatok esetében, ahol almonként több kölyköt vizsgálunk, a statisztikai modellnek az almot is tartalmaznia kell, hogy csökkenteni lehessen az I-es típusú hibák arányát (98) (99) (100) (101). Statisztikai mértékegységül az almot kell választani, nem a kölyköt. A kísérleteket úgy kell megtervezni, hogy az alomtársakat ne tekintsük önálló megfigyelésnek. Az ugyanabban az alanyban többször mért végpontot olyan statisztikai modellel kell elemezni, amely figyelembe veszi, hogy ezek nem független mérések.

Vizsgálati jegyzőkönyv

50. A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia:

Vizsgált vegyi anyag:

— fizikai jelleg és szükség szerint a fizikai és kémiai tulajdonságok,

— azonosító adatok, beleértve a forrást is,

— a készítmény tisztasága, az ismert és/vagy várható szennyeződések.

Vivőanyag (ha van):

— a vivőanyag kiválasztásának indokolása, ha az nem víz vagy fiziológiás sóoldat.

Kísérleti állatok:

— az alkalmazott faj és törzs, és a patkánytól eltérő faj választásának indokolása,

— a kísérleti állatok szállítója,

— az állatok száma, kora a vizsgálat kezdetekor, neme,

— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány, víz stb.,

— az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetekor.

Vizsgálati körülmények:

— az adagolási szintek megválasztásának indokolása,

— az adagolási útvonal és időszak megválasztásának indokolása,

— a beadott dózisok, ezen belül a vivőanyagra, valamint a beadott anyag térfogatára és fizikai formájára vonatkozó adatok részletes leírása,

— a vizsgált vegyi anyag formulázásával/a takarmány előkészítésével, az elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitásával kapcsolatos adatok,

— az anyaállatok és az utódok egyedi azonosítására használt módszer,

— azon randomizálási eljárás(ok) részletes leírása, amelye(ke)t az anyaállatok kezelési csoportokhoz való hozzárendelésére, a kölykök selejtezésre történő kiválasztására, valamint a kölykök tesztcsoportokhoz való hozzárendelésére felhasználtunk,

— a vizsgált vegyi anyag beadására vonatkozó adatok,

— ha alkalmazandó, a vizsgált vegyi anyag takarmányban/ivóvízben lévő koncentrációjának (ppm) átszámítása a tényleges dózisra (mg/testtömeg kg/nap),

— környezeti feltételek,

— a táplálék és a víz minősége (pl. csapvíz, desztillált víz),

— a vizsgálat kezdetének és végének napja.

Megfigyelések és vizsgálati eljárások:

— a megfigyelések és az eljárások szabványosítására használt eljárások, valamint a megfigyelések pontozására szolgáló operatív definíciók részletes leírása,

— az alkalmazott vizsgálati eljárások listája az alkalmazásuk indokolásával,

— az alkalmazott viselkedési/funkcionális, patológiai, neurokémiai és elektrofiziológiai eljárások részletei, beleértve az automatizált eszközökre vonatkozó információkat és adatokat is,

— az eszközök kalibrálását szolgáló és egyenértékűségüket biztosító, illetve a kezelési csoportoknak a vizsgálati eljárásokban való kiegyensúlyozását biztosító eljárások,

— minden, szakmai megítélést igénylő döntés rövid indokolása.

Eredmények (egyenként és összefoglalóan, szükség szerint középértékek és szórásnégyzetek megadásával):

— az állatok száma a vizsgálat kezdetén és végén,

— az egyes vizsgálati módszerekhez felhasznált állatok és almok száma,

— az egyes állatok és származási almuk azonosító száma,

— az alomméret és az átlagos születéskori testtömeg nemenként,

— a testtömegre és a testtömeg változására vonatkozó adatok, beleértve az anyaállatoknak és az utódoknak a vizsgálat befejezésekor mért testtömegét is,

— takarmányfogyasztási és indokolt esetben vízfogyasztási adatok (például ha a vizsgált vegyi anyagot vízzel adtuk be),

— a toxikus reakciókra vonatkozó adatok nemek és adagolási szint szerint, beleértve a toxicitás jeleit vagy az elhullást, beleértve adott esetben az elhullás okát és időpontját is,

— a részletes klinikai megfigyelések jellege, súlyossága, időtartama, a fellépés napja, időpontja és lefolyása,

— a fejlődési tájékozódási pontok (testtömeg, szexuális érés és viselkedési egyedfejlődés) pontszámai az egyes megfigyelési időpontokban,

— a viselkedési, funkcionális, neuropatológiai, neurokémiai, elektrofiziológiai eredmények részletes leírása nemek szerint, beleértve a kontrollokhoz viszonyított növekedéseket és csökkenéseket is,

— boncolási eredmények,

— agytömegek,

— a neurológiai tünetekből és léziókból levezetett diagnózisok, beleértve a természetesen előforduló betegségeket vagy állapotokat is,

— a jellemzőnek tekintett leletekről készült képek,

— a morfometriára használt metszetek homológ voltának értékelésére szolgáló kis nagyítású képek,

— felszívódási és anyagcsereadatok, beleértve a külön toxikokinetikai vizsgálatból származó kiegészítő adatokat is, ha volt ilyen,

— az eredmények statisztikai feldolgozása, beleértve az adatok és az eredmények elemzésére használt statisztikai modelleket is, függetlenül attól, hogy szignifikánsak voltak-e vagy sem,

— a vizsgáló személyzet névjegyzéke, beleértve a szakmai képzéseket is.

Az eredmények diszkussziója:

— dózis-hatás információk nemenként és csoportonként,

— bármely más toxikus hatás és a vizsgált vegyi anyag neurotoxicitási potenciáljával kapcsolatban levont következtetések kapcsolata nemenként és csoportonként,

— a toxikokinetikai információk (ha vannak ilyenek) hatása a következtetésekre,

— hasonlóságok bármely ismert neurotoxikus anyag hatásaival,

— a vizsgálati módszer megbízhatóságát és érzékenységét alátámasztó adatok (pozitív és történeti kontrolladatok),

— a neuropatológiai és a funkcionális hatások közötti kapcsolatok, ha vannak ilyenek,

— NOAEL- vagy benchmarkdózis az anyaállatok és az utódok esetében, nemenként és csoportonként.

Következtetések:

— az adatok értelmezésének átfogó diszkussziója az eredmények alapján, beleértve az arra vonatkozó következtetést, hogy a vizsgált vegyi anyag okozott-e fejlődési neurotoxicitást vagy sem, valamint a NOAEL-t is.

SZAKIRODALOM

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13-14 June 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Elektronikus formátumban: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Elektronikus formátumban: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Elektronikus formátumban: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Elektronikus formátumban: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) E melléklet B.34. fejezete: Egygenerációs reprodukciós toxicitásvizsgálat.

(15) E melléklet B.35. fejezete: Kétgenerációs reprodukciós toxicitásvizsgálat.

(16) E melléklet B.43. fejezete: Neurotoxicitási vizsgálat rágcsálókban.

(17) E melléklet B.31. fejezete: Prenatális fejlődési toxicitásvizsgálat.

(18) Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről, HL L 276., 2010.10.20., 33. o.

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Elektronikus formátumban: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Elektronikus formátumban: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev. 6:247-296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16:545-561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

1. ábra

Általános vizsgálati elrendezés a funkcionális/viselkedési tesztekhez, a neuropatológiai értékeléshez és az agytömegek vizsgálatához. Ez a vázlatrajz a 13–15. bekezdésben foglalt leíráson alapul (PND = posztnatális nap). Az állatok besorolására vonatkozó példák az 1. függelékben találhatók.

1. függelék 1. A lehetséges besorolásokra vonatkozó példák bemutatása szöveges és táblázatos formában az alábbiakban található. Ezek a példák annak illusztrálására szolgálnak, hogy a vizsgálati állatok különböző tesztelési paradigmákba való besorolása több különböző módon is elvégezhető. 1. példa 2. Nemenként és dózisszintenként 20 kölyköt (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk a viselkedési egyedfejlődés elválasztás előtti tesztelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 nőstény kölyköt) a 22. posztnatális napon (PND 22) humánusan elpusztítunk. Az agyakat eltávolítjuk, lemérjük, és feldolgozzuk a szövettani értékeléshez. Ezen túlmenően agytömeg-adatokat gyűjtünk a dózisszintenként fennmaradó 10 hím és 10 nőstény állat fixálatlan agyának felhasználásával. 3. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk az elválasztás utáni funkcionális/viselkedési tesztek céljára (részletes klinikai vizsgálatok, motoros aktivitás, riasztó hanghatások és kognitív funkciók tesztelése serdülő állatokban) és a szexuális éréskori életkor értékelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 nőstény kölyköt) a vizsgálat befejezésekor (kb. PND 70) elaltatunk és perfúzióval rögzítünk. További in situ fixálást követően az agyat eltávolítjuk, és feldolgozzuk a neuropatológiai értékeléshez. 4. A kognitív funkciók fiatal felnőtt egyedekben (pl. PND 60-70) történő vizsgálatához egy harmadik adag, nemenként és dózisszintenként 20 db (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény) kölyköt kell használni. Ezek közül az állatok közül nemenként és csoportonként 10 állatot (almonként 1 hím vagy 1 nőstény egyedet) a vizsgálat befejezésekor el kell pusztítani, az agyakat el kell távolítani, majd megmérni. 5. A maradék 20 állat/nem/csoport esetleges további vizsgálatok számára van fenntartva. 1. táblázat Kölyök sorszáma (8) A vizsgálatba besorolt kölykök száma Vizsgálat/Teszt h n 1 5 20 h + 20 n Viselkedési egyedfejlődés 10 h + 10 n PND 22 agytömeg/neuropatológia/morfometria 10 h + 10 n PND 22 agytömeg 2 6 20 h + 20 n Részletes klinikai megfigyelések 20 h + 20 n Motoros aktivitás 20 h + 20 n Nemi érés 20 h + 20 n Motoros és szenzoros funkció 20 h + 20 n Tanulás és memória (PND 25) 10 h + 10 n Fiatal felnőtt agytömeg/neuropatológia/morfometria ~PND 70 3 7 20 h + 20 n Tanulás és memória (fiatal felnőtt egyedek) 10 h + 10 n Fiatal felnőtt agytömeg ~PND 70 4 8 — Tartalék állatok pótlás vagy további tesztek céljára 2. példa 6. Nemenként és dózisszintenként 20 kölyköt (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény) használunk a viselkedési egyedfejlődés elválasztás előtti tesztelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (almonként 1 hím vagy 1 nőstény kölyköt) humánusan elpusztítunk a 11. posztnatális napon (PND 11). Az agyakat eltávolítjuk, lemérjük, és feldolgozzuk a szövettani értékeléshez. 7. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk az elválasztás utáni vizsgálatok céljára (részletes klinikai megfigyelések, motoros aktivitás, a szexuális éréskori életkor értékelése, motoros és szenzoros funkció). Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 nőstény kölyköt) a vizsgálat befejezésekor (kb. PND 70) elaltatunk és perfúzióval rögzítünk. További in situ fixálást követően az agyat eltávolítjuk, megmérjük, és feldolgozzuk a neuropatológiai értékeléshez. 8. A kognitív funkciók serdülő és fiatal felnőtt egyedekben történő vizsgálatához nemenként és dózisszintenként 10 db kölyköt használunk (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt). Különböző állatokat használunk a kognitív funkció vizsgálatához a 23. posztnatális napon (PND 23) és fiatal felnőttekben. A vizsgálat befejezésekor a felnőttkorban vizsgálandó nemenkénti és csoportonkénti 10 állatot elpusztítjuk, majd az agyakat eltávolítjuk és megmérjük. 9. A vizsgálatra ki nem választott maradék 20 db/nem/csoport állatot az elválasztáskor elpusztítjuk és eltávolítjuk. 2. táblázat Kölyök sorszáma (9) A vizsgálatba besorolt kölykök száma Vizsgálat/Teszt h n 1 5 20 h + 20 n Viselkedési egyedfejlődés 10 h + 10 n PND 11 agytömeg/neuropatológia/morfometria 2 6 20 h + 20 n Részletes klinikai megfigyelések 20 h + 20 n Motoros aktivitás 20 h + 20 n Nemi érés 20 h + 20 n Motoros és szenzoros funkció 10 h + 10 n Fiatal felnőtt agytömeg/neuropatológia/morfometria ~PND 70 3 7 10 h + 10 n (10) Tanulás és memória (PND 23) 3 7 10 h + 10 n (10) Tanulás és memória (fiatal felnőtt egyedek) Fiatal felnőtt agytömeg 4 8 — Az állatokat a 21. posztnatális napon (PND 21) elpusztítjuk és eltávolítjuk. 3. példa 10. Nemenként és dózisszintenként 20 kölyköt (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk a 11. posztnatális napon (PND 11) az agytömeg mérésére és a neuropatológiai értékelésre. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 nőstény kölyköt) a 11. posztnatális napon (PND 11) humánusan elpusztítunk, majd az agyakat eltávolítjuk, lemérjük és feldolgozzuk a kórszövettani értékeléshez. Ezen túlmenően agytömeg-adatokat gyűjtünk a dózisszintenként fennmaradó 10 hím és 10 nőstény állat fixálatlan agyának felhasználásával. 11. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk a viselkedési egyedfejlődés (motoros aktivitás) értékelésére, illetve az elválasztás utáni vizsgálatok céljára (motoros aktivitás, a szexuális éréskori életkor értékelése), valamint a serdülőkori kognitív funkció tesztelésére. 12. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk a motoros és szenzoros funkciós tesztek (riasztó hanghatások) és a részletes klinikai megfigyelések céljára. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 nőstény kölyköt) a vizsgálat befejezésekor (kb. PND 70) elaltatunk és perfúzióval rögzítünk. További in situ fixálást követően az agyat eltávolítjuk, megmérjük, és feldolgozzuk a neuropatológiai értékeléshez. 13. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 1 nőstény kölyköt) használunk a fiatal felnőtt egyedek kognitív funkciójának tesztelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és csoportonként 10 állatot (azaz almonként 1 hím vagy 1 nőstény egyedet) a vizsgálat befejezésekor elpusztítunk, az agyakat eltávolítjuk, majd megmérjük. 3. táblázat Kölyök sorszáma (11) A vizsgálatba besorolt kölykök száma Vizsgálat/Teszt h n 1 5 10 h + 10 n PND 11 agytömeg/neuropatológia/morfometria 10 h + 10 n PND 11 agytömeg 2 6 20 h + 20 n Viselkedési egyedfejlődés (motoros aktivitás) 20 h + 20 n Motoros aktivitás 20 h + 20 n Nemi érés 20 h + 20 n Tanulás és memória (PND 27) 3 7 20 h + 20 n Riasztó hanghatások (serdülők és fiatal felnőtt egyedek) 20 h + 20 n Részletes klinikai megfigyelések 10 h + 10 n Fiatal felnőtt agytömeg/neuropatológia/morfometria ~PND 70 4 8 20 h + 20 n Tanulás és memória (fiatal felnőtt egyedek) 10 h + 10 n Fiatal felnőtt agytömeg

2. függelék Fogalommeghatározások Vegyi anyag: egy anyag vagy keverék Vizsgált vegyi anyag: bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék.

B.54. UTEROTROFIKUS BIOLÓGIAI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKBAN: GYORS SZŰRŐVIZSGÁLAT AZ ÖSZTROGÉNSZERŰ TULAJDONSÁGOK KIMUTATÁSÁRA

BEVEZETÉS

1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 440. vizsgálati iránymutatásában (2007) leírt módszerrel. Az OECD 1998-ban a meglévő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, valamint az endokrin rendszert esetlegesen károsító anyagok kiszűrésére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati iránymutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenységet indított (1). A tevékenység egyik eleme a rágcsáló uterotrofikus biológiai vizsgálati iránymutatásának kidolgozása volt. A rágcsáló uterotrofikus biológiai vizsgálatát ezután egy alapos validálási programnak vetették alá, beleértve a részletes háttér-dokumentáció összeállítását (2) (3), valamint a kiterjedt laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti vizsgálatokat, amelyek a biológiai vizsgálat relevanciáját és reprodukálhatóságát vizsgálták erős referencia-ösztrogénnel, gyenge ösztrogén-receptor agonistákkal, erős ösztrogén-receptor antagonistával, illetve negatív referencia vegyi anyaggal (4) (5) (6) (7) (8) (9). A B.54 vizsgálati módszer a validálási tesztprogram során szerzett tapasztalatokon és az ösztrogén agonistákkal kapcsolatban ennek keretében gyűjtött eredményeken alapul.

2. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat egy gyors szűrővizsgálat, amelyet eredetileg az 1930-as években fejlesztettek ki (27) (28), és elsőként egy szakértői bizottság szabványosította szűrés céljára 1962-ben (32) (35). A vizsgálat a méh tömegének növekedésén vagy az uterotrofikus válasz fokozódásán alapul (összefoglalásért lásd: 29). Abból a szempontból értékeli a vegyi anyagokat, hogy képesek-e a természetes ösztrogének (például 17ß-ösztradiol) agonistáiéhoz vagy antagonistáiéhoz hasonló biológiai aktivitást kiváltani, habár sokkal ritkábban használják antagonisták, mint agonisták kimutatására. A méh kétféle módon reagál az ösztrogénre. A kezdeti válasz részben a megnövekedett vízfelvétel miatti tömeggyarapodás. Ezt a választ a szöveti osztódás miatti tömeggyarapodás követi (30). A méh által adott válaszok a patkányokban és az egerekben minőségileg hasonlóak.

3. Ez a biológiai vizsgálat in vivo szűrővizsgálati célokat szolgál, és alkalmazását az »OECD fogalmi kerete az endokrin rendszert károsító vegyi anyagok tesztelésére és értékelésére« (2. függelék) összefüggésében kell szemlélni. Ebben a fogalmi keretben a uterotrofikus biológiai vizsgálatot a 3. szint tartalmazza olyan in vivo vizsgálatként, amely egyetlen endokrin mechanizmusról, az ösztrogénszerű hatásról szolgáltat adatokat.

4. A uterotrofikus biológiai vizsgálatot arra használják, hogy beépítik az endokrin rendszerrel potenciálisan kölcsönhatásba lépő vegyi anyagok azonosítására szolgáló in vitro és in vivo vizsgálatsorozatba, amely végső soron az emberi egészségre vagy a környezetre gyakorolt kockázatok értékelését célozza. Az OECD validálási program erős és gyenge ösztrogén agonistákat egyaránt használt a vizsgálat ösztrogénszerű aktivitással rendelkező vegyszerek azonosítása terén nyújtott teljesítményének értékelésére (4) (5) (6) (7) (8). Ezáltal a vizsgálati eljárás érzékenysége az ösztrogén agonisták tekintetében jól bizonyított, jó laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság mellett.

5. Ami a negatív vegyi anyagokat illeti, csak egyetlen »negatív« referencia vegyi anyag szerepelt a validálási programban, amelyet már negatívnak talált úgy az uterotrofikus vizsgálat, mint az in vitro receptorkötési és receptorvizsgálatok, de további, az OECD validálási programmal összefüggésben nem álló vizsgálati adatokat is kiértékeltek, hogy még jobban alátámasszák az uterotrofikus biológiai vizsgálat ösztrogén agonisták szűrése terén mutatott specificitását (16).

KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK

6. Az ösztrogén agonisták és antagonisták ligandumként hatnak az a és b ösztrogén receptorokra és aktiválhatják vagy gátolhatják a receptorok transzkripciós működését. Ez káros egészségügyi kockázatokat eredményezhet, beleértve a reproduktív és a fejlődési hatásokat. Ezért fennáll az igény a vegyi anyagok lehetséges ösztrogén agonista vagy antagonista hatásának gyors felmérésére és értékelésére. Bár informatív, a ligandum affinitása egy ösztrogén receptorhoz vagy a riporter gének in vitro transzkripciós aktiválása csak egy a lehetséges veszélyt meghatározó számos tényező közül. További tényezők lehetnek a szervezetbe történő belépéskor bekövetkező metabolikus aktiválódás és deaktiválódás, a célszövetekbe történő disztribúció, illetve a szervezetből történő kiürülés, amelyek legalább részben a beadás módjától és a vizsgált vegyi anyagtól függenek. Ennek következtében szükség van arra, hogy in vivo, azaz aktuális körülmények között szűrjék a vegyi anyagok lehetséges aktivitását, kivéve, ha a vegyi anyag jellemzői a felszívódás-eloszlás-metabolizmus-kiürülés (absorption-distribution-metabolism-elimination, ADME) tekintetében már jelenleg is megfelelő információkat szolgáltatnak. A méh szövetei gyors és erőteljes növekedéssel reagálnak az ösztrogének általi stimulációra, különösen laboratóriumi rágcsálókban, ahol az ösztrogénciklus körülbelül 4 napig tart. A rágcsálófajokat, különösen a patkányokat, széles körben használják a kockázatok jellemzését célzó toxicitási vizsgálatokra is. Ezért a rágcsálók méhe megfelelő célszerv az ösztrogén agonisták és antagonisták in vivo szűrésére.

7. A vizsgálati módszer az OECD validálási vizsgálatban alkalmazott azon protokollokon alapul, amelyeket a laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti vizsgálatokban megbízhatónak és megismételhetőnek találtak (5) (7). Jelenleg két módszer, nevezetesen az ovariektomizált kifejlett nőstény módszer (ovx-felnőtt módszer), és az éretlen, nem ovariektomizált módszer (éretlen módszer) áll rendelkezésre. Az OECD validálási tesztprogramban bebizonyosodott, hogy a két módszer összehasonlítható érzékenységgel és reprodukálhatósággal rendelkezik. Az éretlen módszer azonban, mivel az állatok érintetlen hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengellyel rendelkeznek, valamivel kevésbé specifikus, viszont a benne foglalt vizsgálatok köre nagyobb, mint az ovariektomizált módszer esetében, mert reagálni képes azokra a vegyi anyagokra is, amelyek nemcsak az ösztrogén receptorral, hanem a HPG-tengellyel is kölcsönhatásba lépnek. A patkány HPG-tengelye körülbelül 15 napos korban kezd működni. Ezt megelőzően a pubertást nem lehet olyan kezelésekkel felgyorsítani, mint pl. a GnRH. Amikor a nőstények kezdik elérni a pubertáskort, a nőstényeknek a hüvelykinyílás előtt több csendes ciklusuk van, amelyek nem eredményeznek hüvelykinyílást vagy ovulációt, de hormonális ingadozások megfigyelhetők. Ha egy vegyi anyag közvetlenül vagy közvetve serkenti a HPG-tengelyt, az korai pubertást, korai ovulációt és gyorsított hüvelykinyílást eredményez. Nemcsak a HPG tengelyre ható vegyi anyagok képesek erre, hanem néhány magasabb metabolizálható energiaszintet tartalmazó étrend is, amelyek serkentik a növekedést és felgyorsítják a hüvelykinyílást, anélkül, hogy ösztrogénszerű hatásuk lenne. Az ilyen vegyi anyagok nem váltanak ki uterotrofikus választ az OVX felnőtt állatokban, mivel a HPG-tengelyük nem működik.

8. Állatjóléti okok miatt az éretlen patkányokat használó módszert kell előnyben részesíteni, elkerülve az állatok műtéti előkezelését és elkerülve azoknak az állatoknak a kihagyását, amelyek kezdődő ivarzásra utaló bármilyen jelet mutatnak (lásd 30. bekezdés).

9. Az uterotrofikus válasz nem teljesen ösztrogén eredetű, azaz az ösztrogén agonistákon vagy antagonistákon kívül egyéb vegyi anyagok is választ válthatnak ki. Például a progeszteron, a tesztoszteron, vagy a különféle szintetikus progesztinek viszonylag nagy dózisai mind stimulációhoz vezethetnek (30). Bármilyen választ szövettanilag lehet elemezni a keratinizáció és a hüvely-elszarusodás jelenlétére (30). A válasz lehetséges eredetétől függetlenül az uterotrofikus biológiai vizsgálat pozitív eredménye alapján további tisztázást célzó intézkedéseket kell kezdeményezni. Az ösztrogénszerű hatásra vonatkozó további bizonyítékokat lehet gyűjteni az in vitro vizsgálatokból, úgymint az ER kötődési vizsgálatokból és transzkripciós aktiválási vizsgálatokból, illetve más in vivo vizsgálatokból, úgymint a nőstény pubertás vizsgálatból.

10. Figyelembe véve, hogy az uterotrofikus biológiai vizsgálat in vivo szűrővizsgálatként szolgál, a kiválasztott validálási megközelítés egyaránt megfelelt az állatjólléti megfontolásoknak és a lépcsőzetes vizsgálati stratégiának. Ezért az erőfeszítések arra összpontosultak, hogy alaposan validálják az ösztrogénszerű hatás – amely a fő aggály számos vegyi anyaggal szemben – reprodukálhatóságát és érzékenységét, míg a vizsgálat antiösztrogén elemére kevesebb figyelem irányult. Csak egyetlen erős aktivitású antiösztrogént vizsgáltak, mivel az egyértelmű antiösztrogén-profillal (amelyet nem fed el valamilyen ösztrogénszerű aktivitás) rendelkező vegyi anyagok száma nagyon korlátozott. Így ez a vizsgálati módszer az ösztrogén protokollhoz tartozik, míg a vizsgálat antagonista módozatát leíró protokollt az iránymutatás tartalmazza (37). A tisztán antiösztrogén aktivitású vegyi anyagok esetében a vizsgálat reprodukálhatóságát és érzékenységét később fogják pontosabban meghatározni, miután a vizsgálati eljárást már egy ideig rutinszerűen használták, és több ilyen aktivitással rendelkező vegyi anyagot beazonosítottak.

11. Minden állatkísérleteken alapuló eljárást az állatgondozásra vonatkozó helyi szabványoknak megfelelően kell végrehajtani; az alábbiakban foglalt, gondozásra és kezelésre vonatkozó leírások minimális teljesítményszabványok, amelyeket a helyi szabályozások – mint például a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv (2010. szeptember 22.) (38) – felülírnak (38). Az állatokkal való humánus bánásmódról további iránymutatás a megfelelő OECD-kiadványban található (25).

12. Mint minden, élő állatok felhasználásával végzett vizsgálat esetében, már a vizsgálat megkezdése előtt alapvető fontosságú ellenőrizni, hogy az adatok valóban szükségesek-e. Két olyan körülmény, amikor például az adatokra szükség lehet:

— magas expozíciós potenciál (az elvi keretrendszer 1-es szintje, 2. függelék) vagy ösztrogénszerű hatásra utaló jelek (2. szint) esetén annak vizsgálata, hogy az ilyen hatások in vivo is előfordulhatnak-e,

— a 4. vagy 5. szintű in vivo tesztekben mutatott ösztrogénszerű hatásra utaló jelek esetén annak alátámasztása, hogy a hatás kapcsolatban áll egy olyan ösztrogén-mechanizmussal, amelyet nem lehet in vitro vizsgálattal tisztázni.

13. Az ebben a vizsgálati módszerben használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.

A VIZSGÁLAT ELVE

14. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat az érzékenység tekintetében egy állatkísérletekből álló rendszerre támaszkodik, amelyben a hipotalamusz-hipofízis-petefészek tengely nem működik, ami a keringő ösztrogén alacsony endogén szintjét eredményezi. Ez alacsony kiindulási méhtömeget és maximális választartományt biztosít a beadott ösztrogénre. Két ösztrogénre érzékeny állapot felel meg ennek a követelménynek nőstény rágcsálókban:

i. éretlen nőstények az elválasztás után és a pubertás előtt; és

ii. fiatal kifejlett nőstények a petefészek eltávolítása után, megfelelő időt adva a méhszövetek visszafejlődésére.

15. A vizsgált anyagot orális szondán keresztül vagy szubkután injekció formájában naponta adagoljuk. A vizsgált vegyi anyag fokozatos dózisait adjuk be a kísérleti állatok legalább két kezelési csoportjának (iránymutatásért lásd a 33. bekezdést), csoportonként egy dózisszintet használva, az anyagot az éretlen módszer esetében három egymást követő napon, az ovx felnőtt módszer esetében pedig minimálisan három egymást követő napon beadva. Az állatokat körülbelül 24 órával az utolsó dózis után felboncoljuk. Ösztrogén agonisták esetében a kezelt állatcsoport átlagos méhtömegét a vivőanyag-csoporthoz viszonyítva értékeljük a statisztikailag szignifikáns növekedés kimutatása érdekében. A vizsgálati csoport átlagos méhtömegének statisztikailag szignifikáns növekedése pozitív választ jelent a biológiai vizsgálatban.

A MÓDSZER ISMERTETÉSE

Az állatfaj kiválasztása

16. Általánosan használt laboratóriumi rágcsálótörzseket lehet alkalmazni. A validálás során például Sprague-Dawley- és Wistar-patkánytörzseket használtak. Az ismert vagy feltételezett alacsonyabb érzékenységű méhvel rendelkező törzseket nem szabad használni. A laboratóriumnak a 26. és 27. bekezdésben leírtak szerint bizonyítania kell a felhasznált törzs érzékenységét.

17. A patkányt és az egeret már az 1930-as évek óta használják rutinszerűen az uterotrofikus biológiai vizsgálatban. Az OECD validálási vizsgálatokat csak patkányokon végezték el azon az alapon, hogy a két fajt egyenértékűnek tekintették, ezért egy fajnak elegendőnek kell lennie a világméretű validálás céljára, hogy erőforrásokat és állatokat lehessen megtakarítani. A patkány a választott faj a legtöbb reprodukciós és fejlődési toxicitási vizsgálat esetében. Figyelembe véve, hogy hatalmas történelmi adatbázis létezik egerekre, egy korlátozott nyomonkövetésű validálási vizsgálatot végeztek egereken is annak érdekében, hogy az uterotrofikus biológiai vizsgálati módszert kiterjesszék az egerek kísérleti fajként való használatára (16). Egy áthidaló megközelítést választottak korlátozott számú vizsgált vegyi anyaggal, részt vevő laboratóriummal és nem kódolt minták vizsgálatával, összhangban az erőforrások és állatok megtakarítását célzó eredeti szándékkal. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat fiatal felnőtt ovariektomizált egerekben végzett áthidaló validálási vizsgálata azt mutatja, hogy a patkányokban és egerekben kapott adatok minőségi és mennyiségi szempontból jól megfelelnek egymásnak. Ha az uterotrofikus biológiai vizsgálat eredménye egy hosszú távú vizsgálat előzménye, akkor mindkét kísérlethez ugyanabból a törzsből való, azonos eredetű állatokat használhatnak. Az áthidaló megközelítés az OVX egerekre korlátozódott és a jelentés nem nyújt megbízható adatsort az éretlen modell validálásához, ezért az egerek éretlen modelljét nem veszik figyelembe a jelenlegi vizsgálati módszer alkalmazási területén.

18. Így bizonyos esetekben patkányok helyett egereket is lehet használni. Ennek fajnak a használatát toxikológiai, farmakokinetikai és/vagy egyéb kritériumokkal meg kell indokolni. Egerekben szükség lehet a protokoll módosítására. Például az egerek testtömeghez viszonyított takarmányfogyasztása nagyobb, mint a patkányoké, ezért a takarmány fitoösztrogén-tartalmának alacsonyabbnak kell lennie egerek, mint patkányok esetében (9) (20) (22).

Tartási és etetési körülmények

19. Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonatkozó helyi szabványoknak. Ezek a gondozásra és kezelésre vonatkozó leírások minimális teljesítményszabványok, amelyeket a helyi szabályozások – mint például a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv (2010. szeptember 22.) (38) – felülírnak (38). A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség hőmérséklete 22 °C (kb. ±3 °C eltérési tartománnyal) kell, hogy legyen. A helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie és a takarítás időtartamától eltekintve lehetőleg ne haladja meg a 70 %-ot. A relatív páratartalom célértékének 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges. Naponta 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.

20. A laboratóriumi takarmányt és az ivóvizet korlátozás nélkül kell biztosítani. A fiatal felnőtt állatok egyedileg vagy legfeljebb három egyedből álló csoportokban is tarthatók. Az éretlen állatok fiatal kora miatt társas, csoportos tartás ajánlott.

21. A laboratóriumi takarmányok magas fitoösztrogén-tartalmáról már ismert, hogy olyan mértékben növeli meg a rágcsálók méhének tömegét, amely már zavarja az uterotrofikus biológiai vizsgálatot (13) (14) (15). A laboratóriumi takarmányok magas fitoösztrogén- és metabolizálható energia tartalma korai pubertáshoz is vezethet, ha éretlen állatokat használnak. A fitoösztrogének jelenléte elsősorban a szója és lucerna laboratóriumi takarmányba való beépítésének eredménye és a fitoösztrogének koncentrációja a standard laboratóriumi takarmány egyes gyártási tételei között is változik (23). A testtömeg egy fontos változó, mivel az elfogyasztott takarmány mennyisége összefügg a testtömeggel. Ezért az ugyanabból a takarmányból ténylegesen felvett fitoösztrogén-dózis állatfaj és életkor szerint különbözhet (9). Az éretlen nőstény patkányok testtömeg alapján számított takarmányfogyasztása mintegy kétszerese lehet az ovariektomizált fiatal felnőtt nőstényekének. A fiatal felnőtt egerek testtömeg alapján számított takarmányfogyasztása mintegy négyszerese lehet az ovariektomizált fiatal felnőtt nőstény patkányokénak.

22. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat eredményei (9) (17) (18) (19) azonban azt mutatják, hogy korlátozott mennyiségű étrendi fitoösztrogén elfogadható és nem csökkenti a biológiai vizsgálat érzékenységét. Iránymutatásként, a fitoösztrogének étrendi szintje nem haladhatja meg a 350 μg genistein ekvivalens/gramm laboratóriumi takarmány értéket éretlen nőstény Sprague-Dawley- és Wistar-patkányok esetében (6) (9). Az ilyen étrend is megfelelő a fiatal felnőtt ovariektomizált patkányok vizsgálatkor, mivel a testtömegre vetített takarmányfogyasztás kisebb a fiatal felnőtt, mint a kifejlett állatokban. Amennyiben kifejlett ovariektomizált egereket vagy fitoösztrogénekre érzékenyebb patkányokat kell használni, oda kell figyelni az étrendi fitoösztrogénszint arányos csökkentésére (20). Ezen túlmenően, a különféle étrendek elérhető metabolikus energiájában mutatkozó különbségek a pubertás időpontjának eltolódásához vezethetnek (21) (22).

23. A vizsgálat előtt gondosan ki kell választani egy olyan étrendet, amelynek nem magas a fitoösztrogén- vagy metabolizálható energiaszintje (útmutatásért lásd (6) (9)), amelyek zavarhatnák az eredményeket (15) (17) (19) (22) (36). A laboratórium által használt vizsgálati rendszer 26. és 27. bekezdésekben meghatározott megfelelő teljesítményének biztosítása érdekében mindkét tényezőt ellenőrizni kell. A helyes laboratóriumi gyakorlattal (GLP) összhangban lévő biztonsági intézkedésként reprezentatív mintavételt kell végezni a vizsgálat során alkalmazott takarmány minden egyes tételéből a takarmány fitoösztrogén-tartalmának esetleges analízise céljából (pl. ha a kontroll méhtömeg magas a történelmi kontrollokhoz viszonyítva, vagy ha a referencia ösztrogén, a 17-alfa-etinil-ösztradiol nem eredményez megfelelő választ). Az aliquotokat a vizsgálat részeként, vagy – 20°C-on fagyasztva, vagy olyan módon kell analizálni, amely megakadályozza a minták analízis előtti lebomlását.

24. Egyes alomanyagok természetes ösztrogén vagy antiösztrogén hatású vegyi anyagokat tartalmazhatnak (pl. a kukoricacsutkáról közismert, hogy befolyásolja a patkányok ciklusát és antiösztrogén hatású). A kiválasztott alomanyagnak minimális mennyiségű fitoösztrogént szabad tartalmaznia.

Az állatok előkészítése

25. A betegségekre vagy fizikai rendellenességekre utaló jeleket nem mutató kísérleti állatokat véletlenszerűen kell besorolni a kontroll- és a kezelési csoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Az állatokat egyedi azonosítóval kell ellátni. Előnyös, ha az éretlen állatokat az akklimatizáció alatt az elválasztásig az anyaállatokkal vagy nevelőanyákkal közös ketrecekben helyezik el. Az akklimatizációs időszak a vizsgálat kezdete előtt fiatal felnőtt állatok és anyaállatokkal vagy nevelőanyákkal együtt szállított éretlen állatok esetében körülbelül 5 nap. Ha az éretlen állatokat választott állatokként, anyaállatok nélkül kapja meg a laboratórium, rövidebb időtartamú akklimatizációs időszak válhat szükségessé, mivel az adagolást az elválasztás után azonnal meg kell kezdeni (lásd a 29. bekezdést).

ELJÁRÁS

A laboratórium jártasságának igazolása

26. A laboratórium jártasságának ellenőrzésére két különböző módszert lehet alkalmazni:

— időszakos ellenőrzés, a kiindulási pozitív kontrollvizsgálatra támaszkodva (lásd a 27. bekezdést). Legalább hathavonta és minden alkalommal, amikor olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat teljesítményét (pl. új összetételű takarmány, változás a boncolást végző személy