6.

A melléklet a következő C.31–C.46. fejezettel egészül ki: „ C.31. SZÁRAZFÖLDI NÖVÉNYEK VIZSGÁLATA: CSÍRÁZÁS ÉS CSÍRANÖVEKEDÉS BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 208. vizsgálati iránymutatásában (2006) leírt módszerrel. A vizsgálati módszereket a tudományos fejlődés és a szabályozási célra történő használatra való alkalmazhatóság alapján rendszeresen felülvizsgálják. E frissített vizsgálati módszer célja, hogy megvizsgálja a vegyi anyagoknak a csírázásra és a csíranövekedésre gyakorolt potenciális hatásait. A vizsgálat nem terjed ki a szaporodásra (azaz a magképzésre, a virág kialakulására, a gyümölcs érésére) gyakorolt krónikus hatásokra. Az expozíció feltételeit és a vizsgálandó vegyi anyag tulajdonságait meg kell fontolni a megfelelő vizsgálati módszerek használatának biztosítása érdekében (például fémek/fémvegyületek vizsgálatakor a pH és a kapcsolódó ellenionok hatásait mérlegelni kell) (1). Ez a vizsgálati módszer nem foglalkozik a vegyi anyagok gőzeinek kitett növényekkel. A vizsgálati módszer általános vegyi anyagok, biocidek és növényvédő szerek (más néven peszticidek) tesztelésére alkalmazható. Meglévő módszerek alapján fejlesztették ki (2) (3) (4) (5) (6) (7). A növények vizsgálatára vonatkozó egyéb hivatkozásokat is figyelembe vettek (8) (9) (10). A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza. A VIZSGÁLAT ELVE 2. A vizsgálat a vizsgált vegyi anyagnak a magasabb rendű növények csírázására és korai növekedésére gyakorolt hatásait értékeli a talajon (vagy más alkalmas talajmátrixon) keresztül történő expozíciót követően. A magokat érintkezésbe helyezzük a vizsgált vegyi anyaggal kezelt talajjal, és a hatásokokat rendszerint 14–21 nap elteltével értékeljük, miután a csíranövények 50 %-a megjelent a kontrollcsoportban. A mért végpontok a csírázás vizuális értékelése, a hajtás száraz tömege (alternatívaként a friss hajtások tömege), és bizonyos esetekben a hajtás magassága, valamint a különböző növényi részeken látható káros hatások értékelése. A méréseket és megfigyeléseket összevetjük a kezeletlen kontroll növényekkel. 3. Az expozíció várható útvonalától függően a vizsgált vegyi anyagot el kell keverni a talajba (vagy esetleg a mesterséges talajmátrixba), vagy szét kell oszlatni a talaj felületén, ami megfelelően képviseli az adott vegyi anyagnak való expozíció potenciális útvonalát. A talajba való elkeverést ömlesztett talaj kezelésével végezhetjük. Az alkalmazást követően a talajt áthelyezzük a cserépbe, majd az adott növényfaj magjait ültetjük a talajba. A felületi alkalmazást a cserepes talajon végezzük, amelybe már beültettük a magokat. A vizsgálati egységeket (kontroll és kezelt talaj plusz magok) ezután megfelelő, a növények csírázását/növekedését támogató körülmények közé helyezzük. 4. A vizsgálatot a vizsgálat célja szerint el lehet végezni a dózis-válasz görbe meghatározása érdekében, vagy pedig egyetlen koncentráció/arány alkalmazásával határérték vizsgálatként. Ha az egyetlen koncentráció/arány vizsgálatának eredményei meghaladnak egy bizonyos toxicitási szintet (például hogy x %-nál nagyobb mértékű hatás figyelhető-e meg), akkor dózisbehatároló vizsgálatot kell végezni a toxicitás felső és alsó határértékeinek meghatározása céljából, amelyet egy több koncentrációban/arányban elvégzett vizsgálatnak kell követnie a dózis-válasz görbe felvétele céljából. Megfelelő statisztikai elemzést kell használni az érdeklődésre számot tartó legérzékenyebb paraméter(ek) ECx hatékony koncentrációjának vagy ERX hatékony alkalmazási arányának (pl. EC25, ER25, EC50, ER50) megállapításához. Továbbá, az észlelhető hatást még nem okozó koncentrációt (NOEC) és az észlelhető hatást okozó legkisebb koncentrációt (LOEC) is ki lehet számítani ebben a vizsgálatban. A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK 5. Az alábbi információ hasznos a vegyi anyag várható expozícós útvonalának azonosításához és a vizsgálat tervezéséhez: szerkezeti képlet, tisztaság, vízben való oldhatóság, szerves oldószerekben való oldhatóság, 1-oktanol-víz megoszlási hányados, talaj szorpciós viselkedés, gőznyomás, kémiai stabilitás vízben és fényben, illetve biológiai lebonthatóság. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE 6. A vizsgálat érvényességéhez az alábbi teljesítménykritériumoknak kell teljesülniük a kontrollcsoport(ok)ban: — a magoknak legalább 70 %-a kicsírázott; — a csíranövények nem mutatják fitotoxikus hatások látható jeleit (pl. klorózis, elhalás, hervadás, levél- és szárdeformációk) és a növények csak az adott fajnál szokásos növekedési és morfológiái változatosságot mutatják; — az átlagos túlélési arány a kikelt kontroll-csíranövények esetében legalább 90 % a vizsgálat időtartama alatt; — egy adott faj környezeti feltételei megegyeznek és a táptalaj ugyanakkora mennyiségű talajmátrixot, támogató közeget vagy ugyanabból a forrásból származó táptalajt tartalmaz. REFERENCIA-VEGYIANYAG 7. A referencia-vegyianyagot rendszeres időközönként ellenőrizni lehet annak igazolása céljából, hogy a vizsgálat elvégzése, az adott kísérleti növények által adott válasz és a vizsgálati feltételek nem változtak jelentősen az idő múlásával. Alternatív megoldásként a kontrollok élőanyagtömegének vagy növekedésének korábbi mérési eredményeit lehet felhasználni a vizsgálati rendszer adott laboratóriumban történő értékelésére, amely a laboratóriumon belüli minőségellenőrzési intézkedésként szolgálhat. A MÓDSZER LEÍRÁSA Természetes talaj – Mesterséges táptalaj 8. A növényeket cserépben lehet nevelni homokos vályog, agyagos homok, vagy homokos agyagos vályog használatával, amely legfeljebb 1,5 százalék szerves szént tartalmaz (kb. 3 százalék szerves anyag). A legfeljebb 1,5 százalék szerves szént tartalmazó kereskedelmi virágföldek vagy szintetikus talajkeverékek is használhatók. Agyagos talajok nem használhatók, ha a vizsgált vegyi anyagról közismert, hogy nagy az agyaghoz való affinitása. A terepről származó talajt a homogenizálás és a durva részecskék eltávolítása érdekében 2 mm lyukátmérőjű szitán meg kell szitálni. A végső előkészített talaj típusát és textúráját, százalékos szerves szén tartalmát, pH-ját, sótartalmát és elektronikus vezetőképességét meg kell adni a jelentésben. A talajt be kell sorolni a standard osztályozási rendszer szerint (11). A talajt pasztőrözni vagy hőkezelni lehet a talajkórokozók hatásának csökkentése érdekében. 9. A természetes talaj az eltérő fizikai/kémiai tulajdonságok és mikrobiális populációk miatt megnehezítheti az eredmények értelmezését és növelheti a változékonyságot. Ezek a változók megváltoztatják a nedvességmegtartó képességet, a kémiai megkötő képességet, az átszellőzést, valamint a tápanyag- és nyomelemtartalmat. E fizikai tényezők változékonysága mellett a kémiai tulajdonságok – például a pH és a redox potenciál – is változékonyak lehetnek, ami hatással lehet a vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhetőségére (12) (13) (14). 10. A mesterséges táptalajokat jellemzően nem használják a növényvédő szerek vizsgálatánál, de hasznosak lehetnek az általános vegyi anyagok vizsgálatának céljára, vagy ha arra van szükség, hogy minimálisra csökkentsük a természetes talajok variabilitását és jobban összehasonlíthatóak legyenek a vizsgálati eredmények. A táptalajoknak inert anyagokból kell állniuk, amelyek minimalizálják a vizsgált vegyi anyaggal, az oldószer hordozóanyaggal, vagy mindkettővel való kölcsönhatást. A savval mosott kvarchomokot, az ásványgyapotot és az üveggyöngyöket (pl. a 0,35-0,85 mm átmérőjű gyöngyöket) alkalmas inert anyagoknak találták, amelyek minimális mértékben nyelik el a vizsgált vegyi anyagot (15), és biztosítják, hogy a csíranövények a vegyi anyagot a gyökereiken keresztül maximális mértékben fel tudják venni. Az alkalmatlan táptalajok közé tartoznak a vermikulit, a perlit és az egyéb erősen nedvszívó anyagok. A növények számára tápanyagokat kell biztosítani annak érdekében, hogy a növényekre ne gyakoroljon stresszhatást a tápanyaghiány, és ahol lehetséges, ezt kémiai elemzés vagy a kontroll növények vizuális értékelése útján ellenőrizni kell. A vizsgált fajok kiválasztásának kritériumai 11. A kiválasztott fajoknak meglehetősen széleskörűnek kell lenniük, pl. a növényvilágon belüli rendszertani diverzitás, az elterjedtség, az előfordulási gyakoriság, az életciklus fajspecifikus jellemzői és a természetbeli előfordulás földrajzi területe tekintetében, hogy széles választartományt adjanak (8) (10) (16 ) (17) (18) (19) (20). A lehetséges vizsgálati fajok következő jellemzőit kell figyelembe venni a kiválasztás során: — a fajoknak egységes méretű magokkal kell rendelkezniük, amelyek a megbízható standard vetőmag forrás(ok)ból könnyen hozzáférhetőek, és konzisztens, megbízható és egyenletes csírázást, valamint a csíranövény egyenletes növekedését mutatják; — a növények alkalmasak a laboratóriumban végzett vizsgálatok céljára, illetve megbízható és reprodukálható eredményeket adnak a vizsgálati létesítményen belül és azok között; — a vizsgált fajok érzékenységének összhangban kell lennie a vegyi anyagnak kitett környezetben található növények által adott válaszokkal; — a fajokat bizonyos mértékig már használták korábbi toxicitási vizsgálatok során, és az alkalmazásuk során szerzett tapasztalatok – például gyomirtó biológiai vizsgálatokban, nehézfém szűrővizsgálatokban, sótartalommal kapcsolatos vagy ásványi stressz vizsgálatokban, illetve allelopátia vizsgálatokban – azt mutatják, hogy sokféle stresszorral szemben mutatnak érzékenységet; — összhangban vannak a vizsgálati módszer növekedési feltételeivel; — megfelelnek a vizsgálat érvényességi követelményeinek. Néhány korábban gyakran használt fajt a 2. függelék sorol fel, a potenciális nem terményfajok pedig a 3. függelékben találhatók. 12. A vizsgálandó fajok száma függ a vonatkozó jogszabályi követelményektől, ezért ezt a vizsgálati módszer nem határozza meg. A vizsgált vegyi anyag bevitele 13. A vegyi anyagot egy megfelelő hordozóban (pl. víz, aceton, etanol, polietilén-glikol, gumiarábikum, homok) kell bevinni. Hatóanyagokat és különböző segédanyagokat tartalmazó keverékeket (formulázott termékeket vagy készítményeket) is lehet vizsgálni. Bevitel a talajba/mesterséges táptalajba 14. A vízben oldható vagy vízben szuszpendált vegyi anyagokat vízhez adjuk, majd az oldatot egy megfelelő keverőberendezés segítségével összekeverjük a talajjal. Ez a fajta vizsgálat akkor lehet megfelelő, ha a vegyi anyagnak való kitettség a talajon vagy a talaj pórusaiban lévő vízen keresztül történik, és felmerül a gyökereken át történő felvétel lehetősége. A talaj vízmegtartó képességét a vizsgált vegyi anyag hozzáadásával nem szabad túllépni. A hozzáadott víz térfogatának meg kell egyeznie minden egyes kísérleti koncentráció esetében, de annak mértékét korlátozni kell, hogy a talaj agglomerátumok csomósodása megakadályozható legyen. 15. A vízben kevésbé oldódó vegyi anyagokat egy alkalmas illékony oldószerben (pl. aceton, etanol) fel kell oldani, és homokkal el kell keverni. Az oldószert ezután légáram használatával, a homok állandó kevergetése közben eltávolítjuk a homokból. A kezelt homokot összekeverjük a kísérleti talajjal. Létre kell hozni egy második kontroll mintát is, amely csak homokot és oldószert kap. Egyenlő mennyiségű homokot – a bekevert és eltávolított oldószerrel – kell adni minden kezelési szinthez és a második kontrollhoz. Szilárd, oldhatatlan vizsgált vegyi anyagok esetében a vegyi anyagot egy alkalmas keverő berendezés segítségével összekeverjük száraz talajjal. A továbbiakban a talajt hozzáadjuk a cserepekhez, és azonnal magokat vetünk bele. 16. Amikor talaj helyett mesterséges táptalajt használunk, a vízben oldható vegyi anyagokat közvetlenül a vizsgálat megkezdése előtt oldjuk fel a tápoldatban. A vízben oldhatatlan, de vízben oldószer hordozó segítségével szuszpendálható vegyi anyagokat a hordozóanyaggal együtt kell hozzáadni a tápoldathoz. A vízben nem oldódó vegyi anyagokat, amelyek esetében nem áll rendelkezésre nem-toxikus vízoldékony hordozó, egy megfelelő illékony oldószerben kell feloldani. Az oldatot összekeverjük homokkal vagy üveggyöngyökkel, behelyezzük egy forgó vákuum berendezésbe és elpárologtatjuk, így a vegyi anyag egyenletes bevonatot fog képezni a homokon vagy a gyöngyökön. A cserepek feltöltése előtt a gyöngyök egy lemért részét ugyanazzal a szerves oldószerrel extrahálni, majd a vegyi anyagra analizálni kell. Felületi alkalmazás 17. Növényvédő termékek esetében a vizsgált vegyi anyag bevitelére gyakran alkalmazzák a talaj felületének a vizsgálati oldattal való permetezését. A vizsgálatok során használt berendezéseknek, beleértve a vizsgált vegyi anyag elkészítésére és bevitelére használt berendezéseket, olyan elrendezésűnek és kapacitásúnak kell lenniük, hogy a berendezéseket használó vizsgálatokat a legpontosabb módon lehessen elvégezni és reprodukálható lefedettséget adjanak. A lefedettség egyenletes legyen a talaj egész felületén. Ügyelni kell arra, hogy elkerüljék annak lehetőségét, hogy a vegyi anyagokat a berendezések adszorbeálják vagy azokkal reakcióba lépjenek (pl. műanyag csövek és lipofil vegyi anyagok, vagy acél alkatrészek és elemek). A vizsgált vegyi anyagot rápermetezzük a talaj felületére, utánozva a permetezőtartályból történő tipikus alkalmazást. A permettérfogatoknak általában a normál mezőgazdasági gyakorlatnak megfelelő tartományban kell lenniük, és a térfogatokat (víz mennyisége stb.) meg kell adni a jegyzőkönyvben. Olyan fúvókatípust kell kiválasztani, amely egyenletes lefedettséget biztosít a talaj felszínén. Ha oldószereket és hordozókat alkalmazunk, egy kontroll növényekből álló második csoportot is ki kell alakítani, amely kizárólag oldószert/hordozóanyagot kap. Ez nem szükséges készítményként vizsgált növényvédelmi termékek esetében. A vizsgált vegyi anyag koncentrációjának/arányának ellenőrzése 18. A koncentrációkat vagy az alkalmazás mértékét megfelelő analitikai ellenőrzéssel meg kell erősíteni. Oldható vegyi anyagok esetében valamennyi koncentráció/arány ellenőrzése megerősíthető a vizsgálat során alkalmazott legmagasabb koncentrációjú vizsgálati oldat elemzése révén a rákövetkező hígításra vonatkozó dokumentációval és kalibrált beviteli berendezésekkel (pl. kalibrált analitikai üvegáru, permetező berendezések kalibrálása). Oldhatatlan vegyi anyagok esetében az összetett anyag ellenőrzését a vizsgált vegyi anyagnak a talajhoz adott tömegével kell biztosítani. Ha demonstrálni kell a homogenitást, a talaj elemzésére lehet szükség. AZ ELJÁRÁS A vizsgálat megtervezése 19. Azonos fajba tartozó magokat ültetünk el cserepekben. A cserepenként elültetett magok száma a fajtól, a cserép méretétől és a vizsgálat időtartamától függ. A edényenkénti növények számának megfelelő növekedési feltételeket kell biztosítania, és el kell kerülni túlzsúfoltságot a vizsgálat időtartama alatt. A maximális tőszám 3–10 mag/100 cm2 körül van a magok méretétől függően. Például 1–2 kukorica, szójabab, paradicsom, uborka, vagy cukorrépa növény ajánlott egy 15 cm-es tartályban; három repce vagy hüvelyes növény ajánlott egy 15 cm-es tartályban; és 5–10 hagyma, búza, vagy más apró mag ajánlott egy 15 cm-es tartályban. A magok és az ismétlések száma (az ismétlés edényként van meghatározva, ezért az azonos edényben található növények nem jelentenek ismétlést) elegendő kell legyen az optimális statisztikai elemzéshez (21). Meg kell jegyezni, hogy a változékonyság nagyobb lesz az olyan vizsgált fajok esetében, ahol kevesebb nagy magot használunk edényenként (ismétlésenként), összehasonlítva azokkal a vizsgált fajokkal, ahol nagyobb számú kis magot lehet használni edényenként. Edényenként azonos számú mag ültetésével ez a változékonyság minimalizálható. 20. Kontrollcsoportokat kell használni annak igazolására, hogy a megfigyelt hatások összefüggenek a vizsgált vegyi anyagnak való kitettséggel, illetve kizárólag annak tulajdoníthatók. A megfelelő kontrollcsoportnak minden tekintetben azonosnak kell lennie a vizsgált csoporttal, kivéve a vizsgált vegyi anyagnak való kitettséget. Egy adott vizsgálaton belül valamennyi kísérleti növénynek, beleértve a kontrollokat is, azonos forrásból kell származnia. A torzítások megelőzése érdekében a vizsgálati és kontroll edények véletlen besorolására van szükség. 21. Az inszekticiddel vagy fungiciddel bevont magokat (azaz a »kikészített« magokat) kerülni kell. Bizonyos nem szisztémás kontakt fungicidek (pl. kaptán, thiram) használatát azonban egyes szabályozó hatóságok engedélyezik (22). Ha a magok által hordozott kórokozók jelenléte aggodalomra adhat okot, a magokat rövid ideig gyenge 5 %-os hipoklorit-oldatba lehet mártani, majd alaposan át kell öblíteni folyó vízzel és meg kell szárítani. Az egyéb növényvédőszerekkel végzett javító kezelés nem engedélyezett. Vizsgálati körülmények 22. A vizsgálati feltételeknek meg kell közelíteniük a vizsgált fajok és fajták normális növekedéséhez szükséges feltételeket (a vizsgálati feltételek példáit lásd a 4. függelékben). A fejlődő növényeket a jó kertészeti gyakorlatnak megfelelően ellenőrzött környezetű kamarákban, fitotronokban, vagy üvegházakban kell tartani. Növesztő létesítmények használata esetén ez a gyakorlat rendszerint magában foglalja a hőmérséklet, a páratartalom, a széndioxid-koncentráció, a fény (fényerő, hullámhossz, fotoszintetikusan aktív sugárzás) és a megvilágitási időszak, az öntözőeszközök, stb. ellenőrzését és megfelelően rendszeres (pl. naponta történő) feljegyzését a növények megfelelő fejlődésének biztosítása érdekében, amelyet a kiválasztott fajba tartozó kontroll növények alapján ítélnek meg. Az üvegházi hőmérsékletet a szellőztetés és a fűtő és/vagy hűtő rendszerek segítségével kell kontrollálni. Üvegházban történő vizsgálat esetén általában az alábbi feltételek ajánlottak: — hőmérséklet: 22 °C ± 10 °C; — nedvesség: 70 % ± 25 %; — megvilágítási időszak: minimum 16 óra fény; — fényerő: 350 ± 50 μE/m2/s. A kevesebb fényt igénylő fajok kivételével 400-700 nm hullámhosszú kiegészítő világításra lehet szükség, ha a fényerő 200 μE/m2/s alá csökken. A környezeti feltételeket a vizsgálat során nyomon kell követni és jegyzőkönyvezni kell. A növényeket nem porózus műanyag vagy mázas edényekben kell nevelni, az edény alatt elhelyezett tálcával vagy csészealjjal. Az edényeket rendszeresen át lehet helyezni a vizsgálati feltételek tekintetében a növesztő létesítményen belül fennálló különbségek miatt kialakuló és a növények növekedésében megmutatkozó variabilitás minimalizálása érdekében. Az edényeknek elég nagynak kell lenniük ahhoz, hogy lehetővé tegyék a normális növekedést. 23. A talajt tápanyagokkal lehet egészíteni, hogy fenntartsuk a növények jó életképességét. A kiegészítő tápanyagok iránti igényt és azok időzítését a kontroll növények megfigyelése alapján lehet megítélni. Ajánlott a vizsgálati edények alsó öntözése (pl. üvegszálból készült kanóc használatával). Kezdetben azonban felső öntözést is lehet használni a magok csírázásának ösztönzése céljából, illetve a talaj felületén történő kezelés esetén, mivel megkönnyíti a vegyi anyag bejutását a talajba. 24. A specifikus növekedési feltételeknek megfelelőnek kell lenniük a vizsgált faj és a vizsgált vegyi anyag számára. A kontroll és a kezelt növényeket azonos környezeti feltételek között kell tartani, megfelelő intézkedéseket kell azonban tenni a vizsgált vegyi anyaggal történő keresztexpozíció (pl. illékony vegyi anyagok) megakadályozására a különböző kezelési csoportok között, illetve a kezelési csoportok és a kontrollok között. Egyetlen koncentrációban/arányban történő vizsgálat 25. Egy vegyi anyag egyetlen koncentrációval vagy aránnyal történő vizsgálatának lefolytatásához megfelelő koncentráció/arány (kihívás/határérték) meghatározása érdekében számos tényezőt kell figyelembe venni. Általános vegyi anyagok esetében ezek közé tartoznak a vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságai. Növényvédő szerek esetében a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságait és felhasználási formáit, maximális koncentrációját vagy kiszórt mennyiségét, a szezononkénti alkalmazások számát és/vagy a vizsgált vegyi anyag perzisztenciáját figyelembe kell venni. Annak meghatározására, hogy egy általános vegyi anyag rendelkezik-e fitotoxikus tulajdonságokkal, a vegyi anyagot legfeljebb 1 000 mg/kg száraz talaj szinten kell vizsgálni. Dózisbehatároló vizsgálat 26. Ha szükséges, dózisbehatároló vizsgálatot lehet végezni, hogy útmutatást nyújtson arra vonatkozóan, milyen koncentrációkat/arányokat kell vizsgálni a meghatározó dózis-válasz vizsgálatban. A dózisbehatároló vizsgálathoz a vizsgálati koncentrációknak/arányoknak nagy léptékkel kell emelkedniük (pl. 0,1, 1,0, 10, 100 és 1 000 mg/kg száraz talaj). A növényvédő szerek esetében a koncentrációknak/arányoknak az ajánlott vagy maximális koncentráción, illetve kiszórt mennyiségen kell alapulniuk, pl. az ajánlott/maximális koncentráció vagy a kiszórt mennyiség 1/100, 1/10, 1/1 része. Több koncentrációban/arányban történő vizsgálat 27. A több koncentrációban/arányban történő vizsgálat célja a dózis-válasz összefüggés megállapítása és a csírázás ECx vagy ERX értékének, illetve az élőanyagtömegnek és/vagy a látható hatásoknak a nem kitett kontrollokhoz viszonyított meghatározása, a szabályozó hatóságok követelményei szerint. 28. A koncentrációk és arányok számának és elhelyezkedésének elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy megbízható dózis-válasz összefüggést és regressziós egyenletet generáljanak, és becslést adjanak az ECx vagy az ERx értékére. A kiválasztott koncentrációknak/arányoknak körbe kell venniük a meghatározandó ECx vagy ERx értéket. Például, ha az EC50 értékre van szükség, akkor olyan arányokat kell vizsgálni, amelyek 20–80 %-os hatást eredményeznek. Az ennek eléréséhez ajánlott kísérleti koncentrációk/arányok száma legalább öt egy mértani sorozatban, plusz a kezeletlen kontroll, és az egyes koncentrációkat/arányokat egymástól elválasztó kvóciens értéke legfeljebb három lehet. Minden egyes kezelt és kontroll csoport esetében az ismétlések száma legalább négy legyen, a magok számának pedig legalább 20-nak kell lennie. Az alacsony csírázási arányú vagy változó növekedésű növények esetében több ismétlésre lehet szükség a vizsgálat statisztikai erejének növelése érdekében. Ha nagyobb számú kísérleti koncentrációt/arányt használnak, az ismétlések száma csökkenthető. Ha a NOEC értékét kívánják becsülni, több ismétlésre lehet szükség a kívánt statisztikai erő eléréséhez (23). Megfigyelések 29. A megfigyelési időszak alatt, azaz a kontroll növények (adott esetben az oldószer kontrollok is) 50 %-ának kicsírázása után 14-21 napig a növényeket gyakran megfigyelik (legalább hetente, vagy ha lehetséges, naponta), hogy ellenőrizzék a csírázást, a látható fitotoxicitást és a mortalitást. A vizsgálat végén fel kell jegyezni a túlélő növények csírázási százalékát és élőanyagtömegét, valamint a növény különböző részein látható káros hatásokat. Utóbbiak közé tartoznak a csíranövények megjelenésében mutatkozó rendellenességek, a fejlődésben való visszamaradás, a klorózis, az elszíneződés, a mortalitás, és a növény fejlődésére gyakorolt hatások. A végső élőanyagtömeget a túlélő növények hajtásainak átlagos száraz tömege segítségével lehet mérni, amelyhez a hajtásokat a talaj felszínén kell levágni és 60 °C-on tömegállandóságig szárítani. Alternatív módszerként a végső élőanyagtömeget a hajtások friss tömegének segítségével is mérni lehet. A hajtások magassága egy másik végpont lehet, ha a szabályozó hatóságok megkövetelik. A látható sérülések tekintetében egységes pontozási rendszert kell használni a megfigyelhető toxikus válaszok értékelésére. A minőségi és mennyiségi vizuális értékelés elvégzésére vonatkozó példák a (23) és (24) szakirodalmi hivatkozásban találhatók. ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS Statisztikai elemzés Egyetlen koncentráció/arány vizsgálata 30. Az egyes növényfajok adatait megfelelő statisztikai módszerrel kell elemezni (21). A vizsgált koncentráció/arány hatásának szintjét, vagy az adott hatás elérésének hiányát a vizsgált koncentrációban/arányban (pl. <x % hatást figyeltek meg y koncentráció vagy arány esetén) jegyzőkönyvezni kell. Több koncentráció/arány vizsgálata 31. A dózis-válasz kapcsolatot egy regressziós egyenlet formájában állapítják meg. Különböző modellek használhatók: például a csírázás ECx vagy ERx értéke (pl. EC25, ER25, EC50, ER50) és a megbízhatósági határok – mint kvantális adatok – becslésére a logit, probit, Weibull, Spearman-Karber, vágott Spearman-Karber módszerek, stb. lehetnek megfelelőek. A csíranövények növekedése (tömeg és a magasság), mint folyamatos végpont esetében az ECx vagy ERx értéket és a megbízhatósági határokat megfelelő regressziós elemzés (pl. Bruce-Versteeg nem lineáris regressziós elemzés (25)) segítségével lehet megbecsülni. Ahol csak lehetséges, a legérzékenyebb fajok esetében az R2 legyen 0,7 vagy magasabb, és az alkalmazott vizsgálati koncentrációknak/arányoknak a 20–80 %-os hatások tartományát kell felölelniük. Ha a NOEC értékét kívánják becsülni, az erős statisztikai vizsgálatok alkalmazását kell előnyben részesíteni, és ezeket az adatok eloszlása alapján kell kiválasztani (21) (26). Vizsgálati jegyzőkönyv 32. A vizsgálati jegyzőkönyvnek be kell mutatnia a vizsgálatok eredményeit, valamint a vizsgálati feltételek részletes leírását, az eredmények alapos megvitatását, az adatok elemzését, és az abból levont következtetéseket. Egy táblázatos összefoglalót és az eredmények kivonatát is el kell készíteni. A jelentés kötelező elemei a következők: Vizsgált vegyi anyag: — kémiai azonosító adatok, a vizsgált vegyi anyag lényeges tulajdonságai (pl. log Pow, vízoldhatóság, gőznyomás, illetve a környezetben bekövetkező sorsra és viselkedésre vonatkozó információk, ha rendelkezésre állnak); — a vizsgálati oldat elkészítésére és a vizsgált koncentrációk ellenőrzésére vonatkozó információk a 18. pontban meghatározottak szerint. A vizsgálathoz felhasznált faj: — a vizsgált szervezetre vonatkozó információk: faj/fajta, növénycsalád, tudományos és közönséges név, a mag eredete és története a lehető legrészletesebben (azaz a szállító neve, csírázási százalék, mag méretkategória, tételszám, gyűjtés éve vagy vegetációs időszaka, csírázási minősítés dátuma), életképesség, stb.; — a vizsgált egy- és kétszikű fajok száma; — a faj kiválasztásának indoklása; — a mag tárolásának, kezelésének és fenntartásának leírása. Vizsgálati körülmények: — vizsgálati berendezés (pl. növesztőkamra, fitotron és üvegház); — a vizsgálati rendszer leírása (pl. edényméretek, az edény anyaga és a talaj mennyisége); — a talaj jellemzői (textúra vagy a talaj típusa: a talaj részecskeeloszlása és osztályozása, fizikai és kémiai tulajdonságai, beleértve a szerves anyagok százalékos arányát, a szerves szén százalékos arányát és a pH-t); — a talaj/táptalaj (pl. talaj, mesterséges talaj, homok és egyéb) előkészítése a vizsgálat előtt; — a tápközeg leírása, ha használnak ilyet; — a vizsgált vegyi anyag alkalmazása: a felhasználás módjának leírása, a berendezés leírása, az expozíciós arányok és mennyiségek, beleértve a vegyi anyag ellenőrzését, a kalibrációs módszer leírása és az alkalmazása során tapasztalt környezeti feltételek leírása; — növekedési feltételek: fényerő (pl. PAR: fotoszintetikusan aktív sugárzás), megvilágítási időszak, maximum és minimum hőmérséklet, az öntözés ütemezése és módja, trágyázás; — a magok száma edényenként, a növények száma dózisonként, az ismétlések (edények) száma expozíciós arányonként; — a kontrollok típusa és száma (negatív és/vagy pozitív kontrollok, oldószer kontroll, ha van); — a vizsgálat időtartama. Eredmények: — az összes végpontot, a vizsgálati koncentrációt/arányt és fajt tartalmazó táblázat minden ismétlés esetében; — a csírázó növények száma és százalékos aránya a kontrollcsoporthoz viszonyítva; — a növények élőanyagtömegének mérési eredményei (a hajtások száraz tömege vagy nedves tömege) a kontrollok százalékában; — a növényi hajtások magassága a kontrollok százalékában, ha mérik; — a vizsgált vegyi anyag által okozott látható sérülések százalékos aránya és a látható sérülések kvalitatív és kvantitatív leírása (klorózis, nekrózis, hervadás, levél- és szárdeformáció, valamint a hatások hiánya), a kontroll növényekkel összehasonlítva; — a látható sérülések megítéléséhez használt értékelő rendszer leírása, ha készült vizuális értékelés; — egy arányt tartalmazó vizsgálatok esetében a károsodás százalékos arányát kell jegyzőkönyvezni; — az ECx vagy ERx (pl. EC50, ER50, EC25, ER25) értékek és a kapcsolódó megbízhatósági határok. Ha regressziós elemzést végeznek, biztosítani kell a standard hibát a regressziós egyenlethez, valamint a standard hibát az egyéni paraméterek becsléséhez (pl. emelkedés, metszés); — a NOEC (és LOEC) érték, ha kiszámították; — a statisztikai eljárások és feltételezések leírása; — ezen adatok és a vizsgált faj dózis-válasz összefüggésének grafikus bemutatása. Az e vizsgálati módszerben leírt eljárásoktól való eltérések és a vizsgálat során bekövetkezett valamennyi szokatlan esemény. IRODALOM (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) Nemzetközi Szabványügyi Szervezet. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) Nemzetközi Szabványügyi Szervezet. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1492. (26) E melléklet C.33. fejezete: Földigiliszták szaporodásának vizsgálata (Eisenia fetida/Eisenia andrei). 1. függelék Fogalommeghatározások Hatóanyag (a.i.), (vagy aktív anyag (a.s.)) : egy specifikus biológiai hatás (pl. rovarirtás, növénybetegségek elleni védekezés, gyomirtás a kezelt területen) elérése céljából tervezett anyag, más néven technikai minőségű hatóanyag, aktív anyag. Vegyi anyag : anyag vagy keverék. Növényvédő szerek (CPP vagy PPP) vagy peszticidek : adott biológiai aktivitással rendelkező anyagok, amelyeket szándékosan használnak a termés kártevőktől (pl. gombás betegségek, rovarok és versengő növények) való megóvása érdekében. ECx, x %-os hatáskoncentráció vagy ERx, x %-os hatásarány : az a koncentráció vagy arány, amely x %-os nemkívánatos változást vagy módosulást eredményez a vizsgált végpontban a kontrollhoz viszonyítva (pl. a csírázás, a hajtástömeg, vagy a megmaradó növények végső számának 25 %-os vagy 50 %-os csökkenése, illetve a látható károsodás 25 %-os vagy 50 %-os növekedése EC25/ER25-nek vagy EC50/ER50-nek minősül). Csírázás : a koleoptil vagy a sziklevél megjelenése a talaj felülete felett. Készítmény : a kereskedelemben kapható formulázott termék, amely az aktív anyagot (hatóanyagot) tartalmazza, más néven végső készítmény (8) vagy tipikus végfelhasználói termék (typical end-use product, TEP). LOEC (észlelhető hatást okozó legkisebb koncentráció) : a vizsgált vegyi anyag azon legalacsonyabb koncentrációja, amelynek alkalmazása esetén hatás volt megfigyelhető. Ebben a vizsgálatban a LOEC-nek megfelelő koncentrációnak nincs statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05) az adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva, és magasabb, mint a NOEC-érték. Nem célzott növények : Azok a növények, amelyek kívül esnek a célnövény területén. A növényvédő szerek esetében ez általában a kezelt területen kívüli növényeket jelenti. NOEC (észlelhető hatást még nem okozó koncentráció) : a vizsgált vegyi anyag azon legmagasabb koncentrációja, amelyen hatás nem volt megfigyelhető. Ebben a vizsgálatban a NOEC-nek megfelelő koncentrációnak nincs statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05) az adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva. Fitotoxicitás : A növények normális megjelenési mintájától és növekedésétől egy adott vegyi anyag hatására kialakuló káros eltérések (méréses és vizuális értékelés alapján). Ismétlés : az a vizsgálati egység, amely megtestesíti a kontrollcsoportot és/vagy a kezelési csoportot. Ezekben a vizsgálatokban az edényt definiálják ismétlésként. Vizuális értékelés : A látható károsodás értékelése a növény állásának, életerejének, fejlődési rendellenességeinek, klorózisának, nekrózisának, és általános megjelenésének megfigyelése alapján, a kontrollal összehasonlítva. Vizsgált vegyi anyag : Az e vizsgálati módszerrel vizsgált bármely anyag vagy keverék. 2. függelék A növények vizsgálata során történelmileg használt fajok jegyzéke Család Faj Közismert név DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Sárgarépa Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Napraforgó Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Saláta Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Fehér mustár Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Kínai kel Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Olajrepce Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Káposzta Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Tarlórépa Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Kerti zsázsa Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Retek Chenopodiaceae Beta vulgaris Cukorrépa Cucurbitaceae Cucumis sativus Uborka Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Szójabab Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungóbab Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Törpe bab, zöldbab, kerti bab Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Borsó Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum- graecum Görögszéna Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Szarvaskerep Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Vöröshere Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Bükköny Linaceae Linum usitatissimum Len Polygonaceae Fagopyrum esculentum Hajdina Solanaceae Solanum lycopersicon Paradicsom MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Vöröshagyma Poaceae (Gramineae) Avena sativa Zab Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Árpa Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Évelő perje Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Rizs Poaceae (Gramineae) Secale cereale Rozs Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Cirokmag, shattercane Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Búza Poaceae (Gramineae) Zea mays Kukorica 3. függelék A lehetséges nem terményfajok jegyzéke OECD potenciális fajok növényi toxicitás vizsgálatára. Megjegyzés: Az alábbi táblázat 52 nem terményfajról tartalmaz információt (az egyes tételekhez kapcsolódó hivatkozások zárójelben vannak megadva). A megadott csírázási arányok a publikált szakirodalomból származnak és csak általános útmutatóként szolgálnak. Az egyéni tapasztalatok a mag beszerzési forrásától és egyéb tényezőktől függően változhatnak. CSALÁD Faj botanikai neve (közismert magyar név) Élettartam (9) és előfordulási hely Mag tömege (mg) Csírázás vagy növekedés megvilágítási időszaka (10) Ültetési mélység (mm) (11) Csírázási idő (nap) (12) Különleges kezelések (13) Toxicitási vizsgálat (14) Mag beszerzési források (15) Egyéb hivatkozások (16) APIACEAE Torilis japónica (bojtorjános tüskemag) А, В bolygatott területek, sövények, legelők (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) hideg sztratifikáció (7, 14, 18, 19) érlelésre lehet szükség (19) csírázást a sötétség gátolja (1, 19) különleges kezelést nem igényel (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (angol százszorszép) Ρ rétek, szántók, gyepek (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (18, 19) különleges kezelést nem igényel (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (búzavirág) A mezők, utak mente, nyílt élőhelyek (16) 4,1–4,9 (4, 14) L = D (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) különleges kezelést nem igényel (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (fekete imola) Ρ mezők, utak mente, nyílt élőhelyek (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) érlelésre lehet szükség (18, 19) csírázást a sötétség gátolja (19) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (örménygyökér) Ρ nedves, zavart helyek (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) különleges kezelést nem igényel (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (közönséges oroszlánfog) Ρ mezők, utak mente, bolygatott területek (16, 19) 0,85-1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (17, 18, 19) különleges kezelést nem igényel (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (borzas kúpvirág) Β, Ρ zavart (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) különleges kezelést nem igényel (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (kanadai aranyvessző) Ρ legelő, nyílt területek (16) 0,06–0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) keverje össze egyenlő rész homokkal és áztassa 500 ppm gibberellinsavba 24 órán keresztül (11) különleges kezelést nem igényel (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (szerbtövis) A mezők, nyílt élőhelyek (16) 25–61 (14, 29) 0(1): 5(29): a csírázást a sötétség gátolhatja (1) áztassa meleg vízben 12 órán keresztül (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (szúrós szerbtövis) A nyílt élőhelyek (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) sztratifikáció (14) különleges kezelést nem igényel (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (olasz szerbtövis) A mezők, nyílt élőhelyek (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) különleges kezelést nem igényel (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (réti kakukktorma) Ρ mezők, utak mente (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) a csírázást a sötétség gátolja (18, 19) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (réti kakukkszegfű) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) érlelésre lehet szükség (18) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 15, 22–26) POST (5, 15, 22–26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (fehér libatop) A mezők széle, bolygatott területek (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) kezelés a mag színétől függően (19) nyugalmi állapot száraz tárolóban (19) a csírázást a sötétség gátolja (1, 18, 19) hideg sztratifikáció (18) különleges kezelést nem igényel (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (közönséges orbáncfű) Ρ mezők, szántóföldek, nyílt élőhelyek (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) a csírázást a sötétség gátolja (1, 18, 19) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (borostyánlevelű hajnalka) A utak mente, nyílt élőhelyek, kukoricaföldek (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) különleges kezelést nem igényel (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (palka) Ρ szántóföldek, legelők, utak mente (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) a csírázást a sötétség gátolja (1) különleges kezelést nem igényel (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (szarvaskerep) Ρ füves területek, utak mente, nyílt élőhelyek (16, 19) 1–1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) sztratifikáció (14, 19) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (18, 19) különleges kezelést nem igényel (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Cassia, sarlófű) A nedves erdő (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) áztassa vízben 24 órán keresztül (9) sztratifikáció (14) a mag életképessége a színétől függően eltérő (1) különleges kezelést nem igényel (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata (kender) A öntéstalaj (16) 11–13 (9, 14) L > D (9) 10–20 (9, 21) áztassa vízben 24 órán keresztül (9) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) különleges kezelést nem igényel (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (vöröshere) Ρ mezők, utak mente, szántóföld (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) sztratifikáció (14, 18) érlelésre lehet szükség (19) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1, 19) különleges kezelést nem igényel (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (szúrós gyöngyajak) Ρ nyílt területek (16) 0,75–1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) különleges kezelést nem igényel (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (fodormenta) Ρ nedves területek (16) 2,21 (4) 0 (4) különleges kezelést nem igényel (4) POST (4) F Nepeta cataria (illatos macskamenta) Ρ bolygatott területek (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) különleges kezelést nem igényel (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (közönséges gyíkfű) Ρ szántók, füves területek, bolygatott területek (16, 19) 0,58-1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) a csírázást a sötétség gátolja (18, 19) nagyobb magvak esetén jobb csírázás (1) különleges kezelést nem igényel (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (orvosi tisztesfű) Ρ gyepek, mezsgyék (19) 14–18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (sárga selyemmályva) A mezők, nyílt élőhelyek (16) 8,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) sztratifikáció (14) különleges kezelést nem igényel (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (indiai mályva) A mezők, utak mente (16) 3,8 (14) L = D (14) 10–20 (6, 21) sztratifikáció (14) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) különleges kezelést nem igényel (6, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (mák) A mezők, szántóföldek, bolygatott helyek (16, 19) 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) hideg sztratifikáció és szkarifikáció (1, 19, 32) különleges kezelést nem igényel (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (cérnatippan) pázsit, legelő (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) a csírázást a sötétség gátolja (1, 17–19) különleges kezelést nem igényel (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (parlagi ecsetpázsit) A mezők, nyílt élőhelyek (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) szkarifikáció (14) kezelje 101 mg/l KNO3-oldattal (14) meleg sztratifikáció (1) a csírázást a sötétség gátolja (1) különleges kezelést nem igényel (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (vadzab) A megművelt területek, nyílt élőhelyek (16) 7–37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) szkarifikáció (7, 32) a csírázást a sötétség gátolja (1) hideg sztratifikáció (1, 18) különleges kezelést nem igényel (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (fedélrozsnok) A mezők, utak mente, szántóföldek (16) 0,45–2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) érlelési periódus (1, 7, 32) a csírázást a fény gátolja (1) különleges kezelést nem igényel (14) PRE & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (taréjos cincor) P mezők, utak mente, nyílt élőhelyek (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (19) különleges kezelést nem igényel (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (pirók-ujjasmuhar) A mezők, gyepek, nyílt élőhelyek (16) 0,52–0,6 (14, 30) L = D (14) 10–20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) szkarifikáció, hideg sztratifikáció és érlelés (1, 7, 14, 32) kezelje 101 mg/l KNO3-oldattal (14) a csírázást a sötétség gátolja (1) különleges kezelést nem igényel (21) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (közönséges kakaslábfű) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) szkarifikáció (7, 32) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) különleges kezelést nem igényel (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (észak-amerikai vadrozs) P parti, bolygatott területek (16) 4–5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14–28 (11) különleges kezelést nem igényel (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (réti csenkesz) P mezők, nedves területek (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) különleges kezelést nem igényel (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (éves árpa) A legelők, utak mente, nyílt élőhelyek (16) 3,28 (14) meleg sztratifikáció (1) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) PRE (31) 7 Phleum pratense (mezei komócsin) P legelők, szántóföldek, bolygatott helyek (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) a csírázást a sötétség gátolja (19) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (17) különleges kezelést nem igényel (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (szulák keserűfű) A nyílt élőhelyek, utak mente (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) hideg sztratifikáció 4–8 hétig (1, 2, 4, 20, 29) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (lapulevelű keserűfű) A nedves talaj (16) 1,8-2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (1) a csírázást a sötétség gátolja (18) hideg sztratifikáció (1) különleges kezelést nem igényel (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (pennsylvaniai borsos keserűfű) A mezők, nyílt élőhelyek (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) hideg sztratifikáció 4 héten át 0–5 °C hőmérsékleten (1, 29) a csírázást a sötétség gátolja (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (baracklevelű keserűfű) A bolygatott területek, szántóföld (16, 19) 2,1-2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) szkarifikáció, hideg sztratifikáció, gibberellinsav-kezelés (14) hideg sztratifikáció, érlelés (17–19) a csírázást a sötétség gátolja (19) különleges kezelést nem igényel (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (bodros lórom) P szántóföldek, utak mente, nyílt területek (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) a csírázást a sötétség gátolja (18, 19) érlelésre lehet szükség (18) különleges kezelést nem igényel (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (mezei tikszem) A szántók, nyílt területek, bolygatott területek (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) hideg sztratifikáció, gibberellinsav-kezelés (1, 14, 18, 19, 32) a csírázáshoz fényre van szükség (1) különleges kezelést nem igényel (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (réti boglárka) Ρ szántóföldek, utak mente, nyílt területek (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41-56 (19, 29) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 22, 24–26) POST (5, 22, 24–26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (erdei gyömbérgyökér) Ρ sövények, nedves területek (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) a csírázást a sötétség gátolja (18, 19) meleg sztratifikáció (1) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (ragadós galaj) A szántók, nedves területek, bolygatott területek (16, 19) 7–9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) hideg sztratifikáció (1, 18, 19) a csírázást a besugárzás nem befolyásolja (18, 19) a csírázást a fény gátolja (1) különleges kezelést nem igényel (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (közönséges galaj) Ρ sövényfalak, nyílt területek (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) különleges kezelést nem igényel (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (piros gyűszűvirág) Β, Ρ sövények, nyílt területek (16, 19) 0.1–0.6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) a csírázást a sötétség gátolja (1, 17–19) különleges kezelést nem igényel (4, 22–26) POST (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (perzsa veronika) A szántók, nyílt területek, bolygatott területek (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19): 5 (96 %) (18) a csírázást a sötétség gátolja (18, 19) hideg sztratifikáció (18) különleges kezelést nem igényel (14) PRE & POST (28) A 32 Hivatkozott vetőmag-beszállítók Beszállítói azonosító A beszállítókra vonatkozó információk A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com IDÉZETT IRODALOM (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. Vizsgálatok és Anyagok Amerikai Szabványügyi Intézete, Philadelphia. pp 197 – 208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. pp. 151 – 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34, 453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. pp. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. 4. függelék Példák bizonyos terményfajok megfelelő növekedési feltételeire Az alábbi feltételeket alkalmasnak találták 10 terményfaj esetében, és iránymutatásként lehet használni a növesztőkamrában végzett vizsgálatokhoz bizonyos egyéb fajok esetében is: A szén-dioxid koncentrációja. 350 ± 50 ppm; Relatív páratartalom: 70 ± 5 % a megvilágított időszakokban és 90 ± 5 % a sötét időszakokban; Hőmérséklet: 25 ± 3 °C nappal, 20 ± 3 °C éjjel; Megvilágítási időszak 16 óra megvilágítás/8 óra sötétség, 400–700 nm átlagos hullámhosszat feltételezve; Fény: a fényerő 350 ± 50 μE/m2/s, a növény tetején mérve. A terményfajok a következők: — paradicsom (Solanum lycopersicon); — uborka (Cucumis sativus); — saláta (Lactuca sativa); — szója (Glycine max); — káposzta (Brassica oleracea var. capitata); — sárgarépa (Daucus carota); — zab (Avena sativa); — évelő perjemag (Lolium perenne); — kukorica (Zea mays); — vöröshagyma (Allium cepa). C.32. TELEVÉNYFÉRGEK SZAPORODÁSÁNAK VIZSGÁLATA BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 220. vizsgálati iránymutatásában (2004) leírt módszerrel. A vizsgálat célja a vegyi anyagoknak az Enchytraeus albidus (Henle 1873) televényférgek reprodukciós teljesítményére a talajban kifejtett hatásának értékelése. A vizsgálat alapvetően az Umweltbundesamt, Németország által kifejlesztett módszeren alapul (1), amelyet körvizsgálattal ellenőriztek (2). A vegyi anyagok televényférgekre és földigilisztákra gyakorolt toxicitására vonatkozó egyéb vizsgálati módszereket is figyelembe vettek (3) (4) (5) (6) (7) (8). KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK 2. Az Enchytraeus nemzetségbe tartozó talajlakó annelid férgek ökológiailag releváns fajok az ökotoxikológiai vizsgálatok szempontjából. Míg a televényférgek gyakran megtalálhatók földigilisztákat tartalmazó talajokban, gyakran bőségesen előfordulnak olyan talajokban is, ahonnan a földigiliszták hiányoznak. A televényférgeket laboratóriumi vizsgálatok, valamint félterep- és terepvizsgálatok céljára is lehet használni. Gyakorlati szempontból számos Enchytraeus faj könnyen kezelhető és tenyészthető, és a generációs idejük lényegesen rövidebb, mint a földigilisztáké. A televényférgekkel végzett reprodukciós vizsgálat időtartama ezért csak 4–6 hét, míg a földigilisztákkal (Eisenia fetida) végzett vizsgálaté 8 hét. 3. A szárazföldi környezetben élő televényférgekre vonatkozó alapvető ökológia és ökotoxikológiai információk a (9) (10) (11) (12) szakirodalmi hivatkozásban találhatók. A VIZSGÁLAT ELVE 4. Kifejlett televényférgeket teszünk ki a vizsgált vegyi anyag mesterséges talajba kevert koncentrációsorozatának. A vizsgálat két lépésből áll: a) dózisbehatároló vizsgálat (ha nem áll elegendő információ rendelkezésre), amelyben a kéthetes expozíció után mért mortalitás a fő végpont, illetve b) meghatározó szaporodásvizsgálat, amely során a szülő állat által nemzett összes utódot és a szülő állatok túlélési arányát értékelik. A meghatározó vizsgálat időtartama hat hét. Az első három hét után a kifejlett férgeket eltávolítjuk, és a morfológiai változásokat jegyzőkönyvezzük. Újabb három hét múlva megszámoljuk a kifejlett férgek által előállított bábokból kikelt utódokat. A vizsgált vegyi anyagnak kitett állatok reprodukciós teljesítményét összehasonlítjuk a kontrollcsoporttal (vagy -csoportokkal) i. az észlelhető hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) és/vagy ii. az ECx (például EC10, EC50) meghatározása érdekében. Ez utóbbinál regressziós modell segítségével becsüljük meg azt a koncentrációt, amely x %-kal csökkenti a reprodukciós teljesítményt. Az ECx (például EC10, EC50) értékének a vizsgálati koncentrációk által meghatározott tartományon belül kell elhelyezkednie annak érdekében, hogy az ECx értékét extrapoláció helyett interpolációval lehessen meghatározni. A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK 5. A vizsgált vegyi anyag vízben való oldhatóságának, log Kow értékének, talaj-víz megoszlási hányadosának (pl. e melléklet C.18. vagy C19. fejezete) és gőznyomásának lehetőleg ismertnek kell lennie. Kívánatosak a vizsgált vegyi anyag talajban bekövetkező sorsára vonatkozó további információk, mint például a fotolízis és a hidrolízis sebessége. 6. Ez a vizsgálati módszer vízben oldható vagy oldhatatlan vegyi anyagok esetében egyaránt használható. A vizsgált vegyi anyag alkalmazásának módja azonban ennek megfelelően eltérő lesz. A vizsgálati módszer nem alkalmazható illékony vegyi anyagok esetében, azaz olyan vegyi anyagoknál, amelyek Henry-féle állandója vagy levegő-víz megoszlási hányadosa nagyobb, mint egy, illetve olyan vegyi anyagok esetében, amelyek gőznyomása 25 °C-on meghaladja a 0,0133 Pa értéket. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE 7. A vizsgálat érvényességéhez az alábbi teljesítménykritériumoknak kell teljesülniük a kontrollcsoport(ok)ban: — a kifejlett férgek mortalitási aránya nem haladhatja meg a 20 %-ot a dózisbehatároló vizsgálat végén és a reprodukciós teszt első három hetében. — feltételezve, hogy edényenként 10 férget használunk a vizsgálat összeállítása során, edényenként átlagosan legalább 25 fiatal egyedet kell előállítani a vizsgálat végéig. — a fiatal egyedek átlagos számának relatív szórása nem haladhatja meg az 50 %-ot a reprodukciós vizsgálat végén. Ha a vizsgálati nem felel meg a fenti érvényességi kritériumoknak, a vizsgálatot abba kell hagyni, kivéve, ha a vizsgálat folytatása megfelelően indokolható. Az indoklást a vizsgálati jegyzőkönyvnek tartalmaznia kell. REFERENCIA-VEGYIANYAG 8. Szabályos időközönként vagy esetleg minden vizsgálat keretében tesztelni kell egy referencia-vegyianyagot annak ellenőrzésére, hogy a vizsgált szervezetek által adott válasz nem változott jelentősen az idő múlásával. Megfelelő referencia-vegyianyag a karbendazim, amelyről kimutatták, hogy befolyásolja a televényférgek túlélési arányát és reprodukcióját (13) (14), valamint egyéb olyan anyagokat is lehet használni, amelyek toxicitási adatai jól ismertek. A körvizsgálatban az AgrEvo Company (Frankfurt, Németország) által szállított, Derosal ™ kereskedelmi néven ismert karbendazim-készítményt használták, amely 360 g/l (32,18 %) hatóanyagot tartalmaz (2). A körvizsgálatban meghatározott reprodukciós EC50 érték az 1,2 ± 0,8 mg hatóanyag (a.i.)/kg száraz tömeg tartományban helyezkedett el (2). Amennyiben a vizsgálati sorozat pozitív toxikus standardot is tartalmaz, egyetlen koncentrációt kell alkalmazni, és az ismétlések számának meg kell egyeznie a kontrolloknál használt ismétlésszámmal. A karbendazim esetében az 1,2 mg hatóanyag/kg száraz tömeg (folyékony készítményként) vizsgálata ajánlott. A VIZSGÁLAT LEÍRÁSA Berendezések 9. A vizsgálati edények üvegből vagy más, kémiailag semleges anyagból legyenek. Az üvegedények (pl. térfogat: 0,20–0,25 liter; átmérő: ≈ 6 cm) alkalmasak erre a célra. Az edényeket átlátszó (pl. üveg vagy polietilén) fedéllel kell lefedni, aminek célja, hogy csökkentse a víz elpárolgását, miközben lehetővé teszi a gázcserét a talaj és a légkör között. A fedélnek átlátszónak kell lennie, hogy áteressze a fényt. 10. Általános laboratóriumi felszerelések, így különösen a következők szükségesek: — szárítószekrény; — sztereomikroszkóp; — pH-mérő és fotométer; — megfelelő pontos mérlegek; — megfelelő hőmérséklet-szabályozó eszközök; — megfelelő páratartalom-szabályozó eszközök (nem szükséges, ha az expozíciós edényeknek van fedele); — inkubátor vagy kis helyiség klímaberendezéssel; — csipeszek, horgok vagy hurkok; — fotótál. A mesterséges talaj előkészítése 11. Ebben a vizsgálatban mesterséges talajt használunk (5) (7), amelynek összetétele a következő (száraz tömegek alapján, 105 °C-on állandó tömegig szárítva): — 10 % tőzegmoha, levegőn szárított és finomra őrölt (a 2 ± 1 mm részecskeméret fogadható el); a vizsgálatban való felhasználás előtt ajánlott ellenőrizni, hogy a friss tőzegtétellel készített talaj alkalmas-e a férgek tenyésztésére; — 20 % kaolinagyag (lehetőleg 30 % feletti kaolinittartalommal); — körülbelül 0,3–1,0 % kalcium-karbonát (CaCO3, porított, analitikai tisztaságú) pH = 6,0 ± 0,5 eléréséhez; a hozzáadandó kalcium-karbonát mennyisége elsősorban a tőzeg minőségétől/jellegétől függ; — körülbelül 70 % levegőn szárított kvarchomok (a CaCO3 szükséges mennyiségétől függően), túlnyomórészt finom homok, a részecskék legalább 50 %-a 50–200 mikron között legyen. A talaj meghatározó vizsgálatban való használata előtt célszerű igazolni, hogy a mesterséges talaj alkalmas a férgek tenyésztésére és a vizsgálat érvényességi kritériumainak teljesítésére. Különösen ajánlott ilyen ellenőrzést végezni annak biztosítása érdekében, hogy a vizsgálat elvégzése nem sérül, ha a mesterséges talaj szerves széntartalmát lecsökkentik, pl. a tőzegtartalom 4–5 %-ra való csökkentésével és a homoktartalom megfelelő növelésével. A szerves széntartalom csökkentése esetén kisebb a lehetősége a vizsgált vegyi anyag talajon (szerves szénen) való adszorbeálódásának, miközben a vizsgált vegyi anyag hozzáférhetősége a férgek számára javul. Kimutatták, hogy a fentebb említettnél alacsonyabb – például 2,7 % (15) – szerves széntartalmú természetes talajokban vizsgált Enchytraeus albidus esetében a szaporodással kapcsolatos érvényességi kritériumok teljesülnek, és az eddigi – bár korlátozott – tapasztalatok szerint ez az 5 %-os tőzegtartalmú mesterséges talajjal is elérhető. Megjegyzés: Ha a további (pl. magasabb szintű) vizsgálatok során természetes talajt használunk, a talaj alkalmasságát és a vizsgálat érvényességi feltételeinek teljesítését is demonstrálni kell. 12. A talaj száraz összetevőit alaposan összekeverjük (például nagyüzemi méretű laboratóriumi keverőgéppel). Ezt legalább egy héttel a vizsgálat megkezdése előtt kell megtenni. A kevert talajt két napig tárolni kell annak érdekében, hogy a savassága egyensúlyba kerüljön/stabilizálódjon. A pH-érték meghatározása céljából a talajból és 1 mólos kálium-klorid (KCl) vagy 0,01 mólos kalcium-klorid (CaCl2) oldatból készült 1:5 arányú keveréket használunk (lásd a (16) szakirodalmi hivatkozást és a 3. függeléket). Ha a talaj az elvárt tartománynál savasabb (lásd a 11. pontot), a pH-t megfelelő mennyiségű CaCO3 hozzáadásával lehet beállítani. Ha a talaj túl lúgos, a 11. pontban említett – CaCO3 nélkül készített – keverék hozzáadásával lehet beállítani. 13. A mesterséges talaj maximális víztartó képességét (WHC) a 2. függelékében leírt eljárásokkal összhangban kell meghatározni. Egy vagy két nappal a vizsgálat megkezdése előtt a száraz mesterséges talajt előnedvesítjük annyi ionmentesített víz hozzáadásával, hogy a végső víztartalom (a maximális víztartó képesség 40–60 %-a) körülbelül felét kapjuk A vizsgálat kezdetén az előnedvesített talajt részekre kell osztani a vizsgálati koncentrációk (és adott esetben a referencia-vegyianyagok), illetve a vizsgálatban használt kontrollok számának megfelelően. A nedvességtartalmat a maximális WHC 40–60 %-ára kell beállítani a vizsgált vegyi anyag oldatának és/vagy desztillált vagy deionizált víz hozzáadásával (lásd a 19–21. pontot). A nedvességtartalmat a vizsgálat elején és végén is meg kell határozni (105 °C-on tömegállandóságig történő szárítással), és annak a férgek túléléséhez optimális tartományon belül kell lennie. A talaj nedvességtartalmának durva ellenőrzésére alkalmas módszer, ha enyhén megnyomjuk a talajt a kezünkben, és ha a nedvességtartalom megfelelő, kis vízcseppek jelennek meg az ujjaink között. A vizsgálati állatok kiválasztása és előkészítése 14. Az ajánlott vizsgálati faj az Enchytraeus albidus (Henle 1837, fehér televényféreg), amely Enchytraeidae család tagja (Oligochaeta rend, Annelida törzs). Az E. albidus a telvényférgek egyik legnagyobb méretű faja, már 35 mm hosszúságú példányokat is feljegyeztek (17) (18). Az E. albidus világszerte elterjedt és egyaránt megtalálható a tengeri, édesvízi és szárazföldi élőhelyeken, elsősorban bomló szerves anyagokban (moszat, komposzt), illetve ritkán réteken is (9). A faj széles ökológiai toleranciája és néhány morfológiai eltérés azt jelzi, hogy különböző fajtái létezhetnek. 15. Az E. albidus haleledelként kereskedelmi forgalomban kapható. Ellenőrizni kell, hogy a tenyészetben ne legyenek más, általában kisebb fajok (1) (19). A tenyészet ilyen szennyeződése esetén az összes férget át kell mosni vízzel egy Petri-csészében. Az E. albidus nagy kifejlett példányait kell ezután kiválasztani (sztereómikroszkóp segítségével) az új kultúra elindításához, a többi férget pedig ki kell dobni. Az E. albidust könnyen, sokféle szerves anyagban lehet tenyészteni (lásd a 4. függeléket). Az E. albidus életciklusa rövid, mivel a teljes érettséget 33 nap (18 °C-on) és 74 nap (12 °C-on) között éri el (1). Kizárólag a laboratóriumban legalább 5 hétig (egy generáción át) probléma nélkül tartott kultúrák használhatók fel a vizsgálathoz. 16. Az Enchytraeus nemzetség más fajai is alkalmasak a vizsgálatra, pl. az E. buchholzi (Vejdovsky 1879) vagy az E. crypticus (Westheide & Graefe 1992) (lásd az 5. függeléket). Más televényféreg fajok használata esetén a használt fajt egyértelműen azonosítani, a választást pedig indokolni kell a jegyzőkönyvben. 17. A vizsgálatban felhasznált állatok kifejlett férgek. Petékkel (fehér foltok) kell rendelkezniük a clitellum régióban, és a méretüknek megközelítőleg azonosnak kell lennie (körülbelül 1 cm-es hosszúság). A tenyészkultúrát nem szükséges szinkronizálni. 18. Ha a televényférgeket nem a végső vizsgálathoz használt talajban és feltételek mellett tenyésztik (beleértve a táplálást), akkor legalább 24 órán keresztül, de legfeljebb három napig akklimatizálni kell őket. A vizsgálat elvégzéséhez szükséges mennyiségnél nagyobb számú kifejlett egyedet kell akklimatizálni, hogy lehetőség legyen a sérült, vagy más okból alkalmatlan példányok kizárására. Az akklimatizációs időszak végén csak a petéket tartalmazó és viselkedési rendellenességeket (pl. a féreg próbál kimenekülni a talajból) nem mutató férgeket választjuk ki a vizsgálathoz. A férgeket ékszerészcsipesszel, horoggal vagy hurokkal óvatosan kell eltávolítani és kis mennyiségű friss vizet tartalmazó Petri-csészébe helyezni. Erre a célra az e melléklet C.20. fejezetében (Daphnia magna szaporodásának vizsgálata) javasolt mesterséges friss vizet kell előnyben részesíteni, mert az ionmentesített, ioncserélt vagy csapvíz káros lehet a férgekre. A férgeket sztereomikroszkóp alatt meg kell vizsgálni, és a petéket nem tartalmazó férgeket ki kell dobni. Ügyelni kell a kultúrákat esetleg megfertőző atkák vagy ugróvillások eltávolítására és kidobására. A vizsgálat során fel nem használt egészséges férgeket vissza kell helyezni a törzstenyészetbe. A vizsgálati koncentrációk előkészítése Vízben oldódó vegyi anyagok 19. A vizsgált anyagból ionmentesített vízben olyan mennyiségű oldatot kell készíteni, amely az adott vizsgálati koncentráció összes ismétléséhez elegendő. Javasolt a kívánt nedvességtartalom (azaz a maximum WHC 40–60 %-a) eléréséhez szükséges mennyiségű vizet használni (lásd a 13. pontot). A vizsgált vegyi anyag mindegyik oldatát alaposan össze kell keverni egy tétel előnedvesített talajjal a vizsgálati edénybe helyezés előtt. Vízben oldhatatlan vegyi anyagok 20. Vízben oldhatatlan, de szerves oldószerekben oldódó vegyi anyagok esetében a vizsgált vegyi anyagot fel lehet oldani egy megfelelő hordozó (például aceton) lehető legkisebb mennyiségében. Csak illékony oldószereket szabad használni. A hordozót rápermetezzük vagy összekeverjük kis mennyiségű (például 2,5 g) finom kvarchomokkal. A hordozót elszívó fülkében legalább egy órán keresztül történő párologtatással eltávolítjuk. A kvarchomok és a vizsgált vegyi anyag e keverékét hozzáadjuk az előnedvesített talajhoz, és megfelelő mennyiségű ionmentesített víz hozzáadása után alaposan elkeverjük úgy, hogy a szükséges nedvességtartalmat kapjuk. A végtermékként kapott keveréket a vizsgálati edényekbe töltjük. 21. Vízben és szerves oldószerekben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok esetén a kívánt vizsgálati koncentráció eléréséhez vizsgálati edényenként 2,5 g finomra őrölt kvarchomokot keverünk össze a vizsgált vegyi anyag megfelelő mennyiségével. A kvarchomok és a vizsgált vegyi anyag e keverékét hozzáadjuk az előnedvesített talajhoz, és alaposan elkeverjük megfelelő mennyiségű ionmentesített vízzel úgy, hogy a szükséges nedvességtartalmat kapjuk. A végtermékként kapott keveréket elosztjuk a vizsgálati edények között. Az eljárást megismételjük minden egyes vizsgált koncentráció esetében és egy megfelelő kontrollt is készítünk. 22. A vegyi anyagokat általában nem kell 1 000 mg/kg száraz talaj koncentrációt meghaladó koncentrációban vizsgálni. A magasabb koncentrációban történő vizsgálat azonban az adott vizsgálat céljainak függvényében szükséges lehet. A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE Vizsgálati csoportok és kontrollok 23. Minden vizsgálati koncentráció esetében 20 g száraz tömegnek megfelelő mennyiségű vizsgálati talajt töltünk a vizsgálati edénybe (lásd a 19–21. pontot). A vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó kontrollokat is készítünk. Táplálékot adunk minden egyes edényhez a 29. pontban leírt eljárásnak megfelelően. Minden vizsgálati edényhez tíz véletlenszerűen kiválasztott férget rendelünk. A férgeket óvatosan helyezzük át a vizsgálati edényekbe és a talaj felszínén helyezzük el őket például ékszerészcsipesz, horog vagy hurok használatával. A vizsgált koncentrációk és a kontrollok ismétléseinek száma az alkalmazott vizsgálati tervtől függ (lásd a 34. pontot). A vizsgálati edényeket véletlenszerűen helyezzük el a vizsgálati inkubátorban, és pozíciójukat hetente újra véletlenszerűen megváltoztatjuk. 24. Ha hordozót használunk a vizsgált vegyi anyag bevitelére, a vizsgálati sorozat mellett egy oldószerrel permetezett vagy összekevert kvarchomokot tartalmazó kontrollsorozatot is le kell futtatni. Az oldószer vagy diszpergálószer koncentrációjának meg kell egyeznie a vizsgált vegyi anyagot tartalmazó edényekben használt koncentrációval. Egy többlet kvarchomokot (edényenként 2,5 g) tartalmazó kontrollsorozatot kell futtatni a 21. pontban leírt eljárás szerinti bevitelt igénylő vegyi anyagok esetén. Vizsgálati körülmények 25. A vizsgálati hőmérséklet 20 ± 2 °C. A férgek kedvét a talaj elhagyásától úgy lehet elvenni, ha a vizsgálatot ellenőrzött világos-sötét ciklusok szerint végezzük (lehetőleg 16 óra világos és 8 óra sötét), 400–800 lux megvilágítással a vizsgálati edények területén. 26. A talajnedvesség ellenőrzése érdekében az edényeket a vizsgálat kezdetén, majd azt követően hetente egyszer lemérjük. A tömegveszteséget megfelelő mennyiségű ionmentesített víz hozzáadásával pótoljuk. Megjegyzendő, hogy a vízveszteség csökkenthető, ha a vizsgálati inkubátorban magas levegő-páratartalmat (> 80 %) tartunk fenn. 27. A nedvességtartalmat és a pH-t a dózisbehatároló vizsgálat és a meghatározó vizsgálat elején és végén egyaránt meg kell mérni. Méréseket kell végezni a kontroll- és a kezelt (minden koncentrációval) talajmintákon is, amelyeket ugyanúgy készítünk el és tartunk fenn, mint a vizsgált tenyészeteket, azonban férgeket nem tartalmaznak. Táplálékot csak a vizsgálat kezdetekor lehet ezekhez a talajmintákhoz adni a mikrobiális aktivitás elősegítése céljából. A hozzáadott táplálék mennyiségének a vizsgálati tenyészetekhez adott táplálék mennyiségével kell megegyeznie. Ezekhez az edényekhez a vizsgálat időtartama alatt nem szükséges további táplálékot hozzáadni. Táplálás 28. A televényféreg populáció fenntartására alkalmas táplálék használható. A mikrobiológiai szennyeződés elkerülése érdekében a használat előtt lehetőleg autoklávozott (a felmelegítés is megfelelő) zabpelyhet megfelelő tápláléknak találták. 29. A táplálékot először a férgek behelyezése előtt adjuk hozzá úgy, hogy 50 mg őrölt zabpelyhet keverünk össze a talajjal minden edényben. Ezt követően hetente egyszer adunk táplálékot maximum a 21. napig. A 28. napon etetésre nem kerül sor, mivel a kifejlett egyedeket ebben a szakaszban már eltávolítottuk, és a fiatal férgeknek ezen a ponton túl viszonylag kevés további táplálékra van szüksége. A vizsgálat során az etetés abból áll, hogy a tartályban 25 mg őrölt zabpelyhet helyezünk el a talaj felszínén, vigyázva, nehogy megsebesítsük a férgeket. A gombák szaporodásának csökkentése érdekében a zabpelyhet kis mennyiségű talaj ráhelyezésével el kell temetni a talajban. Ha el nem fogyasztott táplálék marad meg, a fejadagot csökkenteni kell. A dózisbehatároló vizsgálat terve 30. Szükség esetén dózisbehatároló vizsgálatot kell végezni, például a vizsgált vegyi anyag öt koncentrációjával (0,1, 1,0, 10, 100 és 1 000 mg/kg (száraz talajtömeg)). Kezelésenként és kontrollonként elegendő egy ismétlés. 31. A dózisbehatároló vizsgálat időtartama két hét. A vizsgálat végén értékeljük a férgek mortalitási arányát. A férgeket elpusztultként jegyzőkönyvezzük, ha az anterior végére gyakorolt mechanikai ingerre nem reagál. A mortalitáson kívüli egyéb információk szintén hasznosak lehetnek annak eldöntésében, hogy milyen koncentrációtartomány használandó a meghatározó vizsgálatban. A kifejlett férgek viselkedésében (pl. a talajba való beásásra való képtelenség; mozdulatlanul fekvés a vizsgálati edény üvegfala mentén) és morfológiájában (pl. nyílt sebek jelenléte) mutatkozó elváltozásokat is fel kell ezért jegyezni a megjelenő fiatal egyedekkel együtt. Az utóbbit a 6. függelékben leírt festési módszerrel lehet meghatározni. 32. Az LC50 hozzávetőleges értékét meg lehet határozni a mortalitási adatok geometriai átlagának kiszámításával. A meghatározó vizsgálat koncentrációs tartományának megállapítása során a szaporodásra gyakorolt hatásról azt feltételezzük, hogy az LC50-nél akár 10-szer alacsonyabb is lehet. Ez azonban egy empirikus kapcsolat, és a valóság a konkrét esetben ettől eltérő lehet. A dózisbehatároló vizsgálat során tett további megfigyelések, mint például a fiatal egyedek előfordulása, segíthet pontosítani a vizsgált vegyi anyagnak a meghatározó vizsgálatban használandó koncentrációtartományát. 33. Az LC50 pontos meghatározására érdekében ajánlott a vizsgálatot a vizsgált vegyi anyag valamennyi koncentrációja esetében legalább négy ismétlésben és annyi koncentrációban elvégezni, amennyi legalább négy statisztikailag szignifikánsan különböző átlagos választ idéz elő. Hasonló számú koncentrációt és a (ha szükséges) párhuzamos kontrollt használunk. A meghatározó reprodukciós vizsgálat elrendezése 34. Három elrendezést javasolnak egy körvizsgálat ajánlásai alapján (2). — A NOEC meghatározásához mértani sorozatba rendezett legalább öt koncentrációt kell vizsgálni. Minden egyes kísérleti koncentráció esetében négy ismétlést plusz nyolc kontrollt javasolnak. A szomszédos koncentrációk aránya nem lehet 1,8-nél nagyobb. — Az ECx (például EC10, EC50) meghatározásához legalább öt koncentrációt kell megvizsgálni, és a koncentrációknak körbe kell fogniuk az ECx értékét annak érdekében, hogy az ECx-et extrapoláció helyett interpolációval lehessen meghatározni. Minden egyes kísérleti koncentráció esetében legalább négy ismétlést és négy kontroll ismétlést javasolnak. A szomszédos koncentrációk aránya változtatható, azaz a várt hatástartományban legfeljebb 1,8-re, a magasabb és az alacsonyabb koncentrációknál 1,8-nél nagyobb értékre vehető fel. — Egy kombinált módszer lehetővé teszi mind a NOEC, mind az ECx meghatározását. Nyolc kezelési koncentrációt kell használni mértani sorozatban. Kezelésenként négy ismétlés plusz nyolc kontroll ajánlott. A szomszédos koncentrációk aránya nem lehet 1,8-nél nagyobb. 35. Vizsgálati edényenként tíz kifejlett férget kell használni (lásd a 23. pontot). Eledelt a vizsgálati edénybe a vizsgálat kezdetekor, majd hetente egyszer adnak (lásd a 29. pontot) a 21. nappal bezárólag. A 21. napon a talajmintákat kézzel gondosan átvizsgálják, az élő kifejlett férgeket megfigyelik és megszámolják, illetve a magatartásbeli (pl. a féreg képtelen beásni magát a talajba vagy mozdulatlanul fekszik a vizsgálati edény üvegfala mentén) és a morfológiai változásokat (pl. nyílt sebek) feljegyzik. A kifejlett férgeket ezután eltávolítják a vizsgálati edényből és a vizsgálati talajból. Az előállított bábokat tartalmazó vizsgálati talajt három további hétig inkubálják megegyező vizsgálati körülmények között, kivéve, hogy etetésre csak a 35. napon kerül sor (25 mg őrölt zabpehely edényenként). 36. Hat hét után megszámolják a frissen kikelt férgeket. A bengálvörös festésen alapuló módszer (lásd a 6. mellékletet) ajánlott, bár más nedves (de hőt nem használó) extrakciós és lebegéses technikák (lásd a 6. mellékletet) is alkalmasnak bizonyultak (4) (10) (11) (20). A bengálvörös festés ajánlott, mivel a táptalajból történő nedves extrakciót nagyban gátolhatja a szuszpendált agyagrészecskék okozta zavarosság. Határérték-vizsgálat 37. Ha a dózisbehatároló vizsgálat során nem figyelhető meg hatás a legmagasabb koncentrációban (azaz az 1 000 mg/kg koncentrációban), a reprodukciós vizsgálatot határérték-vizsgálatként lehet elvégezni az 1 000 mg/kg használatával annak bizonyítására, hogy a szaporodásra vonatkozó NOEC nagyobb mint ez az érték. Összegzés és a vizsgálat ütemterve 38. A vizsgálat lépései a következőképpen foglalhatók össze: Időpont Dózisbehatároló vizsgálat Meghatározó vizsgálat –7. nap vagy korábban — a mesterséges talaj elkészítése (a száraz alkotóelemek összekeverése) — a mesterséges talaj elkészítése (a száraz alkotóelemek összekeverése) –5. nap — a mesterséges talaj pH-jának ellenőrzése — a talaj maximális WHC értékének mérése — a mesterséges talaj pH-jának ellenőrzése — a talaj maximális WHC értékének mérése a –5. naptól a –3. napig — a férgek kiválasztása az akklimatizációra — a férgek kiválasztása az akklimatizációra a –3. naptól a 0. napig — a férgek akklimatizációja legalább 24 órán keresztül — a férgek akklimatizációja legalább 24 órán keresztül –1. nap — a mesterséges talaj előnedvesítése és tételekre osztása — a mesterséges talaj előnedvesítése és tételekre osztása 0. nap — a törzsoldatok elkészítése — a vizsgált vegyi anyag alkalmazása — a vizsgálati szubsztrátum bemérése a vizsgálati edényekbe — az eledel bekeverése — a férgek bevitele — a talaj pH-jának és nedvességtartalmának mérése — a törzsoldatok elkészítése — a vizsgált vegyi anyag alkalmazása — a vizsgálati szubsztrátum bemérése a vizsgálati edényekbe — az eledel bekeverése — a férgek bevitele — a talaj pH-jának és nedvességtartalmának mérése 7. nap — a talaj nedvességtartalmának ellenőrzése — a talaj nedvességtartalmának ellenőrzése — eledel 14. nap — a kifejlett egyedek mortalitásának meghatározása — a fiatal egyedek számának becslése — a talaj pH-jának és nedvességtartalmának mérése — a talaj nedvességtartalmának ellenőrzése — eledel 21. nap — a kifejlett egyedek viselkedésének megfigyelése — a kifejlett egyedek eltávolítása — a kifejlett egyedek mortalitásának meghatározása — a talaj nedvességtartalmának ellenőrzése — eledel 28. nap — a talaj nedvességtartalmának ellenőrzése — nincs etetés 35. nap — a talaj nedvességtartalmának ellenőrzése — eledel 42. nap — a fiatal férgek megszámlálása — a talaj pH-jának és nedvességtartalmának mérése ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS Az eredmények kezelése 39. Bár a 7. függelék rövid áttekintést ad, ebben a vizsgálati módszerben nincs egyértelmű statisztikai iránymutatás megadva a vizsgálati eredmények elemzésére. 40. A dózisbehatároló vizsgálatban a fő végpont a mortalitás. A kifejlett férgek viselkedésében (pl. a talajba való beásásra való képtelenség; mozdulatlan fekvés a vizsgálati edény üvegfala mentén) és morfológiájában (pl. nyílt sebek) mutatkozó elváltozásokat is fel kell azonban jegyezni a fiatal egyedek jelenlétével együtt. Rendszerint probit analízist (21) vagy logisztikus regressziót kell alkalmazni az LC50 meghatározására. Olyan esetekben azonban, ahol ez az elemzési módszer nem megfelelő (pl. ha kevesebb, mint három koncentráció áll rendelkezésre részleges pusztulással), alternatív módszereket lehet alkalmazni. Ezek közé a módszerek közé tartoznak a mozgóátlagok (22), a vágott Spearman-Karber módszer (23) vagy az egyszerű interpoláció (pl. az LC0 és LC100 geometriai átlaga az LC0 négyzetgyöke és az LC100 szorzataként számítva). 41. A meghatározó vizsgálatban a végpont a fekunditás (azaz a nemzett fiatal egyedek száma). Ugyanakkor – a dózisbehatároló vizsgálat hoz hasonlóan – minden más káros jelet is fel kell tüntetni a végleges jelentésben. A statisztikai elemzés megköveteli a szaporodás számtani átlagának és szórásának kiszámítását kezelésenként és kontrollonként. 42. Ha varianciaanalízist végeztek, a szórást (s) és a szabadságfokot (df) helyettesíteni lehet az ANOVA-ból nyert összevont varianciabecsléssel és annak szabadságfokával, amennyiben a variancia nem függ a koncentrációtól. Ebben az esetben a kontoll és a kezelések varianciáit kell használni. Ezeket az értékeket általában kereskedelmi statisztikai szoftver segítségével számítják ki, ismétlésként az edényenkénti eredményeket használva. Ha a negatív és oldószeres kontrollok esetében az adatok összevonása tűnik ésszerűnek, nem pedig az egyikükkel szembeni tesztelés, meg kell ezeket a kontrollokat vizsgálni, hogy nem különböznek-e szignifikáns mértékben (a megfelelő teszteket lásd a 45. pontban és a 7. függelékben). 43. A további statisztikai vizsgálatok és következtetések attól függenek, hogy az ismétlések értékei normál eloszlást mutatnak és homogének-e, tekintettel azok varianciájára. A NOEC becslése 44. A nagy statisztikai erővel bíró teszteket kell előnyben részesíteni. Fel kell használni a korábbi körvizsgálatok során szerzett az tapasztalatokból vagy egyéb történelmi adatokból leszűrt információkat annak megítélésére, hogy az adatok nagyjából normál eloszlásúak-e. A variancia homogenitása (homoszkedaszticitás) sokkal kritikusabb. A tapasztalat azt mutatja, hogy a szórás gyakran együtt növekszik az átlaggal. Ezekben az esetekben az adatok transzformációja vezethet el a homoszkedaszticitáshoz. Az ilyen transzformációnak azonban a vizsgált adatok helyett a történelmi adatokkal kapcsolatos tapasztalatokon kell alapulnia. A homogén adatokkal többféle vizsgálatot kell végezni, például a Williams-féle próbát (α = 0,05, egyoldalas) (24) (25), vagy bizonyos esetekben a Dunnett-féle próbát (26) (27). Meg kell jegyezni, hogy egyenlőtlen replikáció esetében a táblázat t-értékeit a Dunnett és Williams által javasoltak szerint korrigálni kell. A nagy eltérések miatt időnként a válaszok nem növekednek/csökkennek szabályosan. A monotonitástól való ilyen erős eltérés esetében a Dunnett-féle próba megfelelőbb. Ha a homoszkedaszticitástól való eltérések figyelhetők meg, ésszerű lehet közelebbről megvizsgálni a varianciára gyakorolt lehetséges hatásokat annak eldöntésére, hogy a t-próbákat lehet-e a statisztikai erő nagyobb mértékű elvesztése nélkül alkalmazni (28). Ehelyett többszörös U-próba, például a Holm szerint módosított Bonferroni-féle U-próba (29), vagy ha az adatok heteroszkedaszticitást mutatnak ugyan, de egyébként mögöttes monoton dózis-válasszal jellemezhetők, egy másik nemparaméteres próba [pl. a Jonckheere–Terpstra- (30) (31) vagy a Shirley- (32) (33) próba] is alkalmazható, és általában előnyben kell ezeket részesíteni a nem egyenlő szórásnégyzeteket feltételező t-próbákkal szemben. (lásd még a 7. függelékben található sémát). 45. Ha a határérték-vizsgálat megtörtént, és a paraméteres vizsgálati eljárások előfeltételei (normalitás, homogenitás) teljesülnek, akkor a páros Student-féle t-próbát lehet használni, vagy egyébként a Mann–Whitney-féle U-próbát (29). Az ECx becslése 46. Bármely ECx érték kiszámításához a kezelésenkénti átlagokat használják a regressziós analízishez (lineáris vagy nem lineáris), miután felállították a megfelelő dózis-válasz függvényt. A férgek növekedésének – mint folyamatos válasznak – az ECx értékei megfelelő regressziós analízis alkalmazásával becsülhetőek (35). A kvantált adatok (mortalitás/túlélés és nemzett utódok száma) leírására alkalmas függvények között van a 2–4 paramétert tartalmazó normális szigmoid, logisztikai vagy Weibull-féle függvény, amelyek közül néhány hormetikus válaszok modellezésére is képes. Ha egy dózis-válasz függvényt lineáris regresszióanalízissel illesztettek, szignifikáns r2 (determinációs együttható) értéket és/vagy meredekséget kell találni a regresszióanalízissel, mielőtt az ECx becslésére kerülne sor, amelyet a kontroll átlaga x %-ának megfelelő értéknek a regresszióelemzéssel talált egyenletbe való behelyezésével végeznek el. 95 %-os megbízhatósági határokat Fieller szerint (hivatkozás: Finney (21)) vagy egyéb megfelelő modern módszerek segítségével kell kiszámítani. 47. Alternatív megoldásként a választ a modell paraméter százalékaként vagy arányaként modellezik, amelyet a kontroll átlagos válaszaként értelmeznek. Ezekben az esetekben a normál (logisztikai, Weibull) szigmoid görbe gyakran könnyen illeszthető az eredményekhez a probit regressziós eljárás alkalmazásával (21). Ezekben az esetekben a súlyozó függvényt ki kell igazítani a metrikus válaszokhoz a Christensen által megadottak szerint (36). Ha azonban hormetikus hatást figyeltek meg, a probitanalízist négyparaméteres logisztikai vagy Weibull-függvénnyel kell felváltani, amelyet nem lineáris regressziós eljárással illesztenek (36). Ha az adatokhoz nem illeszthető megfelelő dózis-válasz függvény, alternatív módszereket lehet használni az ECx és megbízhatósági határai becslésére, mint például a Thompson-féle mozgóátlagokat (22) vagy a vágott Spearman-Karber eljárást (23). VIZSGÁLATI JEGYZŐKÖNYV 48. A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következő információkat kell tartalmaznia: Vizsgált vegyi anyag: — fizikai jelleg és adott esetben a fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. vízben való oldhatóság, gőznyomás); — a vizsgált anyag kémiai azonosítása az IUPAC nómenklatúra szerint, CAS-szám, tételszám, szerkezeti képlet és tisztaság; — a minta lejárati ideje. A vizsgálathoz felhasznált faj: — felhasznált kísérleti állatok: faj, tudományos név, beszerzési forrás és tenyésztési körülmények. Vizsgálati körülmények: — a mesterséges talaj összetevői és előkészítése; — a vizsgált vegyi anyag alkalmazásának módszere; — a vizsgálat feltételek leírása, beleértve a hőmérsékletet, nedvességtartalmat, pH-t, stb.; — a kísérleti terv és eljárások teljes leírása. Vizsgálati eredmények: — a kifejlett férgek mortalitási aránya két hét után, valamint a fiatal egyedek száma a dózisbehatároló vizsgálat végén; — a kifejlett férgek mortalitási aránya három hetes expozíció után, valamint a fiatal egyedek teljes feljegyzése a meghatározó vizsgálat végén; — a vizsgált szervezetekben megfigyelt fizikai vagy kóros tünetek és viselkedésbeli változások; — A reprodukciós LC50, NOEC és/vagy ECx (pl. EC50, EC10) érték, adott esetben konfidenciaintervallumokkal, a kiszámítására használt illesztett modell grafikonja, valamint minden olyan információ és megfigyelés, amely segítséget nyújthat az eredmények értelmezéséhez. Az e vizsgálati módszerben leírt eljárásoktól való eltérések és a vizsgálat során bekövetkezett valamennyi szokatlan esemény. IRODALOM (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. (5) E melléklet C.8. fejezete: Földigilisztákra kifejtett toxicitás. (6) ISO (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) (1993). Talajminőség. Szennyező anyagok hatása a földigilisztákra (Eisenia fetida). 1. rész: Az akut toxicitás meghatározása mesterséges talaj használatával, No. 11268-1. ISO, Genf. (7) ISO (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) (1996). Talajminőség. Szennyező anyagok hatása a földigilisztákra (Eisenia fetida). 2. rész: A szaporodásra gyakorolt hatások meghatározása, No. 11268-2. ISO, Genf. (8) Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. (11) Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) (1994). Talajminőség. A pH meghatározása, No. 10390. ISO, Genf. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. (21) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. (25) Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. (28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 (29) Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. (31) Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. (32) Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. (33) Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. (34) Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. (36) Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. 1. függelék Fogalommeghatározások E vizsgálati módszer alkalmazásában a következő fogalommeghatározások alkalmazandók: Vegyi anyag : anyag vagy keverék. ECx (hatáskoncentráció x % hatás eléréséhez): az a koncentráció, amely valamely hatás x %-át okozza a vizsgálati szervezetekben egy adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva. Ebben a vizsgálatban a hatáskoncentrációk a vizsgált vegyi anyag tömegének és a vizsgálat talaj száraz tömegének hányadosában vannak kifejezve. LC0 (nem letális koncentráció): a vizsgált anyag azon koncentrációja, amely nem pusztítja el a kitett vizsgált szervezeteket egy