(19)

A C. rész a következő fejezetekkel egészül ki: „C.47 A halak korai életszakaszára vonatkozó toxicitási vizsgálat BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 210. vizsgálati iránymutatásában (2013) leírt módszerrel. A halak korai életszakaszára vonatkozó vizsgálatok célja a vegyi anyagok által a vizsgált fajokra és azok fejlődési szakaszaira gyakorolt letális és szubletális hatások meghatározása. A vizsgálatok értékes információkkal szolgálnak a vegyi anyagok által más halfajokra gyakorolt krónikus letális és szubletális hatások becsléséhez. 2. A 210. vizsgálati iránymutatás az Egyesült Királyság által benyújtott javaslaton alapul, amelyet az OECD szakértőinek Medmenhamben (Egyesült Királyság) 1988 novemberében tartott ülésén vitattak meg és 2013-ban aktualizáltak annak érdekében, hogy a dokumentumba beépítsék a vizsgálat alkalmazása során szerzett tapasztalatokat és a halakon végzett toxicitásvizsgálatokról szóló, 2010 szeptemberében tartott OECD-munkaértekezlet javaslatait (1). A VIZSGÁLAT ELVE 3. A korai életszakaszban lévő halak a vízben oldott vizsgálati vegyi anyag széles tartományon belüli koncentrációinak vannak kitéve. Átfolyásos körülmények javasoltak; amennyiben ez nem megoldható, úgy félstatikus feltételek is elfogadhatók. A részletekért „A nehezen vizsgálható anyagok és keverékek vízi toxikológiai vizsgálata” című OECD-iránymutatást (2) kell tanulmányozni. A vizsgálat azzal kezdődik, hogy frissen megtermékenyített petéket vizsgálati kamrákba helyeznek, és a vizsgálatot az adott fajtól függően annyi ideig folytatják, amennyi ahhoz szükséges, hogy a kontrollhal növendékké fejlődjön. A letális és szubletális hatásokat kiértékelik, és összehasonlítják a kontrollcsoportbeli értékekkel a megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (LOEC) meghatározása érdekében, hogy meg lehessen állapítani i. a megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt (NOEC) és/vagy ii. az ECx (pl. EC10, EC20) értéket regressziós modell segítségével azon becsült koncentrációt, amely a mért hatásban x % változást okozna. A releváns hatásos koncentrációk és paraméterek jelentése a szabályozási kerettől függhet. Az ECx értékének a vizsgálati koncentrációk által meghatározott tartományon belül kell elhelyezkednie annak érdekében, hogy az ECx értékét extrapoláció helyett interpolációval lehessen meghatározni (a fogalommeghatározásokat lásd az 1. függelékben). A VIZSGÁLATI VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK 4. A vizsgálati vegyi anyag a vizsgálat tárgyát képező anyag. Ismerni kell a vizsgálati vegyi anyag vízoldékonyságát (lásd e melléklet A.6. fejezetét) és gőznyomását (lásd e melléklet A.4. fejezetét), és a vizsgálati oldatokban lévő vegyi anyag mennyiségi meghatározásához rendelkezni kell olyan megbízható analitikai módszerrel, amelynek pontossága és a meghatározási határai ismertek és dokumentáltak. A lehetőleg e vizsgálat céljára kiválasztott fajokkal korábban már elvégzett akut toxicitási vizsgálatok eredményei (lásd e melléklet C.1. és C.49. fejezetét) a vizsgálat lefolytatásához nem szükségesek, ugyanakkor hasznos információkkal szolgálhatnak. 5. Ha a vizsgálati módszert keverék vizsgálatára alkalmazzák, annak összetételét a lehető legpontosabban kell jellemezni, pl. az alkotóelemeinek kémiai azonosítójával, azok mennyiségi előfordulásával, továbbá (pl. a fent említett) anyagspecifikus tulajdonságaival. A vizsgálati módszernek adott keverék szabályozási célú vizsgálatára történő alkalmazása előtt meg kell vizsgálni, hogy az megfelelő eredményeket biztosíthat-e a szándékolt szabályozási célra. 6. A hasznos információk közé tartozik még a szerkezeti képlet, az anyag tisztasága, vízoldékonysága, vízben és fény hatására tanúsított stabilitása, a pKa- és Pow-értékek, valamint a gyors biológiai lebonthatóságra vonatkozó vizsgálatok eredményei is (lásd e melléklet C.4. és C.29. fejezetét). A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE 7. A vizsgálat érvényességéhez a következő feltételeknek kell teljesülniük: — a kísérlet során az oldott oxigén koncentrációját mindvégig a levegőtelítettségi érték 60 %-a felett kell tartani, — a víz hőmérséklete a vizsgálat során a vizsgálati kamrák, illetve bármelyik két egymást követő nap között ±1,5 °C-nál nagyobb mértékben nem térhet el, és a hőmérsékletet a vizsgálati fajra nézve meghatározott hőmérséklet-tartományon belül kell tartani (2. függelék); — a vizsgálati koncentráció analitikai mérése kötelező; — a kontrollcsoportokban és – ahol ez releváns – az oldószeres kontrollokban a megtermékenyített peték összesített túlélési arányszámainak és a kikelést követő életképességük arányának a 2. függelékben meghatározott határértékeknél nagyobbnak vagy azzal egyenlőnek kell lenniük. 8. Amennyiben az érvényességi kritériumokhoz képest csekély eltérés figyelhető meg, a következményeket a vizsgálati adatok megbízhatóságának tükrében mérlegelni kell és ezeket a megfontolásokat a jelentésben fel kell tüntetni. Az oldószeres kontrollban előforduló túlélésre, kikelésre vagy növekedésre gyakorolt hatásokat a negatív kontrollal összehasonlítva kell jelenteni, és a vizsgálati adatok megbízhatóságának tükrében kell értékelni. A MÓDSZER ISMERTETÉSE Vizsgálati kamrák 9. Üvegből, rozsdamentes acélból vagy más, kémiailag semleges anyagból készült edényeket lehet használni. Mint ismeretes a szilikon a lipofil anyagokat erősen abszorbeálja, ezért a szilikon csövek átfolyásos vizsgálatokhoz való használatát és a vízzel érintkező szilikon tömítések alkalmazását pl. monoblokkos üvegakváriumok használatával minimálisra kell csökkenteni. Az edényeknek elég nagynak kell lenniük ahhoz, hogy lehetővé tegyék a kontrollok megfelelő növekedését, az oldott oxigén koncentrációjának fenntartását (pl. kisebb halfajok esetében egy 7 literes tartály elegendő) és a 19. pontban a betelepítési arányra vonatkozóan megadott kritériumok teljesítését. Tanácsos a vizsgálati kamrák véletlenszerű elhelyezése a vizsgálatra kijelölt területen. A teljesen véletlenszerű elrendezéssel szemben célszerűbb a véletlen blokk elrendezés alkalmazása, ahol mindegyik blokkban mindegyik kezelési mód képviselt. A vizsgálati kamrákat védeni kell a nem kívánt zavaró hatásoktól. A vizsgálati rendszert lehetőleg annyi ideig kell a vizsgálati vegyi anyag koncentrációival kondicionálni, amely elegendő ahhoz, hogy a vizsgált élőlények elhelyezése előtt stabil expozíciós koncentrációt lehessen kimutatni. Az állatfaj kiválasztása 10. A vizsgálat céljaira javasolt halfajok listáját az 1. táblázat tartalmazza. Ez nem zárja ki más fajok használatát, de az eljárást ekkor a megfelelő vizsgálati feltételek biztosítása érdekében esetleg módosítani kell. A fajok és a kísérleti módszer megválasztásának indoklását fel kell tüntetni a jelentésben. A tenyészhalak tartása 11. A tenyészállomány megfelelő feltételek melletti tartására vonatkozó részletek a 3. függelékben és a (3) (4) (5) hivatkozásban találhatók. A megtermékenyített peték, embriók és lárvák kezelése 12. A megtermékenyített petéket, embriókat és lárvákat kezdetben a fő tartályon belül elhelyezett, oldalaiknál vagy végeiknél hálós, üvegből vagy rozsdamentes acélból készült kisebb edényekben lehet kitenni a tartályon átfolyó vizsgálati oldatnak. E kisebb edényekben a turbulenciamentes áramlást úgy lehet elérni, hogy az edényeket fel-le mozgatható karra függesztik fel, ügyelve, hogy az élőlények mindig a vizsgálati oldatban legyenek. Lazacfélék megtermékenyített petéit olyan rácsokon vagy hálókon lehet tartani, amelyek nyílásai elég nagyok ahhoz, hogy a petékből kibújó lárvák átessenek rajtuk. 13. Amennyiben a peték fő kísérleti tartályon belüli tartására kis tartályokat, rácsokat vagy hálókat használnak, akkor a lárvák kikelése után ezeket a visszatartó eszközöket – a 3. függelékben található útmutatás szerint – el kell távolítani, kivéve, ha a lárvák szökésének megakadályozása érdekében van rájuk szükség. Amennyiben a lárvákat át kell helyezni, azokat nem szabad kitenni a levegő hatásának, és nem szabad hálót használni a lárváknak a peték tárolására használt tartályból való kiemelésére. Az ilyen áthelyezés időzítése az egyes fajoktól függően változik, és azt a jegyzőkönyvben dokumentálni kell. Az áthelyezés azonban nem mindig szükséges. Víz 14. A vizsgálat céljára bármilyen víz felhasználható, amelyben a vizsgálati fajok kellően hosszú ideig túlélik a vizsgálati körülményeket és növekednek (lásd a 4. függeléket). A víz minőségét a vizsgálat során mindvégig azonos szinten kell tartani. Annak biztosítására, hogy a hígítóvíz ne gyakoroljon nem kívánt hatást a vizsgálat eredményeire (pl. mert komplexet képez a vizsgálati vegyi anyaggal), illetve ne gyakoroljon kedvezőtlen hatásokat a tenyészállomány teljesítményére, időnként mintákat kell venni elemzésre. Mérni kell a következőket: a nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd és Ni), a fontosabb anionok és kationok (pl. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2–), az ammónia, az összes klórtartalmú növényvédőszer-maradék, a teljes szervesszén-tartalom és a szuszpendált szilárd anyagok, például félévente, amennyiben a hígítóvízről tudott, hogy viszonylag állandó minőségű. Amennyiben ismert, hogy a víz változó minőségű, úgy a méréseket gyakrabban kell elvégezni; a gyakoriság attól függ, hogy a víz minősége mennyire változó. Az elfogadható minőségű hígítóvíz néhány kémiai tulajdonságának felsorolása a 4. függelékben található. Vizsgálati oldatok 15. Az átfolyásos vizsgálatok céljára olyan rendszert kell használni, amely folyamatosan adagolja és hígítja a vizsgálati vegyi anyag törzsoldatát (pl. adagolószivattyú, proporcionális hígító vagy telítőrendszer), annak érdekében, hogy a vizsgálati kamrához eljusson a koncentrációk sorozata. A kísérlet során időnként ellenőrizni kell a törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét, amelynek értéke a vizsgálat során nem változhat 10 %-nál nagyobb mértékben. A 24 óránként legalább öt vizsgálati kamrányi vízcserének megfelelő áramlási sebességet találták megfelelőnek (3). A 19. pontban előírt betelepítési arány követése esetén azonban alacsonyabb, pl. 2–3 vizsgálati kamrányi vízcserének megfelelő áramlási sebesség is alkalmazható, hogy megakadályozzák a táplálék gyors eltávozását. 16. A kiválasztott koncentrációjú vizsgálati oldatok a törzsoldat hígításával készíthetők el. A törzsoldatot lehetőleg a vizsgálati vegyi anyagnak a hígítóvízbe, mechanikai eszközök (pl. keverő és/vagy ultrahang) segítségével történő bekeverésével vagy megmozgatásával kell elkészíteni. Telítési oszlopok (oldhatósági oszlopok) vagy passzív adagolási módszerek (6) is alkalmazhatók a megfelelő koncentrációjú törzsoldat elkészítéséhez. Oldószer-hordozóanyag használata nem ajánlott. Abban az esetben azonban, ha oldószerre van szükség, párhuzamosan egy oldószeres kontrollt is futtatni kell a vegyi anyaggal történő kezelésekben alkalmazottal megegyező oldószer-koncentrációval; vagyis az oldószer szintjének azonosnak kell lennie minden koncentrációban és az oldószeres kontrollban. Néhány hígítási rendszer esetében ez esetleg technikailag nehezen kivitelezhető; ebben az esetben az oldószer koncentrációjának az oldószeres kontrollban a kezelt csoportokban lévő legnagyobb oldószer-koncentrációval kell megegyeznie. A nehezen vizsgálható anyagok esetében „A nehezen vizsgálható anyagok és keverékek vízi toxikológiai vizsgálata” című, 23. számú OECD-iránymutatást (2) kell tanulmányozni. Oldószer használata esetén a megfelelő oldószert az anyag kémiai tulajdonságai határozzák meg. A 23. számú OECD-iránymutatás 100 μl/l maximális koncentrációt ajánl. Annak érdekében, hogy elkerülhető legyen az oldószer esetleges hatása a mért végpontokra (7), az oldószer koncentrációját a lehető legalacsonyabb szinten javasolt tartani. 17. Félstatikus vizsgálatok során két különböző vízcsere-módszer közül lehet választani: új vizsgálati oldatokat kell készíteni tiszta edényekben és a kísérlet korábbi fázisait túlélő petéket és lárvákat kíméletesen át kell telepíteni az új edényekbe, vagy az élőlényeket a vizsgálati edényben kell tartani, miközben a vizsgálati oldat/kontroll mennyiségének egy részét (legalább kétharmadát) le kell cserélni. ELJÁRÁS Az expozíció körülményei Időtartam 18. A vizsgálatokat a peték megtermékenyítését követően a lehető legrövidebb időn belül el kell kezdeni, és a megtermékenyített petéket lehetőleg a csírakorong osztódásának kezdete előtt, vagy e fázist követően mihamarabb a vizsgálati oldatba kell helyezni. A vizsgálat időtartama a használt fajtól függ. Néhány javasolt időtartam a 2. függelékben található. Betelepítés 19. A vizsgálat kezdetén használt megtermékenyített peték számának elegendőnek kell lennie a statisztikai követelmények kielégítéséhez. A petéket véletlenszerűen kell elosztani a különböző kezelési módok között, és koncentrációszintenként legalább 80, legkevesebb négy párhuzamos edény között egyenletesen elosztott, megtermékenyített petét kell behelyezni. A betelepítési aránynak (a vizsgálati oldat egységnyi térfogatára jutó biomassza) megfelelően alacsonynak kell lennie, hogy a pete és lárva fejlődési fázisokban az oldottoxigén-koncentrációt külön levegőztetés nélkül is a levegőtelítettségi érték legalább 60 %-ának megfelelő szinten lehessen tartani. Átfolyásos vizsgálatok esetében 24 órára számítottan 0,5 g/liter nedves tömegnél, illetve bármely időpontban 5 g/liter oldatnál nem magasabb betelepítési arány tartása javasolt (3). Fény és hőmérséklet 20. A megvilágítási időszakokat és a víz hőmérsékletét a vizsgálati fajok sajátosságaihoz kell igazítani (lásd a 2. függeléket). Etetés 21. A táplálék és az etetés rendkívül fontos, és elengedhetetlen, hogy az egyes életszakaszokban a megfelelő táplálékot a megfelelő időponttól kezdve a normális fejlődéshez szükséges mennyiségben adják. A táplálék mennyiségének az egyes párhuzamos vizsgálatokban megközelítőleg azonosnak kell lennie, kivéve ha azt a mortalitási arány figyelembevételével ki kell igazítani. A táplálékfelesleget és az ürüléket szükség szerint el kell távolítani a hulladékok felhalmozódásának elkerülése érdekében. Az etetési rend részletei a 3. függelékben találhatók, azonban a tapasztalatok birtokában a táplálékot és az etetési rendet a túlélési arány növelése és a fejlődés optimalizálása érdekében folyamatosan tökéletesítik. Az élő táplálék a környezetgazdagítás egyik forrása, ezért azt – fajtól és életszakasztól függően – a száraz vagy fagyasztott táp helyett vagy mellett ajánlott adni. Vizsgálati koncentrációk 22. A vizsgálati vegyi anyagból általában – koncentrációnként minimum négy replikátummal – ötféle, legfeljebb 3,2 konstans szorzótényezővel különböző koncentráció használata szükséges. A vizsgálati koncentrációk tartományának kiválasztásakor célszerű mérlegelni a lehetőleg ugyanazokon a fajokon végzett akut vizsgálatokra és/vagy dózisbehatároló vizsgálatokra vonatkozó információkat (1), amennyiben azok rendelkezésre állnak. A vizsgálati koncentrációk tartományának kiválasztásakor viszont minden információforrást figyelembe kell venni, többek között a kereszthivatkozásokat, illetve a halembriókon végzett akut toxicitásvizsgálatokra vonatkozó adatokat. Egy határérték-vizsgálat vagy kiterjesztett határérték-vizsgálat ötnél kevesebb koncentrációval akkor fogadható el meghatározó vizsgálatként, ha csak az empirikus NOEC szintjét kell meghatározni. Ötnél kevesebb vizsgálati koncentráció használatát indokolni kell. Nem szükséges vizsgálni a vizsgálati vegyi anyag koncentrációját a 96 órás LC50-nél vagy (amennyiben alacsonyabb) a 10 mg/l értéknél magasabb értékek esetében. Kontrollok 23. A vizsgálati vegyi anyag koncentrációsorozataival párhuzamosan hígítóvizes kontrollt és szükség esetén kizárólag az oldószer-hordozóanyagot tartalmazó oldószeres kontrollt is le kell futtatni (lásd a 16. pontot). Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága 24. Az expozíciós időszak megkezdése előtt (például a vizsgálati koncentrációk mérésével) gondoskodni kell arról, hogy a vegyi anyagot adagoló rendszer minden párhuzamos esetében megfelelően működjön. Meg kell állapítani a szükséges analitikai módszereket, ideértve a megfelelő meghatározási határt (LOQ), és az anyag vizsgálati rendszerben való stabilitásáról megfelelő ismereteket kell szerezni. A vizsgálat során a vizsgálati vegyi anyag koncentrációit az expozíció jellemzése érdekében rendszeres időközönként meg kell határozni. Legalább öt meghatározás szükséges. Átfolyásos rendszerek esetében a vizsgálati vegyi anyag analitikai mérését koncentrációnként egy párhuzamoson legalább hetente egyszer kell elvégezni, felváltva vizsgálva az egyes párhuzamosokat. A további analitikai meghatározások gyakran javítják a vizsgálatok eredményének minőségét. A szemcsés anyagok eltávolítása érdekében szükség lehet a minták szűrésére (pl. egy 0,45 μm pórusméretű szűrőbetét használatával) vagy centrifugálására annak biztosítására, hogy a meghatározások valódi oldatban lévő vegyi anyagra vonatkozzanak. A vizsgálati vegyi anyag adszorpciójának csökkentése érdekében a szűrőket a felhasználásuk előtt telíteni kell. Amennyiben a mért koncentrációértékek nem maradnak a névleges koncentrációérték 80–120 %-án belül, úgy a hatásos koncentrációkat átfolyásos vizsgálatok esetében a számtani átlaghoz viszonyítva kell meghatározni és kifejezni (lásd a C.20 vizsgálati módszer 6. függelékében a számtani átlag kiszámítását (8)), félstatikus vizsgálatok esetében pedig a mért koncentrációk mértani átlagához viszonyítva kell kifejezni (lásd „A nehezen vizsgálható anyagok és keverékek vízi toxikológiai vizsgálata” című, OECD-iránymutatás 5. fejezetét (2)). 25. A vizsgálat során minden vizsgálati edényben legalább hetente egyszer meg kell mérni az oldott oxigén koncentrációját, a pH-t és a hőmérsékletet, valamint indokolt esetben a sótartalmat és a keménységet a vizsgálat elején és végén. A hőmérsékletet legalább egy vizsgálati edényben folyamatosan figyelemmel kell kísérni. Megfigyelések 26. Az embrionális fejlődés fázisa : a vizsgálati vegyi anyag hatásának való expozíció kezdetén az embrionális fejlődési fázis azonosítását a lehető legpontosabban kell elvégezni. Erre a megfelelően tartósított és megtisztított peték egy reprezentatív mintája használható. 27. A peték kikelése és túlélése : A kikelés és túlélés folyamatait naponta egyszer meg kell figyelni, és a tapasztalt számadatokat fel kell jegyezni. Amennyiben az embrionális fejlődési fázisban (pl. a vizsgálat első vagy második napján) gombaképződés figyelhető meg a petéken, úgy az érintett petéket meg kell számlálni és el kell távolítani. Az elpusztult embriókat, lárvákat és növendék halakat észlelésükkor azonnal el kell távolítani, mert gyorsan bomlásnak indulnak és a többi hal mozgásának hatására széteshetnek. Az elhullott egyedek kiemelésekor különös gondot kell fordítani arra, hogy a szomszédos embriók/lárvák nehogy fizikailag sérüljenek. Az elhullás jelei a fajtól és az életciklus szakaszától függően változnak. Például: — megtermékenyített peték: különösen a korai szakaszokban az áttetszőség jelentős csökkenése és színbeli elváltozás, amit a fehérjék koagulációja és/vagy kicsapódása okoz, ami fehér opálos színt eredményez, — embriók, lárvák és növendék halak: mozdulatlanság és/vagy a légzőmozgások és/vagy a szívverés hiánya és/vagy reakció elmaradása fizikai ingerekre. 28. Rendellenes külső megjelenés : a vizsgálat időtartamától és a leírt rendellenesség jellegétől függően megfelelő időközönként fel kell jegyezni a rendellenes testformájú lárvák vagy növendék halak számát. Meg kell jegyezni, hogy rendellenesen fejlődött lárvák és növendék halak természetes körülmények között is előfordulnak, és egyes fajok esetében a kontrollcsoport(ok)ban mennyiségük akár több százalékot is elérhet. Amennyiben a deformitás és az ezzel összefüggő rendellenes viselkedés olyan súlyosnak tekinthető, hogy az az élőlény számára már jelentős szenvedést okoz, és elérte azt a pontot, amikor a felépülés már nem lehetséges, úgy az érintett egyedet el lehet távolítani a vizsgálatból. Az ilyen állatokon eutanáziát kell végrehajtani, és a további adatelemzés szempontjából mortalitásként kell kezelni. E vizsgálati módszer tekintetében ajánlott legtöbb faj esetében normális embrionális fejlődést dokumentáltak (9) (10) (11) (12). 29. Rendellenes viselkedés : a rendellenes viselkedésmódokat – pl. hiperventilláció, koordinálatlan úszásmód, a fajra nem jellemző nyugalom és a fajra nem jellemző táplálkozási mód – a vizsgálat teljes időtartamától függő időközönként (például a melegvízi halfajok esetében naponta egyszer) fel kell jegyezni. Bár e hatásokat nehéz számszerűsíteni, ha megfigyelhetők, akkor segíthetnek a mortalitási adatok értelmezésében. 30. Tömeg : a vizsgálat végén az összes életben maradt halat le kell mérni legalább párhuzamosonként (feljegyezve a párhuzamosban szereplő állatok számát és az egyes állatok átlagos tömegét): lehetőség szerint a halak nedves (itatóspapírral szárított) tömegét kell jelentésbe foglalni, de a száraz tömeg is elfogadható (13). 31. Hosszúság : a kísérlet végén le kell mérni az egyedi hosszúságokat. Ajánlott a teljes hossz mérése, ugyanakkor, ha a farokuszonyon rothadás vagy kimaródás, pusztulás jelei fordulnak elő, akkor a standard hosszt lehet használni. Egy adott vizsgálatban szereplő valamennyi hal esetében ugyanazt a módszert kell alkalmazni. Az egyedi hosszúságot például tolómérővel, digitális fényképezőgéppel vagy kalibrált okulár-mikrométerrel lehet mérni. A jellemző minimális hosszúságok meghatározása a 2. függelékben található. ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS Az eredmények feldolgozása 32. Ajánlatos a kísérletet úgy kialakítani és olyan statisztikai vizsgálatot választani, hogy a biológiai szempontból fontos változásokat az olyan végpontokon, ahol megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációt kell jelenteni, megfelelő (80 %-os vagy ennél nagyobb) statisztikai erővel lehessen észlelni. A releváns hatásos koncentrációk és paraméterek jegyzőkönyvezése a szabályozási kerettől függhet. Amennyiben ECx értéket kell jelenteni, úgy a kísérleti tervek és a regressziós modell kiválasztásának lehetővé kell tennie az ECx érték becslését úgy, hogy i. az ECx 95 %-os konfidencia-intervalluma ne tartalmazzon nullát és ne legyen túl tág, ii. az ECx-nél várható átlag 95 %-os konfidencia-intervalluma ne tartalmazza a kontroll átlagát és iii. a regressziós modell viszonylag jól illeszkedjen az adatokhoz. Bármelyik megközelítés esetében meg kell határozni a százalékos változást minden egyes végponton, amelyet fontos kimutatni vagy megbecsülni. A vizsgálatot úgy kell kialakítani, hogy ez megoldható legyen. Amennyiben az ECx-érték meghatározásának fenti feltételei nem teljesülnek, az NOEC-megközelítést kell alkalmazni. Nem valószínű, hogy a százalékos változás minden végponton megegyezik, és az sem valószínű, hogy olyan megvalósítható kísérletet lehet tervezni, amely minden végpont tekintetében megfelel a fenti feltételeknek, tehát a kísérlet megfelelő kialakítása során azokra a végpontokra kell összpontosítani, amelyek az adott kísérlet szempontjából lényegesek. Az 5. és 6. függelék minden egyes megközelítésre vonatkozóan tartalmaz statisztikai folyamatábrákat és útmutatást, amelyek segítséget nyújtanak az adatok kezeléséhez, valamint a legmegfelelőbb statisztikai vizsgálat vagy modell kiválasztásához. Alkalmazhatók más statisztikai megközelítések is, amennyiben azok használata tudományos szempontból indokolt. 33. Szükséges a párhuzamos eredmények közti eltérések varianciaanalízissel vagy kontingenciatáblázatos módszerrel való elemzése, és az elemzés alapján a megfelelő statisztikai elemző módszerek alkalmazása. Az egyedi koncentrációszintek és a kontrollcsoport szintjei esetében kapott eredmények közötti többszörös összehasonlítás érdekében a lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-féle próba vagy a Williams-féle próba elvégzése javasolt folytonos válaszok esetében, és a lefelé lépegető Cochran–Armitage-féle próba alkalmazása javasolt diszkrét válaszok esetében, amelyek monoton koncentráció-válasznak felelnek meg és az „extra-binomiális” varianciára nincs bizonyíték (14). Amennyiben az „extra-binomiális” variancia igazolható, a Cochran–Armitage-féle próba Rao–Scott-féle módosítása javasolt (15) (16), illetve a Williams- vagy a Dunnett-féle próba (négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció után) vagy a Jonckheere–Terpstra-féle próba a párhuzamosok arányaira. Amennyiben az adatok nem monoton koncentráció-válasznak felelnek meg, folytonos válaszok esetében a Dunnett- vagy a Dunn- vagy a Mann–Whitney-féle módszer bizonyulhat hasznosnak, diszkrét válaszok tekintetében pedig a Fisher-egzakt teszt (14) (17) (18). Bármely statisztikai módszer vagy modell alkalmazása során figyelmet kell fordítani arra, hogy a módszer vagy modell követelményei teljesüljenek (pl. a kísérlet megtervezésekor és a vizsgálat vagy modell alkalmazásakor meg kell becsülni és számításba kell venni a kamránkénti variabilitást). Az adatokat a normális eloszlás szempontjából értékelni kell, és az 5. függelék iránymutatást ad arra vonatkozóan, hogy az ANOVA reziduálisaival mi a teendő. A 6. függelék a regressziós megközelítés további megfontolásait tárgyalja. A statisztikai vizsgálatok követelményeinek való megfelelés érdekében transzformációkra lehet szükség. A regressziós modellek illesztése során végzett transzformációknál körültekintéssel kell eljárni, hiszen megeshet, hogy a nem transzformált adatokban megmutatkozó 25 %-os változás nem felel meg a transzformált adatokban megjelenő 25 %-os változásnak. Minden elemzés esetében a vizsgálati kamra és nem a halegyed az elemzési egység és a kísérleti egység, és ezt a hipotézisvizsgálatnak és a regressziónak is tükröznie kell (3) (14) (19) (20). Vizsgálati jegyzőkönyv 34. A vizsgálati jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia: Vizsgálati vegyi anyag: Egy összetevőből álló anyag: — fizikai megjelenés, vízoldékonyság és a további releváns fizikai-kémiai tulajdonságok; — kémiai azonosítás, például IUPAC- vagy CAS-név, CAS-szám, SMILES- vagy InChI-kód, szerkezeti képlet, tisztaság, adott esetben és amennyiben a gyakorlatban megvalósítható, a szennyeződések kémiai azonossága stb. (ideértve adott esetben a szervesszén-tartalmat). Több összetevőből álló anyag, UVCB-k és keverékek: — amennyire részletesen lehetséges, az összetevőknek például a kémiai azonosítója (lásd fent), mennyiségi előfordulása és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai révén való jellemzés. Vizsgálati fajok: — tudományos név, törzs, származás és a megtermékenyített peték begyűjtésének módja, valamint a későbbi kezelés. Vizsgálati körülmények: — alkalmazott vizsgálati eljárás (például félstatikus vagy átfolyásos, betelepítés); — megvilágítási időszak(ok); — vizsgálati elrendezés (pl. a vizsgálati kamrák és a párhuzamosok száma, a peték száma párhuzamosonként, a vizsgálati kamrák anyaga és mérete (magasság, szélesség, térfogat), víztérfogat vizsgálati kamránként); — a törzsoldat elkészítésének módszere és a vízcsere gyakorisága (az esetleg használt diszpergálószer nevét és koncentrációját meg kell adni); — a vizsgálati vegyi anyag adagolásának módszere (például szivattyú, hígítási rendszerek); — a módszer visszanyerési hatékonysága és a névleges vizsgálati koncentrációk, a meghatározási határ, a mért értékek átlaga és szórása a vizsgálati edényekben, az ilyen adatok megszerzésének módszerei és bizonyítékok annak alátámasztására, hogy a mérések a valódi oldatban lévő vizsgálati vegyi anyag koncentrációszintjeire vonatkoznak, — a hígítóvíz jellemzői: pH-érték, keménység, hőmérséklet, oldottoxigén-koncentráció, maradékklór-tartalom (amennyiben mérik), teljes szervesszén-tartalom (amennyiben mérik), szuszpendált szilárd anyagok (amennyiben mérik), a vizsgálati közeg sótartalma (amennyiben mérik) és bármely más mérési adat; — vízminőség a vizsgálati edényekben: pH-érték, keménység, hőmérséklet és az oldottoxigén-koncentráció; — részletes információk a táplálékról (pl. a haltáp típusa, eredete, az adagolt mennyiség és az adagolás gyakorisága). A következő végpontokra vonatkozóan egyedileg (vagy párhuzamosonként) dokumentált eredmények, azok átlaga, valamint adott esetben a variációs koefficiens: — annak bizonyítása, hogy a kontrollok megfelelnek a vizsgálati fajok teljes túlélési elfogadhatósági normáinak (lásd 2. függelék); — az egyes fejlődési fázisok (embrió, lárva és növendék hal) mortalitására és az összesített mortalitásra vonatkozó adatok; — a kikelésig eltelt napok és a kikelt lárvák száma naponta, és a kikelés végének időpontja; — az egészséges halak száma a vizsgálat végén; — a túlélő állatok hosszára (standard vagy teljes hossz megadása) és tömegére vonatkozó adatok; — az esetleges morfológiai rendellenességek előfordulása, jellemzése és száma; — az esetleges viselkedésbeli eltérések előfordulása, leírása és száma; — a statisztikai elemzés során alkalmazott megközelítés (regressziós analízis vagy varianciaanalízis) és az adatok feldolgozása (az alkalmazott statisztikai vizsgálat vagy modell); — megfigyelhető hatást nem okozó koncentráció minden egyes kiértékelt válaszreakcióra nézve (NOEC); — a megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (p = 0,05-nél) minden egyes kiértékelt válaszreakcióra nézve (LOEC); — ECx adott esetben minden egyes kiértékelt válaszreakcióra nézve, konfidencia-intervallumok (például 90 vagy 95 %) és a számításhoz használt illesztett modell grafikonja, a koncentráció–hatás görbe meredeksége, a regressziós modell egyenlete, a modell becsült paraméterei és a becslés standard hibái. A vizsgálati módszertől való bármely eltérés. Az eredmények tárgyalása, ideértve a vizsgálati módszertől való eltérésnek a vizsgálat eredményére gyakorolt esetleges hatását. 1. táblázat Vizsgálathoz ajánlott halfajok ÉDESVÍZI TORKOLATI és TENGERI Oncorhynchus mykiss Szivárványos pisztráng Cyprinodon variegatus Tarka fogasponty Pimephales promelas Amerikai cselle Menidia sp. Atlanti ezüstösoldalú hal Danio rerio Zebradánió Oryzias latipes Japán rizshal vagy Medaka SZAKIRODALOM (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early LifeStage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 124188. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA660/375011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA600/377061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Chapter C.20 of this Annex, Daphnia magna Reproduction Test. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for lifecycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 10961121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. 1. függelék FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK A farok tövéig mért hossz : az orrcsúcs és a farokúszó középső sugarának végpontja közötti távolság, és olyan halak esetében alkalmazandó, amelyeknél nehéz meghatározni, hogy a gerincoszlop hol ér véget (www.fishbase.org) Standard hossz : az orrcsúcstól az utolsó csigolya poszterior végéig vagy a hipurális lemez mediolaterális részének poszterior végéig mért távolság. Leegyszerűsítve ez a mérés nem tartalmazza a farokúszó hosszát. (www.fishbase.org) Teljes hossz : az orrcsúcs és a farokúszó hosszabbik lebenyének csúcsa közötti távolság, amelyet általában a lebenyek középvonal mentén való összenyomásával mérnek. Ez egy egyenes vonalú mérés, nem követi a test görbületét (www.fishbase.org) 1. ábra A használt különböző hosszúságok leírása Standard hossz Villás elágazású hossz Teljes hossz Vegyi anyag : anyag vagy keverék. ECx (hatásos koncentráció x % hatás eléréséhez) : az a koncentráció, amely valamely hatás x %-át okozza a vizsgálati szervezetekben egy adott expozíciós időn belül, a kontrollal összehasonlítva. Például az EC50 az a becsült koncentráció, amely a vizsgálat valamilyen végpontja tekintetében a kitett populáció 50 %-ában okoz hatást a meghatározott expozíciós idő alatt. Megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentráció (LOEC) : a vizsgálati vegyi anyag azon legalacsonyabb vizsgálati koncentrációja, amelynél a kontrollal összevetve még megfigyelhető a vegyi anyag statisztikailag szignifikáns hatása (p < 0,05). Azonban az LOEC-szint feletti valamennyi vizsgálati koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább egyenlő az LOEC-szinten megfigyelttel vagy súlyosabb annál. Amennyiben e két feltétel nem teljesíthető, akkor kimerítő magyarázatot kell adni arra, hogy hogyan történt az LOEC (és ennélfogva az NOEC) kiválasztása. Az 5. és 6. függelék útmutatást ad. Megfigyelhető hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : a közvetlenül az LOEC alatti vizsgálati koncentráció, amely – a kontrollcsoporttal való összevetésben – nem fejt ki statisztikailag szignifikáns hatást (p < 0,05) a meghatározott expozíciós időszak alatt. Vizsgálati vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy keverék. UVCB : ismeretlen szerkezetű vagy változó összetételű, összetett reakcióban keletkezett vagy biológiai eredetű anyag. IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry (Elméleti és Alkalmazott Kémia Nemzetközi Uniója). SMILES : molekulák egyszerűsített egy sorban történő beviteli rendszere 2. függelék VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK, IDŐTARTAM ÉS A JAVASOLT FAJOK TÚLÉLÉSI KRITÉRIUMAI FAJ VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK A VIZSGÁLAT JAVASOLT IDŐTARTAMA A kontrollhalak vizsgálat végén mért jellemző minimális átlagos teljes hossza (mm) (98) A KONTROLLCSOPORT TÚLÉLÉSI ARÁNYA (minimum) Hőmérséklet (°C) Sótartalom (0/00) Megvilágítás (óra) Kikelés sikeressége Kikelést követő életképesség Édesvíz: Oncorhynchus mykiss Szivárványos pisztráng 10 ± 1,5 (99) 12 – 16 (100) 2 hét azt követően, hogy a kontrollok szabadon táplálkoznak (vagy 60 nap a kikelést követően) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Amerikai cselle 25 ± 1,5 16 a vizsgálat kezdetét követően 32 nap (vagy a kikelést követően 28 nap) 18 70 % 75 % Danio rerio Zebradánió 26 ± 1,5 12 – 16 (101) a kikelést követően 30 nap 11 70 % 75 % Oryzias latipes Japán rizshal vagy Medaka 25 ± 2 12 – 16 (101) a kikelést követően 30 nap 17 80 % 80 % Torkolati és tengeri Cyprinodon variegatus Tarka fogasponty 25 ± 1,5 15–35 (102) 12 – 16 (101) a vizsgálat kezdetét követően 32 nap (vagy a kikelést követően 28 nap) 17 75 % 80 % Menidia sp. Atlanti ezüstösoldalú hal 22–25 15–35 (102) 13 28 nap 20 80 % 60 % 3. függelék A VIZSGÁLATHOZ JAVASOLT FAJOKBÓL SZÁRMAZÓ TENYÉSZÁLLATOK ÉS KÍSÉRLETI ÁLLATOK ETETÉSÉRE ÉS KEZELÉSÉRE VONATKOZÓ IRÁNYMUTATÁS FAJ TÁP (*9) A KIKELÉST KÖVETŐ ÁTHELYEZÉS IDŐPONTJA AZ ELSŐ ETETÉSIG ELTELT IDŐ Tenyészhalak Frissen kikelt lárvák Növendék halak Típus Gyakoriság Édesvízi: Oncorhynchus mykiss Szivárványos pisztráng pisztrángtáp Nincs (1) starter pisztrángtáp BSN napi 2–4 adag táp 14–16 nappal a kikelést követően vagy a felúszáskor (nem fontos) 19 nappal a kikelést követően vagy a felúszáskor Pimephales promelas Amerikai cselle BSN, pehely FBS BSN BSN48, pehely napi 2–3 alkalommal amikor a kikelés 90 %-os 2 nappal a kikelést követően Danio rerio Zebradánió BSN, pehely kereskedelmi táp lárvák számára, protozoa (2), protein (3) BSN48, pehely, BSN, naponta egyszer; pehely naponta kétszer amikor a kikelés 90 %-os 2 nappal a kikelést követően Oryzias latipes Japán rizshal vagy Medaka pehely BSN, pehely (vagy protozoa vagy kerekesférgek) BSN48, pehely (vagy kerekesférgek) BSN naponta egyszer; pehely naponta kétszer vagy pehely és kerekesférgek naponta egyszer nem alkalmazandó 6–7 nappal az ívást követően Torkolati és tengeri: Cyprinodon variegatus Tarka fogasponty BSN, pehely, FBS BSN BSN48 napi 2–3 adag táp nem alkalmazandó 1 nappal a kikelést követően/felúszáskor Menidia sp. Atlanti ezüstösoldalú hal BSN48, pehely BSN BSN48 napi 2–3 adag táp nem alkalmazandó 1 nappal a kikelést követően/felúszáskor 4. függelék AZ ELFOGADHATÓ MINŐSÉGŰ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY FONTOSABB KÉMIAI TULAJDONSÁGA Összetevő Határkoncentráció Finomszemcsés anyag 5 mg/l Teljes szervesszén-tartalom 2 mg/l Nem ionizált ammónia 1 μg/l Maradék klór 10 μg/l Szerves foszfort tartalmazó növényvédő szerek összesen 50 ng/l Szerves klórtartalmú peszticidek + poliklórozott bifenilek 50 ng/l Összes szerves klór 25 ng/l Alumínium 1 μg/l Arzén 1 μg/l Króm 1 μg/l Kobalt 1 μg/l Réz 1 μg/l Vas 1 μg/l Ólom 1 μg/l Nikkel 1 μg/l Cink 1 μg/l Kadmium 100 ng/l Higany 100 ng/l Ezüst 100 ng/l 5. függelék STATISZTIKAI ÚTMUTATÓ AZ NOEC MEGHATÁROZÁSÁHOZ Általános rész Az elemzés egysége a párhuzamos tartály. Tehát folyamatos mennyiségek esetén, mint például a méret, ki kell számítani a párhuzamos minták átlagát vagy mediánját, és ezek a párhuzamos értékek lesznek az elemzendő adatok. Az alkalmazott vizsgálat statisztikai erejét lehetőleg az egyes laboratóriumok megfelelő, korábbi kontrolladatokból álló adatbázisa alapján igazolni kell. A 75–80 %-os erő mellett kimutatható mérethatást minden egyes végpontra vonatkozóan meg kell adni az alkalmazandó statisztikai próbával. A vizsgálati módszer kidolgozásának időpontjában rendelkezésre álló adatbázisok meghatározzák a javasolt statisztikai eljárások keretében elérhető statisztikai erőt. Az egyes laboratóriumoknak igazolniuk kell, hogy teljesíteni tudják az említett statisztikai erőre vonatkozó követelményt, oly módon, hogy saját maguk elvégzik az erőre vonatkozó elemzést vagy igazolják, hogy a variációs koefficiens egyetlen válaszreakció esetében sem haladja meg a vizsgálati iránymutatás kidolgozása során használt variációs koefficiensek 90. percentilisét. A variációs koefficiens értékeit az 1. táblázat tartalmazza. Amennyiben csak a párhuzamosok átlagai vagy mediánjai állnak rendelkezésre, a párhuzamoson belüli variációs koefficienst figyelmen kívül lehet hagyni. 1. táblázat A kiválasztott édesvízi fajok 90. percentilis értékeinek variációs koefficiense Faj Válaszreakció A párhuzamosok közötti variációs koefficiens A párhuzamosokon belüli variációs koefficiens Szivárványos pisztráng Hossz 17,4 9,8 Tömeg 10,1 28 Amerikai cselle Hossz 16,9 13,5 Tömeg 11,7 38,7 Zebradánió Hossz 43,7 11,7 Tömeg 11,9 32,8 A laboratóriumi toxikológiai vizsgálatok értékelésére alkalmazott szinte valamennyi statisztikai vizsgálat célja a kezelt és a nem kezelt csoport összehasonlítása. Ezért a Dunnett- vagy a Williams-féle próbák elvégzése előtt nem helyénvaló szignifikáns ANOVA F-próbát előírni, vagy szignifikáns Kruskal–Wallis-féle próbát Jonckheere–Terpstra-, Mann–Whitney- vagy Dunn-féle próba elvégzése előtt (Hochberg és Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). A Dunnett-féle próba magában foglalja a többszörös összehasonlítás korrekcióját, a szelekciós tesztként elvégzett F-próba kedvezőtlen hatással van a Dunnett-féle próba által kiadott hamis pozitív és hamis negatív eredmények arányára. Ehhez hasonlóan a lépésenként 0,05-ös szignifikanciaszintet alkalmazó Williams- és Jonckheere–Terpstra-féle lefelé lépegető próbák általánosan megőrzik az 5 %-os hamis pozitív arányt, és ezt az arányt, valamint a vizsgálat statisztikai erejét a szelekciós tesztként elvégzett F- vagy Kruskal–Wallis-féle próba negatívan befolyásolja. A Mann–Whitney- és a Dunn-féle próba esetében is el kell végezni a többszörös összehasonlításra tekintettel történő korrekciót, és a Bonferroni–Holm-féle korrekció javasolt. A hipotézisvizsgálatokra vonatkozó ajánlások többségét és az említett vizsgálatok alapját képező feltételezések ellenőrzését a széles körű szakirodalmi jegyzéket is tartalmazó OECD (2006) iránymutatás részletesen tárgyalja. A kontrollok kezelése oldószer használata esetén Oldószer alkalmazása esetén hígítóvizes és oldószeres kontrollt is be kell állítani. A két kontrollt minden egyes válaszreakció tekintetében össze kell hasonlítani, és amennyiben a kontrollok között nem tapasztalható szignifikáns eltérés, úgy azokat statisztikai elemzés céljából egyesíteni kell. Ellenkező esetben az oldószeres kontrollt kell használni az NOEC meghatározására vagy az ECx érték becslésére, a vizes kontrollt pedig figyelmen kívül kell hagyni. Lásd az érvényességi kritériumokban szereplő korlátozásokat (7. pont) A hosszúság, a tömeg, a peték kikelési vagy a lárvák mortalitási aránya, illetve a rendellenesen fejlődött lárvák aránya, továbbá a kikelés vagy a felúszás első vagy utolsó napja tekintetében t-próbát vagy Mann–Whitney-féle próbát kell végezni a hígítóvizes és az oldószeres kontroll összehasonlítására 0,05-ös szignifikanciaszint mellett, valamennyi kezelt csoport figyelmen kívül hagyásával. A vizsgálatok eredményeit jegyzőkönyvbe kell foglalni. A méretre vonatkozó mérések (hossz és tömeg) A halegyedek hosszára és tömegére vonatkozó értékek normális vagy log-normális eloszlásúak lehetnek. A párhuzamos vizsgálatok átlagai a centrális határeloszlás-tétel értelmében általában mindkét esetben normális eloszlást mutatnak, és ezt három édesvízi fajjal végzett több mint száz ELS (korai életszakasz)-vizsgálat adatai is alátámasztják. Amennyiben az adatok vagy a korábbi adatbázisok a halegyedek méretére vonatkozó értékek tekintetében log-normális eloszlásra utalnak, úgy ki lehet számítani a párhuzamosonként a halegyedekre vonatkozó átlagértékek logaritmusát, ahol az elemzendő adatok a párhuzamosok átlagai logaritmusainak antilogaritmusai lesznek. Az adatokat a normális eloszlásnak való megfelelés és a varianciahomogenitás teljesülése szempontjából értékelni kell. E célból az ANOVA modell reziduálisai a koncentrációval mint egyetlen magyarázó változóval használandók. Vizuális meghatározást lehet végezni szórásdiagramok és hisztogramok segítségével, vagy szár-levél diagramokat lehet használni. E helyett végezhető formális próba is, mint például a Shapiro–Wilk- vagy az Anderson–Darling-féle próba. A varianciahomogenitás teljesülését ugyanazon szórásdiagram alapján vizuális meghatározással vagy formálisan, Levene-féle próbával lehet megállapítani. A normalitás és a variancia homogenitása tekintetében csak paraméteres próbákat (pl. Williams, Dunnett) kell értékelni. Figyelmet kell fordítani az esetleges kiugró értékekre és azok elemzésre gyakorolt hatására. A Tukey-féle kiugróérték-próbát és a fent leírt reziduálisok ábráinak vizuális ellenőrzését lehet alkalmazni. Figyelembe kell venni, hogy a megfigyelések a párhuzamos vizsgálatok egészére vonatkoznak, tehát egy kiugró értéket csak gondos mérlegelés után tanácsos az elemzés során figyelmen kívül hagyni. Azok a statisztikai vizsgálatok, amelyek felhasználják a kísérleti elrendezés jellemzőit és a biológiai elvárásokat, lefelé lépegető trendpróbák, mint például a Williams- és Jonckheere–Terpstra-féle próbák. Ezek a vizsgálatok monoton koncentráció-hatás összefüggést feltételeznek, és az adatokat aszerint kell értékelni, hogy megfelelnek-e ennek a feltételezésnek. Ezt a párhuzamosok átlagát a vizsgálati koncentráció függvényében ábrázoló szórásdiagram vizuális értékelésével lehet megállapítani. Segíthet, ha a szórásdiagramra egy szakaszonként lineáris görbét fektetnek, ami összeköti a párhuzamos vizsgálatokon belüli mintamérettel súlyozott átlagkoncentrációkat. A szakaszonként lineáris görbe nagymértékű eltérése a monotonitástól arra utalna, hogy a trendpróbák helyett más próbákat kellene használni. Alternatívaként formális próbák alkalmazhatók. Egy egyszerű formális próba a koncentrációk átlagértékeinek lineáris és kvadratikus kontrasztjainak kiszámítását célozza. Amennyiben a kvadratikus kontraszt szignifikáns, a lineáris kontraszt pedig nem szignifikáns, az a monotonitással kapcsolatos problémára utalhat, amit a görbék alapján további értékelésnek kell alávetni. Ahol felvetődik a normalitás és a varianciahomogenitás kérdése, az említett kontrasztokat rangsorba rendezett transzformált adatokból lehet létrehozni. Egyéb eljárások, mint például a Bartholomew-teszt is alkalmazhatók a monotonicitás vizsgálatára, viszont ezek összetettebb eljárások. 2. ábra NOEC folyamatábra – a méretre vonatkozó mérések (hosszúság és tömeg) Azokat az eseteket kivéve, ahol az adatok nem felelnek meg ezen próbák követelményeinek, a NOEC a Williams- vagy a Jonckheere–Terpstra-féle próba lefelé lépegető alkalmazásával határozható meg. Az OECD (2006) iránymutatása részletesen ismerteti ezeket az eljárásokat. A lefelé lépegető trendpróba követelményeinek nem megfelelő adatok esetén Dunnett-féle próbát vagy Tamhane–Dunnett (T3) tesztet lehet alkalmazni; mindkét teszt magában foglalja a többszörös összehasonlítások miatt szükséges korrekciót. Ezek a próbák feltételezik a normalitást, a Dunnett-féle próba pedig a variancia homogenitását. Amennyiben ezek a feltételek nem teljesülnek, Dunn-féle nem-paraméteres próbát lehet végezni. Az OECD (2006) iránymutatása tartalmazza az említett próbák részleteit. A 2. ábra áttekintést ad arról, hogy a megfelelő vizsgálatot hogyan lehet megválasztani. A peték kikelése és a lárvák túlélése Az adatok a kikelt peték vagy a túlélő lárvák aránya az egyedi párhuzamosokban. Ezeket az arányokat az extra-binomiális variancia szempontjából értékelni kell, ami az ilyen mérések esetében szokásos, de nem általános eljárás. A 3. ábrán látható folyamatábra útmutatást ad a választható vizsgálatokra vonatkozóan; a részletes leírást lásd a szövegben. Két próbát alkalmaznak gyakran. A Tarone C(α) tesztet (Tarone, 1979) és a khí-négyzet próbát, amelyeket minden egyes vizsgálati koncentrációra külön-külön kell alkalmazni. Amennyiben akár egyetlen vizsgálati koncentráció esetében extra-binomiális varianciát találnak, akkor az erre alkalmas módszert kell használni. 1. képlet Tarone C (α) teszt (Tarone 1979) ahol ̂ az átlagos arány egy adott koncentráció esetében, m a párhuzamos tartályok száma, nj a párhuzamosokban lévő állatok száma j, és xj az adott párhuzamosban lévő válaszreakciót mutató állatok száma, pl. nem kelt ki vagy elpusztult. Ezt a vizsgálatot minden egyes koncentrációra külön-külön kell elvégezni. Ezt a tesztet módosított khí-négyzet próbának lehet tekinteni, ugyanakkor a Tarone által végzett, korlátozott statisztikai erőre vonatkozó szimulációk azt bizonyították, hogy nagyobb statisztikai erőt képvisel, mint a khí-négyzet próba. 3. ábra A peték kikelésére és a lárvák mortalitására vonatkozó NOEC folyamatábra Amennyiben az extra-binomiális varianciára nincs szignifikáns bizonyíték, a lefelé lépegető Cochran–Armitage-féle próbát lehet alkalmazni. Ez a próba nem veszi figyelembe a párhuzamosokat, így amennyiben van ilyen bizonyíték, úgy a Cochran–Armitage-féle próba Rao–Scott-féle módosítását javasolt elvégezni, amely számításba veszi a párhuzamosokat, azok méretét és az extra-binomiális varianciát. Végezhető még lefelé lépegető Williams- és Jonckheere–Terpstra-féle próba, valamint Dunnett-féle próba a méretre vonatkozó mérésekre leírtak szerint. Az említett próbák extra-binomiális variancia esetén, illetve annak hiányában is alkalmazhatók, azonban némiképp alacsonyabb statisztikai erőt képviselnek (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao és Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). A kikelés vagy a felúszás első vagy utolsó napja A válaszreakció egy egész szám, amely azt a vizsgálati napot adja meg, amelyen a jelzett megfigyelést végezték az adott párhuzamos tartály esetében. Az értéktartomány általában igen szűk, és gyakran nagy a kötött értékek aránya, pl. a kikelés első napja valamennyi kontrollpárhuzamosban és esetleg egy vagy két alacsony vizsgálati koncentrációban megegyezik. Az ilyen adatok esetében a paraméteres próbák, mint például a Williams- és a Dunnett-féle próba, nem megfelelőek. Hacsak nincs bizonyíték arra, hogy az eredmények a monotonitástól jelentősen eltérnek, a lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-féle próba nagyon erőteljes módszer a vizsgálati vegyi anyag hatásainak kimutatására. Egyébként a Dunn-féle próbát lehet alkalmazni. A lárvák rendellenességei A válaszreakció a valamilyen rendellenességet mutató lárvák száma. Ennek a válaszreakciónak az előfordulási gyakorisága általában alacsony, és néhány olyan probléma merül fel vele kapcsolatban, mint a kikelés első napja esetében, valamint a koncentráció-hatás összefüggés néha szabálytalan. Amennyiben az adatok legalább hozzávetőleg monoton koncentrációs görbét követnek, a lefelé lépegető Jonckheere–Terpstra-féle próba erőteljes módszer a hatások kimutatására. Egyébként a Dunn-féle próbát lehet alkalmazni. HIVATKOZÁSOK: Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. 6. függelék STATISZTIKAI ÚTMUTATÓ REGRESSZIÓS BECSLÉSEKHEZ Általános rész A modell illesztéséhez alkalmazott megfigyelések a párhuzamosok átlagai (hosszúság és tömeg) vagy azok arányai (a peték kikelése és a lárvák mortalitása) (OECD 2006). Általában a párhuzamos minták méretét súlyként használó súlyozott regresszió a javasolt módszer. Más súlyozási rendszerek is alkalmazhatók, mint például az előrejelzett átlagos válaszreakcióval történő súlyozás, valamint ennek és a párhuzamos minták méretével való súlyozásnak a kombinációja. A koncentráción belüli mintavariancia reciprokával történő súlyozás nem ajánlott (Bunke et al. 1999, Seber és Wild, 2003, Motulsky és Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). A válaszreakciók elemzést megelőző bármilyen transzformációja esetén meg kell őrizni a megfigyelések függetlenségét, és az ECx értékét és konfidenciahatárait az eredeti mértékegységben és nem a transzformált egységben kell kifejezni. Például a hosszúság logaritmusának 20 %-os változása nem egyenértékű a hosszúság 20 %-os változásával (Lyles et al. 2008, Draper és Smith 1999). A 4. ábrán látható folyamatábra áttekintést nyújt az ECx becsléseire vonatkozóan. További részletek az alábbi szövegben találhatók. 4. ábra A párhuzamosok átlagos hosszára és tömegére, vagy a peték kikelésére és a lárvák mortalitására vonatkozó ECx becslések folyamatábrája, a részleteket lásd a szövegben A peték kikelésével és a lárvák mortalitásával kapcsolatos megfontolások A peték kikelése és a lárvák mortalitása tekintetében általában a legjobb megoldás egy csökkenő modell illesztése, kivéve, ha az alább ismertetett probit modell illesztését választják. Tehát a ki nem kelt peték vagy az elpusztult lárvák arányát kell modellezni. Ennek az az oka, hogy az ECx arra a koncentrációra utal, amely esetében a kontrollok átlagos válaszreakciójának x %-ával egyenértékű változás következik be. Amennyiben a kontrollpeték 5 %-a nem kel ki és a kikelés sikertelenségét modellezik, akkor az EC20 azt a koncentrációt jelenti, amely esetében a kontrollpeték 5 %-os sikertelen kikelése 20 %-kal változik, ami 0,2*0,05=0,01 értékű vagy 1 százalékpontos változásnak, azaz 6 %-os sikertelen kikelésnek felel meg. Ilyen csekély változást a rendelkezésre álló adatokból nem lehet megbecsülni és annak biológiai szempontból nincs jelentősége. Amennyiben a kikelő peték arányát modellezik, a kontrollarány ebben a példában 95 % lesz és a kontroll átlagának 20 %-os csökkenése 0,95*0,2=0,18 értékű változást jelentene, tehát a kikelés sikeressége 95 %-ról 77 %-ra csökken (= 95–18) és ezt a hatást okozó koncentrációt lehet megbecsülni, ami feltehetően nagyobb jelentőséggel bírhat. Ez a méretre vonatkozó mérésekkel kapcsolatosan nem jelent problémát, noha a méretre gyakorolt kedvezőtlen hatások általában méretcsökkenést jelentenek. A méretre (hosszúság és tömeg) és a peték kikelésének sikerességére vagy a lárvák túlélésére vonatkozó modellek A Brain–Cousens-féle hormetikus modell kivételével az OECD (2006) iránymutatás az említett modellek mindegyikét ismerteti és ajánlja. Az OECD 2–5 elnevezésű modellekben foglaltakat az ökotoxicitás-vizsgálatok kapcsán Slob (2002) tanulmánya is tárgyalja. Természetesen számos egyéb modell hasznos lehet. Bunke és munkatársai (1999) számos olyan modellt sorolnak fel, amelyek itt nem kerültek említésre, és bőségesen állnak rendelkezésre más modellekre való hivatkozások. Az alábbiakban felsorolt modellek az ökotoxicitás-vizsgálatok esetében különösen alkalmasak és széles körben elterjedtek. 5 vizsgálati koncentrációval és kontrollal — Bruce–Versteeg — Egyszerű exponenciális (OECD 2) — Exponenciális alak-paraméterrel (OECD 3) — Egyszerű exponenciális alsó határértékkel (OECD 4) 6 vagy ennél több vizsgálati koncentrációval és kontrollal — Exponenciális alak-paraméterrel és alsó határértékkel (OECD 5) — Michaelis–Menten — Hill Amennyiben hormézis látható (a peték sikeres kikelése vagy a lárvák túlélése esetén nem valószínű, ugyanakkor a méretre vonatkozó megfigyelések során néha előfordul) — Brain–Cousens hormetikus modellje; Brain és Cousens (1989) A peték sikertelen kikelésére és a lárvák mortalitására vonatkozó egyéb modellek — Az ilyen válaszreakciókra alkalmazható növekvő modellekre probit (vagy logisztikus) modelleket lehet illeszteni, amennyiben az extra-binomiális varianciára nincs bizonyíték és a kontroll incidenciája becsülve van a modell illesztésekor. Nem ezt a módszert kell előnyben részesíteni, mivel ebben az egyed és nem a párhuzamos az elemzési egység (Morgan 1992, O'Hara Hines és Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Egyetlen modell illeszkedésének megfelelősége — Minden egyes vizsgálati koncentráció esetében vizuálisan össze kell hasonlítani a megfigyelt és az előrejelzett százalékos csökkenést (Motulsky és Christopoulos 2004, Draper és Smith 1999). — F-próba alkalmazásával össze kell hasonlítani a regresszió átlagos négyzetes hibáját a tiszta átlagos négyzetes hibával (Draper és Smith 1999). — Ellenőrizni kell, hogy a modell minden feltétele jelentősen eltér-e a nullától (vagyis meg kell határozni, hogy a modell valamennyi feltétele fontos-e) (Motulsky és Christopoulos 2004). — A regresszió reziduálisainak a vizsgálati koncentráció függvényében történő ábrázolása, lehetőleg log(koncentráció) skálán. Ennek az ábrának nem kell semmilyen mintázatot követnie; a pontoknak véletlenszerűen kell szóródniuk egy vízszintes egyenes mentén a nulla magasságában. — Az adatokat a normalitás és varianciahomogenitás szempontjából kell értékelni az 5. függelékben feltüntetett módszerrel megegyezően. — Emellett a regressziós modell maradékainak normalitását ugyanazokat a módszereket alkalmazva kell értékelni, mint amelyeket az 5. függelék az ANOVA reziduálisai tekintetében ismertet. A modellek összehasonlítása — Akiake AICc-kritériumait kell alkalmazni. Az alacsonyabb AICc-értékek a jobb illeszkedést jelzik és amennyiben AICc(B)-AICc(A)≥10, akkor az A. modell szinte biztosan jobb, mint a B. modell (Motulsky és Christopoulos (2004). — Vizuálisan össze kell hasonlítani a két modellt aszerint, hogy az egyetlen modellre vonatkozó fenti kritériumoknak mennyire felelnek meg. — A takarékosság elvét javasolt követni, miszerint a legegyszerűbb modellt kell alkalmazni azok közül, amelyek kellően jól illeszkednek az adatokhoz (Ratkowsky 1993, Lyles et al. 2008). Az ECx becslés minősége Az ECx konfidencia-intervalluma nem lehet túl tág. Statisztikai megítélés szükséges annak eldöntésére, hogy a konfidencia-intervallum mennyire lehet tág, hogy az ECx még használható legyen. A peték kikelésére és a méretre vonatkozó adatokhoz illeszkedő regressziós modellek szimulációi azt mutatják, hogy az ECx (x=10, 20 vagy 30) konfidencia-intervallumainak 75 %-a nem lép túl két vizsgálati koncentrációt. Ez általános útmutatást ad arra vonatkozóan, hogy mi az elfogadható, és praktikus útmutató arra, hogy mi az, ami megvalósítható. Számos szerző állítja, hogy szükség van arra, hogy a konfidencia-intervallumokat a modellek minden paramétere tekintetében feljegyezzék, és hogy a modellparaméterek tág konfidencia-intervallumai elfogadhatatlan modelleket jeleznek (Ott és Longnecker 2008, Alvord és Rossio 1993, Motulsky és Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber és Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). Az ECx (vagy bármely más modellparaméter) konfidencia-intervalluma nem tartalmazhatja a nullát (Motulsky és Christopoulos 2004). Ez a minimális szignifikáns különbséggel egyenértékű regresszió, amelyet a hipotézisvizsgálati megközelítésekben gyakran említenek (pl. Wang et al. 2000). Ez a konfidencia-intervallummal is megegyezik, hogy az LOEC szintjén mért átlagos válaszreakció ne tartalmazza a kontroll átlagát. Vizsgálni kell, hogy a paraméterek becslései tudományosan elfogadhatók-e. Pl. ha az y0 konfidencia-intervalluma ±20 %, akkor egyetlen EC10 becslés sem elfogadható. Amennyiben a modell 20 %-os hatást jelez előre C koncentrációnál és a maximális megfigyelhető hatás C és annál alacsonyabb koncentrációnál 10 %-os, akkor az EC20 nem elfogadható (Motulsky és Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). Az ECx nem teheti szükségessé a pozitív koncentrációk tartományán kívüli extrapolációt (Draper és Smith 1999, OECD 2006). Az ECx értékére vonatkozó általános iránymutatás az lehet, hogy az érték ne legyen több mint kb. 25 %-kal a legalacsonyabb vizsgálati koncentráció alatt, vagy ne legyen több mint kb. 25 %-kal a legmagasabb vizsgálati koncentráció felett. HIVATKOZÁSOK: Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48. A halakon végzett rövid távú reprodukciós vizsgálat BEVEZETÉS 1. Ez a vizsgálati módszer egyenértékű az OECD 229. vizsgálati iránymutatásában (2012) leírt módszerrel. Az endokrin rendszerre ható vegyi anyagok halfajokban történő kimutatására alkalmas vizsgálat kifejlesztése és validálása iránti igény azokból az aggodalmakból ered, hogy a vegyi anyagok a környezetben előforduló mennyiségükben az endokrin rendszerrel való kölcsönhatásuk révén káros hatással lehetnek az emberekre és az élővilágra egyaránt. 1998-ban az OECD a meglévő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, valamint a hormonháztartást esetlegesen zavaró anyagok kiszűrését és vizsgálatát célzó új vizsgálati iránymutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenységet indított. E tevékenység egyik eleme a halfajok endokrin rendszerére ható vegyi anyagok kiszűrésére vonatkozó vizsgálati iránymutatás kidolgozása volt. A halakon végzett rövid távú reprodukciós vizsgálatot a kiválasztott vegyi anyagokkal végzett, laboratóriumok közötti vizsgálatokból álló alapos validálási programnak vetették alá, hogy bizonyítsák a vizsgálat relevanciáját és megbízhatóságát a halak szaporodását különböző, többek között az endokrin rendszerre ható mechanizmusokon keresztül befolyásoló vegyi anyagok kimutatása szempontjából (1, 2, 3, 4, 5). Az OECD vizsgálati iránymutatásában szereplő valamennyi végpontot validálták az amerikai cselle tekintetében, és a végpontok egy részét (vagyis a vitellogenint és a másodlagos ivari jellegeket) a japán rizshal és (a vitellogenint) a zebradánió esetében. A validációs munka szakértői értékelését egyrészről az OECD vizsgálati iránymutatási programjának nemzeti koordinátorai által kinevezett szakértői testület (6), másrészről az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége által megbízott független szakértői testület (29) végezte. A vizsgálat célja nem a hormonális zavarok specifikus mechanizmusainak meghatározása, mivel a vizsgálati állatok ép hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengellyel rendelkeznek, amely olyan vegyi anyagokra is reagálhat, amelyek eltérő szinteken gyakorolnak hatást a HPG-tengelyre. 2. Az e fejezetben ismertetett vizsgálati módszer egy in vivo szűrővizsgálati eljárást ír le, amelynek során ivarérett hím és ívási szakaszban lévő nőstény halakat tartanak együtt és tesznek ki vegyi anyag hatásának életciklusuk egy korlátozott szakaszában (21 napig). A 21 napig tartó expozíciós időszak végén két biomarker végpontot kell mérni a hímeknél és a nőstényeknél a vizsgálati vegyi anyag endokrin rendszerre kifejtett hatásának mutatójaként; ez a két végpont a vitellogenin és a másodlagos ivari jellegek. A vitellogenint az amerikai csellénél, a japán rizshalnál és a zebradániónál kell mérni, míg a másodlagos ivari jelleget az amerikai csellénél és a japán rizshalnál. Ezenkívül a vizsgálat során a fekunditás mennyiségi ellenőrzését naponta el kell végezni. Az ivarmirigyeket is konzerválni kell, és kórszövettani értékelés végezhető a kísérleti állatok szaporodási képességének ellenőrzése, valamint más végpontok bizonyító erejének növelése céljából. 3. Ez a biológiai vizsgálat in vivo reprodukciós szűrővizsgálati célokat szolgál, és alkalmazását az »OECD fogalmi kerete az endokrin rendszert károsító vegyi anyagok tesztelésére és értékelésére« (30) című dokumentum összefüggésében kell szemlélni. Ebben a fogalmi keretben a halakon végzett rövid távú reprodukciós vizsgálat 3. szinten javasolt mint olyan in vivo vizsgálat, amely a kiválasztott endokrin mechanizmus(ok)ról/útvonal(ak)ról szolgáltat adatokat. KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK 4. A vitellogenin (VTG) általában a nőstény ikrarakó gerincesek májában termelődik a keringő endogén ösztrogénekre adott válaszként. A szikben található fehérjék prekurzora, és a májban történő megtermelődése után a vérárammal jut el a petefészekbe, ahol a fejlődő ikrák felveszik és módosítják. A vitellogenin szinte kimutathatatlan a fiatal nőstény és hím halak vérplazmájában, mivel a szervezetükben nincs elegendő keringő ösztrogén; ugyanakkor a máj az exogén ösztrogénstimulációra adott válaszul is képes vitellogenin szintetizálására és kiválasztására. 5. A vitellogenin mérésével kimutathatók a különböző ösztrogén hatásmechanizmusú vegyi anyagok. Az ösztrogenikus vegyi anyagok kimutathatók a hím halakban végbemenő vitellogeninindukció mérésével, amely módszerre számos hivatkozás található a szakértői értékelésnek alávetett tudományos szakirodalomban (pl. (7)). A vitellogenin indukcióját aromatizálható androgénekkel szembeni expozíció után is kimutatták (8, 9). A keringő ösztrogén szintjének csökkenése a nőstényeknél – például az endogén androgént természetes ösztrogén 17β-ösztradiollá konvertáló aromatáz gátlása miatt – a vitellogeninszint csökkenését okozza, amelyet az aromatázgátló tulajdonságokkal rendelkező vegyi anyagok kimutatására lehet használni (10, 11). Az ösztrogén/aromatázgátlást követően létrejövő vitellogenin-válasz biológiai jelentőségét megállapították és széles körben dokumentálták. Lehetséges azonban, hogy a VTG-termelést a nőstényeknél az általános toxicitás és a nem az endokrin rendszerre ható toxikus hatásmechanizmusok, pl. a hepatotoxicitás is befolyásolják. 6. Több rutin mérési módszert fejlesztettek már ki és szabványosítottak. Ilyenek a fajspecifikus enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálati módszerek (ELISA), amelyek immunkémiai eljárásokat használnak a termelt vitellogeninmennyiség meghatározására az egyes halakból gyűjtött kis vér- vagy májmintákban (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). A VTG mérése céljából az amerikai cselléből vér-, a zebradánióból vér- vagy fej/farok homogenizátumot, a japán rizshalból pedig májmintát kell venni. A japán rizshal esetében jó korreláció áll fenn a vérben és a májban mért VTG-értékek között (19). A vitellogeninanalízishez előírt mintavételi eljárásokat a 6. függelék tartalmazza. A VTG mérésére szolgáló készletek széles körben elérhetők; az ilyen készleteknek validált fajspecifikus ELISA-módszeren kell alapulniuk. 7. Egyes halfajok hím egyedeinek másodlagos ivari jellegei kívülről láthatók, számszerűsíthetők és reagálnak az endogén androgének szervezetben keringő mennyiségeire; ez a helyzet az amerikai cselle és a japán rizshal esetében, de a zebradánió esetében nem, mert ez a faj nem rendelkezik számszerűsíthető másodlagos ivari jellemzőkkel. A nőstények megőrzik az arra irányuló képességüket, hogy hím másodlagos ivari jellegeket fejlesszenek ki, ha vízben androgén hatású vegyi anyagoknak vannak kitéve. A tudományos irodalomban több olyan vizsgálat áll rendelkezésre, amely dokumentálja az ilyen típusú választ az amerikai cselle (20) és a japán rizshal (21) esetében. A másodlagos ivari jellegek csökkenését a hím egyedekben óvatosan kell értelmezni az alacsony statisztikai erő miatt, és az értelmezést szakértői megítélésre és a bizonyítékok súlyának mérlegelésére kell alapozni. A vizsgálatban a zebradánió használatának – az androgénhatású vegyi anyagokra reagáló számszerűsíthető másodlagos ivari jellemzők hiánya miatt –korlátai vannak. 8. Az amerikai csellében az exogén androgén expozíció fő mutatója a nőstény hal orrán található nászkiütések száma. A japán rizshal nőstény egyedeiben a papilláris nyúlványok száma képezi az androgén vegyi anyagoknak való exogén kitettség fő markerét. Az amerikai cselle és a japán rizshal ivari jellegének értékelése során követendő eljárásokat az 5A., illetve az 5B. függelék tartalmazza. 9. A halakon végzett 21 napos vizsgálat magában foglalja az ikratermelés mennyiségének értékelését és az ivarmirigyek opcionális kórszövettani vizsgálat céljából történő konzerválását. Néhány szabályozó hatóság előírhatja ezt a további végpontot is annak érdekében, hogy a kísérleti állatok szaporodási képességét átfogóbban lehessen értékelni, illetve olyan esetekben, amikor a vitellogenin és a másodlagos ivari jellegek a vegyi anyaggal történő expozícióra nem reagáltak. Noha néhány végpont nagy diagnosztikai értékű lehet (pl. a VTG-indukció a hímekben és a nászkiütés-képződés a nőstényekben), a vizsgálat nem minden végpontja (pl. a fekunditás és az ivarmirigyek kórszövettani vizsgálata) alkalmas a specifikus sejtszintű hatásmechanizmusok egyértelmű meghatározására. Ehelyett a végpontok együttesen teszik lehetővé az esetleges endokrin zavarokkal kapcsolatos következtetések levonását, és ezáltal adnak útmutatást a további vizsgálatokhoz. Noha nem endokrinspecifikus, a fekunditás – az endokrin rendszerre ható ismert vegyi anyagokra való bizonyított érzékenysége miatt (5) – egy fontos figyelembeveendő végpont, mivel ha a vizsgálati vegyi anyag a fekunditást és a többi végpontot nem befolyásolja, akkor nagyobb biztonsággal állítható, hogy a vegyület az endokrin rendszerre valószínűleg nincs hatással. Ugyanakkor, ha a fekunditást befolyásolja, az nagy súllyal esik latba a bizonyítékok mérlegelésekor. Az adatok értelmezésére és a vizsgálati eredmények elfogadhatóságára vonatkozó útmutatás ezen vizsgálati módszerek leírásában található. 10. Az e vizsgálati módszerben használt fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók. A VIZSGÁLAT ELVE 11. A vizsgálat során a vizsgálati edényekben vegyesen elhelyezett, párzóképes állapotú hím és nőstény halakat kell kitenni valamely vegyi anyagnak. A felnőtt korú és párzóképes állapotú halakon a nemek egyértelműen megkülönböztethetők és ezáltal az egyes végpontok ivaronként elemezhetők, illetve biztosított a halak érzékenysége az exogén vegyi anyagok iránt. A vizsgálat befejezésekor a halak ivarát az ivarmirigyek makroszkopikus vizsgálatával kell alátámasztani a has ollóval történő ventrális felnyitása után. A biológiai vizsgálat lényeges feltételeiről a 2. függelék nyújt áttekintést. A vizsgálat általában ívási állapotban lévő populációból vett halakkal indul; öregedő állatokat nem szabad használni. A halak életkorára és párzóképességére vonatkozó útmutató „A halak kiválasztása” című szakaszban található. A vizsgálatot a vegyi anyag három expozíciós koncentrációjával, valamint egy vizes kontrollal és szükség esetén egy oldószeres kontrollal kell végezni. A zebradánió esetében kezelésenként két edényt vagy párhuzamost (minden edény 5 hímet és 5 nőstényt tartalmaz) kell alkalmazni. Az amerikai cselle esetében kezelésenként négy edényt vagy párhuzamost kell használni (minden edény 2 hímet és 4 nőstényt tartalmaz). Ez azért szükséges, hogy érvényesülhessen a hím amerikai csellék territoriális viselkedése, úgy, hogy a vizsgálathoz szükséges statisztikai erő is biztosított legyen. A japán rizshal esetében kezelésenként négy edényt vagy párhuzamost kell használni (minden edény 3 hímet és 3 nőstényt tartalmaz). Az expozíciót 21 napig kell folytatni, és a halakból az expozíció 21. napján kell mintát venni. A fekunditás mennyiségi ellenőrzését naponta kell végezni. 12. A 21. napon végzett mintavétel keretében az állatokat kíméletesen le kell ölni. Az amerikai cselle és a japán rizshal esetében a másodlagos ivari jelleget mérni kell (lásd az 5A. és 5B. függeléket); a zebradánióból és az amerikai cselléből vérmintát kell gyűjteni a vitellogenin meghatározására, míg a zebradánió esetében a vitellogenin meghatározására alternatívaként fej/farok mintát is lehet gyűjteni (6. függelék); a japán rizshalból májmintát kell gyűjteni VTG-analízis céljára (6. függelék); az ivarmirigyeket egészben vagy preparálva kell fixálni az esetleges kórszövettani értékelés céljából (22). A VIZSGÁLAT ELFOGADHATÓSÁGI KRITÉRIUMAI 13. A következő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat elfogadható legyen: — a mortalitási arány a vizes (vagy oldószeres) kontrollokban az expozíciós idő végén nem haladhatja meg a 10 %-ot, — az expozíciós idő alatt az oldott oxigén koncentrációjának mindvégig legalább a levegőtelítettségi érték (ASV) 60 %-ának kell lennie, — a víz hőmérsékletében soha nem lehet ±1,5 °C-nál nagyobb eltérés az egyes vizsgálati edények között, és a hőmérséklet a vizsgálati fajra nézve meghatározott hőmérsékleti tartományon belül 2 °C-ot ingadozhat (2. függelék), — bizonyítékkal kell alátámasztani, hogy a vizsgálati vegyi anyag oldatban lévő koncentrációit az átlagos mért értékek ±20 %-os tartományán belül sikerült tartani; — bizonyítékkal kell alátámasztani, hogy a halak a vegyi anyaggal történő expozíciót megelőzően minden párhuzamos tartályban és a vizsgálat során a kontrollokban aktívan ívnak. A MÓDSZER LEÍRÁSA Felszerelés 14. Normál laboratóriumi felszerelés és különösen az alábbiak: (a) oxigéntartalom- és pH-mérők; (b) a víz keménységi fokának és lúgosságának mérésére szolgáló berendezések; (c) a hőmérséklet szabályozására és lehetőleg folyamatos figyelemmel kísérésére is alkalmas készülékek; (d) kémiailag semleges anyagból készült és az ajánlott betelepítési aránynak és állománysűrűségnek megfelelő kapacitású tartályok (lásd a 2. függeléket); (e) ívási aljzat az amerikai cselle és a zebradánió részére, a szükséges adatok a 4. függelékben találhatók; (f) megfelelő (azaz ±0,5 mg) pontosságú mérleg. Víz 15. A vizsgálat céljára bármilyen víz felhasználható, amelyben a vizsgálati fajok kellően hosszú ideig megélnek a vizsgálati körülmények mellett, és növekednek. A víz minőségét a vizsgálat során mindvégig azonos szinten kell tartani. A víz pH-értékének a 6,5–8,5 tartományon belül kell lennie, azonban egy adott vizsgálat során a pH-érték csak ± 0,5 egységgel térhet el a kiindulási értéktől. Annak biztosítása céljából, hogy a hígítóvíz ne gyakoroljon nem kívánt hatást a vizsgálat eredményeire (pl. mert komplexet képez a vizsgálati vegyi anyaggal), bizonyos időközönként vízmintákat kell venni és elemezni. Mérni kell a következőket: a nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd és Ni), a fontosabb anionok és kationok (pl. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, és SO4 2–), a peszticidek (pl. összes szerves foszfor és összes szerves klór tartalmú peszticidek), a teljes szervesszén-tartalom és a szuszpendált szilárd anyagok, például háromhavonta, amennyiben a hígítóvíz ismerten viszonylag állandó minőségű. Amennyiben legalább egy éven keresztül állandónak bizonyul a vízminőség, a vizsgálatot ritkábban és nagyobb időközönként is el lehet végezni (pl. minden hat hónapban). Az elfogadható minőségű hígítóvíz néhány kémiai tulajdonságának felsorolása a 3. függelékben található. Vizsgálati oldatok 16. A kiválasztott koncentrációjú vizsgálati oldatok a törzsoldat hígításával készíthetők el. A törzsoldatot lehetőleg a vizsgálati vegyi anyagnak a hígítóvízbe mechanikai eszközök (pl. keverő és/vagy ultrahang) segítségével történő bekeverésével vagy megmozgatásával kell elkészíteni. Telítési oszlopok (oldhatósági oszlopok) is használhatók a megfelelő koncentrációjú törzsoldat elkészítéséhez. Oldószer-hordozóanyag használata nem ajánlott. Ugyanakkor, ha oldószerre van szükség, párhuzamosan egy oldószeres kontrollt is futtatni kell a vegyi anyaggal történő kezelésekben alkalmazottal megegyező oldószer-koncentrációval. A nehezen vizsgálható vegyi anyagok esetében az oldószer lehet technikailag a legjobb megoldás; e tekintetben „A nehezen vizsgálható anyagok és keverékek vízi toxikológiai vizsgálata” című OECD-iránymutatást (23) kell tanulmányozni. A megfelelő oldószert az anyag vagy a keverék tulajdonságai határozzák meg. Az OECD-iránymutatás maximum 100 μl/l értéket javasol, amelyet be kell tartani. Egy közelmúltban végzett felülvizsgálat (24) azonban további aggályokra hívta fel a figyelmet az oldószerek endokrin rendszerre kifejtett hatások vizsgálatában való használatával kapcsolatban. Ezért ajánlott, hogy amennyiben feltétlenül szükség van rá, az oldószer koncentrációja a lehető legkisebb legyen, ha ez technikailag megvalósítható (a vizsgálati vegyi anyag fizikai-kémiai tulajdonságaitól függően). 17. Átfolyásos vizsgálati rendszert kell használni. Ez a rendszer a koncentrációsorozatnak a vizsgálati kamrákba történő bejuttatása céljából folyamatosan adagolja és hígítja a vizsgálati vegyi anyag törzsoldatát (pl. adagolószivattyú, proporcionális hígító vagy telítőrendszer segítségével). A vizsgálat során időnként – lehetőleg naponta – ellenőrizni kell a törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét, amelynek értéke a vizsgálat során nem változhat 10 %-nál nagyobb mértékben. Ügyelni kell arra, hogy ne használjanak rossz minőségű műanyag csöveket vagy egyéb olyan anyagokat, amelyek biológiailag aktív vegyi anyagokat tartalmazhatnak. Az átfolyásos rendszerhez használt anyagok kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgálati vegyi anyagnak a kiválasztott anyaghoz való lehetséges adszorpcióját is. A halak tartása 18. A vizsgálati halakat laboratóriumi populációból kell kiválasztani, lehetőleg egyetlen tenyészetből, és a halakat a vizsgálat megkezdése előtt legalább két hétig a vizsgálat során alkalmazandó körülmények, vízminőség és megvilágítás mellett kell akklimatizálni. Fontos, hogy a betelepítési arány és az állománysűrűség (a fogalmak meghatározását lásd az 1. függelékben) a felhasznált vizsgálati fajnak megfelelő legyen (lásd a 2. függeléket). 19. A 48 órás betelepítési időszak után a mortalitást dokumentálni kell, és az alábbi követelményeket kell alkalmazni: — amennyiben a mortalitás a populáció 10 %-ánál nagyobb hét nap alatt: az egész halállományt ki kell cserélni, — amennyiben a mortalitás a populáció 5–10 %-a: további hét napig kell akklimatizálni, amennyiben a mortalitási arány ezt követően is magasabb 5 %-nál, az egész állományt ki kell cserélni; — a mortalitás a populáció 5 %-ánál kisebb hét nap alatt: az állomány alkalmazható a vizsgálathoz. 20. Az akklimatizációs időszak során, az expozíciót előkészítő időszakban és az expozíciós idő alatt a halak nem kaphatnak semmilyen betegség elleni kezelést. Az expozíciót előkészítő időszak és a halak kiválasztása 21. Egy-két hetes expozíciót előkészítő időszak javasolt, amelynek során az állatokat a tényleges vizsgálatban alkalmazotthoz hasonló edényekben kell elhelyezni. A halakat a tartási időszak és az expozíciós fázis alatt ad libitum kell etetni. Az expozíciós fázist olyan, az ivarérett kifejlett állatok laboratóriumi készletéből származó, ivari kétalakúságot mutató (pl. az amerikai cselle és a japán rizshal esetében jól látható másodlagos ivari jellegekkel rendelkező) halakkal kell megkezdeni, amelyek aktívan ívnak. Általános iránymutatásként (és ezt a szempontot nem szabad az adott halállomány tényleges reprodukciós képességétől elszigetelten szemlélni) az amerikai csellék kb. 20 (± 2) hetesek legyenek, feltételezve, hogy egész életük során 25 ± 2 °C-on tartották őket. A japán rizshalak körülbelül 16 (± 2) hetesek legyenek, feltételezve, hogy egész életük során 25 ± 2 °C-on tartották őket. A zebradániók körülbelül 16 (± 2) hetesek legyenek, feltételezve, hogy egész életük során 26 ± 2°C-on tartották őket. Az expozíciót előkészítő szakaszban az ikratermelést naponta meg kell becsülni. Az ívást ajánlatos a vizsgálat expozíciós szakaszába való bevonásukat megelőzően minden párhuzamos tartályban megfigyelni. A kívánatos napi ikratermelést illetően erre a szakaszra vonatkozóan nem lehet mennyiségi iránymutatást adni, ugyanakkor minden egyes faj esetében viszonylag általános, hogy >10 pete/nőstény/nap átlagos ikramennyiség figyelhető meg. A párhuzamosok különböző vizsgálati szintekhez való kiosztásához az ikratermelés mennyisége szerinti véletlen blokk elrendezés alkalmazandó a párhuzamosok kiegyensúlyozott eloszlásának biztosítása érdekében. VIZSGÁLATI ELRENDEZÉS 22. A vizsgálati vegyi anyag három koncentrációját, egy (vizes) kontrollt, illetve – szükség esetén – egy oldószeres kontrollt kell beállítani. Az adatok a kezelések és a kontrollok esetében kapott válaszok közötti statisztikailag szignifikáns különbség meghatározása érdekében elemezhetők. Ezek az elemzések nem a kockázatelemzésben hasznosak (25), sokkal inkább arról adnak tájékoztatást, hogy szükség van-e a vegyi anyag káros hatásainak további hosszabb távú vizsgálatára (vagyis a túlélés, a fejlődés, a növekedés és a szaporodás vizsgálatára). 23. A zebradánió esetében a kísérlet 21. napján hím és nőstény állatokat kell mintavételezni minden kezelési szintből (5 hím és 5 nőstény mindkét párhuzamosban), valamint a kontrollcsoport(ok)ból is a vitellogenin mérésére. A japán rizshal esetében a kísérlet 21. napján hím és nőstény állatokat kell mintavételezni minden kezelési szintből (3 hím és 3 nőstény mind a négy párhuzamosban), valamint a kontrollcsoport(ok)ból is a vitellogenin és a másodlagos ivari jellegek mérésére. Az amerikai cselle esetében az expozíció 21. napján hím és nőstény állatokat kell mintavételezni (2 hím és 4 nőstény mind a négy párhuzamosban), valamint a kontrollcsoport(ok)ból is a vitellogenin és másodlagos ivari jellegek mérésére. El kell végezni a fekunditás mennyiségi értékelését és a gonadális szöveteket egészben kell fixálni, vagy ki kell metszeni az esetleges kórszövettani értékelés céljából, amennyiben az szükséges. A vizsgálati koncentrációk megválasztása 24. E vizsgálat esetében a legnagyobb vizsgálati koncentrációt a legnagyobb elviselhető koncentráció (maximum tolerated concentration, MTC) alapján kell meghatározni, amelyet dózisbehatároló vizsgálattal vagy egyéb toxicitási adatokból, illetve 10 mg/l-ben, vagy a maximális vízoldékonyság mértékében kell megállapítani (amelyik a legalacsonyabb). Az MTC a vegyi anyag azon legnagyobb vizsgálati koncentrációja, amely kevesebb, mint 10 %-os mortalitást eredményez. E megközelítés azt feltételezi, hogy rendelkezésre állnak azok az empirikus akut toxicitási vagy egyéb toxicitási adatok, amelyekből az MTC-t meg lehet becsülni. Az MTC becslése pontatlan lehet és alkalmazhatóságáról jellemzően egyéni szakmai megítélés alapján kell dönteni. 25. Három vizsgálati koncentrációra van szükség, amelyek közötti konstans szorzótényező nem haladja meg a 10-et, valamint egy hígítóvizes kontrollra (és szükség esetén egy oldószeres kontrollra is). 3,2 és 10 közötti szorzótényező ajánlott. ELJÁRÁS A vizsgálati halak kiválasztása és lemérése 26. Fontos a halak testtömegeltéréseinek minimumra csökkentése a vizsgálat elején. A vizsgálathoz javasolt különböző halfajok megfelelő mérettartományait a 2. függelék tartalmazza. A vizsgálatban alkalmazott egész halállomány tekintetében a hím és nőstény halak vizsgálat elején mért egyéni testtömegének lehetőleg az azonos nemű halak testtömege számtani átlagának ± 20 %-os tartományában kell lennie. Az átlagos testtömeg előzetes becslése céljából javasolt a vizsgálat előtt a halállomány egy részmintájának a tömegét lemérni. Az expozíció körülményei Időtartam 27. A vizsgálat időtartama 21 nap, egy expozíciót előkészítő időszakot követően. Az expozíciót előkészítő időszak ajánlott ideje egy–két hét. Etetés 28. A halakat ad libitum kell etetni a megfelelő táplálékkal (2. függelék) olyan mennyiségben, amely segít fenntartani fizikai állapotukat. Gondosan kerülni kell a mikrobatenyészetek kialakulását és a víz zavarossá válását. Általános iránymutatásként a napi adagot két vagy három egyenlő részre lehet osztani, és a halakat naponta többször etetni, az egyes etetések között legalább három órát hagyva. Az egyszerre adott nagyobb adag is elfogadható, különösen hétvégén. A halak a mintavételezés/boncolás előtti 12 órában nem kaphatnak táplálékot. 29. A haltápban vizsgálni kell a szennyező anyagok – szerves klórt tartalmazó növényvédő szerek, policiklikus aromás szénhidrogének (PAH) és poliklórozott bifenilek (PCB-k) – jelenlétét. Kerülni kell a magas fitoösztrogén-tartalmú táplálékokat, amelyek a vizsgálatban befolyásolnák az ismert ösztrogénagonistákra (pl. a 17b-ösztradiolra) adott választ. 30. Az el nem fogyasztott táplálékot és az ürüléket legalább hetente kétszer el kell távolítani az edényekből, pl. a tartályok alját szifonnal megtisztítva. Fény és hőmérséklet 31. A megvilágítási időszakokat és a víz hőmérsékletét a vizsgálati fajok sajátosságaihoz kell igazítani (lásd a 2. függeléket). Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága 32. Az expozíciós időszak megkezdése előtt gondoskodni kell a vegyi anyagot adagoló rendszer megfelelő működéséről. Az összes szükséges analitikai módszernek megalapozottnak kell lennie, ideértve a vegyi anyag tesztrendszerben való stabilitásával kapcsolatos ismereteket. A vizsgálat alatt a vizsgálati vegyi anyag koncentrációit rendszeres időközönként meg kell határozni az alábbiak szerint: a hígító és a toxikus törzsoldat áramlási sebességét lehetőleg naponta kell ellenőrizni, de minimum hetente kétszer, és értéke a vizsgálat során nem változhat 10 %-nál nagyobb mértékben. A vizsgálati vegyi anyag tényleges koncentrációit ajánlott minden edényben a vizsgálat elején és azt követően hetente egyszer megmérni. 33. Az eredményeket célszerű a ténylegesen mért koncentrációértékekre alapozni. Amennyiben azonban az oldatban lévő vizsgálati vegyi anyag koncentrációját sikerült a vizsgálatok során mindvégig a névleges koncentráció ± 20 %-os tartományán belül tartani, akkor az eredményeket a névleges vagy a mért értékekre is lehet alapozni. 34. Szükség lehet a minták szűrésére (0,45 μm pórusméretű szűrőbetét használatával) vagy centrifugálására. Ha erre van szükség, akkor a centrifugálás az ajánlott eljárás. Amennyiben azonban a vizsgálati anyag nem adszorbeálódik a szűrő felszínén, akkor a szűrés is elfogadható módszer. 35. A vizsgálat alatt minden vizsgálati edényben legalább hetente egyszer meg kell mérni az oldott oxigén koncentrációját, a hőmérsékletet és a pH-t. Az víz teljes keménységét és a lúgosságát legalább hetente egyszer meg kell mérni a kontrollokban és a legmagasabb vizsgálati koncentrációt tartalmazó egyik edényben. A hőmérsékletet legalább egy vizsgálati edényben folyamatosan figyelemmel kell kísérni. Megfigyelések 36. Több általános (pl. túlélési arány) és biológiai választ (pl. VTG-szintek) kell értékelni a vizsgálat során vagy a vizsgálat befejezésekor. A fekunditás mennyiségi ellenőrzését naponta el kell végezni. E végpontok mérését és értékelését, illetve hasznosságát az alábbiak ismertetik. Túlélés 37. A halakat a vizsgálati időszak alatt naponta meg kell vizsgálni, a mortalitást fel kell jegyezni, és az elpusztult halakat a lehető leghamarabb el kell távolítani. Az elpusztult halakat nem szabad sem a kontroll-, sem a kezelési edényekben újakra cserélni. A vizsgálat során elpusztult halak ivarát meg kell határozni az ivarmirigyek makroszkopikus vizsgálatával. Viselkedés és külső megjelenés 38. Minden, (a kontrollhoz képest) rendellenes viselkedést fel kell jegyezni; ide sorolhatók az általános toxicitás jelei, beleértve a hiperventillációt, a koordinálatlan úszást, az egyensúly elvesztését és az atipikus nyugalmat vagy táplálkozást. Emellett a külső rendellenességeket (vérzés, elszíneződés) is fel kell jegyezni. A toxicitás ilyen jeleit az adatok értelmezése során gondosan mérlegelni kell, mert olyan koncentrációkat jelezhetnek, amelyek mellett a hormonhatás biomarkerei nem megbízhatóak. A viselkedésre vonatkozó ilyen jellegű megfigyelések hasznos kvalitatív információkkal szolgálhatnak azzal kapcsolatban, hogy milyen jövőbeli halvizsgálatokra lehet szükség. Az amerikai cselle esetében például androgénexpozíció hatására területi agresszivitást figyeltek meg a hímekben vagy a maszkulinizált nőstényekben; a zebradániónál az ösztrogén- és antiandrogén-expozíció csökkenti vagy akadályozza a fajnál jellegzetesen az első hajnali fénnyel jelentkező párzási és ívási magatartást. 39. Mivel a külső megjelenés néhány aspektusa (elsősorban a szín) az állatok kezelésének hatására gyorsan változhat, fontos, hogy a kvalitatív megfigyeléseket az állatoknak a vizsgálati rendszerből való eltávolítása előtt végezzék el. Az amerikai csellével szerzett eddigi tapasztalatok arra utalnak, hogy egyes endokrin rendszerre ható vegyi anyagok először a következő külső jellemzőkben idéznek elő változásokat: testszín (világos vagy sötét), mintázat (függőleges sávok jelenléte), valamint a test alakja (a fej és a pektorális régió). Ezért a halak fizikai megjelenésével kapcsolatos megfigyeléseket kell tenni a vizsgálat során és a vizsgálat végén. Fekunditás 40. Az ívás naponta végzett mennyiségi megfigyelését párhuzamosonként fel kell jegyezni. Az ikratermelést párhuzamosonként az egy túlélő nőstényre jutó napi ikrák számával kell kifejezni. Az ikrákat naponta el kell távolítani a vizsgálati kamrákból. Az amerikai cselle és a zebradánió esetében az ívási aljzatot kell a vizsgálati kamrába helyezni, hogy lehetővé váljon a halak számára a szokásos körülmények közötti ívás. A 4. függelék további részleteket tartalmaz a zebradánió (4A. függelék) és az amerikai cselle (4B. függelék) részére javasolt ívási aljzatokkal kapcsolatban. A japán rizshal esetében nem szükséges ívási aljzatot biztosítani. A halak humánus leölése 41. A 21. napon – azaz az expozíció befejezésekor – a halakon a nyálkahártya-irritáció csökkentése érdekében 300 mg/l NaHCO3 (nátrium-hidrogén-karbonát, CAS.144-55-8) oldattal pufferolt megfelelő mennyiségű trikainnal (trikain-metán-szulfonát, Metacain, MS-222 (CAS.886-86-2), 100–500 mg/l) eutanáziát kell végezni; ezután a „Vitellogenin” című szakaszban leírtak szerint vér- vagy szövetmintát kell venni a VTG-szint meghatározásához. A másodlagos ivari jellegek megfigyelése 42. Egyes endokrin rendszerre ható vegyi anyagok változásokat idézhetnek elő a speciális másodlagos ivari jellegekben (a nászkiütések száma a hím amerikai csellében, a papilláris nyúlványok száma a hím japán rizshalban). Bizonyos hatásmechanizmusú vegyi anyagok az ellenkező ivarú állatokra jellemző másodlagos ivari jelleg kóros előfordulását idézhetik elő; a trenbolonhoz, a metiltesztoszteronhoz és a dihidrotesztoszteronhoz hasonló androgénreceptor-agonisták például a nőstény amerikai cselléknél jól fejlett nászkiütések, nőstény japán rizshalaknál pedig papilláris nyúlványok megjelenését okozhatják (11, 20, 21). Azt is feljegyezték, hogy felnőtt hím amerikai csellében az ösztrogénreceptor-agonisták csökkenthetik a nászkiütések számát és a dorzális tarkólemez méretét (26, 27). Az ilyen általános morfológiára vonatkozó megfigyelések hasznos kvalitatív és kvantitatív információt nyújthatnak a jövőben elvégzendő, potenciálisan szükséges halvizsgálatokkal kapcsolatban. Az amerikai csellénél a nászkiütések, illetve a japán rizshalnál a papilláris nyúlványok számát és méretét közvetlenül, vagy egyszerűbben, konzervált példányokon lehet számszerűsíteni. Az amerikai cselle és a japán rizshal másodlagos ivari jellemzőinek értékelésére ajánlott eljárások az 5A., illetve az 5B. függelékben találhatók. Vitellogenin (VTG) 43. A vérmintákat a farokartériából/vénából heparinnal kezelt mikrohematokrit kapilláriscsővel, vagy pedig fecskendővel végzett szívpunkcióval kell gyűjteni. A hal méretétől függően a begyűjthető vértérfogat példányonként általában 5–60 μl az amerikai cselle és 5–15 μl a zebradánió esetében. A plazmát a vérből centrifugálással kell elkülöníteni, és a vitellogeninszint vizsgálatáig proteázinhibitorokat hozzáadva – 80 °C-on tárolni. Alternatív megoldásként a japán rizshal esetében a májból, zebradánió esetében pedig a fej/farok homogenizátumból vett szövetminta is használható a VTG-szint meghatározásához (6. függelék). A VTG mérésének homológ VTG standardokat és homológ antitesteket használó validált homológ ELISA módszeren kell alapulnia. Olyan módszer alkalmazása javasolt, amely a VTG-t alacsony, akár néhány ng/ml vérplazma (vagy ng/mg szövet) koncentrációban is képes kimutatni, ami a vizsgálati vegyi anyagnak nem kitett hím halakban megfigyelhető háttérszintnek felel meg. 44. A VTG-analízis minőségellenőrzését standardok és vakpróbák alkalmazásával, illetve legalább két ismétlésben végzett analízis révén kell biztosítani. A minimális mintahígítási tényező meghatározása céljából minden ELISA módszer esetében le kell futtatni egy tesztet a mátrixhatás (a mintahígítás hatásának) vizsgálatára. A VTG vizsgálati eljárásokban felhasznált minden ELISA-lemeznek a következő minőségellenőrzési mintákat kell tartalmaznia: a várható VTG-koncentrációkat lefedő legalább 6 kalibrációs standard, és legalább egy nem specifikus kötődési vakpróba (két példányban analizálva). E vakpróbák abszorbanciája a kalibrációs standard maximális abszorbanciájának 5 %-ánál kisebbnek kell lennie. Az egyes hígítási minták legalább két alikvotjának (párhuzamos lyukak) analízisét el kell végezni. Azokat a párhuzamos lyukakban vizsgált mintákat, amelyek értékei között az eltérés nagyobb, mint 20 %, újra kell analizálni. 45. A kalibrációs görbék korrelációs együtthatója (R2) 0,99-nál nagyobb kell legyen. Ugyanakkor azonban a magas korreláció nem garantálja a koncentráció megfelelő előrejelzését minden tartományban. A kalibrációs görbe elegendően nagy korrelációja mellett az egyes standardok kalibrációs görbe alapján számolt koncentrációjának a névleges koncentráció 70–120 %-a közé kell esnie. Ha a névleges koncentráció távolodik a kalibrációs regressziós egyenestől (pl. az alacsonyabb koncentrációknál), szükség lehet arra, hogy a kalibrációs görbét alacsony és magas tartományra osszák, vagy hogy egy nemlineáris modellt alkalmazzanak az abszorbanciaadatok megfelelő illesztésére. Ha a görbét kettéosztják, mindkét vonalszakasznak R2 > 0,99 értékkel kell rendelkeznie. 46. A kimutatási határérték (LOD) a legalacsonyabb analitikai standard koncentrációja, a meghatározási határ (LOQ) pedig a legalacsonyabb analitikai standard koncentrációjának és a legkisebb hígítási tényezőnek a szorzata. 47. Minden olyan napon, amikor VTG-vizsgálatot végeznek, egy inter-assay (vizsgálatközi) referenciastandard felhasználásával készült dúsított mintát is analizálni kell (7. függelék). Az adott napon végzett vizsgálatok eredményeivel együtt dokumentálni kell a várt koncentrációnak a mért koncentrációhoz viszonyított arányát is. A gonadális kórszövettani vizsgálat értékelése 48. A szabályozó hatóságok előírhatják a gonadális kórszövettani vizsgálat elvégzését annak érdekében, hogy vizsgálni lehessen a HPG-tengelyen lévő célszervet a vegyi anyaggal történő expozíciót követően. E tekintetben az ivarmirigyeket az egész testben vagy preparálva kell fixálni. Amennyiben kórszövettani vizsgálat szükséges, a vizsgálati vegyi anyag endokrin aktivitásának értékelése érdekében a hormonrendszer ivarmirigyekre gyakorolt specifikus válaszreakcióit kell keresni. Ezek a diagnosztikus válaszreakciók alapvetően a következők lehetnek: petesejtek jelenléte a herékben, Leydig-sejt hiperplázia, csökkent szikképződés, megnövekedett spermatogonium szám és perifollikuláris hiperplázia. Más gonadális elváltozásoknak, mint például a petevezeték átjárhatatlanságának, a herék elváltozásainak és a stádiumbeli változásoknak különböző okai lehetnek. A halak gonadális kórszövettani vizsgálatáról szóló iránymutatás előírja az ivarmirigyek boncolása, fixálása, a metszetkészítés és a kórszövettani értékelés tekintetében alkalmazandó eljárásokat (22). ADATOK ÉS JEGYZŐKÖNYVEZÉS A biomarker-válaszok értékelése varianciaanalízissel (ANOVA) 49. Egy vegyi anyag potenciális hatásának azonosítása céljából varianciaanalízissel (ANOVA) össze kell hasonlítani a kezelésenként és kontrollcsoportonként kapott válaszokat. Ha oldószeres kontrollt is alkalmaznak, minden végpont tekintetében megfelelő statisztikai próbát kell végezni a hígítóvizes és az oldószeres kontrollok összehasonlítására is. A hígítóvizes és az oldószeres kontrollok esetében kapott adatoknak a rákövetkező statisztikai elemzés során való felhasználására vonatkozó iránymutatás az OECD 2006c (28) szakirodalmi hivatkozásban található. Az összes biológiai válaszadatot elemezni és ivaronként jegyzőkönyvezni kell. Amennyiben nem teljesülnek a paraméteres módszerekhez szükséges feltételek – nem normális eloszlás (pl. Shapiro–Wilk-próba) vagy heterogénvariancia (Bartlett- vagy Levene-féle próba) –, akkor fontolóra lehet venni az adatok transzformálását a variancia homogenizálása érdekében az ANOVA elem