A Bizottság 95/32/EK hatodik irányelve

(1995. július 7.)

a kozmetikai termékek összetételének ellenőrzéséhez szükséges vizsgálati módszerekről

(EGT vonatkozású szöveg)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb a 94/32/EK irányelvvel [1] módosított, a tagállamok kozmetikai termékekre vonatkozó jogszabályainak közelítéséről szóló, 1976. július 27-i 76/768/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 8. cikke (1) bekezdésére,

mivel a 76/768/EGK irányelv rendelkezik a kozmetikai termékek hivatalos vizsgálatáról azzal a céllal, hogy biztosítsa a kozmetikai termékek összetételére vonatkozó közösségi rendelkezések által előírt feltételek betartását;

mivel minden szükséges vizsgálati módszert a lehető leggyorsabban meg kell határozni; mivel bizonyos módszereket a 87/143/EGK [3] és 82/434/EGK [4] irányelvvel majd a 90/207/EGK [5], a 83/514/EGK [6], a 85/490/EGK [7] és a 93/73/EGK [8] irányelvvel módosított 80/1335/EGK [9] bizottsági irányelv révén már elfogadtak;

mivel a kozmetikai termékekben lévő benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szorbinsav, szalicilsav és propionsav, valamint a kozmetikai termékekben lévő hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter és hidrokinon monobenzil-éter azonosítása és mennyiségi meghatározása jelenti a hatodik lépést;

mivel az ezen irányelvben megállapított rendelkezések összhangban vannak a 76/768/EGK irányelv műszaki fejlődéshez való hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A tagállamok megtesznek minden szükséges intézkedést annak biztosítására, hogy a kozmetikai termékek hivatalos vizsgálata során:

- a benzoesav, 4-hidroxi-benzoesav, szorbinsav, szalicilsav és propionsav azonosítása és mennyiségi meghatározása,

- hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter és hidrokinon monobenzil-éter azonosítása és meghatározása,

a mellékletben meghatározott módszerek szerint történjék.

2. cikk

(1) A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek legkésőbb 1996. szeptember 30-ig megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

Amikor a tagállamok elfogadják ezeket a rendelkezéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg.

(2) A tagállamok közlik a Bizottsággal nemzeti joguknak azokat a főbb rendelkezéseit, amelyeket az ezen irányelv által szabályozott területen fogadnak el.

3. cikk

Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában valót kihirdetését követő 20. napon lép hatályba.

4. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1995. július 7-én.

a Bizottság részéről

Emma Bonino

a Bizottság tagja

[1] HL L 181., 1994.7.15., 31. o.

[2] HL L 262., 1976.9.27., 169. o.

[3] HL L 57., 1987.2.27., 56. o.

[4] HL L 185., 1982.6.30., 1. o.

[5] HL L 108., 1990.4.28., 92. o.

[6] HL L 291., 1983.10.24., 9. o.

[7] HL L 295., 1985.11.7., 30. o.

[8] HL L 231., 1993.9.14., 34. o.

[9] HL L 383., 1980.12.31., 27. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

I. BENZOESAV, 4-HIDROXIBENZOESAV, SZORBINSAV, SZALICILSAV ÉS PROPIONSAV AZONOSÍTÁSA ÉS MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA KOZMETIKAI TERMÉKEKBEN

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a kozmetikai termékekben lévő benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szorbinsav, szalicilsav és propionsav azonosítására és mennyiségi meghatározására alkalmas. Külön eljárások írják le ezeknek a tartósítószereknek az azonosítását; a propionsav meghatározását; valamint a 4-hidroxibenzoesav, szalicilsav, szorbinsav és benzoesav meghatározását.

2. Fogalommeghatározás

Az e módszerrel meghatározott benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szalicilsav, szorbinsav és propionsav mennyiségét a szabad savak tömegszázalékában kifejezzük ki.

A. AZONOSÍTÁS

1. Alapelv

A tartósítószerek sav/bázis kivonását követően a kivonatot vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) elemezzük, a derivatizációt a mérés napján végezzük el. Az eredményektől függően az azonosítást nagynyomásúfolyadék-kromatográfiával (HPLC) erősítjük meg, vagy propionsav esetében gázkromatográfiával (GC).

2. Reagensek

2.1. Általános rész

Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy legalább azzal egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie.

2.2. Aceton

2.3. Dietil-éter

2.4. Acetonitril

2.5. Toluol

2.6. n-Hexán

2.7. Folyékony paraffin

2.8. 4 M-os sósav

2.9. Kálium-hidroxid 4 M-os vizes oldata

2.10. Kalcium-klorid, CaCl2 2H2O

2.11. Lítium-karbonát, Li2CO3

2.12. 2-bróm-2’-acetonafton

2.13. 4-hidroxibenzoesav

2.14. Szalicilsav

2.15. Benzoesav

2.16. Szorbinsav

2.17. Propionsav

2.18. Referenciaoldatok

Készítsünk 0,1 %-os (m/v) (100 mg/100 ml) oldatokat mind az öt tartósítószerből (2.13.–2.17.) dietil-éterrel.

2.19. Derivatizáló reagens

2-bróm-2’-acetonafton (2.12.) 0,5 %-os (m/v) acetonitriles oldata (2.4.) (50 mg/10 ml). Ezt az oldatot hetente kell készíteni, és hűtőszekrényben kell tárolni.

2.20. Katalizátor oldat

Lítium-karbonát (2.11) 0,3 %-os vizes oldata (300 mg/100ml). Ezt az oldatot frissen kell készíteni.

2.21. Előhívó szer

Toluol (2.5.)/aceton (2.2.) (20:0,5 v/v)

2.22. Folyékony paraffin (2.7.)/n-hexán (2.6.) (1:2 v/v)

3. Eszközök

Szokásos laboratóriumi felszerelés

3.1. 60 °C hőmérséklet tartására alkalmas vízfürdő

3.2. Előhívó kád

3.3. Ultraibolya fényforrás, 254 és 366 nm

3.4. Vékonyréteg-lemezek, Kieselgel 60, fluorescens indikátor nélkül, 20 x 20 cm, rétegvastagság 0,25 mm, 2,5 x 20 cm-es koncentráló zónával (Merck 11845 vagy ezzel egyenértékű)

3.5. 10 μl-es mikrofecskendő

3.6. 25 μl-es mikrofecskendő

3.7. Maximum 105 °C hőmérséklet tartására alkalmas szárítószekrény

3.8. 50 ml-es üvegcsövek csavaros kupakkal

3.9. Szűrőpapír 90 mm átmérővel, Schleicher és Schull, 5892 Weissband vagy ezzel egyenértékű

3.10. Univerzális pH indikátorpapír, pH 1-11

3.11. 5 ml-es üveg mintatartó ampullák

3.12. Rotációs bepárló (Rotavapor vagy ezzel egyenértékű)

3.13. Főzőlap

4. Eljárás

4.1. Mintaelőkészítés

Mérjünk be hozzávetőlegesen 1 g mintát egy 50 ml-es csavaros kupakú üvegcsőbe (3.8.). Adjunk hozzá négy csepp 4 M-os sósavat (2.8.) és 40 ml acetont (2.2.). Erősen lúgos termékeknél, mint amilyen a mosdószappan, 20 csepp 4 M-os sósavat (2.8.) kell adagolni. Indikátorpapírral (3.10.) ellenőrizzük, hogy a pH 2 körüli értékű legyen. Zárjuk le a csövet és rázzuk erősen egy percig.

Ha szükség van a tartósítószerek acetonos fázisba történő egyszerűbb kivonásának elősegítésére, lágyan melegítsük a keveréket körülbelül 60 °C-ra, hogy a folyadékfázist beolvasszuk.

Hűtsük le az oldatot szobahőmérsékletre és szűrjük át egy szűrőpapíron (3.9.) egy Erlenmeyer lombikba.

Töltsünk 20 ml szűrletet egy 200 ml-es Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 20 ml vizet és keverjük össze. 4 M-os kálium-hidroxiddal (2.9.) állítsuk be a keverék pH-ját körülbelül 10-es értékre úgy, hogy a pH mérésére indikátorpapírt (3.10.) használunk.

Adjunk hozzá 1 g kalcium-kloridot (2.10.) és rázzuk fel erősen. Szűrőpapíron (3.9.) szűrjük át egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba, ami 75 ml dietil-étert (2.3.) tartalmaz és rázzuk erősen egy percig. Hagyjuk szétválni, és a vizes réteget vigyük át egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba. Öntsük el az éteres réteget. Indikátorpapír (3.10.) segítségével a vizes oldat pH-ját 4 M-os sósavval (2.8.) állítsuk be körülbelül kettőre. Adjunk hozzá 10 ml dietil-étert (2.3.), dugjuk be a lombikot és rázzuk erősen egy percig. Hagyjuk szétválni, és az éteres réteget töltsük át egy rotációs bepárlóba (3.12.). Öntsük ki a vizes réteget.

Párologtassuk az éteres réteget csaknem szárazra, és a maradékot újra oldjuk fel 1 ml dietil-éterben (2.3.). Töltsük az oldatot a mintatartó ampullába (3.11.).

4.2. Vékonyréteg kromatográfia

Minden kromatografálásra kerülő referencia- és mintaoldat esetében (3.5.) egy fecskendővel vigyünk fel hozzávetőlegesen 3 μl lítium-karbonát oldatot (2.20.) a TLC-lemez (3.4.) koncentrációs zónájának alapvonalára, egyenlő távolságokban és szárítsuk hideg levegőáramban.

Hogy a foltokat annyira kis területen tartsuk, amennyire csak lehet, tegyük át a TLC-lemezt egy 40 °C-ra melegített főzőlapra (3.13.). Egy mikrofecskendővel (3.5.) vigyünk fel 10 μl-t minden egyes referenciaoldatból (2.18.) és mintaoldatból (4.1.) a lemez alapvonalára, pontosan azokra a foltokra, ahova a lítium-karbonát oldatot vittük fel.

Végül vigyünk fel körülbelül 15 μl derivatizáló reagenst (2.19) (2-bromo-2-acetonafton oldat) megint pontosan azokra a foltokra, ahová a referencia- és mintaoldatokat és a lítium-karbonát oldatot vittük fel.

Hevítsük a TLC-lemezt egy kemencében (3.7.) 80 °C-on 45 percig. Lehűlés után a 2.21. előhívó szerrel (toluol/aceton) – szűrőpapír bevonat használata nélkül – hívjuk elő a lemezt egy olyan kádban (3.2.), amelyet előtte 15 percig hagyunk kiegyenlítődni, amíg az oldószerfront 15 cm-es távolságig ér el – (ez körülbelül 80 percet vesz igénybe).

Szárítsuk meg a lemezt hideg levegőáramban és vizsgáljuk meg a kapott foltokat UV fényben (3.3.). A gyenge foltok fluoreszkálásának növelése érdekében a TLC-lemezt be lehet mártani folyékony paraffin/n-hexán keverékbe (2.22.).

5. Azonosítás

Számítsuk ki az Rf értéket minden egyes foltra.

Hasonlítsuk össze a mintára kapott Rf értéket és a minta UV sugárzás alatti viselkedését a referenciaoldatokra kapott paraméterekkel.

Vonjunk le előzetes következtetést a tartósítószerek jelenlétére és azonosságára vonatkozóan. Hajtsuk végre a B. fejezetben leírt HPLC-vizsgálatot, vagy ha propionsav jelenlétét tapasztaljuk, akkor a C. fejezetben leírt GC-vizsgálatot. Hasonlítsuk össze a kapott retenciós időket a referenciaoldatok retenciós időivel.

Vessük össze a TLC-vel, HPLC-vel vagy GC-vel kapott eredményeket és az összesített eredmények alapján véglegesen azonosítsuk a mintában jelen lévő tartósítószereket.

B. BENZOESAV, 4-HIDROXIBENZOESAV, SZORBINSAV ÉS SZALICILSAV MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA

1. Alapelv

Savanyítást követően a mintát etil-alkohol és víz elegyével kivonjuk. Szűrés után a tartósítószereket nagynyomásúfolyadék-kromatográfiával (HPLC) határozzuk meg.

2. Reagensek

2.1. Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie és megfelelőnek HPLC-re ott, ahol ez szükséges. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy legalább ezzel egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie.

2.2. Abszolút etil-alkohol

2.3. 4-hidroxibenzoesav

2.4. Szalicilsav

2.5. Benzoesav

2.6. Szorbinsav

2.7. Nátrium-acetát (CH3COONa.3H2O)

2.8. Ecetsav (α)420 = 1,05 g/ml

2.9. Acetonitril

2.10. 2 M-os kénsav

2.11. Kálium-hidroxid 0,2 M-os vizes oldata

2.12. 2-metoxibenzoesav

2.13. Etil-alkohol/víz keverék

Keverjünk össze kilenc térfogatrész etil-alkoholt (2.2.) és egy térfogatrész vizet (2.1.)

2.14. Belső standard oldat

Készítsünk egy olyan oldatot, ami hozzávetőlegesen 1 g 2-metoxibenzoesavat (2.12.) tartalmaz 500 ml etil-alkohol/víz elegyben (2.13.)

2.15. Mozgó fázis a HPLC-hez

2.15.1. Acetát puffer: 1 liter vízhez adjunk 6,35 g nátrium-acetátot (2.7.) és 20,0 ml ecetsavat, majd keverjük meg.

2.15.2. A mozgó fázist úgy készítsük el, hogy keverjünk össze kilenc térfogatrész acetátpuffert (2.15.1.) egy térfogatrész acetonitrillel (2.9.).

2.16. Tartósítószer-törzsoldat

Nagy pontossággal mérjünk be körülbelül 0,05 g 4-hidroxibenzoesavat (2.3.), 0,2 g szalicilsavat (2.4.), 0,2 g benzoesavat (2.5.) és 0,05 g szorbinsavat (2.6.) egy 50 ml-es mérőlombikba és töltsük fel jelig etil-alkohol/víz eleggyel (2.13.). Tároljuk ezt az oldatot hűtőszekrényben. Az oldat egy hétig megfelelő.

2.17. Tartósítószerek standard oldata

Töltsünk 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 és 0,50 ml törzsoldatot (2.16.) egy sorozat 20 ml-es mérőlombikba. Minden lombikba adjunk 10,00 ml belső standard oldatot (2.14.) és 0,5 ml 2 M-os kénsavat. Töltsük fel a jelig etil-alkohol/víz eleggyel (2.13.). Ezeket az oldatokat frissen kell készíteni.

3. Eszközök

Szokásos laboratóriumi felszerelés, ha nincs külön meghatározva, valamint:

3.1. Vízfürdő 60 °C-ra beállítva

3.2. Nagynyomásúfolyadék-kromatográf változtatható hullámhosszú UV-detektorral és 10 μl-es befecskendező hurokkal

3.3. Analitikai oszlop

Rozsdamentes acél, 12,5-25 cm, belső átmérő 4,6 mm, Nucleosil 5C18-cal vagy ezzel egyenértékű töltetű

3.4. 90 mm átmérőjű szűrőpapír, Schleicher és Schull, 5892 Weissband vagy ezzel egyenértékű

3.5. 50 ml-es üvegcsövek csavaros kupakkal

3.6. 5 ml-es üveg mintatartó ampullák

3.7. Karborundum kazánkő, 2-4 mm méretű vagy ezzel egyenértékű

4. Eljárás

4.1. Mintaelőkészítés

4.1.1. A minta előkészítése belső standard hozzáadása nélkül

Mérjünk be 1 g-nyi mintát egy 50 ml-es csavaros fedelű üvegcsőbe (3.5.). Pipettával csepegtessünk 1,00 ml 2 M-os kénsavat (2.10.) és 40,0 ml etil-alkohol/víz elegyet (2.13.) a csőbe. Adjunk hozzá körülbelül 1 g kazánkövet (3.7.), zárjuk le a csövet és rázzuk erősen legalább egy percig, míg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ahhoz, hogy a tartósítószerek kivonását az etanolos fázisba elősegítsük, tegyük a csövet pontosan öt percre 60 °C-os vízfürdőbe (3.1.).

Azonnal hűtsük le a csövet hideg vízáramban és tartsuk a kivonatot 5 °C-on egy órán keresztül.

Szűrjük le a kivonatot egy szűrőpapíron (3.4.) keresztül. Töltsünk át körülbelül 2 ml kivonatot egy mintatartó ampullába (3.6.). Tartsuk a kivonatot 5 °C-on, és 24 órán belül végezzük el a HPLC-s meghatározást.

4.1.2. A minta előkészítése belső standard hozzáadásával

Mérjünk be három tizedes pontossággal 1 ± 0,1 g (a gramm) mintát egy 50 ml-es csavaros fedelű üvegcsőbe (3.5.). Pipettával adjunk hozzá 1,00 ml 2 M-os kénsavat (2.10.) és 30,0 ml etil-alkohol/víz elegyet (2.13.). Adjunk hozzá körülbelül 1 g kazánkövet (3.7.) és 10,00 ml belső standard oldatot (2.14.). Zárjuk le a csövet és rázzuk erősen legalább egy percig, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ahhoz, hogy a tartósítószerek kivonását az etanolos fázisba elősegítsük, tegyük a csövet pontosan öt percre 60 °C-os vízfürdőbe (3.1.).

Azonnal hűtsük le a csövet hideg vízáramban, és tartsuk a kivonatot 5 °C-on egy órán keresztül.

Szűrjük le a kivonatot egy szűrőpapíron (3.4.) keresztül. Töltsünk át körülbelül 2 ml kivonatot egy mintatartó ampullába (3.6.). Tartsuk a kivonatot 5 °C-on, és 24 órán belül végezzük el a HPLC-s meghatározást.

4.2. Nagynyomásúfolyadék-kromatográfia

Mozgó fázis: acetonitril/acetátpuffer (2.15.)

Az oszlopon átáramló mozgó fázis áramlási sebességét állítsuk be 2,0 ± 0,5 ml/perc értékre. A detektor hullámhosszát állítsuk 240 nm-re.

4.2.1. Kalibrálás

Minden tartósítószer standard oldatból (2.17.) fecskendezzünk 10 μl-t a folyadék-kromatográfiás készülékbe (3.2.). A kromatogramokból minden oldatra határozzuk meg a vizsgált tartósítószer csúcsmagasságának a belső standard csúcsmagasságához viszonyított arányát. Az egyes tartósítószerekhez tartozó csúcsmagasságok arányát ábrázoljuk az egyes standard oldatok koncentrációjának függvényében.

Győződjünk meg arról, hogy a kalibrációs eljárás során lineáris görbét kaptunk a standard oldatokra.

4.2.2. Mennyiségi meghatározás

Fecskendezzünk 10 μl mintakivonatot (4.1.1.) a folyadék-kromatográfiás készülékbe (3.2.), és vegyük fel a kromatogramot. Fecskendezzünk 10 μl tartósítószer standard oldatot (2.1.7.), és vegyük fel a kromatogramot. Hasonlítsuk össze a kapott kromatogramokat. Ha a 2-metoxibenzoesavéval (ajánlott belső standard) nagyjából megegyező retenciós időnél a mintakivonat (4.1.1.) kromatogramján úgy tűnik, hogy nincs csúcs, akkor fecskendezzünk 10 μl belső standarddal ellátott mintakivonatot (4.1.2.) a folyadék-kromatográfiás készülékbe, és vegyük fel a kromatogramot.

Ha a 2-metoxibenzoesavéval nagyjából megegyező retenciós időnél zavaró csúcsot találunk a mintakivonat (4.1.1.) kromatogramján, akkor egy másik megfelelő belső standardot kell választani. (Ha a vizsgált tartósítószerek egyike hiányzik a kromatogramról, akkor ez a tartósítószer használható fel belső standardként.)

Győződjünk meg arról, hogy a standard oldatra és a mintaoldatra kapott kromatogramok kielégítik a következő elvárásokat:

- A csúcs szétválásánál a leggyengébben szétvált párnak legalább 0,90-nek kell lennie. (A csúcsszétválás definícióját lásd az 1. ábrán).

+++++ TIFF +++++

1. ábra:Csúcsszétválás

Ha a szükséges szétválást nem értük el, akkor vagy egy hatékonyabb oszlopot kell használni, vagy a mozgó fázis összetételét kell állítgatni addig, amíg a csúcs szétválása nem lesz megfelelő.

- Minden kapott csúcs As aszimmetria faktorának a 0,9-1,5 közötti tartományban kell lennie. (A csúcsaszimmetria-faktor definícióját lásd a 2. ábrán). Az aszimmetria-faktor meghatározására szolgáló kromatogram felvételéhez legalább 2 cm/perc papíradagolási sebesség ajánlott.

+++++ TIFF +++++

2. ábra:Csúcsaszimmetria-faktor

- Stabil alapvonalat kell kapnunk.

5. Számítás

A mintaoldatban lévő tartósítószerek koncentrációjának kiszámításához vegyük a vizsgált tartósítószerek csúcsmagasságának a 2-metoxibenzoesav (belső standard) csúcsmagasságához viszonyított arányait és a kalibrációs görbét. A következő képlet segítségével számítsuk ki a minta benzoesav, 4-hidroxibenzoesav, szorbinsav vagy szalicilsav tartalmát tömegszázalékban (xi):

x

%

=

10

· a

=

,

ahol:

a = a vizsgálati minta (4.1.2.) tömege (g),

b = a kivont mintában (4.1.2.) lévő tartósítószer koncentráció (μg/ml) a kalibrációs görbe alapján.

6. Megismételhetőség [1]

0,40 % 4-hidroxibenzoesav-tartalom esetén azonos mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,035 %-ot.

0,50 % benzoesav-tartalom esetén azonos mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás eredménye közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,050 %-ot.

0,50 % szalicilsav-tartalom esetén azonos mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás eredménye közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,045 %-ot.

0,60 % szorbinsav-tartalom esetén azonos mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,035 %-ot.

7. Megjegyzések

7.1. A módszerrel végzett vizsgálat eredményeinek egyenetlensége azt jelzi, hogy a mintából történő savkivonás érdekében adagolt kénsav mennyisége a kritikus és a feldolgozott minta mennyiségére vonatkozó korlátokat az előírt határokon belül kell tartani.

7.2. Ha szükséges, egy megfelelő védőoszlop is használható.

C. PROPIONSAV MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a kozmetikai termékekben legfeljebb 2 % (m/m) koncentrációban jelen lévő propionsav meghatározására alkalmas.

2. Fogalommeghatározás

Az e módszerrel mért propionsav-koncentrációt a termék tömegszázalékában (% m/m) fejezzük ki.

3. Alapelv

A propionsavnak a termékből történt savas kivonását követően a meghatározást gázkromatográfiával végezzük 2-metilpropionsav belső standard felhasználásával.

4. Reagensek

Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie; desztillált vizet vagy ennek megfelelő minőségű vizet kell alkalmazni.

4.1. Etil-alkohol, 96 %-os (v/v)

4.2. Propionsav

4.3. 2-metil-propionsav

4.4. Ortofoszforsav, 10 %-os (m/v)

4.5. Propionsav oldat

Pontosan mérjünk be körülbelül 1,00 g (p gramm) propionsavat egy 50 ml-es mérőlombikba és töltsük fel a jelig etil-alkohollal (4.1.).

4.6. Belső standard oldat

Pontosan mérjünk be mintegy 1,00 g (e gramm) 2-metilpropionsavat egy 50 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel jelig etil-alkohollal (4.1.).

5. Eszközök

5.1. Normál laboratóriumi berendezések és:

5.2. Lángionizációs detektorral felszerelt gázkromatográf

5.3. Üvegcső (20 x 150 mm) csavaros kupakkal

5.4. Vízfürdő, 60 °C-os

5.5. 10 ml-es üvegfecskendő szűrőmembránnal (pórus átmérő: 0,45 μm)

6. Eljárás

6.1. Mintaelőkészítés

6.1.1. A minta előkészítése belső standard hozzáadása nélkül

Mérjünk be mintegy 1 g-nyi mintát egy üvegcsőbe (5.3.). Adjunk hozzá 0,5 ml foszforsavat (4.4.) és 9,5 ml etil-alkoholt (4.1.).

Zárjuk le a csövet és erősen rázzuk fel. Ha szükséges, tegyük a csövet 60 °C-ra melegített vízfürdőbe (5.4.) öt percre azért, hogy a lipid fázis teljesen feloldódjon. Gyorsan hűtsük le vízsugár alatt. Az oldat egy részét szűrjük le membránszűrőn (5.5.). A szűrletet ugyanazon a napon kromatografáljuk.

6.1.2. A minta előkészítése belső standard hozzáadásával

Mérjünk be 1 ± 0,1 g (a gramm) mintát három tizedes pontossággal egy üvegcsőbe (5.3.). Adjunk hozzá 0,5 ml foszforsavat (4.4.), 0,50 ml belső standard oldatot (4.6.) és 9 ml etil-alkoholt (4.1.)

Zárjuk le a csövet és erősen rázzuk fel. Ha szükséges, tegyük a csövet 60 °C-ra melegített vízfürdőbe (5.4.) öt percre azért, hogy a lipid fázis teljesen feloldódjon. Gyorsan hűtsük le vízsugár alatt. Az oldat egy részét szűrjük le membránszűrőn (5.5.). A szűrletet ugyanazon a napon kromatografáljuk.

6.2. A gázkromatográfia körülményei

A következő üzemeltetési körülmények ajánlottak:

Oszlop

Típus: | rozsdamentes acél |

Hossz | 2 m |

Átmérő | 1/8” |

Töltet | 10 % SPTM 1000 (vagy ezzel egyenértékű) + 1 % H3PO4 Kromoszorb WAW tölteten, szemcseméret: 100-120 mesh |

Hőmérséklet

Injektor | 200 °C |

Oszlop | 120 °C |

Detektor | 200 °C |

Vivőgáz | nitrogén |

Áramlási sebesség | 25 ml/perc |

6.3. Kromatográfia

6.3.1. Kalibrálás

Pipettával csepegtessünk egy 20 ml-es mérőlombik sorozatba 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 és 4,00 ml propionsav oldatot (4.5.). Mindegyik mérőlombikba pipettával csepegtessünk 1,00 ml belső standard oldatot (4.6.); töltsük fel őket a jelig etil-alkohollal (4.1.) és keverjük össze. Az így készített oldatok tartalmaznak "e" mg/ml 2-metilpropionsavat, mint belső standardot (azaz 1 mg/ml-t ha e = 1000) és p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml propionsavat (azaz 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 mg/ml-t ha p = 1000).

Fecskendezzünk mindegyik oldatból 1 μl-t és vegyük fel a kalibrációs görbét úgy, hogy a propionsav/2-metilpropionsav tömegének arányát az x-tengelyen, míg a megfelelő csúcsterületeket az y-tengelyen ábrázoljuk.

Minden oldattal végezzünk három befecskendezést, és számítsuk ki az átlagos csúcsterület arányt.

6.3.2. Mennyiségi meghatározás

Fecskendezzünk 1 μl mintaszűrletet (6.1.1.). Hasonlítsuk össze a kromatogramot a standard oldatok (6.3.1.) kromatogramjaival. Ha a csúcsnak hozzávetőlegesen ugyanaz a retenciós ideje mint a 2-metilpropionsavé, akkor váltsunk belső standardot. Ha zavaró hatást nem tapasztalunk, fecskendezzünk 1 μl mintaszűrletet (6.1.2.), és mérjük meg a propionsav csúcsterületét, illetve a belső standard csúcsterületét.

Minden oldattal végezzünk három befecskendezést, és számítsuk ki az átlagos csúcsterület-arányt.

7. Számítás

7.1. A 6.3.1. pontban felvett kalibrációs görbéről olvassuk le a 6.3.2. pontban kiszámított csúcsterület aránynak megfelelő tömegarányt (K).

7.2. Az így kapott tömegarányból számítsuk ki a minta propionsav tartalmát (X) tömegszázalékban a következő képlet segítségével:

x %

= K

= K

,

ahol:

K = a 7.1. pontban kiszámított arány,

e = a 4.6. pontban bemért belső standard tömege grammban,

a = a 6.1.2. pontban bemért vizsgálati minta tömege grammban.

Az eredményeket kerekítsük fel egy tizedes értékre.

8. Megismételhetőség [2]

2 % propionsav-tartalom esetén az ugyanazon a mintán párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség értéke nem haladhatja meg a 0,12 % -ot.

II. HIDROKINON, HIDROKINON MONOMETIL-ÉTER, HIDROKINON MONOETIL-ÉTER ÉS HIDROKINON MONOBENZIL-ÉTER AZONOSÍTÁSA ÉS MEGHATÁROZÁSA KOZMETIKAI TERMÉKEKBEN

A. AZONOSÍTÁS

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a bőrt lágyító kozmetikai termékekben lévő hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter és hidrokinon monobenzil-éter (monobenzon) kimutatását és azonosítását írja le.

2. Eljárás

A hidrokinont és étereit vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) azonosítjuk.

3. Reagensek

Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie.

3.1. Etil-alkohol, 96 %-os (v/v)

3.2. Kloroform

3.3. Dietil-éter

3.4. Előhívószer:

Kloroform/Dietil-éter, 66:33 (v/v)

3.5. Ammónia, 25 %-os (m/m) (d420 = 0,91 g/ml)

3.6. Aszkorbinsav

3.7. Hidrokinon

3.8. Hidrokinon monometil-éter

3.9. Hidrokinon monoetil-éter

3.10. Hidrokinon monobenzil-éter (monobenzon)

3.11. Referencia oldatok

A következő referencia oldatokat frissen kell elkészíteni és egy napig stabilak.

3.11.1. Mérjünk be 0,05 g hidrokinont (3.7.) egy 10 ml-es, mércével ellátott kémcsőbe. Adjunk hozzá 0,250 g aszkorbinsavat (3.6.) és 5 ml etil-alkoholt (3.1.). Adjunk hozzá ammóniát (3.5.) addig, amíg a pH értéke 10 lesz, és töltsük fel 10 ml térfogatra etil-alkohollal (3.1.).

3.11.2. Mérjünk be 0,05 g hidrokinon monometil-étert (3.8.) egy 10 ml-es, mércével ellátott vizsgálócsőbe. Adjunk hozzá 0,250 g aszkorbinsavat (3.6.) és 5 ml etil-alkoholt (3.1.). Adjunk hozzá ammóniát (3.5.) addig, amíg a pH értéke 10 lesz és töltsük fel 10 ml térfogatra etil-alkohollal (3.1.)

3.11.3. Mérjünk be 0,05 g hidrokinon monoetil-étert (3.9.) egy 10 ml-es, mércével ellátott vizsgálócsőbe. Adjunk hozzá 0,250 g aszkorbinsavat (3.6.) és 5 ml etil-alkoholt (3.1.). Adjunk hozzá ammóniát (3.5.) addig, amíg a pH értéke 10 lesz, és töltsük fel 10 ml térfogatra etil-alkohollal (3.1.)

3.11.4. Mérjünk be 0,05 g hidrokinon monobenzil-étert (3.10.) egy 10 ml-es, mércével ellátott kémcsőbe. Adjunk hozzá 0,250 g aszkorbinsavat (3.6.) és 5 ml etil-alkoholt (3.1.). Adjunk hozzá ammóniát (3.5.) addig, amíg a pH értéke 10 lesz és töltsük fel 10 ml térfogatra etil-alkohollal (3.1.)

3.12. Ezüst-nitrát

3.13. 12-molibdát-foszforsav

3.14. Kálium-ferricianid hexahidrát

3.15. Ferriklorid hexahidrát

3.16. Aeroszolos előhívószerek

3.16.1. Egy 5 %-os (m/v) ezüst-nitrát vizes oldathoz (3.12.) adjunk ammóniát (3.5.) addig, amíg a keletkezett csapadék feloldódik.

Vigyázat:

az oldat állás közben robbanásszerűen instabillá válik, és használat után ki kell önteni.

3.16.2. 10 %-os (m/v) 12-molibdofoszfát (3.13.) etil-alkoholos (3.1.) oldata.

3.16.3. Készítsünk egy 1 %-os (m/v) kálium-ferricianid (3.14.) vizes oldatot és egy 2 %-os (m/v) ferriklorid (3.15.) vizes oldatot. Közvetlenül felhasználás előtt keverjünk össze azonos mennyiséget a két oldatból.

4. Eszközök

Szokásos laboratóriumi felszerelés

4.1. Szokásos TLC-berendezés

4.2. Készgyártmány TLC-lemezek; szilikagél GHR/UV254; 20x20 cm (Macgery, Nagel vagy ezzel egyenértékű)

4.3. Ultrahangos fürdő

4.4. Centrifuga

4.5. UV lámpa, 254 nm

5. Eljárás

5.1. Mintaelőkészítés

Mérjünk be 3,0 g mintát egy 10 ml-es, mércével ellátott kémcsőbe (3.8.). Adjunk hozzá 0,250 g aszkorbinsavat (3.6.) és 5 ml etil-alkoholt (3.1.). Állítsuk be az oldat pH-ját 10-re ammónia-oldattal (3.6.). Töltsük fel 10 ml-re etil-alkohollal (3.1.). Dugóval zárjuk le a csövet és homogenizáljuk ultrahangos fürdőben 10 percig. Szűrjük át egy szűrőpapíron vagy centrifugáljuk le 3000-es fordulatszámon.

5.2. TLC

5.2.1. Töltsük fel a kromatográfiás kádat előhívószerrel (3.4.).

5.2.2. Vigyünk fel a lemezre 2 μl referencia oldatot (3.11.) és 2 μl mintaoldatot (5.1.). A előhívást sötétben végezzük szobahőmérsékleten addig, amíg az oldószer front 15 cm-re eltávolodik az alapvonaltól.

5.2.3. Vegyük ki a lemezt, és szobahőmérsékleten hagyjuk száradni.

5.3. Előhívás

5.3.1. Vizsgáljuk meg a lemezt UV fény alatt 254 nm-en, és jelöljük meg a foltokat.

5.3.2. Permetezzük le a lemezt a következő anyagokkal:

- ezüst-nitrát reagens (3.16.1.), vagy

- 12-molibdo-foszforsav (3.16.2.); melegítsük fel hozzávetőlegesen 120 oC-ra, vagy

- kálium-ferricianid oldat és ferriklorid oldat (3.16.3.)

6. Azonosítás

Számítsuk ki az Rf értéket minden egyes foltra.

Hasonlítsuk össze a mintára kapott foltokat a referencia-oldatokra kapott foltokkal a következő szempontok szerint; Rf értékek, a foltok színe az UV sugárzás alatt; valamint a foltok színe a permetező reagenssel végzett előhívás után.

Végezzük el a következő B szakaszban leírt HPLC-vizsgálatot, és hasonlítsuk össze a minta csúcs(ok)ra kapott retenciós időket a referenciaoldatokra kapottakkal.

Vessük össze a TLC- és a HPLC-vizsgálatok eredményeit, hogy azonosítsuk a hidrokinont és/vagy annak étereit.

7. Megjegyzések

A leírt körülmények között a következő Rf értékek adódnak:

hidrokinon: | 0,32 |

hidrokinon monometil-éter: | 0,53 |

hidrokinon monoetil-éter: | 0,55 |

hidrokinon monobenzil-éter: | 0,58 |

B. MEGHATÁROZÁS

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a bőrt lágyító kozmetikai termékekben lévő hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter és hidrokinon monobenzil-éter (monobenzon) meghatározására állapít meg eljárást.

2. Eljárás

A mintát víz/metil-alkohol eleggyel kivonjuk enyhe melegítés közben, hogy a lipid anyagok megolvadjanak. Az elemzett komponensek meghatározását az így kapott oldatból fordított fázisú folyadék-kromatográfiával, UV detektálással végezzük.

3. Reagensek

3.1. Minden reagensnek analitikai tisztaságúnak kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy legalább ezzel megegyező tisztaságú víznek kell lennie.

3.2. Metil-alkohol

3.3. Hidrokinon

3.4. Hidrokinon monometil-éter

3.5. Hidrokinon monoetil-éter

3.6. Hidrokinon monobenzil-éter (monobenzon)

3.7. Tetrahidrofurán, HPLC minőségű

3.8. Víz/metil-alkohol elegy 1:1 (v/v). Elegyítsünk egy térfogatrész vizet és egy térfogatrész metil-alkoholt (3.2.)

3.9. Mozgó fázis: tetrahidrofurán/víz elegy 45:55 (v/v). Elegyítsünk 45 térfogatrész tetrahidrofuránt (3.7.) 55 térfogatrész vízzel

3.10. Referenciaoldat

Mérjünk be 0,06 g hidrokinont (3.3.), 0,08 g hidrokinon monometil-étert (3.4.), 0,10 g hidrokinon monoetil-étert (3.5.) és 0,12 g hidrokinon monobenzil-étert (3.6.) egy 50 ml-es mérőlombikba. Oldjuk fel és töltsük jelig metil-alkohollal (3.2.). Készítsünk referencia oldatot úgy, hogy ebből az oldatból 10,00 ml-t hígítunk fel 50,00 ml-re víz/etil-alkohol eleggyel (3.8.). Ezeket az oldatokat frissen kell elkészíteni.

4. Eszközök

Szokásos laboratóriumi felszerelés, és:

4.1. 60 °C-os hőmérséklet tartására megfelelő vízfürdő

4.2. Nagynyomásúfolyadék-kromatográf változtatható hullámhosszú UV detektorral és 10 μl-es fecskendező hurokkal

4.3. Analitikai oszlop

Rozsdamentes acél, 250 mm hosszú, belső átmérő 4,6 mm, Zorbax fenil-lel (Zorbax SIL-en kémiailag megkötött fenetil-szilán, a végén trimetilklór-szilánnal bedugaszolva) töltve, szemcsemérete 6 μm, vagy ezzel egyenértékű. Ne használjunk védőoszlopot, kivéve feniles védőoszlopot vagy ezzel egyenértékűt.

4.4. Szűrőpapír, 90 mm átmérőjű, Schleicher és Schull, Weissband 5892 vagy ezzel egyenértékű

5. Eljárás

5.1. Mintaelőkészítés

Mérjünk be három tizedes pontossággal 1 ± 0,1 g-nyi (a gramm) mintát egy 50 ml-es mérőlombikba. Diszpergáljuk a mintát 25 ml víz/metil-alkohol elegyben (3.8.). Zárjuk le a lombikot és rázzuk erősen addig, amíg homogén szuszpenziót kapunk. Legalább egy percig rázzuk. Tegyük a lombikot vízfürdőbe (4.1.) és tartsuk 60 °C-on, hogy elősegítsük az kivonást. Hűtsük le a lombikot és töltsük fel jelig víz/metil-alkohol eleggyel (3.8.). Egy szűrőpapíron (4.4.) keresztül szűrjük le az kivonatot. Az kivonat elkészítésétől számított 24 órán belül végezzük el a HPLC-s meghatározást.

5.2. Nagynyomásúfolyadék-kromatográfia

5.2.1. A mozgó fázis (3.9.) áramlási sebességét 1,0 ml/perc értékre, a detektor hullámhosszát 295 nm-re állítsuk be.

5.2.2. Fecskendezzünk az 5.1. pontban leírtak szerinti 10 μl mintaoldatot, és rögzítsük a kromatogramot. Mérjük meg a csúcsterületeket. 5.2.3. pontban leírtak szerint végezzük el a kalibrálást. Hasonlítsuk össze a minta és a standard oldatokra kapott kromatogramokat. A csúcsterületeket és az 5.2.3. pontban kiszámolt arányossági tényezőket (RF) használjuk arra, hogy kiszámítsuk a mintaoldat komponenseinek koncentrációját.

5.2.3. Kalibrálás

Fecskendezzünk 10 μl referencia-oldatot (3.10.) és rögzítsük a kromatogramot. Fecskendezzünk még néhányszor addig, amíg állandó csúcsterületet kapunk.

Határozzuk meg a arányossági tényezőt: RFi

RF

=

p

c

,

ahol:

pi = a hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter vagy hidrokinon monobenzil-éter csúcsterülete, és

ci = a hidrokinon, hidrokinon monometil-éter, hidrokinon monoetil-éter vagy hidrokinon monobenzil-éter referencia oldatainak (3.10.) koncentrációja (g/50 ml).

Győződjünk meg arról, hogy a standard oldatra és a mintaoldatra kapott kromatogramok kielégítik a következő elvárásokat:

- A csúcsszétválásánál leggyengébben szétvált párnak legalább 0,90-nek kell lennie. (A csúcsszétválás definícióját lásd az 1. ábrán).

+++++ TIFF +++++

1. ábra:Csúcsszétválás

Ha a szükséges szétválást nem értük el, akkor vagy egy hatékonyabb oszlopot kell használni, vagy a mozgó fázis összetételét kell állítgatni addig, amíg a csúcs szétválása nem lesz megfelelő.

- Minden kapott csúcs As aszimmetria faktorának a 0,9-1,5 közötti tartományban kell lennie. (A csúcsaszimmetria-faktor definícióját lásd a 2. ábrán). Az aszimmetria-faktor meghatározására szolgáló kromatogram felvételéhez legalább 2 cm/perc papíradagolási sebesség ajánlott.

+++++ TIFF +++++

2. ábra:Csúcsaszimmetria faktor

- Stabil alapvonalat kell kapnunk.

6. Számítás

A mintában lévő elemzett komponensek koncentrációinak kiszámítására használjuk a komponensek csúcsterületeit. A minta komponenseinek koncentrációja tömegszázalékban (xi) a következő képlet segítségével számítható ki:

x

%

=

b

· 100

RF

· a

,

ahol:

a = a vizsgált minta tömege (g),

bi = az i-edik komponens csúcsterülete a mintában.

7. Megismételhetőség [3]

7.1. 2,0 % hidrokinon-tartalom esetén ugyanazon a mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,13 %-ot.

7.2. 1,0 % hidrokinon monometil-éter tartalom esetén az ugyanazon a mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,1 %-ot..

7.3. 1,0 % hidrokinon monoetil-éter tartalom esetén az ugyanazon a mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,11 %-ot.

7.4. 1,0 % hidrokinon monobenzil-éter tartalom esetén ugyanazon a mintán, párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,11 %-ot.

8. Reprodukálhatóság [4]

8.1. 2,0 % hidrokinon-tartalom esetén ugyanazon a mintán, különböző körülmények között (különböző laboratóriumokban, különböző munkatársakkal, különböző készülékkel és/vagy különböző időpontban), párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,37 %-ot.

8.2. 1,0 % hidrokinon monometil-éter tartalom esetén ugyanazon a mintán, különböző körülmények között (különböző laboratóriumokban, különböző munkatársakkal, különböző készülékkel és/vagy különböző időpontban), párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,21 %-ot.

8.3. 1,0 % hidrokinon monoetil-éter tartalom esetén ugyanazon a mintán, különböző körülmények között (különböző laboratóriumokban, különböző munkatársakkal, különböző készülékkel és/vagy különböző időpontban), párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,19 %-ot.

8.4. 1,0 % hidrokinon monobenzil-éter tartalom esetén ugyanazon a mintán, különböző körülmények között (különböző laboratóriumokban, különböző munkatársakkal, különböző készülékkel és/vagy különböző időpontban), párhuzamosan végzett két mennyiségi meghatározás közötti különbség abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,11 %-ot.

9. Megjegyzések

9.1. Ha a kapott hidrokinon-tartalom sokkal magasabb 2 %-nál, és ennek pontos meghatározására van szükség, akkor a minta kivonatát (5.1.) hasonló koncentrációra kell hígítani, mint amilyet egy 2 % hidrokinon tartalmú mintára kapnánk, és a meghatározást meg kell ismételni.

(Néhány műszer esetében a magas hidrokinon koncentrációknál, az abszorbancia kívül eshet a detektor lineáris tartományán.)

9.2. Zavaró hatások

A fent leírt módszer hidrokinonnak és étereinek meghatározását teszi lehetővé egyetlen, izokratikus előhívással. A feniloszlop használata biztosítja a megfelelő visszatartást a hidrokinon számára, de ha a leírt mozgó fázissal C18 oszlopot használunk, ez nem garantálható.

Ugyanakkor ez a módszer hajlamos arra, hogy más vegyületektől eredő hatások zavarják. Ilyen esetekben a meghatározást egy másik mozgó fázis/álló fázis rendszerrel kell megismételni. Megfelelő módszerek találhatók az 1. és 2. lábjegyzetben, azaz:

Oszlop: Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm, vagy ezzel egyenértékű:

hőmérséklet: 36 °C

áramlási sebesség: 1,5 ml/perc

mozgó fázis:

hidrokinonhoz: metilal-kohol/víz 5/95 (V/V)

hidrokinon monometil-éterhez: metil-alkohol/víz 30/70 (V/V)

hidrokinon monobenzil-éterhez: metil-alkohol/víz 80/20 (V/V) [5].

Oszlop: Spherisorb S5-ODS, vagy ezzel egyenértékű:

mozgó fázis: víz/metil-alkohol 90/10 (V/V)

áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Ezek a feltételek hidrokinonhoz megfelelőek [6].

[1] ISO 5725

[2] ISO 5725

[3] ISO 5725

[4] ISO 5725

[5] M. Herpol-Borremans et M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet.Sci. 8-203-214 (1986).

[6] J. Firth and Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, 129. o.

--------------------------------------------------