I. MELLÉKLET

Vizsgálati program a 3., 4., 5., 7. és 8. cikk alapján elvégzendő vizsgálatokhoz

1. A MEGHATÁROZOTT KÁROSÍTÓ JELENLÉTÉRE VONATKOZÓ ÁLTALÁNOS ELVEK

1.1. A meghatározott károsító jelenlétének gyanúja akkor áll fenn, ha a meghatározott növényen végzett első kimutatási vizsgálat pozitív eredményt ad. Tüneteket mutató növényi anyagok esetében az első kimutatási vizsgálat szelektív izolálás is lehet.

1.2. A meghatározott károsító jelenlétének megerősítésére a meghatározott növények tüneteket mutató mintáin kerül sor a következő esetekben: a) ha az első kimutatási vizsgálat tipikus morfológiájú kolóniákat eredményező szelektív izoláció: két azonosítási vizsgálat pozitív eredményt ad; b) ha az első kimutatási vizsgálat a szelektív izolálástól eltérő vizsgálat: i. két azonosítási vizsgálat pozitív eredményt ad, miután a mintán szelektív izolálást végeztek; ii. a szelektív izolálástól eltérő második kimutatási vizsgálat pozitív eredményeket ad.

1.3. A meghatározott károsító jelenlétének megerősítésére a meghatározott növények tüneteket nem mutató mintáin kerül sor a következő esetekben: a) ha a második kimutatási vizsgálat pozitív eredményt ad, feltéve, hogy az első vagy a második kimutatási vizsgálat molekuláris (DNS-alapú) vizsgálat (TaqMan® valós idejű PCR vagy hagyományos PCR); b) olyan tagállamban vagy valamely tagállam olyan területén vett minták esetében, ahol a meghatározott károsító előfordulása nem ismert, valamint másik tagállamból származó minták esetében: ha az a) pont szerinti második kimutatási vizsgálat pozitív eredményt ad, és a mintán végzett szelektív izolálás után két azonosítási vizsgálat pozitív eredményt ad.

2. VIZSGÁLATOK

2.1. Kimutatási vizsgálat

A kimutatási vizsgálatoknak biztosítaniuk kell az újraszuszpendált pellet 1 ml-jében legalább 104 sejt következetes kimutatását.

A második kimutatási vizsgálatnak az első kimutatási vizsgálattól eltérő biológiai elveken vagy eltérő nukleotid régiókon kell alapulnia.

A kimutatási vizsgálatok a következők:

a) a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírt fluoreszkáló ellenanyagpróbák;

b) FISH vizsgálat (van Beuningen et al., 1995 (1)), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995).

c) a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírt izolálás. Az alábbi két lehetőség egyikét kell elvégezni: i. közvetlen izolálás félig szelektív (vagy nem szelektív) tápközegben, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; ii. a biológiai teszttel végzett sűrítést követően izolálás, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

d) hagyományos PCR-vizsgálat Pastrik (2000) (2) primerek alkalmazásával, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

e) TaqMan® valós idejű PCR-vizsgálatok, a következő primerek és próbák alkalmazásával: i. Schaad et al. (1999) (3), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; ii. Vreeburg et al. (2018) (4) (úgynevezett NYtor teszt), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iii. Gudmestad et al. (2009), a Vreeburg et al., (2018)4 által kiigazított formában, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iv. Massart et al. (2014) (5), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint.

2.2. Azonosítási vizsgálatok

Az azonosítási vizsgálatok a következők:

a) fluoreszkáló ellenanyagpróba, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

b) hagyományos PCR-vizsgálat (Pastrik, 2000), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

c) TaqMan® valós idejű PCR-vizsgálatok, a következő primerek és próbák alkalmazásával: i. Schaad et al. (1999), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; ii. Vreeburg et al. (2018) (úgynevezett NYtor teszt), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iii. Gudmestad et al. (2009), a Vreeburg et al., (2018) által kiigazított formában, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint; iv. Massart et al. (2014), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

d) DNS vonalkódolás, a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint;

e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al., 2011 (6)), a nemzetközi diagnosztikai szabványokban leírtak szerint.

3. AZ ELJÁRÁSOK FOLYAMATÁBRÁI

1. folyamatábra: Diagnosztikai eljárás a meghatározott károsító jelenlétének a meghatározott növény tüneteket mutató mintáiban történő kimutatására.

a Első vagy második kimutatási vizsgálatként izolálás alkalmazható. Ha feltételezhető a meghatározott károsító jelenléte a tápközegben, a telepeket meg kell tisztítani tiszta tenyészetek nyerése céljából, amelyeken két azonosítási vizsgálatot kell végezni. A károsító jelenlétének megerősítéséhez a két azonosítási vizsgálat pozitív eredménye szükséges.

b A harmadik kimutatási vizsgálatnak eltérő biológiai elveken vagy eltérő nukleotid régiókon kell alapulnia.

2. folyamatábra: Diagnosztikai eljárás a meghatározott károsító kimutatására a meghatározott növény tünetmentes mintáiban.

a Izolálás nem alkalmazható.

b A harmadik kimutatási vizsgálatnak eltérő biológiai elveken vagy eltérő nukleotid régiókon kell alapulnia. Izolálás nem alkalmazható.

c Az 1.3. b) pontban említett minták esetében a meghatározott károsító jelenlétének megerősítéséhez a második pozitív kimutatási vizsgálat után a meghatározott károsítót izolálni kell a mintából, majd két pozitív azonosítási vizsgálatra van szükség.

4. A MINTA ELŐKÉSZÍTÉSE

4.1. Tünetmentes gumókból vett minták

A standard mintának vizsgálatonként 200 gumót kell tartalmaznia. A nemzetközi diagnosztikai szabványok ismertetik a megfelelő laboratóriumi eljárást, melynek során a köldökrészből vett darabokat feldolgozzák kivonat kinyerése céljából a meghatározott károsító kimutatásához.

4.2. Tünetmentes – a gumóktól eltérő – növényi anyagból vett minták

Látens fertőzések kimutatását szárdarabok egyesített mintáin kell elvégezni. Az eljárás különböző növényekből származó legfeljebb 200 szárdarabra alkalmazható. A nemzetközi diagnosztikai szabványok ismertetik a szárdarabok fertőtlenítésére és feldolgozására szolgáló megfelelő laboratóriumi eljárást, a meghatározott károsító kimutatásához szükséges kivonat kinyerése céljából.

4.3. Tüneteket mutató meghatározott növényekből vett minták

Steril körülmények között szövetrészeket kell kimetszeni a gumó edénynyalábgyűrűjéből vagy a hervadás tüneteit mutató meghatározott növények szárában lévő edénynyalábkötegekből. A nemzetközi diagnosztikai szabványok teljeskörűen ismertetik az ilyen szövetek feldolgozására szolgáló megfelelő laboratóriumi eljárást, a meghatározott károsító kimutatásához szükséges kivonat kinyerése céljából.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-1016.10.7./j.syapm.2011.05.001.